RS50567B - Prolekovi antivirusnih sredstava piperazina i supstituisanog piperidina - Google Patents

Prolekovi antivirusnih sredstava piperazina i supstituisanog piperidina

Info

Publication number
RS50567B
RS50567B RSP-2008/0060A RSP20080060A RS50567B RS 50567 B RS50567 B RS 50567B RS P20080060 A RSP20080060 A RS P20080060A RS 50567 B RS50567 B RS 50567B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
group
compound
methyl
iva
phenyl
Prior art date
Application number
RSP-2008/0060A
Other languages
English (en)
Inventor
Yasutsugu Ueda
John F. Kadow
Nicholas A. Meanwell
Tao Wang
Chung-Pin H. Chen
Kap-Sun Yeung
Zhongxing Zhang
David Kenneth Leahy
Shawn K. Pack
Nachimuthu Soundararajan
Timothy P. Connolly
Pierre Sirard
Kathia Levesque
Dominique Thoraval
Original Assignee
Bristol-Myers Squibb Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34963934&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS50567(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol-Myers Squibb Company filed Critical Bristol-Myers Squibb Company
Publication of RS50567B publication Critical patent/RS50567B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C215/02—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C215/04—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated
    • C07C215/06—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated and acyclic
    • C07C215/10—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated and acyclic with one amino group and at least two hydroxy groups bound to the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/062—Organo-phosphoranes without P-C bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/572—Five-membered rings
    • C07F9/5728—Five-membered rings condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/65515—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a five-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65586—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system at least one of the hetero rings does not contain nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

: PROLEKOVIANTIVIRUSNIH
SREDSTAVA PIPERAZINAI
SUPSTITUISANOG PIPERIDINA
UNAKRSNA REFERENCA NA POVEZANU PRIJAVU
Ova prijava se poziva na prioritet U.S. privremene prijave serijskih brojeva 60/635,231 podnete 10. decembra 2004. i 60/553,320 podnete 15. marta 2004.
OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak daje jedinjenja koja imaju svojstva leka i svojstva biološkog delovanja, njihove farmaceutske kompozicije i postupak primene. Naročito, postupak se odnosi na nove prolekove derivate sa antivirusnim delovanjem. Posebno, predstavljeni pronalazak se odnosi na jedinjenja korisna za lečenje HlV-a i SIDA-e.
STANJE TEHNIKE
HIV-1 (humani virus imunodeficijencije-l) infekcija ostaje glavni medicinski problem, sa približno 42 miliona inficiranih ljudi širom sveta na kraju 2002. Broj slučajeva HlV-a i SIDA-e (sindrom stečene imunodeficijencije) brzo je porastao, godine 2002. zabeleženo je približno 5.0 miliona novih infekcija, a 3.1 milion ljudi umrlo je od SIDA-e. Trenutno dostupni lekovi za tretman HlV-a obuhvataju deset nukleozidnih inhibitora reverzne transkriptaze (RT) ili odobrene kombinovane pilule (zidovudin ili AZT (ili Retrovir®), didanozin (ili Videx®), stavudin (ili Zerit®), lamivudin (ili 3TC ili Epivir®), zalcitabin (ili DDC ili Hivid®), abacavir sukcinat (ili Ziagen®), Tenofovir dizoproksil fumarat so (ili Viread®), Combivir® (sadrži -3TC plus AZT), Trizivir® (sadrži abacavir, lamivudin i zidovudin) i Emtriva® (emtricitabin); tri ne-nukleozidna inhibitora reverzne transkriptaze: nevirapin (ili Viramune®), delavirdin (ili Rescriptor®) i efavirenc (ili Sustiva®), devet peptidomimetičkih inhibitora proteaze ili odobrenih formulacija: sakvinavir, indinavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, Kaletra® (lopinavir i Ritonavir), Atazanavir (Reyataz®), Fosamprenavir® i jedan fuzioni inhibitor koji ciljno deluje na virusni gp41 T-20 (FUZEON®). Svaki od lekova može samo privremeno da zaustavi virusnu replikaciju ako se koristi sam. Međutim, kada se koriste u kombinaciji, ovi lekovi značajno deluju na viremiju i napredovanje bolesti. Ustvari, značajna smanjenja u stopama smrtnosti među pacijentima obolelim od SIDA-e nedavno su dokumentovana kao posledica široke primene kombinovane terapije. Međutim, uprkos ovim impresivnim rezultatima, ova terapija kombinovanim lekovima na kraju ne pomaže kod 30 do 50% pacijenata. Nedovoljna jačina leka, neusaglašenost, ograničeno prodiranje u tkiva i specifična ograničenja leka unutar određenih ćelijskih tipova (npr., većina nukleoziđnih analoga ne može biti fosforilovana u interfaznim ćelijama) mogu biti razlozi nepotpune supresije osetljivih virusa. Osim toga. visoka stopa replikacije i brza tranzicija HIV-1 u kombinaciji sa čestom ugradnjom mutacija, vodi ka pojavi varijanti koje su otporne na lek i neuspehu tretmana kada su prisutne suboptimalne koncentracije leka (Larder and Kemp; Gulick; Kuritzkes; Morris-Joneset ahSchinaziet al;Vacca and Condra; Flexner; Berkhout and Renet al\(Ref. 6-14)). Prema tome, potrebna su nova anti-HIV sredstva koja pokazuju jasne obrasce otpornosti, pogodne farmakokinetičke kao i bezbedonosne profile kako bi se obezbedilo više opcija za lečenje.
Među lekovima protiv HIV-1 koji se trenutno nalaze na tržištu su dominantni nukleozidni inhibitori revezne transkriptaze ili inhibitori peptidomimetičke proteaze. Nenukleozidni inhibitori reverzne transkriptaze (NNRTls) nedavno su dobili veoma značajnu ulogu u terapiji HIV infekcija (Pedersen & Pedersen, Ref 15). Najmanje 30 različitih slučajeva NN RT I je opisano u literaturi (De Clercq, Ref. 16) i nekoliko NNRTls je procenjeno u kliničkim ispitivanjima. Derivati dipiridodiazepinona (nevirapin), benzoksazinona (efavirenc) i bis(heteroaril) piperazina (delavirdin) odobreni su za kliničku upotrebu. Međutim, glavni nedostatak razvoja i primene NNRTls je sklonost brze pojave sojeva rezistentnih na lek, kako u tkivnoj ćelijskoj kulturi tako i kod tretiranih subjekata, posebno onih koji se podvrgavaju monoterapiji. Kao posledica toga, postoji značajno interesovanje u identifikaciji NNRTls koji su manje skloni razvoju rezistencije (Pedersen & Pedersen, Ref 15). Nedavni pregled ne-nukleozidnih inhibitora reverzne transkriptaze predstavlja: "Perspectives on novel therapeutic compounds and strategies for the treatment of HIV infeetion", (Buckheit , reference 99). Prikaz koji pokriva kako NRTI tako i NNRTls je (De Clercq, reference 100). Pregled trenutnog stanja lekova protiv HlV-a je objavljen (De Clercq, reference 101).
Nekoliko derivata indola uključujući indol-3-sulfon, piperazino indol. pirazino indol i 5H-inđolo[3,2-b][l ,5]benzotiazepin derivat navedeni su u literaturi kao inhibitori reverzne transkriptaze HIV-1 (Greenlee et al, Ref. 1; Williams et al, Ref. 2; Romero et al, Ref. 3; Font et al, Ref. 17; Romero et al, Ref. 18; Young et al, Ref. 19; Genin et al. Ref. 20; Silvestri et al. Ref. 21). Indol 2-karboksamidi su takođe opisani kao inhibitori ćelijske adhezije i HIV infekcije (Boschelli et al, US 5,424.329. Ref. 4). 3-Supstituisani prirodni proizvodi indola
(semikohliodinol A i B, didemetilasterihinon i izokohliodinol) opisani su kao inhibitori HIV-1 proteaze (Fredenhagen et al, Ref. 22).
Strukturno srodni derivati aza-indol amida prethodno su opisani (Kato et al, Ref. 23(a); Levacher et al, Ref. 23(b); Dompc Spa, WO-09504742, Ref. 5(a); SmithKline Beecham PLC, WO-09611929, Ref. 5(b); Schering Corp., US-05023265, Ref. 5(c)). Međutim, ove strukture se razlikuju od onih za koje se ovde traži zaštita u tome što su oni pre derivati monoaza-indol mono-amida nego derivati oksoacetamida. i ovde se ne pominje primena ovih jedinjenja za tretman virusnih infekcija, posebno HlV-a.
Novi lekovi za tretman HlV-a potrebni su za tretman pacijenata koji su postali rezistentni na trenutno odobrene lekove opisane u prethodnom tekstu koji ciljno deluju na reverznu transkriptazu ili proteazu. Jedan pristup za dobijanje ovih lekova je naći molekule koji inhibiraju nova i različita ciljna mesta virusa. Opšta klasa inhibitora koji se aktivno ispituju su inhibitori ulaska HlV-a. Ova opšta klasifikacija obuhvata lekove usmerene ka nekoliko ciljnih mesta koji obuhvata] u inhibitore receptora za hemokin (CCR5 ili CXCR4), fuzione inhibitore koji ciljno deluju na virusnu gp41 i inhibitore koji sprečavaju vezivanje virusnog omotača, gpl20, za njegovo CD4 ciljno mesto na humanim ćelijama. Izvestan broj pregleda ili radova o inhibitorima virusnog ulaska nedavno se pojavio i neki od izabranih radova su:Chemokine receptor antagonists as HIV entrv inhibitors.Expert Opinion on Therapeutic Patents (2004), 14(2), 251-255.
Inhibitors of the entry of HIV into host cells.Meanvvell, Nicholas A.; Kadovv, John F. Current Opinion in Drug Discoverv & Development (2003), 6(4), 451-461.
Virus entry as a target for anti- IUV intervention.Este, Jose A. Retrovirologv Laboratorv irsiCaixa, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Universitat Autonoma de Barcelona, Badalona, Spain. Current Medicinal Chcmistrv (2003), 10(17), 1617-1632.
New antirelroviral agents.Rachline, A.; Jolv, V. Service de Maladies Infectieuses et Tropicalcs A, Hopital Bichat-Claude Bernard. Pariš, Fr. Antibiotiques (2003), 5(2), 77-82.
New antirelroviral drugs.Gulick, R. M. Cornell HIV Clinical Trials Unit, Division of International Medicine and Infectious Diseases. Weill Medical College of Cornell Universitv. Nevv York. NY, USA. Clinical Microbiology and Infection (2003), 9(3). 186-193.
Sensitivity of HIV- 1 to entrv inhibitors correlates with envelope/ coreceptor affinity,
receptor densitv, and fu si on kinetics.Reeves, Jacqueline D.; Gallo, Stephen A.; Ahmad, Navid; Miamidian, John L.; Harvev. Phoebe E.; Sharron, Matthevv; Pohlmann, Stefan; Sfakianos, Jeffrey N.; Derdevn, Cvnthia A.; Blumentlial. Robert; Hunter. Eric; Doms, Robert
W. Department of Microbiologv, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States ofAmerica (2002). 99(25), 16249-16254. CODEN: PNASA6 ISSN: 0027-8424.
Opportunities and challenges in targcting HIV entry.Biscone, Mark J.; Pierson, Theodore C; Doms, Robert W. Department of Microbiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. Current Opinion in Pharmacology (2002), 2(5), 529-533.
HIV entry inhibitors in clinical development.O'Hara, Bryan M.; Olson, William C. Progenies Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY, USA. Current Opinion in Pharmacology
(2002), 2(5), 523-528.
Resistance mutation in HIV entrv inhibitors.Hanna, Sheri L.; Yang, Chunfu; Owen, Sherry M.; LaI, Renu B. HIV Immunology and Diagnostics Branch, Division of AIDS5 STD, Atlanta, GA, USA. AIDS (London, United Kingdom) (2002), 16(12), 1603-1608.
HIV entry: are ali receptors created equal?Goldsmith, Mark A.; Doms, Robert W. Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, USA. Nature Immunologv (2002), 3(8), 709-710. CODEN: NIAMCZ ISSN: 1529-2908.
Peptide and non- peptide HIV jusi on inhibitors.Jiang, Shibo; Zhao, Qian; Debnath, Asim K. The New York Blood Center. Linđslev F. Kimball Research Institute, New York, NY, USA. Current Pharmaceutical Design (2002), 8(8), 563-580.
Dva su generalna pristupa za sprečavanje početnog vezivanja virusne membrane. gpl20, za ćelijski CD4 i to su a) inhibitori koji se vezuju za humani CD4 i blokiraju vezivanje virusnog omotača (gpl20) i b) inhibitori koji se vezuju za virusni gpl20 i sprečavaju vezivanje ćelijskog CD4. Drugi pristup je koristan po tome što inhibira virusno ciljno mesto i, ako je selektivan, minimizuje šanse za narušavanje normalne humane fiziologije ili izazivanje sporednih efekata. Sa ovim pristupom, u cilju prevazilaženja spektra ostljivosti na lek koja je izazvana varijabilnošću u sekvencama virusnog omotača i da bi se suzbio razvoj otpornosti, značajno je da se postignu nivoi leka u plazmi koji su što je moguće više puta veći od EC50 ili druge mere koncentracije leka koja je potrebna da uništi virus. Kao što je razmatrano u daljem tekstu, ovi inhibitori su se pokazali bezbednim tako da bi imali široku primenu kod ljudi pa prema tome, moraju biti sposobni da postignu nivoe izloženosti dovoljne da omoguće supresiju virusa. Sto je viši nivo leka u odnosu na nivo koji je potreban da inhibira virusni rast, to je efikasnija i potpunija supresi ja virusne replikacije i manja je šansa virusne mutacije i kasnijeg razvoja rezistentnosti na tretman. Prema tome, značajni aspekti koji doprinose efikasnosti inhibitora vezivanja virusa obuhvataju ne samo suštinsku potentnost i bezbednost, već takođe farmakokinetičke i farmaceutske osobine koje dozvoljavaju postizanje visokog izlaganja plazme fizički podesnoj dozi i prihvatljivom, poželjno pogodnom, rasporedu doziranja. Ovaj pronalazak opisuje pristup vezan za prolek koji u velikom stepenu pojačava maksimalno izlaganje i sposobnost za povećanje umnožaka izlaganja (tj., izlaganja leku višestruko veće od EC50ili EC90) usled povećanja doze efikasnih članova prethodno opisane klase inhibitora vezivanja HlV-a.
Serija nedavnih publikacija i radova opisuju jedinjenje obeleženo kao BMS-806, početni član klase inhibitora ulaska virusa koji ciljno deluju na virusni gp-120 i sprečavaju vezivanje virusa za domaćinske CD4.
A small molecule HIV- 1 inhibilor that targets the HIV- 1 envelope and inhibits CD4
receptor binding.Lin, Pin-Fang; Blair, Wade; Wang, Tao; Spicer, Timothv; Guo, Qi; Zhou, Nannan; Gong, Yi-Fei; Wang, H. -G. Heidi; Rose, Ronald; Yamanaka, Gregorv; Robinson,
Brett; Li, Chang-Ben; Fridell, Robert; Deminie, Carol; Demers, Gvvendeline; Yang, Zheng; Zadjura, Lisa; Meanvvcll, Nicholas; Colonno, Richard. Proceedings of the National Academv of Sciences of the United States of America (2003), 100(19), 11013-11018.
Biochemical and genetic characterizations of a novel human immunodeficiency virus
type 1 inhibitor that blocks gpl20- CD4 interactions.Guo, Qi; Ho, Hsu-Tso; Dicker, Ira; Fan, Li; Zhou, Nannan; Friborg. Jacques; Wang, Tao; McAuliffe, Brian V.; Wang, Hwei-gene Heidi; Rose, Ronald E.; Fang, Hua; Scamati, Helen T.; Langlev, David R.; Meanwell, Nicholas A.: Abraham, Ralph; Colonno, Richard J.; Lin, Pin- fang. Journal of Virology
(2003), 77(19), 10528-10536.
Method using small heterocyc! ic compounds far treating HIV infection by preventing
interaction of CD4 and gpl20.Ho, Hsu-Tso; Dalterio, Richard A.; Guo, Qi; Lin, Pin-Fang. PCT Int. Appl. (2003), WO 2003072028A2.
Discovery of 4- bemoil- l-[( 4- metoksi- lH- pirolo[ 2, 3- b] piridin- 3- il) oxoacetilJ- 2- ( R)-metilpiperazine ( BMS- 3 78806) : A Novel HIV- 1 Attachment Inhibitor That Interferes with
CD4- gpl2() Interactions.Wang, Tao; Zhang. Zhongxing; Wallace. Ovven B.; Deshpande, Milind; Fang, Haiquan; Yang, Zheng; Zadjura, Lisa M.; Tvveedie, Donald L.: Huang, Stella; Zhao, Fang; Ranadivc, Sunanda; Robinson, Brett S.; Gong, Yi-Fei; Ricarrdi, Kcith: Spicer, Timothy P.; Deminie, Carol; Rose, Ronald; Wang, Hvvei-Gene Heidi; Blair, Wade S.; Shi, Pei-Yong; Lin, Pin-fang; Colonno, Richard J.; Meamvell. Nicholas A. Journal of Medicinal Chemistry (2003), 46(20). 4236-4239.
Indolni, azaindolni i drugi derivati iz ove klase koji sadrže okso amid opisani su u određenom broju različitih PCT i objavljenih SAD prijava patenata (Reference 93-95, 106, 108, 109, 110, 111 i 112) i ove reference se direktno odnose na jedinjenja iz ove prijave patenta. Nijedno od jedinjenja u ovim referencama ranije tehnike ne sadrži metil dihidrogen fosfatnu (ili so ili mono ili diestar fosfatne grupe) grupu vezanu za N-l azot i prema tome jedinjenja ovog pronalaska predstavljaju nove kompozicije. Ova grupa drastično povećava iskorišćenost matičnih jedinjenja funkcionisanjem kao modifikacija proleka koja drastično povećava maksimalno sistemsko izlaganje matičnih molekula u prekliničkim modelima humanog izlaganja. Verujemo da se ništa iz ranije tehnike ne može tumačiti tako da opisuje ili sugeriše nova jedinjenja ovog pronalaska i njihovu primenu za inhibiciju HIV infekcije.
Ovaj pronalazak opisuje prolekove specifičnih indol i azaindol ketopiperazin amida koji su ekstremno efikasni u poboljšavanju oralne iskoristljivosti matičnih molekula kao antivirusnih sredstava, posebno kao lekova protiv HlV-a. Matični molekuli su relativno nerastvorljivi, i apsorpcija im je ograničena rastvorljivošću, što znači kako doza raste iznad maksimalnog nivoa, sve se manje i manje leka rastvara u vremenu i prenosi u cirkulaciju već prolazi kroz tclo i eliminiše se kao otpad. Poboljšanja ponuđena prolekom su neophodna, ona omogućavaju značajno povećeanje nivoa leka u tclu, čime je obezbeđena veća efikasnost protiv HIV virusa i naročito protiv manje osetljivih ili rezistentnijih sojeva. Prolekovi su posebno značajni za ovu klasu lekova s obzirom đa ovi lekovi ciljno deluju na omotač HIV virusa, ciljno mesto koje varira od soja do soja i gde je stoga maksimalna izloženost leku poželjna. Iz razloga što će sa prolekom više leka biti apsorbovano i dostići ciljno mesto, težina pilule, troškovi za pacijenta i intervali doziranja mogu biti smanjeni. Identifikacija prolekova sa ovim osobinama je teška i nije jednostavna, niti predstavlja jasan put ka uspešnoj proizvodnji proleka opisanoj u literauri. U stanju tehnike ne postoji jasan postupak kojim bi se koristili prolekovi niti koji bi od njih bio najefikasniji. Sledeća razmatranja i podaci pokazaćc da prolekovi opisani u ovom pronalasku fukcionišu iznenađujuće dobro. Oni oslobađaju matično jedinjenje izuzetno brzo i efikasno i povećavaju izlaganje do nivoa koji su veći od onih zabeleženih za mnoge prolekove.
Primena strategija ili metodologija na bazi prolekova da bi se primetno pojačala svojstva leka ili da bi se prevazišli svojstveni nedostaci u farmakokinetičkim ili farmaceutskim svojstvima leka mogu se koristiti u izvesnim slučajevima da bi se primetno povećala iskorišćenost leka. Prolekovi se razlikuju od formulacija po tome što hemijske modifikacije vode ka u potpunosti novom hemijskom entitetu koji posle primene na pacijenta, regeneriše matični molekul unutar tela. Postoji veliki broj strategija na bazi prolekova koje obezbeđuju izbor u modulaciji stanja za regeneraciju matičnog leka, fizičkih, farmaceutskih ili farmakokinetičkih svojstava proleka, kao i funkciju za koju modifikacije proleka mogu biti vezane. Međutim, nijedna od ovih publikacija ne navodi koji pristup koristiti, a koji ima za rezultat specifične prolekove koji su ovde pronađeni. Određen broj pregleda i razmatranja o strategijama na bazi prolekova objavljeno je i u daljem tekstu je dat nepotpun spisak:IIydrolysis in Drug andprodrug Metabolism.Richard Testa and Joachim Mayer, 2003 Wiley-VCH publisher, ISBN 3-906390-25-x.
Design of Prodrugs,Bunđgard. H. Editor, Elsevier, Amsterdam, 1985.Pharmacokinetics of drug targeting: specifc implications for targeting via prodrugs.Stella, V. J.; Kearnev, A. S. Dep. Pliarm. Chem.. Univ. Kansas, Lavvrence, KS, USA. Handbook of Experimental Pharmacology (1991), 1 ()0(Targeted Drug Delivery), 71-103. CODEN: HEPHD2 ISSN: 0171-2004. Journal; General Revievv written in English. CAN 116:158649 AN 1992:158649 CAPLUS (Copyright 2004 ACS on SciFinder (R)).
Prodrugs. Do they have advantages in clinicalpractice?Stella, V. J.; Charman, W. N. A.; Naringrekar, V. H. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lavvrence, KS, USA. Drugs
(1985), 29(5), 455-73. CODEN: DRUGAY ISSN: 0012-6667. Journal; General Revievv vvritten in English. CAN 103:115407 AN 1985:515407 CAPLUS (Copvright 2004 ACS on SciFinder (R)).
Trends in prodrug research.Stella, V. J.; Naringrekar, V. H.; Charman, W. N. A. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lavvrence, KS, USA. Pharmacv International (1984), 5(11), 276-9. CODEN: PFIINDO ISSN: 0167-3157. Journal; General Revievv vvritten in English. CAN 102:72143 AN 1985:72143 CAPLUS (Copyright 2004 ACS on SciFinder (R)).
Dok je poznato da neke tehnologije imaju specifične primene, tj.. da poboljšavaju rastvorljivost ili apsorpciju na primer, razvoj prolekova ostaje, do velikog stepena. empirijski. Tako obično veliki broj strategija ili hemijskih modifikacija mora biti pregledan i đobijena jedinjenja procenjena u biološkim modelima u cilju utvrđivanja i merenja uspeha strategija na bazi proleka.
Uspešna strategija na bazi proleka zahteva da hemijski reaktivno mesto u molekulu bude modifikovano preko dodavanja grupe proleka i da će kasnije pod željenim uslovima u pacijentima grupa proleka demaskirati i osloboditi matični lek. Molekul proleka mora imati pogodnu stabilnost u prihvatljivom obliku dozaže pre doziranja. Pored toga, mehanizam oslobađanja mora da omogući da prolek efikasno regeneriše matični lek i sa kinetikom koja obezbeđuje terapeutske nivoe matičnog leka na ciljanu bolest. U našim molekulima, indol ili azaindol azot predstavlja prihvatljivu tačku vezivanja za grupu proleka.
Pretpostavka da fosfatna grupa koja je vezana na odgovarajući način ili preko linkera može da poveća oralnu izloženost matičnog leka je koncept koji je poznat u tehnici. Međutim, kao što će biti razmatrano u daljem tekstu, nepredvidivo je da li će korišćenje fosfatne grupe za stvaranje proleka funkcionisati sa đatom supstancom leka. Fosfatna grupa privremeno menja fizičke osobine leka i, prema tome je prolek koji povećava rastvorljivost dobijenog molekula u vodi, sve dok se ne odvoji delovanjem alkalne fosfataze u telu ili drugom hemijskom reakcijom namenski pripremljenog linkera. Na primer, u sledećem radu, autori zaključuju da fosfati mogu da poboljšaju oralnu efikasnost. U ovom radu fosfatni derivat alkoholne grupe u slabo rastvorljivom u vođi, lipofilnom leku pokazuje bolju oralnu biodostupnost nego druga dva proleka i izgleda da nudi prednost u odnosu na matični molekul koji poseduje nisku oralnu biodostupnost.
Evaluation of a targeted prodrug strateg}'to erihance oral absorption ofpoorly waler-
soluble compounds.Chan, O. Helen; Schmid, Heidi L.; Stilgenbauer, Linda A.; Hovvson, William; Horvvell, David C; Stevvart, Barbra H. Pharmaceutical Research (1998), 15(7), 1012-1018.
Objavljena su dva veoma značajna i skorija rada koja razmatraju teškoće identifikacije fosfatnih prolekova sa značajnim prednostima u odnosu na matični molekul za oralnu primenu.
Rad pod nazivom "Absorption Rate Limit Considerations for Oral Phosphate Prodrugs" koji su objavili Tvcho Heimbach et. al. u Pharmaceutical Research 2003, Vol 20, No. 6 str. 848-856 navodi "Iznenađujuća nesposobnost da se koriste fosfatni lekovi oralnim putem pokrenula je ispitivanje u sistemu koji je korišćen za skrining lekova u odnosu na potencijal apsorpcije." Ovaj rad takođe navodi razloge zašto su mnogi fosfatni prolekovi bili nepogodni za oralnu primenu i razmatra nekoliko faktora koji bi potencijalno mogli da ograniče stopu apsorpcije leka. Ovaj rad takođe iđentifikuje nekoliko uspešnih primena. Rad pokušava da identifikuje osobine koje čine neke lekove pogodnim za oralnu primenu kao fosfatnih prolekova, ali jasna je poruka da je ovo još uvek empirijski zasnovano. Ovo je naglašeno zaključcima drugog rada koji su dali isti autori pod nazivom "Enzvme mediated precipitation of parent drugs from their fosfat prodrugs", Tycho Heimbach et. al u International Journal of Pharmaceutics 2003, 261, 81-92. U apstraktu autori navode da mnogi oralni fosfatni prolekovi nisu uspeli da poboljšaju stopu ili stepen apsorpcije u poređenju sa njihovim nerastvorljivim matičnim lekovima. Brzo stvaranje matičnog leka preko crevne alkalne fosfataze može imati za rezultat superzasićene rastvore, što vodi ka taloženju matičnog leka. Ovo bi ograničilo upotrebljivost oralnih fosfata. U zaključcima ovog rada navodi se "U zaključku, taloženje matičnih lekova od fosfatnih prolekova može biti posredovano enzimom. Taloženje izvesnih lekova može takođe biti posmatrano za izvesne lekove u Caco-2 modelu. S obzirom da se vremena indukcije smanjuju, a vremena formiranja jezgra kristalizacije povećavaju sa visokim odnosima superzasićenja, matični lekovi mogu da se talože kada je koncentracija ciljanih prolekova mnogo viša od rastvorljivosti matičnog leka, tj., za matične lekove sa visokim odnosima superzasićenja. Stepen do koga se matični lek taloži u toku konverzije proleka zavisi od stopa konverzije proleka u matični lek, efekta koji prolek ima na taloženje matičnog leka i rastvaranje matičnog leka." Kao što se može videti u zaključku autora, proces je složen i zavisi od mnogih faktora koje je nemoguće predvideti unapred kao što su odnosi superzasićenja, stope konverzije prolekain v/vo,i sposobnost crevnog sistema da rastvori smešu matičnog leka i prolekova.
Dva rada koje je dao Heimbach opisuju klinički status fosfatnih prolekova i razmatraju mnoge nedostatke i nekoliko uspešnih primera. Jedan primer kliničkog nedostatka i jedan primer uspeha dati su u daljem tekstu: Etoposide® je lek protiv kancera koji se primenjuje bilo intravenozno ili oralno. Etoposid fosfatni prolekovi se koriste klinički, ali ove strukture se razlikuju od derivata ove prijave jer ovaj prolek sadrži fosfat formiran direktnim vezivanjem za fenol grupu matičnog leka. Glavni razlozi za pripremu fosfatnog proleka leka etoposida bili su da se poboljša intravenozna primena preko povećane rastvorljivosti i smanjenja inertnih punilaca. Iako je fosfatni prolek procenjen oralno i preklinički i klinički on je korišćen samo klinički za intravenoznu primenu.
Svnthesis of etoposide fosfat, IiMY- 4Q481: a nater- soh/ b/ e clinico! fy active prodrug of
etoposide.Saulnier, Mark G.; Langley. David R.; Kadow, John F.; Senter, Peter D.; Knipe. Jay O.; Tun, Min Min; Vvas, Dolatrai M.; Dovle, Terrence W. Bristol-Mvers Squibb Co.,
Wallingford, CT, USA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (1994), 4(21), 2567-72 i reference koje se navode u ovom radu.
Kao što se može videti iz sledeća dva rada, koristi od fosfatne grupe za oralno doziranje nisu bile jasne.
Randomized comparison of etoposide pharmacokinetics after oral etoposide fosfat and
oral etoposide.De Jong. R. S.; Mulder, N. H.; Uges, D. R. A.; Kaul, S.; Winograd, B.; Sleijfer, D.Th.; Groen, H. J. M.; Willemse, P. H. B.; van der Graaf, W. T. A.; de Vries, E. G. E. Department of Medical Oncologv, Universitv Hospital Groningen, Groningen, Neth. British Journal of Cancer (1997), 75(11), 1660-1666. Ovaj rad je poređio matični lek i prolek direktno i u njemu se zaključuje da oralni etoposid fosfat ne nudi klnički relevantnu prednost u odnosu na oralni etoposid.
Etoposide bioavailability after oral administration of the prodrug etoposide fosfat in
cancer patients during a phase I study.Chabot, G. G.; Armand, J. -P.; Terref, C; De Forni, M.; Abigerges, D.; Winograd, B.; Igvvemezie, L.; Schacter, L.; Kaul, S.; et al. Department Medicine, Gustave-Roussv Institute, Villejuif, Fr. Journal of Clinical Oncology (1996), 14(7), 2020-2030.
U ranijem radu je nađeno da u poređenju sa podacima iz literature, oralni EP je imao 19% višu F vrednost u poređenju sa oralnim E bilo u niskim ili visokim dozama. Zaključeno je da ovi viši F u E od oralnog proleka EP izgleda da su farmakološka prednost koja može biti od potencijalnog farmakodinamičkog značaja za ovaj lek. Međutim, prethodno pomenuto ispitivanje koje je došlo do suprotnih zaključaka je izvršeno kasnije i čini se da su podaci direktnog poređenja bili validniji. Tako, dodavanje fosfatne grupe da bi se poboljšala rastvorljivost nije garancija poboljšane oralne efikasnosti.
Fosfatni prolek inhibitora HIV proteaze Amprenavir je pripremljen i aktivan je sastojak nečega što je sada postalo poboljšan lek za oralnu primenu. Ovo je primer retkog uspeha ovim pristupom. Fosfat je direktno vezan za hidroksi grupu i služi da poveća rastvorljivost. Fosamprenavir sam ili u kombinaciji sa drugim inhibitorom proteaze ritonavirom, koji služi za inhibiciju citohromom P450 3A4-posrcdovane metaboličke deaktivacije, omogućava pacijentima da prime manje pilula, manje pilule (zahvaljujući potrebi za manje inertnih punilaca) i korišćenje ređeg rasporeda doziranja. Jasno, struktura Amprenavira je značajno drugačija od molekula predstavljenog pronalaska i ne predviđa uspeh sa drugim klasama lekova ili upotrebom hemijskih postupaka koji se odnose na fosfatni linker. U daljem tekstu navedena su dva rada koja se odnose na Fosamprenavir. ali najnoviji podaci se mogu naći pretraživanjem baze podataka koja je dobro poznata u u tehnici kao što je IDDB (komercijalna baza podataka pod nazivom Investigational Drugs Database proizvedena od strane Current Drugs Ltd.).
Fosamprenavir vertex Pharmaceuticals/ GlaxoSmithKline. [ Erratum to document cited
in CAl 38: 130388].Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D. M. School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinion in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(5), 824.
Fosamprenavir Vertex Pharmaceuticals/ GlaxoSmithKline.Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D. M. School of Pharmacv, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinion in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(3), 384-390.
Pretraživanje literature za primcre koji se mogu naći navedeni pod ključnim rečima "prolekovi indola" ili "prolekovi azaindola" daju određen broj radova koji su opisani. Nismo upoznati ni sa jednim radom u kome su azainđol prolekovi pripremljeni preko upotrebe metil dihidrogen fosfatne (ili soli ili mono ili đi cstra fosfatne grupe) grupe vezane za N-l.
U vezi sa indol fosfatnim prolekovima, publikacija koju su dali Zhu et. al. opisuje ispitivanje vezano za pronalaženje efikasnog fosfatnog proleka PD 154075. U ovom molekulu, bilo direktni indol fosfat ili metil dihidrogen fosfat ili so prolek indol azota bili su nepogodni prolekovi zbog niske stope regeneracije matičnog molekula. Tako, razvijen je novi i složeni linker prikazan u daljem tekstu da bi ugradio fosfat koji omogućava rastvaranje.
Phosphale prodrugs ofPD 1540 75.Zhu, Zhijian; Chen, Huai-Gu; Goel, Om P.; Chan, O. Helen; Stilgenbauer, Linda A.; Stevvart, Barbra H. Division of Warner- Lambert Company, Chemical Development, Parke-Davis Pharmaceutical Research, Ann Arbor, Ml, USA. Bioorganic & Medicinal Chemistrv Letters (2000). 10(10). 1121-1124.
Mnogi od radova opisuju dizajn prolekova koji nije u vezi sa prevazilaženjem ograničenog rastvaranja i kao rezultat toga niske stope apsorpcije. Određen broj prolekova nisu vezani za azot indola ili azaindola ili su namenjeni za oslobađanje radikal intermedijera pre nego matičnog leka. Prolekovi opisani u ovoj tehnici i njehove osobine ne obezbeduju očigledna rešenja za poboljšanje matičnih inhibitora vezivanja HlV-a.
Sada je nađeno da su novi metil dihidrogen fosfatni prolekovi i farmaceutski prihvatljive soli opšte strukture prikazane u daljem tekstu korisni kao sredstva protiv HlV-a sa novim mehanizmom koji se trenutno ne koristi kod postojećih lekova. Potreba za lekovima sa novim mehanizmima je velika, s obzirom da pacijenti nemaju izbora ako postanu otporni na trenutne klase lekova. Pored toga, lekovi sa novim mehanizmima se mogu koristiti u kombinacijama sa poznatim klasama inhibitora da bi se pokrila pojava otpornosti na ove lekove s obzirom da su sojevi rezistentnog virusa verovatno još uvek podloži delovanju lekova sa alternativnim mehanizmom.
Našli smo da su ovi prolekovi rastvorljiviji u vodi od matičnih molekula, i da se brzo konvertuju u matične molekule posle oralnog doziranja kod glodara iliin vitrotestovima sa humanim enzimima ili tkivima. Pored toga, u jednom istraživanju povećavanja oralne doze, prolek je dao iznenađujuća povećanja u izloženosti leku (AUC) i maksimalnoj koncentraciji (Cmax) kako se doza povećavala. Ova ispitivanja sugerišu da bi ovi prolekovi trebalo da budu od koristi kod pasa i ljudi.
Matično jedinjenje IVa je ispitivano u humanim kliničkim ispitivanjima. Jedinjenje je dozirano zdravim dobrovoljcima. Grafikon izlaganja u odnosu na dozu prikazanje na Slici 1. Kao što se može videti, pojedinačne doze formulacije u obliku kapsule (crveni trouglovi) veličine u opsegu od 200-2400 mg sa povećanjem od 200 mg. Takođe je iz oralnih AUC jasno, da se povećanja u izloženosti leku povećavaju mnogo sporije i manje nego proporcionalno sa dozom. Ustvari, razlike ili povećanje u izloženosti iznad 800 mg je minimalno. Sa opsezima doze od 1:2:4:6:9:12 za tretman kapsulom pod uslovima gladovanja, odnosi srednjih vrednosti Cmax i AUC su 1:1.3:2.4:2.3:2.1:2.7 i 1:1.5:2.3:2.0:1.9:2.4. redom. Kod opsega doza između 200-800 mg povećanje sistemskog izlaganja je vezano za dozu iako manje nego proporcionalno dozi, dok je takvo izlaganje nezavisno od doze iznad doze od 800 mg. Ovaj fenomen ukazuje daje moguća apsorpcija jedinjenja IVa kada se koristi formulacija u obliku kapsule do zasićenja pod uslovima gladovanja.
Proporcionalnost doze kod sistemskog izlaganja izgleda da je mnogo bolje predstavljena pod uslovima sa ishranom (hrana sa visokim sadržajem masti) kako su odnosi Cmax i AUC 1.6 i 1.5, redom, kada su odnosi doze 1:2.3 (800 mg prema 1800 mg). Kao što se može videti poređenjem jedne doze od 200 mg rastvoraIVa(tamno crveni kvadrat) sa istom od 200 mg doze u kapsuli, izloženost iz rastvora je bila veća. Doziranje sa rastvorom je povećalo izlaganje jedinjenju IVa. Cmax i AUC rastvora bili su približno 8- i 3-puta, redom, tih vrednosti kapsule (200 mg). Relativna biodostupnost (32%) kapsule prema formulaciji rastvora sugeriše da je apsorpcija ograničena stopom rastvaranja, što sugeriše potencijal za povećanje sistemskog izlaganja poboljšanjem formulacije.
Hrana sa visokim sadržajem masti imala je pozitivan efekat hrane na jedinjenje. Cmax posle tretmana hranom bila je približno 2.6 i 4.6 puta veća za doze od 800 i 1800 mg, redom, u odnosu na iste kod tretmana gladovanjem. AUCs posle tretmana sa ishranom bile su približno 2.5 i 4.7 puta veće za doze od 800 i 1800 mg, redom, u odnosu na tretman gladovanjem. Vrednosti relativne biodostupnosti (hrana prema gladovanju) bile su 293% i 509% za doze od 800 mg i 1800 mg, redom. Srednja vrednost Tmax promenila se ođ 1.25 ili 2 (gladovanje) do 4 (hrana) časa.
Za kapsulu od 800 mg sa hranom, prosečna koncentracija u plazmi je 1001 i 218 ng/mL 8 i 12 časova posle doze, redom. Rezultati podržavaju režim doziranja od ql2 h ili q8 h za ciljanu Cmin vrednost od najmanje 200 ng/mL posle višestrukih doza. Ova vrednost je izabrana na osnovu prekliničkih podataka. Dodatni pregled nekih od ovih podataka predstavljen kao histogram prikazanje u drugom histogramu na Slici 2B.
ISPITIVANJE VIŠESTRUKE DOZE KOD ZDRAVIH OSOBA
Izvedeno je placebo-konslrolisano ispitivanje rastuće višestruke doze za procenu bezbednosti, tolerancije i farmakokinetičkih osobina jedinjenjaIVakod zdravih osoba. Doziranje je nastavljeno u intervalima od 12 h 14 dana. Ukratko, preliminarni PK rezultati pokazali su da je, posle pojedinačnih i višestrukih Q12H doza jedinjenjaIVa,izlaganje generalno proporcionalno sa dozom u opsezima doze ođ 400 do 1200 mg i 400 do 800 mg sa ishranom sa visokim sadržajem masti i sa laganom ishranom, redom, izlaganje se čini da je zavisno od doze iznad ovih nivoa doze sa različitim tipovima ishrane, akumulacija je niska do srednja (do~1.5 puta), i da postoji dnevna varijacija u izlaganju po tome stoje izlaganje veće posle večernje doze nego posle jutarnje doze. Prema tome, izlaganje je bilo bolje kada je doziranje bilo kombinovano sa ishranom sa viskom sadržajem masti i povećanja izlaganja sa dozom bila su veća sa ishranom sa visokim sadržajem masti.
Ovo je slično rezultatima dobijenim u prethodno opisanom ispitivanju pojedinačne doze.
ISPITIVANJE VIŠESTRUKE DOZE KOD HIV PACIJENATA
Na osnovu podataka za izlaganje iz ispitivanja na normalnim dobrovoljcima, ispitivanje efikasnosti izvedeno je kod HIV pacijenata. Početno iznošenje ovih podataka dato je u razgovoru i objavljenom apstraktu. "Antiviral Activitv, Safety, and Tolerability of a Novel, Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, IVa, in HIV-1 -Infected Subjects" G. Hanna, J. Lalezari, J. Hcllinger, D. Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadovv, P-F. Lin, M. Giordano. R. Colonno, D. Grasela. Abstract J-32, 02/11/2004, llth Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA. Plan ispitivanja je obuhvatao HIV+ odrasle osobe koje nisu imale antiretrovirusnu virusnu terapiju ili osobe koje su bez antiretroviralne terapije bile više od 16 nedelja. Bilo je potrebo da njihov broj CD4 ćelija bude > 250 ćelija/mm<3>i da plazma HIV-1 RNK bude u opsegu od 5,000-500,000 c/mL. U svakoj grupi za doziranje bilo je 15 subjekata i odnos pacijenata koji primaju lek:placebo bio je 4:1.
Placebo-kontrolisano, sekvencijalno ispitivanjeIVakoje je korišćeno u početnoj grupi doze od 800 mg PO svakih 12 h nakon koje sledi druga grupa doziranja od 1800 mg PO primenjenih svakih 12 h. Važno je naglasiti da je lek primenjivan u kapsuli i u kombinaciji sa ishranom sa visokim sadržajem masti da bi se povećala izloženost i nivoi u plazmi. Ispitivani lek je primenjivan 7 dana i jutro osmog dana. Subjekti su posmatrani 14 dana.
Rezultati ispitivanja (za 18 od 24 pacijenata koji primaju lek IVa)
Rezultati ispitivanja (za 18 od 24 pacijenata koji primaju lek IVa) 1. Kao što se može videti iz podataka za nivo doziranja od 800 mg u kombinaciji sa ishranom sa visokim sadržajem masti, zabeleženo je značajno antivirusno dejstvo. Međutim, samo 58% pacijenata je imalo >1.0 log pad virusnog titra. Jači antivirusni odgovor zabeležen je sa režimom doziranja od 1800 mg sa ishranom sa visokim sadržajem masti gde je srednji odgovor bio -.96 loglO pad virusnog titra. Ovi opodaci pokazuju da ovaj lek ima značajno antivirusno delovanje u dozama od 800 mg i 1800 mg (i prema tome između njih) svakih 12 časova u kombinaciji sa ishranom sa visokim sadržajem masti i prema tome može imati značajnu ulogu u kombinovanoj terapiji. Ažurirani prikaz rezultata sa BMS-043 kod ljudi može se dobiti pregledom apstrakta ili slajdova iz oralne prezentacije: "Antiviral Activitv, Safety, and Tolerability of a Novel. Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, BMS-488043, in HIV-I -Infected Subjects" G. Hanna, J. Lalezari, .1. Hellinger, D. Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadow, P-F. Lin, M. Giordano, R. Colonno, D. Grasela. Abstract J-32, 02/11/2004, llth Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA.
Nažalost, biće nepraktično da se ovaj lek primenjuje hronično u toku većeg broja meseci što uključuje primenu od ukupno 9 kapsula od 200 mg svaka, dva puta na dan u kombinaciji sa ishranom sa visokim sadržajem masti iz očiglednih zdravstvenih razloga tako da će biti potrebna nova formulacija koja obezbeđuje povećano izlaganje od niže doze i koja eliminiše potrebu za ishranom sa visokim sadržajem masti.
Prema tome, klinički podaci pokazuju da je neophodan postupak za poboljšanje izloženosti ovog leka od nižih doza i bez ishrane sa visokim sadržajem masti.
Prema tome, početni podaci o prolekovima ovog pronalaska iznenađujuće predviđaju da će oni poboljšati izloženost molekula kao što jeIVai da će dostaviti matične lekove u koncentracijama koje će omogućiti da se lekovi koriste u odsustvu ishrane sa visokim sadržajem masti, sa kapsulama sa manjom količinom leka, i hronično kao komponenta antivirusne terapije.
Početni rezultati dobijeni kod doziranja čvrstih kapusla bilo proleka Iab (lizin so) ili čvrstog matičnog molekula (IVa) kod pasa sažeti su u prvom histogramu na slici 2A. Kao što se može videti, posle doziranja proleka Iab (mono lizin so) bilo kod pasa koji su gladovali ili pasa čija je ishrana sadržala visok sadržaj masti, izloženost je iznenađujuće visoka u poređenju sa doziranjem matičnog molekula. Takođe, efekat ishrane u odnosu na stanje izgladnjivanja je minimalan ukoliko uopšte postoji kod proleka i sa druge strane nema očigledan efekat na izlaganje nakon doziranja čvrstog matičnog molekula. Tako, iznenađujuće, izlaganje matičnog molekula posle doziranja proleka, nc pokazuje nikakvu zavisnost od ishrane sa visokim sadržajem masti što predviđa konzistentnije nivoe izloženosti nakon doziranja nego što su oni kod matičnog molekula. Histogram na slici 2B sumira prethodno razmatrane rezultate kod ljudi za matični molekul IVa i pokazuje zavisnost izlaganja za molekul od ishrane sa visokim sadržajem masti, neproporcionalna povećanja izlaganja u odnosu na dozu, i bolje izlaganje kod doziranja rastvora nego kod doziranja čvrste formulacije. Kao što je razmatrano u daljem tekstu, ovo pokazuje izlaganje koje je ograničeno stopom rastvaranja ili stopom apsorpcije koje u prekliničkim modelima, izgleda da je iznenađujuće poboljšano preko upotrebe fosfatnog proleka. Upotreba fosfatnih prolekova takođe povećava izlaganje kod pasa u uslovima izgladnjivanja u odnosu na matični lek za druga dva proleka. Detaljni opis ovih eksperimenata dat je u eksperimentalnom đelu. Pored toga, detaljni prikaz različitih ispitivanja na pacovima, psima i majmunima za dva dodatna primera prolekova i kod pacova za druga dva proleka pokazuje iznenađujuću vrednost ovih prolekova za povećanje izloženosti u odnosu na one dobijene od matičnog molekula u dozama koje su u korelaciji sa onima koje se verovatno mogu iskoristiti u tečenju i inhibiciji replikacije HIV virusa.
111. Preparation of iridolvl-, azaindolyl-, and related heterocyclic sulfonylureidopiperazines for treatment of HIV and AIDS. Kadovv, John F.; Regueiro-Ren, Alicia; Xue, Qiufen May. PCT međunarodna prijava (2003), WO2004000210 A2.
112.Composition and antiviral activity of substituted azaindoloxoacetic piperazine derivatives.VVang, Tao; Zhang, Zhongxing; Meanwell, Nicholas A.; Kadovv, John F.; Yin, Zhivvei; Xue, Qiufen May: Regueiro-Ren, Alicia; Matiskella, John D.; Ueda, Yasutsugu. Objava U.S. prijave patenta (2004), US 2004110785A1.
REZIME PRONALASKA
Predstavljeni pronalazak sadrži jedinjenja formule I, njihove farmaceutske formulacije i njihovu primenu kod pacijenata koji pate od ili su podložni virusu kao stoje HIV. Jedinjenja formule I, koja obuhvataju njihove netoksične farmaceutski prihvatljive soli, imaju formulu i značenje kao što je opisano u daljem tekstu.
Predstavljeni pronalazak obuhvata jedinjenje formule 1,
gde:
X je C ili N uz uslov da kada je X jednako N, R<1>ne postoji;
W je C ili N uz uslov da kada je W jednako N, R<2>ne postoji;
VjeC;
R<1>je vodonik, metoksi ili halogen;
R2 je vodonik;
R<J>je metoksi ili heteroaril, pri čemu svaki od njih može biti izborno supstituisan sa jednim supstituentom koji je izabran od G; pri čemu je heteroaril triazolil, pirazolil ili oksadiazolil;
E je vodonik ili njegova farmaceutski prihvatljiva mono ili bis so;
Y je izabran iz grupe koju čine
Svako R<10>, R", R<12>,R13, R<1>4,R,s,R1<6>, R<17>nezavisno je H ili metil, uz uslov da su ne više od R10-R17 jednaka metil;
R je izabran iz grupe koju čine C(0)-fenil, C(0)-piridinil, piridinil, pirimidinil, hinolinil, izohinolinil, hinazolinil, hinoksalinil, naftiridinil, ftalazinil, azabenzofuril i azaindolil, pri čemu svaki od njih može biti nezavisno supstituisan sa od jedan do dva člana izabrana iz gaipe koju čine metil, -amino, -NHMe, -NMei, metoksi, hidroksimetil i halogen;
D je izabran iz grupe koju čine cijano, S(0)2R~ , halogen, C(0)NR~ R" , fenil i heteroaril; pri čemu je navedeni fenil ili heteroaril nezavisno izborno supstituisan sa jedan do tri ista ili različita halogena ili od jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana od G; pri Čemu je heteroaril izabran iz grupe koju čine piridinil i oksadiazolil;
A je izabran iz grupe koju čine fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil i oksazolil, gde su navedeni fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil i oksazolil nezavisno izborno supstituisani sa jedan do tri ista ili različita halogena ili od jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana od G;
G je izabran iz grupe koju čine (C|.6)alkil, (Ci.6)alkenil, fenil, hidroksi, metoksi, halogen, -NR<23>C(0)-(C,_6)alkiL -NR<24>R<25>, -S(0)2NR<24>R<25>, COOR<26>i -CONR<24>R<25>; gde j<e>navedeni (Ci-6)alkil izborno supstituisan sa hidroksi, dimetilamino ili jedan do tri ista ili različita halogena;
R26 je izabran iz grupe koju čine vodonik i (CVfjalkil;
Rzu, Rzl, R^; Rz\ R*\ R<z>>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, (C|_6)alkil i -(CH2)nNR<27>R<28>:
nje 0-6; i
svako R"' i R<rH>nezavisno su H ili metil.
Poželjniju varijantu predstavljaju jedinjenja iz prethodnog teksta gde:
Svako X i W su N:
ili jedinjenja iz prethodnog teksta gde:
XjeC;i
WjeN.
Sledeću poželjnu varijantu predstavljaju jedinjenja kao što je opisano u prethodnom tekstu gde:
R<,8>je-C(0)-Ph;i
Yje
Sledeću poželjnu varijantu predstavljaju jedinjenja kao što je opisano u prethodnom tekstu gde: R' je metoksi ili triazolil; gde je navedeni triazolil izborno supstituisan sa jednim supstituentom koji je izabran od G;
Svako R10-R17suH;i
G je metil.
Sledeću poželjnu varijantu predstavljaju jedinjenja kao što je opisano u prethodnom tekstu gde: R<l>je F, a R<J>je 1,2,3-triazolil vezan na položaju N-l.
Sledeću poželjnu varijantu predstavljaju jedinjenja kao što je opisano u prethodnom tekstu gde: R<1>je OMe, a R<3>je 3-metil-l ,2,4-triazolil vezan na položaju N-l.
Sledeću poželjnu varijantu predstavljaju jedinjenja kao što je opisano u prethodnom tekstu gde: svako R<1>i R<3>su metoksi.
Sledeću poželjnu varijantu predstavljaju jedinjenja kao što je opisano u prethodnom tekstu gde je so natrij um, lizin ili trometamin.
Sledeća poželjna varijanta pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antivirusnu efikasnu količinu jedinjenja formule I. uključujući njihove farmaceutski prihvatljive soli. i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, inertnih punilaca ili razblaživača.
Sledeća poželjna varijanta je farmaceutska kompozicija iz prethodnog teksta, korisna za tretman HIV infekcije, koja dodatno sadrži antivirusno efikasnu količinu sredstva za tretman SIDA-e izabran iz grupe koju čine: (a) antivirusno sredstvo (agens) protiv SIDA-e; (b) anti-infektivno sredstvo;
(c) imunomodulator; i
(d) inhibitori ulaska HlV-a.
Takode obuhvaćena varijantama je primena u proizvodnji leka za tretman sisara inficiranog HIV virusom, jedinjenja formule I, uključujući njegove farmaceutski prihvatljive soli ijedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, inertnih punilaca ili razblaživača.
Sledeća varijanta je primena opisana u prethodnom tekstu pri čemu je lek za primenu u kombinaciji sa antivirusno efikasnom količinom sredstva za tretman SIDA-e koje je izabrano iz grupe koju čine antivirusno sredstvo za tretman SIDA-e; anti-infektivno sredstvo, imunomodulator i inhibitor ulaska Hl V-a.
Sledeću varijantu predstavljaju intermeđijerna jedinjenja formule II, korisna za pripremu jedinjenja I,
gde:
X je C ili N uz uslov da kada je X jednako N, R<1>ne postoji;
W je C ili N uz uslov da kada je W jednako N, R<2>ne postoji ;
VjeC;
R1 je vodonik. metoksi ili halogen;
R2 je vodonik;
R3 je metoksi ili heteroaril pri čemu svaki od njih može biti izborno supstituisan sa jednim supstituentom koji je izabran od G; gde je heteroaril triazolil, pirazolil ili oksadiazolil;
L i M su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, C]-C6alkil, fenil, benzil, trialkilsilil, -2,2,2-trihloroetoksi i 2-trimetilsililetoksi uz uslov da ne više od jednog od L i M može biti vodonik;
Y je izabran iz grupe koju čine
Svako R<10>, R11, R<12>,R13, R<1>4,R15,R<16>, R<17>nezavisno su H ili metil, uz uslov da su ne više od dva od R^-R1<7>jednaka metil;
R<18>je izabran iz grupe koju čine C(0)-fenil, C(0)-piridinil, piridinil, pirimidinil, hinolinil, izohinolinil, hinazolinil, hinoksalinil, naftiridinil, ftalazinil, azabenzofuril i azaindolil, pri čemu svaki od njih može biti nezavisno supstituisan sa od jedan do dva člana izabrana iz grupe koju čine metil, -amino, -NHMe, -NMe2, metoksi, hidroksimetil i halogen;
D je izabran iz grupe koju čine cijano, S(0»)2R24, halogen, C(0)NR<2!>R<22>, fenil i heteroaril; pri čemu je navedeni fenil ili heteroaril nezavisno izborno supstituisan sa jedan do tri ista ili različita halogena ili od jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana od G; pri čemu je heteroaril izabran iz grupe koju čine piridinil i oksadiazolil;
A je izabran iz grupe koju čine fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil i oksazolil pri čemu su navedeni fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil i oksazolil nezavisno izborno supstituisani sa jedan do tri ista ili različita halogena ili od jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana od G;
G je izabran iz grupe koju čine (C|_(,)alkil, (C|-6)alkenil. fenil, hidroksi, metoksi, halogen, -NR<23>C(0)-(C,.6)alkil, -NR<24>R<25>, -S(0)2NR<24>R<25>. COOR<26>i -CONR<24>R<25>; pri čem<u>je navedeni (C[„6)alkil izborno supstituisan sa hidroksi, dimetilamino ili jedan do tri ista ili različita halogena;
R26 je izabran iz grupe koju čine vodonik i (Ci_6)alkil;
R<20>, R<2>', R<22>, R<23>, R<24>, R<23>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, (C).6)alkil i -(CH2)nNR<27>R<28>;
svako R<27>i R<28>nezavisno su H ili metil: i
nje 0-6.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 ilustruje AUC (površinu ispod krive) u odnosu na dozu u humanim kliničkim ispitivanjima za jedinjenje IVa.
Slika 2 ilustruje AUC za jedinjenje IVa i prolek Iab u uslovima gladovanja i uslovima sa ishranom u ispitivanjima na psima i ljudima.
Slika 3 ilustruje AUC za oralno IVc kod pacova prema dozi.
Slika 4 ilustruje Cmax za oralno IVc kod pacova prema dozi.
Slika 5 ilustruje profile plazme za IVc kod pacova posle oralnog doziranja Ic.
Slika 6 ilustruje poređenje IVa Cmax i AUC kod mužjaka pacova kojima je dat IVa ili Iab.
Slika 7 ilustruje poređenje IVa Cmax i AUC kod pacova kojima je dat IVa ili Iab.
Slika 8 ilustruje hidrolizu Iab u humanim placentalnim ALP rastvorima i formiranje IVa.
Slika 9 ilustruje profile koncentracije u plazmi Iab i IVa prema vremenu posle intravenozne i oralne primene Iab kod pacova i iz ranijih podataka za IVa kod pacova.
Slika 10 ilustruje profile koncentracije Iab i IVa u plazmi prema vremenu posle intravenozne i oralne primene lab kod pasa i iz ranijih podataka za IVa kod pasa.
Slika 11 ilustruje profile koncentracije Iab i IVa u plazmi prema vremenu posle intravenozne i oralne primene Iab kod majmuna i iz ranijih podataka za IVa kod majmuna.
Slika 12 ilustruje poređenje IVb Cmax i AUC kod mužjaka pacova kojima je davan IVb ili Ibb.
Slika 13 ilustruje poređenje IVb Cmax i AUC kod pasa kojima je davan IVb ili Ibb.
Slika 14 ilustruje hidrolizu Ibb u humanim placentalnim ALP rastvorima i formiranje IVb.
Slika 15 ilustruje koncentraciju u plazmi prema vremenskim profilima za Ibb i IVb posle intravenozne i oralne primene Ibb kod pacova i ranije podatke za IVb kod pacova.
Slika 16 ilustruje koncentraciju u plazmi prema vremenskim profilima Ibb i IVb posle intravenozne i oralne primene Ibb kod pasa i ranije podatke za IVb kod pasa.
Slika 17 ilustruje koncentraciju u plazmi prema vremenskim profilima Ibb i IVb posle intravenozne i oralne primene Ibb kod majmuna i ranije podatke za IVb kod majmuna.
Slika 18 ilustruje poređenje IVc Cmax i AUC kod mužjaka pacova kojima je davan IVc ili Icb.
Slika 19 ilustruje poređenje IVc Cmax i AUC kod pasa kojima je davan IVc ili Icb.
Slika 20 ilustruje hidrolizu Icb u humanim placentalnim ALP rastvorima i formiranje IVc.
Slika 21 ilustruje profile koncentracije Icb i IVc u plazmi prema vremenu posle intravenozne i oralne primene Icb kod pacova i ranije podatke za IVc kod pacova.
Slika 22 ilustruje profile koncentracije Icb i IVc u plazmi prema vremenu posle intravenozne i oralne primene Icb kod pasa i ranije podatke za IVc kod pasa.
Slika 23 ilustruje profile koncentracije Icb i IVc u plazmi prema vremenu posle intravenozne i oralne primene Icb kod majmuna i ranije podatke za IVc kod majmuna.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
S obzirom da jedinjenja predstavljenog pronalaska mogu da poseduju asimetrične centre i prema tome da se javljaju kao smeše diastereomera i enantiomera, predstavljeni pronalazak obuhvata pojedinačne diastereoizomerne i enantiomerne oblike oblike jedinjenja formule I pored njihovih smeša.
DEFINICIJE
Termin "Ci-6alkil" kao što je korišćen ovde i u patentnim zahtevima (osim ukoliko nije drugačije naznačeno) označava pravolančane ili granate alkil grupe kao što su metil, etil, propil, izopropil, butil, izobutil, t-butii, amil, heksil i slično.
"Halogen" označava hlor, brom, jod ili fluor.
"Ani" grupa označava ugljenikove monociklične ili policiklične grupe sa fuzionisanim prstenom (tj., prstenove koji dele susedne parove ugljenikovih atoma) koje imaju potpuno konjugovan sistem pi elektrona. Primeri aril grupa, bez ograničenja, su fenil, naftalenil i antracenil. Aril grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana. Kada je supstituisana, grupa (grupe) supstituenti je poželjno jedna ili više izabranih od alkil, cikloalkil. aril, heteroaril, heteroaliciklična grupa, hidroksi, alkoksi, ariloksi, heteroariloksi, heteroalicikloksi, tiohidroksi, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheteroalicikloksi, cijano. halogen, nitro. karbonil, O-karbamil, N-karbamil, C-amido. N-amido, C-karboksi. O-karboksi. sulfinil, sulfonil, sulfonamido, trihalometil, ureido, amino i -NR<x>R<y.>gde su R<*>i R' nezavisno izabrani iz grupe
koju čine vodonik, alkil, cikloalkil, aril, karbonil, C-karboksi, sulfonil, trihalometili kombinovani, pet- ili šesto-člani heteroaliciklični prsten.
Kao što je ovde korišćena, "heteroaril" grupa označava grupe sa monocikličnim ili fuzionisanim prstenom (tj., prstenove koji dele susedni par atoma) koje u prstenu (prstenovima) imaju jedan ili više atoma izabranih iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor i, pored toga, imaju potpuno konjugovan sistem pi elektrona. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, heteroaril grupa može biti vezana na ugljenikovom ili azotovom atomu unutar heteroaril grupe. Potrebno je naglasiti da termin heteroaril obuhvata N-oksid matičnog heteroarila ako je takav N-oksid hemijski pogodan kao što je poznato u tehnici. Primeri heteroaril grupa, bez ograničenja, su furil. tienil, benzotienil, tiazolil, imidazolil, oksazolil, oksadiazolil, tiadiazolil, benzotiazolil. triazolil, tetrazolil, izoksazolil, izotiazolil, pirolil. piranil, tetrahidropiranil, pirazolil, piridil, pirimidinil, hinolinil, izohinolinil, purinil, karbazolil, benzoksazolil, benzimidazolil, indolil, izoindolil, pirazinil, diazinil, pirazin, triaziniltriazin, tetrazinil i tetrazolil. Kada je supstituisana tada je poželjno supstituisana grupa (grupe) jedna ili više izabranih od alkil, cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklične grupe, hidroksi, alkoksi. ariloksi, heteroariloksi, heteroalicikloksi, tiohidroksi, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheteroalicikloksi, cijano, halogen, nitro, karbonil, O-karbamil, N-karbamil, C-amido, N-amido, C-karboksi, O-karboksi, sulfinil, sulfonil, sulfonamido, trihalometil, ureido, amino i -NRXR\ gde su R<x>i R- kao što je određeno u prethodnom tekstu.
Kao stoje ovde korišćena, "heteroaliciklična" grupa označava grupu sa monocikličnim ili fuzionisanim prstenom koja u prstenu (prstenovima) ima jedan ili više atoma izabrana iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor. Prstenovi su izabrani od onih koji obezbeđuju stabilno uređenje veza i ne obuhvataju sisteme koji ne postoje. Prstenovi takođe mogu da imaju jednu ili više dvogubih veza. Međutim, prstenovi nemaju potpuno konjugovan sistem pi elektrona. Primeri heteroalicikličnih grupa, bez ograničenja, su azetidinil, piperiđil, piperazinil, imidazolinil, tiazoliđinil, 3-pirolidin-l-il, morfolinil, tiomorfolinil i tetrahidropiranil. Kada je supstituisana. grupa (grupe) supstituenti su poželjno jedna ili više izabranih od alkil, cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklične grupe, hidroksi, alkoksi, ariloksi, heteroariloksi, heteroalicikloksi. tiohidroksi, tioalkoksi, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheteroalicikloksi, cijano, halogen, nitro, karbonil, tiokarbonil, O-karbamil. N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, C-tioamido, N-amido, C-karboksi, O-karboksi, sulfinil, sulfonil, sulfonamido, trihalometanesulfonamido. trihalometanesulfonil, silil, guanil. guanidino, ureido, fosfonil, amino i -NR<N>R<y>, gde su R<x>i R<5>kao što je određeno u prethodnom tekstu.
"Alkil" grupa označava zasićeni alifatiČni ugljovodonik uključujući grupe sa pravim ili granatim lancem. Poželjno, alkil grupa ima 1 do 20 atoma ugljenika (uvek kada je ovde naveden brojčani opseg; npr.. "1-20", on označava da grupa, u ovom slučaju alkil grupa može sadržati 1 ugljenikov atom, 2 ugljenikova atoma, 3 ugljenikova atoma, itd. sve do, i uključujući, 20 ugljenikovih atoma). Poželjnije, to je alkil srednje veličine koji ima 1 do 10 atoma ugljenika. Najpoželjnije, to je niži alkil koji ima 1 do 4 atoma ugljenika. Alkil grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana. Kada je supstituisana, grupa (grupe) supstituent je poželjno jedna ili više nezavisno izabranih od trihaloalkil, cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklične grupe, hidroksi, alkoksi, ariloksi. heteroariloksi, heteroalicikloksi, tiohidroksi, tioalkoksi, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheteroalicikloksi, cijano, halo, nitro, karbonil, tiokarbonil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, C-tioamido, N-amido, C-karboksi, O-karboksi, sulfinill, sulfonil, sulfonamido, trihalometansulfonamido, trihalometansulfonil i kombinovani, pet- ili šesto-člani heteroaliciklični prsten.
"Cikloalkil" grupa označava grupu sa monocikličnim ili fuzionisanim prstenom sa svim ugljenicima (tj., prstenove koji dele susedni par ugljenikovih atoma) u kojoj jedan ili više prstenova nemaju potpuno konjugovani sistem pi elektrona. Primeri cikloalkil grupa, bez ograničenja, su ciklopropan. ciklobutan, ciklopentan, ciklopenten, cikloheksan, cikloheksadien, cikloheptan, cikloheptatrien i adamantan. Cikloalkil grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana. Kada je supstituisana, grupa (grupe) supstituenti je poželjno jedna ili više pojedinačno izabrana od alkil, aril, heteroaril, heteroaliciklične grupe, hidroksi, alkoksi, ariloksi, heteroariloksi, heteroalicikloksi, tiohidroksi, tioalkoksi, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheteroalicikloksi. cijano, halo, nitro, karbonil, tiokarbonil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil. C-amido, C-tioamido, N-amido, C-karboksi, O-karboksi, sulfinil, sulfonil, sulfonamido, trihalo- metanesulfonamido, trihalometansulfonil, silil, guanil, guanidino, ureido, fosfonil, amino i -NR<x>R<y>sa Rx i R<y>kao što je određeno u prethodnom tekstu..
"Alkenil" grupa označava alkil grupu, kao što je ovde određena, koja se sastoji najmanje od dva atoma ugljenika i najmanje jedne ugljenik-ugljenik dvogube veze.
"Alkinil" grupa označava alkil grupu, kao što je ovde određeno, koja se sastoji od najmanje dva ugljenikova atoma i najmanje jedne ugljenik-ugljenik trogube veze.
"Hidroksi'* grupa označava -OH grupu.
"Alkoksi" grupa označava kako -O-alkil tako i -O-cikloalkil grupu kao što je ovde određeno.
"Ariloksi" grupa označava kako -O-aril tako i -O-heteroaril grupu, kao što je ovde određeno.
"Heteroariloksi" grupa označava heteroaril-O- grupu sa heteroaril grupom kao što je ovde određeno.
"Heteroalicikloksi" grupa označava heteroalicikličnu-O- grupu sa heteroalickličnom grupom kao što je ovde određeno.
"Tiohidroksi'' grupa označava -SH grupu.
"Tioalkoksi" grupa označava kako S-alkil tako i -S-cikloalkil grupu, kao što je ovde određeno.
"Tioariloksi" grupa označava kako -S-aril tako i -S-heteroaril grupu, kao što je ovde određeno.
"Tioheteroariloksi" grupa označava heteroaril-S- grupu sa heteroaril grupom kao što je ovde određeno.
"Tioheteroalicikloksi" grupa označava heteroalicikličnu-S- grupu sa heteroalicikličnom grupom kao što je ovde određeno.
"Karbonil" grupa označava -C(=0)-R" grupu, gde je R" izabran iz grupe koju čine vodonik, alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, aril, heteroaril (vezan preko ugljenika u prstenu) i heteroaliciklična grupa (vezana preko ugljenika iz prstena), pri čemu je svaka od njih kao što je ovde određeno.
"Aldehidna" grupa označava karbonil grupu gde je R" vodonik.
"Tiokarbonil" grupa označava -C(=S)-R" grupu, sa R" kao što je ovde određeno.
"Keto" grupa označava -CC(=0)C- grupu u kojoj ugljenik na jednoj ili obe strane C=0 može biti alkil, cikloalkil, aril ili ugljenik heteroaril ili heteroaliaciklične grupe.
"Trihalometankarbonil" grupa označava Z:,CC(=0)- grupu gde je navedeni Z halogen. "C-karboksi" grupa označava -C(=0)0-R" grupe, sa R" kao što je ovde određeno. "O-karboksi" grupa označava R'TT^OJO-grupu, sa R" kao što je ovde određeno. Grupa "karboksilne kiseline" označava C-karboksi grupu u kojoj je R" vodonik.
"Trihalometil" grupa označava -CZ3grupu u kojoj je Z halogen grupa kao što je ovde određeno.
"Trihalometansulfonil" grupa označava Z3CS(=0)2- grupa sa Z kao što je određeno u prethodnom tekstu.
"Trihalometansulfonamido" grupa označava Z3CS(=0)2NRX- grupu sa Z i R<x>kao što su ovde određeni.
"Sulfinil" grupa označava -S(=0)-R" grupu, sa R" kao što je ovde određeno i, pored toga, samo kao veza tj. -S(O)-.
A "sulfonil" grupa označava -S(=0)2R" grupu sa R" kao što je ovde određeno i, pored toga samo kao veza tj. -S(0)2".
"S-sulfonamido" grupa označava-S(=0)?NR<x>R<y>, sa R<x>i R<y>kao što je ovde određeno.
"N-Sulfonamido" grupa označava R"S(=0)2NRx- grupu sa Rxkao što je ovde određeno.
"O-karbamil" grupa označava -OC(=0)NR<x>R<y>kao što je ovde određeno.
"N-karbamil" grupa označava R<x>OC(=0)NR<y>grupu, sa R<x>i R<y>kao što je ovde određeno.
"O-tiokarbamil" grupa označava -OC(=S)NRxRy grupu sa R<x>i R<y>kao što je ovde određeno.
"N-tiokarbamil" grupa označava R<x>OC(=S)NR<y->grupu sa R<x>i R<y>kao što je ovde određeno.
"Amino" grupa označava -NH2grupu.
"C-amido" grupa označava -C(=0)NR<x>R<y>grupu sa R<x>i R5, kao što je ovde određeno.
"C-tioamido" grupa označava -C(=S)NR<x>R<y>grupu, sa R<x>i R<y>kao što je ovde određeno.
"N-amido" grupa označava R<x>C(=0)NR<y->grupu, sa R<x>i R<y>kao što je ovde određeno.
"Ureido" grupa označava -NR<x>C(=0)NR<y>R<y2>grupu sa R<x>i R<y>kao što je ovde određeno i R<y2>označava isto kao R<x>i R<y>.
"Tioureido" grupa označava -NR<x>C(=S)NR<v>R<y2>grupu sa R<x>i R} kao što je ovde određeno i R<y2>označava isto kao R<x>i R<y>.
"Guanidino" grupa označava -R<x>NC(=N)NR<>>R<y2>grupu, sa R\ R<y>i R<y2>kao stoje ovde određeno.
"Guanil" grupa označava R<x>R<y>NC(=N)- grupu, sa R<x>i R<y>kao što je ovde određeno. "Cijano" grupa označava -CN grupu.
"Silil" grupa označava -Si(R")3, sa R" kao što je ovde određeno.
"Fosforni" grupa označava P(=0)(OR<x>)2sa Rx kao što je ovde određeno.
"Hidrazino" grupa označava -NR<x>NR<y>R<y2>grupu sa R\ R<y>i R<y2>kao što je ovde određeno.
Svake dve susedne R grupe se mogu kombinovati tako da formiraju dodatni aril, cikloalkil, heteroaril ili heteroeklični prsten luzionisan za prsten koji početno nosi ove R grupe.
U tehnici je poznato da atomi azota u heteroaril sistemima mogu da "učestvuju u dvoguboj vezi heteroaril prstena", i ovo se odnosi na oblik dvogubih veza u dve tautomeme strukture koje sadrže heteroaril grupe sa prstenom od pet članova. Ovo određuje da li azoti mogu biti supstituisani kao što je dobro poznato u tehnici. Opis i patentni zahtevi predstavljenog pronalaska su zasnovani na poznatim opštim principima hemijske veze. Razume se da patentni zahtevi ne obuhvataju strukture za koje je prema literaturi poznato da su nestabilne ili ne mogu postojati. Fiziološki prihvatljive soli jedinjenja prolekova opisanih ovde su u okviru obima ovog pronalaska. Termin "farmaceutski prihvatljiva so" kao što je korišćen ovde i u patentnim zahtevima obuhvata netoksične bazne adicione soli. Termin "farmaceutski prihvatljiva so" kao što je ovde korišćen takođe obuhvata soli kiselih grupa, kao što su karboksilat, fosfat ili fosfat mono estar, sa takvim protivjonima kao što su amonijum, soli alkalnih metala, naročito natrij uma ili kalijuma, soli zemnoalkalnih metala, naročito kalcijuma ili magnezijuma, soli prelaznih metala kao što su soli cinka i soli sa pogodnim organskim bazama kao što su niži alkilamini (metilamin, etilamin, cikloheksilamin i slično) ili sa supstituisanim nižim aikilaminima (npr. hidroksil-supstituisani alkilamini kao što su dietanolamin, trietanolamin ili mono trometamin (takođe pod nazivom TRIS ili 2-amino-2- (hidroksimetil)propan-l,3-diol) tris(hidroksimetil)-aminometan). lizin, arginin, histidin, N-metilglukamin ili sa bazama kao što su piperidin ili morfolin. Razume se da farmaceutski prihvatljive soli, kada su izolovane u čvrstom ili kristalnom obliku, takođe obuhvataju hidrate ili molekule vode zarobljene unutar dobijenog jedinjenja I. Stehiometrijske mogućnosti su dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti tehnike. Razmatranje farmaceutski prihvatljivih soli i spiskovi mogućih soli sadržani su u sledećim radovima:Preparation of \ vater~ soluble compounds ihrough saJt formation.Stahl, P. Heinrich. Cosmas Consult, Freiburg im Breisgau, Germanv. Editor(s): Wermuth, Camille Georges. Practice of Medicinal Chemistrv (2nd Edition) (2003), 601-615. Publisher: Elsevier, London, UK CODEN: 69EOEZ.
Handbook of pharmaceutical salts: properties, selection, and use by Stahl, P. Heinrich, Wermuth, Camille G., International Union of Pure anđ Applied Chemistry. Weinheim; New York: VHCA; Wiley-VCH. 2002.
U sledećem aspektu pronalaska, opisana su nova intermedijerna jedinjenja 11 fosfatnih estara.
U slučaju fosfatnih estara, postoji mogućnost da to budu mono ili bis i obe varijante su pokrivene ovim pronalaskom.
Kao što je ovde korišćen. termin "antivirusno efikasna količina" označava ukupnu količinu svake aktivne komponente postupka koja je dovoljna da pokaže značajnu dobit za pacijenta, tj., lečenje akutnih stanja koje karakteriše inhibicija HIV infekcije. Kada se primenjuje na pojedinačni aktivni sastojak, koji se koristi sam, ovaj termin označava taj sastojak sam. Kada se koristi za kombinaciju, ovaj termin označava kombinovane količine aktivnih sastojaka koje imaju za rezultat terapeutski efekat, bilo primenjene u kombinaciji, serijski ili istovremeno. Termini "lečenje, tretman, tretirati" kao što su korišćeni ovde i u patentnim zahtevima označavaju prevenciju ili olakšavanje bolesti povezanih sa HIV infekcijom.
Predstavljeni pronalazak je takođe usmeren na kombinacije jedinjenja sa jednim ili više sredstava korisnih u lečenje SIDA-e. Na primer, jedinjenja ovog pronalaska mogu se efikasno primenjivati, bilo u periodima pre i/ili posle izlaganja, u kombinaciji sa efikasnim količinama antivirusnih sredstava protiv SIDA-e, imunomodulatorima, antiinfektivnim sredstvima ili vakcinama, kao što su oni u sledećoj tabeli.
ANTIVJRUSNA SREDSTVA
Pored toga, jedinjenja pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa drugom klasom sredstava za tretman SIDA-e koja se nazivaju inhibitori ulaska HlV-a. Primeri takvih inhibitora ulaska HlV-a razmatrani su u DRUGS OF THE FUTURE 1999, 24(12), pp. 1355-1362; CELL, Vol. 9, pp. 243-246, Oct. 29. 1999; i DRUG DISCOVERY TODAY, Vol. 5, No. 5. May 2000, pp. 183-194 iInhibitors of the entry of HIV into host cells.Meanvvell, Nicholas A.; Kadovv, John F.Current Opinion in Drug Discovery & Development (2003), 6(4). 451-461. Posebno se jedinjenja mogu koristiti u kombinaciji sa drugim inhibitorima vezivanja, fuzionim inhibitorima i antagonistima receptora za hcmokin kojima su ciljne strukture CCR5 ili CXCR4 koreceptor.
Biće jasno da obim kombinacija jedinjenja ovog pronalaska sa antivirusnim sredstvima protiv SIDA-e, imunomodulatorima, antiinfektivnim sredstvima, inhibitorima ulaska HlV-a ili vakcinama nije ograničen na spisak dat u prethodnoj tabeli, ali uključuje, u principu, svaku kombinaciju sa svakom farmaceutskom kombinacijom korisnom za tretman SIDA-e.
Poželjne kombinacije su istovremeni ili naizmenični tretmani sa jedinjenjem predstavljenog pronalaska i inhibitorom HIV proteaze i/ili nenukleozidnim inhibitorom HIV reverzne transkriptaze. Izborna četvrta komponenta u kombinaciji je nukleozidni inhibitor HIV reverzne transkriptaze, kao što je AZT, 3TC, ddC ili ddl. Poželjan inhibitor HIV proteaze je Revataz® (aktivni sastojak Atazanavir). Obično se doza od 300 do 600 mg primenjuje jednom na dan. Ovo se može istovremeno primeniti sa niskom dozom Ritonavira (50 do 500 mg). Sledeći poželjan inhibitor HIV proteaze je Kaletra®. Sledeći koristan inhibitor HIV proteaze je indinavir, koji je sulfatna so N-(2(R)-hidroksi-l-(S)-indanil)-2(R)-fenilmetil-4-(S)-hidroksi-5-(l-(4-(3-piridil-metil)-2(S)-N'-(t- butilkarboksamido)-piperazinil)) -pentaneamid etanolat, i sintetisan je prema U.S. 5,413,999. Indinavir se generalno primenjuje u dozi od 800 mg tri puta na dan. Drugi poželjni inhibitori proteaze su nelfmavir i ritonavir. Sledeći poželjan inhibitor HIV proteaze je sahinavir koji seprimenjuje u dozi od 600 ili 1200 mg tri puta na dan. Poželjni nenukleozidni inhibitori HIV reverzne transkriptaze obuhvataju efavirenc. Pripreme ddC, ddl i AZT takođe su opisane u EPO 0,484,071. Ove kombinacije mogu imati neočekivane efekte na ograničavanje brzine i stepena HIV infekcije. Poželjne kombinacije obuhvataju one sa sledećim (1) indinavir sa efavirencom, i, izborno, AZT i/ili 3TC i/ili ddl i/ili ddC; (2) indinavir, i svaki od AZT i/ili ddl i/ili ddC i/ili 3TC, naročito, indinavir i AZT i 3TC; (3) stavudin i 3TC i/ili zidovudin; (4) zidovudin i lamivudin i 141W94 i 1592U89; (5) zidovudin i lamivudin.
U takvim kombinacijama jedinjenje predstavljenog pronalaska i druga aktivna sredstva mogu se primeniti odvojeno ili zajedno. Pored toga, primena jednog elementa može biti pre, istovremeno sa, ili nakon primene drugog sredstva (sredstava).
SKRAĆENICE
Sledeće skraćenice, od kojih su većina uobičajene skraćenice dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti tehnike, koriste se u opisu pronalaska i u primerima. Neke od korišćenih skraćenica su sledeće:
h čas (časovi)
r.t. sobna temperatura
mol mol(molovi)
mmol milimol (milimoli)
g gram (grami)
mg miligram (miligrami)
itiL mililitar (mililitar)
TFA trifluorosirćetna kiselina
DCE 1,2-dihloretan
CH2CI2dihlormetan
TPAP tetrapropilamonijum perutenat
THF tetrahidrofuran
DEPBT 3-(Diethoksifosforiloksi)-l,2,3-benzotriazin-4(3H)-on
DMAP 4-dimetilaminopiridin
P-EDC 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid sa polimernom podlogom EDC 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid
DMF 7V,A'-dimetiIformamid
Hunig baza A^N-Duzopropiletilamin
MCPBA meto-hlorperbenzojeva kiselina
Azaindol l//-pirolo-piridin
4- azaindol l//-pirolo[3,2-/V]piridin
5- azaindol 1 //-pirolo[3,2-c]piridin
6- azaindol l//-pirolo[2,3-c]piridin
7- azaindol 1 //-pirolo[2,3-6]piridin
4,6-diazaindol 5//-pirolo[3,2-c/]pirimidin
5.6- diazaindol l//-pirolo[2,3-ć/jpiridazin
5.7- diazaindol 7//-pirolo[2,3-c/Jpirimidin
PMB 4-metoksibenzil
DDQ 2,3-dihloro-5,6-dicijano-l,4-benzohinon
OTf Trifluorometansulfonoksi
NMM 4-Metilmorfolin
PIP-COPh 1-Benzoilpiperazin
NaI TMDS natrij um heksametildisilazid
EDAC l-(3-Dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid
TMS Trimetilsilil
DCM Dihlorometan
DCE Dihloroetan
MeOFl Metanol
THF Tetrahidrofuran
EtOAc Etil acetat
LDA litijum diizopropilamid
TMP-Li 2,2,6,6-tetrametilpiperidinil litijum
DME Dimetoksietan
DIBALH Diizobutilaluminijum hidrid
HOBT 1-hidroksibenzotriazol
CBZ Benziloksikarbonil
PCC Piridinijum hlorohromat
TRIS Trometamin ili 2-amino-2-(hidroksimetil)propan-1,3-diol
HEMIJSKI POSTUPCI
Predstavljeni pronalazak sadrži jedinjenja formule I, njihove farmaceutske formulacije i njihovu primenu kod pacijenata koji pate od ili su podložni HIV infekciji.
Sema A prikazuje pregled postupka za pripremanje proleka I prema pronalasku od matičnih molekula IV
Da bi se postupak izveo, kao što je prikazano na Šemi A, antivirusno matično jedinjenje koje nas zanima, IV, je konvertovano u fosfatni intermedijer II, N-alkilacijom sa hloridnim intermedijerom III, u prisustvu pogodne baze kao što je natrijum hidrid, kalijum hidrid, natrijum amid, natrijum t-butoksid, natrijum (bis trimetilsilil) amid, kalijum (bis trimetil silil) amid ili njihove kombinacije kao što je natrijum hidrid plus natrijum bis (trimetilsilil) amid. Priprema reagensa III i metodologija za primenu u pripremi prolekova alkilacijom hidroksi grupa opisana je u Y. Ueda et.al. U.S. Patent 6,362,172B2 koji je uključen na osnovu reference u celini. Uslovi alkilacije, zaštitne grupe, uklanjanje zaštitne grupe i uslovi za formiranje soli su generalno primenljivi na našu prijavu, uprkos činjenici što mi vršimo alkilaciju azaindola u indolnom prstenu pre nego hidroksi grupe. U ovoj prijavi može se koristiti od 1.1 do 5.0 ekvivalenata baze, pri čemu je poželjno između 2 i 4 ekvivalenta. Može se koristiti od 1.1 do 12 ekvivalenata reagensa III, pri čemu je poželjno 5 do 10 u zavisnosti od supstrata. Reagens može biti dodat u jednom delu ili se može postepeno povećavati u nekoliko delova u toku vremena. Izvor jodidnog jona obično se dodaje u reakciju da bi se obezbedili povećani prinosi. Elementarni jod je trenutno poželjan kao izvor jodida. 0.1 do 1.5 ekvivalenata joda se obično dodaje po azaindol/indol NH koji se alkiluje, s tim da je poželjnije korišćenje 1.0 do 1.2 ekvivalenata joda jer su prinosi najveći. Alternativni izvori joda obuhvataju, na primer, natrijum jodid, litijum jodid, cezijum jodid, bakar jodid ili tetrabutil amonijum jodid. Funkcija joda je verovatno da stvori odgovarajući jodometil reagens lilain situod hloro metil reagensa 111. Jodo ili bromo reagensi koji odgovaraju III mogli bi se verovatno koristiti direktno u reakciji umesto hlorida III. Reakcija alkilacije iz koraka A obično se izvodi u inertnom organskom rastvaraču kao što je tetrahidrofuran na temperaturi ođ oko 0°C do 50°C poželjnije između 20°C i 400°C. Mogu se koristiti i drugi anhidrovani organski rastvarači kao što su metil tetrahidrofuran, metil t-butil etar, dioksan, etilen glikol dimetil etar, dimetil acetamid ili N,N-đimetilformamid. Estarski intermedijer II se zatim podvrgava koraku uobičajene deprotekcije kako bi se uklonile zaštitne grupe Pr. Reagensi korišćeni u takvom koraku zavisiće ođ korišćene zaštitne grupe, ali biće dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti tehnike. Najpoželjnija zaštitna grupa je t-butil grupa koja se može ukloniti sa trifluorosirćetnom kiselinom, hlorovodoničnom kiselinom ili mravljom kiselinom u odgovarajućem inertnom organskom rastvaraču. Inertni rastvarač može biti dihlormetan, ili moguće, na primer, dihlorctan, toluen ili trifluorometil benzol. U metilen hloridu, deprotekcija trifluorosirćetnom kiselinom može se postići primenom od 1 do 15 ekvivalenata kiseline (ili se kiselina može meriti drugačije kao na primer 5% rastvor u rastvaraču po zapremini) i temperaturama od između 0°C i 40°C. Uopšteno, što se više koristi TFA, to se koristi niža temperatura. Tačni uslovi variraju sa supstratom. Korak 3 opisuje izolaciju slobodne kiseline ili soli koji se mogu formirati preko mnogih standardnih načina koji su dobro poznati u tehnici. Uopšteno, posle uklanjanja zaštitne grupe TFA. koristi se obrada vodom gde se višak kiseline neutralizuje bazom i organske nečistoće se uklanjaju ekstrakcijom sa organskim rastvaračem kao što je etil acetat ili dihlormetan. Na primer, višak vodenog rastvora NaOH može se koristiti za bazifikaciju reakcione smeše. Ovo je dobro poznato svakom hemičaru koji je tehnički kvalifikovan. Ponovno zakišeljavanje vodene faze do pH vrednosti od 2.5 sa vodenim IN HC1 i zatim ekstrakcija sa organskim rastvaračem daće, posle uklanjanja rastvaračain vacuo,slobodnu kiselinu. Slobodna kiselina se može konvertovati u neorganske soli dodavanjem odgovarajućih baza u rastvarače kao što su voda, metanol, etanol, itd. Na primer, dodavanje natrijum karbonata u vodeni rastvor fosfatnog proleka i podešavanje pH vrednosti po približno 7.6 daje rastvor koji posle uklanjanja vode preko liofilizacije daje dinatrijum so proleka. Na sličan način se može koristiti kalijum karbonat. Vodeni rastvori natrijum bikarbonata ili kalijum bikarbonata mogu se koristiti na sličan način. Mono kalijum ili mono natrijum soli mogu se pripremiti pažljivom titracijom rastvora fosfatne kiseline sa kalijum ili natrijum 2-etil heksanoatom. Amin soli se mogu pripremiti rastvaranjem slobodne kiseline u organskim rastvaračima kao što je etil acetat ili acetonitril ili alkoholi niske molekulske mase ili smeše ovih rastvarača koje izborno sadrže vodu. Neki amini koji su potencijalno korisni za formiranje soli obuhvataju: niže alkilamine (metilamin, etilamin, cikloheksilamin i slično) ili supstituisane niže alkilamine (npr. hidroksil-supstituisane alkilamine kao što su dietanolamin, trietanolamin ili tris(hidroksimetil)-aminometan), lizin, arginin. histidin, N-metilglukamin ili baze kao što je piperidin ili morfolin. Sporo dodavanje amina u mešajući rastvor na niskoj temperaturi može dati bilo mono ili bis amin so u zavisnosti od stehiometrije. Soli amina se takođe mogu dobiti mešanjem rastvora i uklanjanjem rastvaračain vacuopre nego kristalizacijom ili taloženjem. Postupci rekristalizacije zavisiće od jedinjenja i soli, ali su dostupni stručnjaku iz ove oblasti tehnike. Sema B prikazje poželjnu sekvencu i grupu reagenasa i uslova za izvođenje opšte sekvence prikazane u Scmi A. Može se koristiti alternativni i u mnogim slučajevima poželjan postupak za izvođenje sekvence u koraku C koja obuhvata uklanjanje zaštitne grupe diestra da bi se dobila intermedijerna kiselinain silu,nakon čega sledi formiranje soli u reakcionom medij umu. Na primer, zagrevanje diestra II u smeši vode i u vodi rastvorljivog korastvarača kao što je na primer aceton, metanol, etanol ili izopropanol može da proizvede slobodnu kiselinu I u reakcionom medijumu( in silu).Poželjan rastvarač je aceton i izopropanol. Mogu se koristiti temperature između temperature sredine i tačaka ključanja rastvarača. U poželjnom opsegu je obično 40°C do 60° C. Dodavanje baze ili poželjnije amina kao što je opisano u prethodnom tekstu u rekcionu smešu koja sadrži slobodnu kiselinu u vodi i korastvarač može da proizvede so direktno. Ako su izabrani odgovarjući uslovi, so može da se iskristališe ili istaloži direktno iz reakcionog medijuma i da se izoluje filtracijom i sušenjem. Posebni primeri su sadržani u eksperimentalnom delu.
Poželjan postupak pripreme intermedijera Ha, Ilb i IIc i kiselina Iac, Ibc i Ic nudi određen broj značajnih prednosti u odnosu na postupke koji se koriste na početku za pripremu Ha, Ilb i IIc u toku istraživanja. Početni otkriveni načini za pripremu sva tri intermedijera II koristili su pripremu di-tercbutil hlormetil fosfata koji je zahtevao upotrebu relativno skupog tetrabutilamonijum di terc-butil fosfata koji je reagovao sa viškom od 10 puta skupog i potencijalno opasnog hlorjodometana. Višak isparijivih materija i jodometana je uklonjenin vacuoda bi se dobio sirovi reagens koji je upotrebljen bez dodatnog prečišćavanja. Višak od najmanje 5 puta ovog reagensa je upotrebljen za reakciju sa jedinjenjima IV što znači daje najmanje 5 ekvivalenata tetrabutilamonijum fofata i 50 ekvivalenata hlorjodometana upotrebljeno u poređenju sa količinama bilo IVa, b ili c. Pored toga, alkilacija jedinjenja IV sa ovim reagensom postignuta je primenom NaH kao baze i joda kao aditiva da bi se potpomogla alkilacija. Ovi uslovi su proizveli reakcionu smešu koja sadrži željeni proizvod II kao glavni proizvod i sporedne proizvode koji su uklonjeni primenom hromatografije na silika gelu, zamornu, vremenski zhatevnu i skup postupak posebno kod reakcija sa tendencijom povećavanja razmere. Nemogućnost uklanjanja sporednih proizvoda rezultovaio je u proizvodima I iz narednog koraka, a uklanjanje zaštitnih grupa koje su sadržavale nečistoće bilo je veoma teško na zadovoljavajući način bilo u pogledu zadovoljavajućeg prinosa ili utrošenog vremena
Poboljšana priprema di-tercbutil hlormetil fosfata koristi jeftiniji ditercbutil kalijum fosfat i samo približno 2 puta viška ovog reagensa u poređenju sa drugim reaktantom hlorometil sulfonil hloridom. Di-terbutil hlormetil fosfat pripremljen pomoću ovog postupka je izolovan u čistom obliku preko pogodne destilacije.
Za konverziju IVa u Ha. samo 1.2 ekvivalenta ovog reagensa je upotrebljeno za alkilaciju jedinjenja IV. Pored toga. manje reaktivna i ekonomična baza, kalijum karbonat, upotrebljena je zajedno sa DIvlSO da bi se postigla alkilacija u kojoj su proizvedena jedinjenja II u dovoljnoj meri oslobođena od sporednih proizvoda tako da se mogu koristiti bez hromatografskog prečišćavanja kao ulazni materijal za reakciju uklanjanja zaštitnih grupa. Slobodna kiselina Iac ili soli kao što je Iab na primer mogu sc dobiti u čistom obliku od Ha koji je pripremljen na ovaj način bez hromatografije.
Za sintezu jedinjenja Ilb i IIc koja sporije reaguje nego IVa, korišćeno je 2 do 2.5 ekvivalenta di-terbutil hlorometil fosfata i modifikovani uslovi (cezijum karbonat kao baza sa Kl u rastvaraču, NMP) korišćeni su za alkilaciju svako IVb i IVc i ostvarivanje konverzije u visokom stepenu do Ilb i IIc redom.
Ponovo novi uslovi dali su jedinjenja II u dovoljnom stepenu čistoće da im se omogući da budu upotrcbljeni za proizvodnju jedinjenja I bez potrebe za hromatografskim prečišćavanjem. Tako novi uslovi smanjuju količine i stehiometriju reagenasa koji su potrebni za pripremu jedinjenja I ovog pronalaska i izbegava se potreba za hromatografskim prečišćavanjem intermedijera II. Početni materijali korišćeni za pripremu di-tercbutil hlorometil fosfata su ekonomičniji i manje opasni i krajnji proizvod je proizveden u većoj čistoći. Konačno, uslovi koji su razvijeni za alkilaciju IVa, IVb i IVc eliminišu potrebu za reaktivnom, zapaljivom natrijum hidrid bazom koja je korišćena u višku i koriste bilo kalijum ili cezijum karbonat.
U koraku alkilacije, može se koristiti pogodna baza M2CO3(M je litijum, natrijum, kalijum, rubidijum ili cezijum). Za konvertovanje IVa u Ha, poželjna je K2C03(1-5 molarnih ekvivalenata, poželjno 2 molarna ekvivalenta po molu IVa). Za konvertovanje IVb u Ilb ili IVc u IIc, poželjan je cezijum karbonat.
Takođe, potreban je pogodan rastvarač kao što je dimetilsulfoksid, N-dimetilformamid, aceton, acetonitril, N-metilpirolidinon, formamid, tetrahidrofuran, itd. (2-50 ml/gramu jedinjenja IV, pri čemu je poželjno 5 ml/gramu); dimetilsulfoksid je poželjan za konverziju IVa u Ha; N-metilpirolidinon je poželjan za konverziju IVb u Ilb ili IVc u IIc.
Pogodni izvor joda iz rastvarača obuhvata, ali nije ograničen na, MI (M je, na primer, litijum, natrijum, kalijum, jod, tetrabutilamonijum, itd.); pri čemu je poželjan kalijum jodid (0.1-5 molarnih ekvivalenata /molu jedinjenja IV; poželjno 2 ekvivalenta).
Alkulujući agens, di-terc-butil hlorometil fosfat, može se koristiti u 1-10 molarnih ekvivalenata po molu jedinjenja IV; ali poželjno je oko 1.2 molarnih ekvivalenata.
Reakciona temperatura može biti 10-60°C (30°C poželjno).
U koraku uklanjanja zaštitne grupe, kada su dve terc-butil grupe uklonjene sa Ha da bi se formirao Iac, ovo se izvodi u prisustvu pogodnog rastvarača kao što je dihlormetan (poželjno), dihloretan, hloroform, ugljentetrahlorid, toluen. benzol, itd. (2-50 ml/gramu jedinjenja IV, poželjno 10 ml/gramu).
Za uklanjanje zaštitne grupe sa Ilb i IIc da bi se dobio Ibc i Ic, redom, ovo se postiže u acetonu/vodi na temperaturi od oko 40°C. Pored toga, u toku uklanjanja zaštitne grupe sa Ha, poželjno je imati prisutnu kiselinu kao što je trifluorosirćetna kiselina (poželjno). hlorovodonična, sumporna, azotna, itd. (2-100 molarnih ekvivalenata na bazi IVa, pri čemu je poželjno 15 molarnih ekvivalenata).
HEMIJSKI POSTUPCI
Uopšteno:
Dodatne pripreme početnih materijala i prekursora sadržane su u Wang et. al. U.S.
Patentu 6.476,034 koji je priznat 05.11.2002. koji je u celini uključen na osnovu reference.
Svi rezultati tečne hromatografije (LC) beleženi su na Shimadzu LC-10AS tečnom hromatografu korišćenjem SPD-10AV UV-Vis detektora sa podacima masene spektrometrije (MS) koji su određeni primenom Micromass Platform for LC u elektrosprej modu.
LC/MS METOD (TJ., IDENTIFIKACIJE JEDINJENJA)
Kolona A: YMC ODS-A S7 3.0x50 mm kolona
Kolona B: PHX-LUNA C18 4.6x30 mm kolona
Kolona C: XTERRA ms C18 4.6x30 mm kolona
Kolona D: YMC ODS-A Cl8 4.6x30 mm kolona
Kolona E: YMC ODS-A Cl8 4.6x33 mm kolona
Kolona F: YMC C18 S5 4.6x50 mm kolona
Kolona G: XTERRA Cl8 S7 3.0x50 mm kolona
Kolona H: YMC Cl 8 S5 4.6x33 mm kolona
Kolona I: YMC ODS-A Cl8 S7 3.0x50 mm kolona
Kolona J: XTERRA C-18 S5 4.6x50mm kolona
Kolona K: YMC ODS-A C18 4.6x33mm kolona
Kolona L: Xterra MS C18 5uM 4.6x30mm kolona
Kolona M: YMC ODS-A C18 S3 4.6x33mm kolona
STANDARDNI USLOVI ZA LC PROLAZ (KOJI SU KORIŠĆENI OSIM UKOLIKO NIJE FDRUGAČUE NAZNAČENO): Gradijent: 100% rastvarač A / 0% rastvarač B do 0% rastvarač A / 100% rastvarač B
Rastvarao A = 10% MeOH - 90% ILO - 0.1% TFA, Rastvarač B = 90% MeOH - 10% H20 -0.1 % TFA; i R, u minuti.
Vreme gradijenta: 2 minuta
Vreme zadržavanja: 1 minut
Stopa protoka: 5 mL/min
Talasna dužina detektora: 220 nm
Rastvarač A: 10% MeOH / 90% H20 / 0.1 % Trifluorosirćetna kiselina
Rastvarač B: 10% H20 / 90% MeOH / 0.1% Trifluorosirćetna kiselina
ALTERNATIVNI USLOVI B ZA LC PROLAZ:
Gradijent: 100% Rastvarača A / 0% Rastvarača B do 0% Rastvarača A / 100% Rastvarača B
Rastvarač A = 10% McOII - 90% H20 - 0.1% TFA, Rastvarač B = 90% MeOH - 10% H20 - 0.1% TFA; i R( u minuti.
Vreme gradijenta: 4 minuta
Vreme zadržavanja: 1 minut
Stopa protoka: 4 mL/min
Talasna dužina detektora: 220 nm
Rastvarač A: 10% MeOH / 90% H20 / 0.1% Trifluorosirćetna kiselina
Rastvarač B: 10% H20 / 90% MeOH / 0.1% Trifluorosirćetna kiselina
Jedinjenja prečišćena preparativnom HPLC razblažena su u MeOH (1.2 mL) i prečišćena primenom sledećih postupaka na Shimadzu LC-10A automatskom preparativnom HPLC sistemu ili na Shimadzu LC-8A automatskom preparativnom HPLC sistemu sa talasnom dužinom detektora (SPD-10AV UV-VIS) i sistemima rastvarača (A i B) koji su isti kao u prethodnom tekstu.
PREPARATIVAN HPLC METOD (TJ., PREČIŠĆAVANJE JEDINJENJA)
Metod prečišćavanja: početni gradijent (40% B. 60% A) do krajnjeg gradijenta (100% B, 0% A) u toku 20 minuta, zadržavanje od 3 minuta (100% B. 0% A).
Rastvarač A: 10% MeOH / 90% H20 / 0.1% Trifluorosirćetna kiselina
Rastvarač B: 10% H20 / 90% MeOH / 0.1% Trifluorosirćetna kiselina
Kolona: YMC Cl8 S5 20x100 mm kolona
Talasna dužina detektora: 220 nm
Za eksperimentalne postupke koji su dati u daljem tekstu korišćeni su sledeći HPLC uslovi ili modifikacije standardnih postupaka:
HPLC uslovi za rutinsku LC čistoću:
Detekcija na 254 nm;
Gradijent 0-100% B/A; A 10% CH3CN-90% H2O-0.1% TFA, B 90% CH3CN-10% H2O-0.1% TFA; Vreme gradijenta: 4 minuta; Kolona YMC ODS-AQ ili ORD-A 4.6x50mm 3 mikrona.
HPLC uslovi za LC/MS analizu:
Kolona J: XTERRA C-18 S5 4.6x50mm kolona, Gradijent: 100% Rastvarača A / 0% Rastvarača B to 0% Rastvarača A / 100% Rastvarača B
Rastvarač A = 10% MeOH - 90% H20 - 0.1% TFA, Rastvarač B = 90% MeOH -10% H20 - 0.1% TFA; i Rtu minuti; Vreme gradijenta: 3 minuta; Stopa protoka: 4 mL/min; Talasna dužina detektora: 220 nm
Početni materijali se mogu nabaviti iz komercijalnih izvora ili se mogu pripremiti primenom postupaka iz literature.
PRIPREMA MATIČNOG JEDINJENJA IV:
Priprema matičnog jedinjenja IV opisana je prethodno u sledećim publikacijama koje su ovde u celini uključene na osnovu reference kao što sledi: U.S. Patent 6,469.006 priznat 22.10.2002. za W. S. Blair et al;
U.S. Patent 6,476,034 priznat 05.1 1.2002. za Wang et al;
U.S. Patent 6,573,262 priznat 03.06.2003. za Meanvvell et al;
U.S. serijski broj 10/630,278 podnete 30.07.2003. za J. Kadovv et al; koji je delimični nastavak U.S. serijski broj 10/214,982 podnete 07.08.2002., koji je delimični nastavak U.S. serijski broj 10/038,306 podnete 02.01.2002., koji odgovara PCT WO 02/062423, podnete 02.01.2002., objavljene 15.08.2002; U.S. serijski broj 10/871,931 podnete 18.06.2004. za Yeung ct al;
U.S. serijski broj 10/762,108 podnete 21.01.2004. za Wang et al, koja odgovara PCT WO 2004/043337 objavljene 27.05.2004.
Izabrani detaljni postupci dati su u daljem tekstu:
TIPIČAN POSTUPAK ZA PRIPREMU INTERMEDIJERA ZA PRIPREMU MATIČNOG JEDINJENJA IV
1) Priprema azaindola 1
Priprema azaindola, Postupak A: Priprema 7-hloro-6-azaindola lc: 2-hloro-3-nitropiridin 22e (5.0 g) je rastvoren u suvom THF (200 ml). Pošto je rastvor ohlađen do - 78°C, dodat je višak vinil magnezijum bromida (1.0 M u THF, 100 ml). Zatim, reakcija je ostavljena na -20°C osam časova pre gašenja sa 20% NH4CI (150 ml). Vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc (3 x 150 ml). Kombinovani organski sloj je sušen preko MgS04. Posle filtracije i koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela da bi se dobilo 1.5 g 7-hloro-6-azaindola le u prinosu od 31%.
Jedinjenja5an, IVai5apopisana su u daljem tekstu.
Jedinjenjelam,4-bromo-7-hloro-6-azaindol (žuta čvrsta supstanca) pripremljeno je pomoću istog postupka koji je korišćen za azaindol le, ali korišćeni početni materijal bio je 5-bromo-2-hloro-3-nitropiridin. (dostupan iz Aldrich, Co.). MSm/ z:(M+H)<+>izrač. za C7HsBrClN2: 230.93: zabeleženo 231.15. HPLC vreme zadržavanja: 1.62 minuta (Kolona B).
Jedinjenjelan(4-metoksi-7-hloro-6-azainđol) i jedinjenje lao (4,7-dimetoksi-6-azaindol): Smeša 4-bromo-7-hloro-6-azaindola (1 g), Cul (0.65 g) i NaOMe (4 ml, 25%) u MeOH (16 ml) zagrevanaje na 110-120°C, 16 časova u zatvorenoj epruveti. Posle hlađenja do temperature sredine, reakciona smeša je neutralizovana sa IN HC1 da bi se postigla pH vrednost 7. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa EtOAc (3 x 30ml). Zatim je kombinovani organski sloj sušen preko MgS04i koncentrovanin vacuoda bi se dobio ostatak, koji je prečišćen hromatografijom na silika gelu (50 g) primenom 1:7 EtOAc:heksana kao eluenta.
(Dimenzije kolone: 20mm x 30 cm) da bi se dobilo 0.3 g 4-metoksi-7-hloro-6-azaindola (bela čvrsta supstanca) i 0.1 g 4,7-dimetoksi-6-azaindola (bela čvrsta supstanca).
Jedinjenjelan(4-metoksi-7-hloro-6-azaindol). MSm/ z:(M+H)<+>izrač. za C8H8C1N20: 183.03; zabeleženo 183.09. HPLC vreme zadržavanja: 1.02 minuta (Kolona B).
Jedinjenjelao(4,7-dimetoksi-6-azaindol). 'H NMR (500 MHz, CDC13) 5 7.28 (m, 2H), 6.63 (m, IH), 4.14 (s, 3H), 3.95 (s, 3H). MSm/ z:(M+H)<+>izrač, za C9H,,N202: 179.08; zabeleženo 179.05. HPLC vreme zadržavanja: 1.36 minuta (Kolona B).
Acilacija azaindola, postupak 13: Priprema metil ( 5- azaindol- 3- il)- oksoacetatu 2b: 5-Azaindol (lb) (0.5 g, 4.2 mmol) dodat je u suspenziju A1C13(2.8 g, 21.0 mmol) u CH2C12(100 ml). Mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi 1 čas pre nego što je ukapavanjem dodat metil hlorooksoacetat (2.5 g, 21.0 mmol). Reakcija je mešana 8 časova. Pošto je pažljivo dodato 20 ml MeOH da bi se reakcija ugasila, rastvarači su uklonjeni pod vakuumom. Čvrsti ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc/MeOH = 10:1) da bi se dobilo 0.6 g (70%) acilovanog proizova 2b.
Karakterizacija jedinjenja 2:
Jedinjenje 2b( Metil ( 5- azaindol- 3- il)- oksoacetat) :'H NMR (500 MHz, CD3OD) 5 9.61 (s, III), 9.02 (s, IH), 8.59 (d, IH, J= 6.63 Hz), 8.15 (d, IH, J= 6.60 Hz)5 4.00 (s. 3H); 13CNMR(125 MHz, CD3OD) 8 178.9, 163.0, 145.6, 144.2, 138.3, 135.0, 124.7, 116.3, 112.1, 53.8. MSm/ z:(M+H)<+>izrač. za C10H9N2O3: 205.06; zabeleženo 205.04. HPLC vreme zadržavanja: 0.32 minuta (Kolona A).
Jedinjenje2ao(Etil (4,7-dimetoksi-6-azaindol-3-il)-oksoacetat) pripremljeno je pomoću istog postupka koji je korišćen za jedinjenje 2b ali korišćeni početni materijal bio je 4,7-dimetoksi-6-azaindol. Jedinjenje je prečišćeno hromatografijom na silika gelu korišćenjem 2 : 3 EtOAc : heksana kao eluenta da bi se dobilo žuto ulje: 'H NMR (500 MHz, CDCI3) 5 9.50 (s, IH), 8.21 (s, IH), 7.47 (s, IH), 4.39 (q, 2H, d= 7.05 Hz), 4.13 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 1.40 (t, 3H, d = 7.2 Hz). MSm/ z:(M+H)4 izrač. za C^H^O,: 279.10; zabeleženo 279.16. HPLC vreme zadržavanja: 1.28 minuta (Kolona B). 2) Priprema kalijum azaindol 3- glioksilata 3
Pripremakalijum ( 7- azaindol- 3- il)- oksoacetata 3a:Jedinjenje 2a (43 g, 0.21 mol) i K2C03(56.9g, 0.4] mol) rastvoreni su u MeOH (200 ml) i H20 (200 ml). Posle 8 časova, proizvod 3a se istaložio iz rastvora. Filtracijom je dobijeno 43 g jedinjenja 3a kao bela čvrsta supstanca u prinosu od 90.4%.
Karakterizacija jedinjenja 3:
Jedinjenje 3a,kalijum ( 7- azaindol- 3- il)- oksoacetat;<!>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 8.42 (d, IH, J= 7.86 Hz), 8.26 (d, 111, J= 4.71 Hz), 8.14 (s, IH), 7.18 (dd, IH, J= 7.86, 4.71 Hz); l3CNMR (75 MHz, DMSO-đ6) 5 169.4, 148.9, 143.6, 135.1, 129.3, 118.2, 117.5, 112.9. MSm/ z:(M+HV<1>odgovarajuće kiseline jedinjenja 3a (3a-K+H) izrač. za C9H7N2O3: 191.05; zabeleženo 190.97. HPLC vreme zadržavanja: 0.48 minuta (Kolona A).
Jedinjenje 3ao( Kalijum ( 4, 7- dimetoksi- 6- azaindol- 3- il)- oksoacetai)pripremljeno je (kao žuta čvrsta supstanca), pomoću istog postupka koji je upotrebljen za pripremu jedinjenja 3a, sa tom razlikom što je etil (4,7-dimetoksi-6-azaindol-3-il)-oksoacetat korišćen kao početni materijal. MSm/ z:(M+H)<+>odgovarajuće kiseline jedinjenja 3ao (M-K+H)<+>izrač. za C11H11N2O5: 251.07; zabeleženo 251.09. HPLC vreme zadržavanja: 0.69 minuta (Kolona B).
Primer postupka za pripremu jedinjenja 5a
Priprema( R)- N-( benzoil)- 3- metil- N'-[( 7- azaindol- 3- il)- oksoacetil]- piperazina 5a:Kalijum 7-azaindol 3-glioksilat 3a (25.4 g, 0.113 mol), (R)-S-metil-N-benzoilpiperazin 4a (22.7 g, 0.111 mol). 3-(dietoksifosforiloksi)-l,2,3-benzotriazin-4(3H)-on (DEPBT) (33.3 g. 0.111 mol) i Hunig baza (28.6 g, 0.222 mol) su spojeni u 500 ml DMF. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 8 časova.
DMF je uklonjen isparavanjem na sniženom pritisku i ostatak je podeljen između etil acetata (2000 ml) i 5% vodenog rastvora Na2CC>3 (2 x 400 ml). Vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom (3 x 300 ml). Organska faza je spojena i sušena preko anhidrovanog MgS04. Koncentrovanjemin vacuodobijen je sirovi proizvod, koji je prečišćen silika gel hromatografijom na koloni sa EtOAc/MeOH (50:1) da bi se dobilo 33 g proizvoda 5a u prinosu od 81%.
Karakterizacija jedinjenja 5 sa sledećom podstrukturom:
Jedinjenje 5a, n = 2, R7.,3- H, R14=( R)- Me, ( R)- N-( benzoil)- 3- metil- N'-[( 7- azaindol-3- il)- oksoacetil]- piperazin:'H NMR (300 MHz, CD3OD) 5 8.57 (d, IH, J = 5.97 Hz), 8.38 (d, IH, J = 4.20 Hz), 8.27 (m, IH), 7.47 (s, 5H)5 7.35 (t, IH, J = 5.13 Hz), 4.75-2.87 (m, 7H), 1.31 (b, 3H);<13>C NMR (75 MFIz, CD3OD) 5 185.6, 172.0, 166.3, 148.9, 144.6, 137.0, 134.8, 130.2, 129.9, 128.4. 126.6, 118.6, 138.0, 112.2, 61.3, 50.3, 45.1, 35.5, 14.9, 13.7. MSm/ z:
(M+H)<+>izrač. za C21H20N4O3: 377.16; zabeleženo 377.18. HPLC vreme zadržavanja: 1.21 minuta (Kolona A). Anal. izrač. za C21II20N4O3: C, 67.01; H, 5.36; N, 14.88. zabeleženo: C, 66.01; H, 5.35; N. 14.61.
Jedinjenje IVa, N-(benzoil)-N'-[(4,7-dimetoksi-6-azaindol-3-il)-oksoacetil]piperazin, pripremljeno je pomoću isotg postupka koji je korišćen za pripremu jedinjenja 5a, ali početni materijal je bio kalijum (4,7-dimetoksi-6-azaindol-3-il)-oksoacetat. Jedinjenje je prečišćeno hromatografijom na silika gelu korišćenjem EtOAc kao eluirajućeg rastvarača da bi se dobila bela čvrsta supstanca. 'H NMR (500 MHz, DMSO-dfi) 8 13.0 (s, IH), 8.15 (s, IH), 7.40 (m, 6H), 4.00 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.63-3.34 (m, 8H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) 8 185.5, 169.3, 166.5, 146.2, 145.7, 136.6, 135.3, 129.6. 128.4, 126.9, 122.2, 122.1, 119.2, 114.4, 56.8, 52.9, 45.5, 39.9. MSm/ z:(M+H)<+>izrač. za C22H23N4O5: 423.17; zabeleženo 423.19. HPLC vreme zadržavanja: 1.33 minuta (Kolona B). Anal. izrač. za C22H21N4O5: C, 62.7; H, 5.02; N, 13.29. Nađeno: C, 61.92; H, 5.41; 13.01. Tačka topljenja: 229.5-232°C.
POSTUPCI ZA PRIPREMU MATIČNOG JEDINJENJA IVC
Priprema 3- metii- l, 2, 4- triazoIa ( 2- 81)
Postupak: Čvrsta smeša fomihidraziđa (68 g, 1.13 mol) i tioacetamida (85 g, 1.13 mol) u posudi od 500 mL sa okruglim dnom zagrevana je uz mešanje na 150°C (temperatura uljanog kupatila) 1.5 časova uz laganu struju azota. uklanjajući H2S i vodu (sakupljeno oko 18 mL tečnosti) formirane tokom reakcije. Reakciona smeša je đestilovana pod sniženim pritiskom, sakupljeno je 60.3 g (0.726 mol. u prinosu od 63.3%) jedinjenja iz naslova na 102°C / 0.35-1 mm Hg kao bela čvrsta supstanca posle uklanjanja tečnog dela. 'li NMR
(CDC13) 5 ppm 2.51 (3H, s, 3-Me), 8.03 (IH, s, 5-H), 9.5 (IH, br, NH); TLC Rf (10% MeOH/C^CL) = 0.3 (fosfomolibđat-karbonizacija, bela tačka). Referenca: Vanek, T.; Velkova, V.; Gut, JiriColl. Czech. Chem. Comm.1985,49,2492.
Priprema 3- 81
Postupak: Posuda od 500 mL sa okruglim dnom napunjena je 4-metoksi-7-hloro-6-azaindolom 2e (9.1 g, 50 mmol; sušenin vacuo),kalijum karbonatom (13.8 g, 100 mmol, 2 ekv.), bakrom u prahu (6.35 g, 100 mmol, 2 ekv.) i 3-metil-l,2,4-triazolom (83 g, 1.0 mol, 20 ekv.). Čvrsta smeša je zagrevana do topljenja na 170-175°C (spoljašnja temperatura uljanog kupatila) pod laganom strujom anhidrovanog azota 12 časova, za koje vreme je HPLC analiza pokazala daje najveća količina početnog materijala 5-30% i gde je najveća količina željenog proizvoda oko 45%, pri čemu je najveća količina izomernog sporednog proizvoda 15%o. Kako se reakciona smeša hladi, MeOH (150 ml.) je lagano dodavan u vrelu, smešu koja se meša. Posle hlađenja, nerastvorljiv materijal (bakar u prahu) je filtriran kroz čep od celita i ispran metanolom. Filtrat je koncentrovanin vacuođo guste paste koja je razblažena vodom (1 L) i ekstrahovana sa EtOAc (3x150 mL). EtOAc ekstrakti su sušeni (MgS04), filtrirani i koncentrovani da bi se dobilo oko 8 g sirovog ostatka koji je kristalizovan rastvaranjem u vrelom CH3CN (50 mL), nakon čega sledi razblaživanje sa vodom (100 mL) i hlađenje na 0°C da bi se sakupilo 1.45 g (12.7%) jedinjenja iz naslova kao bela čvrsta supstanca. Filtrat je prečišćen pomoću C-18 reverzno fazne hromatografije na silika gelu (YMC ODS-A 75 um) eluiranjem sa 15-30% CH3CN/H2O. Odgovarajuće frakcije su spojene i vođeni rastvor posle uklanjanja CH3CN rotacionim uparivačem je liofilizovan da bi se dobilo dodatnih 1.15 g jedinjenja iz naslova3-81.Sirovi vodeni sloj je dodatno ekstrahovan sa EtOAc nekoliko puta. Etil acetatni ekstrakti su sušeni (MgS04). filtrirani, koncentrovani i kristalizovani iz MeOH da bi se dobilo dodatnih 200 mg jedinjenja iz naslova3-81.Ukupan prinos: 2.8 g (12.2 mmol. prinos 24.5%); MSm/ z230 (MH), HRMS (ESI) m/z izrač. za CnHi2N50 (M+H), 230.1042, zabeleženo 230.1038 (A - 1.7 ppm); 'H NMR (CDCT3) 8 ppm 2.54 (3H, s, CH3), 4.05 (3H, s, OCH3), 6.73 (IH, s, H-3), 7.40 (IH, s, H-2), 7.56 (IH, s, H-5), 9.15 (IH, s, triazol-H-5); ,3C NMR (CDC13, 125.7 MHz) 8 ppm 14.2 (triazol-Me), 56.3 (OMe), 100.5 (C-3), 116.9 (C- 5), 123.5, 127.2, 127.5 (C-2), 129.5 (C-7), 141.2 (C-5'), 149.5 (C-4), 161.8 (C-3<r>); Anal. izrač. za CnHnN50: C 57.63, H 4.83, N 30.55, zabeleženo C 57.37, H 4.64, N 30.68.
Struktura je potvrđena pomoću kristalografske analize X-zracima korišćenjem kristala dobijenih iz frakcija C-18 kolone. Deo frakcija C-18 kolone koji sadrži smešu željenog 3-metil-l,2,4-triazolil analoga3-81i izomemog 5-metil-l,2,4-triazolil analoga4-81dodatno je prečišćen pomoću C-18 reverzno fazne kolone eluiranjem sa 8-10% CH3CN/li20. Odgovarajuće frakcije su ekstrahovane sa CH2CI2, i sporo isparavanje rastvarača dalo je kristalni materijal izomemog 7-(5-metil-l,2,4-triazolil)-4-metoksi-6-azaindola (4-81): MS m/z 230 (MH), 'H NMR (CDC13) 8 ppm 3.05 (3H, s, CH3), 4.07 (3H, s, OCH3), 6.74 (IH, q, J=2.4, H-2), 7.37 (IH, t, J=2.4, H-3), 7.65 (IH, s, H-5), 8.07 (IH, s, triazol-H-3). Struktura je potvrđena pomoću kristalografske analize X-zracima.
Priprema 5- 81
Postupak: A1CT3(40 g, 0.3 mol, 15 ekv.) je rastvoren u rastvoru CfLCL (100 mL) i nitrometana (20 mL) pod suvim azotom. Ovom rastvoru je dodato jedinjenje3-81(4.58 g, 0.02 mol) uz mešanje i pod N2, a zatim metil hlorooksoacctat (9.8 g, 0.08 mol, 4 ekv.). Smeša je mešana pod N2na sobnoj temperaturi u trajanju od 1.5 h. Smeša je ukapavanjem dodavana u hladan i mešani 20%o vodeni rastvor amonijum acetata (750 mL). Smeša je mešana 20 minuta i dobijeni talog je filtriran, temeljno ispran i sušenin vacuoda bi se dobilo 4.7 g (0.015 mol, u prinosu od 75%o) jedinjenja iz naslova5-81kao bela čvrsta supstanca: MS m/z 316 (MH); HRMS (ESI) m/z izrač. za C4H14N5O4(M+H). 316.1046; zabeleženo 316.1041 (8 -1.6 ppm); 'H NMR (CDCI3, 500 MHz) 8 ppm 2.58 (3H, s, CH3), 3.96 (3H, s, OCH3), 4.05 (3H, s, OCH3), 7.76 (IH, s, H-5). 8.34 (IH, d, J=3Hz, H-2), 9.15 (IH, s, triazol-H-5), 11.0 (IH, brs, NH). Još jedinjenja iz naslova5-81i hidrolizovane kiseline6-81može se dobiti iz filtrata kiselo-baznom ekstrakcijom sa EtOAc.
Priprema 6- 81
Postupak: U suspenziju metil estra 5-81 (2.2 g, 7.0 mmol) u MeOH (50 mL) dodat je 0.25M NaOH rastvor u vodi (56 mL, 14 mmol, 2 ekv.) na sobnoj temperaturi i smeša je mešana 15 minuta za koje vreme HPLC je pokazao da je hidroliza bila kompletna. Smeša je brzo koncentrovanain vacuoda bi se uklonio MeOH, i u preostali rastvor dodataje voda (100 mL) i IN HC1 (14 mL) uz mešanje kako bi se smeša neutralizovala. Dobijeni fini talog je izfiltriran, ispran vodom i sušenin vacuoda bi se dobilo 1.98 g (6.58 mmol, prinos od 94%) jedinjenja iz nalova6-81kao prljavo bela čvrsta supstanca: MS m/z 302 (MH);<]>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) 8 ppm 2.50 (3H, s, preklopljeno sa DMSO vršnim vrednostima), 3.98 (3H, s, CH3O), 7.87 (HL s, H-5), 8.29 (IH, d..1=3.5Hz. H-2), 9.25 (IH, s, triazol-H-5), 12.37 (IH, s,NH).
Alternativan postupak: U suspenziju metil estra 5-81 (10.7 g, 34 mmol) u MeOH (150 mL) dodat je 0.25M NaOH rastvor u vodi (272 mL, 68 mmol, 2 ekv. ) na sobnoj temperaturi i smeša je mešana 20 minuta za koje vreme HPLC je pokazao da je hidroliza bila kompletna. Smeša je brzo koncentrovanain vacuoda bi se uklonio MeOH, i dobijeni rastvor je ekstrahovan sa EtOAc da bi se uklonile sve neutralne nečistoće. Vodenoj fazi dodat je IN HC1 (68 mL, 68 mmol) da bi se proizvod neutralizovao. Dobijena smeša je zamrznuta i liofilizovana da bi se dobilo 14.1 g ( 33.7 mmol, prinos od 99.2%) jedinjenja iz naslova6-81,koje sadrži 2 mol ekvivalenata NaCl kao prljavo bela čvrsta supstanca. Ovaj materijal je ?c upotrebljen u kasnijoj reakciji bez dodatnog prečišćavanja. Dinatrijum so jedinjenje iz naslova6-81dobijeno je pomoću C-18 reverzno fazne hromatogarfije na koloni posle tretmana sa natrijum bikarbonatom: HPLC >97% (AP, uv na 254 nm); HRMS (Na so, ESI") m/z izrač. za C3H10N5O4(M-H), 300.0733; zabeleženo 300.0724 (A-3 ppm); 'li NMR (Na so, DMSO-d6, 500 MHz) 5 ppm 2.37 (3H, s, Me), 3.83 (3H, s, CH3O). 7.56 (IH, s, H-5), 8.03 (IH, s, H-2), 9.32 (IH, s, triazol-H-5);<l3>C NMR (Na so, DMSO-d6, 125.7 MHz) 5 ppm 13.8 (triazol-Me), 57.2 (OMe), 114.8 (C-3), 120.0 (C-5), 125.1, 143.5 (C-5'), 149.8 (C-4), 160.0 (C-3'), 171.7, 191.3.
Priprema jedinjenja IVc
Postupak: U rastvor kiseline6-81(3.01 g, 10 mmol) i benzoilpiperazin hidrohlorida (3.39 g, 15 mmol) u DMF (50 mL) dodat je trietilamin (10.1 g, 100 mmol, 10 ekv.), a zatim 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (EDC; 5.75 g. 30 mmol) pod N2i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 22 časa posle obrade ultrazvukom i na 40°C u trajanju od 2 časa. Smeša je koncentrovanain vacuoda bi se uklonili DMF i TEA, i u preostali rastvor dodata je voda (200 mL) uz istovremeno mešanje i obradu ultrazvukom. Formirani talog je sakupljen, ispran vodom i sušenin vacuoda bi se dobilo 2.8 g (5.9 mmol, prinos od 59%) jedinjenja iz naslovaIVckao prljavo bela čvrsta supstanca. Filtrat je ekstrahovan sa CFLCL (x2). CH2CL ekstrakti su sušeni (Na2S04), filtrirani i koncentrovani do gume koja je triturisana sa ET2O da bi se dobila čvrsta supstanca. Ova čvrsta supstanca je suspendovana i triturisana sa MeOH da bi se dobilo 400 mg jedinjenja iz naslova IVc kao prljavo bela čvrsta supstanca. Ukupni prinos: 3.2 g (6.8 mmol, prinos od 68%): MS m/z 474 (MH); HRMS (ESI) m/z izrač. za C24H24N7O4(M+H) 474.1890, zabeleženo 474.1884 (A -1.2 ppm); 'H NMR (DMSO- d6) 5 ppm 2.50 (311, s, preklopljen sa DMSO pikovi), 3.43 (4H, br. CH2N), 3.68 (4H, br. CH2N), 3.99 (3H, s, CTLO), 7.46 (5H. br. s, Ar-lls), 7.88 (IH, s, indol-H-5). 8.25 (IH. s, indol-H-2), 9.25 (IH, s. triazol-H-5), 12.40 (111, s, NIT);,<3>C-NMR (DMSO-d„) 6 ppm 13.78, 40.58, 45.11, 56.78, 114.11, 120.95, 122.71, 123.60, 126.98, 128.34, 129.6, 135.43, 138.52, 142.10, 149.15, 161.29, 166.17, 169.22, 185.42; UV (MeOH) Xmax 233.6 nm( e3.43xl0<4>), 314.9 nm (s 1.73xT0<4>); Anal: izrač. za C24H24N7O4.I/5H2O; C 60.42, H 4.94, N 20.55, zabeleženo; C 60.42, H 5.03, N 20.65; KF (H20) 0.75%.
Ova reakcija se takođe može izvesti primenom HATU i DMAP da bi se dobio konzistentniji prinos jedinjenja iz naslova: U suspenziju kiseline6-81(15.6 mmol) i HATU [0-(7-azabenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfonata] (8.90 g, 23.4 mmol; 1.5 ekv.) u DMF (60 mL) i CH2C12(60 mL) dodata je smeša DMAP (5.72 g, 46.8 mmol, 3 ekv.) i benzoilpiperazin hidrohlorida (5.30 g, 23.4 mmol; 1.5 ekv.) u DMF (60 mL) na sobnoj temperaturi i smeša je mešana pod atmosferom azota 4 časa. Smeša je koncentrovanain vacuoda bi se uklonio CH2C12i veći deo DMF, i preostalom rastvoru dodata je voda uz istovremeno mešanje i obradu ultrazvukom. Formirani talog je sakupljen, ispran vodom i sušenin vacuoda bi se dobilo 5.38 g (11.4 mmol, prinos od 72.8%) jedinjenja iz naslovaIVckao prljavo bela čvrsta supstanca: HPLC >95% (AP, uv na 254 nm).
Sintetički eksperimentalni postupci za najbolju pripremu jedinjenja IVb
5-Amino 2 metoksipiridin (50g, 0.4mol) dodat je u mešajuću smešu apsolutnog etanola (280 ml) i IIBF4 (48% u vodi, 172 ml) i hlađen do 0°C. Natrijum nitrit (129 g) je rastvoren u vodi (52 ml) i dodavan u delovima u trajanju od 1 časa. Mešanje je nastavljeno na 0°C 2 časa. Reakciona smeša je razblažena etrom (1 L). Čvrsti proizvod je sakupljen filtracijom i ispran sa 500 ml 50:50 EtOH/etra i zatim nekoliko puta etrom sve dok proizvod nije bio neznatno rozikaste boje. Bledo roze čvrsta supstanca 90 g (-100% prinos) čuvana je u desikatoru preko P2O5.
Isit postupak je praćen za izvođenje reakcije u većoj razmeri:
( I) ( 200 g, 1. 6 mol) ; HBF4( 688 ml) ; NaN02( U6g) ; ElOH ( 1. 12 L) ; H20 ( 208 ml)
Reakcija je izvedena 4 puta (ukupno 800 grama (1-80)). Proizvod je sušen preko P1O548 časova, (samo 24 časa za prvu turu).
Dobijeno je ukupno 1,293 g (2-80). (prinos od 91%).
Ref:J. Heterocyclic Chem.,10, 779, 1973 (za prethodne reakcije, uključujući analitičke podatke)
Razlaganje diazonijum soli izvedeno je u tri ture od:
206 g. 219 g i 231 g primenom 1.3 L, 1.4 L i 1.6 L anhidrovanog toluena redom.
Toluen je prethodno zagrejan pod azotom do 100°C (unutrašnja temperatura) u posudi od 2L i sa 3 grlića koja ima okruglo dno kojoj je dodata i mehanička mešalica. Čvrsta supstanca je dodavana u delovima preko kašičice kroz levak za prašak koji je povezan za adapter sa blago spolja usmerenom pozitivnom strujom azota. U toku dodavanja, temperatura je održavana između 99-102°C (postavljena na 100°C) i snažno mešana. Ukupno vreme dodavanja bilo je 60 minuta za dve manje ture i 70 minuta za poslednju. Pošto je dodavanje završeno, svaka reakcija koja je mešana zagrevana je na 110°C 1 čas. Grejač je uklonjen i mešanje je zaustavljeno. Reakcija je ostavljena da odstoji 2 časa (postignuta temperatura sredine). Upozorenje: Reakcija sadrži BF3 tako da rad sa vrelom reakcijom oslobađa isparljive materije koje izazivaju iritaciju kože kod nekih osoba. Na temperaturi sredine nisu zabeleženi indeidenti (6 različitih ljudi). Vreli toluen iz reakcije je sipan u 4L erlenmajer (tamno braon ulje i ostatak je ostao u posudi). Ostatak je ispran sa 50 ml toluena i sipan u originalne toluenske ekstrakte.
Dodati 1.5L IN NaOH u toluenski sloj, ekstrahovati i isprati sa -100 ml zasićenog vodenog rastvora NaCl.
Spojiti NaCl sa NaOH slojem, ponovo ekstrahovati sa 150 ml toluena, isprati sa 50 ml zasićenog NaCl.
Spojiti toluenske slojeve.
Dodati 1 L IN NaOH u ostatak u reakcionoj posudi i mešati da bi se rastvorilo što je moguće više ostatka i zatim dodati 500 ml Et?0 i sipati u erlenmajer.
Dodati još -500 ml 1 N NaOH u reakcionu posudu i mešati sa -500 ml Et20.
Spojiti tamne Et20 i NaOH ostatke od ispiranja u erlenmajerskoj posudi.
Et20/NaOH smeša je sipana kroz levak za prašak koji sadrži čep od staklene vune da bi se sakupila tamna viskozna čvrsta supstanca. (Dodati još -500 ml etra za ispiranje) u 6L levak za odvajanje.
Ekstrahovati. Isprati etarski sloj sa -200 ml H20 i zatim sa 100 ml zasićenog NaCl.
Spojiti sve ostatke ispiranja sa originalnim NaOH vodenim slojem i ponovo ekstrahovati sa 500 ml etra. Isprati sa 100 ml H20 i 100 ml NaCl. Spojiti etarske ekstrakte. Toluenski i etarski ekstrakti su provereni pomoću LC/MS čistog proizvoda.
Etar (etarski) je koncentrovan na rotacionom uparivaču i ostatak je spojen sa toluenskim ekstraktima da bi se dobio homogeni rastvor koji je u izvornom stanju prebačen u sledeći korak.
Druge dve ture su spojene i obrađene na isti način.
Svi vodeni slojevi su provereni pomoću LC/MS — nema proizvoda.
Ref:./ Heterocychc Chem.,10, 779, 1973 (za prethodne reakcije, uključujući analitičke podatke)
Ukupno 4.6 L toluenskog rastvora koji sadrži3-80postavljeno je u nekoliko zatvorenih epruveta i tretirano sa 900 ml 35% HC1 na 145°C, 2 časa. LC/MS je pokazala da nema početnog materijala, samo 4. Toluenski rastvor je dekantovan i odbačen. Vodena faza je isprana sa EtOAc i koncentrovana da bi se uklonile isparljive materije da bi se dobila braon čvrsta supstanca koja sadrži željeni fluoro-hidroksipiridin 4-80.
Ukupno 244 g ove čvrste supstance je sakupljeno i u izvornom stanju prebačeno u sledeći korak (nije bio poptuno suv).
Napomena: Naknadno smo ovo uradili dekantovanjem toluenskog sloja pre zagrevanja da bi se smanjile zapremine. Ista reakcija je izvedena primenom HBr (48% u ILO) na 100°C 6 časova sa sličnim rezultatom postupku iz literature sa prinosom od 49%.
Ref:J. Heterocyclic Chem.,10, 779, 1973 (za prethodne reakcije.uključujući analitičke podatke).
Prethodna čvrsta supstanca koja sadrži(4-80)podeljena je u 4 ture i tretirana sa rTS04 i pušljivom HN03kao sto je prikazano u daljem tekstu. Količine koje su korišćene bile su:
Jedinjenje4-80rastvoreno je u sumpornoj kiselini (veće količine naznačene u prethodnom tekstu) na sobnoj temperaturi i zatim zagrevano do 65°C. Prethodno formirani rastvor pušljive azotne kiseline i sumporne kiseline (manja količina naznačena u prethodnom tekstu) dodavana je ukapavanajem. Temperatura je održavana između 65°C i 80°C (reakcija je egzotermna i iako je kupatilo na 65°C, temperatura se povećava, obično do 75, nekad do 80°C). Pošto je dodavanje završeno, reakciona smeša je zagrevana na 65°C još 1 čas. Reakciona smeša je zatim hlađena do sobne temperature i sipana u posudu koja sadrži led) (20 g leda/g jedinjenja, javilo se oslobađanje gasa). Čvrsta supstanca se istaložila i sakupljena je filtracijom ('HNM" je pokazala4-80i još nešto (što je odbačeno)).
Vodeni sloj je ekstrahovan sa AcOEt nekoliko puta (3-5) i koncentrovan na rotacionom isparivaču pod vakuumom da bi se dobila čvrsta supstanca koja je triturisana etrom da bi se dobilo5-80kao svetio žuta čvrsta supstanca. Ukupno 117g željenog proizvoda je sakupljeno u prvom prinosu (27% prinos iz diazonijum soli). Deo nije kristalizovao: ovo ulje je triturisano sa MeOH i EhO da bi se dobilo 3.6g jedinjenja 5-80; sledeće taloženjenje iz ishodne tečnosti dalo je dodatnih 6.23g željenog proizvoda 5-80.
Ukupno: 117.0+3.6+6.23 = 126.83. 30.4%). Prinos za tri koraka (razlaganje diazonijum soli; uklanjanje zaštitne grupe i nitracija).
Analitički podaci: 53877-115: 'HNMR(8, MeOD): 8.56-8.27 (dd. J= 7.5, 3.3 Hz, IH), 8.01 (d, J=3.3 Hz, IH); LC/MS(M+l)<+>= 158.9; sobna temperatura = 0.15 min.
Napomena:Deo vodenog rastvora kiseline je uzet i neutralizovan saNaiCOssve dok nije prestalo oslobađanje gasova i zatim je ekstrahovan sa AcOEt => dobijen je drugačiji proizvod. U ovim ekstraktima nije bilo željenog proizvoda.
Ukupno 117g jedinjenja5-80podeljeno je u 4 ture od 30 g x 3 i 27g x 1 i tretirano sa POBrj(3 ekviv.; 163 g x 3 i 155 g x 1) i katalitičkom količinom DMF (15 ml) na sobnoj temperaturi (DMF je dodavan pažljivo => dolazi do oslobađanja gasa). Posle 5 minuta na sobnoj temperaturi, rastvor je zagrevan na 110°C, 3 časa. LC/MS je pokazala daje početni materijal potrošen. Reakciona smeša je ostavljena da se hladi do sobne temperature. Reakcione posude su postavljene u ledeno kupatilo; i zatim je led dodavan veoma sporo i pažljivo u delovima u posudu, došlo je do oslobađanja gasa kao posledica formiranja HBr; tečnost i crna čvrsta supstanca koji su se formirali sipani su u laboratorijsku čašu sa ledom. Dodat je EtOAc i smeša je zatim ekstrahovana nekoliko puta sa EtOAc, Organski sloj je ispran zasićenim vodenim rastvorom NallCO;?, FLO i slanim rastvorom; sušen preko Na2S04i filtriran. Proizvod je sušen u pumpi preko noći da bi se dobilo 123g jedinjenja6-80kao braon čvrsta supstanca (77% prinos).
Napomena:Reakcija je završena u roku od 1 časa.
'HNMR(8, CDC13): 8.52 (m, IH), 7.93 (m, IH).
800 ml vinil magnezijum bromida (IM u THF, Aldrich) hlađeno je ispod -60°C uz snažno mešanje pod N2. 2-bromo-5-fluon>3-nitro piridin (43.3g. 0.196 mol) u 200ml THF
dodavan je ukapavanjem preko levka za dodavanje takvom brzinom da je temperatura održavana ispod -60°C. Ovo je trajalo~1.25 časova. Reakciona smeša je zagrevana do -40 do -50°C i mešana još 1 čas. Zatim je lagano i pažljivo dodavano 1L zasićenog vodenog rastvora NH4C1. Prvo, javila se pena i značajna količina čvrste supstance je bila prisutna, ali se ona uglavnom rastvorila kad je dodavanje završeno i materijal je zagrevan do sobne temperature. Slojevi su se razdvojili i vodeni sloj je ekstrahovan 3 puta sa etil acetatom. Organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, sušeni preko Na7S04, filtrirani i koncentrovani da bi se dobilo~50 g crne gumaste čvrste supstance. HPLC je pokazao 57-58% proizvoda. Ovome je dodat CHiCL i čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i isprana sa CH2CL da bi se dobilo 12.5 g proizvoda kao braon čvrsta supstanca. Reakcija je ponovljena u tačno istoj razmeri i obrađena na isti način. Iz CH2CI2trituracije dobijeno 12.4 g prekursora 2i (HPLC~97% čistoća). Sirova supstanca je povraćena i ostavljena da odstoji u dihlormetanu. Postoje odstajala 3.6 g dodatnog proizvoda je odvojeno i povraćeno filtracijom.
Ukupan prinos = 29.5g (35%).
'HNMR(5, CDCI3): 8.69(bs, IH), 7.92 (đ, J= 1.8 Hz, 111), 7.41 (m, IH), 6.77 (m,lH);
LC/MS(M+l)<+>= 216.-217.9; sobna temperatura = 1.43 min.
Reakcija je izvedena u posudi od 250 ml (stvaranje pene se javilo usled zagrevanja i pogodnija je veća posuda). Smeša prekursora 2i (3 g, 13.95 mmol), 1,2,3-triazola (15 g, 217.6 mmol, 15 ekv.), K2C03(1.9 g, 13.95 mmol. 1 ekv.) i Cu(0)(0.9 g. 13.9 mmol, 1 ekv.) zagrevana jc na 160°C, 7 časova (ođ sobne temperature do 160°C ukupno 7 časova) pod N2(u zavisnosti od Cu(0) dela, reakciono vreme može da varira od 2 časa do 7 časova). Dobijena smeša je razblažena sa MeOH, filtrirana kroz filter papir (da bi se uklonio bakar). Ispiranje je izvršeno sa MeOH (20 ml) i vodom (30 ml).
Filtrat je koncentrovan (rastvarač je uklonjen u rotacionom uparivaču) i razblažen sa etilacetatom. Vodeni sloj je ekstrahovan sa etilacetatom. Kombinovani organski sloj je sušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan. Ostatak je rastvoren u MeOH (20 ml),7-80(750 mg) je iskristalizovan iz metanola kao bela čvrsta supstanca i sakupljena je filtracijom.
(zapremina sporog gradijenta, silika gel heksan/AcOEt (0—»18%) ishodnih tečnosti obično daje 5-10% više jedinjenja 7-80.
'HNMR (5, CDC13): 10.47 (bs, IH), 8.76 (s, IH), 7.94 (s, IH), 7.89 (s, IH), 7.53 (m, 1H)5 6.78 (m, IH); LCMS(M+l)<+>= 204; sobna temperatura = 1.29 min.
Etil metilimidazolijum hlorid (4.3 g, 29.6 mmol, 3 ekv.) postavljenje u posudu od 250 ml. AICI3(11.8 g, 88.6 mmol, 9 ekv.) je dodat u posudu u jednom delu. Formirana je tečna suspenzija (nešto AICI3je preostalo u čvrstom obliku). Posle mešanja od 5-10 minuta jedinjenje (1) (2.0 g, 9.85 mmol) je dodato u jednom delu, nakon čega je lagano dodavan (pomoću šprica) etil hlorooksalacetat (3.3 ml, 29.6 mmol, 3 ekv.). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 20 časova. LCMS je pokazala jedinjenje 8-80: jedinjenje7-80= 6:2.
(Jedinjenje I ima snažnu UV apsorpciju). Reakcija je ugašena pažljivim dodavanjem ledene vode (-75 ml) na 0°C. U ovoj tački istaložena je žuta čvrsta supstanca. Dobijena suspenzija je filtrirana i čvrsta supstanca je isprana vodom. Dodat je MeOH i etilacetat (da bi se uklonio SM koji nje reagovao) i čvrsta supstanca je sušena na vazduhu. (LCMS čisoća 70% - 80%) Dobijeno je 2 g čvrste supstance koja sadrži jedinjenje8-80i ta čvrsta supstanca je prebačena u sledeći korak bez dodatnog prečišćavanja. LCMS(M+l)<f>= 276; sobna temperatura = 0.97 min.
Smeša jedinjenja8-80(4.9 g, 17.8 mmol) & N-benzoilpiperazin hidrohlorida8a-80(HC1 so; 6.0 g, 26.7 mmol, 1.5 ekv.) u DMF (30 ml) mešana jc na sobnoj temperaturi preko noći (16 br). Formiranje talog. Dodatnih 20 ml DMF je dodato u talog. Zatim je dodat HATU (12.2 g, 26.7 mmol. 1.5 ekv.), a zatim DMAP (4.3 g, 35.6 mmol, 2 ekv.). Reakciona smeša je mešana 30 minuta. LCMS je pokazala da je početni materijal8-80potpuno konvertovan u proizvod (PRIMER 216). Dobijena smeša je filtrirana i čvrsta supstanca je isprana vodom. Filtrat je koncentrovanin vacuo.Voda je dodata ostatku i čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom. Čvrste supstance su spojene i isprane vodom. MeOH i EtOAc. Zatim je čvsta supstanca sušena na vazduhu. LCMS & HPLC pokazali suIVb,>99% čistoće. Čvrsti proizvod je pečišćen taložejem i kristalizacijom u 5 -10% CH3OH/CHCI3.
Prečišćavanje IVb
Sirovo jedinjenjeIVbdobijeno kao u prethodnom tekstu (15.3 g) rastvoreno je u 10% MeOI I/CHCl3 (600 ml). Formirana je svetio braon suspenzija, filtrirana kroz filter papir i isprana sa MeOH dva puta. Braonkasta čvrsta supstanca je odbačena (-1.2 g). JedinjenjeIVbje kritalizovano u filtratu, čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i bela čvrsta supstanca je sušena na vazduhu. Filtrat je upotrebljen da bi se kristalizacija ponovila nekoliko puta. Čvrsta supstanca dobijena u svakoj filtraciji analizirana je pomoću HPLC. Sve čiste frakcije su spojene. Ne tako čiste frakcije su ponovo podvrgnute kristalizaciji sa MeOH & CHCI3. Ukupno 12.7 g jedinjenjaIVbje dobijeno iz rekristalizacije i taloženja. Ishodna tečnost je koncentrovana i prečišćena na silika gel koloni (EtOAc, zatim CHCl3MeOH (0-2%)) da bi se dobilo 506 mg proizvoda) kao bela čvrsta supstanca.
'HNIvIR (d, DMSO) 13.1 (bs, IH), 9.0 (s, IH), 8.4 (s, IH), 8.3 (s, IH), 8.2 (s, IH), 7.4 (bs, 5H), 3.7 (bs, 4H), 3.5 (bs, 4H); MS m/z 448 (MH). Anal: izrač. za C27H18FN703; C 59.05, H 4.05, N 21.91, F 4.24. Nađeno; C 57.28, H 4.14, N 21.22; F 4.07%.
Primeri 1- 4:
Priprema prolekova I od ishodnih jedinjenja IV
Sintetička šema za primere 1- 4
Primer 1 Priprema Ia
Postupak: Suspenzija jedinjenjaIVa(211 mg, 0.5 mmol) u THF (2 mL; Sure Seal) pod atmosferom anhidrovanog N2tretirana je sa NaH (86 mg, 2.2 mmol; 4.4 ekv.; 60% uljana disperzija). Posle nekoliko minuta mešanja na sobnoj temperaturi, dodat je di-terc-butil hlormetil fosfat (782 mg, 3.0 mmol; priprema, videti US Patent 6,362,172) i smeša je mešana 1-5 dana, ispitivanje da li je reakcija završena izvdeno je pomoću HPLC (još 1-2 ekv. NaH i fosfata mogu biti potrebni da se reakcija dovede blizu završetka). Pošto je početni materijal upotrebljen, smeša je koncentrovanain vacuodo sušenja i ostatak, koji je izgleda smeša N-alkilovanog indol mono- i bis-t-butil fosfata, rastvorena je u CH?C12(5 mL) je tretiran sa TFA (5 mL) na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 časa. Smeša je koncentrovanain vacuoi ostatak je prečišćen pomoću C-18 reverzne faze silika gela, eluiranjem sa 5-10% CH3CN u vodi koji sadrži NaHCCh, da bi se dobilo 75 mg (0.13 mmol; prinos od 26 %) jedinjenja iz naslovaIakao prljavo beli prašak (dinatrijum so): HPLC >99% (AP na 254 nm); LC/MS (ESI+) m/z 533 (M+H minus 2Na)<+>; HRMS (ESI) m/z izrač. za C23H26N409P (M+H minus 2Na)<+>533.1437, zabeleženo 533.1426 (5 -2.1 ppm); 'H NMR (D20, 500 MHz) 5 ppm 3.51 (2H, m), 3.67 (211, m), 3.73-3.79 (2H, m), 3.89-3.95 (2H, m). 3.94. 3.95 (3H, 2s), 4.05, 4.07 (311, 2s), 6.02- 6.04-6.05-6.07 (2H, ABq.), 7.43, 7.44 (IH, 2s), 7.45-7.56 (5H, m), 8.49, 8.52 (IH, 2s).
Upotrebom sličnog postupka i uslova, lb je pripremljen odIVb. IciIdsu pripremljeni odIVciIVd,redom, ali za prečišćavanje je korišćena pre voda nego rastvor natrijum bikarbonata.
Primer 2
Ib:prinos 13 % (dinatrijum so); HPLC >96% (AP na 254 nm); LC/MS (ES1+) m/z 558 (M+H minus 2Na)<+>; 'H NMR (D20, 500 MHz) 5 ppm 3.59 (2H, m), 3.70-3.84 (411, m), 3.93-3.95 (2H, m), 5.28-5.29-5.30-5.32 (2H, AF3q.), 7.4-7.6 (5H, m), 8.09, 8.10 (IH, 2s), 8.34. 8.36 (IH, 2s), 8.59, 8.61 (IH, 2s), 8.72, 8.75 (IH, 2s).
Primer 3
Ic:Prinos 37% (kiseli oblik; Voda je upotrebljena umesto vodenog rastvora natrijum bikarbonata u toku prečišćavanja; HPLC >98% (AP na 254 nm); LC/MS (ESI+) m/z 584 (M+H); 'H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) 5 ppm 2.40 (3H, s), 3.44 (4H, br.s), 3.66 (4H, brs), 4.04 (3H, s), 5.79 (IH, s). 5.82 (IH, s). 7.46 (5H, brs), 8.07 (IH, s), 8.41 (IH. s), 8.88 (IH. s).
Primer 4
Id:Prinos 7% (kiseli oblik). Voda je upotrebljena umesto vodenog rastvora natrijum bikarbonata u toku prečišćavanja; LC/MS (ESI+) m/z 597 (M+H); 'H NMR (DMSO-dfc) 500 MHz) 8 ppm 1.16, 1.21 (3H, 2d, J = 6.5 Hz), 2.29 (3H, s), 2.3-4.5 (7H, m), 4.00, 4.01 (3H, 2s), 5.79-5.85 (2H, m), 6.36 (IH, t, J = 2 Hz), 7.42-7.47 (5H, m), 7.99 (IH, s), 8.08, 8.09 (Hl, 2s), 8.34, 8.44 (IH, 2s).
Primer 5
Priprema Ica, ( dinatrijum so)
Opšti Postupak: SuspenzijaIVc(0.24 g. 0.5 mmol) u anhidrovanom THF (4 mL) pod atmosferom azota tretirana je natrijum hidridom (60% uljana suspenzija, 0.08 g, 2.0 mmol), i mešana sve dok nije prestalo osolobađanje gasa (približno 5 minuta). Reakciona smeša je tretirana jodom (0.13 g, 0.5 mmol) i mešana 2-3 minuta, a zatim je dodat di-terc-butil hlormetil fosfat (1.6 g, 6.0 mmol, sirov). Struja azota je propuštana preko reakcije da bi se olakšalo uklanjanje velikog dela ili celokupne količine THF. Reakciona smeša je mešana preko noći. HPLC analiza sirovog materijala pokazala je početniIVc(oko 56%) i željeni proizvod pripajanja (oko 32%).
Nekoliko sirovih reakcionih smeša (ukupno 6.7 mmol na bazi početnog materijalaIVc)ponovo je rastvoreno u dihlormetanu, spojeno, koncentrovanoin vacuoda bi se uklonio sav preostali THF. Ostatak je suspendovan u dihlormetanu i TFA (1:1, približno 40 mL ukupne zapremine). Smeša je mešana 1.5-2 časa i zatim je rastvarač uklonjenin vacuo.Ostatak je suspendovan u dihlormetanu i ekstrahovan u vodi (približno 60 mL) i napravljen slabo baznim sa čvrstim ili vodenim natrijum bikarbonatom. Zapremina vodenog sloja je smanjena rotacionim isparivačem prema potrebi i rastvor je napunjen u C-18 reverzno faznu kolonu (približno 80 g C-18, YMC ODS-Aq, 50 mikrona) i eluiran sa vodom, a zatim vodom koja sadrži 2.5% acetonitrila. Frakcije koje sadrže čisti proizvod su sakupljene i organski rastvarač je uklonjen rotacionim isparivačem. Prečišćeni proizvod je dobijen posle liofilizacije da bi se dobilo 1.00 g (1.30 mmol, 19% kroz 2 koraka) jedinjenja iz naslovaIca(dinatrijum so) kao prljavo beli prašak: HPLC čistoća >99% AP na 254 nm (gradijent 0-100% B/A; A 10% CH3CN-90% H2O-0.1% TFA, B 90% CH3CN- 10% H2O-0.1% TFA, vreme gradijenta 4 min. Kolona YMC ODS-Aq 4.6x50mm 3 mikrona); MS-ESI- m/z 482 (M-H minus 2Na)"; HRMS (ESI) m/z izrač. za C25H27N708P (M+H minus 2Na)<+>584.1659, zabeleženo 584.1651 (A -1.3 ppm);<!>H NMR (D20, 500 MHz) 5 ppm 2.53, 2.54 (3H, 2s), 3.56 (2H, s, CH2N), 3.72 (2H, br.s, CH2N), 3.78, 3.83 (2H. 2br.s, CH2N), 3.94, 3.96 (2H, 2br.s, CH2N), 4.14 (3H, s, C1LO). 5.38, 5.40 (2H, 2d, J= 11 Hz), 7.45-7.59 (5H, m, Ar-Hs), 8.07, 8.09 (1H, 2s, indol-H-5), 8.64, 8.67 (IH, 2s, indol-H-2), 8.87, 8.89 (IH, 2s, triazol-H-5);<13>C- NMR (125.7 MHz, D20) 5 ppm 15.43 (N-Me), 44.03, 44.47, 44.66, 45.05, 48.20, 48.82, 49.60, 50.23, 59.78 (OMe), 75.81 (NCfLO), 115.6, 126.0, 127.2, 129.6, 131.0, 131.7, 132.1, 133.5, 136.8, 147.6, 150.1. 154.2, 164.8, 170.4, 175.8, 189.2; UV (H20) lmax 220 nm (e 3.91xl0<4>), 249 nm (c 2.00xl0<4>), 303 nm ( e 1.60x10<4>); Anal: izrač. za C2sH24N70!!PNa2. 8H20. 0.2NaHCO3; C 38.39, H 5.14, N 12.44, P 3.93, Na 6.42 Nađeno; C 38.16. H 4.81, N 12.43, P 3.72, Na 6.05; KF (H20) 17.3%. Manje čiste frakcije su sakupljene da bi se dobilo 0.22 g (0.29 mmol, prinos od 4%) jedinjenja iz naslovaIca(dinatrijum so): HPLC čistoća >95% (AP na 254 nm).
Primer 6
Priprema lah ( hidratisana lizinska so)
Korak jedan
Fosfatni estar A (45.1 g, O.lmol) i hlorjodometan B (200 g, 1.14 mol) su spojeni u 100 ml benzola i smeša je mešana na sobnoj temperaturi četiri časa pre nego što je benzol uklonjen pod vakuumom. Zatim je u ostatak dodato 500 ml etil etra i nerastvorljiva čvrsta supstanca je otfiltrirana. Koncentrovanjem filtrata dobijen je di-terc-butil hlormetil fosfat, koji je upotrebljen u sledećem koraku bez prečišćavanja.
Korak dva
NaH (2.4g, 60% u ulju) je lagano dodavan u suspenziju IVa u suvom THF (120 ml) i smeša je ostavljena da se meša jedan čas na sobnoj temperaturi. Jod (5 g) rastvoren u suvom THF (10 ml) lagano je dodavan u mešajući rastvor. Postoje završeno dodavanje dobijena smeša je mešana na temperaturi sredine još 15 minuta i zatim je dodato jedinjenje di-terc-butil hlormetil fosfat, dobijen iz koraka jedan. Posle mešanja od 16 časova, reakciona smeša je sipana u ledenu vodu (120 ml), nakon čega sledi ekstrakcija sa EtOAc (3 x 300 ml). Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom (100 ml) i zatim slanim rastvorom (100 ml), sušeni preko Na2S04, i koncentrovani pod vakuumom da bi se dobio ostatak, koji je prečišćen silika gel hromatografijom (eluiranjem sa EtOAc/Et/jN (100/1) i zatim EtOAc/MeOH (100/1)) da bi se dobio diestar Ha u prinosu od 70 - 80%.
Korak tri
Mešani rastvor TFA (50 ml) i dihlormetana (450 ml) dodat je u posudu sa okruglim dnom koja sadrži 43.3 g diestra Ha. Posle mešanja na sobnoj temperaturi 16 časova, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom da bi se dobio ostatakIackoji je upotrebljen u sledećim koracima bez bilo kakvog prečišćavanja.
Korak četiri
Prethodnih 55 g sirovog proizvodaIacdodato jc u vodeni rastvor L-lizina (1.36 M, 70 mL) na sobnoj temperaturi. Dobijena suspenzija (pH=1.83) je dodata u rastvor lizina (1.36 M.
-40 mL) do pH 4.88. Dobijena suspenzija je filtrirana kroz čep od celita. Bistri svetio žuti filtrat (-200 mL) je mešan sa acetonom (200 mL) i zagrevan do 45°C. Aceton (1400 mL) je dodavan 2 časa na 45°C. Bistar rastvor je kristalizovan i mešan na 45°C 2 časa, i lagano hlađen do sobne temperature (5 h) i suspenzija je mešana preko noći. Bela čvrsta supstanca je
sakupljena filtracijom i sušena pod kućnim vakuumom na 50°C u trajanju od 24 časa da bi se dobilo 41.2 g jedinjenjaIabkao prljavo bela čvrsta supstanca.
Prethodna čvrsta supstanca je rastvorena u 1:1 vodi-aceton (560 mL) na 45°C. Aceton (700 mL) je dodavan u trajanju od 1 časa na 45°C. Bistar rastvor je kristalizovan i mešan na 45°C, 2 časa. Zatim je lagano hlađen do sobne temperature (5 h) i suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Bela čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i sušena pod kućnim vakuumom na 50°C u trajanju od 36 časova da bi se dobilo 33 gof Iabkao prljavo bela čvrsta supstanca. AP je bila >99% pšto je određeno pomoću HPLC.
'H NMR (500 MHz, D20) 5 8.42 (s, 1/2H), 8.39 (s, 1/2H), 7.52 (m, 6H), 6.12 (m, 2H), 4.07 (s, 3H)3 3.93 (m, 511), 3.72 (m, 3H), 3.67 (m, 2H), 3.52 (m, 211), 3.05 (m, 2H), 1.93 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 1.50 (m, 2H); MS m/z: (M+H-Iizin)<+>izrač. za C23H26N409P 533.14, zabeleženo 533.03. M.P. 166.7 do 172.2 stepeni. Primenom komparativne 'HNMR spajanjem nekoliko različitih pikova, odnos lizina prema IVa je izračunavan prema opsegu od 1.05 : 1 do 1.2 : 1 ekvivalenata lizina prem ishodnom proleku. Određeno je daje formirana so hidrat. Na osnovu DSC (difrakcione skenirajuće kalorimetrije) i TGA (termalne gravitacione analize), zabeleženi sadržaj vode je 2.80%. Teoretsko izračunavanje za monohidrat je 2.58%). Prema tome, odnos vode prema ishodnom molekulu u hidratu mogao bi biti u opsegu 1 : 1 do —1.5: 1.
Primer 7
Priprema kristalnog lc ( mono- hidrat slobodne kiseline)
U smešuIVc(600 mg. 1.27 mmol) u anhidrovanom THF (10 ml) u posudi sa okruglim dnom koja je sušena u termostatu pod azotom na sobnoj temperaturi dodat je NaH
(153 mg, 6.38 mmol, suvi prašak, 95%), i bela suspenzija je mešana sve dok nije prestalo oslobađanje gasa. U smešu je zatim dodath(375 mg, 1.48 mmol), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 časa. U reakcionu smešu dodat je NaH (153 mg, 6.38 mmol, suvi prašak, 95%>), i smeša je mešana oko 5 do 10 min. Sirovi hlormetil di-terc-butilfosfat (2.0 g, oko 1.6 ml, 7.79 mmol) je dodat u smešu, koja je zatim mešana na sobnoj temperaturi 15 časova. LCMS analiza reakcija je pokazala >97% konverzije početnog materijala. Posle isparavanja isparljivih materija, u ostatak je dodat CH2CI2(10 ml), zatim je izvršeno hlađenje u ledenom vodenom kupatilu, lagano je dodat TFA (10 ml) i izvedeno je mešanje na sobnoj temperaturi u trajanju od 3 časa. Reakciona smeša je zatim isparavana, i ostatak je podeljen između CILCL (50 ml) i H20 (50 ml). CH2C12sloj je sipan u reakcionu posudu koja je sadržala nešto nerastvorene braonkaste čvrste supstance, i smeša je ekstrahovana sa razblaženim vodenim rastvorom NaHCC>3 (50 ml). Vodena smeša je prečišćena pomoću reverzno fazne preparativne HPLC (rastvarač A: 10% MeOH- 90% H2O-0.1 %>TFA; rastvarač B: 90% MeOH-10% H20-0.1%>TFA; početak %B = 0, na kraju %B = 100; vreme gradijenta = 6 min; stopa protoka = 45 ml/min; Kolona: phenomenex- Luna 30 x 50 mm, S5; sakupljena frakcija: 3.65 do 4.05 min). Sakupljene frakcije su isparavane do sušenja, i ostatak je sušen pod visokim vakuumom da bi se dobila kiselina Ic kao bledo žuta čvrsta supstanca (356.6 mg); 'H NMR: (500 MHz, CD3OD) 5 9.05 (s, IH), 8.46 (s, IH,), 8.04 (s, IH), 7.47 (b s, 5FI), 5.93 (d, J= 12, 2H), 4.10 (s, 311), 4.00-3.40 (b s, 8H), 2.53 (s, 3H);<19>F NMR analiza je pokazala daje materijal sadržao preostalu TFA, (procenat nije određen); Analitička HPLC metoda: početak %B = 0, na kraju %B = 100, vreme gradijenta = 2min, stopa protoka = 5mL/min, Kolona: Xterra MS Cl8 7u 3.0x50mm, LC/MS: (ES+) m/z (M+H)<+>= 584, HPLC R, = 0.983.
172.2 mg prečišćene kiseline Ic rastvoreno je u 1 ml II20 i zatim je dodato oko 0.3 ml apsolutnog EtOH (jačine 200). Smeša je ostavljena da odstoji u frižideru (temperatura oko 3°C) preko noći, nakon čega je zabeleženo prisustvo kristalnog materijala. Smeša je zatim zagrevana do temperature sredine, razblažena sa H2Odo zapremine od 3 mL, i zatim je lagano dodato 20 mL MeCN. Postoje dodavanje završeno, smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 časa i zatim filtrirana. Sakupljena čvrsta supstanca (90 mg) je sušenain vacuo,i zatim pod visokim vakuumom. Pomoću analize praha X-zracima pokazano je da je ovaj materijal kristalan; Elementarna analiza izračunata za C25H26N7O8PTI2O: C 49.92; H 4.69; N 16.30; zabeleženo: C 49.66; H 4.62; N 15.99; tačka topljenja = 205°C (mereno diferencijalnom skening kalorimetrijom). 'H NMR šema za kristalni materijal je uporedivan sa istim kod prečišćene kiseline i obe su bile konzistentne sa strukturom.
Primer 8
Priprema Iab ( mono L lizin soli) : { 3-[( 4- benzoilpiperazin- l- il)( okso) acetilj- 4. 7-
dimetoksi- l H- pirolo[ 2, 3- c] piridin- 1 - iljmetil dihidrogen fosfat. L- lizin so ( 1:1). Redosled
reackija opisan je u Semi za Primer 8.
Šema za Primer 8
Priprema di- terc- butil hlormetil fosfata
Tetrabutilamonijum so bis-terc butil fosfata (45.1 g, 0.1 mol) i hlorjodometan (200 g, 1.14 mol) spojeni su u 100 ml benzola i smeša je mešana na sobnoj temperaturi četiri časa i zatim je benzol uklonjen pod vakuumom. Deo od 500 ml etil etra je dodat ostatku i nerastvorljiva čvrsta supstanca je otfiltrirana. Koncentrovanjem filtratain vacuoi uklanjanjem isparljivih materija na vakuum pumpi dobijen je di-terc-butil hlormetil fosfat, kao svetio žuto ili svetio braon ulje koje je upotrebl jeno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.
Priprema Ha: ( 3-( 2-( 4- benzoilpiperazin- l- il)~ 2- oksoacetil)- 4, 7- dimetoksi- lH-
pirolo[ 2, 3- cJpiridin-]- iljmetil di- terc- butil fosfata
NaH (2.4 g, 60 mmol, 60% u ulju) lagano je dodat u suspenziju (8.4 g, 20 mmol) jedinjenja IVa u suvom THF (120 ml) i smeša je ostavljena da se meša jedan čas na sobnoj temperaturi. Jod (5 g, 20 mmol) rastvoren u suvom THF (10 ml) lagano i pažljivo je dodat u mešajući rastvor i to brzinom koja omogućava da se stvaranje pene drži pod kontrolom. Po završetku dodavanja, dobijena smeša je mešana na temperaturi sredine još 15 minuta i zatim je dodato -0.1 mol di-terc-butil hlormetil fosfata, dobijenog kao što je opisano u koraku jedan. Posle mešanja u trajanju od 16 časova, reakciona smeša je sipana u ledeni NH4OAC(30%) (120 ml), nakon čega je izvršena ekstrakcija sa EtOAc (3 x 300ml). Spojeni organski ekstrakti su isprani vodom (100 ml) i zatim slanim rastvorom (100 ml), sušeni preko Na2S04, i koncentrovaniin vacuoda bi se dobio ostatak, koji je prečišćen silika gel hromatografijom (eluiranje sa EtOAc/Et3N (100/1) i zatim EtOAc/MeOH (100/1) da bi se dobio diestar Ha (9.0-10.3 g, AP -75%) kao svetio žuta čvrsta supstanca u prinosu od 70 - 80% u nekoliko ponovljenih postupaka.
'H NMR (500 MHz, CDC13) 8 8.09 (s, IH), 7.48 (s, IH), 7.40 (b, 511), 6.15 (d. 2H, J = 11.5 Hz), 4.05 (s, 3IT), 3.90 (s, 3H), 3.90 - 3.30 (b, 8H), 1.39 (s, 18H):<13>C NMR (125 MHz, CDCI3) 8 185.5, 170.7, 166.5. 146.9, 146.2, 139.6, 135.3, 130.2, 128.7. 128.4, 127.2, 124.5, 122.0, 120.8, 115.8, 83.8, 73.2, 57.3, 53.5, 46.1, 41.7, 29.8; MS m/z: (M+H)<+>izrač. za C3iH42N409P 645.27, zabeleženo 645.10.
Priprema Iab: { 3-[( 4- benzoilpiperazin- l- il)( okso) acetil)'- 4, 7- dimetoksi- lH- pirolo[ 2, 3-
cjpiridin- 1 - iljmetil dihidrogen fosfat, L- lizin so ( 1:1)
500 mg diestra Ila rastvoreno je u smeši vode (3 ml) i acetona (3 ml). Dobijena smeša je mešana na 40°C 16 časova da bi se omogućio završetak solvolize. Ovoj reakcionoj smeši (-69 AP) dodat je 4M vodeni rastvor lizina da bi se pH vrednost podesila do 4.83. Aceton (35
ml) je lagano dodavan u reakcionu smešu u trajanju od 30 minuta na 45 - 50°C. Na 45°C, u bistar rastvor je uneta klica kristala Iab i rastvor je mešan na ovoj temperaturi 45 min. Pošto je završeno dodvanje acetona, rastvor je hlađen do sobne temperature 4 časa i kristalizacija Iab je bila završena preko noći. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i usisavanjem pod azotom 2 časa. Bela kristalna čvrsta supstanca je sušena pod kućnim vakuumom na 50 - 55°C 24 časa da bi se dobilo 343 mg Iab.
Iab dobije u prethodnom postupku: 'H NMR (500 MHz. CD3OD) 5 8.38 (s, IH), 7.49 (m, 6H), 6.13 (d, 2H, J= 10.5 Hz), 4.06 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 4.00 - 3.40 (m, 8H), 3.58 (t, IH, J= 6 Hz), 2.92 (t, 2H, J= 7.5 Hz), 1.90 - 1.40 (m, 6H);<13>C NMR (125 MHz, CD3OD) 5 186.1, 173.2, 171.8, 167.8, 147.4, 146.4, 141.0, 135.4, 130.4, 128.8, 127. 2, 124.6, 122.3, 120.2, 114.6, 73.2, 56.6, 54.7, 53.1, 46.0, 41.6, 39.2, 30.5, 27.0, 22.0. HRMS m/z: (M-lizin+H)<+>izrač. za C23H26N4O9P 533.1437, zabeleženo 533.1437. Anal. izrač. C, 51.32; II, 5.79; N, 12.38; P, 4.56; zabeleženo: C, 48.54; H, 5.32; N, 11.76; P, 4.04. tačka topljenja 170°C.
Dobijen pomoću drugog postupka (hidroliza sa TFA u metilen hloridu), Iab je bio 1.70 molarni hidrat i 1.14 molarna lizin so. 'H NMR (500 MHz, D20, 60°C) 5 8.72 (s, IH), 7.84 (m, 6H), 6.44 (d, 2H, J= 10Hz), 4.41 (s, 3H), 4.27 (s, 3H), 4.3 - 3.7 (m, 8H), 4.10 (t, IH, J= 5Hz), 3.39 (t, 2H, J- 5Hz), 2.30 - 1.80 (m, 6H);<l3>C NMR (125 MHz, D20, 27°C) S 186.7, 174.9, 173.2, 167.9, 147.7, 145.7, 142.6, 134.3, 131.1, 129.2, 127.1, 124.3, 122.4, 120.1, 113.8, 73.5, 57.1, 54.9, 54.4, 47.7, 47.1, 46.3, 45.7, 42.6, 42.1, 42.0, 41.5, 39.5, 30.2, 26.8, 21.8. HRMS m/z: (M- lizin+H)+ izrač. za C23H2GN4O9P 533.1437, zabeleženo 533.1425. Anal. izrač. C, 49.11; H 6.13; N, 12.05; zabeleženo: C, 48.93; H 6.26; N 12.07. M.P. 168 - 172°C.
Primer 9
Priprema Ibb ( mono L lizin soli) : [ 3-[( 4- benzoilpiperazin- l- il)( okso) acetil]- 4- fluoro-7-( l H- l, 2, 3- triazol- l- il)- lH- pirolo[ 2, 3- cjpiridin- l- iljmetil dihidrogen fosfata, L- lizin so
( 1:1). Redosled reakcija je opisan u Šemi za Primer 9
Sema za Primer 9
Priprema di- terc- butil hlormetil fosfata
Tetrabutilamonijum so bis-terc butil fosfata (57 g, 0.126 mol, Digital Specialtv Chemicals) i hlorjodometan (221 g. 1.26 mol) mešani su na sobnoj temperaturi četiri časa i zatim su isparljive materije uklonjenein vacuo.500 ml etil etra je dodato u ostatak i nerastvorljiva čvrsta supstanca je otfiltrirana. Koncentrovanjem filtrata i krajnjim uklanjanjem isparljivih materija primenom vakuum pumpe dobijen je di-terc-butil hlormetil fosfat (112 g), tipično kao svetio žuto ili braon ulje, koje je upotrebljeno u sledećem koraku bez dodatnog pečišćavanja.
Priprema Ilb: ( 3-( 2-( 4- benzoilpiperazin- l- il)- 2- oksoacetil)- 4- fluoro- 7-( lII- l, 2, 3-triazol- l- U)- lH- pirolo[ 2, 3- c] piridin- l- il) metil di- terc- butil fosfata
NaH (5.65 g, 95% disperzija u mineralnom ulju, 0.224 mol) lagano je dodavana u suspenziju jedinjenja IVb (20 g, 44.7 mmol) u suvom THF (400ml) i smeša je ostavljena da se meša 0.5 časova na sobnoj temperaturi. Rastvor joda (11.3 g, 44.5 mmol) rastvoren u suvom THF (20 ml) lagano je dodat u mešajući rastvor i to brzinom kojom je se sprečava da reakcija postane burna. Dobijena smeša je mešana dodatna 3 časa pre nego što je uveden drugi deo od 95% NaH (5.65 g, 0.224 mol). Posle 15 minuta na temperaturi sredine, u jednom delu je dodat di-terc-butil hlormetil fosfat (112 g) dobijen iz koraka jedan. Posle mešanja od 16 časova na temperaturi sredine, reakciona smeša je sipana u ledeni NH4OAC(30%)) (200 ml) i zatim ekstrahovana sa EtOAc (3 x 500ml). Spojeni organski ekstrakti su isprani vodom (200 ml) i zatim slanim rastvorom (200 ml), sušeni preko Na?S04i koncentrovani pod vakuumom da bi se dobio ostatak, koji je prečišćen silika gel hromatografijom (eluiranje sa EtOAc/MeOH/Et3N (100/1/1 )da bi se dobilo 15.0 g (43% prinos popravljen za 85%. AP) diestra Ilb kao svetio žuta čvrsta supstanca.
<]>H NMR (500 MHz, CDC13) 8 8.36 (s, III), 8.25 (s. IH), 8.21 (s. IH). 7.88 (s, IH), 7.41 (b, 5H), 5.90 (d, 2H, J= 14.5Hz), 3.90 - 3.40 (b, 8H), 1.23 (s, 18H);<l3>CNMR(125 MHz, CDC13)S 182.9, 170.7, 165.1, 154.6, 152.5, 144.1, 135.1. 134.0, 131.9, 130.3, 128.7. 128.3,
127.2, 125.9, 124.3, 114.0, 84.1, 74.1, 46.2, 41.9, 29.6; HRMS m/z: (M+H)<+>izrač. za C31H38FN7O7P 670.26, zabeleženo 670.34.
Priprema Ibb ( mono L lizin soli) : [ 3- f( 4- benzoilpiperazin- l- il)( okso) acetil]- 4- fluoro-7-( lH- I, 2, 3- triazol- l- il)- lH- pirolo[ 2. 3- c] piridin- l- il] metil dihidrogen fosfat. L lizin soli ( 1:1)
Diestar Ilb (27 g) je rastvoren u smeši vode (55 ml) i acetona (55 ml). Dobijena smeša (pH: nije određen) mešana je na 40°C 16 časova da bi se završila solvoliza. Ovoj reakcionoj smeši dodat je 4M vodeni rastvor lizina da bi se pH vrednost podesila do 3.51. EtOH (500 ml) je dodat u rastvor i zid posude se preko noći obložio sa nešto proizvoda. Bistar rastvor je zatim prebačen u drugu posudu i EtOH (1500 ml) je lagano dodat u reakcionu smešu za~3 časa. Posto je dodavanje etanola završeno, rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 48 časova i dobijena čvrsta supstanca (Ibb) sakupljena je filtracijom i isparana etanolom. Bela kristalna čvrsta supstanca je sušena pod kućnim vakuumom na 55°C 24 časa da bi se dobilo 10.92 g Ibb (98 AP).
Ova čvrsta supstanca je dalje mešana sa 12.5 g soli dobijene iz drugih postupaka u 70 ml vode. EtOH (1000 ml) je zatim dodat i dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi u trajanju od 20 časova. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana sa EtOH (2 x 80 ml) i sušena pod kućnim vakuumom na 50°C pod atmosferom azota 44 časa da bi se dobilo 21.5 g Ibb u AP od 98.7.
Ibb dobijen u prethodnom postupku je -1 molarna lizin so sa 1.12% vode, 0.8% TFA i 0.05% etanola. 'H NMR (500 MHz, CD3OD, 50°C) 58.94 (s, IH), 8.87 (s, IH), 8.69 (s, IH), 8.42 (s, III), 7.83 (m, 5H), 5.81 (d, 2H. J= 12.5Hz), 4.30 - 3.70 (m, 8H), 4.08 (t, III, J= 6.5Hz), 3.67 (t, 2H, .1= 10Hz), 2.26 (m, 2H), 2.07 (m. 2H), 1.88 (m, 2H);<13>C NMR (125 MHz, D20, 30°C) 5 185.2, 174.9, 173.3, 166.8, 153.1. 146.8, 134.8. 134.3, 131.3, 131.1, 130.3, 129.3, 128.9, 128.7, 128.5, 127.2, 124.2, 112.6, 74.0, 54.9, 47.9, 47.2, 46.4, 45.9, 42.7, 42.2, 42.0, 41.7, 39.5, 30.3, 26.8, 21.8. MS m/z: (M-lizin+H)<+>izrač. za C23H22FN7O7P 558.1302, zabeleženo 558.1293. Anal. izrač. C, 48.75; H, 5.07; N, 17.63; P, 4.33; zabeleženo: C, 49.02; H 4.90; N, 17.90; P, 4.37. tačka topljenja 193°C. pKa (potenciometrijski) 6.1, 9.1.
Primer 10
Priprema Icb ( mono trometamin so) : [ 3-[( 4- benzoilpiperazin- l- il)( okso) acetil]- 4-
metoksi- 7-( 3- metil- lH- l , 2, 4- triazol-}- il)- I Il- piroJo[ 2. 3- c] piridin- l- il] metil dihidrogen fosfat,
2- amino- 2-( hidroksimeti\) propcin- l, 3- d\ ol soli ( 1:1). Redosled reakcija je opisan u Šemi za
Primer 10.
Priprema di- terc- butil hlormetil fosfata
Smeša tetrabutilamonijum di-terc-butil fosfata (57 g, 0.126 mol, Digital Specialtv Chemicals) i hlorjodometana (221 g, 1.26 mol) mešana je na sobnoj temperaturi četiri časa pre nego što su isparljive materije uklonjene pod vakuumom. 500 ml etil etra dodato je ostatku i nerastvorljiva čvrsta supstanca je otfiltrirana. Koncentrovanjem liltratain vacuoi uklanjanjem preostalih isparljivih materija primenom vakuum pumpe dobijen je di-terc-butil hlormetil fosfat kao svetio braon ili žuto ulje, koje je upotrebljeno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.
Priprema IIc: ( 3-( 2-( 4- benzoilpiperazin- l- il)- 2- oksoacetil)- 4- metoksi- 7-( 3'- metil- III-1.2, 4- triazol- l- il)- lH- pirolof 2, 3- cJpiridin- 1 - U) metil di- terc- butil fosfata
NaH (2.6 g, 10.3 mmol, 95% u ulju. 5 ekv.) je lagano dodat u suspenziju jedinjenja IVc (10.0 g, 21.1 mmol) u suvom THF (100 ml) i smeša je ostavljena da se meša 0.5 časova na sobnoj temperaturi. Rastvor joda (5.27 g, 20.8 mmol) rastvoren u THF (10 ml) lagano je dodat u mešajući rastvor i to brzinom kojom je sprečeno stvaranje pene ili burna reakcija. Dobijena smeša je mešana još 3 časa pre nego što je uveden drugi deo od 2.6 g NaH. Posle 15 minuta na temperaturi sredine di-terc-butil hlormetil fosfata, dodata je cela doza di-terc-butil hlormetil fosfata, dobijena iz koraka jedan. Posle mešanja od 16 časova, reakciona smeša je sipana u ledeni NH4OAc (30%) (120 ml), a zatim je izvršena ekstrakcija sa EtOAc (3 x 300 ml). Spojeni organski ekstrakti su isprani vodom (100 ml) i zatim slanim rastvorom (100 ml), sušeni preko Na2S04i koncentrovani pod vakuumom da bi se dobio ostatak, koji je prečišćen silika gel hromatografijom (eluiranje sa EtOAc/Ef?N (50/1) i zatim EtOAc/MeOH (100/1)) da bi se dobilo 8.0 g (-75% APS -41% prinos) diestra IIc kao svetio žuta čvrsta supstanca.
'H NMR (500 MHz, CD3OD) 5 8.82 (s, IH), 8.41 (s, IH), 8.04 (s, IH), 7.47 (b, 5H), 6.00 (d, 2H, J= 14.5Hz), 4.10 (s, 3H), 4.00 - 3.40 (b, 8H), 2.49 (s, 3H), 1.28 (s, 18H);,<3>C NMR (125 MHz, CD3OD) 5 18.6, 176.4. 172.9, 168.0, 162.6, 152.6, 147.5, 144.0, 136.5, 131.5, 130.8, 129.9, 129.1, 128.3, 126.1, 124.0, 116.2, 85.8, 75.4,61.6, 57.7,30.1,22.2, 13.7; HRMS m/z: (M+H)<+>izrač. za C33H43N708P 696.29, zabeleženo 696.34.
Priprema Icb ( mono L trometamin soli) : [ 3-[( 4- benzoilpiperazin- 1- il)( okso) acetil] - 4-
metoksi- 7-( 3- metil- lH- l , 2, 4- triazol- l- il)- lH- pirolo[ 2, 3- c] piridin- l- il] metil dihidrogen fosfat,
2- amino- 2-( hidroksimetil) propan- l, 3- diol soli ( 1:1)
500 mg (-75 AP, 0.54 mmol) diestra IIc rastvoreno je u smeši vode (2.5 ml) i acetona (2.5 ml). Dobijena smeša je mešana na 40°C 16 časova da bi se završila solvoliza. Ovoj reakcionoj smeši dodat je 3.0M vodeni rastvor TR1S (mono trometamin) da bi se pH vrednost podesila do 3.32. Aceton (30 ml) je lagano dodavan u reakcionu smešu 1 čas.<*>Pošto je dodavanje acetona završeno, rastvor je mešan preko noći da bi se završila kristalizacija jedinjenja Icb. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i isprana sa 20 : 1 acetona- vode (2 x 5 mL). Bela kristalna čvrsta supstanca je sušena pod kućnim vakuumom pod atmosferom azota na 50°C 24 časa da bi se dobilo 290 mg jedinjenja Icb (>98.5 AP).
<*>PosIe dodavanja oko 15 i 20 ml acetona, u reakcionu smešu je uneta klica kristala Icb.
Icb dobijen u prethodnom postupku:<*>H NMR (500 MHz, CD3OD) 8 8.83 (s, 1H)5 8.52 (s, IH), 8.02 (s, IH) 7.49 (b, 5H)5 5.469 (d, 2H, J= 13 Hz), 4.11 (s, 3H)5 4.00 - 3.40 (m, 8H), 3.66 (s, 6H)5 2.50 (s, 311);,<3>C NMR (125 MHz, CD3OD) 8 185.6, 171.9, 167.4, 161.4, 151.7, 146.9, 143.8, 135.4, 130.3, 129.7, 128.8, 127.2, 124.9. 122.6, 114.3, 73.5, 61.8, 59.9, 56,5, 46.0, 41.75 12.6. HRMS m/z: (M-trisamin+H)<+>izrač.za C25IL7N7O8P584.1659.zabeleženo 584.1664. Anal. izrač. C, 49.43; H, 5.29; N, 15.90; P, 4.39; zabeleženo: C, 49.18; H, 5.38; N, 15.59; P, 4.26. tačka topljenja 203°C.
Dobijen pomoću drugog postupka (hidroliza sa TFA u metilen hloridu), so Icb je~1 molarna mono trometamin so sa 0.47% vode, 0.1% acetona i 0.05% metanola.<*>H NMR (500 MHz, d6-DMSO, 30°C) 8 8.77 (s, 1H)5 8.48 (s, IH), 8.00 (s, IH) 7.44 (b, 5H), 5.42 (d, 2H, J = 15Hz), 4.02 (s, 3H), 3.70 - 3.30 (m, 8H), 3.41 (s, 6H), 2.38 (s, 311);<13>C NMR (125 MHz, CDC13, 30°C) 8 184.8, 169.0, 165.8, 160.3, 150.4, 146.2, 143.2, 135.4, 129.4, 128.9, 128.2, 127.7, 126.9, 123.2, 122.2, 112.9, 72.3, 60.7. 59.0, 56.7, 13.4. MS m/z: (M-trisamin+H)<+>izrač. za C75H27N7OSP 584.2, zabeleženo 584.0. Anal. izrač. C, 49.11; H, 5.37; N, 15.76; P, 4.32; zabeleženo: C, 48.88; II 5.28; N, 15.71; P, 4.16. tačka topljenja 201 - 205°C.
Opšti postupak za formiranje dodatnih soli jedinjenja Iac
Postupak A:
1.2 ekv. metal alkoksida dodato je u rastvor fosforne kiseline u THF i talog je sakupljen kao so.
Postupak B:
2.2 ekv. (za Na, K) ili 1.2 ekv. (za Mg) metal alkoksida dodato je u rastvor fosforne kiseline u THF. Posle 2 časa, rastvarač je isparavan i MeOH je dodat da bi se dobio bistar rastvor. EtOH ili iPrOH je zatim dodavan u rastvor sve dok on nije postao mutan. Zatim je pažljivo dodat MeOH da bi se rastvor ponovo razbistrio. Mešani rastvor je ostavljen otvoren prema vazduhu 16 časova i dobijeni talog je sakupljen kao so.
Postupak C:
2. 2 ekv. amina dodato je u rastvor fosforne kiseline u THF. Posle 2 časa, rastvarač je isparavan i MeOH je dodat da bi se dobio bistar rastvor. EtOH ili iPrOH je zatim dodavan u rastvor sve dok on nije postao mutan. Zatim je pažljivo dodavan MeOH da bi se rastvor razbistrio. Mešani rastvor je ostavljen otvoren prema vazduhu 16 časova i dobijem talog je sakupljen kao so. Primer 11 Priprema jedinjenja II ' a od Ha
Di-fosfat ester Ha (500 mg) rastvoren je u 5 ml 10% TFA u THF. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 4 časa pre nego što je ugašena sa 10%o vodenim rastvorom Na2C03(30 ml). Posle ispiranja sa EtOAc (50 ml), vodena faza je koncentrovana pod vakuumom da bi se dobio ostatak koji je prečišćen primenom Shimadzu automatskog preparativnog HPLC sistema da bi se dobio željeni mono- fosfat IFa (26.5 mg). 'H NMR (500 MHz, CDCI3)d 8.13(s, IH), 7.40 (b, 6H), 6.13 (d, 211. J = 11.5Hz), 4.05 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.90 - 3.40 (m, 8H), 1.39 (s, 9H); MS m/z: (M+H)<+>izrač. za C27H34N4O9P 589.21, zabeleženo 589.13; LC vreme zadržavanja 1.32 min (Kolona: Xterra 4.6x50mmC18 5um).
Alternativna priprema di- terc- butil hlormetil fosfata
Reakcija
U neaktivan reaktor dodati su di-terc-butil kalijum fosfat (1.69 kg), 4.0 ekv. natrijum karbonata i 0.05 ekv. tetrabutil amonijum hidrogen sulfat kroz priključnu cev. Metilen hlorid (7.7 L/kg) je zatim pumpan kroz raspršivač da bi isprali zidovi reaktora. Sa temperaturom košuljice ispod 10°C, dodavana je voda za postizanje egzotermne reakcije tokom deset minuta (7.6 L/kg). Povezana egzotermna reakcija bila je minimalna sa temperaturom doze koja se povećala od 11.1 do 16.2°C u toku dodavanja. Sa temperaturom košuljice i doze blizu 7 i 15°C, redom, 2.0 ekv. hlormetilsulfonilhlorida (CMCS) je dodato preko levka za dodavanje. Punjenje je nastavljeno 2 časa dok je temperatura košuljice lagano rasla do 20°C u toku punjenja. Maksimalna temperatura doze u toku punjenja CMCS bila je 25.3°C. Temperatura košuljice lagano je povećavana u toku punjenja da bi se osiguralo daje egzotermna reakcija započeta jer su preliminarni laboratorijski rezultati pokazali da egzotermna reakcija može biti usporena na nižim temperaturama doze. Reakciona smeša je mešana i posle 3.5 časa, NMR uzorak je pokazao daje reakcija napredovala 72%. Reakcija je ostavljena da teče u preko noći sa temperaturom doze između 19.7 i 23.6°C (Delta V historian). NMR uzorak uzet posle 16 časova pokazao je konverziju reakcije od 76%. Konverzija laboratorijskih doza bila je u opsegu od 60 do 80%>.
Obrada
Posto je ocenjeno da je reakcija završena, dodatna količina vode od 9.3 L/kg je dodata dozi da bi se postiglo razdvajanje faze. Donja faza koja je bogatija proizvodom prebačena je u balon i gornja vodena faza je bačena. Mali otpadni sloj je čuvan sa organskim slojem koji je bogat proizvodom. Organska faza je vraćena u R- IA i dodatna količina vode od 5.1 L/kg dodata je za ispiranje. Faze su se razdvojile, organski sloj bogat proizvodom, u količini od približno 18.5 kg, prebačen je u balon, dok je gornja vodena faza bačena. U drugom razdvajanju slojeva nije zabeleženo prisustvo otpadnog sloja ili čvrstih supstanci. Međutim, preporučuje se dodatno filtriranje organskog sloja bogatog proizvodom da bi se uklonile istaložene soli.
Destilacija metilen klorida
Organski sloj bogat proizvodom je prebačen u posudu rotacionog isparivača EVAPO-1A. Destilacija metilen hlorida započeta je sa temperaturom košuljice od približno 22°C. Brzina destilacije je opala posle 4.5 časa i uzorak doze je uzet da bi se analizirao sadržaj metilen hlorida. NMR analiza je pokazala 4 : 1 odnos di-terc-butil hlormetil fosfata prema metilen hloridu. Tipični laboratorijski rezultati ove frakcije pokazali bi 10 : 1 odnos tako daje destilacija nastavljena sa povećanjem temperature košuljice rotacionog uparivača. Posle dodatnih 2.5 časa, zaustavljena je destilacija. NMR uzorak doze pokazao je da se odnos povećao do 5:1 di-terc-butil hlormetil fosfata prema metiln hloridu. Maksimalna temperatura košuljice rotacionog uparivača bila je 28.4°C.
Čistoća di- terc- butil hlormetil fosfatnog ulja
NMR analiza di-terc-butil hlormetil fosfatnog ulja pokazala je potencijal đa bude veća od 100%. Razvojni postupak obično proizvodi materijal sa potencijalom od 100 ± 10%. Karl-Fischer analizom izmeren sadržaj vode je 0.02 mas.% i GC analizom izmeren sadržaj metilen hlorida je 10.69 mas.%>. Prema tome, zabeleženi potencijal je 89.29 mas.% računajući za doprinos metilen hlorida i vode u ulju.
Čuvanje di- terc- butil hlormetil fosfata
Di-terc-butil hlormetil fosfat ulje postavljeno je hladnu sobu i temperatura je praćena preko registratora sa trakom. Laboratorijske doze se obično održavaju između 0 do 5°C. NMR proizvoda posle 104 časova držanja u hladnoj sobi pokazuje da materijal nije izgubio potencijal. (Sigurnosno testiranje izvedeno u toku istraživanja pokazuje da se tokom čuvanja ulje samo od sebe zagreva uz naknadno povećanje pritiska).
NMR Standardna priprema i priprema uzorka
Priprema standardnog rastvora trimetil fosfata (TMPO U):
Standardni rastvor TMP04 trebalo bi pripremiti na osnovu 100 M% teoretskog prinosa. Na primer: punjenje od 10 g di-t-butil kalijum fosfatne soli trebalo bi da da prinos od 10.41 g (0.402 mola) di-terc-butil hlormetil fosfata. Zapremina dihlormetana u reakcionoj smeši biće 75 mL. Molaritet rastvora je 0.536. Rastvor TMPO4trebalo bi pripremiti u tom molaritetu i 0.5 mL tog rastvora trebalo bi spojiti sa 0.5 mL dihlormetanskog sloja iz reakcije. Integrali dobijeni iz P NMR mogu se direktno porediti i daće % konverzije di-terc-butil hlormetil fosfata.
Određivanje % neodreagovalog početnog materijala u vodenoj fazi reakcije:
Posle beleženja zapremine vodene faze reakcije, tačno 0.500 mL se prebacuje u 1-dram bočicu koja sadrži poznatu težinu unutrašnjeg standarda TMPO4. dodaje se približno 0.24 mL D2O. Izvodi se mućkanje da bi se potpuno pomešalo. Dobija se<3>,P-kvantni spektar.
Izračunavanje % neodreagovalog početnog materijala:
Primer:
Određivanje %- polencijala proizvedenog ulja:
Posle beleženja neto mase destilovanog proizvedenog ulja, izmeriti 1-dram, bočicu sa poklopcem koji se zavrće koja sadrži poznatu masu unutrašnjeg standarda TMPO4. Prebaciti približno 0.02 mL proizvedenog ulja u bočicu i zabeležiti neto težinu proizvedenog ulja. Dodati približno 0.7 mL CDC1>Mućkati da bi se potpuno izmešalo. Dobijen je<3I>P-kvantni spektar. Pregledati<]>H NMR spektar za prisustvo rezidualnog katalizatora prenosa faze (tetra-n-butil-amonijum bisulfata) i metilen hlorida. Zabeležiti ovo kao mol% u odnosu na proizvod.
Izračunavanje %-potencijala:
Primer:
NMR rezultati za di- terc- butil hlormetil fosfat
'H NMR (300.13 MHz, CDC13): 8 1.52 (s, 18H), 5 5.67 (d, J= 15.5, 2H)<B>C NMR (75.47 MHz, CDCI3): 6 29.77 (d, J= 4.5, 6C), S 73.34 (d, J= 7.5, IC), 8 84.16 (d, J= 1.5, 2C) 3,P NMR (121.49 MHz, CDC13): 8-10.51 (s, IP)
Primer 12: Alternativna priprema Iab ( prolek IVa)
Posuda od 500 ml sa 4 grlića i sa okruglim dnom, opremljena mešalicom sa gornje strane, termoelementom. levkom za dodavanje, uvodnim otvorom za azot i pregradom napunjena je sa IVa (20.01 g, 47.37 mmol), K2C03(13.13 g, 95.00 mmol) i DMSO (100 ml, 1.41 mola) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi dajući svetio braon heterogenu suspenziju. Di-terc-butil hlormetil fosfat (14.83 g, 57.32 mmol) je dodat preko levka za dodavanje i reakcija je zagrevana do 30°C 16-24 časa nakon čega je reakcija hlađena do 10°C. U reakciju je dodat DCM (200 ml) i zatim je reakcija lagano ugašena vodom (200 ml) uz održavanje temperature reakcije ispod 20°C čime se dobija dvofazna smeša. Donji sloj bogat proizvodom je odvojen, ispran vodom (200 ml), zatim prebačen u posudu od 500 ml sa 4 grlića i okruglim dnom koja je opremljena sa mešalicom sa gornje strane, termoelementom, levkom za dodavanje i uvodnim otvorom za azot. Trifluorosirćetna kiselina (53.0 ml, 700.94 mmol) je dodata preko levka za dodavanje čime se dobija blago egzotermna reakcija. Reakcija je mešana 1-3 časa, zatim hlađena do 0°C. Dodat je metanol (300 ml) uz održavanje temperature reakcije ispod 20°C, i zatim je izvršeno hlađenje do 0°C. Reakciona posuda je povezana sa aparatom za destilaciju i koncentrovana pod vakuumom do zapremine od 200 ml (200 torr, < 30°C). U reakciju je dodata klica kristala Iac (0.200 g) i zatim je reakcija mešana preko noći na sobnoj temperaturi čime je dobijen talog. Talog je filtriran i vlažan ostatak sa filtra je ispran sa THF (300 ml) i zatim sušen u vakuumskoj peći na 50°C preko noći čime se dobija svetio žuti do beli prašak (23.94 g, 95%). 'H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 8.30 (s. IH), 7.55 (s, IH), 7.44 (s, 5H), 6.12 (d, J= 10.6 Hz. 2H), 3.97 (s, 3H), 3.85 (s, 311), 3.80-3.22 (m, 8H);,<3>C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 5 185.49, 169.26, 166.06, 146.20, 145.60, 140.64, 135.50, 129.68, 128.41, 127.04, 123.46, 121.17. 120.08, 114.32, 72.43, 56.92, 53.32, 45.22, 40.50; ES+ MS m/z (rel. intenzitet) 533(MH+, 100), 453(MH+ - H3PO4, 15).
U reaktor od 10 L sa 4 grlića koji je opremljen termoelementom, mešalicom sa gornje strane, kondenzatorom i ulaznim otvorom za azot dodat je Iac (611 g. 1.15 mol) i voda (3875 ml). U dobijenu suspenziju dodat je lizin (168 g, 3.15 mol). Reakcija je mešana jedan čas na sobnoj temperaturi, zagrevana do 50°C i zatim održavana na 50°C uz mešanje još jedan čas. Dobijeni mutan rastvor (pH = 4.55) je filtriran kroz 10 mikronski Cuno filter u reaktor od 20 L sa 4 grlića koji je opremljen termoelementom, mešalicom sa gornje strane, kondenzatorom i ulaznim otvorom za azot. Reakcija je zagrevana do 50°C i zatim je brzo dodat aceton (8 L). Reakcija je ostavljena da se zagreva do 50°C, zatim je dodavan aceton (4 L) umerenom brzinom održavajući reakcionu temperaturu iznad 45°C. U reakciju je dodata klica kristala Iab (0.200 g) i zatim je reakcija hlađena do sobne temperature u toku 5 časova čime se dobija talog. Talog je mešan preko noći na sobnoj temperaturi i zatim filtriran. Vlažni ostatak sa filtra ispran je acetonom (4 L) i zatim sušen u vakuumskoj peći na 25°C preko noći uz ispuštanje struje vlažnog vazduha čime se dobija pahuljast beli prašak (751 g, 96%).
Primer 13: Alternativna priprema Icb ( prolek IVc)
Reaktor od 10 L opremljen mešalicom sa gornje strane, termoelementom, aparatom za destilaciju i ulaznim otvorom za azot napunjen je jedinjenjem IVc (200.00 g, 422.39 mmol), Cs2C03(344.06 g, 1.06 mol), Kl (140.24 g, 844.81 mmol) i NMP (1.00 L, 10.38 mol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi čime se dobija svetio braon heterogena suspenzija. Di-terc-butil hlormetil fosfat (273.16 g, 1.06 mol) je dodat preko levka za dodavanje i reakciona smeša je zagrevana do 30°C 16-24 časova uz istovremeno mešanje nakon čega je reakcija hlađena do 5°C. U reakciju je dodat DCM (1.5 L) i zatim je reakcija lagano ugašena vodom (3.5 L) uz održavanje reakcione temperature ispod 20°C čime se dobija dvofaza smeša. Donji sloj bogat proizvodom je odvojen, ispran vodom (3.5 L x 3) i zatim prebačen nazad u reaktor. Rastvor je koncentrovan pod vakuumom do zapremine od 1 L održavajući temperaturu ispod 25°C. EPA je dodat (2 L) i zatim je reakcija koncentrovana pod vakuumom do zapremine ođ 2 L održavajući temperaturu ispod 25°C. U reakciju je zatim uneta klica kristala IIc (0.200 g), reakcija je zatim mešana preko noći na sobnoj temperaturi čime se dobija suspenzija. Suspenzija je filtrirana i vlažni ostatak sa filtra je ispran sa MTBE (1 L), sušen u vakuumskoj peći na 50°C preko noći čime se dobija žuti/beli prašak (207.1 g, 70%).
'H NMR (400 MHz, CDC13) 6 8.54 (s, IH), 8.18 (s, IH), 7.91 (s, IH), 7.42 (s, 5H), 5.95 (d, J= 14.2 Hz, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.97- 3.36 (m, 8H), 2.50 (s, 3H), 1.27 (s, 18H);<13>C NMR (100 MHz, CDC13) 5 184.64, 170.65, 165.91, 161.60, 150.82, 145.38, 141.89, 134.96, 130.20, 129.59, 128.68, 127.58, 127.10, 124.77, 122.64, 115.22, 83.90, 83.83, 73.69, 73.63, 56.95, 46.04, 41.66, 29.61, 29.56, 13.90; ES+ MS m/z (rel. intenzitet) 696 (MH<+>, 10), 640 (MH<+>- izobutilen, 30), 584 (MH<+>- 2 izobutilen, 100).
U reaktor od 10 L sa 4 grlića opremljen termoelementom, mešalicom sa gornje strane, kondenzatorom i ulaznim otvorom za azot dodat je Ile (200.24 g, 287.82 mmol), aceton (800.00 ml, 10.88 mol) i voda (800.00 ml, 44.41 mol). Reakcija je zagrevana do 40°C i mešana 18-24 časova. Reakcija je hlađena do 20°C i zatim je dodat trometamin (33.62 g, 277.54 mmol). Reakcija je zagrevana do 40°C i zatim je mešana još jedan čas sve dok se sva čvrsta supstanca nije rastvorila. Reakcija je hlađena do 20°C i zatim filtrirana kroz 10 mikronski Cuno filter u reaktor od 10 L sa 4 grlića opremljen termoelementom, mešalicom sa gornje strane i ulaznim otvorom za azot. Aceton (3 L) je brzo dodat, a zatim je uneta klica kristala Icb (0.500 g), nakon toga dodata je nova količina acetona (3 L). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći u suspenziji i zatim filtrirana. Vlažni ostatak sa filtra je ispran acetonom (800 ml) i zatim sušen u vakuumskoj peći na 50°C preko noći Čime se dobija pahuljast beli prašak (165.91 g, 82%).
Dodatna informacija:
Izolacija intermedijera slobodne kiseline Ic:
U reaktor od 250 mL sa 3 grlića opremljen termoelementom, mešalicom sa gornje strane, kondenzatorom i ulaznim otovorom za azot dodat je IIc (10.0 g, 14.37 mmol), aceton (40.00 ml, 544.15 mmol) i voda (40.00 ml, 2.22 mol). Reakcija je zagrevana do 40°C i mešana 14-24 časova. Reakcija je hlađena do 20°C i zatim mešana tri časa. čime je dobijena suspenzija. Suspenzija je filtrirana, a zatim je vlažni ostatak sa filtra ispran acetonom (40.00 ml) i nakon toga sušen u vakuumskoj peći na 50°C preko noći čime je dobijen pahuljast beli prašak (7.00 g, 83%). NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 8.84 (s, IH), 8.47 (s, IH), 8.06 (s, IH), 7.45 (s, 5H), 5.81 (d, J= 12.3 Hz, 2H), 4.03 (s, 311), 3.91-3.19 (m, 8H), 2.39 (s, 3H);<!3>C NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5 185.20, 169.32, 165.85, 160.75, 150.51, 146.30, 143.24, 135.53, 129.74, 129.22, 128.46, 127.34, 127.09, 123.67, 122.73, 113.94, 72.90 (d,2Jc. f=5 Hz), 57.01, 45.2 (bs), 40.8 (bs), 13.66. ES+ MS m/z (rel. intenzitet) 486 (MH<+>- H3P04, 100).
Primer 14: Alternativna priprema Ibb ( prolek IVb)
U reaktor od 10 L opremljen mešalicom sa gornje strane, termoelementom i ulaznim otvorom za azot dodat je IVb (400.00 g, 894.73 mmol). Cs2C03(873.70 g, 2.68 mol). Kl
(297.70 g, 1.79 mol) i NMP (1.00 L, 10.38 mol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi čime se dobija svetio braon hetrogena suspenzija. Di-terc-butil hlormetil fosfat (460.50 g, 1.78 mol) je dodat preko levka za dodavanje i reakcija je zagrevana do 30°C, 16-24 časova za koje vreme je reakcija hlađena do 5°C. U reakciju je dodat n-BuOAc (2.4 L) i zatim je reakcija lagano ugašena vodom (4 L) održavajući temperaturu reakcije ispod 20°C čime je dobijena dvofazna smeša. Donji vođeni sloj je uklonjen iz reaktora, zatim je u gornji sloj bogat proizvodom uneta klica kristala IIc, (0.40 g), nakon toga je izvršeno mešanje od 3 časa na sobnoj temperaturi čime je dobijena suspenzija. Suspenzija je filtrirana i zatim je vlažni ostatak sa filtra ispran sa MTBE (1.6 L) i nakon toga sušen u vakuumskoj peći na 50°C preko noći čime se dobija žuti/beli prašak (483.2 g, 81%). 'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8.35 (s, 1H)5 8.27 (s, IH), 8.22 (s, IH), 7.90 (s, IH). 7.42, (s, 5H)5 5.92, (d, J= 14.9 Hz, 2H), 4.02-3.40 (m, 8H), 1.24 (s, 18H);,<3>C NMR (100 MHz, CDCh) 8 182.75, 170.64, 152.07, 144.03, 134.91, 133.96, 131.82, 130.21, 128.68, 128.27, 128.00, 127.07, 125.81, 124.01, 113.82, 84.00, 83.93, 73.97, 46.12, 41.90, 29.57, 29.53; ES<+>MS m/z (rel. intenzitet) 558(MH<+>, 100).
U reaktor od 300 ml sa 4 grlića opremljen termoelementom. mešalicom sa gornje strane, kondenzatorom i ulaznim otvorom za azot dodat je Ilb (18.0 g, 26.87 mmol), EPA (36.00 ml, 470.92 mol) i voda (36.00 ml, 2.0 mol). Reakcija je zagrevana do 40°C i mešana 18-24 časova. Reakcija je hlađena do 20°C i zatim je dodat lizin (3.73, 25.54 mmol). Reakcija je mešana 1 čas sve dok se nije rastvorila sva čvrsta supstanca. I PA (54 ml) je dodavana u toku 30 minuta nakon čega je uneta klica kristala Ibb (0.180 g) i izvršeno je mešanje još 30 minuta. IPA je dodavana (18 ml) u toku 1 časa i zatim je reakcija zagrevana do 50°C čime je dobijena gusta suspenzija. U reakciju je uneta klica kristala Ibb (0.180 g) zatim je IPA (36ml) dodavan u toku 2 časa i nakon toga je izvršeno mešanje od 12 časova čime je dobijena suspenzija. Reakcija je zagrevana do 70-80°C u trajanuju od 2 do 3 časa i zatim hlađena do 50567 B
50°C. IPA (59 ml) je dodavana u toku 1 časa i zatim je dodatna količina EPA (121 ml) dodavana u toku 1 časa. Reakcija je hlađena do 20°C u toku 2 časa i zatim mešana još 2 časa, a nakon toga filtrirana. Vlažni ostatak sa filtra ispran je sa IPA (180 ml) i zatim sušen u vakuumskoj peći na 50°C preko noći čime je dobijen beli prašak (15.43 g, 82%).
Dodatna informacija:
Postupak za izolaciju intermedijera slobodne kiseline Ibc:
U bocu od 500 ml sa 3 grlića opremljenu termoelementom, mešalicom sa gornje strane, kondenzatorom i ulaznim otvorom za azot dodat je Ilb (50.00 g, 74.76 mmol), aceton (100.00 ml, 1.36 mol) i voda (100.00 ml, 5.55 mol). Reakcija je zagrevana do 40°C i mešana 18-24 časova.
U bocu od 250 ml sa 3 grlića opremljenu pH sondom, magnetnom šipkom za mešanje i ulaznim otvorom za azot dodato je 150 ml prethodnog Ibc rastvora i zatim je pH vrednost podešena do pH = 6.2 sa 10 N NaOH. Rastvor je prebačen u levak za odvajanje, zatim ispran sa EtOAc (100 ml) i nakon toga sa DCM (100 ml), zatim je prebačen nazad u bocu od 250 ml sa 3 grlića. pH vrednost je podešena do pH = 1.3 sa 2 N HC1. nakon čega je izvršeno mešanje od tri časa, čime se dobija suspenzija koja je filtrirana. Od vlažnog ostatka sa filtra ponovo je napravljena suspenzija u MTBE (150 ml), zatim je izvršena filtracija i nakon toga ponovo je napravljena suspenzija u THF/vodi (100:1. 130 ml) 45 minuta, zatim je izvršeno filtriranje i sušenje u vakuumskoj peći na 50°C preko noći čime je dobijen beli prašak (10.0 g, 33%). NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 8.69 (s. IH), 8.62 (s, IH), 8.42 (s, IH), 7.98 (s. IH), 7.41 (s. 5H), 5.47 (d, J= 13.3 Hz, 2H), 3.99-3.18 (m, 8H); "C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 183.97,50567B
169.23, 165.20, 151.69, 145.91, 135.48, 133.83. 131.59, 129.65, 129.11, 129.03, 128.42, 127.77, 127.49, 127.03, 122.62, 112.08, 72.57. ES+ MS m/z (rel. intenzitet) 558(MH<+>, 100).
Primer 15: Priprema proleka le
Korak jedan
Priprema 2- ( 1 - ( 2-( 4- metoksi- 7- ( 3- metil- IH- 1, 2, 4- triazol- l- il)- l H- pirolo[ 2, 3-
cJpiridin- 3- il)- 2- oksoaeetil) piperidin- 4- ilidene)- 2-( piridin- 2- il) aeefonitril ( IVe) :2-(4-metoksi-7-(3-metil-lH-l,2,44riazol-l-il)-lH-pirolo[2,3-c]piridin-3-il)-2-oksosirćetna kiselina (1.5g), 2-(piperidin-4-iliden)-2-(piridin-2-il)acetonitril hidrohlorid (1.5 g), 3-(dietoksifosforiloksi)-1,2,3- benzotriazin-4(3H)-on (DEPBT) (2.1 g) i Huning baze (2 ml) spojeni su u 20 ml DMF. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 časova. DMF je uklonjen isparavanjem pod sniženim pritiskom i ostatak je podeljen sa MeOH (80 ml). Talog je sakupljen filtracijom da bi se obezbedilo 0.85 g proizvoda, 2-(l-(2-(4-metoksi-7-(3-metil-lH-l,2,4-triazol-l-il)-lH-pirolo[2,3-c]piridin-3-il)-2-oksoacetil)piperidin-4-iliden)-2-(piridin-2-iljacetonitrila (IVe). 'li NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5 12.42 (s, IH), 9.23 (m, III), 8.69 (m, IH), 8.27 (m, IH), 7.89 (m, 2H), 7.58 (m, IH), 7.52 (m, IH), 3.98 (s, 3H). 3.99 - 2.70 (m, 811), 2.60 (m, 311). MS m/z: (M+H)<+>izrač. za C25H23NX03 483.19, zabeleženo 483.18.
Korak dva
50567 B
Fosfatni estar (45.1 g, 0.1 mol) i hlorjodometan (200 g, 1.14 mol) spojem su u 100 ml benzola i smeša je mešana na sobnoj temperaturi četiri časa pre nego što je benzol uklonjen pod vakuumom. Zatim, 500 ml etil etra je dodato ostatku i nerastvorljiva čvrsta supstanca je otfiltrirana. Koncentrovan)em filtrata dobijen je di-terc-butil hlormetil fosfat, koji je upotrebljen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.
Korak tri
NaH (0.2 g, 95%) je lagano dodavan u suspenziju 2-(l-(2-(4-metoksi- 7-(3-metil- 1 H-1 ,2,4-triazol- l-il)-lH-pirolo[2,3-c]piridin-3-il)-2-oksoacetil)piperidin-4-iliden)-2-(piridin-2-il)acetonitrila (IVe) u suvom THF (20 ml) i smeša je ostavljena da se meša jedan čas na sobnoj temperaturi. Jod (0.4 g) rastvoren u suvom THF (2 ml) lagano je dodavan u mešajući rastvor. Smeša je mešana još 3 časa pre dodavanja 0.2 g NaH. Po završetku dodavanja dobijena smeša je mešana na temperaturi sredine još 15 minuta i zatim je dodat di-terc-butil hlormetil fosfat, dobijen iz koraka dva. Posle mešanja od 16 časova, reakciona smeša je sipana u ledeni NH4OAC(30%) (50 ml), a zatim je izvršena ekstrakcija sa EtOAc (3 x lOOml). Spojeni organski ekstrakti su isprani vodom (50 ml) i zatim slanim rastvorom (50 ml), sušeni preko Na2S04i koncentrovani pod vakuumom da bi se dobio ostatak koji je prečišćen silika gel hromatografijom (eluiranje sa EtOAc/Et3N (100/1)) da bi se dobilo 330 mg di-terc-butil (3-(2-(4-(cijano(piridin-2-il)metilen)piperidin-l-il)-2-oksoacetil)-4-metoksi-7-(3-metil-lH-l,2,4-triazol-l-il)-lH-pirolo[2,3-c]piridin-l-il)metil fosfata (Ile). 'H NMR (500 MHz, CD3OD) 5 8.85 (m. IH), 8.66 (m, IH), 8.45 (m, IH), 8.06 (m, IH), 7.92 (m, IH). 7.60 (m, IH), 7.43 (m. IH), 6.05 (m, 2H), 4.11 (s, 3H), 4.00 (m, IH), 3.82 (m, IH), 3.76 (m. IH), 3.60 (m, IH), 3.04 (m, IH), 2.95 (m, IH), 2.85 (m. IH). 2.80 (m. IH). 2.52 (s. 311), 1.30 (m, 18H). MS m/z: (M+H)<+>izrač. za C34H42NSO7P 705.29, zabeleženo 605.30.
Korak četiri
Di-terc-butil (3-(2-(4-(cijano(piridin-2-il)metilen)piperidin-l-il)-2-oksoacetil)-4-metoksi-7-(3 -metil-1H-1,2,4-triazol-1 -il)-1 H-pirolo[2,3-c]piridin-l -il)metil fosfat (Ile) rastvoren je u 8 ml mešanog rastvora TFA i dihlormetana (10% TFA/CH2CI?) i smeša je mešana tri časa. Svi rastvarači su uklonjeni pod vakuumom i ostatak je prečišćen primenom Shimadzu automatskog preparativnog 11PLC sistema da bi se dobilo 25 mg terc-butil (3-(2-(4-(cijano(piridin-2-il)metilen)piperidin-l-il)-2-oksoacetil)-4-metoksi-7-(3-metil-lH-1.2,4-triazol-l-il)-lH-pirolo[2,3-c]piridin-l-il)metil hidrogen fosfata (IPe) i 33 mg (3-(2-(4-(cijano(piridin-2-il)metilen)piperidin-l-il)-2-oksoacetil)-4-metoksi-7-(3-metil-lH-l,2,4-triazol-l-il)-lH-pirolo[2,3-c]piridin-l-il)metil dihidrogen fosfata (le).
terc-Butil (3-(2-(4-(cijano(piridin-2-il)metilen)piperidin-l-il)-2-oksoacetil)-4-metoksi-7-(3-metil-lH-T2,4-triazol-l-il)-lH-pirolo[2,3-c]piridin-l-il)metil hidrogen fosfat (Il'e): 'li NMR (500 MHz, CD3OD) 5 8.83 (m, IH), 8.55 (m, IH), 8.35 (m, IH), 7.92 (m, 2H), 7.54 (m, IH), 7.41 (m, IH), 5.86 (m, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.96 (m, 111), 3.72 (m, IH), 3.65 (m, IH), 3.47 (m, IH), 2.92 (m, IH), 2.85 (m, IH), 2.71 (m, 1H)5 2.65 (m, IH), 2.40 (s, 3H), 1.15 (m, 9H). MS mix: (M+H)<+>izrač. za CjoH^NsO+P 649.23, zabeleženo 649.22.
(3-(2-(4-(cijano(piridin-2-il)metilen)piperidin-l-il)-2-oksoacetil)-4-metoksi-7-(3-metil-lH-l,2,4-triazol-l-il)-lH-pirolo[2,3-c]piridin-l-il)metil dihidrogen fosfat (le): 1II NMR
(500 MHz, DMSO-d6) 5 8.88 (m, IH), 8.65 (m, IH), 8.50 (m, IH), 8.06 (m, IH), 7.90 (m, 1 H)3 7.49 (m, 2H), 5.82 (m, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.96 (m, IH), 3.88 (m, IH), 3.72 (m, IH), 3.46 (m, IH), 2.94 (m, IH), 2.82 (m, 2H), 2.73 (m, IH), 2.40 (m, 3H);<13>C NMR (125 MHz, DMSO-d6) 5 185.2, 165.6, 160.6, 159.1. 151.0. 150.4, 149.5, 146.2, 143.1, 137.4, 129.1, 127.2, 124.4, 123.6, 122.6, 117.4, 116.3, 113.9, 110.0, 72.8, 56.9,48.4, 44.4, 36.4, 34.0, 13.6. MS mix: (M+H)<+>izrač. za C26H26N807P 593.17, zabeleženo 593.14.
Primer 16: Priprema proleka If
U smešu jedinjenja IVf (99.5 mg, 0.21 mmol) u l-metil-2-pirolidinonu (1.0 ml) na sobnoj temperaturi u zatvorenoj boci dodat je Kl (144 mg, 0.87 mmol) i CS2CO3(416 mg. 1.28 mmol)), i smeša je mešana oko 5 minuta. Di-tercbutil hlormetil fosfat reagens (218 mg. 0.84 mmol) je zatim dodavan ukapavanjem. Dobijena smeša je zatim mešana na 35 do 40°C 20 časova. Smeša je zatim razblažena sa H2O (oko 8 ml) i ekstrahovana sa EtOAc (oko 8 ml). Organski ekstrakt je odvojen i isparavan da bi se dobio đi-t-butil hlormetil fosfat; analitička HPLC metoda: Rastvarač A 10% MeOH-90%. H2O-0.1% TFA: Rastvrač B 90%. MeOH-10% H2O-0.1%TFA; Početak %B = 0, Kraj %B = 100, vreme gradijenta = 2min, stopa protoka = 5 mL/min, Kolona: Xterra MS C18 S7 3.0x50mm; LC/MS: (ES) m/z (M+H)<+>= 694.22. HPLC R,= 1.243.
Smeša intermedijera Uf u H20/izopropanolu (1.0 ml/1.0 ml) u zatvorenoj boci sa okruglim dnom mešana je na 40°C, 9.5 časova. Smeša je zatim hlađena do sobne temperature i rastvor je prebačen u bočicu korišćenjem pipete. Ovom rastvoru je dodat MeCN (1.0 ml), a zatim je lagano dodat i izopropanol uz istovremeno mešanje korišćenjem lopatice. Prljavo beli talog je otfiltriran, ispran izopropanolom (2 x 1.0 ml) i zatim sušen pod visokim vakuumom da bi se dobio prolek If;<!>H NMR (500 MHz): (OMSO-d6) 5 8.76 (s, IH), 8.71 (s, IH), 8.69 (s, IH), 8.49 (s, IH), 8.09 (d, J= 8, IH), 8.06 (s, 111), 7.89 (d, J= 7, IH), 7.85 (app t, IH), 7.59 (app t, IH), 5.68 (d, J= 13, 2H), 4.00 (b m, 2H), 3.90 (b m, 2H), 3.85 (b m, 2H). 3.65 (b m, 2H); Analitička HPLC metoda: Rastvarač A 10% MeOH- 90% H2O-0.1% TFA; Rastvarač B 90% MeOH- 10% H2O-0.1% TFA; Početak %B = 0. Kraj %B = 100, vreme gradijenta = 2 min, stopa protoka = 5mL/min, Kolona: Xterra MS C18 S7 3.0x50mm: LC/MS: (ES) m/z (M+H)<+>= 582.00, HPLC Rt= 1.797.
Da bi bila uspešna, konverzija proleka u ishodno jedinjenje mora biti započeta alkalnim fosfatazama kod čoveka. Kvalitativnain vitroispitivanja korišćenjem humane placentalne alkalne fosfataze iin vivoispitivanja kod pacova pokazala su da je konverzija proleka bila brza kakoin vitrosa humanim enzimima tako iin vivokod pacova. Idealno, stopa konverzije biće brza tako da se samo ograničeno izlaganje proleku javlja i dobija se maksimalno izlaganje aktivnom ishodnom antivirusnom agensu. Rezultati ovih ispitivanja (u daljem tekstu) pokazuju daje u sva tri primera proleka procenjivanih kod pacova, prolek brzo konvertovan u aktivan ishodni lek i da su nivoi proleka u plazmi veoma niski u poređenju sa ishodnim lekom u odnosu na sve dobijene podatke. Ova ispitivanja su obavljena sa dozama na kojima doze ishodnog leka i doza ekvivalent iz fosfatnog proleka bile niske i približno jednake,~5 mg/kg. S obzirom da su prednosti prolekova đa se prevaziđe apsorpcija ograničena rastvaranjem, u niskim dozama prednosti prolekova u odnosu na manje rastvorljive ishodne molekule za kliničku upotrebu kod pacijenata neće biti očigledne.In vivoispitivanja niske doze korišćena su da bi se odredilo da li prolekovi proizvode ishodni molekul. Rastvorljivost ishodnih molekula IV zavisi od kristalnog oblika. Kristalni oblik je poželjan za razvoj leka. Podaci za sve ishodne molekule mogu se rezimirati time da je rastvorljivost kristalnog materijala u vodi za sve ishodne molekule IV < 50 ug/mL i u nekim slučajevima mnogo manje. Prema tome. stvarna rastvorljivost u vodi ishodnih molekula je niska i ima glavnu ulogu u smanjenju apsorpcije usled ograničenog rastvaranja u višim dozama.
Napomena 1:Derivat proleka (konc. -0.2 mM) inkubiran je sa alkalnom fosfatazom (ljudska placenta, Sigma, -1.4 jedinice) u pH 8 Tris puferu (konc. -0.03M, 1 mL), i praćeno je nestajanje proleka i formiranje ishodnog jedinjenja i to pomoću HPLC i LC/MS. U većini slučajeva, prolek je potpuno nestao, što odgovara formiranju ishodnog jedinjenja u roku od jednog ili dva časa, i nije zabeležen nijedan drugi intermedijer.
Napomena 2:Prolek je primenjiivan kod pacova oralno (u dozi ekvivalentnoj 5 mg/Kg ishodnog jedinjenja) ili intravenozno (u dozi ekvivalentnoj 1 mg/Kg ishodnog jedinjenja). Nivoi u plazmi pokazuju brzu konverziju u ishodno jedinjenje bez primetne količine proleka (po).
U donjim tabelama termin "LLQ" označava nižu granicu kod kvantitativnog određivanja (tj., nije zabeleženo).
Tabela 2: MAP ispitivanje A: Rezime PK posle oralne intravenozne primene proleka
Ia na pacove. Poređenje sa ranijim podacima za oralnu primenu jedinjenja IVa kod pacova
Isptivanje D rasta doze jednog od prolekova (Ica) izvedeno je kod pacova da bi se pokazale značajne prednosti prolekova u odnosu na ishodni lek za potencijalnu primenu u lečenju HIV-1 pacijenata posle oralnog doziranja. Rezultati izlaganja i mereni parametri iz ispitivanja rasta doze poređeni su sa sličnim rezultatima iz ranijih ispitivanja izvedenih sa ishodnim molekulima.
Na slikama 3 i 4 prikazano je poređenje AUC (površina ispod krive, mera izlaganja leku kod pacova) IVc oralnog doziranja proleka Ica (ispitivanje D) sa onim kod doziranja ishodnog molekula IVc (ispitivanje E) i toksikokintečko ispitivanje kod pacova (TK). Detalji za raniji IVc rast doze (ispitivanje E) i TK ispitivanje kod pacova (F) prikazani su na ovim slikama.
Kao što se može videti sa slika 3 i 4, AUC i Cmax ishodnog molekula posle oralne primene proleka (trouglovi) je veće od onog koje je rezultat primene ishodnog leka u dva posebna ispitivanja. Jasno, rezultati pokazuju da u cilju maksimizacije izlaganja leka u plazmi, prolek nudi iznenađujuću korist. S obzirom da su hemijske strukture ove klase molekula slične, prolekovi klase za koju se očekuje da pokazuju povećanje izlaganja iz primene prolekova pre nego ishodnog jedinjenja. Uz neizvesnost poboljšanja oralnog izlaganja sa fosftanim prolekovima i novine novih jedinjenja, ovaj rezultat nije bio očigledan i iznenađujuć je u svojoj veličini.
Protokol ispitivanja IV i oralne PK kod pacova ispitivanja fosfatnih prolekova A, B i C
Jedinjenja Ic (fosfatni prolek IVc), lb (fosfatni prolek IVb) i Ia (fosfatni prolek IVa) primenjivani su posebno na grupe tri mužjaka Sprague-Dawley pacova IV bolus injekcijom (1 mg/kg; sve doze navedene u ovom dokumentu su ekvivalentne ishodnom jedinjenju) ili preko orlane gavaže (5 mg/kg). Pacovi za ispitivanja oralnog doziranja izgladnjivani su preko noći. Jedinjenje Ic je primenjeno kao slobodna kiselina, a druga dva kao natrijumove soli. Dozirajući rastvori sva tri proleka kako za IV tako i za oralnu primenu pripremljeni su u 100% normalnom slanom rastvoru u 1 mg/mL (koncentracije dozirajućeg rastvora bile su ekvivalentne ishodnom jedinjenju). Uzorci plazme su sakupljani u EDTA vacutainer epruvete u toku 24 časa, i analizirani pomoću LC/MS/MS za prolekove i ishodne molekule. Farmakokinetička analiza je izvedena na Kinetica™.
Postupci za LC/MS/MS analizu prikazani su u protokolima u sledećem tekstu. Rezultati ovog ispitivanja prikazani su u Tabelama 2-4, srednje dve kolone.
Protokol ispitivanja rasta oralne doze kod pacova ( ispitivanje D)
Grupe od tri izgladnela mužjaka Sprague-Dawley pacova oralno su primale jedinjenje Ica (dinatrijum so) u dozi od 4.5, 21 i 163 mg/kg (doze su bile IVc ekvivalent). Dozirajući rastvori su pripremljeni u vodi u 1, 5 i 20 mg (ekvivalent jedinjenja Ic (slobodna kiselina))/mL za doze od 4.5, 21 i 163 mg (ekvivalent jedinjenja IVc)/kg, redom. Uzorci plazme su sakupljani u EDTA vacutainer epruvete u toku 24 časa, i analizirani pomoću LC/MS/MS za Ic i IVc. Farmakokinetička analiza je izvedena na Kinetica™.
Rezultati ovog ispitivanja prikazani su u Tabeli 46 i na slikama 3-5.
In vivo postupci
Postupak za ispitivanje Al: PO i IV primena IVa na pacove; PO doza je bila 5 mg/ kg
Jedinjenje IVa je primenjeno u polietilenglikol 400 (PEG400)/etanolskom (EtOH) rastvoru (90/10, zapr./zapr.), osim ukoliko nije naznačeno drugačije. Uzorci plazme i tkiva sakupljeni su i čuvani na -20°C do početka analize. Mužjaci Sprague-Davvlev pacova (300 - 350 g. Hilltop Lab Animals, Inc.. Scottdale. PA 15683) sa kanilama implantiranim u jugularnu venu i/ili žučni kanal korišćeni su u farmakokinetičkim ispitivanjima jedinjenja IVa. Pacovi su izgladnjivani preko noći u PO ispitivanjima. Uzorci krvi su sakpljeni (0.3 mL) iz jugularne vene u microtainer epruvete koje sadrže EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07147) da bi se dobila plazma. U IV ispitivanjima, doza od 1 mg/kg je primenjena na tri pacova u toku 0.5 min, i serijski uzorci plazme su sakupljeni pre doziranja i 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 i 1440 minuta posle doziranja. U PO ispitivanjima, pacovi (n = 3) su primili PO doze od 5 i 100 mg/kg. Serijski uzorci plazme su uzeti pre doziranja i 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 i 1440 minuta posle doziranja.
Oralni (PO) rezultati ovog ispitivanja prikazani su u koloni krajnje desno tabele 2.
Ispitivanje BI ishodnog leka
Za IV i PO farmakokinetička ispitivanja jedinjenja IVb kod pacova, jedinjenje IVb je rastvoreno u PEG-400/etanol (90/10) kao rastvor. Za IV i PO farmakokinetička ispitivanja jedinjenja IVB kod pasa, jedinjenje IVb je rastvoreno u PEG-400/etanolu (90/10) sa podešavanjem pH vrednosti sa 0.1 N NaOH. Detalji formulacija dati su u tabeli 6.
Pacovi.Korišćeni su mužjaci Sprague-Dawley pacova (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA) sa kanilama implantiranim u jugularnu venu i/ili žučni kanal. Pacovi su izgladnjivani preko noći u PO farmakokinetičkim ispitivanjima. Uzorci krvi od 0.3 ml sakupljeni su iz jugularne vene u microtainer epruvete koje sadrže EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), i centrifugirani da bi se odvojila plazma.
U IV ispitivanju, jedinjenje IVb je primenjeno u 1 mg/kg kao bolus injekcija u toku 0.5 min (n = 3). Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 2, 10, 15, 30, 45. 60, 120, 240, 360. 480 i 1440 minuta posle doziranja.
U PO ispitivanju jedinjenja IVb, pacovi (n = 3) su primili oralnu dozu od 5 mg/kg jedinjenja IVB. Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 i 1440 minuta posle doziranja.
Rezultati ovog oralnog (PO) ispitivanja prikazani su u tabeli 3, kolona krajnje desno.
Tabela 6: Formulacije IVb za in vivo ispitivanja
Bioanalitički postupci za in vivo ispitivanja analiziranja za IVb
Ovo se odnosi na postupak za analiziranje za nivoe koncentracijeIVbu uzorcima plazme pacova (korišćeni za ispitivanja B i BI).
Kvantitativno određivanje jedinjenja IVb pomoću LC/ MS/ MS u plazmi.Alikvote uzoraka plazme iz ispitivanja na pacovima, psima, majmunima ili šimpanzama pripremljene su za analizu taloženjem proteina plazme sa dve zapremine acetonitrila internog standard, jedinjenje IVa. Dobijeni supernatanti odvojeni su od istaloženih proteina centrifugiranjem od 10 minuta i prebačeni u autosempler bočice. Uzorci su pripremljeni ručno ili primenom Tomtec automatskog tečnog manipulatora. Alikvota od 5 u.L je injektirana za analizu.
HPLC sistem se sastojao od dve Shimadzu LC10AD pumpe (Columbia, MD), Shimadzu SIL-HTC autosempler (Columbia, MD) i Hevvlett Packard Series 1100 column compartment (Palo Alto, CA). Kolona je bila YMC Pro Cl8 (2.0 x 50 mm, 3 pm čestice, Waters Co., Milford, MA), održavana na 60°C i sa stopom protoka od 0.3 ml/min. Pokretna faza se sastojala od 10 mM amonijum formata i 0.1% mravlje kiseline u vodi (A) i 100% 10 mM amonijum formata i 0.1 % mravlje kiseline u metanolu (B). Početni sastav pokretne faze bila je 95% A. Posle injektiranja uzorka, pokretna faza se promenila u 15% A/85% B u toku 2 minuta i održavana u tom sastavu još 1 minut. Pokretna faza je zatim vraćena u početne uslove i kolona je ponovo dovedena us tanje ravnoteže za 1 minut. Ukupno vreme analiziranja bilo je 4 minuta.
HPLC je povezan sa Micromass Quattro LC. Azot ultravisoke čistoće je upotrebljen kao gas za raspršivanje i desolvataciju u stopama protoka od 100 L/hr za raspršivanje i 1100 L/hr za desolvataciju. Temperatura desolvatacije bila je 300°C i izvorna temperatura bila je 150°C. Za prikupljanje podataka korišćen je selektivni monitoring reakcije (SRM). Joni koji predstavljaju (M+H)' vrste za IVb i unutrašnji standard su izabrani u MSI i koliziono razdvojeni sa argonom na pritisku od 2 x 10° tora da bi se formirali posebni joni proizvoda koji su kasnije praćeni pomoću MS2. Prelazi, voltaže i vremena zadržavanja sažeti su u tabeli 7.
Standardna kriva plazme bila je u opsegu od 4 do 8000 ng/ml, kriva mozga od 1-1000 ng/ml. Krive su podešene sa kvadratnom regresijom izmerenom recipročnom koncentracijom (l/x). Standardi su analizirani u duplikatu. Uzorci kontrole kvaliteta (QC), pripremljeni u blank plazmi, u tri koncentracije unutar opsega kalibracione krive takođe su analizirani u tri kopije (triplikatu) sa svakim analitičkim setom. Za ovo jedinjenje, predviđene koncentracije ođ 90% plazma QC bile su unutar 20% nomalne koncentracije, ukazujući na prihvatljivu performansu testa.
Nosači i formulacije.U vezi sa tabelom 8, kada korišćeni nosač sadrži NaOH, pH vrednost formulacija rastvora jedinjenja IVc podešena je primenom NaOH da bi se dobila pH vrednost od 8.6-9.0, pri čemu je jedinjenje delimično jonizovano, na osnovu njegovog pKa od 8.4.
Kvantitativno određivanje jedinjenja IVc pomoću LC/ MS/ MS u plazmi ( korišćeno u ispitivanjima C, Cl i D).Alikvote uzoraka plazme iz ispitivanja na pacovima, psima, majmunima i šimpanzama pripremljene su za analizu taloženjem proteina plazme sa dve zapremine acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard, jedinjenje IVa. Dobijeni supematanti su odvojeni opd istaloženih proteina centrifugiranjem od 10 minuta i prebačeni u autosempler bočice. Uzorci su pripremljeni ručno ili primenom Tomtec automatskog tečnog manipulatora. HPLC sistem se sastojao od dve Shimadzu LC10AD pumpe (Columbia, MD), a Shimadzu SIL-HTC autosempler Columbia, MD), i Ilevvlett Packard Series 1100 column compartment (Palo Alto, CA). Kolona je bila YMC Pro Cl8 (2.0 x 50 mm. 3 pm čestice. Waters Co., Milford, MA), održavana na 60°C i stopa protoka od 0.3 ml/min. Pokretna faza se sastojala od 10 mM amonijum formata i 0.1% mravlje kiseline u vodi (A) i 100% 10 mM amonijum formata i 0.1% mravlje kiseline u metanolu (B). Početni sastav pokretne faze bio je 95% A. Posle injektiranja uzorka, pokretna faza je promenjena do 15% A/85%> B u toku 2 minuta i održavana u tom sastavu još 1 minut. Pokretna faza je zatim vraćena do početnih uslova i kolona je ponovo postavljena u stanje ravnoteže za 1 minut. Ukupno vreme analiziranja bilo je 4 minuta. HPLC je povezan sa Micromass Quatt.ro LC. Azot ultra visoke čistoće je korišćen kao gas za raspršivanje i desolvataciju na stopama protoka od 100 L/h za raspršivanje i 1100 L/h za desolvataciju. Temperatura desolvatacije bila je 300°C i temperatura izvora bila je 150°C. Za prikupljanje podataka korišćen je selektivni monitoring reakcije (SRM). Joni koji predstavljaju (M+H)' vrste za IVc i unutrašnji standard sakupljeni su u MSI i koliziono razdvojeni sa argonom na pritisku od 2 x 10"<3>tora da bi se formirali specifični joni proizvoda koji su kasnije praćeni pomoću MS2. Prelazi, voltaže i vremena zadržavanja prikazani su u tabeli 9.
Standardna kriva plazme bila je u opsegu od 4 do 8000 ng/ml, kriva mozga od 1-1000 ng/ml. Krive su fitovane kvadratnom regresijom izmerenom recipročnom koncentracijom (l/x). Standardi su analizirani u duplikatu. Uzorci kontrole kvaliteta (QC), pripremljeni u blank plazmi, u tri koncentracije unutar opsega kalibracione krive su takođe analizirani u triplikatu sa svakim analitičkim setom. Za ovo jedinjenje, predviđene koncentracije od 90% QC plazme su bile unutar 20% nominalne koncentracije, ukazujući na prihvatljiv učinak analize.
Kvantitativno određivanje tri proleka i njihovih ishodnih jedinjenja pomoću
LC/ MS/ MS u biološkim matriksima
Ovaj LC/MS/MS test je razvijen za ispitivanje tri jedinjenja proleka i njihovih ishodnih molekula u biološkim matriksima. Tri jedinjenja proleka bila su: Jedinjenja Ia,Ici lb i njihove odgovarajuće soli ili slobodne kiseline. Napomena - ovaj test je korišćen za oblike slobodne kiseline i soli tri proleka jer je detektovani molekularni jon nezavisan od protivjona soli. Njihova odgovarajuća ishodna jedinjenja bila su:IVa, IVciIVb.
HPLC sistem sastojao se od Shimadzu LClOADvp pumpi (Columbia, MD) i HTC PAL autosempler (Leap Technologies, Gary, NC) povezan za Svnergi Hydro-RP analitičku kolonu (2.0 x 50 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Pokretna faza A sastojala se ođ 0.1% mravlje kiseline u vodi; pokretna faza B bila je 0.1% mravlje kiseline u acetonitrilu. LC stopa protoka bila je 0.4 mL/min u maseni spektrometar. Početni sastav pokretne faze bio je 10% B podignut do 75% B u toku 1.75 min, zadržavan u tom sastavu 0.25 min, podignut do 100% B u toku 0.1 min, zadržavan 0.6 min. vraćen do početnih uslova u toku sledećih 0.1 minuta i zatim vraćen u ravnotežno stanje. Ukupno vreme analiziranja bilo je 4 min. Vremena zadržavanja za sve analite bila su u opsegu između 1.5 i 2.6 min.
HPLC sistem je povezan sa Sciex API3000 triple quadrupole maseni spektrometar (Toronto, Canada) opremlje sa Turboionsprav (turbojonsprej) izvorom podešenim na 450°C i voltažom jonskog spreja podešenom do 4.5 kV. UHP azot je upotrebljen kao raspršivač i pomoćni gasovi sa pritiscima od 80 psi i 7L/min, redom. Analiza je izvedena u modu za pozitivni jon. Prelazi su praćeni za sva jedinjenja i njihove kolizione energije (CE) bile su : m/z 533.41 > 435.24 zaIa(CE=19); m/z 584.46 > 486.29 zaIc(CE=23); m/z 558.31 > 432.13 za lb (CE=19); 423.39 > 204.96 zaIVa(CE=31); 474.36 > 255.97 zaIVc(CE=29); 448.35 > 105.20 zaIVb(CE=35).
Da bi se prilagodilo velikoj raznolikosti uzoraka bioloških matriksa, u pripremi uzoraka korišćeno je taloženje acetonitrila. Test uzorci i standardi su prebačeni u 96 komornu ploču primenom Packard Multiprobe II (Packard Instruments, Dovvners Grove, IL). 200 uL acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard (BMS- 647257, 500 nM) dodato je u 100 pL alikvote oba test uzorka i standarde u 96 komornoj ploči primenom Tomtec Cjuadra 96. Ploča je zatim vorteksovana približno 3 minuta i centrifugirana na 3000 rpm 15 minuta. Primenom Tomtec Quadra 96, 150 pL supernatanta prebačeno je iz ploče u čistu 96 komornu ploču. 150 uL 0.2% mravlje kiseline u vodi je zatim dodato u svaku komoricu primenom Tomtec Quadra 96 i ploča je vorteksovana pre analize. Standardne krive na osam tačaka koncentracije od 5 nM do 10 pM pripremljene su od stok rastvora u acetonitrilu i serijski razblažene u matriksu kako za prolek jedinjenja tako i za i shodna jedinjenja.
Standardne krive su prebačene u duplim 100 uL alikvotama u 96 komornu ploču koja sadrži test uzorke, ekstrahovane sa test uzorcima kao što je opisano u prethodnom tekstu i injektirane na početku, sredini i na kraju analize. Standradne krive su fitovane linearnom regresijom izmerenom kao l/x2. Rezultati i hromatografski vrhovi su obrađeni i koncentracije standarda i nepoznatih supstanci kvantitativno su određene primenom PEBiosvstenis Analvst™ 1.1.
In Vivo postupci
Uslovi za ispitivanje Cl, E i F ( ispitivanja PK, MAP i TK kod pacova)
Za IV i PO farmakokinetička ispitivanja jedinjenja IVc kod pacova, jedinjenje IVc je rastvoreno u PEG-400/etanol u (90/10) kao rastvoru. Pogledati tabelu 8.
Pacov.Košrišćeni su mužjaci Sprague-Davvlev pacova (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottđale, PA) sa kanilama implantiranim u jugularnu venu i/ili žučni kanal. Pacovi su izgladnjivani preko noći u PO farmakokinetičkim ispitivanjima. Uzorci krvi od 0.3 ml sakupljeni su iz jugularne vene u microtainer epruvete koje sadrže EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes. NJ), i ccntrifugirani da bi se odvojila plazma.
U IV ispitivanju, jedinjenje IVc primenjeno je u 1 mg/kg kao bolus injekcija u toku 0.5 min (n = 3). Serijski uzorci krvi sakupljeni su pre doziranja i 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120. 240, 360, 480 i 1440 minuta posle doziranja.
Cl ispitivanje PO pojedinačne doze
U PO ispitivanju Cl jedinjenja IVc, pacovi (n = 3) su primili oralnu dozu od 5 mg/kg jedinjenja IVc. Serijski uzorci krvi sakupljeni su pre doziranja i 15, 30, 45, 60. 120, 240, 360, 480 i 1440 minuta posle doziranja. Oralni (PO) rezultati iz ispitivanja Cl su u tabeli 4, kolona na kraju desno.
Ispitivanje E rasta oralne ( PO) doze
U ispitivanju E rasta oralne doze jedinjenja IVc, grupe pacova (n = 2 po grupi) primile su oralne doze od 25, 75 i 200 mg/kg. U 25 mg/kg, dozirajući rastvor je bio u rastvoru; u višim dozama, dozirajući rastvori bili su suspenzije. Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 i 1440 minuta posle doziranja. Uzorci mozga sakupljeni su na 1440 minuta da bi se ocenilo prodiranje u mozak. Uzorci mozga su osušeni i zabeležene su težine vlažnih uzoraka.. Oralni (PO) rezultati iz ispitivanja E su u tabeli 46.
Toksikološko ispitivanje F 2- nedeljne oralne doze kod pacova
U 2-nedeljenom oralnom ispitivanju F pacova (n=šest/polu/grupi), jedinjenje IVc je primenjeno u dnevnim dozama od 15, 75 ili 200 mg/kg. Toksikokinetičke procene na dane 1 i 14 pokazala je da su sistemska izlaganja (AUCo-24h) jedinjenja IVc generalno bila zavisna od doze ali nisu bila proporcionalna sa dozom (videti tabelu 5), bez dokaza za autoindukciju ili akumulaciju. Na dan 14, AUCo-24hvrednosti bile su malo više kod ženki (<644 pg<*>hr/ml) u poređenju sa mužjacima (<526.88 pg<*>hr/ml) du dozama od <200 mg/kg/dan. Oralni (PO) rezultati iz ispitivanja F su u tabeli 5.
Map ispitivanje G: Ispitivanje PO i IV doziranja diestra Ha kod pacova
Struktura jedinjenja 11a
Praćenje postupak za oralno doziranje Ieg MAP ispitivanja Al sa tom razlikom što je diestar Ha korišćen umesto jedinjenja IVa. Analiza za jedinjenje IV pokazala je da je doziranje diestra Ha oralnim putem proizvelo značajnu količinu IVa. Rezultati su opisani u tabeli 10 u daljem tekstu:
Map ispitivanje H: ispitivanje PO i WIV doziranja monoestra IVa kod pacova
Struktura jedinjenja II ' a
Praćen je postupak za ispitivanje Al oralnog doziranja MAP sa tom razlikom što je monoestar H'a korišćen umesto jedinjenja IVa. Analiza za jedinjenje IVa pokazala je da je doziranje monoestra H'a oralnim putem proizvelo značajnu količinu IVa. Rezultati su opisani u tabeli u daljem tekstu:
Značajan broj ispitivanja je izveden da bi se pokazala i opisala iznenađujuća korist prolekova I. Eksperimenti izlaganja rasta doze u kojima se vrši poređenje izlaganja ishodnih molekula posle doziranja proleka i ishodnog jedinjenja izvedeni su kod pacova i pasa za prolekove I ishodnih molekula IVa, IVb i IVc. Efekat hrane i doze na izlaganje IVa posle doziranja proleka Iab ili ishodnog jedinjenja IVa upoređivani su kod pasa. Prolek je pokazao iznenađujuću sposobnost da poboljša izlaganje i izbegne efekte hrane u poređenju sa ishodnim molekulom. Potpuna farmakokinetička ispitivanja sa niskom dozom (oralno i IV doziranje) izvedeni su kod pacova, pasa i majmuna za prolekove Iab, Ibb i Icb da bi se pokazala konverzija u ishodna jedinjenja IVa, IVb i IVc redom. Ispitivanja oralnog doziranja kod pacova izvedena su za prolek le (slobodna kiselina), i za i shodno jedinjenje IVf da bi se pokazala konverzija i sistemsko izlaganje ishodnih jedinjenja IVe i IVf redom. Rezultati su prikazani u ovoj prijavi.
Dodatno profdisanje Sekcija I
Dodatna ispitivanja sa Iab:
Iac je slobodna kiselna fosfatni prolek N-hidroksimetil proizvod pripajanja jedinjenja IVa i hidrolizovan je alkalnom fosfatazom (ALP) da bi se formirao IVa. Iab, mono-lizin so jedinjenja Iac, korišćen je za sva sledeća ispitivanja.
IV i PO farmakokinetička ispitivanja Iab izvedena su kod pacova, pasa i majmuna. U svim slučajevima, uzorci krvi su sakupljeni u prisustvu EDTA. Prisustvo EDTA, poznatog ALP inhibitora, minimizovalo je značajnuex vivokonverziju Iab u toku obrade uzorka. IVa je brzo formiran posle IV primene Iab. Dobre oralne biodostupnosti (62-94%) jedinjenja IVa zabeležene su posle primene Iab kod pacova, pasa i majmuna sa veoma malo ili bez Iab prisutnog u plazmi. S obzirom na to da u crevima postoje visoki nivoi ALP ekspresije, verovatno je da se posle oralne primene Iab, Iab hidrolizuje sa ALP prisutnom na trepljastim membranama crevnog lumena da bi se formiralo IVa, koje se brzo apsorbuje zahvaljujući njegovoj visokoj permeabilnosti.
In vitroinkubaciona ispitivanja izvedena su za kvalitativnu procenu ALP-zavisne hidrolize Iab u različitim tkivima. Iab je hidrolizovan u prisustvu seruma i hepatocita od pacova, pasa, majmuna i čoveka, kao i placentalne ALP čoveka. U slučajevima gde su Iab i IVa mereni, konverzija Iab u IVa bila je blizu stehiometrijske. Kao posledica hidrolize u serumu, vezivanje proteina od strane Iab ne može se odrediti. Na osnovuin vitropodataka predviđa se da će Iab biti hidrolizovan humanim ALP i da će se IVa formirati posle oralne primene Iab na čoveka.
Kristalna rastvorljivost Iab na sobnoj temperaturi raste od 0.22 mg/ml na pll 1.4 do
>12mg/ml na pH 5.4 i pH 8.9;vodeni rastvori koji sadrže > 100 mg/mL pripremljeni su zain vivotoksikološka ispitivanja. U poređenju, vodena rastvorljivost ishodnog jedinjenja, IVa, na sobnoj temperaturi kao kristalnog materijala određena je kao 0.04 - 0.9 mg/mL (pH opseg od 1.5 - 10). Iab pokazuje prihvatljive stabilnosti rastvora i čvrste supstance.
Veća rastvorljivost Iab u vodi obezbeđuje način da se prevaziđe stopom rastvaranja ograničena apsorpcija IVa ispod određenih doza i na taj način su povećana izlaganja IVa u ispitivanju rasta oralne doze i toksikokinetičkim ispitivanjima. Iab, kada je doziran oralno u —200 mg/kg IVa ekvivalenta, obezbedila je 2-puta veću AUC jedinjenja IVa kod pacova i pasa, bez značajnog izlaganja plazme proleku. u poređenju sa AUC iz ranijih ispitivanja IVa suspenzije u sličnoj dozi. Pored toga. AUC i Cmax vrednosti IVa kod izgladnelih pasa koji su primali Iab suvo-punjene kapsule (200 mg/psu IVa ekvivalent) bili su 38 i 58 puta, redom, oni dobijeni kod izgladnelih pasa kojima je davana formulacija kliničke kapsule IVa, i 4 i 6 puta, redom, oni dobijeni kod hranjenih pasa kojima je davana formulacija kliničke kapsule IVa.
Nisu zabeležene značajne razlike u AUC i Cmax za IVa između izgladnelih i hranjenih pasa koji su primali Iab, budući da je poboljšanje od 9-puta zabeleženo kod hranjenih pasa u poređenju sa izgladnelim psima koji su primali IVa. Ovi rezultati pokazuju da se efikasni nivoi IVa u krvi mogu postići kod pacijenata inficiranih HIV virusom bez potrebe za ishranom sa visokim sadržajem masti. Sprejom sušeni oblik IVa doveo je do sličnih nivoa izlaganja jedinjenja IVa kao oni zabeleženi od lab kod pasa.
Toksikokinetičko ispitivanje tolerancije pojedinačne doze kod CD pacova
1-dnevno oralno toksikokinetičko ispitivanje kod pacova izvedeno je primenom proleka Iab (monolizin so). lab je primenjen u dozi od 16, 72 i 267 mg/kg (slobodna kiselina) oralnom gavažom na tri mužjaka pacova /grupi korišćenjem vode kao nosača (formulacija rastvora). Doze proleka slobodne kiseline odgovaraju IVa (ishodno) molarnim ekvivalentnim dozama od 13, 57 i 211 mg/kg, redom. Procenjena krajnja tačka bila je toksikokinetika plazme Iab i IVa kod pojedinačnih pacova.
Srednje toksikokinetičke vrednosti date su u tabeli 12.
Srednja maskimalna koncentracija u plazmi (Cmax) jedinjenaj Iab (prolek) i jedinjenja IVa (ishodno jedinjenje) postignuta je u roku od 1.1 časova posle doziranja. Oblast plazme ispod krive koncentracije u plazmi prema vremenu (AUC) proleka bila je <0.03% iste vrednosti kod ishodnog jedinjenja. (Kod pacova koji su primali<<>267 mg/kg jedinjenja Iab, AUC IVa se povećalo proporcionalno sa dozom Iab, a Cmax se povećala manje od proporcionalno od doze između 72 i 267 mg/kg Iab.
Poređenje IVa AUC dobijene kod pacova koji su primali bilo IVa (2) ili Iab, prikazano je na slici 6.
Rastvorljivost u prekliničkim formulacijama je predstavljala određen problem. AUC jedinjenja IVa je ekvivalentna za ishodno jedinjenje i prolek u nižim dozama (npr., <50 mg/kg) zbog toga što su oba formulisani kao rastvori (PEG-400 za ishodno jedinjenje i voda za prolek) ali u visokoj dozi (npr., 200 mg/kg) neutralno ishodno jedinjenje je formulisano kao suspenzija budući daje so proleka formulisana kao vodeni rastvor.
2-nedeljno ispitivanje toksičnosti kod pacova primenom doza od 5, 50 ili 500 mg/kg BID da bi se podržalo IND je nastavljeno (3). Faza ispitivanja kod živih pacova je završena, pri čemu nije bilo značajnih opažanja.
Toksikokinetičko i ispitivanje tolerancije pojedinačne doze kod pasa
Višefazno ispitivanje izvedeno je da bi se procenila tolerancija proleka. Iab (monolizin so) u dozama od 24, 90 ili 240 mg/kg (slobodna kiselina, molarni ekvivalent 19, 71 ili 190 mg/kg ishodnog IVa, redom) i toksikokinetika Iab i IVa (4). Iab je primenjivan na dve ženke pasa /grupi jednom dnevno bilo kao vodeni rastvor (24 ili 90 mg/kg) ili kao suvo-punjene kapsule (24, 90 (jednom i dva puta dnevno] ili 240 mg/kg). Kao kranje tačke određeni su: klinički znaci, telesna težina, upotreba hrane i plazma toksikokinetika Iab i IVa. U svim slučajevima, 1-nedeljni period ispiranja je korišćen između doza za sve faze ispitivanja.
Plazma toksikokinetičke vrednosti iz početne faze ispitivanja prikazane su u tabeli 13.
Iab nije detektovan u uzorcima plazme. Srednja maksimalna koncentracija u plazmi (Cmax) IVa postignuta je između 1-2 časova posle doziranja. Kada je Iab primenjivan kao rastvor, obe vrednosti i Cmax i AUC povećale su se manje nego proporcionalno od doze između 24 i 90 mg/kg. Pojava povraćanja je zabeležena oko 30 minuta posle doziranja kod oba psa kojima je davano 90 mg/kg. Cmax i AUC IVa bili su ekvivalentni posle primene Iab u 24 mg/kg primenom bilo suvo-punjenih kapsula ili vodenog rastvora.
Osim povraćanja, nije bilo drugih kliničkih znakova, i nije bilo uticaja na telesnu težinu i ishranu.
Da bi se odredilo da li se povraćanje može eliminisati/smanjiti primenom Iab kao suvo-punjenih kapsula, sledeća faza ispitivanja izvedena je primenom doza od 90 ili 240 mg/kg, i 90 mg/kg koje su davane dva puta sa 4 h između (BED). Toksikokinetičke vrednosti prikazane su u tabeli 14.
Nije bilo razlike u Cmax ili AUC između pasa kojima je davano 90 ili 240 mg/kg Iab primenjeno pomoću suvo-punjenih kapsula. Povraćanje je zabeleženo kod pasa #1201, #2201 i #2202 oko 1 čas posle doziranja. Ispovraćani sadržaj je sakupljen i testiran u pogledu sadržaja Iab da bi se procenila količina ukupne doze koja je izgubljena; procenat procenjenog ukupnog gubitka doze bio je <1% za #1201, =90% za #2201, =9% za #2202. Iako ne izgleda da su procene "gubitka doze" kvantitativno u saglasnosti sa rezultatima AUC plazme, one ukazuju da se testirani sastojak može naći u izbljuvku u kratkom roku posle doziranja. Iab je đetektovan u plazmi pasa, 0.005- 0.049 pM 1 čas posle doziranja i 0.005-0.006 pM 2 časa posle doziranja; prolek se nije mogao detektovati u kasnijim vremenskim tačkama.
Poređenje IVa AUC dobijene kod pasa koji su dobijali bilo IVa (5, 6) ili Iab, prikazano je na slici 7.
Nosači i formulacije
Sažetak formulacija korištenih za Kev PK i ispitivanje hezhednosti
Svein vivoPK ispitivanja kod pacova, pasa i majmuna izvedena su primenom vodenih rastvora za PO i IV doziranje. Toksikološka i ispitivanja izlaganja kod pasa su izvedena sa vodenim rastvorima u dozama od 24 i 90 mg/kg i formulacijama leka u kapsuli u dozama od 24, 90 i 240 mg/kg Tab, mono-lizin so.
U ispitivanju rasta oralne doze kod pacova, Iab je doziran kao vodeni rastvor u koncentracijama od 4.5, 20.0 i 73.5 mg/mL (mono-lizin so oblik proleka). Značajno poboljšanje u AUC i Cmax IVa, ishodnog jedinjenja, posle oralnog doziranja Iab, proleka, zabeleženo je u poređenju sa ranijim podacima za oralno doziranje IVa.
Lek u formulacijama kapsule Iab u dozama od 20 mg/kg IVa ekvivalenta korišćen je za ispitivanje efekta hrane kod pasa. Prolek je upoređivan sa kliničkom formulacijom kapsule ishodnog jedinjenja, IVa, u 20 mg/kg. Kada je IVa klinička kapsula dozirana, zabeleženo je povećanje izlaganja od 9-puta kod pasa koji su primali hranu sa visokim sadržajem masti u poređenju sa psima koji su izgladnjivani. Posle doziranja proleka Iab, izlaganje IVa je bilo značajno više i kao što je očekivano, izlaganje nije bilo značajno različito između izgladnjivanih i hranjenih pasa.
Sažetak metabolizma i far makokin etike
Sažetak nalaza i tumačenje
Iab je fosfatni prolek N-hidroksimetil adukta jedinjenja IVa i hidrolizovan je alkalnom fosfatazom (ALP) da bi se formiralo IVa. Posle primene Iab na životinje, prema tome, uzorci plazme su pripremljeni od krvi sakupljene u prisustvu EDTA, poznatog inhibitora ALP. Konverzija Iab u IVa bila je minimalna (< 2%) u krvi pacova, majmuna i čoveka koja sadrži EDTA, i približno 6% u krvi psa koja sadrži EDTA. Nije očekivana značajnaex vivokonverzija Iab u toku čuvanja uzorka (~20°C) i analize Iab.
Hidroliza Iab ispitivana je uin vitrosistemima životinja i čoveka. S obzirom da su višestruke izoforme ALP široko raširene u različitim tkivima, kvantitativnein vitrodoin vivokorelacije nisu rađene (Fishman et ah, 1968; Komoda et al., 1981; Moss, 1983; Yora and Sakagishi, 1986; Sumikavva et al., 1990). Prema tome, ispitivanja su ograničena na kvalitativnu procenu ALP-zavisne hidrolize u različitim tkivima. Iab je hidrolizovan u prisustvu seruma i hepatocita od pacova, pasa, majmuna i čoveka, kao i placentalne ALP čoveka. U slučajevima gde su mereni lab i IVa, konverzija Iab u IVa bila je blizu stehiometrijske. Zahvaljujući hidrolizi u serumu, vezivanje proteina od strane Iab ne bi se moglo odrediti.
Nimalo ili veoma niski nivoi Iab su detektovani u plazmi pacova, psa i majmuna posle oralne primene Iab. IVa je brzo formiran posle IV primene Iab kod pacova, pasa i majmuna. Odnosi konverzije IV AUC bili su 1.5 kod pacova, 0.80 kod pasa i 0.70 kod majmuna, što sugeriše dobru konverziju od Iab u IVa.
Dobre oralne biodostupnosti (62-94%) IVa zabeležene su posle primene Iab kod pacova, pasa i majmuna. Značajnije, veća rastvorljivost Iab u vodi smanjila je stopom-rastvaranja ograničenu apsorpciju IVa ispod određenih doza i na taj način povećala izlaganja IVa u ispitivanjima rasta oralne doze i toksikokinetičkim ispitivanjima (tabele 12-14 i si. 6-7). AUC nivoi IVa kod izgladnelih pasa koji su primali Iab kapsule bili su oko 40 puta veći od nivoa kod izgladnelih pasa kojima je davano IVa u kliničkom obliku kapsula. Iako je 40-struka razlika verovatno preterana u odnosu na stvarnu kliničku situaciju, na osnovu razvojnog iskustva sa IVa, Iab jasno pokazuje potencijal da poboljša stopom rastvaranja ograničenu apsorpciju zabeleženu sa ishodnim jedinjenjem IVa.
Da bi se ispitao efekat hrane na oralnu apsorpciju IVa kod pasa, Iab i IVa su primenjivani u kapsulama pod uslovima gladovanja i ishrane. Nije bilo značajnih razlika u AUC i Cmax sa Iab, pri čemu je poboljšanje od 9-puta zabeleženo sa IVa sa hranjenjem. Ovi rezultati sugerišu potencijalne kliničke korsti za pacijente inficirane HIV virusom, kod kojih se efikasni nivoi IVa u krvi mogu postići bez potrebe za ishranom sa visokim sadržajem masti.
Metode
Ispitivanja opisana u ovom radu koristila su mono-lizin so jedinjenja Iab. osim ukoliko nije naznačeno drugačije.
Kvantitativno određivanje Iab i IVa pomoću LC/ MS/ MS
LC/MS/MS mctod je razvijen za analizu Iab i IVa u uzorcima plazme iz farmakokinetičkih ispitivanja kod životinja kao i u acetonitrilnom supernatantu izin vitroinkubacionih ispitivanja. Za analizu u plazmi, korišćen je Packard Multiprobe instrument da bi se prebacilo 50 pL (svakog) standarda, QC i uzorka plazme u čistu 96-komornu ploču za ekstrakciju proteinskog precipitata. Posle dodavanja 200 pL acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard IVc, uzorci su mešani vorteksom i dobijeni supernatant je odvojen od istaloženih proteina centrifugiranjem od 10 minuta. Za analizu u supernatantu stvorenom izin vitroispitivanja, pomešana je jednaka zapremina supematanta i acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard. Alikvota prethodnog supematanta prebačena je primenom Tomtec automatskog tečnog manipulatora u drugu čistu 96-komornu ploču. Dodata je jednaka zapremina vode, i ploča je zatvorena poklopcem i mešana vorteksom.
HPLC sistem se sastojao od Shimadzu LClOADvp pumpi (Columbia, MD) i HTC PAL autosempler (Leap Technologies, Cary, NC) povezanih za Phenomenex Synergi Fusion-RP analitičku kolonu (2.0 x 50 mm, 5 p; Torrance, CA). Pokretna faza A sastojala se od 5 mM amonijum formata u vodi; pokretna faza B bila je 100% acetonitril. LC stopa protoka bila je 0.38 mL/min. Početni sastav pokretne faze bio je 3% B, podignuta do 60%> B u toku 1.75 min i održavan 0.25 min, podignuta do 100% B u toku 0.1 min i održavan 0.8 min, vraćen do početnih uslova u toku sledećih 0.1 min, i ponovo postavljen u stanje ravnoteže. Ukupno vreme analiziranja bilo je 4.0 min. Vreme zadržavanja za Iab, IVa i IVc bilo je 1.50, 1.67 i 1.73 min, redom.
HPLC sistem je povezan sa Sciex API4000 triple quadrupole maseni spektrometar (Toronto, Canada) opremljen sa izvorom turbo jonskog spreja postavljen na 550°C i voltaža jonskog spreja postavljena je na 4.5 kV. UHP azot je korišćen kao raspršivač i pomoćni gas sa pritiskom od 80 psi i 7 L/min, redom. Energije kolizije za Iab, IVa i IVc bile su 21, 29 i 31 volti, redom. Zbog načina uzimanja podataka izabran je monitoring reakcije (SRM). Joni koji predstavljaju pozitivne jonske vrste (M+H)+ za Iab, IVa i unutrašnji standard izabrani su u MSI i koliziono razdvojeni sa azotom a kolizione energije su optimizovaned da bi se formirali posebni jonski proizvodi koji su kasnije praćeni pomoću MS2. SRM prelazi za Iab, IVa i IVc bili su m/z 533^435, 423-^205 i 474^256, redom.
Standardne krive u opsegu od 5 nM do 10 pM pripremljene su od stok rastvora i serijski razblažene u matriksu za Iab i IVa. Standardne krive su podeljene na jednake delove u duplikatu, ekstrahovane sa uzorcima, i injektirane na početku, sredini i na kraju analitičke sekvence. Standardne krive su fitovane sa linearnom regresijom merenom recipročnom koncentracijom l/x2. Rezultati i hromatografski vrhovi su obrađeni i koncentracije standarda i nepoznatog kvantitativno su određeni primenom PEBiosvstems Analyst™ 1.1.
In Vitro metode
(1)Stabilnost Iab u EDTA krvi, serumu i Tris- HCl puferu
Stabilnost Iab ispitivana je u svežoj krvi i serumu pacova, pasa, majmuna i čoveka (n = 2). Krv je sakupljena u vacutainer epruvete koje su sadržale K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Serum je sakupljen u vacutainer epruvete koje nisu sadržale antikoagulant. Iab je inkubiran u početnoj koncentraciji od približno 10 pM 60-90 minuta na 37°C. Serijski uzorci su uzeti u prethodno određenim vremenskim tačkama. Alikvote uzoraka krvi (200 pL) prvo su mešane sa 100 pL vode i zatim sa 400 pL acetonitrila. Uzorci seruma (50 pL) dodati su u microtainer epruvete koji sadrže K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), a zatim je dodato 100 pL acetonitrila. Supernatant je analiziran za Iab i IVa pomoću LC/MS/MS.
Stabilnost Iab je takođe procenjivana, kao stoje opisano u prethodnom tekstu, u Tris-HC1 puferu(0.1 M, pH 7.5).
(2) Hidroliza Iab u prisustvu placentalne ALP čoveka
Čvrsta placentalna ALP čoveka dobijena je iz Sigma (P-3895, St. Louis, MO). Rastvor od 1000 jedinica/L pripremljen je u Tris-HCl puferu (0.1 M, pH 7.5). Rastvori od 100 i 10 jedinica/L dobijeni su serijskim razblaženjem. Iab je inkubiran u rastvorima od 10, 100 i 1000 jedinica/L (n = 2) na 37°C 2 časa. Početna koncentracija Iab u inkubaciji bila je 10 pM. Alikvote od 100 pL uzoraka uzete su u prethodno određenim vremenskim tačkama i dodate u K2EDTA microtainer epruvete, nakon čega je dodato 200 pL acetonitrila. Supernatant je analiziran za Iab i za IVa pomoću LC/MS/MS.
In Vivo ispitivanja
Svi uzorci krvi (0.3 mL) sakupljeni su u microtainer epruvete koji su sadržali K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) i postavljeni na izmrvljeni led. Posle centrifugiranja, plazma je odvojena i čuvana na -20°C do analize. Mono- lizin so jedinjenja Iab (oblik 3, Lot 1) korišćena je za farmakokinetička ispitivanja. Dozirajući rastvori jedinjenja Iab pripremljeni su bilo u sterilnoj vodi (za IV primenu kod pasa i majmuna) ili destilovanoj vodi (za sve druge primene doze).
(1)7/7Vivo ispitivanja kod pacova
Korišćeni su mužjaci Sprague-Dawley pacova (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale. PA) sa kanilama implantiranim u jugularnu venu. Pacovi su izgladnjivani preko noći u PO farmakokinetičkim ispitivanjima. Uzorci krvi su sakupljeni iz jugularne vene.
U IV ispitivanju, Iab je primenjen u dozi od 1.4 mg/kg (slobodna kiselina, ili 1.1 mg/kg IVa ekvivalenta) kao bolus injekcija u toku 0.5 min (n = 3). Koncentracija dozirajućcg rastvora bila je 1.4 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 1 mL/kg. Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 2, 10, 15, 30, 45 minuta, i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
U PO ispitivanju, Iab je primenjen u dozi od 7.9 mg/kg (slobodna kiselina, ili 6.3 mg/kg IVa ekvivalenta) oralnom gavažom(n = 3). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 4.0 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 2 mL/kg. Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 15, 30, 45 minuta, i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
(2) In Vivo ispitivanja kod pasa
IV i PO ispitivanja Iab izvedena su na unakrsni način kod tri mužjaka psa rase baset (11 + 1.1 kg, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY). Između IV i PO ispitivanja bio je dvonedeljni period ispiranja.
U IV ispitivanju, Iab je davan infuzijom preko cefalične vene u dozi od 1.2 mg/kg (slobodna kiselina, ili 0.95 mg/kg IVa ekvivalenta) u toku 5 minuta sa konstantnom stopom od 0.1 mL/kg/min. Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 2.4 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi sakupljeni su iz femoralne arterije pre doziranja i 5, 10, 15, 30, 45 minuta, i 1, 2, 4, 6. 8 i 24 časova posle doziranja.
U PO ispitivanju, psi su izgladnjivani preko noći pre doziranja. Iab je primenjen oralnom gavažom u dozi od 6.6 mg/kg (slobodna kiselina, ili 5.2 mg/kg IVa ekvivalenta). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 13.2 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 15, 30, 45 minuta, i 1. 2, 4. 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
Da bi se ispitiao efekat hrane na oralnu apsorpciju IVa posle primene Iab i IVa, ova dva jedinjenja su primenjena u kapsulama kao čvrsta supstanca na grupu od tri psa na unakrsni način preko noći u uslovima ishrane i izgladnjivanja. Između svakog ispitivanja bio je jednonedeljni period ispitivanja. Iab je primenjen u dozi od 200 mg po psu (oko 20 mg/kg) IVa ekvivalent; IVa je primenjen u formulaciji kloničke kapsule u dozi od 200 mg po psu (oko 20 mg/kg). II ispitivanjima gde su psi hranjeni, pripremijenaje sledeći obrok: 2 parčeta slanine, 2 jaja, 2 parčeta tosta sa puterom i džemom, 4 oz. krompir pirea i 8 oz. punomasnoii mleka. Posle homogenizacije primenom laboratorijskog blendera, obrok je podjednako podeljen u pet delova i čuvan zamrznut. Pre ispitivanja, obroci su otopljeni i svaki pas je hranjen jednim delom.
Dodatna ispitivanja formulacije IVa izvedena su kod izgladnelih pasa (n = 2 po doznoj grupi). Psi su primali bilo klinički oblik ili sprejom sušeni oblik IVa u kapsulama. Klinički oblik kapsule IVa primenjen je u pojedinačnoj dozi od 20 mg/kg. Sprejom sušeni oblik IVa primenjen je u 20, 75 i 200 mg/kg.
(3) In Vivo ispitivanja kod majmuna
IV i PO ispitivanja Iab izvedena su na unakrsni način kod tri mužjaka makaki majmuna (11 ± 1.2 kg, Charles Rivcr Biomcdical Research Foundation, Houston, TX). Između IV i PO ispitivanja bio je dvonedeljni period ispiranja. U IV ispitivanju, Iab je davan infuzijom preko femoralne vene u dozi od 1.3 mg/kg (slobodna kiselina, ili 1.1 mg/kg IVa ekvivalenta) u toku 5 minuta sa konstantnom stopom od 0.1 mL/kg/min. Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 2.6 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi sakupljeni su iz femoralne arterije pre doziranja i 5, 10, 15, 30, 45 minuta, i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
U PO ispitivanju, majmuni su izgladnjivani preko noći pre doziranja. Iab je primenjen pomoću oralne gavaže u dozi ođ 7.1 mg/kg (slobodna kiselina, ili 5.6 mg/kg IVa ekvivalenta). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 14.2 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 15, 30, 45 minuta, i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
(4) Analiza rezultata
Svi rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD, osim ukoliko nije naznačeno drugačije.
Farmakokinetlčki parametri jedinjenja Iab i IVa izračunati su pomoću Non-Compartmental analize korišćenjem KINETICA™ softvera (verzija 4.0.2, InnaPhase Co.„ Philadelphia, PA). Cmax i Tmax vrednosti su beležene direktno iz eksperimentalnih opažanja. AUCO-n i AUCtot vrednosti su izračunavane primenom kombinovanog log-linearnog sumiranja. Ukupni telesni klirens (Cl), srednje vreme zadržavanja (MRT), i stabilna distribuirana zapremina u stabilnom stanju (Vss) takođe su izračunavani posle intravenozne primene. Apsolutna oralna biodostupnost (izražena u %) procenjena je uzimanjem odnosa AUC vrednosti normalizovanih prema dozi posle oralnih doza prema onima posle intravenoznih doza.
Klirens jetre Cln izračunavan je iz sledeće jednačine primenom dobro razrađenog modela:
Cln (mL/min/kg)=Qh x Clmt in vivo / (Qh<+>Cljnt. jnvivo)
gde je Qh protok krvi u jetri od 55, 31, 44 i 21 mL/min/kg za pacova, psa, majmuna i čoveka, redom (Daviš and Morris, 1993).
Odnos ekstrakcije u jetri (ER) izračunavanje na sledeći način:
ER = C1H/ Qh
Student-ov t-test je korišćen za statističku analizu (Microsoft Exccl, Rcdmond, WA). Razlike su smatrane statistički značajnim na nivou od P < 0.05.
In Vitro ispitivanja
Stabilnost Iab u EDTA b- vi, serumu i Tris- HCl puferu
Kao deo procene analitičkog testa, stabilnost Iab je ispitivana u krvi koja sadrži EDTA, za koji je pokazano daje inhibitor alkalnih fosfataza (Bowers, Jr. and McComb, 1966; Yora and Sakagishi, 1986). Posle inkubacije na 37°C od 60 minuta, bilo je 1.2% konverzije od početne koncentracije Iab u IVa u krvi pacova (tabela 15), i manje od 1%> konverzije u krvi majmuna i čoveka (tabele 15 i 16). Bilo je približno 6% konverzije u krvi psa, i procenti konverzije bili su slični između dva različita psa, kao i kod istog psa u dva različita slučaja (tabele 15 i 16). Pod uslovima čuvanja uzorka na -20°C, prethodno navedeni niski procenti konverzije zabeleženi na 37°C ne očekuje se da će uneti bilo kakvu značajnuex vivokonverziju u toku analize Iab.
Iab je bio stabilan u Tris-HCl puferu na 37°C u toku perioda ispitivanja od 60 minuta (tabela 17).
Da bi se ispitala hidroliza Iab u sistemskoj cirkulaciji, Iab je inkubirana u svežem serumu (pacov, pas, majmun i čovek) na 37°C 90 minuta. Stopa hidrolize bila je najbrža u serumu pacova, a zatim slede serumi psa, majmuna i čoveka (tabela 18). Konverzija Iab u IVa bila je blizu stehiometrijske.
Serum sadrži nižu ALP aktivnost u poređenju sa tkivima (McComb et al, 1979a). Pored toga, serum takođe sadrži ALP izoforme iz tkivnih izvora kao što su kosti, jetra i crevo, što je pripisano prolasku kroz krvne sudove (Moss, 1983). Prema tome, hidroliza Iab u serumu verovatno je posredovana višestrukim izoformama ALP .
Hidroliza Iab u prisustvu placentalne ALP čoveka
Da bi se ispitala hidroliza Iab u prečišćenom obliku od ALP čoveka, Iab je inkubiran u rastvorima placentalne ALP čoveka u dozama od 10, 100 i 1000 jedinica/L na 37°C, 2 časa. Tl/2 nestajanja Iab određeno je i prikazano u tabeli 19. Kao što je očekivano, stopa hidrolize bila je brža u rastvorima sa višim aktivnostima ALP. IVa je takođe formiran u skladu sa tim (si. 8). Ovo ukazuje na to đa je Iab hidrolizovan sa ALP izvedenom od čoveka da bi se formirao IVa.
In Vivo ispitivanja
In Vivo ispitivanja kod pacova
Farmakokinetička parametri Iab i IVa kod pacova posle IV i oralne primene Iab prikazani su u tabeli 20. Profdi koncentracije u plazmi prema vremenu prikazani su na slici 9. Za poređenje, raniji rezultati iz farmakokinetičkih ispitivanja jedinjenja IVa kod pacova takođe su prikazani.
Ukupni telesni klirens (Cl) jedinjenja Iab posle IV primene bilo je 14 mL/min/kg, što sugeriše na to da je Iab jedinjenje sa niskim klirensom kod pacova. Polu-život eliminacije (ti/2) i srednje vreme zadržavanja (MRT) posle IV primene bili su 0.16 časova i 0.14 časova, redom. Iab nije detektovan posle isteka perioda od 2 časa. Zapremina distribucije Iab u stabilnom stanju (Vss) bila je 0.12 L/kg, što sugeriše veoma ograničenu tkivnu distribuciju. Formiranje IVa od Iab posle IV primene bilo je brzo; IVa je detektovan u prvoj vremenskoj tački uzimanja uzorka od 2 minuta (podaci nisu prikazani). IV AUC odnos IVa formiranog od Iab prema onom iz ranijih ispitivanja IVa bio je 1.5 (teoretska vrednost za potpunu konverziju = 1), što sugeriše potpunu konverziju Iab u IVa.
Sa izuzetkom jednog uzorka (5 nM; tabela 20), Iab nije detektovan ni u jednom uzorku posle oralne primene. Tmax jedinjenja IVa posle oralne primene Iab bila je 0.83 časova, što je kraće od ranijih Tmax jedinjenja IFVa od 2.0 časa, što ukazuje na bržu apsorpciju IVa posle oralne primene proleka. Brža apsorpcija jedinjenja IVa od proleka je verovatno rezultat bolje rastvorljivosti Iab u vodi kao i brze hidrolize Iab da bi se formirao IVa u crevu. lako je apsolutna oralna biodostupnost IVa od Iab bila 62%, niže od ranijih IVa rezultata, izlaganje IVa iz ispitivanja rasta oralne doze lab kod pacova bilo je superiorno u poređenju sa ranijim rezultatima sa IVa (tabela 16 i si. 8).
Profili krajnje koncentracije u plazmi nasuprot vremenu jedinjenja IVa formiranog od Iab su slični ranijim IVa profilima.
31. In vivo ispitivanje kod pasa
Farmakokinetički parametri Iab i IVa kod pasa posle IV i oralne primene Iab izloženi su u tabeli 21. Profili koncentracije u plazmi nasuprot vremena prikazani su na slici 10. Za poređenje, raniji rezultati iz farmakokinetičkih ispitivanja IVa kod pasa takođe su prikazani.
Cl jedinjenja Iab posle IV primene bilo je 70 mL/min/kg, što je značajno više od protoka krvi jetre od 31 mL/min/kg kod pasa, štro sugeriše na potencijalnu uključenost ekstrahepatične hidrolize i/ili drugog načina eliminacije (npr., eksrecijom preko bubrega).t\ai MRT posle IV primene bili su 0.15 h i 0.07 h, redom. Iab nije detektovan nakon isteka perioda od 45 minuta. Vss jedinjenja Iab bila je 0.30 L/kg, što sugeriše nizak potencijal za tkivnu distribuciju. Formiranje IVa ođ Iab posle IV primene bilo je brzo; IVa je detektovano u prvoj vremenskoj tački uzimanja uzorka od 5 minuta (podaci nisu prikazani). IV AUC odnos IVa formiranog od Iab nasuprot onog kod ranijih ispitivanja IVa bio je 0.80, što sugeriše dobru konverziju Iab u IVa. Iab je detektovan u 5 nM (LLQ) samo na 15 minuta i 30 minuta kod jednog psa posle oralne primene. Tmax jedinjenja IVa posle oralne primene jedinjenja lab bilo je 0.25 časova, što je kraće od ranijih Tmax jedinjenja IVa od 2.9 časova, što ukazuje na bržu apsorpciju jedinjenja IVa posle oralne primene proleka. Apsolutna oralna biodostupnost jedinjenja IVa od Iab bila je 94%, stoje više od ranijih IVa rezultata od 57%. Profili krajnjih koncentracije u plazmi nasuprot vremena jedinjenja IVa formiranog od Iab su slični ranijim IVa profilima.
Da bi se ispitao efekat hrane na oralnu apsoipciju IVa posle primene Iab i IVa, psi su primili Iab ili IVa u kapsulama u uslovima gladovanja i uslovima hranjenja. Ispitivanje je izvedeno na unakrsni način, sa jedno-nedeljnim periodom ispiranja između svakog ispitivanja. Nisu zabeležene značajne razlike u AUC i Cmax između gladovanja i uslova hranjenja posle primene Iab (tabela 22), pri čemu je poboljšanje od 9-puta u AUC i Cmax zabeležno posle primene IVa sa hranjenjem (tabela 23). Ukupno, efekat hranjenja bio je izraženiji kod pasa (tabela 23) nego kod čoveka (tabela 24) koji su primali IVa. Ovo sugeriše na razlike kvantitativnih vrsta u efektu hrane na oralnu apsorpciju IVa.
Prikazano je daje oralna apsorpcija IVa ograničena stopom rastvaranja kod čoveka i životinjskih vrsta. Poboljšanje IVa izlaganja kod čoveka posle hranjenja hranom sa visokim sadržajem masti verovatno je posledica povećanog izlučivanja žučnih soli koje su olakšale rastvaranje IVa. Kod pasa, nedostatak efekta hrane na oralnu apsorpciju IVa posle primene Iab sugeriše potencijalne koristi kod čoveka, za čiju ishranu nije neophodna modifikacija.
In Vivo ispitivanja kod majmuna
Farmakokinetički parametri Iab i IVa kod majmuna posle IV i oralne primene Iab prikazani su u tabeli 27. Profili koncentracije u plazmi prema vremenu prikazani su na slici 11. Za poređenje, raniji rezultati iz farmakokinetičkih ispitivanja IVa kod majmuna takođe su prikazani.
Cl jedinjenja Iab posle IV primene bilo je 4.4 mL/min/kg, što sugeriše da je Iab jedinjenje sa niskim klirensom kod majmuna.Uai MRT posle IV primene bili su 1.0 časova i 0.18 časova, redom. MRT je odslikavalo realniju procenu trajanja Iab u plazmi s obzirom da su koncentracije Iab u plazmi u terminalnoj fazi bile niske (si. 11). Iab nije detektovan nakon pedrioda od 6 časova. Vss jedinjenja Iab je bila 0.048 L/kg, što sugeriše veoma ograničenu tkivnu distribuciju. Formiranje IVa od Iab posle IV primene bilo je brzo; IVa je detektovan u prvoj vremenskoj tački uzimanja uzorka od 5 minuta (podaci nisu prikazani). IV AUC odnos IVa formiran od Iab prema onoj iz ranijih ispitivanja IVa bila je 0.70, što sugeriše dobru konverziju Iab u IVa.
Iab je detektovan u koncentraciji od 18 nM na 15 minuta kod samo jednog majmuma posle oralne primene. Tmax jedinjenja IVa posle oralne primene Iab bilo je 0.83 časova, što je kraće od ranijih Tmax jedinjenja IVa od 2.7 časova, što ukazuje na bržu apsorpciju IVa posle oralne primene proleka. Apsolutna oralna biodostupnost jedinjenja IVa od Iab bila je 66%, što je slično ranijim rezultatima za IVa od 60%>.
Profili terminalne koncentracije u plazmi prema vremenu jedinjenja IVa formiranog od Iab su slični ranijim profilima IVa.
Napomena: Iab je detektovan na <200 nM u nekoliko uzoraka u ranim vremenskim tačkama.
Dodatna ispitivanja formulacije kapsule izvedena su kod istih izgladnelih pasa sa kliničkim i sprejom sušenim oblicima IVa za poređenje sa Iab. Kao što je prikazano u tabeli 25, 20 mg/kg IVa ekvivalenta, slično izlaganje IVa zabeleženo je posle primene Iab i sprejom sušenog oblika IVa. Međutim, Iab je dao značajno veće izlaganje IVa u poređenju sa kliničkim oblikom IVa. AUC i Cmax jedinjenja IVa od proleka bili su 37 puta i 45 puta veće. redom, ođ vrednosti od kliničkog oblika IVa. Višestruko povećanje kod pasa je verovatno preterano u odnosu na stvarnu kliničku situaciju na osnovu iskustva sa IVa u razvoju (podaci nisu prikazani).
U ispitivanju rasta doze sprejom sušenog oblika IVa kod pasa, povećanja AUC i Cmax od 20 mg/kg do 75 mg/kg bilo je manje nego proporcionalno prema povećanju doze (tabela 26). Nisu zabeležena dalja povećanja izlaganja od 75 mg/kg do 200 mg/kg.
Dodatno profilisanje deo 2
Dodatna ispitivanja sa prolekom Ibb
IV i PO farmakokinetička ispitivanja jedinjenja Ibb izvedena su kod pacova, pasa i majmuna. U svim slučajevima, uzorci krvi su sakupljeni u prisustvu EDTA. Prisustvo EDTA, poznatog inhibitora ALP, minimizovalo je značajnuex vivokonverziju Ibb u toku obrade uzorka. IVb je brzo formiran posle IV primene Ibb. Dobre oralne biodostupnosti jedinjenja IVb (50-310%; izračuvanjem primenom ranijih IV AUC jedinjenja IVb) zabeležene su posle primene Ibb kod pacova, pasa i majmuna sa veoma niskim nivoima Ibb prisutnim u plazmi. S obzirom da na visoke nivoe ekspresije ALP u crevima, verovatno je da se posle oralne primene Ibb, Ibb hidrolizuje sa ALP prisutnom na trepljastoj membrani lumena creva da bi se formiralo IVb, koji se brzo apsorbuje zahvaljujući njegovoj visokoj permeabilnosti.
In vitroinkubaciona ispitivanja izvedena su za kvalitativnu procenu ALP-zavisne hidrolize jedinjenja Ibb u različitim tkivima. Ibb je hidrolizovan u prisustvu seruma i hepatocita od pacova, psa, majmuna i čoveka, kao i placentalne ALP čoveka. U slučajevima gsde su mereni Ibb i IVb, konverzija Ibb u IVb bila je blizu stehiometrijske. Kao posledica hidrolize u serumu, vezivanje proteina od strane Ibb ne bi se moglo odrediti. Na osnovuin vitrorezultata, pretpostavlja se da će Ibb biti hidrolizovan humanim ALP i da će IVb biti formiran posle oralne primene Ibb na humane subjekte.
Kristalna rastvorljivost jedinjenja Ibb-03 na sobnoj temperaturi je >11 mg/mL u opsegu pH vrednosti od 1.5 do 8.7; vodeni rastvori koji sadrže >75 mg/mL pripremljeni su zain vivotoksikološka ispitivanja. Za poređenje. rastvorljivost u vodi ishodnog jedinjenja, IVb, na sobnoj temperaturi kao kristalnog materijala određena je kao 0.007 - 0.19 mg/mL (opseg pH vrednosti od 1.0 - 9.6). Ibb-03 pokazuje prihvatljive stabilnosti rastvora i čvrstog stanja.
Veća rastvorljivost Ibb u vodi daje sredstva za prevazilaženje stopom rastvaranja ograničenu apsorpciju IVb ispod određenih doza i na taj način povećava izloženost IVb kod ispitivanja rasta oralne doze i toksikokinetičkim ispitivanjima. Ibb, kada je doziran oralno do 200 mg/kg IVb bms ekvivalent, dao je 11- i 2.6-puta (BID) veće AUC jedinjenja IVb kod pacova i pasa, redom, sa relativno niskim izlaganjem plazme proleku (<0.9 pM), u poređenju sa AUC iz ranijih IVb studija sa suspenzijama u sličnoj dozi.
Toksikokinetičko ispitivanje pojedinačne doze kod Sprague Dawley pacova
1-dnevno oralno toksikokinetičko ispitivanje kod pacova izvedeno je primenom proleka Ibb (monolizin so). Ibb je primenjen u dozama od 19, 64 i 236 mg/kg (slobodna kiselina) oralnom gavažom na tri mužjaka pacova/grupi primenom vode kao nosača (formulacija rastvora). Doze proleka slobodne kiseline odgovara IVb (ishodno) molarnih ekvivalentnim doza od 15, 51 i 190 mg/kg, redom. Krajnje procenjene tačke bile su toksikokinetika plazme jedinjenja Ibb i IVb kod pojedinačnih pacova.
Srednje toksikokinetičke vrednosti date su u tabeli 28.
Srednja maksimalna koncentracija u plazmi (Cmax) jedinjenja IVb (ishodno) postignuta je u roku od -1-3 časova posle doziranja. Kod pacova koji su primali <236 mg/kg Ibb, povećanje u AUC jedinjenja IVb bilo je skoro proporcionalno sa Ibb dozom, a Cmax se povećala manje nego proporcionalno sa dozom između 19 i 236 mg/kg jedinjenja Ibb. Ibb je detektovan u plazmi pacova koji su primali >19 mg/kg jedinjeja Ibb ali u veoma niskim koncentracijama u odnosu na one IVb.
Poređenje IVb Cmax i AUC dobijenih kod pacova koji su primali bilo IVb ili Ibb, prikazano je na slici 12.
Izlaganje jedinjenju IVb značajno je povećano posle primene Ibb u poređenju sa onim koje je postignuto posle doziranja IVb.
Toksikokinetičko i ispitivanje tolerancije pojdinačne doze kod pasa
Dvo-fazno ispitivanje izvedeno je da bi se procenila tolerancija na prolek, Ibb (monolizin so) u dozama od 25, 92 ili 250 mg/kg (slobodna kiselina, molarni ekvivalent 20, 74 ili 201 mg/kg ishodnog IVb, redom) i toksikokinetika Ibb i IVb (1). Na dan 1, Ibb je primenjen na jednog psa/polu/grupi jednom dnevno u suvo punjenim kapsulama u prethodno navdenim dozama. Jedno-neđeljni period ispiranja je upotrebljen između doza u ispitivanju. Na dan 8, Ibb je primenjen na jednog psa /polu/grupi jednom dnevno kao vodeni rastvor u dozi od 25 mg/kg ili dva puta dnevno u suvo punjenim kapsulama u dozi od 46 ili 125 mg/kg BID. Krajnje tačke su bile: klinički znaci, telesna težina, upotreba hrane, hemijska svojstva seruma, hematologija i toksikokinetika plazme jedinjenja Ibb i IVb.
Toksikokinetičke vrednosti plazme pojedinačnih pasa prikazane su u tabeli 29.
Niski nivoi (<<>0.9 pM) jedinjenja Ibb deteklovani su u nekim uzorcima plazme na dane 1 i 8. Srednja maksimalna koncentracija u plazmi (Cmax) jedinjenja IVb postignuta je između 1-4 časova posle doziranja za QD doziranja, i 1-2 časa posle druge doze za BED doziranje. U dozi od 25 mg/kg QD, ekvivalentni Cmax i AUC jedinjenja IVb zabeleženi su kada je Ibb primenjeno bilo kao suvo punjene kapsule ili kao vodeni rastvor. Na dan 1, zabeležno je povraćanje (bela, prugasta sa crvenim koji sadrži ostatke kapsule) i to 0.5- 1.25 časova posle doziranja kod svih pasa kojima je davano >92 mg/kg QD (3101M, 3201F, 4101M i 4201F), koji je verovatno đoprineo istom izlaganju između 92 i 250 mg/kg. Na dan 8, povraćanje (belo ili braon) zabeleženo je u roku od 2 časa posle doziranja kod svih pasa koji su dobijali >46 mg/kg BIO; ostaci kapsule su zabeleženi samo u izbljuvku dva psa
(3101M posle prve doze i 4201F posle druge doze). Doziranje od dva puta dnevno obezbedilo je veće izlaganje jedinjenju IVb kod pasa nego doziranje jednom dnevno.
Osim povraćanja, nisu zabeleženi klinički znaci, i nije bilo efekata na telesnu težinu i utrošak hrane.
Uprkos zabeleženom povraćanju kod pasa, veća IVb AUC je zabeležena kod pasa koji su primali Ibb u odnosu na pse koji su dobij ali IVb. Poređenje IVb AUC dobijeno kod pasa koji su primali bilo Ibb ili IVb (2), prikazano je na slici 13.
Apsolutna oralna biodostupnost jedinjenja IVb, ishodnog jedinjenja, posle primene vodenih rastvora Ibb-03, fosfatnog proleka, bila je u opsegu od 50% do 310% kod pacova, pasa i majmuna. Ovi preračuni su zasnovani na ranijim IV rezultatima. Izlaganje IVb, posle oralne primene vodenih rastvora proleka, Ibb-03, doziranog do 190 mg/kg IVb ekvivalenta je 3-10 puta veće u ispitivanju rasta oralne doze kod pacova u poređenju sa ranijim rezultatima sa IVb. Kada je Ibb- 03 doziran BID kao lek u kapsuli kod pasa, postignuto je poboljšanje od 2-3 puta u izlaganju u poređenju sa ranijim rezultatima iz pre-ECN toksikoloških ispitivanja sa BID doziranjem IVb kao suspenzija. Rezultatiin vivoizlaganja od formulacija leka u kapsuli sugerišu da bi oralno izlaganje IVb kod ljudi moglo biti značajno poboljšano primenom uobičajenih čvrstih oblika oralne doze jedinjenja Ibb.
Ibb je fosfatni prolek N-hidroksimetil adukta jedinjenja IVb i hidrolizovan je alkalnom fosfatazom (ALP) da bi se formirao IVb. Posle primene Ibb na životinje, uzorci plazme su pripremljeni od krvi koja je sakupljena u prisustvu EDTA, poznatog inhibitora ALP. Konverzija Ibb u IVb bila je minimalna (< 2%) u krvi koja sadrži EDTA (pacov, pas, majmun i čovek). Nije očekivana značjanijeex vivokonverzija Ibb u toku čuvanja uzoraka (-20°C) i analize Ibb.
Hidroliza Ibb je ispitivana uin vitrosistemima životinja i čoveka. S obzirom na to da su višestruke ALP izoforme široko distribuirane u različitim tkivima, kvantitativnein vitrouin vivokorelacije nisu pokušane (Fishman et al., 1968; Komoda et al., 1981; Moss, 1983; Yora and Sakagishi, 1986; Sumikavva et al., 1990). Prema tome, ispitivanja su bila ograničena na kvalitativnu procenu ALP-zavisne hidrolize u različitim tkivima. Ibb je hidrolizovan u prisustvu seruma (pacov, pas, majmun i čovek), hepatocita (pacov, pas i čovek) kao i placentalne ALP čoveka. Nikakav promet nije uočen u hepatocitama majmuna. Konverzija Ibb u IVb bila je blizu stehiometrijske. Kao posledica hidrolize u serumu, vezivanje proteina od strane Ibb nije moglo biti utvrđeno.
Ibb je potpuno hidrolizovan tako da formira IVb u Caco-2 ćelijama i, kao što je očekivano, veoma niski nivoi Ibb detektovan! su u plazmi pacova, psa i majmuna posle oralne primene Ibb. Ovi rezultati su u skladu sa izveštajima koji opisuju visoke nivoe ekspresije ALP u crevima (McComb et al., 1979a; Buttervvorth, 1983). ALP vezan za membranu se najvećim delom nalazi u trepljastim graničnim membranama mikrovila koji oblažu crevni lumen (Buttervvorth, 1983; Testa and Mayer, 2003). Verovatno se posle oralne primene Ibb, Ibb hidrolizujc sa ALP prisutnom na trepljastim graničnim membranama crevnog lumena da bi se formirao IVb, koji se brzo apsorbuje zahvaljujući njenoj visokoj permeabilnosti.
Iako različite izoforme ALP postoje u različitim tkivima i vrstama, specifičnost za podlogu za ALP je relativno široka (Heimbach et al., 2003), što je u skladu sa prethodno navedenim nalazima za Ibb.
IVb se brzo formira posle IV primene Ibb kod pacova, psa i majmuna. IV AUC odnosi konverzije bili su 0.62 kod pacova, 1.6 kod pasa i 1.7 kod majmuna, što sugeriše zadovoljavajuću do dobru konverziju od Ibb u IVb. Dobre oralne biodostupnosti (50-310%; izračunate korišćenjem ranijih IV AUC jedinjenja IVb) jedinjenja IVb zabeležene su posle primene Ibb kod pacova, pasa i majmuna. Značajnije, veća rastvorljivost Ibb u vodi smanjila je stopom rastvaranja ograničenu apsorpciju jedinjenja IVb i na taj način povećala izlaganje IVb u ispitivanju rasta oralne doze i toksikokinetičkim ispitivanjima u poređenju sa izlaganjima iz ranijih ispitivanja IVb (Discovery Toxicology section tabele 28-29 i si. 12-13).
Metode
Ispitivanja opisana u ovom izveštaju koristila su mono-lizin so jedinjenja Ibb.
Kvantitativno određivanje jedinjenja Ibb i IVb pomoću LC/ MS/ MS
LC/MS/MS metoda je razvijena za analizu Ibb i IVb u uzorcima plazme iz farmakokinetičkih ispitivanja kod životinja kao i u acetonitrilnom supernatantu izin vitroinkubacionih ispitivanja. Za analizu u plazmi, korišćen je Packard Multiprobe instrument za prebacivanje 50 pL svakog standarda, QC i uzorka plazme u čistu 96-komomu ploču za ekstrakciju proteinskog precipitata. Posle dodavanja 200 pL acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard IVc, uzorci su mešani na vorteksu i dobijeni supernatant je odvojen od istaloženih proteina centrifugiranjem u trajanju od 10 min. Za analizu u supernatantu dobijenom izin vitroispitivanja, ista zapremina supematanta i acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard je pomešana. Alikvota prethodno navedenog supematanta je prebačena korišćenjem Tomtec automatskog tečnog manipulatora u drugu čistu 96-komornu ploču. Dodata je ista zapremina vode i ploča je zatvorena poklopcem i mešana na vorteksu.
HPLC sistem se sastojao od Shimadzu LClOADvp pumpi (Columbia, MD) i HTC PAL autosemplera (Leap Technologies, Garv. NC) povezanog za Phenomenex Svnergi Fusion-RP analitičku kolonu (2.0 x 50 mm, 5 p; Torrance, CA). Pokretna faza A sastojala se od 5 mM amonijum formata u vodi; pokretna faza B bila je 100% acetonitril. LC stopa protoka bila je 0.38 mL/min. Početni sastav pokretne faze je bio 2% B, podignuta do 50%> B u toku 1.8 min i održavan 0.5 min, podignuta do 100%> B u toku 0.1 min i održavana 0.5 min, vraćena je do početnih uslova u toku sledećih 0.1 minuta, i ponovo postavljena u stanje ravnoteže. Ukupno vreme analize bilo je 4.0 min. Vreme zadržavanja za Ibb, IVb i IVc bilo je 1.42, 2.21 i 1.73 min, redom.
HPLC sistem je povezan sa Sciex API4000 triple quadrupole maseni spektrometar (Toronto, Canada) opremljen sa izvorom turbo jonskog spreja podešenim na 550°C i voltažom jonskog spreja podešenom do 4.5 kV. UHP azot je upotrebljen kao raspršivač i pomoćni gas sa pritiskom od 80 psi i 7-L/min, redom. Energije kolizije za Ibb, IVb i IVc bile su 19, 25 i 29 volti, redom. Zbog način na koji su uzimani podaci izabran je monitoring reakcije (SRM). Joni koji predstavljaju pozitivne jonske (M+H)+ vrste za Ibb, IVb i unutrašnji standard su izabrani u MSI i koliziono razdvojeni sa azotom i optimizovana im je koliziona energija da bi se formirali specifični jonski proizvodi koji su naknadno praćeni preko MS2. SRM prelazi za Ibb, IVb i IVc bili su m/z 558^432, 448^202 i 474^256, redom.
Standardne krive u opsegu od 5 nM do 10 pM pripremljene su od stok rastvora i serijski razblažene u matriksu za Ibb i IVb. Standardne krive su podeljene na jednake delove u duplikatu, ekstrahovane sa uzorcima, i injektirane na početku, sredini i na kraju analitičke sekvence. Standardne krive su fitovane linearnom regresijom vrednovanom recipročnom koncentracijom l/x2. Rezultati i hromatografski vrhovi su obrađeni i koncentracije standarda i nepoznatog su kvantitativno određeni primenom PEBiosvstems Analvst™ 1.1.
In Vitro metode
(1)Stabilnost Ibb u EDTA krvi, serumu i Tris- HCl puferu
Stabilnost Ibb je ispitivana u svežoj krvi i serumu od pacova, pšsa, majmuna i čoveka (n = 2). Krv je sakupljana u vacutainer epruvete koje su sadržale K?EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Serum je sakupljen u vacutainer epruvete koje su sadržale antikoagulant. Ibb je inkubiran na početnoj koncentraciji od približno 15 pM 90 minuta na 37°C. Serijski uzorci su uzeti u prethodno određenim vremenskim tačkama. Alikvote uzoraka krvi (200 pL) su prvo mešane sa 100 pL vode i zatim sa 400 pL acetonitrila. Uzorci seruma (50 pL) su dodati u microtainer epruvete koje sadrže K2EDTA (Becton Dickinson. Franklin Lakes, NJ) a zatim je dodato 100 pL acetonitrila. Supernatant je analiziran za Ibb i za IVb pomoću LC/MS/MS. Stabilnost Ibb je takođe procenjivana, kao sto je opisano u prethodnom tekstu, u Tris-HCl puferu (0.1 M, pH 7.5).
(2) Hidroliza Ibb u prisustvu placentalne ALP čoveka
Čvrsta placentalna ALP čoveka dobijena je iz Sigma (P-3895, St. Louis, MO). Rastvor od 1000 jedinica/L pripremljen je u Tris-HCl puferu (0.1 M, pH 7.5). Rastvori od 100 i 10 jedinica/L dobijeni su serijskim razblaženjem. Ibb je inkubiran u rastvorima od 10, 100 i 1000 jedinica/L (n = 2) na 37°C u trajanju od 2 časa. Početna koncentracija Ibb u inkubaciji bila je 10 pM. Alikvote od 100 pL uzoraka uzete su u prethodno određenim vremenskim tačkama i dodate u K2EDTA microtainer epruvete, a zatim je dodato 200 pL acetonitrila. Supernatant je analiziran za Ibb i za IVb pomoću LC/MS/MS.
In Vivo ispitivanja
Svi uzorci krvi (0.3 mL) su sakupljeni u microtainer epruvete koje sadrže K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) i postavljeni na izlomljeni led. Posle centrifugiranja, plazma je odvojena i Čuvana na -20°C do analize. Mono- lizin so jedinjenja Ibb (oblik 3) je upotrebljena za farmakokinetička ispitivanja. Dozirajući rastvori jedinjenja Ibb pripremljeni su bilo u sterilnoj vodi (za IV primenu kod pasa i majmuna) ili destilovanoj vodi (za primenu svih ostalih doza).
(1)7« Vivo ispitivanja kod pacova
Korišćeni su mužjaci Sprague-Davvlev pacova (300-350 g. Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA) sa kanilama implantiranim u jugularnu venu. Pacovi su izgladnjivani preko noći u PO farmakokinetičkim ispitivanjima. Uzorci krvi su sakupljeni iz jugularne vene.
U IV ispitivanju, Ibb je primenjen u dozi od 1.3 mg/kg (slobodna kiselina, ili 1.0 mg/kg IVb ekvivalenta) kao bolus injekcija u trajanju od 0.5 minuta (n = 3). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 1.3 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 1 mL/kg. Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 2, 10, 15, 30, 45 minuta, i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
U PO ispitivanju , Ibb je primenjen u dozi od 6.6 mg/kg (slobodna kiselina, ili 5.2 mg/kg IVb ekvivalenta) oralnom gavažom (n = 3). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 1.3 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 5 mL/kg. Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 15, 30, 45 minuta, 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časa posle doziranja.
(2) hi Vivo ispitivanja kod pasa
IV i PO ispitivanja Ibb izvedena su kod mužjaka pasa zečara (10 ± 0.78 kg, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY). Tri psa su korišćena u svakom ispitivanju. Od tri psa, dva ista psa su upotrebljena za IV i PO ispitivanja. Dvo-nedeljni period ispiranja je bio između IV i PO ispitivanja.
U IV ispitivanju, Ibb je davan infuzijom preko cefalične vene u dozi od 1.3 mg/kg (slobodna kiselina, ili 1.0 mg/kg IVb ekvivalenta) u toku 5 minuta sa konstantnom stopom od 0.1 mL/kg/min. Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 2.6 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi su sakupljeni iz femoralne arterije pre doziranja i 5, 10, 15, 30, 45 minuta, 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
U PO ispitivanju, psi su izgladnjivani preko noći pre doziranja. Ibb je primenjen oralnom gavažom u dozi od 7.0 mg/kg (slobodna kiselina, ili 5.6 mg/kg IVb ekvivalent). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 7.0 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 1 mL/kg. Serijski uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja i 15, 30, 45 minuta, 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
(3) In Vivo ispitivanja kod majmuna
IV i PO ispitivanja Ibb izvedena su na unakrsni način kod tri mužjaka makaki majmuna (9.9 ± 2.4 kg, Charles River Biomedical Research Toundation, Houston, TX). Između IV i PO ispitivanja bio je dvo-nedeljni period ispiranja.
U IV ispitivanju, Ibb je davan infuzijom preko femoralne vene u dozi od 1.3 mg/kg (slobodna kiselina, ili 1.1 mg/kg IVb ekvivalenta) u toku 5 minuta sa konstantnom stopom od 0.1 mL/kg/min. Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 2.7 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi su sakupljeni iz femoralne arterije pre doziranja i 5, 10, 15, 30, 45 minuta, 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
U PO ispitivanju, majmuni su izgladnjivani preko noći pre doziranja. Ibb je primenjen oralnom gavažom u dozi od 5.8 mg/kg (slobodna kiselina, ili 4.7 mg/kg IVb ekvivalenta). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 5.8 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 1 mL/kg. Serijski uzorci krvi sakupljeni su pre doziranja i 15, 30, 45 minuta, 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
(4) Analiza rezultata
Svi rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SD, osim ukoliko nije naznačeno drugačije.
Farmakokinetički paramteri jedinjenja Ibb i IVb izračunati su pomoću Non-Compartmental analize primenom KINETICA™ softvera (verzija 4.0.2, InnaPhase Co., Philadelphia, PA). Cmax i Tmax vrednosti su zabeležene direktno iz eksperimentalnih posmatranja. AUCo-ni AUClotvrednosti su izračunavane primenom kombinovanog log-linearnog trapezoidalnog sumiranja. Ukupni telesni klirens (Cl), srednje vreme zadržavanja (MRT) i zapremina koja se distribuira u stabilnom stanju (Vss) takođe su izračunati posle intravenozne primene. Apsolutna oralna biodostupnost (izražena u %) je procenjena uzimanjem odnosa doze — normalizovanih AUC vrednosti posle oralnih doza prema onima posle intravenoznih doza.
in vitrounutrašnji klirens jedinjenja Ibb u hepatocitama (Clml) izračunat je na sledeći način:
Cljnt(pL/min/milion ćelija) = Stopa / Ce
gde Stopa predstavlja stopu metabolizma u hepatocitama (pmol/min/milion ćelija), i Cr je koncentracija Ibb u inkubaciji.
in vivounutrašnji klirens jetre jedinjenja Ibb (Cl,nt, in vivo) izračunat je na sledeći način:
gde x predstavlja 40, 32, 30 i 26 g jetri/kg telesne težine za pacova, psa, majmuna i čoveka, redom (Daviš and Morris, 1993).
Klirens jetre Clnje izračunat iz sledeće jednačine primenom dobro razrađenog modela:
gde Qh predstavlja protok krvi u jetri od 55, 31, 44 i 21 mL/min/kg za pacova, psa, majmuna i čoveka, redom (Daviš and Morris, 1993).
Stopa ekstrakcije u jetri (ER) je izračunat na sledeći način:
Student-ov t-test je korišćen za statističku analizu (Microsoft Excel, Redmond, WA). Razlike su smatrane statististički značajnim na nivou od P < 0.05.
In Vitro ispitivanja
Stabilnost Ibb u EDTA krvi, serumu i Tris- HCl puferu
Kao deo provere analitičkog testa, stabilnost jedinjenja Ibb je ispitivna u krvi koja sadrži EDTA, za koji je poznato daje inhibitor ALP (Bovvers, Jr. and McComb, 1966; Yora and Sakagishi, 1986). Posle inkubacije na 37°C u trajanju od 90 minuta, bilo je manje od 2% konverzije od Ibb u IVb u krvi koja sadrži EDTA i u prisustvu Tris-HCl pufera (tabele 30 i 31). Prethodni mali procenti konverzije zabeležene na 37°C ukazuju na to da je konverzija pod uslovima čuvanja uzoraka (-20°C) malo verovatna. Prema tome, relativno minimalnaex vivokonverzija u IVb očekivana je u toku analize Ibb.
Da bi se ispitala hidroliza jedinjenja Ibb u sistemskoj cirkulaciji, Ibb je inkubiran u svežem serumu (pacova, psa, majmuna i čoveka) na 37°C u trajanju od 90 minuta. Stopa hidrolize je bila najbrža u serumu majmuna, a zatim u serumu čoveka, psa i pacova (tabela 3). Konverzija Ibb u IVb bila je blizu stehiometrijske.
Serum poseduje nižu ALP aktivnost u poređenju sa tkivima (McComb et ah, 1979a). Pored toga, serum takođe sadrži ALP izoforme iz tkivnih izvora kao što su kosti, jetra i crevo, kao rezultat prolaska enzima kroz krvne sudove (Moss, 1983). Prema tome, hidroliza jedinjenja Ibb u serumu je verovatno posredovana višestrukim izoformama ALP.
Hidroliza Ibb u prisustvu placentalne ALP čoveka
Da bi se ispitala hidroliza Ibb u prečišćenom obliku humane ALP, Ibb je inkubiran na 37°C (2 časa) sa rastvorima koji sadrže placentalnu ALP čoveka (10, 100 i 1000 jedinica/L). Određena jeX\ anestajanja Ibb (tabela 4). Kao što je očekivano, stopa hidrolize bila je brža u rastvorima sa višom ALP aktivnošću. IVb je takođe formiran shodno tome (si. 14). Ovo ukazuje na to je Ibb hidrolizovan sa ALP izvedenom od čoveka da bi se formirao IVb.
Napomena: Ibb je inkubiran u početnoj koncentraciji od 10 pM na 37°C u trajanju od 120 min.
In Vivo ispitivanja
In vivo ispitivanja kod pacova
Farmakokinetički parametri jedinjenja Ibb i IVb kod pacova posle IV i oralne primene Ibb prikazani su u tabeli 34. Profili koncentracija u plazmi prema vremenu prikazani su na slici 15. Za poređenje, raniji rezultati iz farmakokinetičkih ispitivanja jedinjenja IVb kod pacova takođe su prikazani.
Ukupni telesni klirens (Cl) jedinjenja Ibb posle IV primene bio je 19 mL/min/kg. što sugeriše da je Ibb jedinjenje sa niskim do umerenim klirensom kod pacova. Polu-život eliminacije (t|/2) i srednje vreme zadržavanja (MRT) posle IV primene bili su 0.18 časova i 0.079 časova, redom. Iab nije detektovan nakon 2 časa. Zapremina distribucije Ibb u stabilnom stanju (Vss) bila je 0.10 L/kg. što sugeriše veoma ograničenu tkivnu distribuciju. Formiranje IVb od Ibb posle IV primene bilo je brzo; IVb je detektovan u prvoj vremenskoj tački uzimanja uzorka od 2 minuta (rezultati nisu prikazani). IV AUC odnos IVb formiranog od Ibb prema toj vrednosti iz ranijeg ispitivanja IVb bio je 0.62 (teoretska vrednost za potpunu konverziju = 1), što ukazuje na zadovoljavajuću konverziju Ibb u IVb kod pacova posle IV doziranja.
Ibb je detektovan (< 10 nM) u plazmi (0.25 i 0.5 časova) posle oralne primene. Tmax jedinjenja IVb posle oralne primene jedinjenja Ibb bila je 0.83 časova, što je kraće od ranije Tmax jedinjenja IVb od 4.7 časova, što ukazuje na bržu apsorpciju IVb posle oralne primene proleka. Brža apsorpcija IVb od leka verovatno je rezultat bolje rastvorljivosti Ibb u vodi kao i brže hidrolize Ibb da bi se formirao IVb u crevima. Apsolutna oralna biodostupnost jedinjenja IVb od Ibb bila je 50%, što je slično ranijoj IVb vrednosti od 60%> (tabela 34). Pored toga, izlaganje IVb od ispitivanja rasta oralne doze Ibb kod pacova bilo je superiorno u poređenju sa ranijim rezultatima sa IVb (tabela 31 i si. 14).
In Vivo ispitivanja kod pusa
Farmakokinetički parametri jedinjenja Ibb i IVb kod pasa posle IV i oralne primene Ibb prikazani su u tabeli 35. Profili koncentracije u plazmi prema vremenu prikazani su na slici 16. Radi poređenja, takođe su prikazani i raniji rezultati iz farmakokinetičkih ispitivanja IVb kod pasa.
Cl jedinjenja Ibb posle IV primene bilo je 27 mL/min/kg, stoje slično protoku krvi u jetri od 31 mL/min/kg kod pasa, što sugeriše da je Ibb jedinjenje sa visokim klirensom kod pasa. tj/2i MRT posle IV primene bili su 0.83 časova i 0.21 časova, redom. MRT je odražavao realniju procenu trajanja Ibb u plazmi, s obzirom na to da su koncentracije Ibb u plazmi u terminalnoj fazi bile niske (si. 3). Ibb nije detektovan nakon 4 Časa. Vss jedinjenja Ibb bila je 0.35 L/kg, što sugeriše ograničenu tkivnu distribuciju. Formiranje IVb od Ibb posle IV primene bilo je brzo; IVb je detektovan u prvoj vremenskoj tački uzimanja uzorka od 5 minuta (rezultati nisu prikazani). IV AUC odnos jedinjenja IVb formiranog od Ibb prema toj vrednosti iz ranijeg ispitivanja IVb bio je 1.6, što sugeriše potpunu konverziju Ibb u IVb kod pasa posle IV primene.
Ibb je detektovan (Cmax = 0.034 nM) u uzorcima plazme u ranim vremenskim tačkama (do 2 časa kod jednog psa) posle oralne primene. Tmax jedinjenja IVb posle oralne primene Ibb bilo je 0.40 časova, slično ranijim Tmax jedinjenja IVb od 0.50 časova. Apsolutna oralna biodostupnost IVb od Ibb bila je 310%, što je slično ranijim rezultatima za IVb od 179%. Pored toga, izlaganje IVb iz ispitivanja Ibb tolerancije kod pasa (rast doze) bilo je veće u porećenju sa ranijim podacima sa IVb (tabela 31 i si. 15).
Profili terminalne koncentracije u plazmi prema vremenu jedinjenja IVb formiranog od Ibb su slični ranijim profilima jedinjenja IVb (si. 16).
In Vivo ispitivanja kod majmuna
Farmakokinetička ispitivanja Ibb i IVb kod majmuna posle intravenozne i oralne primene Ibb prikazani su u tabeli 36. Profili koncentracije u plazmi prema vemenu prikazani su na slici 17. Radi poređenja, raniji podaci iz farmakokinetičkih ispitivanja IVb kod majmuna takođe su prikazani.
Cl jedinjenja Ibb posle IV primene bilo jc 28 mL/min/kgšto sugeriše da je Ibb jedinjenje sa umerenim do visokim klirensom kod majmuna. t|,o i MRT posle IV primene bili su 0.10 časova i 0.093 časova, redom. Vss jedinjenja Ibb bila je 0.15 L/kg. što sugeriše veoma ograničenu tkivnu distribuciju. Formiranje IVb od Ibb posle IV primene bilo je brzo; IVb je detektovan u prvoj vremenskoj tački uzimanja uzorka od 5 minuta (rezultati nisu prikazani). IV AUC odnos jedinjenja IVb formiranog od Ibb prema toj vrednosti iz ranijeg ispitivanja IVb bio je 1.7, što sugeriše potpunu konverziju Ibb u IVb kod majmuna posle IV doziranja.
Ibb nije detektovan (LLQ = 5 nM) ni u jednom uzorku plazme posle oralne primene. Tmax jedinjenja IVb posle oralne primene Ibb bilo je 1.5 časova, što je slično ranijem Tmax jedinjenja IVb od 2.5 časova. Apsolutna oralna biodostupnost jedinjenja IVb od Ibb bila je 187%, što je više od ranijih IVb rezultata od 49% (tabela 36).
Profili terminalne koncentracije u plazmi prema vremenu jedinjenja IVb formiranog od Ibb su slični ranijim profilima IVb (si. 17).
Jednodnevno oralno toksikokinetičko ispitivanje kod pacova je izvedeno primenom proleka Icb (dinatrijum so). Icb je primenjen u dozama od 5, 25 i 200 mg/kg (slobodna kiselina) oralnom gavažom na tri mužjaka pacova/grupi primenom vode kao nosača (formulacija rastvora). Doze proleka slobodne kiseline odgovaraju IVc (ishodno) molarnim ekvivalentnim dozama od 4.5, 21 i 163 mg/kg, redom. Procenjene krajnje tačke bile su toksikokinetika plazme jedinjenja Icb i IVc kod pojedinačnih pacova.
Srednje toksikokinetičke vrednosti su date u tabeli 37.
Srednja maksimalna koncentracija u plazmi (Cmax) jedinjenja IVc (ishodno) postignuta je u roku od~1.7 časova posle doziranja. Kod pacova koji su dobijali <267 mg/kg Icb, povećanje AUC jedinjenja IVc bilo je blizu proporcionalnog sa Icb dozom, i Cmax je porastao na manje od proporcionalnog od doze između 25 i 200 mg/kg jedinjenja Icb. Icb nije detektovan u plazmi pacova koji su primali<<>25 mg/kg jedinjenja Icb, a veoma niske koncentracije (-0.02-0.04 pM) dctektovani su u plazmi pacova koji su primali 200 mg/kg jedinjenja Icb u nekoliko vremenskih tačaka.
Poređenje IVc AUC dobijenog kod pacova koji su primali bilo IVc (1) ili Icb, prikazano je na slici 18.
AUC jedinjenja IVc je slično posle primene bilo ishodnog jedinjenja ili proleka u nižim dozama (npr.,<<>25 mg/kg) zbog toga što oba ova jedinjenja mogu biti formulisana kao rastvori (PEG- 400/etanol/0.1N NaOH za ishodno jedinjenje i voda za prolek), ali u većoj dozi (npr., 200 mg/kg) neutralno ishodno jedinjenje može biti formulisano samo kao suspenzija, pri čemu so proleka može biti formulisana kao vodeni rastvor, koji obezbeđuje superiorno izlaganje IVc.
Toksikokinetičko i ispitivanje tolerancije pojedinačne doze kod pasa
Dvo-fazno ispitivanje je izvedeno da bi se procenila tolerancija proleka, Icb (monotrometamin so) u dozama od 25, 92 ili 250 mg/kg (slobodna kiselina, molami ekvivalent 20, 75 ili 203 mg/kg ishodnog jedinjenja IVc, redom) i toksikokinetika jedinjenja Icb i IVc (2). Na dan 1, Icb je primenjen na jednog psa/polu/grupi jednom dnevno u suvo punjenim kapsulama u prethodno navedednim dozama. Jedno-nedeljni period ispiranja je upotrebljen između doza u ispitivanju. Na dan 8, Icb je primenjen na jednog psa/polu/grupi jednom dnevno kao vodeni rastvor u 25 mg/kg ili dva puta dnevno u suvo punjenim kapsulama u 46 ili 125 mg/kg BID. Krajnje tačke bile su: klinički znaci, telesna težina, uzimanje hrane, hemijska svojstva seruma, hematologija i toksikokinetika plazme jedinjenja Icb i IVc.
Toksikokinetičke vrednosti plazme pojedinačnih pasa prikazane su u tabeli 38.
Niski nivoi (< 0.1 pM) jedinjenja Icb detektovani su u nekim uzorcima plazme na dane 1 i 8. Srednja maksimalna koncentracija u plazmi (Cmax) jedinjenja IVc postignuta jc između 1-2 časa posle doze za QD doziranje, i 1-2 časova polse druge doze za BID doziranje. U dozi od 25 mg/kg QD, ekvivalentni Cmax i AUC IVc zabeleženi su kada je Icb primenjen bilo kao suvo punjene kapsule ili vodeni rastvor.
Na dan 1, zabeleženo je povraćanje (belo ili braon, prugasto sa crvenim koji sadrži ostatke kapsule) i to 1-1.25 časova posle doziranja kod pasa koji su primali<>>92 mg/kg QD (310TM, 4101M i 4201F), što je verovatno doprinelo istom izlaganju između 92 i 250 mg/kg. Na dan 8, povraćanje je zabeleženo u roku od 2 časa posle doziranja kod oba psa koji su primali 125 mg/kg BID, ali sa različitim rezultatima. Životinja 4101M imala je značajno izlaganje uprkos povraćanju, što je u skladu sa odsustvom ostataka kapsule u izbljuvku.
Samo niski nivoi (50.1 pM) jedinjenja Icb su detektovani u nekim uzorcima plazme na dane 1 i 8.
Osim povraćanja, nisu zabeleženi drugi klinički znakovi, i nije bilo uticaja na telesnu težinu i utrošak hrane.
Uprkos povraćanju koje je zabeleženo kod pasa, veća IVc AUC zabeležena je kod pasa koji su primali Icb u odnosu na pse koji su primali IVc. Poređenje IVc AUC dobijeno kod pasa kojima je davan Icb ili IVc (3, 4), prikazano je na slici 19.
Nosači i formulacije
Rezime formulacija korištenih za Key PK i ispitivanje hezbednosti
Svain vivoPK ispitivanja kod pacova, pasa i majmuna izvedena su upotrebom vodenih rastvora za PO i IV doziranje. Pre-ECN toksikološka ispitivanja kod pasa izvedena su sa vodenim rastvorima pripremljenim u 20 mg/kg IVc ekvivalent dozi i kao formulacije lek u kapsuli u dozama od 20, 75 i 203 mg/kg IVc ekvivalenata.
U ispitivanju rasta oralne doze kod pacova, Icb-03 je doziran kao vodeni rastvori u dozama od 4.5, 21 i 163 mg/kg IVc ekvivalenata. Zabeležena su značajna poboljšanja u AUC i Cmax IVc, ishodnog jedinjenja, posle oralnog doziranja Icb, proleka, u poređenju sa ranijim podacima posle IVc oralnog doziranja.
Prikaz metabolizma i farmakokinetike
Rezime nalaza i tumačenja
Icb je fosfatni prolek N-hidroksimetil adukta jedinjenja IVc i hidrolizovan je alkalnom fosfatazom (ALP) da bi se formirao IVc. Posle primene Icb na životinje, prema tome, uzorci plazme su pripremljeni od krvi sakupljene u prisustvu EDTA, poznatog inhibitora ALP. Konverzija Icb u IVc bila je minimalna (< 2%) u krvi koja sadrži EDTA (pacov, pas, majmun i čovek). U toku čuvanja uzoraka (-20°C) i analize Icb nije zabeležena značajnaex vivokonverzija Icb.
Hidroliza Icb je ispitivana kod životinja i čoveka uin vitrosistemima. S obzirom da su višestruke ALP izoforme široko distribuirane u različitim tkivima, kvantitativnein vitropremain vivokorelacije nisu pokušavane (Fishman et ah, 1968; Komoda et ah, 1981; Moss, 1983; Yora and Sakagishi, 1986; Sumikavva et al, 1990). Prema tome, ispitivanja su bila ograničena na kvalitativnu procenu ALP-zavisne hidrolize u različitim tkivima. Icb je hidrolizovan u prisustvu seruma (pacov, pas, majmun i čovek), hepatocita (pacov, pas i čovek) kao i placentalne ALP čoveka. U hepatocitima majmuna nije zabeležen promet. Konverzija Icb u IVc bila je blizu stehiometrijske. Kao posledica hidrolize u serumu, vezivanje proteina od strane Icb nije moglo biti određeno.
IVc je brzo formiran posle IV primene Icb kod pacova, pasa i majmuna. Odnosi konverzije IV AUC bili su 1.0 kod pacova, 0.67 kod pasa i 0.90 kod majmuna, što sugeriše dobru konverziju od Icb u IVc.
Dobre oralne biodostupnosti (80-122%) jedinjenja IVc zabeležene su posle primene Icb kod pacova, pasa i majmuna. Značajnije, veća rastvorljivost Icb u vodi smanjila je stopom rastvaranja ograničenu apsorpciju IVc ispod određenih doza i na taj način povećala je izlaganja IVc u ispitivanjima rasta oralne doze i toksikokinetičkim ispitivanjima u poređenju sa izlaganjima iz ranijih ispitivanja IVc.
Metode
Ispitivanja opisana u ovom radu koristila su monotrometamin so jedinjenja Icb, osim ukoliko nije naznačeno drugačije.
Kvantitativno određivanje Icb i IVc pomoću LC/ MS/ MS
LC/MS/MS metod je razvijen za nalizu Icb i IVc u plazma uzorcima iz Ihrmakokinetičkih ispitivanja na životinjama kao i u supernatantima acetonitrila izin vitroinkubacionih ispitivanja. Za analizu u plazmi, korišćen je Packard Multiprobe instrument za prenos 50 pL svakog od standarda. QC i uzorka plazme u čistu 96-komornu ploču za ekstrakciju proteinskog precipitata. Posle dodavanja 200 pL acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard jedinjenje X prikazano u daljem tekstu, uzorci su mešani na vorteksu i dobijeni supernatant je odvojen od istaloženih proteina centrifugiranjem od 10 min. Za analizu u supernatantu formiranom izin vitroispitivanja, pomešana je ista zapremina supematanta i acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard. Alikvota prethodnog supematanta prebačena je primenom Tomtec automatskog tečnog manipulatora u drugu čistu %-komornu ploču. Ista zapremina vode je dodata, i ploča je zatvorena poklopcem i mešana na vorteksu.
4-metoksi-3-(2-okso-2-(4-(hinazolin-4-il)piperazin-l-il)acetil)-lH-pirolo[2,3-c]piriđin-7-karboksamid
HPLC sistem koji se sastojao od Shimadzu LC 10 ADvp pumpi (Columbia, MD) i HTC PAL autosempler (Leap Technologies, Garv, NC) povezanog za Phenomenex Svnergi Fusion-RP analitičke kolone (2.0 x 50 mm, 5 p; Torrance, CA). Pokretna faza A sastojala se od 5 mM amonijum formata u vodi; pokretna faza B bila je 100% acetonitril. LC stopa protoka bila je 0.4 mL/min. Početni sastav pokretne faze bio je 3% B, podignut do 60% B u toku 1.75 min i održavan 0.5 min, podignut do 100% B u toku 0.1 min i održavan 0.5 min, vraćen do početnih uslova u toku sledećih 0.1 min. i ponovo postavljen u stanje ravnoteže. Ukupno vreme analize bilo je 4.0 min. Vreme zadržavanja za Icb, IVc i jedinjenje X bilo je 1.2, 1.7 i 1.6 min, redom.
HPLC sistem povezan je sa Sciex API4000 triple quadrupole maseni spektrometar (Toronto, Canada) opremljen sa izvorom turbo jonskog spreja postavljenim na 550°C i voltažom jonskog spreja postavljenom na 4.5 kV. UHP azot je upotrebljen kao raspršivač i pomoćni gas sa pritiskom od 80 psi i 7 L/min, redom. Kolizione energije za Icb, IVc i jedinjenje X bile su 23, 29 i 37 volti, redom. Zbog načina uzimanja podataka izabran je monitoring reakcije (SRM). Joni koji predstavljaju pozitivne jonske (M+H) vrste za Icb, IVc i unutrašnji standard izabrani su u MSI i koliziono razgrađeni sa azotom i optimizovane su im kolizione energije da bi se formirali specifični jonski proizvodi koji su naknadno praćeni sa MS2. SRM prelazi za Icb, IVc i jedinjenje X bili su m/z 584-^486, 474->256 i 460-^218, redom.
Standardne krive u opsegu od 5 nM do 10 pM pripremljene su od stok rastvora i serijski razblažene u matriksu za Icb i IVc. Standrađne krive su podeljene na jednake delove u duplikatu, ekstrahovane sa uzorcima i injektirane na početku, sredini i na kraju analitičke sekvence. Standardne krive su fitovane linearnom regresijom vrednovanom recipročnom koncentracijom l/x<2>. Rezultati i hromatografski vrhovi su obrađeni i koncentracije standarda i nepoznatog su kvantitativno određeni primenom PEBiosvstems Analvst™ 1.1.
In Vitro metode
(1 )Stabilnost Icb u EDTA krvi, serumu i Tris- HCl puferu
Stabilnost Icb je ispitivana u svežoj krvi i serumu od pacova, psa, majmuna i čoveka (n = 2). Krv je sakupljena u vacutainer epruvete koje sdrže K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Serum je sakupljen u vacutainer epruvete bez antikoagulanta. Icb je inkubiran u početnoj koncentraciji od približno 10 pM 90 minuta na 37°C. Serijski uzorci su uzimani u unapred određeno vreme. Alikvote uzoraka krvi (200 pL) su prvo mešane sa 100 pL vođe i zatim sa 400 pL acetonitrila. Uzorci seruma (50 pL) su dodati u microtainer epruvete koje sadrže K2EDIA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) i zatim je dodato 100 uL acetonitrila. Supernatant je analiziran za Icb i IVc pomoću LC/MS/MS.
Stabilnost Icb je takođe procenjivana, kao što je opisano u prethodnom tekstu, u Tris-HCl puferu (0.1 M, pH 7.5).
(2) Hidroliza Icb u prisustvu placentalne ALP čoveka
Čvrsta placentalna ALP čoveka dobijena je iz Sigma (P-3895, St. Louis, MO). Rastvor od 1000 jedinica/L pripremljen je u Tris-HCl puferu (0.1 M, pFI 7.5). Rastvori od 100 i 10 jedinica/L dobijeni su serijskim razblaženjem. Icb je inkubiran u 10. 100 i 1000 jedinica/L
rastvorima (n = 2) na 37°C u trajanju od 2 časa. Početna koncentracija Icb u inkubaciji bila je 10 uM. Alikvote 100 pL uzoraka uzete su u unapred određeno vreme i dodate u KoEDTA microtainer epruvete i zatim je dodato 200 pL acetonitrila. Supernatant je analiziran za Icb i IVc pomoću LC/MS/MS.
(1) In Vivo ispitivanja kod pacova
Korišćeni su mužjaci Sprague-Dawley pacova (300—350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA) sa kanilama implantiranim u jugularnu venu. Pacovi su izgladnjivani preko noći u PO farmakokinetičkim ispitivanjima. Uzorci krvi su sakupljeni iz jugularne vene.
U IV ispitivanju, Icb je primenjen u 1.4 mg/kg (slobodna kiselina, ili 1.1 mg/kg IVc ekvivalenta) kao bolus injekcija u toku 0.5 minuta (n = 3). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 1.4 mg/mL. i dozirajuća zapremina bila je 1 mL/kg. Serijski uzorci krvi sakupljeni su pre doziranja i 2, 10, 15, 30, 45 minuta, i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časova posle doziranja.
U PO ispitivanju, Icb je primenjen u 6.9 mg/kg (slobodna kiselina, ili 5.6 mg/kg IVc ekvivalenta) oralnom gavažom (n = 3). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 1.4 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 5 mL/kg. Serijski uzorci krv i sakupljeni su pre doziranja i 15. 30, 45 minuta i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 Časova posle doziranja.
(2) In Vivo ispitivanja kod pasa
IV i PO ispitivanja Icb izvedena su na unakrsni način kod tri mužjaka psa rase baset (12 ± 2.8 kg, Marshall Farms USA hie, North Rose, NY). Između PO i IV ispitivanja bio je period ispiranja od dve nedelje.
U IV ispitivanju, Icb je davan infuzijom preko cefalične vene u dozi od 1.3 mg/kg (slobodna kiselina, ili 1.0 mg/kg IVc ekvivalenta) u toku 5 minuta pod konstantnom stopom od 0.1 mL/kg/min. Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 2.6 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi sakupljeni su iz femoralne arterije pre doziranja i 5, 10, 15, 30, 45 minuta i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časa posle doziranja.
U PO ispitivanju, psi su izgladnjivani preko noći pre doziranja. Icb je primenjen oralnom gavažom u dozi od 6.0 mg/kg (slobodna kiselina, ili 4.9 mg/kg IVc ekvivalenta). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 12 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi sakupljeni su pre doziranja i 15, 30, 45 minuta i 1. 2, 4, 6, 8 i 24 časa posle doziranja.
(3) In Vivo ispitivanja kod majmuna
IV i PO ispitivanja Icb izvedena su na unakrsni način kod tri mužjaka makaki majmuna (10 ± 1.6 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX). Između IV i PO ispitivanja bio je dvo-nedeljni period ispiranja.
U IV ispitivanju, Icb je davan infuzijom preko femoralne vene u dozi od 1.4 mg/kg (slobodna kiselina, ili 1.1 mg/kg IVc ekvivalenta) u toku 5 minuta konstantnom stopom od 0.1 mL/kg/min. Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 2.8 mg/mL, i dozirajuća zapemina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi sakupljeni su iz femaralne arterije pre doziranja i 5, 10, 15, 30, 45 minuta i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časa posle doziranja.
U PO ispitivanju, majmuni su izgladnjivani preko noći pre doziranja. Icb je primenjivan oralnom gavažom u dozi od 4.9 mg/kg (slobodna kiselina, ili 4.0 mg/kg IVc ekvivalenta). Koncentracija dozirajućeg rastvora bila je 9.8 mg/mL, i dozirajuća zapremina bila je 0.5 mL/kg. Serijski uzorci krvi sakupljeni su pre doziranja i 15, 30, 45 minuta i 1, 2, 4, 6, 8 i 24 časa posle doziranja.
(4) Analiza rezultata
Svi rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD, osim ukoliko nije naznačeno drugačije.
Farmakokinetički paramteri jedinjenja Icb i IVc izračunati su pomoću Non-Compartmental analize primenom KINETICA™ softvera (verzija 4.0.2. InnaPhase Co.. Philadelphia, PA). Cmax i Tmax vrednosti direktno su beležene iz eksperimenta. AUC0-ni AUCUltvrednosti su izračunate primenom kombinovanog log-linearnog trapezoidnog sumiranja. Ukupni telesni klirens (Cl), srednje vreme zadržavanja (MRT) i distribuirana zapremina u stabilnom stanju (Vss) takođe su izračunavani posle intravenozne primene. Apsolutna oralna biodostupnost (izražena u %) procenjivana je uzimanjem odnosa dozno-normalizovane AUC vrednosti posle oralnih doza prema istim vrednostima posle intravenoznih doza.
In vitrounutrašnji klirens jedinjenja Icb u hepatocitima (Cl,m) izračunavan je na seledeći način:
Cljnt(uL/min/milion ćelija) = Stopa / Ce
gde Stopa predstavlja stopu metabolizma u hepatiocitima (pmol/min/milion ćelija) i Ceje koncentracija Icb u inkubaciji.
In vivounutrašnji klirens jetre jedinjenja Icb (Clim.jn vivo) izračunavan je na sledeći način:
gde%predstavlja 40, 32, 30 i 26 g jetre/kg telesne težine za pacova, psa. majmuna i čoveka. redom (Daviš and Morris, 1993).
Klirens jetre Clnizračunavan je iz sledeće jednačine primenom dobro razrađenog modela:
gde Qh predstavlja protok krvi u jetri od 55, 31, 44 i 21 mL/min/kg za pacova, psa, majmuna i čoveka, redom (Daviš and Morris, 1993).
Stopa ekstrakcije u jetri (ER) izračunavana jena sledeći način:
Student-ov t-test je korišćen za statističku analizu (Microsoft Excel, Redmond, WA). Razlike su smatrane statistički značajnim na nivou od P < 0.05.
In Vitro ispitivanja
Stabilnost Icb u EDTA krvi, serumu i Tris- HCl puferu
Kao deo validacijc analitičkog testa, stabilnost Icb je ispitivana u krvi koja sadrži EDTA, koji je poznati inhibitor alkalnih fosfataza (Bovvers, Jr. and McComb, 1966; Yora and Sakagishi, 1986). Posle inkubacije na 37°C od 90 minuta, bilo je manje od 2% konverzije Icb u IVc u krvi koja sadrži EDTA i u prisustvu Tris-HCl pufera (tabele 39 i 40). Pod uslovima čuvanja uzoraka na -20°C, prethodno navedeni niski procenti konverzije zabeleženi na 37°C ne očekuje se da uvode bilo kakvu značajnuex vivokonverziju u toku analize Icb.
Da bi se ispitala hidroliza jedinjenja Icb u sistemskoj cirkulaciji, Icb je inkubiran u svežem serumu (pacova, psa, majmuna i čoveka) na 37°C u trajanju od 90 minuta. Stopa hidrolize bila je najbrža u serumu majmuna, zatim u serumu pacova, čoveka i psa (tabela 41). Konverzija Icb u IVc bila je blizu stehiometrijske.
Serum sadrži niže ALP aktivnosti u poređenju sa tkivima (McComb et ah, 1979a). Pored toga, serum takođe sadrži ALP izoforme iz tkivnih izvora kao što su kosti, jetra i creva, kao rezultat prolaska enzima kroz krvne sudove (Moss, 1983). Prema tome, hidroliza Icb u serumu verovatno je posredovana preko višestrukih izolbnni ALP.
Hidroliza Icb u prisustvu placentalne ALP čoveka
Da bi se ispitala hidroliza Iab u prečišćenom obliku od ALP čoveka, Icb je inkubiran u rastvorima placentalne ALP čoveka u dozama od 10, 100 i 1000 jedinica/L na 37°C, 2 časa. Tl/2 nestajanja Icb određeno je i prikazano u tabeli 42. Kao sto je očekivano, stopa hidrolize bila je brža u rastvorima sa višim aktivnostima ALP. IVc je takođe formiran u skladu sa tim (si. 20). Ovo ukazuje na to da je Icb hidrolizovan sa ALP izvedenom od čoveka da bi se formirao IVc.
In Vivo ispitivanja
In Vivo ispitivanja kod pacova
Farmakokinetički parametri Icb i IVc kod pacova posle IV i oralne primene Icb prikazani su u tabeli 43. Profili koncentracija u plazmi nasuprot vremena prikazani su na slici 21. Za poređenje, raniji rezultati iz farmakokinetičkih ispitivanja jedinjenja IVc kod pacova takođe su prikazani.
Ukupni telesni klirens (Cl) jedinjenja Icb posle IV primene bio je 49 mL/min/kg, što sugeriše na to da je Icb jedinjenja sa visokim klirensom kod pacova. Polu-život eliminacije (ti/?) i srednje vreme zadržavanja (MRT) posle IV primene bili su 0.084 časova i 0.072 časova, redom. Distribuirana zapremina Icb u stabilnom stanju (Vss) bila je 0.21 L/kg, što sugeriše veoma ograničenu tkivnu distribuciju. Formiranje IVc od Icb posle IV primene bilo je brzo; IVc je detektovan u prvoj vremenskoj tački uzimanja uzorka od 2 minuta (podaci nisu prikazani). IV AUC odnos IVc formiranog od Icb prema onom iz ranijih ispitivanja IVc bio je 1.0 (teoretska vrednost za potpunu konverziju =1), što sugeriše potpunu konverziju Icb u IVc.
Icb nije detektovan (LLQ = 5 nM) ni u jednom uzorku plazme posle oralne primene. Tmax jedinjenja IVc posle oralne primene Icb bila je 0.80 časova, što je kraće od ranije vrednosti Tmax jedinjenja IVc od 4.0 časa, što ukazuje na bržu apsorpciju IVc posle oralne primene proleka. Brža apsorpcija jedinjenja IVc od proleka je verovatno rezultat bolje rastvorljivosti Icb u vodi kao i brze hidrolize Icb da bi se formirao IVc u crevu. Apsolutna oralna biodostupnost IVc od Icb bila 80%, što je slično ranijoj IVc vrednosti od 82% (tabela 43). Pored toga, izlaganje IVc iz ispitivanja rasta oralne doze Icb kod pacova bilo je superiorno u poređenju sa ranijim rezultatima sa IVc (tabela 37 i si. 18).
Profili krajnje koncentracije u plazmi nasuprot vremenu jedinjenja IVc formiranog od Icb su slični ranijim IVc profilima (SI. 21).
In vivo ispitivanje kod pasa
Farmakokinetički parametri Icb i IVc kod pasa posle IV i oralne primene Icb izloženi su u tabeli 44. Profili koncentracije u plazmi nasuprot vremena prikazani su na slici 22. Za poređenje, raniji rezultati iz farmakokinetičkih ispitivanja IVc kod pasa takođe su prikazani.
Cl jedinjenja Icb posle IV primene bilo je 64 mL/min/kg, što je značajno više od protoka krvi jetre ođ 31 mL/min/kg kod pasa, što sugeriše na potencijalnu uključenost ekstrahepatične hidrolize i/ili drugog načina eliminacije (npr., ekskrecijom preko bubrega). t),2i MRT posle IV primene bili su 0.25 hi 0.14 h, redom. Icb nije detektovan nakon 2 časa. Vss jedinjenja Icb bilo je 0.50 L/kg, što sugeriše nizak potencijal za tkivnu distribuciju. Formiranje IVc od Icb posle IV primene bilo je brzo; IVc je detektovano u prvoj vremenskoj tački uzimanja uzorka od 5 minuta (podaci nisu prikazani). IV AUC odnos IVc formiranog od Icb nasuprot onog ranijeg ispitivanja IVc bio je 0.67, što sugeriše srednju konverziju Icb u IVc kod pasa posle IV primene.
Icb nije detektovan (LLQ = 5 nM) ni u jednom uzorku plazme posle oralne primene. Tmax jedinjenja IVc posle oralne primene jedinjenja Icb bilo je 0.58 časova, što je kraće od ranijeg Tmax jedinjenja IVc od 1.3 časova, što ukazuje na bržu apsorpciju jedinjenja IVc posle oralne primene proleka. Apsolutna oralna biodostupnost jedinjenja IVc od Icb bila je 104%, što je slično ranijim IVc rezultatima od 89%. Pored toga, izlaganje IVc od Icb ispitivanja tolerancije kod pasa (rast doze) bilo je bolje u poređenju sa ranijim rezultatima sa IVc (tabela 41 i si. 21).
Profili terminalne koncentracije prema vremenu jedinjenja IVc formiranog od Icb su slični ranijim IVc profilima (si. 22).
In Vivo ispitivanje kod majmuna
Farmakokinetički paramteri Icb i IVc kod majmuna posle intravenozne i oralne primene Icb prikazani su u tabeli 45. Profili koncentracije u plazmi prema vremenu prikazani su na slici 23. Za poređenje, raniji rezultati iz farmakokinetičkih ispitivanja jedinjenja IVc kod majmuna takođe su prikazani.
Cl jedinjenja Icb posle IV primene bilo je 47 mL/min/kg, što je slično protoku krvi u jetri od 44 mL/min/kg kod majmuna, što sugeriše daje Icb jedinjenje sa visokim klirensom kod majmuna, ti/2i MRT posle IV primene bili su 0.089 časova i 0.097 časova, redom. Vss jedinjenja Icb bila je 0.27 L/kg, što sugeriše ograničenu tkivnu distribuciju. Formiranje IVc od Icb posle IV primene bilo je brzo; IVc je detektovan u prvoj vremenskoj tački uzimanja uzorka od 5 minuta (rezultati nisu prikazani). IV AUC odnos IVc formiranog og Icb prema toj vrednosti iz ranijeg ispitivanja IVc bio je 0.90, što sugeriše dobru konverziju Icb u IVc.
Icb nije detektovan (LLQ = 5 nM) ni u jednom uzorku plazme posle oralne primene. Tmax jedinjenja IVc posle oralne primene Icb bilo je 0.92 časova, što je kraće od ranijeg Tmax jedinjenja IVc od 2.3 časova, što ukazuje na bržu apsorpciju IVc posle oralne primene proleka. Apsolutna oralna biodostupnost jedinjenja IVc od Icb bila je 122%, što je više od ranijih rezultata za IVc od 64% (tabela 45).
Profili terminalne koncentraje u plazmi prema vremenu jedinjenja IVc formiranog od Icb slični su ranijim IVc profilima (si. 23).
Dodatno profilisanje deo 4:
Dodatna ispitivanja sa prolekom le
Prolek le doziranje oralno kod pacova primenom metodologije slične onoj opisanoj u ranijem tekstu za druge prolekove. Posle PO doziranja, ishodni molekul IVe je detektovan u plazmi.
Dodatno profilisanje deo 5:
Dodatna ispitivanja sa prolekom If
Prolek If je doziran oralno na pacove primenom metodologije slične onoj opisanoj u prethodnom tekstu za druge prolekove. Posle PO doziranja, ishodni molekul Ivf je detektovan u plazmi.
Sledeća tabela 47 prikazuje rezultate koji se sastoje od ispitivanja oralnog doziranja kod pacova kao stoje opisano u dodatnim profilisanjima delovi 4 i 5.
Napomena za detekciju prolekova u plazmi i drugim tkivima. Kada je oblik soli
proleka primenjen, podrazumeva se da u telu može da se javi maskiranje soli. Međutim,
testovi korišćeni za kvantitativno određivanje prolekova u predmetnim životinjskim modelima
detektuju analizom slobodnu kiselinu fosfata. Kod ovog analiziranje na primer lizin soli lab
ili slobodne kiseline Iac pretpostavlja se da se analiziraju iste vrste i nije bila namera da se
implicira da su detektovane vrste ustvari lizin so. U ovoj prijavi, ova konvencija se odnosi
samo na uzorke dobijene iz in vivo ispitivanja i uzoraka.
Biologija
• "uM" označava mikromolarno; • "mL" označava mililitar; • "pl" označava mikrolitar; • "mg" označava miligram;
• "DMSO" označava dimetilsulfoksid
Materijal i eksperimentalni postupci korišćeni za procenu anti-HIV dejstva ishodnih jedinjenja koja su stvorena od prolekovain vivoopisani su u daljem tekstu:
Ćelije:
• Humana T ćelijska linija MT-2 i PM1 (AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institutes of Health) održavane su i umnožavane u podlozi RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA). koja sadrži 10% fetusnog goveđeg seruma. (FBS, Sigma, St. Louis , MO).
Virus:
• Laboratorijski sojevi HIV-1 - T-tropički soj LAI dobijen je preko AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institutes of Health. Amplifikovan je u MT-2 ćelijama i titriran primenom testa za virusni prinos (2). Detekcija je postignuta primenom testa reverzne transkriptaze (3), adaptiranog za primenu sa Scintillation Proximity detection protokolom (1) (Amersham Biosciences, Piscatavvav, NJ).
Eksperiment
1. Stokovi jedinjenja pripremljeni su rastvaranjem u DMSO do 30 mM. Za ploče za razblaženje, jedinjenja su serijski razblažena 3-puta u DMSO, primenom 96-komornih polipropilenskih ploča, tako da su koncentracije bile 100-puta veće od krajnje test koncentracije. Za antivirusne i citotoksične testove, 2 pl su dodata po komorici (1% kranje DMSO koncentracije). 2. Jedinjenja su dodata iz ploča za razblaženje u 96 komorne ploče za kulturu tkiva, koje sadrže 100 pl podloge RPMI- 1640, koja sadrži 10 % fetusnog goveđeg seruma u koncentraciji od <20 pM. 3. Za antivirusne testove, ćelije su inficirane višestrukim infekcijama od 0.005. Posle 1 časa na 37°C, inficirane ćelije su razblažene do 200,000 ćelija po ml u podlozi RPMI- 1640, koja sadrži 10% fetusnog goveđeg seruma. 100 pl ovog rastvora dodato je po komorici, što daje krajnju zapreminu od 200 pl. 4. Ploče su inkubirane na 37°C u inkubatoru sa vlažnom atmosferom i CO2i sakupljene su posle 5 dana. 5. Virusne infekcije su praćene merenjem aktivnosti reverzne transkriptraze u supernatantima inficiranih komorica kao što je opisano u prethodnom tekstu. Procenat inhibicije za svako jedinjenje izračunavan je kvantitativnim određivanjem nivoa očitavanja u ćelijama inficiranim u prisustvu svakog jedinjenja kao procenat onog uočenog za ćelije inficirane u odsustvu jedinejnja i oduzimanjem tako određene vrednosti od 100. 6. EC50daje metod za poređenje antivirusne potencije jedinjenja prema ovom pronalasku. Efikasna koncentracija za pedeset procentnu inhibiciju (EC50) izračunata je pomoću Microsoft Excel Xlfit softvera za fitovanje krive. Za svako jedinjenje, krive su stvorene iz procenta inhibicije izračunatih u 8 različitih koncentracija primenom četvoro-parametarskog logističkog modela (model 205). EC50rezultati za jedinjenja prikazani su u tabeli 48.
Rezultati
Ključ za biološke podatke za ECso
Anti-HIV dejstvo samih prolekova nije relevantno s obzirom da se ishodna jedinjenja, kao što je prikazano u ispitivanjima u daljem tekstu, formiraju od prolekovain vivoi da su aktivni sastoci i takođe glavne vrste u plazmi. Pored toga, prolekovi mogu sporo da se konvertuju u ishodna jedinjenja uin vitrotestovima u najmanjem slulčaju do ograničenog stepena, čime se komplikuje tumačenje antivirusnih rezultata.
Citotoksičnost
1. Testovi citotoksičnosti izvedeni su sa istim MT-2 ćelijama, primenom metodologije koja je dobro poznata u tehnici. Ovaj metod je opisan u literaturi (4). Ukratko, ćelije su inkubirane u prisustvu leka šest dana, nakon čega je merena vijabilnost ćelija primenom testa redukcije redoks-aktivne boje. 50 pl XTT reagensa (1 mg/ml 2.3-bis[2-metoksi-4-nitro-5-sulfofeml]-2FI-tetrazolijum-5-karboksanilida, 10 pg/ml fenazin metosulfata rastvoreno u fosfatno puferisanom slanom rastvoru) dodato je u svaku komoricu i inkubirano 3 časa. Formiranje boje od strane ćelija koje aktivno vrše respiraciju kvantitativno je određeno u čitaču ploče na 450 nm, i upotrebljeno za određivanje CC50. CC50za IVa, IVb, IVc i IVd ishodne molekule bile su veće od 10 pM mereno pomoću ove metode. Rezultati citotoksičnosti predstavljaju sekundarni skrining koji prikazuje da jedinjenja nisu nespecifično ubijala ćelije koje su korišćene u antivirusnom testu i dodatno podržavaju tvrdnju da jedinjenja poseduju antivirusno dejstvo.
Prema tome, u skladu sa ovim pronalaskom dodatno je obezbeđen postupak za tretman i farmaceutska kompozicija za tretman virusnih infekcija kao što su HIV infekcija i SIDA. Tretman obuhvata primenu na pacijenta kod koga postoji potreba za takvim tretmanom farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski nosač i terapeutski efikasnu količinu jedinjenja ovog pronalaska.
Farmaceutska kompozicija može biti u obliku oralno primenjljivih suspenzija ili
tableta; nazalnih sprejeva, sterilnih injektabilnih preparata, na primer, kao sterilne injektabilne vodene ili uljane suspenzije ili supozitorije.
Kada se primenjuju oralno kao suspenzija, ove kompozicije se pripremaju prema tehnikama koje su dobro poznate u praksi farmaceutskih formulacija i mogu da sadrže mikrokristalnu celulozu za dobijanje mase, alginsku kiselinu ili natrijum alginat kao suspendujuće sredstvo, metilcelulozu kao sredstvo za povećanje viskoznosti i zaslađivače /sredstva za poboljšanje ukusa i mirisa koja su poznata u tehnici. Kao tablete sa neposrednim oslobađanjem, ove kompozicije mogu da sadrže mikrokristalnu celulozu, dikalcijum fosfat, škrob, magnezijum stearat i laktozu i/ili druge inertne punioce, vezujuća sredstva, punioce, dezintegrišuća sredstva, razblaživače i lubrikante kao što je poznato u tehnici.
Injektabilni rastvori ili suspenzije mogu biti formulisani prema postupcima poznatim u tehnici, primenom pogodnih netoksičnih, parenteralno prihvatljivih razblaživača ili rastvarača, kao što su manitol, 1,3-butandiol, voda, Ringer-ov rastvor ili izotoničan rastvor natrijum hlorida, ili pogodna dispergujuća sredstva ili sredstva za vlaženje i suspendujuća sredstva, kao špto su sterilna, blaga, neetarska ulja, uključujući sintetičke mono- ili digliceride, i masne kiseline, uključujući oleinsku kiselinu.
Jedinjenja ovog pronalaska mogu biti primenjena oralno na ljude u opsegu doza od 1 do 100 mg/kg telesne težine u podeljenim dozama. Jedan poželjan opseg doza je 1 do 10 mg/kg telesne težine oralno u podeljenim dozama. Drugi poželjni opsezi doza su od 1 do 20 mg/kg i 1 do 30 mg/kg telesne težine oralno u podeljenim dozama. Biće jasno, međutim, da određeni nivo doze i učestalost doziranja za svakog određenog pacijenta može da varira i da će zavisiti od niza različitih faktora uključujući dejstvog određenog jedinjenja koje se koristi, metaboličke stabilnosti i dužine delovanja tog jedinjenja. starosti, telesne težine, opšteg zdravstvenog stanja, pola, ishrane, načina i vremena primene, stope izlučivanja, kombinacije lekova, težine određenog stanja i domaćina koji se podvrgava terapiji.

Claims (31)

1. Jedinjenje formule I, gde: X je C ili N uz uslov da kada je X jednako N, R<1>ne postoji; W je C ili N uz uslov da kada je W jednako N, R<2>ne postoji; Vje C; R<1>je vodonik, metoksi ili halogen; R<2>je vodonik; R<3>je metoksi ili heteroaril, pri čemu svaki od njih može biti izborno supstituisan sa jednim supstituentom koji je izabran od G; pri čemu je heteroaril triazolil, pirazolil ili oksadiazolil; E je vodonik ili njegova farmaceutski prihvatljiva mono ili bis so; Y je izabran iz grupe koju čine SvakoR1<0>, R<11>, R<12>, R13,R14,R15,R16, R<17>nezavisno je H ili metil, uz uslov da su ne vise od R10-R17 jednaka metil; R<18>je izabran iz grupe koju čine C(0)-fenil, C(0)-piridinil, piridinil, pirimidinil, hinolinil, izohinolinil, hinazolinil, hinoksalinil, naftiridinil, ftalazinil, azabenzofuril i azaindolil, pri čemu svaki od njih može biti nezavisno supstituisan sa od jedan do dva člana izabrana iz grupe koju čine metil, -amino, -NHMe, -NMe2, metoksi, hidroksimetil i halogen; D je izabran iz grupe koju čine cijano, S(0)2R<24>, halogen, C(0)NR<2>1R22,fenil<i>heteroaril; pri čemu je navedeni fenil ili heteroaril nezavisno izborno supstituisan sa jedan do tri ista ili različita halogena ili od jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana od G; pri čemu je heteroaril izabran iz grupe koju čine piridinil i oksadiazolil; A je izabran iz grupe koju čine fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil i oksazolil, gde su navedeni fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil i oksazolil nezavisno izborno supstituisani sa jedan do tri ista ili različita halogena ili od jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana od G; G je izabran iz grupe koju čine (Ci-6)alkil, (C|_6)alkenil, fenil, hidroksi, metoksi, halogen, -NR<23>C(0)-(Ci_6)alkil, -NR<24>R<25>, -S(0)2NR<24>R<25>, COOR<26>i -CONR<2>4R25;gdej<e>navedeni (Ci.6)alkil izborno supstituisan sa hidroksi, dimetilamino ili jedan do tri ista ili različita halogena; R je izabran iz grupe koju čine vodonik i (Ci.6)alkil; R<20>, R<2>1,R22;R23,R24,R2<5>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, (Ci_6)alkil i -(CH2)„NR<2>7R28;nje 0-6; i I svako R27 iR28nezavisno su H ili metil.
2.Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time stoje R1 je metoksi ili fluoro; R18 je izabran iz grupe koju čine C(0)-fenil, C(0)-piridinil, izohinolinil, hinazolinil i ftalazinil, pri čemu navedeni izohinolinil, hinazolinil ili ftalazinil može biti izborno supstituisan sa od jedan do dva člana izabrana iz grupe koju čine metil, -amino, -NHMe, - NMe2, metoksi, hidroksimetil i halogen; D je izabran iz grupe koju čine cijano, fenil i heteroaril; pri čemu je navedeni heteroaril piridinil ili oksadiazolil; pri čemu je navedeni fenil ili heteroaril nezavisno izborno supstituisan sa jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana iz grupe koju čine C).? alkil, trifluorometil, metoksi i halogen; A je izabran iz grupe koju čine fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil ili oksazolil, gde su navedeni fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil ili oksazolil nezavisno izborno supstituisani sa jedan do tri ista ili različita halogena ili od jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana od metil, halogen, metoksi i -NH2; i Svako R<10>, R11,R12,R13,R14, R<15>, R<16>, R<17>nezavisno su H ili metil, uz uslov daje ne više od jednog od R10-R17 jednak metil.
3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što su svako X i W jednaki N.
4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je X jednako C; i WjeN.
5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što R18je -C(0)-Ph;i Yje
6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time što R<3>je metoksi ili triazolil; pri čemu je navedeni triazolil izborno supstituisan sa jednim upstituentom koji je izabran od G; SvakoR<10->R,<7>jeH;i G je metil.
7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time što: R<1>je F i R<3>je 1,2,3-triazolil vezan na položaju N-1.
8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što R<1>je metoksi; i R3 je 3-metil-l,2,4-triazolil vezan na položaju N-l.
9. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što: svako R<1>i R3 je metoksi.
10. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time stoje so natrijumova, lizin ili trometamin.
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antivirusno efikasnu količinu jedinjenja formule I, prema patentnom zahtevu 1, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, inertnih punilaca ili razblaživača.
12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, korisna za tretman HIV infekcije, koja dodatno sadrži antivirusno efikasnu količinu agensa za tretman SIDA-e izabranog iz grupe koju čine: (a) antivirusno sredstvo protiv SIDA-e; (b) anti-infektivni agens; (c) imunomodulator; i (d) inhibitori ulaska HlV-a.
13. Primena, u proizvodnji leka za lečenje sisara inficiranog HIV virusom, jedinjenja Formule I, prema patentnom zahtevu 1, i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, inertnih punilaca ili razblaživača.
14. Primena prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je lek za primenu u kombinaciji sa antivirusno efikasnom količinom agensa za tretman SIDA-e koji je izabran iz grupe koju čine antivirusna sredstva protiv SIDA-e; anti-infektivni agens; imunomodulator; i inhibitor ulaska HlV-a.
15. Jedinjenje formule II, naznačeno time što X je C ili N uz uslov da kada je X jednako N, R<1>ne postoji; W je C ili N uz uslov da kada je W jednako N, R ne postoji; VjeC; R<1>je vodonik, metoksi ili halogen; R<2>je vodonik; R<3>je metoksi ili heteroaril, pri čemu svaki od njih može biti izborno supstituisan sa jednim supstituentom koji je izabran od G; gde je heteroaril triazolil, pirazolil ili oksadiazolil; L i M su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, C1-C6alkil, fenil, benzil, trialkilsilil, -2,2,2-trihloroetoksi i 2-trimetilsililetoksi uz uslov da ne više od jednog od L i M može biti vodonik; Y je izabran iz grupe koju čine Svako R<10>, R11, R<12>, R13, R<14>,R15,R1<6>, R<17>nezavisno su H ili metil, uz uslov da su ne više od dva od R<10->R'<7>jednaka metil;
R<!8>je izabran iz grupe koju čine C(0)-fenil, C(0)-piridinil, piridinil, pirimidini), hinolinil, izohinolinil, hinazolinil, hinoksalinil, naftiridinil, ftalazinil, azabenzofuril i azaindolil, pri čemu svaki od njih može biti nezavisno supstituisan sa od jedan do dva člana izabrana iz grupe koju čine metil, -amino, -NHMe, -NMe2, metoksi, hidroksimetil i halogen; D je izabran iz grupe koju čine cijano, S(0)2R<24>, halogen, C(0)NR<21>R<22>, fenil i heteroaril; pri čemu je navedeni fenil ili heteroaril nezavisno izborno supstituisan sa jedan do tri ista ili različita halogena ili od jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana od G; pri čemu je heteroaril izabran iz grupe koju čine piridinil i oksadiazolil; A je izabran iz grupe koju čine fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil i oksazolil pri čemu su navedeni fenil, piridinil, furil, tienil, izoksazolil i oksazolil nezavisno izborno supstituisani sa jedan do tri ista ili različita halogena ili od jedan do tri ista ili različita supstituenta izabrana od G; G je izabran iz grupe koju čine (Ci-6)alkil, (Ci_6)alkenil, fenil, hidroksi, metoksi, halogen, -NR<23>C(0)-(C,.6)alkil, -NR<24>R<25>, -S(0)2NR<24>R<25>, COOR<25>i -CONR<24>R<25>; pri čemu je navedeni (C|_6)alkil izborno supstituisan sa hidroksi, dimetilamino ili jedan do tri ista ili različita halogena; R26 je izabran iz grupe koju čine vodonik i (C|-6)alkil; R20,R21,R2<2>,R23,R2<4>, R<25>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, (Q.6)alkil i -(CH2)nNR<27>R<28>; 97 95i svako R<z>' i R<zo>nezavisno su II ili metil; i nje 0-6.
16. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time stoje so lizin.
17. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time što je so trometamin.
18. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 9, naznačeno time što je so lizin.
19. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što Yje i Svako R<10>, R11, R<12>, R<13>, R<1>4,R15,R1<6>, R<17>nezavisno su H ili metil, uz uslov da su ne više od dva od RI0-R'7 jednaka metil;
20. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 19, naznačeno time što: R<1>je metoksi ili fluoro; D je izabran iz grupe koju čine cijano, fenil i piridinil; pri čemu je navedeni fenil ili piridinil nezavisno izborno supstituisan sa jednim supstituentom koji je izabran iz grupe koju čine metil i halogen; i A je izabran iz grupe koju čine fenil, piridinil, pri čemu su navedeni fenil ili piridinil nezavisno izborno supstituisani sa jednim supstituentom koji je izabran iz grupe koju čine metil i halogen.
21. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 20, naznačeno time što D je cijano; A je izabran iz grupe koju čine fenil ili piridinil; Xje C; WjeN; G je metil; R3 je metoksi ili triazolil, pri čemu navedeni triazolil može biti nezavisno izborno supstituisan sa jednim supstituentom koji je izabrn od G; i Svako R<10>, R1R12, R<13>, R14,R15,R16, R17 su H.
22. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 20, naznačeno time što: R<1>je metoksi; i R<3>je triazolil, pri čemu navedeni triazolil može biti nezavisno izborno supstituisan sa jednim supstituentom koji je izabran od G.
23. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što: Yje i R je izabran iz grupe koju čine hinolinil, izohinolinil, hinazolinil, hinoksalinil, naftiridinil ili ftalazinil, pri čemu svaki od njih može biti nezavisno izborno supstituisan sa od jedan do dva člana izabrana iz grupe koju čine metil, -amino, -NHMe, -NMe2, metoksi, hidroksimetil i halogen;
24. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 23, naznačeno time što: R<1>je metoksi ili fluoro; R18 je izabran iz grupe koju čine izohinolinil, hinazolinil i ftalazinil, pri čemu navedeni izohinolinil, hinazolinil i ftalazinil mogu biti nezavisno izborno supstituisani sa jednom grupom metil ili halogenom; i Svako R<10>, R11, R<1>2,R13,R14,R1<5>, R<16>,R17nezavisno je H.
25. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 24, naznačeno time što: Xje C; WjeN; G je metil; i R je metoksi ili triazolil, pri čemu navedeni triazolil može biti nezavisno izborno supstituisan sa jednim supstituentom izabranim od G.
26. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 25, naznačen time što: R<1>je metoksi; R<3>je triazolil, pri čemu navedeni triazolil može biti nezavisno izborno supstituisan sa jednim supstituentom koji je izabran od G; i R18 je hinazolinil.
27. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time Što: R<1>je metoksi ili fluoro; R18je C(0)-fenil; Svako R<10>, R", R<12>, R<13>, R<1>4,R1<5>,R16,R1<7>nezavisno je H; i G je metil.
28. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 27, naznačeno time što: XjeC;i WjeN.
29. Postupak za pripremu jedinjenja Iac koje ima strukturu naznačen time što sadrži: (a) alkilaciju jedinjenja IVa koje ima strukturu sa oko 1.2 molarnih ekvivalenata di-terc-butil hlorometil fosfata po molu jedinjenja IVa, koje ima strukturu Z u prisustvu od oko 2 molarnih ekvivalenata K2CO3kao baze, po molu jedinjenja IVa, i oko 5-10 ml N-metilpirolidinona kao rastvaračem po gramu IVa, na reakcionoj temperaturi od oko 30°C, da bi se formiralo jedinjenje R koje ima strukturu (b) uklanjanje zaštitne grupe sa jedinjenja R na sobnoj temperaturi, i to obe terc-butil grupe dodavanjem dobijenom reakcionoj smeši iz koraka (a), oko 10 ml rastvarača dihiormetana po gramu IVa i oko 15 molarnih ekvivalenata trifluorosirćetne kiseline po molu IVa; i (c) rekuperovanje jedinjenja Iac.
30. Postupak za pripremu jedinjenja Ic koje ima strukturu naznačen time što sadrži: (a) alkilaciju jedinjenja IVc koje ima strukturu sa oko 2.5 molarna ekvivalenta di-terc butil hlormetil fosfata po molu jedinjenja IVc koje ima strukturu Z u prisustvu oko 2.5 molarna ekvivalenta Cs2CO"3 kao baze po molu IVc, oko 2 molaraa ekvivalenta Kl po molu IVc i oko 5-10 ml N-metil-pirolidinona po gramu IVc, na reakcionoj temperaturi od oko 25-30°C, da bi se formiralo jedinjenje IIc koje ima strukturu (b) uklanjanje zaštitne grupe na temperaturi od oko 40°C sa jedinjenja IIc i to obe terc-butil grupe u višku acetona i vode; i (c) rekuperovanje jedinjenja Ic.
31. Postupak za pripremu jedinjenja Ibc koje ima strukturu naznačen time što sadrži: (a) alkilaciju jedinjenja IVb koje ima strukturu sa oko 2 molarna ekvivalenta di-terc butil hlormetil fosfata po molu IVb koji ima strukturu Z u prisustvu od oko 2 molarna ekvivalenta CS2CO3kao baze po molu IVb, oko 2 molarna ekvivalenta Kl po molu IVB i oko 2.5 ml N-metil-pirolidinona po gramu IVb, na reakcionoj temperaturi od oko 30°C, da bi se formiralo jedinjenje Ilb koje ima strukturu (b) uklanjanje zaštitne grupe na temperaturi od oko 40°C a jedinjenja Ilb i to obe terc-butil grupe u višku acetona i vode; i (c) rekuperovanje jedinjenja Ibc.
RSP-2008/0060A 2004-03-15 2005-03-03 Prolekovi antivirusnih sredstava piperazina i supstituisanog piperidina RS50567B (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US55332004P 2004-03-15 2004-03-15
US63523104P 2004-12-10 2004-12-10
PCT/US2005/006980 WO2005090367A1 (en) 2004-03-15 2005-03-03 Prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS50567B true RS50567B (sr) 2010-05-07

Family

ID=34963934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP-2008/0060A RS50567B (sr) 2004-03-15 2005-03-03 Prolekovi antivirusnih sredstava piperazina i supstituisanog piperidina

Country Status (26)

Country Link
US (12) US7745625B2 (sr)
EP (1) EP1725569B1 (sr)
JP (1) JP4734318B2 (sr)
KR (1) KR101153594B1 (sr)
CN (1) CN101941990B (sr)
AR (1) AR048039A1 (sr)
AT (1) ATE384728T1 (sr)
AU (1) AU2005223736C1 (sr)
BR (1) BRPI0508876B8 (sr)
CA (1) CA2560253C (sr)
CY (1) CY1107419T1 (sr)
DE (1) DE602005004517T2 (sr)
DK (1) DK1725569T3 (sr)
ES (1) ES2299022T3 (sr)
GE (1) GEP20094736B (sr)
HR (1) HRP20080064T5 (sr)
IL (1) IL211961A (sr)
MY (1) MY139243A (sr)
NO (1) NO336742B1 (sr)
NZ (2) NZ549867A (sr)
PE (1) PE20051151A1 (sr)
PL (1) PL1725569T3 (sr)
PT (1) PT1725569E (sr)
RS (1) RS50567B (sr)
TW (1) TWI344843B (sr)
WO (1) WO2005090367A1 (sr)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040110785A1 (en) * 2001-02-02 2004-06-10 Tao Wang Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives
TWI329105B (en) 2002-02-01 2010-08-21 Rigel Pharmaceuticals Inc 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses
HRP20050089B1 (hr) 2002-07-29 2015-06-19 Rigel Pharmaceuticals Upotreba 2,4 pirimidindiaminskog spoja za proizvodnju lijeka za lijeäśenje ili sprjeäśavanje autoimunosne bolesti
US20050075364A1 (en) * 2003-07-01 2005-04-07 Kap-Sun Yeung Indole, azaindole and related heterocyclic N-substituted piperazine derivatives
WO2005012294A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-10 Rigel Pharmaceuticals, Inc. 2,4-pyrimidinediamine compounds for use in the treatment or prevention of autoimmune diseases
US7745625B2 (en) * 2004-03-15 2010-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents
US7130185B2 (en) * 2004-06-02 2006-10-31 Research In Motion Limited Handheld computing device having drop-resistant LCD display
US20060100209A1 (en) * 2004-11-09 2006-05-11 Chong-Hui Gu Formulations of 1-(4-benzoyl-piperazin-1-yl)-2-[4-methoxy-7-(3-methyl-[1,2,4]triazol-1-yl)-1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-3-yl]-ethane-1,2-dione
US20060100432A1 (en) * 2004-11-09 2006-05-11 Matiskella John D Crystalline materials of 1-(4-benzoyl-piperazin-1-yl)-2-[4-methoxy-7-(3-methyl-[1,2,4]triazol-1-yl)-1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-3-yl]-ethane-1,2-dione
AU2006206458B2 (en) 2005-01-19 2012-10-25 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses
US7723338B2 (en) * 2005-01-31 2010-05-25 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of 1-benzoyl-4-[2-[4,7-dimethoxy-1-[(phosphonooxy)methyl]-1H-pyrrolo[2,3-C]pyridin-3-yl]-1,2-dioxoethyl]-piperazine
US7601715B2 (en) * 2005-06-22 2009-10-13 Bristol-Myers Squibb Company Process for preparing triazole substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives and novel salt forms produced therein
US7396830B2 (en) 2005-10-04 2008-07-08 Bristol-Myers Squibb Company Piperazine amidines as antiviral agents
US7851476B2 (en) * 2005-12-14 2010-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of 1-benzoyl-4-[2-[4-methoxy-7-(3-methyl-1H-1,2,4-triazol-1-YL)-1-[(phosphonooxy)methyl]-1H-pyrrolo[2,3-C]pyridin-3-YL]-1,2-dioxoethyl]-piperazine
US7501419B2 (en) * 2006-04-25 2009-03-10 Bristol-Myers Squibb Company 4-Squarylpiperazine derivatives as antiviral agents
US7807671B2 (en) * 2006-04-25 2010-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Diketo-piperazine and piperidine derivatives as antiviral agents
US7572810B2 (en) * 2006-06-08 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Alkene piperidine derivatives as antiviral agents
US7504399B2 (en) * 2006-06-08 2009-03-17 Bristol-Meyers Squibb Company Piperazine enamines as antiviral agents
JP5468899B2 (ja) 2006-07-20 2014-04-09 アフィニウム ファーマシューティカルズ， インク． Ｆａｂｉインヒビターとしてのアクリルアミド誘導体
JP5433691B2 (ja) * 2008-06-25 2014-03-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｈｉｖ結合阻害剤としてのジケトピペリジン誘導体
WO2009158394A1 (en) * 2008-06-25 2009-12-30 Bristol-Myers Squibb Company Diketo azolopiperidines and azolopiperazines as anti-hiv agents
PT2323633E (pt) * 2008-09-04 2012-05-29 Bristol Myers Squibb Co Composição farmacêutica estável para a administração optimizada de um inibidor de união de hiv
US8399513B2 (en) * 2008-10-20 2013-03-19 Xenoport, Inc. Levodopa prodrug mesylate hydrate
US9290445B2 (en) * 2008-10-20 2016-03-22 Xenoport, Inc. Methods of synthesizing a levodopa ester prodrug
CA2937222C (en) * 2009-06-25 2019-06-04 Alkermes Pharma Ireland Limited Prodrugs of nh-acidic compounds
WO2011056240A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 Xenoport, Inc. Pharmaceutical compositions and oral dosage forms of a levodopa prodrug and methods of use
US8754068B2 (en) 2010-06-04 2014-06-17 Bristol-Myers Squibb Company Modified C-3 betulinic acid derivatives as HIV maturation inhibitors
RS54239B1 (sr) 2010-06-04 2015-12-31 Bristol-Myers Squibb Company C-28 amidi modifikovanih derivata c-3 betulinske kiseline kao inhibitori sazrevanja hiv-a
WO2012019003A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Substituted indole and azaindole oxoacetyl piperazinamide derivatives
ES2585396T3 (es) 2010-12-02 2016-10-05 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Alquilamidas como inhibidores de la unión del VIH
DK2670751T3 (en) * 2011-01-31 2015-07-20 Bristol Myers Squibb Co PROCEDURES FOR MANUFACTURING HIV BINDING INHIBITOR PRODUCT CONNECTION AND INTERMEDIATES
HUE026371T2 (en) 2011-01-31 2016-05-30 Bristol Myers Squibb Co C-28 amines from modified C-3 betulinic acid derivatives as anti-HIV matrices
US8846647B2 (en) 2011-01-31 2014-09-30 Bristol-Myers Squibb Company C-17 and C-3 modified triterpenoids with HIV maturation inhibitory activity
WO2012142080A1 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Bristol-Myers Squibb Company Thioamide, amidoxime and amidrazone derivatives as hiv attachment inhibitors
US8664213B2 (en) 2011-08-29 2014-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Spiro bicyclic diamine derivatives as HIV attachment inhibitors
WO2013033061A1 (en) 2011-08-29 2013-03-07 Bristol-Myers Squibb Company Fused bicyclic diamine derivatives as hiv attachment inhibitors
MX2014002936A (es) 2011-09-21 2014-04-25 Bristol Myers Squibb Co Nuevos derivados de acido betulinico con actividad antiviral.
US20140356863A1 (en) 2011-11-21 2014-12-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the susceptibility of a virus to an attachment inhibitor
US8426450B1 (en) * 2011-11-29 2013-04-23 Helsinn Healthcare Sa Substituted 4-phenyl pyridines having anti-emetic effect
US9248139B2 (en) 2011-12-21 2016-02-02 Bristol-Myers Squibb Company Co-processing method and formulations for HIV attachment inhibitor prodrug compound and excipients
EA024872B1 (ru) 2012-02-08 2016-10-31 Бристол-Майерс Сквибб Компани Способы получения пиперазинового пролекарства - ингибитора присоединения вич
US8906889B2 (en) 2012-02-15 2014-12-09 Bristol-Myers Squibb Company C-3 cycloalkenyl triterpenoids with HIV maturation inhibitory activity
WO2013138436A1 (en) 2012-03-14 2013-09-19 Bristol-Myers Squibb Company Cyclolic hydrazine derivatives as hiv attachment inhibitors
US8889854B2 (en) 2012-05-07 2014-11-18 Bristol-Myers Squibb Company C-17 bicyclic amines of triterpenoids with HIV maturation inhibitory activity
AU2013279021C1 (en) 2012-06-19 2017-03-16 Debiopharm International Sa Prodrug derivatives of (E)-N-methyl-N-((3-methylbenzofuran-2-yl)methyl)-3-(7-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-3-yl)acrylamide
EP2895472B1 (en) 2012-08-09 2016-11-23 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Tricyclic alkene derivatives as HIV attachment inhibitors
WO2014025854A1 (en) 2012-08-09 2014-02-13 Bristol-Myers Squibb Company Piperidine amide derivatives as hiv attachment inhibitors
JP6186010B2 (ja) 2013-02-06 2017-08-23 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｈｉｖ成熟阻害活性を有するｃ−１９修飾トリテルペノイド類
KR20150121712A (ko) 2013-02-25 2015-10-29 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Hiv의 치료에 유용한 c-3 알킬 및 알케닐 개질된 베툴린산 유도체
US9586957B2 (en) * 2013-03-27 2017-03-07 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited 2-keto amide derivatives as HIV attachment inhibitors
WO2014160689A1 (en) * 2013-03-27 2014-10-02 Bristol-Myers Squibb Company Piperazine and homopiperazine derivatives as hiv attachment inhibitors
UY36070A (es) 2014-04-11 2015-10-30 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Triterpenoides con actividad inhibidora de la maduración de hiv
WO2015195776A1 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Bristol-Myers Squibb Company Betulinic acid derivatives with hiv maturation inhibitory activity
CN107250152A (zh) 2014-11-14 2017-10-13 Viiv保健英国第五有限公司 C17‑芳基取代的桦木酸类似物
US9969767B2 (en) 2014-11-14 2018-05-15 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Oxolupene derivatives
CA2971096A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 ViiV Healthcare UK (No.4) Limited A process for preparing halogenated azaindole compounds using pybrop
CA2971104A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 ViiV Healthcare UK (No.4) Limited A process for preparing halogenated azaindole compounds using boroxine
EP3283467A1 (en) 2015-04-14 2018-02-21 VIIV Healthcare UK(No.4) Limited Methods of producing an hiv maturation inhibitor
KR20240142622A (ko) 2015-10-01 2024-09-30 올레마 파마슈티컬스 인코포레이티드 테트라히드로-1H-피리도[3,4-b]인돌 항에스트로겐 약물
KR102671166B1 (ko) * 2015-12-14 2024-05-31 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. 3,5-디페닐-디아졸 화합물의 수용성 유도체
EP3411033A1 (en) 2016-02-04 2018-12-12 ViiV Healthcare UK (No.5) Limited Fostemsavir for use in heavily treatment-experienced hiv-1 infected individuals
AR107512A1 (es) 2016-02-04 2018-05-09 VIIV HEALTHCARE UK Nº 5 LTD Triterpenoides modificados en c-3 y c-17 como inhibidores del vih-1
RS61312B1 (sr) 2016-02-26 2021-02-26 Debiopharm Int Sa Lek za lečenje infekcija dijabetskog stopala
CN111406056B (zh) 2017-11-21 2023-02-28 辉瑞公司 选择性acc抑制剂的结晶2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇盐
JP7429236B2 (ja) 2019-01-17 2024-02-07 ヴィーブ ヘルスケア ユーケー（ナンバー４）リミテッド ホステムサビルの調製方法
TN2021000159A1 (en) 2019-02-14 2023-04-04 Debiopharm Int Sa Afabicin formulation, method for making the same and uses thereof
SG11202113174SA (en) 2019-06-14 2021-12-30 Debiopharm Int Sa Medicament and use thereof for treating bacterial infections involving biofilm
KR20220034129A (ko) 2019-07-07 2022-03-17 올레마 파마슈티컬스 인코포레이티드 에스트로겐 수용체 길항제 요법
KR20240122840A (ko) 2021-12-17 2024-08-13 비이브 헬쓰케어 컴퍼니 Hiv 감염에 대한 조합 요법 및 그의 용도
EP4611813A1 (en) 2022-11-02 2025-09-10 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Antigen binding proteins
WO2025229019A1 (en) 2024-04-30 2025-11-06 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Neutralizing antibody constructs against hiv
WO2025229018A1 (en) 2024-04-30 2025-11-06 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Neutralizing antibody constructs against hiv

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2101017C (en) 1992-07-24 1999-10-26 Masahiko Higuma Ink jet cartridge, ink jet head and printer
US6469006B1 (en) * 1999-06-15 2002-10-22 Bristol-Myers Squibb Company Antiviral indoleoxoacetyl piperazine derivatives
US20020061892A1 (en) * 2000-02-22 2002-05-23 Tao Wang Antiviral azaindole derivatives
US6476034B2 (en) * 2000-02-22 2002-11-05 Bristol-Myers Squibb Company Antiviral azaindole derivatives
DK1299382T3 (da) * 2000-07-10 2006-01-16 Bristol Myers Squibb Co Præparat og antiviral virkning af substituerede indoloxoeddikesyrepiperazinderivater
EP1363705B9 (en) * 2001-02-02 2012-11-07 Bristol-Myers Squibb Company Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives
US20030207910A1 (en) * 2001-02-02 2003-11-06 Tao Wang Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives
US20040110785A1 (en) * 2001-02-02 2004-06-10 Tao Wang Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives
WO2003082881A2 (en) 2002-03-28 2003-10-09 Procyon Biopharma Inc. Pyridoxal-5-phosphate derivatives as hiv integrase inhibitors
US7745625B2 (en) * 2004-03-15 2010-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents
US7776863B2 (en) 2004-03-24 2010-08-17 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating HIV infection
US7130185B2 (en) * 2004-06-02 2006-10-31 Research In Motion Limited Handheld computing device having drop-resistant LCD display
US7723338B2 (en) * 2005-01-31 2010-05-25 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of 1-benzoyl-4-[2-[4,7-dimethoxy-1-[(phosphonooxy)methyl]-1H-pyrrolo[2,3-C]pyridin-3-yl]-1,2-dioxoethyl]-piperazine
US7851476B2 (en) * 2005-12-14 2010-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of 1-benzoyl-4-[2-[4-methoxy-7-(3-methyl-1H-1,2,4-triazol-1-YL)-1-[(phosphonooxy)methyl]-1H-pyrrolo[2,3-C]pyridin-3-YL]-1,2-dioxoethyl]-piperazine
DK2670751T3 (en) * 2011-01-31 2015-07-20 Bristol Myers Squibb Co PROCEDURES FOR MANUFACTURING HIV BINDING INHIBITOR PRODUCT CONNECTION AND INTERMEDIATES
EA024872B1 (ru) * 2012-02-08 2016-10-31 Бристол-Майерс Сквибб Компани Способы получения пиперазинового пролекарства - ингибитора присоединения вич

Also Published As

Publication number Publication date
PE20051151A1 (es) 2006-01-20
CA2560253A1 (en) 2005-09-29
RU2006136390A (ru) 2008-04-27
AR048039A1 (es) 2006-03-22
NZ549867A (en) 2010-07-30
CY1107419T1 (el) 2012-12-19
HK1096687A1 (en) 2007-06-08
TW200600096A (en) 2006-01-01
MY139243A (en) 2009-09-30
AU2005223736B2 (en) 2011-05-26
JP2007529519A (ja) 2007-10-25
US8871771B2 (en) 2014-10-28
US11369624B2 (en) 2022-06-28
AU2005223736C1 (en) 2011-10-06
US20130253196A1 (en) 2013-09-26
NZ585294A (en) 2011-09-30
US20190111066A1 (en) 2019-04-18
CA2560253C (en) 2013-01-15
NO20064062L (no) 2006-12-08
AU2005223736A1 (en) 2005-09-29
US20120238755A1 (en) 2012-09-20
US20150315218A1 (en) 2015-11-05
CN101941990B (zh) 2012-04-25
DE602005004517T2 (de) 2009-01-22
ES2299022T3 (es) 2008-05-16
US20160361328A1 (en) 2016-12-15
ATE384728T1 (de) 2008-02-15
HK1148533A1 (en) 2011-09-09
PL1725569T3 (pl) 2008-09-30
US20180000849A1 (en) 2018-01-04
HRP20080064T5 (en) 2008-10-31
US8461333B2 (en) 2013-06-11
US20100210599A1 (en) 2010-08-19
US20210023098A1 (en) 2021-01-28
RU2374256C2 (ru) 2009-11-27
EP1725569B1 (en) 2008-01-23
TWI344843B (en) 2011-07-11
IL211961A (en) 2013-08-29
US20050209246A1 (en) 2005-09-22
US7745625B2 (en) 2010-06-29
HRP20080064T3 (hr) 2008-03-31
GEP20094736B (en) 2009-07-27
CN101941990A (zh) 2011-01-12
BRPI0508876B8 (pt) 2021-05-25
KR101153594B1 (ko) 2012-07-05
BRPI0508876A (pt) 2007-09-04
US20150025240A1 (en) 2015-01-22
WO2005090367A1 (en) 2005-09-29
US8168615B2 (en) 2012-05-01
NO336742B1 (no) 2015-10-26
DK1725569T3 (da) 2008-06-02
EP1725569A1 (en) 2006-11-29
DE602005004517D1 (de) 2008-03-13
PT1725569E (pt) 2008-03-28
KR20060129533A (ko) 2006-12-15
BRPI0508876B1 (pt) 2020-05-26
US20200046743A1 (en) 2020-02-13
US20150232414A1 (en) 2015-08-20
JP4734318B2 (ja) 2011-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11369624B2 (en) Salts of prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents
EP1751161B1 (en) Diazaindole-dicarbonyl-piperazinyl antiviral agents
EP1549313A1 (en) Composition and antiviral activity of substituted azaindoleoxoacetic piperazine derivatives
CN1953985B (zh) 哌嗪和取代的哌啶抗病毒药物的前药
IL177945A (en) Prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents
MXPA06010412A (es) Profarmacos de piperazina y agentes antivirales de piperidina sustituidos
HK1096687B (en) Prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents
HK1148533B (en) Prodrugs of piperazine and substituted piperidine antiviral agents