RS50728B - Nukleinske kiseline i polipeptidi novog receptora - Google Patents

Nukleinske kiseline i polipeptidi novog receptora

Info

Publication number
RS50728B
RS50728B YUP-199/03A YUP19903A RS50728B RS 50728 B RS50728 B RS 50728B YU P19903 A YUP19903 A YU P19903A RS 50728 B RS50728 B RS 50728B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
baff
seq
polypeptide
nucleic acid
binds
Prior art date
Application number
YUP-199/03A
Other languages
English (en)
Inventor
Christine M. Ambrose
Jeffrey S. Thompson
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27499682&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS50728(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma Inc. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of YU19903A publication Critical patent/YU19903A/sh
Publication of RS50728B publication Critical patent/RS50728B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Izolovani BAFF-R (Faktor aktivacije B ćelija receptor iz TNF porodice) polipeptid naznačen time što sadrži:(a) SEQ ID BR:5;(b) fragment SEQ ID BR:5 koji se vezuje za BAFF (Faktor aktivacije B ćelija iz TNF porodice)(c) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 70% identična sa SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5;(d) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5;(e) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5;(f) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5; ili(g) SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5, modifikovane sa jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, pri čemu se modifikovana sekvenca vezuje za BAFF.Prijava sadrži 27 nezavisnih i 46 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak obezbeđuje novi receptorski protein. Pronalazak se generalno odnosi na nukleinske kiseline i polipeptide. Pronalazak se još određenije odnosi na nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide koji se odnose na receptor za BAFF, faktor aktiviranja B-ćelije koji pripada porodici faktora nekrozisa tumora ("TNF"), koji je vezan sa ekspresijom B-ćelija i imunoglobulinima. Ovaj receptor se može upotrebiti u tretmanu kancera, limfoma, autoimunih poremećaja ili naslednih genetičkih poremećaja koji uključuju B-ćelije.
STANJE TEHNIKE
Predmetni pronalazak odnosi se na novi receptor u TNF porodici. Novi receptor je identifikovan kao BAFF receptor ("BAFF-R").
TNF porodica sastoji se od parova liganda i njihovih specifičnih receptora označenih kao TNF porodica veznika i TNF porodica receptora (Bazzoni i Beutler (1996)N. Engl. J. Med.334(26):1717-1725). Porodica je uključena u regulaciju imunog sistema i verovatno u druge ne-imunološke sisteme. Regulacija je često nivoa "master-isključivanje" tako da signaliranje TNF porodice može rezultirati velikim brojem uzastopnih događaja najbolje okarakterisanih sa TNF. TNF može inicirati opšti zaštitni inflamatorni odgovor organizma na stranu invaziju koji uključuje izmenjeno ispoljavanje adhezionih molekula uključenih u saobraćaj ćelija, produkciju hemokina da se dovedu specifične ćelije u specifične odeljke i iniciranje različitih efektorskih ćelija. Regulacija ovih puteva, kao takva, ima klinički potencijal.
Veruje se da je indukcija različitih ćelijskih odgovora posredovana takvom TNF porodicom citokina inicirana njihovim vezivanjem za specifične receptore. Najmanje dva različita TNF receptora od približno 55 kDa (TNFR1) i 75 kDa (TNRF2) su identif i kovani (Hohman i sar.,
(1989)J. Biol. Chem.264:14927-14934; i Brockhaus i sar., (1990)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87:3127-3131). Obimni polimorfizmi su povezani sa oba TNF receptorska gena. Oba TNFR dele tipičnu strukturu površinskih receptora ćelija uključujući ekstracelularne, transmembranske i intracelularne domene. Izvanćelijski deo tipa 1 i tipa 2 TNFR-ova sadrže repetitivne amino kiselinske sekvence tipa 4 cistein bogata domena (CDR-ove). Slična repetitivna shema CDR-ova postoji, između ostalih, kod nekoliko drugih ćelijskih površinskih proteina, uključujući p75 receptor faktora rasta nerva, CD40 antigen B-ćelija.
Receptori su snažna oruđa da se razjasne biološki putevi zbog lakoće njihove konverzije u fuzione proteine imunoglobulina. Ovi dimerni rastvorljivi oblici receptora su dobri inhibitori događaja posredovanih sa izlučenim ili za površinu vezanim iigandima. Vezujući se za ove ligande oni sprečavaju da liganda interreaguje sa receptorima vezanim sa ćelijom koja može signalirati. Ne samo što su ovi receptor-Fc fuzioni proteini korisni u eksperimentalnom smislu, nego su uspešno upotrebljavani klinički u slučajevima TNF-R-Fc da se tretira zapaljenje creva, reumatoidni artritis i akutni klinički sindrom koji prati davanje OKT3 (Eason i sar. (1996)Transplatation61(2):224-228; Feldmann i sar. (1996)Int. Arch. Allergy Immund.11(4):362-365; i van Dullemen i sar. (1995)Gastroenterol.109(1):129-135). Može se zamisliti da će manipulisanje mnogih događaja posredovanih signaliranjem putem TNF porodice receptora imati široku primenu u tretmanu imuno zasnovanih bolestii i takođe širok raspon bolesti ćoveka koje imaju patološke posledice zahvaljujući uključivanju imunog sistema. Rastvorljiv oblik nedavno opisanog receptora, osteoprotegerina, može blokirati gubitak mase kostiju i prema tome, događaji kontrolisani sa signaliranjem TNF porodice receptora nisu neophodno ograničeni na regulaciju imunog sistema (Simonet i sar. (1997)Cell 89(2):309-319).Antitela za receptor mogu blokirati vezivanje veznika i otud mogu takođe imati kliničku primenu. Takva antitela su često dugo živeća i mogu imati prednosti u odnosu na rastvorljive receptror-Fc fuzione proteine koji imaju kraće polu-živote u krvi.
Dok inhibicija puteva posredovanih receptorima predstavlja najviše eksploatisanu terapeutsku primenu ovih receptora, originalno je aktivacija TNF receptora bila ta koja je bila klinički obećavajuća (Aggarwal i Natarajan (1996)Eur. Cytokine Netw.7(2):93-124). Aktivacija TNF receptora može inicirati smrt ćelije u ciljnoj ćeliji i otud je primenjivost za tumore bila i još uvek je atraktivna (Eggermont i sar. (1996)Ann. Surg.224(6):756-765). Receptor može biti aktiviran bilo davanjem veznika, tj., prirodnim putem ili su neka antitela koja se unakrsno vezuju sa receptorm takođe potencijalni agonisti. Antitela će imati prednost u onkologiji s obzirom da mogu opstati u krvi duge periode dok veznici generalno imaju kraći životni vek u krvi. Pošto se mnogi od ovih receptora mogu više selektivno eksprimirati u tumorima ili mogu samo signalirati smrt ćelije ili diferencijaciju u tumorima, antitela agonisti mogu biti dobro oružje u tretmanu kancera. Slično tome, mnogi pozitivni imunološki događaji su posredovani preko receptora TNF porodice, npr., inflamatornih reakcija domaćina, produkcije antitela itd. i prema tome agonistička antitela mogu imati korisne efekte u drugim, ne-onkološkim primenama.
Paradoksalno, inhibiranje puteva može imati kliničke koristi u tretmanu tumora. Na primer, Fas veznik se eksprimira u nekim tumorima i ova ekspresija može voditi do smrti Fas pozitivnih limfocita olakšavajući tako sposobnost tumora da izbegne imuni sistem. U ovom slučaju, inhibicija Fas sistema može onda omogućiti imunom sistemu da reaguje na tumor na druge načine sada kada je pristup moguć (Green i Ware (1997)Proc. A/ at/. Acad. Sci.USA 94(12):5986-90).
TNF porodica veznika BAFF, takođe poznatog kao TALL-1, THANK, BIvS i zTNF4 (Schneider i sar (1999)J. Exp. Med.189(11):1747-1756; Shu i sar. (1999)J. Leukoc. Bio/.65(5):680-683; Mukhopadhyay i sar. (1999)J. Bio/. Chem.274(23):15978-15981; Moor i sar.
(1999)Science)285(5425):260-263; Gross i sar. (2000)Nature404(6781 ):995-999) pojačavaju preživljavanje B ćelijain vitro(Batten i sar. (2000)J. Exp. Med.192(10):1453-1466) i pojavljuju se kao ključni regulatori periferne populacije B ćelijain vivo.Miševi koji prekomerno eksprimiraju BAFF pokazuju hiperplaziju zrelih B ćelija i simptome sistematskog lupus eritematozus-a (SLE)
(Mackav i sar. (1999)J. Exp. Med.190(11):1697-1710. Takođe neki SLE pacjenti imaju zna-čajno pvećane nivoe BAFF u serumu (Zhang i sar. (2001)J. Immunol.166(1):6-10). Prema tome izneto je da abnormalni nivoi ovog veznika mogu doprinositi patogenezi autoimunih bolesti pojačavajući preživljavanje autoreaktivnih B ćelija (Batten i sar. (2000)J. Exp. Med.192(10): 1453-1466).
BAFF, membranski protein tipa II, produkovan je od strane ćelija mijeloidnog porekla (Schneider i sar. (1999)J. Exp. Med.189(11):1747-1756; Moore i sar. (1999)Science285(5425):260-263 i eksprimiran je ili na površini ćelije ili u rastvorljvom obliku (Schneider i sar.
(1999)J. Exp. Med.189(11):1747-1756. Za dva člana porodice TNF receptora BCMA i TACI prethodno je pokazano da interreaguju sa 3AFF (Gross i sar. (2000)Nature404:995-999; Thompson i sar. (2000)J. Exp. Med.192(1):129-135; Xia i sar. (2000)J. Exp. Med.192(1):137-143; Marsters i sar. (2000)Curr. Biol.10(13):785-788; Shu i sar. (2000)J. Leukoc. Biol.65(5):680-683; Wu i sar (2000)J. Biol Chem.275:35478-35485).
SADRŽAJ PRONALASKA
Predmetni pronalazak je delom zasnovan na otkriću "BAFF-R", BAFF receptorskog proteina polinukleotidnih sekvenci i BAFF-R polipeptida kodiranih sa tim sekvencama nukleinske kiseline.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira BAFF-R polipeptid ili fragment ili njegov derivat. Nukleinska kiselina može uključivati, npr. sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji je najmanje 50% identičan ili najmanje 90% identičan polipeptidu koji sadrži sekvencu amino kiseline slike 2D (SEQ ID BR:5).
Pronalazak takođe obezbeđuje gotovo potpuno čist molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja hibridizuje pod strogim uslovima za hibridizacionu probu, sekvencu nukleinske kiseline probe, koja se sastoji od kodirajuće sekvence slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) ili komplement pomenute kodirajuće sekvence.
U nekim oblicima sekvenca nukleinske kiseline kodira polipeptid koji ima sekvencu slike 2D (SEQ ID BR:5) sa najmanje jednom konzervativnom supstitucijom amino kiseline.
U nekim oblicima sekvenca amino kiseline kodira polipeptid koji vezuje BAFF.
Nukleinska kiselina može uključivati, npr., nukleinsku kiselinu koja uključuje nukleotidnu sekvencu prikazanu na slici 1A (SEQ ID BR:1), slici 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A (SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4) i slici 3 (SEQ ID BR:6).
Nukleinska kiselina može biti, genomski fragment DNK, ili može biti molekul cDNK. U pronalazak je takođe uključen vektor koji sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina opisanih ovde i ćeliju koja sadrži vektore nukleinskih kiselina opisanih ovde.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje u gotovo u potpunosti čist molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein koji sadrži najmanje dva segmenta, gde jedan od segmenata sadrži polipeptid ili njegov fragment kao što je opisano u sekvencama amino kiseline postavljenim u grnjim oblicima pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje fuzioni protein koji sadrži najmanje dva ili tri segmenta, gde prvi segment sadrži heterologi signalni polipeptid, drugi sadrži polipeptid ili njegov fragment kao što je opisano sekvencama BAFF-R amino kiseline postavljenim u gornjim oblicima pronalaska i treći segment sadrži imunoglobulinski polipeptid. Alternativno, prvi segment sadrži imunoglobulinski polipeptidni fragment koji sadrži signalnu sekvencu i drugi segment koji sadrži BAFF-R polipeptidni fragment.
U drugom obliku pronalazak obezbeđuje gotovo potpuno čisti agens vezivanja koji se specifično vezuje za polipeptid gore-utvrđenih oblika pronalaska.
Predmetni pronalazak je takođe usmeren na ćelije domaćine transformisane sa rekombinantnim ekspresionim vektorom koji sadrži bilo koje molekule nukleinske kiseline opisane gore.
U drugom obliku pronalazak uključuje farmaceutski preparat koji uključuje BAFF-R nukleinsku kiselinu i farmacaeutski prihvatljivi nosač ili razblaživač.
U sledećem aspektu pronalazak uključuje gotovo potpuno prečišćeni BAFF-R polipeptid, npr., bilo koji polipeptid koji kodira BAFF-R nukleinsku kiselinu.
Pronalazak takođe uključuje farmaceutski preparat koji uključuje BAFF-R polipeptid i farmacaeutski prihvatljivi nosač ili razblaživač.
U još jednom aspektu pronalazak obezbeđuje antitelo koje se specifično vezuje za BAFF-R polipeptid. Antitelo može biti, npr., monoklonalno ili polik'onalno antitelo. Pronalazak takođe uključuje farmaceutski preparat koji uključuje BAFF-R antitelo i farmacaeutski prihvatljivi nosač ili razblaživač. Predmetni pronalazak je takođe usmeren na izolovana antitela koja se vezuju za epitop na poiipeptidu koji je kodiran bilo kojim molekulom nukleinske kiseline opisanim gore.
Predmetni pronalazak je dalje usmeren na kitove koji sadrže antitela koja se vezuju za polipeptid koji je kodiran bilo kojim molekulima nukleinske kiseline opisanim gore i negativno kontrolno antitelo.
Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za produkovanje BAFF-R polipeptida. Postupak uključuje obezbeđivanje ćelije koja sadrži BAFF-R nukleinsku kiselinu, npr., vektor koji uključuje BAFF-R nukleinsku kiselinu i kultivisanje ćelije pod uslovima dovoljnim da se eksprimira BAFF-R polipeptid koji kodira nukleinska kiselina. Eksprimirani BAFF-R polipeptid se zatim obnavlja iz ćelije. Poželjno ćelija produkuje malo ili uopšte ne produkuje endogenog BAFF-R polipeptida. Ćelija može biti, npr., prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija.
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak indukovanja imunog odgovora kod sisara protiv polipeptida kodiranog bilo kojim molekulima nukleinske kiseline obelodanjenim gore putem davanja sisaru količine polipeptida dovoljne da indukuje imuni odgovor.
Predmetni pronalazak je takođe usmeren na postupke identifikovanja jedinjenja koje se vezuje za BAFF-R polipeptid kontaktiranjem BAFF-R polipeptida sa jedinjenjem i određivanja da li se jedinjenje vezuje za BAFF-R polipeptid.
Predmetni pronalazak je takođe usmeren na postupke identifikovanja jedinjenja koja vezuju molekul nukleinske kiseline koji kodira BAFF-R polipeptid kontaktiranjem BAFF-R nukleinske kiseline sa jedinjenjem i određivanjem da li se jedinjenje vezuje za molekul nukleinske kiseline.
Pronalazak dalje obezbeđuje postupke za identifikovanje jedinjenja koje moduliše aktivnost BAFF-R polipeptida kontaktiranjem BAFF-R polipeptida sa jedinjenjem i određivanjem da li je aktivnost BAFF-R polipeptida modifikovana.
Predmetni pronalazak je takođe usmeren na jedinjenja koja modulišu aktivnost BAFF-R polipeptida identifikovanu kontaktiranjem BAFF-R polipeptida, vezivanjem za BAFF-R polipeptid ili vezivanjem za molekul nukleinske kiseline koja kodira 3AFF-R polipeptid.
U drugom aspektu pronalazak obezbeđuje postupak dijagnostifikovanja stanja posre-dovanonog sa B-ćelijama, npr., autoimunog poremećaja ili kancera kod subjekta. Postupak uključuje obezbeđivanje uzorka proteina od subjekta i merenje količine BAFF-R polipeptida u uzorku subjekta. Količina BAFF-R u uzorku subjekta je zatim upoređena sa količinom BAFF-R polipeptida u kontrolnom proteinskom uzorku. Izmena u količini BAFF-R polipeptida u uzorku proteina subjekta u odnosu na količinu BAFF-R polipeptida u kontrolnom uzorku proteina naznačava da subjekt ima stanje posredobano sa B-ćelijama. Kontrolni uzorak poželjno je uzet od osobe koja se poklapa, tj., osobe sličnih godina, pola ili drugih opštih stanja ali koja nije pod sumnjom da ima to stanje. Alternativno, kontrolni uzorak može se uzeti od subjekta u vremenu kada subjekt nije bio pod sumnjom da ima poremećaj. U nekim oblicima BAFF-R polipeptid je detektovan korišćenjem BAFF-R antitela.
U daljem aspektu pronalazak uključuje postupak dijagnostifikovanja stanja posredovanih B-ćelijama, npr., autoimunog poremećaja kod subjekta. Postupak uključuje obezbeđivanje uzorka nukleinske kiseline, npr., RNK ili DNK, ili obe, od subjekta i merenje količine BAFF-R nukleinske kiseline u uzorku nukleinske kiseline subjekta. Količina BAFF-R nukleinske kiseline uzorka u nukleinskoj kiselini subjekta je zatim upoređena sa količinom BAFF-R nukleinske kiseline u kontrolnom uzorku. Izmena u količini BAFF-R nukleinske kiseline u uzorku u odnosu na količinu BAFF-R u kontrolnom uzorku ukazuje da subjekt ima autoimuno stanje.
U daljem aspektu pronalazak uključuje postupak za dijagnostifikovanje tumorogenog ili autoimunog stanja subjekta. Postupak uključuje obezbeđivanje uzorka nukleinske kiseline od subjekta i identifikovanja najmanje deia nukleotidne sekvence BAFF-R nukleinske kiseline u uzorku nukleinske kiseline subjekta. BAFF-R nukleotidna sekvenca uzorka subjekta je zatim poređena sa kontrolnim uzorkom. Izmena BAFF-R nukleotidne sekvence u uzorku u odnosu na BAFF-R nukleotidnu sekvencu u pomenutom kontrolnom uzorku ukazuje da subjekt ima takvo stanje.
U još jednom aspektu pronalazak obezbeđuje postupak tretiranja ili prevencije ili odlaganja stanja posredovanog sa B-ćelijama. Postupak uključuje davanje subjektu kod kojeg je takav tretman ili prevencija ili odlaganje potrebno, BAFF-R nukleinske kiseline, BAFF-R polipeptida ili anti-BAFF-R antitela u količini dovoljnoj da tretira, spreči ili odloži tumorogeno ili imunoregulatorno stanje kod subjekta.
Stanja dijagnostifikovana, tretirana, sprečena ili odložena korišćenjem molekula BAFF-R nukleinske kiseline, polipeptida ili antitela mogu biti kancer ili imunoregulatorni poremećaj. Bolesti uključuju one koje su po prirodi autoimune, kao što su sistematski lupus eritematozus, reumatoidni artritis, miastenija gravis, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska trombocitopenija purpura, anti-fosfolipidni sindrom, Chagas-ova bolest, Grave-ova bolest, VVegener-ov granulomatozis, poli-artritis nodoza i rapidni progresivni glomerulonefritis. Terapeutski agens takođe ima primenu u poremećajima plazma ćelija, kao što su multipli mijelom, Walđenstrom-ova makroglobulinemija, bolst teškog lanca, primarni ili sa imunocitama vezani amiloidozis i monoklonalna gamopatija neodređenog značaja (MGUS). Onkološki ciljevi uključuju B ćelije karcinoma, leukemija i limfoma.
Preparati i postupci tretiranja, korišćenjem nukleinskih kiselina, poplipeptida i antitela predmetnog pronalaska mogu se upotrebiti u bilo kom stanju vezanom sa neželjenom proliferacijom ćelija. Predmetni pronalazak posebno se može upotrebiti da se tretiraju ćelije tumora koje eksprimiraju BAFF i/ili BAFF-R.
Preparati pronalaska koji sadrže agoniste BAFF-R (kao što su antitela koja se vezuju za BAFF-R i imitiraju BAFF) takođe mogu biti upotrebljeni da se tretiraju imunodeficijencije označene niskim količinama B ćelija, na primer. Takvi poremećaji, na primer, mogu biti izazvani zračenjem i/ili hemoterapijom.
U drugom obliku pronalaska obezbeđen je postupak za smanjivanje agregacije rekombinantno eksprimiranog proteina. Postupak sadrži poređenje homologog proteina ili njegovog fuzionog proteina da se tako odrede konzervirani domeni i ne identične amino kiseline unutar konzerviranih regiona. Generalno, najmanje jedna ne-polarna amino kiselina je zamenjena u ne naelektrisanu polarnu amino kiselinu ili u prolin, alanin ili serin.
Ukoliko nije drugačije definisano svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje koje je uobičajeno u praksi kojoj pronalazak pripada. I ako su postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu biti upotrebljeni u praktikovanju ili testiranju predmetnog pronalaska, prigodni postupci i materijali su opisani niže. Sve publikacije patentne prijave, patenti i druge reference spomenute ovde inkorporirane su u celini referencom. U slučaju spora, predmetna specifikacija biće kontrola, uključujući definicije. Sem toga, materijali, postupci i primeri su samo radi ilustracije bez namere da budu ograničavajući.
Druge karakteristike i prednosti pronalaska biće očigledni iz sledećeg opisa i zahteva.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1Apokazuje DNK sekvencu BJAB cDNK (SEQ ID BR:1) kloniranu u pJST576.
Slika 1Bpokazuje kompletnu DNK sekvencu cDNK IMAGE klona 2000271 (EST AI250289) (SEQ ID BR:2).
Slika 2Apokazuje nukleotidnu sekvencu JST576 sa intronom uklonjenim kao što je predviđeno od strane GENESCAN programa (SEQ ID BR:3).
Slika 2Bpokazuje 1% agarozni gel PCR produkata dobijenih za BAFF-R koristeći ili prvi lanac cDNK generisane iz BJAB ili IM-9 RNK ili na JST576 cDNK. Put 1. lambda DNK Hindlll digestija. Put 2. BJAB oligo dT prajmovan BAF-225/BAF191. Put 3. BJAB oligo dT prajmo-van BAF-226/BAF-191. Put 4. BJAB po principu slučajnosti prajmovan BAF-225/BAF191. Put 5. BJAB po principu slučajnosti prajmovan BAFF-226/BAF191. Put 6. IM-9 oligo dT prajmovan BAF-225/BAF191. Put 7. IM-9 oligo dT prajmovan BAF-226/BAF191. Put 8. IM-9 po principu slučajnosti prajmovan BAF-225/BAF191. Put 9. IM-9 po principu slučajnosti prajmovan BAF-226/BAF191. Put 10. JST576 cDNK BAF-225/BAF191. Put 11. JST576 cDNK BAF-226/ BAF191. Put 12. bez matrice BAF-225/BAF191. Put 13. bez matrice BAF-226/BAF191.
Slika 2Cpokazuje zrelu (BAFF-R) sekvencu (SEQ ID BR:4) (takođe GenBank prijava br. AF373846) determinisanu sekvenciranjem većim delom PCR produkta koji okružuje predviđeni intron od BJAB prvog lanca cDNK.
Slika 2Dprikazuje sekvencu amino kiseline BAFF-R (JST576) (SEQ ID BR:5). A (Ala) ostatak u boldu naznačava sekvencu koja je nastala upotrebom alternativnog splajsovanja akceptornog mesta. Predviđeni transmembranski domen je u kvadaratu i verovatni stop transfer signal je podvučen.
Slika3 opisuje splajsovanu verziju JST576 (SEQ ID BR:6) koji sadrži 5' UTR sekvencu dobijenu putem RT-PCT iz prvog lanca cDNA slezine čoveka i dedukovanu sekvencu amino kiseline (SEQ ID BR:7). Ova sekvenca sadrži uzvodni stop kodon u okviru čitanja sa ATG.
Slika 4Aprikazuje sekvencu misije BAFF-R cDNK (SEQ ID BR:8) (takođe GenBank prijava br. AF373847).
Slika 4Bpokazuje sekvencu amino kiseline mišjeg BAFF-R (SEQ ID BR:9). Cys ostatci su podebljani i podvučeni i predviđeni transmembranski region je u kvadratu.
Slika 4C prikazuje homologiju između humanih (SEQ ID BR:10) i mišijih (SEQ ID BR:9) BAFF-R sekvenci proteina.
Slika 5 opisuje vezivanje humanog BAFF za JST576 transfektovane ćelije. 293EBNA ćelije su ko-transfektovane sa pJST576 ili CA336 (huTACI) i GFP reporter konstruktom. Ćelije su ispitivane na vezivanje BAFF sa 1 ug/ml biotiniliranog myc-huBAFF praćenog sa SAV-PE.
Slika 6 prikazuje vezivanje humanog i mišijeg BAFF za JST576 transfektovane ćelije. 293EBNA ćelije su ko-transfektovane sa pJST576 i GFP reporter konstruktom. Ćelije su ispitivane 24 časa kasnije na vezivanje BAFF sa 5 ug/ml flag-huBAFF ili flag-muBAFF praćenog sa anti-flag monoklonalnim antitelom M2 i magarećim anti-miš i igG-PE.
Slika 7 prikazuje da se APRIL ne vezuje za JST576 transfektovane ćelije. 293EBNA ćelije su takođe ko-transfektovane sa pJST576 ili CA336 (huTACI) i GFP receptor konstruktom. Ćelije su ispitane za vezivanje APRIL-a sa 1 ug/ml myc-muAPRIL praćenog sa anti-muAPRIL pacovskim-lgG2b, biotiniliranim anti-pacovski-FcG2b i SAV-PE.
Slika 8 prikazuje da BAFF taloži protein iz JST576 transfektovanih ćelija. 293EBNA ćelije su transfektovane ili sa BAFF-R (pJST576), samo vektorom (CH269) ili huTACI (CA336) i obeležene sa<35>S čistinom i metioninom. Ekstrakti su imunoistaloženi sa flag-huBAFF i pušteni na redukujući SDS-PAGE gel. fvlarkeri molekularne težine naznačeni su sa leve strane.
Slika 9 opisuje sekvencu nukleinske kiseline (SEQ ID BR:11) i njenu izvedenu sekvencu amino kiseline (SEQ ID BR:12) gena koji kodira humani BAFF-R:Fc: ostatake nukleinske kiseline 1-63 koji kodiraju mišiji IgG-kapa signal sekvencu; ostatci nukleinske kiseline 64-66 su upotrebljeni da se uvede mesto restrikcionog enzima, ostaci nukleinske kiseline 67-276 kodiraju deo BAFF-R ekstraćelijskog domena, ostatci nukleinske kiseline 277-279 su upotrebljeni da se uvede mesto restrikcionog enzima i ostatci nukleinske kiseline 280-960 kodiraju Fc region humanog IgG 1.
Slika 10 opisuje rezultate Northern blot analize korišćenjem EcoNI fragmenta JST56 kao probe. Sva izlaganja su trajala 4 dana. 10A: Clontech humani imuni II blot; 10B: Clontech humani 12 putić multi-tkivni blot; 10C: Clontech humani multi-tkivni II blot.
Slika 11 prikazuje rezultate Northern blot analize 20 u.g ukupne RNK izolovane iz različitih ćelijskih linija. Blot je ispitan sa EcoNI restrikcionim fragmentom JST576 i izložen tokom 4 dana. Sposobnost ćelijskih linija da vezuju BAFF, kao što je određeno FACS analizom, naznačena je ispod putića.
Slika 12 prikazuje rezultate imunotaloženja nastalog korišćenjem BAFF-R:Fc. Humani BAFF je imuno istaložen sa BAFF-R:Fc ili BCMA:Fc, ali ne sa Fn14-Fc. Kontrolni BAFF protein je prikazan u putiću 1.
Slika 13 prikazuje da humani BAFF-R:Fc blokira vezivanje humanog BAFF za BJAB ćelije. Rezultati FACS analize su prikazani na slici 13A. Kriva E predstavlja vezivanje biotiniliziranog BAFF za BJAB ćelije u odsustvu BAFF-R:Fc. Krive B-D predstavljaju sposobnost BAFF da se vezuje za BJAB ćelije u prisustvu 5 ug/ml, 1 ug/ml ili 0.2 ug/ml respektivno. Kriva A je drugi korak same krive. Slika 13B ilustruje sposobnost različitih koncentracija BAFF-R-Fc (kvadratići) u poređenju sa TACI:Fc (trouglovi) ili ne specifični fuzioni protein LT-R:Fc (kružići) da blokiraju vezivanje BAFF za receptor koji eksprimira BJAB ćelije,
Slika 14prikazuje sposobnost BAFF-R:Fc da blokira ko-stimulaciju B ćelija slezine indukovanu sa BAFF. Grafikon prikazuje inkorporaciju [<3>H] timidina (cpm) u odnosu na pove-ćane količina hBAFF (ng/ml).
Slika 15prikazuje da tretman sa BAFF-R:Fc1 rezultira gubitkom perifernih B ćelija kod normalnih miševa.
Slika 16prikazuje da tretman miševa sa humanim i mišijim BAFF-R:Fc redukuje broj B220+- B ćelija u slezini.
Slika 17prikazuje da davanje BAFF-R:Fc miševima redukuje procenat B220+ B ćelija u limfnom čvoru.
Slika 18prikazuje da davanje BAFF-R:Fc miševima redukuje B220+ B ćelije u perifernoj krvi.
Slika 19Aprikazuje FACS podatke iz supernatanta 4 klona koji produkuju antitela koja vezuju BAFF-R. Takođe je prikazan kontrolni supernatant koji ne sadrži antitela koja vezuju
BAFF-R.
Slika 19Bprikazuje histogram koji pokazuje dva kolona koji blokiraju vezivanje BAFF za BAFF-R. (a) pokazuje ne BAFF kontrolu; (b) pokazuje blokirajuću sposobnost antitela iz klona 2; (c) pokazuje sposobnost blokiranja antitela iz klona 9; i (d) pokazuje krivu kontrolnog antitela koje ne vezuje BAFF-R.
Slika 20prikazuje redosled sekvenci amino kiseline humanog BAFF-R:Fc (hBAFF-R) i mišijeg BAFF-R:Fc (mBAFF-R) ekstraćelijskih domena i procenat agregacije zapažen nakon ekspresije Fc fuzionih proteina koji sadrže naznačene sekvence. Nabrojani JST klonovi predstavljaju sekvence amino kiseline koje pokazuju mutacije (prikazano podvučeno) u roditeljskim sekvencama i nastale agregacije eksprimiranog proteina. Prikazane su delimične sekvence humanog (amino kiseline 2-71 sekvence SEQ ID BR:10; SEQ ID BR:13) i mišijeg (amino kiseline 2-66 sekvence SEQ ID BR:9; SEQ ID BR:14) BAFF-R; i odgovarajući delovi sledećih klonova: JST659 (SEQ ID BR:15), JST660 (SEQ ID BR:16), JST661 (SEQ ID BR:17), JST662 (SEQ ID BR:18), JST663 (SEQ ID BR:19), JST673 (SEQ ID BR:20), JST674 (SEQ ID BR:21), JST675 (SEQ ID BR:22), JST672 (SEQ ID BR:23), JST676 (SEQ ID BR:24), JST671 (SEQ ID BR:25), JST677 (SEQ ID BR:26), JST678 (SEQ ID BR:27), JST664 (SEQ ID BR:28), JST668 (SEQ ID BR:29), JST665 (SEQ ID BR:30), JST666 (SEQ ID BR:31) i JST667 (SEQ ID BR:32).
Slika 21prikazuje autoradiograf proteina imunoistaloženih korišćenjem lizata pripremljenih iz BAFF-R-i.c.d. (BAFF-R intaćeljiski domen) (putić 1), ili kontrolnog vektora- (putić 2) transfektovanih ćelija. Približno 6x10<6>293E ćelija su transfektovane sa konstruktom koji kodira BAFF-R-i.c.d. ili mock plazmid. Nakon 48 časova ćelije su metabolički obeležene sa<35>S tokom 24 časa, lizirane sa puferom za liziranje, prečišćene i imuno istaložene sa anti-myc mAb, 9E10. Imunotalozi su razdvojeni sa 10-20% SDS PAGE u redukujućim uslovima.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
Navedeni radovi, patenti, patentne prijave i naučna literatura, uključujući prijavne brojeve za GenBank baze podataka sekvenci, koji su ovde navedeni predstavljaju znanje onih sa iskustvom u praksi, pa su prema tome inkorporirani referncom u celini u istom obimu kao što je svaka posebno i pojedinačno naznačena da je inkorporirana referencom. Bilo kakav spor između bilo koje reference ovde citirane i specifičnih uputstava ove prijave mora biti razrešen u korist ove poslednje. Takođe, bilo koji spor između praktične definicije reči ili fraze i definicije reći ili fraze specifično iznete u ovoj prijavi treba da se reše u korist ove poslednje.
Standardne reference radova, koji postavljaju opšte principe rekombinantne DNK tehnologije poznate su onima sa iskustvom u praksi i uključuju Abushel i sar., Tekući<p>rotokoli u molekularnojbiolo<g>iji, John Wiley and Sons, New York (1998); Sambrook i sar., Molekularno kloniranje:laboratorijski<p>riručnik, 2 izd., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Plainvievv, New York (1989); Kaufman i sar., izd., Priručnik molekularnih i ćelijskih metoda u biolo<g>iji i medicini, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, izd., Usmerena mutageneza: praktični pristup, IRL Press, Oxford (1991).
Predmetni pronalazak otkriva BAFF-R nukleinske kiseline, izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju BAFF-R polipeptid ili njegov deo, BAFF-R polipeptide, vektore koji sadrže ove nukleinske kiseline, ćelije domaćine transformisane sa BAFF-R nukleinskim kiselinama, anti-BAFF-R antitela i farmaceutske preparate. Takođe su obelodanjeni postupci pripremanja BAFF-R polipeptida, kao i postupci skrinovanja, dijagnosticiranja, tretiranja stanja korišćenjem ovih jedinjenja i postupci skrininga jedinjenja koja modulišu aktivnost BAFF-R polipeptida.
BAFF-R nukleinske kiseline i polipeptidi, kao i BAFF-R antitela, kao i farmaceutski preparati o kojima se ovde diskutuje, korisni su,inter a/ ia,u tretiranju kancera i/ili imunoregulatornih stanja. Ovi poremećaji ukijučuju, npr., bolesti posredovane B ćelijama koje su po prirodi autoimune kao što je sistemski lupus eritematozus, reumatoidni artritis, miastenia gravis, autoimuna hemolitična anemija, idiopatska trombocitopenija purpura, antifosfolipidni sindrom, Chagas-ova bolest, Grave-ova bolest, VVegener-ov granulomatozis, poliarteritis nodoza, i rapidni progresivni glomeruionefritis. Ovaj terapeutski agens takođe ima primenu u poremećajima plazma ćelija kao što je multipli mijelom, Waidenstrom-ova makroglobulinemija, bolest teškog lanca, primarni ili imuno-vezani amiloidozis i monoklonalna gamopatija neodređenog značaja (MGUS). Onkološki ciljevi uključuju B ćelije karcinoma, leukemija i limfoma.
BAFF-R nukleinskekiseline
Jedan aspekt pronalaska odnosi se na izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju BAFF-R proteine ili njihove biološki aktivne delove. Takođe su uključeni fragmenti nukleinske kiseline dovoljni da se upotrebe kao hibridizacione probe da se identifikuju BAFF-R kodirajuće nukleinske kiseline (npr., BAFF-R mRNK) i fragmenti za upotrebu kao prajmeri za lančanu polimeraznu reakciju (PCR) za amplifikaciju ili mutiranje BAFF-R molekula nukleinske kiseline. Onako kako se ovde koristi, termin "molekul nukleinske kiseline" zamišljen je da uključi molekule DNK (npr., cDNK ili genomske DNK), molekule RNK (npr., mRNK), analoge DNK ili RNK generisane korišćenjem analoga nukleotida i njihove derivate, fragmente i homologe. Molekul nukleinske kiseline može biti jedno-lančani ili dvo-lančani, ali je poženije da bude dvo-lančana DNK.
"Probe" se odnose na sekvence nukleinske kiseline varijabilne dužine, poželjno između najmanje 10 nukleotida (nt) ili čak oko, npr., 6000 nt, u zavisnosti od upotrebe. Probe se koriste u detektovanju identičnih, sličnih ili komplementarnih sekvenci nukleinske kiseline. Probe veće dužine obično se dobijaju iz prirodnog ili rekombinantnog izvora, visoko su specifične i mnogo sporije hibridizuju od oligomera. Probe mogu biti jedno- ili dvo-lančane i određene su da imaju specifičnost za PCR, tehnologije hibridizacije zasnovane na membrani ili tehnologije slične
ELISA.
"Izolovani" molekul nukleinske kiseline je onaj koji je odvojen od drugih molekula nukleinske kiseline koji su prisutni u prirodnom izvoru nukleinske kiseline. Primeri izolovanih molekula nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, molekule rekombinantne DNK
sadržane u vektoru, molekule rekombinantne DNK koji se održavaju u heterolognoj ćeliji domaćinu, delimično ili potpuno prečišćene molekule nukleinske kiseline i sintetičke molekule DNK ili RNK. Poželjno, "izolovana" nukleinska kiselina je bez sekvenci koje prirodno okružuju nukleinsku kiselinu (tj., sekvence locirane na 5' i 3' krajevima nukleinske kiseline) u genomskoj DNK organizma iz kojeg je izvedena nukleinska kiselina. Na primer, u različitim oblicima, izolovani BAFF-R molekul nukleinske kiselinemože mogu sadržati manje od oko 50 kb, 25 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ili 0.1 kb nukleotidnih sekvenci koje prirodno okružuju molekul nukleinske kiseline u genomskoj DNK ćelije iz koje je nukleinska kiselina izvedena. Štaviše, "izolovani" molekul nukleinske kiseline, kao što je molekul cDNK, može biti gotovo u potpunosti bez drugih ćelijskih materijala ili medijuma za kulturu kada je produkovan rekombinantnim tehnikama ili hemijskim prekursorima ili drugim hemikalijama, kada je hemijski sintetizovan.
Molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska, npr., molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), ili komplement bilo koje od ovih nukleotidnih sekvenci, može biti izolovan pomoću standardnih tehnika molekularne biologije i informacije o sekvenci koja je obezbeđena ovde. Korišćenjem cele ili dela sekvence nukleinske kiseline sa slika 1A, B, 2A, C i 3 kao hibridizacionih proba, BAFF-R sekvnce nukleinske kiseline mogu biti izolovane korišćenjem tehnika standardne hibridizacije i kloniranja (npr., kao što je opisano u Sambrook i sar, izd., Molekularnokloniranje:laboratorijski<p>raktikum 2 izd., Cold Sprig Harbor Laboratorv Press, Cold Sprig Harbor, NY, 1989; i Ausubel i sar., izd Tekući<p>rotokoli u molekularnoj biolo<g>iji, John Wiley and Sons, New York, NY, 1993).
Nukleinska kiselina pronalaska može biti amplifikovana korišćenjem cDNK, mRNK ili alternativno, genomske DNK, kao šablona i odgovarajućih oligonukleotidnih prajmera prema standardnim PCR amplifikacionim tehnikama. Tako amplifikovane nukleinske kiseline mogu biti klonirane u odgovarajući vektor i okarakterisane analizom sekvenci DNK. Dalje, oligonukleotidi koji odgovaraju BAFF-R sekvencama nukleotida mogu biti pripremljeni standardnim sintetičkim tehnikama, npr., korišćenjem automatizovanog DNK sintetizatora.
Onako kako se ovde koristi termin "oligonukleotid" odnosi se na seriju vezanih nukleotidnih ostataka, pri čemi oligonukleotid ima dovoljan broj nukleotidnih baza da bi se upotrebio u PCR reakciji. Kratka oligonukleotidna sekvenca može biti zasnovana na ili dizajnirana iz genomske ili cDNK sekvence i upotrebljena je da se amplificira, potvrdi ili otkrije prisustvo identične, slične ili komplementarne DNK ili RNK u određenoj ćeliji ili tkivu. Oligonukleotidi sadrže delove sekvence nukleinske kiseline koji imaju najmanje oko 10 nt i čak 50 nt, poželjno oko 15 nt do 30 nt. Oni mogu biti hemijski sintetizovani i mogu se upotrebiti kao probe.
U drugom obliku molekul izolovane nukleinske kiseline pronalaska sadrži molekul nukleinske kiseline koji je komplement nukleotidne sekvence prikazane na slici 1A (SEQ ID BR:1), slici 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A (SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR;4) i slici 3 (SEQ ID BR:6). U drugom obliku molekul izolovane nukleinske kiseline pronalaska sadrži molekul nukleinske kiseline koji je komplement nukleotidne sekvence prikazane na slici 1A (SEQ ID BR:1), 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A (SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4) i slici 3 (SEQ ID BR:6), ili deo ove nukleotidne sekvence. Molekul nukleinske kiseline koji je komplementaran nukleotidnoj sekvenci prikazanoj na slici 1A (SEQ ID BR:1), 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A(SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4) i slici 3 (SEQ ID BR:6) je onaj koji je dovoljno komplementaran sekvenci prikazanoj na slici 1A (SEQ ID BR:1), 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A (SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4) i slici 3 (SEQ ID BR:6) i koji se može vezati vodoničnom vezom sa malo ili bez promašenih sparivanja za nukleotidnu sekvencu prikazanu na slici 1A (SEQ ID BR:1), 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A (SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4) i slici 3 (SEQ ID BR:6) formirajući tako stabilni dupleks.
Onako kako se koristi ovde termin "komplementarni" odnosi se na VVatson-Crick-ovo ili Hoogsteen-ovo sparivanje baza među nukleotidnim jedinicama molekula nukleinske kiseline i termin "vezivanje" označava fizačku ili hemijsku interakciju među polipeptidima ili jedinjenjima ili povezane polipeptide ili jedinjenja ili njihove kombinacije. Vezivanje uključuje jonske, ne-jonske, Van der VVaalas-ove, hidrofobne interakcije itd. Fizičke interakcije mogu biti ili direktne ili indirektne. Indirektne interakcije mogu biti putem ili zahvaljujući efektima drugog polipeptida ili jedinjenja. Direktno vezivanje odnosi se na interakcije koje se ne odigravaju kroz, ili zahvaljujući, efektima drugog polipeptida ili jedinjenja, već se odvijaju bez bitnih hemijskih intermedijera.
Štaviše, molekul nukleinske kiseline pronalaska sadrži samo deo sekvence nukleinske kiseline sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), npr., fragment koji se može upotrebiti kao proba ili prajmer ili fragment biološki aktivnog dela BAFF-R. Ovde obezbeđeni fragmenti definisani su kao sekvence od najmanje 6 (kontinuirano) nukleinskih kiselina ili najmanje 4 (kontinuirano) amino kiseline, dužina dovoljna da omogući specifičnu hibridizaciju u slučaju nukleinskih kiselina ili za specifično prepoznavanje epitopa u slučaju amino kiselina, respektivno, i većinom su delom kra-će od ukupne dužine sekvence. Fragmenti mogu biti izvedeni iz bilo kog kontinuiranog dela nukleinske kiseline ili sekvence amino kiseline koja je izabrana. Derivati su sekvence nukleinske kiselina ili sekvence amino kiseline formirane od prirodnog jedinjenja bilo direktno ili modifi-kovanjem ili delimičnom supstitucijom. Analozi su sekvence nukleinske kiselina ili sekvence amino kiseline koje imaju strukturu sličnu ali ne identičnu sa nativnim jedinjenjem nego se razlikuju od njega u odnosu na komponente bočnih lanaca. Analozi mogu biti sintetički ili različitog evolucionog porekla i mogu imati sličnu ili suprotnu metaboličku aktivnost u poređenju sa divljim tipom.
Derivati i analozi mogu biti pune dužine ili drugačiji u odnosu na punu dužinu, ako derivat ili analog sadrži modifikovane nukleinske kiseline ili amino kiseline, kao što je dole opisano. Derivati ili analozi nukleinskih kiselina ili proteina pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, molekule koji sadrže regione koji su gotovo u potpunosti homologi nukleinskim kiselinama ili proteinima pronalaska u različitim oblicima, najmanje sa oko 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98% ili čak 99% identičnosti (sa poželjnom identičnošću od 80-99%) u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline ili amino kiseline identične veličine ili kada se porede sa poredanom sekvencom u kojoj je redosled određen kompjuterskim programom homologije poznatim u praksi, ili čija kodirajuća nukleinska kiselina je sposobna da hibridizuje sa komplementom sekvence koja kodira gore pomenute proteine u strogim, srednje strogim ili slabo strogim uslovima. Vidi npr.. Ausubel i sar., itd Tekući<p>rotokoli u molekularnojbiolo<g>iji, John Wiley and Sons, New York, NY, 1993 i dole. Primerni program je Gap program (VVisconsin Sequence Analvsis Package, verzija 8 za UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, Wl) upotrebom standardnih okvira, koji koriste algoritam Smith-a i Waterman-a
(1981)Adv. Appl. Math.2:482-489, koji je ovde inkorporiran referencom u celini.
"Homologa sekvenca nukleinske kiseline" ili "homologa sekvenca amino kiseline", ili njihove varijacije odnose se na sekvence okarakterisane homologijom na nivou nukleotida ili nivou amino kiseline kao što je diskutovano gore. Homoioge nukleotidne sekvence kodiraju one sekvence koje kodiraju izoforme BAFF-R polipeptida. Izoforme mogu biti eksprimirane u različitim tkivima istog organizma kao rezultat, na primer, alternativnog uplitanja RNK. Alternativno, izoforme mogu biti kodirane različitim genima. U predmetnom pronalasku, sekvence homologih nukleotida uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju BAFF-R polipeptid drugih vrsta sem čoveka, uključujući, ali bez ograničenja na, sisare i prema tome mogu uključiti, npr., miša,
pacova, zeca, psa, mačku, kravu, konja i druge organizme. Homologne nukleotidne sekvence takođe mogu uključiti, ali nisu ograničene na, alelne varijacije koje se prirodno javljaju i mutacije nukleotidnih sekvenci postavljenih ovde. Homologne nukleotidne sekvence, međutim, ne uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju humani BAFF-R protein. Homologne nukleotidne sekvence uključuju one nukleotidne sekvence koje kodiraju konzervativne supstitucije amino kiseline (vidi niže (sa slike 2D (SEQ ID BR:5)) kao i polipeptid koji ima BAFF-R aktivnost. Homologne sekvence amino kiseline ne kodiraju sekvence amino kiseline humanog BAFF-R polipetida.
Nukleotidne sekvence određene na osnovu kloniranja humanog BAFF-R gena omogućuju generisanje proba i prajmera dizajniranih za upotrebu u identifikovanju i/ili kloniranju BAFF-R homologa u drugim tipovima ćelija, npr., iz drugih tkiva, kao i BAFF-R homolozi drugih sisara. Proba/prajmer obično sadrži gotovo potpuno prečišćen oligonukleotid. Oligonukleotid obično sadrži region nukleotidne sekvence koji hibridizuje pod strogim uslovima sa namanje 12, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 ili 400 uzastopnih sens lanaca nukleotidne sekvence bilo kojeg sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), ili anti-sens lanca nukleotidne sekvence bilo kojeg sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), ili mutanta koji se javlja u prirodi bilo kojeg sa slike 1A (SEQ ID BR:1),Slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6).
Probe zasnovane na humanoj BAFF-R nukleotidnoj sekvenci mogu se upotrebiti da se detektuje transkript ili genomske sekvence koje kodiraju iste ili homologe proteine. U različitim oblicima, proba dalje sadrži obeleženu pričvršćenu grupu, npr., obeležena grupa može biti radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim ili enzimski-ko-faktor. Takve probe mogu se upotrebiti kao deo dijagnostičkog test kita za identifikovanje ćelija ili tkiva koje imaju izmenjenu ekspresiju BAFF-R protein, kao što je merenje nivoa BAFF-R kodirajuće nukleinske kiseline u uzorku ćelija iz subjekta npr., detektovanje nivoa BAFF-R mRNK ili određivanje da li je genomski BAFF-R gen mutiran ili dletiran.
"Polipeptid koji ima biološki aktivni deo BAFF-R" odnosi se na polipeptide koji pokazuju aktivnost sličnu, ali ne obavezno i identičnu aktivnosti polipeptida predmetnog pronalaska, uključujući i zrele oblike, mereno određenim biološkim ogledom, sa ili bez dozne zavisnosti. Fragment nukleinske kiseline koji kodira "biološki aktivni deo BAFF-R" može biti pripremljen izolovanjem dela bilo kojeg sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), koji kodira polipeptid koji ima BAFF-R biološku aktivnost (biološke aktivnosti BAFF-R proteina su opisane niže), eksprimirajući kodirani deo BAFF-R proteina (npr. rekombinantnom ekspresijomin vitro)i određivanjem aktivnosti kodiranog dela BAFF-R. Na primer, fragment nukleinske kiseline koji kodira biološki aktivni deo BAFF-R može po potrebi uključiti domen vezivanja BAFF. U drugom aspektu fragment nukleinske kiseline koji kodira biološki aktivan deo BAFF-R uključuje jedan ili više regiona.
Varijante BAFF-R
Pronalazak dalje sadrži molekule nukleinske kiseline koji se razlikuju od nukleotidnih sekvenci prikazanih na slici 1A (SEQ ID BR:1), 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A (SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4) i slici 3 (SEQ ID BR:6) zahvaljujući degeneraciji genetičkog koda. Ove nukleinske kiseline tako kodiraju isti BAFF-R protein kao što je onaj kodiran nukleotidnim sekvencama prikazanim na slici 1A (SEQ ID BR:1), 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A (SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4) i slici 3 (SEQ ID BR:6). U drugom obliku, molekul izolovane nukleinske kiseline pronalaska ima nukleotidnu sekvencu koja kodira protein sekvence amino kiseline prikazane na slici 2D (SEQ ID BR:5).
Sem toga sekvenca humanog BAFF-R nukleotida prikazana na slici 1A (SEQ ID BR:1), 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A (SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4) i slici 3 (SEQ ID BR:6), biće prihvaćeno od strane onih sa iskustvom u praksi da polimorfizam sekvence DNK koji dovodi do promena u sekvencama aminokiselina BAFF-R može postojati unutar populacije (npr. humane populacije). Takav genetički polimorfizam u BAFF-R genu može postojati među jedinkama unutar populacije zahvaljujući prirodnom alelskom variranju. Onako kako se ovde koriste termini "gen" i "rekombinantni gen" odnose se na molekule nukleinske kiseline koji sadrže otvoreni okvir čitanja, koji kodira BAFF-R protein, poželjno sisarski BAFF-R protein. Takva prirodna alelska variranja mogu obično rezultovati u 1-5% varijanse u nukleotidnoj sekvenci BAFF-R gena. Bilo koja i sve takve nukleotidne varijacije i nastali polimorfizam amino kiselina u BAFF-R koji su rezultat prirodnog alelskog variranja i koji ne naraušavaju funkcionalnu aktivnost BAFF-R uključeni su obim pronalaska.
Štaviše, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju BAFF-R proteine iz drugih vrsta i na taj način imaju nukleotidnu sekvencu koja se razlikuje od humanih sekvenci na slici 1A (SEQ ID BR:1), slici 1B (SEQ ID BR:2), slici 2A (SEQ ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4) i slici 3 (SEQ ID BR:6) su u okviru obima pronalaska. Molekuli nukleinske kiseline koji odgovaraju prirodnim alelskim varijantama i homolozima BAFF-R cDNK pronalaska mogu biti izolovani na osnovu njihove homologije sa humanim BAFF-R nukleinskim kiselinama otkrivenim ovde koristeći humane cDNK, ili njihove delove kao hibridizacione probe prema standardnim tehnikama hibridizacije pod strogim hibridizacionim uslovima. Na primer, rastvorljiva humana BAFF-R cDNK može biti izolovana na osnovu njene homologije sa humanim BAFF-R, koji se vezuje za membranu. Takođe, himana BAFF-R cDNK koja se vezuje za membranu može biti izolovana na osnovu njene homologije sa pogodnim humanim BAFF-R.
Shodno tome, u drugom obliku, izolovani molekul nukleinske kiseline pronalaska je dug najmanje 6 nukleotida i hibridizuje pod strogim uslovima sa molekulom nukleinske kiseline koji sadrži bilo koju nukleotidnu sekvencu sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6). U drugom obliku nukleinska kiselina je dugačka najmanje 10, 25, 50, 100, 250 ili 500 nukleotida. U drugom obliku izolovani molekul nukleinske kiseline pronalaska hibridizuje sa kodirajućim regionom. Onako kako se ovde koristi termin "hibridizuje pod strogim uslovima" je namenjen da opiše uslove za hibridizaciju i ispiranje pri kojim nukleotidne sekvence homologe najmanje 60% jedna sa drugom obično ostaju hibridizovane jedna sa drugom.
Homolozi (tj. nukleinske kiseline koje kodiraju BAFF-R protreine izvedene iz drugih vrsta sem čoveka) ili druge srodne sekvence (npr. paralozi) mogu biti dobijeni niskom, srednjom ili visokom strogoćom hibridizacije sa ćelom ili delom određene humane sekvence, kao probom, koristeći postupke dobro poznate u praksi hibridizacije i kloniranja nukleinske kiseline.
Onako kako se ovde koristi fraza "strogi hibridizacioni uslovi" odnosi se na uslove pod kojim će proba, prajmer ili oligonukleotid hibridizovati sa svojom ciljnom sekvencom, ali ne sa drugim sekvencama. Uslovi strogoće su zavisni od sekvence i biće različiti u različitim okolnostima. Duže sekvence hibridizuju specifičnije pri višim temperaturama nego kratke sekvence. Generalno, uslovi strogoće odbrani su da budu oko 5°C niži od termalne temperature topljenja (Trn) za specifične sekvence pri definisanoj jonskoj snazi i pH. Tm je temperatura (pri definisanoj jonskoj snazi, pH i koncentraciji nukleinske kiseline) pri kojoj 50% proba komplementarnih ciljnoj sekvenci hibridizuje sa ciljnom sekvencom u ravnoteži. Obično će uslovi strogoće biti oni u kojima je koncentracija soli manja od oko 1.0 M natrijumovih jona, obično oko 0.01 do 1.0 M natrijumovih jona (ili drugih soli) pri pH 7.0 do 8.3 i temperaturi od najmanje oko 30°C za kratke probe, prajmere ili oligonukleotide (npr. 10 nt do 50 nt) i najmanje oko 60°C za duže probe, prajmere i oligonukleotide. Uslovi strogoće mogu takođe biti dostignuti dodavanjem destabilizujućih agenasa kao ćto je formamid.
Uslovi strogoće poznati su onima sa iskustvom u praksi i mogu se naći u Tekući<p>rotokoli u molekularnojbiolo<g>iji, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6. Poželjni uslovi su takvi da sekvence od najmanje oko 65%, 70% 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% homologije jedna u odnosu na drugu obično ostaju hibridizovane jedna sa drugom. Ne-limitirajući primer strogih uslova hibridizacije je hibridizacija u zasićenom puferu soli koji sadrži 6XSSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficol-a, 0.02% BSA, i 500 mg/ml denaturisane sperme DNK lososa na 65°C. Ova hibridizacija je praćena sa jednim ili više ispiranja u 0.2X SSC, 0.01 BSA na 50°C. Izoiovanom molekulu nukleinske kiseline pronalaska koji hibridizuje u strogim uslovima sa sekvencama SEQ ID BR:1, SEQ ID BR:2, SEQ ID BR:3, SEQ ID BR:4 i SEO ID BR:6 odgovaraju molekulu nukleinske kiseline koji se javlja u prirodi. Onako kako se koristi ovde "prirodno-javljajući" molekul nukleinske kiseline odnosi se na molekule RNK ili DNK koji imaju sekvence nukleotida koje se javljaju u prirodi (npr., kodiraju prirodni protein).
U drugom obliku, obezbeđena je sekvenca nukleinske kiseline koja može hibridizovati sa molekulom nukleinske kiseline koji sadrži bilo koju nukleotidnu sekvencu sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6) ili fragmente, analoge ili njihove derivate, pod uslovima srednje strogoće hibridizacije. Ne-ograničavajući primer uslova srednje strogoće hibridizacije je hibridizacija u 6X SSC, 5X Denhardt-ovom rastvoru, 0.5% SDS i 100 mg/ml denaturisane DNK sperme lososa na 55°C, praćene sa jednim ili više ispiranja u 1X SSC, 0.1% SDS na 37°C. Drugi uslovi srednje strogoće koji se mogu upotrebiti dobro su poznati u praksi. Vidi, npr., Ausubel i sar., izd Tekući<p>rotokoli u molekularnoj biolo<g>iji, John Wiley and Sons, New York, NY, 1993 i Kriegler, Transfer<g>ena i eks<p>resija, Laboratorijski<p>riručnik, Stockton Press. NY, 1990.
U trećem obliku, obezbeđena je nukleinska kiselina koja hibridizuje sa molekulom nukleinske kiseline koji sadrži bilo koju nukleotidnu sekvencu sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6) ili fragmente, analoge ili njihove derivate, pod uslovima niske strogoće. Ne ograničavajući primer niskih uslova strogoće hibridizacije je hibridizacija u 35% formamida, 5X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficol-a 0.2% BSA. 100 mg/ml denaturisane DNK sperme lososa, 10% (wtA/ol) dekstran sulfata na 40°C, praćeno sa jednim ili više ispiranja u 2X SSC, 25 mM Tris-HCI (pH 7.4, 5 mM EDTA i 0.1% SDS na 50°C. Drugi uslovi niske strogoće koji se mogu upotrebiti dobro su poznati u praksi (npr., kao što se upotrebljavaju za hibridizaciju među vrstama). Vidi, npr., Ausubel i sar., izd Tekući<p>rotokoli u molekularnojbiolo<g>iji, John Wiley and Sons, New York, NY, 1993 i Kriegler, Transfer<g>ena i eks<p>resija, Laboratorijski<p>riručnik, Stockton Press. NY, 1990, Shilo i VVeinberg (1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA78:689-6792.
Konzervativne mutacije
U dodatku na alelske varijante koje se prirodno javljaju BAFF-R sekvence koja može egzistirati u populaciji, iskusni praktičar će dalje shvatiti da promene mogu biti uvedene putem mutacija nukleotidne sekvence sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEO. ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEO. ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6) dovodeći tako do pramena u sekvenci amino kiseline kodiranog BAFF-R proteina bez menjanja funkcionalne sposobnosti BAFF-R proteina. Na primer, nukleotidne supstitucije koje vode supstitucijama amino kiseline na "ne-esencijalnim" ostacima amino kiseline mogu biti napravljene na bilo kojim sekvencama sa slike 1A (SEO. ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2). slike 2A (SEO. ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6). "Ne-esencijalni" ostatak amino kiseline je ostatak koji se može izmeniti iz sekvence divljeg tipa BAFF-R bez izmene biološke aktivnosti, dok je "esencijalni" otatak amino kiseline potreban za biološku aktivnost. Na primer, ostaci amino kiseline koji su konzervirani među BAFF-R proteinima predmetnog pronalaska predviđeni su da budu posebno nepristupačni za izmenu.
Sem toga, ostaci amino kiseline koji su konzervirani među članovima porodice BAFF-R proteina predmetnog pronalaska su takođe predviđeni da budu posebno nepristupačni za promenu. Na primer, BAFF-R proteini predmetnog pronalaska mogu sadržati najmanje jedan domen koji je obično konzerviran region porodice TNF članova. Nije verovatno da su kao lakvi ovi konzervirani domeni dostupni za mutacije. Drugi ostaci amino kiseline, međutim, (npr. oni koji nisu konzervirani ili su polu konzervirani među članovima BAFF-R proteina) ne moraju biti esencijalni za aktivnost i prema tome je verovatno da su dostupni izmenama.
Drugi aspekt pronalaska odnosi se na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju BAFF-R proteine, koji sadrže promene ostataka amino kiseline koji nisu esencijalni za aktivnost. Takvi BAFF-R proteini razlikuju se u sekvenci amino kiseline od one sa slike 2D (SEO. ID BR:5), a ipak zadržavaju biološku aktivnost. U jednom obliku izolovani molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein gde protein sadrži sekvencu amino kiseline sa najmanje oko 45% homologije sekvenci amino kiseline sa slike 2D (SEQ ID BR:5). Poželjno, protein kodiran molekulom nukleinske kiseline je sa najmanje oko 60% homologije sa onim sa slike 2D (SEQ ID BR:5), još poželjnije najmanje sa oko 70%, 80%, 90%, 95%, 98% i najpo-željnije sa najmanje 99% homologije sa onim sa slike 2D (SEQ ID BR:5).
Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira BAFF-R protein homolog proteinu sa slike 2D može biti kreiran uvođenjem jedne ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija nukleotidne sekvence sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEO. ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), tako da su jedna ili više supstitucija adicija ili delecija amino kiseline uvedene u kodirajući protein.
Mutacije mogu biti uvedene u slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEO. ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), na primer standardnim tehnikama, kao što je mutageneza usmerena na mesto i mutageneza posredovana PCR-om. Poželjno, konzervativne supstitucije amino kiseline su napravljene na jednom ili više predviđenih ostataka ne-esencijalne amino kisleine. "Konzerva-tivna supstitucija amino kiseline" je ona u kojoj je ostatak amino kiseline zamenjen sa ostatkom amino kisleine koja ima sličan bočni lanac. Porodice ostataka amino kiseline koje imaju slične bočne lance definisane su u praksi. Te porodice uključuju amino kiseline sa baznim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), ne naelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), ne polarnim bočnim lancima (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranatim bočnim lancima (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Tako, predviđeni ostak ne esencijalne amino kiseline u BAFF-R je zamenjen sa drugim ostatkom amino kiseline iz porodice sa istim bočnim lancem. Alternativno, u drugom obliku, mutacije mogu biti introdukovane po principu slučajnosti duž cele ili dela BAFF-R kodirajuće sekvence, kao što je putem saturacione mutageneze i rezultirajuće mutacije mogu biti skrinovane na biološku aktivnost BAFF-R da se identifikuju mutacije koje zadržavaju aktivnost. Kodirani protein može biti eksoprimiran bilo kojom rekombinantnom tehnologijom poznatom u praksi i aktivnost proteina može biti određena sledeći mutagenezu bilo kojeg sa slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEO. ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6).
U jednom obliku muatnt BAFF-R proteina može biti ispitan za (1) sposobnost da formira protein:protein interakcije sa drugim BAFF-R proteinima, drugim proteinima površine ćelije ili njihovim biološki aktivnim delovima, (2) kompleks formacije između mutantnog BAFF-R proteina i BAFF-R veznika; (3) sposobnosti mutantnog BAFF-R proteina da se vezuje za unutarćelijski ciljni protein ili njegov aktivni deo (npr. avidin proteini); (4) sposobnost da vezuje BAFF; ili (5) sposobnost da specifično vezuje BAFF-R protein antitelo.
Pronalazak obezbeđuje specifične mutante koji kodiraju BAFF-R:Fc polipeptid dizajniran da umanji agregaciju eksprimiranog proteina dok održava aktivnost vezivanja BAFF. Takvi mutanti uključuju, na primer, klonove koji kodiraju sekvence amino kiseline JST661 (SEQ ID BR:17), JST662 (SEQ ID BR:18), JST663 (SEQ ID BR:19), JST673 (SEQ ID BR:20), JST674 (SEQ ID BR:21), JST675 (SEQ ID BR:22), JST672 (SEQ ID BR:23), JST676 (SEQ ID BR:24), JST671 (SEQ ID BR:25), JST677 (SEQ ID BR:26) i JST678 (SEG* ID BR:27). Drugi oblici uključuju mutante koji kodiraju BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptide koji imaju slične karakteristike agregacije sa BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptidom, ali takođe vezuju BAFF uključujući na primer sekvence koje sadrže sekvence amino kiseline JST659 (SEQ ID BR:15), JST660 (SEQ ID BR:16), JST664 (SEQ ID BR:28), JST668 (SEQ ID BR:29), JST665 (SEQ ID BR:30), JST666 (SEQ ID BR:31) i JST667 (SEO. ID BR:32). Drugi oblici uljučuju mutante koji kodiraju BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptide gde su konzervirane amino kiseline između humanog i mišijeg BAFF-R promenjene u druge konzervirane amino kiseline i gde je aktivnost vezivanja BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptida za BAFF sačuvana. U drugim oblicima, mutanti koji kodiraju BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptid koji ima amino kiseline koje nisu konzervirane između humanog i mišijeg BAFF-R koji su promenjene u druge amino kiseline. Poželjno je da je najmanje jedna nepolarna amino kiselina promenjena u prolin ostatak ili nenaelektrisanu polarnu amino kiselinu.
Antisens
Drugi aspekt pronalaska odnosi se na izolovane antisens molekule nukleinske kiseline koji mogu hibridizovati sa ili koji su komplementarni sa molekulom nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu sa si. 2A, C, 3 ili njihove fragmente analoge ili derivate. "Antisens" nukleinska kiselina sadrži sekvencu nukleotida koja je komplementarna sa "sens" nukleotidnom sekvencom koja kodira protein, npr., komplementarnu kodirajućem lancu dvo-lančanog molekula cDNK ili komplementarnu sekvenci mRNK. U specifičnom aspektu, obezbeđeni su antisens molekuli nukleinske kiseline koji sadrže komplementarnu sekvencu od najmanje 10, 25, 50, 100, 250 ili 500 nukleotida ili ceo BAFF-R kodirajući lanac, ili za samo jedan njegov deo. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju fragmente, homologe, derivate i analoge bilo kog BAFF-R proteina sa slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEO. ID BR:6) ili antisens nukleinske kiseline komplementarne sa sekvencom BAFF-R nukleinske kiseline bilo kog sa slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6) su dodatno obezbeđeni.
U jednom obliku, antisens molekul nukleinske kiseline je antisens u odnosu na "kodirajući region" kodirajućeg lanca nukleotidne sekvence koja kodira BAFF-R. Termin "kodirajući region" odnosi se na region nukleotidne sekvence koja sadrži kodone koji su translacirani u aminokiselinske ostatke (npr., kodirajući region proteina humanog BAFF-R koji odgovara nukleotidima 13 do 568 slike 2A (SEQ ID BR:3), ili nukleotide 13 do 565 slike 2C (SEQ ID BR:4) ili nukleotide 298 do 849 si. 3 (SEQ ID BR:6). U drugom obliku antisens molekul nukleinske kiseline je antisens u odnosu na "nekodirajući region" kodirajućeg lanca nukleotidne sekvence koja kodira BAFF-R. Termin "nekodirajući region" odnosi se na 5' i 3' sekvence koje su bočno prema kodirajućem regionu koje nisu translacirane u amino kiseline (tj. takođe označene kao 5' i 3' netranslacirani regioni).
Ako je data sekvenca kodirajućeg lanca koji kodira ovde otkriven BAFF-R, antisens nukleinska kiselina pronalaska može biti dizajnirana prema pravilima Watson-a i Crick-a ili
Hoogsteen-ovim sparivanjem baza. Molekul antisens nukleinske kiseline može biti komplementaran ćelom kodirajućem regionu BAFF-R mRNK, ali je radije oligonukleotid koji je antisens jedinom delu kodirajućeg ili nekodirajućeg regiona BAFF-R mRNK. Na primer, antisens oligonukleotid može biti komplementaran regionu koji okružuje translaciono polazno mesto BAFF-R mRNK. Antisens oligonukleotid može biti dugačak, na primer, oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 40, 45 ili 50 nukleotida. Antisens nukleinska kiselina pronalaska može biti konstruisana korišćenjem hemijske sinteze ili reakcija enzimatskog vezivanja koristeći procedure poznate u praksi. Na primer, antisens nukleinska kiselina (npr, antisens oligonukleotid) može biti hemijski sintetizovan korišćenjem nukleotida koji se prirodno javljaju ili različito modifikovanih nukleotida dizajniranih da povećaju biološku stabilnost molekula ili da povećaju fizičku stabilnost dupleksa formiranog između antisens i sens nukleinskih kiselina, npr., mogu se upotrebiti derivati fosfortioata i nukleotidi supstituisani sa akridinom.
Primeri modifikovanih nukleotida koji se mogu upotrebiti da se generiše antisens nukleinska kiselina uključuju: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-hlorouracil, 5-jodouracil, hipoksantin, ksantin, 4-acetilcitozin, 5-(karboksihidroksimetil)uracil, 5-karboksimetilaminometil-2tiouridin, 5-karboksimetilaminoetiluracil, dihidrouracil, beta-D-galaktozilkveozin, inozin, N6-izopenteniladenin, 1-metilguanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetilguanin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N6-adenin, 7-metilguanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil. Beta-D-manosilkueeozin, 5-metilkarboksimetiluracil, 5-metoksiuracil, 2-metiltio-N6-izopentenil-adenin, uracil-5-oksisirćetna kiselina (v), vibutoksrn, pseudouracil, kveozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metil estar uracil-5oksisirćetne kiseline, uracil-5-oksisirćetna kiselina (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboksipropil) uracil, (acp3)w i 2-6-diaminopurin. Alternativno, antisens nukleinska kiselina može biti produkovana biološki korišćenjem ekspresionog vektora u koji je subklonirana nukleinska kiselina u untisens orijentaciji (tj. RNK transkribovana iz ubačene nukleinske kiseline biće antisens orijentacije u odnosu na ciljnu nukleinsku kiselinu od interesa, opisanu dalje u podpoglavljima koja slede).
Antisens molekuli nukleinske kiseline pronalaska obično se daju subjektu ili se generišuin situtako da oni hibridizuju sa ili se vezuju2a ćelijsku mRNK i/ili genomsku DNK koja kodira BAFF-R protein da tako inhibiraju ekspresiju proteina, npr., putem inhibicije transkripcije i/ili translacije. Hibridizacija se može odigrati putem konvencionalne nukleotidne komplementarnosti da se formira stabilni dupleks, ili, na primer, u slučaju antisens molekula nukleinske kiseline koji se vezuje za DNK dupleks, putem specifične interakcije u glavnom zavoju dvostrukog lanca. Primer načina davanja antisens molekula nukleinske kiseline pronalaska uključuje direktnu injekciju na mestu tkiva. Alternativno, antisens molekuli nukleinske kiseline mogu biti modifikovani da stignu u odabrane ćelije i da se tada daju sistemski. Na primer, za sistemsko davanje, antisens molekuli mogu biti tako modifikovani da se specifično vezuju za receptore ili antigene eksprimlrane na odabranoj površini ćelije, npr., vezivanjem antisens molekula nukleinske kiseline za peptide ili antitela da se vežu za površinu receptora ili antigena. Antisens molekuli nukleinske kiseline mogu takođe biti isporučeni ćelijama korišćenjem ovde opisanih vektora. Da se dostigne dovoljna unutarćelijska koncentracija antisens molekula poželjni su vektorski konstrukti u kojima je antisens molekul nukleinske kiseline stavljen pod kontrolu jakog pol II ili pol III promotora.
U još jednom obliku, antisens molekul nukleinske kiseline pronalaska je a-anomerni molekul nukleinske kiseline. A-anomerni molekul nukleinske kiseline formira specifične dvo-lančane hibride sa komplementarnom RNK u kojima, nasuprot uobičajenim b-jedinicama, lanac ide jedan paralelno drugom (Gaultier i sar. (1987)Nuct. Acids Res.15:6625-6641). Antisens molekul nukleinske kiseline može takođe sadržati 2'O-metilribonukleotid (Inoue i sar. (1987)Nucl.Acids Res.15:6131-6148) ili himerne RNK-DNK analoge (Inoue i sar. (1987)FEBS lett.215:327-330).
Ribozimi i PNA grupe
U još jednom obliku, antisens nukleinska kiselina pronalaska je ribozim. Ribozimi su katalitički molekuli RNK sa ribonukleaznom aktivnosti koji su sposobni da raskidaju jedno-lančanu nukleinsku kiselinu, kao što je mRNK, sa kojom imaju komplementarni region. Tako, ribozimi (npr., čekičoglavi ribozimi (opisani kod Haselhoff i Gerlach (1988)Nature334:585-591)) mogu biti upotrebljeni da katalitčki raskinu BAFF-R mRNK transkripte i da tako inhibiraju translaciju BAFF-R mRNK. Ribozim koji je specifičan za BAFF-R-kodirajuću nukleinsku kiselinu može biti dizajniran na osnovu nukleotidne sekvence BAFF-DNK obelodanjene ovde (npr., SEG* ID BR:3, SEQ ID BR:4, SEQ ID BR:6). Na primer, može biti konstruisan derivat Tetrahymena L-19 IVS RNK u kojem je nukieotidna sekvenca aktivnog mesta komplementarna nukleotidnoj sekvenci koja treba da se raskine u BAFF-R-kodirajućoj mRNK. Vidi npr., Cech i sar., U.S. pat. Br. 4,987,071; i Cech i sar U.S. pat. Br. 5,116,742. Alternativno, BAFF-R mRNK se može upotrebiti da se selektuje katalitička RNK, koja ima specifičnu ribonukleaznu aktivnost, iz pula RNK molekula. Vidi npr., Bartel i sar., (1993)Science261:1411-1418.
Alternativno, ekspresija BAFF-R gena može biti inhibirana ciljanjem nukleotidnih sekvenci, komplementarnih regulatornom regionu BAFF-R (npr., BAFF-R promotor i/ili pojačivač), da se formira trostruka helikoidna struktura koja sprečava transkripciju BAFF-R gena u ciljnim ćelijama. Vidi generalno, Helene (1991)Anticancer Drug Des.6:569-84; Helene i sar., (1992)Ann. N. Y. Acad. Sci 660:27-36;i Maher (1992)Bioassays14:807-15.
U različitim oblicima nukleinske kiseline BAFF-R mogu biti modifikovane u baznim grupama, šećernoj grupi, ili fosfatnoj vezi" da se poboljša, npr., stabilnost, hibridizacija ili rastvorljivostr molekula. Na primer, fosfatna veza deoksiriboze nukleinske kiseline može biti modifikovana da generiše peptid nukleinske kiseline (vidi Hyrup i sar. (1966)Bioorg. Med. Chem.4:5-23). Onako kako se ovde koriste termini "peptid nukleinske kiseline" ili "PNA-ovi" odnose se na mimetike nukleinske kiseline, npr mimetike DNK, u kojima je fosfatna veza deoksiriboze zamenjena sa pseudopeptidnom vezom i zadržane su samo četiri prirodne nukleobaze. Pokazano je da prirodna veza PNA-ova omogućuje specifičnu hibridizaciju za DNK ili RNK u uslovima male jonske snage. Sinteza PNA oligomera može se izvesti korišćenjem standardnog protokola čvrste faze sinteze peptida kao što je opisano u Hyrup i sar. (1996)Bioorg. Med. Chem.4:5-23; Perry-0'Keefe i sar., (1966)Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:14670-675.
PNA-ovi BAFF-R mogu se upotrebiti u terapeutske i dijagnostičke svrhe. Na primer, PNA-ovi mogu biti upotrebljeni kao antisens ili antigen agensi za modulaciju ekspresije gena specifičnu za sekvence putem npr., indukovanja zaustavljanja transkripcije ili translacije ili inhibicije replikacije, PNA-ovi BAFF-R mogu se takođe upotrebiti, npr., u analizi mutacije pojedinačnih parova baza u genu putem npr. PNA usmerenog PCR spoja: kao veštački restrikcioni enzimi kada se koriste u kombinaciji sa drugim enzimima, npr., S1 nukleaze (Hyrup B. (1996)Bioorg. Med. Chem.4:5-23); ili kao probe ili prajmeri za DNK sekvence i hibridizaciju (Hyrup i sar. (1996)Bioorg. Med. Chem.4:5-23; Perry-0'Keefe i sar.. (1966)Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:14670-675).
U drugom obliku, PNA-ovi BAFF-R mogu biti modifikovani, npr., da se pojača njihova stabilnost ili uzimanje od strane ćelije, putem pričvršćivanja lipofilnih ili drugih pomoćnih grupa za PNA, formiranjem PNA-DNK himera ili putem upotrebe lipozoma ili drugim tehnikama isporuke lekova poznatim u praksi. Mogu biti, na primer, generisane PNA-DNK himere BAFF-R koje mogu kombinovati korisne karakteristike PNA i DNK. Takve himere omogućuju prepoznavanje DNK enzima, npr., Rnaze H i DNK polimeraza, da intereaguju sa delom DNK dok će PNA deo obezbediti veći afinitet vezivanja i specifičnosti. PNA-DNK himere mogu biti povezane korišćenjem veznika odgovarajućih dužina odabranih u terminima iz mnoštva baza, broja veza između nukleobaza i orijentacije (Hyrup i sar. (1996)Bioorg. Med. Chem.4:5-23). Sinteza PNA-DNK himera može biti izvedena kao što su opisali Hyrup (1996)Bioorg. Med. Chem.4:5-23 i Finn i sar. (1996)Nucl. Acids Res.24:3357-63. Na primer, lanac DNK može biti sintetizovan na čvrstoj podršci korišćenjem standardne hernije fosforamidnog vezivanja i modifikovanih analoga nukleozida, npr., 5'(4-metoksitritil) amino-5'-deoksi-timidin fosforamidit može biti upotrebljen između PNA i 5' kraja DNK (Mag i sar. (1989)Nucl. Acids Res.17:5973-88). PNA monomeri su zatim spareni na način korak po korak da se produkuje himerni molekul sa 5' PNA segmentom i 3' DNK segmentom (Finn i sar. (1966) gore). Alternativno, himerični molekuli mogu biti sintetizovani sa 5' DNK segmentom i 3<*>PNA segmentom. Vidi Peterson i sar. (1975)Biooeg. Med. Chem. Leti.5:1119-11124.
U drugim oblicima, oligonukleotid može uključiti druge pridodate grupe kao što su peptidi (npr., za usmeravanje receptora ćelija domaćinain vivd),ili agensi olakšavnja transporta kroz ćelijsku membranu <vidi Letsinger i sar., (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:6553-6556; Lemaitre i sar., (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:648-652; PCT publikacija br. WO 88/09810) ili barijera krv-mozak (vidi, npr., PCT publikaciju br. WO 89/10134). Sem toga, oligonukleotidi mogu biti modifikovani putem hibridizacije pokrenute agensima za isecanje (vidi npr., Krol i sar., (1988)Bio Technigues6:958-976) ili interkalarnim agensima (vidi npr., Zon
(1988)Pharm. Res.5:539-549). Do ovog kraja, oligonukleotid može biti konjugovan za drugi molekul, npr., peptid, pokrenut hibridizacijom unakrsno veznog agensa, agensa za transport, agensa za isecanje pokrenutog hibridizacijom itd.
BAFF-R polipeptidi
Jedan aspekt pronalaska odnosi se na BAFF-R proteine i njihov biološki aktivni deo, ili njihove derivate, fragmente, analoge ili homologe. Takođe su obezbeđeni fragmenti polipeptida pogodni za upotrebu kao imunoagensi da se dobiju anti-BAFF-R antitela. U jednom obliku prirodni BAFF-R proteini mogu biti izolovani iz ćelija ili tkivnih izvora odgovarajućom shemom prečišćavanja koristeći standardnu tehniku prečišćavanja proteina. U drugom obliku, BAFF-R proteini su produkovani tehnikama rekombinantne DNK. Alternativno u odnosu na rekombinantnu ekspresiju, BAFF-R protein ili polipeptid može biti sintetisan hemijski korišćenjem standardnih tehnika sinteze peptida.
"Izolovani" ili "prečišćeni" protein ili njegov biološki aktivni deo je gotovo potpuno bez ćelijskog materijala ili drugih kontaminirajućih proteina iz ćelijskog ili tkivnog izvora iz kojeg je dobijen BAFF-R protein, Hi gotovo potpuno bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisan. Jezička fraza "gotovo potpuno bez ćelijskog materijala" uključuje pripremanje BAFF-R proteina u kojem je protein odvojen od ćelijskih komponenti ćelije iz koje je izolovan ili prođu kovan rekombinantne U jednom obliku jezička fraza "gotovo potpuno bez ćelijskog materijala" uključuje pripremanje BAFF-R proteina koji ima manje od oko 30% (suve težine) ne BAFF-R proteina (takođe označenog kao "zagađujući protein"), još poželjnije manje od 20% ne BAFF-R proteina, još više poželjno manje od 10% ne BAFF-R proteina i najpoželjnije manje od 5% ne BAFF-R proteina. Kada je BAFF-R protein ili njegov biološki aktivan deo produkovan rekombinantno, takođe je poželjno da bude gotovo potpuno bez medijuma za kulturu, tj. da medijum za kulturu predstavlja manje od 20%, još poželjnije manje od 10% i najpoželjnije manje od 5% zapremine pripremljenog proteina.
Jezička fraza "gotovo potpuno bez ćelijskog materijala" uključuje preparacije BAFF-R proteina u kojima je protein razdvojen od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija koje su uključene u sintezu proteina. U jednom obliku jezička fraza "gotovo potpuno bez ćelijskog materijala" uključuje pripremanje BAFF-R proteina koji ima manje od 30% (suve težine) hemijskog prekursora ili ne BAFF-R hemikalija, još poželjnije manje od 20% hemijskih prekursora ili ne BAFF-R hemikalija, još više poželjno manje od 10% hemijskih prekursora ili ne BAFF-R hemikalija i najpoželjnije manje od 5% hemijskih prekursora ili ne BAFF-R hemikalija.
Biološki aktivni delovi BAFF-R proteina uključuju peptide koji sadrže sekvence amino kiseline dovoljno homologe sa ili izvedene iz sekvence amino kiseline BAFF-R proteina, npr., sekvence amino kiseline prikazane u SEQ ID BR:5 koja uključuje manje amino kiselina nego što su BAFF-R proteini pune dužine i pokazuje najmanje jednu aktivnost BAFF-R proteina. Obično biološki aktivni delovi sadrže domen ili motiv sa najmanje jednom aktivnosti BAFF-R proteina. Biološki aktivni deo BAFF-R proteina može biti polipeptid koji je, na primer, dugačak 10, 25, 50, 100 ili više amino kiselina.
Biološki aktivni deo BAFF-R proteina predmetnog pronalaska može sadržati najmanje jedan od gore-identifiko<y>anih domena sačuvanih između BAFF-R proteina. Alternativni biološki aktivni deo BAFF-R proteina može sadržati najmanje dva od gore identifikovanih domena. Drugi biološki aktivni deo BAFF-R proteina može sadržati najmanje tri od gore-identifikovanih domena. Još jedan biološki aktivni deo BAFF-R proteina predmetnog pronalaska može sadržati najmanje četiri od gore identifikovanih domena.
Štaviše, drugi biološki aktivni delovi, u kojima su drugi regioni proteina delecirani, mogu biti pripremljeni rekombinantnim tehnikama i procenjeni za jednu ili više funkcionalnih aktivnosti prirodnog BAFF-R proteina.
U jednom obliku BAFF-R protein ima sekvencu amino kiseline prikazanu na slici 2D (SEQ ID BR:5). U drugom obliku BAFF-R protein je gotovo u potpunosti homolog slici 2D (SEQ ID BR:5) i zadržava funkcionalnu aktivnost proteina sa slike 2D (SEQ ID BR:5), a ipak se razlikuje u sekvenci amino kiseline zbog prirodnog alelskog variranja ili mutageneze, kao što je detaljno opisano niže. Shodno tome, u drugom obliku BAFF-R protein je deo koji sadrži sekvencu amino kiseline od najmanje 45% homologije sa sekvencom amino kiseline sa slike2D (SEQ ID BR:5) i zadržava funkcionalnu aktivnost BAFF-R proteina sa slike 2D (SEQ ID BR:5).
U nekim oblicima pronalazak uključuje specifične mutante BAFF-R:Fc polipeptida dizajnirane da smanje agregiranje eksprimiranih proteina dok održavaju aktivnost vezivanja BAFF. Takve mutacije uključuju, na primer, klonove koji kodiraju sekvence amino kiseline JST661 (SEQ ID BR:17). JST662 (SEQ ID BR:18), JST663 (SEQ ID BR:19), JST673 (SEQ ID BR:20), JST674 (SEQ ID BR:21), JST675 (SEQ ID BR:22), JST672 (SEQ ID BR:23), JST676 (SEQ ID BR:24), JST671 (SEQ ID BR:25), JST677 (SEO. ID BR.26) i JST678 (SEQ ID BR:27). Drugi oblici uključuju mutante koji kodiraja BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptide koji imaju slične karakteristike agregiranja sa prirodnim humanim BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptidom, ali takođe vezuju BAFF uključujući na primer, sekvence koje sadrže sekvencu amino kiseline JST659 (SEQ ID BR:15), JST660 (SEQ ID BR:16), JST664 (SEQ ID BR:28), JST668 (SEQ ID BR:29), JST665 (SEQ ID BR:30), JST666 (SEQ ID BR:31) i JST667 (SEQ ID BR:32). Drugi oblici uključuju mutante koji kodiraju BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptid gde su konzervirane amino kiseline između humanog i mišijeg BAFF-R promenjene u druge konzervirane amino kiseline i gde je zadržana aktivnost vezivanja BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptida za BAFF. U drugim oblicima mutanti kodiraju BAFF-R ili BAFF-R:Fc polipeptid koji ima amino kiseline koje nisu konzervirane između humanog i mišijeg BAFF-R koji je promenjen u druge amino kiseline.
Poželjnoda su nepotarne amino kiseline mutirane u prolin ili nepromenjene polarne amino kiseline
Određivanje homologije između dveili više sekvenci
Da se odredi procenat homologije dve sekvence amino kiseline ili dve nukleinske kiseline, sekvence su poredane za svrhu optimalnog poređenja (npr. prekidi mogu biti uvedeni u sekvencu prve amino kiseline ili sekvencu nukleinske kiseline za optimalno poravnavanje sa drugom amino kiselinom ili sekvencom nukleinske kiseline). Ostaci amino kiseline ili nukleotidi na odgovarajućim pozicijma amino kiseline ili pozicijama nukleotida su zatim upoređeni. Kada je pozicija prve sekvence zauzeta istim ostatkom amino kiseline ili nukleotida kao odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci tada su molekuli homologi na toj poziciji (tj. kako se ovde koristi "homologija" amino kiseline ili nukleinske kiseline je ekvivalentna "identičnosti" amino kiseline ili nukleinske kiseline). Homologija sekvence nukleinske kiseline može biti određena kao stepen identičnosti između dve sekvence. Homologija može biti određena korišćenjem kompjuterskog programa poznatog u praksi kao GAP softver obezbeđen u GCG programskom paketu. Vidi Needleman i VVunsch (1970)J. Mol. Biol.48:443-453. Korišćenje GCG GAP softvera sa slede-ćim parametrima za poređenje sekvence nukleinske kiseline: GAP kreacioni prostor 5.0 i GAP ekstenzioni prostor 0.3, kodirajući region analognih sekvenci nukleinske kiseline koje se odnose na one gore pokazalo je stepen identičnosti poželjno od najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% sa CDS (kodirajući) delom sekvence DNK prikazanim na slici 2A (SEO. ID BR:3), slici 2C (SEQ ID BR:4), slici 3 (SEQ ID BR:6).
Termin "identičnost sekvenci" odnosi se na stepen u kojem su dva polinukleotida ili polipeptidne sekvence identične na osnovi ostatak-prema-ostatku u odnosu na posebni region poređenja. Termin "procenat identičnosti sekvence" je izračunat poređenjem dve optimalno poklopljene sekvence u tom regionu poređenja, određivanjem broja pozicija na kojima se identične nukleinske baze (npr. A, T, C, G, U ili I u slučaju nukleinskih kiselina) javljaju u obe sekvence da daju broj poklopljenih pozicija, deljenjem broja poklopljenih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u regionu poređenja (tj., u veličini prozora), i množenjem rezultata sa 100 da se dobije procenat identičnosti sekvence. Termin "identičnost sekvence" onako kako se ovde koristi označava karakteristike polinukleotidne sekvence, gde polinukleotid sadrži sekvencu koja ima najmanje 80 procenta identičnosti, poželjno najmanje 85 procenata identičnosti i često 90 do 95 procenta identičnosti sekvence, najčešće 99 procenta identičnosti sekvence u poređenju sa referentnom sekvencom u regionu poređenja.
Himeričniifuzioni proteini
Pronalazak takođe obezbeđuje BAFF-R himerične ili fuzione proteine. Onako kako se ovde koristi BAFF-R "himerični protein" ili "fuzioni protein" sadrži BAFF-R polipeptid operativno vezan za ne-BAFF-R polipeptid. "BAFF-R polipeptid" odnosi se na polipeptid koji ima sekvencu amino kiseline koja odgovara BAFF-R, dok se "ne-BAFF-R polipeptid" odnosi na polipeptid koji ima sekvencu amino kiseline koja odgovara proteinu koji nije u potpunosti homolog sa BAFF-R proteinom, npr., protein koji je različit od BAFF-R proteina i koji je izveden iz istog ili različitog organizma. Unutar BAFF-R fuzionog proteina BAFF-R polipeptid može odgovarati ćelom ili delu BAFF-R proteina. U jednom obliku BAFF-R fuzioni protein sadrži najmanje jedan biološki aktivan deo BAFF-R proteina. U jednom obliku BAFF-R fuzioni protein sadrži najmanje dva biološki aktivna dela BAFF-R proteina. U još jednom obliku BAFF-R fuzioni protein sadrži najmanje tri biološki aktivna dela BAFF-R proteina. U fuzionom proteinu termin "operativno vezan" se koristi da naznači da su BAFF-R polipeptid i ne-BAFF-R polipeptid fuzionisani jedan sa drugim u okviru. Ne-BAFF-R polipeptid može biti fuzionisan za N-terminus ili C-terminus BAFF-R polipeptida. Ne-BAFF-R polipeptid može biti, na primer, Fc deo antitela. On može biti operativno vezan ili za N-terminus ili C-terminus BAFF-R polipeptida. Fc-ciljne fuzije proteina opisane su kod Lo i sar. (1998)Protein Enginering11:495-500 i U.S. patentima br. 5,541,087 i 5,726,044. Njihova otkrića inkorporirana su ovde referencom.
Na primer, u jednom obJiku BAFF-R fuzioni protein sadrži BAFF-R domen operativno vezan za izvanćelijski domen drugog proteina. Takvi fuzioni proteini mogu se dalje koristiti za skrining ogled za jedinjenja koja modulišu BAFF-R aktivnost (takvi ogledi su dole opisani detaljno).
U još jednom obliku fuzioni protein je GST-BAFF-R fuzioni protein u kojem su BAFF-R sekvence fuzionisane sa C-terminusom GST (tj., glutation S-transferaza) sekvencama. Takvi fuzioni proteini mogu olakšati prečišćavanje i rekombinaciju BAFF-R.
U drugom obliku, fuzioni protein je BAFF-R protein koji sadrži heterologu signalnu sekvencu na svom N-terminusu. Na primer, pošto BAFF-R ne sadrži svoju signalnu sekvencu, heterologna signalna sekvenca mora biti fuzionisana za 5' kraj BAFF-R kodirajuće sekvence radi efikasne sekrecije BAFF-R fuzionog proteina. Ekspresija i/ili sekrecija BAFF-R može biti povećana upotrebom sekvenci različitog heterologog signala.
U još jednom obliku, fuzioni protein je BAFF-R-imunoglobulinski fuzioni protein u kojem su BAFF-R sekvence, koje sadrže jedan ili više domena, fuzionisane sa sekvencama izvedenim iz člana imunoglobulinske porodice proteina. BAFF-R-imunoglobulinski fuzioni proteini pronalaska mogu biti inkorporirani u farmaceutske preparate i davani subjektu da inhibiraju interakciju između BAFF-R veznikatBAFF-R proteina na površini ćelije, supresujući tako BAFF-R-posredovan signal transdukcijein vivo.BAFF-R-imunoglobulinski fuzioni proteini mogu se upotrebiti da deluju na biodostupnost BAFF-R srodnog veznika. Inhibicija BAFF-R veznika/ BAFF-R interakcija može biti terapeutski korisna i za tretman proliferativnih poremećaja kao i za modulisanje (npr., započinjanje inhibicije) preživljavanja ćelija. Štaviše, BAFF-R-imunoglobulinski fuzioni proteini pronalaska mogu se upotrebiti kao imunogeni da produkuju BAFF-R antitela kod subjekta, da prečiste BAFF-R veznike i u skrining ogledu da identifikuju molekule koji inhibiraju interakciju BAFF-R sa BAFF-R veznikom.
BAFF-R himerični ili fuzioni protein pronalaska može biti produkovan standardnim tehnikama rekombinantne DNK. Na primer, fragmenti DNK koji kodiraju različite polipeptidne sekvence vezani su zajedno u-okvir u skladu sa konvencionalnim tehikama, npr., primenom prosto-završenih ili promenjivo-završenih terminusa za vezivanje, digestijom restikcionim enzimima da se obezbede odgovarajući terminusi, popunjavanjem kohezivnih krajeva onako kako je odgovarajuće, tretmanom alkalnom fosfatazom da se izbegne neželjeno pridruživanje i enzimatskim vezivanjem. U drugom obliku, fuzioni gen može biti sintetizovan konvencionalnim tehnikama uključujući automatske DNK sintetizatore. Alternativno se može izvesti amplifikacija fragmenata gena PCR-om korišćenjem sidrenih prajmera koji daju komplementarno kačenje u višku između dva uzastopna fragmenta gena koji se mogu uzastopno kaliti i ponovo ampli-fikovati da se generišu himerične sekvence gena (Vidi, na primer, Ausubel i sar., izd Tekući<p>rotokoli u molekularnojbiolo<g>iji, John Wiley and Sons, New York, NY, 1993). Štaviše, mnogi ekspresioni vektori koji već kodiraju fuzionu grupu su dostupni komercijalno (npr., GSP polipeptid). BAFF-R kodirajuća nukleinska kiselina može biti klonirana u takav ekspresioni vektor tako da fuziona grupa bude vezana u-okviru za BAFF-R protein.
U poželjnom obliku obezbeđen je BAFF-R fuzioni protein sekvencama nukleinske kiseline (SEQ ID BR:11) i amino kiseline (SEQ ID BR:12 sa slike 9.
Agonisti I antagonisti BAFF-R
Predmetni pronalazak takođe se odnosi na varijante BAFF-R proteina koji funkcioniše bilo kao BAFF-R agonisti (mimetici) ili kao BAFF-R antagonisti. Varijante BAFF-R proteina mogu biti generisane mutagenezom, npr., diskretnom taćkastom mutacijom ili odsecanjem BAFF-R proteina. Agonist BAFF-R proteina može zadržati gotovo potpuno iste ili deo bioloških aktivnosti BAFF-R proteina koje se javljaju u prirodi. Antagonist BAFF-R proteina može inhibirati jednu ili više aktivnosti BAFF-R proteina koje se javljaju u prirodi, na primer kompetitivno vezivanje za uzvodnog ili nizvodnog člana kaskade ćelijskog signaliranja koja uključuje BAFF-R protein. Na taj način specifični biološki efekti mogu biti otkriveni tretmanom sa varijantom ograničene funkcije. U jednom obliku tretman subjekta sa varijantom koja ima podskup bioloških aktivnosti oblika proteina koji se prirodno javlja ima manje sporednih efekata kod subjekta u odnosu na tretman sa oblicima BAFF-R proteina koji se javljaju prirodno.
Varijante BAFF-R proteina koje funkcionišu bilo kao BAFF-R agonisti (mimetici) ili kao BAFF-R antagonisti mogu biti identifikovane skriningom kombinatornih biblioteka mutanata, npr., mutacija isecanja za aktivnost BAFF-R proteina za BAFF-R protein agonist ili antagonist. U jednom obliku mozaična biblioteka BAFF-R varijanti je generisana kombinatornom mutagenezom na nivou nukleinske kiseline i kodirana je mozaičnom bibliotekom gena. Mozaična biblioteka BAFF-R varijanti može biti produkovana putem, na primer, enzimatskog vezivanja mešavine sintetičkih oligonukleotida u sekvence gena tako da je degenerativni set potencijalnih BAFF-R sekvenci ekspresibilan kao individualni polipeptidi, ili alternativno kao set većih fuzionih proteina (npr., za prikazivanje faga) koji sadrži set BAFF-R sekvenci u sebi. Postoji mnoštvo postupaka koji se mogu upotrebiti da se produkuju biblioteke potencijalnih BAFF-R varijanti iz degenerativne sekvence oligonukleotida. Hemijska sinteza degenerativne sekvence gena može biti izvedena u automatskom DNK sintetizatoru i sintetički gen može zatim biti vezan u određeni ekspresioni vektor. Upotreba degenerativnog seta gena omogućuje obskbljivanje, u jednoj meša-vini, svih sekvenci koje kodiraju željeni set potencijalnih BAFF-R sekvenci. Postupci za sintetisanje degenerativnih oligonukleotida poznati su u praksi (vidi, npr., Narang (1983)Tetra-hedron39:3; Itakura i sar. (1984)Ann. Rev. Biochem.53:323; Itakura i sar. (1977)Science198:1056-1063; Ike i sar. (1983)Nucl. Acids Res.11:477-488.
Biblioteke polipeptida
Sem toga, mogu biti upotrebljene biblioteke kodirajućih sekvenci fragmenata BAFF-R proteina da se generišu mozaične populacije BAFF-R fragmenata za skrining i uzastopnu selekciju varijanti BAFF-R proteina. U jednom obliku biblioteka kodirajuće sekvence fragmenata može biti generisana tretiranjem dvolančanog PCR fragmenta BAFF-R kodirajuće sekvence sa nukleazom pod uslovima gde se rezovi dešavaju samo oko jednom po molekulu, denaturisanjem dvo lančane DNK, renaturisanjem DNK da se formira dvo-lančana DNK koja može uključiti sens/antisens parove iz različitih produkata rezova, uklanjanjem jedno-lančanih delova iz reformisanih dupleksa tretmanom sa S1 nukleazom i vezivanjem nastale biblioteke fragmenata u ekspresioni vektor. Ovim postupkom može biti izvedena ekspresiona biblioteka koja kodira N-terminalne i interne fragmente različite veličine BAFF-R proteina.
Nekoliko tehnika je poznato u praksi skrininga produkata gena kombinatornih biblioteka napravljenih putem tačkastih mutacija i isecanja i za skrining cDNK biblioteka za genske produkte koji imaju selektvne karakteristike. Takve tehnike su prilagodljive za brzi skrining biblioteka gena putem kombinatorne mutageneze BAFF-R proteina. Najšire korišćene tehnike, koje su pristupačne analizom velike propusne moći, za skrining velikih biblioteka gena obično uključuju kloniranje genske biblioteke u ekspresione vektore koji se mogu replicirati, transformisanje odgovarajućih ćelija sa nastalom bibliotekom vektora i eksprimiranje kombinatronih gena pod uslovima u kojima detekcija željene aktivnosti olakšava izolaciju vektora koji kodiraju gen čiji produkt je detektovan. Rekruzivna ensemblarna mutageneza (REM), nova tehnika koja pojačava frekvencu funkcionalnih mutacija u bibliotekama, može biti upotrebljena u kombinaciji sa skrining ogledima da se identifikuju BAFF-R varijante (Arkin i Yourvan (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:7811-7815; Delgrave i sar. (1993)Protein Engineehng6:327-331).
Anti-BAFF-R antitela
Izolovani BAFF-R protein, ili njegov deo ili fragment, može biti upotrebljen kao imunogen da generiše antitela koja vezuju BAFF-R koristeći standardne tehnike za za poliklonalnu i monoklonalnu preparaciju. BAFF-R protein pune dužine može se upotrebiti, ili alternativno, pronalazak obezbeđuje antigene peptidne fragmente BAFF-R za upotrebu kao imunogene. Antigeni peptid BAFF-R sadrži najmanje 8 ostataka amino kiseline sekvence amino kiseline prikazane na slici 2D (SEQ ID BR:5) i obuhvata epitop BAFF-R tako da antitelo probuđeno protiv peptida formira specifični imuni kompleks sa BAFF-R. Poželjni antigeni peptid sadrži najmanje 10 ostataka amino kiseline, još poželjnije najmanje 15 ostataka amino kiseline, i čak još poželjnije najmanje 20 ostataka amino kiseline, i najpoželjnije najmanje 30 ostataka amino kiseline. Poželjni epitopi koji su obuhvaćeni antigenim peptidom su regioni BAFF-R koji su locirani na površini proteina, npr., hidrofilnim regionima.
Kao što je ovde obelodanjeno sekvence BAFF-R proteina sa slike 2D (SEQ ID BR:5), ili njegovi derivati, fragmenti, analozi ili homolozi, mogu se koristiti kao imunogeni u generisanju antitela koje imuno-specifično vezuje ove proteinske komponente. Termin "antitelo" onako kako se koristi ovde odnosi se na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove imuno-globulinskih molekula, tj. molekula koji sadrže mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje (imunoreaguje sa) antigenom, kao što je BAFF-R. Takva antitela uključuju, ali nisu ograničena na, poliklonalne, monoklonalne. himerične, jednolančane, Fab i F(ab')2fragmente i Fab ekspresionu biblioteku. U specifičnom obliku otkrivena su antitela za humane BAFF-R proteine. Mogu se upotrebiti različite procedure poznate u praksi za produkovanje poliklonalnih ili monoklonalnih antitela za sekvencu BAFF-R proteina sa slike 2D (SEQ ID BR:5) ili njegov derivat, fragment, analog ili homolog. Neki od ovih proteina su diskutovani niže.
Za produkciju poliklonalnih antitela mogu biti imunizovane različite životinje domaćini (npr. zec, koza, miš ili drugi sisar) injekcijom sa prirodnim proteinom ili njegovom sintetičkom varijantom, ili gore pomenutim derivatom. Prigodna imunogena preparacija može sadržati, na primer, rekombinantno eksprimiran BAFF-R protein ili hemijski sintetisan BAFF-R polipeptid. Preparacija može dalje uključiti rastvarač. Različiti rastvarači koji se koriste da povećaju imunološki odgovor uključuju, ali nisu ograničeni na, Freund (kompletan i nekompletan), mineralne gelove (npr aluminijum hidroksid), površinski aktivne supstance (npr. lizolecitin, pluro-nični polioli, polianjoni, peptidi, uljane emulzije, dinitrofenol itd.), humane adjuvanse, kao što su Bacille Calmette-Guerin (BCG) iCorynebacterium parvum,ili slične imunostimulatorne agense. Po potrebi molekuli antitela usmereni protiv BAFF-R mogu biti izolovani iz sisara (npr. iz krvi) i dalje prečišćeni dobro poznatim tehnikama, kao što je hromatografija proteina A da se dobiju IgG frakcije.
Termin "monoklonalno antitelo" ili "preprat monoklonalnog antitela" onako kako se ovde koristi odnosi se na populaciju molekula antitela koja sadrži samo jednu vrstu antigen vezujućeg mesta, koje je sposobno za imunoreagovanje sa određenim epitopom BAFF-R. Prema tome, preparat monoklonalnog antitela tipično pokazuje pojedinačni afinitet vezivanja za određeni BAFF-R protein sa kojim imunoreaguje. Za pripremanje monoklonalnih antitela, usmerenih protiv određenog BAFF-R proteina, ili njegovih derivata, fragmenata, analoga ili homologa može biti upotrebljena bilo koja tehnika koja obezbeđuje produkciju molekula antitela putem kontinuirane kulture ćelijske linije. Takve tehnike uključuju, ali nisu ograničene na, hibridoma tehnike (vidi Kohler i Nilstein (1975)Nature256:495-497); trioma tehnike; hibridoma tehnike humane B-ćelije (vidi Kozbor i sar. (1983)Immunol. Today4:72) i EBV hibridoma tehnike da se produkuju humana monoklonalna antitela (vidi Cole i sar u Monoklonalna antitela i tera<p>ijakancera, Alan R. Liss, Ine, 1985, str. 77-96). Humana monoklonalna antitela mogu biti upotrebljena u praksi predmetnog pronalaska i mogu biti produkovana upotrebom humanih hibridoma (vidi Cote i sar. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80:2026-2030) ili putem transformisanja humanih B-ćelija sa Epstein Barr virusomin vitro(vidi Cote i sar. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80:2026-2030).
Prema pronalasku mogu se adaptirati tehnike za produkovanje jedno-lančanih antitela specifičnih za BAFF-R protein (vidi npr. U.S. patent br. 4,946,778). Sem toga mogu biti prila-gođeni postupci za konstrukciju Fab ekspresionih biblioteka (vidi npr. Huse i sar. (1989)Science246:1275-1281) da se omogući brza i efikasna identifikacija monoklonalnih Fab fragmenata sa željenom specifičnošću za BAFF-R proteine ili njihove derivate fragmente, analoge ili homologe. Ne-humana antitela mogu biti "humanizovana" tehnikama dobro poznatim u praksi. Vidi npr., U.S. patent br. 5,225,539. Fragmenti antitela, koji sadrže idiotipove za BAFF-protein mogu biti produkovana tehnikama poznatim u praksi uključujući, ali bez ograničenja na: (i) F(ab')2fragment produkovan digestijom pepsinom, molekul antitela; (ii) Fab fragment generisan redukovanjem disulfidnih mostova F(ab% fragmenta; (iii) Fab fragment generisan tretmanom molekula antitela sa papainom i redukujućim agensom i (iv) Fv fragmente.
Dodatno su u okviru obima pronalaska rekombinantna anti-BAFF-R antitela, kao što su himerična i humanizovana, monoklonalna antitela, koja sadrže i humane i ne-humane delove, koji mogu biti napravljeni upotrebom standardnih rekombinantnih DNK tehnika. Tako himerična i humanizovana monoklonalna antitela mogu biti produkovana rekombinantnim DNK tehnikama poznatim u praksi, na primer, upotrebom metoda opisanih u PCT Međunarodnoj prijavi br. PCT/US86/02269; Evropskoj patentnoj prijavi br. 184,187; Evropskoj patentnoj prijavi br. 171,496; Evropskoj patentnoj prijavi br. 173,494; PCT Međunarodnoj prijavi br. VVO86/01533; U.S. Pat. Br. 4,816,567; Evropskoj patentnoj prijavi br. 125,023; Better i sar. (1988)Science240:1041-1043; Liu i sar. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 84:214-218; Nishimura i sar. (1987)Cancer Res.47:999-1005; Wood i sar. (1985)Nature314:446-449; Shaw i sar. (1988)J. Natl. Cancer Inst.80:1553-1559); Morrison (1985)Science229:1202-1207; Oi i sar. (1986)Bio Techniques 4:214;U.S. Pat. Br. 5,225,539: Jones i sar. (1986)Nature321:552-525; Verhoevan i sar. (1988)Science239:1534; i Beidler i sar. (1988)J. Immunol.141:4053-4060.
U jednom obliku, postupci za skrining antitela koje poseduje odabranu specifičnost uključuju, ali nisu ograničeni na, za enzim-vezan imunosorbent test (ELISA) i druge imunološki-posredovane tehnike poznate u praksi. U specifičnom obliku, izbor antitela koja su specifična za poseban domen BAFF-R proteina je olakšan generisanjem hibridoma koji se vezuju za fragment BAFF-R proteina koji ima taj domen. Takođe su ovde obezbeđena antitela koja su specifična za jedan ili više domena sa BAFF-R proteinom, npr., domene koji obuhvataju gore identifikovane konzervirane regione BAFF-R porodice proteina ili njihove derivate, fragmente, analoge ili homologe.
Anti-BAFF-R antitela mogu se upotrebiti u postupcima poznatim u praksi, koji se odnose na lokalizaciju i/ili kvantifikaciju BAFF-R proteina (npr. za upotrebu u merenju nivoa BAFF-R proteina u odgovarajućim fiziološkim uzorcima, za upotrebu u dijagnostičkim postupcima, za upotrebu u snimanju proteina i tome slično). U datom obliku antitela za BAFF-R proteine ili njihove derivate, fragmente, analoge ili homologe, koji sadrže vezujući domen izveden antitelom, su iskorišćeni kao farmakološki aktivna jedinjenja (ovde "terapeutici").
Anti-BAFF-R antitelo (npr. monoklonalno antitelo) može se upotrebiti da se izoluje BAFF-R standardnim tehnikama, kao što su afinitetna hromatografija ili imunotaloženje. Anti-BAFF-R antitelo može olakšati prečišćavanje prirodnog BAFF-R iz ćelija i iz rekombinantno produkovanog BAFF-R eksprimiranog u ćelijama domaćina. Štaviše, anti-BAFF-R antitelo može biti upotrebljeno da se detektuje BAFF-R protein (npr. u ćelijskim lizatima ili u ćelijskom supematantu) sa ciljem da se proceni brojnost i način ekspresije BAFF-R proteina. Anti-BAFF-R antitela mogu biti upotrebljena dijagnostički da se prate nivoi proteina u tkivima, kao deo kliničke procedure testriranja, npr. da se, na primer, odredi efikasnost datog režima tretmana. Detekcija se može olakšati spajanjem (tj. fizičkim vezivanjem) antitela za detektibilnu supstancu. Primeri detekta-bilnih supstanci uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale i radaioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju, peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, B-galaktozidazu ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih prostetičkih grupnih kompleksa uključuju steptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescin, fluorescin izotiocijanat, rodamin, dihlorotriaziniiamin fluorescin, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnih materijala uključuje luminol; primeri bioluminescentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin i ekviorin i primeri pogodnih radioaktivnih materijala uključuju125J,<13>1J,35S ili<3>H.
BAFF-R rekombinantni ekspresioni vektoriićelije domaćini
Drugi aspekt pronalaska odnosi se na vektore, preferentno ekspresione vektore, koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira BAFF-R protein ili njegove derivate, fragmente, analoge ili homologe. Onako kako se koristi ovde termin "vektor" odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Jedan tip vektora je "plazmid", koji se odnosi na kružnu dvolanćanu petlju DNK u kojoj je vezan dodatni DNK segment. Drugi tip vektora je virusni vektor, gde dodatni segmenti DNK mogu biti vezani u viralni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni sisarski vektori). Drugi vektori, (npr. ne-epizomalni sisarski vektori) su integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i prema tome su replikovani zajeno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su sposobni za usmeravanje ekspresije gena za koje su operativno vezani. Takvi vektori su označeni ovde kao "ekspresioni vektori". Generalno, ekspresioni vektori, koji su korisni u tehnikama rekombinantne DNK, su često u obliku plazmida. U predmetnoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" mogu se naizmenično upotrebljavati pošto je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora. Međutim namera je da se u pronalazak uključe takve druge forme ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr., replikaciono defektni retrovirusi, adenovirusi i adeno-vezani virusi), koji imaju ekvivalentne funkcije.
Rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska sadrže nukleinsku kiselinu pronalaska u obliku pogodnom za ekspresiju nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu, što znači da rekombinantni ekspresioni vektori uključuju jednu ili više regulatornih sekvenci odabranih na osnovu ćelija domaćina, koji se koristi za ekspresiju, koji je operativno vezan za sekvencu nukleinske kiseline koja treba da se eksprimira. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, pod "operativno vezan" se podrazumeva da je nukleotidna sekvenca od interesa vezana za regulatornu sekvencu(e) na način koji omogućuje ekspresiju nukleotidne sekvence (npr.,in vitrotranskripcioni/translacioni sistem ili u ćeliji domaćinu kada je vektor unet u ćeliju domaćina). Termin "regulatorna sekvenca" podrazumeva da uključuje promotore, pojačivače i druge ekspresione kontrolne elemente (npr., poliadenilacione signale). Takve regulacione sekvence su opisane, na primer, u Goeddel "Tehnolo<g>ija eks<p>resije<g>ena" Metodi u enzimolo<g>iji 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990. Regulatorne sekvence uključuju one koje usmeravaju konstitutivnu ekspresiju sekvence nukleotida kod mnogo tipova ćelija domaćina i one koje usmeravaju ekspresiju sekvence nukleotida samo kod određenih ćelija domaćina (npr., tkivno specifične regulatorne sekvence). Oni sa iskustvom u praksi shvatiće da dizajn ekspresionih vektora može zavisiti od takvih faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja treba da se transformiše, nivoa ekspresije željenog proteina, itd. Ekspresioni vektori pronalaska mogu biti uvedeni u ćelije domaćina da tu produkuju proteine ili peptide, uključujući fuzione proteine ili peptide, koji kodiraju nukleinske kiseline, kao što je ovde opisano (npr., BAFF-R proteine, munantne oblike BAFF-R, fuzione proteine itd.)
Rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu biti dizajnirani za ekspresiju BAFF-R u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama. Na primer, BAFF-R može biti eksprimiran u bakterijskim ćelijama kao što jeEscherichia coli,ćelijama insekata (korišćenjem ekspresionih vektora bakulovirusa) ćelija kvasca ili sisarskim ćelijama. Pogodne ćelije domaćini su dalje diskutovane u Goeddel "Tehnolo<g>ija eks<p>resije<g>ena" Metodi u enzimolo<g>iji 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990. Alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može biti transkribovan i translaciranin vitro,na primer, koristeći T7 promotorske regulatorne sekvence i T7 polimerazu.
Ekspresioni proteini kod prokariota često se prenose u E.colisa vektorima koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotore koji usmeravaju ekspresiju bilo fuzionih ili ne-fuzionih proteina. Fuzioni vektori dodaju jedan broj amino kiselina proteinu koji je tu kodiran, obično na amino terminus rekombinantnog proteina. Takvi fuzioni vektori obično služe za tri svrhe: (1) da povećaju ekspresiju rekombinantnog proteina; (2) da povećaju rastvorljivost rekombinantnog proteina; i (3) da doprinesu prečišćavanju rekombinantnog proteina delujući kao veznici u afinitetnom prečišćavanju. Često, u fuzionom ekspresionom vektoru, proteolitičko mesto isecanja je uvedeno na poziciju fuzione grupe i rekombinantnog proteina da se omogući razdvajanje rekombinantnog proteina od fuzione grupe nakon prečišćavanja fuzionog proteina. Takvi enzimi i njihovi srodne sekvence prepoznavanja, uključuju faktor Xa, trombin i enterokinazu. Uobičajeni ekspresioni vektori uključuju pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith i Johnson (1988)Gene67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass) i pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ.) sjedinjena glutation S-transferaza (GST), maltoza E vezujući protein ili protein A, respektivno u odnosu na ciljni rekombinantni protein.
Primeri pogodnih inducibilnih ne-fuzionih ekspresionih vektoraE. coliuključuju pTrc (Amran i sar. (1988)Gene69:301-315) i pET 11d (Studier i sar. "Tehnolo<g>ija eks<p>resije<g>ena" Metodi u enzimolo<g>iji 185, Academic Press, San Dieg, Calif., 1990, str. 60-89).
Jedna strategija da se maksimizuje ekspresija rekombinantnog proteina kodE. colije da se eksprimira protein u bakteriji domaćinu sa oslabljenim kapacitetom da proteolitički iseca rekombinantni protein. Vidi Gottesman "Tehnolo<g>ija eks<p>resije<g>ena" Metodi u enzimolo<g>iji 185, Academic Press, San Dieg, Calif., 1990, str. 119-128. Druga strategija je da se izmeni sekvenca nukleinske kiseline koja se ubacuje u ekspresioni vektor tako da pojedinačni kodoni za svaku amino kiselinu budu oni koje preferentno koristiE. coli(Wada i sar. (1992)Nucleic Acids Res.20:2111-2118. Takve izmene sekvenci nukleinske kiseline pronalaska mogu se izvesti standardnim tehnikama sinteze DNK.
U drugom obliku BAFF-R ekspresioni vektor je ekspresioni vektor kvasca. Primeri ekspresionih vektora kvasca (npr.Saccharomyces cerevisae)uključuju pYepSec1 (Baldari i sar., (1987JEMBO J.6:229-234), pMFa (Kurjan i Herskovvitz, (1982)Cell 30:933-943),pJRY88
(Schultz i sar (1987)Gene54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) i zaP. pastor/ suključuju pPIC porodicu vektora (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.).
Alternativno, BAFF-R može biti eksprimiran u ćelijama insekata koristeći vektore ekspresije bakulovirusa. Vektori bakulovirusa dostupni za ekspresiju proteina u kultivisanim ćelijama insekata (npr. SF9 ćelije) uključuju pAc serije (Smith i sar. (1983)Mol. Cell Bilol.3:2156-2165) i pVL serije (Lucklow i Summers (1989)Virology170:31-39).
U još jednom obliku nukleinska kiselina pronalaska je eksprimirana u sisarskim ćelijama korišćenjem sisarskog ekspresionog vektora. Primeri sisarskih ekspresionih vektora uključuju pCDM8 (Seed (1987)Nature329:840-842) i pMT2PC (Kaufman i sar. (1987)EMBO J.6:187-195). Kada se koriste u sisarskim ćelijama, kontrolne funkcije ekspresionog vektora su često obezbeđene virusnim regulatornim elementima. Na primer, često korišćeni promotori izvedeni su od polioma, Adenovirusa 2, citomegalovirusa i Simian virusa 40. Za druge pogodne ekspresione sisteme i za prokariotske i za eukariotske ćelije vidi npr., Sambrook i sar., Molekularnokloniranje:laboratorijski<p>rjručnik, 2 izd., Cold Spring Harbor laboratorv, Cold Spring Harbor laboratorv press, Cold Spring Harbor 1989.
U drugom obliku rekombinacioni sisarski vektor je sposoban za usmeravanje ekspresije nukleinske kiseline poželjno u određenom ćeliskom tkivu (npr., tkivno-specifični regulatorni elementi se koriste da se eksprimira nukleinska kiselina). Tkivno specifični regulatorni elementi poznati su u praksi. Ne-ograničavajući primeri pogodnih tkivno-specifičnih promotora uključuju albumin promotor (specifičan za jetru; Pinkert i sar. (1987)Genes Dev.1:268-277), limfoidno-specifične promotore (Calame i Eaton (1988)Adv. Immunol.43:235-275), posebne promotore receptora T ćelija (VVinoto i Baltimore (1989)EMBO J.8:729-733) i imunoglobuline (Banerji i sar. (1983)Cell33:729-740; Quen i Baltimore (1983)Cell33:741-748) neuron-specifične promotore (npr., promotori neurofilamenta; Byrne i Ruddl;e (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:5473-5477, pankreas-specifične promotore (npr., promotor mlečnog puta; U.S. patent br. 4,873,316 i Evropska patentna prijava br. 264,166). Takođe su obuhvaćeni razvojno-regulisani promotori, npr., mišji hoks promotori (Kessel i Gruss (1990)Science249:374-379) i a-fetoprotein promotor (Campes i Tilgman (1989)Genes Dev.3:537-546).
Pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži DNK molekul pronalaska kloniran u ekspresioni vektor u antisens orijentaciji. To znači da je DNK molekul operativno vezan za regulatornu sekvencu na način koji omogućuje ekspresiju (putem transkripcije molekula DNK) RNK molekula koji je antisens u odnosu na BAFF-R mRNK. Regulatorne sekvence, operativno vezane za kloniranu nukleinsku kiselinu u antisens orijentaciji, mogu biti odabrane da usmere kontinuiranu ekspresiju antisens RNK molekula u mnoštvu tipova ćelija, na primer, viralni promotori i/ili pojačivaći ili mogu biti odabrane regulatorne sekvence koje usmeravaju konstitutivnu, tkivno specifičnu ekspresiju antisens RNK. Antisens ekspresioni vektor može biti u obliku rekombinantnog plazmida, fagemida ili isečenog virusa u kojem su antisens nukleinske kiseline produkovane pod kontrolom visoko efikasnog regulatornog regiona, čija aktivnost može biti određena tipom ćelija u koje je vektor uveden. Za diskusiju regulacije ekspresije gena vidi VVeintraub i sar. (1986) "Antisenskao molekularno ORUđE za<g>enetičku analizu"Reviews-Trends in Genetics1(1):.
Drugi aspekt pronalaska, odnosi se na ćelije domaćine u koje su uvedeni rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska. Termin "ćelije domaćini" i "rekombinantna ćelija domaćin" upotreblajvaju se ovde naizmenično. Treba da se shvati da se ovakvi termini odnose ne samo na određeni subjekt nego i na potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćelije. Pošto određene modifikacije mogu da se odigraju u uzastopnim generacijama zahvaljujući bilo mutacijama ili sredinskim uticajima, takvo potomstvo ne mora, u stvari, biti identično roditeljskoj ćeliji, ali je ipak uključeno u okvir obima i termina upotrebljenih ovde.
Ćelija domaćin može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija. Na primer, BAFF-R protein može biti eksprimiran u bakterijskoj ćeliji kao što jeE coli,insektskoj ćeliji, ćeliji kvasca ili sisarskim ćelijama (kao što su ćelije ovarijuma hrčka (CHO) ili COS ćelije). Onima sa iskustvom u praksi poznate su druge pogodne ćelije domaćini.
Vektorska DNK može biti uvedena u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju konvencionim tehnikama transformacije ili transfekcije. Onako kako se koriste ovde termini "transformacija" i "transfekcija" odnose se na mnoštvo tehnika poznatih u praksi za uvođenje strane nukleinske kiseline (npr., DNK) u ćeliju domaćina, uključujući ko-taloženje kalcijum fosfatom ili kalcijum hloridom, DEAE-dekstran-posređovanu transfekciju, lipofekciju ili elektroporaciju. Pogodni metodi za transformisanje ili transfekciju ćelija domaćina mogu se naći kod Sambrook i sar., Molekularnokloniranje:laboratorijski<p>riručnik, 2 izd., Cold Spring Harbor laboratorv press, Plainview, New York (1989), i drugim laboratorijskim priručnicima.
Za stabilnu transfekciju sisarskih ćelija, poznato je da, u zavisnosti od ekspresionog vektora i transfekcione tehnike koja se koristi, samo mali deo ćelija može integrisati stranu DNK u svoj genom. S ciljem da se identifikuju i odaberu ovi integranti, gen koji kodira selektivni marker (npr., rezistencija na antibiotike) je generalno uveden u ćelije domaćine zajedno sa genom za koji postoji interes. Različiti selektabilni markeri uključuju one koji obezbeđuju rezistenciju na lekove, kao što su G418, higromicin i metotreksat. Nukleinska kiselina koja kodira selektabilni marker može biti uvedena u ćeliju domaćina na istom vektoru koji kodira BAFF-R ili može biti uvedena posebnim vektorom. Ćelije koje su stabilno transfektovane sa uvedenom nukleinskom kiselinom mogu biti identifikovane selekcijom sa lekovima (npr., ćelije koje su inkorporirale selektabilni marker gen će preživeti, dok druge ćelije umiru).
Ćelija domaćin pronalaska, kao što je prokariotska ili eukariotska ćelija domaćin u kulturi, može se upotrebiti da produkuje (tj. eksprimira) BAFF-R protein. Shodno tome, pronalazak dalje obezbeđuje postupke za produkovanje BAFF-R proteina korišćenjem ćelija domaćina pronalaska. U jednom obliku pronalazak sadrži kultivisanje ćelija domaćina pronalaska (u koje je unesen rekombinatni ekspresioni vektor koji kodira BAFF-R) u pogodnom medijumu tako da je produkovan BAFF-R protein. U drugom obliku postupak dalje sadrži izolovanje BAFF-R iz medijuma ili ćelije domaćina.
Transgene životinje
Ćelije domaćini pronalaska mogu se upotrebiti da se produkuje nehumana transgena životinja. Na primer, u jednom obliku, ćelija domaćin pronalaska je fertilizovana oocita ili embrionalna stim ćelija u koju su uvedene BAFF-R-kodirajuće sekvence. Takve ćelije domaćini mogu se onda upotrebiti da se kreiraju ne-humane transgene životinje u kojima su u njihove genome uvedene egzogene BAFF-R sekvence ili homologe rekombinantne životinje u kojima su izmenjene endogene BAFF-R sekvence. Takve životinje su korisne za izučavanje funkcionisanja i/ili aktivnosti BAFF-R i za identifikovanje i/ili procenu modulatora aktivnosti BAFF-R. Onako kako se ovde koristi "transgena životinja" je ne-humana životinja, poželjno sisar, još poželjnije glodar kao što su pacov ili miš, kod kojeg jedna ili više ćelija ukjlučuju transgen. Drugi primeri transgenih životinja uključuju ne-humane primate, ovce, pse, krave, koze, piliće, vodozemce itd. Transgen je egzogena DNK koja je integrisana u genom ćelije iz koje se razvija transgena životinja i koja ostaje u genomu zrele životinje, usmeravajući tako ekspresiju kodiranog genskog produkta u jednom ili više ćelijskih tipova ili tkiva transgene životinje. Onako kako se ovde
koristi "homologa rekombinantna životinja" je ne-humana životinja, poželjno sisar, još poželjnije miš, kod kojeg je endogeni BAFF-R gen izmenjen homologom rekombinacijom između endogenog gena i egzogenog DNK molekula uvedenog u ćeliju životinje, npr., u embrionsku ćeliju životinje, pre razvitka životinje.
Transgena životinja pronalaska može biti kreirana uvođenjem BAFF-R kodirajuće nukleinske kiseline u pronukleus mužjaka fertilizovane oocite, npr., mikroinjekcijom, retroviralnom infekcijom i omogućiti oociti da razvije pseudnogravidnu žensku podstaknutu životinju. Humana BAFF-R sekvenca sa slike 2A (SEO. ID BR:3), slike 2C (SEQ ID BR:4), slike 3 (SEQ ID BR:6) može biti uneta kao transgen u genom ne-humane životinje. Alternativno, nehumani homolog humanog BAFF-R gena, kao što je mišji BAFF-R gen (SI. 4A) (SEQ ID BR:8), može biti izolovan na osnovu hibridizacije sa humanom BAFF-R cDNK (dodatno opisano gore) i upotrebljen kao transgen. Intronske sekvence i poliadenilacioni signali mogu se takođe uključiti u transgen da se poveća efikasnost ekspresije transgena. Tkiivno-specifične regulatorne sekvence mogu biti operativno vezane za BAFF-R transgen da se usmeri ekspresija BAFF-R proteina u određene ćelije. Postupci za generisanje transgenih životinja putem manipulacije embrionom i mikroinjekcijom, posebno životinje kao što su miševi, postali su konvencionalni u praksi i opisani su, na primer u U.S. patentima br. 4,736,866; 4,870,009 i 4,873,191; i Hogan u Mani<p>ulisanje embrionom miša, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986. Slični postupci se upotrebljavaju za produkciju drugih transgenih životinja. Transgena osnivačka živo-tinja može biti identifikovana na osnovu prisustva BAFF-R transgena u svom genomu i/ili ekspresiji BAFF-R mRNK u tkivima ili ćelijama životinje. Transgena osnivačka životinja može se zatim upotrebiti da se odgaje dodatne životinje koje nose transgen. Štaviše transgena životinja koja nosi transgen koji kodira BAFF-R može se dalje razmnožavati do drugih transgenih životinja koje nose druge transgene.
Da se kreira homologa rekombinantna životinja priprema se vektor koji se sastoji najmanje od dela BAFF-R gena u koji je delecijom, adicijom ili supstitucijom uveden da izmeni, npr., funkcionalno prekine BAFF-R gen. BAFF-R gene može biti humani gen (npr. slika 2A (SEQ ID BR:3), slika 2C (SEQ ID BR:4), slika 3 (SEQ ID BR:6)), ali još poželjnije on je nehumani homolog humanog BAFF-R gena. Na primer, misiji homolog (si. 4a) humanog BAFF-R gena slika 2A (SEQ ID BR:3), slika 2C (SEQ ID BR:4), slika 3 (SEQ ID BR:6) može biti upotrebljen da se konstruiše homologi rekombinantni vektor pogodan za narušavanje endogenog BAFF-R gena u mišijem genomu. U jednom obliku vektor je dizajniran tako da, nakon homologe rekombinacije, endogeni BAFF-R gen bude funkcionalno prekinut (tj. više ne kodira funkcionalni protein; takođe označen kao "knock out" vektor).
Alternativno, vektor može biti dizajniran tako da je nakon homologe rekombinacije, endogeni BAFF-R gen mutiran ili izmenjen na drugi način, ali još uvek kodira funkcionalni protein (npr. uzvodni regulatorni region može biti izmenjen tako da menja ekspresiju endogenog BAFF-R proteina). U homologom rekombinantnom vektoru izmenjeni protein BAFF-R gena je prikačen za njegove 5' i 3' krajeve dodatnom nukleinskom kiselinom BAFF-R gena da omogući da se homologa rekombinacija odigra između egzogenog BAFF-R gena koje nosi vektor i endogenog BAFF-R gena u embrionalnim stim ćelijama. Dodatna prikačena BAFF-R nukleinska kiselina je dovoljne dužine za uspešnu homologu rekombinaciju sa endogenim genom. Obično je nekoliko kilo baza prikačene DNK (i na 5' i na 3' krajevima) uključeno u vektor. Vidi npr., Thomas i sar. (1987)Cell 51:503za opis homologih rekombinantnih vektora. Vektor je uveden u embrionalnu stim ćelijsku liniju (npr. elektroporacijom) i ćelije u kojima je uvedeni BAFF-R gen homologo rekombinovan sa endogenim BAFF-R genom su selektovane (vidi npr. Li i sar. (1992)
Cell 69:915).
Odabrane ćelije su zatim injektirane u blastocist životinje (npr miša) da se formiraju agregacione himere. Vidi npr., Bradlev u Teratokarcinomi i embrionalne stim ćelije:<p>raktični pristup, Robertson izd. IRL, Oxford, 1987, str. 113-152. Himerni embrion može zatim biti implantiran u pogodnu pseudogravidnu pobuđenu ženku životinje i embrion je doveden do termina. Potomstvo koje je nosilo homologo rekombinovanu DNK u svojim germ ćelijama je moglo biti upotrebljeno da se odgajaju životinje u kojima sve ćelije životinje sadrže homologo rekombinovanu DNK putem transmisije germinativne linije transgena. Postupci za konstruisanje homotogih rekombinantnih vektora i homologih rekombinantnih životinja opisani su dodatno u Bradlev (1991)Curr. Opin. Biatechnol.2:823-829; PCT Internacionalne publikacije br.: WO90711354; VVO91/01140; WO92/0968; i VVO93/04169.
U drugom obliku mogu biti produkovane transgene ne-humane životinje koje sadrže odabrane sisteme koju dopuštaju regulisanu ekspresiju transgena. Jedan primer takvog sistema je cre/loxP rekombinantni sistem bakteriofaga P1. Za opis cre/loxP rekombinantnog sistema vidi npr. Lakso i sar (1992)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:6232-6236. Drugi primer sistema rekombinaze je FLP rekombinantni sistemS. cerevisiae(O'Gorman i sar. (1991)Science251:1351-1355. Ako je cre/loxP rekombinantni sistem upotrebljen da reguliše ekspresiju transgene životinje koja sadrži transgene koji kodiraju i ere rekombinazu i odabrani protein su potrebne. Takve životinje mogu se obezbediti konstrukcijom "dvostruke" transgene životinje, npr. ukrštanjem dve transgene životinje, jedne koja sadrži transgen, koji kodira odabrani protein i druge koja sadrži transgen, koji kodira rekombinazu.
Klonovi ne-humanih transgenih životinja opisanih ovde mogu takođe biti produkovani prema postupcima opisanim u Vvilmut i sar (1997)Nature385:810-813. Ukratko, ćelija, npr., somatična ćelija, iz transgene životinje može biti izolovana i indukovana da izađe iz ciklusa rasta i uđe u G0fazu. Prigušena ćelija može zatim biti fuzionisana, npr. upotrebom električnog pulsiranja sa enukleiranom oocitom iz životinje iste vrste iz koje je izolovana prigušena ćelija. Rekombinantna oocita je zatim kultivisana tako da se razvije do morule ili blastocite i zatim transformiše u pseudogravidnu pobuđenu ženku životinje. Potomstvo rođeno od ove pobuđene ženke životinje biće klon životinje iz koje je ćelija, npr., somatična ćelija, izolovana.
Farmaceutski preparati
Molekuli nukleinske kiseline BAFF-R, BAFF-R proteini i BAFF-R antitela (označeni ovde kao "aktiva jedinjenja") pronalaska i njihovi derivati, fragmenti, analozi i homolozi mogu biti inkorporirani u farmaceutske preprate pogodne za davanje. Takvi preparati obično sadrže molekul nukleinske kiseline, protein, ili antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač. Onako kako se koristi ovde "farmaceutski prihvatljiv nosač" podrazumeva da uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medije, obmotače, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i apsorpcione agense odlaganja i tome slično, kompatibilne sa farmaceutskim davanjem. Pogodni nosači su opisani većinom u skorijem izdanju Remrngton-ovih Farmaceutskih nauka, standardna referenca u ovom području, koja je ovde inkorporirana referncom. Poželjni primeri takvih nosača ili razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na vodu, slane rastvore, fingerove rastvore, rastvore dekstroze i 5% humani serum albumin. Takođe mogu biti upotrebljeni Lipozomi i ne-vodeni nosači, kao što su fiksna ulja. Upotreba takvog medija i agenasa za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u praksi. Upotreba bilo kog komercijalnog medijuma ili agensa u preparatu, ako je on inkopatibilan sa aktivnim jedinjenjem je predmet razmatranja. Dopunsko aktivno jedinjenje može takođe biti inkorporirano u preparate.
Farmaceutski preparat pronalska je formulisan da bude kompatibilan sa nameravanim načinom davanja. Primeri načina davanja uključuju parenteralno, npr. intravenski, intradermalno. subkutano, oralno (npr. inhalacijom), transdermalno (površinski), transmukozalno i rektalno. Rastvori i suspenzije upotrebljeni za parenteralno, intradermalno ili subkutano davanje mogu uključiti sledeće komponente: sterilne razblaživače, kao što su voda za injekcije, slani rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikoli, glicerin, polipropile giikol, ili druge sintetičke rastvarače; antibakterijske agense, kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidante, kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfat; helatirajuće agense, kao što je etilendiaminotetrasirćetna kiselina (EDTA); pufere, kao što su acetati, citrati ili fosfati i agense za doterivanje toničnosti, kao što su natrijum hiorid, ili dekstroza. pH može biti doteran sa kiselinama ili bazama kao što su hlorovodonična kiselina, ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat može biti zatvoren u ampule, odložive siringe ili višestruke dozne vijale napravljene od stakla ili plastike.
Farmaceutski preparati pogodni za injektiranje uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljivi u vodi) ili disperzione i sterilne prahove za trajne preparacije sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. Za intravensko davanje pogodni nosači uključuju fiziološku so, bakteriostatičku vodu, Cremophor EL (BASF, Parsippanv, NJ.) ili fosfatni pufer (PBS). U svim slučajevima preparat mora biti sterilan i mora biti tečan do tog obima da lako postoji u stanju pogodnom za davnje siringama. Mora biti stabilan u uslovima spravljanja i čuvanja i mora se čuvati od delovanja kontaminacije mikroorganizmima, kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarać ili disperzioni medijum, koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer glicerol, propilen giikol, i tečni polietilen glikol i tome slično), i njihove pogodne mešavine. Mora se održavati odgovarajuća fluidnost, na primer u potrebom omotača, kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinskih sredstava. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može biti dostignuto različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorbutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i tome slično. U mnogim slučajevima biće poželjno da se u prepad uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi, kao što su manitol, sorbitol, natrijum hiorid. Produžena apsorpcija injektibilnog preparata, može se postići uključivanjem u preparat agensa koji odlaže apsorpciju, na primer aluminijum monostearata i želatina.
Sterilni injektibilni rastvori mogu biti pripremljeni inkorporiranjem aktivnog jedinjenja (npr. BAFF-R proteina ili anti-BAFF-R antitela) u željenoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka pobrojanih gore, po potrebi, praćeno sterilizacijom putem filtracije. Generalno, disprzije su pripremljene inkorporiranjem aktivne komponente u sterilni nosač, koji sadrži bazni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od onih pobrojanih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremanje sterilnih injektibilnih rastvora postupci pripremanja su sušenje u vakumu i sušenje zamrzavanjem, što daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
Oralni preparati generaJno uključuju inertni razblaživač ili jestivi nosač. Oni mogu biti zatvoreni u želatinozne kapsule ili u tablete. Za svrhu oralnog terapeutskog davanja aktivno jedinjenje može biti inkorporirano sa ekscipijentima i korišćeno u obliku tableta, troheja ili kapsula. Oralni preparati mogu takođe biti pripremljeni korišćenjem tečnog nosača za upotrebu kao ispiraća usta, gde je jedinjenje koje je u tečnom nosaču primenjeno oralno i ispirano i izbačeno ili progutano. Farmaceutski kompatibilni agensi vezivanja i/ili adjuvansni materijali mogu biti uključeni kao deo preparata. Tablete, pilule, kapsule, troheje i tome slično mogu sadržati bilo koji od siedećih sastojaka ili jedinjenja slične prirode: veznik kao što je mikrokristaina celuloza, tragakant guma ili želatin; ekscipijent kao što su škrob i laktoza, agens za dezintegrisanje kao što su alginska kiselina, Pimogel ili kukuruzni škrob; sredstvo za podmazivanje kao što su magnezijum stearat ili Sterotes; glidant kao što je koloidni silikon dioksid; agens za zaslađivanje kao što su sukroza ili saharin; agens za ukus kao što su pepermint, metil salicilat ili ukus pomorandže.
Za davanje inhalacijom jedinjenja se isporučuju u obliku aerosolnog spreja iz kontejnera pod pritiskom ili raspršivača koji sadrži pogodni propelant, npr., gas kao što je ugljen dioksid ili nebulizator.
Sistemsko davanje može takođe biti transmukozalnim ili transdermalnim načinima. Za transmukozalno ili transdermalno davanje, u formulaciji koriste se odgovarajući penetranti u odnosu na barijeru kroz koju treba da se prođe. Takvi penetranti generalno su poznati u praksi i uključuju, na primer, za transmukozalno davanje, deterdžente, žučne soli i derivate fusidične kiseline. Transmukozalno davanje može biti obavljeno upotrebom nazalnih sprejova ili supozitorija. Za transdermalno davanje aktivna jedinjenja su formulisana u masti, meleme, gelove ili kreme kao što je opšte poznato u praksi.
Preparati mogu takođe biti pripremljeni u obliku supozitorija (npr., na konvencionalnoj osnovi supozitorija kao što je kakao puter ili drugi gliceridi) ili trajnih klistira za rektalnu upotrebu.
U jednom obliku, aktivna jedinjenja pripremljena su sa nosačima koji će zaštiti jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što su formulacije za kontrolisano oslobađanje, uključujući implante i sistem mikroinkapsulirane isporuke. Mogu se upotrebiti biodegradabilni, biokompatibilni polimeri kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Postupci pripremanja takvih formulacija biće očigledni onima sa iskustvom u praksi. Materijali se mogu takođe dobiti komercijalno od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomalne suspenzije (uključujući lipozome usmerene na inficirane ćelije sa monoklonalnim antitelima za viralne antigene) mogu se upotrebiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Oni mogu biti pripremljeni prema postupcima poznatim onima sa iskustvom u praksi, na primer, kao što je opisano u U.S. pat. Br. 4,522,811.
Posebno je korisno da se formulišu oralni ili parenteralni preparati u obliku dozne jedinice radi lakšeg davanja i uniformnosti doziranja. Jedinica doznog oblika onako kako se koristi ovde odnosi se na fizički izolovane jedinice pripravljene kao jedinstvene doze za subjekt koji se tretira; svaka jedinica koja sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatog da produkuje željeni terapeutski efekt u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za oblike jedinica doze pronalaska diktirane su i direktno su zavisne od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog efekta koji treba da se postigne.
Molekuli nukleinske kiseline pronalaska mogu biti uneti u vektore i upotrebljeni kao vektori genske terapije. Vektori genske terapije mogu biti isporučeni subjektu na bilo koji od brojnih načina, npr., kao što je opisano u U.S. patentu br. 5,703,055. Isporuka, prema tome, može takođe uključivati, npr., intravensku injekciju, lokalno davanje (vidi U.S. patent br. 5,328,470) ili stereotaktičku injekciju (vidi, npr., Chen i sar. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci.91:3054-3057). Farmaceutsko pripremanje vektora genske terapije može uključiti vektor genske terapije u prihvatljivom razblaživaču, ili može sadržati matriks za sporo oslobađanje u kojem je smešten nosač za isporuku gena. Alternativno, kada se može produkovati kompletan vektor za isporuku gena intaktno od rekombinantnih ćelija, npr., retroviralni vektori, farmaceutska preparacija može sadržati jednu ili više ćelija koje produkuju sistem isporuke gena.
Farmaceutski preparati mogu biti uključeni u kontejner, paket, ili raspršivač zajedno sa uputstvom za davanje.
Upotreba i postupci pronalaska
Molekuli nukleinske kiseline, homolozi proteina i antitela opisani ovde mogu se upotrebiti u jednom ili više sledećih postupaka: (a) skrining ogledima; (b) ogledima detekcije (npr., mapiranja hromozoma, tipiziranja tkiva, forenzičke biologije); (c) medicinskog predviđanja (npr., dijagnostičkim ogledima, prognostičkim ogledima, kliničkim trijalima monitoringa i farmakogenomici); i (d) postupcima tretmana (npr., terapeutici i profilaksi). Kao što je ovde opisano, u jednom obliku BAFF-R protein pronalaska ima sposobnost da vezuje BAFF.
Izolovani molekuli nukleinske kiseline pronalaska mogu se upotrebiti da eksprimiraju BAFF-R protein (npr., putem rekombinantnog ekspresionog vektora u ćeliji domaćinu u primeni genske terapije), da se detektuje BAFF-R mRNK (npr., u biološkom uzorku) ili genetička lezija u BAFF-R genu, i da se moduliše BAFF-R i/ili BAFF-R aktivnost kao što je opisano niže. Sem toga, BAFF-R proteini mogu se upotrebiti da se skrinuju lekovi i jedinjenja koja modulišu aktivnost BAFF-R ili ekspresiju, kao i da se tretiraju poremećaji okarakterisani nedovoljnom ili produkcijom u višku BAFF-R i/ili BAFF-R proteina, ili produkcijom oblika BAFF-R proteina koji imaju smanjenu ili aberantnu aktivnost u poređenju sa BAFF-R proteinom divljeg tipa. Sem toga, anti-BAFF-R antitela pronalaska mogu biti upotrebljena da se detektuju i izoluju BAFF-R proteini i moduliše BAFF-R i/ili aktivnost BAFF-R.
Ovaj pronalazak sadrži nove agense identifikovane gore-opisanim skrining ogledima i njihovu upotrebu u tretmanima kao što je ovde opisano.
Skrining ogledi
Pronalazak obezbeđuje postupak (takođe označen ovde kao "skrining ogled") za identifikovanje modulatora, tj. kandidata ili test jedinjenja ili agenasa (npr., peptida, peptidomimetika, malih molekula ili lekova) koji se vezuju za BAFF-R proteine ili imaju stimulatorni ili inhibitorni efekt na, na primer, ekspresiju BAFF-R ili aktivnost BAFF-R.
U jednom obliku pronalazak obezbeđuje oglede za skrining kandidate ili test jedinjenja koja se vezuju ili modulišu aktivnost BAFF-R proteina ili polipeptida ili njegovog biološki aktivnog dela. Test jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti dobijena korišćenjem biio kog od brojnioh pristupa u postupcima kombinatorne biblioteke poznatim u praksi, uključujući: biološke biblioteke, prostorno adresibilnu paralelnu čvrstu fazu ili bibliteke čvrste faze; postupke sintetičke biblioteke koji zahtevajui dekonvoluciju; bibliotečki postupak "jeda-pozicija jedno-jedinjenje"; i postupke sintetičke biblioteke koja koristi selekciju afinitetnom hromatografijom. Pristup biološke biblioteke je ograničen na peptidne biblioteke, dok su druga četiri pristupa primenjiva na peptide, ne-peptidne oligomere ili biblioteke jedinjenja malih molekula (Lam (1997)Anticancer Drug Des.12:145-167).
Primeri postupaka za sintetisanje molekularnih biblioteka mogu se pronaći u praksi. Na primer u: DevVitt i sar., (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6909-6013; Erb i sar. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:11422-11426; Zuckermann i sar. (1994)J. Med. Chem.37:267802685; Cho i sar. (1993)Science261:1303; Carrel i sar. (1994)Angew Chem. Int. Ed. Engl.33:2059: Carrel i sar. (1994)Angew Chem. Int. Ed. Engl.33:2061 i Gallop i sar. (1994)J. Med. Chem.37:1233-1251.
Biblioteke jedinjenja mogu biti predstavljene u rastvoru (npr., Houghten (1992)Biotechniques13:412-421) ili na pozicijama (Lam (1991)Nature354:82-84), na čipovima (Fodor
(1993)Nature364:555-556), bakteriji (Ladner U.S. pat. Br. 5,223,409), sporama (Ladner U.S. pat. Br.5,223,409), plazmidima (Cull i sar. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:1865-1869) ili na fagu (Scott i Smith (1990)Science249:386-390; Devlin (1990)Science249:4040406; Cvvirla i sar. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:6378-6382; Felici (1991)J. Mol. Biol.222:301-310; Ladner U.S. patent 5,223,409).
U jednom obliku, ogled je na ćelijama zasnovani ogled u kojem ćelije koje eksprimiraju membranski vezujući oblik BAFF-R proteina ili njegovog biološki aktivnog dela na ćelijskoj površini, je kontaktiran sa test jedinjenjem i određena je sposobnost test jedinjenja da se vezuje za BAFF-R protein. Ćelija, na primer, može biti sisarskog porekla ili ćelija kvasca. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da se vezuje za BAFF-R protein može biti postignuto, na primer, sjedinjavanjem test jedinjenja sa radioizotopom ili enzimskim obeleživačem tako da vezivanje test jedinjenja za BAFF-R protein ili njegov biološki aktivni deo može biti određeno detektovanjem obeleženog jedinjenja u kompleksu. Na primer, test jedinjenja mogu biti obeležena sa<12S>J, ^S,<14>C ili<3>H, bilo direktno ili indirektno i radioizotop se može detektovati direktnim brojanjem radioemisije ili scintilacionim brojanjem. Alternativno, test jedinjenje može biti obeleženo enzimatski sa, na primer, peroksidazom rena, alkalnom fosfatazom ili luciferazom i enzimatsko obeležje se može detektovati određivanjem konverzije odgovarajućeg supstrata u produkt. U jednom obliku ogled sadrži kontaktiranje ćelija koje eksprimiraju membranski vezani oblik BAFF-R proteina ili njegovog biološki aktivnog dela na površinu ćelije sa poznatim jedinjenjem koje vezuje BAFF-R da se formira ogledna mešavina, kontaktiranje ogledne mešavine sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da intereaguje sa BAFF-R proteinom, gde određivanje sposobnosti test jedinjenja da interreaguje sa BAFF-R proteinom sadrži određivanje sposobnosti test jedinjenja da preferentno vezuje BAFF-R ili njegov biološki aktivni deo u poređenju sa poznatim jedinjenjem.
U drugom obliku ogled je na ćelijama zasnovan ogled koji sadrži kontaktiranje ćelije koja eksprimira oblik BAFF-R proteina vezanog za membranu, ili njegov biodegradabilni deo, na površini ćelije sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da moduliše (npr. stimuliše ili inhibira) aktivnost BAFF-R proteina ili njegovog biološki aktivnog dela. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da moduliše aktivnost BAFF-R ili njegovog biološki aktivnog dela može biti izvedena, na primer, određivanjem sposobnosti BAFF-R proteina da se vezuje ili interreaguje sa BAFF-R ciljnim molekulom. Onako kako se ovde koristi "ciljni molekul" je molekul u kojem se BAFF-R protein vezuje ili reaguje u prirodi, na primer, molekul na površini ćelije, koji eksprimira BAFF-R protein, molekul na površini druge ćelije, molekul u ekstraćelijskom miljeu, molekul vezan sa unutrašnjom površinom ćelijske membrane ili citoplazmatični molekul. BAFF-R ciljni molekul može biti ne-BAFF-R molekul ili BAFF-R protein ili polipeptid predmetnog pronalaska. U jednom obliku BAFF-R ciljni molekul je komponenta puta transdukcije signala, koji olakšava transdukciju izvan ćeljskog signala (npr. signal generisan vezivanjem jedinjenja za BAFF-R molekul membranski vezan) kroz ćelijsku membranu i u ćeliju. Cilj može biti, na primer, drugi međućelijski protein koji ima katalitičku aktivnost ili protein koji olakšava asociranje nizvodnih signalnih molekula sa BAFF-R.
Određivanje sposobnosti BAFF-R da se vezuje za ili interreaguje sa ciljnim molekulom BAFF-R može biti izvedeno jednim od postupaka opisanim gore za određivanje usmerenog vezivanja. U jednom obliku određivanje sposobnosti BAFF-R proteina da se vezuje za ili interreaguje sa BAFF-R ciljnim molekulom može biti obavljeno određivanjem aktivnosti ciljnog molekula. Na primer, aktivnost ciljnog molekula može biti određena detektovanjem indukcije drugog celularnog glasnika cilja (tj. unutarćelijski Ca<2*>, diacilglicerol IP3, itd) detektovanjem katalitičke/enzimatske aktivnosti cilja i odgovarajućeg supstrata, detektovanje indukcije reporter gena (koji sadrži BAFF-R-odgovorni regulatorni element operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira detektibilni marker, npr., luciferazu) ili detekcije ćelijskog odgovora na primer, preživljavanje ćelije, diferenciranja ćelije ili proliferacija ćelije.
U još jednom obliku ogled predmetnog pronalaska je ogled bez ćelija koji sadrži kontatiranje BAFF-R proteina ili njegovog biološki aktivnog dela sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da se vezuje za BAFF-R protein ili njegov biološki aktivan deo. Vezivanje test jedinjenja za BAFF-R protein može se odrediti ili direktno ili indirektno, kao što je gore opisano. U jednom obliku ogled sadrži kontaktiranje BAFF-R proteina ili njegovog biološki aktivnog dela sa poznatim jedinjenjem koje vezuje BAFF-R da formira oglednu mešavinu, kontaktiranje ogledne mešavine sa test jedinjenjem i određivanje sposobosti test jedinjenja da interreaguje sa BAFF-R proteinom, gde određivanje sposobnosti test jedinjenja da interreaguje sa BAFF-R proteinom sadrži određivanje sposobnosti test jedinjenja da se preferentno vezuje za BAFF-R ili njegov biološki aktivni deo u poređenju sa poznatim jedinjenjem.
U drugom obliku ogled predmetnog pronalaska je ogled bez ćelija koji sadrži kontatiranje BAFF-R proteina ili njegovog biološki aktivnog dela sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da se moduliše BAFF-R protein (npr. stimuliše ili inhibira), aktivnost BAFF-R proteina ili njegovog biološki aktivnog dela. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da moduliše aktivnost BAFF-R može biti izvedena, na primer, određivanjem sposobnosti BAFF-R proteina da se vezuje za ciljni molekul BAFF-R jednim od gore opisanih postupaka za određivanje pravca vezivanja. U alternativnom obliku određivanje sposobnosti test jedinjenja da moduliše aktivnost BAFF-R može biti izvedeno određivanjem sposobnosti BAFF-R proteina da dalje moduliše BAFF-R ciljni molekul. Na primer, katalitička/enzimatska aktivnost ciljnog molekula na odgovarajućem supstartu može biti određena kao što je prethodno opisano.
U još jednom obliku ogled bez ćelija koji sadrži kontatiranje BAFF-R proteina ili njegovog biološki aktivnog dela sa poznatim jedinjenjem, koje vezuje BAFF-R da se formira ogledna mešavina, kontaktiranje ogledne mešavine sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da interreaguje sa BAFF-R proteinom gde određivanje test jedinjenja da interreaguje sa BAFF-R proteinom sadrži određivanje sposobnosti BAFF-R proteina da se preferentno vezuje za ili moduliše aktivnost ciljnog molekula BAFF-R.
Ogledi bez ćelija predmetnog pronalaska su pogodani za upotrebu i u rastvorljivom obliku ili u za membranu^vezanom obliku BAFF-R. U slučaju ogleda bez ćelija koji sadrži membrana-vezani oblik BAFF-R može biti poželjano da se upotrebi agens za rastvoranje tako da je za membranu-vezani oblik BAFF-R održavan u rastvoru. Primeri takvih agenasa za rastvaranje uključuju ne-jonske deterdžente kao što su n-oktilglukozid, n-dodecilglukozid, n-dodecilmaltozid, oktanoil-N-metilglukamid, dekanoil-N-metilglukamid, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, lzotriđecipoli(etilen giikol etar)n, 3-(3-holamidopropil)dimetilaminiol-1-propan sulfonat (CHAPS), 3-3-(3-holamidopropil)dimetilaminiol-2-hidroksi-1-propan sulfonat (CHAPSO), ili N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1 -propan sulfonat.
U više nego jednom obliku od gore pomenutih postupaka ogleda predmetnog pronalaska može biti poželjno da se imobiliše ili BAFF-R ili njegov ciljni molekul da se olakša razdvajanje kompleksovanog oblika od ne kompleksovanih oblika jednog ili oba proteina, kao i da se prilagodi automatizovanje ogleda. Vezivanje test jedinjenja za BAFF-R ili interakcija BAFF-R sa ciljnim molekulom u prisustvu ili odsustvu jedinjenja kandidata može biti izvedeno u bilo kojoj posudi pogodnoj za držanje reaktanata. Primeri takvih posuda uključuju mikrotitarske ploče, test tube i tube za mikrocentrifugu. U jednom obliku može biti obezbeden fuzioni protein koji dodaje domen koji omogućuje da jedan ili oba proteina budu vezani za matriks. Na primer, GST-BAFF-R fuzioni proteini ili GST-ciljni fuzioni proteini mogu biti apsorbovani na sefarozne perle glutationa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ili mikrolitarske ploče izvedene od glutationa, koje su zatim kombinovane sa test jedinjenjem ili test jedinjenje i ili se ne-apsorbovani ciljni protein ili BAFF-R protein, i mešavina zatim inkubira pod uslovima koji omogućuju formiranje kompleksa (npr. pri fiziološkim uslovima za soli i pH) nakon inkubiranja perlice ili mikrotitarska ploča sa bunarčićima su isprani da se uklone nevezane komponente, matriks je imobilizovan u slučaju perli, kompleks određen bilo direktno ili indirektno, na primer, kao što je gore opisano. Alternativno, kompleks može biti disociran iz matriksa i nivoi BAFF-R vezivanja ili aktivnosti određeni korišćenjem standardnih tehnika. Druge tehnike za imobilisanje proteina na matricama mogu se takođe upotrebiti u skrining ogledima pronalaska. Na primer, ili BAFF-R ili njegov ciljni molekul može biti imobilisan korišćenjem konjugacije biotina i streptavidina. Biotinilizirani BAFF-R ili ciljni molekuli mogu biti pripremljni iz bitoin-NHS (N-hidroksi-sukcinimid) koristeđi tehnike dobro poznate u praksi (npr. kit za biotinilizaciju, Pierce Chemicals, Rockford, III) i imobilizirani u bunarčićima streptavidinom obmotanih ploča sa 96 bunarčića (Pierce Chemical). Alternativno, antitela, reaktivna sa BAFF-R ili ciljnim molekulima, ali koja ne interferiraju sa vezivanjem BAFF-R proteina za njegov ciljni molekul, mogu biti derivatizovana u bunarčiće ploče i nevezani cilj ili BAFF-R zarobljen u bunarčićima putem konjugacije antitela. Postupci detektovanja takvih kompleksa u dodatku na one gore opisane za GST-imobilizirane komplekse, uključuju imunodetekciju kompleksa korišćenjem antitela reaktivnih sa BAFF-R ili ciljni molekul, kao i oglede vezane za enzime koji se odnose na detekciju enzimatske aktivnosti vezane sa BAFF-R ili ciljnim molekulom.
U drugom obliku modulatori BAFF-R ekspresije su identifikovani u postupku gde su ćelije kontaktirane sa jedinjenjem kandidatom i određena je ekspresija BAFF-R mRNK ili proteina u ćeliji. Nivo ekspresije BAFF-R mRNK ili proteina u prisustvu jedinjenja kandidata je upoređen sa nivoom ekspresije BAFF-R mRNK ili proteina u odsustvu jedinjenja kandidata. Jedinjenje kandidat može tada biti identifikovano kao modulator ekspresije BAFF-R zasnovane na ovom poređenju. Na primer, kada je ekspresija BAFF-R mRNK ili proteina veća (statistički signifikantno veća) u prisustvu jedinjenja kandidata onda je u njegovom odsustvu jedinjenje kandidat identifikovano kao stimulator ekspresije BAFF-R mRNK ili proteina. Alternativno, kada je ekspresija BAFF-R mRNK ili proteina manja (statistički signifikantno manja) u prisustvu jedinjenja kandidata nego u odsustvu, jedinjenje kandidat je identifikovano kao inhibitor ekspresije BAFF-R mRNK ili proteina. Nivo ekspresije BAFF-R mRNK ili proteina u ćeliji može se odrediti ovde opisanim postupcima za detektovanje BAFF-R mRNK ili proteina.
U još jednom aspektu pronalaska, BAFF-R proteini se mogu upotrebiti kao "mamac proteini" u dvo-hibridnom ogledu ili tri hibridnom ogledu (vidi, npr., U.S, pat, br. 5,283,317;
Zervos i sar. (1993)Cell 72:223-232;Madura i sar. (1993)J. Biol. Chem268:12046-12054;
Bartel i sar. (1993)Biotechniques14:920-924; Ivvabuchi i sar. (1993)Oncogene8:1693-1696; i Brent WO 94/10300, da se identifikuju drugi proteini koji se vezuju za ili intereaguju sa BAFF-R ("BAFF-R-vezujući proteini" ili " BAFF-R-bp") i modulišu aktivnost BAFF-R. Takvi BAFF-R vezujući proteini su verovatno takođe uključeni u propagaciju signala putem BAFF-R proteina kao, na primer, uzvodni ili nizvodni elementi BAFF-R puta.
Dvo-hibridni sistem zasnovan je na modularnoj prirodi većine transkripcionih faktora, koja se sastoji od razdvojenog vezivanja DNK i aktivacije domena. Ukratko, ogled koristi dva različita DNK konstrukta. U jednom konstruktu gen koji kodira za BAFF-R je fuzionisan za gen koji kodira domen vezivanja DNK poznatog transkripcionog faktora (npr., GAL-4). U drugom konstruktu sekvenca DNK iz biblioteke sekvenci DNK, koje kodiraju neidentifikovani protein ("plen" ili "uzorak") je fuzionisan za gen koji kodira aktivaciju domena poznatog transkripcionog faktora. Ako su "mamac" i "plen" proteini sposobni da intereaguju,in vivo,formiranje BAFF-R-zavisnog kompleksa, vezivanje DNK i domeni aktivacije transkripcionog faktora su dovedeni u neposrednu blizinu. Blizina omogućuje transkripciju reporter gena (e.g., LacZ) koji je operativno vezan za transkripciono regulaciono mesto reaktivno na transkripcioni faktor. Ekspresija reporter gena može se detektovati i kolonije ćelija koje sadrže funkcioni transkripcioni faktor mogu biti izolovane i upotrebljene da se dobije klonirani gen koji kodira protein koji interreaguje sa BAFF-R.
Ovaj pronalazak dalje se odnosi na nove agense identifikovane gore opisanim skrining ogledima i njihovu upotrebu za tretmane kao što je ovde opisano.
Ogledi detekcije
Delovi ili fragmenti cDNK sekvenci identifikovanih ovde (i odgovarajući komplet sekvenci gena) mogu biti upotrebljeni na brojne načine kao polinukleotidni reagensi. Na primer, ove sekvence mogu se upotrebiti za: (i) mapiranje njihovih respektivnih gena na hromozomu i tako lociranje regiona gena vezanih sa genetičkom bolesti; (ii) identifikaciju individue iz minutnog biološkog uzorka (tipiziranje tkiva); i (iii) pomoć u forenzičkoj identifikaciji biološkog uzorka. Ove aplikacije su opisane u podpoglavljima niže
Mapiranje hromozoma
Kad ee jedna sekvenca (ili deo sekvence) gena izoluje ova sekvenca može biti upotrebljena da se mapira ili locira gen na hromozomu. Ovaj proces se naziva mapiranje hromozoma. Prema tome delovi ili fragmenti BAFF-R, sekvenci, opisanih ovde mogu se upotrebiti da se mapira lokacija BAFF-R gena, respektivno, na hromozomima. Mapiranje BAFF-R sekvence hromozoma je važan prvi korak u korelisanju sekvenci sa genima vezanih sa bolesti.
Ukratko, BAFF-R geni mogu biti mapirani na hromozome pripremanjem PCR prajmera (poželjno 15-25 bp dugih) iz BAFF-R sekvenci. Kompjuterska analiza BAFF-R sekvenci može se upotrebiti da se brzo odaberu prajmeri koji ne obuhvataju više od jednog egzona u genomskoj DNK, što komplikuje proces amplifikacije. Ovi prajmeri mogu zatim biti upotrebljeni za PCR skrining hibrida somatičnih ćelija koji sadrže individualne hromozome date vrste. Samo oni hibridi koji sadrže specijes-specifičan gen koji odgovara BAFF-R sekvencama će dati amplificirane fragmente.
PCR mapiranje somatičnih ćelijskih hibrida je brza procedura za pripisivanje određene sekvence određenom hromozomu. Tri ili više sekvenci mogu biti određene dnevno koristeći pojedinačni termalni cikler. Koristeći BAFF-R sekvence da se dizajniraju oligonukleotidni prajmeri, može se postići sublokalizacija sa spiskom fragmenata iz specifičnih hromozoma.
Fluorescentnain situhibridizacija (FISH) sekvenci DNK na raspršene metafazne hromozome se može dalje koristiti da obezbedi precizne lokalizacije na hromozomima u jednom koraku. Hromozomski preparati mogu biti napravljeni korišćenjem ćelija čija je deoba blokirana u metafazi hemikalijama kao što je kolcemid koji narušava mitotičko vreteno. Hromozomi se mogu kratko tretirati sa tripsinom i zatim obojiti sa Giemsa-om. Štraftanje nalik na svetle i tamne trake razvija se na svakom hromozomu. tako da se hromozomi mogu pojedinačno identifikovati. FISH tehnika se može upotrebiti sa DNK sekvencom dugačkom samo 500 ili 600 baza. Međutim, klonovi duži od 1,000 baza imaju veću verovatnoću vezivanja za jedinstvene hromozomske lokacije sa dovoljnim intenzitetom signala za jednostavnu detekciju. Poželjno 1,000 baza i još poželjnije 2,000 baza biće dovoljno da. se dobiju dobri rezultati u razumnom vremenu. Radi preglednog prikaza vidi Verma i sar., Hromozomi čoveka: Praktikum osnovnih tehnika, Pergamon Press, N.Y., 1968).
Reagensi za mapiranje hromozoma mogu se koristiti pojedinačno da markiraju pojedinačni hromozom ili pojedinačno mesto na tom hromozomu, ili se može upotrebiti paleta reagensa za markiranje višestrukih mesta i/ili više hromozoma. Reagensi koji odgovaraju nekodirajućim regionima gena su u stvari preferirani za svrhe mapiranja. Verovatnije je da su kodirajuće sekvence konzervirane u porodicama gena, povećavajući tako šansu unakrsnog hibridizovanja tokom mapiranja hromozoma. Kada je jednom sekvenca mapirana na preciznu lokaciju na hromozomu, fizička pozicija sekvence na hromozomu se koreliše sa podacima genetičke mape. Takvi podaci se nalaze, na primer, kod McKusick, MendelovoNASLEđivANJEkod čoveka, dostupno on-line preko Johns Hopkins Universitv Welch Medical Librarv). Odnos između gena i bolesti, mapiranih na isti region hromozoma, može zatim biti identifikovano putem analize veze (ko-nasleđivanje fizički susednih gena), opisanim u, na primer, Egeland i sar.
(1987)Nature,325:783-787.
Štaviše mogu biti određene razlike u sekvencama DNK između jedinki pogođenih i nepogođenih sa bolesti vezanom za BAFF-R gen. Ako je zapažena mutacija kod neke ili svih pogođenih jedinki ali ne i kod nepogođenih jedinki onda je verovatno da je ta mutacija uzročnik određene bolesti. Poređenje pogođenih i nepogođenih jedinki generalno uključuje prvo pregledanje strukturnih pramena na hromozomima, kao što su delecije ili translokacije koje su vidljive na hromozomskim preparatima ili koje se mogu detektovati uotrebom PCR-a zasnovanog na toj sekvenci DNK. Konačno, može se obaviti kompletno sekvenciranje gena od nekoliko jedinki da se potvrdi prisustvo mutacije i da se razlikuje mutacija od polimorfizama.
Tipiziranje tkiva
BAFF-R sekvence predmetnog pronalaska mogu se takođe upotrebiti da se identifikuju jedinke iz minutnih bioloških uzoraka. U ovoj tehnici pojedinačna genomska DNK se digestira sa jednim ili više restrikcionih enzima, i ispita Southern blot-om da se dobiju jedinstvene trake za identifikaciju. Sekvence predmetnog pronalaska korisne su kao dodatni markeri DNK za RFLP ("polimorfizmi dužine restrikcionih fragmenata", opisani u U.S. pat. Br. 5,271,057).
Dalje se sekvence predmetnog pronalaska mogu upotrebiti da se obezbede alternativne tehnike koje određuju stvarnu baza-prema-bazi sekvencu DNK odabranih delova pojedinačnog genoma. Tako, BAFF-R sekvence ovde opisane mogu biti upotrebljene da se pripreme dva PCR prajmera sa 5' i 3' krajevima sekvenci. Ovi prajmeri se zatim mogu upotrebiti da se amplificira pojedinačna DNK i da se zatim sekvencira.
Palete odgovarajućih sekvenci DNK iz jedinki, pripremljene na taj način mogu se pokazati jedinstvenim za individualnu identifikaciju, pošto svaka jedinka ima jedinstven set takvih DNK sekvenci zahvaljujući alelskim razlikama. Sekvence predmetnog pronalaska se mogu upotrebiti da se dobije takva identifikacija sekvenci od jedinki i od tkiva. BAFF-R sekvence pronalaska jedinstveno predstavljaju delove humanog genoma. Alelske varijacije dešavaju se do nekog stepena u kodirajućim regionima ovih sekvenci i u većem stepenu u ne kodirajućim regionima. Procenjeno je da se alelsko variranje između pojedinačnih ljudi odigrava u frekvenci od oko jednom na svakih 500 baza. Većina alelskog variranja potiče od pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama (SNP-ovi) što uključuje polimorfizam dužine restrikcionih fragmenata (RFLP-ove).
Svaka od ovde opisanih sekvenci može, u nekom stepenu, da se upotrebi kao standard u odnosu na DNK iz jedinke koja se poredi u individualne svrhe. Pošto se veći broj polimorfizama dešava u nekodirajućim regionima, manje sekvenci je potrebno da bi se razlikovale jedinke. Nekodirajuće sekvence sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike 2A (SEQ ID BR:3), slike 2B (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), mogu komotno obezbediti pozitivnu pojedinačnu identifikaciju sa paletom od 10 do 1,000 prajmera koji svaki daje nekodirajuće amplificirane sekvence od 100 baza. Ako je predviđeno da se upotrebe kodirajuće sekvence, kao što su one sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike2A(SEQ ID BR:3), slike 2B (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), broj prajmera koji više odgovara za pozitivnu individualnu identifikaciju biće 500-2,000.
Prognostička medicina
Predmetni pronalazak takođe se odnosi na područje medicine predviđanja u kojoj su dijagnostički ogledi, prognostički ogledi, framakogenomika i monitoring kliničkih trijala prognostički (prediktivni) ciljevi da se tako tretira jedinka profilaktički. Prema jednom aspektu predmetni pronalazak odnosi se na dijagnostičke oglede za determinisanje BAFF-R proteina i/ili ekspresiju nukleinske kiseline kao i aktivnost BAFF-R u kontekstu biološkog uzorka (npr. krv, serum, ćelije tkiva) i tako odredi da li je jedinka pogođena sa bolešću ili poremećajem ili je pod rizikom da razvije poremećaj, vezano za aberantnu ekspresiju ili aktivnost BAFF-R. Pronalazak takođe obezbeđuje prognostičke (ili prediktivne) oglede za određivanje da li je jedinka pod rizikom da razvije poremećaj vezan sa ekspresijom ili aktivnošću BAFF-R proteina ili nukleinske kiseline. Na primer, mutacije u BAFF-R genu mogu se ispitati ogledom u biološkom uzorku. Takvi ogledi mogu se upotrebiti za prognostičke i prediktive svrhe da se tako profilaktički trtira jedinka pre početka poremećaja okarakterisanog sa ili vezanog za ekspresiju ili aktivnost BAFF-R proteina ili nukleinske kiseline.
Drugi aspekt poronlaska obezbeđuje postupke za određivanje aktivnosti i ekspresije BAFF-R proteina, nukleinske kiseline ili aktivnosti BAFF-R kod jedinke da se tako odabere odgovarajući terapeutski ili profilaktički agens za tu jedinku (označen ovde kao "farmakogenomika"). Farmakogenomika obogućuje selekciju agenasa (npr. lekova) za terapeutski ili profilaktički tretman jedinke zasnovan na genotipu jedinke (npr. genotipu jedinke ispitanom da se odredi sposobnost jedinke da reaguje na određeni agens).
Još jedan apekt pronalaska odnosi se na monitoring uticaja agensa (npr. lekova, jedinjenja) na ekspresiju ili aktivnost BAFF-R u kliničkim trijalaima.
Ovaj i drugi agensi su opisani detaljnije u sledećim odeljcima.
Diajgnostički ogledi
Primerni postupak za detekciju prisustva ili odsustva BAFF-R u biološkom uzorku uključuje dobijanje biološkog uzorka od test subjekta i kontaktiranje biološkog uzorka sa jedinjenjem ili agensom sposobnim da detektuje BAFF-R protein ili nukleinsku kiselinu (npr., mRNK, genomsku DNK) koja kodira BAFF-R protein tako da je prisustvo BAFF-R detektovano u biološkom uzorku. Agens za detektovanje BAFF-R mRNK ili genomske DNK je obeležena proba nukleinske kiseline sposobna da hibridizuje za BAFF-R mRNK ili genomsku DNK. Proba nukleinske kiseline može biti, na primer, BAFF-R nukleinska kiselina pune dužine, kao što je bilo koja nukleinska kiselina sa slike 1A (SEQ ID BR:1), slike 1B (SEQ ID BR:2), slike2A(SEQ ID BR:3), slike 2B (SEQ ID BR:4) i slike 3 (SEQ ID BR:6), ili njen deo, kao što je oligonukleotid dugačak najmanje 15, 30, 50, 100, 250 ili 500 nukleotida i dovoljan da specifično hibridizuje pod uslovima strogoće sa BAFF-R mRNK ili genomskom DNK. Ovde su opisane druge pogodne probe za upotrebu u dijagnostičkim ogledima pronalaska.
Agens za detekciju BAFF-R proteina je antitelo sposobno da veže BAFF-R protein, poželjno antitelo sa detektabilnim obeležavanjem. Antitela mogu biti poliklonalna, ili poželjnije monoklonalna. Može biti upotrebljeno intaktno antitelo ili njegov fragment (npr., Fab ili F(ab')2). Termin "obeleženo", u odnosu na probu ili antitelo ima namenu da obuhvati direktno vezivanje probe ili antitela sjedinjavanjem (tj. fizički vezano) detektibilne supstance za probu ili antitelo, kao i indirektnim obeležavanjem probe ili antitela reagovanjem sa drugim reagensom koji je direktno obeležen. Primeri indirektnog obeležavanja uključuju detekciju primarnog antitela korišćenjem fluorescentno obeleženog sekundarnog antitela i obeležavanjem kraja DNK probe sa biotinom tako da može biti detektovan sa fluorescentno obeleženim streptavidinom. Termin "biološki uzorak" namenjen je da uključi tkiva, ćelije i biološke tečnosti izolovane iz subjekta, kao i tkiva, ćelije i tečnosti prisutne u subjektu. To znači da postupak detekcije pronalaska može biti upotrebljen da se detektuje BAFF-R mRNK, protein ili genomska DNK u biološkom uzorkuin vitrokao iin vivo.Na primer,in vitrotehnike za detekciju BAFF-R m RNK uključuju Northern hibridizaciju iin situhibridizaciju.In vitrotehnike za detekciju BAFF-R proteina uključuju imunosorbent oglede vezane za enzime (ELISA), VVestem blotove, imunotaloženje i imunofluorescenciju.In vitrotehnike za detekciju BAFF-R genomske DNK uključuju Southern hibridizaciju. Dalje,in vivotehnike za detekciju BAFF-R proteina uključuju uvođenje u subjekt anti-BAFF-R antitela. Antitelo, na primer, može biti obeleženo sa radioaktivnim markerom čije prisustvo i lokalizacija u subjektu mogu biti detektovani standardnim tehnikama imidžinga.
U jednom obliku biološki uzorak sadrži molekule proteina iz test subjekta. Alternativno, biološki uzorak može sadržati molekule mRNK iz test subjekta ili molekul genomske DNK iz test subjekta. Preferentni biološki uzorak je uzorak leukocita periferne krvi izolovan konvencionalnim načinima iz subjekta.
U drugom obliku postupci dalje uključuju dobijanje kontrolnog biološkog uzorka iz kontrolnog subjekta, kontaktiranje kontrolnog subjekta sa jedinjenjem ili agensom sposobnim da detektuje BAFF-R protein, mRNK ili genomsku DNK, tako da je prisustvo BAFF-R proteina, mRNK ili genomske DNK detektovano u biološkom uzorku i poređenje prisustva BAFF-R proteina, mRNK ili genomske DNK u kontrolnom uzorku sa prisustvom BAFF-R proteina, mRNK ili genomske DNK u test uzorku. Pronalazak takođe sadrži kitove za detektovanje prisustva BAFF-R u biološkom uzorku. Na primer, kit može sadržati: obeleženo jedinjenje ili agens sposoban za detektovanje BAFF-R proteina ili mRNK u biološkom uzorku; načine za određivanje količine BAFF-R u uzorku; i načine za poređenje količine BAFF-R u uzorku sa standardom. Jedinjenje ili agens mogu biti upakovani u pogodni kontejner. Kit može dalje sadržati uputstva za upotrebu kita da se detektuje BAFF-R protein ili nukleinska kiselina.
Prognostički ogledi
Dijagnostici postupci opisani ovde mogu se dalje upotrebiti da se identifikuje subjekt koji je pod rizikom da razvije bolest ili poremećaj vezan sa aberantnom ekspresijom ili aktivnosti BAFF-R. Na primer, ogledi opisani ovde, kao što su prethodni dijagnostički ogledi ili ogledi koji slede, mogu se upotrebiti da se identifikuje subjekt koji je pod rizikom da razvije poremećaj vezan sa ekspresijom ili aktivnosti BAFF-R proteina, nukleinske kiseline, npr., autoimuna stanja kao što je autoimuna hemolitička anemija i sistemski lupus eritematosus. Alternativno, prognostički ogledi mogu se upotrebiti da se identifikuje subjekt koji je pod rizikom da razvije bolest ili poremećaj. Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za identifikovanje bolesti ili poremećaja vezanih sa aberantnom eksperisjom ili aktivnosti BAFF-R u kojoj je test uzorak dobijen od subjekta a BAFF-R protein ili nukleinska kiselina (npr., mRNK, genomska ONK) je detektovana, gde je prisustvo BAFF-R proteina ili nukleinske kiseline dijagnostičko za subjekt koji je pod rizikom da razvije bolest ili poremećaj vezan sa aberantnom ekspresijom ili aktivnošću BAFF-R. Onako kako se ovde koristi "test uzorak" može biti biološka tečnost (npr., serum), uzorak ćelija ili tkivo.
Dalje, ovde opisani prognostički ogledi mogu se upotrebiti da se odredi da li subjektu može da se daje agens (npr., agonist, antagonist, peptidomimetik, protein, peptid, nukleinska kiselina, mali molekul ili drugi lekovi kandidati) da se tretira bolest ili poremećaj vezan sa aberantnom ekspresijom ili aktivnošću BAFF-R. Takvi postupci se mogu upotrebiti, na primer, da se odredi da li subjekt može biti efikasno tretiran sa agensom za poremećaj. Tako, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za određivanje da li subjekt može biti efektivno tretiran sa agensom za poremećaj vezan sa aberantnom ekspresijom ili aktivnošću BAFF-R u kojem je test uzorak dobijen a BAFF-R protein ili nukleinska kiselinasu detektovani (npr., gde je prisustvo BAFF-R proteina ili nukleinske kiseline dijagnostičko za subjekt kojem se može davati agens da se tretira poremećaj vezan sa aberantnom ekspresijom ili aktivnosti BAFF-R).
Postupak pronalaska se može takođe upotrebiti da se detektuju genetičke lezije u BAFF-R genu, određujući tako da li je subjekt sa lezijom u genu pod rizikom za ili pati od tumorogenog ili autoimunog poremećaja. U različitim oblicima, postupci uključuju detektovanje, u uzorku ćelija iz subjekta, prisustvo ili odsustvo genetičke lezije okarakterisane sa najmanje jednom izmenom koja pogađa integritet gena koji kodira BAFF-R protein, ili pogrešnom-ekspresijom BAFF-R gena Na primer, takva genetička lezija može biti detektovana putem potvrđivanja postojanja najmanje jedne (1) delecije jednog ili više nukleotida iz BAFF-R gena; (2) adicije jednog ili više nukleotida BAFF-R genu; (3) supstitucije jednog ili više nukleotida BAFF-R gena; (4) hromozomskog rearanžmana BAFF-R gena; (5) izmene nivoa glasničke RNK transkripta BAFF-R gena; (6) aberantne modifikacije BAFF-R gena, kao što je metilacioni put genomske DNK; (7) prisustva ne-divljeg tipa načina uvrtanja transkripta glasničke RNK BAFF-R gena; (8) nivoa ne-divljeg tipa BAFF-R proteina; (9) alelskog gubitka BAFF-R gena i (10) neodgovarajuće post-translacione modifikacije BAFF-R proteina. Kao što je ovde opisano postoji veliki broj tehnika ogleda poznatih u praksi koje mogu da se upotrebe za detektovanje lezija u BAFF-R genu. Preferirani biološki uzorak je uzorak limfocita periferne krvi izolovan iz subjekta konvencionalnim postupcima. Međutim, može se upotrebiti biio koji biološki postupak koji sadrži ćelije sa jedrima, uključujući, na primer, ćelije bukalne mukoze.
U određenim oblicima, detekcija lezija uključuje upotrebu proba/prajmer u lančanoj reakciji polimeraze (PCR) (vidi, npr., U.S. pat. Br. 4,683,195 i 4,683,202), kao što je sidreni PCR ili RACE PCR, ili alternativno, lančana reakcija u vezivanju (LCR) (vidi, npr., Landegarn i sar., (1988)Science241:1077-1080; i Nakazavva i sar. (1994)Proc, Natl. Acad. Sci. USA91:360-364), poslednji je posebno koristan za detekciju tačkastih mutacija u BAFF-R genu (vidi Abravava i sar. (1995)Nucl. Acid Ftes.23:675-682). Ovaj postupak može uključiti postupke sakupljanja uzorka ćelija od pacijenta, izolovanja nukleinske kiseline (npr., genomske, mRNK ili obe) iz ćelija uzorka, kontaktiranja uzorka nukleinske kiseline sa jedinim ili više prajmera koji specifično hibridizuju za BAFF-R gen pod takvim uslovima da se odigraju hibridizacija i amplifikacia BAFF-R gena (ako je prisutan), i detektuje prisustvo ili odsustvo produkta amplifikacije, ili detektuje veličine produkta amplifikacije i uporedi dužina sa kontrolnim uzorkom. Predviđeno je da PCR i/ili LCR mogu korisni da se upotrebe kao preliminarni amplifikacioni korak u konjukciji sa bilo kojom od tehnika koje se koriste za detekciju mutacija i koje su ovde opisane.
Alternativni amplifikacioni postupci uključuju: samopodpomognutu replikaciju sekvence (Guatelli i sar., (1990)Proc, Natl. Acad. Sci. USA87:1874-1878), transkripcioni amplifikacioni sistem (Kwoh i sar. (1989)Proc, Natl. Acad. Sci. USA86:1173-1177), Q-Beta replikazu (Lizardi i sar. (1988)Bio Technology6:1197) ili bilo koju drugu amplifikacionu metodu za nukleinske kiseline, praćeno detekcijom amplifikovanih molekula koristeći tehnike dobro poznate onima sa iskustvom u praksi. Ove detekcione sheme su posebno korisne za detekciju molekula nukleinske kiseline ako su takvi molekuli prisutni u vrlo niskim brojevima.
U alternativnom obliku, muatcije u BAFF-R genu iz ćelije uzorka mogu biti identifikovane izmenama u načinu na koji restrikcioni enzimi deluju. Na primer, uzorak kontrolne DNK je izolovan, ampfifikovan (po izboru), digestiran sa jednom ili više restrikcionih endonukleaza i odre-đene su dužine fragmenata putem gel elektroforeze i upoređene. Razlike u veličini dužine fragmenata uzorka i kontrolne DNK naznačavaju mutacije u uzorku DNK. Štaviše, upotreba ribozoma specifičnih za sekvence (vidi, na primer U.S. pat. br. 5,493,531) može se upotrebiti da se registruje prisustvo specifičnih mutacija putem razvitka ili gubitka ribozimalnog mesta isecanja.
U drugim oblicima, genetičke mutacije u BAFF-R mogu se identifikovati hibridizacijom uzorka i kontrolne nukleinske kiseline, npr., DNK ili RNK, do visoke gustine niza koji sadrži stotine ili hiljade oligonukleotidnih proba (Cronin i sar. (1996)Human mutation7:244-255; Kozal i sar. (1996)Nature Med.2:753-759). Na primer, genetičke mutacije u BAFF-R mogu biti identifikovane u dvo-dimenzionalnom nizu koji sadrži svetlo-generisane DNK probe kao što je opisano kod Cronin i sar.. (1996)Human mutation7:244-255. Ukratko, prvi hibridizacioni niz proba može se upotrebiti da se skanira kroz duge odsečke DNK, u uzorku i kontroli, da se identifikuju promene baza između sekvenci praveći linearne nizove proba koje se sekvencijalno preklapaju. Ovaj korak omogućuje identifikaciju tačkastih mutacija. Ovaj korak je praćen drugim hibridizaclonim nizom koji omogućuje karakterizaciju specifičnih mutacija korišćenjem male, specijalizovane probe komplementarnosti nizova za sve varijante ili detektovane mutacije. Svaki mutacioni niz je sastavljen od paralelnih setova proba, jedan komplementaran genu divljeg tipa i drugi komplementaran mutantnom genu.
U još jednom obliku bilo koja od mnoštva reakcija sekvenciranja poznata u praksi može se upotrebiti da se direktno sekvencira BAFF-R gen i detektuje mutacija poređenjem sekvence uzorka BAFF-R sa odgovarajućim divljim tipom (kontrola) sekvence. Primeri reakcija sekvenciranja uključuju one zasnovane na tehikama razvijenim od strane Maxim-a i Gilbert-a
(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA74:560 ili Sanger-a (1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA74:5463. Takođe je uočeno da bilo koja od monoštva automatskih procedura sekvenciranja može biti upotrebljena kada se izvode dijagnostički ogledi (Naeve i sar. (1995)Biotechniques19:448), uključujući sekvenciranje masenom spektrometrijom (vidi, npr., PCT Internacionalnu publ. br. WO 94/16101; Cohen isar. (1966)Adv. Chromatogr.36:127-162; i Griffin i sar. (1993)Appl. Biochem. Biotechnol.38:147-159).
Drugi postupcu za detekciju mutacija u BAFF-R genu uključuju postupke u kojima zaštita od agenasa isecanja se koristi da se detektuju pogrešno sparene baze u RNK/RNK ili RNK/DNK heterodupleksima (Myers i sar. (1985)Science230:1242). Generalno, praksa tehnike "mismatch cleavage" započinje obezbeđivanjem heterodupleksa formiranog hibridizovanjem (obeležene) RNK ili DNK koja sadrži divlji-tip BAFF-R sekvence sa potencijalno mutiranom RNK ili DNK dobijenom iz uzorka tkiva. Dvo-lančani dupleksi su tretirani sa agensom koji seče jedno-lančane regione dupleksa tako da će postojati zahvaljujući mismeču baznih parova između kontrole i lanaca uzorka. Na primer, RNK/DNK dupleksi mogu biti tretirani sa RNazom i DNK/DNK hibridi tretirani sa S1 nukleazom da se enzimatski digestiraju pogrešno spareni regioni. U drugim oblicima, bik) DNK/DNK ili RNK/DNK dupleksi mogu biti tretirani sa hidroksi-laminom ili osmijum tetroksidom i sa piperidinom sa ciljem da se digestiraju pogrešno spareni regioni. Nakon digestije pogrešno sparenih regiona, nastali materijal je zatim razdvojen po veličini na denaturišućim poliakrilnim gelovima da se odredi mesto mutacije. Vidi, npr., Cotton i sar. (1988)Proc. Nati, Acad. Sci. USA85:4397; Saleeba i sar. (1992)Methods Enzymol.217:286-295. U jednom obliku kontrolna DNK ili RNK mogu biti obeležene radi detekcije.
U još jednom obliku, reakcija isecanja pogršnog sparivanja uključuje jedan ili više proteina koji prepoznaju pogrešno sparene bazne parove u dvo-lančanoj DNK (takozvani "DNK mismeč reper" enzimi) u đefinisanim sistemima za detekciju i mapiranje tačkastih mutacija u BAFF-R cDNK dobijenim iz uzoraka ćelija. Na primer, mutY enzimE coliseče A na G/A pogrešnom sparivanju i timidin DNK glikozilaza iz HeLa ćelija seče T na G/T pogršnim sparivanjima (Hsu i sar. (1994)Carcinogenesis15:1657-1662). Prema jednom primernom obliku, proba zasnovana na BAFF-R sekvenci, npr., sekvenca BAFF-R divljeg tipa je hibridizovana sa cDNK ili drugim produktom DNK iz test ćelije(a). Dupleks je tretiran sa DNK mismeč reper enzimom i produkti isecanja, ako ih ima, mogu biti detektovani na osnovu elektroforetskih protokola, ili tome slično. Vidi, npr., U.S. pat. br. 5,459,039.
U drugom obliku izmene elektroforetske mobilnosti će biti upotrebljene da se identifikuju mutacije u BAFF-R genima. Na primer, jednolančani konformacioni polimorfizam (SSCP) može biti upotrebljen da se detektuju razlike u elektroforetskoj mobilnosti između mutantnog i divljeg tipa nukleinskih kiselina (Orita i sar. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2766, vidi takođe Cotton (1993)Mutat. Res.285:125-144; Havashi (1992)Genet. Anal. Tech. Appl.9:73-79). Jednolančani fragmenti DNK uzorka i kontrolne BAFF-R nukleinske kiseline biće denaturisani i ostavljeni da se renaturišu. Sekundarna struktura jednolančanih nukleinskih kiselina varira u skladu sa sekvencom, nastala izmena u elektroforetskoj mobilnosti omogućuje detekciju promene čak samo jedne baze. Fragmenti DNK mogu biti obeleženi ili detektovani sa obeleženim probama. Osetljivost ogleda može biti pojačana korišćenjem RNK (rađe nego DNK) kod koje je sekundarna struktura osetljivija na promene sekvence. U jednom obliku, predmetni postupak koristi analizu heterodupleksa da se razdvoje molekuli dvolančanog heterodupleksa na osnovi pramena u elektroforetskoj mobilnosti (Keen i sar. (1991)Trends Genet. 7:5).
U još jednom obliku, kretanje mutantnih fragmenata divljeg tipa u poliakrilamidnim gelovima koji sadrže gradijent denaturanta, je ispitano putem gradijent denaturišuće gel elektroforeze (DGGE) (Myers i sar. (1985)Nature313:495). Kada se kao postupak za analizu koristi DGGE DNK će biti modifikovana da se obezbedi da se ona nedenaturiše kompletno, na primer, dodavanjem GC spone od približno 40 bp visoko-taljene GC-bogate DNK sa PCR. U daljem obliku gradijent temperature je upotrebljen umesto denaturišućeg gradijenta da se identifikuju razlike u mobilnosti kontrole i uzorka DNK (Rosenbaum i Reissner (1987)Biophys. Chem.265:12753).
Primeri drugih tehnika za detektovanje tačkastih mutacija uključuju, ali nisu ograničeni na, hibridizaciju odabranih oligonukleotida, selektivnu amplifikaciju, selektivno produženje prajmera. Mogu biti pripremljeni, na primer, oligonukleotidni prajmeri kod kojih je poznata mutacija postavljena centralno i zatim hibridizovana sa ciljnom DNK pod uslovima koji dozvoljavaju hibridizaciju samo ako je nađeno perfektno sparivanje (Saiki i sar. (1986)Nature324:163) Siaki i sar. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:6230). Takvi, za alele specifični oligonukleotidi, su hibridizovani za ciljnu DNK amplifikvanu sa PCR-om ili jedan broj različitih mutacija kada su oligonukleotidi pričvršćeni za hibridizacijsku membranu i hibridizovani sa ciljnom obeleženom DNK.
Tehnologija specifične alelske amplifikacje koja zavisi od selektivne PCR amplifikace može biti alternativno upotrebljena zajedno sa ovim pronalaskom. Oligonukleotidi upotrebljeni kao prajmeri za specifičnu amplifikaciju mogu nositi mutaciju od interesa u centru molekula (tako da amplifikacija zavisi od diferencijalne hibridizacije) (Gibbs i sar. (1989)Nucl. Acid Res.17:2437-2448 ili na ekstremnom 3' kraju jednog od prajmera gde, pod odgovarajućim uslovima, pogrešno sparivanje može sprečiti ili redukovati polimeraznu ekstenziju (Prossner (1993)Tibetch11:238). Sem toga može biti poželjno da se uvede novo restrikciono mesto u regionu mutacije da se kreira detekcija zasnovana na isecanju (Gasparini i sar. (1992)Mol. Cell. Probes6:1). Predviđeno je da kod određenih oblika amplifikacija može takođe biti izvedena korišćenjem Taq ligaze za amplifikaciju (Barny (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:189). U takvim slučajevima, vezivanje će se dogoditi samo ako postoji perfektno poklapanje na 3' kraju 5' sekvence, čineći mogućim da se detektuje prisustvo poznate mutacije na specifičnom mestu traženjem prisustva ili odsustva amplifikacije.
Ovde opisani postupci mogu se izvesti, na primer, korišćenjem prethodno upakovanih dijagnostičkih kitova koji sadrže najmanje jednu probu nukleinske kiseline ili antitela reagensa opisanog ovde, koji se može konvencionalno upotrebiti, npr. u kliničkim postavkama, da se dijagnostifikuju pacijenti koji pokazuju simptome porodične isorije bolesti ili bolest koja uključuje BAFF-R gen.
Dalje, bilo koji tip ćelija ili tkiva, u kojem je BAFF-R eksprimiran može biti upotrebljen u prognostičkim ogledima opisanim ovde. Međutim, bilo koji biološki uzorak koji sadrži ćelije sa jedrom može se upotrebiti, uključujući, na primer. ćelije bukalne mukoze.
Farmakogenomika
Agensi ili modulatori koji imaju stimulativni ili inhibitorni efekt na aktivnost BAFF-R (npr.. ekspresija gena BAFF-R), kao što je identifikovano skrining ogledom opisanim ovde, mogu biti davani jedinkama da se tretiraju (profilaktički ili terapeutski) poremećaji (npr., vezani za kancer ili autoimune bolesti). Zajedno sa takvim tretmanom može biti razmotrena farmakogenomika jedinke (tj. izučavanje veze iameđu individualnog genotipa i individualnog odgovora na strano jedinjenje ili lek). Razlike u metabolizmu terapeutika mogu dovesti do jake toksičnosti ili neuspeha terapeutika menjanjem odnosa između doze i koncentracije u krvi farmakološki aktivnog leka. Tako, famakogenomika jedinke dozvoljava selekciju efektivnog agensa (npr., leka) za profilaktičke ili terapeutske tretmane zasnovane na razmatranju genotipa jedinke. Takva farmakogenomika može dalje biti upotrebljena da se odrede odgovarajuće doze i terapeutski režimi. Shodno tome mogu biti određeni aktivnost BAFF-R proteina, ekspresija BAFF-R nukleinske kiseline ili sadržaj mutacija BAFF-R gena kod jedinke da se odabere odgovarajući agens(i) za terapeutski ili profilaktički tretman jedinke.
Farmakogenomika se odnosi na klinički značajne nasledne variacije u odgovoru na lekove zahvaljujući izmenjenom razmeštanju leka i abnormalnom delovanju pogođenih osoba. Vidi, npr., Eichelbaum (1996)Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.23:983-985 i Linder (1997)Clin. Chem.43:254-266. Generalno, mogu biti identifikovana dva tipa farmakogenetičkih stanja. Genetički uslovi koji se prenose kao pojedinačni faktor koji menja način na koji lekovi deluju na organizam (izmenjeno delovanje leka) ili genetički uslovi koji se prenose pojedinačnim faktorom koji menjaju način na koji organizam deluje na lekove (izmenjen metabolizam leka). Na primer, deficijencija glukozo-6-fosfat dehidrogenaze (G6PD) se često nasleđuje kao enzimopatija u kojoj je glavna klinička komplikacija hemoliza nakon ingestije oksidativnih lekova (anti-malariskih, sulfonoamida, analgetika, nitrofurana) i uzimanja pasulja.
Kao ilustrativni obKk, aktivnost enzima koji metaboliziraju lek je. glavna odrednica i intenziteta i trajanja delovanja leka. Otkriće genetičkih polimorfizama enzima koji metaboliziraju lek (npr., N-acetiltransferaza 2 (NAT 2) i citohrom P450 enzimi CYP2D6 i CYP2C19) pružilo je objašnjenje zašto kod nekih pacijenata nema očekivanih efekata leka ili oni pokazuju preuveličani odgovor na lek i ozbiljnu toksičnost nakon uzimanja standardnih i sigurnih doza leka. Ovi polimorfizmi su eksprimirani u dva fenotipa u populaciji, ekstenzivni metabolizator (EM) i siromašni metabolizator (PM). Preovlađivanje PM je različito medu različitim populacijama. Na primer, gen koji kodira CYP2D6 je visoko polimorfan i identifikovano je nekoliko mutacija u PM koje sve vode odsustvu funkcionalnog CYP2D6. Siromašni metabolizatori CYP2D6 i CYP2C19 vrlo frekventno pokazuju preterane odgovore na lek i sporedne efekte kada dobijaju standardne doze. Ako je metabolit aktivna terapeutska grupa, PM ne pokazuju terapeutski odgovor, kao što je pokazano za analgetičke efekte kodeina posredovane sa CYP2D6-formiranim metabolitom morfinom. Drugi ekstremi su takozvani ultra-brzi metabolizatori koji ne odgovaraju na standardne doze. Nedavno je identifikovano da je molekularna osnova ultra-brzog metabolizma amplifikacija CYP2D6 gena.
Tako, aktivnost BAFF-R proteina, ekspresija BAFF-R nukleinske kiseline ili mutacioni sadržaj BAFF-R gena kod jedinke mogu biti identifikovani da se tako odabere odgovarajući agens(e) za terapeutski ili profilaktički tretman jedinki. Sem toga, farmakogenetičke studije mogu se upotrebiti da se primeni genotipiranje polimorfnih aiela koji kodiraju enzime koji metabolišu lek da se identifikuje reakcija individualnog fenotipa na lek. Primenom ovog znanja na doziranje ili odabir leka mogu se izbeći štetne reakcije ili neuspeh terapeutika i tako pojačati terapeutska ili profilaktička efikasnost, kada se tretira subjekt sa BAFF-R modulatorom, kao što je modulator identifikovan jednim od primernih skrining ogleda opisanih ovde.
Monitoring kliničke efikasnosti
Monitoring uticaja agenasa (npr. lekova, jedinjenja) na ekspresiju ili aktivnost BAFF-R (npr. sposobnost da moduliše proliferaciju aberantne ćelije i/ili diferencijaciju) može biti primenjen ne samo na osnovni skrining leka nego takođe i na kliničke trijale. Na primer opisano jeda efektivnost agensa određenog skrining ogledom povećava ekspresiju BAFF-R gena, nivoe proteina ili dodatno reguliše aktivnost BAFF-R i može biti praćena u kliničkim trijalima subjekta koji pokazuje smanjenu ekspresiju BAFF-R gena, nivoe proteina ili dodatne regulacije aktivnosti BAFF-R. Alternativno efikasnost agensa određena skrining ogledom da smanji ekspresiju BAFF-R gena, nivoe proteina ili dodatno reguliše aktivnost BAFF-R, može biti praćena u kliničkim trijalima subjekta koji pokazuje povećanu ekspresiju BAFF-R gena, nivoe proteina ili dodatnu regulaciju aktivnost BAFF-R. U takvim kliničkim trijalima ekspresija ili aktivnost BAFF-R i , preferentno, drugih gena koji su bili uključeni, na primer, u poremećaj, može biti upotrebljena kao "očitavanje" ili marker za imune odgovore određene ćelije.
Na primer, mogu biti identifikovani geni, uključujući BAFF-R, koji su modulisani u ćeliji tretmanom sa agensom (npr. jedinjenje lek ili mali molekul) koji modulišu aktivnost BAFF-R (npr. identifikovani u skrining ogledu kao što je opisano gore). Tako, da bi se ispitali efekti agenasa na ćelijske proliferacione poremećaje, na primer, u kliničkom trijalu, ćelije mogu biti izolovane i priepremljena RNK i analizirana za nivoe ekspresije BAFF-R i drugih gena uključenih u poremećaj. Nivoi ekspresije gena (tj. način ekspresije gena) mogu biti kvantifikovani Northernblot analizom ili RT-PCR-om, kao što je opisano ovde ili alternativno merenjem količine produkovanog proteina jednim od metoda opisanih ovde ili merenjem nivoa aktivnosti BAFF-R ili drugih gena. Na ovaj način, put ekspresije gena može poslužiti kao marker, naznaka fiziološkog odgovora ćelije na agens. Shodno tome, stanje ovog odgovora može biti određeno pre i u raznim tačkama tokom tretmana jedinke sa agensom.
U jedom obliku pronalazak obezbeđuje postupak za praćenje efektivnosti tretmana subjekta sa agensom (npr. agonista, antagonista proteina, peptida, peptidomimetika, nukleinske kiseline, malog molekula ili drugog leka kandidata identifikovanog skrining ogledima opisanim ovde) sadržeći korake (i) dobijanja uzoraka pre davanja od subjekta pre davanja agensa; (ii) određivanja nivoa ekspresije BAFF-R proteina mRNK ili genomske DNK u uzorku pre davanja; (iii) dobijanje jednog ili više uzoraka od subjekta nakon davanja; (iv) detektovanje nivoa ekspresije ili aktivnosti BAFF-R proteina mRNK ili genomske DNK u uzorcima nakon davanja; (v) poređenje nivoa ekspresije ili aktivnosti BAFF-R proteina mRNK ili genomske DNK u uzorku pre davanja sa BAFF-R proteinom mRNK ili genomskom DNK u uzorcima posle davanja ili uzorcima; (vi) izmene načina davanja agensa subjektu shodno tome. Na primer, povećano davanje agensa može biti poželjno da se poveća ekspresija ili aktivnost BAFF-R na više nivoe nego što je detektovano, tj. da se poveća efektivnost agensa. Alternativno, može biti poželjno povećano davanje agensa da se smanji ekspresija ili aktivnost BAFF-R na niže nivoe nego što je detektovano, tj. da se smani efektivnost agensa.
Postupci tretmana
Predmetni pronalazak obezbeđuje i profilaktičke i terapeutske postupke tretiranja subjekta koji je pod rizikom (ili pod sumnjom) za poremećaj ili ima poremećaj vezan sa aberantnom ekspresijom BAFF-R aktivnosti.
Bolesti i poremećaji koji su okarakterisani sa povećanim (u odnosu na subjekt koji pati od bolesti ili poremećaja) nivoima biološke aktivnosti mogu biti tretirani sa terapeuticima koji antagonizuju (tj. redukuju ili inhibiraju) aktivnost. Terapeutici koji antagonizuju aktivnost mogu biti davani na terapeutski ili profilaktički način. Terapeutici koji mogu da se koriste uključuju, ali nisu ograničeni na, (i) BAFF-R polipeptide ili njihove analoge, derivate, fragmente ili homologe, (ii) antitela za BAFF-R peptide; (iii) nukleinske kiseline koje kodiraju BAFF-R peptid; (iv) davanje antisens nukleinskih kiselina koje su "nefunkcionalne" (npr., zahvaljujući heterolognoj inserciji unutar kodirajućih sekvenci koje kodiraju BAFF-R peptid) koje su upotrebljene za "knockout" endogene funkcije BAFF-R peptida homologom rekombinacijom (vidi, npr., Capecchi (1989)Science244:1288-1292); ili (v) modulatore (tj. inhibitori, agonisti i antagonisti, uključujući dodatni mimetik peptida pronalaska ili antitela specifična za peptid pronalaska) koji menjaju interakciju između BAFF-R peptida i njegovog partnera za vezivanje.
Bolesti i premećaji koji su okarakteristani smanjenjem (u odnosu na subjekt koji ne pati od bolesti ili poremećaja) nivoa ili biološke aktivnosti mogu biti tretirani sa terapeuticima koji povećavaju (tj. su agonisti za) aktivnost. Terapeutici koji dodatno regulišu aktivnost mogu se davati na terapeutski ili profilaktički način. Terapeutici koji mogu biti upotrebljeni uključuju, ali nisu ograničeni na, BAFF-R peptide, ili njegove analoge, derivate, fragmente ili homologe ili agonist koji povećava biodostupnost.
Povećani ili smanjeni nivoi mogu biti lako detektovani kvantifikovanjem peptida i/ili RNK, dobijanjem uzorka tkiva od pacjenta (npr. tkiva iz biopsije) i ispitujućiin vitronivoe RNK ili peptida, strukturu i/ili aktivnost eksprimiranih peptida (ili mRNK BAFF-R peptida). Postupci koji su dobro poznati u praksi uključuju, ali nisu ograničeni na, imunooglede (npr. putem VVestern blot analize imunotaloženja praćenog sa natrijum dodecii sulfat (SDS) poliakriamid gel elektroforezom, imunocitohemijom itd.) i/ili ogledima hibridizacije da se detektuje ekspresija mRNK (npr. Norhern ogled, dot blotovi,in situhibridizacija itd.).
U jednom aspektu pronalazak obezbeđuje kod subjekta postupke za prevenciju bolesti ili stanja vezanih sa aberantnom ekspresijom ili aktivnošću BAFF-R davanjem subjektu agensa koji moduliše ekspresiju BAFF-R ili najmanje jednu aktivnost BAFF-R. Subjekti koji su pod rizikom za bolest koja je uzrokovana ili kojoj doprinosi aberantna ekspresija ili aktivnost BAFF-R može biti identifikovana sa, na primer, bilo kojom ili kombinacijom dijagnostičkih ili prognostičkih ogleda, kao što je ovde opisano. Davanje profilaktičkog agensa može se odigrati pre manifestacije simptoma karakterističnih za aberantnost BAFF-R, tako da bolest ili poremećaj budu sprečeni ili, alternativno, odloženi u svom napredovanju. U zavisnosti od BAFF-R aberantnosti, na primer, BAFF-R agonistički ili BAFF-R antagonistički agensi mogu biti upotrebljeni za tretiranje subjekta. Odgovarajući agens može biti određen na osnovu skrining ogleda opisanih ovde.
Drugi aspekt pronalaska odnosi se na postupke modulisanja ekspresije ili aktivnosti BAFF-R za terapeutske svrhe. Modulatorni postupak pronalaska uključuje kontaktiranje ćelije sa agensom koji moduliše jednu ili više aktivnosti BAFF-R proteina, aktivnosti vezanih sa ćelijom. Agens koji reguliše aktivnost BAFF-R proteina može biti agens kao što je opisano ovde, kao što je nukleinska kiselina iii protein, prirodno javljajući srodni veznik BAFF-R proteina, peptid, peptidomimetik BAFF-R, ili drugi mali molekul. U jednom obliku agens simuliše aktivnost jednog ili više BAFF-R proteina. Primeri takvih simulatornih agenasa uključuju aktivni BAFF-R protein i molekul nukleinske kiseline koji kodira BAFF-R koji je bio uveden u ćeliju. U drugom obliku, agens inhibira jednu ili više aktivnosti BAFF-R proteina. Primeri takvih inhibitornih agenasa uključuju antisens molekule BAFF-R nukleinske kiseline i anti-BAFF-R antitela. Ovi modulatorni postupci mogu se izvesiin vitro(npr. kultivisanjem ćelija sa agensom) ili, alternativno,in vivo(npr. davanjem agensa subjektu). Kao takav, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke tretiranja jedinke pogođene bolešću ili poremećajem, okarakterisanih aberantnom ekspresijom ili aktivnošću BAFF-R proteina ili molekula nukleinske kiseline. U jednom obliku, postupak uključuje davanje agensa (npr., agensa identifikovanog skrining ogledom opisanim ovde), ili kombinacijom agenasa koji modulišu (npr., dodatno regulišu ili deregulišu) ekspresiju ili aktivnost BAFF-R. U drugom obliku postupak uključuje davanje BAFF-R proteina ili molekula nukleinske kiseline kao terapije da kompenzuje redukovanu ili aberantnu ekspresiju ili aktivnost BAFF-R.
U jednom obliku pronalazak obezbeđuje postupke korišćenja BAFF-R. U takve postupke uključeni su postupci inhibiranja rasta B ćelija, rasta B ćelija indukovanog dendritima i maturacije ili produkcije imunoglobulina kod životinje koristeći BAFF-R polipeptid koji sadrži najmanje BAFF-R vezujući deo BAFF-R. Drugi oblici uključuju postupke stimulisanja rasta B-ćelija, rasta B-ćelija indukovanog dendritima i sazrevanje ili produkciju imunoglobulina kod životinje upotrebom BAFF-R polipeptida (kao što je putem transfektovanja ćelija koje su deficijentne za BAFF-R sa vektorima koji omogućuju efikasnu ekspresiju BAFF-R, ili davanjem antitela, koja vezuju BAFF-R ili mimikriraju BAFF-R).
U drugom obliku pronalazak obezbeđuje postupke za upotrebu BAFF-R u tretmanu autoimunih bolesti, hipertenzije, kardiovaskularnih poremećaja, bubrežnih poremećaja, poremećaja proliferacije B ćelija limfocita, imunosupresivnih bolesti, transplantacija organa i HIV-a. Takođe su uključeni postupci upotrebe agenasa za tretman, supresiju ili izmenu imunog odgovora uključujući signalni put između BAFF-R i njegovih veznika, i postupke inhibiranja zapaljenja davanjem antitela specifičnog za BAFF-R ili njegov epitop.
Postupci predmetnog pronalaska se preferentno obavljaju davanjem terapeutski efektivne količine BAFF-R polipeptida, himeričnog molekula koji sadrži BAFF-R polipeptid fuzionisan sa heterologom sekvencom aminokiseline ili homolog anti-BAFF-R antitela.
U jednom obliku pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže BAFF-R polipeptid i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
U drugom obliku pronalazak obezbeđuje himerične molekule koji sadrže BAFF-R polipeptid fuzionisan sa heterologim polipeptidom ili sekvencom aminokiseline. Primer takvog himeričnog molekula sadrži BAFF-R fuzionisan za Fc region imunoglobulina ili epitop tag sekvence.
U drugom obliku pronalazak obezbeđuje antitelo koje se specifično vezuje za BAFF-R polipeptid. Po potrebi antitelo je monoklonalno antitelo.
U jednom obliku pronalaska je postupak tretiranja sisara sa stanjem vezanim sa neželjenom proliferacijom ćelija davanjem sisaru terapeutski efektivne količine preparata koji sadrži BAFF-R antagonist gde BAFF-R antagonist sadrži polipeptid koji antagonizuje interakciju između BAFF-R i njegovog srodnog receptora ili srodnih receptora sa farmaceutski prihvatljivim primaocem.
U preferiranom obliku srodni receptor BAFF na površini ćelije je BAFF-R.
Postupak se može upotrebiti sa bilo kojim antagonistom BAFF-R koji ima polipeptid koji anatagonizuje interakciju između BAFF i njegovog srodnog receptora ili srodnih receptora. Primeri BAFF-R antagonista uključuju ali nisu ograničeni na rastvorljivi BAFF-R polipeptid, rastvorljive himerične molekule BAFF-R, uključujući, ali bez ograničenja na, BAFF-R-lgG-Fc i homologe anti-BAFF-R antitela.
Postupak pronalaska može se upotrebiti u bilo kom stanju vezanom sa neželjenom proliferacijom ćelija. Posebno se postupci predmetnog pronalaska mogu upotrebiti da se tretiraju ćelije tumora koje eksprimiraju BAFF i/ili BAFF-R.
Primeri kancera čija proliferacija je modulisana sa BAFF mogu biti skrinovani merenjemin vivonivoa BAFF i/ili BAFF-R poruka eksprimiranim u bibliotekama tumorskog tkiva. Biblioteke tkiva tumora u kojima su BAFF i/ili BAFF-R poruke visoko eksprimirane biće kandidati. Alternativno, mogu se skrinovati kandidati pretraživanjem javnih i privatnih baza podataka (tj. Incvte baza podataka) sa, na primer, punom dužinom sekvence humane BAFF cDNK.
Anatgonisti BAFF-R predmetnog pronalaska koji se koriste u tretiranju stanja vezanih sa neželjenom proliferacijom ćelija, posebno terapijom tumora, preporučljivo inhibiraju rast ćelija tumora veći od 10%, 20%, 30% ili 40% i najpreporučljivije više od 50%. Antagonisti BAFF-R dobijeni su skriningom. Na primer, antagonisti BAFF-R mogu biti odabrani na osnovu aktivnosti inhibicije rasta (tj. veće od 10%, 20%, 30% ili 40% i 50%) u odnosu na humani karcinom debelog creva HT29 ili humani karcinom pluća A549, koji su izvedeni iz tumora debelog creva i pluća, respektivno.
Drugi oblik pronalaska obezbeđuje postupke inhibiranja rasta B-ćelija i ne B-ćelija, rasta i sazrevanja B-ćelija indukovanog dendritima ili produkcije imunoglobulina kod životinje korišćenjem BAFF-R polipeptida kao što su oni opisani gore.
Postupak inhibiranja rasta B-ćelija i ne B-ćelija, rasta i sazrevanja B-ćelija indukovanog dendritima ili produkcije imunoglobulina može takođe uključiti davanje anti-BAFF-R antitela (pofiklonalnog ili monoklonalnog) koje vezuje BAFF-R ili inhibira vezivanje BAFF za BAFF-R. Davanje antitela prema tome inhibira rast B-ćelija i ne B-ćelija, rast i sazrevanje B-ćelija indukovano dendritima ili produkciju imunoglobulina. Količina antitela koje može biti pogodno za upotrebu može biti ekstrapolirana iz podataka dobijenih ovdein vivo.U praksi su poznati različiti postupci da se ekstrapoliraju doze iz eksperimenata na životinjama, uključujući na primer, ekstrapolaciju zasnovanu na telesnoj težini ili površini.
U nekim oblicima pronalaska BAFF-R:Fc polipeptidi ili anti-BAFF-R antitela davana su u količini od oko 1-20 mg/kg/doza. Doze mogu biti davane dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje ili jednom mesečno po potrebi. Lekar će biti u stanju da odredi odgovarajuću dozu određivanjem efikasnosti balansirane u odnosu na redukovanje bilo kojih neprijatnih efekata terapije.
U drugom obliku pronalazak obezbeđuje postupke korišćenja BAFF-R ili anti-BAFF-R antitela u tretmanu autoimunih bolesti, hipertenzije, kardiovaskularnih poremećaja, bubrežnih poremećaja, poremećaja proliferacije B ćelija limfocita, imunosupresivnih bolesti, transplantacija organa, zapaljenja i HlV-a. Takođe su uključeni postupci za upotrebu agenasa za tretiranje, supresiju ili izmenu imunog odgovora uključujući način signaliranja između BAFF-R i njegovog veznika.
Postupak inhibiranja agregacije eksprimiranog proteina uključujući BAFF-R i BAFF-R:Fc
Pronalazak takođe obezbeđuje postupak inhibiranja ili smanjenja agregacije eksprimiranog proteina posebno humanog BAFF-R ili huBAFF-R:Fc koji imaju tendenciju da agregiraju tokom ekspresije, remeteći prečišćavanje u visokim prinosima. U postupku pronalaska sekvenca amino kiseline proteina koji ima tendenciju da agregira kada se eksprimira u rekombinantnom sistemu je upoređena sa sekvencom amino kiseline homologa ili proteina koji pokazuje manje aktivnosti agregacije. Dva homologa će imati konzervirane domenie i ne-konzervirane amino kiseline između i možda razasute unutra. Generalno, najmanje jedna od ne-konzerviranih amino kiselina, amino kiselina od agregiranog proteina može biti supstituisana sa amino kiselinom u homologu da se smanji agregacija. U nekim oblicima, nepolame amino kiseline su supstituisane. Nepolarne amino kiseline uključuju glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan i cistein. U nekim oblicima nepolarne amino kiseline supstituišu druge nepolarne amino kiseline. Preferirane nepolarne amino kiseline za inhibirajnje ili smanjenje agregacije su prolin i alanin. U drugim oblicima, nenaelektrisana polarna amino kiselina je supstituisana sa nepolarnom amino kiselinom. Nenaelektrisane polarne amino kiseline uključuju asparagin, glutamin, serin, treonin i tirozin.
U postupku pronalaska, napravljeni su supstituenti koji preferentno omogućuju proteinu da zadrži biološku aktivnost. Nekonzervirane amino kiseline su generalno pogodne za supstituciju bez značajnog narušavanja biološke aktivnosti.
U posebnom primeru postupka pronalaska, humani BAFF-R protein može imati supstitucije amino kiseline uvedene na pozicijama V20, P21, A22 i L27 SEQ ID BR:5 (ili V41, P42, A43 i L48 SEQ ID BR:12) i različite njihove kombinacije, koje značajno smanjuju agregaciju proteina. Slična strategija može se upotrebiti za druge proteine koji imaju tendenciju da agregiraju kada se eksprimiraju u rekombinantnim sistemima. I ako ne želimo da budemo vezani za bilo koju određenu teoriju delovanja, veruje se da supstitucija nenaelektrisanih polarnih amino kiselina sa nepolarnim amino kiselinama pruža rastvorljivost proteinu i sprečava agregaciju nepolarnih regiona između proteina.
Predmetni pronalazak nije ograničen u obimu i specifičnim oblicima opisanim ovde. Ustvari, različite modifikacije pronalaska u dodatku na one opisane ovde će postati očigledne onima sa iskustvom u praksi iz opisa koji slede i pratećih slika. Predviđeno je da takve modifikacije budu u okviru obima podnetih zahteva.
PRIMERI
Primer 1
Ovaj primer opisuje molekularno kloniranje BAFF-R, novog receptora za BAFF.
Materijal i postupci
Oligo-dT cDNK biblioteka je napravljena iz BJAB ćelija, humane B ćelijske linije koja vezuje humani BAFF, i direkciono klonirana u ekspresioni vektor CH269. CH269 je derivat pCEP4 (Invitrogen) koji sadrži CMV promotor da vodi ekspresiju klonirane DNK i takođe sadrži oriP od EBV. To omogućuje autonomnu replikaciju više kopija ovih plazmida u ćelijama koje su stabilno transformisane sa EBNA-1, kao što je 293EBNA. BJAB cDNK biblioteka je transformisana u £coliDH10B ćelije i zasađena u format od 96 bunarćića kao pula od približno 2500 nezavisnih klonova po bunarčiću. Iz ovih pulova pripremljena je DNK koristeći Oiagen BioRobot 9600. DNK pulovi su transfektovani koristeći Lipfectamin (Life Technologies) u 293EBNA ćelije zasejane u 6 posuda bunarčića obavijenih fibronektinom. 48 časova nakon transfekcije medijum je uklonjen i ćelije su isprane sa puferom za ispiranje ploča (20 mM HEPES, 0.5mg/m1 goveđeg serum albumina, 0.1% NaN3). Monoslojevi ćelija su prekriveni sa 100 mg/ml biotiniliziranog humanog rekombinantnog rastvorenog myc-BAFF (myc-huBAFF) u puferu za vezivanje (PBS, 2% fetalni kravlji serum, 0.1% NaN3) i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Myc-huBAFF (amino kiseline 136-285) upotrebljen u ogledu je eksprimiran uPichia pastorisputem anjonske izmenivaćke hromatografije praćene gel filtracijom.
BAFF rastvor je uklonjen i ćelije su isprane dva puta i fiksirane inkubiranjem u 1.8%formaldehid-0.2% glutaraldehid-u u PBS tokom 5 minuta. Ćelije su ponovo isprane i zatim inkubirane tokom 30 minuta sa streptavidinom konjugovanim sa alkalnom fosfatazom (SAV-AP)
(Jackson ImmunoResearch) pri razblaženju 1:3000 od štoka pufera za vezivanje. Ćelije su isprane i obojene sa fast red/naftol fosfat (Pierce). Ćelije koje su vezale biotin-BAFF/SAV-AP kompleks su identifikovane u prisustvu crvenog taloga nakon inspekcije mikroskopom malog uveličanja. Drugo skrinovanje zahteva zasejavanje DH10B glicerol stoka BAFF vezujućeg pula za pojedinačne kolonije, inokuliranje u kulture u pulovima od po 100 i ponavljanje ogleda vezivanja BAFF opisanog ovde. Pulovi pozitivni u drugom putu su slično razdvojeni u pojedinačne klonove i ispitani za vezivanje BAFF na transfektovane 239EBNA kao što je gore opisano. Određene su sekvence DNK nezavisnih BAFF-vezujućih klonova.
Rezultati
Jedan od BAFF vezujućih klonova bio je pJST576. On ima veličinu inserta od 1201 baznog para (bp) ne uključujući poli-A rep. Sekvenca inserta je prikazana na slici 1A (SEQ ID BR:1). BLAST analiza ovog klona pokazala je homologiju u Genbank bazi podataka sa hromozomom 22 BAC klon HS250D10 (pristupni broj Z99716). Cela pJST576 sekvenca je nađena unutar BAC. Nađena je homologija sa 3' krajem humanog ESTAI250289 (IMAGE done 2000271). EST je generisan iz humane folikularne limfoma biblioteke. EST AI250289 je dobijen od lncyte i određena je sekvenca inserta (slika 1B) (SEQ ID BR:2). Ova sekvenca je dodala 15 bp od 5' sekvence na pJST576 sekvencu, koja je dodana sa genomskom sekvencom i 23 bp, koja nije. Preostala EST sekvenca ima savršenu homologiju sa pJST576. Otvoreni okvir čitanja ne može biti identifikovan u ovim klonovima.
Primer 2
U ovom primeru odredili smo da JST576 cDNK sadrži intron i zatim utvrdili otvoreni okvir čitanja.
Postupci
GENSCAN (Burge. C i Karlin, SJ. (1997)Mol. Biol.268:78-94) program za predviđanje egzona je obavljen na JST576 cDNK sekvenci. Rezultat ovog programa je predvideo da je intron prisutan u cONK. S ciljem da se odredi da li je predviđanje bilo pravilno obavljena je PCR analiza na prvom lancu cDNK iz dve ćelijske linije koje su eksprimirale JST576. RNK je prečišćena od približno 107 BJAB ili IM-9 ćelija koristeći RNaza kit (OJagen) sledeći sugerisana uputstva proizvođača. RNK je kvantifikovanai 5 ug je upotrebljeno za prvi lanac reakcije cDNKkoristeći Superscript preamplifikacioni kit (Life Technologies). I oligo dT i slučjni heksameri su upotrebljeni da se generiše produkt prvog lanca. Sinteza prvog lanca je obavljena sledeđi preporučeni protokol. Tri (jedna od svake reakcije, 10 ng JST576 ili bez DNK je zatim upotrebljena kao šablon za PCR koristeći oligonukleotide zakačene za predviđeni intron. Oligonukleotidi upotrebljeni u reakciji su 5' oligo BAF-225
[5'-GGCCGAGTGCTTCGACCTGCT-3'] (SEQ ID BR:33) ili BAFF-226
[5'-GGTCCGCCACTCGTGGCCTG-3'] (SEO. ID BR:34) i 3' oligo BAFF-191 [5'-CACCAAGACGGCCGGCCCTGA-3'] (SEQ ID BR:35). Svaka reakcija je sadržala jedan puta Pfu pufer (Stratagene), 200 (M dNTP-ove, 10% DMSO, 150 ng od savkog oligo i 1.25 jedinica od Turbo Pfu polimeraze (Stratagene). Rekcije su obavljene u 35 ciklusa na 94<8>C tokom 30 sekundi, 60°C tokom minuta i 72°C tokom 1.5 minuta. Deset ul svake reakcije je pušteno na1% agarozni gel. Preostali produkti iz BJAB i IM-9 BAF-225/191 reakcija su prečićeni koristeći kit za prečišćavanje High Pure PCR (Roche Molecular Biochemicals) i ceo produkt je podvrgnut sekvenciranju DNK. Sem toga generisani su PCR produkti koristeći prajmere BAF-225 i BAF-191 od preostale cDNK B ćelija, subklonirani i individualni klonovi su sekvencirani. Ovde je upotrebljeno 5f.il preostale cDNK B ćelija (Clonteh) u PCR reakciji sa BAF-225 i BAF=191prajmerima što je gore dato detaljno. PCR produkt je zatim prečišćen koristeći kit za prečišćavanje High Pure PCR i koncentrisan. S ciljem da se subklonira PCR fragment, krajevi fragmenta su fosforilisani i zatupljeni koristeći Sure Clone ligacioni kit (Amersham Pharmacia Biotech) kao što je preporučeno. Nastali produkt je kloniran u EcoRV mesto pBluescriptll (Stratagene) i transformisan uE. coli.Pojedinačni klonovi su odgajeni i plazmidna DNK minipreparovana. Šest nezavisnih izolata je sekvencirano.
Rezultati
Zreli nukleotid i sekvenca amino kiseline JST576 predviđeni sa GENSCAN programom prikazani su na slici 2A (SEO ID BR:3). PCR produkti iz BJAB i IM-9 reakcija obuhvatajući predviđeni intron prikazani su na slici 2B i potvrđuju postojanje introna u JST576 cDNK klonu. Predviđena veličina PCR produkta iz JST576 cDNK je približno 788 bp za BAF-225/BAF-191 i767 bp za BAF-226/BAF-191. PCR produkti dobijeni iz JST576 šablona su približno te veličine (putići 10 i 11). PCR produkti dobijeni koristeći BAF-225/BAF-191 bilo na oligo dT prajmovanom BJAB ili IM-9 prvom lancu cDNK (putići 2 i 6) su iste veličine i značajno su kraći od produkta JST576 cDNK. Predviđena veličina ovog fragmenta bez predviđenog introna je 484 bp. Veličina PCR produkata je konstituent veličine. Isti rezultati su dobijeni kada su BJAB ili IM-9 RNK prajmovana sa slučajnim heksamerima (putići 4 i 8). Reakcije koristeći BAF-226/BAF-191 nisu radile na prvom lancu cDNK šablona. Prema tome izgleda da intro predviđen sa GENESCAN programom stvarno postoji u JST576 cDNK. Sekvenca upletenog produkta iz BJAB i IM-9 RNK je potvrđena sekvenciranjem većine PCR produkta i reflektuje se u sekvenci prikazanoj na slici 2C (SEQ ID BR:4). Sekvenca je identična sekvenci prikazanoj na slici 2A (SEQ ID BR-.3), sem odsustva alanin kodona (GCA) na nukleotidu 149 (prikazano malim slovima). Rezultati sekvenciranja 6 nezavisnih klonova iz RT-PCR reakcije preostale cDNK B ćelija naznačava da su oba akceptorska mesa uvrtanja upotrebljena. Izgleda da je preferentno akceptorsko mesto produkt nastao iz ostatka alanina (5/6 klonovi). Međutim, sekvenca predviđena GENESCAN
(SEQ ID BR:3), koja sadrži dva alanina, je zapažena u 1/6 klonovima. Prema tome je utvrđen otvoreni okvir čitanja za humani JST576 i određena je pojedinačna varijanta uvrtanja. Otvoreni okvir čitanja predviđa protein od 184 amino kiseline prikazan na slici 2D (SEQ ID BR:5). Ostatak alanjna (A) prikazan podebljano pretstavlja upletenu varijantu. Protein je označen kao BAFF-R. Dedukovana sekvenca amino kiseline BAFF-R uključuje hidrofobni region iz ostatka 70-100 (Hopp-Woods algoritam) i potencijalni transmembranski segment iz ostatataka 84-102 kao što je analizirano sa TMPred algoritmom. Region prati visoko naelektrisani deo amino kiselina koji može funkcionisati kao stop transfer signal. BAFF-R nema N-terminalnu signalnu sekvencu i protein membrane tipa III sličan drugim BAFF vezujućim proteinima BCMA (Laabi i sar. (1992)EMBO J.11:389-3904 i TACI (von Bulovv i Bram (1997)Science278:138-141). Predviđeno je da N-terminus bude izvanćelijski domen BAFF-R i sadrži motiv od 4 cisteina na ostatku 19-35 za razliku od ostalih članova TNF porodice receptora. C-terminus BAFF-R je predviđen da bude unutarćelijski domen.
Primer 3
Ovde determinišemo sekvencu DNK uzvodno od predloženog iniciranja metioninom za humani BAFF-R uključujući sop kodon u okviru.
Postupci
Prajmer BAF-254 (5' GGGCGCCTACAATCTCAGCTA 3') (SEQ ID BR:36) je napravljen u genomskoj sekvenci prisutnoj u BAC HS25d10 (Genbank pristupni broj Z99716), uzvodno od predloženog ATG i upotrebljen u PCR reakciji sa oligo BAF-236 (5' GGCGGACCAGCAGGTC-GAAGCACTC 3') (SEQ ID BR:37). Templet u reakciji bio je prvi lanac cDNK napravljen iz RNK humane slezine (Clonteh) koristeći PCR preamplifikacioni kit po uputstvima proizvođača (Life Technologies). PCR reakcija je sadržala 3 u.l reakcije prvog lanca, 1 x Pfu pufer (Stratagene), 10% DMSO, 0.2 mM dNTP-ova, 150 ng svakog prajmera i 1.25 jedinica Pfu Turbo polimeraze (Stratagene). PCR produkt je prečišćen koristeći kit za prečišćavanje High Pure PCR prema uputstvima proizvođača (Roche Molecular Buichemicals). Krajevi PCR produkta su učinjeni tupim i fosforilisani koristeći Sure Clone vezni kit (Amersham Pharmacia Biotech), klonirani u EcoRV mesto pBSK2 (Stratagene) i transformisani u DH5 ćelije. Klonovi nastali vezivanjem su mini-preparirani koristeći VVizard sistem (Promega) i zatim sekvencirani koristeći ABI mašinu.
Rezultati
Sekvenca PCR produkta potvrđuje da mRNK sadrži sekvence direktno uzvodno od ATG koji je sadržan u genomskoj sekvenci. Sevenca podvučena u sekvenci prikazanoj na si.3. Prisustvo u-okviru uzvodno stop kodona i odsustvo drugog metionina ukazuje da metionin nađen u JST576 cDNK je ispravan inicirajući metionin.
Primer 4
Ovaj primer opisuje kloniranje mišje BAFF-R cDNK.
Postupci
Približno jedan milion plaka faga je skrinovan iz biblioteke cDNK mišje A20 ćelijske linije dobavljen od strane Stratagene (La Jolla, CA) prema uputstvu proizvođača. Human JST576BAFF-R CDNK je digestirana sa EcoNI i puštena na 1% slabotopljivom gelu. Fragment od425bp je isečen sa gela i odmeren. Dodana je trostruka zapremina vode i fragment gela je kuvan 5 minuta. Fragment je obeležen sa 50u,Ci<32>P-dCTP (Amersham) u reakciji koja je sadržala 50 mM Tris-a pH8, 5 mM MgCI2, 10 pJvl P-merkaptoetanola, 200 mM HEPES-a pH 6.5, 20 (M dNTP-ova (sem dCTP), 0.27 jedinica pd(N)6heksanukleotida (Amersham Pharmacia Biotech) i 1 jedinicu Klenow enzima (USB) preko noći na sobnoj temperaturi. Oko jedan milion brojanja po ml probe je inkubiran sa filterima u puferu za skrining plaka (50 mM Tris, 1% SDS, 1M NaCI, 0.1% natrijum pirofosfat, 0.2% PVP, 0.2% fikol, 0.2% BSA) preko noći na 65°C. Riteri su isprani u 2 X SSC i 0.1% SDS na 50°C tokom 1.5 časova (3x2 litra) i zatim izloženi filmu za x-zrake tokom 2 dana. Približno 36 pozitinih plaka je identifikovano. Od njih je šest plaka prečišćeno. Fagemidi su oslobođeni koristećiin vivoprotokol isecanja dat od starne Stratagene. Nastale kolonije su odgajene i DNK je minipreparovana (Oiagen). CDNK klonovi su sekvencirani.
Rezultati
Mišja konsenzus BAFF-R nukleotidna sekvenca predstavljena je na slici 4A (SEQ ID BR:8) a sekvenca amino kiseline na slici 4B (SEQ ID BR:9). Tri od klonova su sadržali deleciju 10 amino kiselina od amino kiseline 119 do 129 u unutarćelijskom domenu mišjeg BAFF-R. Redanje humanih i mišjih sekvenci BAFF-R ilustruje da su 4 cisteinska ostatka u unutarćelijskom domenu konzervirana, da je pozicija iniciranja metionina slična i da je C-terminalni region proteina visoko konzerviran (slika 4C) sa najmanje 24 ostatka koji su identični. Sekvence imaju približno 56% ukupne identičnosti.
Primer 5
U ovom primeru opisana je sposobnost humanog rekombinantnog rastvorenog BAFF da se vezuje za ćelije kotransfektovane sa pJST576 i GFP reporter plazmidima.
Materijal i postupci
Reporter plazmid kodira molekule GFP usidrene za membranu i omogućuje identifikaciju transfektovanih i ne-transfektovanih ćelija. 293EBNA ćelije su ko-transfektovane sa reporter plazmidom koristeći Lipfectamine 2000 (Life Technologies). 18-20 časova nakon transfekcije ćelije su otkačene sa ploča sa 5 mM EDTA u PBS i prebrojane. Ćelije su isprane dva puta sa FACS puferom (PBS koji sadrži 10% fetalni goveđi serum, 0.1% NaN3) i 2.5 x 10<5>ćelija je inkubirano 1 čas na ledu sa biotiniliranim myc-huBAFF razblaženom u FACS puferu u rasponu preko 8 ng/ml do 5 ug/ml. Ćelije su isprane sa FACS puferom i inkubirane 30 minuta sa streptavidinom konjugovanim sa fikoertrinom (SAV-PE) (Jacson ImmunoResearch) u razblaženju 1:100 od štoka. Ćelije su ponovo isprane sa FACS puferom i resuspendovane u 1% paraformaldehidu u FACS puferu. Ćelije su analizirane sa FACS za GFP i PE fluorescenciju i podaci su formatirani u dot plotu u četir kvadranta. Tačke u dva desna kvadranta predstavljaju ćelije koje eksprimiraju transfekcioni reporter GFP. Tačke u dva gornja kvadranta predstavljaju ćelije koje imaju vezani biotinilizirani myc-huBAFF sa ovim vezivanjem otkrivenim sa SAV-PE. Ćelije u gornjem desnom kvadrantu su transfektovane ćelije koje vezuju biotinilizirani myc-huBAFF.
Rezultati
Neobojene ćelije i ćelije obojene samo sa SAV-PE pokazuju približno 50% GFP pozi-tivnosti i one su kotransfektovane sa reporter plazmidom (slika 5). Kada su ćelije kotransfektovane sa GFP reporter i pJST576 obojene sa 1 ug/ml biotiniliziranog myc-huBAFF gotovo sve ćelije u donjem desnom kvadrantu pomeraju se gore, uključujući BAFF vezivanje. Sličan rezultat viđen je ako je plazmid koji eksprimira huTACI ko-transfektovan na mesto pJST576. Poznato je da TACI vezuje BAFF. Ćelije su obojene sa petostrukim razblaženjima biotiniliziranog myc-huBAFF od 5 ug/ml do 8 ug/ml i kada je koncentracija biotiniliziranog myc-huBAFF smanjivana i intenzitet pomeranja se smanjivao.
Primer 6
U ovom primeru opisana je sposobnost humanog rekombinantnog rastvorenog BAFF ili mišjeg rekombinantnog rastvorenog BAFF da se veže za ćelije kotransfektirane sa pJST576 i GFP receptor plazmidom.
Materijal i postupci
Kotransfekcije u 293EBNA su opisani u primeru 5. 18-20 č nakon transfekcije ćelije su otkačene, izbrojane, i obojene za FACS analizu slično kao u primeru 5 sa sledećim modifikacijama. Ćelije su inkubirane 1 čas na ledu sa 5 ug/ml bilo mišijeg ili humanog rekombinantnog rastvorenog flag-BAFF, praćenog nakon ispiranja, inkubiranjem tokom 30 minuta sa 5 ug/ml anti-flag monoklonalnog antitela M2 (Sigma Aldrich) i zatim ispitane inkubiranjem ispranih ćelija tokom 30 minuta sa PE konjugovanim magarećim anti-miš IgG (Jackson JmmunoResearch) pri razblaženju štoka od 1:100. Ćelije su ponovo isprane fiksirane sa paraformaldehidom i analizirane sa FACS za GFP i PE pozitivne ćelije.
Rezultati
Približno 50% ćelija su GFP pozitivne što znači da su ko-transfektovane sa reporter plazmidom (slika 6). Kada su ćelije ko-transfektovane sa GFP reporter i pJST576 obojene sa 5 ug/ml humanog ili mišijeg rekombinantnog rastvorenog flag-BAFF, skoro sve ćelije u donjem desnom kvadrantu su se pomerile na gore. Ovo je ukazalo da se i mišiji i humani BAFF vezuju za ćelije transfektovane sa pJST576.
Primer 7
U ovom primeru opisana je sposobnost mišijeg rekombinantnog APRIL-a da se vezuje za ćelije transfektovane sa pJST576 i GFP reporter plazmidom.
Materijal i postupci
Ko-transfekcije u 293EBNA su opisani u primeru 5. 18-20 č nakon transfekcije ćelije su otkačene, izbrojane i obojene za FACS analizu slično kao u primeru 5 sa sledećim modifikacijama. Ćelije su inkubirane tokom 1 časa na ledu sa 1 ug/ml mišijeg rekombinantnog rastvorenog mvc-APRIL, praćenog nakon ispiranja inkubiranjem tokom 30 minuta sa 5 ug/ml anti-mišijeg APRIL monoklonalnog antitela praćenog inkubiranjem od 30 minutai ispranih ćelija sa 5 ug/ml biotiniliziranog anti-pacov lgG2b (Pharmingen) i konačno pokazano inkubiranjem ispranih ćelija tokom 30 minuta sa SAV-PE. Ćelije su ponovo isprane, fiksirane sa paraformaldehidom i analizirane sa FACS za GFP i PE pozitivne ćelije.
Rezultati
Približno 50% ćelija su GFP pozitivne što znači da su ko-transfektovane sa reporter plazmidom (slika 7). Kada su ćelije ko-transfektovane sa GFP reporter i pJST576 obojene sa 1 ug/ml mišijeg myc-APRIL, nijedna ćelija u donjem desnom kvadrantu nije se pomerile na gore. Ovo je u kontrastu sa ćelijama ko-transfektovanim sa plazmidom koji eksprimira humani TACI umesto pJST576. U ovim transfektovanim ćelijama skoro sve su bile pozitivne za misije mvc-APRIL vezivanje. Prethodno je bilo pokazano da se i BAFF i APRIL vezuju i za TACI i BCMA. Prema tome činjenica da se APRIL ne vezuje za BAFF-R što je eksprimirano na pJST576 transfektovanim ćelijama naznačava specifičnost BAFF-R za BAFF.
Primer 8
U ovom primeru opisana je sposobnost BAFF-R eksprimirana na osnovu pJST576 da se ko-imunoistaloži sa rekombinantnim rastvorenim humanim flag-BAFF.
Materijal i postupci
293EBNA ćelije su transfektovane sa Lipofectamine 2000 sa pJST576, vektor samo kontrola, ili plazmidom koji eksprimira huTACI kao pozitivnom kontrolom za vezivanje BAFF. Nako 20 časova inkubacije transfekcioni medijum je usisan, ćelije su isprane sa PBS i medijum je zamenjen sa "S obeležnim medijumom (9 delova OMEM bez metionina i cisteina do 1 dela kompletnog DMEM, dopunjenog sa 10% dijalizovanog fetalnog goveđeg seruma, 4 mM gluta-mina i 100u.Ci/ml<35>S metionina i cisteina (Translabel, ICN Radiochemicals). Ćelije su inkubirane u tom medijumu tokom šest časova nakon čega je medijum uklonjen. Ćelije su isprane sa PBS i zatim rastvorene sa 250u,l ekstrakcionog pufera (1% Brij 98, 150 mM NaCI, 50 mM Tris-a pH 7.5). Ko-imunotaloženja su izvedena inkubiranjem 75u,l ^S obeleženih ekstrakara ćelija sa 5u.g rekombinantnog rastvorenog humanog flag-BAFF u 1 ml DMEM-10% fetalnog goveđeg seruma-0.1% NaN3preko nođi na 4°C. Anti-flag monoklonalno antitelo M2, 10 u.g i protein A-Sepharose su dodani i inkubirani kontinuirano 2 časa. Perlice Sepharose su sakupljene centrifugiranjem, isprane sa FACS puferom i resuspendovane u SDS punećem puferu sa beta-merkaptoetanolom kao redukujućim agensom. Uzorci su prokuvani 5 minuta, kratko centrifugirani da se obore perlice od Sepharose i alikvot je pušten na SDS-PAGE. Gel je inkubiran sa Enlighting (New England Nuclear), osušen i izložen filmu na -80°C.
Rezultati
Ovo imunotaloženje vezuje flag-BAFF za protein A Sepharose perlice preko anti-flag antitela, M2. Ona će takođe oboriti bilo koje proteine u ekstraktu ćelija koje se vezuju za flag-BAFF i ti radioobeleženi proteini će biti detektovani autoradiografijom. Pošto 193 EBNA ćelije ne vezuju BAFF, prazna vektor kontrola pokazuje pozadinu nereaktivnu u proceduri (slika 8). Kada su ekstrakti iz ćelija transfektovanih za TACI ko-imunoistaloženi sa flag-BAFF traka odgovarajuće molekularne težine od približno 34 kDa je zapažena. To je približno predviđenoj molekularnoj težini za punu dužinu humanog TACI (31.2 kDa) proteina poznatog da vezuje BAFF. Kada su ekstrakti iz ćelija transfektovanih sa pJST576 ko-imunoistaloženi sa flag-BAFF, zapažena je traka sa očiglednom molekularnom težinom od približno 12 kDa. Predviđena molekularna težina za BAFF-R eksprimiran iz pJST567 je 18.8 kDa. Razlika između predviđenih i zapaženih molekularnih težina može biti zbog anomalije elektroforetske mobilnosti, zbog naelektrisanja ili konformacije BAFF-R. Druga mogućnost je da je 12 kDa proteolitički fragment BAFF-R.
Primer 9
Ovaj primer opisuje generisanje rastvorljivih oblika BAFF-R. Oligonukleotidni prajmeri komplementarni sa pJST576 mogu biti dizajnirani za PCR amplificiranje BAFF-R izvanćelijskog domena u odsustvu transmembrane i intraćelijskih domena. Tipično, neko uključuje većinu stalka ili regiona amino kiseline između domena vezivanja veznika ili domena trnsmembrane. Neko takođe može varirati količinu stalk regiona uključenog da se optimizuje potenca nastalog rastvo-rljivog receptora. Ovaj umnoženi fragment biće projektovan sa pogodnim restrikcionim mestima da omogući kloniranje u različite heterologe lider sekvence na 5' kraju fragmenta i za različite Ig fuzione himerne fuzione vektore na 3' kraju. Alternativno, može se ubaciti stop signal na 3' kraju BAFF-R izvanćelijskog domena i napraviti rastvorljivi oblik receptora ili upotrebiti drugi C-terminalni fuzioni partner bez resortiranja za upotrebu umesto korišćenja pristupa Ig fuzione himere. Takođe, neko može kreirati N-terminalni fuzioni protein koji se sastoji od fuzionog partnera koji sadrži signalnu sekvencu praćenu sa N-terminalnim izvanćelijskim domenom BAFF-R. Nastali vektori mogu biti eksprimirani u većini sistema koji se koriste u biotehnologiji uključujući kavsac, ćelije insekata, bakterije i sisarske ćelije i primeri postoje za sve tipove ekspresije. Različiti humani Fc domeni mogu biti pričvršćeni da optimizuju ili eliminišu FcR i komplement interakcija ako je potrebno. Alternativno, mutirani oblici ovih Fc domena mogu se upotrebiti da selektivno uklone FcR, ili komplement interakcija ili pričvršćivanje N-vezanih šećera za Fc domen što svakako ima određenih prednosti. Primer BAFF-R:Fc fuzionog molekula prikazan je na slici 9. Ovaj molekul sadrži lider sekvencu tipa I, iz mišijeg Ig-k gena vezanog sa Aat2 restrikcionim mestom za BAFF-R izvanćelijski domen (ostaci amino kiseline 2-71 kao što je prikazano na slici 2D) koji je povratno vezan sa Sali restrikcionim mestom na Fc domen humanog lgG1.
Primer 10
U ovom primeru pokazujemo ekspresioni profil BAFF-R u humanim tkivima i ćelijskim linijama koristeći Northern blot analizu.
Materijal i postupci
Različite B i ne-B ćelijske linije su gajene pod odgovarajućim uslovima. RNK je pripremljena iz približno 10<7>ćelija koristeći RNazni kit (Oiagen). RNK je kvantifikovana i 20 u.g svakog uzorak je pušteno na 1.2% formaldehidni gel kao što je opisano kod Sambrook i sar. Molekularnokloniranje:laboratorijski<p>raktikum, 1989. Gel je blotovan na najlonsku membranu (BMB) i zatim ultravioletno (UV) unakrsno vezan. Nekoliko humanih Northern blotova (12 putića multi-tkivo, humani II, i imuni sistem II) su dobavljeni od Clontech. Filteri su prehibridizovani na 65°C u EkspressHvb (Clontech) puferu tokom 30 min. i zatim hibridizovani sa slučajno prajmovanim<a>P obeleženim EcoNI fragmentom od 3' kraja od JST576 tokom oko 3 časa. Filteri su isprani na sobnoj temperaturi u 2X SSC/0.05% SDS tokom 45 minuta i zatim na 50°C u 0.1X SSC/0.1% SDS tokom 45 minuta. Filteri su izloženi filmu X-zraka tokom 4 dana koristeći 2 pojačavajuća ekrana. Sem toga, nekoliko humanih Northern blotova (12 putića multi-tkivo, humani II, i imuni sistem II) koji su dobavljeni od Clontech-a hibridizovani su za JST576 probu i trtirani kao gore.
Rezultati
Pokazalo se da se mRNK za BAFF-R prvenstveno eksprimira u oragnima imunog sistema na ovom nivou detekcije. Najviši nivo je u slezini i limfnim čvorovima, ali mRNK je takođe bila očigledna kod PBL-a, timusa, malog intestinuma i debelog creva (slika 10 A, B i C). Približna veličina poruke je 4.5 kb; pokazalo se da se pojavljuju dve mRNK populacije u uzorcima gde gen nije visoko eksprimira. Dve mRNK mogu, takođe, postojati u slezini i limfnim čvorovima. Ovo može ukazivati da BAFF-R ima alternativna poliA dodatna mesta ili da RNK prolazi alternativno uplitanje. Kada se brojne ćelijske linije ispitaju za prisustvo BAFF-R mRNK, detektuje se ista 4.5 kb mRNK. Samo linije B ćelija eksprimiraju BAFF-R mRNK (si. 11). mRNK nije detektovana u ispitanim U266, RPMI8226, i Daudi ćelijskoj liniji ili ne-B ćelijskoj liniji.
Primer 11
U ovom primeru pokazujemo da je ekspresija JST576 ograničena na ćelijske linije koje vezuju BAFF.
Materijal i postupci
Ćelijske linije su dobavljene od ATCC i odgajene pod naznačenim uslovima. Različite B i ne-B ćelije su odgajene u odgovarajućim uslovima. RNK je pripremljena iz približno 10<7>ćelija
koristeći Rneasy kit (Qiagen). RNK su kvantifikovane i 20u,g svakog uzorka je pušteno na-1.2% formaldehidni gel kao što su opisali Sambrook i sar., Molekularnokloniranje:laboratorijski priručnik, 1989. Gel je blotovan na najlonsku membranu (BMB) i zatim ultravioletno (UV) unakrsno vezan. Filteri su hibridizovani sa JST576 obeleženim fragmentima i zatim isprani kao u primeru 10. Ćelije su proverene za sposobnost da vezuju BAFF putem FACS analize. Približno 2.5-5 x 10<s>ćelija je sakupljeno, i isprano. FLAG-tagovan BAFF, razblažen u PBS + 5% FCS i 0.05% natrijum azidu (FACS pufer), je inkubiran sa ćelijama preko raspona koncentracije (8-0.125u.g/ml) tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su isprane sa FACS puferom i inkubirane tokom30min. na ledu, sa anti-FLAG monoklonalnim antitelom M2 (Sigma) u 5 ug/ml. Ćelije su ponovo isprane sa FACS puferom i zatim inkubirane sa 1:5000 razblaženim kozjim anti-miš IgG PE konjugovanim antitelom (Jackson ImmunoResearch) tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su isprane kao i gore i zatim analizirane na FACSCalibur flovv sorteru (Becton-Dickinson) koristeći CellOuest softver.
Rezultati
Rezultati eksperimenata vezivanja BAFF prikazani su u tabeli 1. Ćelijske linije koje vezuju BAFF su Ramos, Namalvva, IM-9, NC-37, Raji, BJAB i SKVV6.4. Nivo vezivanja je naznačen brojem + znakovima. Ćelijske linije koje ne vezuju BAFF su U266, RPMI 8226, Daudi, U937, Jurkat, HT29, A549, SW480 i ME260. Sposobnost ćelijske linije da vezuje BAFF je korelisana sa prisustvom BAFF-R mRNK prikazanim na slici 11.
Primer 12
Ovaj primer opisuje sposobnost huBAFF-R:hulgG1 fuzionog proteina, koji je eksprimiran i izlućen u kondicioni medijum putem prolazno transfektovanih 293 EBNA ćelija, da ko-imunotaloži rekombinantni rastvoreni biotinilizirani myc-huBAFF.
Materijal i postupci
293 EBNA ćelije su transfektovane sa Lipofectamine 2000 (Life Technologies) ili sa pJST618 koji eksprimira huBAFF-R (aa2-71):Fc, plazmidom koji eksprimira huBCMA:hulgG1 kao pozitivnom kontrolom za BAFF vezivanje, ili sa plazmidom koji eksprimira huFN14:hulgG1 kao negativnom kontrolom za BAFF vezivanje. Nakon 24 časa inkubacije prikupljen je kondicioni medijum.
SDS-PAGE je obavljena mešanjem jednakih zapremina 2XSDS pufera sa ili bez redu-kujućeg agensa, sa kondicionim medijumom i proključana tokom 5 minuta. Uzorci su zatim pušteni na 4-20% SDS poliakrilamidni gel. Poznate količine prečišćenog hBCMA:Fc su puštene u susednim putićima da se proceni količina hlgGl fuzionog proteina u kondicionom medijumu. Uzorci su preneti na membrane (Immobillion P, Millipore) vvestern blotom u 0.01 M CAPS pH11-10%MeOH puferu. Membrane su blokirane sa 5% nemasnim mlekom u prahu (NFDM) u TBDT, provereni sa 1:3000 razblaženim kozjim anti-human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch) tokom 1 časa, isprani u TBST i izloženi filmu. Ko-imunotaloženja su izvedena inkubiranjem 200 uJ kondicionog medijuma sa 200 ng rekombinantnog rastvorenog humanog flag-BAFF u 1 ml DMEM-10% fetalnog goveđeg seruma-0.1% NaN3preko noći na 4°C. Protein A-Sepharose je dodan i inkubacije su produžene dva časa. Sepharose perlice su sakupljene centrifugiranjem, isprane sa FACS TBST puferom i resuspendovane u SDS unošenom puferu sa beta merkaptoetanolom kao redukcionim agensom. Uzorci su proključani 5 minuta, centrifugirani kratko da se obore Sepharose perlice i alikvot je pušten na SDS-PAGE. Kao pozitivna kontrola pušten je FLAG-huBAFF, 50 ng. Uzorci su preneti na PVDF membrane (Immobillion P, Millipore) vvestern blotom u 0.01 M CAPS pH11-10%MeOH puferu. Membrane su blokirane sa 5% NFDM-TBDT, proverene sa anti-FLAG M2-HRP tokom 1 časa, isprane u TBST i izložene filmu.
Rezultati
Ko-imunotaloženje donosi različite receptor:Fc fuzije preko fuzionog partnera koji interreaguje sa protein A Sepharose. To će, takođe, oboriti bilo koje proteine koji intereaguju sa R:lgG1 fuzijama, kao što je flag-BAFF. Kondicioni medijumi ćelija koje eksprimiraju hBCMA.Fc su u stanju da ko-imunoistalože flag-BAFF, kao što je očekivano, kao traka koja ko-migrira sa flag-BAFF što je zapaženo na vvestern blotu (slika 12). Kondicioni medijumi ćelija koje eksprimiraju hFN14:Fc ne ko-imunotalože flag-BAFF. Kondicioni medijumi ćelija koje eksprimiraju BAFF-R:Fc su sposobni da ko-imunoistalože flag-BAFF. Traka koja ko-migrira sa flag-BAFF je zapažena na vvestern blotu i slična je po intenzitetu onoj koja se ko-imunoistaloži sa huBCMA:hulgG1.
Primer 13
Ovaj primer ilustruje sposobnost BAFF-R:Fc fuzionog proteina, u ovom slučaju huBAFF-R (aa2-71):hulgG1, da blokira vezivanje huBAFF za BJAB ćelije.
Materijalipostupci
huBAFF-R (2-71)-hulgGl fizioni razmatran u primeru 9 generisan je i nazvan pJST618. Ovaj konstrukt je privremeno transfektovan u 293EBNA ćelije i sakupljen je kondicioni medijum.
Fuzioni protein je prečišćen kiselim ispiranjem iz proteina Sepharose praćenog hromatografijom filtracije gela. Biotinilizirani mvc-huBAFF. 200 ng/ml, je preinkubirano bilo sa 50 ul FACS puferom ili sa pet puta serijskim razblaženjima, u rasponu od 5 u,g/ml do 200 ng/ml, prečišćenim huBAFF-R:Fc tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su isprane sa FACS puferom i obojene sa SAV-PE. Ćelije su analizirane putem FACS za PE flurescenciju i podaci su formatirani kao preklopljeni histogrami. Alternativno, 200 ng/ml bfotiniliziranog-BAFF je preinkubirano sa dvostrukuim serijskim razblaženjima bilo hBAFF-R:Fc, hTACl:Fc ili hLTBR.Fc. Ćelije su obojene za vezivanje biotiniliziranog-BAFF kao gore.
Rezultati
Slika 13A pokazuje preklapanje histograma plotovanih za huBAFF vezivanje za BJAB u prisustvu različitih koncentracija huBAFF-R:Fc. Crna linija označena "A" predstavlja pozadinsko vezivanje SAV-PE a crvena linija označena "E" predstavlja ćelije obojene sa biotiniiiziranim myc-huBAFF bez preinkubiranja sa BAFF-R;Fc. Preinkubirani biotinilizirani myc-huBAFF sa 5 u.g/ml huBAFF-R:Fc rezultira pomeranjem u histogramu skoro do nivoa pozadine (kriva B). Preinkubacija bilo sa 1u.g/mJ (kriva C) ili 200 ng/ml (kriva D) huBAFF-R-hulgG1 rezultirala je približno četvorostrukm smanjenjem u vezivanju biotiniliziranog myc-huBAFF.
Slika 13B pokazuje da su i BAFF-R:Fc i TACI:Fc sposobni da blokiraju BAFF vezivanje BJAB ćelija. Pre inkubacija sa LTBR:Fc nije imala BAFF blokirajući efekt.
Primer 14
Ovaj primer opisuje sposobnost BAFF-R:lgG1 fuzionog proteina da blokira BAFF indukovanu proliferaciju ćelija.
Materijalipostupci
Za ogled proliferacijein vitro,mišje B ćelije su izolovane iz slezina C57B16 miševa (starih 8 nedelja) koristeći kolonu za obnavljanje B ćelija (Collect™ Mouse B Cell Recovery Column: Cedarlane Laboratories Limited, Ontario, Canada). Prečišćene B ćelije su analizirane sa FACS i nađeno je da je >90% pozitivno za B220 bojenje. B ćelije su inkubirane u pločama sa 96 bunarčića (10<5>ćelija/bunarčić u 50 ml RPMI dopunjenog sa 10% FBS) tokom 72 časa u prisustvu ili odsustvu 2 mg/ml kozijeg anti-humanog m lanca antitela (Sigma Chemical Co.); kontrolnog hlgG (10 mg/ml) huBAFF-R:Fc (10 mg/ml). Uzorci su obrađeni u triplikatu i sa naznačenim koncentracijama myc-hBAFF. Ćelije su pulsirane dodatnih 18 časova sa [<3>H]timi-dinom (1 u.Ci/bunarčić) i prikupljene. Inkorporacija [<3>H]timidina je praćena tečnim scintilacijonim brojanjem. Humani BAFF-R:Fc fuzioni protein produkovan kao u primeru 13, upotrebljen je u ovom ogledu, kao što je diskutovano u primeru 9 i generisan je iz supernatanta PJST618 transfektovanih 293EBNA ćelija. Supernatant je prikupljen, napunjen u protein A kolonu, razblažen sa kiselinom, neutralizovan i podvrgnut gel filtracionoj hromatografiji sa ciljem da se dobije huBAFF-R:Fc protein bez agregata. BAFF upotrebljen u ovom ogledu je eksprimiran uPichia pastor/ si prečišćen anjonskom izmenjivaćkom hromatografijom praćenom gel filtracijom.
Rezultati
Slika 14 pokazuje da BAFF može da ko-stimuliše rast B ćelija u prisustvu anti-m antitela (kvadratići) i hlgG (trouglovi). Sam BAFF (rombovi) nije sposoban da indukuje proliferaciju B ćelija.
Primer 15
Materijal i postupci
Miševi
Šest nedeija stare ženke BALB/c miševa dobijene su od Jackson Laboratorv (Bar Harbor, ME) i držani u ograđenim uslovima u Biogen Animal Facilitv.
Reagensi i režim tretmana
Receptorski fuzioni proteini sadrže humani lgG1 Fc region. Miševi (5/grupa) su primili 200 ug fuzionih proteina (mišji BAFF-R:Fc ili humani BAFF-R:Fc) 2X/nedelja tokom 4 nedelje, ip (intraperitonealno). Kontrolni miševi primili su poliklonalni humani IgG (Panglobulin™) (HigG), 200 u.g 2X/nedelja tokom 4 nedelje. Tri dana nakon poslednje doze sakuljena je krv iz orbitalnog sinusa, zatim su miševi eutanizirani i slezina, limfni čvorovi i koštana srž su sakupljni za analizu.
Flovv citometrijska analiza
U vreme žrtvovanja zabeležene su težine slezina. Suspenzije pojedinačnih ćelija su pripremljene iz slezine i krvi nakon liziranja crvenih krvnih ćelija u hipotoničnom rastvoru. Suspenzije pojedinačnih ćelija su takođe pripremljene iz ingvinalnih limfnih čvorova i koštane srži. Flovv citometrija je izvedena pomoću mAbs usperene protiv B220, IgM, IgD i CD21. Subpopulacije B ćelija pankreasa su definisane kao folikularne (B220+, IgM™"", CD21<noki>), marginalne zone (B220+, lgM™w, CD21v"oki) i novo formirane (B220+, IgM""0*, CD21-). Ukratko, -1.5 x 10<6>ćelija je inkubirano sa 10 u.g/ml Fc Block (Pharmingen) tokom 10 minuta na ledu da se blokiraju Fc receptori, praćeno dodavanjem fluorescentno obeleženih mAbs i inkubirani na ledu 30 minuta. Ćelije su isprane 1X i resuspendovane u 0.5% formaldehidu. Podaci o fluore-scenciji ćelija su dobijeni na FACSCalibur flovv citometru (Becton Dicknson, San Jose, CA) i analizirani pomoću CellOuest softvera (Becton Dicknson).
Rezultati
Nakon 4 nedelje tretmana sa mišjim ili humanim BAFF-R:Fc pojavila se značajna redu-kcija težina slezina miševa tretiranih sa mišjim i humanim BAFF-R:Fc (slika 15) u poređenju sa kontrolnim humanim IgG-trtiranim miševima. Nađeno je da je očigledni pad sadržaja ćelija slezine rezultat redukcije u broju B ćelija slezine. Srednji broj ukupnih B220+ B ćelija slezine kod miševa tretiranih sa mišjim i humanim BAFF-R:Fc od 1.8 x 10<6>i 2.6 x 10<s>ćelija respektivno bio je značajno redukovan u poređenju sa brojem B ćelija u kontroli HigG tretiranih životinja, koje su imale srednju vrednost 19.8 x 10<e>ćelija (slika 16). Ispitivanje različitih subpopulacija B ćelija slezine, folikularnih, marginalne zone i novo formiranih naznačilo je da je broj B ćelija kod svakog subseta bio redukovan kod BAFF-R.Fc tretiranih miševa (tabela 2), i ako su folikularna i marginalna zona B ćelija imale najveću redukciju.
Miševi su primili 200 u.g HigG, mBAFF-R:Fc ili hBAFF-R:Fc u danima 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 i 25. Miševi su eutanizovani 28. dana i slezine su prikupljene analizom subsetova B ćelija.
Ispitivanje procenta B220+ B ćelija sadržanih u ingvinalnim limfnim čvorovima (LN) pokazalo je da je srednja vrednost populacija B ćelija bila značajno redukovana kod miševa tretiranih mišjim i humanim BAFF-R:Fc koji su imali srednju vrednost od 30.8%+4.1 B ćelija (slika 17). Slični rezultati su dobijeni kada su ispitane periferne krvne ćelije. 42.5%±2.9 limfocita iz miševa tretiranih sa humanim IgG bile su B ćelije, dok je samo 21.2%±6.1 i 8.3%±4.5 limfocita bilo B ćelije kod miševa tretiranih sa humanim BAFF-R::Fc, respektivno (slika 18).
I ako su novo formirane (nezrele) B ćelije i zrele populacije B ćelija bile redukovane u BAFF-R:Fc tretiranim miševima, prekursori B ćelija u koštanoj srži ostale su nepogođene (podaci nisu prikazani).
Diskusija
Ovi rezultati sugerišu dain vivoblokada BAFF sa rastvorenim BAFF-R receptorskim fuzionim proteinom vodi do tnhibicije preživljavanja B ćelija i/ili sazrevanja.
Ovi rezultati takođe sugerišu potencijalnu upotrebu BAFF-R fuzionog proteina kao terapeutskog leka sa kliničkim primenama u bolestima posredovanim sa B ćelijama. Bolesti koje su uključene su autoimune prirode kao što je sistemski lupus eritromatosis, miastenija gravis, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska trombocitopenija purpura, anti-fosfolipidni sindrom. Chagas-ova bolest, Grave-ova bolest, Wegener-ov granu lomatozis, poli-artritis nodoza i rapidni progresivni glomerulonefritis. Terapeutski agens imaće, takođe, primenu u poremećajima plazma ćelija kao što su multipJi mielom, VValdenstorm-ova makroglobulinemija, bolest teškog lanca, primarni ili za imunocite vezani amiloidozis i monoklonalna gamopatija nedeterminisanog značaja (MGUS). Onkološki ciljevi uključuju karcinome B ćelija, leukemije i limfome.
Primer 16
U ovom primeru, opisana je karakterizacija inicijalne palete mišjih monoklonalnih antitela nastalih protiv izvanćelijskih domena BAFF-R. Sva antitela prepoznaju izvanćelijske domene BAFF-R i subset ovih antitela ima antagonističke karakteristike u tome što sprečavaju naknadno vezivanje BAFF za BAFF-R.
Materijaliipostupci
RBF miševi su imunizirani i podstaknuti sa huBAFF-R:Fc. Splenocite iz imunih miševa su fuzionisane sa mišjim mieloma sojem FL653, derivatom soja P3-X63-Ag8.653 da se generišu hibridomi standardnim tehnologijama.
Kondicioni medijumi iz hibridoma klonove koji luče antitela protiv izvanćelijskih domena huBAFF-R:Fc su ispitani sa FACS. Ogled FACS vezivanja je izveden sa 293EBNA ćelijama ko-transfektovanim sa plazmidima koji su eksprimirali BAFF-R pune dužine ilimuBAFF-R i GFP kao u primeru 5. Hibridoma kondicioni medijum je razblažen 1:10u FACS puferu i inkubiran sa transfektovanim ćelijama 30 minuta na ledu. Ćelije su isprane sa FACS puferom i vezivanje je obavljeno inkubacijom sa 1:100 razblaženjem anti-miš IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su ponovo isprane sa FACS puferom i resuspendovane u 1% paraformaldehidu u FACS puferu. Ćelije su analizirane sa FACS za GFP i PE fluorescenciju i podaci su formatirani u čtvorokvadratnom tačkastom plotu kao što je opisano u primeru 5. Ogledi blokiranja BAFF su izvedeni inkubiranjem 10 ug/ml proteina A prečišćenog anti-BAFF-R mAb ili kontrolnog antitela (MOP C21) sa BJAB ćelijama tokom 30 minuta na ledu. Nakon ispiranja ćelije su inkubirane sa 250 ng/ml biotiniliziranog huBAFF tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su ponovo isprane sa vezivanjem BAFF je obavljeno sa SAV-PE. Ćelije su analizirane sa FACS za PE fluorescenciju i podaci su plotovani kao preklapajući histogrami.
Rezultati
Zapaženo je da su se supernatanti iz deset klonova vezivali za huBAFF-R transfektovane ćelije. Tačkasti plotovi FACS podataka od četiri do deset anti-BAFF-R supernatanta prikazani su na slici 19A. Transfekciona efikasnost bila je približno 50%, sa gotovo svim transfektovanim ćelijama pomerenim u gornji desni kvadrant nakon bojenja sa supernatantima. Nijedan od ovih deset supernatanata nije se vezao za 293EBNA ćelije transfektovane sa muBAFFR (podaci nisu pokazani). Kondicioni medijumi iz ovih klonova koji su bili pozitivni za vezivanje BAFF-R testirani su za njihovu sposobnost da blokiraju interakciju BAFF sa BAFF-R eksprimiranim na površini BJAB ćelija. BJAB ćelije eksprimiraju BAFF-R na svojoj površini i eksprimiraju ne-detektibilne količine BCMA ili TACI (Thomson i sar. (2001)Science16. avg.). Dva od deset hibridoma, klonovi 2 i 9, produkovali su mAb-ove koji su bili u stanju da blokiraju interakciju BAFF-R sa BAFF. (Klon 2 je deponovan sa ATCC 6. septembra 2001, kao "anti anti-BAFF-R klon #2.1" (IgGl-kappa izotip) i označen je ATCC br. PTA-3689; klon 9 je deponovan sa ATCC 6. septembra 2001, kao "anti anti-BAFF-R klon #9.1" (IgGl-kappa izotip) i označen je ATCC br. PTA-3688). Preklopljni histogrami na slici 19B pokazuju da preinkubacija 10 u.g/ml, bilo mAb klona 2 (kriva (b)), ili 9 (kriva (c)), pomeraju krivu vezivanja BAFF više od 10 puta u levo, blizu signala kontrolnog BAFF (kriva (a)). Histogram poslednji desno (kriva (d)) naznačava pomeranje kada su kontrolni mAb MOP C21, anti-BAFF-R ne-blokirajući mAb-ovi, ili ne proteini inkubirani sa ćelijama pre BAFF vezivanja.
Primer 17:
Ovaj primer opisuje konstrukciju, sekvence i karakterizaciju proteina amino kiselina supstituisanih u hBAFF-R(2-71)-Fc koja rezultira povećanim rastvaranjem rekombinantno eksprimiranog molekula.
Materijaliipostupci
Dvolančane oligonukleotidne kasete sa kohezionim krajevima bile su upotrebljene da se uvedu substitucije ciljnih ostataka putem vezivanja na ista mesta u hBAFF-R(2-71)-Fc genu.
Ekspresioni plazmidi su transfektovani u 293EBNA ćelije pomoću Lipofectamine 2000 kao u primeru 5. Agregacija je određena pomoću ne-redukovane SDS-PAGE 20 časova post-transfe-kcionog kondicionog medijuma, praćenog vvestern transferom, i detekcijom sa HRP konjugovanim anti-humanim IgG (1:100, Jackson ImmunoResearch) i ECL detekcijom kao u primeru 12.
Eksperimenti imunoprecipitacije su izvedeni korišćenjem 100 uJ od 20 č post-transfe-kcionog kondicionog medija u 1 ml DMEM/10%FBS/0.2%NaA3 sa 200 ng flag-huBAFF. Uzorci su istaloženi tokom 30 minuta na 4°C, 30 u.l proteina A-Sepharose je dodano po tubi i taloženje je nastavljeno tokom narednih 30 minuta. Sepharose perlice su oborene i isprane tri pua sa 1 ml hladnog PBS. Pilule su resuspendovane u 2 X SDS redukujućem puferu i napunjeni u 4-20% akrilamidne gelove. Nakon vvestern transfera kao što je opisano ranije, sposobnost da se imunoistaloži flag-BAFF je izvršena inkubiranjem filtera sa 1 u.g/ml HRP konjugovanog anti-flag M2 (Sigma) praćenog sa ECL detekcijom.
Rezultati:
Dok je humani BAFF-R:Fc visoko nagomilan, mišji BAFF-R:Fc je samo neznatno (<10%) nagomilan. Analiza delecija pokazala je da cela C-terminalna BAFF-R grupa može biti delecirana iz A71 do V36 (poslednji Cys cistein bogatog domena (CRD) je C35) bez smanjenja formiranja agregata. To implicira da su N-terminalni i CRD regioni hBAFF-R potrebni za formiranje agregata.
Inicijalno, generisane su himere mišjeg-humanog BAFF-R:Fc u različitim količinama N-terminalne humane BAFF-R sekvence su zamenjene sa homologim mišjim sekvencama i analizirane za efekat agregacije proteina. Sekvenca amino kiseline za ove i uzstopne supstitucije u BAFF-R:Fc prikazane su na slici 20. Ova slika pokazuje BAFF-R grupu i humanog "divljeg tipa" (slika 9) i mišjeg BAFF-R:Fc, sa brojanjem koje odgovara ostacima amino kiselina iz pune dužine humanog (slika 26) (SEQ ID BR:5) ili mišjeg BAFF-R (slika 4b) (SEQ ID BR:9). Slika 20 takođe pokazuje hBAFF-R:Fc klonove sa supstitucijama, sa supstituisanim ostacima naznačenih podebljano, crveno podvučeno. Himere koje su sadržale manje od prvih 21 mišjih ostataka (Q21) pre preključivanja na humani izgleda da agregiraju slično divljem tipu hBAFF-R:Fc; međutim, oni koji sadrže najmanje 39 mišjih ostataka, agregiraju na značajno redukovan način, slično sa mBAFF-R. Od dodatnih devet ostataka različitih između ove dve himere BAFF-R:Fc konstrukata, četiri od njih razlikuju se između miša i čoveka. To će implicirati da je najmanje jedan od humanih ostataka između C19 i L27, region unutrašnji za CDR, potreban za agregaciju.
Konstrukti koji zamenjuju humane ostatke sa onima koji odgovaraju mišjim na ta 4 mesta ili njihov subset napravljeni su standardnim tehnikama. Kada su samo 4 ostatka V20N P21Q A22T L27P bili supstituisani u humanu BAFF-R grupu, ovaj modifikovani BAFF-R:Fc nije bio agregiran. hBAFF-R:Fc(V20N P21Q A22T L27P)Fc bili su još uvek u stanju da intereaguju sa BAFF kao što je analizirano imunotaloženjem. V20N L27P supstitucija takođe je redukovala agregacije BAFF-R:Fc od oko približno 90% do oko 10%. Intermedijerni nivoi agregacije zapaženi su sa P21Q L27P (40%), L27P (60%), V20N L27A (60%), i V20N L27S (60%). Nijedna od sledećih supstitucija nije smanjila agregaciju proteina: V20N P21Q A22T; V20N A22T; V20N P21Q; V20N i P21Q.
Primer 18
Ovaj primer opisuje da je p21-Arc protein asociran sa BAFF-R. Postupak koji se koristi da se odredi takva interakcija je imunotaloženje.
Postupci
Konstrukt, koji sadrži cDNK koji kodira unutarćelijski domen BAFF-R (BAFF-R-i.c.d) sa mvcobeleženim fuzionisanim na N-terminus, napravljen je i subkloniran u CH269 plazmid na Nhel (5') i Xhol (3<1>) mestima. 293E ćelije su transfektovane sa tim konstruktom i lizirane su 72 časa nakon što je lizis pufer koji sadrži 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH7.5, 1mM Na3V04, 50 mM NaF i 1% Brij97. Ćelijski lizati su izbistreni saStonom centrifugom na 10,000 g tokom 5 minuta i imunoistaloženi su sa anti-mvc monoklonalnim antitelom, 9E10. Imunotalozi su razdvojeni sa 10-20% SDS-PAGE pod redukujućim uslovima i trans-blotirani na PVDF membranu. Blotovani proteini su vizualizovani sa 0.2% Ponceau S rastvorom i područja koja su odgovara proteinima specifično asociranim sa BAFF-R su isečeni i podvrgnuti N-terminalnoj analizi sekvenci amino kiseline. Dvostruka pretraga u ne-redudantnim proteinskim bazama podataka kori-steći PATTERN SEARCH algoritam obavljena je za dobijene N-terminalnu sekvencu.
Rezultati
Jedan od proteina posebno vezanih sa myc-obeleženim BAFF-R citoplazmatičnim domenom ima jasnu molekularnu težinu od 21 kDa. Ovaj protein je nedvosmisleno identifikovan kao p21-Arc (proteinski kompleks vezan sa aktin). P21-Arc je sastavljen od sedam subjedinica proteina nazvanog Arp2/3 kompleks za koji je dokazano da je uključen u polimerizaciju aktina (VVelch i sar. (1997)J. Cell Biol.138:357). Nedavno je izneto da je, protein koji vezuje aktin, filamin, vezan sa za receptor vezanim faktorom nekrozisom tumora 2 (TRAF2) (Leonardi i sar.
(2000)J. Biol. Chem.275:271). Prema tome, identifikacija p21-Arc u ko-imunoistaloženom BAFF-R citoplazmatičnom domenu sugeriše da je p21-Arc ili direktno vezan sa BAFF-R ili indirektno vezan sa BAFF-R preko asocijacije sa TRAF2 i/ili drugim TRAF proteinom koji povratno vezuje BAFF-R.
Iz gore pomenutog detaljnog opisa specifičnih oblika pronalsaka treba da je očigledno da je opisani oblik jedinstven. I ako su posebni oblici otkriveni ovde detaljno to je urađeno na način da se primenom da svrha samo radi ilustracije, i nije namera da se ograniči u odnosu na obim podnetih zahteva, koji slede. Posebno je predviđeno od strane pronalazača da različite supstitucije, izmene i modifikacije mogu biti napravljene u pronalasku bez odstupanja od duha i obima pronalaska, kao što je definisano zahtevima.

Claims (74)

1. Izolovani BAFF-R (Faktor aktivacije B ćelija receptor iz TNF porodice) polipeptidnaznačen timešto sadrži: (a) SEQ ID BR:5; (b) fragment SEQ ID BR:5 koji se vezuje za BAFF (Faktor aktivacije B ćelija iz TNF porodice) (c) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 70% identična sa SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5; (d) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5; (e) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5; (0 aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5; ili (g) SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5, modifikovane sa jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, pri čemu se modifikovana sekvenca vezuje za BAFF.
2. Izolovani BAFF-R polipeptid prema zahtevu 1.naznačen timešto polipeptid sadrži: (a) SEQ ID BR:10; (b) fragment SEQ ID BR: 10 koji se vezuje za BAFF (c) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 70% identična sa SEQ ID BR:10 ili fragment SEQ ID BR: 10; (d) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID BR:10 ili fragment SEQ ID BR:10; (e) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID BR:10 ili fragment SEQ ID BR:10; (f) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID BR:10 ili fragment SEQ ID BR:10; ili (g) SEQ ID BR.10 ili fragment SEQ ID BR:10fmodifikovane sa jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, pri čemu se modifikovana sekvenca vezuje za BAFF.
3. Izolovani BAFF-R polipeptid prema zahtevu 1 ili 2,naznačen timešto polipeptid sadrži: (a) aminokiseline 19 - 35 od SEQ ID BR:5; (b) aminokiseline 19 - 35 od SEQ ID BR:5 modifikovane sa jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, pri čemu se modifikovana sekvenca vezuje za BAFF; (c) SEQIDBR:13; ili (d) SEQ ID BR:13 modifikovana sa jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, pri čemu se modifikovana sekvenca vezuje za BAFF;
4. Izolovani BAFF-R polipeptid prema zahtevu 1,naznačen timešto polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju Čine: (a) SEQIDBR:15; (b) SEQ ID BR:16; (c) SEQID BR:17; (d) SEQ ID BR:18; (e) SEQ ID BR.19; (f) SEQ ID BR:20; (g) SEQ ID BR:21; (h) SEQ ID BR:22; (i) SEQ ID BR:23; (j) SEQ ID BR:24; (k) SEQ ID BR:25; (1) SEQ ID BR:26; (m) SEQ ID BR:27; (n) SEQ ID BR:28; (o) SEQ ID BR;29; (p) SEQ ID BR:30; (q) SEQ ID BR:31; (r) SEQ ID BR:32; (s) fragment bilo koje od sekvenci (a) - (r) koji se vezuje za BAFF (t) bilo koju od sekvenci (a) - (s) modifikovanu sa jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, pri čemu se modifikovan polipeptid vezuje za BAFF.
5. Izolovani BAFF-R polipeptid prema zahtevu 4,naznačen timešto sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: (a) SEQ IDBR:19; (b) SEQ ID BR:22; (c) SEQ ID BR:24; (d) SEQ ID BR:25; (e) SEQ ID BR:26; (f) SEQ ID BR:27; i (g) fragment bilo koje od sekvenci (a) - (0 koji se vezuje za BAFF.
6. Izolovani BAFF-R polipeptid prema zahtevu 1 ili 2,naznačen timešto se polipeptid vezuje za BAFF i poseduje smanjenu sklonost za agregaciju, u poređenju sa odgovarajućim nativnim BAFF-R polipeptidom, i sadrži: (a) SEQ ID BR.5, ili SEQ ID BR:10, gde su jedna ili više nekonzerviranih aminokiselina iz regiona C19-L27 nativnog BAFF-R polipeptida supstituisane sa odgovarajućim aminokiselinama iz BAFF-R polipeptida SEQ ID NO:9; ili (b) fragment sekvence (a) koji se vezuje za BAFF.
7. Izolovani BAFF-R polipeptid prema zahtevu 6,naznačen timešto su supstitucije uvedene na jedan ili na više položaja koji su izabrani iz grupe koju čine: (a) V20, P21, A22 i L27 od SEQ ID BR-.10; (b) V41, P42, A43 i L48 od SEQ ID BR:12; i (c) C19 do L27 od fragmenta SEQ ID BR: 10 koji sadrži aminokiseline 2-71.
8. Izolovani BAFF-R polipeptid prema zahtevu 7,naznačen timešto sadrži aminokiseline 2 - 71 od SEQ ID BR:10, pri čemu su izmenjene aminokiseline izabrane iz grupe koju čine: (a) V20N, P21Q, A22T i L27P: (b) V20N i L27P; (c) P21QiL27P; (d) L27P; (e) V20N i L27A: i (f) V20N i L27S.
9. Izolovani BAFF-R polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 8,naznačen timešto je polipeptid himerični protein.
10. Himerični BAFF-R polipeptid prema zahtevu 9,naznačen timešto sadrži: (a) SEQ ID BR:12: (b) fragment SEQ ID BR:12 koji se vezuje za BAFF (c) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID BR:12 ili sa fragmentom SEQ ID BR:12; ili (d) SEQ ID BR:12 ili fragment SEQ ID BR.12 modifikovanu sa jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, pri čemu se modifikovana sekvenca vezuje za BAFF.
11. Himerični BAFF-R polipeptid prema zahtevu 10.naznačen timešto sadrži aminokiseline 23 - 92 od SEQ ID BR: 12 i Fc region humanog IgGl.
12. Himerični BAFF-R polipeptid prema zahtevu 9,naznačen timešto sadrži: (a) Fc region antitela; (b) sekvence koje su derivirane iz imunoglobulinskog proteina; (c) heterologu signalnu sekvencu; ili (d) glutation S-transferazu.
13. Himerični protein prema zahtevu 9,naznačen timešto sadrži konstantni region imunoglobulina i BAFF-R polipeptid koji je izabran iz grupe koju čine: (a) bilo koja od sledećih sekvenci: SEQ ID BR:13, SEQ ID BR:14, SEQ ID BR:15, SEQ ID BR:16, SEQ ID BR:17, SEQ ID BR.18, SEQ ID BR:19, SEQ ID BR:20, SEQ ID BR:21, SEQ ID BR:22, SEQ ID BR:23. SEQ ID BR:24, SEQ ID BR:25, SEQ ID BR:26, SEQ ID BR:27, SEQ ID BR:28, SEQ ID BR:29, SEQ ID BR:30, SEQ ID BR:31 i SEQ ID BR:32; i (b) fragment sekvence (a) koji vezuje BAFF.
14. Izolovani BAFF-R polipeptid,naznačen timešto sadrži: (a) SEQ ID BR:9; (b) fragment SEQ ID BR:9 koji se vezuje za BAFF (c) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 70% identična sa SEQ ID BR:9 ili fragment SEQ ID BR:9; (d) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID BR:9 ili fragment SEQ ID BR:9; (e) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID BR:9 ili fragment SEQ ID BR:9; ili (f) SEQ ID BR:9 ili fragment SEQ ID BR:9 modifikovane sa jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, pri čemu se modifikovana sekvenca vezuje za BAFF.
15. Izolovani BAFF-R polipeptid,naznačen timešto sadrži: (a) SEQIDBR:14; (b) fragment SEQ ID BR: 14 koji se vezuje za BAFF (c) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 70% identična sa SEQ ID BR:14 ili fragment SEQ ID BR:14; (d) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID BR:14 ili fragment SEQ ID BR.14; (e) aminokiselinsku sekvencu koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID BR:14 ili fragment SEQ ID BR:14; ili (f) SEQ ID BR.14 ili fragment SEQ ID BR:14 modifikovane sa jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, pri čemu se modifikovana sekvenca vezuje za BAFF.
16. Molekul nukleinske kiseline,naznačen timeŠto sadrži sekvencu nukleotida koji kodiraju BAFF-R polipeptid iz zahteva 14 ili 15.
17. Molekul nukleinske kiseline,naznačen timešto sadrži sekvencu nukleotida koji kodiraju BAFF-R polipeptid iz zahteva 1 do 13.
18. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 17,naznačen timešto molekul sadrži sekvencu nukleotida koji su izabrani iz grupe koju čine: (a) SEQ ID BR:3; (b) SEQ ID BR:4; (c) SEQ ID BR:6; (d) SEQ ID BR:11; (e) nukleotidi 67 - 276 od SEQ ID BR;11; (f) nukleotidi 67 - 276 i 280 - 960 od SEQ ID BR:11; (g) fragment od najmanje 100 uzastopnih nukleotida iz bilo koje od sekvenci (a) - (e); (h) fragment bilo koje od sekvenci (a) - (f) koji kodira polipeptid koji se vezuje za BAFF; (i) nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid koji se vezuje za BAFF i koja je najmanje 70% identična sa bilo kojom od sekvenci (a) - (h); (j) nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid koji se vezuje za BAFF i koja je najmanje 80% identična sa bilo kojom od sekvenci (a) - (h); (k) nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid koji se vezuje za BAFF i koja je najmanje 90% identična sa bilo kojom od sekvenci (a) - (h).
19. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 17 ili 18,naznačen timešto molekul kodira BAFF-R polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: (a) SEQ ID BR:5 ili fragment SEQ ID BR:5 koji se vezuje za BAFF; (b) SEQ ID BR: 10 ili fragment SEQ ID BR: 10 koji se vezuje za BAFF; (c) SEQ ID BR:13 ili fragment SEQ ID BR:13 koji se vezuje za BAFF; (d) aminokiselinska sekvenca koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 70% identična sa bilo kojom od sekvenci (a) - (c); (e) aminokiselinska sekvenca koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 80% identična sa bilo kojom od sekvenci (a) - (c); (f) aminokiselinska sekvenca koja se vezuje za BAFF i koja je najmanje 90% identična sa sa bilo kojom od sekvenci (a) - (c).
20. Molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 17 do 19,naznačen timešto nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji je kraći od BAFF-R pune dužine i koji se vezuje za BAFF.
21. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 17,naznačen timešto je kodirani polipeptid izabran iz grupe koju čine: (a) SEQ ID BR.-19; (b) SEQ ID BR:22: (c) SEQ ID BR:24; (d) SEQ ID BR:25; (e) SEQ ID BR:26; (f) SEQ ID BR:27; i (g) fragment bilo koje od sekvenci (a) - (f) koji se vezuje za BAFF.
22. Molekul nukleinske kiseline,naznačen timešto sadrži sekvencu nukleotida koja: (a) hibridizuje pod strogim uslovima sa SEQ ID BR:2, SEQ ID BR:3, SEQ ID BR:4, SEQ ID BR:6 ili sa nukleotidima 67 - 276 SEQ ID BR:11; (b) hibridizuje pod strogim uslovima sa komplementom SEQ ID BR:3 ili SEQ ID BR:4; ili (c) je komplementarna sa nukleinskom kiselinom SEQ ID BR.2, SEQ ID BR:3, SEQ ID BR:4. SEQ ID BR:6 ili sa nukleotidima 67 - 276 SEQ ID BR:11, pri čemu se pod strogim uslovima pod (a) i ( b) podrazumeva inkubacija sa 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% fikolom, 0,02% BSA i 500 mg/ml denaturisanom DNK iz sperme lososa na 65 °C, nakon čega sledi jedno ili više ispiranja u 0,2X SSC, 0,1% BSA na 50 °C, i pri čemu sekvenca nukleotida pod (a), (b), i (c) nije EST AI250289, SEQ ID BR:2 ili Gen. Bank pristupni br. Z99716.
23. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 22,naznačen timešto je sekvenca nukleotida komplementarna sa molekulom nukleinske kiseline prema zahtevu 18.
24. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 16,naznačen timešto sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je izabrana iz grupe koju čine: (a) SEQ ID BR:8; (b) fragment SEQ ID BR:8 koji sadrži najmanje 100 uzastopnih nukleotida; (c) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira SEQ ID BR:14; (d) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koja je najmanje 70% identična sa SEQ ID BR:14 i koja se vezuje za BAFF; (e) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID BR: 14 i koja se vezuje za BAFF; i (f) sekvenca nukleinske kiseline koja je komplementarna sa bilo kojom od sekvenci (a)-(e).
25. Vektor naznačen time što sadrži molekul nukleinske kiseline iz bilo kog od zahteva 17 do 23.
26. Ćelija naznačena time što sadrži vektor iz zahteva 25.
27. Ćelija prema zahtevu 26naznačena timešto je ta ćelija konkretno ćelija jajnika kineskog hrčka.
28. Ćelija prema zahtevu 26naznačena timešto sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 19.
29. Antitelo ili polipeptid koji sadrži antigen-vezujući deo antitela,naznačen timešto se to antitelo ili antigen-vezujući deo polipeptida specifično vezuje za BAFF-R deo polipeptida iz bilo kog od zahteva 1 do 15.
30. Antitelo ili polipeptid prema zahtevu 29,naznačeno timešto se antitelo ili antigen-vezujući deo polipeptida specifično vezuje za BAFF-R polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: (a) SEQ ID BR:5; (b) SEQ ID BR:10; (c) SEQ IDBR:13;i (d) fragment bilo koje od sekvenci (a) - (c) koji se vezuje za BAFF.
31. Antitelo ili polipeptid prema zahtevu 29 ili 30,naznačeno timešto se antitelo ili antigen-vezujući deo polipeptida poseduje jednu ili više sledećih osobina: (a) monoklonsko je; (b) poliklonsko je: (c) himerično je: (d) humanizovano je; (e) jednolančanoje; (f) u obliku je Fab fragmenta; i (g) u obliku je F(ab)<*>2fragmenta.
32. Antitelo ili polipeptid prema zahtevu 31.naznačeno timešto se antitelo ili antigen-vezujući deo polipeptida specifično vezuje za polipeptid iz zahteva 2 ili zahteva 3.
33. Antitelo prema zahtevu 29 ili 30,naznačeno timešto ga proizvodi: (a) hibridomski klon #2.1, zaveden kao ATCC br. PTA-3689; ili (b) hibridomski klon #9.1, zaveden kao ATCC br. PTA-3688.
34. Antitelo prema bilo kom od zahteva 29 do 33 ili polipeptid prema bilo kom od zahteva 29 do 32,naznačeno timešto antitelo ili antigen-vezujući deo polipeptida blokira vezivanje BAFF za BAFF-R.
35. Antitelo ili polipeptid prema zahtevu 34,naznačeno timešto je antitelo ili antigen-vezujući deo polipeptida humanizovano.
36. Antitelo ili polipeptid prema zahtevu 30,naznačeno timešto je antitelo ili antigen-vezujući deo polipeptida humanizovano.
37. Hibridomnaznačen timešto je izabran iz grupe koju čine hibridomski klon #2.1, zaveden kao ATCC br. PTA-3689 i hibridomski klon #9.1, zaveden kao ATCC br. PTA-3688.
38. Farmaceutski preparatnaznačen timešto sadrži jedan ili više sledećih sastojaka: (a) polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 dol3: i (b) antitelo ili polipeptid koji sadrži antigen-vezujući deo antitela iz bilo kog od zahteva 29 do 36.
39. Farmaceutski preparat prema zahtevu 38,naznačen timešto sadrži antitelo ili polipeptid koji sadrži antigen-vezujući deo antitela iz zahteva 36.
40. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 13 ili antitelo ili polipeptid koji sadrži antigen-vezujući deo antitela prema bilo kom od zahteva 29 do 36naznačen timešto se koristi u terapiji.
41. Upotreba polipeptida iz bilo kog od zahteva 1 do 13 ili antitela ili polipeptida koji sadrži antigen-vezujući deo antitela iz bilo kog od zahteva 29 do 36 za proizvodnju medikamenta za tretiranje, sprečavanje nastanka ili odlaganje pojave stanja posredovanog B-ćelijama, poremećaja plazma ćelija, autoimune bolesti, tumorogenog stanja, hipertenzije, kardiovaskularnog stanja, bubrežnog poremećaja, B-ćelijskog limfoproliferativnog poremećaja, Burkitovog limfoma, imunosupresivne bolesti, transplantacije organa, inflamacije ili HIV bolesti.
42. Upotreba prema zahtevu 41,naznačena timeŠto je poremećaj plazma ćelija multipli mijelom, Valdenstremova makroglobulinemija. bolest teških lanaca, primarna ili sa imunocitima udružena amiloidoza ili monoklonska gamopatija neodređenog značaja (MGUS).
43. Upotreba prema zahtevu 41,naznačena timešto je autoimuno oboljenje reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus, miastenija gravis, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska trombocitopenijska purpura, anti-fosfolipidni sindrom, Šagasova bolest, Grejvsova bolest, Vegenerova granulomatoza, nodozni poliarteritis ili glomerulonefritis.
44. Upotreba prema zahtevu 41,naznačena timešto je tumorogeno stanje B-ćelijski karcinom, leukemija ili limfom.
45. Upotreba prema zahtevu 41,naznačena timešto je medikament formulisan za tretiranje, sprečavanje nastanka ili odlaganje pojave sistemskog eritematoznog lupusa.
46. Upotreba prema zahtevu 41,naznačena timešto je medikament formulisan za tretiranje, sprečavanje nastanka ili odlaganje pojave reumatoidnog artritisa.
47. Upotreba prema zahtevu 41,naznačena timešto medikament sadrži polipeptid iz zahteva 3 ili zahteva 5 i formulisan je za tretiranje, sprečavanje nastanka ili odlaganje pojave sistemskog eritematoznog lupusa.
48. Upotreba prema zahtevu 41.naznačena timeŠto medikament sadrži antitelo ili polipeptid koji sadrži antigen-vezujući deo antitela iz zahteva 36 i što je formulisan za tretiranje, sprečavanje nastanka ili odlaganje pojave sistemskog eritematoznog lupusa.
49. Upotreba prema zahtevu 41,naznačena timešto medikament sadrži polipeptid iz zahteva 3 ili zahteva 5 i što je formulisan za tretiranje, sprečavanje nastanka ili odlaganje pojave reumatoidnog artritisa.
50. Upotreba prema zahtevu 41,naznačena timešto medikament sadrži antitelo ili polipeptid koji sadrži antigen-vezujući deo antitela iz zahteva 36 i što je formulisan za tretiranje, sprečavanje nastanka ili odlaganje pojave reumatoidnog artritisa.
51. Izolovana proba nukleinske kiselinenaznačena timešto se sastoji od 10 do 50 uzastopnih nukleotida izabranih između: (a) sekvence koja je izabrana iz grupe koju čine SEQ ID BR:2, SEQ ID BR:3, SEQ ID BR:4 i SEQ ID BR:6; (b) SEQ ID BR:8; (c) sekvence koja je komplementarna sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID BR:2, SEQ ID BR:3, SEQ ID BR:4 i SEQ ID BR:6; i (d) degenerisanih oblika sekvenci (a) ili (b) koji kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu.
52. Postupakin vitro taproizvodnju BAFF-R polipeptidanaznačen timešto obuhvata korake: (a) kultivaciju ćelije iz bilo kog od zahteva 26 do 28 u uslovima koji su dovoljni za eksprimiranje BAFF-R polipeptida; i (b) prikupljanje BAFF-R polipeptida.
53. Postupakin vitroza identifikaciju funkcionalno aktivnog mutantnog BAFF-R polipeptida, iz bilo kog od zahteva 1 do 15,naznačen timešto obuhvata procenu mutantnog BAFF-R na jednu ili na više sledećih aktivnosti: (a) sposobnost vezivanja za BAFF; (b) sposobnost vezivanja za intracelularni ciljni protein ili njegov biološki aktivni deo; (c) sposobnost specifičnog vezivanja za anti-BAFF-R antitelo, pri Čemu prisustvo jedne ili više ovih aktivnosti ukazuje da je mutantni BAFF-R funkcionalno aktivan.
54. Postupakin vitroza identifikacije jedinjenja koje moduliše aktivnost BAFF-Rnaznačen timešto obuhvata korake: (a) uspostavljanja kontakta BAFF-R iz bilo kog od zahteva 1 do 15 sa jedinjenjem; i (b) određivanja da li je aktivnost BAFF-R modulisana.
55. Postupakin vitroza proizvodnju BAFF-R polipeptida sa umanjenom sklonošću ka agregaciji u poređenju sa odgovarajućim nativnim BAFF-R polipeptidom,naznačen timešto obuhvata korake: (a) transformacija ćelije domaćina nukleinskom kiselinom koja kodira BAFF-R polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 do 15, u kome je jedna ili više nekonzerviranih aminokiselina iz regiona C19-L27 supstituisana odgovarajućim aminokiselinama iz BAFF-R polipeptida SEQ ID BR:9; (b) kultivacija ćelije u uslovima koji su dovoljni za eksprimiranje BAFF-R polipeptida koji sadrži supstituisanu(e) amino kiselinu(e); i (c) prikupljanje BAFF-R polipeptida (a).
56. Postupak prema zahtevu 55,naznačen timešto je nekonzervirana aminokiselina nepolarna aminokiselina.
57. Postupak prema zahtevu 56,naznačen timešto je nepolarna aminokiselina zamenjena aminokiselinom koja je izabrana iz grupe koju čine prolin, serin ili alanin.
58. Ne-humana transgena životinjanaznačena timešto egzogene BAFF-R sekvence koje kodiraju BAFF-R polipeptid iz bilokog od zahteva 1-15, uvedene u njen genom ili kod koje su endogene BAFF-R sekvence izmenjene.
59. Kompletnaznačen timešto sadrži barem jedno antitelo iz bilo kog od zahteva 29 do 36 i neku kontrolu.
60. Postupakin vitroza identifikaciju ćelija ili tkiva koje imaju izmenjenu ekspresiju BAFF-R,naznačen timešto obuhvata: (a) uspostavljanje kontakta oligonukleotidne probe koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida iz sekvence koja je izabrana između: SEQ ID BR:1, SEQ ID BR:2, SEQ ID BR:3, SEQ ID BR-.4, SEQ ID BR:6 i sekvenci koje su komplementarne bilo kojoj SEQ ID BR:1, SEQ ID BR:2, SEQ ID BR:3, SEQ ID BR:4 i SEQ ID BR:6, sa biološkim uzorkom poreklom od subjekta; i (b) merenje nivoa nukleinske kiseline koja kodira BAFF-R u biološkom uzorku pomoću detekcije nivoa iRNK BAFF-R; ili alternativno, (c) određivanje da li je nukleinska kiselina BAFF-R u biološkom uzorku mutirana ili deletirana.
61. Dijagnostički komplet za identifikaciju ćelija ili tkiva koje imaju izmenjenu ekspresiju BAFF-Rnaznačen timešto sadrži oligonukleotidnu probu koja ima najmanje 10 uzastopnih nukleotida iz sekvence izabrane iz grupe koju čine: SEQ ID BR:1, SEQ ID BR:2, SEQ ID BR:3, SEQ ID BR:4, SEQ ID BR:6 i sekvence koje su komplementarne bilo kojoj SEQ ID BR:1, SEQ ID BR:2, SEQ ID BR:3, SEQ ID BR:4 i SEQ ID BR:6.
62. Komplet za detekciju prisustva BAFF-R u biološkom uzorkunaznačen timešto sadrži: obeleženo jedinjenje ili sredstvo koje je sposobno da detektuje BAFF-R polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 do 15 ili mRNK koja kodira BAFF-R polipeptid iz bilo kog od zahteva 1-15 u biološkom uzorku; sredstva za određivanje količine BAFF-R u uzorku; i sredstva za upoređivanje količine BAFF-R polipeptida ili mRNA u uzorku sa standardom.
63. Postupakin vitroza dijagnostikovanje stanja posredovanog B-ćelijama kod subjektanaznačen timešto obuhvata korake: (a) merenje količine BAFF-R polipeptida iz bilo kog od zahteva 1 do 15 ili BAFF-R nukleinske kiseline koja enkodira BAFF polipeptida iz bilo kog od zahteva 1 do 15 u biološkom uzorku iz subjekta; i (b) upoređivanje količine BAFF-R polipeptida ili BAFF-R nukleinske kiseline u uzorku subjekta sa količinom BAFF-R polipeptida ili BAFF-R nukleinske kiseline u kontrolnom uzorku. pri čemu razlika u količini BAFF-R polipeptida ili BAFF-R nukleinske kiseline u uzorku subjekta u odnosu na količinu BAFF-R polipeptida ili BAFF-R nukleinske kiseline u kontrolnom uzorku ukazuje da subjekat ima stanje posredovano B-ćelijama.
64. Upotreba: (a) polipeptida iz bilo kog od zahteva 1 do 13: (b) molekula nukleinske kiseline iz bilo kog od zahteva 17 do 23; (c) antitela iz bilo kog od zahteva 29 do 36; ili (d) probe iz zahteva 51, za dobijanje dijagnostičkog reagensa za dijagnostikovanje stanja posredovanog B-ćelijama.
65. BAFF-R polipeptidnaznačen timešto je proizveden pomoću procesa: (a) kultivacije ćelije domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 - 15 u uslovima koji su dovoljni za ekspresiju BAFF-R polipeptida; i (b) izolovanja eksprimiranog polipeptida.
66. Himerični BAFF-R polipeptidnaznačen timešto je proizveden pomoću procesa: (a) kultivacije ćelije domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira: (i) BAFF-R polipeptid koji obuhvata SEQ ID BR:10 ili fragment SEQ ID BR:10 koji se vezuje za BAFF; i (ii) polipeptid koji se razlikuje od BAFF-R polipeptida, u uslovima koji su dovoljni za ekspresiju fuzionog proteina; i (b) izolovanja eksprimiranog himeričnog BAFF-R polipeptida.
67. BAFF-R polipeptid prema zahtevu 65 ili himerični polipeptid prema zahtevu 66,naznačen timešto BAFF-R polipeptid sadrži aminokiseline 2 - 71 od SEQ ID BR:10 ili njen fragment koji se vezuje za BAFF.
68. BAFF-R polipeptid prema zahtevu 65 ili himerični polipeptid prema zahtevu 66,naznačen timešto BAFF-R polipeptid sadrži aminokiseline 2 - 71 od SEQ ID BR:10.
69. Himerični polipeptid prema bilo kom od zahteva 66 do 68,naznačen timeŠto polipeptid koji se razlikuje od BAFF-R polipeptida sadrži Fc domen humanog IgG.
70. BAFF-R polipeptid prema zahtevu 65 ili himerični polipeptid prema bilo kom od zahteva 66 do 69,naznačen timešto je ćelija domaćin ćelija sisara.
71. Polipeptid prema zahtevu 70,naznačen timešto je ćelija sisara ćelija jajnika kineskog brčka.
72. Postupakin vitroza detekciju BAFF-R u biološkom uzorku subjekta,naznačen timešto podrazumeva detekciju BAFF-R polipeptida iz bi iz bilo kog od zahteva 1 do 15 u biološkom uzorku subjekta primenom antitela ili polipeptida koji sadrži antigen-vezujući deo antitela iz bilo kog od zahteva 28 do 35.
73. Postupak prema zahtevu 72,naznačen timešto antitelo ili antigen-vezujući deo polipeptida poseduje jednu ili više sledećih osobina: (a) monoklonsko je; (b) poliklonskoje: (c) himeričnoje: (d) humanizovano je; (e) jednolančano je; (f) u oblikuje Fab fragmenta; i (g) u oblikuje F(ab)'2fragmenta.
74. Postupakin vitroza određivanje da li je genomska sekvenca BAFF-R pretrpela mutaciju ili deleciju, naznačen time što podrazumeva utvrđivanje da li je molekul nukleinske kiseline BAFF-R u biološkom uzorku subjekta pretrpeo mutaciju ili deleciju primenom molekula nukleinske kiseline koji je u stanju da hibridizuje, pod strogim uslovima, sa genomskom sekvencom humane BAFF-R (SEQ ID BR:10) ili BAFF-R miša (SEQ ID BR:9), pri čemu se pod strogim uslovima podrazumeva inkubacija sa 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% fikolom, 0,02% BSA i 500 mg/ml denaturisanom DNK iz sperme lososa na 65 °C, nakon Čega sledi jedno ili više ispiranja u 0,2X SSC, 0,1% BSA na 50 °C.
YUP-199/03A 2000-09-18 2001-09-06 Nukleinske kiseline i polipeptidi novog receptora RS50728B (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23315200P 2000-09-18 2000-09-18
US23414000P 2000-09-21 2000-09-21
US26849901P 2001-02-13 2001-02-13
US31218501P 2001-08-14 2001-08-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU19903A YU19903A (sh) 2006-05-25
RS50728B true RS50728B (sr) 2010-08-31

Family

ID=27499682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-199/03A RS50728B (sr) 2000-09-18 2001-09-06 Nukleinske kiseline i polipeptidi novog receptora

Country Status (33)

Country Link
US (8) US7112421B2 (sr)
EP (3) EP2325317B2 (sr)
JP (2) JP5904689B2 (sr)
KR (1) KR100935744B1 (sr)
CN (3) CN1940068A (sr)
AR (1) AR030760A1 (sr)
AT (2) ATE360070T1 (sr)
AU (2) AU2001288858B2 (sr)
BG (1) BG66208B1 (sr)
BR (1) BR0113921A (sr)
CA (1) CA2422622C (sr)
CY (2) CY1106708T1 (sr)
CZ (1) CZ299161B6 (sr)
DE (1) DE60128002T2 (sr)
DK (3) DK2325317T3 (sr)
EA (2) EA012833B1 (sr)
EE (1) EE05411B1 (sr)
ES (2) ES2388153T3 (sr)
GE (1) GEP20074267B (sr)
HU (1) HU227331B1 (sr)
IL (3) IL154622A0 (sr)
IS (1) IS6729A (sr)
MX (1) MXPA03002328A (sr)
NO (2) NO332318B1 (sr)
NZ (1) NZ525187A (sr)
PL (1) PL207267B1 (sr)
PT (2) PT1352063E (sr)
RS (1) RS50728B (sr)
SK (1) SK4712003A3 (sr)
TW (1) TWI322181B (sr)
UA (1) UA83458C2 (sr)
WO (1) WO2002024909A2 (sr)
ZA (1) ZA200301903B (sr)

Families Citing this family (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
EP0878552A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
WO1999057309A1 (en) * 1998-05-04 1999-11-11 Dako A/S Method and probes for the detection of chromosome aberrations
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
KR20090016772A (ko) 1999-08-17 2009-02-17 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｂａｆｆ 수용체(ｂｃｍａ), 면역조절제
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
JP5062606B2 (ja) * 2000-02-16 2012-10-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔｎｆ関連分子の活性を調節するためのアゴニスト及びアンタゴニストの使用
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
DE60143798D1 (de) 2000-06-16 2011-02-17 Cambridge Antibody Tech Immunspezifisch bindende antikörper gegen blys
WO2002016411A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
EP2267015A3 (en) 2000-08-18 2011-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
CA2428242A1 (en) * 2000-11-07 2002-05-16 Zymogenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
WO2002072827A1 (fr) * 2001-02-28 2002-09-19 Riken Recepteur specifique de cellule b se liant a traf3
CN1636067A (zh) * 2001-08-03 2005-07-06 杰南技术公司 TACls和BR3多肽及其用途
US7112410B1 (en) * 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
AU2002339680A1 (en) * 2001-12-26 2003-07-15 Genset S.A. Agonists and antagonists of bromix for the treatment of metabolic disorders
AU2003221256A1 (en) * 2002-02-21 2003-09-09 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
EP1578923A4 (en) * 2002-04-22 2009-01-21 Hutchinson Fred Cancer Res SOLUBLE MIC POLYPEPTIDE AS A MARKER FOR THE DIAGNOSIS, FORECAST AND TREATMENT OF CANCER AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISEASES
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
ATE437176T1 (de) * 2002-05-17 2009-08-15 Retrovec Aps Gereinigtes hüllprotein eines retrovirus, dafür kodierende nukleinsäuren, vektoren und deren verwendung
EP1551877A4 (en) * 2002-07-25 2006-01-18 Genentech Inc TACI ANTIBODIES AND THEIR USE
EP1608730B1 (en) 2003-03-28 2013-11-06 Biogen Idec MA Inc. Truncated baff receptors
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
AU2004256042A1 (en) * 2003-06-05 2005-01-20 Genentech, Inc. BlyS antagonists and uses thereof
KR20070001880A (ko) * 2003-10-20 2007-01-04 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｂαｆｆ 길항제를 위한 치료 섭생법
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
AU2004315198A1 (en) 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of BCMA and uses thereof
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
CN101120021A (zh) * 2004-12-31 2008-02-06 基因技术公司 结合br3的多肽及其用途
DK1855711T3 (da) * 2005-01-28 2009-10-12 Biogen Idec Inc Anvendelse af BAFF til behandling af Th2-medierede tilstande
EP1902320B1 (en) 2005-05-20 2010-03-10 Genentech, Inc. Pretreatment of a biological sample from an autoimmune disease subject
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
NZ597082A (en) 2005-10-13 2013-11-29 Human Genome Sciences Inc Methods and Compositions for Use in Treatment of Patients with Autoantibody Positive Diseases
AU2006318539B2 (en) 2005-11-23 2012-09-13 Genentech, Inc. Methods and compositions related to B cell assays
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
CL2007001536A1 (es) 2006-05-30 2008-01-25 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd22; polinucleotidos que los codifica; vector y celula huesped que los comprende; metodo de fabricacion; metodo de deteccion del anticuerpo en una muestra biologica; inmunoconjugado que comprende al anticuerpo; composicion que lo comprende y su uso para tratar trastornos proliferativos de celulas b.
US20100166741A1 (en) * 2006-07-13 2010-07-01 Genentech , Inc. Altered br-3 binding polypeptides
JP2011500715A (ja) 2007-10-16 2011-01-06 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 自己免疫疾患の治療のためのＢＬｙＳ阻害剤および抗ＣＤ２０剤の組合せ
BRPI0817182A2 (pt) 2007-10-30 2015-03-17 Genentech Inc Método para purificar um anticorpo e composições
MX2011000616A (es) 2008-07-17 2011-02-24 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos terapeuticos.
CN102149724B (zh) 2008-08-14 2014-04-09 健泰科生物技术公司 使用原地蛋白质置换离子交换膜层析清除污染物的方法
CA2734275A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Genentech, Inc. Compositions and methods for the prevention of oxidative degradation of proteins
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
AU2010224160A1 (en) 2009-03-10 2011-09-22 Biogen Idec Ma Inc. Anti-BCMA antibodies
CN102597268B (zh) 2009-09-03 2017-09-22 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于治疗、诊断和监控类风湿性关节炎的方法
CA2809819A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
CN106983862A (zh) 2010-03-22 2017-07-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 对于稳定含有蛋白质的制剂有用的组合物和方法
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
RU2012151500A (ru) 2010-05-03 2014-06-10 Дженентек, Инк. Композиции и способы, пригодные для снижения вязкости белковосодержащих составов
EP2568960B1 (en) 2010-05-10 2018-06-06 Intas Pharmaceuticals Ltd. Liquid formulation of polypeptides containing an fc domain of an immunoglobulin
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
MX336540B (es) 2010-06-08 2016-01-22 Genentech Inc Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.
MY184736A (en) 2010-06-24 2021-04-20 Genentech Inc Compositions and methods containing alkylglycosides for stabilizing protein-containing formulations
ES2544608T3 (es) 2010-11-17 2015-09-02 Genentech, Inc. Conjugados de anticuerpo y de alaninil-maitansinol
US8735347B2 (en) 2011-02-02 2014-05-27 Children's Hospital Medical Center Regulation of energy metabolism and obesity by modulating B cell activating factor (BAFF, BLYS) or BAFF signaling
RU2013140975A (ru) 2011-02-28 2015-04-10 Дженентек, Инк. Биологические маркеры и способы прогнозирования восприимчивости к антагонистам в-клеток
MX2013013054A (es) 2011-05-12 2014-02-20 Genentech Inc Metodo de monitoreo de lc-ms/ms de reaccion multiple para detectar anticuerpos terapeuticos en muestras de animales utilizando peptidos de firma de estructura.
WO2013055987A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
KR20140102759A (ko) * 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
HRP20181846T1 (hr) 2011-12-22 2018-12-28 Genentech, Inc. Kromatografija membranom za ionsku izmjenu
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
MX364328B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
HRP20181646T2 (hr) 2012-10-12 2019-08-09 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin - anti-psma protutijela
PL2906251T3 (pl) 2012-10-12 2018-02-28 Adc Therapeutics Sa Koniugaty pirolobenzodiazepina-przeciwciało anty-CD22
WO2014057117A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
KR101645905B1 (ko) 2012-10-12 2016-08-04 스피로즌 살 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
WO2014057120A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
AU2013366493B2 (en) 2012-12-21 2017-08-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6445519B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
WO2014140862A2 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP2968585B1 (en) 2013-03-13 2018-07-18 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10442836B2 (en) 2013-08-12 2019-10-15 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1H-benzo[E]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
BR112016013258A2 (pt) 2013-12-16 2018-01-16 Genentech Inc composto conjugado anticorpo-droga, composição farmacêutica, método para tratar câncer e kit
JP6895254B2 (ja) 2013-12-16 2021-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
CA2928952A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
US10435474B2 (en) 2013-12-24 2019-10-08 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
WO2016003876A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of multiple sclerosis and neuromyelitis optica
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10149913B2 (en) 2014-09-12 2018-12-11 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
US10077318B2 (en) 2014-09-12 2018-09-18 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP2017533887A (ja) 2014-09-17 2017-11-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピン類及びその抗体ジスルフィドコンジュゲート
US10780096B2 (en) 2014-11-25 2020-09-22 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA2969689A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
NZ741261A (en) 2015-10-02 2019-11-29 Genentech Inc Pyrrolobenzodiazepine antibody drug conjugates and methods of use
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
EP3365025B1 (en) 2015-10-20 2020-07-15 Genentech, Inc. Calicheamicin-antibody-drug conjugates and methods of use
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
EP3433621A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CN118436801A (zh) 2016-05-20 2024-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
WO2018031662A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
JP7050770B2 (ja) 2016-10-05 2022-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体薬物コンジュゲートの調製方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
UA125198C2 (uk) 2017-02-08 2022-01-26 Ейдісі Терапьютікс Са Кон'югати піролобензодіазепін-антитіло
SI3612537T1 (sl) 2017-04-18 2022-10-28 Medimmune Limited Konjugati pirolobenzodiazepina
WO2018193102A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
WO2018206715A2 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Cyano Biotech Gmbh Modified microcystins and nodularins
AU2018278678B2 (en) 2017-05-09 2022-02-03 Cyano Biotech Gmbh Method for modifying microcystins and nodularins
JP7145891B2 (ja) 2017-06-14 2022-10-03 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 抗ｃｄ１９ ａｄｃを投与するための投与レジメ
BR112020003003A2 (pt) 2017-08-18 2020-08-11 Medimmune Limited conjugados de pirrolobenzodiazepina
AU2018337815A1 (en) 2017-09-20 2020-03-12 Ph Pharma Co., Ltd. Thailanstatin analogs
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
US12116415B2 (en) 2018-10-09 2024-10-15 Single Cell Technology, Inc. Anti-BCMA antibodies
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
EP3894427A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
MX2021010477A (es) 2019-03-15 2021-10-01 Medimmune Ltd Dimeros de azetidobenzodiazepina y conjugados que los comprenden para uso en el tratamiento de cancer.
AR118536A1 (es) 2019-04-01 2021-10-20 Genentech Inc Composiciones y métodos para estabilizar formulaciones que contienen proteína
ES2827148B2 (es) * 2019-11-19 2021-10-19 Instituto Nac De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria Inia Plásmido codificante para el receptor del factor de activación de células B (BAFF-R) y usos del mismo en el tratamiento y prevención de enfermedades inflamatorias en peces
EP4157859A4 (en) * 2020-06-01 2024-12-18 Nanyang Technological University ISOLATED PEPTIDE FOR PEPTIDE COACERVATE AND METHODS OF USE THEREOF
AU2021307452A1 (en) 2020-07-15 2023-02-09 Biogen Ma Inc. Implantable cranial medical device
US20230295274A1 (en) 2020-07-27 2023-09-21 Single Cell Technology, Inc. Anti-sars coronavirus-2 spike protein antibodies
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
CN116096414A (zh) * 2020-08-04 2023-05-09 诺华股份有限公司 Cll的治疗
WO2022031567A1 (en) * 2020-08-04 2022-02-10 Novartis Ag Treatment of b cell malignancies
WO2022246041A2 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Achelois Biopharma, Inc. Compositions and methods for multivalent surface display on enveloped particles
WO2022078524A2 (en) 2021-11-03 2022-04-21 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Specific conjugation of an antibody
CN119384296A (zh) 2022-06-07 2025-01-28 映恩生物制药（苏州）有限公司 抗b7h3抗体-药物偶联物及其用途
JP2026502860A (ja) 2022-12-23 2026-01-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド セレブロン分解剤コンジュゲートおよびその使用
EP4673476A1 (en) * 2023-02-28 2026-01-07 Mayo Foundation for Medical Education and Research Molecules that bind to b-cell activating factor receptor polypeptides
TW202440636A (zh) 2023-03-21 2024-10-16 美商傳記５５有限公司 Ｃｄ１９／ｃｄ３８多特異性抗體
CN121263210A (zh) 2023-04-17 2026-01-02 沛科生物公司 抗体和抗体-药物偶联物以及使用方法和合成工艺及中间体
CN116626306B (zh) * 2023-05-18 2025-09-16 上海吉宣生物科技有限公司 一种检测尿液中HIV(l+2)抗体试剂条的制备方法、试剂条及试剂笔
WO2026006689A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Bcl-xl degrader antibody conjugates and uses thereof
WO2026006688A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Degrader antibody conjugates and uses thereof
CN118949008B (zh) * 2024-07-25 2025-06-10 安徽医科大学第二附属医院 一种可溶性b淋巴细胞刺激因子受体3和脂联素球部融合蛋白制备方法及其应用

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE122007000007I1 (de) 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
EP0950707B1 (en) 1989-07-25 2009-02-18 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5945397A (en) 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
IL98764A0 (en) 1990-07-10 1992-07-15 Smithkline Beecham Corp Oxamides
WO1992009689A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
DE69333969T2 (de) 1992-10-30 2006-09-14 The General Hospital Corp., Boston Wechselwirkendes Fallensystem zur Isolierung von Proteinen
US5547835A (en) 1993-01-07 1996-08-20 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
DE69320824T2 (de) 1993-12-09 1999-05-12 Stmicroelectronics S.R.L., Agrate Brianza, Mailand/Milano Integrierte Schaltung zur Überwachung der Benutzung von Redunanzspeicherbauelementen in einer Halbleiterspeichereinrichtung
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
PT897390E (pt) 1996-03-14 2004-03-31 Human Genome Sciences Inc Factor delta e epsilon de necrose tumoral humana
EP0939804B2 (en) 1996-10-25 2011-06-15 Human Genome Sciences, Inc. NEUTROKINE alpha
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
JP2002517977A (ja) 1997-06-06 2002-06-18 リジェネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｔｎｆリガンドファミリーのｎｔｎ−２メンバー
WO1998055620A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU9013998A (en) 1997-07-21 1999-02-10 Zymogenetics Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
AU9376498A (en) 1997-09-05 1999-03-22 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
CZ294615B6 (cs) 1997-09-12 2005-02-16 Apotech R & D Sa Léčivo obsahující protilátky reaktivní s polypeptidovým ligandem APRIL pro léčení rakoviny
AU9315298A (en) 1997-09-12 1999-03-29 Apotech S.A. Kay - a novel immune system protein
AU2093499A (en) 1997-12-30 1999-07-19 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
WO2000026244A2 (en) 1998-11-04 2000-05-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
SK288176B6 (sk) * 1999-01-07 2014-04-02 Zymogenetics, Inc. Farmaceutický prostriedok obsahujúci fúzny proteín, izolovaná molekula polynukleotidu, expresný vektor, kultivovaná bunka, spôsob prípravy polypeptidu a izolovaný polypeptid
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
MXPA01007464A (es) 1999-01-25 2003-06-06 Apoxis Sa Baff, inhibidores del mismo y su uso en la modulacion de la respuesta de celula b.
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
NZ513290A (en) 1999-02-23 2004-05-28 Human Genome Sciences Inc Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
WO2000050633A1 (en) 1999-02-24 2000-08-31 The General Hospital Corporation Method for cloning signal transduction intermediates
WO2000058362A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
WO2000068378A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
US20030166003A1 (en) 1999-06-14 2003-09-04 Cochran Andrea G. Structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
KR20090016772A (ko) * 1999-08-17 2009-02-17 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｂａｆｆ 수용체(ｂｃｍａ), 면역조절제
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
WO2001058949A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Biogen, Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
DE60143798D1 (de) 2000-06-16 2011-02-17 Cambridge Antibody Tech Immunspezifisch bindende antikörper gegen blys
AU2001288260A1 (en) 2000-08-15 2002-03-13 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
EP2267015A3 (en) * 2000-08-18 2011-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
CA2428242A1 (en) * 2000-11-07 2002-05-16 Zymogenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
JP4516719B2 (ja) 2001-05-11 2010-08-04 アムジエン・インコーポレーテツド Ｔａｌｌ−１と結合するペプチド及び関連分子
CN1636067A (zh) 2001-08-03 2005-07-06 杰南技术公司 TACls和BR3多肽及其用途
WO2003024991A2 (en) 2001-09-21 2003-03-27 Amgen Inc. Tall-1 receptor molecules and uses thereof
US7825089B2 (en) 2001-10-24 2010-11-02 National Jewish Health Three-dimensional structures of TALL-1 and its cognate receptors and modified proteins and methods related thereto
CA2467521A1 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
AU2004256042A1 (en) 2003-06-05 2005-01-20 Genentech, Inc. BlyS antagonists and uses thereof
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione

Also Published As

Publication number Publication date
PT1842918E (pt) 2012-07-23
IL206414A0 (en) 2010-12-30
US7638327B2 (en) 2009-12-29
BG107621A (bg) 2004-01-30
IS6729A (is) 2003-02-28
CY1106708T1 (el) 2012-05-23
HK1059283A1 (en) 2004-06-25
DE60128002D1 (de) 2007-05-31
PT1352063E (pt) 2007-07-11
HU227331B1 (en) 2011-03-28
PL366331A1 (en) 2005-01-24
DK1352063T3 (da) 2007-08-06
CY1113421T1 (el) 2016-06-22
MXPA03002328A (es) 2003-06-06
US20060240517A1 (en) 2006-10-26
CN1622995B (zh) 2013-09-04
EP2325317B2 (en) 2016-07-27
EP2325317B1 (en) 2012-11-07
IL206414A (en) 2012-02-29
CN104311658A (zh) 2015-01-28
NO20031248L (no) 2003-05-16
EA200300381A1 (ru) 2003-10-30
US20140187485A1 (en) 2014-07-03
US20060240518A1 (en) 2006-10-26
AR030760A1 (es) 2003-09-03
EE200300107A (et) 2005-02-15
IL154622A0 (en) 2003-09-17
CN1940068A (zh) 2007-04-04
EA012833B1 (ru) 2009-12-30
HK1158260A1 (en) 2012-07-13
AU2001288858A2 (en) 2002-04-02
ES2388153T3 (es) 2012-10-09
EA024034B1 (ru) 2016-08-31
NO332318B1 (no) 2012-08-27
US20060240519A1 (en) 2006-10-26
EP2325317A1 (en) 2011-05-25
NO20031248D0 (no) 2003-03-18
CZ299161B6 (cs) 2008-05-07
US7112421B2 (en) 2006-09-26
NZ525187A (en) 2006-02-24
PL207267B1 (pl) 2010-11-30
BR0113921A (pt) 2004-12-14
ATE554171T1 (de) 2012-05-15
ES2286139T3 (es) 2007-12-01
CA2422622A1 (en) 2002-03-28
EA200901129A1 (ru) 2010-04-30
AU2001288858B2 (en) 2007-11-01
EE05411B1 (et) 2011-04-15
EP1842918A1 (en) 2007-10-10
AU8885801A (en) 2002-04-02
DK1842918T3 (da) 2012-07-23
DE60128002T2 (de) 2008-01-03
DK2325317T3 (da) 2013-01-07
WO2002024909A2 (en) 2002-03-28
KR20030074596A (ko) 2003-09-19
ATE360070T1 (de) 2007-05-15
US7709220B2 (en) 2010-05-04
TWI322181B (en) 2010-03-21
NO20120869A1 (no) 2014-02-07
HUP0401591A3 (en) 2005-05-30
US20100311189A1 (en) 2010-12-09
US8026072B2 (en) 2011-09-27
KR100935744B1 (ko) 2010-01-06
US20120070437A1 (en) 2012-03-22
BG66208B1 (bg) 2012-04-30
US8524672B2 (en) 2013-09-03
US7635677B2 (en) 2009-12-22
YU19903A (sh) 2006-05-25
IL154622A (en) 2010-11-30
EP1352063B1 (en) 2007-04-18
EP1352063A2 (en) 2003-10-15
JP5904689B2 (ja) 2016-05-25
JP2004509624A (ja) 2004-04-02
ZA200301903B (en) 2004-06-25
EP1842918B2 (en) 2016-07-27
WO2002024909A3 (en) 2003-07-31
EP1842918B1 (en) 2012-04-18
US20040072188A1 (en) 2004-04-15
JP2014064585A (ja) 2014-04-17
US20060240520A1 (en) 2006-10-26
CN1622995A (zh) 2005-06-01
GEP20074267B (en) 2007-12-25
CA2422622C (en) 2010-11-16
HUP0401591A2 (hu) 2004-11-29
WO2002024909A9 (en) 2003-04-03
UA83458C2 (uk) 2008-07-25
SK4712003A3 (en) 2003-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2325317B2 (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
AU2001288858A1 (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
JP2004509624A5 (sr)
HK1059283B (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
HK1158260B (en) Receptor nucleic acids and polypeptides