RS52187B - Vakcine za indukciju i stimulaciju imunskog odgovora za malariju - Google Patents

Abstract

Komplet koji sadrži:- rekombinantni adenovirus sa defektnom replikacijom u farmaceutski prihvatljivom ekspijensu, koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS iz parazita koji izaziva malariju; i - proteinski antigen sa adjuvansom;pri čemu je rekombinantni adenovirus odabran iz grupe koju čine adenovirus čoveka seroptipa 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 i 50, i gde je rekombinantni adenovirus sa defektnom replikacijom kompozicija za indukovanje, a proteinski antigen sa adjuvansom je kompozicija za stimulaciju.Prijava sadrži još 19 patentnih zahteva.

Description

Oblast pronalaska

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na oblast medicine. Posebno, pronalazak se odnosi na nove strategije vakcine za indukciju/stimulaciju( engl. prime/ boost)primenom rekombinanto dobijenih adenoviralnih vektora i prečišćenih proteina u kontekstu adjuvansa za prevencijufalciparum malaria.

Stanje tehnike

[0002]Malarija trenutno predstavlja jednu od najrasprostranjenijih infekcija u tropskim i suptropskim oblastima na Zemlji. Godišnje, malarijska infekcija ubije do 2.7 miliona ljudi u zemljama u razvoju. Široka rasprostranjenost i povećana ušestanost malarije su posledica povećnja broja parazita otpornih na lek i vektora prazita otpornih na insekticide. Ostali faktori obuhvataju ekološke i klimatske promene, društvene poremećaje i sve veće migracije populacije.

[0003]Malarija je izazavana parazitom hematoprotozoanom koji prenosi komarac i pripada vrstiPlasmodium.Četiri vrstePlasmodiumprotozoa( P. falciparum, P. vivax, P. ovaleiP. malariae)su odgovorne za bolesti kod čoveka; brojne druge izazivaju bolesti kod životinja, kao što jeP. yoelii \ P. berghei. P. falciparum jeodgovorana za većinu infekciju kod ljudi i predstavlja nasmrtonosniji tip infekcije. Paraziti malarije imaju životni ciklus koji se sastoji od četiri odvojene faze. Svaka od ovih faza sposobna je da indukuje specifične imune odgovore usmerene na parazite i antigene koji su odgovarajući za datu fazu, ipak prirodno izazvana malarija ne štiti od ponovne infekcije.

[0004]Parazite malarije na čoveka prenosi nekoliko vrsta ženki komarcaAnopheles.Inficirani (zaraženi) komarči ubacuju sporozoitne oblike parazita malarije u krvotok sisara. Sporozoite ostaju nekoliko minuta u krvotoku pre nego što napadnu hepatocite. U ovom stadijumu parazit je lociran u ekstra-celularnoj sredini i izložen je napadu antitela, uglavnom usmeren direktno na proteincircumsporozoite(CS), glavna komponenta površine sporozoite. Kada dođe u jetru, parazit se replikuje i razvija u šizont. Tokom ovog stadijuma, ovaj parazit koji napada će proći kroz aseksualno razmnožavanje, proizvodeći tako do 20,000 ćerki merozoita po inficiranoj ćeliji. Tokom ovog intra-ćelijskog starijuma parazita, glavne uloge imunskog odgovora domaćina imaju T-limfociti, posebno CD8+ T-limfociti (Romero et al. 1989). Posle oko nedelju dana od infekcije jetre, hiljade merozoita je oslobođeno u krvotok i ulaze u crvene krvne ćelije (RBC), postajući tako meta antitelo-posredovanog imunskog odgovora i citokina koje sekretuju T-ćelije. Posle napada na eritorcite, merozoiti prolaze kroz nekoliko stradijuma replikacije, transformišući se tako u trofozoite, i šizonte, koji pucaju proizvode'i tako novu generaciju merozoita koji zatim inficiraju nove RBC. Eritrocitni stadijum je povezan sa jasnom slikom kliničke bolesti. Manji broj trofozoita se može razviti u muške ili ženske gametocite, koji predstavaljaju seksualni stadijum parazita. Kada prijemčiv komarac proguta gametocite, oplodnja ovih gameta dovodi do stvaranja zigota i zatim transformacije u ookinete, zatim u oociste, i konačno u sporozoite, koji migriraju u pljuvačne žlezde i tako se završava ciklus.

[0005]Dve glavne grane patogen-specifičnog imunskog odgovora koji se javlja posle ulaska parazita u telo su celularni (ćelijski) i humoralni. Jedna grana, tj. ćelijski odgovor, odnosi se na CD8+ i CD4+ T ćelije koje učestvuju u imunskom odgovoru. Citotoksični T limfociti (CTL's) eksprimiraju CD8 i mogu specifično da ubiju inficirane ćelije koje eksprimiraju patogene antigene na površinu. CD4+ T ćelije ili T ćelije pomoćnica podržavaju razvoj CTL's, proizvode različite citokine, i takođe pomažu u indukciji B ćeliija za deobu i prozvodnju antitela specifičnih za antigene. Tokom humoralnog odgovora, B ćelije specifične za poseban antigen postaju aktivirane, replikuju se, diferenciraju i proizvode antigen-specifična antitela.

[0006]Obe grane imunskih odgovora su relevantne za zaštitu od malarijske infekcije. Kada infektivni sporozoiti putuju do jetre i hepatociti ulaze, sporozoiti postaju intracelularni patogeni, provodeći vreme izvan inficiranih ćelija. U ovom stadijumu, CD8+ T ćelije i CD4+ T ćelije su posebno važne zato što ove T ćelije i njihovi citokini proizvodi, kao što je interferon-Y(IFN-v), doprinose ubijanju inficiranih hepatocita domaćina. U mišijem modelu malarije nađeno je da eliminacija intracelularnih parazita jetre zavisi od odgovora CD8+ T ćelija usmerenih na peptide koje eksprmiraju paraziti u stadijumu jetre (Hoffman and Doolan, 2000). Deplecija CD8+ T ćelija poništava zaštitu od izazivanja sporozoitama, i adoptivni transfer CD8+ T ćelija daje zaštitu nevakinisanim(eno7. naive)životinjama.

[0007]Kada malarijska infekcija dostigne eritrocitni stadijum u kojem se merozoiti replikuju u RBC, nađeno je da merozoiti slobodno cirkulišu u krvotoku. Zbog toga što eritrocit ne eksprimira MHC molekule klase I ili II potrebnih za srodne interakcije sa T ćelijama, pretpostavlja se da su odgovori antitela najrelevantniji u ovom stadijumu. U zaključku sledi da bi pristup moguće vakcine protiv malarije bio najkorisniji ukoliko indukuje snažan ćelijski imunski odgovor kao i snažan humoralni imunski odgovor tako da napada različite stadijume u kojima se javljaju paraziti u Ijudkom telu.

[0008]Trenutni pristupi razvoj vakcine protiv malarije se može klasifikovati prema različitim stadijumima razvoja parazita, kao što je prethodno opisano. Možemo razlikovati tri vrste mogućih vakicna: • Pre-eritrocitna vakcine, koje su usmerene na sporozoite i/ili hepatocite inficirane šizontom (šizont-inficirane hepatocite). Istorijski, ovaj pristup je dominantna strategija bazirana na CS-u. Budući da je pre-eritrocitna faza infekcije asimptomatička, pre-eritrocitna vakcina bi trebalo idealno da da sterilni imunitet, posredovan humoralnim i ćelijskim imunskim odgovorom, i potpuno spreči latentnu malarijsku infekciju. • Vakcina aseksualne faze krvi, koja je usmerena protiv inficiranih RBC ili samog merozoita, je kosntruisana tako da kliničku težinu svede na minimum. Ove vakcine bi trebalo da smanje stepen morbiditeta i mortaliteta i sprečavaju ulazak i/ili ravoj parazita u eritrocite. • Vakcine za blokiranje transmisije, koje su osmišljene tako da sprečei razvoj parazita u komarcu domaćinu. Ova vrsta vakcina bi trebalo da favorizuje smanjenje brzine infekcije malarijom u populaciji.

[0009]Na kraju, izvođenje razvoja kombinovane vakcine protiv malarije koja za cilj ima više stadijuma životnog ciklusa parazita je razmatrana u tzv. multikomponentnim i/ili više-faznim vakcinama.

[0010]Trenutno nema komercijalno dostupnih vakcina protiv malarije, iako je razvoj vakcine protiv malarije započet pre više od 30 godina. Imunizacija glodara, ne-humanih primata i ljudi sa zračenjem-umanjenim sporozoitima daje zaštitu od naknadnog izazivanja sporozoitima koje su pososbne za razvoj (Nussenzvveig et al. 1967; Clyde et al. 1973). Međutim, do sada troškovi i nemogućnost praktičnog sistema za gajenje kultura na veliko za proizvodnju ozračenih sporozoita sprečilo je široku primenu ove vakcine (Luke et al. 2003).

[0011]Do sada kandidati za vakcinu koji najviše obećavaju a koji su testirani na ljudima su bazirani na malom broju antigena površinskih sporozoita. CS protein je jediniP. falciparumantigen za koji se pokazalo da konzistentno sprečava malariju kada se koristi kao baza za aktivnu imunizaciju kod ljudi od infekcija koje prenose komarči, iako u meri koja često nije dovoljna. Teorijska analiza je ukazala na to da pokrivenost vakcinom kao i efikasnost (delotvornost) vakcine treba da budepreko 85%, ili mutanti koji su virulentniji mogu dapobegnuu endemske oblasti (Gandon et al. 2001).

[0012]Jedan način indukovanja imunskog odgovora kod životinja je administracija inficiranog vektora, koji čuva nukleinske kiseline koje kodiraju antigen u svom genomu. Jedan ovakav nosač je rekombinantni adenovirus, koji je napravljen da ima defektnu replikaciju, uklanjanjem regiona unutar genoma koji su normalno ključni za replikaciju, kao što je E1 region. Primeri rekombinantnih adenovirusa koji sadrže gene koji kodiraju antigene poznati su u stanju tehnike (WO 96/39178). Na primer, pokazano je da HIV-izvedene antigenske komponente dovode do imunskog odgovora ukoliko se distribuiraju rekombinantnim adenovirusima (WO 01/02607; WO 02/22080; US 6,733,993). Kod malarije, razvijena je vakcina bazirana na rekombinantnom adenovirusu. Ovi vektori eksprimiraju celi CS proteinP. yoelii,jedan od mišijih modela malarije, i ovi vektori su pokazali da su u stanju da indukuju sterilni imunitet kod miševa u odgovoru na jednu dozu imunizacije (Bruna-Romero etal. 2001). Pokazano je da CD8+ T ćelije primarno posreduju ovu zaštitu indkuovanu adenovirusom.

[0013]Budući da visok procenat osoba ima pretodni imunutet na generalno upotrebljene adenoviralne vektore kao što je adenovirus serotip (serovar) 5 (Ad5), nove tehnologije su razvijene u stanju tehnike, pri čemu rekombinantni adenovirusi koji su replikaciono defektivni su bazirani na serotipovima koji su suočeni sa postojeći imunitet u obliku neutralizujućih antitela samo u malom procentu zdravih individua. Ovi serotipovi su generalno označeni kao nisko-neutralizovani serotipovi, ili retki serotipovi. Nađeno je da su naročito korisni: Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 i Ad50 (WO 00/70071; VVO 02/40665; WO 2004/037294; WO 2004/083418; Vogels et al. 2003).

[0014]Vical, Inc. San Diego, CA, USA and the Naval Medical Research Center (Horn et al. 1995) su razvili vakcinu baziranu na DNKkoja sadrži plazmid koji eksprimiraP. falciparumCS protein, u Studijama na mišijem modelu pokazana je indukcija antigen-specifičnog CTL i antitelo odgovora posle imunizacije sa piazmidnom DNK

(Doolan et al. 1998). Međutim, prema tome do sada se upotreba DNK vakcine pokazala kao suboptimalna za indukciju zaštitnih imunskih odgovora kod ljudi. Upotrebom DNK vakcine nađeno je da vakcinisani volonteri nisu razvili antitela na CS protein kao što je procenjeno indirektnim testom fluorescentnog antitela (IFAT) protiv sporozoita osušenih na vazduhu i ELISA protiv rekombinantnih i sintetičkih peptida (Wang et al. 2001), iako su njihovi CTL odgovori, značajni.

[0015]Na suprot ovome, pristup RTS.S (prečišćen protein) vakcine protiv malarije (Gordon et al. 1995; US 6,306,625; WO 93/10152) može da indukuje jak odgovor antitela na CS protein (Kester et al. 2001; Stoute et al. 1997 i 1998), pri čemu se je takođe i snažan induktor Th1 tipa ćelijskog i humoralnog imuniteta. Najvažnije, ove vakcine ponovljivo štite približno polovinu primalaca. Međutim, zaštita izazvana sa RTS.S kratko traje (Stoute et al. 1998). Imunizacija sa RTS.S indukuje anti-CS antitela i CD4+ T ćelijske -zavisne IFN-y odgovore, ali slabe CD8+ T ćelijske-zavisne CTL ili IFN-Yodgovore (Lalvani et al. 1999). Međutim, pokazano je da ovi proizvedeni minimalni CD8+ odgovori koji su u korelaciji sa zaštitom u ispitivanjim ana čoveku (Sun et al. 2003). Tako, racionalno poboljašnje če se usmeriti na pojačanje indukovanja CD8+ T ćeiljskih odgovora na CS koji je indukovan sa RTS.S.

[0016]Stoute et al. The Journal of Infectious Disease, 1998, vol. 178, strane 1139-44 i Gargon et al. Expert Review of Vakcine, April 2003, vol. 2, no. 2, strane 231-238 opisuju efikanost kandidata za sporozoita malarije vakcinu , RTS,S formulisanu tako da sadrži emulziju ulje-u -vodi plus imunostimulant monofosforil lipid A i derivat saponina QS2.

[0017]VVO 2004/055187 opisuje rekombinantni adenoviruse sa defektnom replikacijom koji sadrže heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS izPlasmodiumza upotrebu kao vakcina.

[0018]Izazov razvijanja vakcine protivfalciparum malariakoja ima zaštitnu efikanost od bar 85% još uvek nije ostvaren. Zadatak je posebno težak, zato što, za razliku od drugih često smrtonosnih bolesti kao što su male boginje ili variole, prethodno izlaganje malariji i razvoj prirodnog imuniteta ne štiti od naknadne infekcije malarijom. Od svih kandidata za vakcinu i strategija distribucije vakcina koje su do sada testirane, samo je RTS.S dosledno obezbedio određen nivo zaštite. Ostali testirani kandidati su bili ili neadekvatno imunskogeni, ili imunskogeni ali sa neodgovarajućom zaštitom. Ova prijava opisuje stratešku formulaciju kombinacije vakcine namenjene iskorištenje optimalne serološke imunogenosti pristupa the protein/adjuvans zajedno sa izuzetnom indukcijom ćelijskog odgovora koji je obezbeđen rekombinantnim adenoviralnim vektorima sa defektivnom replikacijom.

Kratak opis crteža

[0019]Slika 1. Heterologni režimi vakcinacije indukovanja//stimulacije( engl.prime/boost vakcination),nakon čega sledi merenje odgovora T ćelija u IFN-y ELISPOT analizi u odnosu na C-terminus CS-a. Odgovor je meren dve nedelje posle poslednje vakcinacije. Horizontalne linije predstavljaju vrednosti geometrijske sredine. Slika 2. T-ćelijski odgovor meren u IFN-y ELISPOT analizi koje se odnosi na C-terminus CS-a. Odgovor je meren tri meseca posle poslednje stimulacije . Horizontalne linije predstavaljaju vrednosti geometrijske sredine. Slika 3. Imunski odgovor meren ELISA testom, odnosi se na ponovljen region CS-a, dve nedelje posle stimulisanja. Horizontalne linije predstavljaju vrednosti geometrijske sredine. Slika 4. Imunski odgovro meren pomoću ELISA testa, odnosi se na ponovljen region CS-a, tri meseca poslestimulacije. Horizontalne linije predstavljaju vrednosti geometrijske sredine. Slika 5. T ćelijski odgovor, u eksperimentima indukovanja sa rekombinantnim Ad35-CS vektorom i stimulisanja (engl.boosting) sa RTS.S ili Ad35-CS, meren sa IFN-y ELISpot testom , posle dve nedelje (levo) ili posle tri meseca (desno). Kao referenca korišćen je homologni stimulativni režim indukovanje/stimulacija RTS,S/RTS,S/RTS,S. Slika 6. Imunski odgovor u eksperimentima indukovanja rekombinantnim vektoromAĆ35- CS i stimulisanjapomoćuRTS, S orAd35- CS,merenELISAtestom posle dve nedelje (levo) ili posle tri meseca (desno). Kao referenca korišćen je homologni stimulativni režim indukovanje/stimulacija RTS,S/RTS,S/RTS,S.

Slika 7. T ćelijski odgovor, u eksperimentima stimulacije sa rekombinantnim Ad35-CS vektorom i indukovanja sa RTS,S ili Ad5-CS, mereni posle dve nedeje (levo) ili posle tri meseca (desno). Kao referenca korišćen je homologni stimulativni režim indukovanje/stimulacija RTS,S/RTS,S/RTS,S.

Slika 8. Imunski odgovor u eksperimentima stimulacije sa rekombinantnim Ad35-CS vektorom i indukovanja sa RTS,S ili Ad5-CS, mereni posle dve nedelje (levo) ili posle tri meseca (desno). Kao referenca korišćen je homologni stimulativni režim indukovanje/stimulacija RTS,S/RTS,S/RTS,S.

Slika 9. T ćelijski odgovor meren u IFN-v ELISPOT analizi koji se odnosi na N-terminus CS-a, dve nedlje posle stimulacije. Horizontalne linije predstavljaju vrednosti geometrijske sredine.

Slika 10. T ćelijski odgovor meren u IFN-v ELISPOT analizi koji se odnosi na N-terminus CS-a, tri meseca posle stimulacije. Horizontalne linije predstavljaju vrednosti geometrijske sredine.

Slika 11. T ćelijski odgovor na N-terminus, u eksperimentima indukovanja sa rekombinantnim Ad35-CS vektorom i stimulisanja sa RTS,S ili Ad35-CS, meren dve posle nedelje (levo) ili posle tri meseca (desno). Kao referenca korišćen je homologni stimulativni režim indukovanje/stimulacija RTS,S/RTS,S/RTS,S.

Slika 12. T ćelijski odgovor na N-terminus, u eksperimentima sastimlisanja sa rekombinantim Ad35-CS vektorom i indukovanja sa RTS.S ili Ad5-CS, mereno posle dve nedelje (levo) ili posle tri meseca (desno). Kao referenca korišćen je homologni stimulativni režim indukovanje/stimulacija RTS,S/RTS,S/RTS,S.

OPIS PRONALASKA

[0020]Pronalazak se odnosi na komplet koji se sastoji od rekombinantnog adenovirusa sa defektnom replikacijom u odgovarajućem eksipijensu, koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS iz parazita koji izaziva malariju; i proteinski antigen sa adjuvansom, poželjno samo od parazita koji izaziva malariju; pri čemu je rekombinantni adenovirus odabran iz grupe koju čine human adenovirusi serotipa 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 i 50. Preferentni proteinski antigen obuhvata RTS.S. Preferentni parazit koji izaziva malariju jePlasmodium falciparum.

[0021]U sledećoj realizaciji pronalazak se odnosi na upotrebu rekombinantnog adenovirusa sa defektnom replikacijom, koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS iz parazita koji izaziva malariju, i proteinski antigen sa adjuvansom, poželjno iz parazita koji izaziva malariju, kao što jePlasmodium falciparum,u izradi leka za tečenje (tretiranje) ili prevenciju malarije. Dati rekombinantni adenovirus je adenovirus majmuna ili adenovirus čoveka serotipa 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 ili 50.

[0022]Pronalazak opisuje određene preferentne indukovanja/stimulacije, pri čemu je poželjno da je rekombinantni adenovirus sa defektnom replikacijom upotrebljen kao kompozicija za indukovanje i proteinski antigen sa adjuvansom je upotrebljen kao kompozicija za sitmulaciju.

[0023]Pronalazak se takođe odnosi na metodu vakcinacije sisara protiv infekcije malarijom koja obuhvata korake indukovanja sisara sa rekombinantnim adenovirusom sa defektnom replikacijom u odgovarajućem eksipijensu, dati adenovirus sadrži sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS iz parazita koji izaziva malariju; i stimulaciju datog sisara sa proteinskim antigenom sa adjuvansom, poželjnon RTS.S.

Detaljan opis

[0024]Predmetni pronalazak se odnosi na komplet koji se sastoji od rekombinantnog adenovirusa sa defektnom replikacijom u farmaceutski prihvatljivom eksipijensu, dati adenovirus sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS iz parazita koji izaziva malariju; i proteinski antigen sa adjuvansom; pri čemu je dati rekombinantni adenovirus odabran iz grupe koju čine adenovirus čoveka serotipa 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 i 50. Poželjno, ovaj rekombinantni adenovirus je humani adenovirus serotipa 35. Takođe je preferentan komplet u skladu sa pronalaskom pri čemu dati proteinski antigen sadrži CS protein, ili njegov imunogenski fragment, iz parazita koji izaziva malariju. Ovaj proteinski antigen poželjno sadrži hibridni protein CS proteina ili njegov imunogeni fragment spregnut za površinu antigena iz virusa hepatitisa B (HbsAg), u obliku lipoproteinskih čestica sa HbsAg. U sledećoj poželjnoj realizaciji, proteinski antigen sadrži RTS.S. Takođe je preferentno da je ovaj proteinski antigen sa adjuvansom QS21 i 3D-MPL, poželjno u formulaciji sa lipozomima koji sadrže holesterol.

[0025]lako je u tehnici poznato da različiti paraziti izazivaju malariju kod ljudi, jednu realizaciju predmetnog pronalaska predstavlja komplet u skladu sa pronalaskom, gde je parazit koji izaziva malariju,Plasmodium falciparum.

[0026]Za odgovarajuće imunske odgovore poželjno je da je heterologona nukleinska kiselina, kodon-optimizovana za povećanje proizvodnje kodiranog proteina kod sisara, poželjno kod čoveka. Rekombinantni adenovirus može da bude prisutan u smeši sa adjuvansom.

[0027]Primeljivost adenovirusa majmuna za upotrebu u genskoj terapiji kod čoveka ili vakcini je veoma cenjena kod prosečnih stručnjaka. Pored ovoga, drugi ne-humani adenovirusi kao što su pseći i goveđi adenovirusi za koje je nađeno da inficiraju humane ćelije in vitro pa se prema tome takođe mogu koristiti kod ljudi budući da je njihova seroprevalencij amala u uzorcima dobijen od ljudi. Tako, pronalazak se odnosi i na komplet koji se sastoji od rekombinantnog adenovirusa majmuna, psa ili čoveka sa defektnom replikacijom u farmaceutski prihvatljivom eksipijensu, koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira kodon-optimizovan antigen CS circumsporozoita izPlasmodium falciparum;i proteinski antigen sa adjuvansom koji sadrži RTS.S, pri čemu je poželjno da je proteinski antigen sa adjuvansom odabranim od QS21 i 3D-MPL, poželjno u formulaciji sa lipozomima koji sadrže holesterol.

[0028]U predmentnom pronalasku opisano je i to da određeni režimi indukovanja - stimulacije obezbeđuju neočekivan i iznenađujući rezultat u odnosu na imunske odgovore u različitim komponentama kompleta koji su ovde opisani, a administrirani odgovarajućim redosledom. Shodno tome, pronalazak se takođe odnosi na komplet, gde je rekombinantni adenovirus sa defektnom replikacijom kompozicija za indukovanje, a proteinski antigen sa adjuvansom je kpmpozicija za stimulaciju. Imunski odgovor izazvan jednom administracijom (indukovanje) vakcine često nije dovoljno snažno i/ili postojano da obezbedi delotvnu (efikasnu) zaštitu. Ponovljena administracija (stimulacija) može značajno da pojača humoralne i ćelijske odgovore na antgene vakcine (npr., videti Estcourtet al. 2002).

[0029]Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu rekombinantnog adenovirusa sa defektnom replikacijom koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS iz parazita koji izaziva malariju, i proteinski antigen sa adjuvansom za prozvonju leka za lečenje ili prevenciju malarije, pri čemu je rekombinantni adenovirus, adenovirus majmuna, psa ili goveđi adenovirus, ili adenovirus čoveka serotipa 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 ili 50, pri čemu je poželjno da je rekombinantni adenovirus sa defektnom replikacijom upotrebljen kao kompozicija za indukovanje, a proteinski antigen sa adjuvansom je upotrebljen kao kompozicija za stimulaciju. Prema jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu proteinski antigen obuhvata CS protein, ili njegov imunogeni fragment, od parazita koji izaziva malariju, poželjnoPlasmodium falciparum.Ovi proteinski antigen poželjno obuvhata hidrdni protein CS proteina ili nejgov imunogeni fragment koji je spregnut sa površinskim antigenoim virusa hepatitisa B (HbsAg), u obliku lipoproteinskih čestica sa HbsAg. RTS.S je preferentan proteinski antigen sa adjuvansom, dok je poželjan adjuvans, QS21 i 3D-MPL, poželjno u formulaciji sa lipozomima koji sadrže holesterol.

[0030]Za optimalnu ekspresiju nakon čega sledi optimalni imunski odgovori kod sisara, poželjno ljudi, u predmetnom pronalasku je upotrebljena heterologna nukleinska kiselina koja je kodon-optimizovana za povećanje proizvodnje kodiranog proteina kod sisara, poželjno čoveka.

[0031]U narednoj realizaciji, predmetni pronalazak se odnosi na metodu vakcinacije sisara protiv malarijske infekcije, koja obuhvata korake indukovanja sa rekombinantnim adenovirusom sa defektnom replikacijom u farmaceutski prihvatljivom ekspijensu, koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS iz parazita koji izaziva malariju; i stimulaciju sisara sa proteinskim antigenom sa adjuvansom koji sadrži hibridni protein CS proteina ili njegov imunogenski fragment spregnut sa HbsAg, u obliku lipoproteinskih čestica sa HbsAg. Proteinski antigen požljeno sadrži RTS,S, pri čemu je poželjni adjuvans: QS21 i 3D-MPL, preferentno u formulaciji sa lipozomima koji sadrže holesterol, dok je preferentan parazit koji izaziva malariju,Plasmodium falciparum.

[0032]Proželjni adenovirusi koji se koriste za proizvodnju rekombinantnog adenovirusa i upotrebu u metodama predmetnog pronalaska, mogu da budu humani ili nehumani adenovirusi kao što su adenovirusi majmuna, psa i goveđi adenovirusi, budući da je veoma poželjna upotreba adenovirusa koji se ne suprotstavljaju postojećem imunitetu kod (čoveka) domaćina kojem će rekombinantni virus administrirati. Adenovirusi majmuna i određeni serotipovi adenovirusa čoveka su su veoma pogodni za ovo, kao što je ovde opisano. Preferentni adenovirusi čoveka koje se koriste u ovim metodama, za upotrebu i u kompletima u skladu sa pronalaskom su adenovirusi čoveka serotipa 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 i 50.

[0033]Predmetni pronalazak se odnosi na metodu vakcinacijesisara protiv malarijske infekcije upotrebom kompleta u skladu sa pronalaskom. Komplet u skladu sa pronalaskom je upotrebljen za vakcinaciju sisara protiv malarijske infekcije preferentnom primenom režima indukovanje/stimulacija kao što je ovde opisano , poželjno je da posle stimulacije sledi više naknadnih stimulacija.

[0034]Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu rekombinantnog adenovirusa kao nosača bar jednog antigena malarije i koristi se u heterolognoj kombinaciji sa bar jednim proteinom sa adjuvansom u režimu indukovanje/stimulacija. Neočekivano je nađeno da kombinacija virusnog vektora proteina sa adjuvansom u heterolognom režimu indukovanja/stimulacije obezbeđuje superiorni imunski odgovor kod primata u smuslu inicijalnih odgovora T ćelija i dugotrajnih imunskih odgovora. Posebno, nađeno je da indukovanje sisara sa viralnim vektorom koji sadrži nukelinsku kiselinu koja kodira antigen pa zatim stimulacija bilo sa jednom ili više injekcija proteinskog antigena sa adjuvansom daje vrhunske rezultate u smislu kvalitativnih i/ili kvantitativnih imunskih odgovora. Preferentni viralni vektori su adenoviralni vektori, a bolje adenoviralni vektori čoveka, a još bolje adenoviralni vektori čoveka koji se ne sukobe sa niskim nivoima neutrališuće aktivnosti kod domaćina sisara kojima je administriran. Veoma poželjni serotipovi su adenovirusi 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 i 50.

[0035]Prema jednoj preferentnoj realizaciji, proteinski antigen i antigen kodiran viralnim vektorom su antigeni malarije, a boljePlasmodium falciparumcirkumsprorozoit (CS) protein, ili imunogenski derivati i/ili njihovi fragmenti. Kao jedan primer ovog koncepta, polipeptid kodiran viralnm vektorom sadrži nukelinsku kiselinu koja kodira P.falciparumCS protein, uključujući N-terminalni deo, centralni deo ponovljenog regoina, i C-terminalni deo (uz deleciju 14 C-terminalnih amino kiselina: i vezivna sekvenca za GPI), dok proteinski antigen sadrži konstrukt RTS.S, kojem nedostaje N-terminalni region.

[0036]Proteinski antigen sa adjuvansom za upotrebu u jednom ili svim aspektima pronalaska mogu da sadrže CS protein izP. falciparum,ili njegov imunogenski fragment, koji može da bude u obliku spregnutog (fuzionog ) proteina. Na primer, antigen može da uključi hibridni protein CS proteina ili imunogen fragment spregnut za površinu antigena iz hepatitis B virusa (HBsAg), pri čemu hibridni protein može da bude eksprimiran u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina i može da bude u obliku lipoproteinskih čestica. Kondenzovani protein može da sadrži na primer sve C-terminalne delove CS proteina, četiri ili više uzastopnih ponavljanja imunodominantnog regiona, i površina antigena iz virusa hepatitisa B (HBsAg). Na primer, hibridni protein sadrži sekvencu koja sadrži najmanje 160 amino kiselina koja je u suštini homologa C-terminalnom delu CS proteina i može da bude lišena krajnjih amino kiselina C-terminala u CS proteinu, na primer najmanje 10 do 12 amino kiselina. Hibridni protein može da bude u obliku smeše lipoproteinskih čestica, na primer sa HBsAg.

[0037]Posebno je dat hibridni protein kao što je opisano u WO 93/10152, označen kao "RTS<*>" a ovde označen kao "RTS", koji može da bude u obliku smeše lipoproteinskih čestica sa HBsAg, ovde označen kao RTS,S. Odnos hibridnog proteina:S antigena u oim smešama čestica iznosi na primer 1:4. ;[0038]Hibridni protein označen kao "RTS" dobijen je pomoću genske sekvence CS proteina izP. falciparum NF54(klon 3D7; Caspers et al. 1989) i sadrži u suštini ceo region 207 do 395 CS proteina iz P.falciparumNF54. Deo NF54 (3D7) CS proteinske sekvence koja je sadržana u RTS je sledeća sekvenca od 189 amino kiselina: DPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNKNNOG NGOGHNMPND PNRNVDENAN ANSAVKNNNN EEPSDKHIKE YLNKIQNSLS TEVVSPCSVTC GNGIOVRIKP GSANKPKDEL DYANDIEKKI CKMEKCSSVF NVVNSSIGL (SEQ ID NO:1). ;[0039]Posebno RTS je: • Metioninski ostatak kodiran nukelotidima 1059-1061 izvedenim odSacchromyces cerevisiae TDH3genske sekvence (nukleotidi 1-1058 u ovom okviru čitanja čine sam TDH3 promoter). (Musti et al. 1983). • Tri amino kiseline: Met Ala Pro, izvedene od nukleotidne sekvence (1062-1070) dobijene procedurom kloniranja upotrebljene dobijanje hibridnog gena). • Deo dužine 189 amino kiselna (prethodno data, SEQ ID NO:1) kodiran sa 1071-1637 amino kiselinama 207 do 395 CS proteina sojaP. falciparumNF54 (klon 3D7; Caspers et al. 1989). • Amino kiselina (Gly) kodirana nukleotidima 1638 do 1640, dobijena procedurom kloniranja za hibridni gen. • Četiri amino kiseline, Pro Val Thr Asn, kodirane nekleotidima 1641 do 1652, i predstavlaju četiri karboksi terminalna ostatka hepatitis B virusa (adw serotip) preS2 protein (Valenzuela et al. 1979). • Deo od 226 amino kiseline, kodiran nukleotidima 1653 do 2330, i navodeći S protein hepatitis B virusa (adw serotip) (Valenzuela et al. 1979). ;[0040]RTS može da bude u obliku smeše čestica, RTS,S, pri čemu je odnos RTS:S na primer 1:4. ;[0041]lako pronalazak ni na koji način nije ograničen malarijskim antigenima, pronalazak se može detaljno objasniti pomoću viralnih vektora koji kodiraju malarijski antigen u kombinaciji sa proteinskim malarijskim antigenom sa adjuvansom. Orsečan stručnjak će moći da modifikuje opšta saznanja koja su vode data primenom različitih antigeniskih umetaka ai odgovarajućih proteinskih antigena sa adjuvansom iz drugih patogenih agenasa, uključujući parazite, bakterije, viruse, kvasce, ili sopstveni antigeni, uključujući, ali ne ograničavajući se na, tumor antigene (npr., PSA, gp100, CEA, MUC1, Her2/neu) i si.). ;[0042]Predmetni pronalazak se odnosi na vektor rekombinantnog adenovirusa sa defektnom replikacijom koji sadrži sekvencu heterologone nukleinske kiseline koja kodira antigenPlasmodium falciparum.U preferentnoj realizaciji, dati viralni vektor je adenovirus izveden iz serotipa odabran iz grupe koju čine: Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 i Ad50. Razlog za odabri ovog adenovirusa čoveka je taj što opšta upotreba adenovirusa u in vektorima vakcina je obično otežana činjenicom da su ljudi obično inficirani sa adenovirusima divljeg tipa , koji izazivaju blage ili neočeigledenih bolesti kao što je prehlada. Imunski odgovori nastali tokom ovakve indikacije sa parentalnim serotipom divljeg tipa mogu negativno da utiču na efikasnost rekombinantnog serotip adenovirusa kada se upotrebi kao naknadni vektor rekombinantne vakcine, kao što je vakcina protiv malarije u kojoj su primenjeni adenovirusi. Rasprostranjenost različitih serotipova adenovirusa u populaciji ljudi širom Sveta zavisi od jedne geografske oblasti do druge. Generalo, preferentni serotipovi nailaze na male neutrališuće aktivnosti kod domaćina u većini delova sveta, kao što je naznačeno u nekoliko izveštaja u stanju tehnike. ;[0043]Pronalazači predmetnog pronalaska su sada napravili novu kombinaciju rekombinantnih adenovirusa i prečišćenih proteina u sekvencijalnoj shemi vakcinacije, ovde označena kao heterologna vakcinacija indukovanja/stimulacije, pri čemu su u shemi primenjeni različiti imunski odgovori indukovani različitim komponentama vakcine indukovanja/stimulacije. Na izbor rekombinantnog vektora utiču oni koji se sukobljavaju sa neutrališućom aktivnošću kod malog procenta populacije ljudi kojima je vakcinacija potrebna. Neočekivano, kombinacija antigena sa vektorom adenovirusa i proteinskog antigena sa adjuvansom daje značajno poboljšanje u imunskim odgovorima u odnosu na one kod samih vakcina. Imunsko poboljšanje je ilustrovanoin vitrodetekcijom imunskih odgovora datihin vivo ,rezus makaki majmunima kao što je ovde dato. ;[0044]U sledećoj realizaciji, rekombinatni adenovirus sa defektnom replikacijom je adenovirus majmuna, kao što su oni izolovani iz čimpanze. Primeri koji su pogodni obuvhataju C68 (tkaođe poznat kao Pan 9; US 6,083,716) and Pan 5, 6 and 7 (WO 03/046124). ;[0045]U jednom posebnom aspektu pronalaska, rekombinantni viralni vektor sa defektnom replikacijom sadrži sekvencu nukelinskih kislina koja kodira CS protein, ili njegov imunogeni deo ili fragment. Poželjno, data heterologna nukelinska sekvenca je kodon-optimizovana za povišenu ekspresiju kod sisara, poželjno čoveka. Optimizacija kodona je bazirana na zahtevanom sadržaju amino kiselina, opšta upotreba optimalnog kodona kod sisara je od interesa i aspekate koje treba izbeći kako bi se osigurala odgovarajuća ekpresija.Ovi aspekti mogu da budu obrađena donor ili-akceptor mesta, stop kodoni, Chi-mesta, poli(A) delovi, sekvence bogate sa GC- i AT-, unutrašnje TATA kutije, itd. Metod za optimiaciju kodona za sisare domaćine su poznati prosečnom strulnjaku i mogu se naći na u literatirui iz oblasti molekularne biologije. ;[0046]U poželjnoj realzaiciji, pronalazak se odnos na vektor rekombinantnog adenovirusa sa defektnom replikacijom u skladu sa pronalaskom, pri čemu sadržaj adenina plus timin u heterolgnoj nukelinskoj kiselini, kao št je poređeno sa sadržajem citozin plus gvnin, iznosi manje od 87%, poželjno manje od 80%, a još bolje manje od 59% i najbolje oko 45%. Pronalazak obezbeđuje, u jednoj realizaciji vektor rekombinantnog adenovirusa sa defektnom replikacijom , pri čemu CS protein je jedan od CS proteina kao što je opisano u WO 2004/055187, a bolje CS protein izP. falciparumili njegov imunogenski fragment. ;[0047]Proizvodnja rekombinantnih adenoviralnih vektoria koji pružaju zaštitu heterolognim genima je dobro pozanta u tehnici i obučno obuhvata primenu upakovane ćelijske linije, adapter konstrukata i kozmida i deleciju najmanje funkcionalnog dela regiona E1 iz genoma adenovirusa (videti u daljem tekstu za sisteme pakovanja i i preferentne ćelijske linije). ;[0048]Pronalazak se takođe odnosi na komplet koji sadrži kao komponente sa jedne strane rekombinantnog adenoviralnog vektora koji se susreće sa malom neutralizujućom aktivnošću kod domaćina i sa druge strane prečišćenim proteinom, gde je poželjno da prečišćeni protein je datu smeši sa adjuvansom. Poželjni adjuvans je QS21 i 3D-MPL, preferentni u formulaciji sa lipozomima koji sadrže holesterol. Upotrebljene komponente su korišćene u strategiji distribucije heterologne vakcine indukovanja/stimulacije u kojoj je poželjno prvo administrirati rekombinantni adenoviralni vektor kao agens za indukovanje i zatim prečišćen protein kao agens za stimulaciju, pri čemu se stimulacija može ponoviti više putab. Komponente su obično održavane u farmaceutski prihvatljivim nosačima. Farmaceutski prihvatljivi nosači su dobro poznati u tehnici i opsežno upotrebljeni u širokom opsegu terapeutskih proizvoda. Poželjno, koriste se nosači koji dobro deluju u vakcini. Bolje, vakcine dalje sadrže adjuvans. Adjuvansi su poznati u tehnici da dodatno povećavaju imunski odgovor na primenjeni antigen. Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu kompleta prema pronalasku u terapeutskeo, profilaktičko ili dijagnostičko tretiranje (lečenje) malarije. ;[0049]Predmetni proanalazak se odnosi na metodu lečenja sisara od malarijske infekcije ili prevencije malarijske infekcije kod sisara, gde data metoda obuhvata (bilo kojim redosledom, ili istovremeno) korake administriranja rekombinantnog adenovirusa sa antigenomP. falciparum;i administriranja bar jednog prečišćenogP. falciparumproteina, gde je dati protein pomešan sa adjuvansom. Poželjno rekombinantni adenovirus je odabran iz grupe koju čine Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 i Ad50, pri čemu je takođe poželjno da rekombinantni adenovirus štiti gen koji kodira CS protein, ili njegov imunogenski fragment. Preferentan prečišćen protein koji je upotrebljen u kombinaciji sa rekombinantnim adenovirusom je RTS.S, dok je kao adjuvans poželjan QS21 i 3D-MPL, preferentno u formulaciji sa lipozomima koji sadrže holesterol. ;[0050]Pokretačka sila koja leži u osnovi razvoja imunskih odgovora u citokinima, broj identifikovanih proteinskih mesendžera koji služe da pomognu ćelijama imunog sistema i upravlja eventualnim imunskim odgovorima na Th1 ili Th2 odgovore. Tako, visok nivo citokina Thl-tipa ima tendenciju da favorizuje indukciju ćelijski posredovanih imunskih odgovora na dati antigen, dok visoki nivoi citokina Th2-tipa ima tendenciju da favorizuje indukciju humoralnih imunskih odgovra na antigen. Važno je imati na umu da razlika imunskih odgovora Th1 i Th2-tipa nije apsolutna. U stvarnosti, jedinka će podržati imunski odgovor koji je opisan kao predominantni Th1 ili predominantni Th2. Međutim, često je prikladno razmatrati familije citokina u značenjima onih opisanih u ćelijama CD4+ T miša koje su klonirali Mosmann i Coffman (1989). Tradicionalno, odgovori Thl-tipa su povezani sa proizvodnjom INF-y i IL-2 citokina od strane T-limfocita. Ostale citokine koji su često direktno povezani sa indukcijom imunskih odgovora Th1-tipa ne proizvode T-ćelije, poput IL-12. Suprotno tome, odgvorori Th2-tipa su povezani sa sekrecijom IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 i tumour nekrozis faktora- (TNF-ss). ;[0051]Pogodni adjuvansi za upotrebu u pronalasku uključuju aluminijum soli kao što je aluminijum hidrokid gel (alum) ili aluminijum fosfat, ali takođe i soli kalcijuma, gvožđa ili cinka, ili mogu da budu nerastvorne suspenzije acilovanog tirozina, ili acilovanih šećera, katjonski ili anjonski derivatizovani polisaharidi, polifosfazani, ili montanid lipozomi. ;[0052]U formulaciji vakcina za upotrebu u pronalasku, u sklopu vektora adenovirusa, adjuvans može ili ne mora da bude administriran. U slučaju proteinske komponente kombinacije, sastav adjuvansa može da bude odabran tako da indukuje preferencijalni Th1 odgovor. Dalje, ostali odgovori, uključujući druge humoralne odgovore, takođe može da bude indukovana. ;[0053]Određeni adjuvansi vakcine su posebno pogodni za stimulaciju odgovora citokina Th1 ili Th2-tipa. Tradicionalno, najbolji indikatori balansa Th1: Th2 imunskih odgovora posle vakcinacije ili infekcije uključuje direktno merenje stvaranja (proizvodnje) Th1 ili Th2 citokina pomoću T limfocitain vitroposle restimulacije antigenom, i/ili merenja odnosa lgG1: lgG2a ntigen specifičnih imunskih odgovora. Tako, adjuvans Th1-tipa je jedan, koji stimuliše populaciju izolovanih T-ćelija za proizvodnju visokih nivoa citokina Th1-tipa kada je re-stimulisan sa antigenomin vitro,i indukuje antigen specifične imunoglobulinske odgovore povezane sa izotipom Th1 -tipa. NA primer, imunostimulansi Th1-tipa mogu se formulisati tako da se dobiju adjuvansi pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku a koji mogu da sadrže Monofosforil lipid A, naročito 3-de-O-acilovan monofosforil lipid A (3D-MPL). 3D-MPL je dobro poznat adjuvans koji proizvodi Ribi Imunochem, Montana. Hemijski se često dostavlja kao smeša 3-de-O-aciliranog monofosforil lipida A sa 4,5, ili 6 aciliranih lanaca. Može da bude prečišćen i dobijen prema metodama opisanim u GB 2122204B, čija je referenca takođe data u dobijanju difosforil lipida A, i njihovih 3- O-deaciliranih varijanti. Opisani su i drugi prečišćeni i sintentisani lipopolisaharidi (US Pat. 6,005,099, EP 0729473 B1, EP 0549074 B1). U jednoj realizaciji, 3D-MPL je u obliku posebne formulacije sa veličinom čestica prečnika manjeg od 0.2 pm, i postupak njihovog dobijanja opisan je u EP 0689454. ;[0054]Saponini su sledeći primer Th1 imunostimulanata koji se mogu upotrebiti u pronalasku. Saponini su dobro poznati adjuvansi. Na primer, Quil A (dobijen od kore South American drveta Ouillaja Saponaria Molina), i njihegove frakcije, opisnai su u US Pat. 5,057,540, i EP 0362279 B1. Hemolitički saponini QS21 i QS17 (frakcije Quil A prečišćene sa HPLC) su opisane kao snažni sistemsski adjuvansi, i postupci za njihovo dobijanje opisani su u US Pat. 5,057,540 i EP 0362279 B1. Takođe je u ovim referencama je opisana u potreba QS7 (ne-hemolitička frakcija Quil-A), koja deiuje kao snažan adjuvans za sistemske vakcine. Takođe su poznate i kombinacije QS21 i polisorbata ili ciklodekstrina (WO 99/10008). Posebni sistemi adjuvansa koji sadrže frakcije OuilA, kao što je QS21 i QS7 opisani su u WO 96/33739 i WO 96/11711. ;[0055]Naredni primer imunostimulanta je imunostimulatorni oligonukleotid koji sadrži memetilovane CpG dinukleotide ("CpG"). CpG je skraćenica za citozin-guanozin motive koji su prisutni u DNK. CpG je poznat u tehnici kao adjuvans koji se administrira sismteski i mukozno (WO 96/02555, EP 0468520). Istorijski, zapaženo je da frakcije DNK bacillus -a Calmette-Guerin (BCG) mogu da ispolje anti-tumorski efekt. U daljim ispitivanjima, pokazano je da sintetički oligonukleotidi koji vode poreklo od BCG genske sekvence moguda indukuju imunostimulatorne efekte (iin vitroiin vivo).Autori ovih ispitivanja su zaključili da određene palindromske sekvence, uključujući centralni CG motiv, prenose ovu aktivnost. Detaljne analize su pokazale da CG motiv ima sekvence određenog sadržaja, i da su ove sekvence uobičajene u bakterijskoj DNK ali su retke u DNK vertebrata. Imunostimulatorne sekvenca je često: Purin, Purin, C, G, pirimidin, pirimidin; pri čemu CG motiv nije metilovan, već su druge nemetilovane CpG sekvence su poznate kao imunostimulatorne i mogu se upotrebiti u predmetnom pronalasku. ;[0056]U određenim kombinacijama šest nukleotida, može da bude prisutna palindromska sekvenca. Nekoliko ovih motiva, bilo kao ponovaljanja jednog motiva ili kao kombinacija različitih motiva, mogu da budu prisutna u istom oligonukleotidu. Prisustvo jednog ili više ovih imunostimulatornih sekvenci koje sadrže oligonukleotide može da aktivira različite imune podsetove, uključujući prirodne ćelije ubice (koje proizvode interferon y i imaju citolitičku akitvnosti) i makrofage. Druge nemetilovane CpG sekvence koje ne sadrže ovu konsenzus sekvencu, su sada pokazale da su imunomodulatorne. Kada su formulisane u vakcine, CpG je generalno administeriran u obliku slobodnog ratvora zajedno sa slobodnim antigenom (WO 96/02555, 68) ili pogodno konjugovan (spregnut) za antigen (WO 98/16247), ili formulisan sa nosačem kao što je aluminijum hidroksid( Hepatitis surface antigen).;[0057]Ovi prethodno opisani imunostimulanti mogu da budu formulisani zajedno sa nosačima, kao što su, na primer, lipozomi, emulzije ulje u vodi, i/ili metalne soli, uključujući soli aluminijuma (kao što je aluminijum hidroksid). Na primer, 3D-MPL se može formulisati sa aluminijum hidroksidom (EP 0689454) ili emulzijama ulje u vodi (WO 95/17210); QS21 se može pogodno formulisati sa lipozomima koji sadrže holesterol (WO 96/33739), emulzijama ulja u vodi (WO 95/17210) ili alumom (VVO 98/15287); CpG se može formulisati sa alumom ili sa drugim katjonskim nosačima. ;[0058]Kombinacije imunostimulanata se takođe mogu upotrebiti, kao što je kombinacija monofosforil lipida A i derivata saponina (WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; VVO 98/05355; VVO 99/12565; WO 99/11241) ili kombinacija QS21 i 3D-MPL kao što je opisano u WO 94/00153. Alternativno, kombinacija CpG plus saponin kao što je QS21 se takođe može upotrebiti u predmetnogm pronalasku. Shodno tome, odgovarajući sistem adjuvanasa uključuje, na primer, kombinaciju monofosforil lipida A, kao što je 3D-MPL, zajedno sa soli aluminijuma. Druga realizacija kombinuje monofosforil lipid A i derivate saponina, kao što je kombinacija QS21 i 3D-MPL kao što je opisano u WO 94/00153, ili manje reaktogene kompozicije gde QS21 je dodat lipozomima koji sadrže holesterol (DQ) kao što je opisano u VVO 96/33739. Sledeća formulacija adjuvansa uključuje QS21,3D-MPL i tokoferol u emulziji ulje u vodi kao što je opisano u VVO 95/17210. U narednoj realizaciji, CpG oligonukleotidi su upotrebljeni sami ili zajedno sa aluminijum soli. ;[0059]Odgovarajući adjuvans za upotrebu u predmetnom pronalasku je preferencijalan Th1 stimulišući adjuvans, na primer, adjuvans koji obuvhata saponin poput QS21 ili derivat monofosforil lipida A poput 3D-MPL, ili adjuvans koji obuhvata oba od ova po izobru zajedno sa lipozomima koji sadrže holesterol. Kombinacija QS21 i 3D-MPL u formulaciji sa lipozomima koji sadrže holesterol opisana je na primer u VVO 96/33739 ;[0060]Prednosti predmetnog pronalaska su višestruke. Rekombinantni virusi, kao što su rekombinantni adenovirusi, mogu se proizvesti do veoma visokih titara koristeći ćelije koje se smatraju bezbednim, i koje mogu da rastu u suspenziji do veoma velikih zapremina, korišćenjem medijuma koji ne sadrži komponente životinjskog i ljudskog porekla. Takođe, poznato je da rekombinantni adenovirusi podižu dramatični imunski odgovor protiv proteina koji kodira sekvenca heterologne nukelinske kiseline u adenoviralnom genomu.Predmetni pronalazak kombinuje ove karakteristike u vektoru koji štiti cirkumsporozoitni genP. falciparumuz upotrebu proteina sa adjuvansom za stimuaciju odgovora. Dalje, gen je optimizovan kodonom pri čemu je dobijen nivo ekspresije koji je pogodan za davanje odgvorajućeg imunskog odgovora kod ljudi. Predmetni pronalazak obezbeđuje vakcine protiv malarijskih infekcija, korišćenjem adenovirusa koji ne nailazi na visoke titre neutralizirajućih antitela. Visoko preferentni adenovirusi u ove svhe su serotip 11 i 35 (Ad11 i Ad35, videti VVO 00/70071 i VVO 02/40665). ;[0061]Veoma se razlikuje sadržaj nukleinskih kiselina između patogena koji izazivaju malariju, kao što jeP. falciparumi domaćina od interesa, kao što jeHomo sapiens.Pronalazak obezbeđuje nukelinske kiselline koje su optimizovane kodonom čime se omogućavaviši nivo ekspresije kod sisara, poput ljudi. ;[0062]Upotreba različitih entiteta za stimulativne režime indukovanje/ stimulacije kao što je ovde opisano, obezbeđuje metodu vakcinacije koji obuhvata odgovarajuće imune odgovore ćelijskih i humoralnih grana imunog sistema. Obuhvata CD8+ T ćelije, CD4+ T ćelije i antitela. Ni jedna od ovih vakcina sama ne formira održive imunske odgovore koji aktiviraju optimalne nivoe antigen-specifičnih CD8+ T ćelija , CD4+ T ćelija i antitela. Dalje, redosled kojim su različite komponente administrirane može da izmeni imunske odgovore i može da da prednost različitim periodima moguće zaštite od budućih infekcija. Metode i kompleti predmetnog pronalaska omogućavaju izazivanje imunskog odgovora koji se bavi svim različitim stadijumima životnog ciklusa parazita kod ljudi, od sporozoita koji se slobodno kreću u krvotoku i merozoita do inficiranih hepatocita i RBC. Dalje, obezbeđuje kontinuiranu zaštitu od malarijskih infekcija tokom dužeg vremenskog perioda. ;[0063]U poželljnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na upotrebu rekombinantnih adenovirusa sa defektnom replikacijom uklanjanjem bardela E1 regiona u adenoviralnom genomu, budući da je E1 region potreban za procese replikacije-, transkripcije-, translacije- i pakovanja novoformiranih adenovirusa. Izostavljeni E1 vektori su generalno formirani na ćelijskim linijama koje su komplementne izostavljenim E1 funkcijama. Ove ćelijske linije i njihova upotreba za dobiijanje rekombinantnih virusa je detaljno opisana i dobro poznata u tehnici. Preferentno, PER.C6<®>ćelije, kao što je predstavljeno ćelijama deponovanim pod ECACC br. 96022940 kod European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) pri Centre for Applied Microbiologv and Research (CAMR, UK), ili njihovi derivati su korišćene za prevenciju formiranja replikaciono kompetentnih adenovirusa (rca). U sledećoj preferentnoj realizaciji, ćelije su nanete na podlogu za rast rekombinantnih adenovirusa pored onih izvedenih od adenovirusa serotipa 5 (Ad5). Referenca upućuje na publikacije VVO 97/00326, VVO 01/05945, VVO 01/07571, VVO 00/70071, VVO 02/40665 i VVO 99/55132, za metode i načine za dobijanje adenoviralnih zaliha za Ad5, bez rca kao i drugih adenovirusnih serotipova, kao što je rekombinantni virus sa defektnom replikacijom Ad35 koji se možedobiti na HER ćelijama koje su učinjene besmrtnim sa E1 iz Ad35, ili na PER.C6<®>ćelije koje sadrže i E1 gene iz Ad35 pri čemu se dobijaju odgovarajuće komplementacije adenovirusima B-tipa . ;[0064]Treba naglasiti da u objavljenim dokumentima VVO 00/03029, VVO 02/24730, VVO 00/70071 and VVO 02/40665, Ad50 je pogrešno označen kao Ad51. Serotip Ad51 koji je naveden u pomenutim publikacijama je isti kao serotip Ad50 u dokumentu koji je objavio De Jong et al. (1999), gde je označen kao B-grupa adenovirusa. U cilju pojašnjenja, Ad50 kao što je ovde upotrebljen, je Ad50 serotip B-grupe kao što je naveo De Jong et al. (1999). ;[0065]Vakcine predmetnog pronalaska se obično koriste u režimu indukovanje/stimulacija, na primer Ad/protein; protein/Ad; protein/Ad/Ad; Ad/protein/Ad; Ad/Ad/protein, Ad/protein/protein/protein, Ad/protein/viral vektor/protein, itd. Može se predvideti da kombinacija sa drugom vrstom vakcine (kao što je ogoljena DNK ili rekombinantni viralni vektor različit od adenovirusa) može se primeniti u kombinaciji sa agensima za indukovanje/ stimulaciju predmetnog pronalaska. Takođe s emogu upotrebiti dodatni malarijski antigeni ili (poli)peptidi. ;[0066]Sekvenca je 'izvedena ' kao što je ovde korišćeno ako se nukleinska kiselina može dobiti kroz direktno kloniranje iz sekvenci divljeg tipa koje su dobijene od virusa divljeg tipa, koji se takođe mogu dobiti na primer kroz PCR korišćenjem različitih delova DNK kao templata. Ovo takođe znači da da ove sekvence mogu da budu u obliku divljeg tipa kao i u izmenjenom obliku. Druga opcija za postizanje istog rezultata je kombinovanjem sintetičkih DNK. Treba napomenuti da 'izveden' ne znači isključivo direktno kloniranje DNK divljeg tipa. Prosečan stručnjak će takođe biti svestan mogućnosti moelkularne biologije za dobijanje mutantnih oblika određenog dela nukleinske kiseline. Izrazi 'funkcionalni deo, derivat i/ili njihov analog' treba tumačiti kao ekvivalente sekvenci nukelinskih kiselina na koje se odnose. Prosečan stručnjak će ceniti činjenicu da određene delecije, zamene, (tačkaste) mutacije, dodavanja, itd., mogu da rezlutju u sekvenci nukelinskih kiselina koja ima sličnu funkciju kao originalna sekvenca nukelinskih kiselina i treba da proizvede sličan ili čak identični polipeptid posle tranlsacije. Shodno tome, treba naglasiti da ove alteracije koje značajno ne menjaju funkcionalnost sekvenci nukleinskih kiselina su obuhvaćene obimom predmetnog pronalaska. Ukoliko je određen adenoviralni vektor izveden od određenih adenoviralnih serotipa po izboru, treba napomenuti da krajnji proizvod može da bude dobijen na indirektne načine, kao što je direktno kloniranje i sinteza određenih delova genomske DNK, primenom metodologije koja je poznata u tehnici. Određene delecije, mutacije i druge alteracije genomskog sadržaja koji ne menja specifične aspekte pronalska se smatraju delom pronalaska. Primeri ovih izmena su na primer delecije u u osnovnom lancu vursa d bi se omogućilo kloniranje većih delova heterolognih nukleinskih kiselina. Primeri ovih mutacija su na primer E3 delecije ili delecije i/ili alteracije u regionima koji kodiraju za E2 i/ili E4 proteine adenovirusa. Ove promene primenjene na osnovnom lancu adenovirusa su poznate u tehnici i često se primenjuju, budući daje prostor ograničavajući faktor za pakovanje adenovirusa, ovo je glavni razlog za deleciju određenih delova adenoviralnog genoma. Ostali razlozi za imenu E2, E3 i/ili E4 regiona u genomu mogu da se odnose na stabilnost integriteta adenoviralnog vektora, kao što je na primer opisano u VVO 03/104467 i VVO 2004/001032). Ove primene se između ostalog odnose na upotrebu E4 ili f6 gena iz serotipa iz jedne podgrupe u osnovnom lancu adenovirusa iz druge podgrupe, da bise osigurala komaptibilnost između aktivnosti E4 ili f6 i aktivnosti E1B-55K tokom repliklacije i pakovanja u ćelijskoj liniji. Oni se dalje odnose na upotrebu odgovarajućeg promotora plX za funkcionisanje promoter u cilu dobijanja visoke ekspresije plX i stablniji rekombinantni adenoviralni vektor. ;[0067]'Sa defektnom replikacijom' kao što je ovde korišćen, označava da se viralni vektori ne replikuju u ne-komplementnim (ne-dopunjujućim) ćelijama. U komplelentnim ćelijama, funkcija potrebna za replikaciju i prema tome dobijanje viralnih vektora, je obezbeđno komplementnim ćelijama. Replikacija defektivnih viralnih vektora predmetnog pronalaska ne okuplja sve elemente koji omogućavaju replikaciju u bilo kojoj ćeliji domaćinu osim komplementne ćelije. ;[0068]'Heterologni' kao što je ovde upotrebljen u zajedno sa nukleinskim kiselinama označava da sekvenca nukleinskih kiselina vodi poreklo od različitih originlanih izvora nego verzije divljeg tipa viralnih vektora u kojima je klonirana heterologna nukleinska kiselina. Na primer u slučaju adenovirusa, heterologna nukleinska kiselina koja je klonirana u adenoviralnom vektoru sa defektnom replikacijom, nije adenoviralna sekvenca nukleinskih kiselina, već dolazi od drugih patogenih agenasa od interesa. ;[0069]'Heterologna' kao što je ovde upotrebljeno zajedno sa vakcinom sa stimulativnim režimom indukovanje stimulacija označava da sve ili više odvojene komponente, na primer jednim rekombinantnim ne-replikativnim adenovirus vektorom i jednim proteinom sa adjuvansom upotrebljenim u odmerenoj kombinaciji, pre nego da je jedna komponenta adminsitrirana nekoliko puta, kao što je do sada uobičajeno u industriji. ;[0070]'Antigen' kao što je ovde upotrebljen označava antigen nastao iz izvora koji izaziva imunski odgovor kod domaćina kojem je determinantn data (administrirana). Antigen može da vodi poreklo od spoljašnjeg izvora, npr. patogena, parazita, ili čak da bude sopstveni-antigen{ engi. seli- antigen).Primeri antigenaPlasmodiumkoji mogu da budu distribuirani upotrebom rekombinantnih virusa sa defektnom replikacijom predmetnog pronalaska su cirkumsporozoitni protein (CS), SE36 polipeptid, merezoit površinski protein-1 19 kDa C-terminalni polipeptid (MSP-1p19), MSP-1, MSP-1p42, Apikalni Merozoit Antigen-1 (AMA-1),Liver Stage Antigen1 (LSA-1) iliLiver Stage Antigen- 3(LSA-3), ili fragment jednog od prethodno navedenih. U poželjnom aspektu pronalazak se odnosi na circumsporozoitni (CS) protein izP. falciparum.;[0071]'Kodon-optimizovan" kao što je ovde upotrebljen znači da je sadržaj nukleinskih kiselina u sekvenci izmenjen da bise podržao dovoljno visok nivo ekspresije proteina od interesa kod domaćinakojem je adminsitriran gen koji kodira dati protein. Dovoljno visok nivo ekspresije u ovom kontekstu znači da nivo proteina treba da bude dovoljno visok da izazove imunski odgovor u domaćinu u cilju zaštite od infekcije ili protiv bolesti. U stanju tehnike poznato je da neke vakcine daju imunski odogoro kod ljudi, pri čemu je oko 60% vakcinisanih individua zaštieno od bolesti koje su indukovane naknadnim izazovima patogenima (npr., sporozoitima). Prema tome, nivoi eksprimiranja se smatraju dovoljnim ako je 60% ili više tretiranih pojedinaca zaštićeno od nakandnih infekcija. It is believed that with the combinations of adenoviral aspects that can be applied and the choice of antigen as disclosed herein, such percentages may be reached. Preferentno, 85% pojedinaca je zaštićeno, dok je još bolje da više od 90% vakcinisanih domaćina ima zaštitu od naknadnog izazivanja. Nukleinske kisleline date u predmetnom pronalasku su optimizovane kodonom za ekspresiju kod ljudi. Prema Narum et al. (2001), sadržaj adenina i timina (A+T) u DNKHomo sapiens-a iznosi oko 59%, u poređenju sa sadžajem citozina i guanina (C+G). Sadržaj adenina i timina uP. falciparumukupno iznosi oko 80%. Sadržaj adenin i timina u CS genuP. falciparum -aiznosi oko 87%. Da bi se postigla dovoljna zaštita pretpostavlja se da je neophodno poboljšati nivo stvaranja (proizvodnje) u domaćinu. Jedan način postizanja ove zaštite je podesiti upotrebu kodona za održavanje iste osnovne amino kiselinske sekvence, ali upotreba kodon sekvenci je više karakteristka eksprimiranja kod sisara. Za ovo, rekombinantni virlani veotri sa defektnom replikacijom u skladu sa pronalaskom imaju sadržaj adenina i timina u heterolognim nukleinskim kiselinama predmetnog pronalaska ispod 87%, poželjno manje od 80%, i jop bolje manje ili jednako oko 59%. Na osnosvu upotrebe kodona kod ljudi i sadržaja amino kiselina u CS genimaP. falciparum-a iyoeli- ai,procenat gena optimizovanih kodonom je čak i niži, oko 45% za sadržaj amino kiselina datih u predmetnom pronalasku. Shodno tome, a što se CS gena tiče, poželjno je da je sadržaj adenina i timina oko 45%. Treba napomenuti, da ukoliko se tretira druga vrsta pored ljudi, koji mogu da imaju različitu koncentraciju adenina i timina (manje ili više od 59%), i/ili različitu uptorebu kodona, da geni koji kodiraju CS proteine predmetnog pronalaska mogu da budu podešeni tako da se uklapaju u potrebi sadržaj i daju prednost odgovarajućim nivoima ekspresije za datog domaćina. Naravno, ne može se isključiti i to da neznatne promene u sadržaju mogu da dovedu do neznatnih promena u nivou ekspresije u različitim geografskim područjima u Svetu. Takođe treba napomenuti da neznatne promene u broju ponavljanja u amino kiselinskoj sekvenci proteina, da shodno tome može da se razlikuju procenti. Ostali antigeni od interea mogu da budu slično modifikovani. Svi ovi podešeni sadržaji su obuhvaćeni pronalaskom. ;[0072]Protein označen kao RTS,S je fuzioni protein koji se sastoji od C-terminalne polovineP. falciparumCS proteina (17 centralnih 41 NANP-ponavlajanja plus većina C-terminalnog dela) eksprimiran kao fuzioni protein sa Hepatitis B površinskim antigenom. ;[0073]Jedan od izrazitih nedostatak adrenoviralnih vektora sa inkompetentnom replikacijom je manja patogenost parentalnih virusa i dokumentovan nedostatak izrazitih bolessti izazvanih ovim vektorim kod pojedinaca, uključujući one koji su imunosuprimovane. Rad na modelu malarije kod miševa,P. yoelii,ukazuje na to da rekombinantni adenovirusni konstrukti koje eksprimira CS protein ne samo da izaziva izrazite ćelijske imunske odgovore, već obezbeđuju izuzetnu zaštitu od infekcije. Shodno tome, u cilju poboljšanja inteziteta odgovora T ćelija i dužeg trajanja ukupnog imunskog odgovora na CS, pronalazači predmetnog pronalaska su odlučili da kombinuju režim adenoviralne zaštite sa režimom rekombinantnog proteina u nov stimulativni režim indukcija/stimulacija. ;[0074]Nažalost, miš nije idelan model ze predviđanje odgovora kod ljudi. Ovo je naročito tačno za Adenovirus 35 (Ad35). Standardni vektor koji je replikaciono nekompetentan je Adenovirus 5 (Ad5), koji je pokazao određene probleme sa optimizacijom sposobnosti vektora zbog endemskog širenja ovog virusa i činjenice da bitan deo globalne populacije ljudi ima postojeći imunitet na parentalni virus. Ad35 poseduje potencijal da pokaže bolju korsiite kao vektor vakcine. Dotupnost Ad5 i Ad35 konstrukata sa CSP omogućilo je evaluaciju dve sekvencijalne heterologne adenoviralne imunizacije sa različitim konstruktima posebno za pitanje CS imuniteta. ;[0075]Dendritske ćelije (DC) su najnažnije (napotentije) anteigen-prezenutjuće ćelije u telu, i činjenica da Ad5 i Ad35 određeni za čoveka i rezus DC je jedan od apsekta njihove biologije koja ih čini izuzetnim vektorima vakcina. Međutim, samo Ad5 efikasno inficira misiji DC; Ad35 samo pouzdano inficira DC primata. Shodno tome, iako na osnovno pitanje jačine Ad35 konstrukata odgovor se može naći na modelima malih životinja, pitanje stvarne imunogenosti koja uključuje Ad35 može da bude razmatrano samo kod ne-humanih primata. ;[0076]Pronalazači su odlučili da ispitaju kombinacije režima indkovanje/stimulacija RTS,S sa adenoviralnim vektorima koji sadrže CS gen kako bi odredili da li bi anti-malarijski ćelijski i/ili humoralni odgovori bili poboljšanje na odgovore koji su zapaženi kod samog RTS,S. Dodatno, režim za dve doze same vakcine adenovirusa je optimizovan. ;PRIMER;Heterologna vakcinacija indukovanjem/stimulacija, upotrebom rekombinantnih;adenoviralnih vektora i prečišćenih proteina sa adjuvansom kod rezus majmuna.;[0077]Ciljevi eksperimenta su da odredi režim imunizacije sa RTS,S zatim sa Ad35, i Ad35 nakon čega sledi sa RTS,S, u direktnom poređenju sa standardnim režimom imunizacije sa tri dozeRTS.S i standardni režim sa dve doze Ad35. Sekundarni cilj je optimizacija režim sa dve doze adenovirusa. Ispitivani su i serološki i ćelijski imunski odgovori tokom i nakon nekoliko različitih režima ovih konstrukata u kombinaciji. ;[0078]Rezus majmuni( Macaca mulatta)predstavljaju izuzetan model za ispitivanje humanog imunskog odgovora zato što su bližeg filogenetskog porekla. Aleli MHC klase II su posebno dobro konzervirani; stvaranje nekih zajedničkih alela je procenjeno na pre više od 25 miliona godina, prethodi specijaciji čoveka i rezusa. Shodno tome, postoji slična upotreba epitopa u prezentovanju antigena Th ćelijama, što uveliko povećava prediktivnu vrednost modela. Još je važnije to da se model rezus majmuna u prošlosti pokazao kao visoko predikitvan za odgovore imunogenosti za antigene malarije i za HIV kod čoveka, druga bolest čoveka za koju je razvoj vakcine ometan komleksnosti imunskog odgovora. ;[0079] Preliminarni eksperimenti su već izvedeni na miševima sa adenoviralnim-CS konstruktima misije malarijeP. yoelii kojisu pokazali izuzetnu imunogenost i zaštitnu efikasnost (delotvornost). Međutim, duga istorija neuspešnih pokušaja da se direktno ekstrapolira iz mišijeg modela malarije u ljude u traganju za razvojem vakcine za falciparum malarije zahteva intermedijerni korak u ne-humanom modelu primata. Rezus makaki predstavlja najbolji izbor vrsta zbog obimne baze podataka o prethodnim informacijama o ovim vakicnama u ovim vrstama, zbog filogentske bliskosti čoveku, zato što veličina dozvoljava dovoljnu zapreminu uzorka krvi da osigura adekvatnu procenu imunskih odgovora, i zato što su postojeći reagensi i probe već optimizovani u ovim vrstama i shodno tome ne zahteva dodatne protokole i niz godina za razvoj. Dodatno, adenovirus 35 konstrukti mogu da budu testirani kod ne-humanih primata, zbog nemogućnosti ovog virusa da efikasno napadne dendritske ćelije drugih sisara. ;[0080] Konstrukti i proizvodnja rekombinantnih adenovirusa sa defektnom replikacijom koji okupljajuP. falciparumCS kodirajuće gene (Ad5CS i Ad35CS) upotrebljeni u ovom ispitivanju opisani su detaljno u primerima u VVO 2004/055187 (klon 02-659; vidi sliku. 2). Ukratko, ovi adenovektori sadrže heterologne gene koji kodiraju CS protein sa amino kiselinskom sekvencom koja je slična soju CS proteina NF54, 3D7 klon, koji između ostalog ima N-terminalnu signalnu sekvencu, 27 NANP ponavljanja, klaster ponavaljanja 3 NVDP i jedno odvojeno ponavljanje NVDP, univerzalni epitop (Lockver et al. 1989; Zevering et al. 1994; Nardin et al. 2001), i deleciju od najmanje 14 amino kiselina (na C-kraju). Razlika sa proteinom RTS,S je ta što RTS,S nema N-terminalnu signalnu sekvencu, i veli deo ponovljenog regiona, kao i to što je većina C-terminalno lociranih GPI vezanih{ engl. anchor)signalnih sekvenci takođe odsutna u adenoviralnom konstruktu. ;[0081] Eksperiment je randomizovan, slepo i imunogeno ispitivanje različitih kombinacija i vremenskih strategija za optimizaciju režima indukovanje-stimulacija RTS.S sa Ad5 i Ad35 konstrukata sa CS (Ad5CS i Ad35CS) i za optimizaciju samih Ad5CS i Ad35CS. Prethodno najbolji režim sa kojim su poređeni novi režimi su tri intramuskularne doze 50 ug RTS,S sa adjuvansom davane u intervalima 0, 1, i 3 meseca. Ovo je Grupa 1, Pozitivna kontrolna grupa. Sve grupe su date u Tabeli 1A. U svim slučajevima adjuvans je dodat u količini do 50 ug 3D-MPL, 50 ug QS21, u formulaciji sa lipozomima koji sadrže holesterolkao što je opsano u VVO 96/33739. ;[0082]Grupa 2 je primila dve doze RTS,S/Adjuvans,u intervalima 0 i 1 mesec posle jedne doze Ad35CS 3 meseca. Grupa 3 je primila jednu dozu Ad35CS 0 meseca, pa zatim dve doze RTS, SI Adjuvans u periodam 1 i 3 meseca. ;[0083]Grupe 4, 5, i 6 su samo primile adenoviralne konstrukte. Prethodno iskustvo sa dve doze adenovirusnih 5 konstrukata u različitim bolestim da je ukazalo na to da su optimalni serološki i ćelijski imunski odgovori dobijeni kada interval između imunizacija iznosi najmanje 6 meseci. Zbog neophodnosti evaluacije Ad35 konstrukata kod ljudi ili ne-humanih primata, optimalno vreme između doza za ovaj vektor još nije utvrđen. Tako, Grupa 4 je primila dve doze Ad35CS u intervalima 0, 3 meseca (za direktnu kontrolu proteinskih grupa), i Grupa 5 ima dve doze u intervalima 0, 6 meseci. U cilju praćene činjenice da li su dve doze istog adenovirus konstrukta inferiorne na izmene konstrukata za CS protein, Grupa 5 je poređena sa Grupom 6, koja je primala Ad5CS pa zatim Ad35CS u intervalima 0, 6 meseca. ;[0084]Konačno, kontrolna Grupa 7 je primila dve doze običnog (bez umetnutog gena malarije) Ad35 u intervalima od 0 i 3 meseca da bi bila kao kontrolna grupa za imunizaciju za procenu imunogenosti. ;[0085]Mesta injektiranja su zatvorena i vidno obeležena za praćenje reaktogenosti vakcine. Dodatno, životinje su uspavane i mesto injektiranja je direktno ispitivano na znakove induracije, oticanja, toplote, crvenila, ili drugih abnormaliteta na 24, 48, i 72 h i na 7 i 14 dana post injekcije, lako znakovi sistemske toksičnosti nisu očekivani, životinje su uspavane i ispitane u istim vremenskim intervalim na limfadenopatiju, celulitis, hisrurško uklanjanje izraslina, artritis, anoreksiju, i gubitak težine i praćene su promene njihovih hematoloških i kliničkih hemijskih vrednosti. Krv izvađena u vreme injekcije i u intervalima od 24, 48, 72 h i 7 i 14 dana posle svake injekcije za hematološku analizu (CBC) i za panel kliničkih hemijskih proba koje su uključene (ali ne i ograničene na) određivanje BUN, kreatinina, AST, ALT, GGT, i CK. Za naknadno testiranje adenovirusa uzeti su uzroci stolice i ostavljeni na -70°C svakog dana tokom Dana 0-10 da bi se potvrdilo odsustvo prenošenja ne-replikativnih vektora za svaku injekciju adenovirusa. ;[0086]1-3 ml seruma je sakupljeno u intervalima od 1, 2, i 4 nedelje posle svake injekcije, i nakon toga bar jednom mesečno da bi se odredila priroda i magnituda imuskih odgovora na CS R32 (ponovljen region CS proteina je upotrebljen za razvoj standardizovanog ELISA testa na CS protein, videti niže) pomoću ELISA. Uzorci seruma su čuvani na -70°C do upotrebe, i uzorci su procesuirani u grupi pred kraj ekspreimenta da bi se varijavilnost unutar probe sveo na minimum. Zapremine sakupljenog seruma su adekvatne tako da svaka injekcija adenovirusa, 0.5-1.0 ml seruma iz dana 0, 1, 7 i 14, i najmanje svake 4 nedelja posle toga se mogu upotrebiti za određivanje titra anti-adenovirus antitela. Velike zapremine (20-40 ml) EDTA- ili heparin-anti-koagulisane krvi su sakupljene za sakupljanje ćelija pre prve imunizacije, 4 nedelje posle druge imunizacije (ukoliko dozvoljava potrebna količina), 4 nedelj posle treće imunizacije, i 6 meseci posle treće imunizacije. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su koncentrovane iz ovih uzoraka prema standardnim metodama razdvajanja gradijentom gustine u centrifugi, lako ćelijski prinosi mogu da variraju od životinje do životinje, generalno što je veća zapremina uzoraka, veći je broj regenerisanih ćelija. Zato što je nemoguće predvideti tačnu obnovu ćelije, poželjno je predvideti veći uzorak gde je moguće tako da je dobijeno dovoljno ćelija za ponavaljnje testa za potrebe statističke ispravnosti. Ćelij su zamrznute kako bi se dozvolilo procesuiranje partije u kasnijem vremenskom momentu i shodno tome poboljša kontrola kvaliteta. Ćelije su zamrznute u autolognom serumu sa 10% DMSO na kontrolisanoj temperaturi i ostavljene da stoje u pari tečnog azota najmanje nedelju dana pre upotrebe. ;[0087]Od većih životinja kod kojih su podaci o CBC ukazali da će biti dobro tolerisani, uzeti su dodatni uzorci za sakupljanje ćelija posle indukovanja, ali pre stimulacije. Budući da je 14 majmuna (dve grupe) koje su primile dve doze RTS,S/Adjuvans i 14 majmuna je primilo jednu dozu Ad35CS pre osme nedelje, očekivano je da se uzorkuje bar i shodno tome održi statistički značaj. Sakupljanje ćelija će se izvršiti ne pre nego što prođe 4 nedelje od injekcije. Budući da su grupe samo sa adenovirus konstruktima primile samo dve injekcije, i shodno tome ima manje zahtevan raspored ispuštanja krvi nego majmuni koji su primili tri injekcije, očekuje se da sakupljanje ćelija između dve injekcije ne uzrokuje tegobe. ;[0088]Analize imunskih odgovora ćelije uključuju kratkotrajni ELISPOT test za kvatifikaciju antigen-specifičnih ćelija koje proizvode IFN-y. Analiza protočnom citometrijom antigen-stimulisanih ćelija ne može samo da potvrdi samo podatke sakupljene u ELISPOT testocima, ali obezbeđuje dodatne informacije o fenotipu antigen-specifičnih ćelija koje odgovaraju. Shodno tome, takđe je izvršeno određivanje antigen-specifičnih CD8+ podskup koji sekretuje IFN-v intracelularnim bojenjem i tečnom citometrijom. ;[0089]Dodatni testovi koji su izvedeni uključuju ELISpot analizu za dodatne citokine, intracelularno obeležavanje podseta T ćelije brojanja dodatnih citokina, ostali testovi bazirani na protočnoj citometriji za kvantifikaciju proizvodnje podseta antigen-specifičnih T ćelija, i kvantitativni RT-PCR za korelaciju sa drugim metodama. ;[0090]Majmuni su podeljeni u dve grupe pojednako uklopljeni po starosti, polu, težini i geografskom poreklu, i grupe su zatim randomiovane. Sva određivanja vezana za kliničke procene i krajnje tačke bezbednosti su određena bez znanja o grupi zadataka na majmunima. Slično, svi imunološki testovi su izvedeni bez prethodnog znanja grupa kojima pripadaju individualni uzroci. Izuzetak ovomšlepompristupu čine životinje koje su primile imunizaciju 0 i 6 meseca što je suprotno 0, 1, i 3; međutim ovoslepotestiranje je održavano u pogledu davanja specifične injekcije. ;[0091]Veličina grupe od sedam životinja po test grupi (i četiri u kontrolnoj grupi) je idalan da minimizira veličinu grupe ali i da se tačno odrede razike između grupa, na osnovu prethodnih rezlutata dobijenih prema sličnim, ali daleko povezanim eksperimentima. ;[0092]Geometrijska sredina rezultata ELISA testova je poređena parametrijski standardnim analizama kao što je Student-ov t-test, pretpostavljajući jednake varijanse i dva smera, i ANOVA. Rezultati ELISPOT testova, izraženi kao broj tačaka po 200,000 ćelija, su slično obrađeni i takođe su ispitani neparametrijskim analizama koa što je Kruskal-VVallis -ov test. Gde su potrebna poređenja unutar grupe, primenjen je Student-ov t-test, na sirovim ili logaritamski transformisanim podacima, kako bi se odredile razlike između parova grupa. ;[0093]Pre injekcije, dlaka je ošišana i koža očišćena sa 70% alkoholom, i na koži je neizbrisivim markerom nacrtan kug prečnika 2.5-3 cm kako bi se naznačilo mesto injektiranja za nakandnu procenu palapcije i reaktogenosti. Injekcije RTS.S su pomešane sa adjuvansom neposredno pre ulaska u prostoriju sa majmunima. Krajnja zapremina iznosi 0.5 ml i distribuirana je kroz igle veličine 25-29 u unutrašnji bedreni mišić. Adenovirus konstrukti su pripremljeni kao što je opisano (VVO 2004/055187) u puferovanom rastvoru soli i takođe su administrirani u isto intramuskularno mesto u krajnjojj zapremini od 0.5 ml. ;[0094]Primarni biouzorak je krv, bilo za serum ili ćelije. Raspored ispuštanja krvi je dat u Tabeli 1B. Hematološki status životinja je praćen; ukazujući na kapacitet pojedinca da održava ponovljeno biouzorkovanje ili označavanje da je planiran raspored biouzorkovanja redukovan. Svaki put kada se uzme uzorak krvi, urađna je hematološka analiza krvi (CBC) na instrumentuCoulter automated blood cell counter(kojem je potrebnan uzorak od < 50 ul nekoagulisane krvi). Proizvođač preporučuje smernice slične GLP -u za rukovanje i održavanje po potrebi. Hematokrit, hemoglobin, srednja korpuskularna zapremina (MCV), broj crvenih krvnih zrnaca (RBC), i procenat retikulocita je pažljivo praćen kako bi se osiguralno to da životinje ne postanu anemične. ;[0095]Venska krv je sakupljena iz femoralne vene, vene safene, ili cefalične (glavene) vene pomoću igala veličina 20-24 i špriceva ili vakuum epruveta. Generalno preferentne su vene safene ili cefaličnae vene za uzimanje uzoraka krvi od 10 ml ili manje, a femoralne vene su poželjne za izbegavanje hemolize i skraćeno ukupno vreme punktiranja vene kada je zapremina veća od 10 ml. ;[0096]Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su sakupljene od životinja pre imunizacije, dve nedelja posle poslednje imunizacije, i tri meseca posle poslednje imunizacije. U ovom protokulu, PBMC su odvojene standardnim metodama centrifugacije u gradijentu gustine, i kriokonzervirane u 45% autolognom serumu (45% fiziološki rastvor i 10% DMSO). Ukratko, cela krv je naneta na medijum za razdvajanje ćelijaLymphoprep<®>( Axis- Shield, Oslo, Norway) ficoll- hypaque cell separation mediumi centrifugirana na 650g u trajanju od 20 min. Ćelijski sloj je uklonjen i ispran dva puta sa dPBS (BioVVhittaker, VValkersville, MD), na 400g tokom 15 min. Ćelije sposobne za život su izbrojane pomoću Coulter ACT*10 hemocitometra. Pločice su resuspendovan do 1x10<7>/ml u 50% dPBS, 50% fiziološkom rastvoru. DMSO je dodat u kapima do konačne zapremine od 10%. Ćelije su zamrznute u alikvotima od 0.55 ml ili tačno 5 miliona ćelija svaka ostavljena preko noći u izopropanoloskom kupatilu sa kontrolisanom temperaturom u hladnjaku na -70°C, i uskladišteno u pari tečnog azota do upotrebe.

[0097]Posle poslednje vakcinacije, identifikovane su interferon gama (IFN-y) sekretuzjuće T ćelije u uzorcima krvi iz različitih majmuna , pomoću enzim-vezanog imunospot (ELISpot) testa posle stimulaacije celih antigena i C- i N-terminalnim specifičnim peptidnimpulovima ( engl. pool)(kao što je detaljno opisano u daljem tekstu). Rezultati su dati na slici 1 (2 nedelje posle poslednje vakcinacije) i slici 2 (3 meseca posle poslednje vakcinacije), i dati u tabeli 2 i 4, kao jedinica procečnog formiranja mrlje (tačke) po milion ćelija (SFU); statističko poređenje je urađeno analizom varijanse

(ANOVA) na logaritmovanim podacima. Poređene su sve grupe. U slučaju da je određen statistički značaj može se uraditi post-hok analiza za međusobno poređenje grupa {rezultati nisu prikazani).

[0098]Za poređenje ELISpot rezultata između različitih režima tratiranja, odnos titara geometrijske srednje vrednosi je izračunat za režime sa Ad35 kao tretman indukovanja, U ovim odnosima, geometrijska srednja vrednost (geometrijska sredina) titra dobijenog tretiranjem sa samim RTS.S (u interavilma 0, 2, 3 meseca) je uzeta kao referentna vrednost (referentni tretman) (slike 5 i 6, i table a10). Slično, odnosi su izračunati za režime sa Ad35 kao stimulativni tretman (slika 7 i 8, i tabela 11).

[0099]Slične analize su urađene za rezultate N terminus-specifične stimulacije T ćelija ELISpots. Rezultati su dati na slikama 9 i 10, i u tabelama 12 i 14. Na kraju, odnosi su izračunati i predstavljeni na slici 11 (režimi indukovanja Ad35) i na slici 12 (režimi stimulacije Ad35), i tabelama 16 i 17.

[0100]Test ELISpots je izvršen na otopljenim kriokonzerviranim PBMC -ovim na pločama sa PVDF dnom MultiScreen-IP ELISpot (Millipore, Bedford, MA) prema standardnoj metodologiji. Sterilne tehnike su striktno primenjivane dok jedinične ćelije nisu uklonjene na Dan 2 za konračni razvoj mrlja (tačaka).

[0101]Upotrebljen medijum: kompletni medijum (cRPMI) je sveže pripremljen od RPMI-1640 (BioVVhittaker, VValkersvile, MD) uz dodatak 1:100 penicilin/streptomicina, 1:100 L-glutamina, 1:200 NaHC03(Sigma, St. Louis, MO), 1:100 Ne-Esencijalne amino kiseline, 1:100 Piruvata, i 1:300 2-ME (Gibco). Goveđeg fetalnog seruma (FCS, HvCIone, Logan, UT), od serije koja je prethodno okrakterisana probom nespecifilne proliferacije u cilju podržavanja dobar rast ćelija majuna pri čemu se dobija neznatan stimulatorni šum, dodato do 10% krajnje zapremine za cRPMI-10, 20% za cRPMI-20, itd. Media-Plus (M+) je dodatno dopunjen sa anti-majmunskim CD28 i anti-majmunskim CD49D antitelima kao 1:500 (BD Pharmingen, San Jose, CA).

[0102]Sledeći stimulanti su pripremljeni sveži u dvostrukoj koncentraciji od krajnje koncentracije u M+ bez dodatog seruma: Con A: Concanavalin A (Sigma) kao 2.5 ug/ml (krajnja 1.25 ug/ml) kao pozitivna kondrola za sve amuple. CS- C:pul ( engl. pool)od 15-mer polipeptida, koje preklapa 11 amino kiselina, pokrivajući C-terminalni deo PfCS molekula (isporučuje GSK, Rixensart, Belgium) u koncentraciji od 2.5 ug/ml svakog peptida (krajnja 1.35 ug/ml).

CS- N: sličan pul od 15mer peptida, koje preklapa 11, pokrivajući N-terminus PfCS molekula

RTS. S: prečišćen kompleks celog proteina RTS,S antigen pogodan za ćelijsku kulturu (GSK) u konc. od 2 ug/ml (krajnja 1 ug/ml).

HEF: prečišćen ceo protein Hepatitis B površinsk antigen (HbS) ("S" komponenta RTS.S), takođe pogodan za ćelijsku kulturu (GSK) u kon. od 23.2 ug/ml (krajnja 11.6 ug/ml). HbS- P: pul HbS 15mer peptida (GSK) u konc. 2.5 ug/ml svakog peptida (krajnja 1.25 ug/ml).

Negativna kontrola je M+ nije dodatno dopunjena.

[0103]Ploče su pripremljene na sledeći način. Ploče su obložene sa 50 ul/well u razblaženju od 1:100 u sterilnom dPBS primarnog monoklonalnog anti-majmunskog IFN-Yantitela (UcvTech #21-43-09, Utrecht, the Netherlands), i inkubirane u plastičnoj kesi na 4°C u trajanju od 5-6 h. 1 h pre upotrebe, antitelo za oblaganje je uklonjeno i ploče su blokirane sa cRPMI-10 na 37°C, 5% C02u inkubatoru za gajenje ćelijskih kultura sa kontrolisanom vlažnošću. Neposredno pre upotrebe, medijum za blokiranje je uklonjen.

[0104]Otapanje criokonzerivanih PBMC: Zamrznute ampule su kružnim pokretima promešane u toploj vodi (37-40°C do otapnja i količina od 0.55 ml je odmah prebačena u 8 ml RPMI-20. Ćelije su isprane na 350g tokom 13 min, i pelete su pažljivo resuspendovane u 2.0 ml cRPMI-20. Sterilni alikvoti od 40 ul su zatim uklonjeni kako bi se potvrdio broj ćelija sposobnih za život, i zapremina je podešena po potrebi za dobijanje suspenzije jedne ćelije od 2x10<6>ćelija/ml.

[0105]Prestimulacija: jednake zapremine suspenzija ćelija cRPMI-20 i stimulanti u M+ su pomešani u polipropilenskium epruvetama za ćelijsku kulturu pri čemu se dobija željena koncentracija svih reagenasa. Ćelije su zatim ostavljene u inkubatoru u trajanju od bar 5 h, polupokloplenje i nagnute kako bi se omogućila razmena gasova.

[0106]Poslednja stimulacija: Posle 5-6 h inkubacije, ćelije su centrifugirane na 400g tokom 10 min i supernatanti su bačeni. Ćelije su zatim odmah resuspendovane u pola cRPMI-20 i pola stimulanta. Vraćene su nazad u inkubator na 10-20 min da bi se omogućila stablizacija pH. Zatim su ćelije brzo promešane i pažljivo je pipetrino 200 ul (200,000 ćelija ) u odgovarajuća ležišta na blokiranim i ispražnjenim pločama . Tokom svih faza vodilo se računa o tome da ležišta ne budu suva. Ploče su zatim inkubirane preko noći (> 16 h).

[0107]Razvoj mrlja (tačaka): pripremljeno je razblaženje od 1:100 sekundarnog poliklonalnog anti-majmunskog-!FN-Yantitela (UCvTech) u dPBS u sa 2% FCS. Ćelije i medijum su zatim brzim pokretima uklonjeni sa ploče ; ležišta su isprana 8 puta sa dPBS-0.5% Tween 20 (Sigma), i dodato je 50 ul razblaženog sekundarnog antitela. Ploče su inkubirane na pokretnom panelu tokom 3 h na sobnoj temperaturi u plastičnoj vreći. Ploče su ponovo isprane 8 puta sa dPBS-0.5% Tween 20 i nanete u konc. 50 ul/ležištu sa konjugatom Streptavidin-Alkaline Fosfataza (Southern Biotech #7100-04, Birmingham, AL) u razblaženju od 1:1000. Ploče su zatim inkubirane još 2 h na sobnoj temperaturu u plastičnoj vreći na pokretnom panelu. Konačno, ploče su isprane 8 puta kao što je prethodno opisano, pa su zatim isprane destilovanom vodom i dodato je 100 pl/ležištu hromogenog substrata NBT-BCIP (Pierce Biotech, Rockford, IL). Ostavljeno je 10-20 min da se boja razvije, sve dok pozatine ne postane tamna. Ploče su zatim isprane sa bar dve porcije od 300 ul destilovane water, i osušene na vazduhu preko noći pre očitavanja.

[0108]Očitavanja ploča: Ploče sup očitane na čitaču AID ELHR01 Elispot pomoću AID ELISpot Reader v3.1.1. Sva ležišta su vizuelno pregledana, i neodgovarajuće tačke (gaza ili drugi ostaci) su ručno odstranjene. Podaci su sačuvanu u Excel tabeli. Vrednosti za duplikat ili triplikat ležišta su uprosečene, i ovaj broj je pomnožen sa 5 pri čemu se dobijaju krajnji sirovi podaci u mrlja/million ćelija.

[0109]Kontrola kvaliteta: prosečna regeneracija viabilnih ćelija posle zamrzavanja/otapanja prelazi 95%. Testovi su ponovljeni ukloliko je prosečni medijum

kontrolnih ležišta veći od 20 mrlja/milionu, ili ako ležišta sa ConA iznose manje od 500 mrlja/milionu. Takođe, ukupni CD4+ and CD8+ viabilnost, kao što je procenjeno pomoću prosečne citometrije sa 7-AAD izuuzimanjem boje i površinskim bojenjem, sve je moralo da bude veće od 90% ili je test ponovljen (podaci nisu dati).

Table 4. Imunitet Č-terminalne -specifična IFN-y T ćelije tri meseca posle stimulacije: srednja vrednost i geometrijska sredina ELISpot (u SFU/milion ćelija) i ANOVA poređenje. Dati su razliučiti režimi indukovanje/stimulacija (levo).

REFERENCE CITIRANE U OPISU

Ovaj spisak referenci koje citira Prijavilac je samo za čitaoca. On ne predstavlja deo ovog

Evropskog patenta, lako su reference prikupljene s velikom pažnjom, nemoguće je isključiti

greške ili propuste, te se EPO ograđuje od svake odgovornosti u tom pogledu.

Patentna dokumentacija citiranauopisu

•WO9639178Ar00121 • VVO0102607A F00121 • WO0222080A f00121 • US6733993B [ 00121 •WO0070071Af00131f00601[ 00631fOO641 •VVO0240665Af0013l[ 00601 r00631TOP641 • WO2004037294A [ 00131 • WO2004083418A f00131 • US6306625B [ 00151 • WO9310152A f00151 f00371 • WO2004055187A [ 00171 [ 00461 [ 00801 F00931 •US6083716Ar00441 • WO03046124Af00441 • GB2122204B f00531 • US6005099A f00531 •EP0729473B1r00531• EP0549074B1 r00531 •EP0689454Af00531r00571 • US5057540A f00541 f00541 • EP0362279B1 rOQ541 f00541 •WO9910008A100541• VV09633739A [ 00541 f00571 r00581 fOO 581£00591IMS11 • WO9611711Af00541 • VVO9602555A f00551 • EP0468520A f00551 • VVO960255568A f00561 • VV09816247A f00561 •WO9517210Af00571[ 00571 r00581 [ 00 58J • VV09815287A [ 00571 • VVO9400153A [ 00581 [ 00581 r00581 • VV 09856414A r00581 •WO9805355Ar00581 • VV09912565A r00581 • WQ9911241A [ 00581 • WO 970 0326A[ 00631• WO0105945Ar00631 • WO0107571A [ 00631 • VV09955132A [ 00631 • VVO0003029A[ 00641• VVO0224730A[ 00641•VVO03104467A [ 00661• WO2004001032A[ 00661

Nepatentna litratura navedena u opisu

• Stoute et al.The Journal of Infectious

Disease, 1998, vol. 178,1139-44 [ 00161

• Garcon etal.Expert Review of Vaccines, 2003, vol. 2, 2231-238[ 00161• Bruna-Romero O et al.Complete, long-lasting protection against malaria of mice primed and boosted with two distinct viral vectors expressing the same plasmodial antigenProc Natl Acad Sci USA, 2001, vol.98.11491-11496 [ 01101•Caspers P etal.The circumsporozoite protein gene from NF54, a Plasmodium falciparum isolate used in malaria vaccine trialsMol Biochem Parasitol, 1989, vol. 35,185-189 [ 01101• Clyde DF etal.lmmunization of men against sporozoite-induced falciparum malariaAm J Med Sci, 1973, vol. 266,169-177 [ 01101• DeJong JC et al.Adenoviruses from human immunodeficiencv virus-infected individuals. including two strains that represent new candidate serotvpes Ad50 and Ad51 of species B1 and D, respectivelvJ Clin Microbiol, 1999. vol. 37, 3940-3945[ 01101•Doolan DLetal.DMA vaccination as an approach to malaria control: current status and strategiesCurr Topic Microbiol Immunol,1998, vol. 226, 37-56r0110l• Estcourt MJ etal.Prime-boost immunization generates a high frequency, high-avidity CD8+ cytotoxic T lymphocyte populationlnt Immunol, 2002, vol. 14, 31-37 [ 01101•Gandon Setal.lmperfect vaccines and the evolution of pathogen virulenceNature, 2001,vol. 414, 751-756 £01101•GordonDMet al.Safety, immunogenicity, and efficacy of a recombinantly produced Plasmodium falciparum circumsporozoite protein-hepatitis B surface antigen subunit vaccineJ Infect Dis, 1995, vol. 171,1576-1585101101• Hoffmann SLDoolanDLMalaria vaccines-targeting infected hepatocvtesNature Med, 2000, vol. 6,1218-1219[ 01101• Horn NA etal.Cancer Gene Therapy using plasmid DNA: purification of DNA for human clinical trialsHuman Gene Therapy, vol. 6, 565-573[ 01101• Kester KE etal.RTS.S Malaria Vaccine Evaluation Group. Efficacy of recombinant circumsporozoite protein vaccine regimens against experimental Plasmodium falciparum malariaJ Infect Dis, 2001, vol. 183, 640-647 101101• Kurtis JD etal.Pre-erythrocytic immunity to Plasmodium falciparum: the case for an LSA-1 vaccineTrends in Parasitology, 2001, vol. 17,219-223101101•LalvaniAet al.Potent induction of focused Thl-type cellular and humoral immune responses by RTS.S/SBAS2, a recombinant Plasmodium falciparum malaria vaccineJ Infect dis, 1999, vol. 180, 1656-1664 f0110l •Lockver MJ etal.VVild isolates of Plasmodium falciparum show extensive polymorphism in T cell epitopes of the circumsporozoite proteinMol Biochem Parasitol, 1989, vol. 37, 275-280 [ 01101• Luke TCHoffmanSLRationale and plans for developing a non-replicating, metabolically active. radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoite vaccineJ Exp Biol, 2003, vol. 206, 3803-3808fOHOl• Nardin EH et al.Atotally synthetic polyoxime malaria vaccine containing Plasmodium falciparum B cell and universal T cell epitopes elicits immune responses in volunteers of diverse HLAtypesJ Immunol, 2001, vol. 166, 481-489[ 01101• Mosmann TRCoffmanRL.TH! And TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional propertiesAnn Rev of Immunol, 1989, vol. 7,145-173101101• Musti AM etal.Transcriptional mapping of two yeast genes coding for glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase isolated by sequence homology with the chicken geneGene, 1983, vol. 25,133-143[ 01101• Narum DL etal.Codon optimization of gene fragments encoding Plasmodium falciparum merzoite proteins enhances DNA vaccine protein expression and immunogenicity in micelnfectand Immun, 2001, vol. 69, 7250-7253 [ 01101• Nussenzvveig RS etal.Protective immunity produced by the injection of X-irradiated sporozoites of Plasmodium bergheiNature, 1967, vol. 216, 160-162 [ 01101• Romero P etal.Cloned cytotoxic T cells recognize an epitope in the circumsporozoite protein and protect against malariaNature, 1989, vol. 341, 323-326fOHOl•Stoute JA et al.Aprelimtnary evaluation of a recombinant circumsporozoite protein vaccine against Plasmodium falciparum malariaN Eng J Med, 1997, vol. 336, 86-91 [ 01101• Stoute JA etal.Long-term efficacy and immune responses following immunization with the RTS,S malaria vaccineJ Infect Dis, 1998, vol. 178, 1139-1144( 01101 •SunPF et al.Protective immunity induced with malaria vaccine, RTS.S, is linked to Plasmodium falciparum circumsporozoite protein-specific CD4{+) and CD8(+) T cells producing IFN-gammaJ Immunol. 2003, vol. 171,6961-6967[01101•Valenzuela P etal.Nucleotide sequence of the gene coding for the major protein of

hepatitis B virus surface antigenNature, 1979, vol. 280, 815-819£01101•Vogels R etal.Replication-deficient human adenovirus type 35 vectors for gene transfer and vaccination: efficient human cell interaction and bvpass of pre-existing adenovirus immunityJ Virol, 2003, vol. 77,8263- f01101•Wang R etal.lnduction of CD4+ T cell-dependent CD8+ type 1 responses in humans by a malaria DNA vaccineProc Natl Acad Sci USA, 2001, vol. 98,10817-10822101101•Zevering Y etal.Effect of polvmorphism of sporozoite antigens on T-cell activationRes Immunol, 1994, vol. 145, 469-476[0110]

Claims (20)

1. Komplet koji sadrži: - rekombinantni adenovirus sa defektnom replikacijom u farmaceutski prihvatljivom ekspijensu, koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS iz parazita koji izaziva malariju; i - proteinski antigen sa adjuvansom; pri čemu je rekombinantni adenovirus odabran iz grupe koju čine adenovirus čoveka seroptipa 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 i 50, i gde je rekombinantni adenovirus sa defektnom replikacijom kompozicija za indukovanje, a proteinski antigen sa adjuvansom je kompozicija za stimulaciju.

2. Komplet prema zahtevu 1, naznačen time, što rekombinantni adenovirus je adenovirus čoveka serotipa 35.

3. Komplet prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što proteinski antigen sadrži CS protein, ili njegov imunogenski fragment, iz parazita koji izaziva malariju.

4. Komplet prema zahtevu 3, naznačen time, što proteinski antigen sadrži hibridni protein iz CS proteina ili njegov imunogenski fragment spregnut za površinu antigena iz hepatitis B virusa (HBsAg), u obliku lipoproteinskih čestica sa HBsAg.

5. Komplet prema zahtevu 4, naznačen time, što proteinski antigen sadrži RTS,S.

6. Komplet prema jednom od zahteva 1-5, naznačen time, što je proteinski antigen sa adjuvansom with an adjuvant comprising QS21 and 3D-MPL.

7. Komplet prema zahtevu 6, naznačen time, što adjuvans sadrži i lipozome koji sadrže holesterol.

8. Komplet prema jednom od zahteva 1-7, naznačen time, što parazit koji izazvia malariju jePlasmodium falciparum.

9. Komplet prema jednom od zahteva 1-8, naznačen time, što heterologna nukelinska kiselina je optimizovana kodonom za povećamu proizvodnju kodiranpg proteina kod sisara, poželjno čoveka.

10.Komplet prema jednom od zahteva 1-9, naznačen time, što rekombinantni adenovirus je prisutan u smeši sa adjuvansom.

11.Komplet koji se sastoji od : - rekombinantnog adenovirusa majmuna, psa ili goveda, sa defektnom replikacijomu farmaceutski prihvatljivom eksipijensu, pri čemu dati adenovirus sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira kodon-optimizovan antigen circumsporozoite (CS) izPlasmodium falciparum;i - proteinski antigen sa adjuvansom sa RTS.S; pri čemu rekombinantni adenovirus sa defektnom replikacijom je kompozicija za indukciju, a dati proteinski antigen sa adjuvansom je kompozicija za stimulaciju.

12.Komplet prema zahtevu 11, naznačen time, što adjuvans u proteinskom antigenu sa adjuvansom, obuhvata QS21 i 3D-MPL.

13.Komplet prema zahtevu 12, naznačen time, što adjuvans sadrži još i lipozome sa holesterolom.

14.Upotreba rekombinantnog adenovirusa sa defektnom replikacijom koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen CS iz parazita koji izaziva malariju, i proteinski antigen sa adjuvansom u proizvodnju leka za lečenje ili prevenciju malarije, pri čemu je rekombinantni adenovirus, adenovirus majmuna, psa ili goveda , serotipa 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 ili 50, i gde dati rekombinantni adenovirus sa defektnom replikacijom je upotrebljen kao kompozicija za indukovanje, a proteinski antigen sa adjuvansom je uptorebljen kao kompozicija za stimulaciju.

15.Upotreba prema zahtevu 14, gde proteinski antigen sa adjuvansom sadrži CS protein, ili njegov imunogenski fragment, iz parazita koji izaziva malariju.

16.Upotreba prema zahtevu 14 ili 15, gde parazit koji izaziva malariju jePlasmodium falciparum.

17.Upotreba prema jednom od zahteva 14-16, gde proteinski antigen sadrži hibridni protein iz CS proteina ili njegov imunogenski fragment spregnut za antigen na površini hepatitis B virusa (HBsAg), u obliku čestica sa HBsAg.

18.Upotreba prema zahtevu 17, gde proteinski antigen sa adjuvansom sadrži RTS,S.

19.Upotreba prema jednom od zahteva 14-18, gde proteinski antigen je sa sledećeim adjuvansom: QS21 i 3D-MPL.

20.Upotreba prema jednom od zahteva 14-19, gde je heterologona nukleinska kiselina optimizovana kodonom za povećanu proizvodnju kodirajućeg preoteina kod sisara, poželjno čoveka.