RS52304B - Supstituisani indolil alkil amino derivati kao novi inhibitori histon deacetilaze - Google Patents

Abstract

Jedinjenje formule (I),njegove N-oksid forme, njegove farmaceutski prihvatljive adicijske soli i njegove stereohemijske izomerne forme, naznačeno time dasvaki n je ceo broj s vrednošću 0, 1 ili 2 i kada je n jednako 0 onda je moguća diretna veza;svaki m je ceo broj s vrednošću 1 ili 2;svaki X je neovisno N ili CH;svaki Y je neovisno O, S, ili NR4; gdesvaki R4 je vodonik, C1-6alkil, C1-6alkiloksiC1-6alkil, C3-6cikloalkil,C3-6cikloalkilmetil, fenil-C1-6alkil, -C(=O)-CHR5R6 ili -S(=O)2-N(CH3)2; gde svaki R5i R6 je neovisno vodonik, amino, C1-6alkil ili aminoC1-6alkil; ikada je Y jednako NR4 i R2 je na 7-poziciji indolila onda R2 i R4 zajedno mogu da formiraju dvovaljani radikal-(CH2)2- (a-1), ili-(CH2)3- (a-2);R1 je vodonik, C1-6alkil, hidroksi C1-6alkil, C1-6alkilsulfonil, C1-6alkilkarbonil ili mono- ili di(C1-6alkil)aminosulfonil;R2 je vodonik, hidroksi, amino, halo, C1-6alkil, cijano, C2-6alkenil, polihaloC1-6alkil, nitro, fenil, C1-6alkilkarbonil, hidroksikarbonil, C1-6alkilkarbonilamino, C1-6alkiloksi, ili mono- ili di(C1-6alkil)amino;R3 je vodonik, C1-6alkil, ili C1-6alkiloksi; ikada su R2 i R3 na susednim atomima ugljenika, oba mogu da formiraju dvovaljani radikal -O-CH2-O-.Prijava sadrži još 11 patentnih zahteva.

Description

OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak bavi se jedinjenjima koja mogu da inhibiraju enzimsku aktivnost histon deacetilaze (HDAC). On se nadalje odnosi na procese za njihovo priređivanje, na smeše koje ih sadrže, kao i na njihovu upotrebu, iin vitroiin vivo,da inhibiraju HDAC te kao lek, na primer kao lek koji vrši inhibiranje proliferacijskih uslova, kao što su karcinom i psorijaza.

Nuklearni histoni su poznati kao integralne i dinamičke komponente mašinerije koja je odgovorna za regulisanje genske transkripcije i drugih DNA-šablonskih procesa za replikaciju, obnavljanje, rekombinaciju i hromosomsku segregaciju, Oni su subjekt post-translacijskih modifikacija uključujući acetilaciju, fosforilaciju, metilaciju, ubikvitinaciju i ADP-ribosilaciju.

Histon deacetilaza(deacetilaze), koje se ovdje navode kao "HDAC-ovi", su enzimi koji kataliziraju uklanjanje acetil modifikacije na lizinskoj rezidui proteina, uključujući nukleosomske histonske jezgre H2A, H2B, H3 i H4. Zajedno s histon acetiltransferazom(transferazama), koje se ovdje navode kao "HAT-ovi", HDAC-ovi regulišu nivo acetilacije histona. Ravnoteža acetilacije nukleosomskih histona igra značajnu ulogu u transkripciji mnogih gena. Hipoacetilacija histona povezana je sa strukturom kondenzovanog hromatina što rezultira represijom transkripcije gena, dok su acetilirani histoni povezani s otvorenijom strukturom hromatina i aktivacijom transkripcije.

Jedanaest strukturno srodnih HDAC-oca je opisano i podeljeno u dve klase. Klasa I HDAC-ova sastoji se od 1, 2, 3, 8 i 11, dok se klasa II HDAC-ova sastoji od HDAC 4,5, 6, 7,9 i 10. Članovi treće klase HDAC-ova nisu strukturno srodni klasi I i klasi II HDAC-

ova. Klasa I/II HDAC-ova deluje cink-ovisnim mehanizmom, dok je klasa III HDAC-ova NAD-ovisna.

Uz histone, drugi proteini također su bili supstrati za acetilaciju, osobito faktori

transkripcije kao što su p53, GATA-1 i E2F; nuklearni receptori kao što je glukokortiokoidni receptor, receptori štitaste žlezde, estrogen receptori; te proteini koji regulišu ćelijski ciklus kao što je pRb. Acetilacija proteina bila je povezana sa

stabilizacijom proteina, kao što je p53 stabilizacija, regrutovanjem kofaktora i povećanim vezanjem DNA. p53 je tumorski supresor koji može uzrokovati zastoj ćelijskog ciklusa ili apoptozu kao odgovor na različite stres signale, kao što je oštećenje DNA. Glavna meta za p53-izazvani zastoj ćelijskog ciklusa čini se daje p21 gen. Sledeći do njegove aktivacije pomoću p53, p21 bio je identifikovan zbog svoje povezanosti s ciklin/ciklin-ovisnim kinaza kompleksima što rezultira zastojom ćelijskog ciklusa na Gl i G2 fazama, njegovom dogradnjom tokom starenja, te njegovom interakcijom s proliferacijskim ćelijskim nuklearnim antigenom.

Proučavanje inhibitora HDAC-ova pokazuje da oni imaju značajnu ulogu u zastoju ćelijskog ciklusa, diferenciranju ćelija, apoptozi i obrtanju transformisanih fenotipova.

Inhibitor trihostatin A (TSA), na primer, izaziva zastoj ćelijskog ciklusa na Gl i G2 fazama, obrće transformisani fenotip različitih ćelijskih linija, te izaziva diferenciranje Friend-ovih ćelija leukemije i drugih. Za TSA (i suberoilanilid hidroksamsku kiselinu SAHA) je publikovano da inhibira rast ćelija, izaziva terminalrio diferenciranje, te sprečava formiranje tumora u miševa (Finnin et al., Nature, 401: 188-193, 1999);,

Trihostatin A također je naveden kao koristan u tretiranju fibroze, npr. fibroze džigerice i ciroze džigerice. (Geerts et al., Europska patentna prijava EP 0 827 742, publikovana 11. marta 1998).

Farmakofor za HDAC inhibitore sastoji se od metal-vezujuće domene, koja je u interakciji s aktivnim mestom HDAC-ova koje sadrži cink, linker domenu, te površinsku domenu prepoznavanja ili region prepoznavanja, koji je u interakciji s reziduama na rubu aktivnog mesta.

Za inhibitore HDAC-ova također je navedeno da izazivaju ekspresiju p21 gena. Transkripcijsko aktiviranje p21 gena pomoću ovih inhibitora je potaknuto remodeliranjem hromatina, nakon čega sledi acetilacija histona H3 i H4 u p21 promotor regionu. Ova aktivacija p21 dešava se na p53-neovisni način i tako su HDAC inhibitori operatfvni u ćelijama s mutiranim p53 genima, što je oznaka brojnih tumora.

Nadalje, HDAC inhibitori mogu da poseduju indirektna dejstva kao stoje pojačavanje domaćin imunog odgovora i inhibicija tumorske angiogeneze pa tako može da vrši supresiju rasta primarnog tumora i ometa metastaze (Mai et al., Medicinal Research Reviews, 25: 261-309).

U svetlu gore navedenog, HDAC inhibitori mogu da poseduju veliki potencijal u tretiranju ćelija proliferacijskih bolesti ili stanja, uključujući tumore s mutiranim p53 genima.

Patentna prijava EP1472216 koja je publikovana 14. avgusta 2003, godine opisuje bicikličke hidroksamate kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijave EP1485099 , EP1485348 , EP1485353 , EP1485354 , EP1485364 , EP1485365 , EP1485370 , EP1485378 koje su publikovane 18. septembra 2003. godine, između ostalog, opisuju supstituisane piperazinilpirimidinil hidroksamske kiseline kao inhibitore histon deacetilaze dok EP1485365 opisuje R306465.

Patentna prijava EP1492534 koja je publikovana 9. oktobra 2003. godine opisuje jedinjenja karbamske kiseline koja poseduju piperazinsku vezu, kao HDAC inhibitore.

Patentna prijava EP1495002 koja je publikovana 23. oktobra 2003. godine opisuje supstituisana piperazinil fenil benzamidna jedinjenja, kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO04/009536 koja je publikovana 29. januara 2004. godine opisuje derivate koji sadrže alkilni veznik između arilne grupe i hidroksamata, kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava EP 1525199 koja je publikovana 12. februara 2004. godine opisuje (hetero)arilalkenil supstituisane bicikličke hidroksamate, kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO04/063146 koja je publikovana 29. jula 2004. godine opisuje derivate N-hidroksi-benzamid derivata s protu-upalnom i protu-tumorskom aktivnošću.

Patentna prijava WO04/063169 koja je publikovana 29. jula 2004. godine opisuje supstituisane derivate aril hidroksamata kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO04/072047 koja je publikovana 26. avgusta 2004. godine opisuje indole, benzimidazole i nafimidazole kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO04/082638 koja je publikovana 30. septembra 2004. godine opisuje hidroksamate koji su vezani za ne-aromatične heterocikličke prstene kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO04/092115 koja je publikovana 28. oktobra 2004. godine opisuje hidroksamat derivate kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO05/028447 koja je publikovana 31. marta 2005. godine opisuje benzimidazole kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentne prijave WO05/030704 i WO05/030705 koje su publikovane 7. aprila 2005. godine opisuje benzamide kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO05/040101 koja je publikovana 6. maja 2005. godine opisuje acilurea vezane i sulfonilurea vezane hidroksamate kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO05/040161 also koja je publikovana 6. maja 2005. godine opisuje biaril vezane hidroksamate kao inhibitore histon deacetilaze.

Jedinjenja ovog pronalaska razlikuju se od jedinjenja prethodne tehnike strukturom, njihovom farmakološkom aktivnošću i/ili farmakološkom jačinom.

Problem kojega je trebalo da se reši je da se dobiju inhibitori histon deacetilaze s visokom enzimskom i ćelijskom aktivnošću koji imaju povećanu biološku raspoloživost i/iliin vivojačinu.

Nova jedinjenja ovog pronalaska pokazuju sjajnu histon deacetilaza enzimsku i ćelijsku aktivnost. Ona imaju visoki kapacitet da aktiviraju p21 gen, i na nivou ćelije i nain vivonivou. Ova jedinjenja imaju poželjan farmakokinetički profil i niski afinitet za P450 enzime, što smanjuje rizik nepoželjnih lek-lek interakcija čime se postiže ujedno veća sigurnost primene.

Korisne osobine ovih jedinjenja su metabolička stabilnost, rastvorljivost i/ili p21 indukcijski kapacitet. Konkretnije, jedinjenja ovog pronalaska imaju povećani poluživot u hepatocitima pacova, imaju povećanu stabilnost/rastvorljivost u vodenim rastvorima i/ili imaju poboljšanein vivop21 promotorski inducirajuće kapacitete.

Ovaj pronalazak odnosi se na jedinjenja formule (I)

N-oksid forme, farmaceutski prihvatljive adicijske soli i njihove stereohemijski izomerne forme, gde

svaki nje ceo broj s vrednošću 0, 1 ili 2 i kada je n jednako 0 onda je moguća direktna veza;

svaki m je ceo broj s vrednošću 1 ili 2;

svaki X je neovisno N ili CH;

svaki Y je neovisno O, S, ili NR<4>; gde

svaki R4 je vodonik, Ci-ealkil, Ci^alkiloksiC|.6alkil, C3-6cikloalkil, C3.6cikloalkilmetil, fenilC,.6alkil, -C(=0)-CHR<5>R<6>ili -S(=0)2-N(CH3)2; gde

svaki R5 'R6je neovisno vodonik, amino, Ci-salkil ili aminoCi_6alkil; i

kada je Y jednako NR<4>i R<2>je na 7-poziciji indolila, onda R<2>i R<4>zajedno mogu da formiraju dvovaljani radikal

R<1>je vodonik, Ci-6alkil, hidroksiCi^alkil, Ci-ćalkilsulfonil.Ci.6alkilkarbonil ili mono- ili

di(C i -6alkil)aminosulfonil;

R2 je vodonik, hidroksi, amino, halo, Ci^alkil, cijano, C2-6alkenil, polihaloCi.6alkil, nitro,

fenil, Ci.6alkilkarbonil, hidroksikarbonil, Ci-6alkilkarbonilamino,

Ci-ćalkiloksi, ili mono- ili di(Ci.6alkil)amino;

R3 je vodonik, Ci^alkil, ili Ci-6alkiloksi; i

kada su R<2>i R<3>na susednim atomima ugljenika, oni mogu da formiraju dvovaljani radikal

Linije koje su ucrtane u bicikličkom prstenastom sistemu od supstituenata označuju da veze mogu da se dodaju na bilo koji od raspoloživih atoma u bicikličkom prstenastom sistemu.

Termin "histon deacetilaza inhibitor" ili "inhibitor histon deacetilaze" korišćen je da se identifikuje jedinjenje koje može da bude u interakciji s histon deacetilazom i da inhibira njenu aktivnost, konkretno njenu enzimsku aktivnost. Inhibiranje enzimske aktivnosti histon deacetilaze znači da se smanjuje mogućnost histon deacetilaze da ukloni acetilnu grupu s histona. Poželjno, takvo inhibiranje je specifično, tj. inhibitor histon deacetilaze smanjuje mogućnost histon deacetilaze da ukloni acetilnu grupu s histona pri koncentraciji koja je niža od one koncentracije inhibitora kojaje nužna da se proizvede neki drugi, nepovezani biološki efekt.

Kao što je korišćeno u gore navedenim definicijama i u nastavku, halo je generički termin koji označuje fluoro, hloro, bromo i jodo; C,.2alkil je ravni lanac zasićenog ugljovodičnog radikala koji ima 1 ili 2 atoma ugljenika kao što su, npr. metil ili etil; Cu6alkil definiše C]_2alkil te ravne ili razgranate zasićene ugljovodonične radikale koji imaju od 3 do 6 atoma ugljenika kao što su, npr. propil, butil, 1-metiletil, 2-metilpropil, pentil, 2-metil-butil, heksil, 2-metilpentil i slično; a polihaloCi^alkil definiše Ci^alkil koji sadrži tri identična ili različita halo supstituenta, na primer trifluorometil; C2.6alkenil definiše ravne i razgranate lance ugljovodoničnih radikala koji imaju jednu dvostruku vezu i imaju od 2 do 6 atoma ugljenika kao što su, na primer, etenil, 2-propenil, 3-butenil, 2-pentenil, 3-pentenil, 3-metil-2-butenil, i slično; C3-6cikloalkil obuhvata cikličke ugljovodonične grupe koje imaju od 3 do 6 atoma ugljenika, kao što su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopentenil, cikloheksil, cikloheksenil i slično.

Farmaceutski prihvatljive adicijske soli obuhvataju farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli i farmaceutski prihvatljive bazične adicijske soli. Farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli koje su gore navedene namenjene su da uključuju terapeutski aktivne netoksične forme kiselih adicijskih soli, koje mogu da čine jedinjenja formule (I). Jedinjenja formule (I) koja imaju bazične osobine mogu da se prevedu u njihove farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli tretiranjem navedene bazične forme s odgovarajućom kiselinom. Odgovarajuće kiseline uključuju, na prirner, neorganske kiseline kao što su hidrohalogene kiseline, npr hlorovodončna kiselina ili bromovodonična kiselina; sumporna; azotna; fosforna i slične kiseline; ili organske kiseline kao što su, na primer, sirćetna, trifluorosirćetna, propanska, hidroksisirćetna, mlečna, piruvatna, malonska, ćilibarna( tj.butandionska kielina), maleinska, fumarna, jabučna, vinska, limunska, metansulfonska, etansulfonska, benzensulfonska,/?-toluensulfonska, ciklamična, salicilna, p-amino-salicilna, pamoična i slične kiseline.

Jedinjenja formule (I) koja imaju kisele osobine mogu da se prevedu u svoje farmaceutski prihvatljive bazične adicijske soli tretiranjem navedene kisele forme s odgovarajućom organskom ili neorganskom bazom. Odgovarajuće bazične forme soli obuhvataju, na primer, amonijum soli, soli alkalnih i zemnoalkalnih metala, npr. litijum, natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum soli i slično, soli s organskim bazama, npr. soli s benzatinom,N-metil-D-glukaminom, hidrabaminom, te soli s amino kiselinama kao što su, npr, arginin, lizin i slično.

Termin "kisele ili bazične adicijske soli" također obuhvata hidrate i adicijske forme rastvarača, koje mogu da obrazuju jedinjenja formule (I). Primeri takvih formi su npr. hidrati, alkoholati i slično.

Termin "stereohemijski izomerne forme jedinjenja formule (I)", kako se ovde koristi, definiše sva moguća jedinjenja koja su izgrađena od istih atoma koji su povezani istim sledom hemijskih veza ali koji imaju različitu trodimenzionalnu strukturu, koji nisu među sobom zamenjivi, što jedinjenja formule (I) mogu da poseduju. Ako nije drugačije navedeno ili naznačeno, hemijska oznaka jedinjenja uključuje smešu svih mogućih stereohemijski izomernih formi, koje navedena jedinjenja mogu da poseduju. Navedena smeša može da sadrži sve diastereomere i/ili enantiomere bazične molekularne strukture navedenog jedinjenja. Sve stereohemijski izomerne forme jedinjenja formule (I), kako u čistoj formi tako i u smeši, namenjene su da bude unutar obima ovog pronalaska.

//-oksid forme jedinjenja formule (I) znači da su time obuhvaćena ona jedinjenja formule (I) gde su jedan ili više atoma azota oksidirani do tzv. N-oksida, konkretno onih N-oksida gde su jedan ili više od piperidin-, piperazin ili piridazinil-azota /</->oksidirani.

Neka jedinjenja formule (I) mogu također da postoje u svojim tautomernim formama. Takve forme, mada nije eksplicitno naznačeno u gore navedenim formulama, su namenjene da budu obuhvaćene obimom ovog pronalaska.

Svagde gde se ovde koristi, termin "jedinjenja formule (I)" znači da su njime također obuhvaćene sve farmaceutski prihvatljive adicijske soli i sve stereoizomerne forme.

Kako se ovde koristi, termini "histon deacetilaza" i "HDAC" namenjeni su da označe bilo koju od familija enzima koja uklanja acetilne grupe s e-amino grupa lizinskih rezidua na N-terminalnom atomu histona. Ako nije drugačije naznačeno samim kontekstom*, termin "histon" namenjen je da označi bilo koji histonski protein, uključujući Hl, H2A, H2B, H3, H4 i H5, od bilo koje specije. Humani HDAC proteini ili genski proizvodi uključuju, ali nisu ograničeni na HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9 HDAC-10 i HDAC-11. Histon deacetilaza može također da se izvede iz izvora protozoa ili gljivica.

Prva grupa interesantnih jedinjenja sastoji se od onih jedinjenja formule (I) gde vredi jedno ili više sledećih ograničenja: a) svaki R<4>je vodonik, Ci^alkil, C3^cikloalkil, C3.6cikloalkilmetilx? -C(=0)-CHR<5>R<6>ili -S(=0)2-N(CH3)2; b) R<1>je vodonik, Ci^alkil, hidroksiCi_6alkil, Ci^alkilsulfonil, ili mpno- ili di(Ci_6alkil)aminosulfonil; ili

c) R3 je vodonik.

Druga grupa interesantnih jedinjenja sastoji se od onih jedinjenja formule (I) gde vredi

jedno ili više sledećih ograničenja:

a) svaki nje ceo broj s vrednošću 0 ili 1; b) svaki X je neovisno N; c) svaki R4 je vodonik ili Ci^alkil;

d) R<1>je vodonik, Ci^alkil ili hidroksiCi-ćalkil; ili

e) R2 je vodonik, halo, Ci^alkil ili Ci-6alkiloksi.

Treća grupa interesantnih jedinjenja sastoji se od onih jedinjenja formule (I) gde vredi jedno ili više sledećih ograničenja:

a) svaki nje ceo broj s vrednošću 0 ili 1;'

b) svaki R4 je vodonik, C,.6alkil, C]^alkiloksiC|.6alkil, C3.6cikloaIky ili

fenilCi^alkil;

c) R<1>je vodonik, Ci^alkil, hidroksiCi^alkil, C|.6alkilkarbonil ili Ci.6alkilsulfonil; ili

d) R je vodonik, halo, C|.6alkil, cijano, nitro ili Ci^alkiloksi.

Četvrta grupa interesantnih jedinjenja sastoji se od onih jedinjenja formule (I) gde vredi

jedno ili više sledećih ograničenja:

a) svaki nje ceo broj s vrednošću 0 ili 1; b) svaki m je ceo broj s vrednošću 1;

c) svaki R4 je vodonik, Ci.6alkiloksiC|.6alkil, C3.6cikloalkil ili

fenilCi-6alkil; c) R<l>je vodonik, hidroksiC].6alkil, C|.6alkilkarbonil ili Ci.6alkilsulfonil;

d) R2 je vodonik, halo, cijano, nitro ili Ci-6alkiloksi; ili

e) R3 je Ci^alkiloksi; ili

f) kada su R<2>i R<3>na susednim atomima ugljenika, oni mogu da formiraju dvovaljani

radikal -0-CH2-0-.

Peta grupa interesantnih jedinjenja sastoji se od onih jedinjenja formule (I) gde vredi jedno ili više sledećih ograničenja: a) svaki nje ceo broj s vrednošću 1;<b) svaki m je ceo broj s vrednošću 1; c) svaki X je neovisno N; d) svaki Y je neovisno NR<4>; e) svaki R4 je C].6alkil; f) R<1>je vodonik;

g) R<2>je vodonik ili halo; ili

h) R<3>je vodonik.

Grupa poželjnih jedinjenja sastoji se od onih jedinjenja formule (I) gde

svaki nje ceo broj s vrednošću 0 ili 1; svaki R4 je vodonik, Ci^alkil,

Ci.6alkiloksiCi_6alkil, C3.6cikloalkil ili fenilCi^alkil; R<1>je vodonik, Ci-ćalkil, hidroksiCi. ćalkil, Ci-6alkilkarbonil ili Ci^alkilsulfonil; i R2 je vodonik, halo,

Ci-6alkil, cijano, nitro, polihaloCi^alkil ili C].6alkiloksi.

Grupa poželjnijih jedinjenja sastoji se od onih jedinjenja formule (I)

gde svaki nje ceo broj s vrednošću 1; svaki m je ceo broj s vrednošću 1; svaki X je neovisno N; svaki Y je neovisno NR<4>; svaki R4 je Ci^alkil; R<1>je vodonik; R2 je vodonik ili halo; i R<3>je vodonik.

Najpoželjnija jedinjenja su jedinjenje br. la , jedinjenje br. 30 Jedinjenje br. 39 i jedinjenje br. 50.

Jedinjenja formule (I) i (II), njihove farmaceutski prihvatljive soli i N-oksidi te njihove stereohemijski izomerne forme mogu da se prirede na standardni način. Polazni materijal i neki intermedijeri su poznata jedinjenja te su komercijalno raspoloživi ili mogu da se prirede prema standardnim reakcijskim procedurama koje su generalno poznate u tehnici ili kao što je opisano u patentnim prijavama EP1485099 , EP1485348 , EP1485353 , EP1485354 , EP1485364 , EP1485365 , EP1485370 i EP1485378 . Neke metode priređivanja bit će ovde detaljnije opisane. Ostale metode dobijanja finalnih jedinjenja formule (I) su opisane u primerima.

a) Hidroksam kiseline formule (I) mogu da se prirede reakcijom intermedijera formule (II), gde Q je tetrahidropiraniloksiaminokarbonil, što se ovde navodi kao intermedijeri formule

(Il-a), s odgovarajućom kiselinom, kao što je na primer trifluorosirćetna kiselina. Navedena reakcija se vrši u odgovarajućem rastvaraču, kao što su, na primer, metanol ili dihlorometan.

b) Alternativno, hidroksamske kiseline formule (I) mogu da se prirede reakcijom intermedijera formule (II), gde je Q Cj^alkiloksikarbonil, što se ovde navodi kao intermedijeri formule (II-c), s hidroksilaminom, u prisutnosti baze kao što je na primer natrijum hidroksid. Navedena reakcija se vrši u odgovarajućem rastvaraču, kao što je npr. metanol.

Jedinjenja formule (I) mogu također da se prevedu u svako drugo jedinjenje poznatim reakcijama u tehnici ili transformisanjem funkcionalnih grupa. Određen broj takvih transformacija je već ovde opisan. Drugi primeri su hidroliza karboksilnih estera do odgovarajuće karboksilne kiseline ili alkohola; hidroliza amida do odgovarajućih karboksilnih kiselina ili amina; hidroliza nitrila do odgovarajućih amida; amino grupe na imidazolu ili fenilu mogu da se zamene vodonikom poznatim reakcijama diazotiranja i naknadnom zamenom diazo grupe vodonikom; alkoholi mogu da se prevedu estere i etere; primarni amini mogu da se prevedu u sekundarne ili tercijarne amine; dvostruke veze mogu da se hidrogenišu do jednostruke veze; jod radikal na fenilnoj grupi može da se prevede u estersku grupu ubacivanjem ugljenik monoksida u prisutnosti podesnog paladijum katalizatora.

Ovaj pronalazak također se bavi intermedijerima formule (II)

N-oksid formama, farmaceutski prihvatljivim adicijskim solima i njihovim stereohemijski izomernim formama, gde

svaki nje ceo broj s vrednošću 0, 1 ili 2 i kadaje n jednako 0 onda je moguća diretna veza;

svaki m je ceo broj s vrednošću 1 ili 2;

svaki X je neovisno N ili CH;

svaki Y je neovisno O, S, ili NR<4>; gde

svaki R4 je vodonik, Cj^alkil, Ci-6alkiloksiCi-6alkil, C3_5cikloalkil,

C3-6cikloalkilmetil, fenilC,.6alkil, -C(=0)-CHR<5>R<6>ili -S(=0)2-N(CH3)2; gde

svaki R51 R6je neovisno vodonik, amino, Ci^alkil ili aminoCi-6alkil; i

kadaje Yjednako NR<4>i R2jena 7-poziciji indolila zatim R<2>i R<4>zajedno mogu da

formiraju dvovaljani radikal

R<1>je vodonik, Ci_6alkil, hidroksiC|.<salkil, C|.6alkilsulfonil,Ci_6alkilkarbonil ili mono- ili

di(C i-6alkil)aminosulfonil;

R2 je vodonik, hidroksi, amino, halo, Ci_6alk.il, cijano, C2.6alkenil, polihaloC].6alkil, nitro,

fenil, Ci^alkilkarbonil, hidroksikarbonil, Ci.6alkilkarbonilamino,

Ci-6alkiloksi, ili mono- ili di(Ci-6alkil)amino;

R3 je vodonik, Ci.6alkil, ili C|.6alkiloksi;

kada R<2>i R<3>su na susednim atomima ugljenika, oni mogu da formiraju dvovaljani radikal

-O-CH2-O-; i

Q je Ci.2alkiloksikarbonil, hidroksikarbonil ili tetrahidropiraniloksiaminokarbonil.

Grupe interesantnih, poželjnih, poželjnijih i najpoželjnijih jedinjenja mogu da se definišu za jedinjenja formule (II), prema grupama koje su definisane za jedinjenja formule (I).

a) Intermedijeri formule (Il-a) mogu da se prirede reakcijom intermedijera formule (III) s intermedijerom formule (II), gde Q je hidroksikarbonil, koji se ovde navodi kao

intermedijeri formule (Il-b), u prisutnosti reagensa kao što je AP-(etilkarbonimidoil)-_V,iV-dimetil-l,3-propandiamin, monohidrohlorid (EDC) i l-hidroksi-l/Z-benzotnazol (HOBT). Reakcija može da se izvrši u prisutnosti baze kao što je trietilamin, u podesnom rastvaraču, kao što je smeša dihlorometana i tetrahidrofurana.

b) Intermedijeri formule (Il-a) mogu također da se prirede reakcijom intermedijera formule (VI) s odgovarajućim karboksaldehidom formule (V), gde je t ceo broj s vrednošću 0 ili 1, i kada je t jednako 0 onda je moguća direktna veza, u prisutnosti odgovarajućeg reagensa, kao što je natrijum borhidrid, u podesnom rastvaraču kao što je dihloroetan ili metanol. c) Intermedijeri formule (Il-b) mogu da se prirede reakcijom intermedijera formule (II), gde Q je metil- ili etiloksikarbonil (Ci.2alkil), što se ovde navodi kao kiselinom, ili bazičnim rastvorom, npr. vodonik bromidom ili natrijum hidroksidom, u podesnom rastvaraču npr. alkoholu, kao što je etanol ili propanol. d) Intermedijeri formule (II-c) mogu da se prirede reakcijom etil estera karboksilne kiseline formule (IV) s odgovarajućim karboksaldehidom formule (V), u prisutnosti odgovarajućeg reagensa, kao što je natrijum borhidrid, npr. natrijum tetrahidroborat, u podesnom rastvaraču kao što je alkohol, npr. metanol. e) Na identičan način, intermedijeri formule (II-c) mogu da se prirede reakcijom intermedijera formule (XIV) s odgovarajućim intermedijerom formule (XV), u prisutnosti odgovarajućeg reagensa, kao što je natrijum borhidrid npr. natrijum tetrahidroborat, u podesnom rastvaraču kao što je alkohol, npr. metanol. f) Intermedijeri formule (II-c) mogu također da se prirede reakcijom intermedijera formule (X) s intermedijerom formule (XI) gde je W odgovarajuća izlazna grupa kao stoje, na primer, halo, npr. fluoro, hloro, bromo ili jodo, ili sulfoniloksi radikal kao što je metilsulfoniloksi, 4-metilfenilsulfoniloksi i slično. Reakcija može da se izvrši u reakcijski inertnom rastvaraču kao što je, na primer, alkohol, npr. metanol, etanol, 2-metoksi-etanol, propanol, butanol i slično; eter, npr. 4,4-dioxan, l,l'-oksibispropan i slično; keton, npr. 4-metil-2-pentanon; ili N,N-dimetilformamid, nitrobenzen, acetonitril i slično. Dodavanje odgovarajuće baze kao što je na primer, karbonat ili hidrokarbonat alkalnog ili zemnoalkalnog metala, npr. trietilamin ili natrijum karbonat, može da se koristi da se pokupi kiselina koja se oslobodi tokom reakcije. Da se ubrza reakcija može da se doda malena količina odgovarajućeg metalnog jodida, npr. kalijum ili natrijum jodida. Mešanjem može da se ubrza reakcija. Reakcija može standardno da se izvrši na^emperaturi koja je u rasponu između sobne temperature i temperature refluksa te, ako se želi, reakcija može da se izvrši uz povećani pritisak.

g) Na identičan način, intermedijeri formule (II-c) mogu da se prirede reakcijom intermedijera formule (XII) s intermedijerom formule (XIII), gde je W odgovarajuća

izlazna grupa kao što je gore opisano.

Intermedijeri formule (VI) mogu da se prirede reakcijom intermedijera formule (VII) s piperidinom u podesnom rastvaraču, npr. dihlorometanu.

Intermedijeri formule (VII) mogu da se prirede reakcijom intermedijera formule (VIII) s intermedijerom formule (III), u prisutnosti odgovarajućeg reagensa kao sto je JV-(etilkarbonimidoil)-V,jV-dimetil-l,3-propandiamin, monohidrohlorid (EDC) i 1-hidroksi-l//-benzotriazol (HOBT). Reakcija može da se izvrši u prisutnosti baze kao što je trietilamin, u podesnom rastvaraču, kao što je smeša dihlorometana i tetrahidrofurana. Intermedijeri formule (VIII) mogu da se prirede reakcijom intermedijera formule (IX) s intermedijerom formule (IV), gde R<!>je vodonik, što se ovde navodi kao intermedijeri formule (IV-a), u prisutnosti natrijum hidroksida, u podesnom rastvaraču, kao što je tetrahidrofurana, nakon čega sledi neutralizacija s hlorovodoničnom kiselinom i dodavanje natrijum karbonata.

Jedinjenja formule (I) i neki intermedijeri mogu da imaju bar jedan stereogeni centar u svojoj strukturi. Ovaj stereogeni centar može da bude u R ili S konfiguraciji.

Jedinjenja formule (I), onako kako se priređuju u gore navedenim procesima, generalno su racemičke smeše enantiomera, koji mogu da se odvoje jedan od drugog ako se slede postupci razdvajanja koji su poznati u tehnici. Racemička jedinjenja'formule (I) mogu da se prevedu u forme odgovarajuće diastereomerne soli reakcijom s podesnom hiralnom kiselinom. Navedene forme diastereomernih soli mogu da se naknadno razdvoje, na primer, selektivnom ili frakcionom kristalizacijom iz kojih se enantiomeri oslobađaju delovanjem alkalija. Alternativni načn razdvajanja enantiomernih formi jedinjenja formule (I) uključuje tečnu hromatografiju pomoću hiralne stacionarne faze. Navedene čiste stereohemijske izomerne forme mogu također da se izvedu iz odgovarajućih čistih stereohemijskih izomernih formi odgovarajućih polaznih materijala, pod uslovom da se reakcija dešava stereospecifično. Poželjno, ako se želi specifični stereoizomer, navedeno jedinjenje može da se sintetizuje stereospecifičnim metodama priređivanja. Ove metode prevashodno koriste enantiomerno čiste polazne materijale.

Jedinjenja formule (I), njihove farmaceutski prihvatljive soli i njihove stereoizomerne forme imaju cenjene farmakološke osobine time što pokazuju efekat inhibiranja histon deacetilaze (HDAC).

Ovaj pronalazak definiše metodu za inhibiranje abnormalnog rasta ćelija, uključujući transformisane ćelije, primenom efektivne količine jedinjenja ovog pronalaska. Abnormalni rast ćelija odnosi se na rast ćelija neovisno od normalnih mehanizama regulacije (npr. gubitak kontaktne inhibicije). To uključuje inhibiranje tumorskog rasta i direktno - zaistavljanjem rasta, terminalnim diferenciranjem i/ili apoptozom ćelija karcinoma, i indirektno - inhibiranjem neovaskularizacije tumora.

Ovaj pronalazak također definiše metodu za inhibiranje tumorskog rasta primenom efektivne količine jedinjenja ovog pronalaska subjektu, npr. sisani (konkretnije: čoveku) kojemu je potreban takav tretman. Tačnije, ovaj pronalazak definiše metodu za inhibiranje rasta tumora primenom efektivne količine jedinjenja ovog pronalaska. Primeri tumora koji mogu da se inhibiraju, ali bez ograničenja, su: karcinom pluća (tj. adenokarcinom uključivo karcinom nemalih ćelija pluća), karcinom gušterače (na primer, egzokrini karcinom), karcinomi kolona (tj. kolorektalni karcinom, kao na primer adenokarcinom kolona i adenom kolona), karcinom prostate uključujući uznapredovalu bolest, hematopoetski tumori limfoidne loze (tj. akutna Iimfocitna leukemija, limfom B-ćelija, Burkitt-ov limfom), mijeloidne leukemije (na primer, akutna mijeloična leukemija (AML)), folikularni karcinom štitaste žlezde, mijelodisplastični sindrom (MDS), tumori mezenhimalnog porekla (tj. fibrosarkomi i rabdomiosarkomi), melanomi, teratokarcinomi, neuroblastomi, gliomi, benigni tumori kože (tj. keratoakantomi), karcinomi dojke (i uznapredovali), karcinomi bubrega, karcinomi jajnika, karcinomi mokraćnog mehura, epidermalni karcinomi.

Jedinjenje prema ovom pronalasku može da se koristi za druge terapeutske namene, na primer: a) povećanje osetljivosti tumora na radioterapiju upotrebljavanjem pripravka prema pronalasku pre, za vreme ili nakon iradijacije tumora; b) lečenje artropatija i osteopatologijskih stanja kao što su reumatoidni artritis, osteoartritis, juvenilni artritis, giht, poliartritis, psorijatički artritis, ankilozirajući spondilitis i sistemski lupus eritomatodes; c) inhibiranje proliferacije ćelija glatkih mišića, uključujući vaskularne proliferacijske bolesti, aterosklerozu i restenozu; d) tretiranje upalnih stanja i kožnih bolesti kao što su ulceroziii kolitis, Crohnova bolest, alergijski rinitis, graft vs. host disease (reakcija trasnsplantata na domaćina),

konjunktivitis, astma, ARDS (akutni respiracijski stres sindrom), Behcet-ova bolest, odbacivanje transplantata, urtikarija, alergijski dermatitis, alopecija areata, sklerodermija, egzantem, ekcem, dermatomiozitis, akne, diabetes, sistemski lupus

eritematodes, Kawasaki-eva bolest, multipla skleroza, emfizem, cistična fibroza i kronični bronhitis; e) tretiranje endometrioze, uterinih fibroida, disfunkcionalnog krvarenja iz maternice i hiperplazije endometrija; f) tretiranje okularnih vaskularizacija uključujući vaskulopatiju koja pogađa retinalne i horoidalne krvne žile; g) tretiranje kardijalne disfunkcije (poremetnje funkcije srca); h) inhibiranje imunosupresivnih stanja kao što je infekcija HlV-om; i) tretiranje renalne disfunkcije (poremetnje funkcije bubrega); j) suprimiranje endokrinih bolesti; k) inhibiranje disfunkcije glukoneogeneze; 1) tretiranje neuroloških bolesti, npr. Parkinsonova bolest ili neurološke bolesti koje završavaju kognitivnim smetnjama, npr. Alzheimer-ova bolest ili poliglutaminske neuronalne bolesti;

m) tretiranje psihijatrijskih bolesti, na primer šizofrenije, bipolarnih poremećaja,

depresije, anksioznosti i psihoze;

n) inhibiranje neuromuskularnih bolesti, na primer amiotrofične lateralne skleroze;

o) tretiranje spinalne muskularne atrofije;

p) tretiranje ostalih patoloških stanja koja su podložna za tretiranje jačanjem

ekspresije gena;

q) napredna genska terapija;

r) inhibiranje adipogeneze;

s) tretiranj e parazitoza kao što j e malarij a.

Dakle, ovaj pronalazak opisuje jedinjenja formule (I) za upotrebu kao lek te upotrebu ovih jedinjenja formule (I) za proizvodnju medikamenta za tretiranje jednog ili više gore navedenih stanja.

Jedinjenja formule (I), njihove farmaceutski prihvatljive soli i njihove stereoizomeme forme mogu da poseduju cenjene dijagnostičke osobine time što mogu da se koriste za detektiranje ili identifikovanje HDAC u biološkom uzorku što obuhvaća detekciju ili merenje formiranja kompleksa između obeleženog jedinjenja i HDAC.

Metode za otkrivanje ili identifikaciju mogu da koriste jedinjenja koja su obeležena s agensima za obeležavanje kao što su radioizotopi, enzimi, fluorescentne supstance, luminescentne supstance itd. Primeri radioizotopa uključuju<125>1,<131>I,<3>H i 14C. Enzimi se obično učine detektibilnima konjugacijom odgovarajućeg supstrata koji, opet, katalizuje reakciju za detekciju. Primeri enzima uključuju, na primer, beta-galaktosidazu, beta-glukosidazu, alkalnu fosfatazu, peroksidazu i malat dehidrogenazu, poželjno peroksidazu rena. Luminescentne supstance uključuju, na primer, luminol, luminol derivate, kiciferin, ekvorin i luciferazu.

Biološki uzorci mogu da se definišu kao telesna tkiva ili telesne tečnosti. Primeri telesnih tečnosti su cerebrospinalna tečnost, krv, plazma, serum, urin, ispljuvak, slina i slično.

U svetlu njihovih korisnih farmakoloških osobina, predmetna jedinjenja mogu da se formulišu u različite farmaceutske forme za potrebe primene.

Da se prirede farmaceutske smeše ovog pronalaska, efektivna količina konkretnog jedinjenja, bilo u formi kisele ili bazične adicijske soli, se kao aktivni sastojak kombinuje s farmaceutski prihvatljivim nosačem, a taj nosač može da bude u ćelom nizu formi, ovisno o tome koja je forma poželjna za primenu. Ove farmaceutske smeše su poželjno u jediničnom dozirajućem obliku koji je podesan, poželjno, za primenu oralno, rektalno, perkutano ili parenteralnom injekcijom. Na primer, pri prieđivanju smeša u formi za oralno doziranje, može da se koristi bilo koji od običnih farmaceutskih medija, kao što su, na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi i slično u slučaju oralnih tečnih preparata kao što su suspenzije, sirupi, eliksiri i rastvori; ili Čvrsti nosači kao što su škrob, šećer, kaolin, lubrikanti, veziva, sredstva za razgrađivanje i slično u slučaju prašaka, pilula, kapsula i

tableta.

Zbog lakoće njihove primene, tablete i kapsule predstavljaju najbolju jediničnu formu za oralno doziranje, pri čemu se očigledno koriste čvrsti farmaceutski nosači. Za parenteralne smeše, nosač će obično da sadrži sterilnu vodu, bar većim delom, mada mogu da se uključe drugi sastojci, na primer da se poveća rastvorljivost. Mogu da se prirede rastvori za injiciranje u kojima, na primer, nosač sadrži rastvor soli, rastvor glukoze ili smešu soli i glukoze. Također mogu da se prirede suspenzije za injiciranje, pri čemu mogu da se koriste odgovarajući tečni nosači, agensi za suspendovanje i slično. U smešama podesnim za perkutanu primenu, nosač obično sadrži agens koji povećava prodiranje i/ili podesan agens za kvašenje, koji se proizvoljno kombinuje s podesnim aditivima bilo koje prirode u manjim proporcijama, pri čemu ti aditivi ne izazivaju značajni štetan efekt na kožu. Navedeni aditivi mogu da olakšaju primenu na kožu i/ili mogu da budu korisni za priređivanje željenih smeša. Ove smeše mogu da se primene na različite načine, npr. kao transdermalni flaster, kao tačkasti nanos ili kao pomada.

Ima posebne prednosti ako se formulišu gore navedene farmaceutske smeše u formi za jedinično doziranje za laku primenu i uniformnost doziranja. Forma za jedinično doziranje u specifikaciji i patentnim zahtevima ovde se odnosi na fizički diskretne jedinice koje su podesne za integralno doziranje, pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka, koja je izračunata da se postigne željeni terapeutski učinak, u vezi s potrebnim farmaceutskim nosačem. Primeri takvih formi za jedinično doziranje su tablete (uključujući tablete sa središnjim urezom i prevučene tablete), kapsule, pilule, paketi prašaka, vafli, rastvori za injekcije ili suspenzije, čajne žičice, supene žlice i slično, te njihovi segregirani multiplikatori.

Oni koji imaju iskustva u ovom području tehnike mogu lako da odrede efektivnu količinu iz rezultata testova koji se mogu kasnije naći. Generalno, podrazumeva se da je terapeutski efektivna količina od 0.005 mg/kg do 100 mg/kg telesne težine^te konkretno od 0.005 mg/kg do 10 mg/kg telesne težine. Može da odgovara primena potrebne doze kao dve, tri ili četiri subdoze u odgovarajućim intervalima tokom dana. Navedene subdoze mogu da se formulišu kao forme za jedinično doziranje koje, na primer, sadrže 0.5 do 500 mg, te konkretno od 10 mg do 500 mg aktivnog sastojka po formi za jedinično doziranje.

Kao sledeći aspekt ovog pronalaska predviđena je kombinacija HDAC-inhibitora s drugim protu-tumorskim agensom, osobito za upotrebu kao lek, specifičnije u tretiranju karcinoma ili srodnih bolesti.

Za tretiranje gore navedenih stanja, jedinjenja ovog izuma mogu da se napredno koriste u kombinaciji s jednim ili s više medicinskih sredstava, konkretno, s drugim protu-tumorskim agensima. Primeri protu-tumorskih sredstava su: - koordinacijska jedinjenja platine, na primer cisplatina, karboplatina ili oksaliplatina; - taksanska jedinjenja, na primer paklitaksel ili docetaksel; - inhibitori topoizomeraze I, kao što su kamptotecin jedinjenja, na primer irinotekan ili topotekan; - inhibitori topoizomeraze II, kao što su protu-tumorski podofilotoksin derivati, na primer etoposid ili teniposid; - anti-tumorski vinca alkaloidi, na primer vinblastin, vinkristin ili vinorelbin; - anti-tumorski nukleozidni derivati, na primer 5-fluorouracil, gemcitabin ili kapecitabin; - agensi za alkilovanje kao što su azotni senf ili nitrozourea, na primer ciklofosfamid, hlorambucil, karmustin ili lomustin; - anti-tumorski derivati antraciklina, na primer daunorubicin, doksorubicin, idarubicin ili mitoksantron; - HER2 antitela, na primer trastuzumab; - estrogenski receptorski antagonisti ili selektivni estrogenski receptorski modulatori, na primer tamoksifen, toremifen, droloksifen, faslodeks ili raloksifen; - inhibitori aromataze, kao što su eksemestan, anastrozol, letrazol i vorozol; - diferencirajući agensi kao što su retinoidi, vitamin D i agensi koji blokiraju metabolizam retinoične kiseline (RAMBA), na primer akutan; - inhibitori DNA metil transferaza, na primer azacitidin; - kinaza inhibitori, na primer flavoperidol, imatinib mesilat ili gefitinib; - inhibitori farnesiltransferaze; - drugi HDAC inhibitori;

- inhibitori ubikuitin-proteasomskog puta, na primer Velcade; ili

- Yondelis.

Termin "koordinacijsko jedinjenje platine" kako se ovde koristi označava bilo koje koordinacijsko jedinjenje platine koje inhibira rast tumora, pri čemu je platina u obliku jona.

Termin "taksansko jedinjenje" označuje klasu jedinjenja koja sadrže taksanski prstenasti sistem i odnosi se na ekstrakte ili su izvedeni iz ekstrakta određenih vrsta tisovine (Taxus).

Termin "inhibitori topoizomeraze" koristi se za označavanje enzima koji mogu izmeniti DNA topologiju u eukaritotskim ćelijama. Oni su kritični za značajne celularne funkcije i

proliferaciju ćelija. Postoje dve klase topoizomeraza u eukariotskim ćelijama, odnosno tip I i tip II. Topoizomeraza I je monomerni enzim s molekularnom težinom približno 100,000. Enzim se veže za DNA i unosi prolazni prekid jedne niti, razdvajajući dvostruku zavojnicu (ili omogućujući da se ona razdvoji) i nakon toga zatvara prekid pre disocijacije s DNA niti. Topizomeraza II ima slični mehanizam delovanja koji uključuje izazivanje prekid DNA niti ili formiranje slobodnih radikala.

Termin "jedinjenja kamptotecina" koristi se da označi jedinjenja koja su povezana ili izvedena iz roditeljskog jedinjenja kamptotecina koji je u vodi nerastvorljiv alkaloid izveden iz kineskog drva Camptothecin acuminata i indijskog drva Nothapodvtes foetida. Termin "podofilotoksinsko jedinjenje" koristi se za označavanje jedinjenja koje je povezano ili izvedeno iz roditeljskog podofilotoksina, koji je opet ekstrahiran iz biljke mandragora.

Termin "protu-tumorski vinca alkaloidi" se koristi za označavanje jedinjenja koja su povezana ili izvedena iz ekstrakta zimzelene biljke (Vinca rosea).

Termin "agensi za alkilovanje" obuhvataju raznoliku grupu hemikalija koje imaju zajedničko to što imaju kapaciteta da ugrade, u fizološkim uslovima, alkilne grupe u biološki vitalne makromolekule kao što je DNA. S većinom važnijih agenasa kao što su azotni senf i nitrosouree, aktivne alkilirajuće vrste sugenerisane in vivonakon složenih reakcija razgrađivan]a, od kojih se neke enzimske. Najvažnija farmakološka dejstva agensa za alkilovanje su ona koja ometaju fundamentalne mehanizme koji su povezani š proliferacijom ćelija u konkretnoj sintezi DNA i podeli ćelija. Kapacitet agensa za alkilovanje koji je u interferenciji s DNA funkcijom i integritetom u tkivima s brzom proliferacijom daje temelj za njihovu terapeutsku primenu i za mnoge od njihovih toksičnih osobina.

Termin "protu-tumorski derivati antraciklina" obuhvata antibiotike koji su dobijeni iz gljiveStrep. peuticus var. caesiusi njenih derivata, za koje je karakteristično da imaju prstenastu strukturu tetraciklina s neobičnim šećerom, daunosaminom, za kojega je vezan glikozidnom vezom.

Pojačavanje receptor 2 proteina humanog epidermnog faktora rasta (HER 2) u primarnim karcinomima dojke pokazalo se da je korelaciji s lošom kliničkom prognozom za određene bolesnike. Trastuzumab je visoko pročišćeno iz rekombinantne DNA izvedeno humanizirano monoklonsko IgGl kapa antitelo koje se veže s visokim afinitetom i specifično za ekstracelularnu domenu HER2 receptora.

Mnogi karcinomi dojke imaju estrogenske receptore i rast ovih tumora može se stimulisati estrogenom. Termini "estrogeni receptorski antagonisti" i "selektivni estrogeni receptorski modulatori" se koriste za označavanje kompetitivnih inhibitora estradiolskog vezanja za estrogeni receptor (ER). Selektivni estrogeni receptorski modulatori, kada se vežu za ER, izazivaju promenu trodimenzionalnog oblika receptora, moduliranjem njegova vezanja za estrogeni responzivni element (ERE) na DNA.

U žena koje su u postmenopauzi, glavni izvor estrogena u cirkulaciji je prevođenje androgena iz nadbubrežne žlezde i jajnika (androstenedion i testosteron) u estrogene (estron i estradiol) pomoću enzima aromataze u perifernim tkivima. Uklanjanje estrogena putem inhibiranja aromataze ili inaktivacije je efikasni i selektivni tretman za neke pacijente u menopauzi s hormon-ovisnim karcinomom dojke.

Termin "antiestrogeni agens" ovde se koristi da se obuhvate ne samo estrogeni receptorski antagonisti i modulatori selektivnog estrogenog receptora, već također i inhibitori aromataze, kao što je pre diskutovano.

Termin "diferencirajući agensi" obuhvata jedinjenja koja mogu da, na različite načine, inhibiraju proliferaciju ćelija i izazovu diferenciranje. Poznato jer da vitamin D i retinoidi imaju značajnu ulogu u regulisanju rasta i diferenciranju celog niza normalnih i malignih tipova ćelija. Agensi koji blokiraju metabolizam retinoične kiseline (RAMBA) povećavaju nivoe endogene retinoične kiseline inhibiranjem citohrom P450-upravljanog katabolizma retinoične kiseline.

Promene DNA metilacije su među najčešćim abnormalnostimaUhumanoj neoplaziji. Hipermetilacija unutar promotora odabranih gena obično je povezana š inaktivacijom uključenih gena. Termin "inhibitori DNA metil transferaze" koristi se za označavanje jedinjenja koja deluju putem farmakološkog inhibiranja DNA metil transferaze i reaktivaciju ekspresije tumorskog supresorskog gena..'. •

Termin "inhibitori kinaze" obuhvata jake inhibitore kinaze koji su uključeni u progresiju ciklusa ćelije i programiranu smrt ćelije (apoptoza).

Termin "inhibitori farnesiltransferaze " koristi se za označavanje jedinjenja koja su načinjena da se spreči farnesilacija Ras i drugih intracelularnih proteina. Pokazalo se da ona deluju na proliferaciju i preživljavanje malignih ćelija.

Termin "drugi HDAC inhibitori" uključuje, ali nije ograničen na:

- karboksilate, na primer butirat, cimetnu kiselinu, 4-fenilbutirat ili valproičnu kiselinu; - hidroksamske kiseline, na primer suberoilanilid hidroksamska kiselina (SAHA), SAHA analozi koji sadrže piperazin, biaril hidroksamat A-161906 i njihovi karbozolileter-, tetrahidropiridin- i tetralon- analozi, bicikličkiaril-_V-hidroksikarboksamidi, piroksamid, CG-1521, PXD-101, sulfonamid hidroksamske kiseline, LAQ-824, LBH-589, trihostatin A (TSA), oksamflatin, skriptaid, skriptaid srodne tricikličke molekule, m-karboksi cimetna kiselina bishidroksamska kiselina (CBHA), CBHA-slične hidroksamske kiseline, analog trapoksin-hidroksamske kiseline, R306465 i srodne benzoil- i heteroaril-hidroksamske kiseline, aminosuberati i malonildiamidi;

- ciklički tetrapeptidi, na primer trapoksin, apidicin, depsipeptid, spiruhostatin-srodna jedinjenja, RedFK-228, ciklički tetrapeptidi koji sadrže sulfhidril (SCOP), ciklički tetrapeptidi koji sadrže hidroksamsku kiselinu (CHAP), TAN-174s i azumamidi;

- benzamidi, na primer MS-275 ili CI-994, ili

- depudecin.

Termin "inhibitori ubikvitin-proteasomskog puta" se koristi da se identifikuju jedinjenja koja inhibiraju ciljano uništenje ćelijskih proteina u proteasomu, uključujući regulacijske proteine ćelijskog ciklusa.

Za tretiranje karcinoma, jedinjenja ovog pronalaska mogu da se primene bolesniku kao što je gore opisano, zajedno s ozračivanjem. Pod ozračivanjem se misli na zračenje, konkretno na gama zračenje, posebno ono koje emituju linearni akceleratori ili radionuklidi koji su danas u opštoj upotrebi. Ozračivanje tumora radionuklidima može da bude vanjsko ili unutrašnje.

Ovaj pronalazak također se odnosi na kombinaciju prema ovom pronalasku protu-tumorskog agensa i HDAC inhibitora prema ovom izumu.

Ovaj pronalazak također se odnosi na kombinaciju prema ovom pronalasku za upotrebu medicinske terapije na primer za inhibiranje rasta tumorskih ćelija.

Ovaj pronalazak također se odnosi na kombinacije prema ovom pronalasku za inhibiranje rasta tumorskih ćelija.

Ovaj pronalazak također se odnosi na metodu inhibiranja rasta tumorskih ćelija u čoveka što obuhvata primenu subjektu efektivne količine kombinacije prema ovom izumu.

Ovaj pronalazak nadalje definiše metodu za inhibiranje abnormalnog rasta ćelija, uključujući transformisane ćelije, primenom efektivne količine kombinacije prema ovom pronalasku.

Drugi medicinski agens i HDAC inhibitor mogu da se primene istovremeno (npr. u odvojenim ili jedinstvenim smešama) ili sekvencijalno u bilo kojem redosledu. U ovom potonjem slučaju, dva jedinjenja treba da se primene unutar perioda te u količini i na način koji je dovoljan da se osigura povoljan i sinergijski efekat. Poželjna<*>metoda i red primene te odgovarajuća doza i režim za svaku komponentu kombinacije će da ovise o konkretnom drugom medicinskom agensu i HDAC inhibitoru koji se primenjuje, putu njegove primene, konkretnom tumoru koji se tretira i o domaćinu koji se tretira. Optimalnu metodu i redosled primene te režim i količinu doziranja može da odredi lice koje poznaje ovu tehniku pomoću standardnih metoda u svetlu informacija koje su ovde navedene.

Koordinacijsko jedinjenje platine se korisno primenjuje u dozi od 1 do 500 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 50 do 400 mg/m<2>, konkretno za cisplatin u dozi od oko 75 mg/m<2>te za karboplatin od oko 300 mg/m<2>tokom tretmana.

Taksansko jedinjenje se korisno primenjuje u dozi od 50 do 400 mg po kvadratnbm metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 75 do 250 mg/m<2>, konkretno za paklitaksel u dozi od oko 175 do 250 mg/m 9 te za docetaksel u oko 75 do 150 mg/m 9 tokom tretmana.

Jedinjenje kamptotecina se korisno primenjuje u dozi od 0.1 do 400 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 1 do 300 mg/m<2>, konkretno za irinotekan u dozi od oko 100 do 350 mg/m 9 te za topotekan u oko 1 do 2 mg/m 9 tokom tretmana.

Protu-tumorski podofilotoksinski derivat se korisno primenjuje u dozi od 30 do 300 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 50 do 250mg/m<2>, konkretno za etoposid u dozi od oko 35 do 100 mg/m 7 i za teniposid u oko 50 do 250 mg/m 9 tokom tretmana.

Protu-tumorski vinca alkaloid se korisno primenjuje u dozi od 2 do 30 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, konkretno za vinblastin u dozi od oko 3 do 12 mg/m2, za vinkristin u dozi od oko 1 do 2 mg/m<2>, te za vinorelbin u dozi od oko 10 do 30 mg/m<2>tokom tretmana.

Protu-tumorski nukleozidni derivat se korisno primenjuje u dozi od 200 do 2500 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 700 do 1500 mg/m<2>, konkretno za 5-FU u dozi od 200 do 500mg/m<2>, za gemcitabin u dozi od oko 800 do 1200 mg/m<2>te za kapecitabin u oko 1000 do 2500 mg/m<2>tokom tretmana.

Agensi za alkiliranje kao što je azotni senf (mehloretamin hidrohlorid) ili nitrosourea se korisno primenjuju u dozi od 100 do 500 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 120 do 200 mg/m<2>, konkretno za ciklofosfamid u dozi od oko 100 do 500 mg/m , za hlorambucil u dozi od oko 0.1 do 0.2 mg/kg, za karmustin u dozi od oko 150 do 200 mg/m<2>, te za lomustin u dozi od oko 100 do 150 mg/m<2>tokom tretmana.

Protu-tumorski derivat antraciklina se korisno primenjuje u dozi od 10 do 75 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 15 do 60 mg/m<2>, konkretno za doksorubicin u dozi od oko 40 do 75 mg/m<2>, za daunorubicin u dozi od oko 25 do 45mg/m , te za idarubicin u dozi od oko 10 do 15 mg/m tokom tretmana.

Trastuzumab se korisno primenjuje u dozi od 1 do 5mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, konkretno 2 do 4 mg/m<2>tokom tretmana.

Antiestrogeni agens se korisno primenjuje u dozi od oko 1 do 100 mg dnevno ovisno o konkretnom agensu i stanju koje se tretira. Tamoksifen se korisno primenjuje oralno u dozi od 5 do 50 mg, poželjno 10 do 20 mg dva puta dnevno, pri čemu se terapija produžava dovoljno vremena da se postigne i zadrži teraputski efekt. Toremifen se korisno primenjuje oralno u dozi od oko 60 mg jednom dnevno, pri čemu se terapija produžava dovoljno vremena da se postigne i zadrži teraputski efekt. Anastrozol se korisno primenjuje oralno u dozi od oko 1 mg jednom dnevno. Droloksifen se korisno primenjuje oralno u dozi od oko 20-100 mg jednom dnevno. Raloksifen se korisno primenjuje oralno u dozi od oko 60 mg jednom dnevno. Eksemestan se korisno primenjuje oralno u dozi od oko 25 mg jednom dnevno.

Ove doze mogu da se primene na primer jednom, dva puta ili više puta tokom tretmana, što može da se ponovi na primer svakih 7, 14, 21 ili 28 dana.

Obzirom na njihova korisna farmakološka svojstva, komponente kombinacija prema ovom pronalasku, tj. medicinski agens i HDAC inhibitor mogu da se formulišu u različite farmaceutske forme za svrhu primene.

Komponente mogu da se formulišu u individualne farmaceutske smeše ili u jedinstvenu farmaceutsku smešu koja sadrži obe komponente.

Ovaj pronalazak se prema tome odnosi na farmaceutsku smešu koja sadrži medicinski agens i HDAC inhibitor, zajedno s jednim ili više farmaceutskih nosača.

Ovaj pronalazak također se odnosi na kombinaciju prema ovom pronalasku u formi farmaceutske smeše koja sadrži protu-tumorski agens i HDAC inhibitor, prema ovom pronalasku, zajedno s jednim ili više farmaceutskih nosača.

Ovaj pronalazak nadalje se odnosi na upotrebu kombinacije prema ovom pronalasku za proizvodnju farmaceutske smeše za inhibiranje rasta tumorskih ćelija.

Ovaj pronalazak nadalje se odnosi na proizvod koji kao prvi aktivni sastojak sadrži HDAC inhibitor prema ovom pronalasku te kao drugi aktivni sastojak protutumorski agens, kao kombinovani preparat za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu za tretiranje bolesnika koji boluju od karcinoma.

Eksperimentalni deo

Primeri koji slede se ovde navode kao ilustracija.

U tekstu koji sledi, "DCM" je definisan kao dihlorometan, "DIPE" je definisan kao diisopropil eter, "DMA" je definisan kao N,N-dimetilacetamid, "DMSO" je definisan kao dimetilsulfoksid ,"EDC" je definisan kao A"-(etilkarbonimidoil)--V,A^-dimetil-l,3-propandiamin, monohidrohlorid, "EtOAc" je definisan kao etil acetat, "EtOH" je definisan kao etanol, "HOBt" je definisan kao l-hidroksi-l//-benzotriazol, "MeOH" je definisan kao metanol, "TFA" je definisan kao trifluorosirćetna kiselina i "THF" je definisan kao tetrahidrofuran.

A. Priređivanje intermediiernih jedinjenja

Primer A1

a).Pnređivanje^

Smeša etil estera 2-[4-(aminometil)-l-pipeirdinil]- 5-pirimidinkarboksilne kiseline, (0.0114 mol), l-metil-l#-indol-3-karboksaldehida (0.017 mol) i MgS04(0.5 g) u MeOH (80 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 15 časova, zatim ohlađena do sobne temperature. U porcijama je dodan natrijum tetrahidroborat (0.018 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 5 časova, izvađena i stavljena u vodu te ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (6.6 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 94/6/0.5). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 4.3 g (90%) intermedijera 1 .

J?) Priređivanj e intermedijera 2

Smeša intermedijera 1 (0.0037 mol) i natrijum hidroksida (0.0074 mol) u EtOH (60 ml) je mešana na 50°C u trajanju 15 časova, zatim ohlađena do sobne temperature i rastvarač je uparen do suvog, što daje 1.5 g (100%) intermedijera 2 .

.<?). Priređivanje jnteimedijera 3

EDC (0.0075 mol), zatim HOBt (0.0075 mol) pa 0-(tetrahidro-2#-piran-2-il)-hidroksilamin (0.015 mol) su dodani na sobnoj temperaturi smeši intermedijera 2 (0.005 mol) u DCM (100 ml) i THF (100 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na 40°C u trajanju 4 časa, izvađena i stavljena na ledeno hladnu vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (4 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.5). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 1 g (42%) intermedijera 3 . Deo (0.051 g) je kristaliziran iz DIPE. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.03 g intermedijera 3 , tačka tališta 70°C.

Primer A2

a). Priređivanje intermedij era 4

Smeša etil estera 2-[4-(aminometil)-l-piperidinil]- 5-pirimidinkarboksilne kiseline, (0.0072 mol) u THF (40 ml) i natrijum hidroksidu IN (40 ml) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Dodana je hlorovodonična kiselina IN (40 ml). Smeša je mešana 10 minuta. Dodan je natrijum karbonat (0.0216 mol). Smeša je mešana 10 minuta. U porcijamaje dodan l-[[(9//-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]oksi]- 2,5-pirolidindion (0.0072 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 6 časova, zatim ohlađena do 0°C i zakiseljena s hlorovodoničnom kiselinom. Talog je filtriran, ispran s dietil eterom i osušen, što daje 4.1 g (100%) intermedijera 4 .

b)..Pjixeđiyaiyejntem

Trietilamin (0.02 mol), EDC (0.0082 mol) i HOBt (0.0082 mol) su dodani na sobnoj temperaturi smeši intermedijera 4 (0.0068 mol) u DCM/THF (200 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 15 minuta. Dodah je 0-(tetrahidro-2//- piran-2-il)- hidroksilamin (0.0082 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 48 časova, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj ispran je s NaHC0310%, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (4 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 3.4 g (89%) intermedijera 5 . c). Priređivanje intermedijera 6 Smeša intermedijera 5 (0.0355 mol) i piperidina (0.089 mol) u DCM (400 ml) je mešana na 35°C tokom 72 časa. Rastvarač je uparen. Rezidue su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 80/20/2). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 6.7 g (56%). Deo rezidua (0.79 g) je kristalizirao iz dietil etera. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.62 g intermedijera 6, tačka tališta 129°C. d) Priredivanje_intermed^era 7

Smeša intermedijera 6 (0.0009 mol) i 5-hloro-li¥-indol-3-karboksaldehida (0.0012 mol) u

1,2-dihloro-etanu (3Omi) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći.

U porcijama je dodan natrijum tris(acetato-a-0)hidro- borat(l-) (0.0013 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 4 časa, izvađena i stavljena u smešu voda/NaOH 3N i ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (0.5 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0.5). Dve frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.07 g (16%) intermedijera 7 .

Primer A3

a). Priređivah .intermedtjera. 8

Rastvor etil estera 2-(metilsulfonil)- 5-pirimidinkarboksilne kiseline, (0.094 mol) u acetonitrilu (40 ml) dodan je na 10°C suspenziji 4-piperidinmetanola (0.086 mol) i kalijum karbonata (0.172 mol) u acetonitrilu (200 ml) pod N2tokom. Smeša je zagrejana do sobne temperature, zatim mešana u trajanju 4 časa, izvađena i stavljena u vodu te ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (23 g) su kristalizirale iz smeše acetonitril/dietil eter. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 7.8 g (34%) intermedijera 8 . Matični sloj je uparen. Rezidue (17g)<*>su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (20-45 (im) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje .4.6 g (20%) intermedijera 8 , tačka tališta 129°C. b). Priredi y anj e. intermedij era 9 Trietilamin (0.038 mol), zatim metansulfonil hlorid (0.025 mol) dodani su na 0°C rastvoru intermedijera 8 (0.0189 mol) u DCM (80 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na 0°C u trajanju 2 časa i stavljena u ledeno hladnu vodu. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen, što daje 6.5 g (100%) intermedijera 9 . c) Priređi vanje intermedij era 10 Smeša intermedijera 9 (0.0189 mol), Af-metil-l/f-indol-3-etanamina (0.0172 mol) i kalijum karbonata (0.0344 mol) u acetonitrilu (180 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 24 časa, stavljena u vodu pa ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (8.5 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (70-200 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0 do 97/3/0.1). Ciste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 1.25 g (20%) intermedijera 10 . d) Priređiv anje. intermedijera.1.1 Smeša intermedijera 10 (0.003 mol) i natrijum hidroksida (0.006 mol) u EtOH (80 ml) je mešana i refluksirana preko noći, zatim ohlađena do sobne temperature i rastvarač je uparen do suvog, što daje 1.3 g (100%) intermedijera 11 , tt >260°C. e). Priređivanje intermedij era12

EDC (0.0045 mol), zatim HOBt (0.0045 mol) dodani su na sobnoj temperaturi smeši

intermedijera 11 (0.003 mol) u THF (100 ml) i DCM (100 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 15 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2jt/'-piran-2-il)-hidroksilamin (0.012 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 72 časa, stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (3 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um)(eluent: DCM/MeOH/NH4OH 94/6/0.1;). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen. Rezidue (0.82 g) su sakupljene u dietil eteru. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.78 g intermedijera 12 , tačka tališta 154°C.

Primer A4

a). Priređivanje .intermedij era. 13

Smeša etil estera 2-[4-(aminometil)-l-piperidinil]- 5-pirimidinkarboksilne kiseline, (0.0049 mol), li¥-indol-3-etanol, metansulfonata (ester) (0.0054 mol) i kalijum karbonata (0.01 mol) u acetonitrilu (20 ml) je mešana i refluksirana preko noći, zatim ohlađena, stavljena u ledeno hladnu vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (2.2 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.2). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.442 g (22%) intermedijera 13 , tačka tališta 238°C. b)..Priređiv anj e. intermedyera..l4 Smeša intermedijera 13 (0.0025 mol), (2-bromoetoksi)(l,l-dimetiletil)dimetilsilana (0.0034 mol) i .V-etil--<V->(l-metiletil)- 2-propanamina (0.0038 mol) u DMSO (20 ml) je mešana na 50°C u trajanju 15 časova, zatim ohlađena do sobne temperature, stavljena u ledeno hladnu vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (1.7 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.76 g (54%) intermedijera 14 . c).Priređivanje jntermedijera 15

Smeša intermedijera 14 (0.0013 mol) i natrijum hidroksida (0.0027 mol) u EtOH (40ml) je mešana na 80°C preko noći, zatim ohlađena do sobne temperature i rastvarač je uparen, što daje 0.75 g (100%) intermedijera 15 .

d) Priređivanjejntermed<y>era. 16

EDC (0.002 mol), pa zatim HOBt (0.002 mol) dodani su na sobnoj temperaturi smeši intermedijera 15 (0.0013 mol) u THF (80 ml) i DCM (80 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 15 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2i/-piran-2-il)-hidroksilamin (0.0068 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi'u trajanju 72 časa, stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO,t), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (1.3 g) su pročišćene tiromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um )(eluent: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.38 g intermedijera 16 , e).Priređivanje jntermedijera 17

Smeša intermedijera 16 (0.0011 mol) i tetrabutilamonijum fluorida (0.0032 mol) u THF

(10 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 72 časa, stavljena u vodu pa ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj ispran je vodom, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen, što daje 0.5 g (88%) intermedijera 17 .

Primer A5

a). Priređivanje .intermedij era 45

Rastvor metil estera 2-hloro-5-pirimidinkarboksilne kiseline, (0.058 mol) u DMA (80 ml)

je dodan dokapavanjem rastvoru 4-piperidinmetanamina (0.116 mol) iN-

etildiisopropilamina (0.145 mol) u DMA (150 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 1 čas i 30 minuta, stavljena u ledeno hladnu vodu i ekstrahirana s EtOAc, zatim s DCM. Organski sloj je ispran vodom, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue su kristalizirane iz DIPE. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 10 g (65%) intermedijera 45 .

b) Priređivanj e_ intermedij era 46

Smeša intermedijera 45 (0.0024 mol), l-metil-5-nitro- l//-indol-3-karb0ksaldehida (0.0036 mol) i MgS04(0.25 g) u MeOH (80 ml) je mešana na 60°C preko noći, zatim ohlađena do sobne temperature. U porcijama je dodan natrijum tetrahidroborat (0.0041 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 18 časova, stavljena u vodu i ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue (1.1 g) su kristalizirane iz acetonitrila. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.9 g (86%) intermedijera 46 , tačka tališta: 150°C. c). Pr iređi vanje intermedij era 47 Smeša intermedijera 46 (0.002 mol) i natrijum hidroksida (0.008 mol) u EtOH (60 ml) je mešana na 60°C preko noći, zatim ohlađena do sobne temperature i uparena. Rezidue su sakupljene u dietil eteru. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.6 g (67%) intermedijera 47 đ)..Pjiređivanj e intermedij era 48

EDC (0.0019 mol) i HOBt (0.0019 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru intermedijera 47 (0.0013 mol) i trietilamina (0.0039 mol) u DCM/THF (50/50) (100 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 15 minuta. Dodan je O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)- hidroksilamin (0.0026 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 72 časa, stavljena u vodu i ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO-O, filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue (1 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad kromasila (5 um) (eluent: DCM/MeOH/NFkOH 98/2/0.2 do 92/8/0.2). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.101 g (15%) intermedijera 48 .

Primer A6

a). Priređivanje jntejmedijera 49

Rastvor metil estera 2-hloro-5-pirimidinkarboksilne kiseline, (0.033 mol) u DCM (80 ml) dodan je na sobnoj temperaturi rastvoru 4-piperidinmetanola (0.066 mol) iN-etildiisopropilamina (0.083 mol) u DCM (100 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 3 časa i 30 minuta stavljena u ledeno hladnu vodu i ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO-O, filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue su sakupljene pentanom. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 7.88 g (95%) intermedijera 49 . b) Priređivanj e. intermedij era 50 DMSO (0.058 mol) je dokapavanjem dodan na -78°C rastvoru etandioil dihlorida (0.0278 mol) u DCM (50ml) pod N2tokom. Smeša je mešana u trajanju 15 minuta. Dokapavanjem je dodan rastvor intermedijera 49 (0.023 mol) u DCM (200 ml). Smeša je mešana na - 78°C u trajanju 1 čas i 30 minuta. Dokapavanjem je dodan trietilamki (0.118 mol). Smeša je mešana na -78°C u trajanju 1 čas, izvađena i stavljena u vodu te ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue su kristalizirale iz dietil etera. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 3.06 g (54%) intermedijera 50. c).Pribivanjeinte^edijera51 Intermedijer 50 (0.0122 mol) dodan je na 5°C rastvoru 1-metil- l //-indol-3-etanamina (0.0122 mol) u MeOH (270 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana nekoliko minuta. Dodani su natrijum cijanoborhidrid (0.0183 mol) i sirćetna kiselina (0.0183 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 48 časova, izvađena i stavljena na kalijum karbonat 10% pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue (4.9 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NFLtOH 97/3/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 1.2 g (24%) intermedijera 51 . d)_ Priređivanj e. intermedij era..52 Smeša intermedijera 51 (0.0009 mol) i natrijum hidroksida (0.0039 mol) u EtOH (60 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 15 časova, zatim uparena do suvog, što daje intermedijer 52 . Ovaj intermedijer korišćen je direktno u sledećem reakcijskom stepenu. e). Priređivanje mtermedijera 53

HOBt (0.0019 mol), a zatim EDC (0.0019 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru

intermedijera 52 (0.0009 mol) i 0-(tetrahidro-2//-piran-2-il)- hidroksilamina (0.0019 mol) u DCM/THF (130 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 48 časova, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue (0.93 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH40H

97/3/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.155 g (33%) intermedijera 53 .

Primer A7

a). Prebivanje jntermedijera.54

Smeša etil estera 2-[4-(aminometiI)-l-piperidinil]- 5-pirimidinkarboksilne kiseline (0.0038 mol), l-etil-l#-indol-3-karboksaldehida (0.0049 mol) i Pd/C 10% (0.5g) u MeOH (20 ml) koji sadrži 1 ml 10% tiopenskog rastvora u EtOH, je hidrogenirana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa pod pritiskom 3 bara, zatim filtrirana preko celita. Rastvarač je uparen do suvog. Rezidue (1.8 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.2 do 93/7/0.5). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.7 g (44%) intermedijera 54 . b)..Priređivanj e. inte.rmedy.era .5.5 Natrijum hidrid 60% (0.009 mol) dodan je na 0°C rastvoru intermedijera 54 (0.0045 mol) u THF (50 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 1 čas. Dokapavanjem je dodan rastvor jodo-etana (0.0062 mol) u THF (10 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (0.6 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NHtOH 95/5/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.16 g (8%) intermedijera 55 . c).Priređivanje;.intermedijera 56

Smeša intermedijera 55 (0.0003 mol) i natrijum hidroksida (0.03g) u EtOH (15 ml) je mešana na 80°C u trajanju 6 časova, zatim uparena do suvog, što daje 0.16 g (100%) intermedijera 56 .

d)..Priređivanj e intermedij era 57

EDC (0.0005 mol) i HOBt (0.0005 mol) dodani su na sobnoj temperaturi smeši

intermedijera 56 (0.0003 mol) u DCM (20 ml) i THF (20 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana u trajanju 15 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2H-piran-2-il)- hidroksilamin (0.0007 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 72 časa, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (0.3 g) su pročišćene hromatografijom na koloni ižnad kromasila (5 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0.35). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.03 g (16%) intermedijera 57 .

Primer A8

a). Priređivanje .intermedijera58

Natrijum hidrid (0.011 mol) je dodan na 5°C rastvoru intermedijera 13 (0.0037 mol) u

THF (30ml) pod N2tokom. Smeša je mešana u trajanju 30 minuta. Dokapavanjem je dodan rastvor jodometana (0.0081 mol) u THF (10 ml). Smeša je mešana na 10°C u frajanju 2 časa, zatim dovedena do sobne temperature u trajanju 1 čas i 30 minuta, izvađena i stavljena u ledenu vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (1.7 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad kromasila (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH3OH 98/2/0.1). Dvije frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.265 g intermedijera 58 i 0.57 g (17%) intermedijera 10 .

b). Priređivanj e intermedij era 59

Smeša intermedijera 58 (0.0006 mol) i natrijum hidroksida (0.0012 mol) u EtOH (30 ml) je mešana na 80°C preko noći, zatim ohlađena do sobne temperature i rastvarač je uparen, što daje 0.26 g (100%) intermedijera 59 . .<?). Priređivanje intermedij era. 60

EDC (0.0009 mol) i HOBt (0.0009 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru intermedijera 59 (0.0006 mol) u THF (30 ml) i DCM (30 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 15 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2//-piran-2-il)-hidroksilamin (0.0012 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO-O, filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (0.6 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad kromasila (5 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.05 i 94/6/0.3). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.1 g (33%) intermedijera 60 .

Primer A9

a). Priređivanjejntermedij era. 6.1

DMSO (0.127 mol) je dodan na -78°C rastvoru etandioil dihlorida (0.061 mol) u DCM

(110 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana u trajanju 15 minuta. Dodan je rastvor intermedijera 8 (0.051 mol) u DCM (200 ml). Smeša je mešana na -78°C u trajanju 1 čas i 30 minuta. Dokapavanjem je dodan trietilamin (0.26 mol). Smeša je mešana na -78°C u trajanju 15 minuta, zatim dovedena do sobne temperature u trajanju 2 časa i 30 minuta. Dodana je voda. Smeša je ekstrahirana s DCM. Organski sloj

je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (14 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (20-45 um) (eluent: cikloheksan/EtOAc 70/30). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 7.6 g (57%) intermedijera 61 .

b)..Priređivanj e. intermedij era 62

Natrijum cijanoborhidrid (0.049 mol) i sirćetna kiselina (0.034ml) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru 5-hloro-l-metil-li/-Indol-3-etanamina (0.031 mol) i intermedijera 61 (0.034 mol) u MeOH (700 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa, izvađena i stavljena u kalijum karbonat 10% pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue (14.8 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (20-45 um) (eluent: DCM/MeOH/NFLjOH 95/5/0.2). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 4.52 g (32%) intermedijera 62 . c). Priređivanje inte?medijera 63 Metansulfonil hlorid (0.0049 mol) dodan je na 5°C rastvoru intermedijera 62 (0.004 mol) i trietilamina (0.008 mol) u DCM (150 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa, izvađena i stavljena u ledenu vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue (2.39 g) su sakupljene u DIPE. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 1.78 g (84%) intermedijera 63 , tačkatališta 162°C. <D. Priređivanj e. intermedij era 64

Smeša intermedijera 63 (0.0032 mol) i natrijum hidroksida (0.0128 mol) u EtOH (150 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 5 časova, zatim ohlađena do sobne temperature i sakupljena u dietil eteru. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 1.57 g (99%) intermedijera 64 , tačka tališta > 260°C.

e). Priređiyanje intermedijera. 65

EDC (0.0064 mol) i HOBt (0.0064 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru

intermedijera 64 (0.0032 mol) u THF (160 ml) i DCM (160 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 30 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2//-piran-2-il)-hidroksilamin (0.0064 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 dana, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue (2.77 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen. Rezidue (0.385 g) su kristalizirane iz smeše CH3CN/dietil eter. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.084 g intermedijera 65 , tacka tališta 179°C.

Primer A10

a).Priređivahe.inte

Rastvor etil estera 2-(metilsulfonil)-5-pirimidinkarboksilne kiseline acid (0.094 mol) u acetonitrilu (240 ml) dodan je na sobnoj temperaturi rastvoru 1,1-dimetiletil estera 4-piperidinil-karbamske kiseline (0.078 mol) i kalijum karbonata (0.156 mol) u acetonitrilu (120 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, izvađena i stavljena u ledenu vodu pa ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj ispran je vodom, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue su kristalizirale iz dietil etera. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 14.4 g (53%) intermedijera 66 , tačka tališta 160°C.b).Priređjvary\e.interm

TFA (20 ml) je dodan na sobnoj temperaturi rastvoru intermedijera 66 (0.0225 mol) u

DCM (110 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 15 časova, izvađena i stavljena u vodu pa zalužena s kalijum karbonatom. Smeša je ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen, što daje 5.5 g (98%) intermedijera 67 .

Primer Ali

a). Priređivanje;jntermedijera.6.8

Natrijum hidrid 60% u ulju (0.0069 mol) dodan je na 0°C rastvoru etil estera 2-metil-l//- indol-3-sirćetne kiseline (0.0046 mol) u THF (10 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 1 čas. Dodan je jodoetan (0.006 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 časova i izvađena pa stavljena u EtOAc i zasićeni NaCl. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen do suvog. Rezidue (1.1 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: cikloheksan/EtOAc 80/20). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.73 g (65%) intermedijera 68 . b). Priredi vanj e. intermedij era 69 Rastvor diisobutilaluminijum hidrida u toluenu (0.0045 mol) dodan je dokapavanjem na -78°C rastvoru intermedijera 68 (0.003 mol) u DCM (15ml) i 1,2-dimetoksietanu (15 ml) (molekularna sita: 3 angstrom) pod N2tokom. Smeša je mešana na-78°C u trajanju 3 časa, zatim je reakcija zaustavljena s HC1 3N i ekstrahirana s DCM. Organski sloj ispran je vodom, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen do suvog, što daje 0.7 g (>100%) intermedijera 69 . c). Priređivanje jntermedijera 70 Titanijum (IV) etoksid (0.0023 mol) je dodan smeši intermedijera 67 (0.0021 mol) i intermedijera 69 (0.0021 mol) u 1,2-dihloro-etanu (25 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 30 minuta. U porcijama je dodan natrijum tris(acetato-a-0)hidro-borat(l-) (0.0023 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 18 časova, zatim je reakcija zaustavljena s NaHC03pa je smeša ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen do suvog. Rezidue (1.2 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (5 um) (eluent: DCM/MeOH/NEUOH 95/5/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.2 g (21%) intermedijera 70 . .4). Priređivanj e intermedij era 71

Smeša intermedijera 70 (0.0004 mol) i natrijum hidroksida (0.0009 mol) u EtOH (30 ml) je mešana na 60°C preko noći, zatim ohlađena do sobne temperature pa uparena, što daje 0.2 g (100%) intermedijera 71 .

e). Priređi vanj e intermedij era 72

EDC (0.0007 mol) i HOBt (O.lg) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru intermedijera 71 (0.0004 mol) i trietilamina (0.0009 mol) u DCM/THF (40 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 15 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2//-piran-2-il)-hidroksilamin (0.0009 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 72 časa, izvađena i stavljena na vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue (0.4 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad kromasila (5 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0.1 do 90/10/1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.087 g (37%) intermedijera 72 .

Primer A12

a). Priredi<y>anje intermedijera 73

Intermedijer 50 (0.0046 mol) dodan je na 5°C rastvoru 6-metoksi-l-metil-l//-indol-3-etanamina (0.0046 mol) u MeOH (100 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana u trajanju 30 minuta. Natrijum cijanoborhidrid (0.0068 mol), a zatim sirćetna kiselina (0.0046 mol) su dodani u porcijama. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 48 časova, izvađena i stavljena iznad kalijum karbonata 10% pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (4 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um)) (eluent: DCM/MeOH/NHUOH 96/4/0.2). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen. Deo (0.7 g) rezidua (2.2 g) je kristalizirao iz acetonitrila. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.43 g (61%) intermedijera 73 , tačka tališta 122°C.

b). Priređivan^je intermedij era 74

Smeša intermedijera 73 (0.0015 mol) i natrijum hidroksida (0.006 mol) u EtOH (90 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 8 časova, zatim uparena do suvog, što daje intermedijer 74 c) Priređivah

HOBt (0.003 mol), a zatim EDC (0.003 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru

intermedijera 74 (0.0015 mol) i 0-(tetrahidro-2#-piran-2-il)- hidroksilamina (0.003 mol) u THF/DCM (200 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 48 časova, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (1.1 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (10 um) (eluent: DCM/MeOH/NHiOH 95/5/0.5). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen. Rezidue (0.24 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (10 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.5). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje.0.17 g (21%) intermedijera 75 .

Primer Al3

a). Priredi:yanj e jntermedijera 76

Smeša 6-metoksi-l/f-indol-3-etanamina (0.053 mol) i 1,3-isobenzofurandiona (0.058 mol) u toluenu (130 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 48 časova, zatim filtrirana. Filtrat je uparen, što daje 5.4 g (32%) intermedijera 76 . b) .Priređivanj e intermedij era 77

Rastvor intermedijera 76 (0.017 mol) u DMF (19ml) dodan je dokapavanjem na sobnoj

temperaturi suspenziji natrijum hidrida (0.034 mol) u DMF (11 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 1 čas i 30 minuta. Dodan je 1-jodo-propan (0.034 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 1 čas i 15 minuta. Dodan je zasićeni rastvor NaCl. Smeša je ekstrahirana s EtOAc. Organski

sloj ispran je vodom, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen, što daje 4.9 g

intermedijera 77 . Ovaj proizvod je korišten direktno u sledećem reakcijskom stepenu.

c). Pribivanje intermedij era 78

Smeša intermedijera 77 (0.068 mol) i hidrazin monohidrata (0.068 mol) u EtOH (60 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 1 čas, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen, što daje 3.53 g intermedijera 78 . Ovaj proizvod je korišten direktno u sledećem reakcijskom stepenu. 4)..Priređivanj e intermedij era 79

Natrijum cijanoborhidrid (0.024 mol) i sirćetna kiselina (0.0167 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru intermedijera 61 (0.0167 mol) i intermedijera 78 (0.015 mol) u MeOH (380 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana u trajanju 30 minuta, izvađena i stavljena na kalijum karbonat 10% pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (8.84 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 nm) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.2). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 2.85 g (40%) intermedijera 79 .

_e).Priređivanje intermedijera. 80.

Smeša intermedijera 79 (0.0028 mol), jodo-etana (0.0056 mol) i trietilamina (0.0085 mol) u DMF (60 ml) je mešana na 50°C u trajanju 7 časova, izvađena i stavljena na ledenu vodu pa ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj je ispran vodom, osušen (MgS04), filtriran i rastvarač je uparen. Rezidue (1.8 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad kromasila (5 um) (eluent: DCM/MeOH 100/0 do 95/5). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 1.1 g (78%) intermedijera 80 .

fj Priredivanje .intermed^era .81

Smeša intermedijera 80 (0.0022 mol) i natrijum hidroksida (0.0088 mol) u EtOH (100 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 6 časova, zatim mešana na sobnoj temperaturi preko noći i uparena do suvog. Rezidue su sakupljene u dietil eteru. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.965 g (88%) intermedijera 81 , tačka tališta > 260°C.

g)[.Priređivanje .intermedy_era 82

a). Priređivanje .intemedijera 83

Smeša intermedijera 62 (0.0034 mol) i natrijum hidroksida (0.0134 mol) u EtOH (150 ml)

je mešana na 80°C u trajanju 3 časa, zatim ohlađena do sobne temperature i uparena do suvog. Rezidue su sakupljene u dietil eteru. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 1.18 g (78%) intermedijera 83 , tačka tališta > 260°C.

EDC (0.0038 mol) i HOBt (0.0038 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru intermedijera 81 (0.0019 mol) u THF (100 ml) i DCM (100 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 30 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2//-piran-2-il)-hidroksilamin (0.0038 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 48 časova, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (1.2 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad kromasila (5 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.05 do 93/7/0.35). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.114 g intermedijera 82 .

Primer A14

b) Priređivanje: jntermedijera..84

EDC (0.0052 mol) i HOBt (0.0052 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru intermedijera 83 (0.0026 mol) u THF (120 ml) i DCM (120 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 30 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2//-piran-2-il)-hidroksilamin (0.0052 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 6 dana, izvađena i stavljena u ledenu vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (2 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.5). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen. Rezidue (0.75 g, 55%) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad kromasila (10 nm) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.5). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.625 g intermedijera 84 . Ovaj proizvod je korišten direktno u sledećem reakcijskom stepenu. Primer Al 5 Priređivanje intermedijejra.85 4-Piperidinmetanamin (0.65 mol) i kalijum karbonat (96 g) mešani su u acetonitrilu (1000 ml) i zatim je dodan rastvor etil estera 2-(metilsulfonil)-5-pirimidinkarboksilne kiseline (0.37 mol) u acetonitrilu (500 ml), dokapavanjem na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Reakcijska smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi i rastvarač je uparen. Rezidue su mešane u vodi i smeša je ekstrahirana s DCM (2 x 500 ml). Organski sloj je odvojen, ispran vodom, osušen (MgS04), otfiltriran, i rastvarač je uparen. Rezidue su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (eluent 1: EtOAc/heksan 1/1; eluent 2: MeOH + malena količina NH4OH). Frakcije produkta su sakupljene, pomešane s kašom kalijum karbonata i smeša je ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), otfiltriran, i rastvarač je uparen, što daje 31 g (32 %) intermedijera 85 . Primer Al 6 a). Priređivanje .intermedij era 86

Natrijum hidrid (0.0095 mol) je dodan na 5°C rastvoru 5-hloro-l//-indol-3-karboksaldehida (0.0056 mol) u THF (52 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana na 0°C u trajanju 1 čas. Dodan je 1-jodo-propan (0.0067 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 2 dana, izvađena i stavljena u vodu pa ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen, što daje 1.5 g intermedijera 86 . Ovaj proizvod je korišten direktno u sledećem reakcijskom stepenu.

b). Priređivanj e jntermedij era. 87

Natrijum cijanoborhidrid (0.0068 mol) i sirćetna kiselina (0.0046 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru intermedijera 85 (0.0042 mol) i intermedijera 86 (0.0051 mol) u MeOH (120 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana i refluksirana u trajanju 2 dana, zatim ohlađena do sobne temperature, izvađena i stavljena na kalijum karbonat 10% pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (2.42 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NKUOH 95/5/0.2). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 1.2 g (60%) intermedijera 87 . c). Priređivanje .intermedij era 88 Smeša intermedijera 87 (0.0025 mol) i natrijum hidroksida (0.01 mol) u EtOH (120 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 4 časa, zatim uparena do suvog. Rezidue su sakupljene u dietil eteru. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.845 g (72%) intermedijera 88 , tačka tališta >260°C. d). Priredi vary\^

EDC (0.0036 mol) i HOBt (0.0036 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru

intermedijera 88 (0.0018 mol) u THF (90 ml) i DCM (90 ml) pod N2tokom. Smeša je mešana u trajanju 30 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2//-piran-2-il)- hidroksilamin (0.0036 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 3 dana, izvađena i stavljena na ledenu vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (1.3 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 92/8/0.5). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.54 g (56%) intermedijera 89 .

Primer Al 7

a). Priređi vanje intermedijera. 90

Metansulfonil hlorid (0.004 mol) je dodan na 10°C rastvoru l,2-dimetil-l#-indol-3-etanola (0.0026 mol) i trietil amina (0.008 mol) u DCM (10 ml) pod N2 tokom: Smeša je mešana na 10°C u trajanju 4 časa. Rastvarač je uparen do suvog, što daje intermedijer 90 . Ovaj proizvod je korišten direktno u sledećem stepenu. b)[.Priređivaheintermed Smeša intermedijera 85 (0.0054 mol), intermedijera 90 (0.0075 mol) i kalijum karbonata (0.021 mol) u acetonitrilu (150 ml) je mešana i refluksirana u trajanju 2 dana, zatim ohlađena do sobne temperature, izvađena i stavljena na ledenu vodu pa ekstrahirana s EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (MgS04), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (1.88 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (15-40 um) (eluent: DCM/MeOH/NFLtOH 97/3/0.1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.15 g (7%) intermedijera 91 . c). Priređivanje intermedijera 92

Smeša intermedijera 91 (0.0003 mol) u natrijum hidroksidu (0.0014 mol) i EtOH (20 ml)

?

je mešana i refluksirana u trajanju jedan dan, zatim ohlađena do sobne temperature pa uparena do suvog. Rezidue su sakupljene u dietil eteru. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.12 g (82%) intermedijera 92 , tačka tališta > 260°C.

d) Priređivanje, intermedij era. 93

EDC (0.0005 mol) i HOBt (0.0005 mol) su dodani na sobnoj temperaturi rastvoru

intermedijera 92 (0.0002 mol) u THF (15 ml) i DCM (15 ml). Smeša je mešana u trajanju 15 minuta. Dodan je 0-(tetrahidro-2#-piran-2-il)-hidroksilamin (0.0005 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 4 dana, izvađena i stavljena na ledenu vodu pa ekstrahirana s DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO/t), filtriran, i rastvarač je uparen. Rezidue (0.14 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (10 um) (eluent: DCM/MeOH/NFLiOH 95/5/0.3). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.035 g (25%) intermedijera 93 .

Tabela F-l sadrži listu intermedijera koji su priređeni prema jednom od gore navedenih primera.

B. Priređivanje finalnih jedinjenja

Primer BI

Priređivanje jedinj enj a. 1 a

TFA (2ml) je dodan smeši intermedijera 3 (0.0006 mol) u MeOH (40 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 30 časova. Rastvarač je uparen. Rezidue su kristalizirale iz smeše EtOAc/dietil eter. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.31 g (86%) jedinjenja la, tačka tališta 130°C.

Alternativna sinteza jedinjenja 1

Priređi vanje jedinj enj a 1 b

Hidroksilamin (50% u vodi, 7.5 ml) i zatim NaOH IN (15 ml) dodani su na 10°C smeši intermedijera 1 (0.0098 mol) u MeOH (10 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa. Smeša je zakiseljena do pH 5-6 dodavanjem rastvora HC1 IN. Talog je otfiltriran, ispran dietil eterom i osušen. Rezidue su (4.5 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela LiChroprep® NH2 (25-40 um) (eluent: DCM/MeOH/H20 90/10/1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 3.1 g (80%). HC1 soje priređena na frakciji (0.5 g) u EtOH i talog je otfiltriran, ispran dietil eterom i osušen, što daje 0.43 g jedinjenja lb, tačka tališta 220°C.

Primer B2

Priređivanje jedi nj enj a 2

TFA (0.5 ml) je dodan smeši intermedijera 7 (0.0001 mol) u MeOH (10 ml) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa. Rastvarač je uparen. Rezidue su kristalizirale iz smeše acetonitril/dietil eter. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.036 g (50%) jedinjenja 2 , tačka tališta 205°C.

Primer B3

Pjriređivanje jedinj enj a 3

TFA (5 ml) je dodan na sobnoj temperaturi smeši intermedijera 12 (0.0014 mol) u MeOH (100 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 48 časova. Rastvarač je uparen do suvog. Rezidue su kristalizirale iz smeše EtOAc/dietil ether. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.545 g (74%) jedinjenja 3 , tačka tališta 121°C.

Primer B4

Prirediyanjejedjheha4

TFA (0.5 ml) je dodan smeši intermedijera 17 (0.0009 mol) u MeOH (80 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 4 dana. Rastvarač je uparen. Rezidue su kristalizirale iz dietil etera. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.19 g (32%) jedinjenja 4 , tačka tališta 103°C.

Primer B5

Priređivanje jedinj enj a 18

Smeša intermedijera 48 (0.0002 mol) u TFA (0.75 ml) i MeOH (15 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa. Rastvarač je uparen. Rezidue su kristalizirale iz dietil etera. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.071 g (59%) jedinjenja 18 .

Primer B6

Priređiyanj.e jedinj enj _a 19

Smeša intermedijera 53 (0.0003 mol) u TFA (1 ml) i MeOH (20 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa. Rastvarač je uparen do suvog. Rezidue su kristalizirale iz smeše MeOH/CH3CN/dietil eter. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.133 g (80%) jedinjenja 19 , tačka tališta 174°C.

Primer B7

Priređivanje

Smeša intermedijera 57 (0.00005 mol) u TFA (0.25 ml) i MeOH (10 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa. Rastvarač je uparen. Rezidue (0.04 g) su kristalizirale iz smeše CH3CN/dietil eter. Talog je otfiltriran i osušen. Rezidue (0.04 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela LiChroprep® NH2(25-40 um)

(eluent: DCM/MeOH/H20 80/20/2). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.02 g (80%) jedinj enj a 20 , tačka tališta 90°C.

Primer B8

Priređivanje jedinj enj a 21

r.

Smeša intermedijera 60 (0.0001 mol) u TFA (0.5 ml) i MeOH (10 ml) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarač je uparen. Rezidue (0.15 g) su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela LiChroprep® NH2(25-40 um) (eluent: DCM/MeOH/H20 80/20/2). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen, što daje 0.064 g (78%) jedinjenja 21 , tačka tališta 83°C.

Primer B9

.Priređivanje jedinj enj a. 22

Smeša intermedijera 65 (0.002 mol) u TFA (6 ml) i MeOH (120 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa. Rastvarač je uparen do suvog. Rezidue su kristalizirale iz smeše CH3CN/MeOH/dietil eter. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.9 g (87%) jedinjenja 22 , tačka tališta 183°C.

Primer BIO

PriređiYanj<_>ej[cdtnjenja23

Smeša intermedijera 72 (0.0001 mol) u TFA (0.5 ml) i MeOH (10 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 48 časova. Rastvarač je uparen. Rezidue su kristalizirale iz dietil etera. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.059 g (59%) jedinjenja 23 , tačka tališta 182°C.

Primer BI 1

Priređi vanje jedinj enj a. 24

Smeša intermedijera 75 (0.0003 mol) u TFA (1 ml) i MeOH (20 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa. Rastvarač je uparen do suvog. Rezidue su kristalizirale iz MeOH/CHsCN/dietil eter. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.147 g (78%) jedinjenja 24 , tačka tališta 160°C.

Primer BI2

Priređivanje jedinj enj a 2 5

Smeša intermedijera 82 (0.0009 mol) u TFA (2.5 ml) i MeOH (56 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa. Rastvarač je uparen do suvog. Rezidue su pročišćene hromatografijom na koloni iznad silika gela (25-40 um) (eluent: DCM/MeOH/HiO90/10/1). Čiste frakcije su sakupljene i rastvarač je uparen. Rezidue su kristalizirale iz DIPE. Talog je otfiltriran i osušen, što daje 0.286 g (53%) jedinjenja 25 , tačka tališta 80°C.

Primer B13

Priređivanje jedinj enj a 26

Smeša intermedijera 84 (0.0012 mol) u TFA (3 ml) i MeOH (60 ml) je mešana»asobnoj temperaturi u trajanju 24 časa. Rastvarač je uparen do suvog. Rezidue su kristalizirale iz smeše DCM/MeOH. Talog je otfiltriran, ispran dietil eterom i osušen, što daje 0.322 g (50%) jedinjenja 26 , tačka tališta 188°C.

Primer B14

Priređivanje jedinj enj a 2 7

Smeša intermedijera 89 (0.001 mol) u TFA (2.5 ml) i MeOH (50 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 24 časa, zatim uparena do suvog. Rezidue su kristalizirale iz smeše MeOH/CH3CN/dietil eter. Talog je otfiltriran, ispran vodom i osušen, što daje 0.33 g (55%) jedinjenja 27 , tačka tališta 171°C.

Primer B15

Priređivanjejedinjenja 28

Smeša intermedijera 93 (0.00007 mol) u TFA (0.2ml) i MeOH (4 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju 3 dana, zatim uparena do suvog, što daje 0.041 g (100%) jedinjenja 28 , tačka tališta 80°C.

Tabela F-2 ima listu jedinjenja koja su priređena prema jednom od gore navedenih primera. U tabelama su korištene sledeće skraćenice:.C2HF302označuje trifluoroacetatnu so, tt označuje tačku tališta.

C. Farmakološki primer:

In vitroanaliza inhibiranja histon deacetilaze (vidi primer Cl) meri inhibiranje HDAC enzimske aktivnosti koje se dobije s jedinjenjem formule (I).

Celijska aktivnost jedinjenja formule (I) određena je na A2780 tumorskim ćelijama pomoću kolorimetrijske analize za ćelijsku toksičnost ili preživljenje (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983) (vidi primer C.2).

Rastvorljivost jedinjenja meri sposobnost jedinjenja da ostane u rastvoru.

U prvoj metodi, merena je sposobnost jedinjenja da ostane u vodenom rastvoru nakon razblaženja (vidi primer C.3.a). DMSO-stock rastvori su razblaženi s jednim vodenim puferskim rastvaračem u 3 uzastopna stepena. Za svako razblaživanje merena je mutnoća s nefelometrom.

U drugoj metodi rastvorljivost jedinjenja za različite pH vrednosti može da se izmeri upotrebom hemiluminescentnog azotnog detektora (vidi primer C.3.b).

Permeabilnost leka pokazuje njegovu sposobnost da se pomera iz'jednog medija u drugi. Specifično, to je njegova sposobnost da prolazi kroz membranu creva u krvni tok te iz krvnog toka u ciljni organ. Permeabilnost (vidi primer C.4) može da se meri putem nastajanja fosfolipid dvosloja veštačke membrane koji je filterski imobilizovan. U analizi filter-imobilizovane veštačke membrane, formiranje "sendvič" s mikrotitarskom pločom od 96-jamica i filterskom pločom od 96-jamica, tako daje svaka sastavljena jamica podeljena u dve komore s donorskim rastvorom na dnu i akceptorskim rastvorom na vrhu, a deli ih 125 um mikro-filterski disk (0.45 um pore), koji je prevučen s 2%(wt/v) dodekan rastvorom dioleoilfosfatidil-holina, u uslovima da multi-lamelarni dvosloji formiraju unutar filtera kanale kadaje sistem u kontaktu s vodenim rastvorom pufera. Permeabilnost jedinjenja kroz ovu veštačku membranu meri se u cm/s. Cilj je da se vidi kolika je permeabilnost leka kroz paralelnu veštačku membranu za 2 različite vrednosti pH's: 4.0 i 7.4. Detekcija jedinjenja vrši se UV-spektrometrijom pri optimalnoj talasnoj dužini između 250 i 500 nm.

Metabolizam leka znači da se ksenobiotičko ili endobiotičko jedinjenje koje je rastvorljivo u lipidima enzimski transformiše u polarni, u vodi rastvorlj iv i izlučiv metabolit (ili metabolite). Glavni organ za metabolizam leka su džigerica. Metabolički proizvodi su često manje aktivni nego što je lek iz kojega nastaju ili su neaktivni. Međutim, neki metaboliti mogu biti pojačane aktivnosti ili toksičnog delovanja. Tako metabolizam leka može da uključuje oba procesa: "detoksikaciju" i "toksikaciju". Jedni od glavnih enzimskih sistema koji određuju sposobnost organizma da obradi lekove i hemikalije su oni koje reprezentuju citohrom P450 monooksigenaze, što su NADPH ovisni enzimi. Metabolička stabilnost jedinjenja može da se odrediin vitroupotrebom subcelularnog humanog tkiva (vidi primer C.5.a.). Ovde se metabolička stabilnost jedinjenja izražava kao % leka koji je metabolizirao posle 15 minuta inkubacije ovih jedinjenja s mikrosomima. Količina jedinjenja određuje se LC-MS analizom.

Metabolička stabilnost jedinjenja može također da se odredi merenjem vremena poluživota jedinjenja u hepatocitnim ćelijama pacova (vidi primer C.5.b.).

Pokazalo se da veliki broj antitumorskih agensa aktivira p21 protein, uključujući agense koji oštećuju DNA i inhibitore histon deacetilaze. Agensi koji oštećuju DNA aktiviraju p21 gen putem tumorskog supresora p53, dok inhibitori histon deacetilaze transkripcijski aktiviraju p21 gen preko transkripcijskog faktora Sp i. Prema tome, agensi koji oštećuju DNA aktiviraju p21 promotor putem p53 responzivnog elementa dok inhibitori histon acetilaze aktiviraju p21 promotor putem spi mesta (smešteni na -60 bp do +40 bp regionu relativno prema TATA kutiji) što oboje dovodi do povećane ekspresije p21 proteina. Kada se p21 promotor u ćelijama sastoji od p21 1300 bp promotorskcjg fragmenta koji ne sadrži p53 responzivne elemente on je onda ne-responzivru prema agensima koji

oštećuju DNA.

Kapacitet jedinjenja da izazove p21 može da se evaluira na nekoliko načina.

Prva metoda je da se tretiraju ćelije tumora s jedinj enj em od interesa i posle lize ćelija detektuje p21 indukcija s p21 enzim vezanom imunosorbent analizom (WAF1 ELISA Oncogene). p21 analiza je "sendvič" enzimski imunoesej koji koristi i mišja monoklonska antitela i poliklonska antitela kunića. Poliklonsko antitelo kunića, specifično za humani p21 protein, imobilizovano je na površini plastičnih jamica koje se sadržane u kitu. Bilo koji p21 koji se nalazi u uzorku koji treba da se ispita će da veže antitelo hvatač. Biotinilirano detektorsko monoklonsko antitelo također prepoznaje humani p21 protein, te će da veže bilo koji p21, koje je zadržano antitelom hvatačem. Detektorsko se antitelo, obrnuto, veže konjugovanim streptavidinom iz peroksidaze rena. Ren peroksidaza katalizira prevođenje hromogenog supstrata tetra-metilbenzidina iz bezbojnog rastvora do plavog rastvora (ili žutog nakon dodavanje reagensa za zaustavljanje reakcije), a njegov intenzitet proporcionalan je količini p21 proteina koji je vezan za ploču. Obojeni proizvod reakcije je kvantifikovan pomoću spektrofotometra. Kvantitativno određivanje se vrši konstrukcijom standardne krive iz poznatih koncentracija p21 (dostavljen liofilizovan). Ova analiza može da meri p21 indukciju kao posledicu DNA oštećenja ili ako posledicu inhibicije histon deacetilaze (vidi primer C.6.a.).

Druga metoda ispituje kapacitet jedinjenja da indukuje p21 kao posledicu HDAC inhibicije na razini ćelije. Ćelije mogu da budu stabilno transficirane s ekspresijskim vektorom koji sadrži p21 1300bp promotorski fragment koji ne sadrži p53 responzivne elemente i gde povećanje ekspresije reporterskog gena, poređujući s nivoima kontrole, identifikuje jedinjenje kao jedinjenje koje imap21 indukcijski kapacitet. Reporterski gen je fluorescentni protein i ekspresija reporterskog gena se meri kao količina emitovanog fluorescentnog svetla (vidi primer C.6.b.).

Ova poslednja metoda jein vivometoda gde se miševi koriste za skrining farmaceutske aktivnosti jedinjenja. Gore opisane stabilno transformisane tumorske ćelije mogu da se primene miševima u količini koja je dovoljna da deluje na proizvodnju tumora. Nakon što su tumorske ćelije imale dovoljno vremena da formiraju tumor, potencijalno aktivno jedinjenje može da se primeni životinjama i efekt navedenog jedinjenja na tumorske ćelije može da se evaluira merenjem ekspresije reporterskog gena.

Inkubiranje s farmaceutski aktivnim jedinj enj em daje kao rezultat povećanje ekspresije reporterskog gena u poređenju s kontrolnim nivoima (vidi primer C.6.C.)

Specifični HDAC inhibitori ne bi trebali da inhibiraju druge enzime kao što su zastupljeni CYP P450 proteini. CYP P450 (E. coli ekspresija) proteini 3 A4, 2D6 do 2C9 prevode njihove specifične supstrate u fluorescentnu molekulu. CYP3A4 protein prevodi 7-benziloksi-trifluorometil kumarin (BFC) u 7-hidroksi-trifluorometil kumarin. CYP2D6 protein prevodi 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamino)etil]-7-metoksi-4-metilkumarin (AMMC) u 3-[2-(N,N-dietilamino)etil]-7-hidroksi-4-metilkumarin hidrohlorid i CYP2C9 protein prevodi 7-metoksi-4-trifluorometil kumarin (MFC) u 7-hidroksi-trifluorometil kumarin. Jedinjenja koja inhibiraju enzimsku reakciju rezultiraju smanjenjem fluorescentnog signala (vidi primer C.7).

PrimerCl . : In vitroanaliza inhibiranja histon deacetilaze:

Primer Cl:a.:. In vitro analiza_s[.HJ-obeježenim.supstratom:

HeLa nuklearni ekstrakt (izvor: Biomol) inkubiranje na 60 ug/ml s 75 uM supstrata. Kao supstrat za merenje HDAC aktivnosti koristi se veštački peptid, tj. amino kiseline 14-21 histona H4. Supstrat je biotiniliran na NH2-terminalnom delu sa spejserom 6-aminoheksanske kiseline, te je zaštićen na COOH-terminalnom delu pomoću amidne grupe i specifično [<3>H]acetiliran na lizinu 16. Supstrat, biotin-(6-aminoheksanska kiselina)Gly-Ala-([<3>H]-acetil-Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH2), dodan je u pufer koji sadrži 25 raM Hepes, 1 M saharoze, 0.1 mg/ml BSA i 0.01% Triton X-100 na pH 7.4. Posle 30 min reakcija deacetiliranja završava dodavanjem HC1 i sirćetne kiseline (finalna koncentracija 0.035 mM, odnosno 3.8 mM). Nakon zaustavljanja reakcije, slobodni 3H-acetat je ekstrahiran s etil acetatom. Nakon mešanja i centrifugiranja, u p-brojaču merena je radioaktivnost alikvota gornje (organske) faze.

Za svaki eksperiment, kontrole (koje sadrže HeLa nuklearni ekstrakt i DMSO bez jedinjenja), blank inkubacija (koja sadrži DMSO ali bez HeLa nuklearnog ekstrakta ili jedinjenja) i uzorci (koji sadrže jedinjenje koje je rastvoreno u DMSO i HeLa nuklearni ekstrakt) su izvršeni paralelno. U prvoj instanci, jedinjenja su ispitana za koncentraciju 10"<5>M. Kada su jedinjenja pokazala aktivnost za koncentraciju 10"<5>M, načinjena je kriva koncentracija-odgovor gde su jedinjenja ispitana za koncentracije između 10" M i 10" M. U svakom testu blank vrednost je oduzeta od kontrole i od vrednosti uzoraka. Kontrolni uzorak reprezentuje 100% supstratne deaktilacije. Za svaki uzorak radioaktivnost je izražena kao procent srednje vrednosti kontrola. Kadaje moguće IC50-vrednosti (ona koncentracija leka koja je potrebna da se smanji količina metabolita na 50% kontrole) može da se izračuna pomoću probit analize podataka. Ovde se efekti ispitanih jedinjenja izražavaju kaoPIC50(negativna log vrednost od IC50-vrednosti) (vidi tabelu F-3).

Primer C. 1 . b. :Jnyjtro analiza s fluorescen^supstratom: Korištenje HDAC Fluorescent Activitv Assay/Drug Discovery Kit od proizvođača Biomol (kat. br. AK-500-0001). Analiza HDAC fluorescentne aktivnosti zasniva se na Fluor de Lys (Fluorogenic Histone deAcetvlase Lysyl) supstratu i kombinaciji razvijača. Fluor de Lys supstrat sadrži bočni lanac acetilovanog lizina. Deacetilacija supstrata čini osetljivim supstrat tako da, u drugom stepenu, tretiranje s Fluor de Lys razvijačem proizvodi fluorofor.

HeLa nuklearni ekstrakti (izvor: Biomol) inkubirani su na 60 ug/ml s 75 uM supstrata. Fluor de Lys supstrat je dodan u pufer koji sadrži 25 mM Tris, 137 mM NaCl, 2.7 mM KC1 i 1 mM MgCL;.6H20 na pH 7.4. Posle 30 min, dodana je 1 zapremina razvijača: Fluorofor je ekscitiran s 355 nm svetlom i emitovano svetio (450 nm) je detektirano na fluorometrijskom čitaču ploča.

Za svaki eksperiment, kontrole (koje sadrže HeLa nuklearni ekstrakt i pufer), blank inkubacija (koja sadrži pufer ali ne HeLa nuklearni ekstrakt) i uzorci (koji sadrže jedinjenje koje je rastvoreno u DMSO i dalje razblaženo puferom i HeLa nuklearni ekstrakt) su izvršeni paralelno. U prvoj instanci, jedinjenja su ispitana za koncentraciju 10'<5>M. Kada su jedinjenja pokazala aktivnost na 10"<5>M, načinjena je kriva koncentracija-odgovor gde su jedinjenja ispitana za koncentracije između 10"<5>M i 10"<9>M. Svi uzorci su ispitani 4 puta. U svakom testu blank vrednost je oduzeta od kontrole i od vrednosti uzorka. Kontrolni uzorak reprezentuje 100% supstratne deactilacije. Za svaki uzorak fluorescencija je izražena kao procent prosečne vrednosti kontrola. Kadaje moguće ICso-vrednost (ona koncentracija leka koja je potrebna da se smanji količina metabolita na 50% kontrole) može da se izračuna pomoću probit analize podataka. Ovde se efekti ispitanih jedinjenja izražavaju kao pICjo(negativna log vrednost od IC50-vrednosti) (vidi tabelu F-3).

Primer C. 2: Određivanje antiproliferacijske aktivnosti na A2780 ćelijama

Sva ispitana jedinjenja su rastvorena u DMSO i daljnja razblaživanja su načinjena u mediju kulture. Finalne koncentracije DMSO nikad nisu prelazile 0.1 % (v/v) u analizama proliferacije ćelija. Kontrole sadrže A2780 ćelije i DMSO bez jedinjenja dok blank sadrži DMSO ali bez ćelija. MTT je rastvoren na 5 mg/ml u PBS. Priređen je glicinski pufer koji sadrži 0.1 M glicina i 0.1 M NaCl koji je puferiran do pH 10.5 s NaOH (1 N) (svi reagensi su bili od tvrtke Merck).

Ćelije humanog A2780 karcinoma jajnika (ljubazni poklon od Dr. T.C. Hamilton [Fox Chase Cancer Centre, Pennsvlvania, SAD]) su odnegovane u RPMI 1640 mediju koji je obogaćen s 2 mM L-glutamina, 50 ug/ml gentamicina i 10 % seruma goveđeg zametka. Ćelije su rutinski održavane kao kulture u monosloju na 37°C u vlažnoj 5 % CO7atmosferi. Ćelije su propuštene jednom sedmično korištenjem tripsin/EDT rastvor na odnos cepanja 1:40. Svi mediji i dodaci su dobijeni od Life Technologies. Ćelije su bile bez mikoplazma kontaminacije kao što je određeno s kitom Gen-Probe Mvcoplasma Tissue Culture (izvor: BioMerieux).

Ćelije su posejane u NUNC™ ploče kultura s 96 jamica (izvor: Life Technologies) i ostavljene su da se vežu za plastiku preko noći. Gustoće koje su korištene za ploče su bile 1500 ćelija po jamici u ukupnoj zapremini od 200 ul medija. Nakon što su se sve ćelije prilepile za ploče, medij je promenjen i lekovi i/ili rastvarači su dodani do finalne zapremine 200 ul. Nakon četiri dana inkubiranja, medij je zamenjen s 200 ul svežeg medija pa su procenjene gustoća ćelija i viabilnost korištenjem MTT-bazirane analize. U svaku jamicu, dodano je 25 ul MTT rastvora i ćelije su nakon toga inkubirane 2 časa na 37°C. Medij je zatim pažljivo aspiriran i plavi MTT-formazan proizvod je rastvoren dodavanjem 25 ul glicinskog pufera i zatim 100 ul DMSO. Mikrotest ploče su mućkane 10 min na tresaču mikroploča i merena je apsorbancija na 540 nm pomoću Emax spektrofotometra s 96-jamica (izvor: Sopachem).

Unutar eksperimenta, rezultati za svaki eksperimentalni uslov su prošek za 3 replikativne vrednosti. Za potrebe početnog skrininga, jedinjenja su ispitana na jednoj fiksnoj koncentraciji od IO"<6>M. Za aktivna jedinjenja, eksperimenti su ponovljeni da se dobije potpuna kriva koncentracija-odgovor. Za svaki eksperiment, kontrole (koje ne sadrže lek) i blank inkubacija (koja ne sadrži ćelije ili lekove) su izvršene paralelno. Blank vrednost je oduzeta od vrednosti svih kontrola i uzoraka. Za svaki uzorak, prosečna vrednost za rast ćelija (u jedinicama apsorbancije) izražena je kao procent prosečne vrednosti za rast ćelija kontrole. Kadaje moguće ICso-vrednost (ona koncentracija leka koja je potrebna da se smanji količina metabolita na 50% kontrole) može da se izračuna pomoću probit analize podataka (Finney, D.J., Probit Analyses, 2<nd>Ed. Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). Ovde se efekti ispitanih jedinjenja izražavaju kao pICso(negativna log vrednost od IC50-vrednosti) (vidi tabelu F-3).

Primer C. 3: Rastvorliivost/ stabilnost

C..3.1..Rastyoryiypst u

U prvom stepenu razblaživanja, 10 ul koncentriranog stock-rastvora aktivnog jedinj enj a, koji je solubilizovan u DMSO (5 mM), dodano je u 100 ul fosfatnog citratnog pufera pH 7.4 i mešano. U drugom stepenu razblaživanja, alikvot (20 ul) iz prvog stepena razblaživanja je otpipetiran u 100 jal fosfatnog sitratnog pufera pH 7.4 te promešan. Najzad, u trećem stepenu razblaživanja, uzorak (20 ul) iz drugog stepena razblaživanja je razblažen u 100 jul fosfatnog citratnog pufera pH 7.4 te promešan. Sva razblaživanja su izvršena u pločama s 96 jamica. Neposredno nakon poslednjeg stepena razblaživanja merenaje mutnoća tri uzastopna stepena razblaživanja s nefelometrom. Razblaživanje je načinjeno u triplikatu za svako jedinjenje da se isključe slučajne greške. Bazirano na merenjima mutnoće, izvršeno je rangiranje u tri klase. Jedinjenja š visokom rastvorljivošću imaju skor 3 i za ova jedinjenja prvo razblaženje je čisto. Jedinjenja sa srednjom rastvorlj ivošću dobila su skor 2. Za ova jedinjenja prvo razblaženje je nečisto i drugo razblaženje je čisto. Jedinjenja sa slabom rastvorlj ivošću dobila su skor 1 i za njih su i prvo i drugo razblaženje nečisti (vidi tabelu F-3).

C.3.b..Rastyprljiyps^st^^ nar??

Rastvorljivost jedinjenja, na različitim pH vrednostima, može da se izmeri upotrebom hemiluminescentnog azotnog detektora, (vidi tabelu F-3).

Primer C. 4: Paralelna analiza permeabilnosti veštačkih membrana

Stock uzorci (alikvoti 10 ul stock rastvora od 5 mM u 100 % DMSO) su razblaženi u deep-well ili pre-mix ploči koja sadrži 2 ml vodenog puferskog sistema pH 4 ili pH 7.4 (PSR4 koncentrat sistemskog rastvora (pION)).

Pre nego su uzorci dodani u referentnu ploču, dodano je 150 jal pjifera jamicama i obavljeno je blank UV merenje. Nakon toga je pufer bačen i ploče su korištene kao referentne ploče. Sva merenja su obavljena u UV-rezistentnim pločama (izvor: Costar ili Greiner).

Nakon blank merenja referentne ploče, dodano je 150 jal razblaženih uzoraka u referentnu ploču i 200 ul razblaženih uzoraka je dodano u donorsku ploču 1. Akceptorska filterska ploča 1 (izvor: Millipore, type: MAIP N45) prevučena je s 4 jal rastvora koji formira veštačku membranu (l,2-dioleoil-sn-glicer-3-fosfoholin u dodekanu koji sadrži 0.1% 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol i štavljenje na vrh donorske ploče 1 da formira "sendvič". Pufer (200 ul) je otpipetiran u akceptorske jamice na vrhu. Sendvič je pokriven s poklopcem i spremljen u trajanju 18 h na sobnoj temperaturi u tami.

Blank merenje akceptorske ploče 2 izvršeno je dodavanjem 150 ul pufera u jamice, nakon čega sledi merenje UV. Nakon blank merenja akceptorske ploče 2 pufer je odbačen i 150 ul akceptorskog rastvora je preneseno iz akceptorske filter ploče 1 u akceptorsku ploču 2. Zatim je akceptorska filterska ploča 1 uklonjena iz sendviča. Nakon blank merenja donorske ploče 2 (vidi gore), 150 ul donorskog rastvora preneseno je iz donorske ploče 1 u donorsku ploču 2. UV spektar donorske ploče2, akceptorske ploče 2 i jamice referentne ploče su skenirani (sa SpectraMAX 190). Svi su spektri obrađeni da se izračuna permeabilnost s PSR4p komandnim softverom. Sva jedinjenja su merena u triplikatu. Karbamazepin, griseofulvin, aciklogvanisin, atenolol, furosemid i hlorotiazid su korišteni kao standardi u svakom eksperimentu. Jedinjenja su rangirana u 3 kategorije ovisno o tome imaju li slabu permeabilnost (prosečni efekt < 0.5 x IO"<6>cm/s; skor 1), srednju permeabilnost (1 x IO"<6>cm/s> prosečni efekt > 0.5 x IO"<6>cm/s; skor 2) ili visoku permeabilnost (> 1 x IO'6 cm/s; skor 3).

Primer C. 5: Metabolička stabilnost

Primer C. 5, a.

Priređivanja subcelularnog tkiva su izvršena prema Gorrodet al.(Xenobiotica 5: 453-462, 1975) centrifugalnim odvajanjem nakon mehaničke homogenizacije tkiva.

Tkivo džigerice je isprano u ledeno hladnom 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4) puferu da se ispere suvišak krvi. Tkivo je zatim osušeno, odvagnuto i grubo sečeno s hirurškim makazama. Komadići tkiva su zatim homogenizovani u 3 zapremine ledeno hladnog 0.1 M fosfatnog pufera (pH 7.4) korištenjem bilo Potter-S (Braun, Italija) koji je opremljen teflonskim tučkom ili Sorvall Omni-Mix homognenizatora, u trajanju 7x10 sec. U oba slučaja, sud je držan u ledu ili na ledu tokom procesa homogenizacije.

Homogenati tkiva su centrifugurani na 9000 x g u trajanju 20 minuta na 4 °C korištenjem Sorvall centrifuge ili Beckman ultracentrifuge. Dobijeni supernatant je spremljen na -80 °C i obeleženkao 'S9'.

S9 frakcija može da se dodatno centrifugira na 100.000 x g u trajanju 60 minuta (4 °C) korištenjem Beckman ultracentrifuge. Dobijeni supernatant je pažljivo aspiriran, odliven je alikvot i označen kao 'citosoP. Talog je ponovo suspendovan u 0.1 M fosfatnom puferu (pH 7.4) u finalnoj zapremini od 1 ml na 0.5 g originalnog tkiva i označen kao 'mikrosomi'.

Sve subcelulame frakcije su podeljene u alikvote, odmah zamrznute u tečnom azotu i spremljene na -80 °C sve do upotrebe.

Za uzorke koje treba da se ispitaju, inkubacijska smeša je sadržavala PBS (0.1M), jedinjenje (5 uM), mikrosome (1 mg/ml) i NADPH-generirajući sistem (0.8 mM glukoza-6-fosfat, 0.8 mM magnezijum hlorid i 0.8 jedinica glukoza-6-fosfat dehidrogenaza). Kontrolni uzorci su sadržavali isti materijal ali su mikrosomi zamenjeni toplinski inaktiviranim (10 min na 95 stepena celzijusa) mikrosomima. Prinos jedinjenja u kontrolnim uzorcima je uvek bio 100%.

Smeše su prethodno inkubirane u trajanju 5 min na 37 stepena celžijusa. Reakcija je započeta u vremenu nula (t = 0) dodatkom 0.8 mM NADP i uzorci su inkubirani u trajanju 15 min (t = 15). Reakcija je završena dodavanjem 2 zapremine DMSO. Zatim su uzorci centrifugirani u trajanju 10 min na 900 x g i supernatanti su spremljeni na sobnoj temperaturi ne dulje od 24 h pre analize. Sve inkubacije su izvršene u duplikatu. Analiza supernatanta je izvršena s LC-MS analizom. Ispiranje svih uzoraka su izvršena na Xterra MS Cl8 (50 x 4.6 mm, 5 um, Waters, SAD). Korištenje HPLC sistem Alliance 2790 (izvor: Waters, SAD). Ispiranje je vršeno puferom A (25 mM amonijum acetat (pH 5.2) u H20/acetonitril (95/5)), rastvarač B bio je acetonitril i rastvarač C metanol uz brzinu toka od 2.4 ml/min. Gradijent koji je korišten bio je povećanje koncentracije organske faze od 0 % preko 50 % B i 50 % C u 5 min sve do 100 % B u 1 min na linearni način i koncentracija organske faze je održavana konstantnom daljnjih 1.5 min. Ukupna injicirana zapremina bila je 25 ul.

Kao detektor korištenje Cjuattro (izvor: Micromass, Manchester, UK) trostruki kvadrupolni maseni spektrometar opremljen sa ESI izvorom. Temperatura izvora i temperatura desolviranja su postavljene na 120, odnosno 350 i azot je korišten kao nebulizator i gas za sušenje. Podaci su sakupljeni u pozitivnom načinu skeniranja (reakcija jednog jona). Konusna napetost je postavljena na 10 V i vreme zaostanka bilo je 1 sec. Metabolička aktivnost je izražena kao postotak metabolizma jedinjenja posle 15 min inkubiranja u prisutnosti aktivnih mikrosoma

Jedinjenja koja imaju procent metabolizma manji od 20 % defiriisana su kao jako metabolički stabilna. Jedinjenja koja su imala metabolizam između 20 i 70 % definisana su kao srednje stabilna i jedinjenja koja su imala procent metabolizma veći od 70 bila su definisana kao slabo metabolički stabilna. Tri referentna jedinjenja bila su uvek uključena kada se vršio skrining metaboličke stabilnosti. Verapamil je bio uključen kao jedinjenje koje ima slabu metaboličku stabilnost (% metabolizam = 73 %). Cisaprid je bio uključen kao jedinjenje koje ima srednju metaboličku stabilnost (% metabolizam 45 %) i propanol je bio uključen kao jedinjenje s intermedijer visoke metaboličke stabilnosti (25 % metabolizam). Ova referentna jedinjenja su korištena da se potvrdi analiza metaboličke stabilnosti.

C.5..b; Metabolička stabilnost

Hepatociti pacova su izolirani iz Sprague Dowley pacova. Jedinjenja su rastvorena u 5 mM stock rastvora u 100% DMSO i inkubirana na finalnoj koncentraciji od 5 uM u trajanju 0, 15, 30, 60 i 120 min s ćelijskom kulturom hepatocita pacova (0.5 miliona viabilnih ćelija/ 0.5 ml) korištenjem ploča s 24 jamice.

Uzorci su priređeni za LC-MS dodavanjem dve zapremine DMSO. Uzorci su dobro promućkani i posle toga centrifugirani na 900gu trajanju 10 min (sobna temperatura). Svi eksperimenti su izvršeni u triplikatu. 50 ul dobijenog supernatanta je analizirani pomoću

LC-MS.

Za LC-MS, ispiranje uzoraka izvršeno je na Hvpersil BDS C18 koloni (50 x 4.6 mm, 5 um, Thermohvpersil, UK). HPLC sistem sačinjen je od Survevor sistema za unos (Survevor Inc., San Jose, SAD) koji je opremljen sa Survevor autosamplerskim uređajem. Ispiranje je vršeno s puferom A (10 mM amonijum acetat (pH 6.9) u HbO/acetonitril (95:5)) i rastvaračem B (acetonitril) s brzinom toka od 1.2 ml/min. Gradijent koji je korišten bio je 0.5 min rastvarač A kao uslovi na početku nakon čegaje sledilo povećanje koncentracije organske faze od 0 % B sve do 95% B tokom 2 min na linearni način. Ova faza je održavana stacionarnom sledećih 2 min i smanjena je ponovo do 0% B unutar 0.5 min.

Totalna zapremina uzoraka za injiciranje bila je 50 uL. Temperatura kolone je održavana na 40 °C. LC tok je cepan za MS detektovanje i 0.1 ml ostavljen kao izvor.

Za detektovanje je korišten trostruki kvadrupolni maseni spektrometar TSQ Quantum (Thermofinnigan, LaJolla, SAD) koji je opremljen ESI izvorom. Napetost izvora je postavljena na 3800 volti, a temperatura kapilare na 300 °C. Maseni spektrometar je radio u pozitivnom jonskom načinu u SIM te je adjustiran na masu M+H sa širinom sjcena od 1 Da za potrebu kvantifikacije. Kontrola instrumenta, akvizicija podataka i obrada izvršeni su sa Xcalibur softverom (ThermoFinnigan, San Jose, CA, SAD). Metabolička stabilnost jedinjenja u hepatocitima pacova izražena je kaoin vitropoluživoti.

Kao referenca, korišteno je jedinjenje R306465 (WO03/76422)( in vitrovreme poluživota: 8 min). Jedinjenje 1 i jedinjenje i jedinjenje 5 su ispitani i imali suin vitrovreme poluživota od 81 min., odnosno 60 min.

Primer C. 6: p21 indukcijski kapacitet

Primer C.6.a: p21 enzim vezana imunosprbent analiza

Sledeći protokol je primenjen da se odredi nivo ekspresije p21 proteina u humanim ćelijama A2780 karcinoma jajnika. A2780 ćelije (20000 ćelija /l 80 ul) su posejane u ploče s 96 jamica u RPMI 1640 mediju kojemu su dodani s 2 mM L-glutamina, 50 ug/ml gentamicina i 10 % seruma goveđeg zametka. 24 časova pre lize ćelija, jedinjenja su dodana s finalnom koncentracijom od IO"<5>, IO'<6>, IO"<7>i 10"<8>M. Sva jedinjenja koja su ispitana rastvorena su u DMSO i daljnja razblaživanja su načinjena u mediju kulture. 24 časova nakon dodavanja jedinjenja, supernatanti su uklonjeni iz ćelija. Ćelije su isprane s 200 jal ledeno hladnog PBS. Izvršeno je usisavanje iz jamica^ dodano je 30 ul lizin pufera (50 mM Tris.HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 % Nonidet p40 i 10 % glicerol). Ploče su inkubirane preko noći na -70 °C.

Odgovarajući broj mikrotitarskih jamica izvađen je iz folijskog omotača i stavljen na prazni držač jamica. Priređen je radni rastvor (lx) pufer za ispiranje (20x koncentrat za ispiranje ploča: 100 ml 20-struko koncentriran rastvor PBS i površinski aktivnog rastvora, sadrži 2 % hloroacetamida). Liofilizovani p21 WAF standard je rekonstituisan s destilovanom H2O i dalje razblažen sa razblaživačem uzoraka (dostavljeno u kitu).

Uzorci su priređeni njihovim razblaživanjem 1:4 u razblaživaču uzoraka. Uzorci (100 ul) i p21 WAF1 standardi (100 jal) su otpipetirani u odgovarajuće jamice i inkubirani na sobnoj temperaturi 2 časa. Jamice su isprane 3 puta s lx puferom za ispiranje i zatim je 100 jal reagensa detektorskog antitela (rastvor biotiniliranog monoklonskog p21 WAF1 antitela) pipetirano u svaku jamicu. Jamice su inkubirane na sobnoj temperaturi u trajanju 1 čas i zatim isprane tri puta s lx puferom za ispiranje. 400x konjugat (peroksidaza streptavidin konjugat: 400-struko koncentriran rastvor) je razblažen i jamicama je dodano 100 jal lx rastvora. Jamice su inkubirane na sobnoj temperaturi 30 min i zatim isprane 3 puta s lx puferom za ispiranje i 1 puta s destilovanom H2O. Rastvor supstrata (hromogeni supstrat)

(100 ul) je dodan u jamice i jamice su inkubirane 30 minuta u tami na sobnoj temperaturi. Rastvor za zaustavljanje reakcije je dodan u svaku jamicu istim redosledom kao što je pre bio dodavan rastvor supstrata. Apsorbancija svake jamice je merena pomoću spektrofotometarskog čitača ploča za sve talasne dužine 450/595 nm.

Za svaki eksperiment, kontrole (koje ne sadrže lek) i blank inkubiranje (ne sadrže nikakve ćelije ili lekove) su izvršene paralelno. Vrednosti za blank su oduzete od vrednosti za sve kontrole i sve uzorke. Za svaki uzorak, vrednost za p21 WAF1 indukciju (u jedinicama apsorbance) su izražene kao procent vrednosti za p21 WAF1 koji se nalazi u kontroli. Procent koji je veći od 130 % definisan je kao značajna indukcija. Ispitano je devet jedinjenja i sva su pokazala značajnu indukciju na 10-<6>M.

Primer C.6.b.: Ćelijiska .metoda

A2780 ćelije (ATCC) su negovane u RPMI 1640 mediju kojemu je dodano 10% FCS, 2 mM L-glutamina i gentamicina na 37°C u vlažnom inkubatoru s 5%C02. Svi rastvori ćelijske kulture su dobijeni od Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). Ostali materijali su proizvedeni od tvrtke Nunc.

Genomska DNA je ekstrahirana iz proliferirajućih A2780 ćelija i korištena kao šablon za ugneždeno PCR izdvajanje p21 promotora. Prvo pojačavanje je izvršeno tokom 20 ciklusa na temperaturi zagrevanja 55°C korištenjem oligonukletoidnog para

GAGGGCGCGGTGCTTGG i TGCCGCCGCTCTCTCACC s genomskom DNA kao šablonom. Dobijeni 4.5 kb fragment koji sadrži -4551 do +88 fragihent relativno prema TATA kutiji je ponovo pojačan s oligonukleotidima

TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG i ATA CTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC

tokom 20 ciklusa sa zagrevanjem na 88°C što daje 4.5 kb fragment i posle toga s oligonukleotidnim parom TCG GGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC i ATA CTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC tokom 20 ciklusa sa zagrevanjem na 88°C daje 1.3 kb fragment koji sadrži -1300 do +88 fragment relativno prema TATA kutiji. Restrikcijska mesta XhoI i KpnI koja se nalaze u oligonukleotidima (podvučena sekvenca) su korištena za subkloniranje.

Luciferaza reporter uklonjen je od pGL3-bazični i zamenjen s ZsGreen reporterom (iz pZsGreenl-Nl plazmida) na KpnI i Xbal restrikcijskim mestima. pGL3-bazični-ZsGreen-1300 sagrađen je ubacivanjem gore navedenog 1.3 kb fragmenta humanog p21 promotorskog regiona u pGL3-bazični-ZsGreen na XhoI i KpnI mesta. Svi restrikcijski enzimi su nabavljeni od Boehringer Manheim (Nemačka).

A2780 ćelije su nanesene na ploče sa 6-jamica s gustoćom 2xl0<5>ćelija, inkubirane su tokom 24 časa, te transficirane s 2 ug pGL3-bazični-ZsGreen-1300 i 0.2 ug pSV2neo vektora korištenjem Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Brussels, Belgija) kao što je opisao proizvođač. Transficirane ćelije su odabrane tokom 10 dana s G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) i odnegovane su suspenzije jedne ćelije. Posle tri sedmice, dobijeni su jedinstveni klonovi. A2780 odabrani klonovi su ekspandirani i posejani na 10000 ćelija po jamici u ploče s 96-jamica. 24 časova nakon sejanja, ćelije su tretirane dodatnih 24 časa sjedinjenjima (što deluje na spi mesta u proksimalnom p21 promotorskom regionu). Posle toga, ćelije su fiksirane s 4% PFA tokom 30' i bojane u protustruji s Hoechst bojom. p21 promotorska aktivacija koja dovodi do ZsGreen proizvodnje i time fluorescencije, praćena je pomoću Ascent Fluoroskan uređaja (Thermo Labsvstems, Brussels, Belgija).

Za svaki eksperiment, kontrole (koje ne sadrže lek) i blank inkubiranje (ne sadrže nikakve ćelije ili lekove) su izvršene paralelno. Vrednosti za blank su oduzete od vrednosti za sve kontrole i sve uzorke. Za svaki uzorak, vrednost za p21 indukciju su izražene kao procenat vrednosti za p21 koji se nalazi u kontroli. Procenat indukcije koji je veći od 130 % bio je definisan kao značajna indukcija.

Sedamdeset i jedno jedinjenje je ispitano i sva su pokazala značajnu indukciju na 10"<6>M.

PrimerC.6,c.: In yiyo_metoda

Odabrani klon je injiciran supkutano (IO<7>ćelija/200 ul) u butinu golog miša i kaliperom merljivi tumor je dobijen posle 12 dana. Počevši od 12. dana, životinjama je doziran, oralno ili intravenski, dnevno tokom 6 dana rastvarač i 20-40 mpk jedinjenja (4-10 životinja svaki). Tumori su evaluirani fluorescentno kućno razvijenim automatizovanim sistemom za snimanje celog tela (fluorescentni stereomikroskop tip Olvmpus® SZX12 opremljen s GFP filterom i vezan za CCD kameru tip JAI<®>CV-M90 koja je kontrolisana softverskim paketom koji se bazira na IMAQ Vision Sofhvare od National Instruments<®>). Kao referenca, korišteno je jedinjenje R306465 (WO03/76422). Jedinjenja su rangirana kao neaktivna (fluorescencija nije merljiva), slabija, identična ili bolja od R306465. Ispitano je jedinjenje 1 i bilo je bolje od i bilo je bolje odi R306465.

Primer C. 7: Kapacitet inhibiranja P450

Sva ispitana jedinjenja su rastvorena u DMSO (5 mM) i daljnje razblaživanje do 5 x IO"<4>M je načinjeno u acetonitrilu. Daljnja razblaživanja su načinjena u puferu za analizu (0.1M NaK fosfatni pufer pH 7.4) i finalna koncentracija rastvarača nije nikad bila veća od 2 %. Analiza za CTP3A4 protein uključuje po jamici 15 pmol P450/mg proteina (u 0.01M NaK-fosfatnom puferu + 1.15% KC1), NADPH generirajući sistem (3.3 mM glukoza-6-fosfat,

0.4 U/ml glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, 1.3 mM NADP i 3.3 mM MgCl2.6H20 u puferu za analizu) i jedinjenje u ukupnoj zapremini za analizu od 100 ul. Nakon 5 min pre-inkubacije na 37 °C pokrenuta je enzimatska reakcija dodavanjem 150 uM fluorescentnog supstrata BFC u pufer za analizu. Nakon inkubiranja 30 minuta na sobnoj temperaturi reakcija je završena nakon dodavanja 2 zapremine acetonitrila. Fluorescentno određivanje je izvršeno na talasnoj duljini ekscitacije od 405 nm i uz talasnu duljinu emisije od 535 nm. Ketokonazol (ICso-vrednost = 3 x 10 M) je uključen kao referentno jedinjenje u ovim eksperimentima.

Analiza za CYP2D6 protein uključuje po jamici 6 pmol P450/mg proteina (u 0.01M NaK-fosfatnom puferu + 1.15% KC1), NADPH generirajući sistem (0.41 mM glukoza-6-fosfat, 0.4 U/ml glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, 0.0082 mM NADP i 0.41 mM MgCl2.6H20 u puferu za analizu) i jedinjenje u ukupnoj zapremini za analizu od 100 ul. Nakon 5 min pre-inkubacije na 37 °C pokrenuta je enzimatska reakcija dodavanjem 3 uM fluorescentnog supstrata AMMC u pufer za analizu. Nakon inkubiranja 45 minuta na sobnoj temperaturi reakcija je završena nakon dodavanja 2 zapremine acetonitrila. Fluorescentno određivanje je izvršeno na talasnoj duljini ekscitacije od 405 nm i uz talasnu duljinu emisije od 460 nm. Kvinidin (ICso-vrednost < 5 x 10" M) je uključen kao referentno jedinjenje u ovim eksperimentima.

Analiza za CYP2C9 protein uključuje po jamici 15 pmol P450/mg proteina (u 0.01M NaK-fosfatnom puferu + 1.15% KC1), NADPH generirajući sistem (3.3 mM glukoza-6-fosfat, 0.4 U/ml glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, 1.3 mM NADP i 3.3 mM MgCl2.6H20 u puferu za analizu) i jedinjenje u ukupnoj zapremini za analizu od 100 ul. Nakon 5 min pre-inkubacije na 37 °C pokrenuta je enzimatska reakcija dodavanjem 200 uM fluorescentnog supstrata MFC u pufer za analizu. Nakon inkubiranja 30 minuta na sobnoj temperaturi reakcija je završena nakon dodavanja 2 zapremine acetonitrila. Fluorescentno određivanje je izvršeno na talasnoj duljini ekscitacije od 405 nm i uz talasnu duljinu emisije od 535 nm. Sulfafenazol (ICso-vrednost = 6.8 x 10"<7>M) je uključen kao referentno jedinjenje u ovim eksperimentima.

Za početni skrining, jedinjenja su ispitana pri jednoj fiksnoj koncentraciji od 1 x IO"<5>M. Za aktivna jedinjenja, eksperimenti su ponovljeni da se dobije cela kriva koncentracija-odgovor. Za svaki eksperiment, kontrole (koje ne sadrže lek) i blank inkubiranje (koje ne sadrži enzim ili lekove) su izvršene paralelno. Sva jedinjenja su ispitana u kvadroplikatu. Blank vrednost je oduzeta od svih vrednosti kontrola i uzoraka. Za svaki uzorak, prosečna vrednost P450 aktivnosti uzorka (u relativnim jedinicama fluorescencije) izražene su kao procent prosečne vrednosti P450 aktivnosti kontrole. Procent inhibicije izražen je kao 100% minus prosečna vrednost P450 aktivnosti uzorka. Kadaje bilo moguće, izračunate su ICso-vrednosti (koncentracija leka koja je potrebna da se smanji P450 aktivnost- na 50% kontrole).

D. Primer smeše: tablete s tankom prevlakom

Pjiređiv.am'ejezgre tablete

Smeša of 100 g jedinjenja formule (I), 570 g laktoze i 200 g škroba je dobro pomešano i nakon toga nakvašeno rastvorom 5 g natrijum dodecil sulfata i 10 g polivinil-pirolidona u oko 200 ml vode. Nakvašena praškasta smeša je prosejana, osušena i ponovo prosejana. Zatim je dodano 100 g mikrokristalne celuloze i 15 g hidrogeniranog biljnog ulja. Sve je dobro promešano i presovano u tablete, što daje 10.000 tableta, a svaka sadrži 10 mg jedinjenja formule (I).

Prevlaka

Rastvoru 10 g metil celuloze u 75 ml denaturisanog etanola dodan je rastvor 5 g etil celuloze u 150 ml dihlorometana. Zatim je dodano 75 ml dihlorometana i 2.5 ml 1,2,3-propantriola. 10 g polietilen glikolaje rastopljeno i rastvoreno u 75 ml dihlorometana. Ovaj poslednji rastvor je dodan prošlom i zatim je dodano 2.5 g of magnezijum oktadekanoata, 5 g polivinil-pirolidona i 30 ml koncentrirane kolor suspenzije i sve je homogenizovano. Jezgre tableta su prevučene s ovako dobijenom smešom u aparatu za prevlačenje.

Claims (12)

1. Jedinjenje formule (I), njegove iV-oksid forme, njegove farmaceutski prihvatljive adicijske soli i njegove stereohemijske izomerne forme,naznačeno timeda svaki nje ceo broj s vrednošću 0, 1 ili 2 i kadaje n jednako 0 onda je moguća diretna veza; svaki m je ceo broj s vrednošću 1 ili 2; svaki X je neovisno N ili CH; svaki Y je neovisno O, S, ili NR<4>; gde svaki R4 je vodonik, C|_6alkil, Ci-6alkiloksiCi .6alkil, C3-6cikloalkil, C3-6cikloalkilmetil, fenilC,.6alkil, -C(=0)-CHR<5>R<6>ili -S(=0)2-N(CH3)2; gde svaki R5 'R6je neovisno vodonik, amino, Ci^alkil ili aminoCi^alkil; i kadaje Y jednako NR<4>i R<2>je na 7-poziciji indolila onda R<2>i R<4>zajedno mogu da formiraju dvovaljani radikal R<1>je vodonik, Ci^alkil, hidroksiCi^alkil, Ci^alkilsulfonH Ci-6alkilkarbonil ili mono- ili di(Ci-6alkil)aminosulfonil; R2 je vodonik, hidroksi, amino, halo, Ci^alkil, cijano, C2.6alkenil, polihaloCi^alkil, nitro, fenil, Ci^alkilkarbonil, hidroksikarbonil, Ci-ealkilkarbonilamino, Ci-6alkiloksi, ili mono- ili di(Ci.6alkil)amino; R3 je vodonik, Ci^alkil, ili Ci^alkiloksi; i kada su R<2>i R<3>na susednim atomima ugljenika, oba mogu da formiraju dvovaljani radikal -0-CH2-0-.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1,naznačeno timeda svaki nje ceo broj s vrednošću 0 ili 1; svaki R4 je vodonik, Ci-6alkil, Ci-6alkiloksiC|.6alkil, C3^cikloalkil ili fenilCi_6alkil; R<1>je vodonik, Ci^alkil, hidroksiCi-6alkil, Ci-6alkilkarbonil ili C|.6alkilsulfonil; i R2 je-vodonik, halo, Ci-6alkil, cijano, nitro, polihaloCi-6alkil ili Ci-6alkiloksi.

3. Jedinjenje prema zahtevu 1 i 2,naznačeno timeda svaki nje ceo broj s vrednošću 1; svaki mje ceo broj s vrednošću 1; svaki X je neovisno N; svaki Y je neovisnoNR<4>;svaki R4 je Ci^alkil; R1 je vodonik; R2 je vodonik ili halo; i R3 je vodonik. ,

4. Jedinjenje kao što je navedeno u zahtevima 1, 2 i 3naznačeno timedaje navedeno jedinjenje jedinjenje br. la Jedinjenje br. 30 Jedinjenje br. 39 i jedinjenje br. 50 .

5. Farmaceutska smešanaznačena timeda sadrži farmaceutski prihvatljive nosače i kao aktivni sastojak terapeutski efikasnu količinu jedinjenja prema zahtevima 1 do 4.

6. Proces za priređivanje farmaceutske smeše prema zahtevu 5,naznačen timeda se farmaceutski prihvatljivi nosači i jedinjenje prema zahtevu 1 do 4 intimno pomešaju.

7. Jedinjenje prema bilo kojem zahtevu 1 do 4,naznačeno time štose koristi kao lek.

8. Upotreba jedinjenja kao što je navedeno u zahtjevima 1 do 4,naznačena timešto se odnosi na proizvodnju medikamenta za tretiranje proliferacijskih bolesti.

9. Kombinacija anti-tumorskog agensa i HDAC inhibitora kao što je navedeno u bilo kojem zahtevu 1 do 4.

10. Proces za proizvodnju jedinjenja prema zahtevu 1,naznačen timešto a) reakcija intermedijera formule (II), gde je Q tetrahidropiraniloksiaminokarbonil, koji se ovde navodi kao intermedijer formule (Il-a), s odgovarajućom kiselinom, kao na primer, trifluoro sirćetnom kiselinom, daje hidroksamsku kiselinu formule (I). b) reakcija intermedijera formule (II), gde je Q Ci.2alkiloksikarbonil, što se ovde navodi kao intermedijeri formule (II-c), s hidroksilaminom, u prisutnosti baze i u odgovarajućem rastvaraču daje hidroksamsku kiselinu formule (I)

11. Jedinjenje formule (II), njegove /V-oksid forme, njegove farmaceutski prihvatljive adicijske soli i njegove stereohemijske izomerne forme,naznačeno timeda svaki nje ceo broj s vrednošću 0, 1 ili 2 i kadaje n jednako 0 onda je moguća direktna veza; svaki m je ceo broj s vrednošću 1 ili 2; svaki X je neovisno N ili CH; svaki Y je neovisno O, S, ili NR<4>; gde svaki R4 je vodonik, Ci^alkil, Ci.^alkiloksiCi-6alkil, C3-6cikloalkil, C3.6cikloalkilmetil, fenilCi.6alkil, -C(=0)-CHR<5>R<6>ili -S(=0)2-N(CH3)2; gde svaki R51 R<6>je neovisno vodonik, amino, Ci^alkil ili aminoCi^alkil; i kadaje YjednakoNR<4>iR2<je>je na 7-poziciji indolila onda R<2>i R<4>zajedno mogu da formiraju dvovaljani radikal R<1>je vodonik, Ci^alkil, hidroksiCi-6alkil, Ci.6alkilsulfonU Ci-ćalkilkarbonil ili mono- ili di(C i .6alkil)aminosulfonil; R2 je vodonik, hidroksi, amino, halo, Ci^alkil, cijano, C2-6alkenil, polihaloCi^alkil, nitro, fenil, Ci-6alkilkarbonil, hidroksikarbonil, Ci^alkilkarbonilamino, Ci-6alkiloksi, ili mono- ili di(Ci.6alkil)amino; R3 je vodonik, Ci-6alkil, ili Ci^alkiloksi; kada su R<2>i R<3>na susednim atomima ugljenika, oni mogu da formiraju dvovaljani radikal -0-CH2-0-; i Q je Ci_2alkiloksikarbonil, hidroksikarbonil ili tetrahidropiraniloksiaminokarbohil.

12. Proces za priređivanje jedinjenja kao stoje navedeno u zahtevu 11,naznačen timešto a) reakcija jedinjenja formule (II), gde je Q hidroksikarbonil, što se ovde navodi kao jedinjenje formule (Il-b), s intermedijerom formule (III) u prisutnosti odgovarajućeg reagensa kao što je A^-(etilkarbonimidoil)-A^,j<V->dimetil-l,3-propandiamin, monohidrohlorid (EDC) i 1-hidroksi-l//-benzotriazol (HOBT) formira jedinjenja formule (Il-a), b) reakcija intermedijera formule (VI) s odgovarajućim karboksaldehidom formule (V), gde je t ceo broj s vrednošću 0 ili 1, i kada je t jednako 0 onda je moguća direktna veza, u prisutnosti odgovarajućeg reagensa, formira jedinjenja formule (Il-a), c) reakcija jedinjenja formule (II), gde je Q metil- ili etiloksikarbonil (Ci-2alkil), što se ovde navodi kao jedinjenja formule (II-c), s odgovarajućim kiselim rastvorom ili bazičnim rastvorom, formira jedinjenja formule (Il-b), d) reakcija etil estera karboksilne kiseline formule (IV) s odgovarajućim karboksaldehidom formule (V), u prisutnosti odgovarajućeg reagensa, formira jedinjenja formule (II-c), e) reakcija intermedijera formule (XIV) s odgovarajućim intermedijerom formule (XV), u prisutnosti odgovarajućeg reagensa, u podesnom rastvaraču, formira jedinjenja formule (II-c), f) reakcija intermedijera formule (X) s intermedijerom formule (XI) gde je W odgovarajuća izlazna grupa kao što je, na primer, halo, npr. fluoro, hloro, bromo ili jodo, ili sulfoniloksi radikal kao što je metilsulfoniloksi, formira jedinjenja formule (II-c), ili reakcija intermedijera formule (XII) s intermedijerom formule (XIII), gde je Wje odgovarajuća izlazna grupa kao što je gore opisano, formira jedinjenja formule (II-c).