RS50626B - Upotreba 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina za tretman simptoma huntington-ove bolesti - Google Patents

Abstract

Jedinjenje, koje se upotrebljava za zadržavanje ili usporavanje napredovanja jednog ili više simptoma Huntington-ove bolesti kod pacijenta kod koga se simptomi biraju između nevoljnih pokreta i narušenog hoda, naznačeno time, što to jedinjenje predstavlja (+)-izomer 3,11b-cis-dihidrotetrabenazina, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. Prijava sadrži još 14 patentnih zahteva.

Description

UPOTREBA 3,11B-CIS-

DIHIDROTETRABENAZINA ZA

TRETMAN SIMPTOMA HUNTINGTON-OVE BOLESTI

OPIS

Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu dihidrotetrabenazina za tretiranje Huntington-ove bolesti.

OSNOVA PRONALASKA

Huntington-ova bolest, ranije poznata kao Huntington-ova horeja, je nasledna neurodegenerativna bolest koja je danas neizlečiva. Ovu bolest izaziva obnavljanje ekspanzije CAG trinukleotida (navodi se kao mutacija HD) na IT15 genu lociranom na hromozomu 4p16.3, što stvara abnormalni oblik proteina, koji se naziva Huntingtin. Ovaj abnormalni protein startuje proces koji dovodi do smrti neurona u regionu prugastog tela u mozgu, verovatno začepljenjem ili agregacijom ovog abnormalnog proteina unutar mnogih vrsta neurona.

Gen Huntington-ove bolesti (HD) sadrži segment DNK koji se sastoji od ponavljanja sekvencije CAG nukleotida, koja kodira aminokiselinu glutamin. Nađeno je da ukoliko postoji trideset ili manje ponavljanja CAG unutar ovog gena, onda osoba koja nosi ovaj gen neće dobiti HD. Međutim, ukoliko osoba nosi gen u kome postoji preko četrdeset ponavljanja CAG, onda ima tendenciju da dobije ovu bolest.

Huntington-ova bolest se prenosi preko autozomalno dominantne nasledne sheme, tako da svako dete roditelja koji oseča HD sa 50% verovatnoćom će naslediti ovu bolest. Simptomi Huntington-ove bolesti tipično se javljaju u dobu od oko 30 do 50 godina, a bolest obično napreduje tokom perioda od 10-25 godina. Karakteristike i simptomi bolesti su promene u ličnom identitetu, depresija, nagle promene raspoloženja, nesigurnost u hodu, nekontrolisana horeja, uznemireni i nagli pokreti i tremori, demencija, nerazgovetan govor, poremećeno rasuđivanje, teškoće pri gutanju i izgled pijanca.

Kada se kod pojedinca pojave simptomi Huntington-ove bolesti, tok bolesti može trajati negde od deset do trideset godina. Tipično, tok HD bolesti se može grubo podeliti u tri faze, ranu, srednju i kasnu faza.

U ranoj fazi pacijenti još uvek mogu da obavljaju većinu njihovih uobičajenih aktivnosti. Još uvek mogu da rade i još uvek mogu biti u stanju da voze automobil. Ipak, oni mogu da pokazuju blage nekontrolisane kretnje, posrtanje i nespretnost, nedostatak koncentracije, gubitak pamćenja skorašnjih događaja i depresiju, kao i promene raspoloženja, nevoljne kretnje su relativno blage, govor je još uvek jasan, a demencija, ukoliko i postoji, je još uvek blaga.

Tokom srednje faze, pacijenti postaju hendikepirani i tipično im je potrebna pomoć u nekim od njihovih rutina dnevnih aktivnosti. Padovi, gubitak telesne mase, teškoće pri gutanju mogu predstavljati probleme tokom ove faze, a demencija postaje vidljivija za slučajnog posmatrača. Pored toga, nekontrolisane kretnje postaju izraženije.

Tokom poslednje faze; pogoršanje kod pacijenata ide dotle da oni zahtevaju skoro celokupnu brigu, a mnogi zahtevaju konstantnu kontrolu u bolnicama ili sanatorijumima. U ovoj fazi oni mogu da više nisu u stanju da hodaju ili govore, mada mogu da pokazuju i neke nevoljne kretnje, oni postaju sve ukočeniji. Pacijenti u ovoj fazi često nisu u stanju da gutaju hranu. U ovoj fazi većina pacijanata gubi moć razumevanja i očigledno su nesvesni svoje okoline. Kada pacijent konačno umre, uzrok smrti je obično povezan sa istim prirodnim uzrocima koji dovode do smrti kod drugih teško iznurenih pacijenata, kao što su nedovoljna ishranjenost ili pneumonija.

U skladu sa stavom US National Institute of Neuroiogical Disorders and Stroke (NINDS), koji je deo National Institute of Helath (NIH), danas ne postoji način da se zaustavi ili povrati tok Huntington-ove bolesti.

činjeni su pokušaji da se razviju tretmani za HD, i jedna studija koju su načinili Karpuj et al, objavljena uNature Medicine,vol. 8, no. 2, str. 143-149, u februaru 2002, obuhvatila je ordiniranje cistamina. Očigledno, cistamin inaktivira enzim transglutaminazu, koji pomaže stvaranje nagomilanog proteina Huntingtina, za koji se smatra da je odgovoran za ovu bolest. Ipak, za sada, prema onome što podnosioci ove prijave znaju, danas ne postoji opšte prihvaćen lek za tretiranje ili smirivanje napredovanja Huntingnton-ove bolesti.

Otkriće gena odgovornog za Huntington-ovu bolest (videti članak radne grupe o Huntington-ovoj bolesti u časopisuCell,vol. 72, str. 971, od 26 marta 1993) omogućilo je razvoj dijagnostičkih testova na prisustvo mutiranog oblika ovog gena. Dijagnostički testovi, koji koriste lančanu reakciju polimeraze (PCR) za detekciju broja ponavljanja CAG na genu IT-15, sada su široko dostupni i omogućavaju davanje prognoze da li će ili neće kod pacijenta da se razviju simptomi Huntignton-ove bolesti; videti na primer, pregledni članak M.Havden et al., uAm. J. Hum. Genet,vol. 55, str. 606-617 (1994); zatim članak S. Hersch, pod naslovom 'The Neurogenetics Genie: Testing for the Huntington's Desease Mutation", u časopisuNeurol.,vol. 44, str. 1369-1373 (1994); i članak R.R. Brinkman et al., pod naslovom "The Likelihood of Being Affected with Huntington's Desease by Particular Age, for Specific CAG Siže", u časopisuAm. J. Hum. Genet.vol. 60, str. 1202-1210 (1997).

Tetrabenazin (hemijski naziv: 1,3,4,6,7,11b-heksahidro-9,10-dimetoksi-3-(2-metilpropil)-2H-benzo(a)hinolizin-2-on) je u upotrebi kao farmaceutski lek još od kasnih 1950-tih. Na početku razvijen kao anti-psihotik, tetrabenazin se danas upotrebljava u simptomatičnom tretmanu poremećaja hiperkinetičkih kretnji, kao što su kod Huntington-ove bolesti, senilne horeje, tikova, tardivne diskinezije i Tourette-ovog sindroma, videti npr. članke Janković et al., uAm. J. Psychiatry,vol. 156, no. 8, str. 1279-81, august 1999; i Janković et al.,Neurology,vol. 48, no. 2, str. 58-62, februar 1997.

Primarno farmakološko dejstvo tetrabenazina je smanjivanje dotoka monoamina (npr. dopamina, serotonina i norepinefrina) u centralni nervni sistem, preko inhibiranja humanog vezikularnog izoforma 2 transportera monoamina (hVMAT2). Ovaj lek takođe blokira postsinaptičke receptore dopamina.

Tetrabenazin je efikasan i siguran lek za tretman raznih poremećaja hiperkinetičkih kretnji i, suprotno od tipičnih neuroleptika, pokazano je da ne pokazuje uzroke tardivne diskinezije. Ipak, tetrabenazin pokazuje brojne efekte povezane sa doziranjem, uključujući izazivanje depresije, Parkinsonizma, pospanosti, nervoze ili anksioznosti, nesanice, a u retkim slučajevima, neuroleptičkog malignog sindroma.

Centralni efekti tetrrabenazina skoro isto potsećaju na one kod rezerpina, ali od rezerpina se razlikuju po tome što nema dejstva na transporter VMAT1. Nedostatak dejstva na transporter VMAT1 znači da tetrabenazin ima manje periferno dejstvo nego rezerpin, pa stoga ne proizvodi sporedne efekte povezane sa VMAT1, kao što je hipotenzija.

Hemijska struktura tetrabenzaina je prikazana na Slici 1 u nastavku.

Ovo jedinjenje ima hiralne centre na atomima ugljenika 3 i 11b, pa stoga, teorijski može postojati u ukupno četiri izomerna oblika, kao što pokazuje Slika 2.

Na Slici 2 definisana je stereohemija svakog izomera korišćenjem nomenklature "R" i "S", koju su razvili Cahn, Ingold i Prelog, videti Jerry March, "Advanced Organic Chemistrv", 4th. Edition, John Wiely & Sons, New York, 1992, str. 109-114. Na Slici 2, i bilo gde u ovoj patentnoj prijavi, oznake" R"i "S" date su prema redosledu brojčanih položaja atoma ugljenika. Tako, na primer,RSje skraćeno obeležavanje za 3R,11bS. Slično, ako su prisutna tri hiralna centra, kao u dihidrotetrabenazinu, opisanom niže, oznake "R" ili "S" se navode prema redosledu atoma ugljenika 1, 2 i 11b. Tako, 2S,3/?,11bR je iziomer koji se navodi u skraćenom obiku kaoSRR,itd.

Komercijalno dostupni tetrabenazin je racemska smešaRRi SS izomera, i izgleda da suRRi SS izomeri termodinamički najstabilniji izomeri (u nastavku se navode pojedinačno ili kolektivno kao frans-tetrabenazin, zato što atomi vodonika u položajima 3 i 11 b imajutransorijentaciju).

Tetrabenazin ima nešto slabiju i promenljivu bioupotrebljivost. On se ekstenzivno metaboliše pri prvom metaboličkom prolasku, pa se malo ili nimalo nepromenjenog tetrabenazina detektuje u urinu. Glavni metabolit je dihidrotetrabenazin (hemijski naziv: 2-hidroksi-3-(2-metilpropil)-1,3,4,6,7,11b-heksahidro-9,10-dimetoksi-benzo(a)hinolizin) koji se formira redukcijom 2-keto grupe u tetrabenazinu, i smatra se da je prvenstveno odgovoran za dejstvo ovog leka (videti Mehvar et al.,Drug Metab. Disp.,vol. 15, str. 250-255 (1987) iJ. Pharm. Sci.vol. 76, no. 6, str. 461-465 (1987) i Roberts et al.,Eur. J. Clin. Pharmacol.vol. 29, str. 703-708 (1986)).

Ranije su identifikovana i karakterisana četiri izomera dihidrotetrabenazina, a svi su izvedeni iz stabilnijihRRi SS izomera polaznog tetrabenazina, i imaju relativnutransorijentaciju između atoma vodonika u položajima 3 i 11 b (videti Kilbourn et al.,Chirality,vol. 9, str. 59-62 (1997) i Brossi et al.,Helv. Chim. Acta,vol XLI, no. 193, str. 1793-1806 (1958)). Ova četiri izomera su (+)-a-dihidrotetarbenazin, (-)-a-dihidrotetrabenazin, (+)-p-dihidrotetrabenazin i (-)-p-dihidrotetrabenazin. Strukture ova četiri poznata razmatrana izomera dihidrotetrabenazina prikazane su na Slici 3.

Kilbourn et al., (videtiEur. J. Pharmacoi.,vol 278, str. 249-252 (1995) iMed. Chem. Res.vol. 5, str. 113-126 (1994) su ispitivali specifično vezivanje radioaktivno-obeleženih izomera dihidrotetrabenazina u mozgu pacova pri svesti. Pronašli su da se izomer (+)-(a)-[<11>C]dihidrotetrabenazina (2R,3R,11bR) akumulira u regijama mozga koje su povezane sa višim koncentracijama transportera dopamina (DAT) i vezikularnog transportera monoamina (VMAT2) u neuronskim membranama. Međutim, suštinski neaktivni izomer (-)-(a)-[<11>C] dihidrotetrabenazina bio je skoro uniformno raspoređen u mozgu, što ukazuje da se ne dešava specifično vezivanje za DAT i VMAT2. Ispitivanjain vivo,u korelaciji sa ispitivanjimain vitro,su pokazala da izomer (+)-(<x)-[11C] dihidrotetrabenazina pokazuje vreednost K za [<3>H]metoksitetrabenazin >2000-struko veću, nego K, za izomer (-)-(aH<11>C]dihidrotetrabenazina.

U međunarodnoj patentnoj prijavi pod brojem PCT/GB2005/000464 (broj publikacije WO 2005/077946) opisuje se dobijanje i upotreba farmaceutskog agensa izomera dihidrotetrabenazina, izvedenih iz nestabilnihRSiSRizomera tetrabenazina (u nastavku će se označavati pojedinačno ili kolektivno kaocis-tetrabenazin, zato što atomi vodonika u položajima 3 i 11b imaju relativnuc/sorijentaciju).

PREGLED PRONALASKA

U našoj prethodnoj prijavi no. PCT/GB2005/000464, nađeno je dacis-dihidrotetrabenazin ima svojstvo da zaustavi ili uspori razvoj bar nekih od simptoma Huntignton-ove bolesti. Određenije, nađeno je da pogoršanje hodanja i porast nevoljnih kretnji (npr. tremora i trzanja) povezanih sa Huntington-ovom bolešću može da se zaustavi ili značajno uspori prilikom ordiniranjacis-dihidrotetrabenazina iz ovog pronalaska.

U skladu sa tim, u prvom aspektu, ovaj pronalazak daje jedinjenje koje se upotrebljava za zadržavanje ili usporavanje napredovanja jednog ili više simptoma Huntington-ove bolesti kod pacijenta, kod koga se ovi simptomi biraju između nevoljnih kretnji i pogoršanja hodanja, pri čemu je to jedinjenje (+) izomer 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

Danas su dostupni dijagnostički testovi za utvrđivanje da li neki pojedinac nosi mutirani gen Huntington-ve bolesti. Pošto će se kod neke osobe, koja nosi mutirani gen Huntington-ove bolesti, skoro neizbežno razviti Huntington-ova bolest, bilo bi prikladno da ukoliko se početak razvoja ove bolesti može predvideti, zaustaviti ili usporiti, tokom perioda života te osobe, unutar koga će se kod njega ili nje najverovatnije bolest razviti.

U skladu sa tim, u sledećem aspektu ovog pronalaska, daje se jedinjenje za upotrebu u profilaktičkom tretmanu Huntington-ove bolesti kod pacijenta koji je identifikovan da nosi mutirani gen odgovoran za Huntington-ovu bolest, pri čemu je to jedinjenje (+) izomer 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde definisana.

Profilaktički tretman se može usmeriti na prevenciju ili usporavanje sub-kliničkog napredovanja ove bolesti kod nekog pacijenta. Pod sub-kliničkim napredovanjem se podrazumeva razvoj bolesti pre onog momemnta kada simptomi ove bolesti postaju klinički očigledni, nasuprot biohemijskom ispitivanju ili ispitivanju koje koristi tehnike skeniranja, kao što je kompjuterizovana tomografija ili mapiranje magnetnom rezonancom (MRI).

Na primer, c/s-dihidrotetrabenazin se može ordinirati profilaktički osobi u dobu života 15-50 godina, npr. 20-50 godina ili 25-50 godina, koja nosi mutirani gen HD, ali kod koje se još uvek nisu razvili simptomi ove bolesti.

Pozivanje na mutirani oblik gena Huntiongton-ove bolesti ili slične izraze u ovoj prijavi, odnosi se na oblike gena u kojima je broj ponavljanja CAG na genu IT-15 najmanje tridesetpet, tipičnije, najmanje četrdeset, na primer najmanje 45, ili bar 50. U nekim slučajevima može postojati vrlo visok broj ponavljanja CAG (npr. 70 i više), pa je verovatno da će se kod osoba, koje nose mutirani oblik gena sa tako visokim brojem ponovljenih CAG, verovatno razviti juvenilni početak ove bolesti.

Stoga, c/s-dihkJrotetrabenazin se može profilaktički ordinirati osobama, starosti ispod 30 godina, na primer u opsegu od 10-29 godina, tipičnije 15-29 ili 20-29 godina starosti, koje su testirane, pa su im pronađeni mutirani oblici gena IT-15, u kojima broj ponavljanja CAG prevazilazi 60, određenije najmanje je 65, a poželjno 70 ili više. c/s-Dihidrotetrabenazin, koji se koristi u ovom pronalasku je (+)3,11b-c/s-dihidrotetrabenazin.

Ovaj 3,11b-cis-dihidrotetrabenazin, koji se koristi u ovom pronalasku, može biti u suštinski čistom obliku, na primer sa čistoćom izomera većom od 90%, tipično većom od 95%, a poželjnije većom od 98%.

Naziv "čistoća izomera" u ovom kontekstu se odnosi na količinu prisutnog 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina, relativno prema ukupnoj količini ili koncentraciji dihidrotetrabenazina u svim izomernim oblicima. Na primer, ukoliko 90% od ukupnog dihidrotetrabenazina prisutnog u preparatu predstavlja 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazin, tada je čistoća izomera 90%.

Ovaj 3,11b-c*s-dihidrotetrabenazin, koji se koristi u ovom pronalsku, može biti u obliku preparata koji je suštinski bez 3,11b-črans-dihidrotetrabenazina, poželjno je da sadrži manje od 5% 3,11b-frans-dihidrotetrabenazina, poželjnije manje od 3% 3,11b-frans-dihidrotetrabenazina, a najpoželjnije, manje od 1%3,11b-fra/?s-dihidrotetrabenazina.

Naziv "3,1 Ib-c/s", kako se ovde koristi, označava da atomi vodonika u položajima 3 i 11b u strukturi dihidrotetrabenazina, imaju relativnuc/sorijentaciju, prikazanu Formulom (I) u nastavku.

Postoje četiri moguća izomera dihidrotetrabenazina koji imaju 3,11b-c/s konfiguraciju, a to su 2S,3S,11bR izomer, 2R,3R,11bS izomer, 2R,3S,11bR izomer i 2S,3R,11bS izomer. Ova četiri izomera su izolovana i karakterisana, a imaju sledeće strukture: (a) 2S,3S,11bR izomer 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina koji ima formulu (la): (b) 2R,3RS,11bS izomer 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina koji ima formulu (lb): (c) 2R,3S,11bR izomer 3,11 b-c/s-dihidrotetrabenazina koji ima formulu (Ic): (d) 2S,3R,11bS izomer 3,11b-c/5-dihidrotetrabenazina koji ima formulu (Id):

Pojedinačni izomeri iz ovog pronalaska mogu se karakterisati njihovim spektroskopskim, optičkim i hromatografskim osobinama, a takođe i njihovim apsolutnim stereohemijskim konfiguracijama, određenim kristalografijom pomoću X-zraka.

Izomeri koji se koriste u skladu sa ovim pronalaskom su desnogiri (+) izomeri.

Naročito poželjan izomer je (la), tj. 2S,3S,11b/? izomer3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina.

Bez nametanja bilo koje posedbe apsolutne konfiguracije ili stereohemije, ova četiri izomera se mogu karakterisati kao što sledi:

Izomer A ( nije jedinjenje iz ovog pronalaska)

Optička aktivnost izmerena pomoću ORD (metanol, 21°C): levogira (-). IR spektar (čvrst KBr),<1>NMR spektar (CDCI3) i<13>C-NMR spektar (CDCI3), suštinski su prikazani u Tabeli 1.

Izomer B ( jedinjenje iz ovog<p>ronalasaka)

Optička aktivnost izmerena pomoću ORD (metanol, 21°C): desnogira (+). IR spektar (čvrst KBr),<1>NMR spektar (CDCI3) i 13C-NMR spektar (CDCI3), suštinski su prikazani u Tabeli 1, a kristalografska svojstva, pomoću X-zraka, su prikazana u Primeru 4.

Izomer C ( jedinjen je iz ovog pronalasaka)

Optička aktivnost izmerena pomoću ORD (metanol, 21 °C): desnogira (+). IR spektar (čvrst KBr),<1>NMR spektar (CDCI3) i 13C-NMR spektar (CDCI3), suštinski su prikazani u Tabeli 2.

Izomer D ( nije jedinjenje iz ovog pronalasaka)

Optička aktivnost izmerena pomoću ORD (metanol, 21°C): levogira (-). IR spektar (čvrst KBr),<1>NMR spektar (CDCI3) i 13C-NMR spektar (CDCI3), suštinski su prikazani u Tabeli 2.

Vrednosti ORD za svaki izomer se daju u primerima koji slede, ali napominje se da se te vrednosti daju samo u svrhu primera i da mogu da variraju u skladu sa stepenom čistoće izomera i uticajem drugih varijabli, kao što su fluktuacije temperature i efekti zaostalih molekula rastvarača.

Nazivi "čistoća enantiomera" i "enantiomerno čist" u ovom kontekstu se odnose na prisutnu količinu datog enantiomera 3,11b-c/'s-dihidrotetrabenazina, relativno prema ukupnoj količini ili koncentraciji dihidrotetrabenazina u svim enantiomernim i izomernim oblicima. Na primer, ukoliko je 90% od ukupnog dihidrotetrabenazina prisutnog u preparatu u obliku jednog enantiomera, tada je čistoća tog enantiomera 90%.

Primera radi, u svakom aspektu ovog pronalaska, svaki pojedinačni enantiomer može biti prisutan sa čistoćom enantiomera od najmanje 55% (npr. najmanje 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 100%).

FARMACEUTSKI PRIHVATLJIVE SOLI

Ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, pozivanje na dihidrotetrabenazin i njegove izomere u ovoj prijavi obuhvata njenim obimom, ne samo slobodnu bazu dihidrotetrabenazina, već takođe i njene soli, a naročito kisele adicione soli. Posebne kiseline, iz kojih se formiraju ove kisele adicione soli, su kiseline koje imaju vrednost pKamanju od 3,5, a češće manju od 3. Na primer, kisele adicione soli se mogu formirati iz kiselina koje imaju pKau opsegu od +3,5 do -3,5.

Poželjne kisele adicione soli su one koje se formiraju sa sulfonskim kiselinama, kao što su metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, benzensulfonska kiselina, toluensulfonska kiselina, kamforsulfonska kiselina i naftalinsulfonska kiselina.

Jedna posebna kiselina, iz koje se mogu formirati kisele adicione soli, je metansulfonska kiselina.

Kisele adicione soli se mogu dobiti postupcima koji su ovde opisani, ili konvencionalnim hemijskim postupcima, kao što su oni koji su opisani u "Pharmaceutical Salts. Properties, Seiection and Use", P. Heinrich Strahl (urednik), Camille G. VVermuth (urednik), ISBN:3-90639-026-8, tvrd povez, 388 str., avgust 2002. Obično, ove soli se mogu dobiti reagovanjem oblika slobodne baze ovog jedinjenja sa odgovarajućom bazom ili kiselinom, u vodi ili nekom organskom rastvaraču ili u smeši ovih; obično se koriste nevodeni medijumi, kao Što su etar, etilacetat, etanol, izopropanol ili acetonitril.

Ove soli su tipično farmaceutski prihvatljive soli. Međutim, soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu se dobiti kao intermedijarni oblici, koji se zatim mogu konvertovati u farmaceutski prihvatljive soli. Ove farmaceutski neprihvatljive soli čine takođe deo ovog pronalaska.

POSTUPCI DOBIJANJA IZOMERA DIHIDROTETRABENAZINA

Dihidrotetrabenazin iz ovog pronalaska može se dobiti postupkom koji se sastoji od reakcije jedinjenja formule (II):

sa reagensom, ili sa reagensima koji su pogodni, za hidratisanje 2,3-dvogube veze u jedinjenju formule (II), a zatim ukoliko je to potrebno, odvajanjem i izolovanjem željenog izomernog oblika dihidrotetrabenazina.

Hidratisanje 2,3-dvogube veze se može obaviti hidroborovanjem, koristeći odgovarajući reagens bora, kao što je diboran-etar (npr. boran-tetrhidrofuran (THF)), koji kao intermedijar daje adukt alkilboran, pa sledi oksidacija ovog adukta alkilborana i hidroliza u prisustvu baze. Ovo hidroborovanje se tipično obavlja u suvom, polarnom aprotonskom rastvaraču, kao što je etar (npr. THF), obično ne na povišenoj temperaturi, na primer na sobnoj temperaturi. Adukt boran-alken se tipično oksidiše sa oksidacionim sredstvom, kao što je vodonik-peroksid, u prisustvu baze koja predstavlja izvor hidroksilnih jona, kao što je amonijum-hidroksid ili hidroksid nekog alkalnog metala, npr. kalijum-hidroksid ili natrijum-hidroksid. Sekvencija reakcija hidroborovanje-oksidacija-hidroliza u Procesu A tipično daje dihidrotetrabenazin u kome su atomi vodonika u položajima 2 i 3, a imaju relativnutransorijentaciju.

Jedinjenja formule (II) se mogu dobiti redukcijom tetrabenazina, dajući dihidrotetrabenazin, posle čega sledi dehidratacija dihidrotetrabenazina.

Redukcija tetrabenazina se može obaviti korišćenjem aluminijum-hidridnog reagensa, kao što je Ittijum-aluminijumhidrid, ili bor-hidridnog reagensa, kao što je natrijum-borhidrid, kalijum-borhidrid ili derivata borhidrida, kao na primer alkilborhidrida, kao što je litijum-tri-sek-butil-borhidrid. Alternativno, korak redukcije se može obaviti i korišćenjem katalitičkog hidrogenovanja, na primer, preko Raney-nikla ili oksida platine, kao katalizatora. Pogodni uslovi za obavljanje koraka ove redukcije su opisani detaljnije u nastavku, ili se mogu naći u U.S. Patent No. 2,843,591 (Hoffman-la Roche) i u Brossi et al., uHelv. Chim. Acta,vol XLI, no. 193, str. 1793-1806 (1958).

Zahvaljujući tome Što je tetrabenazin, kao polazni materijal za reakciju redukcije, tipično smešaRRi SS izomera (tj. frans-tetrabenazin), dihidrotetrabenazin koji se koristiu koraku redukcije, imaće isto takotranskonfiguraciju u položajima 3 i 11b, oblik jednog ili više poznatih izomera dihidrotetrabenazina prikazanih gore, na Slici 3. Dakle, Proces A može da obuhvati uzimanje poznatih izomera dihdirotetrabenazina, dehidratišući ih da se formira alken (II), a zatim "rehidratišući" ovaj alken (II), korišćenem uslova koji daju potrebne novec/sizomere dihdirotetrabenazina iz ovog pronalaska.

Dehiratacija dihidrotetrabenazina u alken (II) se može obaviti korišćenjem raznih standardnih uslova za dehidrataciju alkohola ili alkena, videti npr. J. March (citat gore), strane 389-390, i literaturu koja se tu navodi. Primeri takvih uslova su upotreba sredstva za dehidrataciju na bazi fosfora, kao što su fosfor-halidi ili fosfor-oksihalidi, npr. POCb i PCI5. Kao alternativa direktne dehidratacijie, hidroksilna grupa u dihidrotetrabenazinu se može konvertovati u odlazeću grupu L, kao što je halogen (npr. hlor ili brom), a zatim podvrgnuti uslovima za eliminaciju H-L (npr. u prisustvu baze). Konverzija hidroksilne grupe u halid se može postići korišćenjem postupaka koji su dobro poznati verziranom hemičaru, na primer, reakcijom sa ugljentetrahloridom ili ugljen-tetrabromidom, u prisustvu trialkil- ili triaril-fosfina, kao što je trifenilfosfin ili tributilfosfin.

Tetrabenazin, koji se koristi kao polazni materijal u ovoj redukciji kojom se dobija dihidrotetrabenazin, može se dobiti komercijalno, ili se može sintetizovati po postupku koji je opisan u U.S. Patent No. 2,830,993 (Hoffman-La Roche).

Sledeći postupak (Proces B), za dobijanje dihidrotetrabenazina iz ovog pronalaska, se sastoji od podvrgavanja jedinjenja formule (III):

uslovima za otvaranje prstena 2,3-epoksidne grupe u jedinjenju formule (III), a zatim ukoliko je potrebno, odvajanjem i izolovanjem željenog oblika izomera dihidrotetrabenazina.

Ovo otvaranje prstena se može obaviti u skladu sa poznatim postupcima za otvaranje epoksidnog prstena. Međutim, sada poželjan postupak za otvaranje prstena epoksida je redukciono otvaranje prstena, koje se može postići korišćenjem redukcionog sredstva, kao što je boran-THF. Reakcija sa boran-THF se može obaviti u polarnom, aprotonskom rastvaraču, kao što je etar (npr. tetrahidrofuran), obično na temperaturi okoline, a kompleks borana, koji se pri tome formira, zatim se hidrolizuje, zagrevanjem u prisustvu vode i baze, na temperaturi refluksa rastvarača. Proces B tipično daje izomere dihidrotetrabenazina u kojima atomi vodonika u položajima 2 i 3 imaju relativnu cfe-orijentaciju.

Epoksidna jedinjenja formule (III) se mogu dobiti epoksidovanjem alkena gornje formule (II). Reakcija epoksidovanja se može obaviti korišćenjem uslova i reagenasa koji su dobro poznati verziranom hemičaru, videti na primer J. March (citat gore), str. 826-829, i literaturu koja se tamo navodi. Tipično, za epoksidovanje se može upotrebiti per-kiselina, kao što je mete-hlorperbenzoeva kiselina (MCPBA) ili smeša per-kiseline i nekog sredstva za oksidaciju, kao što je perhloma kiselina.

Ukoliko su polazni materijali u procesima A i B smeše enantiomera, tada će proizvod ovih procesa tipično biti parovi enantiomera, npr. racemske smeše, verovatno zajedno sa dijastereomernim nečistoćama. Neželjeni dijastereoizomeri se mogu ukloniti tehnikama, kao što je hromatografija (npr. HPLC), a pojedinačni enantiomeri se mogu izdvojiti raznim postupcima koji su poznati verziranom hemičaru. Na primer, mogu se izdvojiti pomoću:

(i) hiralne hromatografije (hromatografije na hiralnom nosaču); ili

(ii) formiranjem soli sa optički čistom hiralnom kiselinom, razdvajanjem soli dva dijastereomera frakcionom kristalizacijom, a zatim oslobađanjem dihidrotetrabenazina iz ove soli; ili (iii) formiranjem derivata (kao što je estar) sa optički čistim reagensom za derivatizaciju (npr. sredstvom za esterifikaciju), razdvajanjem dobijenih epimera (npr. hromatografijom) i zatim konvertovanjem ovog derivata u dihidrotetrabenazin.

Jedan postupak za razdvajanje parova enantiomera dobijenih bilo kojim od Procesa A i B, a za koji je nađeno da je naročito efikasan, je esteriftkacija hidroksilne grupe dihidrotetrabenazina sa optički aktivnim oblikom Mosher-ove soli, kao što je R (+) izomer prikazan niže, ili njenim aktivnim oblikom:

Dobijeni estri dva enantiomera dihidrobenazina se mogu zatim razdvojiti hromatografijom (npr. HPLC) a razdvojeni estri hidrolizovati, dajući pojedinačne izomere dihidrobenazina, korišćenjem baze, kao što je hidroksid alkalnog metala (npr. NaOH) u polarnom rastvaraču, kao što je metanol.

Alternativa uporebi smeša enantiomera kao polaznog materijala u Procesima A i B, a zatim obavljanja razdvajanja enantiomera, je da se Procesi A i B mogu voditi na pojedinačnom enantiomeru kao polaznom materijalu, dajući proizvode u kojima dominira pojedinačni enantiomer. Pojedinačni enantiomeri alkena (II) se mogu dobiti podvrgavanjemRR/ SStetrabenazina stereoselektivnoj redukciji, koristeći litijum-tri-sek-butil-borhidrid, što daje smešuSRRiRSSenantiomera dihidrotetrabenazina, pa razdvajanjem ovih enantiomera (npr. frakcionom kristalizacijom) i zatim dehidratisanjem razdvojenih pojedinačnih enantiomera dihidrotetrabenazina, dajući dominantno ili isključivo pojedinačni enantiomer jedinjenja formule (II).

Procesi A i B su ilustrovani detaljnije u nastavku, u Shemama 1 i 2, respektivno.

Shema 1 ilustruje dobijanje pojedinačnih izomera dihidrotetrabenazina, koji imaju 2S,3S,11bft i 2/?,3R,11bS konfiguracije, u kojima su atomi vodonika vezani u položajima 2 i 3 u relativnojtransorijentaciji. Ova reakciona shema obuhvata gore definisani Proces A.

Polazna tačka sekvencije reakcija u Shemi 1 je komercijalno dostupni tetrabenazin (IV), koji je racemska smešaRRi SS optičkih izomera tetrabenazina. U svakom od ovihRR iSS izomera atomi vodonika u položajima 3 i 11b su raspoređeni u trans orijentaciji. Kao alternativa korištenju komercijalno dostupnog jedinjenja, tetrabenazin se može sintetizovati u skladu sa procedurom koja je opisana u U.S: Patent No. 2,830,933 (videti, posebno Primer 11).

Racemska smešaRR iSS tetrabenazina se redukuje korišćenjem bor-hidridnog redukcionog sredstva, kao što je IrHjum-tri-sek-butil-borhidrid ("L-Selektrid"). dajući smešu poznatih 2S,3S,11bR i 2S,3S,11bS izomera (V) dihidrotetrabenazina, od kojih je, radi jednostavnosti, prikazan samo 2S,3S,11W? izomer. Korišćenjem umesto natrijum-borhidrida stemo zahtevnijeg L-Selektrida, kao što je borhidridno redukciono sredstvo, formiranjeRRRi SSS izomera dihidrotetrabenazina se svodi na minimum ili suzbija.

Izomeri dihidrotetrabenazina (V) reaguju sa sredstvom za dehidratisanje, kao što je fosfor-pentahlorid, u aprotonskom rastvaraču, kao što je hlorovani ugijovodonik (na primer, hloroform ili dihlorometan, poželjno dihlorometan) formirajući nezasićeno jedinjenje (II), kao par enantiomera, od kojih je samo R-enantiomer prikazana u Shemi. Reakcija dehidratisanja se tipično obavlja na temperaturi nižoj od sobne temperature, na primer, na oko 0-5°C.

Nezasićeno jedinjenje (il) se podvrgava stereoselektivnom re-hidratisanju, dajući dihidrotetrabenazin (VI) i njegov lik u ogledalu ili antipod (nije prikazan), gde su atomi vodonika u položajima 3 i 11b raspoređeni u relativnojcisorijentaciji, a atomi vodonika u položajima 2 i 3 su raspoređeni u relativnojtransorijentaciji. Ovo stereoselektivno re-hidratisanje se obavlja proceduroim hidroborovanja, korišćenjem smeše boran-THF u tetrahidrofuranu (THF), uz formiranje intermedijarnog kompleksa borana (nije prikazan), koji se zatim oksidiše vodonik-peroksidom, u prisustvu baze, kao što je natrijum-hidroksid.

Zatim može da se obavi inicijalni korak prečišćavanja (npr. sa HPLC), dajući proizvod (V) sekvencije reakcija rehidratisanja, kao smešu 2S,3S,11b/? i2R, 3R, 11bSizomera, od kojih je u Shemi prikazan samo 2S,3S,11bf? izomer. Da bi se razdvojili ovi izomeri, smeša se tretira sa ft-(+)-Mosher-ovom kiselinom, u prisustvu oksalilhlorida i dimetilaminopiridina (DMAP) u dihlorometan u, dajući par dijastereomernih estara (VII) (od kojih je prikazan samo jeadn dijastereomer), koji se zatim mogu razdvojiti korišćenjem HPLC. Ovi pojedinačni estri mogu zatim da se hidrolizuju, korišćenjem hidroksida alkalnog metala, kao što je natrijum-hidroksid, dajući pojedinačni izomer (VI).

U varijaciji sekvencije koraka prikazanih u Shemi 1, posle redukcijeRR/ SStetrabenazina, dobijena smeša enantiomera dihidrotetrabenazina se može razdvojiti, dajući pojedinačne enantiomere. Razdvajanje se može obaviti formiranjem soli sa hiralnom kiselinom, kao što je (+)- ili (-)-kamforsurfonska kiselina, pa razdvajanjem dobijenih dijastereomera frakcionom kristalizacijom, dajući so pojedinačnog enantiomera, pa zatim oslobađanjem slobodne baze iz ove soli.

Izdvojeni enantiomer dihidrotetrabenazina se može dehidratisati, dajući pojedinačni enantiomer alkena (II). Naknadno rehidratisanje ovog alkena (II) će dati pretežno ili isključivo pojedinačni enantiomer c/'s-dihidrotetrabenazina (VI). Prednost ove varijacije je da ne obuhvata formiranje estara sa Mosher-ovom kiselinom, pa se tako izbegava hromatografsko razdvajanje, koje se tipično koristi za razdvajanje estara Mosher-ove kiseline.

Shema 2 ilustruje dobijanje pojedinačnih izomera dihidrotetrabenazina, koji imaju 2R,3S,11bR i 2S,3f?,11bS konfiguracije, u kojima su atomi vodonika vezani u položajima 2 i 3 u relativnojcisorijentaciji. Ova reakciona shema obuhvata Proces B, definisan gore.

U Shemi 2 nezasićeno jedinjenje (II) se dobija redukcijom tetrabenazina, što daje 2S,3R,11bR i 2R,3S,11bS izomere (V) dihidrotetrabenazina, i dehidratisanje sa PCI5na način koji je opisan gore, u Shemi 1. Međutim, umesto podvrgavanja jedinjenja (II) hidroborovanju, 2,3-dvoguba veza se konvertuje u epoksid, reakcijom sa mefa-hlorperbenzoevom kiselinom (MCPBA) i perhlornom kiselinom. Ova reakcija epoksidacije pogodno je da se obavlja u alkoholnom rastvaraču, kao što je metanol, tipično u okolini sobne temperature.

Zatim se epoksid (Vit) podvrgava redukcionom otvaranju prstena, korišćenjem elektrofilnog redukcionog sredstva boran-THF, dajući intermedijarni kompleks borana (nije prikazan), koji se zatim oskidiše, pa čepa sa vodonik-peroksidom u prisustvu alkalije, kao što je natrijum-hidroksid, dajući dihidrotetrabenazin (VIII) kao smešu 2R,3S,11bR i 2S,3R,11bS iziomera, od kojih je jednostavnosti radi, prikazan samo 2R,3S,11bR izomer. Tretman ove smeše izomera (VIII) saR-(+)-Mosher-ovom kiselinom, u prisustvu oksalilhlorida i dimetilaminopiridina (DMAP) u dihlorometanu, daje par epimernih estara (IX) (od kojih je prikazan samo jedan epimer), koji se zatim može razdvojiti hromatografijom, pa hidrolizovati sa natrijum-hidroksidom, u metanolu, na način koji je opisan gore u Shemi 1.

BIOLOŠKA SVOJSTVA I TERAPEUTSKE UPOTREBE

Tetrabenazin ispoljava terapeutske efekte inhibiranjem vezikularnog transportera monoamina VMAT2 u mozgu, inhibiranjem i pre-sinaptičkih i post-sinaptičkih receptora dopamina.

Izomeri c/s-dihidrotetrabenazina su takođe inhibitori VMAT2, stim da izomeri C i B ostvaruju najveći stepen inhibicije. Kao i tetrabenazin, jedinjenja iz ovog pronalaska imaju mali afinitet prema VMAT1, a VMAT1 je izoform koji se nalazi u perifernim tkivima i nekin endokrinim ćelijama, pokazujući tako da ona neće izazivati sporedne efekte povezane sa rezerpinom. Jedinjenja C i B pokazuju takođe inhibitorsko delovanje protiv katehol O-metil transferaze (COMT), izoforma oksidaze monoamina A i B, i izoforma 5-hidroksitriptamina 1d i 1b.

Iznenađuje da izomeri C i B takođe pokazuju primetno razdvajanje VAMT2 od aktivnosti receptora dopamina, tako što su visoko aktivni u vezivanju VMAT2, a oba jedinjenja pokazuju slabu ili nepostojeću aktivnost vezivanja za receptor dopamina i nedostatak aktivnosti za vezivanje transportera dopamina (DAT). Ustvari, ni jedan od izomera c/s-dihidrotetrabenazina ne pokazuje značajnu aktivnost za vezivanje DAT. Ovo ukazuje da ovim jedinjenjima možda nedostaje dopaminergijska strana efekta koji izaziva tetrabenazin. Izomeri C i B su takođe ili slabo aktivni ili neaktivni kao inhibitori adrenegijskih receptora, a ovo ukazuje da ovim jedinjenjima možda nedostaje adrenergijska strana efekta, koja se često sreće kod tetrabenazina. Ustvari, u lokomotornim ispitivanjima na pacovima, tetrabenazin je pokazao sedativni efekat zavisan od doze, dok sedativni efekti nisu opaženi nakon ordiniranja izomera dihidrotetrabenazina B i C iz ovog pronalaska.

Pored toga, i izomer C i izomer B su snažni inhibitori transportera proteina serotonina, SERT. Inhibiranje SERT je jedan od mehanizama preko koga antidepresanti, kao što je fluoxetine (Prozac<®>) ispoljavaju njihove terapeutske efekte, Stoga, svojstvo izomera C i B da inhibiraju SERT pokazuje da ovi izomeri mogu da deluju i kao antidepresanti, što je značajno suprotno od tetrabenazina, kod koga je depresija uočljivo prepoznata kao sporedni efekat.

Izomer B je testiran na modelu transgenskih miševa sa Huntington-ovom bolešću i pokazano je da zaustavlja napredovanje brojnih simptoma Huntington-ove bolesti, uključujući nevoljne pokrete, kao što su nevoljna horeja, tremori i trzanja i narušavanje hoda. Na osnovu ovog ispitivanja, koje je do sada obavljeno, predviđa se da će c/s-dihidrotetrabenazinska jedinjenja iz ovog pronalaska biti korisna u tretmanu Huntington-ove bolesti, a naročito u zaustavljanju i usporavanju napredovanja ove bolesti, odnosno za profilaktičku upotrebu, radi sprečavanja razvoja ove bolesti.

Ova jedinjenja se obično ordiniraju osobi kojoj je to potrebno, na primer humanom ili animalnom pacijentu, poželjno humanom.

Tipično, ova jedinjenja se ordiniraju u količinama koje su terapeutski ili profilaktički korisne, a koje su obično netoksične. Međutim, u nekim situacijama, korist odordiniranja dihidrotetrabenazinskih jedinjenja iz ovog pronalaska može da prevagne nad nedostacima bilo kakvih toksičnih efekata ili sporednih efekata, u kom slučaju se može smatrati poželjnim ordiniranje jedinjenja u količinama koje su povezane i sa nekim stepenom toksičnosti.

Tipična dnevna doza ovog jedinjenja može ići do 1000 mg na dan, na primer, u opsegu od 0,01 mg do 10 mg po kilogramu telesne mase, uobičajenije od 0,025 mg do 5 mg po kg telesne mase, na primer do 3 mg po kg telesne mase, a tipičnije od 0,15 mg do 5 mg po kg telesne mase, mada se mogu ordinirati više i niže doze, ukoliko se to zahteva.

Primera radi, početna polazna doza od 12,5 mg može se ordinirati 2 do 3 puta na dan. Doza se može povećavati za 12,5 mg na dan, na svakih 3 do 5 dana, sve dok se za tog pojedinca ne dostigne maksimalna tolerantna i efikasna doza, što će odrediti lekar. Konačno, količina jedinjenja koje se ordinira mora biti saglasna sa prirodom bolesti ili fiziološkim stanjem koje se tretira i terapeutskom koristi i prisustvom ili odsustvom sporednih efekata izazvanih datim režimom doziranja, a to sve predstavlja diskreciono pravo lekara.

FARMACEUTSKE FORMULACIJE

Jedinjenja dihidrotetrabenazina se tipično ordiniraju u obliku farmaceutskih preparata.

Farmaceutski preparati mogu biti u bilo kom obliku pogodnom za oralnu, parenteralnu, površinsku, intranazalnu, intrabronhijalnu, očnu, ušnu, rektalnu, intra-vaginalnu ili transdermalnu primenu. Ako su ovi preparati namenjeni za parenteralno ordiniranje, oni se mogu formulisati za intravenozno, intramuskularno, intraperitonealno, subkutano ordiniranje ili za direktno oslobađanje u ciljani organ ili tkivo, injekcijom, infuzijom ili nekim drugim načinom oslobađanja.

Farmaceutski oblici doze, pogodni za oralno ordiniranje, su tablete, kapsule, kaplete, pilule, pastile, sirupi, rastvori, sprejovi, prahovi, granule, eliksiri i suspenzije, sublingvalne tablete, sprejovi, komadići ili parčići i bukalni listići. Farmaceutski preparati koji sadrže jedinjenja dhidrotetrabenazina iz ovog pronalaska se mogu formulisati u skladu sa poznatim tehnikama, videti na primer, "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Companv, Easton, PA, USA.

Tako, preparati tableta mogu sadržati u jediničnoj dozi aktivno jedinjenje zajedno sa inerntim razblaživačem ili nosačem, kao što je šećer ili šećerni alkohol, npr. laktoza, saharoza, sorbitol ili manitol; i/ili razblaživačem koji nije šećer, kao što su natrijum-karbonat,. kalcijum-fosfat, talk, kalcijum-karbonat ili celuloza i njeni derivati, kao što su metilceluloza, etilceluloza, hidroksipropilceluloza, i škrobovi, kao što je kukuruzni škrob. Tablete mogu takođe da sadrže i takve standardne sastojke, kao što su agensi za vezivanje i granulaciju, kao što su polivinilpirolidon, dezintegrante (npr. umreženi polimeri koji bubre, kao što je umrežena karboksimetilceluloza), sredstva za podmazivanje (npr. stearati), prezervative (npr. parabeni), antioksidante (npr. BHT), sredstva za puferovanje (na primer fosfatni i citratni puferi) i sredstva za penušanje, kao što su smeše citrata/bikarbonata. Ovi dodaci su dobro poznati i ne treba ovde da se detaljno diskutuju.

Formulacije kapsula mogu biti u varijanti tvrdih želatinskih ili mekih želatinskih kapsula, a mogu da sadrže aktivnu komponentu u čvrstom, polučvrstom ili tečnom obliku. Želatinske kapsule se mogu formirati iz želatina animalnog porekla, ili izvedene iz njegovih sintetskih ili biljnih derivata.

čvrsti oblici za doziranje (npr. tablete, kapsule itd.) mogu biti obloženi ili ne-obloženi, ali tipično imaju oblogu, na primer zaštitni film kao oblogu (npr. vosak ili lak) ili oblogu za kontolisano oslobađanje. Ova obloga (npr. Eudragit<®>, vrsta polimera) se može dizajnirati tako da oslobađa aktivnu komponentu na željenoj lokaciji unutar gastro-intestinalnog trakta. Dakle, obloga se može odabrati tako da se razgrađuje unutar određenih pH uslova u gastrointestinalnom traktu, i tako selektivno oslobađa ovo jedinjenje u stomaku, ili u ileumu, ili u duodenumu.

Umesto, ili dodatno oblaganju, lek se može prezentirati u obliku čvrste matrice, koja sadrži agens za kontrolisano oslobađanje, na primer agens za odloženo oslobađanje, koji se može prilagoditi selektivnom oslobađanju ovog jedinjenja pod uslovima promenljive kiselosti ili alkaliničnosti u gastrointestinalnom traktu. Alternativno, materijal matrice, ili obloga koja usporava oslobađanje, mogu biti u obliku erozivnog polimera (npr. polimer anhdrida maleinske kiseline), koji u suštini konstantno erodira, dok oblik za doziranje prolazi kroz gastrointestinalni trakt.

Preparati za površinsku upotrebu su masti, kreme, sprejovi, flasteri, gelovi, kapi i inserti (npr. intraokularni inserti). Ovi preparati se mogu formulisatiu skladu sa poznatim postupcima.

Preparati za parenteralno ordiniranje se tipično prezentiraju kao sterilni vodeni ili uljani rastvori ili fine suspenzije, ili se mogu dati kao fino usitnjeni sterilni prahovi, za ekstratemporalno pripremanje sa sterilnom vodom za injekcije.

Primeri formulacija za rektalno ili intra-vaginalno ordiniranje su pesarije i supozitorije, koje mogu biti, na primer, formirane iz oblikovanih topivih ili voštanih materijala, u kojima je sadržano aktivno jedinjenje.

Preparati za ordiniranje inhalacijom mogu biti u obliku prahova za inhaliranje ili tečnih ili praškastih sprejova, i mogu se ordinirati u standardnom obliku, korišćenjem inhalatora za prahove ili uređaja za oslobađanje aerosola. Ovi uređaji su dobro poznati. Za ordiniranje inhalacijom, praškaste formulacije tipično sadrže aktivno jedinjenje zajedno sa inertnim praškastim razblaživačem, kao što je laktoza.

Jedinjenja iz ovog pronalaska se obično prezentiraju u obliku jedinične doze i kao takva sadrže dovoljno jedinjenja da se obezbedi željeni nivo biološke aktivnosti. Na primer, formulacija namenjena oralnom ordiniranju može da sadrži od 2 mg do 200 mg aktivnog sastojka, uobičajenije, od 10 mg do 100 mg, na primer, 12,5 mg, 25 mg i 50 mg.

Aktivno jedinjenje će se ordinirati pacijentu kome je to potrebno (na primer, humanom ili animalnom pacijentu) u količini koja je dovoljna da se postigne željeni terapeutski efekat.

PRIMERI

Sledeći primeri, ali koji- ne ograničavaju, ilustruju sintezu i svojstva jedinjenja dihidrotetrabenazina iz ovog pronalaska.

Primer 1

Pobijanje 25. 3S, 11 bR i 2R. 3R, 11 bS izomera dihidrotetrabenazina

1 A. Redukcija RR/ SS tetrabenazina

Polako, tokom 30 min, se dodaje 1M L-Selectride<®>u tetrahidrofuranu (135 mL, 136 mmol, 2,87 ekviv.), u mešani rastvor racemata tetrabenazinaRR/ SS(15 g, 47 mmol) u etanolu (75 mL) i tetrahidrofuranu (75 mL), na 0°C. Po završetku dodavanja smeša se 30 min meša na 0°C, a zatim ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu.

Smeša se prespe na tucani led (300 g), pa se doda voda (100 mL). Ovaj rastvor se ekstrahuje dietiletrom (2x200 mL), a kombinovani etarski ekstrakti se operu vodom (100 mL) i delimično osuše iznad anhidrovanog kalijum-karbonata, Sušenje se završava korišćenjem anhidrovanog magnezijum-sulfata, a posle filtriranja rastvarao se ukloni pod sniženim pritiskom (potrebna je zaštita od svetlosti, temperatura kupatila <20°C), dajući svetložutu čvrstu supstancu.

Ova supstanca se razmuti u petroletru (30-40°C), pa filtrira, dajući belu praškastu supstancu (12 g, 80%).

1B. Dehidratisanje redukovanog tetrabenazina

U porcijama se dodaje, tokom 30 min, fosfor-pentahlorid (32,8 g, 157,5 mmol, 2,5 ekviv.) u mešani rastvor proizvoda redukovanog tetrabenazina iz Primera 1A (20 g, 62,7 mmol) u dihlorometanu (200 mL), na 0°C. Po završetku dodavanja, reakciona smeša se još 30 min meša na 0°C, pa se ovaj rastvor lagano prespe u 2M rastvor natrijum-karbonata u vodi, koji sadrži tucani led (0°C). Kada prestane započeto izdvajanje gasa, smeša se načini baznom (oko pH 12), korišćenjem čvrstog natrijum-karbonata.

Alkalni rastvor se ekstrahuje koristći etilacetat (800 mL), a kombinovani organski ekstrakti se osuše iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Posle filtriranja, rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom, dajući mrko ulje, koje se prečisti hromatografijom na koloni (silicijum-dioksid, etilacetat), dajući polovično čist alken, kao žutu čvrstu supstancu (10,87 g, 58%).

1C. Hidratisanje sirovog alkena iz Primera 1B

Rastvor sirovog alkena (10,87 g, 36,11 mmol) iz Primera 1B, u suvom THF (52 mL), tretira se na sobnoj temperaturi sa 1 M boran-THF (156,6 mL, 156,6 mmol, 4,30 ekviv.), koji se dodaje ukapavanjem. Reakcija se 2 h meša, doda voda (20 mL), pa se rastvor učini baznim do pH 12, sa 30% rastvorom natrijum-hidroksida u vodi.

Ovoj mešanoj alkanoj reakcionoj smeši se doda 30% rastvor vodonik-peroksida u vodi, pa se taj rastvor 1 h zagreva pod refluksom, pre nego što se ostavi da se ohladi. Doda se voda (100 mL), pa smeša ekstrahuje etilacetatom (3*250 mL). Kombinuju se organski ekstrakti i osuše iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, a posle filtriranja rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom, dajući žuto ulje (9 9).

Ovo ulje se prečisti preparativnom HPLC (kolona: Lichrospher Si60, 5 |jm, 250x21,20 mmm, mobilna faza: heksan:etanol:dihlorometan (85:15:5); UV 254 nm, protok: 10 mL/min), sa 350 mg po injektiranju, posle čega sledi koncentrisanje traženih frakcija pod vakuumom. Ovaj prozvod se zatim rastvori u etru, pa još jednom koncentriše pod vakuumom, dajući racemat dihidrotetrabenazina, prikazan gore, kao žutu penu (5,76 g, 50%).

1D. Dobijanje Mosher- ovih estarskih derivata

Dodaju se R-(+)-a-metoksi-a-trifluorometilfenilsirćetna kiselina (5 g, 21,35 mmol), oksalilhlorid (2,02 mL) i DMF (0,16 mL) u anhidrovani dihlorometan (50 mL), pa se ovaj rastvor 45 min meša na sobnoj temperaturi. Ovaj rastvor se koncentriše pod sniženim pritiskom, a ostatak još jednom razmuti u anhidrovanom dihlorometanu (50 mL). Dobijeni rastvor se ohladi u rashladnom kupatilu led-voda, pa doda dimetilaminopiridin (3,83 g, 31,34 mmol), a zatim prethodno osušeni rastvor (pomoću molekulskih sita 4A) anhidrovanog dihlorometana i čvrstog proizvoda iz Primera 1C (5 g, 15,6 mmol). Posle 45 min mešanja na sobnoj temperaturi, doda ce voda (234 mL), a smeša se ekstrahuje etrom (2*200mL). Etarski ekstrakti se osuše iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata i propuste kroz sloj silicijum-dioksida, a proizvod se eluira etrom.

Sakupljeni etarski eluat se koncentriše pod sniženim pritiskom dajući ulje koje se prečisti upotrebom hromatografije na koloni (silcijum-dioksid, heksametar (10:1)). Isparavanje sakupljenih traženih frakcija iz kolone i uklanjanje rastvarača pod sniženim pritiskom, daje čvrstu supstancu, koja se dalje prečišćava upotrebom hromatografije na koloni (silicijum-dioksid, heksan:etilacetat (1:1)), dajući tri glavne komponente, koje su delimično razdvojene u pikovima Mosher-ovih estara 1 i 2.

Preparativna HPLC ove tri komponente (kolona: 2*Lichrospher Si60, 5 pm, 250x21,20 mm, mobilna faza: heksamizopropanol (97:3), UV 254 nm, protok: 10 mL/min) sa napajanjem od 300 mg, posle čega sledi koncentrisanje željenih frakcija pod vakuumom, što daje čiste derivate Mosher-ovih estara: Pik 1 (3,89 g, 46,5%)

Pik 2 (2,78 g, 33%).

Frakcije koje odgovaraju ovim pikovima podvrgavaju se hidrolizi da se oslobode pojedinačni izomeri dihidrotetrabenazina, koji su identifikovani i karakterisani kao Izomeri A i B. Veruje se da svaki od Izomera A i B ima jednu od sledećih struktura:

Određenije, veruje se da Izomer B ima 2S,3S,11bR apsolutnu konfiguraciju, na osnovu eksperimenata kristalografije pomoću X-zraka, opisanih u Primeru 4, u nastavku.

1E. Hidroliza pika 1, koja daje Izomer A ( nije jedinjenje iz ovog pronalaska)

Doda se rastvor 20% natrijum-hidroksida u vodi (87,5 mL) u rastvor Mosher-ovog estra u Piku 1 (3,89 g, 7,27 mmol) u metanolu (260 mL), pa se dobijena smeša meša i zagreva 150 min pod refluksom. Posle hlađenja na sobnu temperaturu doda se voda (200 mL), a rastvor ekstrahuje etrom (600 ml), osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata i posle filtriranja koncentriše pod sniženim pritiskom.

Ostatak se rastvori upotrebivši etilacetat (200 mL), pa se ovaj rastvor opere vodom (2x50 mL), a organska faza osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, pa posle filtriranja koncentriše pod sniženim pritiskom, dajući žutu penu. Ovaj materijal se prečisti hromatografijom na koloni (silicijum-dioksid, eluiranje sa gradijentom etilacetafcheksan (1:1) do etilacetata). Kombinuju se željene frakcije, a rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom. Ostatak se razmuti u etru, pa se rastvarač još jednom ukloni pod sniženim pritiskom, dajući Izomer A kao beličastu penu (1,1 g, 47%).

Izomer A, za koji se veruje da ima 2ft,3R,11bS konfiguraciju (apsolutna stereohemija nije određena) karakterisan je pomoću<1>H-NMR,<13>C-NMR, IR, masene spektrometrije, hiralne HPLC i ORD. Podaci za IR, NMR i MS Izomera A su dati u Tabeli 1, a podaci za hiralnu HPLC i ORD su dati u Tabeli 3.

1F. Hidroliza Pika 2, koja daje Izomer B ( jedinjenje iz ovog pronalaska)

Doda se rastvor 20% natrijum-bidroksida u vodi (62,5 mL) u rastvor Mosher-ovog estra u Piku 2 (2,78 g, 5,19 mmol) u metanolu (185 mL), pa se dobijena smeša meša i zagreva 150 min pod refluksom. Posle hlađenja na sobnu temperaturu doda se voda (142 mL), a rastvor ekstrahuje etrom (440 ml), osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata i posle filtriranja koncentriše pod sniženim pritiskom.

Ostatak se rastvori upotrebivši etilacetat (200 mL), pa se rastvor opere vodom (2x50 mL), a organska faza osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, pa posle filtriranja koncentriše pod sniženim pritiskom. Ovom ostaku se doda petroletar (30-40°C), pa se rastvor još jednom koncentriše pod vakuumom, dajući Izomer B kao belu penu (1,34 g, 81%).

Izomer B, za koji se veruje da ima 2S,3S,11bR konfiguraciju, karakterisan je pomoću 'H-NMR,<13>C-NMR, IR, masene spektrometrije, hiralne HPLC, ORD i kristalografijom pomoću X-zraka. Podaci za IR, NMR i MS Izomera B su dati u Tabeli 1, a podaci za hiralnu HPLC i ORD su dati u Tabeli 3. Podaci za kristalografiju pomoću X-zraka su dati u Primeru 4.

Primer 2

Pobijanje2R - 3S , 11 bR i2S. 3R11 bS izomera dihidrotetrabenazina

2A. Dobijanje 2, 3- dehidrotetrabenazina

Rastvor koji sadrži racemsku smešuRRi SS enantiomera tetrabenazina (15 g, 47 mmol) u tetrahidrofuranu se podvrgava redukciji sa L-Selectride<®->om, po postupku iz Primera 1A, dajući smešu 2S,3R,11bf? i 2f?,3S,11bS enantiomera dihidrotetrabenazina, kao belu praškastu supstancu (12 g, 80%). Ovaj delimično prečišćen dihidrotetrabenazin se dehkJratiše upotrebom PCi5, u skladu sa postupkom iz Primera 1B, dajući polovično čistu smešu 11bR i 11bS izomera 2,3-dehidrotetrabenazina (od kojih je 11bR enantiomer prikazan niže), kao žutu čvrstu supstancu (12,92 g, 68%). 2B. Epoksidovanje sirovog alkena iz Primera 2A

U mešani rastvor sirovog alkena iz Primera 2A (12,92 g, 42,9 mmol) u metanolu (215 mL) doda se rastvor 70% perhlorne kiseline (3,70 mL, 43 mmol) u metanolu (215 mL). U reakciju se doda 77% 3-hloroperoksibenzoeva kiselina (15,50 g, 65 mmol), pa se reakciona smeša 18 h meša na sobnoj temperaturi, zaštićena od svetla.

Reakciona smeša se prespe u zasićeni rastvor natrijum-sulfita u vodi (200 mL), pa doda voda (200 mL). U nastalu emulziju se doda hloroform (300 mL), pa se smeša načini baznom sa zasićenim rastvorom natrijum-bikarbonata (400 mL).

Odvoji se organski sloj, a vodena faza opere sa još hlorofbrma (2x150 mL). Kombinovani hloroformski slojevi se osuše iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, a posle filtriranja rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom, dajući mrko ulje (14,35 g, prinos >100%- verovatno je u proizvodu zaostao rastvarač). Ovaj materijal se koristi bez daljeg prečišćavanja.

2C. Redukciono otvaranje prstena u epoksidu iz Primera 2B

Mešani rastvor sirovog epoksida iz Primera 2B (14,35 g, 42,9 mmol predpostavljajući 100% prinos) u suvom THF (80 mL) lagano se, tokom 15 min tretira sa 1M boran/THF (184,6 mL, 184,6 mmol). Reakcija se 2 h meša, dodć voda (65 mL) pa se dobijeni rastvor 30 min zagreva uz mešanje pod refluksom.

Posle hlađenja, u reakcionu smešu se doda 30% rastvor natiijum-hkJroksida i vodi (97 mL), a zatim 30% rastvor vodonik-peroksida (48,6 mL), pa se reakcije još 1 h meša i zagreva pod refluksom.

Ohlađena reakciona smeša se ekstrahuje etilacetatom (500 mL), osuši iznac anhidrovanog magnezijum-sulfata, a posle filtriranja rastvarač se ukloni poc sniženim pritiskom, dajući ulje. Ovom ulju se doda heksan (230 mL), pa s« rastvor ponovo koncentriše pod sniženim pritiskom.

Uljani ostatak se prečisti hromatografijom na koloni (silicijum-dioksid, etilacetat) Kombinuju se željene frakcije, a rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom. Ostata* se još jednom prečisti koristeći hromatografiju na koloni (silicijum-dioksid eluiranje sa gradijentom, od heksana do etra). Kombinuju se željene frakcije, s rastvarači ispare pod sniženim pritiskom, dajući svetložutu čvrstu supstanct (5,18 g, 38%).

2D. Dobijanje derivata Mosher- ovih estara izomera

2R, 3S, 11bR i 2S. 3R, 11bS dihidrotetrabenazina

Dodaju se R-(+)-a-metoksi-a-trifluorometilfenilsirćetna kiselina (4,68 g, 19,98 mmol), oksalilhtorid (1,90 mL) i DMF (0,13 mL) u anhidrovani dihlorometan (46 mL), pa se ovaj rastvor 45 min meša na sobnoj temperaturi. Ovaj rastvor se koncentriše pod sniženim pritiskom, a ostatak još jednom razmuti u anhidrovanom dihlorometanu (40 mL). Dobijeni rastvor se ohladi, koristeći rashladno kupatilo led-voda, pa se doda dimetilaminopiridin (3,65 g, 29,87 mmol), a zatim prethodno osušeni rastvor (pomoću molekulskih sita 4A) čvrstog proizvoda iz Primera C (4,68 g, 14,6 mmol) u anhidrovanom dihlorometanu (20 mL). Posle 45 min mešanja na sobnoj temperaturi doda se voda (234 mL), pa se smeša ekstrahuje etrom (2*200 mL). Etarski ekstrakti se osuše iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, propuste kroz sloj silicijum-dioksida i proizvod eluira etrom.

Sakupljeni etarski eluat se koncentriše pod sniženim pritiskom, dajući ulje, koje se prečisti hromatoghrafijom na koloni (silicijum-dioksid, heksan:etar (1:1)).

Isparavanje sakupljenih željenih frakcija iz kolone i uklanjanje rastvarača pod sniženim pritiskom daje ružičastu čvrstu supstancu (6,53 g).

Preparativna HPLC ove supstance (kolona: 2*Lichospher Si60, 5 um, 250x21,20mm, mobilna faza: heksan:izopropanol (97:3), UV254 nm, protok 10 mL/min) sa punjenjem od 100 mg, posle čega sledi koncentrisanje željenih frakcija pod vakuumom, daje čvrstu supstancu koja se smuti sa petroletrom (30-40°C), i sakupi filtriranjem, dajući čiste derivate Mosher-ovih estara.

Pik 1 (2,37 g, 30%)

Pik 2 (2,42 g, 30%).

Frakcije koje odgovaraju ovim pikovima podvrgavaju se hidrolizi, da se oslobode pojedinačni izomeri dihidrotetrabenazina, koji su identifikovani i karakterisani kao Izomeri C i D. Veruje se da svaki od Izomera C i D ima jednu od sledećih struktura:

2F. Hidroliza Pika 1 koja daje Izomer C ( jedinjenje iz ovog pronalaska)

Doda se rastvor 20% natrijum-hidroksida u vodi (53 mL) u mešani rastvor Mosher-ovog estra u Piku 1 (2,37 g, 4,43 mmol) u metanolu (158 mL), pa se dobijena smeša meša 150 min pod refluksom. Posle hlađenja, u reakcionu smešu se doda voda (88 mL), a dobijeni rastvor ekstrahuje etrom (576 ml). Organski ekstrakt se osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata i posle filtriranja koncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatku se doda etilacetat (200 mL), pa se rastvor opere vodom (2x50mL). Organska faza se osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, pa posle filtriranja koncentriše pod sniženim pritiskom.

Ovaj materijal se tretira petroletrom (30-40°C), a dobijena suspendovana supstanca sakupi filtriranjem. Filtrat se koncentriše pod sniženim pritiskom, pa se druga šarža suspendovane supstance sakupi filtriranjem. Kombinuju se obe dobijene čvrste supstance i osuše pod sniženim pritiskom, dajući Izomer C (1,0 g, 70%).

Izomer C, za koji se veruje da ima ili 2/?,3S,11bft ili 2S,3f?,11bS konfiguraciju (apsolutna stereohemija nije određena) karakterisan je pomoću<1>H-NMR,<13>C-NMR, IR, masene spektrometrije, hiralne HPLC i ORD. Podaci za IR, NMR i MS Izomera C su dati u Tabeli 2, a podaci za hiralnu HPLC i ORD su dati u Tabeli 4.

2G. Hidroliza Pika 2 koja daje Izomer D ( nije jedinjenje iz ovog pronalaska)

Doda se rastvor 20% natrijum-hidroksida u vodi (53 mL) u mešani rastvor Mosher-ovog estra u Piku 2 (2,42 g, 4,52 mmol) u metanolu (158 mL), pa se dobijena smeša meša 150 min pod refluksom. Posle hlađenja, u reakcionu smešu se doda voda (88 mL), a dobijeni rastvor ekstrahuje etrom (576 ml). Organski ekstrakt se osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata i posle filtriranja rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom. Ostatku se doda etilacetat (200 mL), pa se rastvor opere vodom (2*50 mL). Organska faza se osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, pa posle filtriranja koncentriše pod sniženim pritiskom.

Ovaj ostatak se tretira petroletrom (30-40°C), a dobijena suspendovana oranž supstanca sakupi filtriranjem. Ova supstanca se rastvori u etilacetatheksanu (15:85) i prečisti hromatografijom na koloni (silicijum-dioksid, eluiranje sa gradijentom, etilacetatheksan (15:85) do etilacetata). Kombinuju se željene frakcije, a rastvarač ukloni od sniženim pritiskom. Ostatak se razmuti u petroletru (30-40°C), a dobijena suspenzija sakupi filtriranjem. Sakupljena čvrsta supstanca se osuši pod sniženim pritiskom, dajući Izomer D, kao belu čvrstu supstancu (0,93 g, 64%).

Izomer D, za koji se veruje da ima ili 2R,3S,11bR ili 2S,3R,11bS konfiguraciju (apsolutna stereohemija nije određena) karakterisan je pomoću<1>H-NMR,<13>C-NMR, IR, masene spektrometrije, hiralne HPLC i ORD. Podaci za IR, NMR i MS Izomera D su dati u Tabeli 2, a podaci za hiralnu HPLC i ORD su dati u Tabeli 4. U Tabelama 1 i 2 infracrveni spektri su određeni korišćenjem postupka sa diskom od KBr. Spektri<1>H-NMR su dobijeni u rastvorima deuterisanog hlorofoma, koristeći instrument Varian Gemini NMR spectrometer (200 MHz). Spektri<13>C-NMR su dobijeni u rastvorima deuterisanog hlorofoma, koristeći instrument Varian Gemini NMR spectrometer (50 MHz). Maseni spektri su dobijeni koristeći instrument Micromass Platform II spectrometer (ES<+>uslovi). U Tabelama 3 i 4 cifre za Optičku Rotacionu Disperziju (ORD) su dobijene korišćenjem instrumenta Optical Activitv PolAAr 2001, u rastvoru metanola, na 24°C. Merenja retencionih vremena u HPLC obavljena su korišćenjem hromatografa HP 1050 HPLC, sa UV detekcijom.

Primer 3

Alternativni postupak za dobiianie Izomera B i dobiianie mezilatne soli

3A. Redukcija RR/ SS tetrabenazina

Lagano se, tokom 30 min, dodaje 1M L-Selectride<®>u tetrahidrofuranu (52 mL, 52, mmol, 1,1 ekviv.) u ohlađeni (rashladno kupatilo sa ledom), mešani rastvor racemata tetrabenazina (15 g, 47 mmol) u tetrahidrofuranu (56 mL). Po završetku dodavanja smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu, pa se meša još 6 h. TLC analiza (silicijum-dioksid, etilacetat) je pokazala samo neznatne količine zaostalog polaznog materijala.

Smeša se prespe u mešanu smešu tucanog leda (112 g), vode (56 mL) i glacijalne sirćetne kiseline (12,2 g). Nastali žuti rastvor se opere etrom (2*50mL), pa načini baznim, laganim dodavanjem čvrstog natrijum-karbonata (oko 13 g). U smešu se uz mešanje dodaje petroletar (30-40°C), a sirovi (3-DHTBZ se sakupi filtriranjem kao bela čvrsta supstanca.

Ova sirova supstanca se rastvori u dihlorometanu (oko 150 mL), a dobijeni rastvor opere vodom (40 mL), osuši koristeći anhidrovani magnezijum-sulfat, filtrira i koncentriše pod sniženim pritiskom do oko 40 mL. Formira se gusta suspenzija bele supstance. Doda se petroletar (30-40°C), pa se ova suspenzija 15 min meša na temperaturi laboratorije. Proizvod se sakupi filtriranjem, pa ispere petroletrom (30-40'C) (40-60 mL) na filteru, dok talog ne bude beo kao sneg, a zatim suši na sobnoj temperaturi, dajući (i-DHTBZ (10,1 g, 67%), kao belu čvrstu supstancu. TLC analiza (silicijum-dioksid, etilacetat) je pokazala samo jednu komponentu.

3B. Dobijanje i frakciona kristalizacija kamforsulfonske soli racemskog p- DHTBZ

Proizvod iz Primera 3A i 1 ekvivalent (S)-(+)-kamfor-10-sulfonske kiseline se uz zagrevanje rastvore u minimalnoj zapremini metanola. Nastali rastvor se ostavi da se ohladi, a zatim lagano razblažuje etrom, dok se ne završi formiranje taloga. Dobijena bela kristalna supstanca se sakupi filtriranjem i opere etrom pre sušenja.

So kamforsulfonske kiseline (10 g) se rastvori u smeši apsolutnog etanola (170 mL) i metanola (30 mL). Dobijeni rastvor se meša i ostavi da se hladi. Posle dva sata nastali talog se sakupi filtriranjem kao bela kristalna supstanca (2,9 g). Uzorak ovog kristalnog materijala se mućka u levku za odvajanje sa viškom zasićenog rastvora natrijum-karbonata u vodi i dihlorometanom. Odvoji se organska faza, osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtrira i koncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se triturira petroletrom (30-40°C), a organska faza još jednom koncentriše. Hiralna HPLC analiza ove soli, uz upotrebu kolone Chirex (S)-VAL i (R)-NEA 250*4,6 mm i heksan:etanola (98:2) kao eluenta, uz protok od 1 mL/min, pokazuje daje izolovani p-DHTBZ obogaćen jednim enantiomerom (čistoća enantiomera oko 80%).

Obogaćena so kamforsulfonske kiseline (14 g) se rastvori u apsolutnom etanolu (140 mL), pa se doda propan-2-oI (420 mL). Dobijeni rastvor se meša, a u toku od jednog minuta počne stvaranje taloga. Ova smeša se ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu, pa se 1 h meša. Nastali talog se sakupi filtriranjem, opere etrom i osuši, dajući belu kristalnu supstancu (12 g).

Ovaj kristalni materijal se mućka u levku za odvajanje sa viškom zasićenog rastvora natrijum-karbonata u vodi i dihlorometanom. Odvoji se organska faza, osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtrira i koncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se triturira, koristeći petroletar (30-40°C), pa se organski sloj još jedanput koncentriše, dajući (posle sušenja pod vakuumom) (+)-B-DHTBZ (6,6 g, ORD =+107,8°). Ovaj izolovani enantiomer ima čistoću >97%.

3C. Dobijanje Izomera B

Rastvor fosfor-pentahlorida (4,5 g, 21,6 mmol, 1,05 ekviv.) u dihlorometanu (55 mL), tokom 10 min lagano se dodaje u mešani, ohlađeni (rashladno kupatilo led-voda) rastvor proizvoda iz Primera 3B (6,6 g, 20,6 mmol) u dihlorometanu (90 mL). Po završetku dodavanja nastali žuti rastvor se još 10 min meša, pre nego što se prespe u snažno mešanu smešu natrijum-karbonata (15 g) u vodi (90 mL) i tucanog leda (90 g). Ova smeša se još 10 min meša, pa se prebaci u levak za odvajanje.

Kada se faze razdvoje, odvoji se mrki dihlorometanski sloj, osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtrira i koncentriše pod sniženim pritiskom, dajući sirovi alkenski intermedijar kao mrko ulje (oko 6,7 g). TLC analiza (silicijum-dioksid, etilacetat) pokazuje da u sirovom proizvodu nije zaostao (+)-B-DHTBZ.

Ovaj sirovi alken se razmuti (u atmosferi suvog azota) u anhidrovanom tetrahidrofuranu (40 mL), pa se tokom 15 min, uz mešanje, dodaje rastvor borana u THF (1M rastvor, 2,5 ekviv., 52 mL). Ova reakciona smeša se zatim 2 h meša na sobnoj temperaturi. TLC analiza (silicijum-dioksid, etilacetat) pokazuje da-u reakcionoj smeši nije zaostao alkenski intermedijar.

U mešanu reakcionu smešu doda se rastvor natrijum-hidroksida (3,7 g) u vodi (10 mL), a zatim rastvor vodonik-peroksida u vodi (50%, oko 7 mL), pa se nastala dvofazna smeša 1 h meša pod refluksom. TLC analiza organske faze u ovom trenutku (silicijum-dioksid, etilacetat) pokazuje da se javlja proizvod sa vrednošću Rf koja se očekuje za Izomer B. Opažena je takođe i karakteristična nepolarna komponenta.

Reakciona smeša se ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu, pa se prebaci u levak za odvajanje. Odvoji se gornji, organski sloj, pa koncentriše pod sniženim pritiskom dok se ne ukloni većina THF. Ostatak se razmuti u etru (stabilizovan (BHT), 75 mL), opere vodom (40 mL), osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtrira i koncentriše pod sniženim pritiskom, dajući svetložuto ulje (8,1 g).

Ovo žuto ulje se prečisti hromatografijom na koloni (silicijum-dioksid, etilacetat:heksan (80:20), pa do 100% etilacetata), pa se sakupe željene frakcije iz kolone, kombinuju i koncentrišu pod sniženim pritiskom, dajući svetio ulje koje se tretira etrom (stabilizovan, 18 mL) i koncentriše pod sniženim pritiskom, dajući Izomer B kao svetložutu čvrstu penu (2,2 g).

Hiralna HPLC, koja koristi uslove opisane u Primeru 3B, potvrdila je da je Izomer B formiran sa enantiomernim viškom (e.e) većim od 97%.

Optička rotacija je izmerena korišćenjem polarimetra Bellingham Stanlev ADP220, dajući [aDJ= +123,5°.

3D. Dobijanje mezilatne soli Izomera B

Metansuifonatna so Izomera B se dobija rastvaranjem smeše 1 ekvivalenta Izomera B iz Primera 3C i 1 ekvivalenta metansulfonske kiseline u minimalnoj zapremini etanola, pa se zatim doda dietiletar. Nastali beli talog se sakupi filtriranjem, pa osuši pod vakuumom, dajući mezilatnu so, sa prinosom od oko 85% i čistoćom (pomoću HPLC) od oko 96%.

Primer 4

Kristalografsko is<p>itivanje Izomera B pomoću X- zraka

Dobijena so (S)-(+)-kamfor-10-sulfonske kiseline i Izomera B i monokristal su podvrgnuti kristalografskom ispitivanju pomoću X-zraka, pod sledećim uslovima: Difraktometar: Nonius KappaCCD area detector (t/i skeniranje i OJ skeniranje da se ispuni asimetrična jedinica)

Određivanje ćelije: DirAx (Duisenberg, A.J.M.,J. Appl. Cryst,vol 25, str. 92-96

(1992)

Sakupljanje podataka: Collect (Collect: Data collection softvvare, R. Hooft, Nonnius B.V. 1998)

Redukcija podataka i poboljšanje ćelije: Demo (Z. Otwinowski i W. Minor, "Methods in Enzimologv", vol. 276: Macromolecular Crystalography, Deo A, str. 307-326; C.W. Čarter i R.M. Sweet, urednici, Academic Press).

Korekcija absorpcije: Sheldrick, G.M. SADABS - Bruker Nonius area detector scalin and absorption conection-V2./0.

Rešavanje strukture: SHELXS97 (G.M.Sheldrick,Acta Cryst.A467-473 (1990). Poboljšanje strukture; SHELXL97 (G.M.Sheldrick, Universitv of Gottingen, Nemačka)

Grafika: Cameron - A Molecular Graphics Package (D.M. VVatkin, L. Pearce i C.K. Prout, Chemical Crystalograpby Laboratorv, University of Oxford, 1993|

Specijalni detalji: Svi atomi vodonika su postavljeni u idealne položaje, pa poboljšavani Korišćenjem modela jahača, izuzev onih u NH i OH, koji su locirani u mapi razlika i poboljšani korišćenjem ograničenja. Hiralnost: NI=R, C12=S, C13=S, C15=R, C21=S, C24=R.

Rezultati ovog ispitivanja su dati niže, u Tabelama A, B, C, D i E. U ovim tabelama oznaka RUS0350 se odnosi na Izomer B.

TABELA B

Atomske koordinate (*10<4>), parametri ekvivalentnog izotopskog premeštanja[A<2>x10<3>]i faktori zauzimanja mesta. C^je definisan kao trećina traga ortogonalizova nog tenzoraUJ

Termalni elipsoidi nacrtani na nivou 30% verovatnoće

Na osnovu gore iznetih podataka veruje se da Izomer B ima konfigura2S,3s,1 IbR,koja odgovara Fomruli (la):

Primer 5

Analiza efekta izomera B na Huntington- ovu bolest, na modelu transgenskih

miševa

Transgenski (R6/2) miševi B6CBA-Tg(HDexon1)62Gpb/1J su transgenski na 5-tom kraju humanog HD gena, koji nosi ponovljene ekspanzije (CAG)115-(CAG)150. Transgenski miševi R6/2 pokazuju progresivan neurološki fenotip koji imitira mnoge karakteristike Huntington-ove bolesti, uključujući kretnje oblika nalik horeji, nevoljne stalno ponavljane kretnje (ili stereotipiju), tremor i epileptične napade. Oni često uriniraju i tokom bolesti pokazuju gubitak telesne mase. Ovi simptomi se javljaju između 6 i 8 nedelje starosti.

Obavljeno je ispitivanje da se utvrdi efekat Izomera B na Huntignon-ovu bolest na modelu ovih transgenskih miševa, testiranjem životinja u bateriji bihejvioralnih testova.

Postupci

Ženke transgenskih miševa B6Cba-Tg(Hdexonl)62Gpb/1J (Jackson Laboratorv, USA) su smeštene po pet u kavezu i obogaćenoj sredini, sa ciklusom svetlo-nrak 12 h -12 h (svetio se pali u 7,00 h pre podne, a gasi u 7,00 h posle podne), na sobnoj temperaturi (21±2°C), sa vlažnošću 50±15%. Miševi su imali slobodan pristup komercijalnoj hrani za miševe (miš/brzina odgajanja, ref. 9341 Provimi Kliba, Švajcarska) i pitkoj vodi.

Izomer B u kukuruznom ulju ordiniran je sa ponavljanjem (5 mg/kg i.p.) jednom dnevno, tokom 4 dana, do 10 nedelje starosti miševa.

U dane testiranja miševi su podvrgnuti sledećim testovima, koristeći protokol koji je opisan u odeljku protokola:

1. Uprošćeni lrwin-ov test

Dva sata pre posmatranja, životinje se stave u individualne kaveze. Merenja se prvo obavljaju u ovim individualnim kavezima. Registruju se konvulzije, tremori-trzanja, stereotipija i oglašavanja životinja. Životinje se zatim stave na otvorenu površinu 58,5x68,5 cm sa ivicom od 6 cm, pa se posmatraju približno 3 min. Ocenjuju se karakteristike hoda. Ponovo se notira prisustvo konvulzija ili tremora-trzanja i stereotipije. Na kraju perioda od 3 min, registruje se broj fekalnih gomilica i barica urina. Miševi se zatim, posle testiranja vrate u njihove individualne kaveze.

2. Lokomotorna aktivnost

Miševi se stave u transparentnu plastičnu kutiju, sa dimenzijama dna 30^30 cm, u sobi sa niskim intenzitetom svetlosti (maksimalno 20 luksa). Lokomotorna akivnost se određuje tokom perioda od 10 min, korišćenjem video-analizatora likova (Videotrack, View Point, Lyon, Francuska). Mere se broj, rastojanje i prosečna brzina pokreta pri hodu. Posle testiranja miševi se vrate u njihove kaveze za boravak.

3. Rotarod

Tokom dva uzastopna dana pre prvog ordiniranja, životinje se treniraju da koriste Rotarod: one se drže na ubrzavajućem Rotarodu (Ugo Basile, Italija), najduže 450 s. One prolaze kroz dve sesije treniranja, polazeći od 4 o/min tokom 300 s, a zatim ostaju 10 s pri 40 o/min. Ove dve sesije treniranja se obave u intervalu od 1 h. Na dan testiranja svaka životinja se podvrgne jednom pokušaju pod gore opisanim uslovima. Svaki pokušaj se završava ili kada miš padne, ili ako ostane na Rotarodu svih 450 s. Posle testiranja miševi se vrate u njihove kaveze za boravak.

Rezultati ovih testova su prikazani u Tabelama 5 do 9.

Protokol eksperimenta

Veličina eksperimentalne grupe: 10

Grupa 1: hemizigotni transgenski miševi B6CBA-Tg(Hdexon 1)62Gpb/1J se tretiraju sa 5 mg/kg i.p. agensa za testiranje, jedanput na dan, tokom 4 dana (od dana 0 do dana 3).

Protokol testiranja

U 10. nedelji starosti, pre ordiniranja (Dan 0) i tokom svakog od 3 dana posle ordiiranja, životinje se podvrgavaju testovima koji su opisani niže, kao što sledi: Dan -2.

Treniranje na Rotarodu, 2 sesije u intervalu od 1 h

Dan-1.

•Treniranje na Rotarodu, 2 sesije u intervalu od 1 h

Dan 0.

•Uprošćeni Invin-ov test

•Test lokomotome aktivnosti, neposredno posle uprošćenog lrwin-ovog testa •Rotarod test, neposredno posle testa lokomotome aktivnosti Ordiniranje testiranog agensa, 1 h posle Rotarod testa

•Uprošćeni Irvvin-ov test, 40 min poste ordiniranja

•Lokomotorna aktivnost, neposredno posle uproćenog lrwin-ovog testa Dan 1.

•Ordiniranje testiranog agensa

•Uprošćeni lrwin-ov test, 40 min posle ordiniranja

•Rotarod test, neposredno posle uprošćenog lrwin-ovog testa Dan 2.

•Ordiniarnje testiranog agensa

•Uprošćeni Invin-ov test, 40 min posle ordiniranja

•Rotarod test, neposredno posle uprošćenog lrwin-ovog testa Dan 3.

•Ordiniarnje testiranog agensa

•Uprošćeni lrwin-ov test, 40 min posle ordiniranja

•Test lokomotome aktivnosti, neposredno posle uprošćenog lrwin-ovog testa

Statistička analiza

Rezultati uprošćenog irwin-ovog testa su analizirani korišćenjem ne-parametarskog Mann-Whitney-ovog U-testa. Podaci o lokomotomoj aktivnosti su analizirani korišćenjem Dunnett-ovog t-testa. Rezultati sa Rotaroda su analizirani korišćenjem ne-parametarskog Mann-Whitney-ovog U-testa. Statističke analize su obavljane korišćenjem softvera Statview SE<+9raphlcs>softvvare, Brain Povver.

Ovi rezultati pokazuju da iako kontrolni miševi i miševi tretirani sa Izomerom B tokom prva tri dana nakon ordiniranja, pokazuju napredovanje simptoma tipični! za Huntington-ovu bolest, miševi koji su tretirani sa Izomerom B, tokom period< od 17 do 24 dana posle ordiniranja, pokazuju signifikantno manje pogoršanje nego kontrolni miševi. Tokom ovog perioda naročito je pogoršanje hoda bik suštinski zaustavljeno ili usporeno, a dešavanje nevoljnih kretnji, kao što su nevoljna horeja, tremori i trzanja, kod miševa tretiranih sa Izomerom B nije postalo gore posle 21. dana, nego što je bilo pre ordiniranja Izomera B. Veriovatno bi ponavljanjem ordiniranja Izomera B u odgovarajućim intervalima (što nije učinjeno u ovom testu) dalji razvoj ovih simptoma mogao biti zaustavljen ili usporen.

Dakle, ovi rezultati pokazuju da bi Izomer B mogao biti koristan za prevenciju početka, ili usporavanje razvoja simptoma povezanih sa Huntington-ovom bolešću.

Primer 6

Poređenje sedativnih svojstava tetrabenazina i

Izomera B i C dihidrotetrabenazina

Obavljeno je ispitivanje na pacovima, da se utvrdi da li izomeri dihidrotetrabenazina iz ovog pronalaska imaju sedativna svojstva. Poređeni su efekti ovih izomera na spontanu lokomotornu aktivnost pacova, sa efektima koje izazivaju tetrabenazin i haloperidol, koristeći postupak koji je opisan u nastavku. Rezultati su prikazani u Tabeli 10.

Postupci

Mužjaci pacova Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Saint-Germain/L'Arbresle, Francuska), mase 200-250 g na početku ispitivanja, korišćeni su u ovim studijama. Pacovi su smešteni po 2 ili 3 u kavezu, u kavezima tipa Makrolon III, u prostoru opremljenom sledećim uslovima životne sredine: temperatura: 20±2°C, vlažnost: minimalno 45%, izmena vazduha: >12 puta na sat, ciklus svetio/mrak od 12h/12h [počinje u 7,00 h u jutro]. Pacovi su ostavljeni da se tokom najmanje pet dana aklimatizuju na ove uslove, pre nego što počne ovo ispitivanje. Pacovima je na slobodnom rasplaganju hrana (Dietrex, Vigny, Francuska, ref. 811002) i voda (voda iz česme).

Rastvori svakog od testiranih jedinjenja u kukuruznom ulju prpremaju se sveži, na dan eksperimenta. Haloperidol se priprema u 0,5% hidroksietilcelulozi u dejonizovanoj vodi. Ordiniraju se, ili tečni nosač, ili testirano jedinjenje, u jednoj dozi (0,3, 1, 3 i 10 mg/kg i.p.). Ordinira se i haloperidol, kao refrentno jedinjenje (2 mL/kg i.p.).

Životinje se stave u kaveze od pleksiglasa pod videokamerom, u sobi sa slabim intenzitetom svetla (maksimalno 50 luksa). Četrdesetpet min i 3 h nakon ordiniranja određuje se - lokomotorna aktivnost tokom perioda od 20 min, korišćenjem video analizatora likova (Videotrack, View Point, Francuska). Registruje se lokomotorna aktivnost i u referentnoj grupi (haloperidol) 1 h posle ordiniranja. Mere se broj i trajanje pokreta i trajanje neaktivnosti. Na kraju merenja lokomotome aktivnosti (45 min i 3 h) vrednuju se zatvaranje očnih kapaka i uzbuđivanje u kavezu od pleksiglasa, kao što sledi:

Zatvaranje očnih kapaka:

0: (normalno) očni kapci su potpuno otvoreni

1: očni kapci blago padaju

2: ptoza, padanje očnih kapaka približno do pola

3: očni kapci potpuno zatvoreni.

Uznemiravanje:

1: vrlo nisko - stupor, koma, malo ili nikakvo reagovanje

2: nisko - nešto od stupora, "dosađuje se", nešto malo pokreta glave ili tela 3: srednje nisko - blagi stupor, nešto malo ispitivačkih pokreta sa periodima

nepokretnosti

4: normalno - živahnost, ispitivačke kretnje/ sporo smirivanje 5: srednje visoko - blaga ekscitiranost, tenzija, iznenadno skakanje ili smirivanje 6: visoko - hiper živahnost, uzbuđenje, iznenadni napadi trčanja ili telesnih pokreta

Broj događanja i trajanje (u sekundama) pokreta hodanja (velikih) i trajanje perioda neaktivnosti (u sekundama) određuje se tokom perioda od 20 min (45 min i 3 h posle ordiniranja), korišćenjem videoanalizatora likova (Videotrack, VievvPoinz, Lyon, Francuska). Praćenje likova se obavlja pomoću videokamere stavljene iznad kaveza od pleksiglasa, registrovanjem ukupne lokomotome aktivnosti. Likovi registrovani pomoću videokamere se digitalizuju, a pomeranja od tačke centra gravitacije digitalnog lika se slede i analiziraju, korišćenjem sledećeg postupka: meri se brzina pomeranja od tačke centra gravitacije, a postavljene su dve vrednosti praga koje definišu vrstu pokreta: prag 1 (velika brzina) i prag 2 (mala brzina). Kada se životinja kreće, a brzina pomeranja tačke od centra gravitacije je iznad praga 1, ovo kretanje se smatra hodajućim kretanjem. Ako je životinja neaktivna, ova brzina je ispod praga 2, pa se to kretanje smatra neaktivnošću.

Ovi rezultati su iskazani kao srednja vrednost ± SEM za 12 pojedinačnih vrednosti. Statističke analize su obavljene korišćenjem ANOVA (jednosmerni) i Dunnet-ovog t-testa, i ne-parametarskog testa Kruska-VVallis, posle čega sledi Mann-Wh'rtney U-test za sedaciju. Vrednost p<0,05 je usvojena kao indikativna za sign'rfikantnost.

Protokol

Veličina grupe: 12

Grupa 1: Referentna, haloperidol (1 mg/kg i.p.)

Grupa 2: Kontrolna grupa sa tečnim nosačem (2 mL/kg i.p.)

Grupa 3: Tetrabenazin (0,3 mg/kg i.p.)

Grupa 4: Tetrabenazin (1 mg/kg i.p.)

Grupa 5: Tetrabenazin (3 mg/kg i.p.)

Grupa 6: Tetrabenazin (10 mg/kg i.p.)

Grupa 7: Izomer C (0,3 mg/kg i.p.)

Grupa 8: Izomer C (1 mg/kg i.p.)

Grupa 9: Izomer C (3 mg/kg i.p.)

Grupa 10: Izomer C (10 mg/kg i.p.)

Grupa 11: Izomer B (0,3 mg/kg i.p.)

Grupa 12: Izomer B (1 mg/kg i.p.)

Grupa 13: Izomer B (3 mg/kg i.p.)

Grupa 14: Izomer B (10 mg/kg i.p.)

Rezultati

Ovi rezultati pokazuju da tetrabenazin izaziva sedativni efekat zavisan od doze i 45 min i 3 h posle ordiniranja, dok Izomer B i izomer C ne pokazuju sedativne efkete u bilo kom vremenu, mada Izomer C pokazuje blag, ali ne-signifikantan lokomotorni efekat 3 h posle ordiniranja.

Primer 7

Farmaceutski preparati

( i) Formulacija I tablete

Preparat tablete, koji sadrži dihidrotetrabenazin iz pvog pronalaska, dobija se mešanjem 50 mg dihidrotetrabenazina sa 197 mg laktoze (BP) kao razblaživača i 3 mg magnezium-stearata kao lubrikanta, pa se presuje u oblik tablete na poznat način.

( ti) Formulacija II tablete

Preparat tablete, koji sadrži dihidrotetrabenazin iz ovog pronalaska, dobija se mešanjem ovog jedinjenja (25 mg) sa oksidom gvožđa, magnezijum-stearatom, kukuruznim škrobom i talkom, pa se presuje u oblik tablete na poznat način.

( Hi) Formulacija kapsule

Formulacija kapsule se dobija mešanjem 100 mg dihidrotetrabenazina iz ovog pronalaska sa 100 mg laktoze, pa punjenjem ove smeše u standardne neprozirne tvrde želatinske kapsule.

Claims (15)

1. Jedinjenje, koje se upotrebljava za zadržavanje ili usporavanje napredovanja jednog ili više simptoma Huntington-ove bolesti kod pacijenta kod koga se simptomi biraju između nevoljnih pokreta i narušenog hoda, naznačeno time, što to jedinjenje predstavlja (+)-izomer 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Upotreba jedinjenja prema Zahtevu 1, pri čemu se pomenuti simptomi nevoljnih pokreta biraju između nevoljne horeje, tremora i trzanja.

3. Upotreba jedinjenja (+)-izomera 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, kao što je definisano u Zahtevu 1, za profilaktički tretman Huntingtonove bolesti kod pacijenta koji je identifikovan da nosi mutirani gen odgovoran za Huntington-ovu bolest.

4. Upotreba jedinjenja prema Zahtevu 3, za profilaktički tretman pacijenta starosti između 15 i 50 godina, koji nosi mutirani oblik HD gena, a kod koga se još uvek nisu razvili simptomi ove bolesti, tako da ovaj profilaktički tretman ima za svrhu sprečavanje ili usporavanje pojave simptoma povezanih sa Huntigton-ovom bolešću, pri čemu to jedinjenje predstavlja (+)-izomer 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kao što je definisano u Zahtevu 1.

5. Jedinjenje koje se koristi prema bilo kom od Zahteva 1 do 4, naznačeno time, što (+)-izomer 3,11b-c/c-dihidrotetrabenazina ima formulu (la):

6. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 do 6, naznačeno time, što pomenuti (+)-izomer 3,11b-c7s-dihidrotetrabenazina ima čistoću izomera veću od 90%.

7. Jedinjenje prema Zahtevu 6, naznačeno time, što pomenuti (+)-izomer 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina ima čistoću izomera veću od 95%.

8. Jedinjenje prema Zahtevu 7, naznačeno time, što pomenuti (+)-izomer 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina ima čistoću izomera veću od 98%.

9. Jedinjenje prema bilo kom od prethodnih Zahteva, naznačeno time, što je pomenuti (+)-izomer 3,11b-c/s~dihidrotetrabenazina u obliku kisele adicione soli.

10. Jedinjenje prema Zahtevu 9, naznačeno time, što pomenutu so predstavlja metansulfonatna so.

11. Jedinjenje koje se koristi prema bilo kom od prethodnih Zahteva, naznačeno time, što pacijent, kome se ordinira to jedinjenje, nosi mutirani oblik gena u kome je broj ponavljanja CAG na genu IT-15 najmanje 35.

12. Jedinjenje koje se koristi prema Zahtevu 11, naznačeno time, što pacijent, kome se ordinira to jedinjenje, nosi mutirani oblik gena u kome je broj ponavljanja CAG na genu IT-15 najmanje 40.

13. Jedinjenje koje se koristi prema Zahtevu 12, naznačeno time, što pacijent, kome se ordinira to jedinjenje, nosi mutirani oblik gena u kome je broj ponavljanja CAG na genu IT-15 najmanje 50.

14. Upotreba jedinjenja prema Zahtevu 4, gde pomenuti profilaktički tretman predstavlja prevencija ili usporavanje sub-kliničkog napredovanja ove bolesti u pacijentu.

15. Upotreba (+)-izomera 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina ili njegove farmaceutski prihvaltjive soli za proizvodnju medikamenta koji se koristi kako je definisano u bilo kom od Zahteva 1 do 14.