RS51237B - Trombopoietska jedinjenja - Google Patents

Description

Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenja, naročito peptide i polipeptide koji imaju trombopoietsku aktivnost. Jedinjenja ovog pronalaska se mogu koristiti za povećanje stvaranja trombocita ili prekursora trombocita (npr. megakariocita) kod sisara.

Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenja, naročito peptide, koji imaju svojstvo da stimulišuin vitroiin vivostvaranje trombocita i njihovih prekursorskih ćelija, kao što su megakariociti. Pre razmatranja prirode jedinjenja ovog pronalaska, daje se ono što sledi kao osnova u pogledu dva proteina koji imaju trombopoietsku aktivnost, a to su: trombopoietin (TPO) i faktor rasta i razvoja megakariocita (MGDF).

Kloniranje endogenog trombopoietina (TPO) (Lok et al.,Nature,1994, 369, 568-571; Bartley et al.,Cell,1994, 77, 1117.1124; Kuter et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA1994, 9_1, 11104-11108; de Sauvage et al.,Nature,1994, 369, ,533-538; Kako et al.,Journal of Biochemistry,1995, 119, 229-236; Chang et al.,Journal of Biological Chemistry,1995, 270, 511-514) brzo je povećalo naše razumevanje megakariopoieze (proizvodnje megakariocita) i trombopoieze (proizvodnje trombocita).

Endogeni humani TPO je glikozilovani protein od 60 do 70 kDa, primarno nastaje u jetri i bubrezima, i sastoji se od 332 aminokiseline (Bartlev et al.Cell,1994, 77, 1117-1124; Hang et al.Journal of Biological Chemistry,1995, 270, 511-514). Ovaj protein je visoko zaštićen među različitim vrstama i 23% je homologan sa humanim eritropoietinom (Gurnev et al.Blood,1995, 85, 981-988) na amino terminusu (aminokiseline 1 do 172)(Bartley et al.,Cell,1994, 77, 1117-1124). Pokazano je da endogeni TPO poseduje sve karakteristike ključnog biološkog regulatora trombopoieze. Njegova delovanjain vitrosu specifična indukcija kolonija megakariocita i iz prečišćenih hematopoietičkih prekursorskih ćelija murida (Zeigler et al.Blood,1994, 84. 4045-4052) i iz humanih ćelija CD34<+>(Lok et al.Nature,1994, 369, 568-571; Rasko et al.,Stem Cells,1997, 15, 33-42), zatim generisanje megakariocita sa povećanim brojem ploida (Broudy et al.Blood,1995, 85, 402-413) i indukovanje sazrevanja terminalnog megakariocita i proizvodnja trombocita (Zeigler et al.,Blood,19914, 84, 4945-4052; Choi et al.,Blood,1995, 85, 402-413). Nasuprot tome, sinetski antisensni oligodeoksinukleotidi na receptoru TPO (c-MpI) značajno inhibiraju svojstvo stvaranja kolonija progenitora megakariocita (Methia et al.Blood,1993, 82, 1395-1401). Pored toga, miševi šokirani sa c-MpI su ozbiljno trombocitopenični i deficitarni u megakariocitima (Alexander et al.,Blood,1996, 87, 2162-2170).

Rekombinantni humani MGDF (rHuMGDF, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) je sledeći trombopoietički polipeptid povezan sa TPO. On se proizvodi upotrebomE. colitransformisane sa plazmidom koji sadrži cDNA koji kodira skraćeni protein, koji obuhvata domen amino-terminala koji se vezuje za receptor humanog TPO (Ulich et al.Blood,1995, 86, 971-976). Polipetid se ekstrahuje, preoblikuje i prečisti, a poli[etilenglikol] (PEG) ostatak se kovalentno spoji sa amino terminusom. Dobijeni molekul se ovde navodi kao PEG-r-HuMGDF, ili skraćeno MGDF.

Razna izučavanja koja koriste modele životinja (Ulich, T.R. et al.,Blood,1995, 86, 971-976; Hokom, M.M. et al.,Blood,1995, 86, 4486-4492) su jasno pokazala terapeutsku efikasnost TPO i MGDF prilikom transplantacije koštane srži i prilikom tretmana trombocitopenije, stanja koje je često posledica hemoterapije ili radiološke terapije. Preliminarni podaci na humanim bićima su potvrdili korisnost MGDF prilikom povišavanja broja trombocita u raznim situacijama (Basser et al.,Lancet,1996, 348, 1279-81; Karo et al.,Journal of Biochemistry,1995, 119, 229.236; Ulich et al.,Blood1995, 86, 971-976). MGDF se može koristiti za poboljšanje procesa davanja trombocita, pošto ordiniranje MGDF povećava broj cirkulatornih trombocita za oko tri četvrtine od originalne vrednosti kod zdravih donora trombocita.

Dejstvo TPO i MGDF se ispoljava kroz vezivanje za c-MpI receptor koji se eksprimuje primarno na površini nekih hematopoietičkih ćelija, kao što su megakariociti, trombociti, CD34<+>ćelije i primitivne prekursorske ćelije (Debili, N. et al.,Blood1994, 85, 391-401; de Sauvage, F.J. et al.,Nature1994, 369, 533-538; Bartlev, D.T. et al.,Cell 1994,77, 1117-1124; Lok, S. et al.,Nature1994, 369.565-8). Kao i većina receptora za interleukine i proteinske hormone, c-MpI pripada klasi superfamilije receptora citokina I (Vigon, I. et al.,Proc. Natl. Avad-Sci. USA1992, 89, 5640-5644). Aktivacija ove klase receptora se sastoji u homodimerizaciji receptora indukovanoj vezivanjem liganda, koja za uzvrat pokreće kaskadu događaja transdukcije signala.

Obično se interakcija proteinskog liganda sa receptorom često obavlja na relativno velikoj granici dodira faza. Međutim, kao što je pokazano u slučaju vezivanja humanog hormona rasta za njegov receptor, samo nekoliko ostataka na granici dodira faza stvarno doprinose glavnini energije vezivanja (Clakson, T. et al.,Science1995, 267, 383-386). Ovo i činjenica da preostala masa proteinskog liganda služi samo da pokaže epitope za vezivanje u pravoj topologiji, omogućava da se nađu aktivni ligandi mnogo manje veličine.

U stremljenju ka ovome, biblioteka peptida faga predstavlja sistem koji je poslužio kao moćna tehnika pri identifikaciji malih peptidnih imitacija velikih proteinskih liganada (Scott, J.K. et al.,Science1990, 249, 386; Devlin, J.J. et al.,Science1990, 249, 404). Korišćenjem ove tehnike, otkriveni su mali peptidni molekuli koji deluju kao agonisti c-MpI receptora (Cwirla, S.E. et al.,Science

1997,276, 1696-1699).

U jednom takvom ispitivanju, prosečne sekvencije malog peptida služile su kao spojnice za prekrivanje proteina vlaknaste fage, pa su ispirane na bazi afiniteta nasuprot vanćelijskom domenu imobilizovanog antitela c-MpI, a preostale fage su bile obogaćene za drugu rundu prečišćavanja na bazi afiniteta. Ovakva selekcija vezivanja i proces repropagacije si više puta ponovljeni kako bi se obogatio skup čvršćih veziva. Kao rezultat toga, prvo su identifikovane dve familije peptida koji se vezuju za c-MpI, koje po sekvencijama nisu srodne jedna drugoj. Zatim su kreirane biblioteke mutageneze da bi se dalje optimizirala najbolja veziva, što je konačno dovelo do izolovanja vrlo aktivnog peptida sa IC50= 2 nM i sa EC50= 400 nM (Cwirla, S.E. et al.,Science1997, 276, 1696-1699). Ovaj peptid sa 14 ostataka, označen kao TMP (umestro TPO mimetički peptid) nema jasnu homologiju sekvencije sa TPO ili MGDF. Struktura ovog TMP jedinjenja je kao što sledi: lle Gly Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala SEQ ID NO: 1 ili

IEGPTLRQWLAARA

koristeći skraćenice aminokiselina sa jednim slovom.

Ranije, u sličnoj studiji na EPO mimetičkim peptidima, otkriven je EPO mimetički peptid (EMP) korišćenjem iste tehnike (VVrighton, N.C. et al.Science1996, 273. 458.463) i pronađeno je da deluje kao dimer pri vezivanju za EPO receptor (EPOR). Tako nastali kompleks (ligand)2/(receptor)2ima C2 simetriju, prema kristalografskim podacima X-zraka (Livnah, O. et al.,Science1996, 273, 464-471). Na bazi ove strukturne informacije, projektovan je kovalentno vezani dimer EMP u kome su povezani C-terminusi dva EMP monomera preko fleksibilnog distancera, za koga je nađeno da ima znatno poboljšano vezivanje kao i bioaktivnostin vitro/ in vivo(VVrighton, N.C. et al.,Nature Biotechnology1997, 15. 1261-1265).

Slična strategija dimerizacije na C-terminusu je primenjena i na TPO mimetički peptid (TMP) (Cwirla, E.E. et al.,Science1997, 276, 1696-1699). Nađeno je da dimer vezan preko C-terminusa (C-C-veza) u TMP ima poboljšan afinitet vezivanja od 0,5 nM i primetno povećanu aktivnostin vitro(EC50= 0,1 nM) u testovima proliferacije ćelija (Cwirla, S.E. et al.,Science1997, 276, 1696-1699). Struktura ovog C-C dimera je pokazana niže:

U sledećem aspektu ovog pronalaska tandemski dimeri se mogu pripojiti uz jedan ili više ostataka koji se izvode iz imunoglobulinskih proteina, koji se obično navode kao Fc region u tim imunolglobulinima. Dobijena jedinjenja se navode kao Fc spojnice TMP tandemskih dimera.

Sledi kratak pregled koji se odnosi na Fc regione antitela koji su korisni u vezi sa nekim od jedinjenja iz ovog pronalaska.

Antitela sadrže dva funkcionalno različita dela, varijabilni domen, poznat kao "Fab" koji vezuje antigen, i konstantni domen, poznat kao "Fc" koji daje vezu sa efektorskim funkcijama, kao što je komplementarna fiksacija ili fagocitoza. Fc deo imunoglobulina ima dug poluživot u plazmi, a Fab je kratkoživeći (Capon, et al.,Nature1989, 337, 525-531).

Proizvodi terapeutskih proteina su konstruisani korišćenjem Fc domena u pokušaju dobijanja dužeg poluživota ili ugrađivanja funkcija, kao što je vezivanje

Fc receptora, vezivanje proteina A, komplementarna fiksacija i placentni transfer, a sve to je prisutno u Fc regionu imunoglobulina (Capon et al.,Nature1989, 337, 525-531). Na primer, Fc region antitela lgG1 je pripojen uz CD30-L, molekul koji vezuje receptore CD30, koji se eksprimiraju na ćelijama tumora Hodgin-ove bolesti, ćelijama anaplastnog limfoma, ćelijama leukemije T-ćelija i drugim malignim tipovima ćelija. Videti, U.S. Patent No. 5,480,981. Anti-inflamatorno i sredstvo protiv odbacivanja IL-10 je pripojeno na Fcy2a murida da bi se produžil kratak poluživot cirkulisanja citokina (Zheng, X. et al.,The Journal of lmmunology1995, 154, 5590-5600). U studijama je takođe vrednovana upotreba receptora faktora nekroze tumora, povezanog sa Fc proteinom humanog lgG1, za tretiranje pacijenata sa septičkim šokom (Fisher, C. et al.,N. Eng. J. Med.,1996, 334, 1697-1702; Van Zee, K. et al.,The Journal of lmmunology1996, 156, 2221-2230). Fc je takođe pripojen receptom CD4 u proizvodnji terapeutskog proteina za tretman AIDS. Videti, Capon et al.,Nature1989, 337, 525-531. Pored toga, interleukin 2 je pripojen na deo Fc lgG1 ili lgG3 da bi se prevazišao kratak poluživot interleukina 2 i njegova sistemska toksičnost. Videti, Harvill et al.,lmmunotechnology1995,1, 95-105.

Uprkos pristupačnosti TPO i MGDF, ostaje potreba za dobijanjem i drugih jedinjenja koja imaju biološku aktivnost stimulacije proizvodnje trombocita (trombopoetska aktivnost) i/ili prekursorskih ćelija trombocita, naročito megakariocita (megakariopoetska aktivnost). Predmetni pronalazak daje nova jedinjenja koja imaju takvu aktivnost, odnosno aktivnosti i srodne aspekte.

Opis pronalaska

Predmetni pronalazak daje grupu jedinjenja koja su u stanju da se vezuju i da startuju signal kroz membranu, tj. da aktiviraju c-MPI receptor, isti receptor koji posreduje u aktiviranju endogenog trombopoietina (TPO). Dakle, jedinjenja iz ovog pronalaska imaju trombopoetsku aktivnost, tj. svojstvo da stimulišu,in vivoiin vitro,stvaranje trombocita i/ili megakariocitopoetsku aktivnost, tj. svojstvo da stimulišu,in vivoiin vitro,stvaranje prekursora trombocita.

U prvoj poželjnoj realizaciji, jedinjenja ovog pronalaska sadrže sledeću opštu strukturu: gde se TMPii TMP2svaki nezavisno, biraju iz grupe jedinjenja koja poseduju središnu strukturu:

gde su:

X2se bira iz grupe koju čine Glu, Asp, Lys i Val;

X3se bira iz grupe koju čine Gly i Ala;

X4je Pro;

X5se bira iz grupe koju čine Thr i Ser;

X6se bira iz grupe koju čine Leu, Me, Val, Ala i Phe;

X7se bira iz grupe koju čine Arg i Lys;

X8se bira iz grupe koju čine Gln, Asn i Glu;

X9se bira iz grupe koju čine Trp, Tyr, Cys, Ala i Phe;

X-io se bira iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys;

Li je linker, koji je opisan u nastavku; i

n je 0 ili 1,

i njihove fiziološki prihvatljive soli.

U jednoj realizaciji U sadrži (Gly)n, gde je n 1 do 20, a kada je n veće od 1, do polovine Gly ostataka može biti supstituisano drugom aminokiselinom koja se bira između preostalih 19 prirodnih aminokiselina ili njihovih stereoizomera.

Pored gore pomenute strukture jezgra X2-Xi0za TMPii TMP2, moguće su takođe i druge srodne strukture, gde je jedna ili više od onih koje slede dodata središnoj strukturi TMP2i/ili TMP2: Xije vezan za N-terminus i ili su Xn, Xi2, X13i/ili X14vezani za C-terminus, pri čemu su Xi, Xn, Xi2 Xi3i X14kao što sledi: Xise bira iz grupe koju čine Ile, Ala, Val, Leu, Ser i Arg;

Xnse bira iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His i Glu; X12se bira iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser i Gln;

Xi3se bira iz grupe koju čine Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln i Gly; i

X-|4 se bira iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu i Gly.

U drugoj poželjnoj realizaciji jedinjenja ovog pronalaska imaju opštu formulu:

(Fc)m-(L2)q-TMP1-(L1)n-TMP2-(L3)r(Fc)p

gse su TMPl TMP2i n opisani gore; Li, L2i L3su linkerske grupe koje se nezavisno biraju između linkerskih grupa koje su ovde opisane; Fc je Fc region imunoglobulina (definisan u nastavku); m, p, q i r se, svaki nezavisno, biraju iz grupe koju čine 0 i 1, pri čemu je najmanje jedan između m i p jednak 1, zatim ukoliko je m 0, tada je i q 0 i ukoliko je p 0, tada je i r 0; i njihove fiziološki prihvatljive soli. U jednoj realizaciji L1tL2 i L3se nezavisno sastoje od (Gly)n, gde je n 1 do 20, a kada je n veće od 1, do polovine Gly ostataka može biti supstituisano sa drugom aminokiselinom koja se bira između preostalih 19 prirodnih aminokiselina ili njihovih steroizomera.

Ovim pronlaskom su takođe obuhvaćeni derivati gornjih jedinjenja (opisani niže).

Poželjno je da su jedinjenja ovog pronalaska peptidi, a oni se mogu dobiti standardnim metodama sinteze ili bilo kojim drugim metodama dobijanja peptida. Jedinjenja ovog pronalaska koja sadrže ne-peptidne delove mogu se sintetizovati standardnim reakcijama organske hernije, pored standardnih reakcija hernije peptida, kako je već podesno.

Jedinjenja ovog pronalaska se mogu koristiti u terapeutske i profilaktičke svrhe tako što se ugrađuju u odgovarajuće materijale farmaceutskih nosača i ordiniraju u efikasnim količinama subjektu, kao što je humano biće (ili neki drugi sisar). Ostali srodni aspekti su takođe uključenju predmetni pronalazak.

Kratak opis slika

Brojni drugi aspekti i pogodnosti ovog pronalaska biće jasni nakon razmatranja sledećeg njihovog detaljnog opisa i pozivanja na crteže, gde su: Slika 1 pokazuje uzorak Fc polinukleotidne i proteinske sekvencije (SEQ ID No: 3 je kodirano vlakno koje se čita 5'-3', SEQ ID NO: 4 je komplementarno vlakno koje se čita 3'-5'; i SEQ ID NO: 5 je kodirana sekvencija aminokiselina) humanog lgG1, koji seu ovom pronalasku može koristiti u Fc jedinjenjima za spajanje. Slika 2 pokazuje shemu sinteze dobijanje pegilovanog peptida 19 (SEQ ID NO:17).

Slika 3 pokazuje shemu sinteze za dobijanje pegilovanog peptida 20 (SEQ ID NO: 18).

Slika 4 pokazuje broj trombocita generisanin vivou normalnim ženkama miševa BDF1, tretiranim sa jednom bolus injekcijom od 100 ug/kg različitih jeidnjenja, kao što sledi: PEG-MGDF označava PEG prosečne molekulske težine od 20 kD, vezan za N-terminalnu amino grupu reduktivnom aminacijom aminokiselina 1-163 u urođenoj humanoj TPO koja se eksprimira uE. Coli(tako da nije glikozilovana) (videti WO 95/26746, pod naslovom "Compositions and Methods for Stimulating Megakarryocyte Grovvth and Differentiation"); TMP označava jedinjenje SEQ ID NO:1; TMP-TMP označava jedinjenje SEQ ID NO: 21; PEG-TMP-TMP označava jedinjenje SEQ ID NO: 18, gde je PEG, grupa PEG prosečne molekulske težine 5 kD, vezana kao što je pokazano na Slici 3; TMP-TMP-Fc je definisano niže, i Fc-TMP-TMP je isto kao i TMP-TMO-Fc, izuzev što je Fc grupa vezana sa kraja N-terminala, umesto s kraja C-terminala TMP-TMP-peptida.

Slika 5 pokazuje broj trombocita generisanihin vivou normalnim miševima BDF1 koji su tretirani sa različitim jedinjenjima oslobođenim kroz implantiranu osmotsku pumpu, tokom 7-mo dnevnog perioda. Jedinjenja su definisana na isti način kao što je izneto gore, za Sliku 4.

Slike 6A, 6B i 6C pokazuju shematske dijagrame poželjnih jedinjenja ovog pronalaska. Slika 6A pokazuje jedinjenje spojeno sa Fc, u kome je Fc ostatak pripojen na N-terminus TMP dimera i gde je Fc deo u monomernom obliku (jedan lanac). Slika 6B pokazuje jedinjenje spojeno sa FC, u kome je Fc region pripojen na N-terminus TMP dimera, gde je Fc deo dimeran, a jedan Fc monomer je vezan za TMP dimer. Slika 6C pokazuje jedinjenje spojeno sa Fc, u kome je Fc ostatak pripojen na N-terminus TMP dimera, gde je Fc deo dimeran, a svaki Fc monomer je vezan sa TMP dimer.

Detaljan opis pronalaska

U nastojanju da se pronađu male strukture kao vodeća jedinjenja u razvoju terapeutskih agenasa sa poželjnijim svojstvima, konstruisani su različiti tipovi dimera TMP i srodnih struktura u kojima je C-terminus jednog TMP peptida vezan za N-terminus drugog TMP peptida, bilo direktno ili preko linkera, pa se zatim ispituju efekti ovakve strategije dimerizacije na bioaktivnost nastalih dimernih molekula. U nekim slučajevima, ovi tako-zvani tandem-dimeri (C-N veza) konstruisani su tako da imaju linkere između dva monomera, a ovi linkeri poželjno je da su sastavljeni od prirodnih aminokiselina, tako da je njihova sinteza pristupačna za rekombinantne tehnologije.

Predmetni pronalazak je zasnovan na otkriću grupe jedinjenja koja imaju trombopoetsku aktivnost i za koje se smatra da ispoljavaju njihovu aktivnost vezivanjem za endogeni TPO receptor, c-Mpl.

Jedinjenja i derivati

U prvoj poželjnoj realizaciji, pronađena jedinjenja se sastoje od sledeće opšte strukture:

gde se TMPii TMP2svaki nezavisno, biraju iz grupe jedinjenja koja imaju središnu strukturu:

X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Xg-Xi o

gde su:

X2se bira iz grupe koju čine Glu, Asp, Lys i Val;

X3se bira iz grupe koju čine Gly i Ala;

X4je Pro;

X5se bira iz grupe koju čine Thr i Ser;

X6se bira iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala i Phe;

X7se bira iz grupe koju čine Arg i Lys;

Xs se bira iz grupe koju čine Gln, Asn i Glu;

X9se bira iz grupe koju čine Trp, Tyr, Cys, Ala i Phe;

Xio se bira iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys;

Uje linker, koji je opisan u nastavku; i

n je 0 ili 1,

i njihove fiziološki prihvatljive soli.

U jednoj realizaciji Lisadrži (Gly)n, gde je n 1 do 20, a kada je n veće od 1, do polovine Gly ostataka može biti supstituisano drugom aminokiselinom koja se bira između preostalih 19 prirodnih aminokiselina ili njihovih stereoizomera.

Pored gore pomenute strukture jezgra X2-Xio za TMP1i TMP2, moguće su takođe i druge srodne strukture, gde je jedna ili više od onih koje slede dodata središnoj strukturi TMP2i/ili TMP2: Xise vezuje za N-terminus i/ili su Xn, Xi2, Xi3i/ili Xi4vezani za C-terminus, pri čemu su Xi, X11p Xi2 X13i Xu kao što sledi: Xtse bira iz grupe koju čine Ile, Ala, Val, Leu, Ser i Arg;

Xnse bira iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His i Glu; Xi2se bira iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser i Gln;

X13se bira iz grupe koju čine Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln i Gly; i

Xi4se bira iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu i Gly.

Naziv "TMP" se koristi da označi ostatak načinjen od, odnosno koji sadrži, najmanje 9 subjedinica (X2-X-|0), gde X2-Xi0čini središnu strukturu. Subjedinice X2-Xh poželjno je da su aminokiseline koje se nezavisno biraju između 20 aminokiselina koje se nalaze u prirodi. Međutim, obaj pronalazak obuhvata I jedinjenja gde se X2-Xi4nezavisno biraju iz grupe atipičnih aminokiselina, koje se ne nalaze u prirodi, koje su dobro poznate u stanju tehnike. Specifično, poželjne aminokiseline se identifikuju za svaki položaj. Na primer, X2može biti Glu, Asp, Lys ili Val. Ovde se koriste simboli za aminokiseline sa tri slova i sa jednim slovom; u svakom slučaju skraćenice su standardne, koje se koriste za 20 aminokiselina koje se nalaze u prirodi, ili za dobro poznate njihove varijacije. Te amino kiseline mogu biti ili L ili D stereohemije (izuzimajući Gly, koja nije ni L ni D), a TMP mogu da sadrže bilo koju od stereohemijskih kombinacija. Međutim, za sve aminokiseline u TMP lancu poželjna je L stereohemija. Predmetni pronalazak daje takođe reversne TMP molekule u kojima je sekvencija aminokiselina obrnuta na amino terminusu u odnosu na karboksi terminus. Na primer, molekulu koji ima normalnu sekvenciju Xi-X2-X3, reversna je sekvencija X3-X2-Xi. Predmetni pronalazak daje takođe i retro-reversne TMP molekule u kojima je, nalik reversnom TMP, sekvencija aminokiselina amino terminusa reversna u odnosu na karboksi terminus, pa su ostaci koji su normalno "L" enantiomeri u TMP, promenjeni u "D" stereoizomerni oblik.

Pored toga, obuhvaćene su takođe i fiziološki prihvatljive soli TMP. "Fiziološki prihvatljive soli" označavaju bilo koje soli koje su poznate ili kasnije otkrivene, a koje su farmaceutski prihvatljive. Neki specifično poželjni primeri su: acetat, trifluoroacetat, hidrohlorid, hidrobromid, sulfat, citrat, tartarat, glikolat, oksalat.

Podrazumeva se takođe da "derivati" TMP mogu biti supstituisani sa gore opisanim TMP. Takvi derivati TMP su ostaci u kojima je načinjena jedna ili više od sledećih modifikacija: - zamenjena je jedna ili više peptidil [-C(0)NR-] veza sa nepeptidnim vezama, kao što su -CH2-karbamatna veza [-CH2-OC(0)NR-]; fosfonatna veza; -CH2-sulfonamidna veza [-CH2-S-(0)2NR-]; karbamidna veza [-NHC(0)NH-]; veza -CH2-sekundarni amin; ili alkilovana peptidil veza [-C(0)NR<6->, gde je R<6>niži alkil]; - peptidi u kojima je N-terminus derivatizovan u -NRR<1>grupu; u -NRC(0)R grupu; u -NRC(0)OR grupu; u -NRS(0)2R grupu; u -NHC(0)NHR grupu, gde su R i R<1>vodonik ili niži alkil, pod uslovom da R i R<1>nisu oba vodonik; zatim u sukcinimidnu grupu; u benziloksikarbonil-NH- grupu (CBZ-NH-); ili u benziloksikarbonil-NH- grupu koja ima 1 do 3 supstituenta na fenil prstenu, koji se biraju iz grupe koju čine niži alkil, niži alkoksi, hloro i bromo; i - peptidi u kojima je C terminus derivatizovan u -C(0)R<2>, gde se R<2>bira iz grupe koju čione niži alkoksi i -NR3R<4>, gde seR<3>iR<4>nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik i niži alkil. Pod "niži'' podrazumeva se grupa sa 1 do 6 atoma ugljenika.

Pored toga, u molekule TMP mogu se uvesti modifikacije aminokiselina, reagovanjem ciljanih ostataka aminokiselina peptida sa organskim agensom za derivatizovanje koji je u stanju da reaguje selektivno sa bočnim lancima ili sa ostacima terminusa. Kao primer mogu da posluže sledeće: Lizinil i ostaci amino terminusa mogu da reaguju sa anhidridom ćilibarne ili druge karboksilne kiseline. Derivatizacija sa ovim agensima ima efekat promene znaka naboja lizinil ostataka. Drugi podesni reagensi za derivatizaciju alfa-amino ostataka su imidoestri, kao što je metilpikolinimidat; piridoksalfosfat; piridoksal; hlorokarbohidrid; trinitrobenzensulfonska kiselina; O-metilizourea; 2,4-pentandion i reakcija sa glioksilatom katalizovana sa transaminazom.

Arginil ostaci se mogu modifikovati reakcijom sa jednim ili više konvencionalnih reagenasa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija argininskih ostataka zahteva da se reakcija obavlja pod alkalnim uslovima zbog visoke pKa vrednosti gvanidinske funkcionalne grupe. Pored toga, ovi reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina, kao i sa arginin gvanidino grupom.

Specifična modifikacija tirozil ostataka široko je izučavana sama za sebe, sa posebnim interesovanjem za uvođenje spektralnih obeleživača u tirozil ostatke, reakcijom sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se koriste N-acetilimidazol i tetranitrometan za formiranje O-acetiltirozil vrsta i 3-nitro derivata, respektivno.

Karboksilne bočne grupe (asparaginil ili glutamil) mogu se selektivno modifikovati reakcijom sa karbodiimidima ili 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)karbodiimidom. Pored toga, asparagil i glutamil ostaci se mogu konvertovati u asparaginil ili glutaminil ostatke reakcijom sa amonijumovim jonima.

Glutaminil i asparaginil ostaci se često deaminuju u odgovarajuće glutamil ili asparagil ostatke. Alternativno, ovi ostaci se mogu deaminovati pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka ulazi u obim ovog pronalaska.

Derivatizacija sa bifunkcionalnim agensima je korisna za umrežavanje peptida ili njihovih funkcionalnih derivata sa matricom nosača koja je nerastvorna u vodi ili drugim makromolekulskim nosačem. Obično su agensi za umrežavanje koji se koriste, npr. 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidin estri, na primer, estri sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalnim imidoestrima, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3-ditiobis (sukcinimidilpropionat) i bifunkcionalne meleimide kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Agensi za derivatizovanje, kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio] propioimidat daju fotoaktivatibilne intermedijare koji su u stanju da stvaraju poprečne veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice koje nisu rastvorne u vodi, kao što su ugljeni hidrati aktivirani sa cijanogen-bromidom i reaktivni substrati, opisani u U.S. Patent No. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 i 4,330,440, mogu da se koriste za imobilizaciju proteina.

Ostale moguće modifikacije su hiroksilovanje prolina i lizina, fosfori lova nje hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, oksidacija atoma sumpora u Cys, metilovanje alfa-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (Creighton, T.E., "Proteins: Structure and Molecule Properties", VV.H.Freeman Co, San Francisco, str. 79-86 (1983)), acetilovanje N-terminala amina i u nekim primerima amidovanje C-terminalnih karboksi grupa.

Poželjno je da ovako derivatizovani ostaci poboljšavaju u jedinjenjima ovog pronalska jednu ili više karakteristika, uključujući trombopoitečku aktivnost, rastvorljivost, absorpciju, biloški poluživot i slično. Alternativno, derivatizovani ostaci daju jedinjenja koja imaju iste ili suštinski iste karakteristike i/ili svojstva jedinjenja koja nisu derivatizovana. Ti ostaci mogu alternativno da eliminišu ili priguše bilo koji nepoželjni sporedni efekat ovih jedinjenja ili slično.

Pored središne strukture, X2-Xio, pomenute gore, druge strukture specifično razmotrene, su one u kojima je jedna ili više dodatih X grupa vezana za središnu strukturu. Dakle, Xii/ili Xn, Xi2, Xi3i Xu mogu biti pripojeni središnoj strukturi. Neke dodatne strukture, koje služe kao primer, su sledeće:

gde su Xido Xi4opisani gore. Svaki od TMPiI TMP2može biti isti ili različit po sekvenciji i/ili dužini. U nekim poželjnim realizacijama TMPii TMP2su isti.

Naročito poželjan TMP je sledeći: lle-Gly-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO:1) "Sadrži" ovde znači, između ostalog, da jedinjenje može da uključi dodatne aminokiseline na bilo kome od oba - ili na C-terminusima date sekvencije. Međutim, dok god su prisutne strukture, kao što su X2do Xio, Xido Xu, ili jedna od drugih za primer uzetih struktura, preostala hemijska struktura je relativno manje značajna. Naravno, bilo koja struktura izvan središne X2do Xiostrukture, ili X^ do Xi4strukture, ne srne značajno da interferira sa trombopoiteičkom aktivnošću jedinjeja. Na primer, Met ostatak na N-terminusu je predviđen da pada unutar ovog pronalaska. Pored toga, mada su mnoga poželjna jedinjenja ovog pronalaska tandem dimeri po tome što poseduju dva TMP ostatka, druga jedinjenja ovog pronalaska su tandem multimeri TMP, tj. jedinjenja, na primer sledećih struktura: TM P1 -L-TM P2-L-TM P3;

TMPi -L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5,

gde TMP1tTMP2, TMP3, TMP4i TMP5mogu imati istu ili različite strukture i gde je svaki od TMP i L definisan kao što je ovde opisano, a svaki linker je opcion. Poželjno je da jedinjenja ovog pronalaska imaju 2-5 TMP ostataka, naročito je

poželjno 2-3, a najpoželjnije 2. Jedinjenja prve realizacije ovog pronalaska poželjno je da imaju manje od oko 60, poželjnije manje od oko 40 aminokiselina ukupno (tj. ona su peptidi).

Kao što je gore pomenuto, jedinjenja prve realizacije ovog pronalaska poželjno je da su dimeri TMP, koji su vezani direktno ili su povezani preko linkerske grupe. Monomerni TMP ostaci su prikazani u konvencionalnoj orijentaciji, od N do C terminusa, čitajući s leva na desno. U skladu sa tim, može se videti da su sva pronađena jedinjenja orijentisana tako da je C-terminus TMPipovezan ili direktno ili preko linkera za N-terminus TMP2. Ova orijentacija se navodi kao tandemska orijentacija, pa se pronađena jedinjenja mogu opšte navesti kao "tandemski dimeri". Ova jedinjenja se navode kao dimeri, čak i kada su TMPii TMP2strukturno različiti. Naime, predviđeni su i homodimeri i heterodimeri.

"Linkerska" grupa ("Li") je opciona. Kada je prisutna, nije kritično koji je njen hemijski sastav, pošto ona prvenstveno služi kao distancer. Linker treba tako da se odabere da ne interferira sa biološkom aktivnošću konačnog jedinjenja i takođe da značajno ne poveća imunogenicitet konačnog jedinjenja. Poželjno je da se linker napravi od aminokiselina povezanih zajedno peptidnim vezama. Dakle, u poželjnim realizacijama, linker je Yn, gde je Y amino kiselina koja se nalazi u prirodi ili njen stereoizomer, a "n" je bilo koji broj od 1 do 20. Dakle, linker se pravi od 1 do 20 aminokiselina povezanih peptidnim vezama, pri čemu se aminokiseline biraju između 20 aminokiselina koje se nalaze u prirodi. U poželjnijoj realizaciji, 1 do 20 aminokiselina se bira između Gly, Ala, Pro, Asn, Gln, Cys, Lys. Još poželjnije je da se linker pravi većinom od aminokiselina koje su bez sternih smetnji, kao što su Gly, Gly-Gly [(Gly)2], Gly-Gly-Gly [(Gly)3]...

(Gly)20, Ala, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, itd. Drugi specifični primeri linkera su:

Radi objašnjenja gornje nomenklature, na primer (Gly)3Lys(Gly)4znači Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Kombinacije Gly i Ala su takođe poželjne.

Mogući su takođe i ne-peptidni linkeri. Na primer, mogu se koristiti alkil linkeri, kao što je -HN-(CH2)s-CO-, gde je s=2-20. Ovi alkil linkeri mogu još biti supstituisani sa bilo kojom grupom bez sternih smetnji, kao što je niži alkil (npr. Ci-C6), niži acil, halogen (npr. Cl, Br), CN, NH2, fenil itd.

Sledeći tip ne-peptidnog linkera je polietilenglikolna grupa, kao što je

gde je n toliko da se ukupna molarna masa linkera kreće od približno 101 do 5000, poželjno od 101 do 500.

Obično se pronalazi da je poželjan linker dužine od oko 0-14 subjedinica (npr. aminokiselina) za trombopoetska jedinjenja iz prve realizacije ovog pronalaska.

Peptidni linkeri se mogu menjati, tako da formiraju derivate na isti način kako je gore opisano za TMP.

Dalje, jedinjenja prve grupe mogu biti linearna ili ciklična. Pod "ciklična" podrazumeva se da su najmanje dva odvojena, tj. koja nisu zavisna, dela molekula povezana jedan sa drugim. Na primer, amino i karboksi terminus krajeva molekula se mogu kovalentno povezati formirajući ciklični molekul. Alternativno, molekul može da sadrži dva ili više Cys ostataka (npr. u linkeru) koji se mogu ciklizovati preko stvaranja disulfidne veze. Razmatra se dalje da se više od jednog tandemskog dimera peptida može da poveže formirajući dimer dimera. Tako, na primer, tandemski dimer koji sadrži Cys ostatak može da formira intermolekulsku disulfidnu vezu sa Cys iz drugog takvog dimera. Videti na primer, jedinjenje SEQ ID NO: 29, niže.

Jedinjenja ovog pronalaska mogu takođe biti kovalentno ili nekovalentno povezana sa nosačem molekula, kao što je linearni polimer (npr. polietilenglikol, polilizin, dekstran itd.), polimer račvastog lanca (videti, na primer, U.S. Patent No. 4,289,872 Denkenwalter-a i drugih, izdat 15. septembra 1981; 5,229,490 Tam-a, izdat 20 jula 1993; WO 93/21259 Frechet-a i drugih, publikovan 28 oktobra 1993); lipid, holesterolska grupa (kao što je steroid); ili ugljenihidrat ili oligosaharid. Drugi mogući nosači su jedan ili više u vodi rastvornih polimernih dodataka, kao što su polioksietilenglikol ili polipropilenglikol, kao što je opisano u U.S. Patent NO: 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4, 670,414; 4,791,192 i 4,179,337. Drugi korisni polimeri, koji su poznati u stanju tehnike, su monometoksi-polietilenglikol, dekstran, celuloza ili drugi ugljeni hidrati na bazi polimera, poli(N-vinilpirolidon)-polietilenglikol, homopolimeri propilenglikola, kopolimer polipropilenoksid/etilenoksid, polioksietilovani polioli (npr. glicerin) i polivinilalkohol, kao i smeše ovih polimera.

Poželjan takav nosač je polietilenglikol (PEG). PEG grupa može biti bilo koje podesne molarne mase, a može biti prava ili račvasta. Prosečna molekulska masa PEG poželjno je da bude u opsegu od oko 2 kDa do oko 100 kDa, poželjnije od oko 5 kDa do oko 50 kDa, a najpoželjnije od oko 5 kDA do oko 10 kDa.

Peg grupe se obično povezuju sa jedinjenjem ovog pronalaska preko acilovanja, redukcionim alkilovanjem, Michael-ovom adicijom, tiol alkilovanjem ili drugim hemoselektivnim metodama konjugovanja/povezivanja preko reaktivne grupe na PEG ostatku (npr. aldehid, amino, estar, tiol, a-haloacetil, maleimido ili hidrazino grupa) sa reaktivnom grupom na ciljanom jedinjenju (npr. aldehid, amino, estar, tiol, a-haloacetil, maleimido ili hidrazino grupa).

Grupe ugljenih hidrata (oligosaharida) podesno se mogu povezati sa mestima za koja se zna da su mesta glikozilovanja na proteinima. Obično, O-povezani oligosaharidi se vezuju za serinske (Ser) ili treoninske (Thr) ostatke, dok se N-povezani oligosaharidi vezuju za asparagin (Asn) ostatke, kada su ovi deo sekvencije Asn-X-Ser/Thr, gde je X bilo koja aminokiselina, izuzimajući prolin. X je poželjno jedna od 19 aminokiselina koje se nalaze u prirodi, ne računajući prolin. Nađeno je da su u svakom tipu različite strukture N-povezanih i O-povezanih oligosaharida i ostataka šećera. Jedan tip šećera, koji se obično nalazi u obe, je N-acetilneuraminska kiselina (navodi se kao sialinska kiselina). Obično, sialinska kiselina je terminalni ostatak i N-povezanih i O-povezanih oligosaharida i zahvaljujući njenom negativnom naboju, može da dodeli kisela svojstva glikozilovanom jedinjenju. Ovakvo mesto se može ugraditi u linker jedinjenja iz ovog pronalaska, a poželjno je da ih glikoziluje ćelija za vreme rekombinantnog stvaranja polipetidnih jedinjenja (npr. u ćelijama sisara, kao što su CHI, BHK, COS). Međutim, ova mesta se mogu još glikozilovati sintetskim ili polusintetskim Oprocedurama, koje su poznate u stanju tehnike.

Primeri nekih peptida iz ovog pronalaska su pokazani niže. Koriste se oznake aminokiselina sa jednim slovom, a linker je pokazan odvojeno crtama, radi jasnoće. Dodatne skraćenice: BrAc znači bromoacetil (BrCH2C(0)), a PEG je polietilenglikol.

U svakom od gornjih jedinjenja podrazumeva se isto tako Met na N-terminusu (iii M ostatak, koristeći oznaku jednim slovom). Multimeri (npr. tandemski i ne-tandemski, kovalentno vezani i nekovalentno vezani) gornjih jedinjenja se takođe podrazumevaju.

U drugoj realizaciji ovog pronalaska, jedinjenja koja su gore opisana mogu se pripojiti uz jednu ili više Fc grupa, bilo direktno ili preko linkerskih grupa. Obično, formula ove druge grupe jedinjenja je :

gde su TMP-i, TMP2i n opisani gore; L-i, L2i L3su linkerske grupe koje se nezavisno biraju između gore opisanih linkerskih grupa; Fc je Fc region imunoglobulina; m, p, q i r se, svaki nezavisno, biraju iz grupe koju čine 0 i 1, pri čemu najmanje jedan od m ili p je 1, i još, kada je m jednako 0, tada je q jednako 0, i ako je p jednako 0, tada je i r jednako 0;

i njihove fiziološki prihvatljive soli.

Prema tome, jedinjenja ove druge grupe imaju strukture koje su definisane za prvu grupu jedinjenja opisanih gore, ali ova jedinjenja su još spojena sa najmanje jednom Fc grupom, direktno ili preko jedne ili više linkerskih grupa.

Sekvencija Fc u gornjim jedinjenjima se može birati između humanog imuniglobulna lgG-1 teškog lanca, videti Ellison, J.W. et al.,Nucleic Acids Res.1982, 10, 4071-4079, ili bilo koje druge sekvencije koja je poznata u stanju tehnike (npr. druge klase IgG,uključujući, ali ne ograničavajući se istim, lgG-2, lgG-3 i lgG-4, ili druge imunoglobuline).

Dobro je poznato da su Fc regioni antitela načinjeni od monomernih polipeptidnih segmenata koji mogu biti povezani u dimerne i multimerne oblike disulfidnim vezama, ili ne-kovalentnim povezivanjem. Broj unutarmolekulskih disulfidnih veza između monomernih subjedinica originalnih Fc molekula kreće se od 1 do 4, zavisno od klase (npr. IgG, IgA, IgE) ili subklase (npr. lgG1, lgG2, lgG3, lgA1, lgA2) posmatranog antitela. Naziv "Fc" koji se ovde koristi, je generički za monomerne, dimerne i multimerne oblike Fc molekula. Treba naglasiti da Fc monomeri spontano dimerizuju kada su prisutni odgovarajući Cys ostaci, ukoliko nisu prisutni posebni uslovi koji sprečavaju dimerizaciju preko stvaranja disulfidne veze. Čak iako se Cys ostaci, koji normalno formiraju disulfidne veze u Fc dimeru, uklone ili zamene drugim ostacima, monomerni lanci će obično dimerizovati kroz ne-kovalentne interakcije. Naziv "Fc" se ovde koristi da označi sledeće oblike: nativni monomer, nativni dimer (povezan preko disulfidne veze), modifikovani dimeri (povezani preko disulfida i/ili ne-kovalentno) i modifikoani monomeri (tj. derivati).

Varijanti, analozi i derivati Fc dela se mogu konstruisati, na primer, pravljenjem raznih supstitucija ostataka ili sekvencija.

Varijant (ili analog) polipeptida su umetnuti varijanti, gde su jedan ili više ostataka aminokiselina dodati sekvenciji aminokiselina Fc. Umetci se mogu locirati na jednom ili na oba terminusa proteina, ili se mogu smestiti unutar unutrašnjih regiona sekvencije aminokiselina Fc. Umetnuti varijanti sa dodatnim ostacima na jednom ili oba terminusa mogu da obuhvate, na primer, spojene proteine i proteine koji sadrže obeleživače ili označivače aminokiselina. Na primer, molekul Fc može opciono da sadrži Met na N-terminalu, naročito ako je molekul rekombinantno izlučen u ćeliji bakterije, kao što jeE. Coli.

U varijantima skraćenih Fc u polipeptidu Fc, uklonjen je jedan ili više ostataka aminokiselina. Ova skraćivanja se mogu ostvariti na jednom ili na oba terminusa polipeptida Fc, uklanjanjem jednog ili više ostataka unutar sekvencije aminokiselina Fc. Prema tome, skraćeni varijanti sadrže sve fragmente sekvencije polipeptida Fc.

U supstitucionim varijantima, jedan ili više ostataka aminokiselina polipeptida Fc se ukloni i zameni sa alternativnim ostacima. U jednom aspektu, ove supstituicije su po prirodi konzervativne, a predmetni pronalazak obuhvata takođe i supstitucije koje nisu konzervativne.

Na primer, cisteinski ostaci se mogu izbaciti ili zameniti sa drugim aminokiselinama, kako bi se sprečilo formiranje nekih ili svih disulfidnih poprečnih veza u sekvencijama Fc. Cisteinski ostaci su aminokiseline u položajima 7 i 10 u SEQ ID NO: 5. Svaki od ovih cisteinskih ostataka se može ukloniti, ili se jedan ili više ovih cisteinskih ostataka može supstituisati sa drugim aminokiselinama, kao što su Ala ili Ser. Kao sledeći primer, mogu se takođe načiniti modifikacije za uvođenje supstitucija amino kiselina sa ciljem: (1) da se amputira vezno mesto receptora Fc; (2) da se amputira kompletno vezno mesto (C1q); i (3) da se amputira mesto antitela koje zavisi od citotoksičnosti posredovane ćelijom (ADCC). Takva mesta su poznata u stanju tehnike i bilo koje poznate supstitucije koje se mogu upotrebiti su unutar obima Fc. Na primer, videtiMolecular lmmunology,1992, 29,(5), 633-639, u vezi mesta ADCC u lgG1.

Slično, može se isto tako jedan ili više tirozinskih ostataka zameniti fenilaminskim ostacima. Pore toga, svaki drugi varijant umetanja, izbacivanja (npr. 1-25 aminokiselina) i/ili suptituisanja aminokiselina koje se takođe podrazumeva, obuhvaćen je obimom ovog pronalaska. Obično su poželjne konzervativne supstitucije aminokiselina. Pored toga, alternacije mogu biti u obliku izmenjenih aminokiselina, kao što su peptidomimetike ili D-aminokiseline.

Sekvencije Fc u TMP jedinjenju se takođe mogu derivatizovati, tj. obavljajući modifikacije koje su različite od umetanja, izbacivanja ili supstitucije ostataka aminokiselina. Poželjno je da su ove modifikacije kovalentne po prirodi, a to su na primer, hemijsko vezivanje sa polimerima, lipidima i drugim organskim i neorganskim ostacima. Derivati iz ovog pronalaska se mogu pripremati da bi se povećao polu-život cirkulacije, ili se mogu planirati da poboljšaju ciljni kapacitet polipeptida za željene ćelije, tkiva ili organe.

Moguće je takođe korišćenje spašavanja veznog domena receptora u nedirnutom molekulu Fc, npr. deo Fc u jedinjenjima ovog pronalaska, kao što je opisano u WO 96/32478, pod naslovom "Altered Polvpeptides with Incerased Half-Life". Dodatni članovi klase molekula, ovde označenih kao Fc, su oni koji su opisani u WO 97/34631, pod naslovom "Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lifes". Obe objavljene PCT publikacije koje su citirane u ovom odeljku su ovde uključene kroz ovaj navod.

Spajanja Fc mogu biti na N ili C terminusu TMP^ili JMP2ili i na N i C terminusu ovih TMP. Sa iznenađenjem je otkriveno da su peptidi u kojima je Fc ostatak povezan sa N terminusom TMP grupe bioaktivniji od ostalih mogućnosti, pa je stoga poželjno spajanje koje ima Fc domen na N terminusu TMPi(tj. r i p su oba 0, a m i q su oba 1 u opštoj formuli). Kada se spoji Fc lanac sa N-terminusom TMP ili linkera, to spajanje se obično obavlja preko C-terminusa Fc lanca, i obrnuto.

Poželjna su takođe jedinjenja koja su dimeri (npr. tandemski ili ne-tandemski) jedinjenja koja su opisana u opštoj formuli datoj gore. U tim slučajevima, svaki Fc lanac je povezan sa tandemskim dimerom TMP peptida. Shematski primer takvog jedinjenja je pokazan na Slici 6C. Poželjan primer ove vrste jedinjenja je zasnovan na Slici 6C, gde je Fc dimer jedinjenja SEQ ID NO: 5, svaki L2je (Gly)5, svaki od TMPti TMP2je jedinjenje SEQ ID NO:1, i svaki Lije (Gly)8. Ovo jedinjenje se ovde navodi takođe kao "Fc-TMPi-L-TMP2". Ono se takođe predstavlja kao dimer (preko Fc dela) SEQ ID NO: 34. Analogno jedinjenje u kome je Fc grupa povezana preko linkera na C-terminus TMP2grupa takođe je razmotreno na Slici 6C, a ovde se navodi kao TMPi-L-TMP2-Fc.

Daju se neki specifični primeri jedinjenja iz druge grupe, kao što sledi:

U svakom od gornjih jedinjenja isto tako je obuhvaćen i Met na N-terminalu (ili M ostatak, kada se koristi oznaka jednim slovom). Met ostatak može biti povezan sa N-terminusom Fc grupe u onim slučajevima kada je Fc grupa povezana sa N-terminusom TMP. U onim slučajevima kada je Fc grupa povezana sa C-terminusom TMP, Met ostatak može biti povezan sa N-terminusom TMP grupe.

U svakom od gornjih slučajeva poželjan Fc je Fc region teškog lanca humanog imuniglobulina lgG1, ili njegov biološki aktivan fragment, derivat ili dimer, videti Ellison, J.W. et al.,Nucleic Acids Res.1982, 10, 4071-4079. Sekvencija Fc prikazana u SEQ ID NO: 5 je najpoželjniji Fc za gornja jedinjenja. Poželjna su takođe gornja jedinjenja u kojima je Fc u dimernom obliku sekvencije SEQ ID NO: 5, a svaki Fc lanac je povezan sa TMP tandemskim dimerom.

Pored toga, mada mnoga od poželjnih jedinjenja druge realizacije obuhvataju jedan ili više tandmeskih dimera, time što poseduju dva povezana TMP ostatka, druga jedinjenja ovog pronalaska obuhvataju tandemske multimere ovih TMP, tj. jedinjenja koja imaju na primer sledeće strukture:

gde TMPi, TMP2, TMP3, TPM4i TMP5mogu da imaju iste ili različite strukture i gde su Fc, svaki od TMP i L definisani gore, a svaki linker je opcioni. U svakom od gornjih slučajeva Fc grupa može biti monomerna ili dimerna, a u slučaju kada

je Fc dimerna, jedan ili više TMP multimera može biti povezan sa svakim Fc lancem. Razmatraju se takođe i drugi primeri, gde su TMP dimeri ili multimeri povezani i sa N- i sa C-terminusima jednog ili oba Fc lanca, uključujući slučaj kada su TMP dimeri ili multimeri povezani sa sva četiri terminusa Fc lanca.

Poželjno je da jedinjenja ove druge realizacije iz ovog pronalaska imaju ukupno od 200 do 400 aminokiselina (tj. ona su polipeptidi).

Metode pripremanja

Jedinjenja ovog pronalaska se mogu napraviti raznim načinima. Pošto su mnoga od ovih jedinjenja peptidi ili uključuju peptide, posebno su relevante metode sitetizovanja peptida. Na primer, mogu se koristiti tehnike sinteze na čvrstoj fazi. Podešene tehnike su dobro poznate u stanju tehnike, a to su one koje su opisali Merrifield uChem. Polypeptides,str. 335-61 (Urednici Katsovanis i Panavotis, 1973); Merrifield,J. Am. Chem. Soc.1963, 85, 2149; Daviš et al.Biochem. lntlA985,10, 394-414; Stevvart i Young,Solid Phase Peptide Synthesis

(1969); U.S.Patent No. 3,941,763; Finn et al.The Proteins,3. izdanje, Vol. 2, str. 105-253 (1976); i Erickson et al.,The Proteins,3. izdanje, Vol. 2, str. 257-527

(1976). Poželjna tehnika za pravljenje pojedinih peptida je sinteza na čvrstoj fazi, zato što je to najefikasniji metod pravljenja malih peptida.

Peptidi se mogu takođe praviti u transformisanim ćelijama domaćina, koristeći tehnike rekombinantne DNA. Da bi se to ostvarilo, pripremi se molekul rekombinantne DNA kodiran za taj peptid. Metode pripremanja takvih molekula DNA i/ili RNA su dobro poznate u stanju tehnike. Na primer, sekvencije kodirane za peptide se mogu odstraniti iz DNA korišćenjem podesnih restrikcionih enzima. Relevantne sekvencije se mogu kreirati korišćenjem reakcije polimerizacije lanca (PCR) sa umetanjem korisnih restrikcionih mesta za naknadno kloniranje. Alternativno, molekul DNA/RNA se može sintetizovati korišćenjem tehnika hemijske sinteze, kao što je metoda fosforamidita. Takođe, može se koristiti i kombinacija ovih tehnika.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata i vektor koji kodira peptide u odgovarajućem domaćinu. Vektor sadrži DNA molekul koji kodira peptide operativno povezane sa odgovarajućom sekvencijom koja kontroliše ekspresiju. Metode za ostvarivanje ovog operativnog povezivanja, bilo pre ili posle umetanja molekula DNA koji kodira peptid u vektor, dobro su poznate. Sekvencije koje kontrolišu ekspresiju obuhvataju promotere, aktivatore, poboljšivače, operatore, ribizomska vezna mesta, signale za startovanje, sigale za zaustavljanje, kap signale, signale poliadentilovanja i druge signale povezane sa kontrolom transkripcije ili translacije.

Nastali vektor, koji sadrži molekul DNA koji kodira peptid, koristi se za transformisanje odgovarajućeg domaćina. Ova transformacija se može obaviti metodama koje su dobro poznate u stanju tehnike.

Bilo koja od velikog broja raspoloživih i dobro poznatih ćelija se može koristiti u praktikovanju ovog pronalaska. Izbor posebnog domaćina zavisi od brojnih faktora koji su poznati u stanju tehnike. Ti faktori su, na primer, kompatibilnost sa odabranim vektorom ekspresije, toksičnost prema ćeliji domaćina peptida kodiranog sa molekulom DNA, brzina transformacije, lakoća obnavljanja peptida, karakteristike ekspresije, biosigurnost i troškovi. Balans ovih faktora mora se praviti znajući da svi domaćini ne mogu biti jednako efikasni za ekspresiju posebne sekvencije DNA.

U okviru ovih opštih uputstava, korisni mikrobni domaćini su bakterije (kao što jeE. coli),kvasci (kao što suSaccharomyces sp.iPichia pastoris)i druge gljivice, insekti, biljke, ćelije sisara (uključujući humana bića) u kulturi, ili drugi domaćini koji su poznati u stanju tehnike.

Zatim, transformisani domaćin se kultiviše pod konvencionalnim uslovima fermentacije, tako da se eksprimiraju željeni peptidi. Ovi uslovi fermentacije su dobro poznati u stanju tehnike.

Konačno, peptidi se prečišćavaju iz fermentacione čorbe i od ćelija domaćina u kojima su bili izlučeni. Ove metode prečišćavanja takođe su dobro poznate u stanju tehnike.

Jedinjenja koja sadrže derivatizovane peptide ili koja sadrže ne-peptidne grupe, mogu se sintetizovati dobro poznatim tehnikama organske hernije.

Upotreba jedinjenja

Jedinjenja iz ovog pronalaska imaju svojstvo da se vezuju i aktiviraju c-MpI receptor i/ili imaju svojstvo da stimulišu proizvodnju (iin vivoiin vitro)trombocita ("trombopoetska aktivnost") i prekursora trombocita ("megakariocitopoetska aktivnost"). Za merenje ovakve (ili ovakvih) aktivnosti ovih jedinjenja mogu se koristiti standardni testovi, kao što su oni koji su opisani u WO 95/26746, pod naslovom "Compositions and Methods for Stimulating Megakariocvte Grovvth and Differentiation". Testoviin vivose dodatno opisuju ovde u odeljku Primera.

Stanja koja se tretiraju postupcima i preparatima iz ovog pronalaska su obično ona koja su povezana sa postojanjem deficitarnosti megakariocita/trombocita, ili kod kojih se u budućnosti očekuje ili predviđa deficitarnost megakariocita/ trombocita (npr. zbog planiranog hirurškog zahvata ili davanja trombocita). Takva stanja mogu biti rezultatin vivodeficitarnosti (privremene ili permanentne) aktivnog liganda Mpl. Generički naziv za deficitarnost trombocita je trombocitopenija, pa su stoga postupci i preparati ovog pronalaska obično na raspolaganju za profilaktičko ili terapeutsko tretiranje trombocitopenije kod pacijenata kojima je isto neophodno.

Svetska zdravstvena organizacija je klasifikovala stepen trombocitopenije prema broju cirkulatornih trombocita kod pojedinca (Miller et al.,Cancer,1981, 47, 210-211). Na primer, osoba koja ne pokazuje znake trombocitopenije (Stepen 0) obično ima najmanje 100.000 trombocita/mm<3>. Blaga trombocitopenija (Stepen 1) ukazuje na sadržaj cirkulatornih trombocita između 79.000 i 99.000 /mm<3>. Umerena trombocitopenija (stepen 2) pokazuje između 50.000 i 74.000 trombocita/mm<3>, a ozbiljnu trombocitopeniju karakteriše između 25.000 i 49.000 trombocita/mm<3>. Trombocitopeniju koja ugrožava život ili iscrpljuje karakteriše koncentracija cirkulatornih trombocita manja od 25.000 /mm<3>.

Trombocitopenija (deficitarnost u trombocitima) može biti prisutna zbog različitih razloga, uključujući hemoterapiju i druge terapije sa raznim lekovima, radiološku terapiju, hirurgiju, nepredviđeni gubitak krvi i druga specifična stanja bolesti. Primeri specifičnih stanja bolesti u kojima dolazi do trombocitopenije, a koja se mogu tretirati u skladu sa ovim pronalaskom, su: aplastična anemija, idiopatska ili imuna trombocitopenija (ITP), uključujući idiopatsku trombocitopeniju purpura, koja je povezana sa rakom dojke, ITP povezan sa HIV i sa HIV povezana trombocitopenija purpura, metastaze tumora koje dovode do trombocitopenije, sistemski lupus eritematozus, uključujući neonatalni lupusni sindrom splenomegalije, Franconi-jev sindrom, deficitarnost vitamina B12, deficitarnost folne kiseline, May-Hegglin-ovu anomaliju, Wiskott-Aldrich-ev sindrom, hronično oboljenje jetre, mijelodisplastični sindrom povezan sa trombocitopenijom, paroksizmalnu noćnu hemoglobinurija, akutna i potpuna trombocitopenija koja sledi posle terapije sa C7E3 Fab (Abciximab), aloimuna trombocitopenija, uključujući porođajnu aloimunu trombocitopeniju, trombocitopenija povezana sa antifosfolipidnim antiteilima i trombozom, autoimuna trombocitopenija, imuna trombocitopenija indukovana lekovima uključujući trombocitopeniju indukovanu karboplatinom, trombocitopenija indukovana heparinom, embrionalna trombocitopenija, trombocitopenija u trudnoći, Hughes-ov sindrom, lupoidna trombocitopenija, nepredviđeni i/ili masivni gubitak krvi, mijeloproliferativni poremećaji, trombocitopenija kod pacijenata sa malignitetima, trombotička trombocitopenija purpura uključujući trombotičku mikroangiopatiju koja se manifestuje kao trombotička trombocitopenija purpura/hemoliitičko uremijski sindrom kod pacijenata sa kancerom, autoimuna hemolitička anemija, perforacija prikrivenog jejunalnog divertikuluma, aplazija samo crvenih krvnih zrnaca, autoimuna trombocitopenija, epidemijska nefropatija, akutna bubrežna smetnja povezana sa rifampicinom, Paris-Trousseau-ova trombocitopenija, neonatalna aloimuna trombocitopenija, paroksizmalna noćna hemoglobinurija, hematološke promene kod kancera stomaka, hemolitički uremički sindromi u detinjstvu, hematološke manifestacije povezane sa virusnim infekcijama, uključujući hepatitis A virus i trombocitopenija povezana sa CMV. Takođe, neki tretmani AIDS dovode do trombocitopenije (npr. AZT). Nekim poremećajima prilikom zarastanja rana takođe godi porast trombocita.

U pogledu predviđanja deficitarnosti trombocita, npr. usled predstojećeg hirurškog zahvata, jedinjenje ovog pronalaska se može ordinirati nekoliko dana do nekoliko sati pre potrebe za trombocitima. U slučaju akutnih situacija, npr. usled nepredviđenog i masivnog gubitka krvi, jedinjenje ovog pronalaska se može ordinirati zajedno sa krvlju ili prečišćenim trombocitima.

Jedinjenja ovog pronalaska mogu takođe biti korisna prilikom stimulisanja nekih tipova ćelija, koje se razlikuju od megakariocita, ukoliko je utvrđeno da te ćelije eksprimiraju Mpl receptor. Stanja povezana sa tim ćelijama, koje eksprimiraju Mpl receptor, a koja odgovaraju na stimulaciju sa Mpl ligandom, su takođe unutar obima ovog pronalaska.

Jedinjenja iz ovog pronalaska se mogu koristiti u bilo kojoj situaciji kada je poželjna proizvodnja trombocita ili ćelijskih prekursora trombocita, ili kada je poželjna stimulacija c-MpI receptora. Tako, na primer, jedinjenja ovog pronalaska se mogu koristiti za tretiranje bilo kog stanja kod sisara gde postoji potreba za trombocitima, megakariocitima i slično. Takva stanja su detaljno opisana u sledećim izvorima, na primer: VV095/26746; VV095/21919; VV095/18858; VVO95/21920, koji su ovde priključeni.

Jedinjenja ovog pronalska mogu takođe biti korisna u održavanju sposobnosti za život ili života skladištenja trombocita i/ili megakariocita i srodnih ćelija. U skladu sa tim, može biti korisno da se doda efikasna količina jednog ili više takvih jedinjenja u preparat koji sadrži takve ćelije.

Pod "sisar" se podrazumeva bilo koji sisar, uključujući humana bića, domaće životinje, uključujući pse i mačke, zatim egzotične i/ili zoološke životinje, uključujući majmune, laboratorijske životinje, uključujući miševe, pacove i zamorce, seoske životinje uključujući konje, marvu, ovce, koze i svinje, i slično. Poželjan sisar je humano biće.

Farmaceutske kompozicije

Predmetni pronalazak se odnosi na postupke koji koriste farmaceutske preparate pronađenih jedinjenja. Ti farmaceutski preparati se mogu ordinirati kao injekcije, oralno, nazalno, transdermalno ili kroz druge oblike ordiniranja, uključujući npr. intravenozne, intradermalne, intramuskularne, intramamarne, intraperitonealne, intratekalne, intraokularne, retrobulbarne, intrapulmonarne (npr. lekovi u obliku aerosola) ili podkožne injekcije (uključujući ordiniranje depoa za dugotrajno oslobađanje); zatim sublingvalno, analano, vaginalno ili hirurškom implantacijom, npr. ugrađivanje kapsule u slezinu, mozak ili rožnjaču. Takav tretman se može sastojati od jedne doze ili od više doza tokom nekog perioda vremena. Obično, pod ovim pronalaskom se podrazumevaju farmaceutski preparati koji sadrže efikasnu količinu jedinjenja ovog pronalaska, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačima, prezervativima, sredstvima za rastvaranje, emulgatorima, adjuvantima i/ili nosačima. Takvi preparati obuhvataju razblaživače različitog sadržaja pufera (npr. Tris-HCI, acetat, fosfat), pH, jonske jačine, pa aditive kao što su dezintegranti i sredstva za rastvaranje (npr. Tvveen 80, Polvsorbate 80), antioksidante (npr. askorbinska kiselina, natrijum-metabisulfit), prezervative (npr. Thimersol, benzilalkohol) i supstance za povećanje mase (npr. laktoza, manitol), ugrađivanje materijala u zrnaste preparate polimernih jedinjenja, kao što su polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina itd., ili u lipozome. Može se takođe koristiti hialuronska kiselina koja može da utiče na promociju uzrdžanog trajanja prilkom cirkulacije. Opciono, farmaceutski preparati mogu da sadrže i druge farmaceutski prihvatljive tečnosti, polučvrste supstance ili čvrste razblaživače koji služe kao farmaceutski tečni nosači, ekscipijenti ili medijumi, uključujući, ali bez ograničavanja na iste, polioksietilensorbitan-monolaurat, magnezijum-stearat, metil- i propilhidroksi-benzoat, škrobove, saharozu, dekstrozu, gumu akacije, kalcijum-fosfat, mineralno ulje, kakaobuter i teobromin ulje. Ovakvi preparati mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanjain vivo,brzinu iščezavanjain vivoovih proteina i derivata. Videti, npr.Remington' s Pharmaceutical Sciences,18. izdanje (1990, Mack Publishing Co, Easton, Pa, 18042) strane 1435-1712, ovde priključenu kroz ovaj citat. Preparati mogu biti napravljeni u tečnom obliku, ili mogu biti kao suvi prah, npr u liofilizovanom obliku. Takođe se podrazumevaju formulacije za usporeno oslobađanje koje se implantiraju, kao što su transdermalne formulacije.

Podrazumeva se da se ovde koriste doze u čvrstom obliku, koje su opisane u 89. glavi uRemington' s Pharmaceutical Sciences,18. izdanje (1990, Mack Publishing Co, Easton, Pa, 18042), koja je ovde priključena kroz citat. Doze čvrstog oblika su tablete, kapsule, pilule, troheje ili pastile, kasete ili pelete. Pri formulaciji ovih preparata može se takođe koristiti lipozomalno ili proteinoidno kapsuliranje (na primer, proteinoidne mikrosfere, opisane u U.S. Patent No. 4,925,673). Može se koristiti lipozomalno kapsuliranje, a lipozomi se mogu derivatizovati sa raznim polimerima (npr. U.S. Patent No. 5,013,556). Opis mogućih doza čvrstog oblika za terapeutske svrhe dao je Marshall, K. uModern Pharmaceutics,urednici G.S. Banker i C.T. Rhodes, 10. glava, 1979, ovde priključena kroz citat. Obično, formulcaija sadrži pronađeno jedinjenje, inertne sastojke koji omogućavaju zaštitu od stomačne sredine, i oslobađanje biološki aktivnog materijala unutar creva.

Posebno se podrazumevaju takođe oblici oralne doze gornjih pronađenih jedinjenja. Ukoliko je neophodno, ova jedinjenja se mogu hemijski modifikovati tako da se efikasno oralno oslobađaju. Obično, hemijska modifikacija koja se podrazumeva je pripajanje najmanje jednog ili više ostataka samom molekulu jedinjenja, pri čemu pomenuti ostatak dozvoljava: (a) inhibiciju proteolize, i (b) absorpciju u krvotok iz stomaka ili creva. Takođe, poželjno je povećanje ukupne stabilnosti jedinjenja i porast vremena cirkulacije u telu. Primeri takvih ostataka su: polietilenglikol, kopolimeri etilenglikola i propilenglikola, karboksimetilceluloza, dekstran, polivinilalkohol, polivinilpirolidon i poliprolin (Abuchovvski i Daviš,Soluble Polymer- Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs,urednici Hocenberg i Roberts, Wiley-lnterscience, New York, NY (1981), str. 367-383; Nevvmark et al.J. Appl. Biochem.1982, 4, 185-189). Drugi polimeri, koji se mogu koristiti, su poli-1,3-dioksolan i poli-1,3,6-tioksolan. Za gore ukazanu farmaceutsku upotrebu polietilenglikolni ostaci su poželjni.

Za oblike doza za oralno oslobađanje može se takođe koristiti kao nosač so modifikovane alifatične aminokiseline, kao što je natrijum-(8-[2-hidroksibenzoil]amino)kaprilat (SNAC), da bi se poboljšala absorpcija terapeutskih jedinjenja iz ovog pronalaska. Klinička efikasnost formulacije heparina, koja koristi SNAC, pokazana je u II Fazi ispitivanja obavljenog u firmi Emisphere Technologies. Videti U.S. Patent 5,792,451, "Oral drug delivery composition and methods".

Terapeutsko sredstvo se može ugraditi u formulaciju kao fini višezrnasti materijal u obliku granula ili peleta, veličine čestica oko 1 mm. Formulacija materijala za ordiniranje u obliku kapsule može biti takođe prah, slabo presovana masa ili čak kao tablete. Terapeutsko sredstvo se može dobiti presovanjem.

Sredstva za bojenje i aromatizovanje mogu takođe biti uključena: na primer, protein (ili derivat) se može formulisati (kapsuliranjem u liposom ili mikrosferu), pa se zatim ubaciti u jestivi proizvod, kao što je rashlađeni napitak, koji sadrži sredstva za bojenje i aromatizovanje.

Terapeutsko sredstvo se može razblažiti ili mu se povećati zapremina, pomoću inertnog materijala. Ovi razblaživači su ugljeni hidrati, naročito manitol, a-laktoza, bezvodna laktoza, celuloza, saharoza, modifikovani dekstrani i škrob. Mogu se takođe koristiti kao punioci neke neorganske soli, kao što su kalcijum-trifosfat, magnezijum-karbonat i natrijum-hlorid. Neki komercijalno pristupačni razblaživači su Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcopress i Avicell.

U dozu čvrstog oblika formulacije terapeutskog sredstva mogu biti uključeni i dezintegranti. Materijali koji se koriste kao dezintegranti, ne ograničavajući se na iste, su škrob, uključujući komercijalne dezintegrante na bazi škroba, Explotab. Mogu biti korišćeni i natrijum-skrobglikolat, Amberlite, natrijum-karboksimetilceluloza, ultra-amilopektin, natrijum-alginat, želatin, ljuske pomorandže, kisela karboksimetilceluloza, prirodni sunđer i bentonit. Sledeći oblik dezintegranata su nerastvorne katjonske jonoizmenjivačke smole. Kao dezintegranti i veziva mogu se koristiti sprašene gume, a to su sprašene gume kao što je agar, Karava ili tragant. Alginska kiselina i njena natrijumova so takođe se koriste kao dezintegranti.

Veziva se mogu koristiti za držanje celine terapeutskog sredstva unutar oblika tvrde tablete, a to su materijali od prirodnih proizvoda, kao što je akacija, tragant, škrob i želatin. Ostali su metilceluloza (MC), etilceluloza (EC) i karboksimetilceluloza (CMC). Polivinilpirolidon (PVP) i hidroksipropilmetilceluloza (HPMC) se mogu koristiti u alkoholnim rastvorima za granulisanje terapeutskog sredstva.

U formulaciju terapeutskog sredstva se može uključiti sredstvo protiv trenja, kako bi se sprečilo lepljenje tokom postupka formulisanja. Lubrikanti se mogu koristiti kao sloj između terapeutskog sredstva i zida kalupa, i to su, ali bez ograničavanja na iste, stearinska kiselina, uključujući njene magnezijumove i kalcijumove soli, politetrafluoroetilen (PTFE), tečni parafin, biljna ulja i voskovi. Mogu se takođe koristiti rastvorni lubrikanti, kao što je natrijum-laurilsulfat, magnezijum-laurilsulfat, polietilenglikol raznih molarnih masa, Carbowax 4000 i 6000.

Glidanti se mogu dodati da poboljšaju svojstvo tečljivosti leka tokom formulisanja i da pomognu preraspodelu prilikom presovanja. Glidanti mogu biti škrob, talk, pirogeni silicijum-dioksid i hidratisani silikoaluminat.

Da se potpomogne rastvaranje terapeutskog sredstva u vodenoj sredini, može se dodati surfaktant, kao sredstvo za kvašenje. Surfaktanti su anjonski deterdženti, kao što su natrijum-laurilsulfat, dioktil-natrijum-sulfosukcinat i dioktil-natrijum-sulfonat. Mogu se koristiti i katjonski deterdženti, koji mogu biti benzalkonijumhlorid ili benzetonijumhlorid. Listu potencijalnih nejonskih deterdženata, koji se mogu ugraditi u formulaciju kao surfaktanti, čine lauromakrogol 400, polyoxyl 40 stearat, polioksietilen hidrogenovano kastor ulje 10, 50 i 60, glicerinmonostearat, polisorbat 40, 60, 65 i 80, estar masnih kiselina saharoze, metilceluloza i karboksimetilceluloza. Surfaktanti mogu da se nalaze u formulaciji proteina ili derivata, ili samo ili kao smeša u različitim odnosima.

Aditivi koji potencijalno poboljšavaju absorpciju ovog jedinjenja su, na primer, masne kiseline, oleinska kiselina, linoleinska kiselina i linolenska kiselina.

Mogu biti poželjne i formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem. Lek se može ugraditi u inertnu matricu, npr. gumu, koja dozvoljava oslobađanje mehanizmima difuzije ili izluživanja. U formulaciju mogu da se ugrade i matrice koje se lagano razgrađuju, kao što su npr. alginati, polisaharidi. Sledeći oblik kontrolisanog oslobađanja ovog terapeutskog sredstva je po metodi terapeutskog sistema Oros

(Alza Corp.), tj. lek je zatvoren u polupropustljivu membranu koja dozvoljava ulazak vode i istiskivanje leka kroz jedan mali otvor, usled osmostskog efekta. Neke enteričke prevlake takođe imaju efekat odloženog oslobađanja.

Za formulisanje mogu da se koriste u druge prevlake. Ove obuhvataju niz šećera koji se mogu dodati u sud za oblaganje. Terapeutsko sredstvo se može takođe dati kao tableta obložena filmom, a materijali koji se u ovom primeru koriste dele se u 2 grupe. U prvoj su ne-enterički materijali, metilceluloza, etilceluloza, hidroksietilceluloza, metilhidroksi-etilceluloza, hidroksipropilceluloza, hidroksipropil-metilceluloza, natrijum-karboksi-metilceluloza, providone i polietilenglikoli. Drugu grupu čine enterički materijali, koji su obično estri ftalne kiseline.

Da bi se obezbedilo optimalno oblaganje filmom, može se koristiti smesa materijala. Oblaganje filmom se može obavljati u sudu za oblaganje ili u fluidizacionoj koloni, ili oblaganjem sa presovanjem.

Ovde se podrazumeva i pulmonarno oslobađanje sadašnjeg proteina (ili njegovih derivata). Protein (ili derivat) se oslobađa u plućima sisara prilikom inhaliranja i prolazi korz epitel pluća u krvotok. (Ostali opisi ovog su kod Adjei et al.,Pharmaceutical Research1990, 7, 565-569; Adjei et al.,International Journal of Pharmaceutics1990, 63, 135-144 (leuprolidacetat); Braquet et al.,Journal of Cardiovascular Pharmacology1989, 13(5), 143-146 (nedotelin-1); Hubbard et al.,Annals of Intemal Medicine1989, 3, 206-212 (a1-antitripsin); Smith et al.,J. ClinJnvest.1989, 84, 1145-1146 (a1-proteinaza); Osvvein et al., "Aerosolization of Proteins",Proceedings of Symposium on Respirator/Drug DeliveryII, Kevstone, Colorado, mart, 1990 (rekombinantni humani hormon rasta); Debs et al.,The Journal of lmmunology1988, 140, 3482-3488 (interferon-y i faktor nekroze tumora a) i Platz et al., U.S. Patent No. 5,284,655 (faktor stimulacije kolonija granulocita).

Za upotrebu u praksi ovog pronalaska razmatra se široki opseg mehaničkih uređaja konstruisanih za pulmonarno oslobađanje terapeutskog proizvoda, uključujući bez ograničavanja na iste, nebulizatore, inhalatore sa odmerenom dozom, inhalatore praha, koji su dobro poznati verziranima u stanje tehnike.

Neki specifični primeri komercijalno raspoloživih uređaja podesnih za praktikovanje ovog pronalaska su Ultravent nebulizer, koji proizvodi Mallinckrodt Inc., St. Louis, Missouri; Acom II Nebulizer, koji proizvodi Marquest Medical Products, Englevvood, Colorado; Ventolin inhalator sa odmerenom dozom, koji proizvodi Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina, i Spinhaler inhalator praha, koji proizvodi Fisons Corp., Bedford, Massachisetts.

Svi ovi uređaji zahtevaju upotrebu formulacija podesnih za oslobađanje pronađenih jedinjenja. Tipično, svaka formulacija je specifična za vrstu uređaja koji se koristi i može da obuhvati i upotrebu propelantskog materijala, pored razblaživača, adjuvanata i/ili nosača koji se koriste u terapiji.

Najpodesnije je da se pronađeno jedinjenje priprema u zrnastom obliku, sa prosečnom veličinom čestica manjom od 10 um, najpoželjnije od 0,5 do 5 pm, za najefikasnije distalno oslobađanje u plućima.

Nosači su ugljeni hidrati, kao što je trehaloza, manitol, ksilitol, saharoza, latoza i sorbitol. Ostali sastojci koji se koriste u formulacijama su DPPC, DOPE, DSPC i DOPC. Mogu se koristiti prirodni ili sintetski surfaktanti. Može se koristiti polietilenglikol (čak nezavisno od njegove upotrebe u derivatizovanju proteina ili analoga). Može se koristiti dekstran , kao što je ciklodekstran. Mogu se koristi soli žučne kiseline i drugi srodni poboljšivači. Može se koristiti celuloza i derivati celuloze. Mogu se koristiti aminokiseline, kao što se koriste u formulaciji pufera.

Podrazumeva se takođe upotreba lipozoma, mikrokapsula ili mikrosfera, inkluzionih kompleksa ili drugih vrsta nosača.

Formulacije koje su podesne za upotrebu u nebulizatorima, bilo sa mlazem ili ultrazvučnih, tipično sadrže pronađeno jedinjenje rastvoreno u vodi, sa koncentracijom oko 0,1 do 25 mg biološki aktivnog proteina po ml_ rastvora. Formulacije mogu takođe da sadrže pufer i prost šećer (npr. za stabilizaciju proteina i za regulisanje osmotskog pritiska). Formulacija nebulizatora može takođe da sadrži surfaktant, da se smanji ili spreči agregacija proteina indukovana površinom, koju izaziva atomizacija rastvora prilikom stvaranja aerosola.

Formulacije za upotrebu u uređajima za inhalaciju sa odmerenom dozom, obično sadrže fino usitnjen prah pronađenog jedinjenja suspendovan u propelantu, uz pomoć surfaktanta. Propelant može da bude bilo koji konvencionalan materijal koji se koristi u tu svrhu, kao što je hlorofluorougljenik, hidrohlorofluorougljenik, hidrofluorougljenik, ili ugljovodonik, uključujući trihlorofluorometan, dihlorodifluorometan, dihlorotetrafluoroetanol i 1,1,2,2-tetrafluoroetan, ili njihove kombinacije. Podesni surfaktanti su sorbitantrioelat i sojin lecitin. Kao surfaktant može se koristiti takođe i oleinska kiselina.

Formulacije za oslobađanje iz uređaja za inhalaciju praha sadrže fino usitnjen suv prah koji sadrži jedinjenje ovog pronalaska, a mogu da sadrže i sredstvo za povećanje mase, kao što je laktoza, sorbitol, saharoza, manitol, trehaloza ili ksilitol, u količinama koje olakšavaju dispergovanje praha iz uređaja, npr. 50 do 90 mas% formulacije.

Podrazumeva se takođe i nazalno oslobađanje jedinjenja ovog pronalaska. Nazalno oslobađanje omogućuje prelazak proteina u krvotok direktno posle ordiniranja terapeutskog proizvoda u nos, bez potrebe za taloženjem proizvoda u plućima. Formulacije za nazalno oslobađanje su one sa dekstranom ili ciklodekstranom. Oslobađanje transportom kroz druge mukozne membrane takođe se podrazumeva.

Doze

Režime doziranja u postupku za tretiranje gore-pomenutih stanja određuje ordinirajući lekar, uzimajući u obzir razne faktore koji modifikuju delovanje lekova, npr. starost, stanje, telesnu težinu, pol i dijetu pacijenta, ozbiljnost infekcije, vreme ordiniranja i druge kliničke faktore. Obično, doza je unutar opsega od 0,1 ug do 100 mg jedinjenja ovog pronalaska po kilogramu telesne težine na dan, poželjno 0,1 do 1000 ug/kg, a poželjnije 0,1 do 150 ug/kg za davanje u dnevnim dozama ili u ekvivalentnim dozama u dužim ili kraćim intervalima, npr. svaki drugi dan, dvaput nedeljno, nedeljno ili dva ili tri puta na dan.

Jedinjenje ovog pronalaska se može ordinirati inicijalnom udarnom dozom, posle koje sledi kontinualna infuzija za održavanje terapeutskih cirkulatornih saržaja proizvoda leka. Kao drugi primer, jedinjenje ovog pronalaska se može ordinirati kao jednokratna doza. Oni koji su uobičajeno verziranu u stanje tehike jednostavno mogu da optimizuju efikasne doze i režime ordiniranja, na osnovu postojeće medicinske prakse i kliničkog stanja pojedinog pacijenta. Frekvencija doziranja zavisi od farmakokinetičkih parametara agenasa i puta ordiniranja. Optimalne farmaceutske formulacije određuje verzirana osoba u stanju tehnike, zavisno od puta ordiniranja i željene doze. Videti na primer,Remington' s Pharmaceutical Sciences,18. izdanje (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa 18042) strane 1435-1712, čiji je opis ovde priključen kroz ovaj citat. Te formulacije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanjain vivoi brzinu iščezavanja ordiniranog agensain vivo.Zavisno od puta ordiniranja, podesna doza se može izračunavati iz telesne težine, površine tela ili veličine organa. Dalja poboljšanja u izračunavanjima neophodnim za određivanje odgovarajuće doze za tretman, uključujući svaku od gore-pomenutih formulacija, oni koji su verzirani u stanju tehnike obavljaju rutinski bez nepotrebnog eksperimentisanja, naročito u pogledu informacije o doziranju i testovima koji su ovde opisani, kao i u pogledu opaženih farmakokinetičkih podataka koji su zapaženi u kliničkim probama na humanim bićima, koji su razmatrani gore. Odgovarajuće doze se mogu utvrditi upotrebom utvrđenih testova za određivanje sadržaja doza u krvi, u vezi sa odgovarjućim podacima doza-odgovor. Konačni režim doziranja određuje ordinirajući lekar, uzimajući u razmatranje razne faktore koji modifikuju dejstvo lekova, npr. specifična aktivnosti leka, ozbiljnost oštećenja i davanje odgovora pacijenta, starosti, stanja, telesne težine, pola i dijete pacijenta, ozbiljnosti bilo koje infekcije, vremena ordiniranja i drugih kliničkih faktora. Pošto se obave proučavanja, dodaju se ostale informacije u vezi sa odgovarajućim sadržajima doze i trajanjem tretmana za različite bolesti i stanja.

Terapeutski postupci, preparati i jedinjenja iz ovog pronalaska se mogu takođe koristiti sami ili u kombinaciji sa drugim citokinima, rastvorljivim receptorom MpL, hematopoietičkim faktorima, intereleukinima, faktorima rasta ili antitelima, prilikom tretmana stanja bolesti koje karakterišu i drugi simptomi, pored deficitarnosti trombocita. Predviđa se da će se jedinjenje ovog pronalaska pokazati korisnim u tretiranju nekih oblika trombocitopenije, u kombinaciji sa opštim stimulatorima hematopoieze, kao što su 11-3 ili GM-CSF. Drugi faktori stimulacije megakariocita, tj. meg-CSF, faktor prekursorske ćelije (SCF), inhibitoni faktor leukemije (LIF), onkostatin M (OSM) ili drugi molekuli sa aktivnošću stimulacije megakariocita, mogu se takođe koristiti sa Mpl ligandom. Sledeći citokini ili hematopoietički faktori za primer u ovakvom uporednom ordiniranju su IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, faktor stimulacije kolonija-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-SCF, faktor stimulacije kolonija granulocita (G-SCF), EPO, interferon-alfa (IFN-alfa), konsenzusni interferon, IFN-beta, IFN-gama, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, trombopoietin (TPO), angiopoietini, na primer Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, polipeptid sličan humanom angiopoietinu, vaskulami endotelialni faktor rasta (VEGF), angiogenin, koštani morfogeni protein-1, koštani morfogeni protein-2, koštani morfogeni protein-3, koštani morfogeni protein-4, koštani morfogeni protein-5, koštani morfogeni protein-6, koštani morfogeni protein-7, koštani morfogeni protein-8, koštani morfogeni protein-9, koštani morfogeni protein-10, koštani morfogeni protein-11, koštani morfogeni protein-12, koštani morfogeni protein-13, koštani morfogeni protein-14, koštani morfogeni protein-15, koštani morfogeni protein receptor 1A, koštani morfogeni protein receptor 1B, neurotrofni faktor izveden iz mozga, cilijarni neurotrofni faktor, cilijarni neurotrofni faktor receptora a, citokinom indukovani neutrofilni hemotaktični faktor 1, citokinom indukovani neutrofil, hemotaktični faktor 2a, citokinom indukovani neutrofilni hemotaktični faktor 2p, faktor rasta p ćelije endotelijuma, endotelin 1, epidermalni faktor rasta, atraktant neutrofila izveden iz epitelijuma, faktor rasta fibroplasta 4, faktor rasta fibroplasta 5, faktor rasta fibroplasta 6, faktor rasta fibroplasta 7, faktor rasta fibroplasta 8, faktor rasta fibroplasta 8b, faktor rasta fibroplasta 8c, faktor rasta fibroplasta 9, faktor rasta fibroplasta 10, kiseli faktor rasta fibroplasta, bazni faktor rasta fibroplasta, izveden iz soja glijalnih ćelija neurotrofni faktor receptora a1, izveden iz soja glijalnih ćelija neurotrofni faktor receptora a2, rastu srodni protein, rastu srodni protein a, rastu srodni protein p, rastu srodni protein y, epidermalni faktor rasta koji vezuje heparin, faktor rasta hepatocita, receptor faktora rasta hepatocita, faktor rasta sličan insulinu I, receptor faktora rasta sličnog insulinu, faktor rasta sličan insulinu II, faktor rasta sličan insulinu koji vezuje protein, faktor rasta keratinocita, inhibitorni faktor leukemije, receptor a inhibitornog faktora leukemije, receptor faktora rasta nervnog faktora rasta, neurotrofin-3, neurotrofin-4, faktor rasta placente, faktor rasta placente 2, faktor rasta ćelije endotelijuma izveden iz trombocita, faktor rasta izveden iz trombocita, A lanac faktora rasta izvedenog iz trombocita, AA faktor rasta izveden iz trombocita, AB faktor rasta izveden iz trombocita, B lanac faktora rasta izveden iz trombocita, BB faktor rasta izveden iz trombocita, a receptor faktora rasta izveden iz trombocita, (3 receptor faktora rasta izveden iz trombocita, faktor stimulisanja rasta pre-B ćelije, receptor faktora rasta prekursorske ćelije, TNF, uključujući TNFO, TNF1, TNF2, a faktor rasta za transformisanje, p faktor rasta za transformisanje, pi faktor rasta za transformisanje, pl.2 faktor rasta za transformisanje, P2 faktor rasta za transformisanje, p3 faktor rasta za transformisanje, pi faktor rasta za latentno transformisanje, p faktor rasta za transformisanje koji vezuje protein I, p faktor rasta za transformisanje koji vezuje protein II, p faktor rasta za transformisanje koji vezuje protein III, receptor tipa I faktora rasta nekroze tumora, receptor tipa II faktora rasta nekroze tumora, receptor aktivatora plazminogena tipa urokinaze, faktor rasta vaskularnog endotelijuma i himerički proteini i njihovi biološki ili imunološki aktivni fragmenti. Još može biti korisno ordiniranje, bilo simultano ili sekvencijalno, efikasne količine rastvornog Mpl receptora sisara, koji izgleda ima efekat izazivanja fragmentacije megakariocita na trombocite, kada megakariociti dostignu zreo oblik. Dakle, ordiniranje jedinjenja ovog pronalaska (da bi se povećao broj zrelih megakariocita) koji sledi nakon ordiniranja rastvornog receptora Mpl (da bi se dezaktivirao ligand i dozvolilo zrelim megakariocitima da proizvode trombocite) smatra se da je naročito efikasan način stimulacije proizvodnje trombocita. Gore pomenute doze treba da se podese tako da se kompenzuju ove dodatne komponente u terapeutskom sastavu. Napredak tretiranog pacijenta se može pratiti konvencionalnim metodama.

U slučaju kada se jedinjenja ovog pronalaska dodaju u preparate za trombocite i/ili megakariocite i srodne ćelije, uključena količina se obično utvrđuje eksperimentalnim tehnikama i testovima koji su poznati u stanju tehnike. Opseg količina, je na primer od 0,1 ug do 1 mg jedinjenja ovog pronalaska na 10<6>ćelija.

Podrazumeva se da su sadržaji iz prijave ovog pronalaska u pogledu specifičnog problema ili situacije obuhvaćeni sposobnostima onog koji je uobičajeno verziran u stanje tehnike, u vezi sadržaja koji se ovde nalazi. Primeri proizvoda iz ovog pronalaska i reprezentativni postupci njihovog izolovanja, upotrebe i proizvodnje su dati u nastavku.

Primeri

I. Izlažu se postupci kao primer pravljenja nekih od jedinjenja iz prve grupe, koja je ovde opisana.

A. Materijali i postupci

Svi derivati aminokiselina (svi su L-konfiguracije) i smola koji su korišćeni u sintezi peptida, poručeni su iz firme Novabiochem. Reagensi za sintezu peptida (DCC, HOBt, itd.) su poručeni u oblicima rastvora iz firme Applied Biosvstems, Inc. Dva derivata PEG su iz firme Shearvvater Polvmers, Inc. Svi rastvarači (dihlorometan, N-metilpirolidinon, metanol, acetonitril) su iz firme UM Sciences. Analitika HPLC je obavljana na sistemu Beckman, sa kolonom Vvdac (0,46 cm*25 cm, C18 reversna faza, 5 mm), sa protokom 1 mL/min, uz dvostruku detekciju sa UV, na 220 i 280 nm. U svim operacijama HPLC korišćeni su linearni gradijenti sa dve mobilne faze: Pufer A-H20 (0,1% TFA) i Pufer B-acetonitril (0,1% TFA). Brojni peptidi na koje se ovde poziva, npr. 17b, 18, 19 i 20, su numerisani pozivanjem na Tabelu 1, a neki od njih su dodatno ilustrovani na Slikama 2 i 3.

Sinteza peptida

Svi peptidi se dobijaju po metodi dobro poznate sinteze na čvrstoj fazi u više koraka. Sinteza na čvrstoj fazi sa Fmoc hernijom se obavlja korišćenjem ABI sintetizera peptida. Tipično, sinteza peptida počinje sa prethodno napunjenom VVang-ovom smolom, na 0,1 mmol skali. Deprotekcija Fmoc se obavlja po standardnom piperidinskom protokolu. Kuplovanje se ostvaruje upotrebom DCC/HOBt. Zaštićene grupe u bočnom lancu su: Glu(O-t-Bu), Thr(t-Bu), Arg(Pbf), Gln(Trt), Trp(t-Boc) i Cys(Trt). Kod prvog prekursora peptida za pegilovanje, Dde se upotrebljava za zaštitu bočnog lanca Lys na linkeru, a Boc-Ile-OH se upotrebljava za poslednje kuplovanje. Dde se uklanja upotrebom bezvodnog hidrazina (2% u NMP, 3><2 min), nakon čega sledi kuplovanje sa anhidridom bromosirćetne kiseline, prethodno oblikovano delovanjem DCC. Za petid 18, cisteinski bočni lanac u linkeru zaštiti se tritil grupom. Krajnja deprotekcija i cepanje svih peptidil-smola osvaruje se tokom 4 h na sobnoj temperaturi, koristeći trifluorosirćetnu kiselinu (TFA) koja sadrži 2,5% vode, 5% fenola, 2,5% triizopropilsilana i 2,5% tioanizola. Posle uklanjanja TFA, otcepljeni peptid se istaloži sa hladnim bezvodnim etrom. Stvaranje cikličnog peptida preko disulfida obavlja se direktno na sirovom materijalu, korišćenjem 15% DMSO u vodi (pH 7,5). Svi sirovi peptidi su prečišćeni preparativnom HPLC sa reversnom fazom, a strukture su potvrđene sa ESI-MS i analizom aminokiselina.

Alternativno, svi gore opisani peptidi se mogu dobiti korišćenjem t-Boc hernije. U tom slučaju, polazne smole su klasična Mirrifield-ova ili Pam-ova smola, a zaštitne grupe u bočnom lancu su: Glu(OBzl), Thr(Bzl), Arg(Tos), Trp(CHO), Cvs(p-MeBzl). Za krajnje cepanje peptidil smola koristi se fluorovodonik (HF).

Svi tandemski dimerni peptidi koji su opisani u ovoj studiji, koji imaju linkere od prirodnih aminokiselina, mogu se dobiti takođe tehnologijom rekombinantne

DNA.

PEGilovanie

Razvijena je nova, konvergentna strategija za pegilovanje sintetskih peptida koja se sastoji u kombinovanju, preko formiranja konjugovane veze u rastvoru, peptida i PEG ostatka, pri čemu svaki nosi posebnu funkcionalnost koja je uzajamno reaktivna prema onoj drugoj. Prekursorski peptidi se mogu lako dobiti konvencionalnom sintezom na čvrstoj fazi, kao što je opisano gore. Kao što je opisano u nastavku, ovi peptidi su "pred-aktivirani" sa odgovarajućom funkcionalnom grupom na specifičnom mestu. Prekursori se prečiste i potpuno karakterišu pre reagovanja sa PEG ostatkom. Povezivanje peptida sa PEG se obično odigrava u vodenoj fazi i lako se može pratiti analitički pomoću HPLC sa povratnom fazom. Pegilovani peptidi se mogu lako prečistiti preparativnom HPLC i karakterisati sa analiitičkom HPLC, analizom aminokiselina i laserskom desorpcionom masenom spektrometrijom.

Pobijanje peptida 19

Peptid 17b (12 mg) i MeO-PEG-SH 5000 (30 mg, 2 ekviv.) se rastvore u 1 ml_ vodenog pufera (pH 8). Smeša se inkubira oko 30 min na sobnoj temperaturi, a reakcija se proverava analitičkom HPLC, koja pokazuje da je >80% reakcije završeno. Pegilovani materijal se izoluje preparativnom HPLC.

Pobijanje peptida 20

Peptid 18 (14 mg) i MeO-PEG-maleimid (25 mg) se rastvore u oko 1,5 mL vodenog pufera (pH 8). Smeša se inkubira oko 30 min na sobnoj temperaturi, za koje vreme se završi oko 70% transformacije, što se prati analitičkom HPLC, unošenjem alikvota uzorka u kolonu HPLC. Pegilovani materijal se prečisti preparativnom HPLC.

Test bioaktivnosti

Biotestin vitroTPO je mitogeni test, koji koristi IL-3 zavisni klon 32D ćelija murina, transfektovan humanim mpl receptorom. Ovaj test je detaljno opisan u WO 95/26746. Ćelije se drže u medijumu MEM koji sadrži 10% fetusnog klona II i 1 ng/mL mlL-3. Pre dodavanja uzorka, ćelije se pripreme dvostrukim ispiranjem sa medijumom za rast kome nedostaje mlL-3. Dobije se proširena na dvanaest tačaka standardna kriva TPO, koja se kreće od 3333 do 39 pg/mL. Za svaki uzorak pripreme se četiri razblaženja, za koja je procenjeno da padaju u linearni deo standardne krive (1000 do 125 pg/mL) i urade u triplikatu. Uzorak svakog razblaženja, zapremine 100 uL, ili standard, se dodaju u odgovarajuće bazenčiće mikrotitarske ploče sa 96 bazenčića, koji sadrži 10.000 ćelija/bazenčić. Posle 44 h na 37°C i u 10% C02, doda se u svaki bazenčić MTS (tetrazolsko jedinjenje koje se redukuje pomoću ćelija do formazana). Približno 6 h kasnije pročita se optička gustina na čitaču ploče, pri 490 nm. Generiše se kriva doza-odgovor (logTPO koncentracije prema optičkoj gustini umanjenoj za šlepu probu), pa se obavi linearna regresiona analiza tačaka koje padaju u linearni deo standardne krive. Odrede se koncentracije nepoznatih testiranih uzoraka, koristeći dobijenu linearnu jednačinu i korekciju za faktor razblaživanja.

Skraćenice

HPLC: tečna hromatografija visoke performanse; ESI-MS: masena spektrometrija sa jonizacijom pomoću elektronskog spreja; MALDI-MS: masena spektrometrija sa jonizacijom laserskom desorpcijom potpomognutom matricom; PEG: poli(etilenglikol). Sve aminokiseline su predstavljene standardnim šiframa sa tri slova ili sa jednim slovom. T-Boc: terc-butosikarbonil; tBU: terc-butil; Bzl: benzil; DCC: dicikloheksilkarbodiimid; HOBt: 1-hidroksibenzotriazol; NMP: N-metil-2-pirolidinom; Pbf: 2,2,4,6,7-pendametilhidro-benzofuran-5-sulfonil; Trt: tritil; Dde: 1-(4,4-dimetii-2,6-diokso-cikloheksiliden)etil.

B. Rezultati

TMP tandemski dimeri sa poliglicinskim linkerima

Konstrukcija sekvencijalno povezanih TMP dimera je zasnovana na predpostavci da je neophodan dimerni oblik TMP za njegovu efikasnu interakciju sa c-MpI (receptor TPO) i da zavisno od toga kako su oni postavljeni jedan prema drugom u kontekstu receptora, dva molekula TMP bi mogla povezati lance u konfiguraciji C- i N-terminusa na takav način da on ne smeta ukupnoj dimernoj konformaciji. Jasno, aktivnost tandemski povezanih dimera može takođe da zavisi od pravog izbora dužine i sastava linkera koji spaja C- i N-terminuse dva sekvencijalno postavljenja TMP monomera. Pošto ne postoji informacija o strukturi TMP veze za c-MpI, sintetizovan je niz dimernih peptida sa linkerima koji su sačinjeni od 0 do 10 i do 14 glicinskih ostataka (Tabela 1). Glicin je odabran zbog njegove jednostavnosti i fleksibilnosti. Rezonovano je da fleksibilni glicinski peptidni lanac može da dopusti slobodno savijanje dva povezana lanca TMP i njihovo ponavljanje u traženu konformaciju, dok bi aminokiseline sa sterno jačim nagoveštajem mogle da dovedu do nepoželjnih sekundarnih struktura čija krutost može da prekine korektno pakovanje dimernog peptida u kontekst receptora.

Do ovakvih peptida se lako dolazi konvencionalnim metodama sinteze peptida na čvrstoj fazi (Merrifield, R.B.,Journal of American Chemical Society1963, 85, 2149) bilo kojom od hernija Fmoc ili t-Boc. Za razliku od sinteze paralelnih dimera povezanih preko C-terminusa (SEQ ID NO: 2) koja zahteva upotrebu ortogonalne protekcije lizinskog ostatka, kao inicijalne tačke grananja za izgradnju dva peptidna lanca na pseudosimetričan način (Cvvirla, S. E: et al.Science1997, 276. 1696-1699), sinteza naših tandemskih dimera je jednostavno, postepeno spajanje kontinualnih peptidnih lanaca sa C- i N-terminisom. Pošto dimerizacija TMP ima dramatičniji efekat na proliferativnu aktivnost nego na afinitet za vezivanje, kao što je pokazano na dimeru preko C-terminala (Cvvirla, S.E: et al.,Science,1997. ,276_ 1696-1699). sintetski peptidi su testirani direktno na biološku aktivnost u testu proliferacije ćelije koji zavisi od TPO, koristeći II-3 zavisni klon 32D ćelija murida, transficiran sa celokupnom dužinom c-MpI (Palacios, R. Et al.,Cell,1985, 41, 727). Kao što pokazuju rezultati testiranja (Tabela 1 u nastavku) svi tandemski dimeri povezani preko poliglicina su pokazivali >1000-struko povećanje efikasnosti u poređenju sa monomerom, a bili su čak efikasniji od dimera preko C-terminula u ovom testu ćelijske proliferacije. Apsolutna aktivnost dimera preko C-terminusa u našem testu bila je niža nego ista u originalnom TPO proteinu, i razlikuje se od prethodno objavljenih nalaza u kojima je dimer preko C-terminusa aktivniji od priordnog liganda (Cvvirla, S.E. et al.Science1997, 276, 1696-1699). Ovo može biti usled razlike u uslovima koji su korišćeni u ova dva testa. Ipak, razlika u aktivnosti između tandemskih dimera (terminal prvog monomera je povezan sa N-terminusom drugog monomera) i paralelnih dimera (terminal prvog monomera je povezan sa C-terminusom drugog monomera) u istom testu, jasno pokazuje superiornost tandemski dimerizovanog proizvoda u poređenju sa paralalnim dimerskim proizvodom. Interesantno je da linker toleriše širok opseg dužina. Optimalni linker sa izabranim TMP monomerima (SEQ ID NO: 1) očigledno je sastavljen od 8 glicina.

Ostali tandemski dimeri

Nakon prve serije TMP tandemskih dimera, konstruisano je nekoliko drugih molekula, ili sa raličitim linkerima, ili su sadržali modifikacije na samom monomeru. Prvi od ovih molekula, peptid 13, ima linker sastavljen od GPNG, sekvencije za koju se zna da ima visoku sklonost formiranju sekundarne strukture tipa p-obrta. Mada je oko 100-struko efikasniji od monomera, nađeno je da je ovaj peptid >10-struko manje aktivan od analoga povezanog sa GGGG. Dakle, uvođenje relativno krutog p-obrta u linkerski region izgleda da izaziva blagu distorziju optimalne konformacije agonista u ovom kratkom obliku linkera.

Trp9 u TMP sekvenciji je visoko konzerviran ostatak između aktivnih peptida izolovanih iz prosečne biblioteke peptida. Postoji takođe visoko konzervirani Trp u jednoglasnim sekvencijama EPO mimetičkih peptida i nađeno je da ovaj Trp ostatak učestvuje u formiranju hidrofobnog jezgra između dva EPO mimetička peptida (EMP-ovi) i doprinosi hidrofobnim interakcijama sa receptorom EPO (Livnah, O. et al.,Science1996, 273, 464-471). Po analogiji, mislilo se da Trp ostatak u TMP može imati sličnu funkciju u dimerizaciji peptidnog liganda, i u pokušaju da se modulišu i procene efekti nekovalentnih hidrofobnih sila koje se javljaju između dva indolska prstena, konstruisano je nekoliko analoga, što je imalo za rezultat mutacije na Trp. Tako, u peptidu 14, Trp ostatak u svakom od dva TMP monomera je zamenje sa Cys, pa je oksidacijom formirana unutarmolekulska disulfidna veza između dva cisteina, koja je, kako je bilo predviđeno, trebalo da imitira hidrofobne interakcije između dva Trp ostatka prilikom dimerizacije peptida. Peptid 15 je redukovan iz peptida 14. U peptidu 16, dva Trp ostatka su zamenjena sa Ala. Kao što pokazuju rezultati testa, ova sva tri analoga su bila neaktivna. Ovi podaci demonstriraju još da je Trp važan za aktivnost mimetičkog peptida TPO, a ne samo za stvaranje dimera.

Sledeća dva peptida (peptid 17a i 18) sadrže u njihovom linkeru od 8 aminokiselina ostatak Lys i Cys. Ova dva jedinjenja su prekursori dva pegilovana peptida (peptid 19 i 20) u kojima je bočni lanac sa Lys i Cys modifikovan ostatkom polietilenglikola (PEG). Odlučeno je da se uvede PEG ostatak u sredinu relativno dugog linkera, tako da je velika komponenta PEG (5 kDA) dovoljno daleko od značajnih mesta za vezivanje u peptidnom molekulu. Za PEG se zna da je biokompatibilan polimer, koji se sve više koristi kao kovalentni modifikator za pooboljšanje farmakokinetičkih profila terapeutski sredstava baziranih na peptidu i proteinu.

Smišljen je modularni metod, zasnovan na rastvoru, za podesno pegilovanje sintetskih ili rekombinantnih peptida. Ovaj metod je zasnovan na danas dobro zasnovanoj strategiji hemoselektivnog vezivanja, koja koristi specifičnu reakciju između para uzajamno reaktivnih funkcionalnosti. Tako, za pegilovanje peptida 19, prethodno se aktivira lizinski bočni lanac sa bromoacetil grupom, dajući peptid 17b, da bi se tu smestila reakcija sa PEG, koji je derivatizovan tiolom. Da bi se to obavilo, za protekciju lizinskog e-amina se koristi ortogonalna zaštitna grupa Dde. Kada se jedanput ceo peptidni lanac sastavi, ponovo se zaštiti amin N-terminala sa t-Boc. Zatim se ukloni Dde da bi se omogućilo bromoacetilovanje. Ova strategija daje sirovi peptid visokog kvaliteta koji se lako prečišćava korišćenjem konvencionalne HPLC sa reversnom fazom. Povezivanje peptida sa PEG koji je modifikovan sa tiolom, odigrava se u vodenom puferu na pH 8, a reakcija sa završava za 30 min. Analiza MALDI-MS prečišćenog, pegilovanog materijala je pokazala karakterističan spektar zvonastog oblika, sa inkrementom od 44 Da između susednih pikova. U PEG-peptidu 20. cisteinski ostatak je stavljen u linkerski region, a tiolska grupa u njegovom bočnom lancu služi kao mesto za spajanje PEG koji sadrži maleimid. Slični uslovi se koriste pri pegilovanju ovog peptida. Kao što pokazuju rezultati testa, ova dva pegilovana peptida imaju čak veću aktivnostin vitrood njihovh ne-pegilovanih kopija.

Peptid 21 ima u njegovom linkeru od 8 aminokiselina potencijalni motiv za glikozilovanje, NGS. Pošto je primerak ovih tandemskih dimera napravljen od prirodnih aminokiselina povezanih peptidnim vezama, ekspresija takvog molekula u odgovarajućem eukariotičkom ćelijskom sistemu bi proizvodila glikopeptid sa ugljeno-hidratnim ostatkom dodatim u bočnom lancu karboksiamida Asn. Glikozilovanje je uobičajen proces post-translacione modifikacije koji može imati više pozitivnih uticaja na biološku aktivnost datog proteina, povećavanjem njegove rastvorljivosti u vodi i stabilnostiin vivo.Kao što pokazuju rezultati testa, ugrađivanje ovog motiva za glikozilovanje u linker održava visoku bioaktivnost. Sintetski prekursor potencijalnog glikopeptida ima efekat na aktivnost koja je uporedna sa onom -(Gly)8-vezanog analoga. Jedanput kada se glikoziluje, očekuje se da ovaj peptid ima aktivnost istog reda kao i pegilovani peptidi, zbog sličnih hemofizičkih svojstava koja pokazuju PEG i ostatak ugljenog hidrata.

Poslednji peptid je dimer dimera. Dobija se oksidacijom peptida 18, koji gradi unutar molekulsku disulfidnu vezu između dva cisteinska ostatka koji su smešteni u linkeru. Ovaj peptid je konstruisan da se naglasi mogućnost da je TMP aktivan kao tetramer. Rezultati testa pokazuju da ovaj peptid nije aktivniji od prosečnih tandemskih dimera, na podešenoj molarnoj bazi, što indirektno potvrđuje ideju da je zaista aktivni oblik TMP dimer, inače bi dimerizacija tandemskog dimera imala dodatni uticaj na bioaktivnost.

Tabela I koja sledi, daje sumarno relativne aktivnosti (relativne efikasnosti) gore-opisanih jedinjenja, zasnovane nain vitrotestovima, kao što je prethodno opisano.

PRIMEDBA: Brojevi u tabeli pokazuju približno 1 log aktivnosti, tako da je razlika u aktivnosti između "1" i "4" približno 1000-struka. Inkrement 0,5 je intermedijarna tačka, tako da aktivnost između "1" i "3,5" je približno 500-struka. "ND" označava da nije određivana. II. U nastavku se izlažu metode kao primeri za dobijanje nekih jedinjenja druge grupe, koja su ovde opisana.

A. Pobijanje fuzionisanog jedinjenja Fc vrste koja je pokazana na Slici 6C

Sekvencija PNA koja kodira Fc region humanog lgG1 fuzionisana je u delovima uz dimer TPO-mimetičkog peptida (SEQ ID NO. 34), pa se stavi pod kontrolu promotera luxPr u izlučenom vektoru plazmida pAMG21, kao što sledi.

Gen za fuzionisanje se konstruiše korišćenjem standardne PCR tehnologije. Šabloni za PCR reakcije bili su vektori za fuzionisanje koji sadrže Fc sekvenciju i sintetski gen koji kodira ostatak jedinjenja SEQ ID NO: 34. Sintetski gen je konstruisan iz 4 preklopljena oligonukleotida, pokazana niže:

Ova 4 oligonukleotida su sparivana tako da formitraju dupleks pokazan niže:

SEQ ID NO: 39 [kolinearni oligonukleotidi 1830-52 i 1830-54],

SEQ ID NO: 40 [kolinearni oligonukleotidi 1830-53 i 1830-55], i

SEQ ID NO: 41 [kodirana sekvencija aminokiselina]

Ovaj dupleks je amplifikovan u reakciji PCR koristeći 1830-52 i 1830-55 kao sensne i antisensne prajmere.

Fc deo molekula se generiše PCR reakcijom, sa FC DNA, koristeći prajmere

Oligonulkeotidi 1830-51 i 1830-52 sadrže proizvod preklapanja 24 nukleotida, dozvoljavajući da se dva gena fuzionišu zajedno u korektno očitavanje delova, kombinovanjem gornjih proizvoda PCR u trećoj reakciji, koristeći spoljašnje prajmere 1216-52 i 1830-55.

Krajnji genski proizvod (fuzionisani gen pune dužine) se digestira sa restrikcionom endonukleazomX6ali SamHI, pa se zatim veže u vektor pAMG21 (videti niže), koji se takođe digestira saXbali BamHI. Povezana DNA se transformiše u kompetentnim ćelijama domaćinaE. Coli,soj 2596 (GM221, opisan niže). Kloni se ispituju u pogledu svojstva da proizvode rekombinantni proteinski proizvod i na posedovanje fuzije gena koji ima korektnu sekvenciju nukleotida. Sadržaji izlučivanja proteina se određuju u studijama u balonu od 50 ml_ sa mućkanjem. Celokupni ćelijski lizati se analiziraju na izlučivanje fuzije pomoću Coomassie PAGE obojenih gelova.

Sekvencija aminokiselina fuzionisanog proteina je pokazana ispod odgovarajuće sekvencije nukleotida. Eksprimovani plazmid pAMG21 se dobija iz ATW pod pristupnim brojem 98113, koji je deponovan 24 jula 1996.

GM221 ( Amgen- ov soj domaćina # 2596)

Amgen-ov soj domaćina #2596 je sojE. ColiK-12 koji je modifikovan tako da sadrži i temperaturno osetljivi lambda represor cl857s7 u početnom regionuebgi 1acl<Q>represor u krajnjemm regionuebg(68 min). Prisustvo ova dva represorska gena dozvoljava da se koristi ovaj domaćin sa raznim sistemima ekspresije. Međutim, oba ova represora su nevažna za ekspresiju iz luxPR. Netransformisani domaćin nema otpornost prema antibioticima.

Mesto vezivanja ribozoma gena cl857s7 je modifikovano tako da sadrži poboljšani RBS. Ovaj se umetne uebgoperon, između nukleotida na položaju 1170 i 1411, kao što je numerisan u Banci gena pod pristupnim brojem M64441 Gb_Ba, sa izbacivanjem interventne sekvencijeebg.

Ovaj konstrukt se oslobađa u hromozome, koristeći rekombinantnu fagu, nazvanu Mmebg-cl857s7, poboljšanu sa RBS#4 u F'tet/393. Posle rekombinacije i rezolucije samo gore opisani hromozomski umetak ostaje u ćeliji. On je preimenovan u F'tet/GM101.

Zatim se modifikuje F'tet/GM101 oslobađanjem konstrukta 1acl<Q>uebgoperonu između položaja 2493 i 2937 u nukleotidu, prema numeraciji u Banci gena, pod pristupnim brojem M64441Gb_Ba, sa izbacivanjem interventne sekvencijeebg.

Ovaj konstrukt se oslobađa u hromozom, koristeći rekombinantnu fagu nazvanu Agebg-LaclQ#5 u F'tet/GM101. Posle rekombinovanja i razdvajanja, samo gore opisani hromozomski umetak ostaje u ćeliji. On je preimenovan u F'tet/GM221. Episom F'tet se izvadi iz snopa vlakana korišćenjem akridin-oranža koncentracije 25 ug/mL u LB. Izvučeni snop vlakana je identifikovan kao osetljiv na tetracilin i čuva se kao GM221.

Fuzioni konstrukt Fc koji se sadrži u plazmidu pAMG21 (ovde se navodi kao pAMG21-Fc-TMP-TMP), koji se opet sadrži u soju domaćina GM221, istaloži se na ATCC, pod pristupnim brojem 98957, sa datumom deponovanja 22. oktobar 1998.

Ekspresija

Kulture pAMG21-Fc-TMP-TMP uE. ColiGM221 u medijumu Luria Broth koji sadrži 50 ug/mL kanamicina, inkubiraju se na 37°C, pre indukcije. Indukcija gena Fc-TMP-TMP kao proizvoda ekspresije iz luxPR promotera postiže se posle dodavanja sintetskog autoizazivača N-(3-oksoheksanoil)-DL-homoserin laktona u medijum kulture, do konačne koncentracije 20 ng/mL, pa se kulture inkubiraju još 3 h na 37°C. Posle 3 h bakterijske kulture se ispitaju mikroskopijom na prisustvo uključaka, pa se zatim sakupe centrifugiranjem. Prisustvo refrakcije tela uključaka je opaženo u indukovanim kulturama, što ukazuje da se Fc-TMP-TMP najverovatnije proizvodi kao nerastvorna frakcija uE. Coli.Pelete ćelija direkto se lizuju resuspendovanjem u uzorku Laemmli-jevog pufera koji sadrži 10% p-merkaptoetanola, pa se analiziraju pomoću SDS-PAGE. Intenzivna Coomassie-va bojena traka od približno 30 kDa se opaža na gelu SDS-PAGE. Očekivani genski proizvod trebalo bi da ima 269 aminokiselina u dužinu i da ima očekivanu molekulsku težinu od oko 29,5 kDa. Fermentacija se takođe obavlja pod standardnim uslovima šarže, na skali od 10 L, što vodi sličnim sadržajima ekspresije Fc-TMP-TMP onima koji su dobijeni na laboratorjskoj skali.

Prečišćavanje Fc- TMP- TMP

Ćelije se razbiju u vodi (1/10) homogenizacijom pod visokim pritiskom (2 prolaza na 9,7 bar), pa se inkluziona tela sakupe centrifugiranjem (4200 o/min u J-6B, tokom 1 h). Inkluziona tela se solubilizuju u 6M gvanidinu, 50 mM Tris, 8 mM DTT, na pH 8,7 tokom 1 h, pri odnosu 1/10. Solubilizovana smeša se razblaži 20 puta u 2M urei, 50 mM Tris, 160 mM argininu, 3 mM cisteinu, pri pH 8,5. Smeša se preko noći meša na hladnom. U ovoj fazi procedure, Fc-TMP-TMP

monomerske subjedinice dimerizuju, formirajući jedinjenje povezano preko disulfida, koje ima strukturu pokazanu na Slici 6C, pa se ovo zatim koncentriše ultrafiltracijom oko 10 puta. Potom se 3 puta razblaži sa 10 mM Tris, 1,5 M urea, pri pH 9. Potom se podesi pH ove smeše sa sirćetnom kiselinom na pH 5. Talog se ukloni centrifugiranjem, a bistrim slojem se napuni SP-Sepharose Fast Flow kolona, uravnotežena sa 20 mM NaAc, 100 mM NaCI, sa pH 5 (punjenje proteina 10 mg/mL, sobna temperatura). Protein se eluira koristeći 20 zapremina kolone u istom puferu, sa gradijentom koji se kreće od 100 mM NaCI do 500 mM NaCI. Sjedinjene frakcije iz kolone se razblaže 3 puta, pa se time napuni Sp-Sepharose HP kolona sa 20 mM NaAc, 150 mM NaCI, pri pH 5 (punjenje proteina 10 mg/mL, sobna temperatura). Protein se eluira sa 20 zapremina kolone, koristeći gradijent u istom puferu, koji se kreće od 150 mM NaCI do 400 mM NaCI. Sakupi se sadržaj pika i filtrira. III. Sledi pregled podatakain vivona miševima, sa raznim jedinjenjima ovog pronalaska.

Miševi

Normalna ženka BDF1, starosti približno 10-12 nedelja.

Program uzimanja krvi

Deset miševa po grupi tretira se 0. dana, dve grupe su startovale 4. dana odvojeno sa ukupno 20 miševa po grupi. U svakoj vremenskoj tački uzimana je krv od pet miševa, miševima je uzimana krv najmanje tri pita nedeljno. Miševi se anesteziraju sa izofluranom, a ukupna zapremina krvi od 140-160 pL se dobije punktiranjem orbitalnog sinusa. Krv se broji u uređaju Technicon H1E blood analvzer, sa softverom za krv murida. Mereni parametri su bela krvna zrnca, crvena krvna zrnca, hematokriti, hemoglobin, trombociti, neutrofili.

Tretman

Miševi su dobijali ili injekcije potkožno za tretman sa jednom dozom, ili implant sa 7-mo dnevnom mikro-osmostskom pumpom za kontinualno oslobađanje. Potkožne injekcije se daju sa zapreminom od 0,2 mL. Osmotske pumpe se umeću u potkožnu inciziju načinjenu na koži između skapula miševa, pod anestezijom. Jedinjenja se razblažuju u PBS sa 0,1% BSA. Svi eksperimenti su imali jednu kontrolnu grupu, obeleženu sa "nosač", koja je bila tretirana samo sa ovim razblaživačem. Koncentracija testiranih sadržaja u pumpama je podešena tako da kalibrisani protok iz pumpi daje sadržaje koji su indicirani za tretman, a pokazani su grafički.

Jedinjenja

Titracija doze jedinjenja se oslobađa u mišu mikro-osmostskom pumpom.tokom 7 dana. Miševi su tretirani sa različitim jedinjenjima pri jedinstvenoj dozi od 100 ug/mL, u 7-mo dnevnoj osmotskoj pumpi. Neka od istih jedinjenja su zatim davana miševima kao jedna bolus injekcija.

Rezultati testa aktivnosti

Rezultati eksperimenata o aktivnosti su pokazani na Slikama 4 i 5. U testovima doza-odgovor, koristeći 7-mo dnevnu mikro-osmotsku pumpu (podaci nisu prikazani) opažen je maksimalni efekat sa jedinjenjem SEQ ID NO: 18, od 100 ug/kg/dan. Doza od 10 ug/kg/dan je bila oko 50% za maksimalno aktivna, a 1 ug/kg/dan je bila najniža pri kojoj se može opaziti aktivnost u ovom sistemu testiranja. Jedinjenje sa dozom 10 ug/kg/dan je približno jednako aktivno kao nepegilovani rHu-MGDF pri 100 ug/kg/dan, u istom eksperimentu.

IV. Diskusija

Opšte je prihvaćeno da MGDF deluje na način koji je sličan humanom hormonu rasta (hGH), tj. jedan molekul proteinskog liganda vezuje dva molekula receptora pri njegovom aktiviranju (VVells, J.A. et al.,Ann. Rev. Biochem.1996, 65, 609-634). Ovakva interakcija imitirana je dejstvom mnogo manjeg peptida TMP. Međutim, ove studije ukazuju da ova mimikrija zahteva usaglašeno delovanje dva TMP molekula, pošto kovalentna dimerizacija TMP, bilo na paralelni C-C ili sekvencijalni C-N način, povećava biološku efikasnost originalnog monomerain vitroza faktor veći od 10<3>. Relativno niska bioefikasnost monomera verovatno je usled neefikasnosti stvaranja nekovalentnog dimera. Prethodno formirani kovalentni dimer ima sposobnost da eliminiše entropijsku barijeru za stvaranje nekovalentnog dimera, koja je isključivo posledica slabih, nekovalentnih interakcija između dva molekula malog peptida od 14-ostataka.

Interesantno je da je većina tandemskih dimera efikasnija od dimera sa paralelnim C-terminalima. Tandemska dimerizacija izgleda da daje molekulu bolje fitovanje konformacije, nego što to čini paralelna C-C dimerizacija. Prividno nesimetrično svojstvo tandemskog dimera može biti da ga dovodi bliže prirodnom ligandu, koji, kao nesimetričan molekul, koristi dva različita mesta za vezivanje dva identična molekula receptora.

Umetanje PEG ostatka je zamišljeno da poboljša aktivnost modifikovanog petidain vivo,dajući mu zaštitu od proteolitičke degradacije, i usporavajući njegovo uklanjanje kroz bubrežno filtriranje. Nije se očekivalo da pegilovanje može još da poboljša bioaktivnost tandemski dimerizovanog TMP peptidain vitro,u testu proliferacije na bazi ćelije. V. Sledi rezime podatakain vivona majmunima, za razna jedinjenja ovog pronalaska.

Da bi se vrednovali hematološki parametri ženki rezus majmuna, koji su povezani sa ordiniranjem AMP2 potkožnim ordiniranjem, napravljen je i izveden sledeći protokol. Sakupljeno je pet grupa po tri majmuna u svakoj. Grupa 1 je služila kao kontrolna i primala je acetatni pufer (20 mM natrijum-acetat, 0,25 mM natrijum-hlorid, pH 5) koji nije sadržao AMP2 niti pegilovani, rekombinantni humani MGDF (PEG-rHuMGDF). Grupa 2 je primala jednu ili više doza AMP2 u intervalima koji su naznačeni niže. Grupa 3 je primala 1000 ug/kg AMP2 u intervalima koji su naznačeni niže. Grupa 4 je primala 5000ug/ kgu intervalima koji su naznačeni niže, i Grupa 5 je primala 100 ug/kg PEG-rHuMGDF u intervalima koji su naznačeni niže.

Dan kada je ordinirana prva pojedinačna doza je označen kao 0. Dan 1. Ciklusa. U 2. Ciklusu doze su ordinirane u dane: 21, 23, 25, 28, 30 i 32. Tokom 3. Ciklusa pojedinačna doza je ordinirana 84. dana, a u 4. Ciklusu pojedinačna doza je ordinirana 123. dana. Praćeni su klinički znaci kod životinja jedanput na dan u periodu aklimatizacije, a tri puta na dan (pre doziranja, neposredno ili 30 min nakon doziranja i 2 do 3 h posle doziranja) u dane doziranja i jedanput na dan u dane kada nije bilo doziranja. Potrošnja hrane je izračunavana svakodnevno, na osnovu broja komada hrane koji su dati i broja koji su preostali, za svaku životinju, počevši od 7 dana pre početka perioda doziranja, pa do kraja perioda oporavka. Telesna težina svake životinje je merena dva puta pre režima doziranja i dva puta tokom doziranja i perioda oporavka. Uzorci krvi za hematologiju su pripremljeni jedanput pre početka doziranja i po jedanput u dane: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 22, 24, 26, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 111, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 150. Za farmakokinetičku analizu sakupljani su uzorci od 0,5 mL seruma, jedanput pre doziranja i jedanput 1, 4 i 24 h posle doziranja. Uzorci su uzimani u dane 0, 21, 32, 84 i 123, pa su čuvani na približno -70°C do analize. Za analizu antitela, uzimani su uzorci krvi od 2 mL nedelju dana pred svaku pojedinačnu dozu i po jedanput u dane 0 (pred doziranje), 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104, 11, 118, 129, 136, 143 i 150. Uzorci su čuvani na -70°C do analize.

Rezultati su pokazali da su vrednosti za trombocite porasle u svim tretiranim grupama, a najveći porasti su zapaženi za PEG-rHuMGDF i grupe sa visokom dozom AMP2. U 1. Ciklusu vrednosti za trombocite u piku su porasle približno 3,3-struko, a 3,1-struko u grupi Peg-rHuMGDF (9. dan) i grupi AMP2 od 5000 ug/kg (9. dan), respektivno, u poređenju sa srednjim brojem trombocita u kontrolnoj grupi. Vrednosti trombocita za nisku dozu AMP2 su porasle približno 1.5-struko prema kontroli, u iste naznačene dane studije. Slični odgovori su zapaženi u svim ostalim ciklusima.

Međutim, u 4. Ciklusu, grupa PEG-rHuMGDF nije pokazala tako veliki porast broja trombocita kao u prethodnim ciklusima. Grupa PEG-rHUMGDF je imala približno 2-struko povećanje broja trombocita u odnosu na kontrolnu grupu, 9. dana posle doziranja u ovom ciklusu. Za poređenje, srednji broj trombocita u grupi sa najvišom dozom AMP2 u 4. Ciklusu bio je 3,3-struko veći nego u kontrolnoj grupi. Pored toga, PEG-rHuMGDF životinje su imale srednji broj trombocita za 53% niži od srednjeg broja trombocita u kontrolnoj grupi, na početku 4. Ciklusa (po dozi), a srednji broj trombocita ove grupe na kraju 4. Ciklusa (27 dana posle primanja doze) bio je 79% niži, nego isti u kontrolnoj grupi. Za sve AMP2 životinje na početku i kraju 4. Ciklusa iznosio je ±15% broja trombocita u kontrolnoj grupi.

U 1. i 2. Ciklusu trend smanjena broja crvenih krvnih zrnaca (RBC) zapažen je u svim tretiranim grupama, u poređenju sa kontrolnom. Najevidentnije sniženje je bilo od 41 do 43 dana, a najveće sniženje u RBC je zapaženo u grupi PEG-rHuMGDF. Ovi brojevi počinju da se vraćaju na normalne nivoe (u poređenju sa kontrolnom grupom) tek od 47 dana. Sadržaji belih krvnih zrnaca (WBC) tokom 1. i 2. Ciklusa su dramatično porasli (2,6-struko) 35. dana, u poređenju sa kontrolom. Blag porast je zapažen 33. dana u grupi AMP2 sa 5000 ug/kg. Vrednosti su se usmerile ka normalnim sadržajima (kontrola) počevši od 37. dana. Sličan odgovor je opažen u 3. Ciklusu, bez jasne promene u vrednosti WBC u 4. Ciklusu, u bilo kojoj od tretiranih grupa.

Tokom 3. Ciklusa, brojevi RBC su blago porasli od 13. dana (nakon pojedinačne doze 3. Ciklusa) u svim tretiranim grupama, izuzev grupu AMP2 sa 500 ug/kg. Vrednosti RBC su se vratile na normalne sadržaje (u poređenju sa kontrolom) od 17. dana.

U 4. Ciklusu, brojevi RBC su se smanjili u svim tretiranim grupama, u poređenju sa kontrolnom, izuzev grupe AMP2 sa 500 u/kg. Za razliku od drugih ciklusa, postoji više od jednog minimuma u ovom ciklusu. Ovi padovi se javljaju od 1-9 dana posle doziranja, a oporavak počinje tek od 11. dana.

Ovi rezultati pokazuju da se porast broja trombocita, iznad istog kod kontrolnih životinja, može detektovati 7 do 9 dana nakon doziranja kod svih tretiranih životinja u svim testiranim ciklusima. Izgleda da ponovljena faza doziranja izaziva veći odgovor u proizvodnji trombocita, u poređenju sa pojedinačnom fazom doziranja. U 4. Ciklusu, odgovor trombocita izazvan u grupi PEG-rHuMGDF, bio je niži u poređenju sa prethodnim ciklusima i u poređenju sa odgovorom na visoku dozu AMP2. Opažena su smanjenja u broju RBC u 1, 2, 3 i 4. Ciklusu, u većini tretiranih grupa u jednom trenutku tokom svakog izučavanog ciklusa, međutim, po prestanku doziranja svi hematološki paramteri su se vratii na normalne sadržaje (u poređenju sa kontrolnim).

Ukupno, ovi rezultati su pokazali da se tretman sa AMP2 kod rezus majmuna dobro podnosi i da AMP2 daje za rezultat povećanje broja trombocita posle tretmana u različitim ciklusima. Nije se desilo, na bazi rezultata o broju trombocita, da je bilo biološki značajnog odgvora na AMP2 posredovanog imunitetom. Nasuprot, tretman u različitim ciklusima sa PEG-rHuMGDF je pokazao inhibiciju, kroz odgovor trombocita u 4. Ciklusu, što uazuje da su generisana antitela za PEG-rHuMGDF, a ova anti-MGDF antitela mogu unakrsno da reaguju sa endogenim TPO rezusa.

Pošto je sada u potpunosti opisan, predmetni pronalazak, a svakom ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike je jasno da se mogu napraviti mnoge izmene i modifikacije u njemu, bez odstupanja od duha i obima ovog pronalaska koji je ovde iznet.

Realizacije ovog pronalaska gde se izuzetno svojstvo ili povlastica štite, definisani su kao što sledi.

Claims (33)

1. Jedinjenje koje se vezuje na mpl receptor, a ima strukturu TMPi-(Li)n-TMP2 gde su TMPii TMP2, svaki nezavisno, odabrani iz grupe središnih jedinjenja sa strukturama odabranim od grupa koje čine: gde, X2je odabran iz grupe koju čine Glu, Lys i Val; X3je odabran iz grupe koju čine Gly i Ala; X4je Pro; X5je odabran iz grupe koju čine Thr i Ser; X6je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala i Phe; X7je odabran iz grupe koju čine Arg i Lys; Xsje odabran iz grupe koju čine Gln, Asn i Glu; X9je odabran iz grupe koju čine Trp, Tyr, Cys, Ala i Phe; X-io je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys; gde, X2je odabran iz grupe koju čine Glu.Asp, Lys i Val; X3je Ala; X4je Pro; X5je odabran iz grupe koju čine Thr i Ser; X6je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala i Phe; X7je odabran iz grupe koju čine Arg i Lys; Xs je odabran iz grupe koju čine Gln, Asn i Glu; Xg je odabran iz grupe koju čine Trp, Tyr, Cys, Ala i Phe; Xio je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys; gde, X2je odabran iz grupe koju čine Glu, Asp, Lys i Val; X3je odabran iz grupe koju čine Gly i Ala; X4je Pro; X5je Ser; X6je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala i Phe; X7je odabran iz grupe koju čine Arg i Lys; X8je odabran iz grupe koju čine Gln, Asn i Glu; X9je odabran iz grupe koju čine Trp, Tyr, Cys, Ala i Phe; Xi0je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys; gde, X2je odabran iz grupe koju čine Glu,Asp, Lys i Val; X3je odabran iz grupe koju čine Gly i Ala; X4je Pro; X5je odabran iz grupe koju čine Thr i Ser; Xeje odabran iz grupe koju čine Ile, Val, Ala i Phe; X7je odabran iz grupe koju čine Arg i Lys; Xsje odabran iz grupe koju čine Gln, Asn i Glu; X9je odabran iz grupe koju čine Trp, Tyr, Cys, Ala i Phe; X10je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys; gde, X2je odabran iz grupe koju čine Glu, Asp, Lys i Val; X3je odabran iz grupe koju čine Gly i Ala; X4je Pro; X5je odabran iz grupe koju čine Thr i Ser; X6je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala i Phe; X7je Lys; X8je odabran iz grupe koju čine Gln, Asn i Glu; Xg je odabran iz grupe koju čine Trp, Tyr, Cys, Ala i Phe; X-io je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys; gde, X2je odabran iz grupe koju čine Glu.Asp, Lys i Val; X3je odabran iz grupe koju čine Gly i Ala; X4je Pro; X5je odabran iz grupe koju čine Thr i Ser; X6je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala i Phe; X7je odabran iz grupe koju čine Arg i Lys; Xaje odabran iz grupe koju čine Gln i Asn; X9je odabran iz grupe koju čine Trp, Tyr, Cys, Ala i Phe; Xio je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys; gde, X2je odabran iz grupe koju čine Glu.Asp, Lys i Val; X3je odabran iz grupe koju čine Gly i Ala; X4je Pro; X5je odabran iz grupe koju čine Thr i Ser; X6je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala i Phe; X7je odabran iz grupe koju čine Arg i Lys; Xs je odabran iz grupe koju čine Gln, Asn i Glu; Xg je odabran iz grupe koju čine Tyr, Cys, Ala i Phe; Xioje odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys; i gde, X2je odabran iz grupe koju čine Glu, Asp, Lys i Val; X3je odabran iz grupe koju čine Gly i Ala; X4je Pro; X5je odabran iz grupe koju čine Thr i Ser; X6je odabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala i Phe; X7je odabran iz grupe koju čine Arg i Lys; X$je odabran iz grupe koju čine Gln, Asn i Glu; Xg je odabran iz grupe koju čine Trp, Tyr, Cys, Ala i Phe; Xio je odabran iz grupe koju čine Leu, Val, Ala, Phe, Met i Lys; gde je L1, linker: i nje 0 ili 1; njegove fiziološki prihvatljive soli.

2. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što se dati TMPii TMP2nezavisno biraju iz grupe koju čine: gde su X2do Xiokao što je definisano; a Xii Xn-X-|4 su odabrani iz grupe koju čine : a) Xije odabran iz grupe koju čine Ile, Val, Leu, Ser, i Arg; Xnje odabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His i Glu; X12je odabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser i Gln; Xi3je odabran iz grupe koju čine Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln i Gly; i Xi4je odabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu i Gly. b) Xije odabran iz grupe koju čine Ile, Ala, Val, Leu, Ser i Arg; Xnje odabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Lys, His i Glu; Xi2je odabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser i Gln; X-i3je odabran iz grupe koju čine Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln i Gly; i Xm je odabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu i Gly, i c) Xije odabran iz grupe koju čine Ile, Ala, Val, Leu, Ser i Arg; Xnje odabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His i Glu; Xi2je odabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Gly, Ser i Gln; Xi3je odabran iz grupe koju čine Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln i Gly; i Xh je odabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu i Gly.

3. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što se pomenuti TMPii/ili TMP2derivatizuju kao što sledi: jedna ili više peptidil veza [-C(0)NR-] se zameni sa ne-peptidil vezom, odabranom iz grupe koju čine: -CH2-karbamatna veza [-CH2OC(0)NR-]; fosfonatna veza; -CH2-sulfonamidna veza [-CH2-S(0)2NR-]; urea veza [-NHC(0)NH-]; veza -CH2-sekundarni amin; i alkilovana peptidil veza [-C(0)NR<6->, gde je R6 niži alkil]; N-terminus koji je -NRR<1>grupa; u -NRC(0)R grupu; u -NRC(0)OR grupu; u -NRS(0)2R grupu; u -NHC(0)NHR grupu, gde su R i R<1>vodonik i niži alkil, pod uslovom da R i R<1>nisu oba vodonik; u sukcinimidnu grupu; u benziloksikarbonil-NH-(CBZ-NH-) grupu; ili u benziloksikarbonil-NH- grupu koja ima 1 do 3 supstituenta na fenil prstenu koji se biraju iz grupe koju čine niži alkil, niži alkoksi, hloro i bromo; C-terminus koji je -C(0)R<2>, gde se R<2>bira iz grupe koju čine niži alkoksi i -NR3R<4>, gde se R<3>i R<4>nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik i niži alkil.

4. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što sve aminokiseline imaju D konfiguraciju.

5. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što najmanje jedna od aminokiselina ima D konfiguraciju.

6. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što je ciklično.

7. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što je svaki od TMPii TMP2lle-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO: 1).

8. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što Lipredstavlja peptid.

9 Jedinjenje prema Zahtevu 8, naznačeno time, što L-i predstavlja Yn, gde je Y aminokiselina koja se nalazi u prirodi ili njen stereoizomer, a n je 1 do 20.

10. Jedinjenje prema Zahtevu 8, naznačeno time, što Lipredstavlja (Gly)n, gde je n od 1 do 20, a kada je n veće od 1, do polovine Gly ostataka može biti supstituisano sa drugom aminokselinom koja se bira između preostalih 19 prirodnih aminokiselina ili njenih stereoizomera.

11. Jedinjenje prema Zahtevu 8, naznačeno time, što se Libira iz grupe koju čine:

12. Jedinjenje prema Zahtevu 8, naznačeno time, što l_isadrži Cys ostatak.

13. Jedinjenje, naznačeno time, što je to dimer jedinjenja prema Zahtevu 12.

14. Dimer prema Zahtevu 13, naznačen time, što je to

15. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što Lipredstavlja (CH2)n, gde je n od 1 do 20.

16. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što se bira iz grupe koju čine:

17. Jedinjenje prema Zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što ima formulu (Fc)m-(L2)q-TMP1-(L1)n-TMP2-(L3)r-(Fc)p gde su L-i, L2i L3linkerske grupe koje se, svaka nezavisno, biraju iz grupe koju čine Yn, gde je Y aminokiselina koja se nalazi u prirodi ili njen stereoizomer, a n je 1 do 20; (Gly)n, gde je n od 1 do 20, a kada je n veće od 1, do polovine Gly ostataka može biti supstituisano sa drugom aminokselinom koja se bira između preostalih 19 prirodnih aminokiselina ili njenih stereoizomera; (CH2)n, gde je n od 1 do 20, Fc je Fc region imunoglobulina; m, p, q i r se, svaki nezavisno, biraju iz grupe koju čine 0 i 1, pri čemu najmanje jedan od m ili p je 1, i još ukoliko je m jednako 0, tada je q jednako 0, i ukoliko je p jednako 0, tada je r jednako 0; i njegova fiziološki prihvatljiva so.

18. Jedinjenje prema Zahtevu 17, naznačeno time, što se Li, L2i L3, svaki nezavisno, biraju iz grupe koju čini Yn, gde se Y bira između aminokiselina koje se nalaze u prirodi ili njihovih stereoizomera, a n je 1 do 20.

19. Jedinjenje prema Zahtevu 18, naznačeno time, što Lipredstavlja (Gly)n, gde je n 1 do 20, a kada je n veće od 1, do polovine Gly ostataka može biti supstituisano sa drugom aminokselinom koja se bira između preostalih 19 prirodnih aminokiselina ili njenih stereoizomera.

20 Jedinjenje prema Zahtevu 18, naznačeno time, što se L-i, l_2 i L3nezavisno biraju iz grupe koju čine:

21 Jedinjenje prema Zahtevu 18, naznačeno time, što l_i, l_2 ili L3sadrže Cys ostatak.

22. Jedinjenje, naznačeno time, što je to dimer jedinjenja prema Zahtevu 21.

23 Jedinjenje prema Zahtevu 17, naznačeno time, što L1( L2ili L3predstavljaju (CH2)n, gde je n 1 do 20.

24. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time što se bira iz grupe koju čine:

25. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedinjenje prema Zahtevu 1 pomešano sa svojim farmaceutski prihvatljivim nosačem.

26. Polinukleotid, naznačen time, što kodira jedinjenje prema Zahtevima 8, 13, 18 ili 22.

27. Vektor, naznačen time, što sadrži polinukleotid prema Zahtevu 26.

28. Ćelija domaćina, naznačena time, što sadrži vektor prema Zahtevu 27.

29. Postupak za dobijanje jedinjenja prema Zahtevima 8, 13, 18 ili 22, naznačen time, što obuhvata gajenje ćelija domaćina prema zahtevu 28, u podesnom hranljivom medijumu i izolovanju datog jedinjenja iz pomenutih ćelija ili hranljivog medijuma.

30 Upotreba jedinjenja prema jednom od Zahteva 1-8 za proizvodnju leka za upotrebu u postupku povećanja megakariocita ili trombocita kod pacijenta.

31. Upotreba prema zahtevu 30, naznačeno time, što je upotrebljeno od 1 ug/kg do 100 mg/kg.

32. Jedinjenje prema zahtevu 17 naznačeno time, što sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:34.

33. Jedinjenje prema zahtevu 17, naznačeno time, što sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO:46.