RS50831B - Izolovano antitelo ili fragment antitela koji se specifično vezuju za rg1 polipeptid - Google Patents

Abstract

Izolovano antitelo ili fragment antitela koji se specifično vezuju za RG1 polipeptid iz SEQ ID NO: 2, naznačeni time, stoje polipeptid odabran od grupe koja se sastoji od:(a) polipeptida koji se sastoji od amino kiseline 28 do amino kiseline 46 kako je to dato na Slici 2 (SEQ ID NO: 2); i(b) polipeptida koji se sastoji od amino kiseline 28 do amino kiseline 46 i amino kiseline 77 do amino kiseline 91 kako je to dato na Slici 2 (SEQ ID NO: 2).Prijava sadrži još 5 nazavisnih i 7 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi, delimično, na novo identifikovane polinukleotide i polipeptide; varijante i derivate polinukieotida i polipeptida; načine stvaranja polinukleotida i polipeptida i njihovih varijanti i derivata; antitela usmerena prema polipeptidima, njihovim varijantama i derivatima; i upotrebu polinukleotida,

polipeptida, varijanti, derivata i antitela. Posebno, u ovom i ostalim pogledima, pronalazak se odnosi na nove humane polipeptide ekstracelularnog matriksa (označen kao RG1), polinukleotide koji kodiraju ove polipeptide, antitela usmerena prema ovim polipeptidima, i antisens polinukleotide koji blokiraju ekspresiju RG1.

STANJE TEHNIKE

Rak prostate je bolest koja često nastaje kod čoveka, i otkriveno je da otprilike jedna trećina muškaraca preko 45 godine starosti oboljevaju od istog. Postoje podaci i o genetičkim razlozima i razlozima uricaja spoljašnje okoline koji dovode do nastanka ove bolesti, gde je najveći broj ovih razloga rezultat kombinacije oba faktora. Studije o bolesti raka u porodicama ukazuju da genetička predispozicija igra ulogu u otprilike 5-10% svih bolesti raka prostate, a u otprilike 45% slučajeva kod muškaraca mlađih od 55 godina.

Postoje podaci da se rak prostate razvija kao više stepena bolest, od kojih je jedna od preteča prostatička intraepitelna neoplazija (PIN). Rane faze bolesti su androgeno zavisne, dok su kasnije faze hormonski nezavisne. Proliferativni poremećaj prostate poznat kao benigna prostatička hiperplazija se često otkriva klinički ali verovatno nije faza u razvoju raka. Ipak to se često povezuje sa rakom prostate. Oblici raka u prostati su često multifokalni, generalno se sporo razvijaju, i heterogeni su. Kasnije faze raka često metastaziraju na limfne čvorove i na kost.

Rak prostate se uobičajeno dijagnozira fizičkim pregledom preko nivoa seruma specifičnog antigena prostate (PSA). Radikalna prostatektomija je izborni tretman za lokalizovanje bolesti. Razvijena metastazna bolest se trenutno leči androgenom ablazijom izazvanom orhiektomijom ili lečenjem sa GnRH (hormonom koji oslobađa gonadotropin), i anti androgenom terapijom. Pa ipak, razvijena bolest skoro u svim slučajevima postaje otporna na hormone i za poodmaklu bolest ne postoji lek. Sta više, postoje ozbiljna nepoželjna dejstva povezana kako sa radikalnom prostatektomijom tako i sa terapijom androgene ablacije. Ona uključuju visoki rizik od nedržanja mokraće i impotencije povezanih sa radikalnom prostatektomijom i frakture kosti i osteoporoze povezane sa terapijom androgene ablacije.

Zbog toga, postoji značajna potreba za novim terapeutskim prilazima kako za ranu tako i za kasnije faze raka prostate. Postoji takođe značajna potreba za novim dijagnostičkim sredstvima, posebno sredstvima koja mogu da razlikuju faze bolesti, pošto to značajno utiče na opcije u lečenju. Na primer, ukoliko se bolest razvila i preko prostate i metastazirala na limfne čvorove, radikalna prostatektomija se ne sprovodi pošto nema dejstva na progresiju, a može izazvati značajne neželjene sporedne efekte. Sredstvo koji bi moglo da otkrije metastazu,in vivo,imalo bi veliki značaj.

Promene u ekspresiji specifičnih proteina su prikazane kod raka prostate uključujući abnormalnu p53 ekspresiju u kasnoj fazi raka prostate, smanjene nivoe TGF-|3 receptora, smanjene nivoe E-kadherina, C-Cam (ćelijski adhezioni molekul), i nekoliko integrina. Ekspresija onkogenog bcl-2 je značajno povećano u kasnoj fazi androgeno nezavisnih tumora, i prognoza za pacijente sa ekspresijom bcl-2 sa značajnim povećanjem je relativno loša. Dok su prethodno pomenute promene u ekspresiji gena dobro dokumentovane, nisu identifikovane nikakve promene u ekspresiji koje bi pokazale da su uzroci bolesti. Bilo bi, zbog toga, korisno identif i kovati nove proteine čija bi ekspresija bila povezana sa prisustvom ili razvojem tumora prostate koji bi služili kao ciljani molekuli za dijagnozu i terapiju raka prostate.

Ovaj pronalazak otkriva novi homolog u superfamiliji proteina ekstracelularnog matriksa. Ovaj homolog, nazvan RG1 se ekspresuje u tkivu prostate i može biti prekomerno ekspresovan u tumorima prostate.

Ekstracelularni matriks je kompleksna mreža kolagena i elastina, ugrađena u viskoelastičnu osnovu sastavljenu od proteoglukana i glikoproteina. Ovaj matriks postoji kao trodimenzionalna podržavajuća skela koja izoluje delove tkiva, posreduje kod ćelijskog povezivanja i određuje arhitekturu tkiva (Bissel et al.,J. Theor. Biol.99:31-68, 1982; Carlson et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78:2403'2406, 1981). Matriks se ponaša kao makro molekularni filter (Hay, E.D.,Cell Biology of Extracellular Matrix,New York, Plenum Press, 1982) i takođe utiče na citodiferencijaciju, mitogenezu i morfogenezu (Gospodarovviczs, D.,Cancer Res.38:4155-171, 1978). Biohemijske interakcije između normalnih ćelija i matriksa mogu se promeniti u neoplaziju i to može uticati na rast ćelija tumora. Ćelije tumora i matriks mogu međusobno da utiču na različite načine. Prvo, ćelije tumora mogu se povezati sa matricom putem specifičnih receptora plazme membrane (Terranova et al.,Cancer Res.42:2265-2269, 1982). Drugo, degradacija matriksa određena je kaskadom enzima koje doprinose preko ćelija tumora i domaćina (Eisen et al.,Bioch. Biophys.Acta 151:637-645, 1968). Treće, u diferenciranim oblastima tumora, ćelije tumora mogu da sintetišu i akumuliraju matriks ili da izazovu ćeliju domaćina da u prekomernim količinama akumulira matriks (Brownstein et al.,Cancer40:2979-2986, 1977).

RG1 pokazuje homologiju sa superfamilijom proteina ekstracelularnog matriksa, kodiranih Mindin/F-spondin genima. Familija gena se ujedinjuje putem dva konzervirana spondin domena, FS1 i FS2, blizu amino završetka i bar jednog trombospondin tip 1 ponavljanja (TSR1) na karboksi završetku (Shimeid, S.M., Mol. Biol. Evol. 15(9):1218-1223, 1998). Motiv TSR je originalno pronađen u kičmenim proteinima ekstracelularnog matriksa (Bornstein,P., J. Cell Biol.130:503-506, 1995) a potom je otkriven u nekoliko drugih proteina ekstracelularnog matriksa. Postoji nekoliko linija dokaza da TSR-ovi posreduju u adheziji ćelija i igraju ključnu ulogu u genezi tumora. Na primer, pokazano je da proteolitički fragmenti trombospondina koji sadrži TSR-ove, i sintetički peptidi koji imaju sekvence koje korespondiraju sa TSR regionom trombospondina, potpomažu srastanje ćelije tumora i metastazu (Prater etal., J. Cell Biol.112:1031-1040, 1991; Tuszvnski and Nicosia,BioEssays18:71-76, 1996) , imaju anti-angiogensku aktivnost (Tolsma et al.,J. Cell Biol.122:497-511, 1993) i inhibiraju agregaciju plateleta i metastazu melanoma (Tuszvnski et al.,J. Cell Biol.116:209-217, 1992).

Trenutno, u članove ove superfamilije spadaju i geniCaenorhabditis elegans,jedan gen Drosophila i mnogi geni kod kičmenjaka. Kod C. Elegans, gen F10E7.4 kodira za pet TSR-a kao dodatak FS1 i FS2 domenima (Higajashijima et. al.,Dev. Biol.192:211-227, 1997). Kod Drosophila, član familije sa nazivom M-spondin (mspo) sadrži domene FS1 i FS2 i jedan TSR (Umemiva et al.,Dev. Biol.186:165-176, 1997) . M-spondin gen kodira skriveni protein koji je lokalizovan na položajima povezivanja mišića i izgleda da funkcioniše kao protein ekstracelularnog matriksa koji podržava spoj između mišića i apoderma. Članovi familije kod kičmenjaka uključuju gene izolovane iz Danio (Brachdanio) rerio, zebraribe (Mindin 1 i Mindin 2, F-spondin 1 i F-spondin 2), F-spondin pacova, Xenopus F-spondin i Mindin pacova. Mindin 1 i Mindin 2 su blisko povezani jedan sa drugim i imaju strukturu gena sličnu M-spondinu kodDrosophila.Oba, Mindin 1 i Mindin 2 gena kodiraju jedan TSR kao dodatak FS1i FS2 domenima (Higashijima et al., Dev. Biol.192:211-227,1997). F-spondin 1 i F-spondin 2 zebraribe, F-spondin pacova (Kiasr et al., Cell 69:95-110, 1992) i Xenopus F-spondin (Altaba etal.,Proc. Nati. Acad. Sci. USA90:8268-8272) geni imaju svi slične strukture, i kodiraju 6 kopija TSR-a kao dodatak oblastima FS1 i FS2. Kod vertebrata, Mindin/F-spondin superfamilija može biti klasifikovana u dve grupe: one gene blisko povezane sa F-spondinom pacova i Mindin genima i one gene koji su blisko povezani sa Drosophila M-spondin genom. I Mindin vertebrata i F-spondin geni kičmenjaka kodiraju proteine koji se primarno ekspresiju preko podne ploče neuralne cevi u toku embrionalnog razvoja.

Nedavno je iz amfioksusa izolovan jedan gen u vezi sa F-spondinom, AmfiF-spondin (Shimeld, S.M., Mol. Biol. Evol. 15(9):1218-1223, 1998). Na osnovu molekularne filogenetike, AmfiF-spondin je u bliskoj vezi sa posebnom podgrupom F-spondin gena kičmenjaka koji kodiraju šestTSR-ova. AmfiF-spondin pretvara u kod tri TSR-a i dva fibronektin tipa III ponavljanja, gde jedan od njih ima snažan identitet kao fibronektin tip III ponavljanja iz Brisanja u Kolorektalnom Tumoru (Deleted in Colorectal Cancer - DCC). Ekspresija ovog proteina je otkrivena kroz veći deo centralnog nervnog sistema i nije ograničena na središnj liniju kako je opisano za Mindin i F-spondin proteine kičmenjaka.

Ovi podaci sugerišu da bi proteini ekstracelularnog matriksa, kao što je novi RG1 protein, koji je homolog Mindin/F-spondin superfamiliji, bili dobri kandidati za upotrebu prilikom dijagnostikovanja raka i terapeutske intervencije.

SUŠTINA PRONALASKA

Ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotidnu sekvencu koja jedinstveno kodira novi protein ovde označen kao RG1. RG1 polipeptid pokazuje homologiju sa Mindin proteinom ekstracelularnog matriksa kod pacova. On sadrži sekvencu za hidrofobni signal na N-kraju, dva spondin domena (FS1 i FS2), i ponavljanje trombosporina tipa 1 na svom C-kraju. RG1 pokazuje 89,7% sličnost sa Mindinom pacova. Polinukleotidna sekvenca, označena ovde kaorgl,odva opisana na Slici 1 (SEQ ID N0:1), kodira sekvencu amono kiselina za RG1, koja je prikazana na Slici 2 (SEQ ID NO:2).

Prema svemu ovome, zadatak ovog pronalaska je da obezbedi polipeptide, između ostalog, koji su identifikovani kao novi i homologi su Mindin familiji proteina ekstracelularnog matriksa, kao što je prikazano upoređivanjem sekvence amino kiselina na Slici 2 (SEQ ID NO: 2) i poznate sekvence amijno kiselina iz drugih proteina ekstracelularnog matriksa.

Štaviše, dalji zadatak ovog pronalaska je da obezbedi polinukleotide koji kodiraju takve polipeptide, naročito polinukleotide koji kodiraju polipeptide označene ovde kao RG1.

U saglasnosti sa ovim aspektom pronalaska ovde su obezbeđeni izolovani polinukleotidi koji kodiraju RG1, uključujući mRNK, cDNK, i u daljim realizacijama ovog aspekta pronalaska, biološki, dijagnostički, klinički ili terapeutski upotrebljive varijante, analoge ili derivate istog, ili fragmente istog, uključujući fragmente varijanti, analoga i derivata.

Među naročito pretpostavljenim realizacijama ovog aspekta pronalaska su alelne varijante polinukleotida koje se prirodno pojavljuju a koji kodiraju varijante polipeptida ovde označene kao RG1.

U saglastnosti sa ovim aspektom pronalaska ovde su obezbeđeni novi polipeptidi humanog porekla ovde označeni kao RG1 isto kao i biološki, dijagnostički ili terapeutski korisni fragmenti, varijante ili derivati istog, varijante ili derivati fragmenata, i analozi prethodnog.

Među posebno pretpostavljenim realizacijama ovog aspekta pronalaska su varijante RG1 kodirane alelnim varijantamarg1polinukleotida, koji prirodno nastaju.

Drugi zadatak pronalaska je da obezbedi postupak proizvodnje već pomenutih polipeptida, polipeptidnih fragmenata, varijanti i derivata, fragmenata varijanti i derivata, i analoga prethodno pomenutog. Pretpostavljena realizacija ovog aspekta pronalaska je obezbeđenje postupka proizvodnje gore pomenutih RG1 polipeptida uključivanjem kultivacije ćelije domaćina koje imaju ugrađen egzogeno dobijen polinukleotid za kodiranje RG1 pod uslovima za ekspresiju humanog RG1 u domaćinu i zatim ponovno nadoknađivanje ekspresovanog polipeptida.

U saglasnosti sa drugim predmetom pronalaska ovde su obezbeđeni proizvodi, kompozicije, postupci i metodi,interalia,koje iskorištavaju gore pomenute polipeptide i polinukleotide za između ostalog, istraživanja u biološke, kliničke i terapeutske svrhe.

U saglasnosti sa određenim pretpostavljenim realizacijama ovog i drugih aspekata pronalaska obezbeđene su probe koje hibridizuje dorglsekvenci.

Dalji predmet pronalaska je da obezbedi antitela koja su visoko selektivna za RG1 polipeptide, ili njihove fragmente, i koja mogu da se koriste u postupcima za dijagnozu i/ili otkrivanje ekspresije RG1, koje može biti povezano sa tumorom prostate. U skladu sa određenim pretpostavljenim realizacijama ovog aspekta pronalaska, antitela su obeležena tako da proizvode signal koji se može pratiti. Naročito poželjno bi bilo radio-označeno antitelo, enzim, boja ili fluorescer.

U daljem aspektu pronalaska obezbeđena su antitela koja će biti konjugovana sa terapeutskim agensom za davanje ćelijamain vitro,ćelijamaex vivoi ćeljamain vivo,ili u višećelijski organizam. Naročito pretpostavljena u ovom pogledu su terapeutski agensi koji su citotoksični. Određene pretpostavljene realizacije u ovom pogledu su davanje ovakvih konjugovanih antitela humanom pacijentu radi tretmana bolesnog stanja karakterisanog RG1 aktivnošću ili ekspresijom kao što je tumor prostate.

U daljem aspektu pronalaska obezbeđuju se peptidi i anti-idiotipična antitela koja se mogu koristiti za stimulaciju imunog odgovora.

U daljem aspektu pronalaska je dobijanje ribozoma i polinukleotida koji su komplementarnire/1polinukleotidima (tzv. antisens polinukleotidi) za davanje u ćelijein vitro,u ćelijeex vivoi u ćelijein vivo,ili u višećelijske organizme. Naročito značajno u ovom slučaju je davanje antisens molekula humanom pacijentu za tretman bolesnog stanja, kao što je tumor prostate ili benigna prostatična hiperplazija, što je olakšano smanjenjem nivoa aktivnosti RG1.

Dgui predmeti, karakteristike, prednosti i aspekti ovog pronalaska postaće očigledni stručnjacima iz ove oblasti nauke iz opisa koji sledi. Potrebno je, međutim, razumeti da su naredni opis i specifični primeri, iako ukazuju na pretpostavljene realizacije pronalaska, dati samo u ilustrativno. Različite primene i modifikacije u okviru duha i obima priloženog pronalaska biće vrlo očigledni stručnjacima iz ove oblasti nauke tokom čitanja opisa koji sledi i čitanjem drugih delova ovog otkrića.

KRATAK OPIS SLIKA

SLIKA 1: Polinukleotidna sekvencarg1 (SEG ID NO: 1), koja kodira biološki i imunološki aktivnu formu RG1.

SLIKA 2: Dedukovana sekvenca amino kiselina RG1 (SEQ ID NO: 2), gde su F-spondin domeni jednostruko podvučeni a domeni trombospondina duplo podvučeni.

SLIKA 3: Poređenje sekvence aminokiselina RG1 sa sekvencom Mindina pacova. Sekvenca RG1 je na vrhu strane.

SLIKA 4: Polinukleotidi i dedukovane sekvence amino kiselina RG1.

SLIKA 5: Ekspresijarg1mRNK u humanim tkivima, po Taqman-u PCR analiza. RNK je iz humanih tkiva, i tumorskih i normalnih, izolovana standardnim tehnikama. Prajmeri i probe za detekciju ekspresijerg1mRNK dizajnirani su korišćenjem softvera Perkin Elmers Primer Express i sintetisani su Svntethc Genetics.Rg1mRNK otkrivena je u tkivima prostate kod čoveka. Mnogo niža ekspresijarg1mRNK može se detektovati i u ostalim tkivima, npr. u jetri.

SLIKA 6: Prečišćavanje prirodnog RG1 proteina izlučenog od strane LNCaP ćelija. VVestern blot analiza, pomoću antiseruma generisanog na sintetičkoj RG1 polipeptidnoj sekvenci (3C, SEQ ID NO: 10; videti primer 4), da bi se detektovao prirodni RG1 protein izlučen od strane LNCaP ćelija. Elutirane frakcije sa Q-Sefarozne hromatografije podloge kondicionirane sa koncentrovanim LNCaP ćelijama: (L) punjačka kolona, (F) protočna kolona, (12) odvojene frakcije preko salinitetnog gradijenta. Predpostav<l>jena molekulska težina RG1 je oko 36kD, međutim pokazalo se da bakterijski P.G1, BHK RG1 i RG1 protein iz LNCaP, svi migriraju na oko 45kD na PAGE-u (L, frakcije 6-9).

SLIKA 7: ImuRohiosiohemijsko bojenje RG1 u humanom tkivu prostate.

Tkivo prostate dobijeno je \ z Urološkog Odeljenja Medicinskog Fakulteta Stranford Univerziteta Bojenje je vršeno pomoću Vector ABC-AP kita (AK5002). Bojenje je vizualizovano sa Vector Red substratnim kitom (SK-5100) i ponovno bojeno sa Hematoksilinom. Rezultati pokazuju iako bojenje peri-luminalne membrane u žlezdi.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Definicije

Kao stoje korišćeno u specifikaciji, primerima i pridodatim tvrdnjama., ukoliko nije specificirano suprotno, sledeći termini imaju prikazano značenje.

'RG1' se odnosi na polipeptid koji nosi sekvencu amino kiselina prikazanu na Slici 2 (SQL ID NO: 2); varijante, analoge, derivati i njihovi fragmenti, i fragmenti varijanata, analoga i derivata. Termini 'fragmenti', 'derivati' i 'analoge' kada se odnose na polipeptide na Slici 2 (SEQ ID NO: 2), odnose se na polipeptide koji zadržavaju u suštini iste biološke i/i!i imunološke aktivnosti kao i polipeptid sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2).

' r<gV>se odnosi na polinukleotide sa sekvencom prikazanom na Slici 1 (SEQ ID NO: 1) i polinukleotide koji kodiraju polipeptide sa sekvencom prikazanom na Slici 2 (SEQ ID NO: 2); i na polinukleotide koji kodiraju RG1 varijante, analoge, derivate i fragmente, i fragmente varijanti, analoga i derivata.Rg1se takođe odnosi na takve polinukleotide sastavljene od RNK kao i polinukleotide koji su komplementarni polinukleotidima koji kodiraju polipeptidnu sekvencu prikazanu na Slici 2 (SEQ ID NO: 2).

'Polinukleotidfj)' u glavnom se odnosi na bilo koji poliribonukieotid ili polideoksiribonukleotid, koji može biti nemodifikovana RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK. Tako, na primer, polinukleotidi kako se sada koristi termin, odnosi se na, između ostalog, jedno- i dvo-lančanu DNK, DNK koja predstavlja mešavinu jednolančanih i dvolančanih regiona, jedno- i dvo-lančanu RNK, i RNK koja predstavlja mešavinu jeno- i dvo-lančanih regiona, hibridne molekule DNK i RNK koji mogu biti jedno-lančani ili, što je više tipično, dvo-lančani ili mešavinu jedno- i dvo-lančanih regiona. Nadalje, termin polinukleotidi koji se ovde koristi, odnosi se na trolančane regione RNK ili DNK ili RNK i DNK spakovane zajedno. Lanci u ovim regionima mogu biti iz istog ili različitih molekula. Regioni mogu obuhvatati ceo jedan ili više molekula, ili sto je tipičnlje obuhvataju samo region nekih molekula. Jedan od molekula tri-heličnog regiona često je oligonukleotid.

Ovde korišćen, termin 'poiinukleotid' uključuje predhodno opisane DNK ili RNK koji sadrže jednu ili više modifikovanih baza Tako, DNK ili RNK sa skeletom koji je modifikovan zbog stabilnosti ili zbog drugih razloga su 'polinukleotidi' u značenju ovde namenjenom. Štaviše, DNK ili RNK koji sadrže netipične baze, kao što je inozin, ili modifikovane baze, kao što su tritijum-obeležene baze, da navedemo samo dva primera, su polinukleotidi u značenju ovde utvrđenom.

Kvalifikovane osobe razumeće mnoštvo modifikacija koje su napravljene sa DNK i RNK i koje imaju mnoge korisne namene njima poznate. Termin 'polinukleotidi' kako se ovde koriste uključuju takev hemijski. enzimski ili metabiolčki modifikovane forme polinukleotida, ako i hemijske forme DNK i RNK karakteristične za viruse i ćelije, uključujući tu i proste i kompleksne ćelije, izmedju ostalog.

'Polipeptidi', kako se ovde koristi termin, uključuju sve polipeptide nadalje opisane.

Osnovne struktura polipeptida dobro je poznata i opisana je u mnogim udžbenicima i drugim publikacijama. U ovom kontekstu, termin se odnosi na bilo koji peptid ili protein sastavljen od dve i'i više amino kiselina sastavljenih linearno peptidnim vezama. Kako se koristi ovde, termin se odnosi i na kratke lance, koji se nazivaju oligopeptio'i ili oligomeri, na primer, i na duge lance, koji se uglavnom nazivaju proteini, kojih ima mnogo tipova.

Razumljivo je da polipeptidi često sadrže i druge amino kiseline osim onih 20 amino kiselina koje se navode «:.20 20 koje se prirodno pojavljuju, i da mnoge amino kiseline, uključujući terminalne, mogu biti modifikovane u date polipeptide, ili u prirodnom procesu kao što je glikolizacija i drugim post-translacionim modifikacijama, ili hemijskim tehnikama modifikacije dobro poznatim u struci. Čak i obične modifikacije koje se prirodno pojavljuju kod polipeptida su tako mnogobrojne da bi se ovde nabrajale, ali one su dobro opisane u osnovnom tekstu i dosta detaljnije u monografijama, kao i u obimnoj literaturi, i dobro su poznate u struci. Među poznatim modifikacijama koje se mogu pojaviti kod polipeptida u ovom pronalasku su, da kažemo samo neke su, acetilacija, acilacija, ADP-ribozilacija, amidacija, kovalentno spajanje flavina, kovalentno spajanje hemo moiata, kovalentno spajanje polinukleotida ili polinukleotidnih derivata, kovalentno spajanje masti i derivata masti, kovalentni spoj fosfotidilinositola, ukrštanje, ciklizacija, formiranje disulfidnih veza, demetilacija, kormiranje kovalentnih veza, formiranje čistina, formiranje piroglutamata, formilacija, gama-karboksilacija, glikacija, glikolizacija, fromiranje GPI stege, hidroksilacija, jodacija, metilacija, miristoilacija, oksidacija, proteolitična obrada, fosforilacija, prenilacija, racemizacija, selenoilacija, sulfacija, dodavanje amino kiselina posredstvom transfer-RNK na proteine, ako što je arginilacija, i ubikvitinacija.

Ovakve modifikacije dobro su poznate u struci i detaljno su opisane u naučnoj literaturi. Nekoliko uobičajenih modifikacija, glikozilacija, dodavanje masti, sulfacija,

gama-karboksilacija ostataka glutamične kiseline, hidroksilacija i ADP-ribozilacija, na primer, opisano je u najosnovnijim tekstovima, kao što je, na primer, I. E. Creighton,Proteins- Structure and Molecular Properties,2<nd>Ed., W. H. Freeman and Companv. New York, 1993. O ovome se mogu naći mnogi radovi, kao što je, na primer, rad Wold, F., uPosttranslation Covalent Modification of Proteins,B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp 1-12, 1983; Seifer i sar.,Meth. Enzymol.182: 626-646, 1990 i Rattan i sar.,Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging,Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992.

Razumljivo je i dobro poznato, kao što je već rečeno, da polipeptidi nisu uvek potpuno linearni. Na primer, polipeptidi se mogu granati stoje rezultat ubikvitinacije, i mogu biti u obliku kruga, cirkularni, sa ili bez granjanja, što je uglavnom rezultat posttranslacionih tiešavanja, uključujući tu i prirodnu obradu i procese kojima je uzrok humana manipulacija, što su sve procesi koji nisu prirodni. Kružni, razgranati i razgranato kružni polipeptidi mogu se sintetisati ne-translacionim prirodnim procesima i takođe potpuno veštačkim metodama.

Promene se mogu pojaviti bilo gde u polipeptidu, uključujući skelet polipeptida, postrane lance amino kiselina i na amino ili karboksil kraju. U stvari, blokiranje amino ili karboksilne grupe u polipeptidu, ili oba kraja, kovalentnim modifikacijama, je uobičajeno u prirodi i sintetičkim polipeptidima i takve modifikacije mogu se pojaviti kad polipeptida ovog pronalaska takođe. Na primer, ostatak na amino kraju polipeptida napravljen kodE. coli,pre proteolitične obrade, skoro uvek će biti N-formilmetionin

Modifikacije koje se pojavljuju u polipeptidima često će biti u funkciji onoga kako su napravljeni. Kod polipeptida napravljenih eksprecijom gena koji je kloniran u domaćinu, na primer, pripoda i veličina modifikacije u velikoj meri će biti određena kapacitetom posttranslacionih modifikacija ćelije domaćina i modifikacionim signalima koji su prisutni u sekvenci amino kiselina polipeptida. Na primer, kao što je dobro poznato, glikozilacija se ne pojavljuje često u bakterijskim ćelijama kao sto jeE. coli.Shodno tome, kada je potrebna glikozilacija, polipeptid bi trebalo da se ekspresuje u glikozilatnom domaćinu, uglavnom ćeliji eukariota. Ćelije insekata često nose iste posttranslacione glikozilacije kao i ćelije sisara i, iz ovog razloga, razvijen je sistem ekspresije u ćelijama insekata da bi efikasno ekspresovao proteine sisara koji, između ostalih stvari, imaju prirodne uzorke glikozilacije. Slično razmatranje se primenjuje i na druge modifikacije.

Razumljivo je da isti tip modifikacija može biti prisutan u istom ili sličnom stupnju na nekoliko mesta u datom polipeptidu Takođe, dati polipeptid može imati mnogo tipova modifikacija.

Uglavnom, kako se ovde koristi, termin polipeptid obuhvata sve takve modifikacije, naročito one koje su prisutne u polipeptidima sintetisanim ekspresijom polinukleotida u ćeliji domaćina.

'Polinukleotidi kojikodirajupolipeptid' termin koji se koristi ovde obuhvata

polinukleotide koji imaju sekvencu za kodiranje polipeptida ovog pronalaska, naročito RG1 polipeptida sa sekvencom amino kiselina koja se vidi na Slici 2 (SEQ ID NO: 2) Termin obuhvata polinukleotide koji imaju jedan kontinualni ili nekontinualni region za kodiranje polipeptida (na primer, prekinut intronima) zajedno sa dopunskim

regionima.

'Biološka aktivnost' termin se odnosi na strukturne, regulatorne ili biohemijske funkcije prirodnog RG1 polipeptida.

'Imunološka aktivnost'odnosi se na sposobnost prirodnog, rekombinantnog ili veštačkog RG1, ili njegovog fragmenta, da indukuje specifične imune odgovore kod određenih životinja ili ćelija i da se veže za specifična antitela.

'Oligonukleotid(i)'se odnosi na relatinvo kratke polinukleotide. Često se termin odnosi na jedno-lančane deoksiribonukleotide ali se može odnositi i na jedno- ili dvo-lančane ribonukleotide, RNK:DNK hibride i dvo-lančane DNK, izmedju ostalog. Oligonukleotidi, kao što je jedno-lančana DNK proba oligonukleotida, često su sintetisani hemijskim metodama, kao što su one primenjene u mašinama za automatsko sintetisanje oligonukleotida. Međutim, oligonukleotidi se mogu napraviti različitim drugim metodama, uključujućiin vitrotehnike pomoću rekombinantne DNK i preko ekspresije DNK u ćelijama ili organizmima. 'Oligonukleotidi' iii 'oligomeri' ili polinukleotidni 'fragmenti', 'delovi', ili 'segmenti' odnose se na polinukieotidne sekvence od bar najmanje 10 nukleotida i najviše od oko 60 nukleotida, najbolje oko 15 do 30 nukleotida, a još bolje 20-25 nukleotida.

'PrirodniRGTse odnosi na RG1 koji je proizveden u ljudskim ćelijama koje nisu genetički manipulisane, i specifično zamišljene različite forme RG'i koje se pojavljuju ;z posttranslacionih modifikacija polipeptida koje uključuju, ali nisu limitirane na acetilaciju, karboksilaciiu, glikozilaciju, fosforilaciju, lipidaciju, acilaciju i raspadanje.

'Varijant(e)' polinukleotida ili polipeptida, kao termin koji se ovde koristi, su polinukleotidi ili polipeptidi koji se razlikuju od reference polinukleotida ili poiipeptida. Varijante u ovom smislu opisane su nadalje i na drugim mestima u priloženom tekstu veoma detaljno. (1) Polinukleotid koji se razlikuje u polinukleotidnoj sekvenci od drugog, referentnog polinukleotida. Uglavnom, razlike su limitirane tako da su polinukieotidne eskvence referentnog i varijante međusobno jako slične i, u mnogim đelovima, identične.

Kao što je opisano nadalje, promene u sekvenci polinukleotida varijante mogu biti mirujuće. To znači da one ne moraju promeniti amino kiseline koje su kodirane polinukleotidima. Gde su promene limitirane na mirujuće promene ovog tipa varijant će kodirati polipeptid sa istom sekvencom amino kiselina koju ima i referenca. Takođe kako je dalje opisano, promene u sekvenci polinukleotida varijante mogu promeniti sekvencu amino kiselina polipeptida koji kodira referentni polinukleotid. Ovakve polinukieotidne promene mogu rezultirati u substituciji, dodavanju, brisanju, fuziji i skraćenju amino kiselina u polipeptidu kodiranom sekvencom reference, kao što je dalje rečeno. (2) Polipeptid koji se razlikuje u sekvenci amino kisleina od drugog, referentnog polipeptida. Uglavnom, razlike su limitirane tako da su sekvence reference i varijante većinom slične i, u mnogim delovima identične. Varijanta i referentni polipeptid mogu se razlikovati u sekvenci amino kiselina u jednoj ili više substitucija. dodavanja, de!ecije, fuzije i skraćivanja, koji mogu biti prisutni u bilo kojoj kombinaciji. Rekombinantna varijanta koja kodira ove iste ili slične polipeptide može se sintetisati ili izdvojiti pomoću upotrebe 'redundancije' u genetskom kodu. Substitucija različitih kodona, kao što je mirujuća promena koja pravi različita mesta restrikcije, može se upotrebiii da optimizira kloniranje u plazmid ili virusni vektor ili ekspresiju u pojedinim prokariotskim ili eukariotskim sistemima. Takođe se mogu upotrebiti mutacije da bi se modifikovale osobine polipeptida, promenili afiniteti ligandnih veza, interiančani afiniteti ili degradacija polipeptida ili nivo obrta.

'Alelna varijanta' se odnosi na odstupanja odrg1polinukleotida. Aleli koji su rezultat mutacije, npr., promene u sekvenci polinukleotida, i uglavnom produkuju izmenjene RNK ili polipeptide čija struktura ili funkcija može ili ne mora biti izmenjena. Bilo koji gen može biti bez, sa jednom ili više alelih formi. Uobičajene mutacione promene koje dovode do stvaranja alela se uglavnom svode na delecije, adicije ili substitucije nukleotida. Svaka od ovih promena može se pojaviti sama, ili u kombinaciji sa drugim, ili jednom i više puta u datoj sekvenci.

'Derivat' se odnosi na polinukleotide ili polipeptidne derivate iz prirodnihrg1ili RG1, dobijene hemijskim modifikacijama kao što su ubikvitinacija, obeležavanje (npr., sa radionuklidima, različitim enzimskim modifikacijama), pegilacija (derivatizacija sa polietilen glikolom) ili insercijom ili substitucijom amino kiselina kao što su ornitin (ili substitucijom nukleotida koji kodiraju takve amino kiseline), koji se normalno ne pojavljuju u humanim proteinima.

'Delecija'je defmisana kao promena u sekvenci polinukleotida ili amino kiselina u kojoj nedostaje jedan ili više polinukleotida ili ostataka amino kiselina.

Mnsercija' ili 'dodavanje' je takva promena u sekvenci polinukleotida ili amino kiselina koja rezultira u dodavanju jednog ili više poilnukleotida iii ostataka amino kiselina, u upoređenju sa prirodno nastalim polinukleotidima ili sekvencom amino kiselina.

'Substitucija' je rezultat zamena jednog ili više polinukleotida ili amino kiselina drugim različitim polinukleotidima ili amino kiselinama.

Substitucije amino kiselina su rezultat zamene jedne amino kiseline sa drugom koja ima sličnu strukturu i/ili hemijske osobine, kao što je zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom ili treonina serinom, odn., kanzervativna zamena amino kiselina. Insercije ili delecije su obično u obimu od 1 do 5 amino kiselina. Dozvoljene varijacije mogu se eksperimentalno odrediti pravljenjem sistematskih insercija, delecija, ili substitucija amino kiselina u polipeptidima korišćenjem tehnike rekombinantne DNK i analiziranjem aktivnosti rezultirajućih rekombinantnih varijanti.

'Fragment' je polipeptid sa sekvencom amino kiselina koja je u celini ista kao deo, ne kao cela sekvenca amino kiseline goprepomenutog RG1 polipeptida i njegoih varijanti ili derivata.

Polipeptidni 'fragment', 'deo' ili 'segment' je niz aminokiselinskih ostataka od najmanje oko 5 amino kiselina, češće najmanje oko 7, obično najmanje oko 9 do 23, i u različitim realizacijama, od najmanje oko 17 ili više amino kiselina.

Rekombinantili'Rekombinantni DNK molekultermin se odnosi na polinukleotidnu sekvencu koja se ne pojavljuje u prirodi, ili je proizvod veštačke kombinacije dva inače odvojena segmenta sekvence. Pod terminom 'rekombinantno proizveden' podrazumeva se veštačka kombinacija često dobijena načinom hemijske sinteze, ili veštačkom manipulacijom izolovanih segmenata polinukleotida, n.pr., tehnikama genetskog inženjeringa. Ovakva Manipulacija obično se radi da bi se zamenio kodon sa redundantnim kođonom koji kodira istu ili konzervativnu amino kiselinu, obično uvođenjem ili odstranjenjem sekvence položaja prepoznavanja. Alternativno, to se radi da bi se spojili polinukleotidni segmenti sa željenim funkcijama da bi se generisao jedinični genetički entitetkoja sadrži željenu kombinaciju funkcija koje se ne mogu naći u prirodnim formama. Strane prepoznavanja restrikcionih enzima, regulacione sekvence i kontrolne sekvence ili druge korisne osobine mogu se uključiti u dizajn. 'Rekombinant' se takođe može odnositi na polinukleotide koji kodiraju polipeptide i napravljeni su korišćenjem DNK rekombinantnih tehnika.

'Izolovani' znači promenjeni iz svog prirodnog stanja 'rukom čoveka'; odn., da su, ako se pojave u prirodi, promenjeni ili izmešteni iz svoje prirodne okoline, ili oboje. Na primer, polinukleotid koji se pojavljuje u prirodi ili polipeptid prirodno prisutan u živim životinjama u svom prirodnom stanju nije 'izolovan', ali isti polinukleotid ili polipeptid izdvojen iz koegzistirajućih materijala njegovog prirodnog stanja je 'izolovan', po terminu koji se ovde koristi. Na primer, u odnosu na polinukleotide, termin znači da su izdvojeni iz hromozoma i ćelije u kojoj se prirodno pojavljuju.

Polinukleotidi i polipeptidi mogu se pojavljivati u raznim sastavima, kao što su podloge, rastvori za uvođenje polinukleotida i polipeptida, na primer, u ćelije, sastavu ili rastvorima hemijskih ili enzimskih reakcija, koji se, na primer, ne pojavljuju u prirodi, i, takđe izolovani polinuklotidi ili polipeptidi u okviru značenja ovog termina kao što je upotrebljen ovde.

'Substancijaino čisti'i'substancijalno homogeni'se koriste promenljivo i opisuju RG1 polipeptid, ili njegove fragmente, iii polinukieotidne segmente koji kodiraju isto, gde su takvi polipeptidi ili polinukleotidi odvojeni od komponenata koji ih prirodno okružuju. RG1 polipeptid ili njegov fragment, ili segment DNK koji kodiraju isto u osnovi nemaju prirodno vezane komponente kada se izdvoje iz prirodnih kontaminanti koje ih prate u prirodnom stanju. Tako, polipeptid koji je hemijski sintetisan ili sintetisan u ćelijskom sistemu različitom od ćelije iz koje prirodno potiče biće u osnovi bez prirodno pratećih komponenti. Slično tome, polinukleotidi koji su hemijski sintetisani ili sintetisan'! u ćelijskom sistemu koji je različit od ćelije u kojoj prirodno nastaje biće u osnovi bez svojih prirodno-pratećih komponenata.

'Homologe', kada se koristi za opisivanje polinukleotida, ukazuje na to da su dva polinukleotida ili njihove određene sekvence, kada su optimalno centrirana i komparirana, identična, sa podesnim insercijama ili delecijama nukleotida, kod najmanje 70% nukleotida, obično od oko 75% do 99%, i sto je bolje od najmanje 98 do 99% nukleotida.

'Sličnost', kada se upotrebljava za opisivanje polipeptida, je utvrđena upoređivanjem sekvence amino kiselina i konzerviranih amino kiselinskih substituenata jednog polipeptida sa sekvencom drugog

'Polimerazna lančana reakcija'ili 'PCR' odnosi se na proceduru gde se specifični delovi DNK umnožavaju kao što je opisano u U.S. Pat. No. 4,683,195, izdatom 28 Jula 1987. Uglavnom, potrebno je da budu dostupne informacije sekvenci sa krajeva i dalje, fragmenta traženog polipeptida. tako da se mogu dizajnirati oligonukleotidni prajmeri; ovi prajmeri ukazivaćejedan na drugi, i biće identični ili slični u sekvenci suprotnim trakama osnove koja treba da bude umnožena. 5' treminalni nukleotidi dva prajmera podudaraće se sa krajevima umnoženog materijala. PCR se može koristiti za umnožavanje specifične DNK sekvence iz cele genomne DNK, cDNK transkribovane sa celokupne ćelijske RNK, plazmidne sekvence, itd. (Videti

uglavnom Mullins i sar.,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.,51: 263, 1987; Erlich, ed., PCRTechnology,Stockton Press, NY, 1989).

'Stringentnost'se obično pojavljuje u opsegu od oko Tm(temperatura topljenja) -5°C (5 °C ispod Trn probe) do oko 20°C do 25°C ispod Trn. Kao što će biti razumljivo stručnjaku iz ove oblasti, stringentna hibridizacija može se koristiti za identifikaciju ili otkrivanje identičnih polinukleotidnih sekvenci ili za identifikaciju ili otkrivanje sličnih ili srodnih polinukleotidnih sekvenci. Kako je ovde korišćen, termin 'stringentni uslovi' označava hibridizaciju koja će se dogoditi samo ako postoji sličnost između sekvenci od najmanje 95%, a još bolje najmanje 97%.

'Hibridizacija' kako se ovde koristi, obuhvataće 'bilo koji proces u kom se polinukleotidni lanac spaja sa komplementarnim lancem preko sparivanja baznih parova' (Coombs,J., Dictionary of Bioiechnology,Stockton Press, New York, N.Y., 1994).

'Terapeutski efektivnadoza' odnosi se na onu količinu polipeptida ili njegovih antitela, antagonista, ili inhibitora, uključujući tu i antisens molekule i ribozome, koji popravljaju simptome ili uslove bolestnog stanja. Terapeutska efikasnost ili toksičnost ovakvih jedinjenja može se odrediti standarnim farmaceutskim procedurama u kulturi ćelija ili sa eksperimentalnim životinjama, n.pr., ED50(doza koja je terapeutski efektivna kod 50% populacije) i LD50(doza letalna za 50% populacije). Odnos doza terapeutskog i toksičnog efekta je terapeutski indeks, i on može da se iskaže kao odnos, ED50/LD50.

Tretiranje' ili 'tretman' kako se ovde koristi je tretman bolesnog stanja kod ljudi, gde je bolesno stanje povezano sa rastom tumora prostate i uključuje bolesno stanje u kome je pacijentu potreban povišeni nivo RG1.

Detaljan opis pronalaska

Priloženi pronalazak se odnosi na novi RG1 polipeptid,rg\polinukleotide, i antitela upravljena prema RG1 polipeptida, između ostalog, kao što je u daljem tekstu detaljno opisano. Naročito se pronalazak odnosi na naove RG1 polipeptide i polinukleotide koji kodiraju ove RG1 polipeptide, i specijalno se odnosi na RG1 sa sekvencom amino kiselina koja je prikazana na Slici 2 (SEQ ID NO: 2) irg\sa polinukleotidnom sekvencom prikazanom na Slici 1 (SEQ ID NO: 1). Ovaj pronalazak takođe obuhvata RG1 varijante. Naročito poželjna RG1 varijanta je ona sa najmanje 70% sličnosti (poželjno najmanje 70% identičnosti) sa polipeptidnom sekvencom prikazanom na Slici 2 (SEQ ID NO: 2) i što je još poželjnije sa najmanje 90% sličnosti (još poželjnije najmanje 90% identičnosti) sa polipeptidom prikazanom na Slici 2 (SEQ ID NO: 2) i što je još poželjnije sa najmanje 95% sličnosti (i dalje najpoželjnije najmanje 95%identičnosti) sa polipeptidnom sekvencom prikazanom na Slici 2 (SEQ ID NO: 2) i takođe uključuje delove takvih polipeptida sa takvim delovima polipeptida koji uglavnom sadrže najmanje 30 amino kiselina i što je još poželjnije najmanje 50 amino kiselina.

Kodirajuća sekvenca za predviđeni RG1 počinje 296 baznih parova dalje od 5' kraja nukleotidne sekvence prikazane na Slici 1 (SEQ ID NO: 1). RG1 ima tri strukturna domena karakteristična za Mindin/F-spondin superfamiliju proteina ekstracelularnog matriksa: dva spondin domena (FS1 i FS2), koje obuhvataju amino kiseline 31 do 103 i 138 do 221, respektivno, i trombospondin domen, koji obuhvata amino kiseline 278 do 330.

Priloženi pronalazak delimično se bazira na strukturnoj homologiji prikazanoj na Slici 3 između RG1 i Mindina pacova, koji je drugi član familije proteina ekstracelularnog matriksa. Aminokiselinska sekvenca RG1 je skoro 89,7% slična Mindinu pacova.

Priloženi pronalazak takođe se bazira delimično i na ekspresiji profila RG1, što je prikazano njegovom ekspresijom u bibliotekama tkiva prostate i ponovnoj ekspresiji u bibliotekama tumora prostate. Profil tkiva se vidi u analizi ekspresije mRNK u uzorcima tkiva normalnog i tumorskog tkiva na PCR baziranoj Taqman analizi. Ovaj metod analize pokazuje da je mRNK koja kodira RG1 ponovno ekspresovana u tkivu prostate u odnosu kada se uporedi sa drugim tkivima.

Polinukleotidi

U skladu sa jednim aspektom ovog pronalaska, obezbađeni su izolovani polinukleotidi koji kodiraju RG1 polipeptid sa amino kiselinskom sekvencom izvedenom sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2).

Koristeći informaciju prikazanu ovde, kao što je polinukleotidna sekvenca prikazana na Šlica 1 (SEQ ID NO: 1), polinukleotidi ovog pronalaska koji kodiraju RG1 polipeptid mogu se dobiti korisćenjem standardnih procedura kloninga i skri<p>^nga, kao što su one za kloniranje cDNK korišćenjem mRNK iz ćelija humanog tkiva kao početnog materijala. Objašnjenje pronalaska, polinukleotidna sekvenca sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1) pronađena je u cDNK klonovima dobijenim iz tkiva prostate čoveka.Rg1kao gen koji ima ekspresiju u prostati je identifikovan pomoćulncyteLifeSeg baze podataka. NukleotiDNK sekvenca identifikovana je pretraživanjem baze podataka, korišćenjem 'Protein Function' programa dobijenog od Incvte'a u svrhu pretraživnaja baze podataka. Nukleotidna sekvenca nađena je u kategoriji molekula ćelijske adhezije u dobijenoj bazi podataka i opisana je kao homolog f-spondina. Elektronska Northern analiza rasporedarg1polinukleotidnih sekvenci u setu biblioteka u bazi podataka otkriva da serg1ekspresuje mnogo češće u bibliotekama prostate a rede u bibloitekama različitih drugih tkiva, ukijučujući one iz normalnih I tumorskih tkiva.

Praćenjem spajanja setarg1klonova u bazi podataka u susedne polinukieotidne sekvence, i izdavanjem susedne sekvence, identifikovan je cela dužina kodirajuće sekvence u predviđenom montiranom polinukleotidu. Ova sekvenca kodira protein koji je homolog mindinu pacova.

incit klonovi 1640796, 1712252, i 1880265 dobijeni suiz lncyteu eksperimentalnom radu i utvrđeno je da klon 3360733 sadrši najviše 5' nukleotidnih sekvenci. Ovaj kod je do kraja sekvencioniran i sadrži celu sekvencu potrebnu za kodiranje predviđenog RG1 proteina. Ova sekvenca se vidi na Siici 1 (SEQ ID NO: 1).

Polinukleotidi u ovom pronalasku mogu biti u formi RNK, kao što je mRNK, ili u formi DNK, uključujući, na primer, cDNK i genomne DNK dobijene kloniranjem ili proizvedene tehnikama hemijske sinteze ili kombinacijom ovih, ili metodama ovde opisanim. DNK može biti jednolančana ili dvolančana. Jednolančana DNK moše da bude lanac za kodiranje, takođe poznat kao prepoznatljiv lanac, ili može biti nekodirajući lanac, takođe poznat kao neprepoznatljiv lanac.

Sekvenca koja kodira polipeptid može biti identična sekvenci polinukleotida pokazanog na Slici 1 (SEQ ID NO: 1). To takođe može biti polinukleotid sa različitom sekvencom, koja, kao rezultat suviška (degeneracije) genetičkog koda, kodira polipeptide sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2).

Polinukleotidi ovog pronalaska koji kodiraju polipeptid na Slici 2 (SEQ ID NO: 2) mogu obuhvatiti, ali ne mogu biti limitirani, na sekvencu za kodiranje samog polipeptida; kodirajuća sekvenca polipeptida, zajedno sa pridodatom, nekodirajućom sekvencom, uključujući na primer, ali ne limitirana, na introne i nekodirajuće 5 i 3 sekvence, kao što su transkribovane, ne-translatirane sekvence koje imaju ulogu u transkripciji, one koje procesuju mRNK (npr., signali za spletanje i poliadenilaciju) ili pridodate sekvence za kodiranje koje kodiraju dodatne amino kiseline, kao takvi omogućavaju još neke funkcije.

Tako, na primer, polipeptidi mogu da se fuzionišu u marker sekvence, kao što su peptidi, koji pojednostavljuju prečišćavanje fuzioniranoh polipeptida. Kod pojedinih preferiranih otelovljenja ovog aspekta pronalaska, marker sekvenca je heksa-histidin peptid, kao što je dodatak kod pTrcHisB vektora (Invitrogen, Carlsbad, CA) između ostalih, od kojih su mnogi komercijalno raspoloživi. Kao što je opisano kod Gentz i sar., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824, 1989), na primer, heksa-histidin omogućava olakšano prečišćavanje u fuziji proteina.

Polinukleotidi mogu da kodiraju polipeptid koji je polipeptid sa dodatim amino ili karboksil-terminalnim amino kiselinama, ili amino kiselinsku unutrašnjost polipeptida ( kada aktivna forma ima više od jednog polipeptidnog lanca, na primer). Ovakva sekvenca može imati ulogu u pretvaranju polipeptida iz prekursora do prirodne forme, može olakšavati kretanje polipeptida, može skraćivati ili produžavati polu-život polipeptida ili može olakšavati manipulaciju polipeptidima pri ogledima ili produkciji, između ostalog. Kao što je uin situslučaju, dodate aminokiseline mogu se procesirati dalje od polipeptida proteolitičkim enzimima.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na varijante predhodno opisanih polinukleotida koji kodiraju fragmente, analoge i derivate polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom izvedenom sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2). Varijant polinukleotida može biti varijant koji se prirodno pojavljuje kao što je prirodni aleli varijant, ili može biti varijant za kojeg nije poznato da se pojavljuje u prirodi. Ovakvi varijanti koji se ne pojavljuju prirodno mogu se napraviti mutagenim tehnikama, uključujući one koje se primenjuju na nukleotide, ćelije ili organizme.

Među varijantima u ovom smislu su varijanti koji se razlikuju od već pomenutih polinukleotida po polinukleotidnim substitucijama, delecijama ili adicijama. Substitucije, delecije ili adicije mogu uključivati jedan ili više polinukleotida. Varijati se mogu menjati u kodirajuće ili nekodirajuće regio.ne ili u oboje. Promene u kodirajućim regionima mogu proizvesti konzervativne ili nekonzervativne substitucije, delecije ili adicije amino kiselina.

Među veoma važnim otelovljenjima pronalaska u ovom smislu su polinukleotidi koji kodiraju polipeptide sa amino kiselinskom sekvencom RG1 prikazanom na Slici 2 (SEQ ID NO: 2); varijante, analoge, derivati ili njihovi segmenti, i fragmeni varijanata, analoga i derivata.

Nadalje naročito značajni u ovom smislu su polinukleotidi koji kodiraju RG1 varijante, analoge, derivati i fragmenti, i varijanti, analoge i derivati fragmenata, koji imaju aminokiselinsku sekvencu RG1 polipeptide sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2) u kojoj se nekoliko, mali broj, 5 do 10, 1 do 5, 1 do 3, 2, 1 ili nijedan aminokiselinski ostatak substituiše, odstranjuje ili dodaje, u bilo kojoj kombinaciji. Naročito važne među ovim su neprimetne substitucije, adicije ili delecije, koje ne menjaju osobine i aktivnosti RG1 polipeptida. Takođe naročito važne u ovom smislu su i konzervativne substitucije. Najhitniji jako poželjni su polinukleotidi koji kodiraju polipeptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 2 (SEQ ID NO: 2) bez substitucija.

Sledeća poželjna otelovljenja ovog pronalaska su polinukleotidi koji su najmanje 70% identični polinukleotidima koji kodiraju RG1 polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom na Slici 2 (SEQ ID NO: 2), i polinukleotidi koji su komplementarni takvim poiinukleotidima. Alternativno, najpoželjniji su polinukleotidi koji sadrže region koji je najmanje S0% identičan polinukleotidu koji kodira RG1 polipeptid i polinukleotide komplementarne njima. U odnosu na ovo, polinukleotidi najmanje 90% identični istim su naročito poželjni, i među ovim naročito poželjnim nukleotidima, još su važniji oni sa najmanje 95% idnetičnosti. Štaviše, oni sa najmanje 97% su jako poželjni mađu onim sa najmanje 95%, I među njima, oni sa najmanje 98% i sa najmanje 99% su naročito jako poželjni, a najpoželjniji su oni sa najmanje 99% identičnosti.

Naročito poželjna otelovljenja sa obzirom na ovo, štaviše, su polinukleotidi koji kodiraju polipeptide koji zadržavaju u osnovi istu biološku aktivnost kao polipeptid kodiran polinukleotidnom sekvencom prikazanom na Slici 1 (SEQ ID NO: 1).

Priložen pronalazak se dalje odnosi na polinukleotide koji hibridiziraju sa ovim gore opisanim sekvencama. S obzirom na ovo, priloženi pronalazak se naročito odnosi na polinukleotide koji hibridiziraju pod strogo određenim uslovima sa ovde gore opisanim polinukeotidima.

U diskusiji pridodatoj ovde koja se odnosi na polinukieotidne probe pronalaska, na primer, polinukleotidi pronalaska kao što je već opisano, mogu se koristiti kao hibridizacione probe za cDNK i genomsku DNK da bi se izolovale cDNK pune dužine i genomski klonovi koji kodiraju RG1 i da bi se izolovala cDNK i genomski klonovi drugih gena koji imaju veliku sličnost u sekvenci sarg1genom. Ovakve probe će uglavnom biti sastavljene od najmanje 15 baza. Stoje bolje, ovakve probe će imati najmanje 30 baza a mogu imati najmanje 50 baza.

Na primer, kodirajući regionrg1gena može se izolovati pretraživanjem biblioteka upotrebom sintetičkih oligonukleotidnih proba koje su napravljene korišćenjem poznate DNK sekvence. Na primer, označen oligonukleotid sa sekvencom komplementranom onoj koju ima polinukleotid u priloženom pronalasku može se koristiti za pretraživanje biblioteke cDNK ili genomne DNK da bi se identifikovali klonovi koji hibridiziraju sa probama.

U celosti, polinukleotid priloženog pronalaska može da kodira polipeptid, polipeptid sa vodećom sekvencom (koji se može označiti kao prepolipeptid).

Biće primećeno da se pronalazak takođe odnosi na, između ostalog, polinukleotide koji kodiraju fragmente polipeptida, polinukleotide koji hibridiziraju sa polinukleotidima koji kodiraju fragmente polipeptida, naročito one koji hibridiziraju pod strogo kontrolisanim uslovima, i polinukleotide, kao što su PCR prajmeri, za amplifikaciju polinukleotida koji kodiraju fragmente polipeptida. U odnosu na ovo, poželjni polinukleotidi su oni koji odgovaraju fragmentima poželjnih polipeptida, kao sto se dalje opisuje.

Polipeptidi

Priloženi pronalazak dalje se odnosi na RG1 polipeptide koji imaju izvedenu sekvencu amino kiselina sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2).

Pronalazak se takođe odnosi na fragmente, analoge i derivate ovih polipeptida. Termini fragment, derivat i analog kada se odnose na polipeptide sa Slike 2 (SEQ ID

NO: 2) označavaju polipeptid koji u osnovi zadržava istu biološku aktivnost kao takav polipeptid.

Polipeptid priloženog pronalaska može biti rekombinantni polipeptid, prirodni polipeptid ili sintetički polipeptid. U određenim poželjom oličenju, to je rekombinantni polipeptid.

Fragment, derivat ili analog polipeptida sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2) može biti (i) onaj kod koga je jedan ili više aminokiselinskih ostataka zamenjeno sa konzerviranim ili nekonzerviranim aminokiselinskim ostatcima (poželjno sa konzerviranim aminokiselinskim ostatcima) i takvi substituisani aminokiselinski ostatci mogu ali ne moraju biti ti koji su kodirani genetičkim kodom, ili (ii) onaj kod koga jedna ili više aminokiselinskih ostataka uključuje substituentnu grupu ili (iii) onaj kod koga je polipeptid spojen sa drugom komponentom, kao što je ona za povećanje polu-života polipeptida (npr., polietiienglikci) ili (iv) onaj kod koga sa dodatne amino kiseline spajaju u polipeptide, kao što je vodeća ili sekretorna sekvenca ili sekvenca koja se koristi za prečišćavanje polipeptida. Smatra se da su ovakvi fragmenti, derivati i analoge u domašaju kvaiifikovanim osobama, nezavisno od prisutinh lekcija.

Među naročito željenim oličenjima pronalaska u odnosu na ovo su polipeptidi sa sekvencom aminokiselina RG1 prikazanij na Slici 2 (SEQ ID NO: 2), varijante, analoge, derivati i njegovi fragmenti, i varijante, analoge i derivati fragmenata.

Među poželjnijim varijantama su one koje se razlikuju od referance po konzervativnim amino kiselinskim substitucijama. Ovakve substitucije su one koje substituišu datu arnino kiselinu u polipeptidu drugom amino kiselinom sličnih karakteristika. Tipično viđene kao konzervativne substitucije su zamene, jedna drugom, među alifatičnim amino kiselinama ALA, Val, Leu i lle, interna zamena hidrokslinih ostataka Ser i Thr, promena kiselinskih ostataka Asp i Glu, substitucija amidnih ostataka Asn i Gin, promene baznih rezidua Lys i Arg i zamene među aromatskih ostataka Phe i Tyr.

Dalje naročito željene u ovom smislu su varijante, analoge, derivati i fragmenti, i varijante, analoge i derivati fragmenata, koji imaju sekvencu amino kiselina RGH1 polipeptida sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2) u kojoj je nekoliko, mali broj, 5 do 10, 1 do 5, 1 do 3, 2, 1 ili nijedan aminokiselinskih ostataka substituisano, izbrisano ili dodano, u bilo kojoj kombinaciji. Naročito poželjne između ovih su neprimetne substitucije, adicije ili delecije, koje ne menjaju osobine i aktivnost RG1 polipeptida. Takođe naročito su poželjne u ovom smislu konzervativne substitucije. Najpoželjiji su polipeptidi sa aminokiselinskom sekvencom na Slici 2 (SEQ ID NO : 2) bez substitucija.

Polipeptidi i polinukleotidi priloženog pronalaska se dobijaju u izolovanoj formi, i prečišćeni su do homogenosti.

Polipeptidi priloženog pronalaska takođe uključuju polipeptide sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2) kao i polipeptide koji su slični najmanje 70% (poželjno najmanje 70%) polipeptidu na Slici 2 (SEQ ID NO: 2} i sto je još bolje imaju najmanje 90% sličnosti (još bolje najmanje 90% sličnosti) sa polipeptidom sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2) a najbolje najmanje 95% sličnosti (najmanje bar 95% identičnosti) sa polipeptidom na Slici 2 (SEQ ID NO: 2) i takođe uključuju delove takvih polipeptida sa takvim delovima polipeptida koji uglavnom imaju najmanje 30 amino kiselina i bolje najmanje 50 amino kiselina.

Kao što je poznato u struci 'sličnost' između dva polipeptida je određena upoređivanjem sekvence amino kiselina i njihovih konzerviranih amino kiselinskih substituenata jednog polipeptida sa sekvencom drugog.

Fragmenti ili delovi polipeptida priloženog pronalaska mogu se upotrebiti za proizvodnju odgovarajućih celih polipeptida prilikom sinteze peptida; dakle fragmenti mogu biti upotrebljeni kao medijatori za proizvodnju celih polipeptida.

Fragmenti

Takođe među željenim oličenjima ovog aspekta priloženog pronalaska su polipeptidi koji sadrže fragmente RG1, naročito fragmente RG1 sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2), i fragmente varijanti i derivata RG1 sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2).

0 ovom slučaju fragment je polipeptid sa sekvencom amino kiselina koja je u celosti ista kao deo ali ne cela amino kiselinska sekvenca već pomenutog RG1 polipeptida i njegovih varijanti i derivata.

Takav fragment može biti 'slobodan', odn., ne deo fuzije sa drugim amino kiselinama ili polipeptidima, ili mogu biti obuhvaćeni u okviru većeg polipeptida u kom oni formiraju deo ili region. Kada su u sastavu većeg polipeptida, ovi fragmenti mogu biti obuhvaćeni jednim većim polipeptidom. Na primer, određeno poželjna oličenja odnose se na fragment RG1 polipeptida priloženog pronalaska koji je u sastavu prekursora polipeptida dizajniranog za ekspresiju u domaćinu i sa heterologim pre- i propoiipeptidnim regionlma spojenim sa amino krajem RG1 fragmenta i pridodatom regionu spojenom sa karboksilnim krajem fragmenta. Tako, fragmenti u jednom aspektu ovde namenjenog značenja, odnose se na deo ili delove fuzije polipeptida ili fuziju proteina dobijenih iz RG1.

Kao reprezentativni primeri poiipeptidnih fragmenata pronalaska, ovde se pominju oni koji imaju od oko 25 do oko 331 amino kiselina.

U ovom kontekstu 'oko' uključuje naročito navođen opseg i opsege veće ili manje za nekoliko, mali broj, 5, 4, 3, 2 ili 1 amino kiselina na bilo kom kraju ili na oba kraja. Na primer, oko 331 amino kiselina u ovom kontekstu znači polipeptidni fragment od 25 plus ili minus nekoliko, mali broj, 5, 4, 3, 2 ili 1 amino kiselina do 331 plus ili minus nekoliko, mali broj, 5, 4, 3, 2 ili 1 amino kiselinskih ostatka, odn., obim širok od 25 minus nekoliko amino kiselina do 331 plus nekoliko amino kiselina ili uzak od 25 plus nekoliko amino kiselina do 331 minus nekoliko amino kiselina.

Veoma poželjni u ovom slučaju su pomenuti obimi plus minus ne više od 5 amino kiselina u jednom ili oba kraja. Naročito važni su navedeni obimi plus ili minus ne više od 3 amino kiseline na jednom ili oba kraja. Naročito jako značajni su obimi plus ili minus 1 amino kiselina najednom ili oba kraja ili obimi bez adicija ili delecija. Najpoželjniji od svih u ovom slučaju su fragmenti od oko 25 do 331 amino kiselina.

Među naročito poželjnim fragmentima pronalaska su skraćeni mutanti RG1. Skraćeni mutanti RG1 uključuju varijante ili derivate sekvence sa Slike 2 (SEQ ID NO: 2), sa izuzetkom delecije neprekidnih serija ostataka (to jest, kontinuiranog regiona, dela porcije) koji uključuju amino kraj sekvence prikazane na Slici 2 (SEQ ID NO: 2), ili kontinualnu seriju ostataka koji uključuju karboksi kraj ili, kao kod duplo skraćenih mutanata, deleciju dvaju kontinualnih serija ostataka, od kojih jedna ima amino kraj a druga karboksi kraj. Fragmenti sa veličinom obima utvrđenom gore takođe su poželjna oličenja skraćenih fragmenata, koji su naročito poželjni između svih ostalih.

Naročito značajni u ovom aspektu pronalaska su fragmenti okarakterisani biološkim i/ili imunološkim svojstvima RG1. Ovi fragmenti obuhvataju one koji sadrže predskazane strukturalne oblasti RG1, koji obuhvataju najmanje amino kiseline 31 do 103,138 do 221 i 278 do 330 ili one fragmente koji se koriste za generisanje antitela, kao što su oni opisani u Primeru 4.

Određeni poželjni regioni u ovom smislu određeni su u Slici 2 (SEQ ID NO: 2), i uključuju, ali nisu limitirani na, regione već pomenutih tipova identifikovane analizom amino kiselinske sekvence određene na Slici 2 (SEQ ID NO: 2).

Među veoma važnim fragmentima u ovom smislu su oni koji sadrže regione RG1 koji kombinuju nekoliko strukturnih odlika, kao što su odlike određene u prethodnom tekstu. U odnosu na to, oblasti dva spondina i jednog trombospondina, koje obuhvataju Mindin/spondin superfamiliju proteina ekstracelularnog matriksa, naročito su poželjni regioni. Ovakvi regioni mogu biti u sastavu većih polipeptida ili mogu sami po sebi biti poželjni fragmenti ovog pronalaska, kao što je diskutovano ranije. Može se proceniti da termin 'oko' kako se koristi u ovom paragrafu ima značenje koje je određeno u predhodnom tekstu kada se tiče fragmenata u celosti.

Dalje požeiji regioni su oni koji posreduju u aktivnosti RG1. U odnosu na ovo su jako značajni fragmenti koji imaju hemijsku, bioišku ili druge aktivnosti RG1, uključujući one sa sličnom aktivnošću ili pojačanom aktivnošću, ili sa smanjenjem nepoželjne aktivnosti. Jako poželjni u odnosu na ovo su fragmenti koji sadrže regione koji su homologi u sekvenci, ili po mestu, ili i po sekvenci i u poziciji aktivnim regionima polipeptida na koji se odnose, kao što su drugi proteini u Mindin familiji, što uključuje RG1.

Vektori, ćelije domaćina i sistem ekspresije

Priloženi pronalazak se takođe odnosi na vektore koji uključuju polinukleotide ovog pronalaska, ćelije domaćinakoje su genetički promenjene sa vektorima pronalaska i proizvodnjom polipeptida u pronalasku pomoću rekombinantnih tehnika. Ovakve tehnike opisane su u Sambrook i sar.,Molecular Ctoning, A Laborator/Manual,Cold Spring Harbor Press, Plainvievv, N.Y., 1989 i Ausubel, F.M. i sar.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, New York, N.Y , 1989.

Ćelije domaćina mogu se genetički izmeniti da bi ugradile polinukleotide i ekspresovale polipeptide priloženog pronalaska. Na primer, polinukleotidi se mogu uvesti u ćelije domaćina korišćenjem dobro poznatih tehnika inficiranja, transdukcije, transfekcije, transvekcije i transformacije. Polinukleotidi se mogu uvesti sami ili sa drugim polinukleotidima. Ovi drugi polinukleotidi mogu se uvesti nezavisno, ili zajedno sa polinukleotidima pronalaska.

Tako, na primer, polinukleotidi pronalaska mogu se uneti u ćelije domaćina sa drugim, odvojenim, polinukleotidima koji kodiraju selektivni marker, korišćenjem standardnih tehnika za prenošenje i selekcijom u, na primer, ćelijama sisara. U ovom slučaju, polinukleotidi će uglavnom biti stabilno inkorporirani u genom ćelija domaćina.

Alternativno, polinukleotidi mogu biti zajedno sa vektorom koji ima selektivni marker za propagaciju u domaćinu. Konstrukt vektora može se uvesti u ćelije domaćina pomoću već pomenutih tehnika. Uglavnom, plazmidni vektor je uveden kao DNK u obliku precipitata, kao što je kalcijum fosfat, ili u kompleksu sa lipidom. Elektroporacija se takođe može koristiti za uvođenje polinukleotida u domaćina. Ako je vektor virus, oni se mogu pakovatiin vitroili uvesti u ćelije za pakovanja i da tada će pakovanje virusa moći da se proširi u ćelije. Širok izbor tehnika pogodnih za pravljenje polinukleotida i introdukciju u ćelije u ovom aspektu pronalaska dorbo su poznate i predstavljaju rutinu osobama u struci. Ovakve tehnike opisane su u Sambrook i sr., kao što je citirano napred, što predstavlja primer mnogih laboratorijskih priručnika koji se bave ovim tehnikama. O saglasnosti sa ovim aspektom pronalaska , vektor može biti, na primer, plazmidni vektor, jedne ili dvo lančani vektor faga, jedno- ili dvo-lančani RNK ili DNK viraini vektor. Ovakvi vektori mogu se uvesti u ćeliju kao polinukleotidi, poželjno DNK, pomoću poznatih tehika za uvođenje DNK i RNK u ćelije. Vektori, u slučaju faga i viralnih vektora, takođe mogu biti i obično se uvode u ćeiije kao zapakovani ili ukapsulirani virus uz pomoć dobro poznatih tehnika za infekciju i transdukciju. Viraini vektori mogu biti replikaciono kompetentni ili replikaciono defektni. U slučaju poslednjeg viralna propagacija u osnovi će se dogoditi samo u komplementnim ćelijama domaćina.

Značajni među vektorima, u određenim aspektima, su oni za ekspresiju polinukleotida i polipeptida priloženog pronalaska. Uglavnom, ovakvi vektori imaju cis kontrolne regione za ekspresiju u domaćinu operativno povezane sa polinukleotidima koji će biti ekspresovani. Podesne trans faktore ili obezbeđuje domaćin, ili komplementarni vektor ili vektor sam po sebi posle uvođenja u domaćina.

U određenim požeijnim oličenjima u odnosu na ovo, vektori omogućuju specifičnu ekspresiju. Ovakva specifična ekspresija može biti indukovana ili ćelijski specifična, ili obje. Naročito značajni među indukovanim vektorima su vektori koji se indukuju na ekspresiju pomoću faktora sredine koji su jednostavni za manipulaciju, kao što je temperatura i hranljivi sastojci. Veliki broj pogodnih vektora u ovom aspektu pronalaska, uključujući konstitutivne i vektore za indukciju ekspresije za korišćenje u prokariotskim i eukariostskim domaćinima, dobro je poznato i upotrebljavano u struci.

Izmenjene ćelije domaćina mogu se kultivisati na konvencionalnim podlogama, koje se mogu modifikovati da bi bile pogodne za, između ostalog, aktiviranje promotera, selekciju transformanata ili amplificirajućih gena. Uslovi kultivacije, kao što je temperatura, pH i slično, ranije korišćeno sa ćelijom domaćina izabranom za ekspresiju uglavnom će biti pogodni za ekspresiju polipeptida priloženog pronalaska što je očigledno kvalifikovanim stručnjacima.

Veliki broj vektora za ekspresiju može se koristiti za ekspresiju polipeptida ovog pronalaska. Ovakvi vektori podrazumevaju hromozomalne, episomalne i vektore poreklom iz virusa n.pr., vektore poreklom iz bakterijskih plazmida, bakteriofaga, episoma kvasaca, hromozomalnih elemenata kvasaca, iz virusa kao što su bakulovirusi, papova virusi, kao što je SV40, vakcina virusa, adenovirusa, virusa ptičjih boginja, virusa pseudobesnila, retrovirusa, i alfa virusa kao što je Sindbis virus, i vektora dobijenih sa njihovim kombinacijama, kao što su oni dobijeni iz plazmida i genetičkih elemenata bakteriofaga kao što su kozmidi i fagemidi, svi se mogu koristiti za ekspresiju u saglasnosti sa ovim aspektom priloženog pronalaska. Uglavnom, u odnosu na ovo može se koristiti svaki vektor koji omogućuje održavanje, propagaciju ili ekspresiju polinukleotida za ekspresiju polipeptida u domaćinu.

Pogodne DNK sekvence mogu se ugraditi u vektor pomoću bilo koje dobro poznate rutinske tehnike. Uglavnom, DNK sekvenca za ekspresiju dodata je na vektor za ekspresiju prijanjanjem DNK sekvence i vektora za ekspresiju jednoj ili više restrikcionih endonukleaza i onda prijanjanjem restrikcionih fragmenata pomoću 14 DNK ligaze. Procedure za restrikciju i vezivanje koje se mogu koristiti dobro su poznate i rutinske za kvalifikovane stručnjake. Pogodne procedure u ovom smislu, i za konstrukciju vektora ekspresije pomoću alternativnih tehnika, takođe su dobro poznate i rutinske za stručnjake, kao što je do detalja opisano kod Sambrook i sar., ovde već citirano.

DNK sekvenca vektora za ekspresiju operativno je povezana sa odgovarajućim sekvencama ekspresione kontrole, uključujući, na primer, promotor za direktnu transkripciju mRNK. Primeri ovakvih promotora uključuju lambda PL promotor faga, lac, trp, tac i trc promotore £.Coli,rane i kasne promotore SV40 i promotore retroviralog LTRa, da pomenemo samo neke od dobro poznatih promotora. Biće razumljivo da su brojni promotori koji nisu spomenuti a pogodni su za korišćenje u ovom aspektu pronalaska, dobro poznati i svakodnevno se upotrebljavaju od strane stručnjaka kao što je ilustrovano u ovoj diskusiji i primerima.

Uglavnom, konstrukt; za ekspresiju sadržaće mesta za inicijaciju transkripcije i završetak, i. u transkrlpcionom regionu, mesto za translaciju koje vezuje ribozome. Kodirajući deo transkripata ekspresovan od strane kanstrukata imaće AUG inicijaciju translacije na početku i kodon za zabršetak pogodno postavljen na kraju polipeptida koji treba da bude preveden.

Nadalje, konstrukti mogu imati kontrolni region koji reguliše i u isto vreme pobuđuje ekspresiju. Uglavnom, u skladu sa mnogim svakodnevno korišćenim procedurama, ovakvi regioni radiće preko kontrole transkripcije, kao što je, između ostalog, represor mesta za spajanje i pojačavač.

Vektori za propagaciju i ekspresiju uglavnom uključuju selektivne markere. Ovakvi markeri takođe su pogodni za umnožavanje ili mogu sardžati dopunske markere za ovu svrhu. U odnosu na to, poželjno je da vektori ekspresije imaju jedan ili više selektivnih marker gena koji će omogućiti fenotipsku osobinu za selekciju u transformisanim ćelijama domaćina. Poželjni markeri uključuju dihidrofolat reduktazu, neomicin, puromicin ili higromicin, ili rezistentnost na higromicin u kulturi ćelija eukariota, i gene za rezistenciju na tetraciklin, teomicin, kanamicin ili ampicilin u kulturiE. coli \drugih bakterija.

Vektor sa pogodnom DNK sekvencom koja je opisana na drugom mestu ovde, isto kao i pogodni promotor, i druge pogodne kontrolne sekvence, mogu se uvesti u pogodnog domaćina pomoću doro poznatih tehnika prikladnih za ekspresiju željenog polipeptida. Reprezentativni primeri pogodnih domaćina uključuju ćelije bakterija, kao što suE. coli, Streptomyces i Salmonella typhimurium;fungalne ćelije, kao što su

ćelije kvasca; inskete kao što jeDrosophilaS2 iSpodopteraSf9; ćelije životinja kao što su CHO, COS i Bowes-ov melanom; i biljne ćelije, obično ćelije insekata BTI-TN-5B1-4. Domaćini za veliki broj ekspresionih konstrukata dobo su poznati, i stručnjaci će posle ovoga biti u mogućnosti da izaberu domaćina za ekspresiju polipeptida u skladu sa ovim aspektom priloženog pronalaska.

Različiti sistemi ćelijskih kultura sisara mogu se upotrebiti za ekspresiju, takođe. Primeri za ovo uključuju COS-7 linije fibroblasta bubrega kod majmuna (Giuzman i sar.,Cell 23:175, 1991).Druge ćelijske linije koje su sposobne da izvrše ekspresiju kompatibilnog vektora uključuju na primer, C127, 3T3, CHO, HeLa, ljudskog bubrega 293 i BHK ćelijske linije. U ćelijama domaćina sisara, može se koristiti više ekspresionih sistema baziranih na virusima. U slučaju gde je adenovirus iskorišćen kao vektor ekspresije, polinukleotidna sekvenca koja kodira RG1 može se vezati u ađenovirusni kompleks transkripcšje/translacije koji se sastoji od promotora poslednjeg i trodelne vodeće sekvence. Ubacivanje neesencijalnog regiona E1 ili E3 vlralnog genoma rezultiraće u živom virusu sposobnom da vrši ekspresiju RG1 u inficiranim ćelijama domaćina (Logan i Shenk,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81:3655-59, 1984). Nadalje, transkripcioni pojačivači, kao šti je Rous sarkoma virus (RSV), može se iskoristiti za povećanje ekspresije u domaćinskim ćelijama sisara.

Štaviše, priioženi pronalazak takođe uključuje rekombinantne konstrukte, kao što su ekspresioni konstiukti, sastavljeni od jedne ili većeg broja sekvenci gore opisanih. Konstrukti sadrže vektor, kao što je plazmid ili viraini vektor, u koji je ubačena takva sekvenca pronalaska. Sekvenca se može ubaciti unapred ili unazad orjentisana. Neka značajna odličja sa obzirom na ovo, konstrukt sadrži još i regulatorne sekvence, uključujući na prime, promotor, operativno povezan sa sekvencom. Veliki

broj korisnih vektora i promotora poznat je stručnjacima, i postoji mnogo komercijalno dostupnih za korišćenje u priloženom pronalasku.

Sledeći vektori, komercijalno dostupni, dobijeni su putem primera. Među vektorima koji su bolji za korišćenje kod baketija su pQE70, pQE60 o pQE9, dobijeni id Oiagen USA (Valencia, CA); pBS vektori, Phagescript vektori, Bluescript vektori, pNH8A, pNHI6a, pNHI8A, pNH46A, dobijeni od Stratgen-a (LaJolIa, CA); i ptcr 99a, pK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 dobijeni iz Pharmacia Biotech (Piscataway, N.Y.). Najvažniji je pTrcHisB vektor, dobijen od Invitrogen-a. Među važnim vektorima eukariota su pVVLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXTI i pSG na rspolaganju iz Stratgene-a; i PSVK3, pBPV, pMSG o pSVL od Pharmacia Biotech. Najbitniji je pCIneo vektor dobijen iz Promega. Ovi vektori su izlistani samo kao ilustacija svega što je komercijalno pristupačno na tržištu i dobro su poznati stručnjacima iz struke za korišćenje u saglasnosti sa ovim aspektom priloženog pronalaska. Biće shvatljivo da bilo koji drugi plazmid ili vektor pogodan za, na primer, indrodukciju, održavanje, propagaciju ili ekspresiju polinukleotida ili polipeptida pronalaska u domaćinu može da se koristi sa ovog aspekta pronalaska.

Promotor regioni mogu se izdvojiti iz bilo kog poželjnog gena korišćenjem vektora koji imaju jedinicu reporter transkripcije bez promotora, kao što je hloramfenikol acetil transferaza ('cat') transkripciona jedinica, koja se nalazi niže od restrikcionog mesta ili oblasti za uvođenje pogodnog promotor fragmenta; npr., fragmenta koji može da sadrži promotor. Kao što je poznato, introdukcija u vektor fragmenta koji ima promotor na na restrikcionom mestu naviše od cat gena pobuđuje produkciju CAT aktiviteta, što se može utvrditi standardnim CAT probama. Vektori pogodni za ovo dobro su poznati i stalno pristupačni. Dva ovakva vektora su pKK232-B i pCM7. Tako, promotori za ekspresiju polinukleotida priloženog pronalaska uključuju na samo dobro poznate i pristupačne promotore, nego i promotore koji se stalno mogu dobiti ovakvim tehnikama, pomoću reporter gena.

Među dobro poznatim bekterijalnim promotorima pogodnim za ekspresiju polinukleotida i polipeptida u saglasnosti sa priloženim pronalaskom su lacl i lacZ promotoriE. coli,T3 i T7 promotori, T5 tac promotor, lambda PR, PL promotori, trp promotor i trc hibridni promotor, koji su izvedeni iz trp i lac promotora. Među poznatim eukariotskim promotorima pogodnim u ovom smislu su CMV neposredni rani promotor, HSV promotor timidin kinaze, i rani i kasni SV40 promotori, promotori retroviralnih LTR, kao što su oni Rous sarkoma virusa ('RSV') i metalotionein promotori, kao što je kod miševa metalotionein-l promotor.

Selekcija pogodnoh vektora i promotora za ekspresiju u ćeliji domaćina je dobro poznata procedura i neophodna tehnika u ekspresiji konstruisanih vektora, introdukciji vektora u domaćina i ekspresiju u domaćinu, za stručna lica.

Uglavnom, rekombinantni ekspresioni vektori uključuju poreklo replikacije. promotor izveden iz visoko-ekspresovanog gena da bi upravili transkripciju nadole od strukturne sekvence, i selektivnog markera koji dozvoljava izolaciju ćelija koje nose vektor posle izlaganja vektoru.

Priloženi pronalazak se takođe odnosi i na ćelije domaćina koje nose gore opisane konstrukte o kojima se već diskutovalo. To mogu biti ćelije viših eukariota, kao što su ćelije sisara, ili nižih eukariota, kao što su ćelije kvasaca, ili prokariotske ćelije, kao što su bakterijske ćelije. Konstrukti u ćelijama domaćina mogu se koristiti na konvencionalni način za proizvodnju produkta gena kodiranih rekombinantnom sekvencom.

Polipeptidi se mogu ekspresirati u ćelijama sisara, kvasaca, bakterija ili drugih ćelija pod kontrolom odgovarajućih promotora. Ćelijski nezavistan translacioni sistem takođe se može primeniti za dobijanje ovakvih protiena korišćenjem RNK izvedenih iz DNK konstrukata priloženog pronalaska.

Pogodni vektori za kloniranje i ekspresiju za korišćenje sa prokariotskim i eukariotskim domaćinima opisali su Sambrook i sar.. kao sto je već citirano. Transkripcija DNK koja kodira polipeptide priloženog pronalaska kod viših eukariota može se povećati insercijom sekvence pojačivača u vektro. Pojačavači su cis-podražavajući elementi DNK, obično od 10 do 300 bp koji rade na povećavanju transkripcione aktivnosti promotora u datom ćelijskom tipu domaćina. Primeri pojačivača su SV40 pojačavač, koji je lociran na zadnjem mestu replikacionog početka na 100 do 270 bp, pojačivač ranog promotora citomegalovirusa, polinoma pojačivač na zadnjem mestu replikacionog početka, i pojačivači adenovirusa.

Polinukleotidi pronalaska, koji kodiraju heterologne strukturalne sekvence polipeptida ovog pronalaska uglavnom se ubacuju u vektor pomoću standardnih tehnika tako da su operativno povezane sa promotorom za ekspresiju. Polinukleotid se postavlja tako da je mesto početka transkripcije locirano pogodno na 5' mestu za zakačinjanje ribozoma. Mesto zakačinjanja ribozoma biće 5' na AUG što inicira translaciju poiipeptida koji treba da se ekspresuje. Ugkavnom, nema nijednog drugog mesta koje počinje sa kodonom inicijacije, sto je obično AUG, i leši između mesta zakačinjanja ribozoma i AUG za inicijaciju. Takođe, generalno, postoji stop kodon za translaciju na kraju polipeptida i tamo je poliadenilatni signal i signal za završetak transkripcije pogodno postavljen na 3' kraju transkribovanog regiona.

Za sekreciju translatovanog proteina u lumen endoplazmatičnog retikuluma, u periplazmidni prostor ili ekstraćelijsko okruženje, pogodni sekrecioni signal inkorporiše se u ekspresovani polipeptid. Signali mogu biti endogeni ili heterologni. Polipeptid se može ekspresovati u modifikovanoj formi, kao što je fuzija proteina, i može obuhvatati ne samo sekrecione signale nego i dopunske heterologne funkcionalne regione. Tako na primer, regioni dodatih amino kiselina, naročito amino kiselina sa nabojem, može se dodati N-kraju polipeptida da bi se poboljšala stabilnost i otpornost u ćeliji domaćinu, za vreme prečišćavanja ili stalnog rukovanja i čuvanja. Takođe, specijalni regioni mogu se dodati polipeptidima da bi se pojednostavilo prečišćavanje. Ovakvi regioni mogu se odstraniti pre završne preparacije polipeptida. Dodavanje peptidnih polovina polipeptidima da bi se izazvala sekrecija ili ekskrecija, da bi se poboljšala stabilnost i olakšalo prečišćavanje, između ostalog, familijarna je i rutinska tehnika za stručna lica. Na primer, kada su potrebne velike količine RG1 za indukciju antitela, pogodni su vektori koji režiraju visok nivo ekspresije fuzionisanih proteina koji su već pročišćeni. Ovakvi vektori obuhvataju, ali nisu limitirani na, multifunkcionalni vektorE. coliza kloniranje i ekspresiju kao što je Bluescript (Stratgene), kod kog je sekvenca za kodiranjerg1povezana u vektor u sklopu sekvence za amino-kraj Met i zatim 7 rezidua p-galaktoziđaze tako da se formira hibridni protein; pIN vektori (Van Heede i Shuster,J. Biol. Chem.264:5503-5509, 1989) i slično. PtrcHis vektori (Invitrogen, Carlsbad, CA) mogu se koristiti za ekspresiju stranih polipeptida kao fuzionih proteina koji imaju polihistidin (6xHis) marker za brzo prečišćavanje. Proteini napravljeni u ovakvim sistemima su određeni da imaju deo za cepanje, kao za mesto cepanja enterokinaze, tako da klonirani

polipeptid koji je od značaja može biti oslobođen iz fuzione peptidne polovine po želji.

Prateći transformaciju pogodne linije domaćina i njegov rast do željene gustine ćelija, inducibilni promotori, ako su prisutni, mogu se indukovati prikladnim sredstvima (npr., pramenom temperature ili izlaganjem hemijskom reagensu) i ćelije se dalje kultivisati za određen period.

Tada se ćelije sakupljaju centrifugiranjem, razbijaju fizičkim ili hemijskim sredstvima, i sirov ekstrakt sa dalje prečišćava.

Mikrobijalne ćelije upotrebljene u ekspresiji proteina mogu se razbiti bilo kakvim konvencionalnim metodom, uključujući zamrzavanje i odmrzavanje, sonikacija, mehaničko razbijanje, ili korišćenjem agenasa za liziranje ćelija, što su metodi dobro poznati stručnim licima.

RG1 polipeptid može se dobiti i pročistiti rekombinantnih ćelijskih kultura dobro-poznatim metodama uključujući precipitaciju sa amonijum sulfatom i etanolom, kiselinsku ekstrakciju, hromatografijom sa zamenama anjona i katjona, fosfocelulaznom hromatografijom, hidrofobnom interakcijskom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom, hidroksiapatitnom hromatografijom i hromatografijom sa lektinom. Najpoželjnija, tečna hromatografija visoke performanse ('HPLC') upotrebljava se za prečišćavanje. Dobro poznate tehnike za presavijanje proteina upotrebljava se za regeneraciju aktivnnog obkika kada je polipeptid denaturisan u toku izolacije i prečišćavanja. Razni drugi metodi za prečišćavanje proteina dobro su poznati u struci i uključuju one opisane kod Deutscher, M.,Methods in Enzymology,Vol. 182, Academic Press, San Diego, 1982; i Scopes, R.,Protein Purification: Principles and Practice,Springer-Verlag, NevvZork, 1982.

Alternativno, polipeptidi priloženog pronalaska mogu se proizvesti putem direktne sinteze pomoću tehnika čvrstih faza (Stev/art i sar.,Solid- Phase Peptide Synthesis,VV.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Merrifield, J.,J. Am. Chem. Soc.85:2149, 2154, 1963).In vitrosinteza proteina može se izvesti upotrebom manuelnih tehnika ili automatizovano. Automatska sinteza može se postići, na primer, korišćenjem Applied BioSvstems 431A peptidnim sintetajzerom (Perkin Elmer, Foster Citz, Calif.) u saglasnosti sa dobijenim instrukcijama proizvođača. Različiti fragmenti RG1 mogu se sintetisati hemijski odvojeno i kombinovatl pomoću hemijskih metoda da se dobije cela dužina molekula.

Polipeptidi ovog pronalaska uključuju prirodno pročišćene produkte, produkte hemijskih sintetičkih procedura, i produkte dobijene rekombinantnim tehnikama u prokariotskim i eukariotskim domaćinima, uključujući, na primer, bakterijske ćelije, ćelije kvasaca, viših biljaka, insekata i sisara. U zavisnosti od domaćina za rekombinantnih prođukcionih procedura, polipeptidi ovog pronalaska mogu se glikolizovati ili mogu biti ne-glikolizovani. Nadalje, polipeptidi ovog pronalaska mogu uključivati u sebe inicijalni ostatak modifikovanog metionina, u nekim slučajevima to je rezultat procesa koji se dešavaju u ćeliji domaćinu.

Korišćenje RG1 polipeptida i polinokleotida koji ih kodiraju

Rg1polinukleotidi i RG1 polipeptidi koriste se u brojnim aplikacijama u saglasnosti sa priložnim pronalaskom, naročito u onim koje koriste hemijske i biološke osobine RG1. Dodatne aplikacije se odnose na dijagnosticiranje i tretman bolesti ćelijske proliferacije, kao stoje rak prostate. Ovi aspekti pronalaska su dalje ilustrovani u diskusiji i opisani u specifikacijama.

Razlog za koršćenje polinukieotidne i polipeptidne sekvence priloženog pronalaska baziran je delimično na hemijskoj i strukturnoj homologiji između RG1 koji je ovde otkriven i drugih molekula ekstracelularnog matriksa i na preferencijalnoj ekspresiji RG1 u tkivima prostate, u poređenju sa drugim tkivima. RG1 se koristi u dijagnozi i tretmanu stanja, promena i bolesti koje su u vezi sa nepodesnim rastom tkiva prostate. Ovo uključuje, ali nije limitirano na, rak i rast metastaznog tumora.

figi polinukleotidna sekvenca koristi se kao DNK proba, i kao cilj za antisens i ribozom terapiju, ili kao osnova za produkciju antisens polinukleotida.

RG1 polipeptidi se koriste za dobijanje antitela za RG1 koja mogu biti korisna za otkrivanje nivoa RG1 polipeptida u ćelijama i tkivima i u ciljanju lekova za primarne i metastazne tumore.

RG1 polipeptidi se koriste za stimulaciju imunog odgovora u ćelijama koje ga sadrže. Polinukleotidi koji kodiraju RG1 koriste se u dijagnostičkim probama za otkrivanje nivoa polinukleotida koji kodiraju RG1 u ćelijama i tkivima. U uslovima koji su povezani sa ekspresijom RG1, kao što je rak prostate, suzbijanje ekspresije ili aktivnosti RG1 može predstavljati prednost. Ekspresije RG1 može se suzbiti primenjivanjem antisens oligonukleotida ili ribozoma. Alternativno, antitela koja prepoznaju specifična mesta RG1 polipeptida koja su odgovorna za njegovu aktivnost, mogu se primeniti za tretman bolesti i stanja povezanih sa aktivnošću RG1.

Polinukieotidne probe

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na korišćenje polinukleotida koji se odnose nargAda bi se otkrili komplementarni polinukleotidi kao što su, na primer, dijagnostički reagensi. Otkrivanjerglpolinukleotida povezanih sa bolešću omogućavaju dobijanje sredstva za razviće dijagnostikain vitroiin vivokoji mogu biti dopuna ili mogu definisati dijagnozu bolesti ili sklonost prema bolesti koja rezultira u ekspresiji RG1 koja je tkivno specifična.

Osobe koje imaju mutacije u genima koji kodiraju RG1 mogu se otkriti na nivou DNK pomoću raznih tehnika. Uzorci polinukleotida u dijagnosticiranju dobijaju se iz ćelija pacijenata, kao što je krv, mokraća, pljuvačka, biopsija tkiva i materijal autopsije. Genomna DNK koristi se za direktnu detekciju ili se enzimski umnožava sa PCR

pre analize (Saiki i sar.,Nature,324: 163-166, 1986). RNK i cDNK takođe se koriste na isti način. Na primer, PCR prajmeri komplementarni polinukleotidnoj sekvenci koja kodira RG1 koriste se za identifikaciju i analizu ekspresijerg1i mutacije. Na primer, delecije i insercije mogu se otkriti promenama u veličini umnoženog produkta u odnosu na normalni genotip. Tačkaste mutacije identifikuju se hibridizacijom umnožene DNK sa radioaktivno obeleženomrg\RNK ili alternativno, radioaktivno obeleženimrg1antisens DNK sekvencama. Sekvence koje se idealno poklapaju izdvajaju se od nepoklopljenih dupleksa razlaganjem sa Rnazom A ili pomoću razlika u temperaturi topljenja.

Razlike u sekvencama između referentnog gena i gena sa mutacijama takođe se mogu otkriti direktnim DNK sekvenciranjem. Nadalje, klonirane sekvence DNK koriste se kao probe za otkrivanje specifičnih segmenata DNK. Osetljivost ovih metoda može se pojačati korišćenjem PCR ili drugih metoda umnožavanja. Na primer, koristi se sekvencioni prajmer sa dvolančanim produktom PCR-a ili jednolančani šablonski molekul dobijen modifikovanim PCR-om. Određivanje sekvence odvija se konvencionalnim procedurama sa radioaktivno obeleženim polinukleotidima ili procedurama automatskog sekvenciranja sa fluorescentnim obeleživačima.

Genetičko testiranje bazirano na razlikama u sekvencama DNK može se postići otkrivanjem promena u elektorforetskoj pokretljivosti DNK fragmenata u gelu, sa ili bez agenasa za denaturaciju. Male delecije i insercije u sekvenci mogu se vizualizovati gel elektroforezom visoke rezolucije. DNK fragmenti različitih sekvenci mogu se raspoznati na denaturisanom gelu formamidnog gradijenta u kome je pokretljivost različitih fragmenata DNK zadržana u gelu na različitim mestima u odnosu na njihove specifične temperature topljenja ili delimičnog topljenja (videti npr., Mvers i sar.,Science,230: 1242, 1985).

Sekvencione promene na specifičnim mestima takođe se otkrivaju probama nukieazne protekcije, kao stoje RNKzna i S1 protekcija ili metoda hemijskog razdvajanja (npr., Catton i sar.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA,85:4397-4401, 1985).

Određivanje specifičnih sekvenci DNK postiže se metodama hibridizacije, RNKzne protekcije, hemijskog cepanja, direktnim sekvenciranjem DNK ili korišćenjem drugih restrikcionih enzima, (npr., đužinski polimorfizmi restrinkcionih fragmenata ('RFLP') i Southern blotting genomske DNK).

U nastavku mnogo konvencionalni]-: gel-e!etroforeze i sekvenciranja DNK, mutacije se takođe mogu ustanovitiin situanalizom.

Polipepudne probe

Priloženi pronalazak takođe se odnosi na dijagnosiičke probe, kao što su kvantitativne i kvalitativne analize nivoa RG1 polipeptida u ćelijama i tkivima i telesnim tečnostima, uključujući određivnje normalnog i nenormalnog nivoa. Na primer, dujagnostička proba u saglasnosti sa pronalaskom za utvrđivanje prekomerne ekspresije RG1 polipeptida u poređenju sa kontrolnim uzorcima tkiva koji su narmalni koriste se za detekciju neoplazije, na primer, raka prostate. Ovakav dijagnostički test se takođe može koristiti za otkrivanje rasta metastaznih tumora. Tehnike testiranja koje se mogu koriatiti za određivanje nivoa polipeptida, kao što je RG1 polipeptida priloženog pronalaska, u uzorku uzetom iz domaćina dobro su poznate stručnim licima. Ovi metodi testiranja obuhvataju radioimunoanalizu (RIA), probe kompetitivnog vezivanja, vvestern Blot analizu i enzimima vezanu imunoabsorbentnu analizu (ELISA), i fluorescentno sortiranje aktiviranih ćelija (FACS). Od ovih, najviše se primenjuje ELISA. ELISA analiza obuhvata pripremu antitela specifičnih na RG1, poželjno monoklonalnih antitela. U nastavku, uglavnom se dobije reporter antitelo koje se vezuje za monoklonalno antitelo. Reporter antitelo zakačeno je za reagent koji se može pratiti kao što je radioaktivni, fluorescentni ili enzimatski reagent, u ovom siučaju peroksidaza rena.

Da bi se izveo ELISA test uzorak se uzima sa domaćina i inkubira na čvrstoj podlozi,npr., polistirenskom sudu , koji vezuje polipeptide uzorka. Bilo koje slobodno mesto za vezivanje na polipeptida za sud pokriva se inkubacijom sa nespecifičnim proteinom kao što je albumin serum govečeta. Zatim se u sudu inkubiraju monoklonalna antitela za vreme čega se monoklonalna antitela vezuju na bilo koje RG1 polipeptide već zakačene za poiistirenski sud Nepovezana monoklonalna antitela se ispiraju sa buferom. Reporter antitelo vezano peroksidazom rena za sud rezultiraće u spajanju reporter antitela za bile koje monoklonalno antitelo spojeno sa RG1. Nespojena reporter antito'a zatim se ispiraju. Reagens za peroksidaznu aktivnost, uključujući kciorimetrijski substrat tada se dodaje sudu. Imobilisana peroksidaza, povezanasa RG1 preko primarnih i sekundarnih antitela, daje obojeni produkt. Intenzitet boje u datoni vremenskom perionu označava količinu RG1 polipeptida koja je prisutna u uzorku. Kvantitativni rezultati obično se dobijaju u odnosu na standardnu krivu.

U kompetitivnoj analizi antitela specifična za RG1 prijanjaju za čvrstu podlogu i obeležen RG1 i uzorak iz domaćina prevode se preko čvrste podloge i količina

oboleženog, spojena sa čvrstom podlogom je u korelaciji sa količinom RG1 u uzorku.

Ove i druge analize su opisane na raznim mestima, kod Hampion i sar.,{ Serological Methods, a Laboratory Manual,APS Press, St. Paul, Minn. 1990) i Maddox i sar., (J. Exp. Med. 158:12111, 1983).

Antitela

Pronalazak se dalje odnosi na antitela koja se specifično vezuju za RG1, i koja su ovde obeležena kao RG1 antitela. Prekomerna ekspresija RG1 u tkivima prostate i njihovo lociranje na površini ćelija predstavljaju karakteristiku odličnog markera za skrining, dijagnozu, prognozu, praćenje analizu i oslikavanje metoda. Nadalje, ove karakteristike ukazuju da je RG1 odlična meta za terapeutske metode kao što su ciljana terapija antitelima, imunoterapija i genska terapija. Kako se koristi ovde, termin 'specifično vezana za' odnosi se na interakciju antitela i polipeptida, gde je interakcija zavisna od prisustva određene strukture (npr., antigenskog determinanta iii epitopa) na polipeptidu; drugim rečima, antitela se prepoznaje i vezuje uglavnom na specifične strukture polipeptida pre nego na proteine.

RG1 polipeptidi, njihovi fragmenti ili drugi derivati, ili njihove analoge, ili ćelije u kojima se ekspresuju konste se kao imunogen za proizvodnju antitela takođe (riarlovv,Aniibodies,Colđ Sprinu Harour Press, NY (1989)). Ova antitela mogu biti, na primer, poliklonalna ili monoklonalna. Priloženi pronalazak takođe uključuje himerna;jednolančana, humanizirana i ijudska antitela, kao i Fab fragmente, ili produkte Fab ekspresione biblioteke. Različite procedure poznate stručnim licima mogu se koristiti za produkciju ovakvih antitela ili fragmenata.

Antitela generisana na osnovu polipeptida koji odgovara sekvenci priloženog pronalaska može se dobiti direkinim injektiranjem polipeptida u životinju ili putem administracije polipeptida u životinju. Tako dobijena antitela sama će onda vezivati polipeptide Na ovaj način čak i sekvenca koja kodira samo fragment polipeptida može se koristiti za generisanje vezivanja antitela čitavog prirodnog polipeptida. Ova antitela se mogu zatim koristiti za izolaciju polipeptida iz tkiva koja vrše ekspresiju polipeptida.

Za preparaciju monoklonalnih antitela, može se koristiti bilo koja tehnika kojom se dobijaju antitela produkovana u kontinuainoj kulturi ćelijskih linija. U primere se ubrajaju hibridoma tehnike (Kohler i Milstein, Nature 256: 495-497, 1975), humane B-ćelije hibridoma tehnike (Kozbor i sar.,lmmunology Today 4:72,1983) i EBV-hibridoma tehnike za produkciju humanih monoklonalnih antitela (Cole i sar., uMonoclonal Antibodies and Cancer,Alan R. Liss. Inc., 77-96, 1985).

U nastavku, mogu se koristiti tehnike razvijene za produkciju 'himernih antitela', spajanje gena antitela miša sa genima antitela čoveka da bi se dobio molekul sa podesnim specifikacijama antigena i biloškom aktivnošću (Morrison i sar.,Proc, Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855, 1984; Neuberger i sar.,Nature312:604-608, 1984; Takeda i sar.,Nature314:452-454, 1985). AlteRNKtivno, tehnike koje su opisane za produkciju jednolančanih antitela (U.S.Pat.No. 4,946,778) može se prilagoditi za produkciju RG1-specifičnih jednolančanih antitela.

Štaviše, 'humana' antitela mogu se produkovati pomoću metoda opisanih u U:S: Patent NOS. 5,877,397 i 5,569,825, koji su ovde prikazani ćelom referencom.

Antitela se takođe mogu produkovati indukcijomin vivoprodukcije u populaciji limfocita ili pretraživanjem biblioteka rekombinantnih imunoglobulina ili umetanjem visoko specifičnih reagenata za spajanje kao što su opisali Orlandi i sar.,( Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:5333-3637. 1989) a VVinter i Milstein( Nature349:293-299, 1991).

Fragmenti antitela koji imaju specifična mesta za spajanje sa RG1 takođe se mogu generisati. Na primer, ovakvi fragmenti uključuju, ali nisu limitirani na F(ab')2 fragmente koji se mogu produkovati pepsinskim razlaganjem molekula antitela i Fab fragmente koji se mogu generisati smanjenjem disulfidnih mostova na F(ab')2 fragmentima. Alternativno, mogu se konstruisati biblioteke Fab ekspresije da bi se omogućila brza i jednostavna identifikacija monoklonalnih Fab fragmenata sa željenim specifikacijama (Huse i sar.,Science256:1270-1281, 1989).

Aminokiselinska sekvenca RG1 prikazana ovde koristi se za selekciju specifičnih oblasti RG1 polipeptida za dobijanje antitela. Kao što je razumljivo stručnim licima, regioni ili epitopi RG1 polipeptida kojima su namenjena antitela, mogu da variraju sa nameravanom aplikacijom. Na primer, antitela namenjena za korišćenje i imunoreakcijama za otkrivanje RG1 koji se spaja za membranu ćelija prostate mogu se nameniti ka pristupačnim epitopima na RG1 polipeptida. Regioni RG1 polipeptida koji pokazuju imunogensku strukturu, isto kao i drugi regioni ili domeni, mogu se lako identifikovati različitim drugim metodama, kao što su Chou-Fasman, Garnier-Robson, ili Jameson-vVolf analize. Fragmenti sa ovim reziduima naročito su pogodni za stvaranje anti-RG1 antitela. Naročito su korisni sledeci fragmenti, ali nisu limitirani na samo te, sekvence PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO: 8):

HSSDYSMWRKNQYVS (SEQ ID NO: 10); DAGTDSGFTFSSPNAFATIPODTV (SEQ

ID NO. 11); i NEIVDSASVPET (SEQ ID NO: 12). Generacija poliklonalnih antitela ovih regiona opisana je u Primeru 4.

Antiteia ovog pronalaska mogu naročito biti korisna u dijagnostičkim ispitivanjima, vizualnim metofologijama, i terapeutskim metodama za rukovođenje o raku prostate. Pronalazak omogućava različite imunološke analize korisne za detekciju RG1 polipeptida i za dijagnozu raka prostate. Ovakve analize uglavnom uključuju jedno ili više RG1 antitela sposobnih da prepoznaju i vežu se za RG1 polipeptid. Najpoželjnija antitela selektivno će se vezivati na RG1 i neće se vezati (ili će se slabo vezati) za ne-RGI polipeptide. Analize uključuju različite formate imunoloških testova dobro poznatih u struci, kcji uključuju ali nisu limitirani na različite tipove radioimunološkin analiza, enzimima povezane irnunoapsorbentske probe i si. Nadalje, imunološke vizalizacione metode sposobne za detekciju raka prostate takođe su omogućene ovim pronalaskom, i one uključuju ali nisu limitirane na radioscintigrafske vizualizacione metode koje uključuju obeležena RG1 antitela. Ovakve analize mcgu biti klinički konsne u otkrivanju , praćenju i prognozi raka prostate.

Gore opisana antitela mogu se koristiti za izolaciju ili identifikaciju klonova koji eskspresuju polipeptid ili za izolaciju polipeptida ovog pronalaska vezivanjem antitela za solidnu podlogu za izolaciju i/ili prečišćavanje pomoću afinitetne hromatografije.

Nadalje, RG1 antitela mogu se koristiti za izolaciju RG1 pozitivnjih ćelija korišćenjem tehnika ćelijskog sotriiranja i prečišćavanja. Naročito, RG1 antitela mogu se korisititi za izolaciju ćelija raka protstate iz ksenografa tumorskog tkiva, iz ćelija u kulturi, itd. Korišćenjem ćelijskog sortiranja na bazi antitela ili tehnikama prečišćavanja po afinitetu. DrugeKoristi od RG1 antitela ovog pronalaska uključuju stvaranje anti-idiotipičnih antitela koja oponašaju RG1 polipeptid.

RG1 antitela se mogu koristiti za otkrivanje prisustva raka prostate ili metastaza tumora. Prisustvo ovakvih ćelija sa RG1 u različitim biološkim uzorcima, uključujući serum, uzorke biopsije prostate i drugih tkiva, može se otkriti sa RG1 antitelima. U nastavku, RG1 antitela mogu se koristiti u različitim vizualnim metodologijama kao što je imuno scintigrafija sa Tc99m (ili drugim izotopom) konjugovanim antitelom. Na primer, vizualni protokol sličan onom koji je ranije opisan i koji koristi ln-111 konjugovano anti-PSMA antitelo može se koristiti za otkrivanje povratnog i metastatskog raka prostate. (Sodee i sar., Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997).

RG1 antitela ovog pronalaska mogu se obeležiti sa markerom za detekciju ili konjugovati sa drugim molekulom, kao što je citotoksični agens i koristiti se za ciljanje sekundarnog molekula u RG1 pozitivnim ćelijama (Vitetta, E.S. i sar., lmmunotoxin therapv u DeVita, Jr, V.T. i sar., eds Cancer: Principles and Practice of Oncologv, 4th ed., J.B. LippincottCo., Philadelphia, 2624-2636, 1993). Primeri citotoksičnih agenasa uključuju, ali nisu limitirani na, ricin, doksorubicin, daunorubicin, taksol, etidijum bromid, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, dihidroksi antracin dion, aktinomicin D, difterija toksin,Pseudomonaseksotoksin (PE) A, PE40, abrin, i glukokortikoid i druge hemoterapeutske agense isto kao i radioizotope. Pogodni markeri za detekciju uključuju, ali nisu limitirani na, radioizotope, fluorescentne komponente, bioluminiscentne komponente, hemiluminiscentne komponente, helatore metala ili enzime. Pogodni radioizotopi uključuju sledeće: Antimon-124, Antimon-125, Arsen-74, Barijum-103, Barijum-140, Berilijum-7, Bizmut-j206, Bizmut-207, Kadmijum-109, Kadmijum-115m, Kalcijum-45, Cerijum-139, Cerijum-141, Cerijum-144, Cezijum-137, Hrom-51, Kobalt-56, Kobalt-57, Kobalt-58, Kobalt-60, Kobalt-64, Erbijum-169, Europijum-152,

Gadolinijum-153, Zlato-195, Zlato-199, Hafnijum-175, Hafnijum-181, lndijum-11, Jod-123, Jod-131, lridijum-192, Gvožđe-55, Gvožđe-59, Kripton-85, Olovo-210, Mangan-54, Živa-197, Živa-203, Molibden-99, Neodimijum-147, Neptunijum-237, Nikl-63, Niobijum-95, Osmijum-185+191, Paladijum-103, Platina-195m, Prazeodimijum-143, Prometijum-147, Protaktinijum-233, Radijum-2226, Renijum-186, Rubidijum-86, Rutenijum-103, Rutenijum-106, Skandijum-44, Skandijum-46, Selen-75, Srebro-110m, Srebro-11, Natrijum-22, Stroncijum-85, Stroncijum-89, Stroncijum-90, Sumpor-35, Tantal-182, Tehnecijum-99m, Telur-125, Telur-132, Talijum-170, Talijum-204, Torijum-228, Torijum-232, Kalaj-113, Titanijum-44, Volfram-185, Vanadijum-48, Vanadijum-49, lterbijum-169, ltrijum-88, ltrijum-90, ltrijum-91, Cink-65 i Cirkonijum-95.

Imunoterapija za rak<p>rostate

Pronalazak omogućava različite imunoterapeutske metode za tretiranje raka prostate, uključujući i trapiju antitelima,in vivo,iex vivoimunoterapeutske prilaze. Na jedan način, pronalazak omogućava RG1 antitela koja se mogu koristiti sistematično za tretiranje raka prostate. Na primer, nekonjugovana RGH1 antitela mogu se ubrizgati u pacijenta tako da se antitela vezuju za RG1 ili se spajaju sa ćelijama raka prostate i omogućavaju uništavanje ćelija, i tumora, mehanizmima koji mogu uključiti komplementarano posredovanu citolizu, antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost, promenom fiziološke funkcije RG1 i/ili inhibicijom vezivanja liganda ili putevima transdukcije signala. RG1 antitela konjugovana sa toksičnim agensom kao što je ricin ili radioizotopi mogu se takođe koristiti terapeutski za dopremanje toksičnog agensa direktno do ćelija raka prostate koje imaju RG1 i tako uništiti ćelije tumora.

Imunoterapija raka prostate pomoću RG1 antitela sledi model lečenja koji je uspešno primenjen na druge tipove raka, što uključuje, ali nije limitirano na, rak debelog creva, (Arlen i sar.,Crit. Rev. Immunol.18: 133-138, 1998), multipli mijelom (Ozaki i sar.,Blood90:3179-3186, 1997; Tsunenari i sar.,Blood90: 2437-2444, 1997), rak želuca (Kasprzvk i sar.,Cancer Res.52:2771-2776, 1992), B-ćelijski limfom (Funakoshi i sar.,Immunother. Emphasis Tumor Immunol.19: 93-101, 1996.), leukemiju (Zhong i sar.,Leuk. Res.20: 581-589, 1996.), kolorektalni tumor (Moun i sar.,Cancer Res.54: 6160-6166, 1994.; Velders i sar.,Cancer Res.55: 4398-4404, 1995.), i rak dojke (Shepard i sar.,J. Clin. Immunol.11: 117-127, 1991.).

Pronalazak nadalje omogućava vakcine formulisane da sadrže RG1 polipeptid ili njegov fragment. Korišćenje antigenskog tumora u vakcini za stvaranje humoralnog i ćelijskog imuniteta za korišćenje u anti-kancernoj terapji i dobro je poznato i već je primenjivano u terapiji raka prostate korišćenjem humanog PSMA i PAP imunogena glodara ( Hodge i sar., Int.J.Cancer 63: 231-237, 1995; Fong i sar., J Immunol. 195:3113-31117,1997.). Ovakav metod se može primenjivati korišćenjem RG1 polipeptida ili njegovog fragmenta, ili RG1 kodiranog molekula nukleinske kiseline i

rekombinantnog vektora sposobnog za ekspresiju i prezentovanje RG1 imunogena.

Na primer, sistem dopremanja virusnog gena se moze koristiti za dopremanje RG1-kodirajućeg molekula nukleinskih kiselina. Različiti sistemi za dobijanje viralnih gena koji mogu se koristiti u praksi ovog aspekta pronalaska uključuju, ali nisu limitirani na, vakcine, kokošije boginje, kamarinske boginje, adenovirus, influenca, poliovirus, grupa adenovirusa, lentivirus i sinbas virus (Restifo, uCurr. Opin. Immunol.8: 658-663, 1996). Ne-viralni sistemi dopremanja takođe se mogu primeniti korišćenjem golih DNK koje kodiraju RG1 polipeptid ili njegove fragmente, koji se daju pacijentima (tj. Intramuskulamo) da bi se pobudio antikancerogeni odgovir. U jednom oličenju, upotrebljava se cela duzina humanog rg1 cDNK . U drugom oličenju upotrebljavaju se fragmenti humane ljudske rg1 cDNK. U drugom otelovljenju, mogu se upotrebiti molekuli rg1 nukleinskih kiselina koje kodiraju specifične T limfocite (CTL) epitope. CTL epitopi mogu se odrediti korišćenjem specifičnih algoritama (npr. Epimer, Brovvn Universitv) da bi se identifikovali peptidi u okviru RG1 polipeptida koji su sposobni za optimalno vezivanje za specifične HLA alele.

Takođe se mogu upotrebiti različiteex vivostrategije. Jedan prilaz uključuje ćelije dendrita da predstavljaju RG1 polipeptid kao antigen za imuni sistem pacijenta. Ćelije dendrita ekspresuju MHC klasu I i II , B7 kostimulator i IL -12 , tako da su vrlo specijaiizovane ćelije koje prezentuju antigen. U raku prostate, autologe ćelije dendrite vezane sa peptidima membrane antigena koje su specifične za prostatu PSMA koriste se u Fazi I kliničkih ispitivanja za stimulaciju imunog sistema pacijenta sa rakom prostate (Tjoa i sar., Prostate 28: 65-69, 1966; Murphy i sar., Prostate 29; 371-3810, 1996.). Ćelije dendrita mogu se koristiti da prezenuju RG1 polipeptide T ćelijama u kontekstu MHC klase I i II molekula. U jednom oličenju, autologe ćelije dendrita povezane sa RG1 polipeptidima sposobne su da se vezu za MHC molekule. U drugom oličenju, dendritne ćelije su vezane sa kompletnim RG1 polipeptidom. Pored, postoji i drugo oličenje koje uključuje inzinjering prekomerne ekspresije rg1 gena u ćelijama dendrita korišćenjem različitih implementacionih vektora, kao što su adenovirus (Arthuri sar.,Cancer Gene TherA:17-25, 1997), reirovirus ( Henderson i sar.,Cancer Res.56: 3763-3777, 1996), lentivirus, grupa adenovirusa, DNK transfekcija (Ribaš i sar.,Cancer Res.57 : 2865-2869, 1997) i tumorom izazvana RNKtransfekcija(Ashley isar.,J Ehp. Med.186: 1177-1182, 1997).

Anti-idiotipična, anti- RG1 antitela takođe se mogu koristiti u antikancerogenoj terapiji kao vakcina za indukovanje imunog odgovora kod ćelija koje ekspresuju RG1 polipeptid. Naročito obro je poznata generacija anti-idiotipičnih antitela i moze se adaptirati za dobijanje anti-idiotipičnih koja oponašaju epitope na RG1 polipeptidu ( vidi, na primer, VVagner i sar.,Hibridoma16: 33-40, 1997.; Foon i sar.,J. Clin. Invest.96: 334-342, 1995.; Kerly i sar,Cancer Immunol Immunother43:65-76, 1996.) Ovakva anti-idiotipična antitela mogu se koristiti u anti-idiotipičnoj terapiji kao što se i radi sa drugim anti-idiotipičnim antitelima koje su usmerene protiv antigena tumora.

Metode genetičke imunizacije mogu se upotrebiti da proizvedu profiiaktički Ili terapijski humoralni i ćelijski imuni odgovor upravljen protiv ćelija raka koje ekspresuju RG1. Korišćenjem DNK molekula koji kodiraju RG1 opisanih ovde konstrukti koji sadrže DNK koja kodira RG1 polipeptid / imunogen i pogodnu regulatornu sekvencu mogu se ubaciti direktno u mišić ili kozu jedinke, tako da ćelije mišića uzimaju konstrukt i ekspresuju kodirani RG1 polipeptid / imunogen. RG1 polipeptid/ imunogen moze se ekspresovati kao polipeptid površine ćelija ili moze biti sekretovan. Ekspresija RG1 polipeptid/ imunogena rezultuje u stvaranju profilaktičnog ili terapeutski humoralnog i ćelijskog imuniteta protiv raka prostate. Različite profilaktičke i terapeutsko-genetičke imunizacione tehnike mogu se koristiti (pogledati informaciju i reference publikovane na Internet adresi www. Genweb.com.).

Antisens oligonukleotidi, antisens vektori i ribozomi

Anti-sens polinukleotidi komplementarnirg1mogu se sintetisati. Ovakvi oligonukleotidi mogu se dostaviti u ćelije sa ili bez lipida koji mogu potpomagati uzimanje antisens oligonukleotida u ćelije.

Alternativno, vektori ekspresije dobijeni od retrovirusa, adenovirusa, herpesa ili vakcina virusa, ili iz različitih bakterijskih plazmida, mogu se koristiti za konstrukciju i dostavljanje rekombinantnih vektora koji će ekspresovati anti-senarg1.Videti, na primer, tahnike opisane po Sambrook i sr., (supra) i Ausubel i sar. (supra).

Polinukleotidi koji imaju celokupnu sekvencu cDNK i/ili njihove regulatorne elemente omogućavaju pronalazačima da koristerg1polinukleotide kao alat za ispitivanje sens lanaca (Youssoufian i Lodish, Mol. Cell. Biol. 13:98-104, 1993) ili antisens lanaca (Eguchi i sar., Ann. Rev. Biochem.- 60:631-652, 1991) za regulaciju funkcije gena. Ovakva tehnologija sada je dobro poznata u struci, i sens i anti sens oligomeri, ili veći fragmenti mogu se napraviti u različitim lokacijama celog kontrolnog regiona.

Gen: koji kodiraju RG1 mogu se isključiti transfektiranjem ćelije ili tkiva ekspresionim vektorima koji ekspresiraju visok nivo željenogrg1nukleotidnog fragmenta. Ovakvi konstrukti mogu zagušiti ćelije sa neprevodljivim ili antisens sekvencama. Čak i u slučaju odsustva integracije u DNK, ovakvi vektori nastavljaju da transkribuju RNK molekule dok ne onesposobe sve kopije endogenom nukleazom. Prolazna ekspresija može trajati mesec i više sa ne-replicirajućim vektorom i još duže ako su podesni replikacioni elementi u sastavu vektorskog sistema.

Kao što je već pomenuto, modifikacija ekspresije gena, može se dobiti dizajniranjem antisens molekula, DNK ili RNK, kontrolnih regionarg1tt.j. promotora, pojačivača i introna. Oligonukleotidi dobijeni sa mesta početka transkripcije, t.j. između -10 i +10 regiona vodeće sekvence, poželjniji su. Antisens molekuli takođe mogu biti napravljeni da blokiraju translaciju mRNK onemogućavanjem transkripta da se veže za ribozome. Slično tome, inhibicije sa postiže korišćenjem metodologije sparivanja baza nazvane 'trostruki heliks' . Trostruki heliks sparivanje uključuje sposobnost dvostrukog heliksa da se dovoljno otvori zbog vezivanja polimeraza, transkripcionih fragmenata ili regulatornih molekula. Nedavna terapeutska dostignuća sa trostrukom DNK opisali su Gee, J.E. i sar., (U Huber i Car,Molecular and Immunologic Approaches,Futura publishing Co., Mt. Kisco, N.Z., 1994).

Ribozomi su enzimski RNK molekuli sposobni da katališu specifično spajanje RNK

(U.S. Patent No. 4,987,071; WO 93/23057). Mehanizam akcije ribozoma uključuje po sekvenci specifičnu hibridizaciju molekula ribozoma za komplementranu RNK, što je praćeno endonukleolitičnim spajanjem. U okviru pronalaska napravljeni su ribozomi sa motivmo čekićaste glave koji mogu da specifično i efikasno katališu endonukleolitično vezivanje RNK koja kodira RG1. Specifična mesta spajanja ribozoma u okviru bilo koje ciljne RNK označena su na početku skaniranjem ciljnog molekula na mesta vezivanja ribozoma što uključuje sledeće sekvence, GUA, GUU i GUC. Jednom označene, kratke RNK sekvence od između 15 i 20 ribonukleotida koji odgovaraju regionu ciljnog gena koji ima mesto spajanja mogu se oceniti po drugim strukturnim odlikama koje mogu činiti oligonukleotide neoperativnim. Pogodnost potencijalnih ciljeva takođe se može proceniti testiranjem mogućnosti hibridizacije sa komlementarnim oligonukleotidima korišćenjem reakcija zaštite ribonukleaze. (Irie isar., Advance. Pharmacol.40:207-257, 1997).

Antisens molekuli i ribozomi pronalaska mogu se napraviti bilo kom metodom sinteze RNK molekula. One uključuju tehnike za hemijsku sintezu oligonukleotida kao što je sinteza pomoću čvrste faze fosforamida. Alternativno, RNK molekuli se mogu generisatiin vitroiin vivotranskripcijom ili pomoću DNK sekvenci koje kodiraju RG1. Ovakve DNK sekvence mogu se ubaciti u veliki broj vektora sa pogodim promotorima polimeraza kao što su T7 ili Sp6. Alternativno, antisens cDNK konstrukti koji sintetišu antisens RNK konstitutivno ili indukcijom mogu se uvesti u ćelijske linije, ćelije ili

tkiva.

RNK molekuli mogu se modifikovati da povećaju intracelularnu stabilnost i polu-život. Moguće promene uključuju, ali nisu limitirane na, dodavanje bočnih sekvenci na 5' i/ili krajeve molekula ili koršćenje fosforotioata ili 2' O-metila rede nego fosfodiesteraznih veza u kosturu molekula. Povećanje stabilnosti takođe se postiže uključivanjem netradicionalnih baza kao što su inozin i guanozin, kao i acetil-, metil-, tio- i slične forme adenina, citidina, guanina, timina i uridina koje se ne mogu lako prepoznati endogenim endonukleazama. Metode za uvođenje antisens vektora u

ćelije ili tkiva ubrajaju metode o kojima je već diskutovano i koje su jednako pogodne zain vivo, in vitroiex vivoterapiju. Zaex vivoterapiju, antisens molekuli uvode se u ćelije koje su uzete iz pacijenata i klonalno propagirane za autologno transplantiranje natrag u istog pacijenta kao što je pokazano u U.S. Pat. Nos. 5,399,493 i 5,437,994, ovde prikazane referencom. Predavanje transfekcijom i pomoću lipozoma ili drugim lipidima ili ne-lipidnim baznim agensima dobro je poznato u nauci.

Analize za identifikaciju agenasa koji se vezuju za RG1

Priloženi pronalazak takođe se odnosi na analize i metode koje se mogu koristiti za određivanje agenasa koji se vezuju na RG1. Specifično agensi koji se vezuju za RG1 mogu se odrediti preko sposobnosti RG1 liganada i drugih agenasa ili konstituenta za vezivanje sa RG1 i/ili sposobnosti da inhibiraju/stimulišu aktivnost RG1.

Alternativno, agensi koji se vezuju za RG1 polipeptid mogu se identifikovati pomoću dvo-hibridnog sistema kvasca ili u toku analize spajanja. U dvo-hibridnom sistemu kvasca, ekspresiona jedinica koja kodira fuzioni protein koji je sastavljen od jedne subjedinice transkripcionog faktora koji ima dve subjedinice i RG1 polipeptida, uvodi se i eksprimira u ćeliji kvasca. Ćelija je dalje modifikovana da sadrži (1) ekspresionu jedinicu koja kodira marker za detekciju čija ekspresija potražuje dve subjedinice transkripcionog fragmenta za ekspresiju i (2) ekspresionu jedinicu koja kodira fuzioni protein sastavljen od druge subjedinice transkripcionog faktora i klonirani fragment DNK. Ako kodirani segment DNK kodira protein koji se vezuje za RG1 polipeptid, rezultati ekspresije su u interakciji RG1 i kodiranog proteina. Ovo omogućava da dve subjedinice transkripcionog faktora u blisku vezu, što omogućava rekonstituciju transkripcionog faktora. Ovo rezultira u ekspresiji markera. Ovaj dvostruki sistem gljicvica naročito je koristan u skeniranju bibnlioteke cDNK koja kodira segmente za ćelijsko vezivanje partnera RG1.

RG1 polipeptidkoji se može koristiti u napred navedenom uključuje, ali nije limitiran na, izolovani RG1 polipeptid, fragnemt polipeptida, ćelija koja je promenjena da vrši ekspresiju RG1 polipeptida, ili frakciju ćelije koja je izmenjena da vrsi ekspresiju RG1 polipeptida. Nadalje, RG1 polipeptid može biti polipeptid cele dužine ili definisani fragment RG1 polipeptida. Očigledno je da će se dok god RG1 polipeptid može da se ispituje na vezivanje agenasa, t.j. preko promene u molekulskoj dužini ili aktivnosti, taj sistem koristiti sada.

iVietod koji se koristi za određivanje da li će se agens/ćelijska komponenta vezati za RG1 polipeptid baziranje primarno na prirodi korišćenog RG1. Na primer, analiza

pomoć1.!retardacionog gela može se koristit: za određivanje da li će se agens vezati za RG1 ili njegov fragment. Alternativno, imunodetekcija i tehnologije biočinova mogu se prihvatiti na korišćenje sa RG1 polipeptidom. Spretan stručnjak može koristiti veliki broj tehnika za određivanje da li će se agens vezati ili ne za RG1 polipeptid.

Agensi i ćelijske komponente mogu dalje bit: testirani na sposobnost da menjaju aktivnost RG1 polipeptida korišćenjem sistema analize slobodnih ćelija ili sistem analize ćelija. Kako aktivnosti RG1 polipeptida postaju više definisane, funkcionalne analize bazirane na inedtifikoavnoj aktivnosti mogu se primenjivati.

Kako se ovde koristi, za agens se kaže da antagoniše aktivnost RG1 kada agens redukuje aktivnost RG1. Poželjni antagovnist će selektivno antagonisati RG1, ne utičući pri tom na druge ćelijske proteine. Dalje, poželjni antagonist će redukovati RG1 aktivnost više od 50%, još bolje 90%, a najpoželjnije skroz eliminisati svu aktivnost RG1.

Agensi koji su testirani u navedenim metodima mogu se nasumice izabirati ili racionalno izabirati ili dizajnirati. Kako se ovde koristi, za agens se kaže da je nasumice izabran kada je on izabran ne uzimajući u obzir specifične sekvence RG1 polipeptida. Primer nasumično izabranog agensa je korišćenje hemijske biblioteke ili biblioteke peptidne kombinatorike, ili bujon rasta organizma ili biljnog ekstrakta.

Kako se ovde koristi, za agens se kaže da je racionalno izabran ili napravljen kada je on izabran na bazi koja nije slučajna i koja uzima u obzir sekvencu ciljanog mesta i/ili je njegova konfirmacija u vezi sa akcijom agensa. Agens može biti racionalno izabran ili dizajniran korišćenjem sekvence peptida koji čine RG1 polipeptid. Na primer, racionalno izabran agens može da bude peptid čija je sekvenca amino kiselina identična fragmentu RG1 polipeptida.

Agensi testirani u metodama priloženog pronalaska mogu biti, na primer, peptidi, antitela, oligonukleotidi, mali molekuli i derivaii vitamina, isto kao i karbohidrati. Sposobni strušnjak može lako prepoznati da ne postoji granica strukturne prirode agenasa koji se koriste u prezentovanom metodu odabira. Jedna klasa agenasa priloženog pronalaska su peptidi čija je sekvenca amino kiselina odabrana na osnovu aminokiselinske sekvence RG1 polipeptida.

Peptidni agensi mogu se proizvesti korišćenjem standardnim metodirna sinteze peptida preko čvrste faze (ili faze rastvora), kao što je poznato. Nadaije, DNK koja kodira ove peptide može se sintetisati pomoću komercijalno raspoloživih instrumenata sinteze oligonukleotida i proizvoditi korišćenjem standardnih rekombinantnih sistema. Proizvodnja preko čvrste faze peptidne sinteze je neophodna ukoliko se uvode ne-genski kodirane amino kiseline.

Druga klasa agenasa priloženog pronalaska sa antitela koja su imunoreaktivna kod kritičnih pozicija RG1 polipeptida. Kao što je opisano, antitela se dobijaju imunizacijom pogodnog sisara sa peptidom koji ima antigenske regione, takve delove RGt polipeptida koje antitela napadaju Ovakvi agensi mogu se koristiti u studijama kompetitivnog vezivanja da bi se identifikovala druga generacija inhibitornih agenasa a i blokirala aktivnost RG1.

Ćelijski ekstrakti testirani u metodama priloženog pronalaska mogu biti, na primer, vodeni ekstrakti ćelija ili tkiva, organski ekstrakti ćelija ili tkiva ili delimično prečišćene ćelijske frakcije. Stručnjak če shvatiti da ne postoji granica izvora celijskih ekstrakata korišćenih u metodama priloženog pronalaska.

Agensi koji se vezuju za RG1 polipeptid, kao sto su RG1 antitela, mogu se koristiti za izmenu aktivnosti RG1, da bi se ciljali antikancerogeni agensi za pogodne ćelije sisara, ili identifikovali agensi koji blokiraju interakciju sa RG1. Ćelije koje vrše ekspresiju RG1 mogu se ciljati ili identifikovati korišćenjem agensa koji ih vezuje za RG1.

Kako če se koristiti agensi za vezivanje sa RG1 zavisi od prirode agensa koji se vezuje za RG1. Na primer agens koji se vezuje za RG1 može biti korišćen za to da: obezbeđuje konjugovane toksine, Kao što je toksin difterije, kolere, ricin ili pseudomonas egzotoksin, ćelijama koje imaju ekspresiju RG1; menjaju aktivnost RG1; direktno ubijaju ćeliju koja vrši ekspresiju RG1; ili u metodama procena identifikacije agenasa koji se kompetitivno vezuju Na primer, agens koji inhibira RG1 može se koristiti u direktnoj inhibiciii rasta ćelija koje vrše ekspresiju RG1 dok se agens koji se vezuje za RG1 koristi kao dijagnostički agens.

Farmakološki sastav i izdavanje

Priloženi pronalazak se odnosi na farmakološki sastav koji obuhvatarg1polinukleotide, RG1 polipeptide, antitela, agoniste, antagoniste ili inhibitore, same ili u kombinaciji sa najmanje jednim od drugih agenasa, kao što su stabilizujuće komponente, koji se mogu izdavati u bilo kojm sterilnom , biokompatibilnom farmakološkom nosiocu, koji uključuju ali nisu limitirani na, fiziološki rastvor, buferovani fiziološki rastvor, dekstrozu i vodu. Neki od ovih molekula mogu se davati pacijentu pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim agensima, lekovima ili hormonima, u fakmakološkim sastavima u kojima su izmešani sa nosačima ili farmakološki pogodnim prenosnicima. Ujedno oličenju priloženog pronalaska, farmakološki pogodan nosilac je farkamološki inertan.

Priloženi pronalazak se takođe odnosi i na izdavanje farmakoloških jedinjenja. Ovakvo izdavanje radi se oralno ili parenteralno. Metodi parenteralnog izdavanja uključuju površinsko, intra-anterijsko (direktno u tumor), intramuskulamo, potkožno, intramedularno, intratekalno, intraventikularno, intravensko, intraperitonalno ili intranazalno izdavanje. U dodatku aktivnih činilaca, ova farmakološka jedinjenja mogu da imaju pogodne farmakološki prihvatljive nosače koji obuhvataju nosače i pomoćna sredstva koja olakšavaju razlaganje aktivnih supstanci u preparaciji što se može farmakoioški iskoristiti. Dalji detalji tehnika za formulisanje i izdavanje mogu se naći u parlednjem izdanjuRemington- ove Pharmaceutical Sciences(Ed. Maack Publishing Co., Easton, Pa.).

Farmakološki sastav za oralnu primenu može se formulisati pomoću farmakološki prihvatljivih nosača dobro poznatih stručnim licima u količinama pogodnim za oralnu primenu. Ovakvi nosači omogućavaju framakološkim sastavima da budu formulisani kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, rastvori, suspenzije i slično, za uzimanje od strane pacijenta.

Farmakološka priprema za oralnu primenu može se ostvariti kombinacijom aktivnih komponenata sa čvrstim nosačima, rezultujuća smesa može se samleti, i napraviti mešavina granula, posle dodavanja pogodnih pomoćnih sredstava, ako se žele dobiti tablete ili dražeje. Pogodni nosači su karbohidrati ili proteinski punjači kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol, ili sorbitol; škrob iz kukuruza, pčenice, pirinča, krompira ili drugih biljaka; celulozni nosači kao što su metil, celuloza, hidroksipropilmetilceluloza, ili natrijum karboksimetilceluloza; i gume kao što su arabika i tragakant; i proteini kao što su želatin i kolagen. Ako se želi, mogu se dodati agensi za razlaganje ili razblaživanje, kao što su unakrsno vezani polivinil pirolidon, agar, algalne kiseline ili njihove soli, kao natrijum alginat.

Dražeje se dobijaju sa pogodnom prevlakom kao što su rastvori koncentrovanoh šećera, koji mogu sadržati gumirabiku, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilen glikoi, i/ili titanijum diokid, rastvori lakova, i pogodnih organskih rastvarača ili mešavine rastvarača. Boje ili pigmenti mogu se dodati prevlakama tableta ili dražeja za identifikaciju produkta ili za obeležavanje količine aktivne komponente, t.j. doze.

Farmakološki sastojci koji se mogu unositi oralno uključuju kapsule pravljene od želatina, isto kao i meke, zapečaćene kapsule pravljene od želatina i prevlake kao što je glicerol ili sorbitol. Takve kapsule mogu imati aktivne sastojke pomešane sa punjačem ili supstancom koja služi za vezivanje kao što je laktoza ili skrom, lubrikante kao što je talk ili magnezijum stearat, i po želji stabilizatore. U mekim kapsulama, aktivna komponenta može se rastvoriti ili pomešati sa pogodnim tečnostima. kao što su masna ulja, tečni parafin, ili tečni polietilen glikoi sa ili bez stabilizatora.

Farmakološka formulacija za parenteralno izdavanje uključuje vodene rastvore aktivnih komponenata. Kao inekcije, farmakološki sastav pronalaska može se formuiisati u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim buferima kao što je Harik-ov rastvor, Ringerov rasvor, ili fiziološki buferovan rastvor. Inekcija vodenih rastvora može da sadrži supstance koje povećavaju viskoznost rastvora, kao što je natrijum karboksimeti! celuloza, sorbitol ili dekstran. Nadalje, rastvori aktivnih supstanci mogu se napraviti u vidu pogodnih masnih suspenzija. Pogodni lipofilni rastvarač ili prenosilac uključuje masna ulja kao što je sezamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što je etil oleat ili trigliceridi, ili lipozomi. Po želji, rastvor može da ima pogodne stabilizatore ili agense koji poječavaju rastvorljivost sastojaka da bi se omogućila priprema jako koncenrtovanih rastvora.

Za površinsku ili nazalnu primenu, koriste se pogodni penetranti koji mogu da prođu kroz barijeru. Ovi penetranti opšte su poznati u struci

Kompleti

Pronalazak se dalje odnosi na farmakološka pakovanja i komplete koji obuhvataju jedan iii više sudova sa jednim ili više sastojaka već pomenutih jedinjenja pronalaska. U vezi sa ovim sudovima može biti i obaveštenje u formi koja je data od strane vladine agencije koja reguliše korišćenje ili prodaju lekova ili bioloških produkata, koja označava odobrenje agencije za pravljenje, korišćenje ili prodaju proizvoda za izdavanje pacijentima.

izrada i čuvanje

Farmakološki sastav priloženog pronalaska moze se izrađivati na način poznat u struci, t.j. mešanjem, rastvaranjem, granuliranjem, pravljenjem dražeja, pravljenjem praha, ernulizacijom, inkapsuliranjem, procesima hvatanja ili liofilizacije.

Farmakološki sastav može se dobiti u vidu soli i može se napraviti sa bilo kojom kiselinom, što uključuje, ali nije limitirano na, hidrohlornu, sulfurnu, sirćetnu, mlečnu, tartamu, maličnu, sucinsku, itd. Školi su bolje rastvorljive u vodenim ili prugim protonskim rastvaračima koji odgovaraju formama slobodnih baza. U drugim slučajevima, poželja priprema može biti liofilizovani prah u 1mM-50mM histidina, 0.1%-2% saharozi, 2%-7% manitolu sa pH vrednostima 4.5 do 5.5 što se kombinuje sa buferom pre korišćenja. Kada se pripreme farmakološka jedinjenja sa komponentama pronalaska i u prihvatljivom nosaču, ona se mogu staviti u pogodnie sudove i obeležlti za tretman indikovanog stanja. Za izdavanje RG1, ovakvo izdavanje ukljušuje količinu, učestalost i metod izdavanja.

Terapi jski efekti vne doze

Farmakološka jedinjenja pogodna za korišćenje u priloženom pronalasku obuhvataju jedinjenja u kojima se aktivni sastojci nalaze u efektivnoj količini da bi se postigao nameravani cilj, t.j. tretiralo naročito stanje bolesti okarakterisano ekspresijom RG1. Određivanje efektivne doze je u domenu stručnuh lica iz ove oblasti.

Za biio koji sastojak, terapeutski efektivna doza može se odrediti u početku ili analizom ćelijske kulture, t.j. neoplastičnim ćelijama, ili kod životinja, obično kod miševa, zečeva, pasa ili svinja. Životinje se takođe koriste da bi se odredile potrebne doze i načini izdavanja kod ljudi.

Terapeutski efektivne doze odnose se na onu količinu proteina ili njihovih antitela, antagonista ili inhibitora koji poboljšavaju simptome ili stanje. Terapijska efikasnost ili toksičnost ovakvih komponenata može se odrediti standardnim parmaceutskim procedurama u kulturi ćelija ili eksperimentalnim životinjama, t.j. ED5o(doze efektne kod 50% populacije) i LD50(doze letalne za 50% populacije). Odnos između terapijske i letalne doze je terapijski indeks, : on se izražava kao odnos ED50/ LD50. Farmaceutska jedinjenja koja pokazuju visok terapijski indeks su više cenjena. Rezultati dobijeni analizom ćelijskih kultura i životinjskih studija koriste se u formulisanju opsega doza za korišćenje kod ljudi. Doziranje ovakvih komponenti leži u opsegu cirkularnih koncentracija koje uključuju ED50sa malo ili bez toksičnosti. Doziranje varira u okviru ovog opsega u zavisnosti od primenjene doze, osetljivosti pacijenta i načina primene.

Tačna doza se bira od strane doktora u zavisnosti od pacijenta koji treba da se tretira Doziranje i prirnena se podešava da bi se dobio dovoljan nivo aktivne polovine ili da se održi željeni efekat. Dodatni faktori koji se mogu uzeti u obzir uključuju ozbiljnost bolesti, tj. veličinu tumora i mesto na kome je; težinu i pol pacijenta; način ishrane, vreme i učestalost primene, kombinaciju lekova, reakcije osetljivosti, i tolerancije/odgovora na terapiju. Dugo aktivna farmakološka jedinjenja mogu se primenjivati svaka 3 do 4 dana, svake nedelje, ili jednom na dve nedelje u zavisnosti od polu-života i brzine uklanjanja naročite formulacije.

Normalne doze variraju od 0.1 do 100,000 mikrograma, sve do doze od 1 g, u zavisnosti od načina primene. Uputstvo za doziranje i način primene može se naći u literaturi. Videt: U.S. Pat. Nos. 4,657,760; 5,206,344; ili 5,225,212. Stručna lica će upotrebiti različite formulacije za polinukleotide i za proteine ili njihove inhibitore. Slično tome, dopremanje polinukleotida ili polipeptida biće specifično u zavisnosti od ćelija, uslova, mašta, itd.

Priloženi pronalazak opisan je dalje primerima koji slede. Primeri su dodati samo da bi ilustrovali pronalazak po referenci na specifična oličenja. Ova objašnjenja, dok ilustruju neke specifične aspekte pronalaska, ne oslikavaju granice niti definišu doseg priloženog pronalaska.

Svi primeri su rađeni standardnim tehnikama, koje su stručnim licima dobro poznati, ukoliko nije drugačije detaljno opisano. Rutinske tehnike molekularne biologije u sledećim primerima mogu se raditi kao šti je opisano u standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što je Sambrook i sar.,Molecular Cloning: A Laborator/Manuai,2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboraton/Press. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Primer 1: Identifikacija humanihrg1polinukleotida

Rg1je identifikovan kao gen koji se ekspresuje u prostati u incvte LifeSeg bazi podataka. Nukleoiidna sekvenca određena je pretraživanjem baze podataka, pomoću 'Protein Function' koja je dobijena od lncyte-a u cilju pretraživanja baze podataka. Nukieotidna sekvenca nađena je u kategoriji molekula za adheziju ćelija u daioj bazi podataka i opisana je kaohomolog f-spondina. Elektronska Northern analiza rasporedarg1polinukleotidnih sekvenci u setu biblioteka u bazi podataka otkrila je visok nivo ekspresijerg1u bibliotekama prostate i niži nivo u bibliotekama drugih tkiva, uključujući normalna i tkiva tumora.

Posle spajanja setarg1klonova u bazi podataka u veliku polinukleotidnu sekvencu. i njenog uređivanja, identifikovana je cela kodirajuća sekvenca u predviđenom sastavljenom polinukleotida. Ova sekvenca kodira protein koji je homolog f-spondinu i Mindin-2

Incyte klonovi 1640796, 1712252, i 1880265 dobijeni su od lncyte-a za eksperimente i kod klona 3360733 je utvrđeno da ima najviše 5' nukleotidnih sekvenci. Ovaj klon je ceo sekvenciran i sadrži celu sekvencu za kodiranje predviđenog RG1 proteina. Ova sekvenca je prikazana na Slici 1 (SEQ NO ID:1).

Primer 2: Ekspresija Rg1 mRNK

EkspresijarglmRNK u raznim uzorcima normalnog i tumorskog tkiva i u ćelijskim linijama , određena je semi-kvantitativnom PCR tehnikom koristeći Taqman analizu, (Perkin-EImer). Uzorci normalnih, benignih i tumorskih tkiva prostate koja su razvrstavana po modif'kovanom Gieason sistemu dobijena su iz Urološkog odeljenja Stanford Medicinskog Univerziteta RNK je izolovana iz njih standardnim procedurama.RNK iz drugih tumora i normalnih tkiva nabavljena je iz komercijalnih izvora, uključujući Clonetech i Biochain.Ćelijske linije tumora prostate, (PC-3, LNCaP i DU145=, đobijene su od strane American Type Culture Collection i propagirane u kulturi standardnim metodima korišćenjem podloge sa serumom. Ksenograf tumori dobijeni iz ovakvih ćelijskih linija su ubačeni u golog miša i sakupljeni iz miša oko 4-6 nedelja poale implantacije. RNK je izolovana iz tumora standardnim procedurama.

PCR analiza bazirana na Taqman-u rađena je na prajmerima : CGC GCA TAG CTG CGA CTA C (SEQ iD NO: 3) i GCC GCG TCC GCA AAG (SEQ ID NO: 4) i Taqman probi. 6-FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra (SEQ ID NO. 5).

Ovi prajmeri i probe dizajnirani su korišćenjem Perkin Elmer Primer Express softvera i sintetisani sa Svnthetic Genetics. PCR reakcije vrše se 30-40 ciklusa i kvantifikovana su pomoćurg1mRNK da se dobije standardna kriva za upoređivanje. Ove analize pokazuju da jerg1mRNK otkriven u velikoj učestalosti u proatati i u značajno manjim količinama u nekoliko drugih tkiva (videti Sliku 5).

Primer 3: Kloniranje i ekspresija RG1 u BHK ćelijama

RG1 kodirajući region dobijen je iz lncyte plazmida 3360733. Kodirajuće sekvenca umnožena je PCR-om sa prajmerima SST115 (5'-TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCCAGCCCGGC-3') (SEQ ID NO: 6) i SST113 (5'-AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGACG-3') (SEQ ID NO: 7) u standardnoj PCR reakciji (100 uL) pomoću 1 x Pfu turbo polimeraznog pufera (Stratgene, La Jolla, CA) / 200 uM dTNPs/0,2 pM oligonukleotidni prajmeri/2,5 Pfu Turbo polimeraza (Stratgene). Uslovi za umnožavanje PCR-om bili su sledeći: 3 min na 95°C, 30 sec na 60°C, 2 min na

72°C) x 35, 72°C za 7 min. Rezultujući produkt umnožen PCR-om pročišćen je korišćenjem QIAquick PCR kolone (Qiagen, Valencija, CA) i razlaganjem sa Xbal i Pmll restrikcionim enzimima do fragmenta od 1010 bp koji je pročišćen iz 1% agaroznog gela korišćenjem BIO 101 GeneCIean pribora (Vista, CA). Prečišćeni fragment povezan je (korišćenjem Epicientre Fast Link pribora, Epicenter, Madison, Wl) sa necitopatskim Sindbis ekspresionim vektorom pSINrep21 (Agapov i sar., 1998, PNAS 95: 12989-12994), razložen sa Xbal i Pmill, i transformisan u DHP alfa kompetentne ćelije (Life Technologies, Gaitheresburg, CA) i selektovane na LB aganim pločama sa ampicilinom (100 pg/mL). Jedna ovakva kolonija otporna na ampicilin rasla je na LB podlozi sa ampicilinom i sekvencijalnom analizom je pokazano da ima ubačene sekvence za kodiranje RG1. Ovaj plazmid dobio je ime pPEG6.

Dva mikrograma pPEG6 korišćeno je za transfekciju 1-3 x 105 ćelija bubrega govečeta i hrčka (BHA) korišćenjem Lipofktamin Plus reagensa (Life Technologies, Gaithersburg, MD) po instrukcijama proizvođača. Posle transfekcije, ćelije su inkubirane u DMEM plus krvnom serumu fetusa 24-48 sati, i za to vreme ćelije su se delile 1 na 10 i započeta je selekcija ćelija koje imaju plazmid dodavanjem puromicina (2,5 pg/mL u finalnoj koncentraciji) i seruma sa DMEM. Pošto su ćelije izmešane (4-5 dana posle dodavanja puromicina) ispirane su sa PBS, deljene 1 na 10, i dodavana je DMEM podloga sa serumom i 5 ug/mL puromicinom. Posle sledećih 2-3 dana, podloga je promenjena sa DMEM i 5 pg/mL puromicina bez seruma, ćelije su rasle 2.3 dana i prisustvo RG1 proteina je detektovano u podlozi VVestern analizom korišćenjem RG1 antitela. RG1 protein detektovan je na nivou 1 ug/mi.

Primer 4: Stvaranje antitela

Poliklonalni antiserumi zeca pravljeni su na osnovu pet sekvenci veštačkih polipeptida koji su dobijeni iz RG1 sekvence proteina. Ove sekvence izabrane su zbog njihovog predpostavljenog mesta na površini proteina, u cilju generisanja antiseruma koji će najverovatnije da prepoznaju površinske epitope. Ostaci cisterna zamenjeni su aminobutričnom kiselinom (Abu) da pospeše sintezu. Specifične sekvence amino kiselina, mesta na RG1 proteinu i ciljna mesta za pet peptida izlistana su ispod.

Peptidi su kovalentno vezani sa hemocijamnom (KLH), preko dodatnog cisteina na karboksil kraju, da bi se koristile kao imunogen. Slično tome, pripremljen je konjugat serum albumin govečeta (BSA) za analizu titra antiseruma preko ELISA testa.

Dve životinje su imunizirane sa svakim peptidom. inicijalna imunizacija je pravljena sa komplentim Freund pomoćnim sredstvom (0.5 mg/životinja), što je praćeno

ponavljanjem u intervalima od tri nedelje sa 0.25 mg/životinji u nekompletnom Freund pomoćnom sredstvu primenjenom intramuskularno. Periodično su uzimani testovi krvi i meren je titar antitela na specifične BSA- peptidne konjugate pomoću ELISA testa i to je zatim upoređivano sa preimunim serumima. Pokazani je da su antiserumi na C1

i C3 peptide aktivni. Antiserumi na C2 nisu pokazivali da prepoznaju RG1 polipeptid. Antiserumi na 4C i 5C nisu testirani.

Humana monoklonalna anitela na RG1 su generisana preko imuniziranih transgenih miševa na RG1 peptide i 6-histidinom-obeležen RG1 fuzioni protein ekspresovan je uE. coli.Splenociti ovih životinja spajani su s mijeloma ćelijama da se naprave hibridoma ćelije. Dobijene hibridoma ćelije su pretraživane ELISA testom na one koje proizvode antitela na RG1 peptide i proteine.

Primer 5: VVestern blct analiza antitela

Antiserumi su testirani na specifičnost prema RG1 preko VVestern blotting. RG1 specifični antiserumi (oni napravljeni na osnovu sekvenci 1C i 3C) testirani su na prolaznu ekspresiju RG1 u COS ćelijama, prirodnog RG1 iz LNCaP ćelija i RG1 proizvedenom u transficiranim ćelijama bubrega bebe hamstera (BHK). RG1-specifični antiserumi daije su testirani na iizate pripravljene iz: LNCaP tumora, LNCap ćeiija, PC3 tumora, PC3 ćelija i nekoliko klunučkih uzoraka iz tumora prostate čoveka. Ćelije i tkiva razlagana su u deterdžentnom buferu. Posle vrenja od 5 min, 10f.il svakog lizata pakovano je na 12% SDS-poiiakrilamidni gel da razlaže proteine. Izdvojeni proteini dalje su prenošeni na nitrocelulozne membrane. Specifičnost na vezivanje RG1 antitela potvrđena je vezivanjem u prisustvu homologih i heterologih peptida. RG1-specifični antiserumi mogu detektovanti protein u svim uzorcima osim kod PC-3 ćelija i PC-3 tumora.

Primer 6. Prečišćavanje prirodnog RG1 proteina iz LNCaP ćelija

VVestern blot analizom pokazano je da u kulturi LNCaP ćelija dolazi do sekrecije prirodnog RG1 proteina. U ciljuda se pročisti prirodni protein, ćelije su 48 sati rasle u podlozi bez seruma. Sa ove podloge ćelije su sakupljene i centrifugirane, i koncentrovane oko pedeset puta ultrefiltracijom. Koncentrovana poldoga je 10 puta razblažena sa 20 mM natrijum acetatnim buferom, pH 6.5 i natovaren na Q-Sefaroznu anjon izmenjivačku kolonu. U koloni je bio i natrijum hloridni gradijent (0.5% po min) i hvata frakcije 2.0 ml. Rgl protein elitira na oko 75mM NaCI kao što jr pokazano sa VVestern blot i SDS PAGE. Prirodni RG1 protein ide na malo nižoj molekulskoj težini u odnosu na 6 histidin-RG1 fuzioni protein koji se ekspresuje u bakterijama, verovatno zato što nema fuzione peptide.

Primer 7: Imunohistihemijsko bojenje ekspresije RG1

Ekspresija RG1 proteina određena je, po LifeSpan Biosciencess, Inc. u različitim tkivima, humanom, uključujući bubreg, pluća, pankreas, mišiće, mozak i prostatu. Dodatna tkiva prostate dobijena su od Urološkog Odeljenja Univerziteta iz Stranford-a i testirana su na Berlex. Isečci tkiva su đeparafinisani po standardnim metodama. Polikolnalno antitelo RG1-3C korišćeno je kao primarno antitelo i sastem za detekciju koji obuhvata Vektor A3C-AP kit (AK5002) sa Vektorom crvenog sustratnog kita (Sk5002). Kao negativna kontrola, bojenje je vršeno kada nema primarnog antitela.

* »r* *

Sve publikacije i patenti o kojima se govorilo u predhodnom tekstu ovde su inkorporisani po referenci. Dok je priloženi pronalazak opisivan sa referancom na njegovo specifično oličenje, stručnjaci treba da razumeju da se mogu napraviti razlilite promene i ekvivalenti se mogu substituisati bez narušavanja osnovnog duha i svrhe. Nadalje, mnoge modifikacije se mogu napraviti da bi se adaptirale na određenu situaciju , materijal, sastav materije, preradu, korak po korak u preradi, u odnosu na cilj, duh i svrhu priloženog pronalaska. Za sve ovakve modifikacije nameravano je da budu u okviru svrhe zahteva dodatih ovome.

Claims (13)

1. Izolovano antitelo ili fragment antitela koji se specifično vezuju za RG1 polipeptid iz SEQ ID NO: 2,naznačeni time,što je polipeptid odabran od grupe koja se sastoji od: (a) polipeptida koji se sastoji od amino kiseline 28 do amino kiseline 46 kako je to dato na Slici 2 (SEQ ID NO: 2); i (b) polipeptida koji se sastoji od amino kiseline 28 do amino kiseline 46 i amino kiseline 77 do amino kiseline 91 kako je to dato na Slici 2 (SEQ ID NO: 2).

2. Antitelo prema Zahtevu 1,naznačeno time,što se antitelo specifično vezuje za sekvencu amino kiseline PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO: 8).

3. Antitelo prema Zahtevu 1,naznačeno time,što se antitelo specifično vezuje za sekvencu amino kiseline HSSDYSMWRKNQYVS (SEQ ID NO: 10).

4. Antitelo prema Zahtevu 1,naznačeno time,što je antitelo poliklonalno antitelo.

5. Antitelo prema Zahtevu 1,naznačeno time,što je antitelo monoklonalno antitelo.

6. Imunokonjugat koji sadrži izolovano antitelo, ili fragment antitela, koji se specifično vezuju za RG1 polipeptid iz SEQ ID NO: 2,naznačen time,što je odabran od grupe koja se sastoji od: a) polipeptida koji se sastoji od amino kiseline 28 do amino kiseline 46 kako je to dato na Slici 2 (SEQ ID NO: 2); i b) polipeptida koji se sastoji odi amino kiseline 28 do amino kiseline 46 i amino kiseline 77 do amino kiseline 91 kako je to dato na Slici 2 (SEQ ID NO: 2).

7. Imunokonjugat prema Zahtevu 6,naznačen time,što je terapeutski agens citotoksični agens.

8. Imunokonjugat prema Zahtevu 7,naznačen time,što je citotoksični agens odabran od gurpe koja sadrži ricin, doksorubicin, daunorubicin, taksol, etidijum bromid, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, dihidroksi antracin dion, aktinomicin D, difterija toksin,Pseudomonaseksotoksin (PE) A, PE40, ricin, abrin, glukokortikoid i radioizotope.

9. Imunokonjugat prema Zahtevu 6,naznačen time,što su fragmenti antitela odabrani od grupe koja se sastoji od Fv, F(ab') i F(ab')2fragmenata.

10. Upotreba imunokonjugata koji sadrži terapeutski agens i izolovano antitelo, ili fragment antitela,naznačena time,što se navedeno izolovano antitelo, ili fragment antitela, specifično vezuju za RG1 polipeptid iz SEQ ID NO: 2 odabranog od grupe koja se sastoji od: a) polipeptida koji se sastoji od amino kiseline 28 do amino kiseline 46 kako je to dato u SEQ ID NO: 2; b) polipeptida koji se sastoji odi amino kiseline 77 do amino kiseline 91 kako je to dato u SEQ ID NO: 2. za proizvodnju medikamenta za tretiranje kancera prostate povezanog sa RG1 ekspresijom.

11. Upotreba imunokonjugata prema Zahtevu 6 za proizvodnju kompozicije za selektivno uništavanje ćelije koja ekspresuje RG1 polipeptid iz SEQ ID NO:2 reagovanjem imunokonjugata sa ćelijom tako da terapeutsko sredstvo imunokonjugata može da uništi ćeliju.

12. Antitelo prema Zahtevima 1,2,3,4 ili 5,naznačeno time,što služi za upotrebu kao medikament.

13. Imunokonjugat prema Zahtevima 6, 7, 8 ili 9,naznačen time,što služi za upotrebu kao medikament.