RS51281B - Sinteza insulinotropičnog peptida - Google Patents

Abstract

Postupak dobijanja insulinotropičnog peptida, koji obuhvata sledeće korake a) do f):a) obezbeđivanje prvog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), gde je svaki od ostataka X8 i X10, chiralna amino kiselina, svaki od H i E po izboru ima zaštitu bočnog lanca;b) obezbeđivanje drugog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom TFTSDVX17-18YLEG (SEQ ID NO. 8) gde je ostatak ozbeležen simbolom X17-18, dipeptidni ostatak pseudoprolina, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca;c) kuplovanje prvog fragmenta za drugi fragment pri čemu se dobija treći peptidni fragment sa amino kiselinskom sekvencom HX8EX10 TFTSDVX17-18YLEG (SEQ ID NO. 11), dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu bočnog lanca;d) obezbeđivanje četvrtog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), gde X35 je ostatak ahiralne amino kiseline, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca;e) kupolvanje četvrtog peptidnog fragmenta za arginin u cilju dobijanja petog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), dati ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu bočnog lanca; if) kuplovanje petog fragmenta za treći fragment pri čemu se dobija insulinotropic peptide including the amino acid sekvence HX8EX10TFTSDVX17-18YLEGQAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 13), dati ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu bočnog lanca.Prijava sadrži još 18 zavisnih patentnih zahteva.

Description

[0001]Pronalazak se odnosi na metode za dobijanje insulinotropičnih peptida, posebno glukagonu-sličnog peptida-1 (GLP-1) i njegovih identičnih delova (kopija/duplikakta), pomoću procesa sa čvrstom fazom i tečnom fazom. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na intermedijerne peptidne fragmente koji se mogu koristiti u ovim metodama.

[0002]Brojni potupci za sintezu peptida su opisani u literaturi (na primer,videtU.S.

Patent No. 6,015,881; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamberet al. (eds), Peptides, Chemistrv and Biologv, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Rinikeretal. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320; Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133; i Andersson et al. (2000) Biopolimers 55:227-250. Različite metode sinteze se razlikuju po fizičkom stanju faze na kojoj se odvija sinteza, tačnije da li je u pitanju tečna ili čvrsta faza.

[0003]U sintezi peptida na čvrstoj fazi (SPPS), amino kiselinska ili peptidna grupa je vezana za čvrstu podlogu od smole. Zatim, sukcesivno su vezane amino kiseline ili peptidne grupe za peptid koji je vezan za podlogu dok se ne formira peptidni materijal od interesa. Peptid vezan za podlogu se zatim uobičajeno otcepi od podloge i podvrgnut daljem procesiranju i/ili prečišaćvanju. U nekim slučajevima, sinteza na čvrstoj fazi vodi do zrelgo peptidnog proizvoda; u drugim slučajevima peptid otcepljen od podloge (tj., "peptidni intermedijedni fragment") je upotrebljen za dobijanje većih, zrelih peptidnih proizvoda.

[0004]Peptidni intermedijemi fragmenti dobijeni procesima na čvrstoj fazi mogu se kuplovati zajedno procesima sinteze na čvrstoj fazi ili na tečnoj fazi (u daljem tekstu dat kao "sinteza na fazi u rastvoru "). Sinteza u rastvoru može posebno da bude korisna u slučajevima gde je sinteza korisnof zrelog peptida na čvrstoj fazi nemoguća ili nije praktična. Na primer, u sintezi na čvrstoj fazi, duži peptidi eventualno mogu da usovijiti neregluarnu konformaciju dok su još vezani za čvrstu podlogu, otežavajući tako dodavanje dodatnih amino kiselina ili peptidnog materijala za rast lanca. Kako se peptidni lanac produžava na podlozi od smole, efikasnost faza procesa kao što je kuplovanje i uklanjanje zaštite može da bude dovedeno u pitanje. Ovo, sa druge strane, može da dovede do dužeg vremena procesiranja za kompenzaciju ovih problema, pored povećanja gubitka u polaznim materijalima, kao što su amino kiseline, ko-reagensi, i

rastvarači. Ovi problemi mogu da se povećaju sa povećanjem dužine peptida.

[0005]Shodno tome, nije često naći zrele peptide sa više od 30 amino kiselina u dužini sintetisani u jednom fragmentu primenom samo procedure na čvrstoj fazi. Umesto toga, individualni fragmenti se mogu odvojeno sisntetisati na čvrstoj fazi, i zatim kuplovati na čvrstoj fazi i/ili na fazi u rastvoru za dobijanje željenog peptidnog proizvoda. Ova pristup zahteva pažljiv odabir raspoloživih fragmenata (kandidata). Dok neki opšti principi mogu da usmeravaju selekciju fragmenta, često se zahteva empirijsko testiranje kadidata fragmenata. Strategije fragmenata koji su izvodljivi u jednom kontekstu mogu da budu neizvodljivi u drugim kontekstima. Čak i kad prihvatljivi kandidati fragmeanta nisu otkriveni, proces inovaticija i dalje može biti potreban za strategiju sinteze za rad pod komercijalno prihvatljivim uslovima. Shodno tome, sitenze peptida upotrebom hibridnih šema se često izazov, i u mnogim slučajevima teško je predvideti koji problemi su prisutni u s'rtetičkoj šemi do izvođenja date sinteze.

[0006]U kupovanju na fazi rastvarača, dva peptidna intermedijerna fragmenta, ili peptidni intermedijerni fragment i reaktivna amino kiselina, su kuplovane u odgovarajućem rastvaraču, obično u prisustvu dodatnih reagenasa koji unapređuju efikasnost i kvalitet reakcije kuplovanja. Peptidni intermedijerni fragmenti su reaktivno uređeni tako da se N-terminalni kraj jednog fragmenta kupluje za C-terminalni kraj drugog fragmenta, ilivice versa.Dodatno, zaštitne grupe na sporednim (bočnim) lancima koje su prisutne tokom sinteze na čvrstoj fazi obično ostaju na fragmentima tokom kuplovanja na fazi u rastvoru kako bi se osigurala specifična reaktivnost terminalnih krajeva fragmenata. Ove zaštitne grupe bočnih lanaca obično se ne uklanjaju do formiranja zrelog peptida.

[0007]Skromna poboljšanja u jednom ili više koraka u ukupnoj šemi sinteze mogu dovesti do značajnih poboljšanja u dobijanju zrelih peptida. Ova poboljšanja mogu da dovedu do velike u uštede u ukupnom vremenu i reagensima, i takođe mogu zančajno da poboljšaju čistoću krajnjeg proizvoda.

[0008]Dok se diskusija o važnosti poboljšanja u hibridnoj sintezi može primeniti na bilo koju vrstu peptida dobijenih prema ovim procedurama, od posebne je važnosti u kontekstu peptida koji su terapeutski efikasni i koji su proizvodeni u razmerama za komercijalnu upotrebu u medicini. Sinteza većih biomolekularnih farmaceutskh proizvoda, kao što su terapeutski peptidi, može biti veoma skupa. Zbog troškova reagenasa, vremena sinteze, brojnih koraka u sintezi, pored dodatnih drugih faktora, veoma mala poboljšanja u sintetičkom procesu ovih velikih biomolekularnih faramceutskih proizvoda može da ima važan uticaj na to da li čak i kad je ekonomski izvodljivo dobiti dati farmaceutski proizvod. Ova pobolšanja su neophodna zbog visokih troškova proivzodnje za veće biomolekularne farmaceutske proizvode što je podržano činjenicom da, u brojnim slučajevima, postoji nekolicina, ako uopšte postije, odgovarajućih terapeutskih alternativa za ove vrste većih biomolekularnih farmaceutskih prizvoda.

[0009]Ovo se jasno vidi u slučaju glukagonu-sličnog peptida -1 (GLP-1) i njegovih njegovih identičnih delova. Ovi peptidi su naznačeni kao mogući terapeutski agensi za lečenje tipa 2 insulin-ne zavisnogdiabetes mellitusakao i srodnih metaboličkih poremećaja, kao što je klinička gojaznost. Gutniak, M.K., et al., Diabetes Care 1994:17:1039-44.

[0010]Lopez et al. je odredio da nativni GLP-1 ima dužinu od 37 amino kiselnskih ostataka. Lopez, L. O, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80:5485-5489 (1983). Ovo određivanje je potvrđena radom Uttenthal, L. O., et al., J. Clin. Endocrinal. Metabol., 61:472-479 (1985). Nativni GLP-1 može da bude predstavljen oznakom GLP-1 (1-37). Ovo označavanje ukazuje na to da peptide ima sve amino kiseline od 1 (N-kraj) do 37 (C-kraj). Nativni GLP-1 ima amino kiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO. 1:

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

[0011]Objavljeno je da nativni GLP-1 (1-37) generalno ne može da posreduje u biosintezi insulina, ali biološki važni fragmenti ovog peptida imaju insulinotropične osobine. Na primer, nativni peptid dužine 31-amino kiseline GLP-1 (7-37) prema SEQ ID NO. 2:

HAEGTFTS DVSS YLEGQAAKEFIAW LVKGRG

je insulinotropični i ima amino kiseline na položajima od 7 (N -kraj) do 37 (C kraj) position nativne GLP-1. GLP-1 (7-37) ima terminalni glicin. Kada ovaj glicin nije prisutan, rezultantni peptid je i dalje insulinotropikalno aktivan i označen kao GLP-1 (7-36) prema

SEQ ID NO. 3:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR

GLP-1 (7-36) se često javlja sa C-terminalnim argininomu obliku amida, i ovaj oblik može da bude predstavljen oznakom GLP-1 (7-36)-NH2.

GLP-1 (1-37) se generalno konvertuje u svoj insulinotropićno aktivan identični deoin vivo.Na primer, GLP-1 (1-37) je prirodno konvertovan u GLP-1 (7-37)in vivo.Ovaj peptide, sa druge strane, takođe može da bude podvrgnut dodatnom procesiranju proteolitičkim uklanjanjem C-terminalnog glicina pri čemu se dobija GLP-1 (7-36), koji se često javlja u obliku amida GLP-1 (7-36)-NH2. Tako, terapeutski tretmani mogu da obuhvate administraciju GLP-1 (1-37) ili njegovih identičnih delova, sa očekivanjem da se njegov insulinotropični aktivan derivat formirain vivo.Uobičajeno, međutim, terapeutski tretmani koji se ispituju obuhvataju administraciju insulinotropično aktivne GLP-1 fragmente.

[0012] Prema US 6,887,849, insulinotropična aktivnost GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36) i GLP-1 (7-36)-NH2 se čini daje specifična za pancreasee beta ćelije, pri čemu izgleda da ovi peptidi indukuju biosintezu insulina. Ovo čini ove peptide i farmaceutski prihvatljive njegove identične delove korisnim u ispitivanju patogeneze početka dijabetes melitusa kod odraslih, stanje koje je okarakterisano hiperglikemijom u kojoj su nekontrolisane (abnormalne)dinamike sekrecije insulina. Dalje, oviu peptidi koji lične na glukagon mogu da budu korisni u terapiji i lečenju ove bolesti, i u terapiji i lečenju hiperglikemije. Prema EP 1137667B1, ovi peptidi ili njihovi farmaceutski prihvatljivi identični delovi takođe mogu da budu korisni za lečenje drugih tipova dijabetesa, kliničke gojaznosti, glukagonoma, sekretorne poremećaje disajnih puteva, metaboličke poremećaje, artritis, osteoporozu, bolesti centralnog nervnog sistema, restenoze, neurodegenerativne bolesti, bubrežne insuficijencije, kongestivne srčane insuficijencije, neofrotični sindrom, ciroze, pulmonarnog edema, hipertenzije, i/ili poremećaje gde je poželjan smanji unos hrane.

[0013] Nativni GLP-1(1-37) i njegov nativni, insulinotropično aktivni identični delovi prema SEQ ID NO. 1 do 3 su metabolički nestabilni sa poluživotom u plazmi od samo 1 do 2 minutein vivo.Egzogeno administriran GLP-1 se takođe brzo razgrađuje. Ova metabolička nestabilnost je ograničnena na terapeutski potencijal nativnog GLP-1 i njegovih nativnih fragmenata.

[0014] Razvijeni su sintetički identični delovi peptida GLP-1 sa poboljšanom stabilnošću. Na primer, peptid i skladu sa SEQ ID NO. 4 je opisan u EP 1137667 B1:

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR

[0015] Ovaj peptid je sličan nativnom GLP-1 (7-36), izuzev što se ahiralni ostatak alfa-aminoizobuterne kiseline (pokazan šematski skraćenicom Aib) pojavljuje na položajima 8 i 35 umesto odgovarajućih nativnih amino kiselina na ovim položajima. Ahiralna alfa-aminoizobuterna kiselina je takođe pozanta i kao metilalanin. Ovaj peptid se može označiti formulom (Aib<8>'<35>)GLP-1(7-36)-NH2.

[0016] EP 1137667 navodi da peptid u skladu sa SEQ ID NO: 4 i njegovi identični delovi mogu da izgrade pojedinačni fragment primenom tehnika na čvrstoj fazi. Opis sintreze pojedinačnog fragmenta dati u EP 1137667 je problematičan. Kao prvo, ova pristup može dovesti do visokog nivoa epimerizacije u kranjem kuplovanju amino kiselina, npr., histidin u slučaju (Aib<8,3S>) GLP-1 (7-36). Dodatno, uklanjanje nečistoća može da bude teško, tokom hromatografskom prečišćavanja, i prinos može da bude suviše mali. Shodno tome, potrebne su poboljšane strategije za sintezu peptida u skladu sa SEQ ID NO. 4 da bi se proizveo ovaj peptid i njegovi identični delovi u komercijalno prihvatljivom prinosima, čistoće, i količinama.

[0017] Pored ovih razmatranja, pitanja koje se odnose na regenraciju proizvoda i čistoće proizvoda za proizvodnju peptida na veliko, kao i baratanje reagnsima, skladišćtenje (čuvanje) i odlaganje, mogu da imaju veliki uticaj na izvodljivost šeme sinteze peptida. Tako, postoji kontinualna potreba za procesima sinteze peptida koji mogu efikasno da proizvodeu peptidne materijale od komercijalnog iteresa u velikim serijama sa poboljšanim prinosima.

[0018] Predmetni pronalazak se odnosi na dobijanje insulinotropičnih peptida, koji su sintetisani prema pristupu sinteze na čvrstoj fazi i sintezi na fazi rastvarača ("hibrid"). Generalno, ovaj pristup obuhvata sintezu tri različita peptidna intermedijerna fragmenta primenom hernije sintteze na čvrstoj fazi. Hernija sinteze na fazi rastvarača je zatim primenjena da bise dodao dodatni amino kiselinski materijal jednom od fragmenata. Fragmenti su zatim kuplovani zajedno na čvrstoj fazi i fazi na rastvor. Upotreba pseudoprolina u jednom od fragemanta olakšava sintezu na čvrstoj gazi i takođe olakšava naknadno kuplovanje ovih fagmenata sa drugim fragmentima, sintezom na fazi rastvarača. Predmetni pronalazak je veoma koristan za formrianje insulinotropičnih peptida kao što su GLP-1, GLP-1 (7-36) i njihovih prirodnih i ne-prirodnih identičnih delova, naročito GLP-1 (7-36) i njegovih prirodnih i ne-prirodnih identičnih delova.

[0019] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metod dobijanja insulinotropičnog peptida, koji obuhvata: 1. a) dobijanje peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvensom HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6) gde X<8>i X<10>su ostaci ahiralne amino kiseline, ili je dati fragment kopija saX8i X<10>ostacima, svaki od H, E,X<8>i X<10>po izboru ima azštitu bočnih lanaca; i

2. b) inkorporaciju peptidnog fragmenta u insulinotropični peptid.

[0020] Poželjno, X<8>amino kiselinski ostatak koji odgovara metil alaninu (Aib). X<10>je poželjno amino kiselina koja odgovara glicinu.

[0021] U narednom apsektu, Ponalazak se odnosi na peptidni fragment amino kiselinske sekvvence HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6), gde svaki od X<8>i X<10>su ostaci ahiralne amino kiseline, svaki od H, E, X<8>i X<10>po izboru sadrži zaštitu za spredni lanac. Poželjno, X<8>je amino kiselinski ostatak koji odgovara Aib i X<10>je amino kiselinski ostatak koji odgovara glicinu.

[0022] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metodu dobijanja insulinotropičnog peptida, a koji obuhvata sledeće korake: a) dobijanje peptidnog fragmenta ili njegovog identičnog dela sa amino kiselinskom sekvencom TFTSDVX<1718>YLEG (SEQ. ID No. 8) gde ostatak označen simbolom X17"

<18>je dipeptidni ostatak pseudoprolina; i

b) inkorporiranje peptidnog fragmentau insulinotropični peptid.

[0023] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na peptid ili njegov

identični deo sa sekvencom amino kiselina TFTSDVX<17>"<18>YLEG (SEQ. ID No. 8) pri čemu ostatak koji je označen simbolom X<17>'<18>je dipeptidni ostatak pseudoprolina; dati amino kiselinski ostaci po izboru uključuju zaštitu bočnih lanaca.

[0024] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode dobijanja insulinotropičnog peptida u skladu sa zahtevom 1, koji obuhvata sledeće korake: a) kuplovanje prvog peptidnog fragmenta sekvence amino kiselina HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6), gde svaki od X<8>i X<10>je ostatak achiralne amino kiseline, svaki od H i E po izboru uključuje zaštitnu bočnih lanaca, za drugi peptidni fragment amino kiselinske sekvence TFTSDVX17'18YLEG (SEQ ID NO. 8), pri čemu ostatak označen simbolom X17'18 je dipeptidni ostatak pseudoprolina, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca.dajući treći peptidni fragment amino kiselinske sekvence HX<8>EX<10>TFTSDVX17'18YLEG (SEQ ID NO. 11), dati amino kiselinski ostaci sekvenc po izboru uključuju zaštitu bočnih

lanaca; i

b) inkorporiranje peptidnog fragmenta u insulinotropični peptid.

[0025] U narednom aspektu, predmetni pronazak se odnosi na metodu dobijanja

insulinotropičnog peptida, koja obuhvata sledeće korake:

a) dobijanje peptidnog fragmenta ili njegovog identičnog dela amino kiselinske sekvence QAAKEFIAWLVKX<35>(SEQ ID NO. 9), gde X35 je sotatak achiralne amino

kiseline, dati ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; i

b) inkorporiranje peptidnog fragmenta u insulinotropični peptid.

[0026] U narednom aspektu, predmetni pronazak se odnosi na metodu dobijanja

insulinotropičnog peptida, koja obuhvata sledeće korake:

a) obezbeđlvanje prvog peptidnog fragmena amino kiselinske sekvence HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6), gde X<8>i X<10>su ostaci achiralne amino kiseline, svaki od H i E po izboru uključuje zaštitu bočnog lanca; b) obezbeđlvanje drugog peptidnog fragmenta amino kiselinske sekvence TFTSDVX<17>"<18>YLEG (SEQ ID NO. 8) gde ostatak označen simbolom X<17>"<18>je dipeptidni ostatak pseudoprolina, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; c) kuplovanje prvog fragmenta za drugi fragment priu čemu se dobija treći peptidni fragment amino kiselinske sekvence HX<8>EX<10>TFTSDVX<17>'<18>YLEG (SEQ ID NO. 11), dati amino kiselinski ostaci sekvence, po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; d) dobijanje četvrtog peptidnog fragmenta amino kiselinske sekvence QAAKEFIAWLVKX<35>(SEQ ID NO. 9), gde X35 je ostatak achiralne amino kiseline, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; e) kuplovanje četvrtog peptidnog fragmenta za arginin tako da se dobija peti peptidni fragment amino kiselinske sekvence QAAKEFIAWLVK X<35>R (SEQ ID NO.

12), dati ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; i

f) kuplovanje petog fragmenta za trećipri čemu se dobija insulinotropični peptid amino kiselinske sekvence HX8EX1 °TFTSDVX1718YLEGQAAKEFIAWLVK X35R

(SEQ ID NO. 13), dati ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca.

[0027] Poželjno, predmetni pronazak se odnosi na metodu dobijanja insulinotropičnog peptida, koja obuhvata sledeće korake: a) dobijanja prvog peptidnog fragmena amino kiselinske sekvence HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6), gde svaka od X<8>i X10 je ostatak ahiralne amino kiseline, svaka od H i E po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; b) dobijanja drugog peptidnog fragmenta amino kiselnske sekvence TFTSDVX17'<18>YLEG (SEQ ID NO. 8) gde je ostatak označen simbolom X<17>"<18>, dipeptidni ostatak pseudoprolina, dati ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; c) kuplovanje prvog fragmenta za drugi fragment pri čemu se dobija treći peptidni fragment amino kislinske sekvence HX<8>EX<10>TFTSDVX<1718>YLEG (SEQ ID NO. 11), dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; d) dobijanje četvrtog peptidnog fragmenta amino kiselinske sekvence QAAKEFIAWLVKX<35>(SEQ ID NO. 9), gde X<35>je ostatak ahiralne amino kiseline, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; e) kuplovanje četvrtog peptidnog fragmenta za arginine pri čemu se dobija peti peptidni fragment amino kiselinske sekvence QAAKEFIAWLVK X<35>R (SEQ ID NO.

12), dati ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; i

f) kuplovanje petog fragmenta za treći fragment pri čemu se dobija insulinotropični peptid amino kiselinske sekvence HX8EX10TFTSDVX1718YLEGQAAKEFIAWLVK

X<35>R (SEQ ID NO. 13), dati ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca.

[0028] U narednom aspektu, predmetni pronazak se odnosi na metodu kao što je prethodno opisano, a koja obuhvata sledeće korake: g) uklanjanje zaštitnih grupa za bočnog lanca pri čemu se dobija insulinotropični peptid amino kiselinske sekvenceHX8EX<10>TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEQ ID NO. 5) i njegovi identični delovi, pri čemu svaki od simbola X na položajima ,8, 10, i 35 nezavisno označavaju achiralni, po izboru amino kiselinski ostaci sa sternim efektom.

[0029] Uklanjanje zaštitnih grupa bočnog lanca, poželjneo s eizbodi upotrebom rastvora za uklanjanje zažtite koji sadrži bar jedan acidolitički reagens i bar jedan sakupljač kationa( engl. cation scavenger).Acidolitički reagensi za globalno uklanjanje zaštite su poželjno odabrani iz grupe koju čine trifluorsirćetna kiselina (TFA), HCI, Lewis-ove kiselinekao što su: BF3Et20 ili Me3SiBr, tečna fluorovodonična kiselina (HF), bormovodonik (HBr), trifluorometansulfonska kiselina i njihove kombinacije. Odgovarajući sakupljači katjona poželjno su odabrani od ditiotreitola (DTT), anizola, p-krezola, etanditiola i dimetil sulfida. Rastvor za uklanjanje zaštite takođe može da obuhvati vodu.

[0030] U sledećem aspektu, predmetni pronazak se odnosi na metodu kao što je prethodno opisano, a koja obuhvata sledeće korake: a) dobijanje prvog peptidnog fragmenta amino kiselinske sekvence HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6), gde svaka od X8 i X<10>je ostatak ahiralne amino kiseline, svaka

od H, E,X<8>i X<10>po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca ;

b) dobijanje drugog peptidnog fragmenta amino kiselinske sekvence TFTSDVX<17>"<18>YLEG (SEQ ID NO. 8) gde ostatak koji je označen simbolom X<17>"<18>je dipeptidni

ostatak pseudoprolina, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca;

c) kuplovanje prvog fragmenta za drugi fragment pri čemu se dobija treći peptidni fragment sa amino kiselinskom sekvencom HX<8>EX<10>TFTSDV X<17>'<18>YLEG (SEQ

ID NO. 11), dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca;

d) dobijanje četvrtog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom QAAKEFIAWLVKX<35>(SEQ ID NO. 9), pri čemu X35 je ostatak na achiralnoj amino

kiselini, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca;

e) Kuplovanje četvrtof peptidnog fragmenta za arginin pri čemu se dobija peti peptidni fragment sa amino ksileinskom sekvencom OAAKEFIAVVLVK X<35>R

(SEQ ID NO. 12), dati ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; i

f) kuplovanje petog fragment za treći fragment pri čemu se dobija insulinotropični peptid formule (SEQ. ID No. 5) HX<8>EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX<35>R

i njegovi identični delovi,

pri čemu svaki od svmbola X na položajima , 8, 10, i 35 nezavisno označavaju achiralni, po izboru amino kisellinski ostatak sa sternim efektom; i gde jedan ili više amino kiselinskih ostataka po izboru ima zaštitu bočnih lanaca.

[0031] Slika . 1 je šematski dijagram sinteze u skladu sa premdetnim pronalaskom.

[0032] Fragment 12 je peptidni fragment koji sadrži amino kislinsku sekvencu HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6). Fragment 14 je peptidni fragment sa amino kiselinskom sekvencom T<11>FTSD<15>VX<17-18>YL<20>EG (SEQ ID NO. 8). Fragment 16 je peptidni fragment sa amino kiselinskom sekvencom Q<23>AA<25>KEFIA<30>WLVKX<35>(SEQ ID NO. 9). Intermedijeni fragment 18 je peptidni fragment sa amino kiselinskom sekvencom H<7>X<8>EX<10>TFTSO<15>VX<17>'<18>YL<20>EG (SEQ ID NO. 11). Intermediajerni peptidni fragment 20 je peptidni fragment sa amino kiselinskom sekvencom Q<23>AA<25>KEFIA<30>WLVKX35R(SEQ ID NO. 12). Proizvod 11 je traženi zaštićeni peptid H<7>X<8>EX10TFTSD<15>VX<17>'<18>YL<20>EG QAA<25>KEFIA<30>WLVKX<35>R (SEQ ID NO. 13) gde su Ser-Ser na položajima 17 i 18 još uvek zaštićeni u obliku pseudoprolina. Dijagram je detaljno opisan u daljem tekstu.

[0033] Realizacije predmetnog pronalaska su opisane u daljem tekstu ali bez namere da budu iscrpni ili da ograničavaju pronalazak na date obilke opisane u detaljnom opisu. Radije, realizacije su odabrane i opisano tako da prosečan stručnjak može da razume i

proceni principe i izvođenje predmetnog pronalaska.

[0034]Predmetni pronalazak se odnosi na sintetičke metode dobijanja peptida kao što je glukagonu-slični peptid -1 (GLP-1), i prirodni i njegovi ne-prirodni insulinotropično aktivni identični delovi, primenom tehnika sinteze na čvrstoj fazi i/ili na fazi rastvarača. Peptidni molekuli pronalaska mogu da budu zaštićeni, nezaštićeni, ili delimično zaštićeni. Zaštita može da obuhvati zaštitu N-kraja, zaštitu bočnog lanca, i/ili zaštitu C-kraja. Dok je pronalazak generalno usmeren na sintezu ovih glukagonu-sličnih peptida, njihovih identičnih delova, fragmenata i njihovih identičnih delova, i proizvoda fuzije i njihovih identičnih delova, ovde dati inventivni sadržaji se takođe mogu primeniti za sintezu drugih peptida, posebno onih koji su sinteztisani kombinacijom pristupa sinteze na čvrstoj fazi i na fazi rastvarača. Pronalazak se takođe može upotrebiti za sintezu peptidnih intermedijernih fragmenata povezanih sa nečistoćama, posebno nečistoća koje potiču od piroglutamata. Poželjni GLP-1 molekuli korisni u izvođenju predmtnog pronalaska obuhvataju prirodne i ne-prirodne GLP-1 (7-36) i njihove identične delove.

[0035]Kao što je ovde upotrebljeno, izraz "uključjući amino kiseline sekvence" požželjno znači "imaju amino sekvencu amino kiselina (amino kiselinsku sekvencu)".

[0036]Kao što je ovde upotrebljeno," njihovi identični delovi" odnose se na prirodne i ne-prirodne analoge, derivate, fuzona jedinjenja, soli, ili slične a peptide. Kao što je ovde uptorebljeno, peptidni analog s egeneralno odnosi na peptide sa modifikovanom amino kiselinskom sekvencom kao što su, supstitucijom jedne ili više amino kiselina, delecije, inverzije, i/ili dodavanja (adicije) u odnosu na drugi peptid ili identični peptid. Supstitucije mogu da uključe jednu ili više prirodnih ili ne-prirodnih amino kiselina. Susptitucije poželjno mogud a budu konzervativne ili visoko konervativne. Konzervativna supstitucija se odnosi na supstituciju amino kiseline drugom koja generalno ima isto net elektronsko naelektrisanje i generalno je iste veličine i oblika. Na primer, amino kiseline sa alifatičnim ili supstituisanim alifatičnim sprednim lancem amino kiseline imaju približno istu veličinu kada se ukupan broj ugljenika i heteroatoma u bočnim lancima ne razlikuje za više od oko četiri. Imaju priblično isti oblik kada se broj grana u njihovim bočnim lancima razlikuje za ne više od oko jedan ili dva. Smatra se da su amino kiseline sa fenil ili supstituisanim fenil grupama u bočnim lancima približno iste veličine i oblika. U daljem tekstu dato je pet grupa amino kiselina. Zamenom amino kisleine u jedinjenju drugom amino kisleinom iz istih grupa dovodi do konzervativne supstitucije. Grupa I: glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, serin, treonin, cistein, metionin i amino kiseline koje se ne javljaju u prirodi sa CrC4alifatičnim ili CrC4hidroksil supstituisanim alifatičnim lancima (pravog lanca ili monrazgranati (sa jednom granom)).

Grupa II: glutaminska kiselina, asparaginska kiselina i amino kiseline koje se ne javljaju u prirodi sa karboksilnom kiselinom supstituisanim CrC4alifatičnim bočnim lancima (nerazgranat ili sa jednom tačkom granjanja).

Grupa III: lizin, ornitin, arginin i amino kiseline koje se ne javljaju u prirodi sa amino ili gvanidino supstituisanim CrC4 alifatičnim bočnim lancem (nerazgragant ili sa jednom tačkom grajanjanja).

Grupa IV: glutamin, asparagin i amino kiseline koje se ne javljaju u prirodi sa amid supstituisanim C1-C4alifatičnim bočnim lancima (nerazgranati ili sa jednom tačkom granjanaj).

Grupa V: fenilalanin, fenilglicin, tirozin i triptofan.

[0037]Kao što je ovde uptorebljen, izraz " identični deo " odnosi se na soli a peptida, ili na njihove derivate koji imaju amidnu grupue na C-kraju.

[0038]"Visoko konzervativna supstitucija" je zamena amino kiseline drugom amino kiselinom koja ima istu funkcionalnu grupue u bočnom lancu i gotovo istu veličinu i oblik. Amino kiseline sa alifatičnim ili supstituisanim alifatičnim bočnim amino kiselinskim lancima gotovo su iste veličine kada se ukupan broj ugljenika i heteroatoma u njihovim bočnim lancima razlikuje za ne više od dva. Oni imaju skoro isti oblik kada imaju isti broj grana u bočnim lancima. Primeri vioko konzervativnih supstitucija su valin umesto leucina , treonin umesto serina, asparaginska kiselina umesto glutaminske kiseline i acid fenilglicin umesto fenilalanina.

[0039]"Peptidni derivati" generalno označva peptid, peptidni analog, ili drugi peptidni identični deo sa hemijskom mofikacijom na jednoj ili više bočnih grupa, alfa ugljeniku, atomima ugljenika, terminalnoj amino grupi, i/ili terminalnoj grupe karboksilne kiseline. Kao primer, hemijska modifikacija uključuje, ali nije ograničena na, dodavanje hemijskih ostataka, stvaranje novih veza, i/ili uklanjanje hemijskih ostataka. Modifikacije na bočnom lancu amino kiselina, obuvhataju, bez ograničenja su, acilovanje e-amino grupa lizina, N-alkovanje arginina, histidina, ili lizina, alkilovanje karboksilne grupe glutaminske ili asparaginske kiseline, i deamidairanje glutamina ili asparagina. Modifikacije terminalne amino grupe su, bez ograničenja, des-amino modifikacije, modifikacije N-nižeg alkila, N-di-nižeg alkila, i modifikacije N-acila (npr., -CO-niži alkil). Modifikacije na terminalnoj (krajnjoj) karboksinoj grupi su, bez ograničenja, modifikacije amida, nižeg alkil amida, dialkil amida, i nižeg alkil estra. Poželjni derivat su derivati koji su amidirani na terminalnoj karboksilnoj grupi, npr. amid, niži alkil amid ili dialkil amid the peptida. Shodno tome, parcijlno ili u potpunosti zaštićeni peptidi čine peptidne derivate

[0040]U izvođenju predmetnog pronalaska, jedinjenje ima "insulinotropičnu" aktivnost ako može da stimulište, ili izazove stimulaciju, ili pomogne u izazvanju stimulacije sinteze ili eksprimiranja hormona insulina. U poželjnim modelima izvođenja, insulinotropična aktivnost se može prikazati u skladu sa probama (analizama) opisanim u U.S. Pat. Nos. 6,887,849 and 6,703,365.

[0041]U poželjnim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje methodologije za sintezu sintetičkih (X8,X10, X<35>)GLP-1 (7-36) peptida sledeće formule (SEQ. ID NO. 5):

HX<8>EX<10>TFTSDVSSYLEGQMKEFIAWLVKX<35>R

i njihovih identičnih delova, pri čemu svaki od simbola X na položajima 8,10, i 35 nezavisno označava aciralni, po izboru amino kiselinski ostatak sa sternim efektom. Bilo koji od ostataka X<8>, X<10>, i/ili X<35>po izboru može da ima zaštitne grupe bočnog lanca. Peptidi u skladu sa ovom formulom razlikuju se od nativnog GLP-1 (7-36) bar po tome što su ahiralni, po izboru X<8>i X<35>ostaci sa sternim efektom supstituisani nativnim amino kiselinskim ostacima na položajima 8 i 35. X<10>ostatak može da bude izveden od nativnog ahiralnog glicina ili druge ahiralne amino kiseline. Upotreba ahiralnih amino kiselina X<8>, X<10>, i X<35>ne samo da pomažu u stabilizaciji nastalog peptida, već je otkriveno i da primenom ovih amino kiselina kao izgrađivačkih (gradivnih) jedinica takođe potpomaže brži sitnetički put predmetnog pronalaska kao što je dato na Slici. 1 i opisano u daljem tekstu.

[0042]Posebno poželjna realizacija peptida (X8,X10, X<35>) GLP-11 (7-36) koji se može sintetisati u skladu sa principima predmetnog pronalaska obuhvata peptide formule

(SEQ ID NO. 4):

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR

i njihove identične delove, koji su poželjno amidirani na C-kraju. Ovaj peptid koristi ahiralni ostatak alfa-aminoizobutirne kiseline (ili metilalanin, šematski dato skraćenicom

Aib) budući da X8 i X<35>, poželljno imaju amid na C-krajevima, koristi ostatak nativne G na položaju 10, i mogu da budu označeni formulom (Aib<8,35>)GLP-1(7-36)-NH2. Ovako obeležavanje ukazuje na to da amino kiselinski ostatak koji odgovaraja amino kiselini "Aib" se nalazi na položajima 8 i 35 umesto nativnog alanina. Ahiralna alfa-aminoizobutrina kiselina, takođe je poznata i kao metilalanin. Peptid u skladu sa SEQ ID NO. 4 opisan je u EP 1137667 B1. Prisustvo ostataka Aib na položajima 8 i 35 pokazuju sporu metaboličku razgradnju u telu, čineći tako ovaj peptid mnogo stabilnijim u telu nego što je to nativni GLP-1 (7-36) peptid.

[0043]Predmetni pronalazak obezbeđuje poboljšane metodologije za dobijanje GLP-1(7-36) peptida kao što je (Aib<8,35>)GLP-1(7-36)-NH2. Dato kao primer, Slika . 1 šematski pokazuje ilustrativnu šemu 10 za sintezu GLP-1 (7-36) peptida i njihovih identičnih delova. Pretpostavljamo da je Šema 10 na Slici. 1 posebno pogodna za sintezu GLP-1(7-36) peptida u industrijskim razmerama. Procedure za industrijsko dobijanje se obično izvode kako bis e obezbedila količina peptida koja je korisna za komeercijalnu distribuciju. Na primer količina peptida u ovoj proceduri može biti 500g, ili 1 kg po šarži, a češće desetine kg do stotine kg po šarži ili veće. U poželjnim realizacijama, inventivne metode mogu da obezbede ova poboljšanja kao smanjenje vremena procesiranja (sinteze), poboljšanja u prunosu proizvoda, poboljšavanj u čistoti proizvoda, i/ili smanjenje potrebene količine reagenasa i polaznih materijala.

[0044]Šema sinteze 10 data je Slici. 1 koristi kombinaciju tehnika sinteze na čvrstoj i tečnoj fazi za dobijanje peptidnog proizvoda 11.

[0045]Kao što je prikazano na Slici. 1, šema 10 obuhvata sintezu peptidnih intermedijernih fragmenata 12, 14, i 16 na čvrstoj fazi. Fragment 12 je peptidni fragment koji sadrži amino kiselinske ostatke u skladu sa SEQ ID NO. 6:

gde su X<8>i X<10>kao što je prethodno definisano, ili njegov indetični deo s ostacima X<8>i X<10>. Jedan ili više amino kiselinskih ostataka može da obuhvati zaštitne grupe bočnog lanca u skladu sa uobičajenim praksama. U nekim realizacijama, peptidni fragment 12 može biti vezan za smolu preko C-kraja. Ovaj fragment po izboru može da nosi zaštitne grupe na N-kraju i/ili C-kraju. Nađeno je daje Fmoc posebno korisna zaštitna grupa za N-kraj za sintezu peptidnog fragmenta za sintezu na čvrstoj fazi.

[0046] Fragment 12 sadrži 4 amino kiselinska ostatka koji odgovaraju amino kiselinama u položajima 7 do 10 nativnog GLP-1 (7-36) peptida, i shodno tome mogu se predstaviti oznakom (X<8>, X<10>)GLP-1 (7-10). U poželjnim realizacijama, X<8>je Aib i X<10>je glicin u skladu sa SEQ ID NO. 7:

Ili njegov identični deo koji sadrži ostatak Aib na položaju 10. Peptidni fragment u skladu sa SEQ ID NO. 7 može se označiti kao (Aib<8>)GLP-1(7-10) da bide naglasila supstitucija Aib nativnim alaninom na položaju 8 nativnog GLP-1 (7-10).

[0047] Sinteza na čvrstoj fazi se generalno izvodi u smeru od C-krja ka N-kraju fragmenta 12. Tako, amino kiselina X<10>, koja se nalazi na delu C-kraja fragmenta, je prvi amino kiselinski ostatak koji je kuplovan za podlogu čvrste faze smole. Sinteza na čvrstoj fazi je zatim nastavljena konsekutivnim dodavanjem amino kiselinskog ostatka na način koji odgovara željenoj sekvenci. Sinteza peptidnog intermedijernog fragmenta je završena nakon što je ostatak na N-kraju (na primer, histidinski ostatak H na N-kraju) dodat u nascentni peptidni lanac.

[0048] Ovaj odabir i upotreba peptidnog fragmenta u skladu sa SEQ ID NOS. 6 i 7 obezbeđuje značajnu prednost u šemi 10. Prvo, H se pokazao kao amino kiselinski ostatak koji je teško dodati u peptidni lanav koji raste delimično i zbog problema epimerizacije. Međutim, fragment 12 je dovoljno mali da ublaži ove probleme. Dalje, fragment 12 je dovoljno dugačak da ima dva hiralna centra. Tako, jednostavna kristalizacija omogućava prečišćavanje fragmenta. Ukoliko se fragment 12 završava na Aib, fragment bi onda imao samo jedan hiralni centar i kao posledica toga bi bili teže racemski prečistiti. Postavljanjem ahiralnog G na položaj na C-kraju takođe se izbegava problem racemizacije koji bi razmatrao ako se fragment 12 na C-kraju završava hirlanim E. Ukratko, odabir fragmenta 12 kao peptidne gradivne jedinice olakšava izgradnju fragmenta, njegovo prečišćavanja, i kuplovanje sa drugim peptidnim materijalima. Odabir fragmenta takođe ispoljava nisku racemizaciju H. neočekivano, H je dodat u ovaj fragment sa veoma niskim nivoom epimerizacije, npr., oko 3 tež. % u nekim modelima prakse.

[0049] Fragment 14 je peptidni fragment sa amino kiselinskim ostacima u skaldu sa

SEQ ID NO. 8:

gde je ostatak označen simbolom X<17>"<18>dipeptidni ostatak pseudoprolina, deinisan u daljem tekstu, ili njegov identični deo, sa X<17>'<18>na položajima 17 i 18. Fragment 14 sa amino kiselinskim ostacima koji generalno odgovaraju amino kiselinskim ostacima na položajima 11 do 22 nativnog GLP-1(7-36) peptida, izuzev stoje dipeptidni ostatak

pseudoprolina X<17>'<18>upotrebljen umesto ostataka SS (Ser-Ser) koji zauzimaju odgovarajuće položaje 17 i 18 nativnog GLP-1 (7-36).

[0050]Jedan ili više amino kiselinskih ostatak fragmenta 14 mogu da uključe i zaštitne grupe bočnih lanaca u skladu sa uobičajenom praksom. U nekim realizacijam, peptidni fragment 14 može da bude vezan vezana preko C-kraja za smolu. Ovaj fragment po izboru može da ima zaštitne grupe na N-kraju i/ili C-kraju. Nađeno je da je Fmoc posebno korisna zaštitna grupa za N-kraj za sintezu peptidnog fragmenta za sintezu na čvrstoj fazi. Peptidni fragment u skladu sa SEQ ID NO. 8 moež se ozančiti kao (X<17>'18)GLP-1 (11-22) kako bi se naznačima supstitucija X<17>'<18>ostatka pseudoprolina ostatkom Ser-Ser na položajima 17 i 18.

[0051]Kao što je primenjeno praksi predmetnog prnalaska, izraz pseudoprolin se odnosi na dipeptid koji sadrži ostatak hidroksilne grupe amino kiseline kao što je Ser ili Thr gde su delovi bočnog lanca sa hidroksilnim grupama zaštićeni kao prolinu-sličan, TFA labilni, oksazolidinski prsten između alfa-amino i hidroksilne grupe bočnog lanca. Kao posledica stvaranja ovakvog oksazolidinskog prstena, dipeptid funkcioniše kao reverziblni mimetik prolina.

[0052]Generalno, tipičan pseudoprolinski ostatak, inkorporiran u peptid, može se predstaviti formulom

gde O predstravlja bilo koji amino kiselinski ostatak i svaki od R<1>i R<2>je nezavisno odgovarajuća dvovalentni vezujući ostatak. Često, R<1>je dovalentni ostatak formule

gde svaki od R<3>i R<4>je nezavisno monovalentni ostatak kao što je H, ili niži alkil kao što je metil. R<3>i R4takođe mogu da budu članovi u prstenartoj strukturi. Poželjno, svaki od R<3>i R4 je metil. U slučaju zaštićenog oksazolidinin prstena Ser, R2 je dvovalentni ostatak CH2, dok u slučjau Thr, R2 je dvovalentni ostatak (CH3)CH.

[0053]Izraz "niži alkil" odnosi se na monovalentni alkil radikal sa pravim ili razgranatim lancem od jedan do šest atoma ugljenika, poželjno jedan do četiri atoma. Ovaj izraz je dalje dat primerima radikala kao što je metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, s-butil, isobutil, t-butil, n-pentil, 3-metilbutil, n-heksil, 2-etilbutil i si. Poželjlni sotaci nižih alkila su metil i etil, gde je metil posebno poželjan.

[0054]Tokom uklanjanja zaštite, R<1>ostatak je otcepljen pri čemu nastaje dipeptidni ostatak u skladu sa formulom: gde <P i R<2>su kao što je prethodno definisano. Kao što je primenjeno za fragment 14, ostatak pseudoprolina poželjno odgovara ostatku Ser-Ser gde koji je Ser bliži C-kraju je zaštićen okdazolidinskim prstenom i ima sledeću strukturu:

[0055]Bočni lanac Ser koji nosi hidroksilnu grupu blići N-kraju je zaštićen, recimo t-Bu zaštitnom grupom. Prilikom zaštite oksazolidin prstenaste strukture, i otcepljivanja t-Bu, dobija se ostatak Ser-Ser.

[0056] Upotreba mimetika prolina kao izgradivačkih jedinica za sintezu fragmenta 14 obezbeđuje značajne prednosti u kontekstu predmetnog pronalaska. Prvo, sinteza na čvrstoj fazi fragmenta 14 je značajno olakšana. Kada pseudoprolin nije upotrebljen za sintezu fragmenta 14na čvrstoj fazi, pomostji ozbiljan problem sa uklanjanjem Fmoc-a od ostataka 13 do 11. Pretpostalvja se da ovaj problem potiče zbog S nabrane konformacije. Upotreba pseudoprolina čini ova uklanjanja Fmoc daleko lakšim, usled smanjenja stepena 6 konformacije. Drugo, naknadno kuplovanje na čvrstoj fazi fragmenta 14 za fragment 12 pri čemu nastaje fragment 18, opisano u daljem tekstu je značajno olakšano. U odsustvu ostatka pseudoprolina, rastvorljivost fragmenta 18 u tipičnom rastvaraču za kuplovanje na čvrstoj fazo je veoma mala. Pseudoprolin poboljšava rastvorljivost fragmenta 18, olakšavajući kuplovanje na čvrstoj fazi ovog fragmenta za fragment 20 (Videti diskusiju na Slici. 1, u daljem tekstu).

[0057]Sinteza na čvrstoj fazi se generalno izvodi u smeru od C-kraja ka N-kraju fragmenta 14. Tako, amino kiselina G amino koj aje prisutna na delu C-kraja fragmenta, je prvi amino kiselinski ostatak koji je kuplovan za nosač (smol) čvrste faze. Sinteza na čvrstoj fazi je nastavljena konsekutivnim dodavanjem amino kiselinskih ostataka na način koji odgovara željenoj sekvenci. Međutim, dipeptid pseudoprolina X<17>"<18>je dodat na rastući lanac na položaj koji odgovara položajima 17 i 18 na GLP-1(7-36) umesto uzastopnog dodavanja para nativnih ostataka Ser na pšoložaje 17 i 18. Sinteza peptidnog intermedijernog fragmenta je završena posle ostatka na N-kraju (na primer, N-terminalni ostatak treonina residue (T) je oddat u nascentni peptisni lanac.

[0058]Fragment 16 je peptidni fragment, ili njegov indetični deo, sa amino kiselinskim ostacima u skladu sa SEQ ID NO. 9:

Q<23>AA<25>KEFIA<30>WLVKX<35>

gde X<35>je kao što je prethodno definisano, ili njegov identičniu deo sa ostatkom X<35>. Jedan li više amino kiselinskih ostataka može da sadrži zaštitne grupe na bočnom lancu u skladu sa uobičajenom praksom. Fragment 16 sadrži amino kiselinska ostatke koji odgovaraju amino kiselinama na položajima 23 do 35 u nativnom peptidu GLP-1 (7-36), osim što je X<35>na položaju 35 umesto nativne amino kiseline na tom položaju. Fragment 16 može da bude označen kao (X35)GLP-1 (23-35).

[0059]U nekim realizacijama, peptidni fragment 16 može da bude vezan za smolu preko C-kraja. Ovaj fragment po izboru može da ima bočni lanac, zaštitne grupe na N-kraju i/ili C-kraju. Nađeno je daje Fmoc posebno korisna zaštitna grupa za N-kraj za sintezu peptidnog fragmenta za sintezu na čvrstoj fazi.

[0060]U poželjnim realizcaijama, X35 je Aib u skladu sa SEQ ID NO. 10:

Q<23>AA<25>KEFIA<30>WLVKAib35

ili njegov indetični deosa Aib na položaju 35. Peptidni fragment u skladu sa SEQ ID NO. 10 može da bude označen kao (Aib<35>)GLP-1 (23-35) da bi se naglasila supstitucija Aib nativnom amino kiselinom na položaju 35 nativnog GLP-1 (7-36).

[0061]Napominjemo da fragment 16 u skladu sa SEQ ID NOS. 9 i 10 još uvek ne sadrži ostatak R (arg) na položaju 36 na C kraju. Arg je nakandno kuplovan za C kraj fragmenta 16 u fazi rastvora, poželjno sa Arg bez zaštite na bočnim lancima. Ova strategija obezbeđuje prednosti u šemi 10 na Slici. 1, jer se tako izbegavaju neželjene sporedne reakcije do kojih dolazi kao posledice upotrebe zaštićenog Arg. Na primer, posle uklanjanja zaštite sa zaštićenog Arg, sporedni proizvodi uklanjanja zaštite mogu da reaguju sa drugim elementima peptida, npr., tivptofanom. Ovim se smanjuje količina željenog peptida koji je raspoloživ u sirovom proizvodu za prečišćavanje.

[0062] Sinteza na čvrstoj fazi se generalno izvodi us meru od C-kraja ka N-kraju fragmenta 16. Tako, amino kiselina X35, koja je prisutna na delu C-kraja fragmenta, je

prvi amino kiselinski ostatak koji je kuplovan za nosač čvrste faze. Sinteza na čvrstoj fazi je zatim nastavljena konsekutivnim dodavanjem amino kiselinskih ostataka na način koji odgovara željenoj sekvenci. Sitneza fragmenta peptidnog intermedijera jepotpuna nakon ostatka na N-kraju (na primer, ostatak glutamina (Q) na N-kraju je dodat u nascentni peptidni lanac. Bilo koja od amino kiselina upotrebljenih u sintezi fragmenta 16 može da ima zaštitu na bočnim lancima u skladu sa uobičajenom praksom.

[0063] Zbog sternih smetnji u blizini smole sa nanetim X<35>, kuplovanje lizina (34) i valina (33) za rastući peptidni lanac može da bude problematično. Čak i sa viškom amino kiseline, teško je izvesti ove reakcije kuplovanja do kraja. Odabir rastvarača i/ili zatvaranje( end- capping)može da pomogne u ublažavnaju ovog problema. Nađeno je da priroda rastvoarača za kuplovanje može da ima uticaja na stepen kuplovanja. U jednom setu primera, na primer, reakcije kuplovanja su izvedene na u 3:1 NMP/DCM, 1:1 NMP/DCM, 1:1 DMF/DCM, i 3:1 DMF/DCM. Odnos ovih kombiancija rastvarača su bazirane ne zapremini. NMP se odnosi na N-metil pirolidon, DCM s eodnosi na dihlormetan, i DMF s eodnosi na dimetilformamid. Nađeno je da se reakcije kuplovanja odvijaju brže kada se koristi 1:1 DMF/DCM.

[0064]End- cappingposle svakog kuplovanja lizina i valina se takođe može primeniti kako bi se sprečilo da neizreagovani materijal na smoli material ne nastavi dalje u reakcije kuplovanja. Materijal zaend- cappingse po potrebi lakše uklanja material tokom prečišćavanja. Mogu se primeniti uobičajene tehnike zaend- capping.

[0065] Ponovo se pozivano na Sliku . 1, gde su fragment 12, 14, i 16, zajedno sa Arg, povezani tako da daju željeni peptid 11. Da bi se ovo postiglo, fragment 12 je dodat u fragment 14 na čvrstoj fazo pri čemu se dobija veći, intermedijerni fragment 18 sa amino kiselinskim ostacima u skladu sa SEQ ID NO. 11:

H<7>X<8>EX<10>TFTSD<15>VX<17-18>YL<20>EG

gde suX<8>, X<10>, i X<17>"<18>kao što je prethodno definisano. U poželjnoj realiazciji, X<8>je Aib, X10 je nativni G, i X17"18 je ostatak dipeptida pseudoprolina kao što je prethodno definisano. Ovaj intermedijerni peptidni fragment može da bude označen kao (X<8>, X<10>,

X17"18) GLP-1 (7-22).

[0066] Slika 1 dalje pokazuje da je Arg dodat u fragment 16 na C-kraju na fazi rastvora pri čemu se dobijan veći intermedijerni peptidni fragment 20 sa amino kiselinskim ostacima u skladu sa SEQ ID NO. 12:

Q<23>AA<25>KEFIA<30>WLVKX<35>R

gde je X<35>kao što je prethodno definisano i poželjeno je preferablv Aib. Poželjno, Arg dodat u peptidni fragment na ovaj način ne uključuje zaštitu bočnog lanca. Ovaj intermedijerni peptidni fragment 20 može da bude označen kao (X35)GLP-1 (23-36). Peptidni fragmenti 18 i 20 su zatim kuplovani u fazi rastvoru dajući željeni zaštićeni peptid 11 u skladu sa SEQ ID NO. 13 gde je Ser-Ser na položajima 17 i 18 u obliku zaštićenog pseudoprolina:

H 7X8EX10TFTSD15VX17-18YL20EG OAA^KEFIA^VVLVIO^R

[0067] Peptid 11 može da bude označen kao (X<8>,X<10>, X<1718>, X<35>)GLP-1(7-36). U med u kojoj druge amino kiseline imaju zaštitu bočnog lanca, ova zaštita se poželjno održava tokom dato koraka.

[0068] U izvođenju reakcione šeme na Slici. 1, sinteza na čvrstoj fazi u u rastvaraču se može izvesti standardnim metodamakoje su pozante u industriji. U reprezentativnom modelu prakse, peptidi su sintetzisani na čvrstoj fazi primenom jemijskih tehnika prema kojima su amino kiseline dodate sa C-kraja na N-kraj. Tako, amino kiselina ili peptidna grupa koja je bliža C-kraju datog fragmenta je prva koja se dodaje smoli. Ovo se izvodi reakcijom funkcionalne grupe na C-kraju amino kiseline ili peptidne grupe sa komplementarnom funkcionalnom grupom na smoli (nosaču). Deo amino kiseline ili peptidne grupe na N-kraju je maskirana kako bi se prečile neželjene sporedne reakcije. Amino kiselina ili peptidna grupa poželjno ima zaštitu bočnoglanca. Zatim su sukcesivne za peptidni materijal vezan za podlogu dodate amino kiseline ili peptidne grupe do stvaranja željenog peptida. Većina ima zaštićene bočne lance u skladu sa uobičajenom praksom. Sa svakim uspešnim kuplovanjem , uklonjena je grupa za maskiranje na N-kraju peptidnog materijala vezanog za smolu. Zatim su reagovale sa C-krajem sledeće amino kiseline čiji je N-kraj, maskiran. Proizvod sinteze na čvrstoj fazi je peptid vezan na nosač (smolu).

[0069] Bilo koja podloga pogodna za izvođenje sinteze peptida na čvrstoj fazi se može primeniti. U poželjnim realizacijama, podloga obuvhata smolu koja je napravljena od jednog ili više polimera, kopolimera ili kombinacija pilvmera kao što je poliamid, polisulfamid, supstituisani polietileni, polietileneglicerol, fenoine smole, polisaharidi, ili polistiren. Polimerni nosač takođe može da bude bilo koja čvrsta suptanca koja kje dovoljno nerastvorna i inertmna u odnosu na rastvarače koji se koriste u sitenzi peptida. Čvrstu podlogu obično čine vezane grupe (ostaci) za koej se kupluje rastući peptid tokom sinteze i koje se mogu otcepiti pod željenim uslovima i pri tome odvoje peptid od podloge. Odgovarajće čvrste podloge koje imaju linkere koji se mogu otceptiti fotonom

svetlosi ( PC- cleavable; photo- cleavable), dejstvom TFA ( TFA- cleavable), destvom HF

( HF- cleavable),dejstvom fluoridnog jona{ fluoride ion- cleavable),dalje mogu se rediktivno otcepiti( reductivelv- cleavable) ;otcepiti dejstvom Pd(O){ Pd( O) cieavable) ;zatim nukelofilno otcepiti( nucleophilicallv- cleavable) ;ili radikalno otcepiti (radically-cleavable).Poželjne grupe za vezivanje se mogu otcepiti pod takcim uslovima da su grupe bočnog lanca otcepljenog peptida u suštini u celosti zaštićene.

[0070]U poželjnoj metodi sinteze, peptidni intermedijerni fragmenti sitnetisani na čvrstoj podlozi koja je osetljvia na kiseline sa sadrži tritil grupe, i još bolje na smoli koja sadrži tritil grupe sa viseće grupe hlora, na primer 2-hlortritil hlorid (2-CTC) smola (Barlos et al.

(1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946). Primeri takođe obuvhataju tritil hlorid smmolu, 4-metiltritil hlorid smolu, 4-metoksitritil hloridsmolu, 4-aminobutan-1-ol 2-hlortritvl smolu, 4-aminometilbenzoil 2-hlortritil smolu, 3-aminopropan-1-ol 2-hlortritil smolu, smola 2-hlortritil bromasirćetne kiseline, smola 2-hlortritil cijanosirćetne kiseline , 2-hlortritil 4-cijanobenzoeve kiseline, glicinol 2-hlortritil smola, propionska 2-hlortritil smola, etileneglikol 2-hlortritil smola, N-Fmoc hidroksilamin 2-hlortritil smola, hidrazin 2-hlortritil smola. Poželjne čvrste podloge su polistiren, koji može da bude kopolimerizovan sa divinilbenzenom, pri čemu se formira materijal za podlogu čije su reakcine grupe pričvršćene.

[0071]Druge smole koje se koriste u sintezi na čvrstoj fazi su "Wang" smole, koje sadrže kopolimer stirena i divinilbenzena sa pričvršćenim 4-hidroksimetilfeniloksimetil grupama (Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc), i smole 4-hydroksimetil-3-metoksiphenoksibuterne kiseline (Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706). Smole VVang, 2-hlortritil hlorid, i 4-hidroksimetil-3-metoksifenoksi buteme kiseline mogu se nabaviti od, na primer, Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, California.

[0072]Da bi se pripremila smola za cintezu na čvrstoj fazi, smola mora da bude prethodno isprana odgovarajućim rastvaračima. Na primer, smola kao što je 2-CTC snoola je dodata u peptidnu komporu i prethodno isprana odgovarajućim rastvaračem. Rastvarač za prethodno ispiranje može da bude odabran na osnovu vrste rastvarača (ili smeše rastvarača) koji je uptoreblje u reakciji kuplovanja, ilivice versa.Rastvarači koji su pogodni za ispiranje i takođe za naknadnu reakciju kuplovanja su dihlormetan (DCM), dihloretan (DCE), dimetilformamid (DMF), i slični, kao i smeše ovih reagenasa. Drugi korisni rastvarači su DMSO, piridin, hlorform, dioksan, tetrahidrofuran, etil acetat, N-metilpirolidon, i njihove smeše. U nekim slučajevima kuplovanje se može izvesti u binarnom sistemu rastvarača, kao što je smeša DMF i DCM u zapreminskom odnosu od 9:1 do 1:9, a bolje, 4:1 do 1:4.

[0073]Sitneze predmetnog pronalaska poželjno se odvijaju u prisustvu odgovarajućih zaštitnih grupa osim ako je drugačije naznačeno. Priroda i upotreba zaštitnih grupa je dobro poznata u tehnici. Generalno, odgovarajuća zaštitna grupa je grupa bilo koje vrste koja može da pomogne u sprečavanju atoma ili ostatka za koji je vezan, npr., kiseonik ili azot, od učestvovanja u neželjenim reakcijama tokom procesiranja i sinteze. Zaštitne grupe uključuju zaštitne grupe za bočni lanac i amino- zaštitne grupe ili zaštite grupe N-kraja . Zaštitne grupe takođe mogu da spreče reakciju očo vezivanje karboksilnih kiselina, tiola i si.

[0074]Zaštitna grupa bočnog lanca odnosi se na hemijske grupe koje su kuplovanje za bočni lanac (tj., R grupa u opštoj formuli amino kisleine H2N-C(R)(H)-COOH) amino kiseline koje pomažu u sprečavanju dela bočnog lanca da reaguje sa upotrebljenim hemijskim agensima u koracima sitenze peptida, procesiranja, itd. Izbor zaštitne grupe za bočni lanac može da zavisi od različitih faktora, na primer, tipa izvedene sinteze, procesiranja kojem je izložen peptid, i željenog intermedijemog proizvoda ili krajnjeg proizvoda. Priroda zašne grupe bočnog lanca takođe zavisi od prirode same amino kiseline . Generalno, zaštitna grupa bočnog lanca je odabrana tako da se ne uklanja tokom uklanjanja zaštite sa a-amino grupa u toku sinteze na čvrstoj fazi. Shodno tome, a-amino zaštitna grupa i zaštitna grupa bočnog lanca, obično nisu iste.

[0075]U nekim slučajevima i u zavisnosti od vrste reagensa koji su upotrebljeni u sintezi na čvrstoj fazi i drugih procesiranja peptida, amino kiselina ne mora da zahteva prisustvo zaštitnih grupa bočnog lanca. Ove amino kiseline obično ne sadrže reaktivni kiseonik, azot ili drugi reaktivni deo u bočnom lancu.

[0076]Primeri zaštitnih grupa bočnih lanava su acetil (Ac), benzoil (Bz), terc-butil, trifenilmetil (tritil), tetrahidropvranil, benzili etar(Bzl) i 2,6-dihlorbenzil (DCB), t-butoksikarbonil (Boe), nitro, p-toluensulfonil (Tos), adamantiloksikarbonil, ksantil (Xan), benzil, 2,6-dihlorbenzil, metil, etil i t-butil estar, benziloksikarbonil (Z), 2-hlorbenziloksikarbonil(2-CI-Z), t-amiloksikarbonil (Aoc), i zaštitne grupe aromatičnog ili alifatičnog uretan-tipa, fotolabilne grupe kao stoje nitro veratril oksikarbonil (NVOC); i fluorid labilne grupe kao što je trimetilsilil oksikarbonil (TEOC).

[0077] Poželjne zaštitne grupe za bočni lanac koje se česte koriste u sintezi peptida GLP-1 u izvođenju predmetnog pronalaska date su u Tabeli A:

[0078]Zaštitna grupa na amino-kraju obuhvata hemijske grupe (ostatke) kuplovane sa alfa amino grupom amino kiseline. Tipično, amino-terminalna zaštitna grupa je uklonjena u reakciji uklanjanja zaštite pre dodatka sledeće amino kisleine u rastući peptidni lanac, ali može da bude prisutna kada je peptid otcepljen od podloge. Izbor zaštitne grupe amino kraja može da zavisi od različitih karakteristika, na primer, vrste izvende sitnteze i željenog intemediojernog proizvoda ili krajnjeg proizvda

[0079]Primeri amino-terminalne zaštitne grupe su (1) zaštitne grupe acil-tipa, kao što je formil, akrilili (Acr), benzoil (Bz) i acetil (Ac); (2) aromatične zaštitne grupe uretan-tipa, kao što je benziloksikarbonil (Z) i supstituisani Z, kao što je p-hlorbenziloksikarbonil, p-nitrobenziloksikarbonil, p-bromobenziloksikarbonil, p-metoksibenziloksikarbonil; (3) zaštitne grupe alifatičnog uretana, kao što je t-butiloksikarbonil (Boe), diizopropilmetoksikarbonil, izopropiloksikarbonil, etoksikarbonil, alliloksikarbonil; (4) zaštitne grupe cikloalkil uretan tipa, kao što je 9-fluorenil-metiloksikarbonil (Fmoc), ciklopentiloksikarbonil, adamantiloksikarbonil, i cikloheksiloksikarbonil; i (5) zaštitne grupe hiouretan-tipa, kao što je fenilthiokarbonil. Poželjne zaštitne grupe su 9-fluorenil-metiloksikarbonil (Fmoc), 2-(4-bifenilil)-propil(2)oksikarbonil (Bpoc), 2-fenilpropil(2)-oksikarbonil (Poc) i t-butiloksikarbonil (Boe).

[0080]Fmoc ili Fmoc-slična hernija je veoma poželljna za sintezu peptida na čvrstoj fazi, budući da otcepljenje nastalog peptide u zaštićenom obliku je relativno jasno za izvođenje primenom umereno kiselog agensa za otcepeljenje. Ova vrsta reakcije otcepljivanja je relativno čista u smislu dobijenih sporednih proizvoda, nečistoća, itd., čineći ih tehnički i ekonomski isplativim za regeneraciju peptida dobijanja na veliko, iz frakcija ispiranja bubrenja i skupljanja, povećavajući prinos. Kao što je ovde uptorebljeno, "na veliko" po pitanju sinteze peptida generalno obuhvata sintezu peptida od najmanje 500 g, a bolje najmanje 2 kg po šarži. Sinteze na veliko se obično izvode u velikim reakcionim sudovima, kao što su čelični reakcioni sudovi, koji mogu da prihvate količine reagenasa kao što su smole, rastvarači, amino kiseline, heimjski reagensi za kuplovanje, i reackije ukalanjanja zaštite, a veličina omogućava proizvodnju peptida reda veličine kilograma po toni.

[0081]Dodatno, zaštitna grupa Fmoc se može selektivno otceptiti od peptida u odnosu na zaštitne grupe bočnih lanaca tako daje ostavljena zaštita na bočnom lancu kada se Fmoc otcepi. Ova vrsta sleektivnosti je važna tokom kuplovanja amino kisleine i tako smanje reakcije na bočnom lancu. Dodatno, zaštitne grupe na bočnom lancu se mogu selektivno otcepiti u odnosu na Fmoc, ostavljajući tako Fmoc na mestu. Ova poslednja vrsta selektivnosti je važan oslonac u šemema prečišćavanjam opisanim u daljem tekstu.

[0082]Reakcija kuplovanjanj na čvrstoj fazi može se izvesti u prisustvu jednog ili više jedinjenja koji pospešuju ili unapređuju reakciju kuplovanja. Jedinjenja koja mogu da ubrzaju reakciju i smanje brzinu sporednih reakcija uključujući fosfonijum i uronijum soli koje mogu, u prisustvu tercijerne baze, na primer, diizopropiletilamina (DIEA) i trietilamina (TEA), da konvertuju zaštićene amino kiseline u aktivirane vrste (na primer, BOP, PvBOPO, HBTU, i TBTU svi prave HOBt estre). Drugi reagensi pomažu sprečavanje racemizacije obezbeđivanjem reagenasa za zaštitu. Ovi reagensi sadrže karbodiimide (na primer, DCC ili VVSCDI) sa dodatim pomoćnim nukleofilom (na primer, 1-hidroksi-benzotriazol (HOBt), 1-hidroksiazabenzotriazol (HOAt), ili HOSu). Takođe se može primeniti kombinovana metoda anhidrida, koristi izobutil hlorformat, sa ili bez dodatog pomoćnog nukleofila, kao i metoda azida, usled male racemizacije povezane sa istim. Ovi tpovi jedinjenja takođe mogu da povećaju brzinu karbodiimid-posrednovanih kuplovanja, kao i sprečavanje dehidratacije Asn i Gln ostataka.

[0083]Nakon što je određeno da je kuplovanje završeno, reakciona smeša za je isprana rastvaračem, i ciklus kuplovanja je ponovljen za svaki sledeći amino kiselinsk ostatak peptidnog materijala. Da bi se kuplovala sledeća amino kiseline, uklanajnje N-terminalne zaštine grupe (na primer, Fmoc grupe) sa materijala vezanog za smolu se obično izvodi tretiranjem sa reagensom koji sadrži 20-50% (tež.) piperidina zu rastvaraču, kao što je N-metilpirolidon (NMP) ili dimetilformamid (DMF). Posle uklanjanja Fmoc zaštitne grupe, izvodi se isprianje iz nekoliko koraka, kako bi se uklonio rezidulani piperidin i sporedni proizvodi Fmoc -a (kao što je dibenzofulven i njegovi adukti sa piperidinom).

[0084]Sledeće amino kiseline mogu se upotrebiti kao stehiometrjski višak amino kiselina u odnosu na faktor nanošenja peptidnog materjiala na smoli. Generalno, količina amino kisleina koja je upotrebljena u koraku kuplovanja je bar ekvivalentna faktoru nanošenja prve amino kiseline na smolu (1 ekvivalent ili više). Poželjno količina amino kisleina upotrebljenih u koraku kuplovanja used je najmanje 1.3 ekvivalenta (0.3 viška) ili više, i još bolje, oko 1.5 ekvivalent (0.5 viška) ili više. U nekim slučajevima, na primer, korak kuplovanja koristi equivalentnu količinu amino kiselina u opsegu između 1 i 3.

[0085]Posle finalnog ciklusa kupolvanja, smola je isprana rastvačem kao što je NMP, i ispran inertnim drugim rastvačem kao što je DCM. Da bi se uklonio sintetisani peptid sa smole, urađen je tratman otcepljivanja tako što otcepljeni peptidni materijal još uvek nosi bočni lanac i terminalne zaštićene grupe. Ostavljanje zaštitnih grupa pomaže sprečavanje neželjnih reakcija kuplovanja ili drugih neželjenih reakcija peptidnih fragmenata tokom ili posle otcepljenja od smole. U slučaju kada je upotrebljen Fmoc ili sličan za sintezu peptida, otcepljenje zaštićenog dela može se postići na bilo koji željeni način kao što je primena relativno slabih kiselih reagenasa kao što je sirćetna kiselina ili razblažena TFA u rastvaraču kao što je DCM. Obično je upotrebljava 0.5 do 10 tež. procentna, poželjno 1 do 3 tež. procentna TFA u DCM. Videti, npr., U.S. Pat. No. 6,281,335.

[0086]Koraci otcepljenja peptidnog intermedijera sa čvrste faze smole mogu se ivesti kao što jeopisano u daljem tekstu. Međuti, može se primeniti bilo koji odgovarajući postupak kojim se efikasno otcepljuju peptidni intermedijerni fragmenti sa smole. Na primer, oko 5 do 20, poželjno oko 10 zapremina rastvarača koji sadrži kiseli reagens za otcepljenje je dodato u sud koji sadrži peptidni materijal vezan za smolu. Kao posledica, u reagens je uronjena smola, obično u obliku zrna,. Reakcija otcepljenja se odvija tako što se tečni sadržaj mešan na odgovarajućoj temperaturi, određeno vereme. Agitacija sprečava zrna da se zgrudvaju. Odgovarajuće vreme i temperaturski uslovi će zavisiti depend od faktora kao što je kiseli reagens koji se koristi, priroda peptida, priroda smole 1 slično. Kao opšte smernice, pogodno bi bilo mešanje od oko -15°C do oko 5°C, poželjno od oko -10°C do oko 0°C tokom 5 minuta do dva sta, poželjno oko 25 minuta do oko 45 minuta. Vreme otcepljivanja može da bude u opsegu pd oko 10 minuta do oko 2 h ili čak ceo dan. Otcepljivanje se poželjno izvodi na niskim temperaturama kako bi se prilagodili egzotermnoj reakciji do koje obično dolazi tokom reakcije. Dodatno, niža temperatura rekaicje otcepljenja sprečava osetljivi deo zaštitnih grupa bočnog lanca, kao što su tritil grupe, bude uklonjen u ovom stadijumu.

[0087]Na kraju tretmana otcepljenja, reakcija se prekida. Ovo se može postići, na primer, kombinovanjem reagenasa za otcepljenje sa odgovarajućom bazom, kao što je piridin ili slični, i agitacija i mešanje nastavljeno još neko vreme kao na primer dodatnih 5 minuta do 2 sata, poželjno oko 20 minuta do oko 40 minuta. Dodavanje baze i nastavljena agitacija dovode do porasta temperature suda. Na kraju agitacije, sadržaj suda može da ima temperaturu od oko 0 °C do oko 15 °C, poželjno oko 5 °C do oko 10 °C.

[0088]Faktori kao što je bubrenje i skupljanje smole u cilju poboljšanja aspkeata regenreacije peptida može se po izboru inkorporirati u ukupni proces sinteze. Ove tehnike su opisane, na primer, u U.S. Pat. Pub. No. 2005/0164912 A1.

[0089]U nekim aspektina, otcepljeni peptidni fragmenti se mogu rpipremiti za kuplovanje na čvrstoj fazi za druge peptidne fragmente i/ili amino kiseline. Reakcije kuplovanja peptida u fazi rastvora su opisani, na primer, u New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafeal; Dodsvvorth, David J.; and Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303.

[0090]Kupolvanje peptidnih intermedijernih fragmenata za druge fragmente ili amino kiselinu (kiseline) u fazio rastvora može se izvesti pomoćuin situreagenasa za kuplovanje, na primer 2-(1H-benzotriazol-1-il)tris(dimetilainino)fosfonijum heksafluorofosfat (BOP), o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HBTU), o-(7-azobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU), dicikloheksikarbodiimid (DCC), karbodiimid rastvom u vodi (WSCDI), ili o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N<*>,N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborat (TBTU). Druge tehnike kuplovanja koriste prethodno pripremljene aktivne estre kao štosu estri hidroksisukcinimida (HOSu) i p-nitrofenola (HONp); prethodno pripremeljen simetrične anhidride; nesimetrične anhidride kao što su N-karboksianhidridi (NCAs); ili halogenidi kiselina kao što je acil fluorid kao i acl hlorid.

[0091]Aodgovarajući rastvarač za kuplovanje se može upotrebiti u reakciji kuplovanja na fazi rastvora. Treba naglasiti da rastvarač(i) za kuplovanje mogu da utiču na stepen racemizacije formirane peptidne veze; rastvorljivost peptida i/ili peptidne fragmente; i brzinu reakcije kuplovanja. U nekim realizacijama, rastvarač za kuplovanje obugvhata jedan ili više reagenasa koji se mešaju sa vodom. Primeri rastvarača koji se mešaju sa vodom su, na primer, DMSO, piridin, hlorform, dioksan, tetrahidrofuran, etil acetat, N-metilpirolidon, dimetilformamid, dioksan; ili njihove smeše.

[0092]U drugim realizacijama, reakcija kuplovanja moče da obuhvati jedan ili više reagenasa koji se ne mešaju sa vodom. Primer rastvarača koji se ne meša sa vodom je metilen hlorid. U ovim realizacijama, rastvarač koji se ne meša sa vodom je poželjno kompatibilan sa reakcijom uklanjanja zaštite; na primer, ako je upotrebljen rastvarač koji se ne meša sa vodom onda ond poželjno ne utiče na reakciju uklanjanja zaštite.

[0093]Posle formiranja peptida 11, proizvod se može podvrgnuti uklanjanju zaštite, prečišćavanju, liofilizaciji, daljem procesiranju (npr., reakcija sa drugim peptidom pri čemu se dobija fuzioni protein); kominacije isti, i/ili slično, po potrebi.

[0094]Na primer, prema pronalasku, zaštitne grupe bočnog lanca se obično zadržavaju na fragmentima peptidnih intermedijera tokom sinteze na čvrstoj fazi i takođe u i tokom reakcija kuplovanja na fazi razstvarača. Generalno, posle završenog kuplovanja u rastvaraču, može se izvesti jedan ili više koraka uklanjanja zaštite kako bi se uklonila jedna ili više zaštitnih grupa sa peptida.

[0095] Prilikom uklanjanje zaštitnih grupa sa bočnog lanca opštim uklanjanjem zaštite koriste se rastvori koji obuhvataju acidolitike reagense za cepanje zaštitnih grupa bočnih lanaca. Acidolitički reagensi za opšte uklanjanje zaštite uključuju čistu trifluorsirćetnu kiselinu (TFA), HCI, Levvis -ove kisleine poput BF3Et20 ili Me3SiBr, tečne fluorovodonične kiseline (HF), bromodovonika (HBr), trifluorometansulfonske kiseline, i njihove kombiancije. Rastvor za uklanjanje zaštite takođe obuhvata jedan ili više odgovarajućih tzv. sakupljača katjona (engl. cation scavengers), na primer, ditiothreitol (DTT), anizol, p-crezol, etanditiol, ili dimetil sulfid. Rastvor za uklanjanje zaštite takođe sadrži vodu. Kao što je ovde uptorebljeno, količine reagensa koji ulazi u sastav kompozicije za uklanjanje zađtite, obično su izražene u odnosu, gde je količina individualne komponente izražena kao brojilac u "delovim", kao npr. "delovi težine" ili "delovi zapremine" i iemnilac u ukupnom broju delova u kompoziciji. Na primer, rastvor za uklanjanje zaštite koji sadrži TFA:H20:DTT u odnosu 90:5:5 (težina/težina/težina) ima TFA kao 90/100 težinskih delova, H20 kao 5/100 težinskih delova , i DTT kao 5/100 tež. delova.

[0096]U nekim realizacijama, reakcija uklanjanja zaštite može se izvesti kada je količina acidolitičkog reagensa, poželjno TFA, u kompoziciji za uklanjanje zaštite veća od 90/100 tež. delova. Druge poželjen kompozicije za uklanjenj zaštite sadrže acidolitički reagens u količini od 93/100 tež delova ili više, ili u količini u opsegu od 93/100 tež. delova do

95/100 tež. delova.

[0097]Taloženje se obično izvodi pomoću etra, npr., dietil etra ili MTBE (Metil Tert Butyl Ether). Posle taloženja, peptid je poželjno izolovan i osušen pre nego što je kombinovan sa drugim sastojcima, liofiliziran, pakovan, skladišten, dalje procesiran i/ili na drugi način korišćen. Ovo se može postići na bilo koji pogodan način. Prema jednom pristupu, peptid je sakupljen filtracijom, ispran sa dosta MTBE kako bi se smanjio sadržaj soli na odgovarajući nivo, i zatim osušen.

[0098]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje korisne tehnike za prečišćavanje velike klase peptida, uključujući GLP-1 peptide i njihove identične delove.

[0099]Posebno poželjan proces prečišćavanja obuhvata bar dva eluiranja (prolaska) kroz hromatografsku sredinu, gde se bar prvi prolazak odvija pri prvom pH i bar drugi prolazak se odbija pri drugom pH. Bolje, prvi prolazak se odvija na kiselom pH, dok se drugi prolazak odvija na baznom pH. U poželjnim realizacijama, bar jedan prolazak pod kiselim uslovima se odvija pre prolaska pod baznim uslovima. Kao ilustraciju modusa prečiišćavanja ovaj pristup s emože opisani u ilustrativnom kontekstu prečišćavanja potpuno zaštićenog peptida 11 nastao prema šemi 10 datoj na Slici. 1. Prvo, sa peptida je uklonjena zaštita. Otcepljene su zaštitne grupe na N-kraju i sa bočnih lanaca. Prvi hromatografski prolaz je izveden u gradijentu voda/ACN (acetonitril), sa dovoljno TFA da se dotigne pH od oko 1 do 5, poželjno oko 2. Drugi prolaz je zatim izveden u gradijentu voda/ACN sa malom količinom amonijaka i/ili amonijum acetata, ili si., kako bi se obezbedio pH od oko 8 do 9, poželjno 8.5 do 8.9.

[0100] Vrednosti pH, bilo kisele bilo nazne, unapređuju uniformnost jonske vrste koja je prisutna u vakom slučaju, tako, kiselo pH je poželjno dovoljno nisko tako da su u suštini svi aminokiselinsk ostaci u peptidnom materijal, u protonovanom obliku. Bazno pHje poželjno dovoljno visoko da su u suštini svi amino kiselinski ostaci u peptidnom materijalu deprotonovani. Kiselan i bazna hromatografija se može ivesti bilo kojim redom. Pogodno je na kraju izvesti baznu hromatografiju kada je acetat peptida željeni proizvod u istoj meri u kojoj acetat može da bude proizvod hromatografije.

[0101] Principi predmetnog pronalaska su dalje ilustrovani u odnosu na sledeće ilustrativne primer. U daljem tekstu, svi procent i odnosi su dati u odnosu na zapreminu osim ako je drugačije naznačeno.

Primer 1 - Sinteza na čvrstoj fazi Fragmenta 12 sa Fmoc zaštitom na N- kraiu. i

zaštitom bočnih lanaca na His i Glu.

A. Dobijanje Fmoc-Gly-aktivirane( nanete)2CTC smole

[0102] Prvo, pripremljena je 2CTC smola sa Fmoc-Gly. Količina upotrebljenih reagenasa je data u sledećoj tabeli:

[0103]2-CTC smola je ddoata u 500 mL peptidni reaktor i ostavljena da nabubri dodatkom 400 mL DCM u trajanju od 30 min na 25 °C. Podloga je oceđena i dodat je rastvor Fmoc-Gly-OH i DIEA u 8 zapremina DMF:DCM (87.5:12.5). Smeša je mešana u azotu tokom 2 h na temperaturi od 25°C.

[0104]Podloga je još jednom oceđena i isprana sa 350 mL DMF ijednom sa 175 mL DMF. Zatim, preostala aktivna mesta na 2-CTC smoli su zatvorena{ end- capped)dodatkom 350 mL rastvora MeOH:DIEA (9:1) u trajanju od 1 h. Podloga je oceđena, isprana sa 250 mL DMF -a dva puta i zatim sa 350 mL DCM četiri puta. Smola je vraćena u stanje pre kvašenja ispiranjem sa 3X350 mL IPA. Smola je osušena do konstatne težine dajući 38.20 g aktivirane smole( engl. loaded resin).Analiza pokazue faktor nanošenjaod 0.18 mmol/g.

B. Sintezana čvrstojfazi

[0105]Sinteza na čvrstoj fazi je izvedena sa 20.0g Fmoc-Gly-2-CTC smole nanate kao 0.18 mmol/g kao što je pripremljeno u Delu A Primera 1. Smola je nabubrila u DCM -u (200 mL) tokom 30 min na 25 °C. Rastvarač DCM je oceđenjen i smola je isprana tri puta sa NMP (5 zapr. svako ispiranje).

[0106]Smola je zatim dva puta isprana sa 20% zapremine piperidina u NMP (5 zapr. svakog tretmana) u cilju uklnjanja Fmoc zaštitnih grupa. Posle drugog tretmana 20% piperidin/NMP, smoela je isprana pet puta sa NMP (5 zapr. svako ispiranje) do negativne reakcije na hloranil.

[0107]Za dobijanje rastvora za kuplovanje, izmerena je amino kiselina (2.85 equiv.) i 6-Hlor-1-Hydroksibenzotriazol (6-CI-HOBT, 2.85 equiv.), rastvoreni su u 2.55x zapremina NMP zatim kombinovane sa DIEA (3.25 equiv.) na 5 °C do 10 °C. TBTU (2.85 ekviv.) je rastvoren u 1.3x zapremina NMP na 5 °C do 10 °C. Dva rastvora su kombinovana. Dobijeni rastvor je dodat ureakcioni su. Sud je ispran sa 1.3x zapremine DCM dodat u reaktor, i zatim smeša mešana 2-3 h na 25 °C do 27 °Cuzet je uzorak za analizu Kaiser Test -a kako bi se utvrdilo da li je reakcija završena. Ukoliko je reakcija kuplovanja nepotpuna i posle 3 h (pozitivan Kaiser -ov Test), reakcioni sud je oseđen i ponovno kuplovanje izvedeno sa svežim rastvorom aktivniranih amino kiselina. Posle završene reakcije kuplovanja, rastvor za kuplovanje je oceđen, smola je isprana sa NMP 4 puta (5 vol. svako ispiranje). Ciklus uklanjanja zaštitnih grupa Fmoc i rekacija kuplovanja je ponovljen na preostalim amino kiselinama u fragmentu (tj., u smeru Glu(OtBu)—>Aib-His(trt)).

[0108]Zbog problema reakcije kuplovanja između aktivirane Fmoc-His(trt)-OH i H-Aib-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC i nestailnosti aktivrane Fmoc-His(trt)-OH, reakcija kuplovanja je primorana se završi ceđenjem reakcionog rastvora posle jednog sata i odmah je izvedena reakcija kupolvanja sa drugim, sveže aktiviranim rastvorom Fmoc-His(trt)-OH

[0109]Svi reagensi upotrebljeni u Delu B ovog primera dati su u sledećoj tabeli:

[0110] Peptidni fragment vezan za smolu je ispran sa NMP (5 vol.) 4 puta, DCM (6 vol.) 5 times, IPA (5 vol.) 3 puta. Smola je zatim osušena na 35°C u vakuumu pri čemu se dobija 22.58 g smole i peptida vezanog za smolu.

C. Otcepljenje Fmoc i fragmenata sa zaštićenim bočnim lanacima sa smole

[0111] Smola iz prethodno opisanog Dela B above je nabubrela u DCM -u (12.5 zapremina u odnosu na težinu u potrebljene sole; 12.5 ml DCM po g smoel ili 12.5 litara po kg) u toku 30 min na 25 °C i zatim je isprana sa DCM 2 puta (6.25 zapr. svako ispiranje) ucilju uklanjanja NMP ostataka. Smola je ohlađena sa poslednjim ispiranjem DCM na -5 °C. DCM je oceđen i dodat je hladni rastvor 1% TFA/DCM (10 zapr. na -5 °C do -10 °C) i smeša mešana 30 min na 0 °C. Dodat je piridin (1.3 ekviv. TFA) u reaktor za neutralizaciju TFA. Rastvor za otcepljenje je profiltriran i sakupljen u sudu. Dok je sud zagrevan nn 25 °C, smola je isprana sa DCM 7 puta (7.5 vol.), frakcije od sipiranja su kombinovane sa rastvorom za otcepljenje. Rastvor DCM za otcepljenje je kombinovan sa vodom (7.5 zapr.). Dobijena smeša je destilovana pod sniženim pritiskom u cilju uklanjanja DCM (350 tora na 28 °C). Peptidni fragment je istaložen iz vode kada je uklonjen DCM. Fragment je ispran vodom i osušen na 30 °C-35 °C ur vakuumu. Dobijeno je ukupno 4.73 g Fmoc-(Aib<8>)GLP-1(7-10)-OH.

Primer 2

A. Dobijanje Fmoc-Gly-aktivirane 2CTCsmole

[0112]Pripremljena je 2CTC smola sa Fmoc-Gly. Količine upotrebljenih reagenasa su date u sledećoj tabeli:

[0113]U 2-CTC smolu dodato je 500-mL peptidnog reaktora i smola je nakvašena (nabubrila) dodatkom 400 mL DCM tokom 30 min. Smola je zatim ostavljena da se osuši, i dodat je rastvor Fmoc-Gly-OH i DIEA u 8 zapremina DMF:DCM (87.5:12.5 odnos zapremina). Smeša je mešana pod azotom 2 h na temperaturi od 25 °C.

[0114]Nosač odd smole je oceđen i još jednom ispran sa 400 mL DMF i jednom sa 200mL DMF. Zatim, preostala aktivna mesta na 2-CTC smoli su zatvorena{ end- capped)dodatkom 390 mL rastvora MeOH:DIEA (9:1 odnos zapremina) u toku 1 h. Nosač je ponovo oceđen, dva puta ispran sa 350 mL DMF, i četiri puta ispran sa 350 mL DCM. Smola je zatim vraćena u stanje pre kvašenja ispiranjem sa 3X350 mL IPA. Smola je osušena na 35 °C u vakuumu do konsntante težine dajući 48.51 g aktivirane smole. Analiza je pokazala faktor nanošenja od 0.54 mmol/g.

B. Sinteza na čvrstoj fazi

[0115]Sinteza načvrstoj fazi je izvedena sa 27.59g Fmoc-Gly-2-CTC smole aktivirane kao 0.54 mmol/g. Smola je nabubrila u DCM (300 mL) tokom 30 min na 25 °C. rastvarač DCM je oceđen, i smla je tri puta isprana sa NMP (5 vol. svako ispiranje).

[0116]Smola je zatim tretirana dva puta sa 20% zapr. Piperidina u NMP (5 zapr. Svako tretiranje) u cilju uklanjanja zaštitnih grupa Fmoc. Posle drudod tretiranja sa 20% piperidin/NMP smoela je šest puta isprana sa NMP (5 zapr. svako ispiranje) do negativngo testa na hloranil.

[0117]Za pripremanje rastvora za kuplovanje, amino kiselina (1.7 ekviv.) i 6-Hlor-1-Hidroksibenzotriazol (6-CI-HOBT, izmereno je 1.7 ekviv., rastvoreno u 4.6x zapremine NMP i zatim kombinovano sa DIEA (1.9 equiv.) na 5 °C do 10 °C. TBTU (1.7 ekviv.) je rastvoren u 2.28x zapremini NMP na 5 °C do 10 °C. Dva rstvora su zatim kombinovana. Dobiejni rastvor je dodat u reakcioni sud. Sud je ispran sa 2.28 zapremine DCM u reaktor, koji je zatim mešan 2-3 h na 25 °C - 27 °C. Uzet je uzorak za anlizu za Kaiser-ov Test da bi se proverilo da je reakcija završena. Po završetku reakcije kuplovanja, rastvor za kuplovanje je oceđen, i smola isprana sa NMP 4 puta (5 zapr. svako ispiranje). Ciklus uklanjanja Fmoc grupa reakcija kuplovanja je ponovljena za preostale amino kiseline u fragmentu (tj., po redosledu Glu(OtBu)-»Aib—►His(trt)).

[0118]svi reagensi upotreblkjeni u ovom primeru su dati u sledećoj tabeli:

C. Otcepljenje fragmenta sa smole

[0119]Smola je isprana sa NMP (5 zapr.) 6 puta i zatim sa DCM (6 zapr.) 8 puta u cilju uklanjanja ostatka NMP. Smola je ohlađena sa poslednjim DCM isprianjem na -5 °C. Posle ceđenja DCM, hladan rastvor (-5 °C do -10 °C) 1% TFA/DCM (10 zapr.) je dodat, i dobijena smeša u sudu je mešana 30 min na 0 °C. U reaktor je dodat piridin (1.3 ekviv., TFA) wasu cilju neutralizacije TFA. Rastvor za otcepljenje je sakupljen u čaši. Dok se sud ugrejao do 25 °C, smola je isprana sa DCM (7.5 zapr.) 11 puta i oceđena u rastvor za otcepljenj. DCM rastvor je kombinovan sa vodom (10 zapr.). Dobijena smeša je destilovano pod snićenim pritiskom u cilju uklanjanja DCM (350 tora na 28 °C). Ffragment je staložen iz vode kada je uklonjen DCM. Fragment je ispran vodom i osušen na 30 °C- 35 °C u vakuumu. Ukupno je dboijeno 11.12 g Fmoc-(Aib<8>)GLP-1(7-10)-OH (78.8% prinos).

Primer 3

• A. Dobijanje Fmoc-Gly-aktivirane 2CTC smole

r01201 Fmoc- GIv- naneta 2CTC smola je dobijena. Količine upotreblienih reagenasa su

date u sledećoj tabeli:

[0121]2-CTC smola je napunjena u peptidni reaktor zapremine 500-mL i nabubrila potapanjem u 400 mL DCM-a u toku 30 min. Podloga je isceđena i rastvor Fmoc-Gly-OH i DIEA u 8 zapremina DMF:DCM (87.5:12.5) je dodat. Reakcijska smeša je mešana u argonskoj atmosferi u toku 2 sata na temperaturi od 25°C.

[0122]Podloga je isceđena i isprana jednom sa 400 mL DMF-a. Potom, bilo koje preostale aktivne tačke na 2-CTC smoli suend- cappedsa 390 mL MeOH:DIEA (9:1) rastvora u toku 1 sat. Podloga je isceđena, isprana dva puta sa po 350 mL DMF-a i potom četiri puta sa po 350 mL DCM-a. Smola je vraćena u stanje pre kvašenja ispiranjem sa 4 x 250 mL IPA. Smola je osušena na temperaturi od 35 °C u vakuumu do konstantne težine da bi se dobilo 52.02 g aktivirane smole. Analize pokazuju faktor nanošenja = 0.72 mmol/g.

• B. Sinteza na čvrstoj fazi

[0123] Sinteza na čvrstoj fazi je izvedena počevši od 24.43g Fmoc-Gly do 2-CTC smole aktivirane sa faktorom nanošenja = 0.72 mmol/g. Smola je nabubrila u DCM-u (250 mL) u toku 30 min na temperaturi od 25 °C. Rasvarač DCM je isceđen i smola je isprana tri puta NMP-om (5 vol. svako ispiranje).

[0124] Smola je potom tretirana dva puta sa 20% piperidina u NMP-u (5 vol. svaki tretman) da bi se uklonile Fmoc zaštitne grupe. Posle drugog 20% piperidin/NMP tretmana, smola je isprana šest puta NMP-om (5 vol. svako ispiranje) do negativnog hloranil testa.

[0125] Da bi se pripremio rastvor za kuplovanje, amino keselina i 6-hlor-1-Hodroksibenzotriazol (6-CI-HOBT) su izmereni, rastvoreni u NMP-u i potom kombinovani sa DIEA na temperaturi od 10 °C do 5 °C. TBTU je rastvoren u NMP-u na temperaturi od 10 °C do 5 °C. Dva rastvora su potom kombinovana. Dobijeni rastvor je dodat u reakcioni sud. Balon sa ravnim dnom je ispran DCM-om (za količine pogledati sledeću tabelu) u reaktor, koji je mešan u toku 2 do 6 sati na temperaturi od 25 °C do 27 °C. Uzet je uzorak za Kaiser Test da bi se proverilo kompletiranje (završetak) reakcije. Ako reakcija kuplovanja nije završena - kompletirana posle 3 sata (pozitivan Kaiser Test), reakcioni sud je isceđen i ponovljena reakcija kuplovanja je izvedena sa svežim rastvorom pobuđene amino kiseline. Pošto je reakcija kuplovanja kompletirana, rastvor za kuplovanje je isceđen i smola je isprana NMP-om 4 puta (5 vol. svako ispiranje). Potom, uklanjanje Fmoc zaštitnih grupa i ciklus reakcije kuplovanja su ponovljeni za preostale fragmente amino kiselina (na primer u sledećem redosledu GIU (O-tBu)—Aib-+His(trt)).

f0126] Svi reagensi upotrebljeni u ovom primeru dati su u sledećoj tabeli:

•C.Uklanjanje fragmenta Fmoc-AA(7-10)-OH iz smole

[0127] Dobijena smola je isprana NMP-om (5 vol.) 6 puta i DCM-om (6 vol.) 7 puta da bi se uklonio NMP. Smola je rashlađena poslednjim DCM ispiranjem na temperaturu od -5 °C. Rastvarač DCM je isceđen i podloga smole je isprana hladnim (-5 °C do -10 °C) rastvorom 1 % TFA/DCM (11.26 vol.) u toku 5 min na temperaturi od 0 °C. Rastvor za uklanjanje je prikupljen u balon sa ravnim dnom, u koji je dodat piridin (1.3 ekv. od ukupnog TFA) da bi se neutralizovao TFA. Potom, druga porcija hladnog 1% TFA/DCM (6.14 vol.) je dodato u reaktor i mešana u toku 2 min. Drugi rastvor za uklanjanje je ponovo isceđen u balon sa ravnim dnom za prikupljanje. Dok se sud zagrevao na temperaturu od 25 °C, smola je isprana DCM-om 9 puta (8.2 vol.) i isceđena u rastvor za uklanjanje. DCM rastvor je kombinovan sa vodom (8.2 vol.). Dobijena smeša je destilovana na smanjenom pritisku da bi se uklonio DCM (350 mmHg na temperaturi od 28 °C). Kad je uklonjen DCM, fragment se taloži iz vode. Fragment je ispran vodom i osušen na temperaturi od 30 °C do 35 °C u vakuumu. Ukupno 14.02 g Fmoc-(Aib<8>)GLP-1(7-10)-OH (86.6% prinos) u skladu sa SEQ ID NO. 7 je dobijeno. Analize pokazuju čistoću od 94.3% AN.

Primer4- Sinteza na čvrstoj fazi Fmoc-( Aib35) GLP- 1 ( 23- 35)- OH zaštitnih grupa na

bočnom lancu

• A.Dobijanje Fmoc-Aib-aktivirane 2CTC smole

101281 Fmoc- Aib- naneta 2CTC smola je dobijena. Količine upotrebljenih reagenasa su

date u sledećoi tabeli:

[0129]2-CTC smola je napunjena u peptidni reaktor zapremine 500 mL i nabubrila potapanjem u 400 mL DCM-a u toku 30 min. Podloga je isceđena i rastvor Fmoc-Aib-OH i DIEA u 8 zapremina DMF:DCM (87.5:12.5) je dodat. Reakcijska smeša je mešana u argonskoj atmosferi u toku 2 sata na temperaturi od 25 °C.

[0130]Podloga je isceđena i isprana DMF-om, 400 mL prvi put i 200 mL drugi put. Potom, bilo koje preostale aktivne tačke na 2-CTC smoli suend- capped sa400 mL MeOH:DIEA (9:1) rastvora u toku 1 sat. Podloga je isceđena. Smola je isprana jednom sa 450 mL DMF-a/MeOH/DlEA (4:0.9:0.1), jedan put sa 200 mL DMF-a i četiri puta sa 350 mL DCM-a. Smola je vraćena u stanje pre kvašenja ispiranjem sa 3 x 350 mL IPA. Smola je osušena do konstantne težine da bi se dobilo 45.15 g aktivirane smole. Analize pokazuju faktor nanošenja = 0.24 mmol/g.

•B. Sinteza načvrstojfazi

[0131]10.01 g Fmoc-Aib do 2-CTC smole sa faktorom nanošenja = od 0.24 mmal/g je napunjeno u reakcioni sud i nabubrilo potapanjem u DCM (120 mL) u toku 30 min na temperaturi od 25 °C. Rastvarač DCM je isceđen i smola je isprana tri puta NMP-om (6 vol. svako ispiranje).

[0132]Smola je potom tretirana dva puta sa 5% zapreminski piperidina u NMP-u (6 vol. svaki tretman) da bi se uklonile Fmoc zaštitne grupe. Posle drugog 5% piperidin/NMP tretmana, smola je isprana četiri puta NMP-om (6 vol. svako ispiranje).

[0133]Da bi se pripremio rastvor za kuplovanje, amino keselina (1.875 ekv.) i 1-hodroksi-benzotriazol monohidrat (HOBT hidrat, 2.07 ekv.) su rastvoreni u 3.5 x zapremina NMP-a na temperaturi od 5 °C do 10 °C i potom kombinovani sa 16.1 mL rastvora HBTU (2.0 ekv.) u NMP-u (1.5 x vol.). Potom 2.2 mL DIEA (2.63 ekv.) je dodato u aktivacioni sud na temperaturi od 10 °C do 5 °C. Dobijeni rastvor je prebačen u reakcioni sud. Aktivacioni sud je ispran sa 1.5 x zapremina DCM-a u reaktor, koji je potom mešan u toku 2 sata na temperaturi od 25 °C. Reakcioni sud je isceđen. Reakcija kuplovanja je ponovljena još jedan put sa svežim rastvorom pobuđene amino kiseline (1.875 ekv.) Posle kompletiranja druge reakcije kuplovanja, rastvor za kuplovanje je isceđen i smola je isprana NMP-om 4 puta (6 vol. svako ispiranje). Potom, uklanjanje Fmoc zaštitnih grupa i ciklus reakcije kuplovanja je ponovljen za preostale fragmente amino kiselina (na primer u sledećem redosledu Lys(BocHVal-*Leu-»Trp(Boc)-»Ala-f|le-»Phe-*GIU(OtBu)-» Lys(Boc)->Ala^Ala-+Gln(trt)).

T01341Svi reagensi upotreblieni u ovom primeru dati su u sledećoi tabeli:

[0135]Dobijena Smola je isolated ispiranjem sa 4 puta NMP-om (6 vol.), 4 puta DCM-om (6 vol.) i 3 puta izopropanolom (IPA, 6 vol.). Dobijena smola je osušena na temperaturi od 35 °C u vakuumu. 14.3 g izgrađene smole je dobijeno.

• C. Uklanjanje intermedijarnih fragmenata iz dobijene smole

[0136] 6.6 g prethodno izgrađene - dobijene smole je nabubrilo potapanjem u 10 x zapreminu DCM-a u toku 30min i ohlađeno na temperaturu od -10 °C. DCM je isceđen i hladan rastvor 1% TFA/DCM (12 vol. na temperaturi od -5 °C do -10 °C) je dodat i

mešan u toku 30 min na temperaturi od 0 °C. Rastvor za uklanjanje je prikupljen u balon sa ravnim dnom koji sadrži piridin (2 - 3 ekv. od TFA). U toku zagrevanja na temperaturu od 25 °C, smola je mešana sa 1% TFA/DCM (10 x vol.) u toku 5min i piridin (2 - 3 ekv.) je dodat. Posle još 5 minuta, rastvor je prikupljen. Smola je isprana DCM-om 4 puta (10 vol.). Sva DCM ispiranja su kombinovana sa vodom (voda/DCM = 1/4). Dobijena smeša je destilovana na smanjenom pritisku da bi se uklonio DCM (350 mmHg na temperaturi od 28 °C). Kad je uklonjen DCM, fragment se taloži iz vode. Fragment je ispran vodom i osušen na temperaturi od 30 °C do 35°C u vakuumu. Postupak uklanjanja je ponovljen još jednom. Ukupno 2.36 g Fmoc-(Aib<35>) GLP-1 (23-35)-OH je dobijeno (92 % prinos).

Primer 5

• A. Dobijanje Fmoc-Aib-aktivirane 2CTC smole

T01371Fmoc- Aib- naneta 2CTC smola je dobijena. Količine reagenasa upotreblienih u

ovom primeru date su sledećoj tabeli:

[0138]2-CTC smola je napunjena u peptidni reaktor zapremine 500 mL i nabubrila potapanjem u 400 mL DCM-a u toku 30 min. Podloga je isceđena i rastvor Fmoc-Aib-OH i DIEA u 8 zapremina DMF.DCM (87.5:12.5) je dodat. Reakcijska smeša je mešana u argonskoj atmosferi u toku 2 sata na temperaturi od 25 °C.

[0139]Podloga je isceđena i isprana sa 400 mL DMF-a. Potom, bilo koje preostale aktivne tačke na 2-CTC smoli suend- cappedsa 400 mL MeOH:DIEA (9:1) rastvora u toku 1 sat. Podloga je isceđena, isprana jedan put sa 400 mL DMF-a, jedan put sa 200 mL DMF-a i četiri puta sa 350 mL DCM-a. Smola je vraćena u stanje pre kvašenja ispiranjem sa 3x 350 mL IPA. Smola je osušena do konstantne težine da bi se dobilo 45.32 g aktivirane smole. Analize pokazuju faktor nanošenja = 0.30 mmol/g.

• B. Sinteza na čvrstoj fazi

[0140]Sinteza na čvrstoj fazi je izvedena počevši od 15.0g Fmoc-Aib do 2-CTC smole aktivirane sa faktorom nanošenja = 0.30 mmol/g. Smola je nabubrila u DCM-u (150 mL) u toku 30 min na temperaturi od 25 °C. Rasvarač DCM je isceđen i smola je isprana dva puta DCM-om (6 vol. svako ispiranje) i tri puta NMP-om (6 vol. svako ispiranje).

[0141]Smola je potom tretirana dva puta sa 20% piperidina u NMP-u (6 vol. svaki tretman) da bi se uklonile Fmoc zaštitne grupe. Posle drugog 20% piperidin/NMP tretmana, smola je isprana šest puta NMP-om (6 vol. svako ispiranje) do negativnog hloranil testa.

[0142]Da bi se pripremio rastvor za kuplovanje, amino keselina (1.7 ekv.) i 6-hlor-1-hodroksibenzotriazol (6-CI-HOBT, 1.7 ekv.) su izmereni, rastvoreni u 2.6 x zapremina NMP-a na temperaturi od 10 °C do 5 °C i potom kombinovani sa DIEA (1.9 to 3.0 ekv.). TBTU ili HBTU (1.7 ekv.) je rastvoren u 1.33 x zapremina NMP-a na temperaturi od 10 °C do 5 °C. Dva rastvora su potom kombinovana. Dobijeni rastvor je dodat u reakcioni sud. Balon sa ravnim dnom za prikupljanje je ispran sa 1.33 x zapremina DCM-a u reaktor, koji je potom mešan sa smolom u toku 2 do 3 sata na temperaturi od 25 °C do 27 °C. Uzet je uzorak za Kaiser Test da bi se utvrdila kompletnost reakcije. Ako reakcija kuplovanja nije kompletirana posle 3 sata (pozitivan Kaiser Test), reakcioni sud je isceđen i ponovljena reakcija kuplovanja je izvedena sa svežim rastvorom pobuđene amino kiseline. Pošto je reakcija kuplovanja kompletirana, rastvor za kuplovanje je isceđen i smola je isprana NMP-om 4 puta (6 vol. svako ispiranje). Potom, uklanjanje Fmoc zaštitnih grupa i ciklus reakcije kuplovanja je ponovljen za preostale fragmente amino kiselina (na primer u sledećem redosledu: Lys(Boc)-A/al->Leu-+ Trp(Boc)->Ala-»lle->Phe->GIU

(OtBu)-*Lys(Boc)-*Ala^Ala->Gln(trt)).

[0143]Zbog mogućeg sternog efekta( engl, buttressing effect)između 2-metilalanina (Aib) i 2-CTC smole, prilično je teško izvesti kompletne reakcije kuplovanja prve dve amino kiseline (Lys(Boc)-34 i Val-33). Zbog toga, obe reakcije kuplovanja za (Lys(Boc)-34, Val-33) su izvedene ti puta (na primer, reakcija kuplovanja je praćena sa dve ponovljene reakcije kuplovanja). Takođe, anhidrid sirćetne kiseline je upotrebljen da bi seend- capneodreagovani materijali povezani sa smolom posle reakcija kuplovanja Lys(Boc)-34 i Val-33. Ovo je povećalo efikasnost kasnijih postupaka prečišćavanja uklanjanjem nečistoća iz željenog proizvoda u toku hromatografskog prečišćavanja.

f0144] Svireagensi upotreblieni u ovom primeru dati su u sledećoi tabeli:

•C.Uklanjanje fragmenta iz dobijene smole

[0145] Prethodno dobijena smola je isprana DCM-om 7 puta (6 vol. svako ispiranje) da bi se uklonio NMP ostatak i smola je rashlađena poslednjim DCM ispiranjem na temperaturu od -5 °C. Rastvarač DCM je isceđen i hladan rastvor 1% TFA/DCM (12 vol. na temperaturi od -5 °C do -10 °C) je dodat i mešan u toku 30 min na temperaturi od 0 °C. Rastvor za uklanjanje je prikupljen u balon sa ravnim dnom koji sadrži piridin (1.3 ekv. od TFA). Dok se sud zagrevao na temperaturu od 25 °C, smola je isprana DCM-om 9 puta (10 vol.) i isceđena u rastvor za uklanjanje. DCM rastvor je kombinovan sa vodom (6 vol.). Dobijena smeša je destilovana na smanjenom pritisku da bi se uklonio DCM (350 mmHg na temperaturi od 28 °C). Kad je uklonjen DCM, fragment se taloži iz vode. Fragment je ispran i osušen na temperaturi od °C do 35 °C u vakuumu. U ovom primeru postupak uklanjanja je ponovljen još jednom. Ukupno 6.78 g Fmoc-(Aib<35>) GLP-1 (23-35)-OH je dobijeno (68.1% prinos) sa čistoćom od 87.3% AN..

Primer 6

• A. Dobijanje Fmoc-Aib-aktivirane 2CTC smole

r01461 Fmoc- Aib- naneta 2CTC smola je dobijena. Količine reagenasa upotrebljenih u

ovom primeru date su sledećoi tabeli:

[0147]2-CTC smola je napunjena u peptidni reaktor zapremine 500 mL i nabubrila potapanjem u 400 mL DCM-a u toku 30 min. Podloga je isceđena i rastvor Fmoc-Aib-OH i DIEA u 8 zapremina DMF:DCM (87.5:12.5) je dodat. Reakcijska smeša je mešana u argonskoj atmosferi u toku 2 sata na temperaturi od 25 °C.

[0148]Podloga je isceđena i isprana sa 400 mL DMF-a. Potom, bilo koje preostale aktivne tačke na 2-CTC smoli suend- cappedsa 400 mL MeOH.DlEA (9:1) rastvora u

toku 1 sat. Podloga je isceđena, isprana jedan put sa 400 mL DMF-a, isprana jedan put sa 200 mL DMF-a i isprana četiri puta sa 350 mL DCM-a. Smola je vraćena u stanje pre kvašenja ispiranjem sa 3x 350 mL IPA. Smola je osušena do konstantne težine da bi se dobilo 47.56 g aktivirane smole. Analize pokazuju faktor nanošenja = 0.37 mmol/g.

•B. Sintezana čvrstojfazi

[0149]Sinteza na čvrstoj fazi je izvedena počevši od 25.0g Fmoc-Aib do 2-CTC smole aktivirane sa faktorom nanošenja = 0.37 mmol/g. Smola je nabubrila u DCM-u (250 mL) u toku 30 min na temperaturi od 25 °C. Rastvarač DCM je isceđen i smola je isprana dva puta DCM-om (6 vol. svako ispiranje) i tri puta NMP-om (6 vol. svako ispiranje).

[0150]Smola je potom tretirana dva puta sa 20% zapreminski piperidina u NMP-u (6 vol. svaki tretman) da bi se uklonile Fmoc zaštitne grupe. Posle drugog 20% piperidin/NMP tretmana, smola je isprana šest puta NMP-om (6 vol. svako ispiranje) do negativnog hloranil testa.

[0151]Da bi se pripremio rastvor za kuplovanje, amino keselina i 6-hlor-1-hodroksi-benzotriazol (6-CI-HOBT) su izmereni, rastvoreni u 3.2 x zapremina NMP-a (ili DMF-a za Lys-34, Val-33 i Gln do 23) potom kombinovani sa DIEA na temperaturi od 10 °C do 5 °C. TBTU je rastvoren u 1.6 x zapremina NMP-a (ili DMF-a za Lys-34, Val-33 i Gln do 23) na temperaturi od 10 °C do 5 °C. Dva rastvora su potom kombinovana. Dobijeni rastvor je dodat u reakcioni sud i balon sa ravnim dnom je ispran sa 1.6 x zapremina DCM-a u reaktor, koji je mešan sa smolom u toku 2 do 3 sata na temperaturi od 25 °C do 27 °C. Uzet je uzorak za Kaiser Test da bi se utvrdila kompletnost reakcije. Ako reakcija kuplovanja nije završena - kompletirana posle 3 sata (pozitivan Kaiser Test), reakcioni sud je isceđen i ponovljena reakcija kuplovanja je izvedena sa svežim rastvorom pobuđene amino kiseline. Pošto je reakcija kuplovanja kompletirana, rastvor za kuplovanje je isceđen i smola je isprana NMP-om 4 puta (6 vol. svako ispiranje). Potom, uklanjanje Fmoc zaštitnih grupa i ciklus reakcije kuplovanja je ponovljen za preostale amino kiseline u fragmentu (na primer u sledećem redosledu Lys(Boc)—>Val-+ Leu-+Trp(Boc)-»Ala-+lle^Phe^GIU (OtBuHLys(Boc)->Ala-^AIa-^GIn(trt)).

[0152] Zbog mogućeg sternog efekta između 2-metilalanina (Aib) i 2-CTC smole, prilično je teško izvesti kompletne reakcije kuplovanja prve dve amino kiseline (Lys(Boc)-34 i Val-33). Uslovi za odvijanje reakcije kuplovanja za Lys(Boc)-34, Val-33 i Gln(trt) do 23 su modifikovani povećanjem upotrebljenih količina i amino kiselina i 6-CI-HOBT sa 1.7 ekv. na 2.5 ekv. i DIEA sa 1.9 ekv. na 3.0 ekv.. Rastvarač za reakciju kuplovanja takođe je promenjen od NMP u DMF u cilju forsiranog kompletiranja reakcije kuplovanja. Takođe, u ovom primeru, anhidrid sirćetne je upotrebijen da bi seend- capneodreagovani materijali povezali sa smolom posle reakcija kuplovanja Lys(Boc)-34 i Val-33. Ovo je povećalo efikasnost kasnijih postupaka prečišćavanja uklanjanjem nečistoća iz željenog proizvoda u toku hromatografskog prečišćavanja.

f01531 Svi reagensi upotreblieni u ovom primeru dati su u sledećoj tabeli:

•C. Uklanjanje fragmenta iz dobijene smole

[0154]Prethodno dobijena smola je isprana DCM-om 6 puta (6 vol. svako ispiranje) da bi se uklonio NMP i smola je rashlađena poslednjim DCM ispiranjem na temperaturu od -5 °C. Rastvarač DCM je isceđen i hladan rastvor 1% TFA/DCM (10 vol. na temperaturi od -5 °C do -10 °C) je dodat i mešan u toku 30 min na temperaturi od 0 °C. Rastvor za uklanjanje je prikupljen u balon sa ravnim dnom koji sadrži piridin (1.3 ekv. od TFA). Dok se sud zagrevao na temperaturu od 25 °C, smola je isprana DCM-om 7 puta (6 vol.) i isceđena u rastvor za uklanjanje. DCM rastvor je kombinovan sa vodom (10 vol.). Dobijena smeša je destilovana na smanjenom pritisku da bi se uklonio DCM (350 mmHg na temperaturi od 28 °C). Kad je uklonjen DCM, fragment se taloži iz vode. Fragment je ispran i osušen na temperaturi od 30 °C do 35 °C u vakuumu. U ovom primeru, postupak uklanjanja je ponovljen još jedan put da bi se postiglo potpuno uklanjanje. Ukupno 12.36 g Fmoc-fAib35) GLP-1 (23-35)-OH je dobijeno (59.35% prinos) sa čistoćom od 84.3%

AN.

Primer 7

•1. Ispiranje smole:

[0155]Počevši od prethodno aktivirane Fmoc-Gly-0 do 2-CTC smole (faktor nanošenja od 0.18 do 0.65 mmol/g), ili Fmoc-Aib-0 do 2-CTC (faktor nanošenja od 0.25 do 0.65 mmol/g), standardna Fmoc hernija je primenjena. Smola je prvo nabubrila potapanjem u 10 x zapremina DCM-a u toku 30 do 60 min. Potom DCM je isceđen i smola je isprana sa 10 x zapremina NMP-a (od 3 do 5 puta (5 min. svako)).

•2. Opšti ciklus sinteze:

[0156]Using a smola isprana u skladu sa Sekcijom 1 ovog Primera 7, Fmoc uklanjanje je ostvareno sa dva tretmana -10 x rastvorom 20% piperidina u NMP-u (v/v). Tretmani su trajali od 15 do 30 min svaki. Piperidin/NMP solution je isceđen posle svakog tretmana. Smola je potom isprana NMP-om 4 do 5 puta (10 x zapremina, 5 min svako).

[0157] Da bi se pripremio rastvor za kuplovanje, Fmoc zaštićena amino kiselina (AA) i HOBt, su izmereni (od 1.5 do 2.0 ekv.), rastvoreni u 4 x zapremina NMP-a na temperaturi od 10°C i kombinovani sa DIEA (1.5 do 2.0 ekv.). HBTU (1.5 do 2.0 ekv.) je rastvoren u 3 x zapremina NMP-a na temperaturi od 10°C. Dva rastvora su potom kombinovana i pomešan sa 3 x zapremina DCM-a u toku 1 do 2 min. Dobijeni rastvor je dodat u reakcioni sud i pomešan sa smolom uz intezivno mešanje u toku 1.5 do 5 sati. Uzet je uzorak za Kaiser test da bi se proverilo kompletiranje (završetak) reakcije. Nekompletna reakcija kuplovanja je ponovo izvedena. Pošto je reakcija kuplovanja kompletirana, rastvor za kuplovanje je isceđen i smola je isprana NMP-om 5 puta (10 x zapremina, 5 min svako). • A. Poštujući uobičajene postupke za sintezu, fragment FmoC - GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC koji sadrži prirodnu sekvencu je postupno dobijen. Potom je fragment u skladu sa SEQ ID NO. 7 kuplovan sa dobijenim fragment Fmoc-GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC dobijenim u ovoj Sekciji A upotrebom uobičajenih postupaka za sintezu. • B. Poštujući uobičajene postupke za sintezu, fragment Fmoc-GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC je postupno dobijen. Međutim, uslovi za uklanjanje Fmoc zaštitnih grupa su promenjeni u rastvor 10% piperidina i 2% DBU u NMP(v/v) umesto rastvora 20% piperidina u NMP-u (v/v). Takođe je i vreme tretiranja na poziciji AA14 [Fmoc-Ser(tBu)-] i poziciji AA13 [Fmoc-Thr(tBu)-j produženo na 1.5 sat da bi ostvarilo kompletiranje reakcije. Potom je fragment u skladu sa SEQ ID NO. 7 kuplovan sa dobijenim Fmoc-GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC fragmentom upotrebom uobičajenih postupaka za sintezu.

• C. Poštujući uobičajene postupke za sintezu, sa rastvorom za uklanjanje Fmoc zaštitnih grupa satava 10% piperidina i 2% DBU u NMP(v/v), fragment Fmoc-(X<17>"<18>) GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC je postupno dobijen. Potom je fragment u skladu sa SEQ ID NO. 7 kuplovan sa dobijenim Fmoc-(X<17>"<18>) GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC

fragmentom upotrebom uobičajenih postupaka za sintezu.

• D. Poštujući uobičajene postupke za sintezu, fragment Fmoc-(X<17>"<18>) GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC je postupno dobijen. Potom je fragment u skladu sa SEQ ID NO. 7

kuplovan sa dobijenim Fmoc-(X<17>'<18>) GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC fragmentom

upotrebom uobičajenih postupaka za sintezu.

• E. Poštujući uobičajene postupke za sintezu u gornjem paragrafu D i izuzimajući razlike naznačene u sledećoj tabeli, fragment Fmoc-(X<17>"<18>) GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC je postupno dobijen. Potom je fragment u skladu sa SEQ ID NO. 7 kuplovan sa dobijenim Fmoc-(X<17>"<18>) GLP-1 (11 do 22) do 2-CTC fragmentom upotrebom uobičajenih postupaka za sintezu.

f01581 Sledeća tabela daje detalje postupaka A do E ovog Primera:

•F. Uklanjanje fragmenta:

[0159]Da bi se postiglo uklanjanje fragmenta, uzimajući u obzir bilo koji peptidni fragment sintetizovan u ovom primeru, dobijena peptidna smola je nabubrila potapanjem u 10 x zapremina DCM-a u toku 30 min i ohlađena na temperaturu od -10 °C. DCM je isceđen i rastvor 1% TFA/DCM (10 x zapremina) je dodat i mešan u toku 30 min. Rastvor za uklanjanje je prikupljen u balon sa ravnim dnom koji sadrži piridin (2 - 3 ekv. u odnosu na TFA). U toku zagrevanja na temperaturu od 25 °C, smola je tretirana sa 1% TFA/DCM (10 x zapremina) u toku 5 min i potom piridin (2 - 3 ekv. u odnosu na TFA) je dodat. Posle još 5 min intezivnog mešanja, rastvor je prikupljen. Smola je potom isprana sa 10 x zapremina DCM- 4 puta (5 min svako). Rastvori svih ispiranja i uklanjanja su kombinovani i pomešani sa vodom (voda/DCM odnos = -1/4 zapreminski). Dobijena smeša je distilovana na smanjenom pritisku da bi se uklonio DCM (350 torr/28 °C). Peptidni fragment se taloži iz vode posle uklanjanja DCM i filtriranja. Peptidni fragment je ispran vodom i osušen na temperaturi od 30 "C u vakuumu.

Primer 8-Sinteza rastvora: Dodavanje Arg

[0160](Aib<35>) GLP-1 (23-35) fragment (koji nosi zaštitne grupe bočnog lanca u skladu sa Tabelom A i Fmoc zaštitnu grupu na N-terminalu (9.11 g, 3.94 mmol) je rastvoren u DMSO (90 mL). U ovaj rastvor, HOBt (2.42 g, 4 ekv.), HBTU (5.98 g, 4 ekv.), DIEA (3.44 mL, 5 ekv.) i H-Arg (2HCI)-NH2 (3.8 8g, 4 ekv.) su dodati zajedno sa 10 mL DMSO. Reakciona smeša je intezivno mešana i praćena upotrebom HPLC. Posle 4 sata, reakcija nije kompletirana, pa je 2 mL DIEA dodato. Reakcija se završila u toku noći. Potom je piperidin (5 mL) dodat u reakcionu smešu. Uklanjanje Fmoc je urađeno u toku 2 sata. Reakciona smeša je ohlađena ledenom vodom (800 mL) i mešana u toku 40 min. Dobijeni proizvod u čvrstom stanju je profiltriran, ispran vodom (400 mL) i osušen u toku noći da bi se dobio fragment (9.65 g, težina ; prinos 109%) (Aib<35>) GLP-1 (23-36).

Primer 9

[0161]Fragment (Aib<8>, X<1>7"18) GLP-1 (7 do 22) (7.73 g, 2.88 mmol) koji nosi zaštitne grupe bočnog lanca u skladu sa Tabelom A i Fmoc zaštitnu grupu na N-terminalu je rastvoren u DMSO (65 mL).

[0162]U ovaj rastvor, HOBt (0.73 g, 4.77 mmol), HBTU (1.46 g, 3.85 mmol), DIEA (0.71 mL, 7.40 mmol) i fragment (Aib<35>) GLP-1 (23-36) (8.5 g, 3.45 mmol) su dodati zajedno sa 20 mL DMSO. Reakciona smeša je intezivno mešana i praćena upotrebom HPLC. Posle 3 sata reakcija kuplovanja je kompletirana. Potom je piperidin (5 mL) dodat u reakcionu smešu. Uklanjanje Fmoc je urađeno u toku 2 sata. Reakciona smeša je ohlađena ledenom vodom (800 mL) i mešana u toku 30 min. Dobijeni proizvod u čvrstom stanju je profiltriran, ispran vodom (400 mL) i osušen u toku noći da bi se dobio zaštićeni peptid (Aib<8>, X<17>'<18>, Aib<35>) GLP-1 (7-36).

Primer 10- Opšte uklanjanje zaštite

[0163] Peptid pripremljen prema Primeru 9 (16.24 g) je tretiran rastvorom TFA/DTT/voda (100 mL/5 g/2.0 mL) tokom 2 h i dobijeni rastvor je dodat u MTBE (800 mL) u ledenom kupatilu. Posle 30 min agitacije, dobijeni beli čvrsti ostatak je profiltriran, ispran sa MTBE (400 mL) i osušen dajući tako dirov peptidni proizvod (16.0 g, težinski prinos 138%). Nastali peptid sa uklonjenom zaštitom je u daljem tekstu označen kao "sirovi" peptid.

Primer 11 - Prečišćavanje

[0164]Prečišćavanje sirovog peptida je izvedeno na Kromasil<®>C4,10 mikrona, 2.0 x 25 cm koloni dajući prečišćen peptid čistoće 98+% čistoće i prinos od~60 % sadržan / sadržan . Prečišćavanje obuhvata prvo hromatografsko propuštanje na pH 2, nakon čegla sledi drugo propuštanje na pH 9. Posle ovog prečišćavanja, prečišćen se može dalje procesirati na na različite načine. Na primer, dobijena frakcija iz drugog propuštanja se može liofilzirati ili propustiti kroz koncentracionu kolonu i izolovati

taloženjem. Izolovanjem će se dobiti željeni peptid (acetat).

[0165]Kao prikaz dva procesa propuštanja kroz kolonu, sirov peptid je rastvoren kao 5 mg/ml (sa bazom) u smeši 10% acetonitril/ voda (0.2M sirćetna kiselina). Replikatne 1000 mg injekcije (sa bazom) su pripremljene korišćenjem gradijenta acetonitril/ THF / voda/TFA i frakcije čistoće -95% su sakupljene( engl. pool)."Reciklizovana frakcija" je takođe sakupljena čistoće -70% što čini -34% regeneracije. Reciklizovana frakcija je ponovo injektirana primenom istog gradijenta acetonitril/ THF / voda/ TFA, i sakupljena kao -85% čistoće i kombinovana sa osnovnim prinosom( pulom).Prinos za prvo propuštanje hromatografskog prečišćavanja je 70%.

[0166]Kombinovanipulprvog propuštanja kroz kolonu (pH 2 je dalje prečišćen u drugom propuštanju kroz kolonu na istoj Kromasil<®>C4 koloni ali primenom drugog gradijenta acetonitril/ THF / voda/ amonijum acetat (pH 8.8). Frakcije su kombinovane dajući čistoću 98 +% kao -85% rgeneracije drugog propuštanja kroz kolonu. Ukupni prinos za oba prečišćavanja je 60% (sadržan /sadržan).

[0167]Kombinovani pul drugog propuštanja kroz kolonu (pH 8.8) je zatim koncentrovan na istoj Kromasil<®>C4 koloni, prrimenom step gradijenta metanol / voda/ amonijum acetat. Frakcije su kombinovane i spremne za izolovanje.

A. Priprema rastvora sirovog peptida:

[0168]8 g sirovog peptida je rastvoreno u 500 ml 90% rastvora 0.2N sirćetne kiselina/10% acetonitril. Rastvor je profiltriran filtered, jednom kroz 0.45 mikrona Durapore filter (47 mm prečnik) (Millipore) i zatimkroz Supor EKV disk stack mikron filter (0.65/0.2 mm prečnik) (Pali Filters). Sirovi injekcionu rastvor je analiziran HPLC i nađeno je da sadrži 5.02 mg (wt%) peptida po ml. (500 ml x 5.02 mg/ml = 2512 mg sadržanog peptid).

B. Hrokmatografija-prvo propuštanje krozkolonuna pH~2:

[0169]Četiri replikatne injekcije su pripremljene sa rastvorom sirovog peptida pod sledećim uslovima: Kolona : proizvođač: Kromasil sa pakovanjem C4, 10 mikrona i dimenzijama od 2.0 x 25cm

Detektor: Ultravioletni detektor podešen na 280 nm (8 nm širina trake, 350/20 nm ref.)

Temp. kolone: ambijent

Brzina protoka: 13.0 ml/min (-50 bar povratni pritisak)

Mobilna faza:

1. A = smeša 0.1% trifluorsirćetna kiselina /15% acetonitril/ 85% voda

2. B = smeša 0.1% trifluorsirćetna kiselina /15% tetrahidrofuran / 70% acetonitril /15% voda

Gradijent: Gradijent počinje sa 100% A mobilnom fazom i ostavljena na tom nivou 0.1 minut. Uzorak je zatim ručno nanet na kolonu pumpom C (videti opis Pumpe C). Posle nanošenja uzorka, linearni gradijent od 100% A do 83% A tokom 1 minuta. Mobilna faza je zatim zadržana na 83% A sledećih 11 minuta. Drugi linearni gradijent je zatim držan na 73% A tokom 10 minuta. Mobilna faza je zatim ostavljena na 73% A sledećih 15 minut. Analiza je zatim završena i nakon toga sledi 10 minuta ispiranja sa 100% B i zatim 20 minuta ekvilibracija kolone na 100% A.

Uzorak je nanet pomoću odvojen izokratske HP 1100 pumpe pri 9.0 ml/min (pumpa - C). Nečistoće koje se rano eluiraju su odvojene od glavnog pika pomoću 11 minuta izokratskog 83% A pa zatim linearnim gradijentom do 73% A u toku sledećih 10 minuta. Pik glavnog peptida je zatim eluiran tokom 15 minut na 73% A. Frakcije su sakupljene tokom ovog 15 minutnog 73% A.

C. Ponovljeno prvo propuštanje kroz kolonunapH-2:

[0170]reciklizovan pul je dobijen od frakcija za koje je određeno da sadrže nečistoće koje se mogu dodati u kombinovnai pul. Ove frakcije su zasebno kombinovane i razblažene sa jednakim zapreminama vode. Reciklizovana injekcija je naneta na kolonu pripremljena od ovih zasebno kominbovanih pulova. Primenjeni su isti hromatografski usolvi i frakcije prihvatljive čistoće su kombinovane, razblažene jednakim zapreminama vode, i zatim dodate u kombinovani pul od prvog propuštanja kroz kolonu.

[0171]Nanošenje reciklizovanih rastvora za injektiranje je značajno manje nego u slučaju sa sirovim rastvorom zbog većekoličine nečistoća koje se eluiraju u blizini peptidnog pika. U prošeku, postoji 1 reciklizovana injekcija za svake 2 sirove injekcije.

D. Prep hromatografija drugog propuštanja kroz kolonu na pH 8.8:

[0172]Krajnji kombinovani pul iz prvog propuštanja kroz kolonu je dalje prečišćen ponovnom hromatografijom na pH 8.8. Primena pH 8.8 za drugo propuštanje kroz kolonu značajno menja redosled euliranja nečistoća, omogućavajući tako bolje bolje čišćenje pri većoj regenaraciji. Uslovi primenjeni za ovu drugu hromatografiju su sledeći: Kolona: Manufactured by Kromasil sa pakovanjem C4, 10 mikrona i dimanzija:2.0 x 25cm

Detektor: Ultraviolet detektor podešen na 280 nm (8 nm širina trake, 350/20 nm ref)

Temp Kolone: ambijenta

Brzina protoka: 13.0 ml/min (-50 bar povratni pritisak)

Mobilna faza:

A = smeša 15% acetonitril/ 85% voda sa 2 grama po litru amonijum acetata i 1mL po litru konc. amonijum hidroksida.

B = smeša 15% tetrahidrofuran / 60% acetonitril / 25% voda sa 2 grama po litru amonijum acetata i 1mL po litru kon. ammnijum hidroksida.

Gradijent: Gradijent po'inje sa 100% A mobilnom fazom i ostavaljen tako 0.1 minut. Uzorak je zatim ručno nanet na kolonu pomoću pumpe C. Posle nanošenja uzorka, primenjen je linearni gradijent od 100% A do 67% A tokom 2 minuta. Mobiln faza je zatim ostavljena na 67% A sledeća 33 minuta. Analiza je završena i nakon toga sledi ispiranje u trajanju od 5 minuta sa 100% B , a nakon toga 15 minuta ponovne ekvilibracije kolone sa 100% A.

Uzorak je nanet na kolonu pomoću odvojene izokratske HP 1100 pumpe sa 9.0 ml/min (pumpa - C). Posle 30 minuta nanošenja, primenjen je kratki gradijent od 100%A do 67% A , od 30.2 do 32 min. Pik glavnog peptida eluiran je tokom 33 minuta pri 67% A. Sakupljanje frakcija početo od 20 minuta posle nanošenja na kolonu i zaršeno nakon što je glavni pik u potpunosti euliran. Frakcije su sakupljane približno 15 minuta. Prihvatljive frakcije su sakupljene( engl. pooled)i razblažene sa istom količinom vode. Recikovanje je moguće u ovom stadijumu prečišćavanja, ali odbačene frakcije generalno ne sadrže dovoljno peptida da obezbedi injekciju recikla. Ovo može da bude izvodljivo ako se izvrši veliki broj injekcija i odbačene frakcije su sakupljene za reciklovanje.

E. Koncentraciona analiza:

[0173] Krajnja kombinovana frakcija ( pul) drugog propušđtanja kroz kolonu je naneta na istu kolonu i brzo eluirana različitom mobilnom fazom u cilju koncentrovanja peptida ua izolovanje. U koraku primenjeni su sledeći uslovi: Kolona: Proizvođač Kromasil sa pakovanjem C4, 10 mikrona i dimenzijama 2.0x25 cm Detektor: Ultravioletni detektor podešena na 280 nm (8 nm širina trake, 350/20 nm ref)

Kolona Temp: ambijent

Brzina protoka: 13.0 ml/min (~50 bar povratni pritisak)

Mobilna faza:

A = smeša 10% metanol / 90% 20 mM amonijum acetat

B = smeša 90% metanol /10% 20 mM amonijum acetat

Gradijent: Gradijent počinje sa 100% A mobilne faze u trajanju od 0.1 minuta. Uzorak je zatim ručno nanet na kolonu pumpom C. Posle nanošenja uzorka, mobilna faza je ostavljena na 100% A tokom 5 minuta. Mobilna faza je zatim direktno prebačena na 100%B u toku 20 minuta. Analiza je završena i nastavljeno sa ponovnom ekvilibracijom kolone sa 100% A u trajanju od 15 minuta.

Uzorak je nanet pomoću odvojene izokratske HP 1100 pumpe sa 9.0 ml/min (pumpa - C). Posle koraka nanošenja u trajanju od 45 minuta, sledi kratko zadržavanje na 100% A u trjanju od 5 minuta, zatim step gradijent do 100% B u trajanju od 20 minuta kako bi se eluirao peptid. Eluiranje glavnog pika počinje 2 minuta posle step gradijenta do 100%B. Sledećih 12 minuta eluirane su frakcije sa peptidom i sakupljene za izolovanje.

Primer 12-Liofilizacija

[0174]Odmerena je FLPE boca od 1 litra sa širokim grlom. U ovu bolcu dodat je prečišćen pul (frakcija) (210 ml) (Aib<8>, X<17>"<13>, Aib<35>) GLP-1 (7-36) acetata u vodenom rastvoru acetonitril/amonijum acetat. Sud je ispran dejonizovanom vodom 3 x 5 mL i frakcije od sipiranja su dodate u pul. Ovaj rastvor je promešan kako bi se homogenziovao i zatim zatvoren i smrznut u tečnom azotu. Zamrznuta boca je zatim otvorena i grlić je pokriven dvostrukim Kimvvipe -om koji je pričvršen gumicom. Boca je stavljena u epruvete sa vakuum zatvaračima{ engl. vacutainer)na liofilizatoru i liofilizirana. Temperatura kondenzatora -89°C, pritisak 19 mikrona.

[0175]Posle 24 h provereno je napredovanje reakcije, i zapažen je veliki komad leda. Liofilizacija je restartovana.

[0176]Posle dodatnih 18 h boca je uklonjena sa liofilizatora i proverena je tećina. Težina je nestabilan, ubrzano raste zbog hidgroskopske prirode proizvoda. Statički proizvod je brzo prebačen u tariranu staklenu bočicu i odmeren, dobijeno je 0.822 g.

Primer 13: Taloženje prečišćenog peptida

[0177]U sudu, rastvor 100.5 mg čistog (Aib<8>, X<17>"<18>, Aib<35>) GLP-1 (7-36) acetata u 2 mL 20 mM amonijum acetata u MeOH/voda (9:1 odnos zapremina) je razblažen sa 1 mL 20mM amonijum acetata u MeOH/voda (9:1 odnos zapremina). Uz agitaciju, polako je dodato 20 mL Izopropanola (IPA) u sud na 20 °C do 25°C. Došlo je do zamućenja smeše nakon dodatih 15 mL IPA. Mešanje je nastavljeno preko noći na 20 °C do 25 °C. Staloženi proizvod je profiltriran i spran sa 5 mL IPA i zatim osušen na 25°C u vakuumu do konstane težine. Dobijen je 90.9 mg peptida (regeneracija od 90.42%).

Primer 14: Izolovanje prečišćenog peptida

[0178]U sudu, rastvor 497.7 mg čistog (Aib<8>,<X17>'<18>, Aib<35>) GLP-1 (7-36) acetata u 10 mL 20 mM amonijum acetata u smeši MeOH/voda (9:1) je razblažen sa 6 mL 20mM amonijum acetata u smeši MeOH/voda (9:1). Uz agitaciju, u sud je polako je dodato 40 mL izopropanola (IPA) na 20 °C do 25 °C tokom 35 min. Došlo je do zamućenja smeše nakon dodata 2 mL IPA. Mešanje je nastavljeno još jedan sat na 20 °C do 25°C. Staloženi proizvod je profiltriran i ispran sa 5 mL IPA i zatim osušen na 25 °C u vakuumu do konstantne težine. Dobijeno je 458.4 mg peptida (regenracija od 92%).

Primer 15: Izolovanje prečišćenog peptida

[0179] U sudu, 900 mL IPA je polako dodato u rastvor, na mešalici,~1000 mg prečišćenog (Aib<8>,<X17>"<18>, Aib<35>) GLP-1 (7-36) acetata u 150 mL 20 mM amonijum acetata u smeši MeOH/voda (9:1) kroz koncentracionu kolonu na 20 °C do 25°C. Ovo dodavanje je završeno u toku 45 min.. Došlo je do zamućenja smeše nakon dodatih 260 mL IPA. Mešanje je nastavljeno još 40 min na 20 °C do 25°C. Staloženi proizvod je profiltriran i ispran sa 5 mL IPA i zatim osušen na 20 °C to 25 °C u vakuumu do konstantne težine. Dobijeno je 746 mg peptida (regeneracija od 74.6%).

Claims (1)

1. Postupak dobijanja insulinotropičnog peptida, koji obuhvata sledeće korake a) do f): a) obezbeđlvanje prvog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6), gde je svaki od ostataka X<8>i X<10>, chiralna amino kiselina, svaki od H i E po izboru ima zaštitu bočnog lanca; b) obezbeđivanje drugog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom TFTSDVX<17>-<18>YLEG (SEQ ID NO. 8) gde je ostatak ozbeležen simbolom X<1718>, dipeptidni ostatak pseudoprolina, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; c) kuplovanje prvog fragmenta za drugi fragment pri čemu se dobija treći peptidni fragment sa amino kiselinskom sekvencom HX<8>EX<10>TFTSDVX17'18YLEG (SEQ ID NO.

11), dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu bočnog lanca; d) obezbeđivanje četvrtog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom QAAKEFIAWLVKX<35>(SEQ ID NO. 9), gde X<35>je ostatak ahiralne amino kiseline, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru uključuju zaštitu bočnog lanca; e) kupolvanje četvrtog peptidnog fragmenta za arginin u cilju dobijanja petog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), dati ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu bočnog lanca; i f) kuplovanje petog fragmenta za treći fragment pri čemu se dobija insulinotropic peptide including the amino acid sekvence HX<8>EX<10>TFTSDVX<1718>YLEGQAAKEFIAWLVK X35R(SEQ ID NO. 13), dati ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu bočnog lanca.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što obuhvata sledeće korake: g) uklanjanje zaštitnih grupa s abolčnog lanca pri čemu se dobija insulinotropični peptid amino kiselinske sekvence HX<8>EX<10>TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX<35>R (SEQ ID NO. 5) i njegovi identični delovi, pri čemu simpoli X na položajima , 8,10, i 35 nezavisno označavaju ahiralni, po izboru amino kiselinski ostatak sa sternim efektom.

3. Postupak dobijanja insulinotropičnog peptida prema zahtevu 1, naznačen time što obuvhata sledeće korake: a) obezbeđivanje prvog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6), gde X8 je amino kiselinski ostatak koji odgovara Aib i X10 je amino kiselinskki sotatak koji odgovara glicinu, i svaki od H i E po izboru imaju zaštitu na bočnim lancima; b) obezbeđivanje durog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom TFTSDVX<17>'<18>YLEG (SEQ ID NO. 8) gde je ostatak označen simbolom X<17>"<18>, dipeptidni ostatak pseudoprolina, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu na bočnim lancima; c) kuplovanje prvog fragmenta za drugi fragment pri čemu se dobija treći peptidni fragment sa amino kiselinskom sekvencom HX<8>EX10TFTSDV X<17>"<18>YLEG (SEQ ID NO.

11), dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu na bočnim lancima; d) obezbeđivanje četvrtog peptidnog fragmenta sa amino kiselinskom sekvencom QAAKEFIAWLVKX<35>(SEQ ID NO. 9), gde X35 je amino kiselinski ostatak koji odgovara Aib, dati amino kiselinski ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu na bočnim lancima; e) kupolvanje četvrtog peptidnog fragmenta za arginin pri čemu se dobija peti peptidni fragment amino kiselinske sekvence OAAKEFIAVVLVK X<35>R (SEQ ID NO. 12 dati ostaci sekvence po izboru imaju zaštitu bočnog lanca; i f) kuplovanje petog fragmenta sa trećim fragmentom nakon čega su uklonjene zaštitne grupe sa bočnih lanaca pri čemu se dobija insulinotropični peptid formuleHX8EX<10>TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX<35>R (SEQ. ID No. 5) i njegovi identični delovi, gde X<8>i X<35>su amino kiselinski ostaci koji odgovaraju Aib i X<10>je amino kiselinski ostatak koji odgovara glicinu.

4. Postupak prema zahtevima 1 ili 3, naznačen time, što X<8>je amino kiselinski ostatak koji odgovara metil alaninu.

5. Postupak prema zahtevima 1 or 3, naznačen time, što X<10>amino kiselinski ostatak koji odgovara glicinu.

6. Peptidni fragment amino kiselinske sekvence HX<8>EX<10>(SEQ ID NO. 6), naznačen time, što svaki odX8i X10 je ahiralna amino kiselina, a svaki od H, E, X<8>i X<10>po izboru ima zaštut bočnog lanca.

7. Ppeptidni fragment prema zahtevu 6, naznačen time, što X<8>amino kiselinski ostatak koji odgovara Aib, a X10 je amino kiselinski ostatak koji odgovara glicine.

8. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što insulinotropični peptid obuhvata amino kisleinsku sekvencu (SEQ. ID No. 5) i njegove identične delove, pri čemu svaki od simbola X na položajima 8,10, i 35 nezavisno označava ahiralni, po izboru amino kiselinski ostatak sa sternim efektom; i gde jedan ili više amino kiselinskih ostatak po izboru ima zaštitu bočnog lanca.

9. Postupak prema zahtevu 8, naznačen time, što bar jedan od X<8>i X<35>je ostatak Aib.

10. Postupak prema zahtevu 8, naznačen time, što X<10>je ostatak glicina.

11. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što X<17>"<18>ima formulu gde<Ppredstavlja ostatak bilo koje amino kiseline po izboru sa zaštitom na bočnom lancu i svaki od R<1>i R2 je nezavisno odgovarajući dvovalentni vezujućaostatak.

12. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time, što 0 predstavlja ostatak Ser po izboru sa zaštitom na bočnom lancu.

13. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time, što R<2>je-CH2-.

14. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time, što R<1>je gde svaki od R<3>i R<4>je nezavisno monovalentni ostatak odabran od H ili nižeg alkila ili R<3>i R<4>takođe mogu da budu članovi strukture prstena.

15. Postupak prema zahtevu 14, naznačen time, što svaki od R<3>i R4 je metil.

16. Peptide ili njegov identičn deo sa amino kiselinskom sekvencom TFTSDVX17"<18>YLEG (SEQ. ID NO. 8), naznačen time, što ostatak označen simbolom X17"18 je dipeptidni ostatak pseudoprolina; dati amino kiselinski ostaci po izboru imaju zaštitu na bočnim lancima

17. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što X35 je amino kiselinski ostatak metilalanina.

18. Postupak prema zahtevima 1 to 2, naznačen time, što insulinotropični peptid ima amino kisleinsku sekvencu (SEQ. ID No. 4) i njegovi identični delovi.

19. Postupak prema zahtevu 18, naznačen time, što insulinotropični peptide ima amino kiselinsku sekvencu (SEQ. ID No. 4) i njegovi identični delovi, koji je amidiran na C-kraju.