RS51325B - Polipeptidi koji imaju antimikrobno dejstvo i polinukleotidi koji ih kodiraju - Google Patents

Abstract

Polipeptid koji ima antimikrobnu aktivnost, naznačen time što sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2.Prijava sadrži još 17 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OBLASTPRONALASKA

[0001]Predstavljeni pronalazak se odnosi na izolovane polipeptide koji imaju antimikrobno dejstvo i izolovane polinukleotide koji kodiraju te polipeptide. Pronalazak se takođe odnosi na konstrukte nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine koje sadrže te polinukleotide kao i na postupke za proizvodnju i primenu tih polipeptida.

OSNOVA PRONALASKA

[0002]Ovchinnikova et al. "Purification and primarv structure of two isoforms of arenicin, a novel antimicrobial peptide firom marine polvchaeta Arenicola marina", FEBS Lett., vol. 577, pp. 209-214 (2004) opisuje dva antimikrobna peptida od 21-ostatka, arenicin-1 i arenicin-2, koji ispoljavaju aktivnost protiv Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija i gljiva iz celomocita morske polihete Arenicola marina. Arenicini nemaju strukturnu sličnost ili homologiju sekvenci sa bilo kojim prethodno identifikovanim antimikrobnim peptidima.

[0003]Cilj predstavljenog pronalaska je obezbediti polipeptide koji imaju antimikrobno dejstvo i polinukleotide koji kodiraju te polipeptide.

REZIME PRONALASKA

[0004]Predstavljeni pronalazak se odnosi na izolovane polipeptide koji imaju antimikrobno dejstvo i koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQID NO: 2.

[0005]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na izolovane polinukleotide koji kodiraju polipeptide koji imaju antimikrobno dejstvo, i koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2.

[0006]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na konstrukte nukleinske kiseline, rekombinantne ekspresione vektore i rekombinantne ćelije domaćine koje sadrže te polinukleotide.

[0007]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na postupke za proizvodnju takvih polipeptida koji imaju antimikrobno dejstvo koji sadrže (a) kultivaciju rekombinantne ćelije domaćina koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid pod uslovima koji pogoduju proizvodnji polipeptida; i (b) dobijanje polipeptida.

[0008]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na postupke za primenu polipeptida i polinukleotida prema pronalasku.

DEFINICIJE

[0009] Antimikrobno dejstvo:Termin "antimikrobno dejstvo" ovde je definisan kao dejstvo koje omogućava ubijanje ili inhibiciju rasta mikrobnih ćelija. U kontekstu predstavljenog pronalaska termin "antimikrobna" određen je tako da označava postojanje baktericidnog i/ili bakteriostatičnog i/ili fungicidnog i/ili fungistatičnog efekta i/ili virucidalnog efekta, pri čemu termin "baktericidni" treba razumeti kao sposoban da ubija baterijske ćelije. Termin "bakteriostatičan" treba razumeti kao sposoban da inhibira bakterijski rast, tj. da inhibira rastuće bakterijske ćelije. Termin "fungicidan" treba razumeti kao sposoban da ubija gljivične ćelije. Termin "fungistatičan" treba razumeti kao sposoban da inhibira gljivični rast, tj. da inhibira rastuće gljivične ćelije. Termin "virucidalni" treba razumeti kao sposoban da inaktivira virus. Termin "mikrobne ćelije" označava bakterijske ili gljivične ćelije (uključujući kvasce).

[0010]U kontekstu predstavljenog pronalaska termin "inhibicija rasta mikrobnih ćelija" određen je tako da označava da su ćelije u ne-rastućem stanju, tj., da nisu sposobne da se umnožavaju.

[0011]Za svrhe predstavljenog pronalaska, antimikrobno dejstvo može biti određena prema postupku koji su opisali Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991). Alternativno, antimikrobno dejstvo može biti određeno prema NCCLS vodiču iz CLSI (Institut za kliničke i laboratorijske standarde; ranije poznat kao Nacionalni Komitet za kliničke i laboratorijske standarde).

[0012]Polipeptidi koji imaju antimikrobno dejstvo mogu biti sposobni da smanje broj živih ćelija vrsteEscherichia coli(DSM 1576) do 1/100 posle 24 časa (poželjno posle 12 časova, poželjnije posle 8 časova, poželjnije posle 4 časa, poželjnije posle 2 časa, najpoželjnije posle

1 časa, i naročito posle 30 minuta) inkubacije na 20°C u vodenom rastvoru od 25% (tež./tež.); poželjno u vodenom rastvoru od 10% (tež./tež.); poželjnije u vodenom rastvoru od 5%

(tež./tež.); čak još poželjnije u vodenom rastvoru od 1% (tež./tež.); najpoželjnije u vodenom rastvoru od 0.5% (tež./tež.); i naročito u vodenom rastvoru od 0.1% (tež./tež.) polipeptida koji imaju antimikrobno dejstvo.

[0013]Polipeptidi koji imaju antimikrobno dejstvo takođe mogu biti sposobni da inhibiraju rast vrsteEscherichia coli(DSM 1576) za 24 časa na 25°C u podlozi za rast mikroba, kada se dodaju u koncentraciji od 1000 ppm; poželjno kada se dodaju u koncentraciji od 500 ppm; poželjnije kada se dodaju u koncentraciji od 250 ppm; čak još poželjnije kada se dodaju u koncentraciji od 100 ppm; najpoželjnije kada se dodaju u koncentraciji od 50 ppm; i naročito kada se dodaju u koncentraciji od 25 ppm.

[0014]Polipeptidi koji imaju antimikrobno dejstvo mogu biti sposobni da smanje broj živih ćelijaBacillus subtilis(ATCC 6633) do 1/100 posle 24 časa (poželjno posle 12 časova, poželjnije posle 8 časova, poželjnije posle 4 časa, poželjnije posle 2 časa, najpoželjnije posle 1 časa, i naročito posle 30 minuta) inkubacije na 20°C u vodenom rastvoru od 25% (tež./tež.); poželjno u vodenom rastvoru od 10% (tež./tež.); poželjnije u vodenom rastvoru od 5%

(tež./tež.); čak poželjnije u vodenom rastvoru od 1% (tež./tež.); najpoželjnije u vodenom rastvoru od 0.5% (tež./tež.); i naročito u vodenom rastvoru od 0.1 % (tež./tež.) polipeptida koji imaju antimikrobno dejstvo.

[0015]Polipeptidi koji imaju antimikrobno dejstvo takođe mogu biti sposobni da inhibiraju rastBacillus subtilis(ATCC 6633) za 24 časa na 25°C u podlozi za rast mikroba, kada se dodaju u koncentraciji od 1000 ppm; poželjno kada se dodaju u koncentraciji od 500 ppm; poželjnije kada se dodaju u koncentraciji od 250 ppm; čak poželjnije kada se dodaju u koncentraciji od 100 ppm; najpoželjnije kada se dodaju u koncentraciji od 50 ppm; i naročito kada se dodaju u koncentraciji od 25 ppm.

[0016]Polipeptidi prema predstavljenom pronalasku imaju najmanje 20%, poželjno najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, poželjnije najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, čak poželjnije najmanje 90%, najpoželjnije najmanje 95%, i čak najpoželjnije najmanje 100% antimikrobnog dejstva polipeptida koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je prikazana kao aminokiseline 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2.

[0017] Izolovani polipeptid:Termin "izolovani polipeptid" kao što je ovde korišćen odnosi se na polipeptid koji je najmanje 20% čist, poželjno najmanje 40% čist, poželjnije najmanje 60% čist, čak poželjnije najmanje 80% čist, najpoželjnije najmanje 90% čist, i čak najpoželjnije najmanje 95% čist, kao što je određeno pomoću SDS-PAGE.

[0018] Značajno čist polipeptid:Termin "značajno čist polipeptid" ovde označava preparat polipeptida koji sadrži najviše 10%, poželjno najviše 8%), poželjnije najviše 6%, poželjnije najviše 5%, poželjnije najviše 4%, najviše 3%, čak poželjnije najviše 2%, najpoželjnije najviše 1%, i čak najpoželjnije najviše 0.5 težinskih % drugog polipeptidnog materijala sa kojim je on prirodno povezan. To jest, prema tome, poželjno je daje značajno čist polipeptid najmanje 92% čist, poželjno najmanje 94% čist, poželjnije najmanje 95% čist, poželjnije najmanje 96% čist, poželjnije najmanje 96% čist, poželjnije najmanje 97% čist, poželjnije najmanje 98% čist, čak poželjnije najmanje 99%, najpoželjnije najmanje 99.5% čist i čak najpoželjnije 100% čist prema težini ukupnog polipeptidnog materijala prisutnog u preparatu.

[0019]Polipeptidi prema predstavljenom pronalasku poželjno su u značajno čistom obliku. Naročito, poželjno je da su polipeptidi u "uglavnom čistom obliku", tj., da je preparat polipeptida uglavnom bez drugog polipeptidnog materijala sa kojim je on prirodno povezan. Ovo se može postići, na primer, pripremom polipeptida pomoću dobro poznatih rekombinantnih postupaka ili pomoću klasičnih postupaka prečišćavanja.

[0020]Ovde, termin "značajno čist polipeptid" je sinonim sa terminima "izolovani polipeptid" i "polipeptid u izolovanom obliku."

[0021] Identičnost:Veza između dve aminokiselinske sekvence ili između dve nukleotidne sekvence opisana je parametrom "identičnost".

[0022]Za svrhe predstavljenog pronalaska, stepen identičnosti između dve aminokiselinske sekvence određen je primenom programa FASTA uključenog u verziju 2.0x FASTA programskog paketa (videti W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analvsis", PNAS 85: 2444-2448; i W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183: 63-98). Korišćeni matriks za bodovanje bio je BLOSUM50, penal za prazninu (gap) bio je -12, i penal za produžavanje praznine bio je -2.

[0023]Stepen identičnosti između dve nukleotidne sekvence određen je primenom istog algoritma i softverskog paketa kao što je opisano u prethodnom tekstu. Korišćeni matriks za bodovanje bio je matriks identičnosti penal za prazninu bio je -16, a penal za produžavanje praznine bio je -4.

[0024]Alternativno, poravnanje dve aminokiselinske sekvence određeno je korišćenjem programa Needle iz EMBOSS paketa (http://emboss.org) verzija 2.8.0. Program Needle koristi algoritam za globalno poravnanje opisan u Needleman, S. B. and Wunsch, C. D.

(1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. Korišćen je supstitucioni matriks BLOSUM62, penal za otvaranje praznine je 10, penal za produženje praznine je 0.5. Stepen identičnosti između aminokiselinske sekvence iz ovog pronalaska (kao što su aminokiseline 1 do 43 iz SEQ ID NO:2) i druge aminokiselinske sekvence izračunat je kao broj tačnih poklapanja u poravnanju dve sekvence, podeljen sa dužinom (brojem aminokiselnskih ostataka) sekvence iz ovog pronalaska; ili alternativno izlazni rezultat iz programa Needle označen sa "najduža identičnost" korišćen je kao procenat identičnosti i izračunat na sledeći način: (identični ostaci x 100)/(dužina poravnanja - broj praznina u poravnanju). Rezulat je izražen u procentu identičnosti.

[0025] Polipeptidni fragment: Termin "polipeptidni fragment" ovde je definisan kao polipeptid kod koga je jedna ili više aminokiselina deletirana sa amino i/ili karboksil kraja SEQ ID NO:2 ili njene homologe sekvence, gde fragment ima antimikrobno dejstvo. U jednoj varijanti fragment uključuje najmanje 15, poželjno najmanje 16, poželjnije najmanje 17, još poželjnije najmanje 18, najpoželjnije najmanje 19 i naročito najmanje 20 susednih aminokiselina iz SEQ ID NO:2.

[0026] Podsekvenca: Termin "podsekvenca" je ovde definisan kao nukleotidna sekvenca kod koje je jedan ili više nukleotida deletirano sa 5' i/ili 3' kraja SEQ ID NO:l ili njene homologe sekvence, gde podsekvenca kodira polipeptidni fragment koji ima antimikrobno dejstvo.

[0027] Alelska varijanta: Termin "alelska varijanta" ovde označava bilo koji od dva ili više alternativnih oblika gena koji zauzimaju isti lokus na hromozomu. Alelske varijacije nastaju prirodno putem mutacija i mogu dovesti do polimorfizma unutar populacija. Genske mutacije mogu biti tihe (bez promene u kodiranom polipeptidu) ili mogu kodirati polipeptide sa promenjenim aminokiselinskim sekvencama. Alelska varijanta polipeptida je polipeptid kodiran od strane alelske varijante gena.

[0028] Značajno čist polinukleotid: Termin "značajno čist polinukleotid" kao što je ovde korišćen odnosi se na na pripremljeni polinukleotid koji je oslobođen od drugih različitih ili neželjenih nukleotida i koji je u obliku koji je pogodan za korišćenje unutar proizvodnog sistema za proteine dobijene genetičkim inženjeringom. Stoga, značajno čist polinukleotid sadrži najviše 10%, poželjno najviše 8%, poželjnije najviše 6%, poželjnije najviše 5%, poželjnije najviše 4%, poželjnije najviše 3%, još poželjnije najviše 2%, još poželjnije najviše 1%, i najpoželjnije najviše 0.5 težinskih % drugog polinukleotidnog materijala sa kojim je povezan u nativnom obliku. Značajno čist polinukleotid, međutim, može uključivati 5' i 3' netranslatirane regione koji se prirodno javljaju, kao što su promotori i terminatori. Poželjno je daje značajno čist polinukleotid najmanje 90% čist, poželjno najmanje 92% čist, poželjnije najmanje 94% čist, poželjnije najmanje 95% čist, poželjnije najmanje 96% čist, poželjnije najmanje 97% čist, još poželjnije najmanje 98% čist, još poželjnije najmanje 99%, i najpoželjnije najmanje 99.5 težinskih % čist. Polinukleotidi ovog pronalaska su poželjno u značajno čistom obliku. Naročito, poželjno je da su polinukleotidi dati ovde u "značajno čistom obliku", tj., daje pripremljeni polinukleotid u značajnom stepenu oslobođen od drugog polinukleotidenog materijala sa kojim je u nativnom stanju povezan. Ovde je termin "značajno čist polinukleotid" sinonim sa terminima "izolovani polinukleotid" i "polinukleotid u izolovanom obliku." Polinukleotidi mogu biti poreklom genomski, cDNK, RNK, polusintetički, sintetički, ili bilo koja njihova kombinacija.

[0029] cDNK:Termin "cDNK" je ovde definisan kao DNK molekul koji se može pripremiti reverznom transkripcijom sa zrelog splajsovanog iRNK molekula dobijenog iz eukariotske ćelije. cDNK nedostaju intronske sekvence koje su obično prisutne u odgovarajućoj genomskoj DNK. Inicijalni, primarni RNK transkript je prekursorska iRNK koji se u nizu koraka obrađuje pre nego što postane zrela splajsovana iRNK. Ovi koraci uključuju uklanjanje intronskih sekvenci procesom koji se označava kao splajsovanje. cDNK izvedenoj iz iRNK prema tome, nedostaju sve intronske sekvence.

[0030] Konstrukt nukleinske kiseline:Termin "konstrukt nukleinske kiseline" kao što je ovde korišćen, odnosi se na molekul nukleinske kiseline, bilo jedno- ili dvo-lančani, koji je izolovan iz gena koji se javlja u prirodi, ili koji je modifikovan tako da sadrži takve segmente nukleinskih kiselina koji u prirodi ne postoje. Temin konstrukt nukleinske kiseline je sinonim sa terminom "ekspresiona kaseta" kada konstrukt nukleinske kiseline sadrži kontrolne sekvence neophodne za ekspresiju kodirajuće sekvence ovog pronalaska.

[0031] Kontrolna sekvenca:Termin "kontrolne sekvence" ovde je derfinisan tako da uključuje sve komponente koje su neophodne ili pogodne za ekspresiju polinukleotida koji kodira polipeptid ovog pronalaska. Svaka kontrolna sekvenca može biti nativna ili strana nukleotidnoj sekvenci koja kodira polipeptid. Takve kontrolne sekvence uključuju, ali nisu ograničene, na lider, poliadenilacionu sekvencu, propeptidnu sekvencu, promotor, signalnu peptid sekvencu i terminator transkripcije. U minimalnom slučaju, kontrolne sekvence uključuju promotor, i transkripcione i translacione stop signale. Kontrolnim sekvencama se mogu dodati linkeri u svrhu uvođenja specifičnih restrikcionih mesta koja olakšavaju vezivanje kontrolnih sekvenci sa kodirajućim regionom nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid.

[0032] Operativno vezan:Termin "operativno vezan" ovde označava konfiguraciju u kojoj je kontrolna sekvenca postavljena na odgovarajućoj poziciji u odnosu na kodirajuću sekvencu polinukleotidne sekvence na taj način da kontrolna sekvenca upravlja ekspresijom kodirajuće sekvence polipeptida.

[0033]Kodirajuća sekvenca: Kada se ovde koristi termin "kodirajuća sekvenca" on označava nukleotidnu sekvencu, koja direktno određuje aminokiselinsku sekvencu njenog proteinskog proizvoda. Granice kodirajuće sekvence su u opštem slučaju određene otvorenim okvirom čitanja, koji obično počinje sa ATG start kođonom ili alternativnim start kodonom kakvi su GTG i TTG. Kodirajuća sekvenca može biti DNK, cDNK, ili rekombinantna nukleotidna sekvenca.

[0034] Ekspresija: Termin "ekspresija" uključuje bilo koji korak u proizvodnji polipeptida, koji uključuje, ali nije ograničen na, transkripciju, post-transkripcionu modifikaciju, translaciju, post-translacionu modifikaciju, i sekreciju.

[0035] Ekspresion vektor: Termin "ekspresioni vektor" ovde je definisan kao linearni ili cirkularni molekul DNK koji sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid pronalaska, i koji je operativno vezan sa dodatnim nukleotidima koji obezbeđuju njegovu ekspresiju.

[0036] Ćelija domaćin: Termin "ćelija domaćin", kao što je ovde korišćen, uključuje bilo koji ćelijski tip koji je podložan transformaciji, transfekciji, transdukciji, i sličnom sa konstruktom nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotid ovog pronalaska.

[0037] Modifikacija: Termin "modifikacija" ovde označava bilo koju hemijsku modifikaciju polipeptida koji sadrži aminokiseline 1 do 21 iz SEQ ID NO:2, kao i genetičku manipulaciju DNK koja kodira polipeptid. Modifikacija (modifikacije) može biti supstitucija (substitucije), delecija (delecije) i/ili insercija (insercije) aminokiseline (aminokiselina), kao i zamena (zamene) bočnog lanca (lanaca) aminokiseline; ili korišćenje neprirodnih aminokiselina sa sličnim karakteristikama u aminokiselinskoj sekvenci. Naročito modifikacija (modifikacije) mogu biti amidacije, kao što je amidacija C-terminusa.

[0038] Veštačka varijanta: Kada je ovde korišćen, termin "veštačka varijanta" označava polipeptid koji ima antimikrobno dejstvo proizveden od strane organizma koji eksprimira modifikovanu nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO:l. Modifikovana nukleotidna sekvenca dobijena je ljudskom intervencijom putem modifikacije nukleotidne sekvence date u SEQ ID NO:l.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Polipeptidi sa antimikrobnim dejstvom

[0039] U prvom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na izolovane polinukleotide sa aminokiselinskom sekvencom koja ima stepen identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQ ID N0:2 (tj., zrelim polipeptidom) od najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%), još poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, i najpoželjnije najmanje 97%, koji ima antimikrobno dejstvo (u daljem tekstu "homologi polipeptid"). U poželjnom aspektu, homologi polipeptidi imaju aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje u 10 aminokiselina, poželjno u 5 aminokiselina, poželjnije u 4 aminokiseline, još poželjnije u 3 aminokiseline, najpoželjnije u dve aminokiseline, i najpoželjnije u jednoj aminokiselini od aminokiselina 1 do 21 iz SEQ ID NO:2.

[0040]Polipeptid ovog pronalaska poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:2. U sledećem poželjnom aspektu, polipeptid sadrži aminokiseline 1 do 21 iz SEQ ID NO:2. U sledećem poželjnom aspektu, polipeptid se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO:2. U sledećem poželjnom aspektu, polipeptid se sastoji od aminokiselina 1 do 21 iz SEQ ID NO:2.

[0041]Poželjno, promene aminokiselina su minorne, odnosno konzervativne aminokiselinske supstitucije ili insercije koje ne utiču značajno na savijanje i/ili aktivnost proteina; male delecije, tipično od jedne do oko 10 aminokiselina; mala amino- ili karboksil-terminalna produženja, kao što su amino-terminalni metioninski ostatak; mali linker peptid od oko 20-25 ostataka; ili malo produženje koje olakšava prečišćavanje menjanjem naelektrisanja ili druge funkcije, kao što je poli-histidinski deo, antigenski epitopili vezujući domen.

[0042]Primeri konzervativnih supstitucija su unutar grupe baznih aminokiselina (arginin, lizin i histidin), kiselih aminokiselina (glutaminska i asparaginska kiselina), polarnih aminokiselina (glutamin i asparagin), hidrofobnih aminokiselina (leucin, izoleucin i valin), aromatičnih aminokiselina (fenilalanin, triptofan i tirozin) i malih aminokiselina (glicin, alanin, serin, treonin i metionin). Supstitucije aminokiselina koje ne menjaju specifičnu aktivnost poznate su u tehnici i opisane su, na primer, od strane H. Neurath i R.L. Hill, 1979, u The Proteins, Academic Press, New York. Najčešće zamene su Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/GIy, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu i Asp/Gly.

[0043]Kao dodatak za 20 standardnih aminokiselina, nestandardne aminokiseline (kao što su 4-hidroksiprolin, 6-N-metil lizin, 2-aminoizobuterna kiselina, izovalin, i alfa-metil serin) mogu supstituisati aminokiselinske ostatke polipeptida divljeg tipa. Ograničen broj nekonzervativnih aminokiselina, aminokiselina koje nisu kodirane genetskim kodom, i neprirodnih aminokiselina mogu supstituisati aminokiselinske ostatke. "Neprirodne aminokiseline" su modifikovane nakon sinteze proteina, i/ili imaju u bočnom lancu (lancima) hemijsku strukturu koja je različita od iste kod standardnih aminokiselina. Neprirodne aminokiseline mogu biti hemijski sintetisane, i poželjno, komercijalno su dostupne, i uključuju pipekolinsku kiselinu, tiazolidin karboksilnu kiselinu, dehidroprolin, 3- i 4-metilprolin i 3,3-dimetilprolin.

[0044]Alternativno, promene aminokiselina takve su prirode da su fizičko-hemijske osobine polipeptida izmenjene. Na primer, promene aminokiselina mogu poboljšati termičku stabilnost polipeptida, promeniti specifičnost za supstrat, promeniti pH optimum, i slično.

[0045]Esencijalne aminokiseline u ishodnom polipeptidu mogu biti identifikovane u skladu sa postupcima poznatim u tehnici, kao što su mutageneza usmerena na određeno mesto ili alanin-skenirajuća mutageneza (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). U poslednje pomenutoj tehnici, mutacije pojedinačnog alanina uvedene su na svaki ostatak u molekulu, i dobijeni mutantni molekuli su testirani u odnosu na biološku aktivnost (tj., antimikrobno dejstvo) da bi se identifikovali aminokiselinski ostaci koji su kritični za aktivnost molekula. Videti takođe, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Biološka interakcija takođe može biti određena fizičkom analizom strukture, kao što je određivanje takvim tehnikama kao što je nuklearna magnetna rezonanca, kristalografija, difrakcija elektrona, ili obeležavanje na osnovu fotoafiniteta, zajedno sa mutacijama pretpostavljenih aminokiselina kontaktnog mesta. Videti, na primer, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64. Identiteti esencijalnih aminokiselina takođe se mogu saznati preko analiza identiteta sa polipeptidima koji su srodni polipeptidu prema pronalasku.

[0046]Pojedinačne ili višestruke supstitucije aminokiselina mogu se načiniti i testirati korišćenjem poznatih metoda mutageneze, rekombinacije i/ili mešanja, praćenim relevantnim postupcima skrininga, kao što su oni dati od strane Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ili WO 95/22625. Druge metode koje se mogu koristiti uključuju PCR koji je sklon greškama, fagni displej (npr., Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; SAD Patent br. 5,223,409; WO 92/06204), i mutageneza usmerena na određeni region (Derbvshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al„ 1988, DNA 7:127).

[0047]Postupci mutageneze/mešanja mogu se kombinovati sa visoko produktivnim, automatizovanim skrining postupcima da bi se detektovala aktivnost kloniranih, mutagenih polipeptida eksprimiranih od strane ćelija domaćina. Mutageni DNK molekuli koji kodiraju aktivne polipeptide mogu se dobiti iz ćelija domaćina i brzo sekvencionirati korišćenjem standardnih postupaka u tehnici. Ovi postupci omogućuju brzo određivanje značajnosti individualnih aminokiselinskih ostataka u polipeptidu od interesa i mogu se primeniti na polipeptide nepoznate strukture.

[0048]Ukupan broj aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili insercija aminokiselina 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2 je 10, poželjno 9, poželjnije 8, poželjnije 7, poželjnije najviše 6, poželjnije najviše 5, još poželjnije 4, još poželjnije 3, još poželjnije 2, i najpoželjnije 1.

[0049]U jednoj varijanti, polipeptidi pronalaska uključuju najmanje 4 cisteinska ostatka, poželjno polipeptidi uključuju tačno 4 cisteinska ostatka. U drugoj varijanti, polipeptidi su ciklični polipeptidi.

N-Terminalna ckstenzija

[0050]N-terminalna ekstenzija polipeptida pronalaska može se pogodno sastojati od 1 do 50 aminokiselina, poželjno 2-20 aminokiselina, naročito 3-15 aminokiselina. U jednoj varijanti, N-terminalna ekstenzija peptida ne sadrži Arg (R). U sledećoj varijanti N-terminalna ekstenzija obuhvata kex2 ili kex2-slično restrikciono mesto kao što će biti definisano u daljem tekstu. U poželjnoj varijanti N-terminalna ekstenzija je peptid, koji sadrži najmanje 2 Glu (E) i/ili Asp (D) aminokiselinska ostatka, kao što je N-terminalna ekstenzija koja sadrži jednu od sledećih sekvenci: EAE, EE, DE i DD.

Kex2 mesta

[0051]Kex2 mesta (videti npr., Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") i kex2-slična mesta su dvobazna mesta prepoznavanja (tj., mesta isecanja) koja se nalaze između regiona koji kodira propeptid i zrelog regiona nekih proteina.

[0052]U nekim slučajevima pokazano je da insercija kex2 ili kex2-sličnog mesta poboljšava tačnost obrade od strane endopeptidaze na mestu isecanja kod propeptida, što rezultuje u povećanoj sekreciji proteina.

[0053]U kontekstu pronalaska insercija kex2 ili kex2-sličnog mesta omogućava isecanje na određenom mestu u N-terminalnoj ekstenziji čime se antimikrobni polipeptid produžava u poređenju sa zrelim polipeptidom prikazanom kao aminokiseline 1 do 21 iz SEQ ID NO:2.

Fuzionisani polipeptidi

[0054]Polipeptidi ovog pronalaska takođe uključuju fuzionisane polipeptide ili fuzionisane polipeptide koji se mogu isecati u kojima je drugi polipeptid fuzionisan na N-terminusu ili C-terminusu polipeptida pronalaska ili njegovog fragmenta. Fuzionisani polipeptid je proizveden fuzijom nukleotidne sekvence (ili njenog dela) koja kodira drugi polipeptid sa nukleotidnom sekvencom (ili njenim delom) ovog pronalaska. Tehnike za proizvodnju fuzionisanih polipeptida poznate su u tehnici i uključuju vezivanje kodirajućih sekvenci koji kodiraju polipeptide tako da su u okviru i da je ekspresija fuzionisanog polipeptida pod kontrolom istog promotora (ili više promotora) i terminatora.

Izvori polipeptida koji imaju antimikrobno dejstvo

[0055]Polipeptid ovog pronalaska može se dobiti iz mikroorganizama iz bilo kog roda. Za potrebe ovog pronalaska, termin "dobijen iz" kao što je ovde korišćen u vezi sa datim izvorom, značiće da je polipeptid kodiran nukleotidnom sekvencom proizveden od strane izvora ili soja u koji je nukleotidna sekvenca iz izvora ubačena. U poželjnom aspektu, polipeptid dobijen iz datog izvora izbacuje se izvan ćelije.

[0056]Polipeptid ovog pronalaska može biti bakterijski polipeptid. Na primer, polipeptid može biti gram pozitivni bakterijski polipeptid, kao što je polipeptid iz bakterija roda Bacillus-a, npr., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ili Bacillus thuringiensis polvpeptide; ili polipeptid iz bakterija roda Streptomyces, npr., polipeptid Streptomyces lividans ili Streptomyces murinus; ili gram negativni bakterijski polipeptid, npr., polipeptid E. coli, Pseudomonas sp.

[0057]Polipeptid ovog pronalaska može takođe biti polipeptid gljiva, poželjnije polipetid kvasaca, kao što je polipeptid Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ili Yarrowia polypeptide; ili još poželjnije filamentozni gljivični polipeptid kao što je polipeptid Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, ili Trichoderma.

[0058]U poželjnom aspektu, polipeptid je polipeptid sa antimikrobnim dejstvom iz Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomvces douglasii, Saccharomvces kluvveri, Saccharomyces norbensis, ili Saccharomyces oviformis.

[0059]U sledećem poželjnom aspektu, polipeptid je polipeptid iz Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foctidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Mvceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ili Trichoderma viride.

[0060]U sledećem poželjnom aspektu, polipeptid je polipeptid izArenicola marina,npr., polipeptid sa SEQ ID NO:2.

[0061]Podrazumeva se da za vrste navedene u prethodnom tekstu, pronalazak obuhvata i savršena i nesavršena stanja, i druge taksonomske ekvivalente, npr., anamorfe, nezavisno od imena vrsta po kojima su poznate. Stručnjaci će lako prepoznati identitet odgovarajućih ekvivalenata.

[0062]Sojevi ovih vrsta su lako dostupni javnosti u određenom broju kolekcija kultura, kao što su American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), i Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0063]Dodatno, takvi polipeptidi mogu biti identifikovani i dobijeni iz drugih izvora uključujući mikroorganizme izolovane iz prirode (npr., zemlje, đubriva, vode, itd.) korišćenjem napred navedenih proba. Tehnike za izolaciju mikroorganizama iz prirodnih staništa dobro su poznate u tehnici. Polinukleotid zatim može biti dobijen skriningom na osnovu sličnosti genomske ili cDNK biblioteke drugog mikroorganizma. Kada se putem probe (proba) detektuje polinukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid, polinukleotid se može izolovati ili klonirati korišćenjem tehnika koje su dobro poznate prosečnom stručnjaku (videti, npr., Sambrook et al., 1989, supra).

[0064]Polipeptidi ovog pronalaska takođe uključuju fuzionisane polipeptide ili fuzione polipeptide koji se mogu iseći u kojima je drugi polipeptid fuzionisan na N-terminusu ili na C-terminusu polipeptida ili njegovog fragmenta. Fuzioni polipeptid je proizveden putem fuzije nukleotidne sekvence (ili njenog dela) koja kodira drugi protein sa nukleotidnom sekvencom (ili njenim delom) ovog pronalaska. Tehnike za proizvodnju fuzionisanih polipeptida poznate su u tehnici, i uključuju vezivanje kodirajuće sekvence polipeptida tako da su u okviru i daje ekspresija fuzionisanog polipeptida pod kontrolom istog promotora (ili više promotora) i terminatora.

Polinukleotidi

[0065]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na izolovane polinukleotide koji imaju nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid ovog pronalaska. U poželjnom aspektu, nukleotidna sekvenca je izložena u SEQ ID NO:l. U sledećem poželjnom aspektu, nukleotidna sekvenca je kodirajući region zrelog polipeptida iz SEQ ID NO:l. Ovaj pronalazak takođe obuhvata nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptide koji imaju aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO:2 ili njihovog zrelog polipeptida, koji se iz SEQ ID NO:l razlikuju usled degeneracije genetičkog koda. Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na podsekvence SEQ ID NO:l koji kodiraju fragmente SEQ ID NO:2 koji imaju antimikrobno dejstvo.

[0066]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na mutantne polinukleotide koji obuhvataju najmanje jednu mutaciju u SEQ ID NO:l kodirajućoj sekvenci zrelog polipeptida, u kojoj mutantna nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji se sastoji od aminokiselina 1 do 21 iz

SEQ ID NO:2.

[0067]Tehnike korišćene za izolaciju ili kloniranje polinukleotida koji kodira polipeptid poznate su u tehnici i uključuju izolaciju iz genomske DNK, pripremu iz cDNK, ili njihovu kombinaciju. Kloniranje polinukleotida ovog pronalaska iz takve genomske DNK može se izvesti, npr., korišćenjem dobro poznate lančane reakcije polimeraze (PCR) ili skriningom ekspresionih biblioteka za antitela da bi se detektovali klonirani fragmenti DNK sa zajedničkim strukturnim osobinama. Videti npr., Innis et al, 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Mogu se koristiti i druge procedure za amplifikaciju nukleinskih kiselina kao što su lančana reakcija ligaze (LCR), transkripcija aktivirana ligacijom (LAT) i amplifikacija na osnovu nukleotidne sekvence (NASBA). Polinukleotidi se mogu klonirati iz sojaArenicola,ili drugog ili srodnog organizma i prema tome, na primer, može biti alelska varijanta ili varijanta vrste polipeptida koji kodira region nukleotidne sekvence.

[0068]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na polinukleotide sa nukleotidnom sekvencom koja ima stepen identičnosti sa kodirajućom sekvencom SEQ ID NO:l (tj., nukleotidi 496 do 558) zrelog polipeptida od najmanje 60%, poželjno najmanje 65%, poželjnije najmanje 70%, poželjnije najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, i najpoželjnije najmanje 97% identičnosti, koja kodira aktivni polipeptid.

[0069]Modifikacija nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid ovog pronalaska mode biti neophodna za sintezu polipeptida u značajnom stepenu sličnih polipeptidu. Termin "u značajnom stepenu sličan" polipeptidu odnosi se na oblike polipeptida koji se ne javljaju u prirodi. Ovi polipeptidi se mogu na neki način zbog inženjeringa razlikovati od polipeptida izolovanog iz prirodnog izvora, npr., veštačke varijante koje se razlikuju po specifičnoj aktivnosti, termostabilnosti, pH optimumu, ili sličnom. Varijanta sekvence može se konstruisati na osnovu nukleotidne sekvence predstavljene kao kodirajući region za polipeptid SEQ ID NO:l, ili njenog dela, npr., njena podsekvenca, i/ili uvođenjem nukleotidnih supstitucija koje ne dovode do druge aminokiselinske sekvence polipeptida kodiranog nukleotidnom sekvencom, ali koja odgovara korišćenju kodona od strane organizma domaćina koji je predviđen za proizvodnju enzima, ili uvođenjem nukleotidnih supstitucija koje mogu dati druge aminokiselinske sekvence. Za opšti opis nukleotidnih supstitucija videti, npr., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

[0070]Stručnjacima će biti jasno da se takva supstitucija može izvršiti izvan regiona koji su kritični za funkciju molekula, a da i dalje rezultira u aktivnom polipeptidu. Aminokiselinski ostaci esencijalni za aktivnost polipeptida kodiranog od strane izolovanog polipeptida pronalaska, i koji se poželjno stoga ne supstituišu, mogu biti identifikovani prema postupcima koji su poznati u tehnici, kao što je mutageneza usmerena na određeno mesto ili alanin-skenirajuća mutageneza (videti npr., Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). U prethodno pomenutoj tehnici, mutacije su uvedene u svaki pozitvno naelektrisani ostatak u molekulu, a rezultirajući mutantni molekuli su testirani u odnosu na antimikrobno dejstvo da bi se identifikovali aminokiselinski ostaci koji su kritični za aktivnost molekula. Mesta interakcije supstrata i enzima mogu se takođe odrediti analizom trodimenzionalne strukture kao što je određeno tehnikama kao što su analiza nuklearnom magnetnom rezonancom, kristalografija ili obeležavanje na osnovu fotoafmiteta (videti npr., de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al, 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

[0071]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na izolovane polinukleotide koji kodiraju polipeptid ovog pronalaska, koji hibridizuje pod manje rigoroznim uslovima, poželjno srednje rigoroznim uslovima, poželjnije srednje do visoko rigoroznim uslovima, još poželjnije visoko rigoroznim uslovima, i najpoželjnije veoma rigoroznim uslovima sa (i) nukleotidima 496 do 558 iz SEQ ID NO:l, (ii) cDNK sekvencom sadržanom u nukleotidima 1 do 558 iz SEQ ID NO:l, ili (iii) komplementarnim lancem (i) ili (ii); ili njihovim alelskim varijantama ili podsekvencama (Sambrook et al., 1989, supra), kao što je ovde definisano.

[0072]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na izolovane polinukleotide dobijene (a) hibridizacijom populacije DNK pod manje, srednje, srednje do visoko, visoko, ili veoma visoko rigoroznim uslovima sa (i) nukleotidima 496 do 558 iz SEQ ID NO: 1, (ii) cDNK sekvencom sadržanom u nukleotidima 1 do 558 iz SEQ ID NO:l, ili (iii) komplementarnim lancem (i) ili (ii); i (b) izolovanja hibridizovanog polinukleotida, koji kodira polipeptid koji ima antimikrobno dejstvo.

Konstrukti nukleinskih kiselina

[0073]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na konstrukte nukleinskih kiselina koji sadrže izolovani polinukleotid ovog pronalaska operativno vezan sa jednom ili više kontrolnih sekvenci koje upravljaju ekspresijom kodirajuće sekvence u pogodnoj ćeliji domaćinu pod uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnim sekvencama.

[0074]Izolovanim polinukleotidom koji kodira polipeptid ovog pronalaska može se manipulisati na različite načine da bi se obezbedila ekspresija polipeptida. Može biti poželjna ili neophodna manipulacija sekvence polinukleotida pre njenog ubacivanja u vektor u zavisnosti od ekspresionog vektora. Tehnike za modifikaciju polinukleotidne sekvence koje koriste postupke za rekombinantnu DNK dobro su poznati u tehnici.

[0075]Kontrolna sekvenca može biti odgovarajuća sekvenca promotora, nukleotidna sekvenca koju prepoznaje ćelija domaćin za ekspresiju polinukleotida koji kodira polipeptid ovog pronalaska. Sekvenca promotora sadrži transkripcione kontrolne sekvence koje posreduju u ekspresiji polipeptida. Promotor može biti bilo koja nukleotidna sekvenca koja pokazuje transkripcionu aktivnost u izabranoj ćeliji domaćinu uključujući mutantne, isečene i hibridne promotore, i može biti dobijena od gena koji kodiraju ekstracelularne ili intracelularne polipeptide bilo homologe ili hetrologne ćeliji domaćinu.

[0076]Primeri pogodnih promotora za upravljanje transkripcijom konstrukata nukleinskih kiselina ovog pronalaska, naročito u bakterijskoj ćeliji domaćinu, predstavljaju promotore dobijene iz E. coli lac operona, Streptomvces coelicolor gena za agarazu (dagA), Bacillus subtilis gena za levansusaharazu (sacB), Bacillus licheniformis alfagena za alfa-amilazu (amyL), Bacillus stearothermophilus gena za maltogenu amilazu (amyM), Bacillus amyloliquefaciens gena za alfa-amilazu (amyQ), Bacillus licheniformis gena za penicilinazu (penP), Bacillus subtilis xylA i xylB gena, i prokariotskog gena za betalaktamazu (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), kao i tac promotor (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Dodatni promotori opisani su u "Useful proteins from recombinant bacteria" u Scientific American, 1980, 242: 74-94; i u Sambrook et al., 1989, supra.

[0077]Primeri pogodnih promotora za upravljanje transkripcijom konstrukata nukleinskih kiselina ovog pronalaska u filamentoznoj ćeliji gljive domaćina su promotori dobijeni od gena za TAKA amilazu Aspergillus oryzae, asparaginsku proteinazu Rhizomucor miehei, neutralnu alfa-amilazu Aspergillus niger, acidostabilnu amilazu Aspergillus niger, glukoamilazu Aspergillus niger ili Aspergillus awamori (glaA), lipaze Rhizomucor miehei, alkalne proteaze Aspergillus oryzae, triozofosfat izomeraze Aspergillus oryzae, acetamidaze Aspergillus nidulans, amiloglukozidaze Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Ouinn (WO 00/56900), proteaze slične tripsinu Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glukozidaze Trichoderma reesei, celobiohidrolaze I Trichoderma reesei, endoglukanaze I Trichoderma reesei, endoglukanaze II Trichoderma reesei, endoglukanaze III Trichoderma reesei, endoglukanaze IV Trichoderma reesei, endoglukanaze V Trichoderma reesei, ksilanaze I Trichoderma reesei, ksilanaze II Trichoderma reesei, beta-ksilozidaze Trichoderma reesei, kao i NA2-tpi promotor (hibrid promotora od gena za neutralnu alfa-amilazu Aspergillus niger i trioza fosfat izomeraze Aspergillus oryzae); i njihovi mutantni, isečeni i hibridni promotori.

[0078]U kvascu kao domaćinu, korisni promotori dobijeni su iz gena za enolazu (ENO-1) iz Saccharomyces cerevisiae, galaktokinazu (GALI) iz Saccharomyces cerevisiae, alkohol dehidrogenazu/gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (ADH1,ADH2/GAP) iz Saccharomyces cerevisiae, triozafosfat izomerazu (TPI) iz Saccharomyces cerevisiae, metalotionin (CUP1) iz Saccharomyces cerevisiae, i 3-fosfoglicerat kinazu iz Saccharomyces cerevisiae. Drugi korisni promotori za ćeliju domaćina kvasca opisani su od strane Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0079]Kontrolna sekvenca može biti takođe pogodna terminator sekvenca transkripcije, sekvenca koju prepoznaje ćelija domaćin za prekid transkripcije. Terminator sekvenca je operativno povezana sa 3' terminusom nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid. Bilo koja terminator sekvenca koja je funkcionalna u ćeliji domaćinu može se koristiti u ovom pronalasku.

[0080]Poželjni terminatori za filamentozne gljivične ćelije domaćine dobijene su iz gena za TAKA amilazu iz Aspergillus orvzae, glukoamilazu iz Aspergillus niger, antranilat sintazu iz Aspergillus nidulans, alfa-glukozidazu iz Aspergillus niger, i proteazu sličnu tripsinu iz Fusarium oxysporum.

[0081]Poželjni terminatori za ćeliju domaćina kvasca dobijeni su iz gena za enolazu iz Saccharomvces cerevisiae, citohrome C (CYC1) iz Saccharomyces cerevisiae, i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze iz Saccharomyces cerevisiae. Drugi korisni terminatori za ćeliju domaćina kvasca opisani su od strane Romanos et al., 1992, supra.

[0082]Kontrolna sekvenca može takođe biti pogodna lider sekvenca, region iRNK koji ne podleže translaciji, a koji je važan za translaciju u ćeliji domaćinu. Lider sekvenca je operativno vezana za 5' terminus nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid. Bilo koja lider sekvenca koja je funkcionalna u izabranoj ćeliji domaćinu može se koristiti u ovom pronalasku.

[0083]Poželjni lideri za filamentoznu gljivičnu ćeliju domaćina dobijeni su iz gena za TAKA amilazu iz Aspergillus oryzae i triozafosfat izomerazu iz Aspergillus nidulans.

[0084]Pogodni lideri za ćeliju domaćina kvasca dobijeni su iz gena za enolazu (ENO-1) iz Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerat kinazu iz Saccharomyces cerevisiae, alfa faktor iz Saccharomyces cerevisiae, i alkohol dehidrogenazu/gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (ADH2/GAP) iz Saccharomyces cerevisiae.

[0085]Kontrolna sekvenca takođe može biti poliadenilaciona sekvenca, sekvenca operativno vezana za 3' terminus nukleotidne sekvence i koja je, kada uđe u transkripciju, prepoznata od strane ćelije domaćina kao signal za dodavanje poliadenozinskih ostataka transkribovanoj iRNK. Bilo koja poliadenilaciona sekvenca koja je funkcionalna u izabranoj ćeliji domaćinu može se koristiti u ovom pronalasku

[0086]Poželjne poliadenilacione sekvence za filamentozne gljivične ćelije domaćine dobijene su iz gena za TAKA amilazu iz Aspergillus oryzae, glukoamilaze iz Aspergillus niger, antranilat sintaze iz Aspergillus nidulans, proteaze slične tripsinu iz Fusarium oxysporum, i alfa-glukozidaze iz Aspergillus niger.

[0087]Korisne poliadenilacione sekvence za ćeliju domaćina kvasca opisane su od strane Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

[0088]Kontrolna sekvenca može takođe biti kodirajući region za signalni peptid koji kodira aminokiselinsku sekvencu povezanu za amino terminus polipeptida koja usmerava kodirani polipeptid unutar ćelijskog sekretornog puta. 5' kraj kodirajuće sekvence nukleotidne sekvence može suštinski sadržati kodirajući region za signalni peptid prirodno vezan u translacioni okvir čitanja sa segmentom kodirajućeg regiona koji kodira sekretovani polipeptid. Alternativno, 5' kraj kodirajuće sekvence može sadržati kodirajući region za signalni peptid koji je stran kodirajućoj sekvenci. Strani kodirajući region za signalni peptid može biti neophodan tamo gde kodirajuća sekvenca prirodno ne sadrži kodirajući region za signalni peptid. Alternativno, strani kodirajući region za signalni peptid može jednostavno zameniti prirodni kodirajući region za signalni peptid da bi poboljšao sekreciju polipeptida. Međutim, bilo koji kodirajući region za signalni peptid koji usmerava eksprimirani polipeptid u sekretorni put izabrane ćelije domaćina može se koristiti u ovom pronalasku.

[0089]Efektivni kodirajući regioni za signalni peptid za bakterijske ćelije domaćine su kodirajući regioni za signalni peptid dobijeni iz gena za NCIB 11837 maltogenu amilazu iz Bacillus, alfa-amilazu iz Bacillus stearothermophilus, subtilizin iz Bacillus licheniformis, beta-laktamazu iz Bacillus licheniformis, neutralne proteaze (nprT, nprS, nprM) iz Bacillus stearothermophilus, i prsA iz Bacillus subtilis. Dodatni signalni peptidi opisani su od strane Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137. [0090|Efektivni kodirajući regioni za signalni peptid za filamentozne gljivične ćelije domaćine su kodirajući regioni za signalni peptid dobijeni iz gena za TAKA amilazu iz Aspergillus orvzae, neutralnu amilazu iz Aspergillus niger, glukoamilazu iz Aspergillus niger, asparaginsku proteinazu iz Rhizomucor miehei, celulazu iz Humicola insolens, i lipazu iz Humicola lanuginosa.

[0091]U poželjnom aspektu, kodirajući region za signalni peptid su nukleotidi 1 do 72 iz SEQ ID NO:l koji kodiraju aminokiseline -165 do -142 iz SEQ ID NO:2.

[0092]Korisni signalni peptidi za ćeliju domaćina kvasca dobijeni su iz gena za alfa-faktor iz Saccharomvces cerevisiae i invertazu iz Saccharomvces cerevisiae invertase. Drugi korisni kodirajući regioni za signalni peptid opisani su od strane Romanos et al., 1992, supra.

[0093]Kontrolna sekvenca takođe može biti kodirajući region za propetpid koji kodira aminokiselinsku sekvencu postavljenu na amino terminusu polipeptida. Rezultujući polipeptid je poznat kao proenzim ili propolipeptid (ili u nekim slučajevima zimogen). Propolipeptid je u opštem slučaju neaktivan i može se prevesti u zreli aktivni polipeptid katalitičkim ili autokatalitičkim cepanjem propeptida iz polipeptida. Kodirajući region za propeptid može se dobiti iz gena za alkalnu fosfatazu (aprE) iz Bacillus subtilis, neutralnu proteazu (nprT) iz Bacillus subtilis, alfa-faktor iz Saccharomvces cerevisiae, asparaginsku proteinazu iz Rhizomucor miehei, i laktazu iz Mvceliophthora thermophila (W095/33836).

[0094]U poželjnom aspektu, kodirajući region za propeptid su nukleotidi 73 do 495 iz SEQ ID NO: 1 koji kodiraju aminokiseline -141 do -1 of SEQ ID NO:2.

[0095]U slučajevima kada su i regioni signalnog peptida i prpeptida prisutni na amino terminusu polipeptida, region propeptida je postavljen do amino terminusa polipeptida, a region signalnog peptida je postavljen do amino terminusa regiona propeptida.

[0096]Takođe može biti poželjno da se dodaju regulatorne sekvence koje omogućuju regulaciju ekspresije polipeptida u odnosu na rast ćelije domaćina. Primeri regulatornih sistema su oni koji dovode do toga da se ekspresija gena uključi ili isključi kao odgovor na hemijski ili fizički stimulus, uključujući prisustvo regulatornog jedinjenja. Regulatorni sistemi u prokariotskim sistemima uključuju lac, tac, i trp operator sisteme. Kod kvasaca, može se koristiti ADH2 sistem ili GALI sistem. Kod filamentoznih gljiva kao regulatorne sekvence mogu se koristiti promoter TAKA alfa-amilaze, promotor glukoamilaze iz Aspergillus niger, i promotor glukoamilaze iz Aspergillus orvzae. Drugi primeri regulatornih sekvenci su one koje dozvoljavaju amplifikaciju gena. U eukariotskim sistemima oni uključuju gen za dihidrofolat reduktazu koji se amplifikuje u prisustvu metotreksata i gene za metalotionein koji se amplifikuju sa teškim metalima. U ovim slučajevima, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid bila bi operativno vezana sa regulatornom sekvencom.

Ekspresioni vektori

[0097]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na rekombinantne ekspresione vektore koji sadrže polinukleotid ovog ponalaska, promotor i transkripcione i translacione stop signale. Različite nukleinsko kiselinske i kontrolne sekvence opisane u prethodnom tekstu mogu se spojiti zajedno da bi se proizveo rekombinantni ekspresioni vektor koji može uključiti jedan ili više pogodnih restrikcionih mesta da bi se omogućila insercija ili supstitucija nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid na takvim mestima. Alternativno, nukleotidna sekvenca ovog pronalaska može biti eksprimirana preko insercije nukleotidne sekvence ili konstrukta nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu u odgovarajući ekspresioni vektor. Prilikom stvaranja ekspresionog vektora, kodirajuća sekvenca je smeštena u vektoru tako da je kodirajuća sekvenca operativno vezana odgovarajućum kontrolnom sekvencom za ekspresiju.

[0098]Rekombinantni ekspresioni vektor može biti bilo koji vektor (npr., plazmid ili virus) koji se može pogodno podvrgnuti procedurama rekombinantne DNK i može omogućiti ekspresiju nukleotidne sekvence. Izbor vektora će u tipičnom slučaju zavisiti od kompatibilnosti vektora sa ćelijom domaćinom u koju je vektor ubačen. Vektori mogu biti linearni ili cirkularni plazmidi.

[0099]Vektor može biti vektor koji se autonomno replicira, tj., vektor koji postoji kao ekstrahromozomski entitet, čija je replikacija nezavisna od hromozomske replikacije, npr., plazmid, ekstrahromozomski element, minihromozom, ili veštački hromozom. Vektor može posedovati bilo koje sredstvo za osiguravanje samoreplikacije. Alternativno, može biti takav da se, kada je ubačen u ćeliju domaćina, integriše u genom i replicira zajedno sa hromozomom (hromozomima) u koji je integrisan. Dodatno, mogu se koristiti pojedinačni vektor ili plazmid, ili dva ili više vektora ili plazmida koji zajedno sadrže ukupnu DNK koja se introdukuje u genom ćelije domaćina, ili transpozon.

[0100]Vektori ovog pronalaska poželjno sadrže jedan ili više selektabilnih markera koji omogućavaju laku selekciju transformisanih ćelija. Selektabilni marker je gen čiji proizvod obezbeđuje otpornost na biocide ili viruse, otpornost na teške metale, prototrofiju auksotrofima, i slično.

[0101]Primeri bakterijskih selektabilnih markera su dal geni iz Bacillus subtilis ili Bacillus licheniformis, ili markeri koji daju otpornost na antibiotike kao što je otpornost na ampicilin, kanamicin, hloramfenikol, ili tetraciklin. Pogodni markeri za ćelije kvasca su ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRPI i URA3. Selektabilni markeri za korišćenje u filamentoznim gljivičnim ćelijama domaćinima uključuju, ali nisu ograničeni na, amdS (acetamidaza), argB (ornitin karbamoiltransferaza), bar (fosfinotricin acetiltransferaza), hph (higromicin fosfotransferaza), niaD (nitrat reduktaza), pyrG (orotidin-5'-fosfat dekarboksilaza), sC (sulfat adeniltransferaza), i trpC (antranilat sintaza), kao i njihovi ekvivalenti. Poželjni za korišćenje u ćeliji Aspergillus su amdS i pyrG geni iz Aspergillus nidulans ili Aspergillus oryzae i bar gena iz Streptomyces hygroscopicus.

[0102]Vektor ovog pronalaska poželjno sadrži element (elemente) koji omogućavaju integraciju vektora u genom ćelije domaćina ili autonomnu replikaciju vektora u ćeliji nezavisno od genoma.

[0103]Za integraciju u genom ćelije domaćina, vektor se može oslanjati na polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid ili bilo koji drugi element vektora za integraciju u genom homologom ili nehomologom rekombinacijom. Alternativno, vektor može sadržati dodatne nukleotidne sekvence za upravljanje integracijom putem homologe rckombinacije u genom ćelije domaćina na tačno određenom mestu (mestima) u hromozomu (hromozomima). Da bi se povećala verovatnoća integracije na tačno određenom mestu, integrativni elementi treba poželjno da sadrže dovoljan broj baznih parova nukleinskih kiselina, kao što je 100 do 10,000 baznih parova, poželjno 400 do 10,000 baznih parova, i najpoželjnije 800 do 10,000 baznih parova, koji imaju visok stepen identičnosti sa odgovarajućom ciljnom sekvencom da bi se povećala verovatnoća homologe rekombinacije. Integrativni elementi mogu biti bilo koja sekvenca koja je homologa sa ciljnom sekvencom u genomu ćelije domaćina. Dodatno, integrativni elementi mogu biti nekodirajuće ili kodirajuće nukleotidne sekvence. Sa druge strane, vektor može biti integrisan u genom ćelije domaćina putem nehomologe rekombinacije.

[0104]Za autonomnu replikaciju, vektor može dalje sadržati oridžin replikacije koji omogućava autonomnu replikaciju vektora u dat oj ćeliji domaćinu. Oridžin replikacije može biti bilo koji plazmid replikator koji posreduje u autonomnoj replikaciji koja funkcioniše u ćeliji. Termin "oridžin replikacije" ili "plazmid replikator" ovde je definisan kao nukleotidna sekvenca koja omogućava plazmidu ili vektoru da se replicira\ n vivo.

[0105]Primeri bakterijskih oridžina replikacije su oridžini replikacije plazmida pBR322, pUC19, pACYC177, i pACYC184 koji dozvoljavaju replikaciju u E. coli, i pUBUO, pE194, pTA1060, i pAMbl koji dozvoljavaju replikaciju u Bacillus.

[0106]Primeri oridžina replikacije za korišćenjeu ćelijama domaćinima kvasca su oridžini replikacije od 2 mikrona replikacije, ARS1, ARS4, kombinacija ARS1 i CEN3, i kombinacija ARS4 i CEN6.

[0107]Primeri oridžina replikacije korisni u filamentoznim gljivičnim ćelijama domaćinima su AMA1 i ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). Izolacija AMA1 gena i konstruisanje plazmida ili vektora koji sadrže gen može se postići prema postupcima datim u WO 00/24883.

[0108]U ćeliju domaćina može se ubaciti više od jedne kopije polinukleotida da bi se povećala proizvodnja genskog produkta. Povećanje broja kopija polinukleotida može se dobiti putem integracije najmanje jedne dodatne kopije sekvence u genom ćelije domaćina ili putem uključivanja selektabilnog marker gena sa polinukleotidom koji se može amplifikovati, gde se ćelije koje poseduju amplifikovane kopije selektabilnog marker gena, i time dodatne kopije polinukleotida, mogu selektovati putem kultivisanja ćelija u prisustvu odgovarajućeg selektabilnog agensa.

[0109]Postupci koji se koriste za vezivanje elemenata opisanih u prethodnom tekstu da bi se konstruisali rekombinantni ekspresioni vektori ovog pronalaska dobro su poznati stručnjacima (videti npr., Sambrook et al., 1989, supra).

Ćelije domaćini

[0110]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na rekombinantne ćelije domaćine, koje sadrže polinukleotid ovog pronalaska, koje se pogodno koriste za rekombinantnu proizvodnju polipeptida. Vektor koji sadrži polinukleotid ovog pronalaska ubačen je u ćeliju domaćina tako da se vektor zadržava kao integralni deo hormozoma ili samoreplicirajući ekstrahromozomski vektor kao što je opisano ranije. Termin "ćelija domaćin" obuhvata bilo koje potomke roditeljske ćelije koji nisu identični roditeljskoj ćeliji usled mutacija koje se dešavaju tokom replikacije. Izbor ćelije domaćina će u velikom stepenu zavisiti od gena koji kodira polipeptid i njegovog izvora.

[0111]Ćelija domaćin može biti jednoćelijski organizam, npr., prokariot, ili višećelijski organizam, npr., eukariot.

[0112]Korisni jednoćelijski mikroorganizmi su bakterijske ćelije kao što su gram pozitivne bakterije uključujući, ali ne ograničavajući se na, ćelije Bacillus, npr., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, i Bacillus thuringiensis; ili ćelija Streptomyces, npr., Streptomyces lividans i Streptomyces murinus, ili gram negativne bakterije kao što su E. coli i Pseudomonas sp. U poželjnom aspektu, bakterijska ćelija domaćin je ćelija Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, ili Bacillus subtilis. U sledećem poželjnom aspektu, ćelija Bacillus je alkalofilni Bacillus.

[0113] Uvođenje vektora u bakterijsku ćeliju može biti izvedeno, na primer, transformacijom protoplasta (videti npr., Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), korišćenjem kompetentnih ćelija (videti npr, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ili Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), elektroporacijom (videti npr., Shigekavva and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ili konjugacijom (videti npr., Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

[0114]Ćelija domaćin može takođe biti eukariotska, kao što je ćelija sisara, insekta, biljke ili gljive.

]0115]U poželjnom aspektu, ćelija domaćin je ćelija gljive. "Gljive" kao što su ovde korišćene uključuju filum Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, i Zygomycota (kao što je defmisano od strane Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) kao i

Oomvcota (kao što je navedeno u Hawksworth et al., 1995, supra, strana 171) i sve mitosporne gljive (Hawksworth et al, 1995, supra).

[0116]U poželjnijem aspektu, gljivična ćelija domaćin je ćelija kvasca. "Kvasac" kao što je ovde korišćen uključuje asporogeni kvasac (Endomvcetales), bazidiosporogeni kvasac, i kvasac koji pripada Fungi Imperfecti (Blastomvcetes). Kako se klasifikacija kvasaca može u budućnosti promeniti, za potrebe ovog pronalaska, kvasac će biti definisan kao što je opisan u Biologv and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Svmposium SeriesNo. 9, 1980).

[0117]U još poželjnijem aspektu, ćelija domaćina kvasca je ćelija Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomvces, Schizosaccharomyces, ili Yarrowia.

[0118]U najpoželjnijem aspektu, ćelija domaćina kvasca je ćelija Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluvveri, Saccharomvces norbensis ili Saccharomyces oviformis. U sledećem najpoželjnijem aspektu, ćelija domaćina kvasca je ćelija Kluyveromyces lactis. U sledećem najpoželjnijem aspektu, ćelija domaćina kvasca je ćelija Yarrowia lipolvtica.

[0119]U sledećem još poželjnijem aspektu, ćelija domaćina gljive je čelija filamentozne gljive. "Filamentozne gljive" uključuju sve filamentozne oblike potklase Eumycota i Oomycota (kao što je definisano od strane Hawksworth et al., 1995, supra). Filamentozne gljive se u opštem slučaju karakterišu micelijalnim zidom od hitina, celuloze, glukana, hitozana, manana, i drugih kompleksnih polisaharida. Vegetativni rast postiže se elongacijom hifa, katabolizam ugljenika je obligatno aeroban. Za razliku od ovoga, vegetativni rast kod kvasca kao što je Saccharomyces cerevisiae postiže se pupljenjem jednoćelijskog talusa, a katabolizam ugljenika može biti fermentacijom.

[0120]U još poželjnijem aspektu, filamentozna gljivična ćelija domaćin je ćelija Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bierkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromvces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ili Trichoderma.

[0121]U najpoželjijem aspektu, filamentozna gljivična ćelija domaćin je ćelija soja Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ili Aspergillus oryzae. U sledećem najpoželjnijem aspektu, filamentozna gljivična ćelija je ćelija Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookvvellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ili Fusarium venatum. U sledećem najpoželjnijem aspektu, filamentozna gljivična ćelija je ćelija Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneiria, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, ili Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Mvceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ili Trichoderma viride.

[0122]Ćelije gljiva mogu biti transformisane procesom koji obuhvata formiranje protoplasta, transformaciju protoplasta i regeneraciju ćelijskog zida na način koji je sam po sebi poznat. Pogodni postupci za transformaciju ćelija domaćina Aspergillus i Trichoderma opisane su u EP 238 023 i Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Pogodni postupci za transformaciju vrsta Fusarium opisane su od strane Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, i u WO 96/00787. Kvasac može biti transformisan korišćenjem postupaka opisanih od strane Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; i Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Postupci proizvodnje

[0123]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na postupke za proizvodnju polipeptida ovog pronalaska, koji obuhvata

(a) kultivisanje ćelije, koja je u obliku divljeg tipa sposobna da proizvodi polipeptid, pod uslovima pogodnim za proizvodnju polipeptida; i (b) rekuperovanje polipeptida. Poželjno, ćelija pripadarodu Arenicola,ipoželjnije Arenicola marina.[0124]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na postupke za proizvodnju polipeptida ovog pronalaska, koji obuhvata (a) kultivisanje ćelije pod uslovima pogodnim za proizvodnju polipeptida; i (b) rekuperovanje polipeptida.[0125]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na postupke za proizvodnju polipeptida ovog pronalaska, koji obuhvata (a) kultivisanje ćelije pod uslovima pogodnim za proizvodnju polipeptida, gde ćelija domaćin sadrži mutantnu nukleotidnu sekvencu sa najmanje jednom mutacijom u kodirajućem regionu zrelog polipeptida iz SEQ ID NO:l, gde mutantna nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji se sastoji od aminokiselina 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2, i (b) rekuperovanja polipeptida.

[0126]U proizvodnim postupcima ovog pronalaska, ćelije su kultivisane u hranljivom medijumu pogodnom za proizvodnju polipeptida korišćenjem metoda dobro poznatih u tehnici. Na primer, ćelije mogu biti kultivisane kultivisanjem u šejker boci, i fermentacijom malog i velikog obima (uključujući kontinualnu, u seriji, u seriji uz limitiranje supstrata , ili fermentaciju u čvrstom stanju) u laboratorijskim ili industrijskim fermentorima izvedene u pogodnom medijumu i pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju i izolovanje polipeptida. Kultivacija se odigrava u pogodnom hranljivom medijumu koji sadrži izvore ugljenika i azota i neorganske soli, korišćenjem postupaka koji su poznati u tehnici. Pogodni medijumi su raspoloživi od komercijalnih dobavaljača ili se mogu pripremiti prema objavljenim kompozicijama (npr., u katalozima American Type Culture Collection). Ukoliko je polipeptid izlučen u hranljivi medij um, polipeptid se može rekuperovati direktno iz medij uma. Ukoliko se polipeptid ne luči, može se rekuperovati iz ćelijskog lizata.

[0127]Polipeptidi se mogu detektovati korišćenjem postupaka poznatih u tehnici koji su specifični za polipeptide. Ovi postupci za detekciju mogu uključivati korišćenje specifičnih antitela. Na primer, test antimikrobnog dejstva može se koristiti da se odredi aktivnost polipeptida kao što je ovde opisan.

[0128]Rezultujući polipeptid može se rekuperovati postupcima koji su poznati u tehnici. Na primer, polipeptid se može rekuperovati iz hranljivog medij uma konvencionalnim procedurama uključujući, ali se ne ograničavajući na, centrifugiranje, filtraciju, ekstrakciju, sušenje raspršivanjem, isparavanje ili taloženje.

[0129]Polipeptid ovog pronalaska može se prečistiti različitim postupcima poznatim u tehnici uključujući, ali se ne ograničavajući na, hromatografiju (npr., jonoizmenjivačka, afinitetna, hidrofobna, hromatografija izoelektričnim fokusiranjem i razdvajanje na osnovu veličine čestica), procedure elektroforeze (npr., preparativno izoelektrično fokusiranje), diferencijalnu rastvorljivost (npr., taloženje amonijum sulfatom), SDS-PAGE, ili ekstrakciju (videti npr., Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

Kompozicije

[0130]Predstavljeni pronalazak se takođe odnosi na kompozicije, kao što su farmaceutske kompozicije, koje sadrže polipeptid pronalaska. Poželjno, kompozicije su obogaćene takvim polipeptidom. Termin "obogaćen" označava da je antimikrobno dejstvo kompozicije povećano, npr., sa faktorom obogaćenja od 1.1.

[0131]Kompozicije mogu dalje sadržati drugi farmaceutski aktivni agens, kao što je dodatni biocidni ili biostatički agens, kao što je drugi antimikrobni polipeptid koji pokazuje antimikrobno dejstvo kao što je defmisano u prethodnom tekstu. Biocidni agens može biti antibiotik, kao što je poznato u tehnici. Klase antibiotika uključuju peniciline, npr. penicilin G, penicilin V, meticilin, oksacilin, karbenicilin, nafcilin, ampicilin, itd.; penicilini u kombinaciji sa inhibitorima beta-laktamaze, cefalosporini, npr., cefaklor, cefazolin, cefuroksim, moksalaktam, itd.; karbapenemi; monobaktami; aminoglikozidi; tetraciklini; makrolidi; linkomicini; polimiksini; sulfonamidi; hinoloni; hloramfenikol; metronidazol; spektinomicin; trimetoprim; vankomicin; itd. Biocidni agens takođe može biti antimikotički agens, uključujući poliene, npr., amfotericin B, nistatin; 5-flukosin; i azoli, npr., mikonazol, ketokonazol, itrakonazol i flukonazol.

[0132]U jednoj varijanti biocidni agens je ne-enzimski hemijski agens. U sledećoj varijanti agens je ne-polipeptidni hemijski agens.

[0133]Kompozicija može sadržati pogodan nosač. Kompozicija takođe može sadržati pogodan razblaživač koji je sposoban da dopremi antimikrobne polipeptide pronalaska na željeno mesto kada se kompozicije koriste kao lek.

[0134]Polipeptidne kompozicije mogu se pripremiti u skladu sa postupcima poznatim u tehnici i mogu biti u tečnom ili suvom obliku. Na primer, polipeptidna kompozicija može biti u obliku granulata ili mikrogranulata. Polipeptid koji treba uključiti u kompoziciju može se stabilizovati u skladu sa postupcima poznatim u tehnici.

[0135]Primeri poželjnih upotreba polipeptidnih kompozicija pronalaska dati su u daljem tekstu. Doza polipeptidne kompozicije pronalaska i drugi uslovi pod kojim se kompozicija koristi mogu biti određeni na osnovu postupaka poznatih u tehnici.

Postupci i upotreba

[0136]Ovaj pronalazak je takođe usmeren na postupke za korišćenje polipeptida koji imaju antimikrobno dejstvo. Antimikrobni polipeptidi su u tipičnom slučaju korisni na bilo kom mestu koje je podložno kontaminaciji bakterijama, gljivama ili algama. U tipičnom slučaju, takva mesta nalaze se u vodenim sistemima, kao što su vodeni sistemi za hlađenje, voda za ispiranje rublja, uljani sistemi kao što ulja za sečenje, lubrikanti, uljana polja i slično, gde treba uništiti mikroorganizme ili kontrolisati njihov rast. Međutim, ovaj pronalazak se takođe može koristiti za sve primene gde su korisne antimikrobne kompozicije, kao što su zaštita drveta, lateks, lepak, papir, karton, tekstil, koža, plastika, različitih spojeva i stočna hrana.

[0137] Druge upotrebe obuhvataju konzerviranje hrane, pića, kozmetike kao što su losioni, kreme, gelovi, pomade, sapuni, šamponi, balzami, antiperspiranti, dezodoransi, vodica za usta, proizvodi za kontaktna sočiva, enzimske formulacije, ili sastojci hrane.

[0138] Stoga, antimikrobni polipeptidi pronalaska mogu biti korisni kao dezinfekciona sredstva, npr., za lečenje infekcija oka ili usta, kožne infekcije; u antiperspirantima ili dezodoransima; za čišćenje ili dezinfekciju kontaktnih sočiva i zuba (oralna higijena).

[0139] U opštem slučaju predviđeno je da su antimikrobni polipeptidi ovog pronalaska korisni za čišćenje, dezinfekciju ili inhibiciju rasta mikroorganizama na bilo kojoj površini. Primeri površina, koje pogodno mogu stupiti u kontakt sa antimikrobnim polipeptidom pronalaska su površine procesne opreme korišćene npr., u mlekarama, hemijskim ili farmaceutskim postrojenjima fabrika, sistemima za prečićavanja vode, fabrikama za preradu ulja, fabrikama papira, fabrikama za preradu vode, tornjevima za hlađenje. Antimikrobne polipeptide pronalaska treba koristiti u količini koja je efikasna za čišćenje, dezinfekciju ili inhibiciju rasta mikroorganizama na datoj površini.

[0140] Antimikrobni polipeptidi pronalaska mogu se dodatno koristiti za čišćenje površina i posuđa za kuvanje u fabrikama za preradu hrane i na bilo kojoj površini na kojoj se hrana priprem ili servira kao što su bolnice, strački domovi i restorani.

[0141] Takođe se može koristiti kao konzervans ili dezinfekciono sredstvo u vodenim bojama.

[0142] Pronalazak se takođe odnosi na korišćenje antimikrobnog polipeptida ili kompozicije pronalaska kao leka. Dodatno, antimikrobni polipeptid ili kompozicija pronalaska može se takođe koristiti za proizvodnju leka za kontrolisanje ili suzbijanje mikroorganizama, kao što su gljive ili bakterije, poželjno gram pozitivne bakterije.

[0143] Kompozicija i antimikrobni polipeptid pronalaska može se koristiti kao antimikrobni veterinarski ili humani lek ili profilaktički agens. Stoga, kompozicija i antimikrobni polipeptid pronalaska može se koristiti u pripremi veterinarskih ili humanih terapeutskih agenasa ili profilaktičkih agenasa za lečenje mikrobnih infekcija, kao što su bakterijske ili gljivične infekcije, poželjno infekcije gram pozitivnim bakterijama. Naročito mikrobne infekcije mogu biti udružene sa bolestima pluća uključujući, ali ne ograničavajući se na, tuberkulozu, upalu pluća i cističnu fibrozu i seksualno prenosive bolesti, uključujući, ali se ne ograničavajući se na gonoreju i hlamidiju.

[0144] Kompozicija pronalaska sadrži efikasnu količinu antimikrobnog polipeptida pronalaska.

[0145] Termin "efikasna količina" kada se ovde koristi označava količinu antimikrobnih polipeptida pronalaska, koja je dovoljna da inhibira rast datog mikroorganizma.

[0146] Pronalazak se takođe odnosi na kompozicije za zarastanje rana ili proizvode kao što su zavoji, medicinski uređaji kao što su npr., kateteri pa do proizvoda protiv peruti, kao što su šamponi.

[0147] Formulacije antimikrobnih polipeptida pronalaska primenjuju se na domaćina koji pati ili ima predispoziciju za mikrobnu infekciju. Primena može biti topikalna, lokalna ili sistemska, u zavisnosti od specifičnog mikroorganizma, poželjno biće lokalizovana. U opštem slučaju doza antimikrobnih polipeptida pronalaska biće dovoljna da smanji populaciju mikroba za najmanje oko 50%, obično za najmanje 1 log, i može biti za 2 ili više log ubijenih mikroba. Jedinjenja ovog pronalaska primenjeni su u dozi koja smanjuje populaciju mikroba uz istovremeno minimizovanje bilo kakvih neželjenih dejstava. Predviđeno je da se kompozicija dobij a i koristi pod nadzorom lekara zain vivoupotrebu. Antimikrobni polipeptidi pronalaska naročito su korisni za uništavanje gram negativnih bakterija, uključujući Pseudomonas aeruginosa, i Chlamvdia trachomatis; i gram-pozitivne bakterije, uključujući streptokoke kao što su Streptococcus pneumonia, S. uberis, S. hvointestinalis, S. pvogenes i S. agalactiae; i stafilokoke kao što su Staphvlococcus aureus, S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus i S. camosus.

[0148] Formulacije antimikrobnih polipeptida pronalaska mogu se primeniti na domaćina koji pati od ili ima predispoziciju za mikrobnu infekciju pluća, kao što je upala pluća; ili za mikrobnu infekciju rane, kao što je bakterijska infekcija rane.

[0149] Formulacije antimikrobnih polipeptida pronalaska se takođe mogu primeniti na domaćina koji pati od ili ima predispoziciju za kožnu infekciju, kao što su akne, atopički dermatitis, seborejni dermatitis; poželjno kožna infekcija je bakterijska kožna infekcija, npr., izazvana Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes, Pityrosporum ovale ili Malassezia furfur.

[0150] Antimikrobni polipeptidi pronalaska su takođe korisni zain vitroformulacije za uništavanje mikroba, naročito gde se ne želi uvođenje određenih količina konvencionalnih antibiotika. Na primer, antimikrobni polipeptidi pronalaska mogu se dodati životinjskoj i/ili ljudskoj hrani; ili mogu biti uključeni kao aditiv zain vitrokulture ćelija da bi se sprečilo preterani razvoj mikroba u kulturi tkiva.

[0151] Podložnost određenog mikroba uništavanju sa polipeptidima pronalaska može biti određenaiv vitrotestiranjem, kao što je detaljno dato u eksperimentalnom delu. U tipičnom slučaju, kultura mikroba je kombinovana sa antimikrobnim polipeptidom na različitim koncentracijama tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da omogući dejstvo proteina, obično između oko jednog sata do jednog dana. Nakon toga vijabilni mikrobi se broje, i određuje se nivo uništavanja (ubijanja).

[0152] Mikrobi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, gram-negativne bakterije, na primer: Citrobacter sp.; Enterobacter sp.; Escherichia sp., npr. E. coli; Klebsiella sp.; Morganella sp.; Proteus sp.; Providencia sp.; Salmonella sp., npr. S. typhi, S. tvphimurium; Serratia sp.; Shigella sp.; Pseudomonas sp., npr. P. aeruginosa; Yersinia sp., npr. Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica; Franciscella sp.; Pasturella sp.; Vibrio sp., npr. V. cholerae, V. parahemolvticus; Campvlobacter sp., npr. C. jejuni; Haemophilus sp., npr. H. influenzae, H. ducreyi; Bordetella sp., npr. B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis; Brucella sp., Neisseria sp., npr. N. gonorrhoeae, N. meningitidis, itd. Druge bakterije od interesa uključuju Legionella sp., npr. L. pneumophila; Listeria sp., npr. L. monocvtogenes; Mycoplasma sp., npr. M. hominis, M. pneumoniae; Mycobacterium sp., npr. M. tuberculosis, M. leprae; Treponema sp., npr. T. pallidum; Borrelia sp., npr. B. burgdorferi; Leptospirae sp.; Rickettsia sp., npr. R. rickettsii, R. typhi; Chlamydia sp., npr. C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci; Helicobacter sp., npr. H. pylori, itd.

[0153] Ne-bakterijski patogeni od interesa uključuju gljivične i protozojske patogene, npr. Plasmodia sp., npr. P. falciparum, Trypanosoma sp., npr. T. brucei; shistosomes; Entaemoeba sp., Cryptococcus sp., Candida sp., npr. C. albicans; itd.

[0154] Različiti postupci primene se mogu upotrebiti. Polipeptidna formulacija se može dati oralno, ili injekcijom intravaskulamo, subkutano, peritonealno, putem aerosola, oftalmički, unutar bešike, topikalno, itd. Na primer, u tehnici su dobro poznati postupci za primenu inhalacijom. Doza terapeutske formulacije će široko varirati, zavisno od specifičnog antimikrobnog polipeptida koji se primenjuje, prirode bolesti, učestalosti primene, načina primene, klirensa agensa iz domaćina, i sličnog. Inicijalna doza može biti veća, praćena manjim dozama za održavanje. Doza može biti primenjena jednom ili dva puta nedeljno, ili podeljena u manje doze i primenjena jednom ili nekoliko puta dnevno, polu-nedeljno, itd. da bi se održao efikasan nivo doze. U mnogim slučajevima, oralna primena će zahtevati veću dozu nego intravenska. Amidne veze, kao i amino i karboksi terminusi, mogu biti modifikovani da bi se postigla stabilnija oralna primena. Na primer, karboksi terminus može biti amidovan.

Formulacije

[0155]Jedinjenja ovog pronalaska mogu se uključiti u razne formulacije za terapeutsku primenu. Naročito, jedinjenja ovog pronalaska mogu se formulisati u farmaceutske kompozicije preko kombinacije sa odgovarajućim, farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima, i mogu se formulisati u preparate u čvrstom, polu-čvrstom, tečnom obliku ili u obliku gasa, kao što su tablete, kapsule, praškovi, granule, pomade, kreme, pene, rastvore, supozitorije, injekcije, inhalati, gelovi, mikrosfere, losioni i aerosoli. Primena takvih jedinjenja može se postići na razne načine, uključujući oralnu, bukalnu, rektalnu, parenteralnu, intraperitonealnu, intradermalnu, transdermalnu, intrahealnu, itd., primenu. Antimikrobni polipeptidi pronalaska mogu biti sistemski distribuirani nakon primene ili mogu biti lokalizovani korišćenjem implanta ili druge formulacije koja deluje tako da zadržava aktivnu dozu na mestu implantacije.

[0156]U jednoj varijanti, formulacija za topikalnu primenu sadrži helatirajući agens koji smanjuje efikasnu koncentraciju dvovalentnih katjona, naročito kalcijuma i magnezijuma. Na primer, agensi kakav je citrat, EGTA ili EDTA mogu biti uključeni, pri čemu je citrat poželjan. Koncentracija citrata bi obično bila od oko 1 do 10 mM.

[0157]Jedinjenja ovog pronalaska mogu se primeniti sama, u međusobnoj kombinaciji, ili mogu biti korišćena u kombinaciji sa drugim poznatim jedinjenjima (npr., perforin, anti-inflamatorni agensi, antibiotici, itd.) U farmaceutskom obliku doze, jedinjenja se mogu primeniti u obliku njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Sledeći postupci i inertni punioci su dati samo radi primera i ni u kom slučaju nisu ograničavajući.

[0158]Za oralne preparate, jedinjenja mogu biti korišćena sama ili u kombinaciji sa odgovarajućim aditivima da bi se napravile tablete, praškovi, granule ili kapsule, na primer, sa konvencionalnim aditivima, kao što su laktoza, manitol, kukuruzni škrob ili škrob iz krompira; sa vezujućim sredstvima, kao što su kristalna celuloza, derivati celuloze, akacija, kukuruzni škrob ili želatini; sa sredstvima za raspadanje, kao što su kukuruzni škrob, škrob iz krompira ili natrijumkarboksimetilceluloza; sa lubrikantima, kao što je talk ili magnezijum stearat; i ukoliko je poželjno, sa razblaživačima, puferima, ovlaživačima, konzervansima i aromatizerima.

[0159]Jedinjenja mogu biti formulisana u preparate za injekcije njihovim razblaživanjem, suspendovanjem ili emulzifikovanjem u vodenom ili ne-vodenom rastvoru kao što je biljno ili drugo slično ulje, sintetički gliceridi alifatične kiseline, estri viših alifatičnih kiselina ili propilen glikol; i ukoliko je poželjno, sa konvencionalnim aditivima kao što su sredstva za povećanje rastvorljivosti, izotonični agensi, suspendujući agensi, emulzifikujući agensi, stabilizatori i konzervansi.

[0160] Jedinjenja se mogu koristiti u formulaciji aerosola da bi se primenili preko inhalacije. Jedinjenja ovog pronalaska mogu se formulisati u prihvatljivim propelentima pod pritiskom kao što su dihlorodilfuorometan, propan, azot i slično.

[0161] Jedinjenja se mogu koristi kao losioni, na primer da spreče infekciju od opekotina, putem formulacije sa konvencionalnim aditivima kao što su sredstva koja povećavaju rastvorljivost, izotonični agensi, suspendujući agensi, emulzifikujući agensi, stabilizatori i konzervansi.

[0162] Dodatno, jedinjenja se mogu napraviti u obliku supozitorija mešanjem sa raznim bazama kao što su emulzifikujuće baze ili baze rastvorljive u vodi. Jedinjenja ovog pronalaska mogu se primeniti rektalno preko supozitorija. Supozitorije mogu uključivati nosače kao što su kakao puter, Carbowax i polietilen glikoli, koji se tope na telesnoj temperaturi, a u čvrstom stanju su na sobnoj temperaturi.

[0163] Mogu biti obezbeđeni jedinični oblici doze za oralnu ili rektalnu primenu kao što su sirupi, eliksiri, i suspenzije, gde svaka jedinica doze, na primer, čajna kašika, supena kašika,

tableta ili supozitorija, sadrži unapred određenu količinu kompozicije koja sadrži jedno ili više jedinjenja ovog pronalaska. Slično tome, jedinični oblik doze za injekciju ili intravensku primenu može sadržati jedinjenje ovog pronalaska u kompoziciji kao rastvor u sterilnoj vodi, normalnom fiziološkom rastvoru ili drugom farmaceutski prihvatljivom nosaču.

[0164] Implanti za formulacije sa produženim oslobađanjem dobro su poznati u tehnici. Implanti su formulisani kao mikrosfere, pločice, itd. sa biorastvorljivim ili bionerastvorljivim polimerima. Na primer, polimeri mlečne kiseline i/ili glikolne kiseline formiraju erodibilni polimer koji domaćin toleriše. Implant koji sadrži antimikrobne polipeptide pronalaska smešta se u blizini mesta infekcije, tako da se lokalna koncentracija aktivnog agensa povećava u odnosu na ostatak tela.

[0165] Termin "jedinični oblik doze", kao što je ovde korišćen, odnosi se na fizički odvojene jedinice pogodne kao jedinične doze za humane ili animalne subjekte, gde svaka jedinica sadrži unapred definisanu količinu jedinjenja ovog pronalaska izračunatu u količini koja je dovoljna da proizvede željeni efekatin zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem ili prenosiocem. Specifikacije za jedinični oblik doze ovog pronalaska zavise od određenog primenjenog jedinjenja i efekta koji treba postići, i farmakodinamike vezane za jedinjenje u domaćinu.

[0166]Farmaceutski prihvatljivi inertni punioci, kao što su prenosioci, adjuvanti, nosači ili razblaživači, lako su dostupni. Osim toga, farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance, kao što su agensi za podešavanje pH i puferovanje, agensi za podešavanje toničnosti, stabilizatori, ovlaživači i slično, lako su dostupni.

[0167]Tipične doze za sistemsku primenu su od 0.1 pg do 100 miligrama po kg težine subjekta po primeni. Tipično doziranje može biti po jedna tableta dva do šest puta dnevno, ili jednokratna kapsula ili tableta jednom dnevno koja ima proporcionalno veći sadržaj aktivnog sastojka. Efekat vremenski određenog oslobađanja može biti obezbeđen materijalom kapsule koji se rastvara na različitim pH vrednostima, kapsulom koja oslobađa jedinjenje polako putem osmotskog pritiska, ili putem bilo kog poznatog načina kontrolisanog oslobađanja.

[0168]Stručnjaci će lako proceniti da nivo doze može varirati kao funkcija specifičnog jedinjenja, težine simptoma i podložnosti subjekta neželjenim dejstvima. Neka od specifičnih jedinjenja su jača od drugih. Poželjne doze za dato jedinjenje lako se mogu odrediti od strane stručnjaka na različite načine. Poželjan načinje izmeriti fiziološku potenciju datog jedinjenja.

[0169]Korišćenje lipozoma kao sredstva za dopremanje je jedan od postupaka od interesa. Lipozomi se stapaju sa ćelijama ciljnog mesta i dopremaju sadržaj lumena intracelularno. Lipozomi se održavaju u kontaktu sa ćelijama dovoljno vremena da bi se omogućila fuzija, korišćenjem različitih načina da se održi kontakt, kao što je izolacija, vezujući agensi i slično. U jednom aspektu pronalaska, lipozomi su dizajnirani tako da budu u obliku aerosola za primenu na pluća. Lipozomi se mogu pripremiti sa prečišćenim proteinima ili peptidima koji posreduju u fuziji sa membranama, kao što je Sendai virus ili influenca virus, itd. Lipidi mogu biti bilo koja kombinacija poznatih lipida koji formiraju lipozome, uključujući katjonske ili lipide sa jonima suprotnog naelektrisanja, kao što je fosfatidilholin. Preostali lipid će uobičajeno biti neutralni ili kiseli lipidi, kao što su holesterol, fosfati dil serin, fosfatidilglicerol, i slično.

[0170]Za pripremu lipozoma može se koristiti postupak opisan od strane Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361. Ukratko, lipidi i kompozicija u lumenu koja sadrži peptide kombinuju se u odgovarajućem vodenom medijumu, pogodno fiziološkom rastvoru gde će ukupna Čvrsta supstanca biti u opsegu od oko 1-10 težinskih procenata. Nakon intenzivnog mešanja kratak vremenski period, od oko 5-60 sek., epruveta se stavlja u toplo vodeno kupatilo, od oko 25-40°C i ovaj ciklus se ponavlja oko 5-10 puta. Kompozicija se zatim obrađuje ultrazvukom pogodan vremenski period, u opštem slučaju od oko 1-10 sek. I može se dalje vorteksovati. Zapremina se povećava dodavanjem vodenog medijuma, u opštem slučaju povećavajući zapreminu od oko 1-2 puta, nakon čega sledi šejkiranje i hlađenje. Ovaj postupak omogućava ugradnju molekula velikih molekulskih težina u lumen.

Formulacije sa drugim aktivnim agensima

[0171] Za korišćenje u predmetnim postupcima, antimikrobni polipeptidi pronalaska mogu se formulisati sa drugim aktivnim agensima, naročito drugim antimikrobnim agensima. Drugi agensi od interesa uključuju razne antibiotike poznate u tehnici. Klase antibiotika uključuju penicilin G, penicilin V, meticilin, oksacilin, karbenicilin, nafcilin, ampicilin, itd.; peniciline u kombinaciji sa inhibitorima beta-laktamaze, cefalosporine, npr. cefaklor, cefazolin, cefuroksim, moksalaktam, itd.; karbapeneme; monobaktame; aminoglikozide; tetracikline; makrolide; linkomicine; polimiksine; sulfonamide; hinolone; hloramfenikol; metronidazol; spektinomicin; trimetoprim; vankomicin; itd.

[0172] Anti-gljivični agensi su takođe korisni, uključujući poliene, npr. amfotericin B, nistatin; 5-flukosin; i azole, npr. mikonazol, ketokonazol, itrakonazol i flukonazol. Antituberkulozni lekovi uključuju izoniazid, etambutol, streptomicin i rifampin. U formulaciju antimikrobnih polipeptida pronalaska takođe se mogu uključiti citokini, npr. interferon gama, faktor nekroze tumora alfa, interleukin 12, itd.

In vitrosinteza

[0173] Antimikrobni peptidi pronalaska mogu se pripremitiin vitrosintezom, korišćenjem konvencionalnih metoda poznatih u tehnici. Dostupni su različiti komercijalni sintetički aparati, na primer automatski sintetizatori od Applied Biosvstems Inc., Beckman, itd. Korišćenjem sintetizatora, aminokiseline koje se javljaju u prirodi mogu biti zamenjene sa neprirodnim aminokiselinama, naročito D-izomerima (ili D-oblicima) npr. D-alanin i D-izoleucin, diastereoizomeri, bočni lanci sa različitom dužinom ili funkcionalnim grupama, i slično. Određena sekvenca i način pripreme biće određeni na osnovu pogodnosti, ekonomičnosti, zahtevane čistoće i sličnog.

[0174] Hemijsko vezivanje može biti obezbeđeno različitim peptidima ili proteinima koji sadrže pogodne funkcionalne grupe za vezivanje kao što su amino grupe za formiranje amida ili supstituisanih amina, npr. reduktivna aminacija, tiol grupe za formiranje tioetra ili disulfida, karboksil grupe za formiranje amida, i slično.

[0175]Ukoliko je poželjno, u peptid se tokom sinteze ili tokom ekspresije mogu uvesti različite grupe, što dozvoljava vezivanje za druge molekule ili za površinu. Na taj način cisteini se mogu koristiti za dobijanje tioetara, histidini za vezivanje za kompleks jona metala, karboksil grupe za stvaranje amida ili estara, amino grupe za stvaranje amida, i slično.

[0176]Polipeptidi se takođe mogu izolovati i prečistiti u skladu sa konvencionalnim postupcima rekombinantne sinteze. Može se pripremiti lizat ekspresionog domaćina koji se prečišćava korišćenjem HPLC, ekskluzione hromatografije, gel elektroforeze, afinitetne hromatografije, ili drugih tehnika prečišćavanja. Najvećim delom, kompozicije koje su korišćene sadržaće najmanje 20% željenog proizvoda po težini, još češće najmanje oko 75% po težini, poželjno najmanje oko 95% po težini, a za terapeutske svrhe, obično najmanje oko 99.5% po težini, u odnosu na kontaminante vezane za postupak pripreme proizvoda i njegovog prečišćavanja. Obično će procenti biti zasnovani na ukupnom proteinu.

[0177]Ovaj pronalazak je dodatno opisan sledećim primerima koje ne treba smatrati ograničavajućim za obim pronalaska.

PRIMERI

[0178]Hemikalije korišćene kao puferi ili supstrati bili su komercijani proizvodi u najmanjem slučaju klase reagensa. U sledećim primerima, antimikrobni polipeptid prikazan kao aminokiseline 1 do 21 iz SEQ ID NO:2 označava se kao "Arenicin".

PRIMERI

Antimikrobno dejstvo Arenicina

[0179]Antimikrobni peptid prikazan kao aminokiseline 1 do 21 iz SEQ ID NO:2 sintetički je pripremljen. Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) određena je da bi se testiralo antimikrobno dejstvo Arenicina prateći NCCLS uputstva od CLSI (Clinical and Laboratorv Standards Institute; ranije poznat kao National Committec for Clinical and Laboratorv Standards) - protocol M7-A6, vol. 20, No. 2: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibilitv.

Testovi za aerobne bakterije

[0180]Antimikrobni peptid pronalaska testiran je na 12 sojeva bakterija dobijenih iz American Type Culture Collection (ATCC). Rezultati u Tabeli 1 su srednje vrednosti dve nezavisne procene.

PRIMER 2

Minimalna inhibitorna koncentracija protiv kliničkih gljivica

[0181]Minimalna inhibitorna koncentracija Arenicina protiv kvasaca i gljivica određena je u suštini kao što je opisano od strane NCCLS/CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).

[0182]Ukratko, suspenzija gljivica ili kvasaca od oko 1 McFarland jedinice razblažena je 1:100 u PD buljonu (8 g/L dekstroze krompira) i rast je analiziran na serijska dvostruka razblaženja Arenicina (0.03-32 ug/mL). Test ploče inkubirane su na 25-27°C za Candida albicans, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes i Epidermophvton floccosum, i na 30°C za Candida glabrata, Pichia pastoris, Saccharomvces cerevisiae i Aspergillus niger. Rast je vizuelno određen (golim okom, koso osvetljenje) nakon oko 40 časova inkubacije. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 2 u daljem tekstu.

Claims (18)

1. Polipeptid koji ima aritimikrobnu aktivnost, naznačen time što sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2.

2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što aminokiselinska sekvenca ima najmanje 75% identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQ ID NO:2.

3. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, naznačen time što aminokiselinska sekvenca ima najmanje 80% identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2.

4. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time što aminokiselinska sekvenca ima najmanje 85%) identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2.

5. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što aminokiselinska sekvenca ima najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2.

6. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačen time što aminokiselinska sekvenca ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinama 1 do 21 iz SEQ ID NO: 2.

7. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2.

8. Polipeptid prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što se sastoji iz SEQ ID NO: 2.

9. Polipeptid prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što se sastoji od aminokiselina 1 do 21 iz SEQ IDNO: 2.

10. Izolovani polinukleotid naznačen time što sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9.

11. Konstrukt nukleinske kiseline naznačen time što sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 10 funkcionalno vezan za jednu ili više kontrolnih sekvenci koje usmeravaju proizvodnju polipeptida u ekspresionom domaćinu.

12.Rekombinantni ekspresioni vektor naznačen time što sadrži konstrukt nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 11.

13. Rekombinantna ćelija domaćin naznačena time što sadrži konstrukt nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 11.

14. Postupak za proizvodnju polipeptida prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 naznačen time što sadrži (a) kultivaciju ćelije koja je u obliku svog divljeg tipa sposobna da proizvede polipeptid, ili kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid, pod uslovima koji su pogodni za proizvodnju polipeptida; i (b) rekuperovanje polipeptida.

15. Kompozicija naznačena time što sadrži antimikrobni polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

16.In vitropostupak za ubijanje ili inhibiciju rasta mikrobnih ćelija, naznačen time što sadrži dovođenje u dodir mikrobnih ćelija sa antimikrobnim polipeptidom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9.

17. Antimikrobni polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 -9 za primenu kao lek.

18. Primena antimikrobnog polipeptida prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 u pripremi veterinarskog ili humanog terapeutskog sredstva za lečenje mikorbne infekcije.