RS50408B - Memno peptidi, postupak za njihovo pripremanje i njihova primena - Google Patents

Abstract

) Jedinjenje formule (I) gde R1 i R2 zajedno su O sa dvostrukom vezom, ili oba su H ili H i OH, ili H i 0-C1-C4-alkil; R3 i R4 zajedno su O sa dvostrukom vezom, ili oba su H ili H i OH, ili H i 0-C1-C4-alkil; R8 je odabran od H, OH, C1-C4-alkila i O-C1-C4-alkila; R6 je grupa odabrana od grupe formule (II) gde R9 je odabran atoma vodonika i glikozidno vezanog sećera, i grupe formule (III)gde R10 je H ili glikozidno vezan šećer, i gde, ako R6 je grupa formule (II), tada R5 je veza za ugljenikov atom C9 formule (II) i R7 je atom vodonika, ili R5 je vezan za ugljenikov atom C9 formule (II) i R5 je atom vodonika, iako R6 je grupa formule (III), tada su R5 i R7 svaki po atom vodonika; A je amino kiselina; n je ceo broj biran od 2 do 12, pri čemu je svaki A isti ili se razlikuje od svakog drugog A; pri čemu je atom azota u izoindolskom prstenu formule (I), azot N-terminalnog amina prve amino kiseline iz (A)n grupe; i (A)n formira peptidni lanac; ili njegova so ili derivat. Prijava sadrži 6 nezavisnih i 18 zavisnih patentnih zahteva

Description

OPIS PRONALASKA

Pronalazak se odnosi na nove derivate peptida, nazvane memno peptidi, koji se mogu dobiti fermentacijom Memnoniella echinata FH2272, DSM 13195, u jednom kulturnom medijumu, na postupak za pripremanje memno peptida, kao i na primenu memnopeptida kao farmaceutskih sredstava, na primer za proizvodnju farmaceutskih proizvoda za lečenje srčane slabosti.

Kardiovaskularni poremećaji još uvek su na vrhu uzroka smrti u zapadnim industrijskim zemljama. Jedan ne beznačajan deo njih su pacijenti sa srčanom slabošću. Pod sfšanom se slabošću podrazumeva neodgovarajuće funkcionisanje srca. Scrce nije u stanju da obezbedi protok koji odgovara potrebama sisara. Srčana je slabost akutna ili hronična nesposobnost štrca da pod opterećenjem, čak i pri mirovanju, obezbedi protok krvi neophodan za metabolizam ili da prihvati povratnu otrovanu krv. To je stanje srca kada kompenzacioni mehanizmi, kao što je broj otkucaja srca, istisnuta zapremina krvi ili natpritisak više nisu dovoljni za održavanje normalnog kapaciteta srca. Srčana slabost ima različite uzroke, kao, npr., zapaljenjske i degenerativne promene miokarda (šišanog mišića), poremećaje srčane cirkulacije i infarkt miokarda. Srčana slabost dovodi do promena u perifernoj cirkulaciji, do poremećaja disanja, funkcije bubrega i elektrolitičke ravnoteže, a takođe do smanjenja snage skeletne muskulatore, i na kraju, ona često vodi u smrt.

Srčana slabost uglavnom se javlja u poodmaklom dobu. Učestanost je 3 poremećaja na 1000 stanovnika po godini kod ljudi starosti od 35-64 godina i 10/1000/godina u starosnoj grupi od 65 do 94 godine. Smrtnost kod 75-godiŠnjaka povećava za faktor 200 u poređenju sa starosnom grupom između 35 i 44 godina. Smrtnost je ostala približno konstantna između 1970 i 1983 kako su pokazala istraživanja u SAD. Za Saveznu Republiku Nemačku treba pretpostaviti iste cifre. Više od 50% pacijenata umire u prvih pet godina posle postavljene dijagnoze. Ovo statističko ispitivanje samo po sebu ukazuje na veliki značaj srčane slabosti za stanovništvo, ali isto tako potvrđuje nedovoljne mogućnosti medicinskog leČenja koje su danas na raspolaganju lekaru. Imajući u vidu nedovoljnost postojećih postupaka lečenja, razvijene su nove koncepcije koje treba da dovedu do novih lekova za srce. Sposobnost srčanih i skeletnih mišića da se skupljaju i tako vrše mehanički rad zavisi od (1) kontraktilnih strukturnih elemenata (miofibrila) i (2) od hemijske energije (ATP) kojom raspolažu miofibrili, a koja se pretvara u energiju u procesu skupljanja. U procesu skupljanja dolazi do skraćivanja miofibrila. To se može inicirati impulsima motornog nerva, pod čijim delovanjem joni kalcijuma (Ca'<+>) ulaze u sarkoplazmatički prostor iz vanćelijskog prostora u toku nekoliko milisekunđi pa se naslage kalcijuma prazne. Kod slabosti miokarda (srčana sllabost) Ca2<T>koncentracija u miofibrilima može biti smanjena. Međutim, Cajoni su nezamenljivi za aktiviranje kontraktilnog sistema. Ako postoji potražnja, Ca'<+>se upumpava u sarkoplazmatički retikulum (SR) uz kataizovanje jedne membran-ske, Ca<2+->zavisne, Mg<2+->ATPaze: taj se enzim takode naziva i Sarko(Endo)-plazmatična Ca<2+>ATPaza (SERCA2). Prema hidropatskoj analizi, Ca<2+>ATPaza sadrži deset transmembranskih spirala i više vanmembranskih petlji. Na citozo-lnoj su strani obrazovana područja za vezivanje Ca"<+>i ATP vezivanje, za fosforilovanje i za zajedničko delovanje sa modulatorskim proteinom fosfolam-banom (PLB). Ovaj poslednji je jedan proteinski pentamer koji je lokalizovan u membrani od SR i vrši inhibitorski uticaj na SERCA2 u nefosforilovanom stanju. Pod fiziološkim stresom vrši se fosforilovanje PLB koje povećava afinitet SERCA2a prema Ca<2+>i tako povećava brzinu transporta Ca<2+>jona u SR. Fosforilovanje PLB (jedan protein 52 amino kiseline) vrši se na dva radikala amino kiselina: serin-16 može se fosforilovati sa protein kinazom zavisnom od cAMP, a treonin se može fosforilovati u položaju 17 sa kinazom zavisnom od Ca<2+>/kalmodulina, Ovo fosforilovanje izaziva promenu u konfiguraciji u PLB koju prati povećan afinitet SERCA2 prema Ca"<+.>Anti-PLB antitela u stanju su da imitiraju efekt fosforilovanja PLB pa tako potvrđuju ključnu ulogu PLB kao regulatora kontraktilnog delovanja srca (Phospholamban: Protein Structure, Mechanism of Action and Role in Cardiac Function. H. K. Simmerman and L. R. Jones, Phvsiological Revievvs; Vol. 78, No. 4, 921ff, 1998). Zbog toga bi aktivatori SERCA2 trebalo do ostvare povoljan uticaj kod srčane slabosti.

Neočekivano je otkriveno da kulture gljivičnog soja Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 sadrže prirodne supstance koje su u stanju da ostvare povoljno delovanje na srce i na krvotok. Izdvojena aktivna jedinjenja, memno petidi, prirodne su supstance koje sadrže specifične sastavne grupe. Ove sastavne grupe sadrže terpenske jedinice, jednu takzovanu poliketiđnu grupu i jednu grupu koja sadrži azot.

Terpeni su prirodna jedinjenja koja se mogu formalno prikazati kao proizvodi polimerizovanja priuzvoda ugljovodonika izoprena. Zavisno od broja izoprenskih grupa, mogu se razlikovati monoterpeni (C10), seskiterpeni (Cl5), diterpeni (Cjo) itd. Veliki se broj jedinjenja može obrazovati od od osnovnih stzruktura supstituisanjem, ciklizovanjem, preraspoređivanjem, oksidovanjem, itd.; kao rezultat toga, u literaturi su opisane mnoge hiljade terpena. Jedinjenja koja sadrže azot izvedena od terpena takođe su objavljena, ali se ona računaju među alakaloide (npr. Gentiana alkaloids) [Rompp Chemie Lexikon [Rompp's Chemical Encyclopedia], 9th Edition, Volume 6, page 4508 ft'., Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York, 1992]. Ti se terpeni, međutim, bitno razlikuju od memno peptida prema pronalasku, pošto terpeni ne sadrže poliketiđnu grupu kojom mogu da vežu azot.

Primeri drugih poznatih terpena koji sadrže azot jesu:

- Stachvbocins [J. Antibiotics, 48: 1396 (1995)]; - Stachvbotrins [Y. Nozwa et al, J. Antibiotics, 50: 635-645 (1997)]; - Spirođihydrobenzofuran lactams [J. Antibiotics, 49: 13 (1996)]; - Nakijiquinones [Tetraheđron, 51: 10867010874 (1995)]; - F1839-A do J su terpeni koji sadrže azot i koji imaju poliketidne grupe [japanski patenti 061864133 i 08283118). Svi su oni inhibitori holesterol esteraze.

Ovi su derivati terpena sintetizovani od raznih sojeva Memnoniella echinata i Stachybotris i drugih. Opisani su kao antagonosti endotelinskog receptora, kao inhibitori HIV-1 proteaze i holesterol esteraze i kao tonik za kosu. Inhibitor inozitol monofosfataze L-671,776 jc, šta više, izdvojen iz kultura soja Memnoniella echinata, ATCC 20928 [Y.KT. Lam et al. J. Antibiotics, 45, pp. 1397-1402, (1992)].

Memno peptidi prema pronalasku imaju raznovrsan spektar aktivnosti. Važno svojstvo je njihovo delovanje na aktiviranje SERCA2 a time i na oslahelo srce.

Stoga se ovaj pronalazak odnosi na jedinjenja formule (I)

gde

Rii R2zajedno su O sa dvostrukom vezom, ili H2, ili H i OH, ili H i O-CrC4-alkiI;

R3i R4zajedno su O sa dvostrukom vezom, ili H2, ili H i OH, ili H i O-CrC4-alkil;

Rg se bira od H, OH, CrC4-aIkila i 0-CrC4-alkila kao što je O-metil;

R6je jedna grupa formule (II)

gse R9je H ili jedan glikozidno vezan šećer, ili

jedna grupa formule (III)

gde R10 je H ili jedan glikozidno vezan šećer,

i gde,

ako R6je jedna grupa formule (II). tada R5je jedna veza za ugljcnikov

atomC9 formule (II), a R5 je II, a

ako R6je jedna grupa formule III, tada R5i R7su H;

A je jedna amino kiselina;

n je jedan ceo broj biran od 1 do 12, pri čemu je svaki A isti ili se razlikuje od svakog drugog A;

pri čemu je azotov atom u izoindolskom prstenu formule (I) nitrogen N-završnog amina prve amino kiseline iz (A)n grupe;

ili na neku njegovu so ili derivat;

pod uslovom da

A je jedna amino kiselina osim Glu kada n je 1, a Rji R2 zajedno prestavljaju dvostruko vezan O, a R3i R4zajedno predstavljaju H2, a R6je jedna grupa formule (II), R5je jedna veza za ugljenikov atom C9 grupe formule (ii), R7je H, R8jeHiR9je H.

U formuli (I) (A)n može biti najmanje jedna prirodna amino kiselina birana od: Gly, Ala, VI, Leu, Ile, Prp, Ser, Thr, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, Asp, His, Glu, Asn, Gin, Cys i Met. (A)n može biti jedan peptidni lanac koji ima od 2 do 12 amino kiselina. Kod jednog izvođenja (A)n sadrži 10 amino kiselina.

CrC4-Alkil je jedan alkil pravolinijskog ili račvastog niza koji ima 1 do 3 ugljenikova atoma, kao što su metil, etil, i-propil i terc-butil.

Šečer može biti neka heksoza, na primer aldoheksoza kao što je manoza, glukoza ili galaktoza, koja može biti eventualno supstituisana sa dodatnim grupama kao što jeC. xdo C4-alkil ili NH2.

Ovaj se pronalazak dalje odnosi na sve očigledne derivate jedinjenja formule I. Derivati su soli, proizvodi redukcije, estri, etri, acetali kao i amidi i proizvodi N-alkilacije, zatim svi optički antipodi, diastereomeri i svi stereomerni oblici.

Kod jednog izvođenja, jedinjenje formule (I) ima formulu (IV)

gde grupe Rt, R2, R3, R4, R9i (A)n imaju značenje kako je napred pokazano. U formuli (IV) Rji R2 zajedno mogu biti dvostruko vezan O, R3i R4mogu zajedno biti H2a R9može biti H.

Kod jednog izvođenja pronalazak prema pronalasku je memno peptid A,<C>76H108N16O18S, formule (IVa)

U ovoj formuli, dekalinska struktura koja ima 4-metil i jednu metilen grupu jeste terpenska grupa; supstituisan izoindolski prsten je ketidna grupa. Sekvenca amino kiselina

Met His Gln Oro His Gln Pro Leu Pro Pro (SEQ ID NO: 1)

deo je kazeinske sekvence. Metionin (Met) može se oksidisati u sulfoksid.

Formula (IVb) pokazuje preporučljiv prostorni oblik:

gde (A)n ima značenje kako je napred ukazano.

Fiziohemijska i spektroskopska svojstva preporučljivih jedinjenja prema pronalasku mogu se ukratko prikazati na sledeći način:

Memno peptid A

Igled: bezbojna supstanca rastvorljiva u polarnim organskim rastvaračima

i vodi,

On je stabilan u neutralnom, blago kiselom medijumu,

Empirijska

formula. C78H108N16OlgS,

Molekulska

masa: 1565,87 Da,

UV apsorp-

cija ( Km)' 270 nm>

Podaci

NMR: videti Tabelu 1

Numerisanje ugljenikovih atoma i pripadajućih NMR hemijskih pomera-nja klasifikovani su prema proceduri numerisanja za ciklične seskiterpene.

Slika 1: Numerisanje jednog cikličnog seskiterpen ketolida.

Kod jednog izvođenja pronalaska, jedinjenja formule (I) mogu se dobiti fermentovanjem Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, ili nekih njenih varijanata ili mutanata pod pogodnim uslovima u jednoj jedinici sa medijumom za gajenje sve dok se ne pojavi bar jedan memno peptid formule (I) u medijumu kulture, posle čega se izdvajaju memno peptidi.

Pronalazak se zbog toga dalje odnosi na postupak za pripremanje jednog jedinjenja formule 1 koji obuhvata fermentovanje jednog mikroorganizma Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13 295, ili jedne od njenih varijanata ili mutanata pod pogodnim uslovima u jednom medijumu za gajenje dok se u medijumu za gajenje ne pojavi bar jedan memno peptid formule (I), a potom izdvajanje memno peptida iz rnedijuma za gajenje.

Kod jednog izvođenja, soj FH 2272, DSM 13195, njegovi mutanti i/ili varijante fermentišu se u jednom hranljivom rastvoru (takođe nazvanom medijum za gajenje) koji sadrži bar jedan izvor ugljenikovih atoma i bar jedan izvor azotovih atoma i, eventualno, sadrži uobičajene neorganske soli, sve dok se u medijumu za gajenje ne pojave memno peptidi. Memno peptidi se mogu izdvojiti iz medijuma za gajenje i eventualno razdvojiti na posebne aktivne komponente i prečistiti. Kod jednog se izvođenja memno peptidi sabiraju u medijumu za gajenje pa se razdvajaju na posebne komponente.

Kod jednog drugog izvođenja, bar se jedan od izvora azotovih atoma, koji se koristi za medijum za gajenje, bira od amino kiselina i peptida. Amino kiseline i peptidi koji se koriste kao izvori azotovih atoma mogu biti isti kao grupa (A)n, kako je napred definisana.

Postupak prema pronalasku može se koristiti za fermentovanje i na laboratorijskom nivou (u opsegu mililitara do litara) i na industrijskom nivou (na nivou kubnih metara).

Odgajena je jedna veoma produktivna kolonija Memnoniella echinata FH 2272. Jedan uzorak je deponovan kod Deutsche Sammlung von Mikroorga-nismen und Zellkulturen GmbH, Masheroder Weg 1B, 3300 Brunswick, Germany, prema pravilima Budimpeštanske konvencije, na dan 14. decembra 1999 pod sledećim brojem: Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195.

Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 ima mrko-zeleni micelijum i naznačena je konidiofornim karakteristikama genusa Memnoniella.

Varijante i mutanti soja Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, mogu se takođe koristiti za sintezu bar jednog jedinjenja mnemo peptida prema pronalasku. Ti se mutanti mogu proizvesti na neki od poznatih načina, na primer fizičkim postupcima, na primer zračenjem ultraljubičastim zracima ili rendgen-skim zracima, ili hemijskim mutagenima kao što su etil metansulfonat (EMS), 2-hidroksi-4-metoksibenzofenon (MOB) ili N-metil-N'-nitro-N-nitroizogvanidin (MNNG). Moguće varijante obuhvataju blisko srodne gljivičaste sojeve Stachybotrys, kao što su Stachybotrys atra, Stachybotrys chartarum ili Stachybotrys complementi.

Pretraživanje mutanata i varijanata koji sintetizuju bar jedno od jedinjenja memno peptida prema pronallasku može se izvesti prema sledećoj šemi: Izdvajanje micelijuma posle fermetisanja;

Ekstrahovanje memno peptida iz filtrata kulture koristeći čvrste faze, Analiza pomoću HPLC, DC ili ispitivanjem biološkog delovanja.

U daljem tekstu opisani uslovi fermentacije važe za gljivice Memnoniella echinata FH 2272, deponovani uzorak DSM 13195 i na njihove mutante i varijante.

Kod jednog izvođenja, u hranjivom rastvoru koji sadrži bar jedan rastvor ugljenikovih atoma, kazein pepton kao izvor azotovih atoma, i uobičajene neorganske soli, Memnonieall ecinata FH 2272 proizvodi memno peptid A. Kod jednog izvođenja, Memnoniella echinata FH 2272 je DSM 13195.

Mogući izvori ugljenikovih atoma za aerobičnu fermentaciju uključuju ugljovodonike i šećerne alkohole koji se mogu asimilovati, kao što su glukoza, laktoza, saharoza, škrobovi, dekstrini, fruktoza, melase, glicerol, galaktoza i D-manitol, i prirodni proizvodi koji sadrže ugljovodonike kao što je slađni ekstrakt. Mogući izvori azotovih atoma obuhvataju, na primer, amino kiseline, peptidc, proteine, proizvode razlaganja amino kiselina, peptida i proteina, kao što su kazein, peptoni i triptoni, mesne ekstrakte, ekstrakte kvasca, ekstrakte kikirikija, mleveno seme, na primer kukuruza, pšenice, pasulja, soje i pamuka, kompozicije koje sadrže seme, ostatke od destilacija kod proizvodnje alkohola, jela od mesa, ekstrakte kvasaca, amonijumove soli i nitrate. Kod jednog izvođenja bar je jedan izvor azota biran od sintetički dobijenih peptida i od biosintetički dobijenih peptida. Hranjivi rastvor eventualno sadrži bar jednu neorgansku so. Kod jednog izvođenja, neorganska se so bira od hlorida, karbonata, sulfata i fosfata. Sulfati i fosfati mogu se birati od sulfata alkalnih metala, fosfata alkalnih metala, sulfata zemno alkalnih metala i fosfata zemno alkalnih metala, pri čemu se zemno alkalni metali biraju od gvožđa, cinka, kobalta i mangana. Obrazovanje memno peptida prema pronalasku može se odvijati u hranjivom rastvoru koji sadrži kazeinski pepton. Kod jednog izvođenja hranjivi rastvor sadrži koncentraciju u opsegu od oko 0,05 do 5 %. Drugo jedno izvođenje obuhvata koncentraciju kazein peptona u opsegu od 0,1 do 1%. Još jedno drugo izvođenje sadrži koncentraciju kazein peptona u opsegu od 0,2 do 5%. Hranjivi rastvor može sadržati glukozu. Jedno izvođenje sadrži koncentraciju glukoze u opsegu od 0,5 do 3%. Hranjivi rastvor takođe može sadržati tečnost od natopljenog kukuruza. Kod jednog izvođenja hranjivi rastvor sadrži koncentraciju tečnosti od natopljenog kukuruza u opsegu od 0,05 do 1%. Drugo jedno izvođenje sadrži koncentraciju tečnosti od natopljenog kukuruza u opseu od 0,1 do 0,5%. Hranjivi rastvor mže sadržati u tragovima bar jednu komponentu biranu od kalijum hlorida, natrijum sulfata i gvožđe sulfata.

Kod jednog izvođenja hranjivi rastvor sadrži kazein pepton, glukozu, tečnost od natopljenog kukuruza i tragove kalijum hlorida, magnezijum sulfata i gvožđesulfata. Kod drugog izvođenja, hranjivi rastvor sadrži koncentraciju kazein peptona u opsegu od oko 0.05 do 5%, koncentraciju glukoze u opsegu od 0,5 do 3%, koncentraciju tečnosti od natopljenog kukuruza u opsegu od 0,05 do 1% i tragove kalijum hlorida, magnezijum sulfata i gvožđa sulfata. Podaci u procentima uvek se odnose na masu celokupmog hranjivig rastvora.

U ovom hranjivom rastvoru, Memnoniella echinata, koja može biti Memnoniell echinata FH 2272, DSM 13195, obrazuje mešavinu memno peptida. U zavisnosti od sastava hranjivog rastvora, količinski odnosi jednog ili više od memno peptida prema pronalasku mogu se menjati. Šta više, sinteza pojedi-načnih memno peptida može se kontrolisati sastavom medijuma, tako da neki memno peptid možda uopšte da ne bude proizveden, ili da bude proizveden u količini ispod granice zapažanja mikroorganizma.

Gajenje mikroorganizma može se vršiti aerobno, tj., na primer potapanjem uz vibriranje ili mešanje u bocama za vibriranje ili u posudama za fermentaciju, eventualno sa dovođenjem vazduha ili kiseonika. Može se vršiti na temperaturi u opsegu od 18 do 37°C, u užem opsegu od 20 do 32°C, i u još užem opsegu od 25 do 30°C. pH opseg treba da bude između 6 i 8, na primer između 6,5 i 7,5. Opšte uzev, mikroorganizam se gaji pod tim uslovima u trajanju od 24 do 300 časova, najčešće od 36 do 140 časova.

Pogodno je da se gajenje može izvesti u više stepena, tj, može se pripremiti bar jedna pretkultura u nekom tečnom hranljivom medijumu, pa se potom može kalemiti u stvarni proizvodni medijum, glavnu kulturu, na primer kalemljenjem jednog micelijuma u neki hranjivi rastvor i pustitiu ga da raste oko 6 do 120 časova, naprimer 48 do 72 časa. Micelijum se može dobiti, na primer, puštanjem soja da raste oko 3 do 40 dana, bolje 4 do 10 dana, na nekom čvrstom ili tečnom hranjivom medijumu, na primer na agaru slada-kvasca ili na agaru krompirove dekstroze (standarni medijum za gljivice budi, na primer koji priprema Difco).

Tok fermentacije se može pratiti pomoću pH kulture ili zapremine micelijuma kao i hromatografskim postupcima, kao što je tankoslojna hromatografija ili tečna hromatografija visokog pritiska ili ispitivanjem biološkog dclovanja. Jedinjenje prema pronalasku može se nalaziti i u micelijumu i u filtratu za gajenje, ali se najveći deo obično nalazi u filtratu za gajenje.

Proces izdvajanja, opisan u daljem tekstu, služi za prečišćavanje memno peptida prema pronalasku, na primer memno peptida A. Izdvajanje ili prečišćavanje memnopeptida prema pronalasku iz medijuma za gajenje može se vršiti prema poznatim postupcima vodeći računa o hemijskim, fizičkim i biološkim svojstvima prirodnih supstanci. Za ispitivanje koncentracija memno peptida u medijumu za gajenje ili u pojedinačnim stepenima izdvajanja, može se koristiti tankoslojna hromatografija, na primer na silikagelu, koristeći izopro-panol/25%NH3za ispiranje, ili HPLC. Detekcija kod razdvajanja u tankoslojnoj hromatografiji može se izvesti, na primer, pomoću spektralnih reagensa kao što je hlorsulfonska kiselina/glacijalna sirćetna kiselina, pri čemu se količina obrazo-vane supstance poredi sa kalibracionim rastvorom.

Za izdvajanje memno peptida prema pronalasku, micelijum se obično prvo izvadi iz hranjivog rastvora koristeći uobičajene procedure, pa se onda memno peptidi ekstrahuju iz ćelijske mase koristeći, eventualno, neki organski rastvarač koji se može mešati u vodi. Faza organskog rastvarača sadrži prirodne supstance prema pronalasku. Može biti eventualno koncentrovana u vakuumu a ostatak može biti dalje prečišćen kako će biti dalje opisano. Kod jednog se izvođenja memno peptid ekstrahuje iz kulture dodavanjem rastvarača mešavini gljivica i hranjivog rastvora.

Filtrat kulture može se eventualno kombinovati sa koncentratom ekstrakta micelijuma i ekstrahovati nekim pogodnim organskim rastvorom koji se može mešati sa vodom, na primer sa n-butanolom. Potom uklonjenja organska faza može se eventualno koncentrovati u vakuumu. Da bi se odmastili vredni proizvodi, koncentrat se može razrediti nekim nepolarnim rastvaračem u kome jedinjenja prema pronalasku nisu mnogo rastvorljiva, na primer heksanom, petroleum etrom ili dietil etrom. U tom se procesu memno peptidi talože a lipofilne nečistoće ostaju nerastvorene i mogu se ukloniti uobičajenim postupcima razdvajanja čvrstih i tečnih faza.

Talog koji sadrži memno peptide može se rastvoriti u razmcri 1/30 u početnoj zapremini vode/metanola. Talog se tom prilikom potpuno rastvara i može se liofilizovati. Liofilizat, u daljem tekstu sirov proizvod, može sadržati 5 do 50% memno peptida i može se koristiti za dalje izdvajanje.

Dalje prečišćavanje bar jednog memno peptida prema pronalasku može se izvesti hromatografijom na pogodnim materijalima, na primer na molekulskim sitima, na silikagelu, aluminijum oksidu, na izmenjivačima jona, ili na adsorberskim smolama ili na suprotnim fazama (RP). Memno peptidi mogu se izdvojiti pomoću ovih hromatografija. Hromatografija memno peptida može se izvoditi koristeći puferovane vodene rastvore ili mešavine vodenih i organskih rastvora.

Pod mešavinama vodenih i organskih rastvarača podrazumevaju se svi organski rastvarači koji se mogu mešati sa vodom, kao što su metano!, propanol i acetonitrtil u koncentraciji od 5 do 80% rastvarača, češće 20 do 50% rastvarača. ili, alternativno, svi puferovani vodeni rastvarači koji se mogu mešati sa organskim rastvaračima. Puferi koje treba upotrebiti mogu biti isti kao oni napred pomenuti.

Izdvajanje memno peptida na bazi njihove različite polarnosti može se izvesti pomoću suprotnofazne hromatografije, na primer na MCI® (adsorberska smola od Mitsubishi-ja, Japan) ili Amberlite® (Toso Haas), ili drugih hidrofobnih materijala, kao na RP-8 i RO-18 fazama. Pored toga, razdvajanje se nože izvesti pomoću normalnofazne hromatografije, na primer na silikagelu, aluminijumoksidu i sličnom.

Hromatografija memno peptida može se izvoditi koristeći puferovane ili okiseljene vodene rastvore ili mešavine vodenih rastvora sa alkoholima ili drugim organskim rastvaračima koji se mogu mešati sa vodom. Kod jednog se izvođenja organski rastvarač bira od propanola i acetonitrila.

Kada je reč o puferovanim ili okiseljenim vođenim rastvorima, podrazumeva se da to znači najmanje jedan rastvor sam ili u kombinaciji. Tako, na primer, taj se najmanje jedan rastvor može birati od vode, fosfatnih pufera, amonijum acetata, citratnih pufera i kiselina. Kod jednog izvođenja je citratni pufer u koncentraciji u opsegu od 0 do 0,5 M. Kiseline se biraju od mravlje kiseline, sirćetne kiselin, trifluorsirćetne kiseline i svih komercijalno dostupnih kiselina pozatih stručnjaku. Kod jednog je izvođenja komercijalno dostupna kiselina u koncentraciji u opsegu od 0 do 1%. Kod jednog drugog izvođenja koncentracija kiseline je 0,1%.

Hromatografija se može izvoditi koristeći jedan gradijent koji počinje sa 100% vode a završava se sa 100% rastvarača. Koristi se bar jedan rastvarač. Može se koristiti i mešavina dva ili više rastvarača. Kod jednog izvođenja se llinearni gradijent kreće od 20 do 50% jednog rastvarača biranog od propanola i acetonitrila.

Alternativno se može primeniti hromatografija na gelu ili hromatografija na hidrofobnim fazama.

Hromatografija na gelu može se vršiti na poliakrilamidnim ili kopolimernim gelovima, kao što su Biogel-P 2® (Biorad) ili Fractogel TSK HW 40® (Merck, Nemačka ili Toso Haas, SAD).

Kao sledeće, veoma efikasan postupak za prečišćavanje proizvoda prema pronalasku može biti primena jonskih izmenjivača. Tako, na primer, bazni memno peptid A može se veoma pogodno izdvojiti na katjonskim izmenjivačima, kao što je Fractogel® EMD SO,. Mogu se koristiti puferski rastvori između pH 5 i 8, na primer između pPI6 7,5. Ispiranje se može ostvariti, na primer, koristeći jedan rastući gradijent soli. Sem vode, može biti korisno da se koriste mešavine vodenih puferskih rastvora sa nekim organskim rastvaračem kao rastvarači. Udeo organskih rastvarača može biti između 10% i 90%, recimo između 30 i 60%.

Sekvenca napred pornenutih hromatografskih procesa može biti reverzi-bilna.

Kao sledeće, vrlo efikasan stepen prečišćanja memno peptida jeste krista-lizacija. Memno peptidi se mogu kristalizovati iz rastvora u organskim rastvara-čima i iz mešavima vode sa organskim rastvaračima. Kristalizovanje se može izvoditi na inače poznat način, na primer koncentrovanjem ili hlađenjem zasićenih rastvora memno peptida.

Memno peptidi prema pronalasku stabilni su u čvrstom stanju i u rastvorima u pH opsegu između 3 i 8, na primer 5 i 7, pa se mogu uključiti u uobičajene farmaceutske preparate.

Obrazovanje memno peptida koji sadrže azot može se pospešiti dodavanjem poželjnih amino kiselina ili peptida kao prekurzora kulturama Memnoniela echinata. Moguće je da je posebnost sojeva Memnoniela echinata da se vezuju za amino grupe amino kiselina i peptida isporučenih sa sintezom petočlanog prstenastog laktama, obično jednog izoindolskog prstenastog sistema. To se vezivanje odvija bilo polazeći od aldehidnog prekurzora u toku jedne oksidacije ili od stepena oksidacije laktona u obliku otvorenog prstena ili u obliku cikličnog laktona. Ta sposobnost Memnoniella echinata da vezuje amine potpuno je neočekivana i može se koristiti za dobijanje zaštićenih, konvertovanih derivata amina, kao što su terpenski derivati amino kiselina i peptida.

Bar jedno jedinjenje od memno peptida prema pronalasku može biti pogodno zbog svojih vrednih farmakoloških svojstava za upotrebu u humanoj ili u veterinarskoj medicini kao farmaceutskih preparat.

Zbog toga se ovaj pronalazak odnosi na primenu jedinjenja formule (1) ili neke njegove fiziološki podnošljive soli za proizvodnju leka za srce za lečenje ili predohranu srčane slabosti.

Jedinjenja prema ovom pronalasku takođe se mogu koristiti za proizvodnju farmaceutskih sredstava za lečenje oboljenja kod kojih je srčana slabost primarni ili sekundarni uzrok oboljenja kao što je, na primer, slabost krvotoka.

Mehanizam đelovanja memno peptida nije tačno poznat, ali je zapaženo značajno delovanje.

Memno peptiidi imaju, pored toga, antimikrobno dejstvo.

Zbog toga se ovaj pronalazak odnosi i na upotrebu jedinjenje formule (I) ili neke njegove fiziološki podnošljive soli za proizvodnju farmaceutskih proizvoda za lečenje mikrobnih, na primer bakterijskih, infekcija.

Tabela 3 prikazuje minimalnu inhibitornu koncentraciju (MIC) antimi-krobnog spektra memno peptida A protiv izvesnih probranih bakterija.

Pored antibakterijskog delovanja, jedinjenja prema pronalasku imaju i blaga antimikotična, tj. protivgljivična, svojstna, na primer protiv Candida albicans.

Pored toga, supstance prema pronalasku imaju izvesno pogodno inhibitorno delovanje na glukoza-6-fosfat translokazu (G-6-P-TJ), enzim koji je od značaja za metabolizam glukoze a time i za lečenje diabetes mellitus-a. Tako, na primer, jedinjenje memno peptid A ima selektivno delovanje protiv G-6-P - TL, ali ne suzbija koenzim G-6-P fosfatazu.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na primenu jedinjenja formule (I) ili neke njegove fiziološki podnošljive soli za proizvodnju farmaceutskog sredstva za terapiju diabetes mellitus-a.

Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske preparate bar jednog jedinjenja memno peptida prema pronalasku.

Bar jedno jedinjenje memno peptida prema pronalasku može se u opštem slučaju dati kao takvo u nerazblaženom obliku. Primena kao mešavine sa pogodnim neutralnim dodacima ili nosačima jedno je od izvođenja pronalaska. Nosači koji se koriste u farmaceutskim sredstvima mogu biti uobičajeni i farmakološki podnošljivi nosači i/ili neutralni dodaci.

Uopšteno govoreći, farmaceutska sredstva prema pronalasku mogu se davati oralno ili parenteralno, ali je moguće i rektalno davanje. Pogodni oblici čvrstih ili tečnih farmaceutskih preparata su, na primer, granule, praškovi, tablete, obložene tablete, (mikro)kapsule, supozitorijumi, sirupi, emulzije, suspenzije, aerozoli, kapljice ili rastvori za injekcije u obliku ampula i preparati koji imaju zaštićeno ispuštanje aktivnog jedinjenja, u čijem se pripremanju obično koriste nosači i aditivi i/ili neutralni dodaci kao što su sredstva za razlaganje, veziva, sredstva za oblaganje, sredstva za bubrenje, sredstva za klizanje ili za podmazivanje, sredstva za davanje ukusa, zasladivači ili sredstva za rastvaranje. Često korišćeni nosači ili neutralni dodaci koji se mogu pomenuti jesu, na primer, magnezijum karbonat, titanijum dioksid, laktoza, manitol i drugi šećeri, talk, laktoprotein, želatin, škrob, vitamini, celuloza i njeni derivati, životinjska ili biljna ulja, polietilen glikoli i rastvarači kao što je sterilna voda, alkoholi, glicerol i višebazni alkoholi.

Ako je potrebno, dozne jedinice mogu biti stavljene u mikiokapsule za oralno davanje da bi se odložilo ispuštanje ili da bi se produžilo u većem periodu vremena, na primer oblaganjem ili umetanjem aktivnog jedinjenja u obliku čestice u pogodne polimere, voskove ili slično.

Kod jednog izvođenja farmaceutski se preparati mogu proizvesti i davati u doznim jedinicama, pri čemu svaka jedinica sadrži, kao aktivan sastojak, jednu specifičnu dozu bar jednog jedinjenja memno peptida prema pronalasku. U slučaju čvrste dozne jedinice kao što su tablete, kapsule i supozitorijumi, ta doza može da bude do oko 500 mg, ali uobičajenije je da bude oko 0,1 do 200 mg, a u slučaju rastvora za injekcije u obliku ampula oko 200 mg, obično oko 0,5 do 100 mg na dan.

Dnevna doza koja se daje obično zavisi od telesne mase, starosti, pola i stanja sisara. Pod izvesnim okolnostima, međutim, mogu biti potrebne i veće i manje doze. Davanje dnevne doze može se izvesti bilo jednim jedinim davanjem u obliku jedne pojedinačne doze, ili u vidu nekoliko manjih doznih jedinica višestrukim davanjem delimičnih doza u određenim intervalima.

Farmaceutski preparati prema pronalasku mogu se proizvesti prevođenjem bar jednog jedinjenja od memno peptida prema pronalasku u pogodan oblik za davanje koristeći uobičajene nosače i, ukoliko je potrebno, aditive i/ili neutralne dodatke.

Pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima. Procenti se odnose na masu. Odnosi mešanja u slučaju tečnosti odnose se na zapreminu, ukoliko nisu dati drugi detalji.

Cilj je sledećih primera da ilustruju pronalazak a da ne ograničuju njegov opseg.

PRIMERI

Primer 1. Pripremanje glicerolske kulture Memnoniella echinata FFI 2272, DSM

13195

100 ml hranljivog rastvora (sladni ekstrakt 2,0%, ekstrakt kvasca 0,2%, glukoza 1,0%, (NH4)2HP040,05%, pH 6,0) u sterilnoj Erlenmeyer-ovoj boci, zapremine 300 ml, inokulisano je sojem Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, pa je inkubisano na obrtnom vibratoru na 25°C i na 140 min"<1>tokom 7 dana. 1,5 ml te kulture razblaženo je sa 2,5 mk 80% glicerola i pohranjeno na -20°C.

Primer 2. Pripremanje u jednoj Erlenmeverovoj boci kulture ili predkultute Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195

Sterilna Erlenmeyer-ova boca, zapremine 300 ml, koja je sadržala 100 ml sledećeg hranljivog rastvora: 10 g/l glukoze, 5 g/l kazein peptona, 10 g/l tečnosti od natopljenog kukuruza i 7 ml rastvora elemenata u tragovima (10 g/l KC1. 10 g/l MgS04x 7 H20, 3,6 g/l FeS04x 7 H20 i 6 g/l MgS04x H20) inokulisano je jednom kulturom gajenom u jednoj kosoj epruveti (isti hranjivi rastvor ali sa2%agara) ili sa 1 ml jedne glicerolske kulture (videti Primer 1) i inkubisano pri 180 min'<1>i 30°C na jednom vibratoru. Za inokulisanje posuda za fermentaciju od 10 i 200 1, jedna potoljena kultura starosti 48 do 96 časova (količina inokulacije oko 10%) iz istog hranjivog rastvora bila je dovoljna.

Primer 3. Pripremanje memno peptida

Sud za termetaciju zapremine 30 1 radio je pod sledećim uslovima Hranjivi medijum:

10 g/l glukoze

0,5 g/l kazein peptona

7 ml rastvota elemenata u tragovima

pH 6,5 (pre sterilisanja)

Rastvor elemenata

u tragovima: KC1 10 g/l, MgS04x 7 H20 10 g/l, FeS04x 7 ILO 3,6 g/l i

MnSG4x ILO 6 g/l

Vreme inkubacije: 45 časova

Temperatura

inkunacije 28°C

Brzina mešalice: 300 min<1>

Provetravanje: 15 1 min 1

Obrazovanje je pene po želji suzbijano ponovljenim dodavanjem etanol-skog rastvora polivalentnog alkohola.

Primer 4. Izdvajanje mešavine memno peptida iz rastvora kulture Mamnoniella echinata FH 2271, DSM 13195

Po završetku fermentacije Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195. hranjivi rastvor iz suda za fermentaciju, dobijen prema Primeru 3 (200 1) filtriran je uz dodavanje oko 2% pomoćnog sredstva za filtriranje (npr. Celite®) a ćelijska masa (22 1) ekstrahovana je sa 66 1 metanola. Metanolski rastvor koji je sadržao vredne supstance oslobođen je od micelijuma filtriranjem, pa je potom koncentrovan u vakuumu. Koncentrat je razblažen vodom i nanesen na pripremljenu, 17 1 MCI GEL, kolonu CHP20P zajedno sa filtratom kulture (180 1). Ispran je sa gradijentom vode psle 60% propan-2-olom u vodi. Protok kolone (25 l/h) sakupljan je po frakcijama (10 1 svaka) pa su frakcije koje sadrže memno peptid kombinovane (od 25% do 30% propan-2-ola).

Koncentracija u vakuumu dala je 20 1 mrkog ratvora. Šest litara izmenjivača katjona, Fractogel® EMD S03, stabilizovanog na pH 7 sa kalijum fosfatnim puferom složeno je u jednu kolonu (125 mm x 500 mm). Posle punjenja izmenjivača jona sa 20 1 napreci opisanog koncentrata, ispran je gradijentom od 10 mM kalijum fosfatnog pufera, pH 7, posle 1 M NaCI u 10 mM kalijum fosfatnog pufera, pH 7 u vodi/metanolu (1:1). Protok kolone, tj. nevezan materijal, sadržao je neutralne memno peptide. Protok u stubu bio je 12 l/h; količine od po 1 1 sakupljene, su u frakcijama tokom gradijentnog ispiranja. Sa 0,75 M NaCI (frakcije 31 i 32) dobijen je memno peptid A. Frakcije 31 i 32 su kombinovane i koncentrovane u vakuumu na oko 500 ml.

Primer 5. Obogaćivanje memno peptida A hromatografijom na gelu

8 g proizvoda dobijenog prema Primeru 4 naneto je na kolonu kapaciteta 3,9 1 ispunjenu sa Fractogel® TSK HVV-40 s (širina x visina = 10 cm x 50 cm). Ipiranje: metanol/voda pumpano je kroz kolonu sa protokom od 20 ml/min a izlazna tečnost iz kolone sakupljana je u vidu frakcija (20 ml). Memno peptidi uglavnom su nalaženi u frakcijama 75 do 85. One su kombinovane i oslobođene od metanola u vakuumu. Od njih je dobijeno 0,9 g mešavine aktivnih jedinjenja.

Primer 6. Sistem HPLC za otkrivanje memno peptida

Niže opisani sistem omogućuje ispitivanje čistoće kao i izdvajanje i kvanti-ziranje memnoterpena, na primer u sirovoj mešavini ili u filtratima kulture.

Ipiranje: 0,1% trifluorsirćetna kiselina u32%acetonitrilu

Kolona: Nucleosil 100C1SAB 250/4, Macherey-Nagel

Protok: 1,0 ml/min

Detekcija: Apsorpcija ultraljubičaste svetlosti na 210 nm.

Pod naznačenim uslovima, memno peptid A može imati sledeće vreme zadržavanja: Memno peptid A: 7,0 minuta.

Primer 7. Prečišćavanje memno peptida A

500 ml memno peptida A, izdvojenog i obogaćenog prema Primeru %•, naneto je na jednu 500 ml Nucleosil® 100-7C18AB kolonu i hromatografisano koristeći gradijent od 25 do 50% acetonitrila u 0,05% trifluorsirćetnoj kiselini/ vodi. Protok isplake bio je 50 ml/min; veličina frakcija 50 ml. Memno peptid A nađen je u frakcijama 71 do 78. Ponovljeno prečišćavanje kombinovanih frakcija sa konstantnom koncentracijom rastvarača od 28% acetonitrila u 0,05% trifluorsirćetnoj kiselini dalo je >95% čist memno peptid C posle sušenja zamr-zavanjem (100 mg).

Analiza memno peptida A :

10jug memno peptida A hidrolizovano je u stalno ključaloj hlorovodoni-čnoj kiselini i analizirano u jednom analizatoru amino kiselina. Nađene su sledeće uobičajene amino kiseline:

UV apsorbovanje:Xmaxna 269 nm, 305 nm (rame).

FAB maseni spektar velike rezolucije pokazao je jedan intenzivan MH<*>na m/z 1565,7819 Da, što se dobro poklapa sa proračunatom masom (za C76Hl09N16O18S, monoizotopno) od 1565,7827. MS/MS fragmentacij odgovarala je formuli (IVa).

Claims (25)

1. Jedinj enj e formule(I) gde Rii R2zajedno su O sa dvostrukom vezom, ili oba su H ili Hi OH, ili H i 0-Ci-C4-alkil; R3i R4zajedno su O sa dvostrukom vezom, ili oba su H ili H i OH, ili H i 0-Ci-C4-alkil; R8 je odabran od H, OH, Ci-C4-alkila i 0-Ci-C4-alkila; R^je grupa odabrana od grupe formule (II) gde R9je odabran atoma vodonika i glikozidno vezanog šećera, i grupe formule (III) gde Rio je H ili glikozidno vezan šečer, i gde, ako Rg je grupa formule (II), tada R5je veza za ugljenikov atom C9 formule (II) i R7je atom vođonika, ili R5je vezan za ugljenikov atom C9 formule (II) i R5jue atom vođonika, i ako Re je grupa formule (III), tada su R$i R7svaki po atom vođonika; A je amino kiselina; n je ceo broj biran od 2 đo 12, pri Čemu je svaki A isti ili se razlikuje od svakog drugog A; pri čemu je atom azota u izoinđolskom prstenu formule (I), azot N-terminalnog amina prve amino kiseline iz (A)n grupe; i (A)n formira peptidni lanac; ili njegova so ili derivat.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1, formule (IV) gde su grupe Ri, Rj, R3, R4, Rs» R9i (A)n kao što je definisano u zahtevu 1, ili njegova so ili derivat.

3. Jedinjenje prema zahtevu 2, ili njegova so ili derivat, naznačeno time, što Rii R2zajedno su O sa dvostrukom vezom, R3i R4su oba H, i R9je H.

4. Jedinjenje prema zahtevu 1, formule (V) gde su grupeRuR2»R3, R4, R5, R?, R«, Rioi (A)n kao što je definisano u zahtevu 1, ili njegova so ili derivat.

5. Jedinjenje prema jednom od prethodnih zahteva, ili njegova so ili derivat, naznačeno time, što (A)n je peptidni lanac sa amino kiselinskom sekvencom: Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Ile-Pro-Pro (SEQID NO: 1), pri čemu je Met grupa po izboru oksidisana tako da obrazuje sulfoksiđ.

6. Jedinjenje prema jednom od prethodnih zahteva, ili njegova so ili derivat, naznačeno time, štoR$ili Rio je aldoheksoza.

7. Jedinjenje prema jednom od premodnih zahteva, ili njegova so ili derivat, naznačeno time, što se može dobiti gajenjem gljivice odabrane od Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, ili njene varijanate ili mutanata pod pogodnim uslovima u medijumu za gajenje do pojave jedinjenja u u medijumu za gajenje i nakandnim izolovanjem datogjedinjenja.

8. Jedinjenje prema zahtevu 7, koje dalje obuhvata pretvaranje datog jedinjenja u najmanje bar jedan hemijski oblik odabran od derivata i fiziološki podnošljivih soli.

9. Jedinjenje prema zahtevu 1, formule (IVb) gde (A)n je definisano prema zahtevu 1.

10. Jedinjenje prema zahtevu 1, memno peptid A, C76Hio8Ni60i8S, formule (IVa) ili njegova so ili derivat.

11. Jedinjenje prema jednom prethodnih zahteva, naznačeno time, što grupa (A)n sadrži deo aminokiselinske sekvence za kazein.

12. Jedinjenje prema zahtevu 11, naznačeno time, što je (A)n amino kiselinska sekvenca: Met His Gln Pro His Gln Pro Ile Pro Pro (SEQ DD NO: 1).

13. Jedinjenje prema zahtevu 12, naznačeno time, što je metionim (Met) oksidisan tako da obrazuje sulfoksid.

14. Kompozicija koja sadrži najmanje jedno jedinjenje formule (I), pri čemu je dato jedinjenje definisano prema jednom od prethodnih zahteva, i prihvatljiv nosač.

15. Kompozicija prema zahtevu 14, naznačena. time, što je data kompozicija farmaceutska kompozicija i dati prihvatljiv nosač je farmaceutski prihvatljiv nosač.

16. Postupak za đobijanje jedinjenja formule (I), ili njegove soli ili derivata, prema jednom od od zahteva 1-13, koji obuhvata gajenje Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, ili njenog mutanata ili varijante, pod pogodnim uslovima u medijumu za gajenje koji sadrži bar jedan izvor ugljenikovih atoma i bar jedan izvor azotovih atoma do pojave bar jednog jedinjenja formule (I) u medijumu za gajenje i naknadno izolovanje datog jedinjenja.

17. Postupak prema zahtevu 16, koji dalje obuhvata konverziju jedinjenja u najmanje jedan hemijski oblik odabran od derivata i fiziološki podnošljivih soli.

18. Postupak prema zahtevu 16 ili 17, naznačen time, što se gajenje odvija pod aerobnim uslovima.

19. Postupak prema jednom od zahteva 16-18. naznačen time, što je dati izvor azotovih atoma odabran od amino kiselina i peptida.

20. Postupak prema jednom od zahteva 16-19, naznačen time, što hranljivi medijum sadrži kazein pepton u koncentraciji od oko 0,05% do oko 5 tež. % ukupnog hranljivog rastvora.

21. Postupak prema jednom od zahteva 16-20, naznačen time, što hranljivi medijum sadrži kazein pepton, glukozu, kukuruzni ekstrakt, i u tragovima kalijumhlorid, magnezijumsulfat i gvožđe-sulfat.

22. Upotreba jedinjenja formule (I), ili njegove soli ili derivata, prema jednom od zahteva 1 -13, za proizvodnju leka za lečenje srčane insuficijencije.

23. Upotreba jedinjenja formule (I), ili njegove soli ili derivata, kao što je definisano jednom od zahteva 1-13, za proizvodnju leka za lečenje oboljenja gde je srčana isuficijencija primarni ili sekundarni uzrok.

24. Upotreba jedinjenja formule (I), ili njegove soli ili derivata, kao što je definisano u jednom od zahteva 1 - 13, za proizvodnju leka za lečenje dijabetes melitusa.

25. Upotreba jedinjenja formule (I), ili njegove soli ili derivata, kao što je definisano u jednom od zahteva jednom od zahteva 1 - 13, za proizvodnju leka za lečenje mikrobne infekcije.