RS52920B - Postupak identifikovanja vezujućih molekula koji mogu neutralisati virus besnila - Google Patents

Abstract

Postupak identifikovanja vezujućeg molekula koji potencijalno ima aktivnost neutralisanja virusa besnila ili molekula nukleinske kiseline koji kodira vezujući molekul, koji potencijalno ima aktivnost neutralisanja virusa besnila, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake:a) dovođenje u kontakt zbirke vezujućih molekula na površini genetskih pakovanja koja se mogu umnožavati sa virusom besnila u uslovima koji omogućavaju izvođenje vezivanja, pri čemu je zbirka vezujućih molekula proizvedena od izolovanih RNK ćelija dobijenih od ljudi koji su podvrgnuti vakcinaciji protiv besnila ili onih pojedinaca koji su bili izloženi virusu besnila.b) razdvajanje i povraćaj vezujućih molekula koji se vezuju za virus besnila od vezujućih molekula koji se ne vezuju za isti,c) izolovanje najmanje jednog povraćenog vezujućeg molekula,d) potvrđivanje da izolovani vezujući molekul ima neutrališuću aktivnost prema virusu besnila,i dalje obuhvata korak razdvajanja i povraćaja vezujućih molekula koje kodiravarijabilna teška 3-30 genska semena linja. Prijava sadrži još 4 patentna zahteva.

Description

OBLAST TEHNIKE

Pronalazak je iz oblasti medicine. Preciznije, pronalazak se odnosi na identifikovanje vezujućih molekula koji neutrališu virus besnila. Vezujući molekuli su korisni u profilaksi besnila posle izloženosti.

STANJE TEHNIKE

Besnilo je virusna infekcija proširena gotovo širom sveta, koja zahvata pre svega divlje i domaće životinje, ali obuhvata, isto tako, ljude, dovodeći do razarajućeg, gotovo nepromenjivog fatalnog encefalitisa. Na godišnjem nivou, procenjuje se da ima više od 70,000 fatalnih ishoda kod ljudi, a milioni drugih zahtevaju lečenje posle izloženosti.

Virus besnila ima oblik metka, ima omotač i jedno-struki je RNK virus, koji je klasifikovan kao pripadnik familije rabdovirusa i roda Lyssavirusa. Genom besnila kodira pet virusnih proteina: RNK-zavisnu RNK polimerazu (L); nukleoprotein (N); fosforilisani protein (P); matriks protein (M), lociran na unutrašnjoj strani proteinskog omotača virusa i glikoprotein (G) spoljašnje površine.

Protein G (62-67 kDa) jeste glikoprotein tipa-I, koji je sastavljen od 505 aminokiselina, i koji poseduje dva do četiri potencijalna N-glikozilacijska položaja, od kojih se samo jedan ili dva glikoziliraju u zavisnosti od sojeva virusa.G protein obrazuje ispupčenja, koja prekrivaju spoljašnju površinu omotača viriona, a poznato je da indukuje antitela, koja neutrališu virus.

Besnilo se može lečiti ili prevenirati i pasivnim i aktivnim imunizacijama. Profilaksa posle izloženosti besnilu uključuje brzo lokalno zbrinjavanje rane i primenu i pasivnih (imunoglobulini protiv besnila) i aktivnih (vakcine) imunizacija.

Trenutno, imunoglobulini protiv besnila (RIG) se pripremaju iz uzoraka seruma ljudi imunih na virus besnila (HRIG) ili konja imunih na virus besnila (ERIG). Nedostatak ERIG-a, kao i HRIG-a, jeste taj što nisu raspoloživi u dovoljnim količinama, a, u slučaju HRIG-a su i vrlo skupi. Pored toga, korišćenje ERIG-a bi moglo dovesti do sporednih reakcija, kao što je anafilaktički šok. Mogućnost kontaminacije poznatim ili nepoznatim patogenima pruža dodatnu zabrinutost u vezi sa HRIG-om. Da bi se prevazišli ovi nedostaci, predlaže se korišćenje monoklonskih antitela koja su u stanju da neutrališu virus besnila u profilaksi posle izloženosti. U ovoj oblasti su poznata mišja monoklonska antitela koja neutrališu virus besnila (vidi Schumacheret al,1989). Međutim, korišćenje mišjih antitelain vivoograničeno je zbog problema, povezanih sa primenom mišjih antitela ljudima, kao što je kratak polu-život u serumu, nesposobnost da se pokrenu određene funkcije humanog efektora i pobuđivanje neželjenog dramatičnog imunog odgovora prema mišjem antitelu kod čoveka (reakcija "humano anti-mišje antitelo" (HAMA)).

Odnedavno su opisana humana monoklonska antitela koja neutrališu virus besnila (vidi Dietzscholdet al.,1990, Championet al.,2000 i Hanlonet al.,2001). Da bi humana monoklonska antitela protiv besnila bila delotvorna kao HRIG u profilaksi posle izloženosti, koristila bi se mešavina monoklonskih antitela. U takvoj mešavini svako antitelo bi se vezivalo za različiti epitop ili položaj na virusu, kako bi se sprečilo iskakanje rezistentnih varijanti virusa.

Trenutno još postoji značajna potreba za novim humanim monoklonskim antitelima koja neutrališu virus besnila, a koja imaju poboljšani profilaktički potencijal posle izloženosti, posebno antitela, koja poseduju različite specifičnosti u odnosu na prepoznavanje epitopa. Ovaj pronalazak obezbeđuje takva humana monoklonska antitela koja pružaju potencijal za korišćenje u mešavinama, koje su od koristi u profilaksi posle izloženosti za široki raspon virusa besnila i njihovih varijanti, koje su rezistentne na neutralizaciju.

OPIS SLIKA

Slika 1 pruža poređenje aminokiselinskih sekvenci virusa besnila soja CVS-11 i E57 "escape" (virus koji ne podleže, beži od imunološkog prepoznavanja, prim. prev.) virusa. Ćelije inficirane virusom sakupljene su 2 dana nakon infekcije i izolovana je ukupna RNK. Proizvedena je cDNK, koja je korišćena za sekvenciranje DNK. Prikazani su regioni koji sadrže mutacije, a mutacije su označene zatamnjenjem. Slika 1A prikazuje poređenje nukleotidnih sekvenci. Brojevi iznad aminokiselina označavaju brojeve aminokiselina iz glikoproteina virusa besnila, uključujući signalni peptid. Slika 1B prikazuje poređenje aminokiselinskih sekvenci. Na vrhu je prikazan šematski crtež glikoproteina virusa besnila. Crni kvadrat označava signalni peptid, dok sivi kvadrat označava transmembranski domen. Sekvence na Slici 1 predstavljene su, takođe, kao SEQ ID No:130-141.

Slika 2 pruža poređenje aminokiselinskih sekvenci virusa besnila soja CVS-11 i "escape" virusa EJB. Ćelije inficirane virusom sakupljene su 2 dana nakon infekcije i izolovana je ukupna RNK. Proizvedena je cDNK, koja je korišćena za sekvenciranje DNK. Prikazani su regioni koji sadrže mutacije, a mutacije su naznačene zatamnjenjem. Slika 2A prikazuje poređenje nukleotidnih sekvenci. Brojevi iznad aminokiselina označavaju brojeve aminokiselina iz glikoproteina virusa besnila, uključujući signalni peptid. Slika 2B prikazuje poređenje aminokiselinskih sekvenci. Na vrhu je prikazan šematski crtež glikoproteina virusa besnila. Crni kvadrat označava signalni peptid, dok sivi kvadrat označava transmembranski domen. Sekvence na Slici 2 predstavljene su, takođe, kao SEQ ID No:142-151.

Slika 3 prikazuje vektor PDV-C06.

Slika 4 prikazuje kompetitivnu ELISA-u scFv-a protiv virusa besnila i biotinizovanog antitela protiv virusa besnila, nazvanog CR-57. ELISA ploče, koje su presvučene prečišćenim G proteinom virusa besnila, inkubirane su sa odgovarajućim scFv pre dodavanja CR-57bio (0.5 [ xg/ m\). Nakon toga je praćeno vezivanje CR-57bio u odsustvu i prisustvu scFv-a.

Slika 5 prikazuje kompetitivnu ELISA-u scFv-a protiv virusa besnila i antitela protiv virusa besnila, nazvanog CR-57. ELISA ploče, koje su presvučene prečišćenim proteinom G virusa besnila, inkubirane su sa CR-57 (1 u.g/ml) pre dodavanja viška scFv-a. Posle toga, vezivanje scFv je praćeno u odsustvu i prisustvu CR-57.

Slika 6 prikazuje kompetitivni ELISA test IgG antitela protiv proteina G virusa besnila i antitela protiv virusa besnila, nazvanog CR-57. G protein (ERA soj) je inkubiran sa neobeleženim IgG antitelima (prikazanim na osi X). Dodato je biotinizovano antitelo CR57 (CR57bio) i ostavljeno je da se vezuje za G protein pre vizualizacije uz pomoć streptavidin-HRP-a. ELISA signali su prikazni kao procenat vezivanja samog CR57bio.

Slika 7 prikazuje kompetitivni FACS test IgG antitela protiv proteina G virusa besnila i antitela protiv virusa besnila, koji se označava sa CR-57. PER.C6 ćelije koje ekspresuju G protein (ERA soj) su inkubirane sa neobeleženim IgG antitelima (prikazanim na osi X). Dodato je biotinizovano CR57 antitelo (CR57bio) i ostavljeno je da se vezuje za ćelije koje ekspresuju G protein, pre vizualizacije uz pomoć streptavidin-PE. FACS signali su prikazani kao procenat vezivanja samog CR57bio.

Slika 8 prikazuje poređenje aminokiselinskih sekvenci CVS-11 i "escape" virusa E98. Ćelije inficirane virusom su sakupljene 2 dana nakon infekcije i izolovana je ukupna RNK. Proizvedena je cDNK, koja je korišćena za sekvenciranje DNK. Prikazan je region koji sadrži tačkastu mutaciju, a mutacija je označena zatamnjenjem. Slika 8A pruža poređenje nukleotidnih sekvenci. Broj iznad nukleotida označava mutirani nukleotid (označen zatamnjenjem) iz okvira otvorenog za čitanje glikoproteina virusa besnila, bez sekvence signalnog peptida. Slika 8B pruža poređenje aminokiselinskih sekvenci. Broj iznad aminokiseline označava mutiranu aminokiselinu (označenu zatamnjenjem) iz glikoproteina virusa besnila bez sekvence signalnog peptida.

Slika 9 prikazuje filogenetsko stablo 123 "street" (virus koji se prirodno javlja u prirodi za razliku od virusa atenuisanog u laboratoriji, prim. prev.) virusa besnila (sekvence glikoproteina G 123 virusa besnila, Neighbor povezivanje, Kimura-2-parametarski postupak, 500 traka). Zatamnjenje označava viruse, koji poseduju N>D mutacije, kao što se zapažaju na E98 "escape" virusima.

Slika 10 prikazuje neutralizirajuće epitope na glikoproteinu besnila. Prikazan je šematski crtež glikoproteina virusa besnila, koji slikovito prikazuje antigene položaje, uključujući novi CR57 epitop. Signalni peptid (19 aminokiselina) i transmembranski domen su označeni crnim kvadratima. Označeni su disulfidni mostovi. Broje se aminokiseline zrelog proteina umanjenog za sekvencu signalnog peptida.

OPIS PRONALASKA

U nastavku slede definicije izraza kako su korišćeni u pronalasku.

DEFINICIJE

Vezuju ći molekul

Kao što je ovde korišćen izraz "vezujući molekul" se odnosi na intaktni imunoglobulin, uključujući monoklonska antitela, kao što su himerična, humanizovana ili humana monoklonska antitela, na fragment imunoglobulina, koji sadrži antigen-vezujući i/ili varijabilni domen, koji ulazi u kompeticiju sa intaktnim imunoglobulinom za specifično vezivanje vezujućeg partnera imunoglobulina,npr.virus besnila ili njegov fragment kao što je, primera radi, G protein. Bez obzira na strukturu, antigen-vezujući fragment se vezuje sa istim antigenom koga prepoznaje intaktni imunoglobulin. Antigen-vezujući fragment može sadržavati peptid ili polipeptid, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od najmanje 2 susedna aminokiselinska ostatka, najmanje 5 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 10 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 15 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 20 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 25 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 30 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 35 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 40 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 50 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 60 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 70 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 80 aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 90 aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 100 aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 125 aminokiselinskih ostataka, najmanje 150 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 175 aminokiselinskih ostataka, najmanje 200 susednih aminokiselinskih ostataka ili najmanje susednih 250 aminokiselinskih ostataka aminokiselinske sekvence vezujućeg molekula.

Izraz "vezujući molekul", kao što je ovde korišćen, uključuje sve, u struci poznate, klase i subklase imunoglobulina. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, vezujući molekuli se mogu podeliti na pet glavnih klasa intaktnih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekolicina njih se može dalje podeliti u subklase (izotipovi),npr.,IgAl, IgA2, IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4.

Antigen-vezujući fragmenti uključuju,između ostalih,Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, fragmente regiona koji određuje komplementarnost (CDR), jedno-lančana antitela (scFv), dvovalentna jedno-lančana antitela, jedno-lančana antitela faga, diantitela, triantitela, tetraantitela, (poli)peptide, koji sadrže najmanje fragment imunoglobulina, koji je dovoljan da (poli)peptidu omogući specifično vezivanje antigena, itd. Prethodni fragmenti mogu biti proizvedeni sintetski ili pomoću enzimskog ili hemijskog cepanja intaktnih imunoglobulina ili se mogu proizvesti genetskim inženjeringom pomoću tehnika rekombinantnih DNK. Postupci proizvodnje su dobro poznati u struci, a opisani su, primera radi, u Antibodies: A Laboratorv Manual, izdanje: E. Harlow i D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, New York. Vezujući molekul ili njihov antigen-vezujući fragment može posedovati jedan ili više vezujućih položaja. Ukoliko postoji više od jednog vezujućeg položaja, vezujući položaji mogu biti identični jedan drugome ili oni mogu biti različiti.

Vezujući molekul može biti ogoljen ili nekonjugovan vezujući molekul, ali, isto tako, može biti deo imunokonjugata. Ogoljeni ili nekonjugovani vezujući molekul je određen kako bi se odnosio na vezujući molekul koji nije konjugovan, operativno je spojen ili je na drugi način fizički ili funkcionalno povezan sa efektorskim delom ili tagom, kao što je,između ostalih,toksična supstanca, radioaktivna supstanca, lipozom, enzim. Podrazumevalo bi se da ogoljeni ili nekonjugovani vezujući molekuli ne isključuju vezujuće molekule koji su bili stabilizovani, umnoženi u multimere, humanizovani ili manipulisani na bilo koji drugi način, ali ne uz pomoć pričvršćivanja efektorskog dela ili priveska. Prema tome, na ovaj način su ovde uključeni svi post-translaciono modifikovani ogoljeni ili nekonjugovani vezujući molekuli, uključujući slučajeve gde su modifikacije izvršene na prirodnom okruženju ćelije, koja proizvodi vezujući molekul, uz korišćenje rekombinantnih ćelija koje proizvode vezujući molekul, a uvode se uz pomoć ljudske ruke, nakon inicijalne izrade vezujućeg molekula. Naravno, izraz ogoljeni ili nekonjugovani vezujući molekul ne isključuje sposobnost vezujućeg molekula da obrazuje funkcionalne veze sa efektor ćelijama i/ili molekulima nakon primene u organizmu, budući da su neke od takvih interakcija neophodne da bi se izvršilo biološko dejstvo. Nedostatak povezane efektorske grupe ili priveska se, stoga, primenjuje u definiciji ogoljenog ili nekonjugovanog vezujućeg molekulain vitro,ne

in vivo.

Re gioni koji određuju komplementarnost ( CDR )

Izraz "regioni koji određuju komplementarnost", kao što je ovde korišćen, označava sekvence u okviru varijabilnih regiona vezujućih molekula, kao što su imunoglobulini, koji uglavnom u visokom stepenu doprinose antigen vezujućem položaju koji je, po raspodeli oblika i naboja, komplementaran epitopu. koga prepoznaje na antigenu. CDR regioni mogu biti specifični za linearne epitope, prekinute epitope ili konformacijske epitope proteina ili fragmenta proteina, ili kako su prisutni na proteinu u njegovoj nativnoj konformaciji, ili, u nekim slučajevima, kako su prisutni na denaturiranim proteinima,npr.,uz pomoć rastvaranja u SDS. Epitopi mogu, takođe, biti sastavljeni od posttranslacijskih modifikacija proteina.

Funkcionalna varijanta

Izraz "funkcionalna varijanta", kao što je ovde korišćen, odnosi se na vezujući molekul, koji sadrži nukleotidnu i/ili aminokiselinsku sekvencu, koja ima izmenjen jedan ili više nukleotida i/ili aminokiselina u poređenju sa sekvencama nukleotida i/ili aminokiselina matičnog vezujućeg molekula, a još je u stanju da ulazi u kompeticiju za vezivanje za vezujućeg partnera,npr.virusa besnila ili njegovog fragmenta, sa matičnim vezujućim molekulom. Drugim rečima, modifikacije u aminokiselinskoj i/ili nukleotidnoj sekvenci matičnog vezujućeg molekula u značajnoj meri ne utiču ili ne menjaju vezujuće karakteristike vezujućeg molekula, koji je kodiran od strane nukleotidne sekvence ili koji sadrži aminokiselinsku sekvencu,t. j.,vezujući molekul je još u stanju da prepoznaje i vezuje svoju metu. Funkcionalna varijanta može posedovati modifikacije konzervativne sekvence, koje uključuju nukleotidne i aminokiselinske supstitucije, adicije i delecije. Ove modifikacije mogu biti uvedene standardnim tehnikama, poznatim u struci, kao što je mutageneza usmerena ka položaju i nasumična PCR-om posredovana mutageneza, a može uključivati prirodne nukleotide i aminokiseline, kao i one koji u prirodi ne postoje.

Supstitucije konzervativnih aminokiselina uključuju one u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima slične strukturne ili hemijske karakteristike. Familije aminokiselinskih ostataka, koji poseduju slične bočne lance definisane su u struci. Ove familije uključuju aminokiseline sa bazičnim bočnim lancima{ npr.,lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima{ npr.,asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), polarnim bočnim lancima bez naboja{ npr.,asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima( npr.,glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-razgranatim bočnim lancima( npr.,treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima( npr.,tirozin, fenilalanin, triptofan). Stručnim licima u ovoj oblasti bilo bi jasno da se takođe mogu koristiti druge klasifikacije familija aminokiselinskih ostataka osim one koja je prethodno korišćena. Pored toga, varijanta može posedovati supstitucije ne-konzervativnih aminokiselina,npr.,zamena aminokiseline sa aminokiselinskim ostatkom koji ima različite strukturne ili hemijske karakteristike. Slične minorne varijacije mogu, isto tako, uključiti aminokiselinske delecije ili umetanja, ili oboje. Vodiči za utvrđivanje koji aminokiselinski ostaci mogu biti izloženi supstituciji, umetanju ili deleciji, bez poništavanja imunološke aktivnosti, mogu se naći korišćenjem, u struci dobro poznatih, kompjuterskih programa.

Mutacija u nukleotidnoj sekvenci može biti pojedinačna alteracija izvršena na lokusu (tačkasta mutacija), kao što su tranzicione ili transverzione mutacije, ili alternativno, višestruki nukleotidi mogu biti umetnuti, izbrisani ili izmenjeni na pojedinačnom lokusu. Pored toga, jedna ili više alteracija može biti izvršena na bilo kom broju lokusa unutar nukleotidne sekvence. Mutacije se mogu izvršiti bilo kojim pogodnim postupkom, poznatim u struci.

Domaćin

Izraz "domaćin", kao što je ovde korišćen, određen je s namerom da se odnosi na organizam ili ćeliju, u koje se može uvesti vektor, kao što je klonirajući vektor ili ekspresioni vektor. Organizam ili ćelija mogu biti prokariotski ili eukariotski. Podrazumevalo bi se da je ovaj izraz određen s namerom da se odnosi ne samo na određeni subjektni organizam ili ćeliju, već, isto tako na potomstvo takvog organizma ili ćelije. Budući da se određene modifikacije mogu desiti u sledećim generacijama ili zbog mutacije ili zbog uticaja okoline, takvi naslednici ne moraju, u stvari, biti identični matičnom organizmu ili ćeliji, ali su još uvek uključeni unutar okvira izraza "domaćin", kao što je ovde korišćen.

Human

Izraz "human", kada se primenjuje na vezujuće molekule kao što su ovde definisani, odnosi se na molekule koji su direktno dobijeni od čoveka ili se baziraju na humanoj sekvenci. Kada je vezujući molekul dobijen ili je baziran na humanoj sekvenci i nakon toga je modifikovan, još bi se smatrao humanim kao što je i korišćeno tokom specifikacije. Drugim recima, izraz humani, kada se primenjuje na vezujuće molekule, određen je kako bi uključio vezujuće molekule koji imaju varijabilne i konstantne regione, dobijene iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije, koje su bazirane na varijabilnim ili konstantnim regionima, koji se pojavljuju ili se ne pojavljuju kod čoveka ili u humanim limfocitima, ili u modifikovanom obliku. Tako, humani vezujući molekuli mogu uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani od strane humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije, koji sadrže supstitucije i/ili delecije( npr.,mutacije, koje su, primera radi, uvedene nasumičnom mutagenezom ili mutagenezom usmerenom ka položajuin vitroili putem somatske mutacijein vivo).Izraz "na bazi", kao što je ovde korišćen, odnosi se na situaciju kada se sekvenca nukleinske kiseline može egzaktno kopirati iz kalupa, ili sa neznatnim mutacijama, kao na primer uz pomoć "error-prone" (koji dozvoljava, omogućava grešku, prim. prev.) PCR postupaka, ili se izrađuje sintetski podudarajući se tačno sa kalupom ili sa neznatnim modifikacijama. Semisintetski molekuli na bazi humanih sekvenci se, takođe, smatraju humanim kao što je ovde i korišćeno..

Monoklonsko antitelo

Izraz"monoklonsko antitelo", kao što je ovde korišćen, odnosi se na preparat molekula antitela pojedinačne molekulske smeše,t. j.,primarne strukture,t. j.,koja poseduje jednu aminokiselinsku sekvencu. Monoklonsko antitelo pokazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet za pojedini epitop. Sledstveno tome, izraz "humano monoklonsko antitelo" odnosi se na antitelo koje ispoljava jednu specifičnost vezivanja, koje poseduje varijabilne i konstantne regione, koji su dobijeni ili su bazirani na humanim imunoglobulinskim sekvencama germinativne linije ili su dobijeni iz potpuno sintetskih sekvenci. Postupak izrade monoklonskog antitela nije od značaja.

Molekuli nukleinske kiseline

Izraz "molekul nukleinske kiseline", kao što je korišćen u tekućem pronalasku, odnosi se na polimernu formu nukleotida, a uključuje i sens i antisens lance RNK, cDNK, genomske DNK, i sintetske oblike i mešane polimere prethodno navedenih. Nukleotid se odnosi na ribonukleotid, deoksinukleotid ili modifikovani oblik bilo jednog ili drugog tipa nukleotida. Izraz, takođe, uključuje jednostruke i dvostruke oblike DNK. Pored toga, polinukleotid može uključiti ili jedan ili oba nukleotida koji postoje u prirodi i modifikovane nukleotide, koji su povezani zajedno pomoću nukleotidnih spojnica koje postoje u prirodi i/ili koje se u prirodi ne nalaze. Molekuli nukleinske kiseline mogu biti modifikovani hemijski ili biohemijski ili mogu sadržavati u prirodi ne-postojeće ili derivatizovane nukleotidne baze, što će stručna lica u ovoj oblasti lako proceniti. Takve modifikacije uključuju, primera radi, obeležavanja, metilaciju, supstituciju jednog ili više nukleotida koji postoje u prirodi sa analogom, internukleotidne modifikacije, kao što su spajanja bez naboja( npr.,metil fosfonati, fosfotriestri, fosforamidati, karbamati, itd.), spajanja sa nabojem( npr.,fosforotioati, fosforoditioati, itd.), viseći delovi( npr.,polipeptidi), sredstva za interkalaciju( npr.,akridin, psoralen, itd.), helatori, alkilacijska sredstva i modifikovane spojnice( npr.,alfa anomerne nukleinske kiseline, itd.). Gornji izraz je, isto tako, određen kako bi uključio bilo koju topološku konformaciju, uključujući jedno-lančane, dvo-lančane, parcijalno udvostručene, trostruke, konformacije poput šnale za kosu, okrugle konformacije i konformacije tipa katanca. Takođe su uključeni sintetski molekuli, koji imitiraju polinukleotide u njihovoj sposobnosti da se vezuju za naznačenu sekvencu posredstvom vezivanja vodonika i drugim hemijskim interakcijama. Takvi molekuli su poznati u struci, a uključuju, na primer, one u kojima su peptidne spojnice zamena za fosfatne spojnice u kostrukciji molekula. Ukoliko nije drugačije naznačeno, referenca na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata njen komplement. Tako bi se podrazumevalo da referenca na molekul nukleinske kiseline koji poseduje pojedinu sekvencu uključuje njen komplementarni lanac, sa svojom komplementarnom sekvencom. Komplementarni lanac je, takođe, od koristi,npr.,za antisens terapiju, hibridizacione probe i PCR prajmere.

Farmaceutski prihvatljiv ekscipijent

Pod "farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom" se podrazumeva bilo koja inertna supstanca koja se sjedinjuje sa aktivnim molekulom, kao što je lek, agens ili vezujući molekul za izradu prijatne ili pogodne forme dozaže. "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" jeste ekscipijent koji nije toksičan, ili je barem njegova toksičnost prihvatljiva u odnosu na njegovu nameravanu primenu primaocima u korišćenim dozažama i koncentracijama, a kompatibilan je sa drugim sastojcima formulacije, koja uključuje lek, sredstvo ili vezujući molekul.

Profilaksa posle izloženosti

"Profilaksa posle izloženosti" (PEP) je indikovana za lica, kod kojih postoji mogućnost da su izložena besnoj životinji. Moguće izloženosti uključuju izloženost ujedu( t. j.,bilo kom prodiranju zubima kroz kožu) uključujući ujede životinja i izloženost koja ne uključuje ujed. Izloženosti koje ne uključuju ujed obuhvataju izlaganje velikim količinama virusa besnila u aerosolima u laboratorijima ili u pećinama i hirurške primaoce rožnjača, koje su transplantirane od pacijenata koji su preminuli od besnila. Kontaminiranost otvorenih rana, razderotina, mukoznih membrana, ili teoretski, ogrebotina, sa pljuvačkom ili drugim potencijalno infektivnim materijalom (kao što je nervno tkivo) besne životinje, takođe, sačinjava izloženost koja ne uključuje ujed. Drugi kontakt sam po sebi, kao što je maženje besne životinje i kontakt sa krvlju, mokraćom ili izmetom besne životinje, ne ulazi u okvir izloženosti i ne predstavlja indikaciju za profilaksu. PEP bi trebala započeti što je moguće ranije nakon izloženosti. Ukoliko se izlaganje nije desilo, profilaksa posle izloženosti nije potrebna. U svim režimima profilakse posle izloženosti, s izuzetkom lica koja su prethodno imunizovana, istovremeno bi se primenjivale aktivne i pasivne imunizacije.

Specifično vezivanje

Izraz"specifično vezivanje", kao što je ovde korišćen, u odnosu na interakciju vezujućeg molekula,npr.,antitela, i njegovog vezujućeg partnera,npr.,antigena, znači da je interakcija zavisna od prisustva pojedine strukture,npr.,antigene determinante ili epitopa, na vezujućem partneru. Drugim rečima, antitelo prvenstveno vezuje ili prepoznaje vezujućeg partnera, čak i kada je vezujući partner prisutan u mešavini drugih molekula ili organizama. Vezivanje može biti posredovano kovalentnim ili ne-kovalentnim interakcijama ili njihovom kombinacijom. Drugačije rečeno, izraz "specifično vezivanje" označava imunospecifično vezivanje za antigen ili njegov fragment, i isključuje imunospecifično vezivanje za druge antigene. Vezujući molekul, koji se imunospecifično vezuje za antigen, može se vezivati za druge peptide ili polipeptide sa manjim afinitetom, kao što je utvrđeno uz pomoć,npr.,radioimunoloških testova (RIA), enzimski vezanih imunosorbent testova (ELISA), BIACORE ili drugih, u ovoj oblast poznatih, testova. Vezujući molekuli ili njihovi fragmenti, koji se imunospecifično vezuju za antigen, mogu ulaziti u unakrsno reagovanje sa srodnim antigenima. Poželjno, vezujući molekuli ili njihovi fragmenti, koji se imunospecifično vezuju za antigen, ne ulaze u unakrsne reakcije sa drugim antigenima.

Terapeutski delotvorna količina

Izraz "terapeutski delotvorna količina" se odnosi na količinu vezujućeg molekula, kao što je ovde definisan, koji je efikasan u profilaksi posle izloženosti besnilu.

Vektor

Izraz "vektor" označava molekul nukleinske kiseline u koji se može umetnuti drugi molekul nukleinske kiseline kako bi se uveo u domaćina gde će biti replikovan, i, u nekim slučajevima, ekspresovan. Drugim rečima, vektor je u stanju da transportuje molekul nukleinske kiseline za koji će biti vezan. Klonirajući, kao i ekspresioni vektori su razmotreni pod izrazom "vektor", kao što je ovde korišćen. Vektori uključuju, ali bez ograničavanja istima, plazmide, kozmide, bakterijske veštačke hromozome (BAC) i veštačke hromozome kvasca (YAC) i vektore, koji su dobijeni iz bakteriofaga ili biljnih ili životinjskih (uključujući ljudske) virusa. Vektori sadrže izvor replikacije, koji predloženi domaćin prepoznaje, a u slučaju ekspresionih vektora, sadrže promoter i druge regulatorne regione, koje domaćin prepoznaje. Vektor koji sadrži molekul druge nukleinske kiseline u ćeliju se uvodi, primera radi, putem transformacije, transfekcije ili korišćenjem mehanizama ulaska bakterija ili virusa. Poznati su i drugi putevi uvođenja nukleinske kiseline u ćelije, kao što je elektroporacija ili bombardovanje čestica, koje se često koristi sa biljnim ćelijama, i slično. Postupak uvođenja nukleinske kiseline u ćelije zavisi, između ostalih, od tipa ćelija i tako dalje. Ovo nije od presudnog značaja za pronalazak. Određeni vektori imaju sposobnost da se autonomno replikuju u domaćinu, u koga su uvedeni( npr.,vektori koji poseduju bakterijski izvor replikacije mogu se replikovati u bakterijama). Drugi vektori se, uvođenjem u domaćina, mogu integrisati u genom domaćina, i na taj način se replikovati zajedno sa genomom domaćina.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

Pronalazak obezbeđuje postupak identifikovanja vezujućih molekula koji su u stanju da specifično vezuju i neutrališu virus besnila.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak obuhvata postupak identifikovanja vezujućih molekula, koji su u stanju da se vezuju za virus besnila i poseduju aktivnost neutralizacije virusa besnila. Poželjno, vezujući molekuli pronalaska poseduju, takođe, aktivnost neutralizacije virusa besnila. Vezujući molekuli pronalaska su humani vezujući molekuli. Alternativno, oni, isto tako, mogu biti vezujući molekuli drugih životinja. Virus besnila je deo roda Lvssavirusa. Ukupno uzevši, rod Lvssavirusa uključuje jedanaest genotipova: virus besnila (genotip 1), Lagos virus slepog miša (genotip 2), Mokola virus (genotip 3), Duvenhage virus (genotip 4), Evropski lvssavirus slepog miša 1 (genotip 5), Evropski lvssavirus slepog miša 2 (genotip 6), Australijski lvssavirus slepog miša (genotip 7), Aravan virus (genotip 8), Khujand virus (genotip 9), Irkut virus (genotip 10) i Zapadnokavkaski virus (genotip 11). Pored vezivanja virusa besnila, vezujući molekuli mogu, takođe, biti u stanju da vezuju druge genotipove roda Lvssavirusa. Poželjno, vezujući molekuli mogu, isto tako, biti u stanju da neutrališu druge genotipove roda Lvssavirusa. Pored toga, vezujući molekuli mogu, čak, biti u stanju da vezuju i/ili neutrališu viruse iz familije rhabdovirusa, koji nisu Lvssavirusi. Ova familija obuhvata rodove: cvtorhabdovirusa, ephemerovirusa, lvssavirusa, nucleorhabdovirusa, rhabdovirusa i vesiculovirusa.

Vezujući molekuli mogu biti u stanju da se specifično vezuju sa virusom besnila u njegovom prirodnom obliku ili u njegovoj inaktivisanoj/atenuiranoj formi. Inaktivacija virusa besnila može biti izvršena obradom sa,između ostalih,beta-propiolaktonom (BPL) (White i Chappel, 1982), zagrevanjem na 56°C tokom više od 30 minuta, gama zračenjem, tretmanom sa acetiletileniminom ili etileniminom ili obradom sa askorbinskom kiselinom i bakar sulfatom tokom 72 sata (Madhusudanaet al.,2004). Takođe se mogu koristiti opšti postupci inaktivacije virusa, koji su dobro poznati stručnom licu u ovoj oblasti, kao što je,između ostalih,pasterizacija (vlažna toplota), obrada suvom toplotom, toplotna obrada parom, tretman sa niskim pH, obrada sa organskim rastvaračem/deterdžentom, nanofiltracija; UV svetlosno zračenje. Poželjno, inaktivacija se vrši putem obrade sa beta-propiolaktonom (BPL). Postupci za ispitivanje da li je virus besnila još infektivan ili je parcijalno ili potpuno inaktivisan, dobro su poznati licu, stručnom u ovoj oblasti, a, između ostalog, se mogu naći u Laboratorv techniques in rabies, Izdanje od strane: F.-X Meslin, M.M. Kaplan i H. Koprowski (1996), 4. izdanje, Poglavlje 36, Svetska zdravstvena organizacija, Zeneva.

Vezujući molekuli mogu, isto tako, biti u stanju da se specifično vezuju za jedan ili više fragmenata virusa besnila, kao što je,između ostalih,preparat od jednog ili više proteina i/ili (poli)peptida, dobijenih iz virusa besnila ili ćelija transfektovana sa proteinom i/ili (poli)peptidom virusa besnila. U postupcima lečenja i/ili prevencije, kao što su postupci profilakse posle izloženosti virusu besnila, vezujući molekuli su, poželjno, u stanju da se specifično vezuju za površinski dostupne proteine virusa besnila, kao što je M (vidi Amevamaet al.2003) ili G protein. Za dijagnostičke potrebe, humani vezujući molekuli mogu, takođe, biti u stanju da se specifično vezuju za proteine, koji nisu prisutni na površini virusa besnila. Aminokiselinska sekvenca površinski dostupnih i untrašnjih proteina raznih poznatih sojeva virusa besnila mogu se naći u EMBL-bazi podataka i/ili drugim bazama podataka.

Poželjno, fragment sadrži barem antigenu determinantu, koju prepoznaju humani vezujući molekuli pronalaska. "Antigena determinanata", kao što je ovde korišćena, jeste deo, kao što je (poli)peptid, (gliko)protein virusa besnila ili njihov analog ili fragment, koji je u stanju da se vezuje sa humanim vezujućim molekulom pronalaska, sa afinitetom, dovoljno velikim za obrazovanje kompleksa antigen-vezujući molekul, koji se može detektovati.

Vezujući molekuli mogu biti intaktni imunoglobulinski molekuli, kao što su poliklonska ili monoklonska antitela, posebno humana monoklonska antitela, ili vezujući molekuli mogu biti antigen vezujući fragmenti, koji uključuju, ali bez ograničavanja na njih, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, fragmente regiona koji određuje komplementarnost (CDR), jedno-lančana antitela (scFv), bivalentna jedno-lančana antitela, jedno-lančana antitela faga, dimerne fragmente, trimerne fragmente, tetramerne fragmente i (poli)peptide, koji sadrže najmanje fragment imunoglobulina, koji je dovoljan da prenese specifično vezivanje antigena na virus besnila ili njegov fragment. Vezujući molekuli mogu biti korišćeni u ne-izolovanom ili izolovanom obliku. Pored toga, vezujući molekuli mogu biti korišćeni sami ili u mešavini, koja sadrži barem jedan humani vezujući molekul (ili njegovu varijantu ili fragment). Drugim rečima, vezujući molekuli mogu biti korišćeni u kombinaciji,npr.,u vidu farmaceutske smeše koja sadrži dva ili više vezujućih molekula, njihovih varijanti ili fragmenata. Primera radi, vezujući molekuli, koji poseduju aktivnost neutralizacije virusa besnila, mogu biti kombinovani u pojedinačnoj terapiji, kako bi se postigao željeni profilaktički, terapeutski ili dijagnostički efekat.

RNK virusi, kao što je virus besnila, koriste svoju sopstvenu RNK polimerazu tokom replikacije virusa. Ove RNK polimeraze imaju tendenciju da budu "error-prone". Ovo vodi ka obrazovanju takozvanih kvazi-vrsta tokom virusne infekcije. Svaka kvazi-vrsta ima jedinstven RNK genom, što bi moglo dovesti do razlika u aminokiselinskoj smeši virusnih proteina. Ukoliko se takve mutacije dešavaju u strukturnim virusnim proteinima, virus bi mogao potencijalno iskočiti iz imunog sistema domaćina, zbog promena u T ili B ćelijskim epitopima. Verovatnoća da se ovo desi je veća kada se pojedinci tretiraju mešavinom dva vezujuća molekula, kao što su humana monoklonska antitela, nego sa mešavinom poliklonskih antitela (HRIG). Prema tome, preduslov za mešavinu od dva humana monoklonska antitela za lečenje besnila jeste da ta dva antitela prepoznaju epitope, koji se ne preklapaju i ne ulaze u kompeticiju, a nalaze se na njihovom ciljanom antigenu,t. j.,glikoproteinu virusa besnila. Na taj način se mogućnost pojavljivanja "escape" virusa besnila svodi na minimum. Kao posledica navedenog, vezujući molekuli su poželjno u stanju da reaguju sa različitim epitopima na virusu besnila, koji se ne preklapaju i ne ulaze u kompeticiju, kao što su epitopi na proteinu G virusa besnila. Mešavina vezujućih molekula može, dalje, sadržavati, barem jedno drugo terapeutsko sredstvo, kao što je lek koji je pogodan za profilaksu posle izloženosti besnilu.

Uobičajeno, vezujući molekuli u skladu sa pronalaskom mogu se vezivati za njihove partnere u vezivanju,t. j.,za virus besnila ili njegove fragmente, kao što su proteini virusa besnila, sa konstantom afiniteta (Kđ-vrednost), koja je manja od 0.2<*>IO"<4>M, 1.0*IO5 M, 1.0<*>IO<-6>M, 1.0<*>IO"<7>M, poželj<n>o manja od 1.0* 10"8 M, poželjnije manja od 1.0<*>IO"<9>M, poželjnije manja od 1.0* 10"10 M, još poželjnije manja od 1.0<*>10"" M, i posebno manja od 1.0<*>10"<12>M. Konstante afiniteta mogu varirati za izotipove antitela. Primera radi, afinitet vezivanja za izotip IgM odnosi se na afinitet vezivanja od najmanje oko 1.0<*>IO"<7>M. Konstante afiniteta mogu, primera radi, biti određene, korišćenjem površinske plazmon rezonance,t. j.,optičkog fenomena koji omogućuje analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu, uz pomoć detekcije promena u koncentracijama proteina u okviru matriksa biosenzora, primera radi, korišćenjem BIACORE sistema (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Švedska).

Vezujući molekuli mogu se vezivati za virus besnila u prečišćenom/izolovanom ili u ne-prečišćenom/ne-izolovanom obliku. Vezujući molekuli se mogu vezivati za virus besnila u rastvorljivom obliku, kao na primer u uzorku, ili se mogu vezivati za virus besnila koji je vezan ili pričvršćen na nosač ili supstrat,npr.,mikrotitarske ploče, membrane i kuglice, itd. Nosači ili supstrati mogu biti izrađeni od stakla, plastike( npr.,polistiren), polisaharida, najlona, nitroceluloze ili teflona, itd.. Površina takvih podloga može biti čvrsta ili porozna, a može biti bilo kog pogodnog oblika. Alternativno, vezujući molekuli mogu se, takođe, vezivati za fragmente virusa besnila, kao što su proteini ili (poli)peptidi virusa besnila. U ostvarenju su vezujući molekuli u stanju da se specifično vezuju za protein G virusa besnila ili njegov fragment. Proteini ili (poli)peptidi virusa besnila mogu biti ili u rastvorljivom obliku ili se mogu vezivati za virus besnila, koji je vezan ili je pričvršćen za nosač ili supstrat, kao što je prethodno opisan. U drugom ostvarenju, ćelije koje su transfektovane sa G proteinom mogu biti korišćene kao partner u vezivanju za vezujuće molekule.

Vezujući molekuli pronalaska vrše nuetralisanje infektivnosti virusa besnila. To se može postići sprečavanjem vezivanja virusa besnila na njegove receptore na ćelijama domaćina, kao što je,između ostalih,mišji p75 neurotrofin receptor, adhezivni molekul nervne ćelije (CD56) i acetilholinski receptor, ili inhibicijom oslobađanja RNK u citoplazmu ćelije ili sprečavanjem transkripcije ili translacije RNK. U specifičnom ostvarenju, vezujući molekuli sprečavaju da virus besnila inficira ćelije domaćina za najmanje 99%, najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, najmanje 45%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 35%, najmanje 30%, najmanje 25%, najmanje 20% ili najmanje 10% u odnosu na inficiranje ćelija domaćina virusom besnila u odsustvu navedenih vezujućih molekula. Neutralizacija se može, primera radi, izmeriti, kao što je opisano u Laboratorv techniques in rabies, Izdato od strane: F.-X Meslin, M.M. Kaplan i H. Koprowski

(1996), 4. izdanje, Poglavlja 15-17, Svetska zdravstvena organizacija, Ženeva. Pored toga, humani vezujući molekuli mogu biti vezujući molekuli za fiksiranje komplementa koji su u stanju da potpomažu u liziranju virusa besnila sa omotačem. Humani vezujući molekuli bi, takođe, mogli dejstvovati kao opsonini i uvećati fagocitozu virusa besnila ili putem podsticanja njegovog preuzimanja posredstvom Fc ili C3b receptora ili putem aglutinacije virusa besnila, kako bi se olakšala njihova fagocitoza.

U poželjnom ostvarenju, vezujući molekuli, koji poseduju aktivnost neutralisanja virusa besnila, primenjuju se u IgG formatu, poželjno u formatu IgGl.

Drugi aspekt ovog izlaganja jeste obezbeđivanje molekula nukleinske kiseline koji kodira najmanje vezujući molekul. Ovakvi molekuli nukleinske kiseline se mogu koristiti kao intermedijeri u svrhu kloniranja,npr.u prethodno opisanom procesu afinitetnog sazrevanja. U poželjnom ostvarenju, molekuli nukleinske kiseline su izolovani ili prečišćeni.

Drugi aspekt jeste da se obezbede vektori,t. j.,.konstrukcije nukleinske kiseline, koje sadrže jednu ili više molekula nukleinske kiseline u skladu sa tekućim pronalaskom. Vektori mogu biti dobijeni iz plazmida, kao što su,između ostalih,F, Rl, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, itd.; kozmida; faga, kao što su lambda, lambdoid, M13, Mu, Pl, P22, Q(j, T-even, T-odd, T2, T4, T7, itd.; biljnih virusa, kao što su,između ostalih,mozaični virus alfalfa, bromovirus, capillovirus, carlavirus, carmovirus, caulivirus, clostervirus, comovirus, crvptovirus, cucumovirus, dianthovirus, fabavirus, fijivirus, furovirus, geminivirus, hordeivirus, ilarvirus, luteovirus, machlovirus, marafivirus, necrovirus, nepovirus, phvtorepvirus, biljni rhabdovirus, potexvirus, potvvirus, sobemovirus, tenuivirus, tobamovirus, tobravirus, virus bolesti pegavog uvenuća paradajza, tombusvirus, tvmovirus, itd.; ili životinjskih virusa, kao što su,između ostalih,adenovirus, arenaviridae, baculoviridae, birnaviridae, bunyaviridae, calciviridae, cardiovirusi, coronaviridae, corticoviridae, cystoviridae, Epstein-Barr virus, enterovirusi, filoviridae, flaviviridae, virus bolesti stopala i usta, hepadnaviridae, virusi hepatitisa, herpesviridae, virusi imunodeficijencije, virus gripa, inoviridae, iridoviridae, orthomyxoviridae, papovavirusi, paramyxoviridae, parvoviridae, picornaviridae, poliovirus, polydnaviridae, poxviridae, reoviridae, retrovirusi, rhabdoviridae, rhinovirusi, Semliki Forest virus, tetraviridae, togaviridae, toroviridae, vakcinija virus, virus vezikularnog stomatitisa, itd.. Vektori se mogu koristiti za kloniranje i/ili ekspresiju humanih vezujućih molekula pronalaska, a mogli bi se, koristiti čak i za potrebe genske terapije. Takođe su opisani i vektori, koji sadrže jednu ili više molekula nukleinske kiseline i operativno su povezani sa jednom ili više molekula nukleinske kiseline za regulisanje ekspresije. Izbor vektora zavisi od postupaka rekombinovanja koji su sledili i od korišćenog domaćina. Uvođenje vektora u ćelije domaćina može biti izvršeno,između ostalih,putem transfekcije kalcijum fosfata, virusne infekcije, transfekcije posredovane DEAE-dekstranom, transfekcije lipofektamina ili putem elektroporacije. Vektori se mogu autonomno replikovati ili se mogu replikovati zajedno sa hromozomom u koji su bili integrisani. Poželjno, vektori sadrže jedan ili više selektivnih markera. Izbor markera može zavisiti od izbora ćelija domaćina, premda to nije presudno za pronalazak kao što je stručnim licima u ovoj oblasti dobro poznato. Oni obuhvataju, ali se njima ne ograničavaju, kanamicin, neomicin, puromicin, higromicin, zeocin, gen timidin kinaze iz virusa herpes simpleksa (HSV-TK), gen dihidrofolat reduktaze iz miša (dhfr). Vektori, koji sadrže jednu ili više molekula nukleinske kiseline i koji kodiraju humane vezujuće molekule kao što je prethodno opisano, a operativno su povezani sa jednom ili više molekula nukleinske kiseline, koji kodiraju proteine ili peptide koji se mogu koristiti za izolovanje vezujućih molekula, takođe su obuhvaćeni pronalaskom. Ovi proteini ili peptidi uključuju, ali bez ograničavanja na njih, glutation-S-transferazu, protein koji vezuje maltozu, polihistidin koji vezuje metal, protein sa zelenom fluorescencijom, luciferazu i beta-galaktozidazu.

Domaćini, koji sadrže jednu ili više kopija gorepomenutih vektora, predstavljaju dodatni predmet izlaganja. Poželjno, domaćini su ćelije domaćina. Ćelije domaćina uključuju, ali se istima ne ograničavaju, ćelije koje su poreklom iz sisara, biljki, insekata, gljivica ili bakterija. Bakterijske ćelije uključuju, ali se njima ne ograničavaju, ćelije Gram pozitivnih bakterija, kao što je nekoliko vrsta roda Bacillus, Streptomvces i Staphvlococcus ili ćelije Gram negativnih bakterija, kao što je nekoliko vrsta roda Escherichia, kao što jeE. coli,i Pseudomonas. Iz grupe gljivičnih ćelija poželjno se koriste ćelije kvasca. Ekspresija u kvascu može biti izvršena korišćenjem sojeva kvasca, kao što su,između ostalih, Pichia pas tor is, Saccharomyces cerevisiaeiHansenula polymorpha.Pored navedenog, kao ćelije domaćina mogu biti upotrebljene ćelije insekata, kao što su ćelije Drosophile i Sf9. Pored toga, ćelije domaćina mogu biti biljne ćelije. Tranformisane (transgenske) biljke ili biljne ćelije proizvedene su poznatim postupcima, primera radi, genskim transferom posredovanim Agrobacteriumom, transformacijom diskova lista, transformacijom protoplasta putem polietilen glikolom indukovanog transfera DNK, elektroporacijom, ozvučenjem, mikroinjekcijama ili holističkim genskim transferom. Dodatno, pogodan ekspresioni sistem može biti sistem bakulovirusa. U ovom pronalasku su poželjni ekspresioni sistemi koji koriste ćelije sisara, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), COS ćelije, BHK ćelije ili ćelije Bovves melanoma. Ćelije sisara obezbeđuju ekspresovane proteine sa posttranslacijskim modifikacijama, koji su najsličniji prirodnim molekulima koji su porekiom od sisara. Budući da se ovaj pronalazak bavi molekulima koji mogu biti primenjeni na ljudima, potpuno humani ekspresioni sistem bi bio posebno poželjan. Prema tome, još je poželjnije da su ćelije domaćina humane ćelije. Primeri humanih ćelije su,između ostalih,HeLa, 911, AT1080, A549, 293 i HEK293T ćelije. Poželjne ćelije sisara su ćelije humane mrežnjače, kao što su ćelije 911 ili ćelijski niz koji je deponovan u European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisburv, Wiltshire SP4 OJG, Velika Britanija, 29. februara 1996. godine, pod brojem 96022940, a na tržištu se nalazi pod trgovačkim imenom PER.C6<®>(PER.C6 je registrovana trgovačka marka Crucell Holland B.V.). Za potrebe ove prijave "PER.C6" se odnosi na ćelije, koje su deponovane pod brojem 96022940 ili njihove prethodnike, u ushodnom ili nishodnom nizu, kao i potomstvo prethodnika deponovanih ćelije, kao i na derivate bilo koga od prethodno navedenih. Ćelije humane proizvodnje sadrže barem funkcionalni deo sekvence nukleinske kiseline, koja kodira El region adenovirusa u formatu koji se može ekspresovati. Navedene ćelije domaćina se dobijaju iz humane mrežnjače, i obesmrćuju se nukleinskim kiselinama, koje sadrže El sekvence adenovirusa, kao što je ćelijski niz koji je deponovan u European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisburv, Wiltshire SP4 OJG, Velika Britanija, 29. februara 1996. godine, pod brojem 96022940, a na tržištu se nalazi pod trgovačkim imenom PER.C6<®>. Proizvodnja rekombinantnih proteina u ćelijjama domaćina može se izvršiti prema postupcima, koji su u struci dobro poznati. Korišćenje ćelija, koje se prodaju na tržištu pod trgovačkim imanom PER.C6<®>, kao proizvodna platforma za proteine od značaja, bilo je opisano u WO 00/63403.

Postupak proizvodnje vezujućeg molekula ili funkcionalne varijante u skladu sa pronalaskom jeste dodatni deo izlaganja. Postupak obuhvata korake a) kultivisanja domaćina, pod uslovima, pod kojima se može provesti ekspresija vezujućeg molekula ili njegove funkcionalne varijante, i b) opciono, povraćaja ekspresovanog vezujućeg molekula ili njegove funkcionalne varijante. Ekspresovani vezujući molekuli ili njihove funkcionalne varijante mogu biti povraćeni iz ekstrakta bez ćelija, ali je poželjno da se povraćaj vrši iz medijuma kulture. Postupci za povraćaj proteina, kao što su vezujući molekuli, iz ekstrakata bez ćelija ili medijuma kulture, dobro su poznati stručnjaku u ovoj oblasti.

Alternativno, pored ekspresije u domaćinima, kao što su ćelije domaćina, vezujući molekuli ili njihove funkcionalne varijante, mogu biti sintetski proizvedeni, pomoću uobičajenih peptidnih sintesajzera ili u translacionim sistemima bez ćelija, uz korišćenje nukleinske kiseline RNK, koja je dobijena iz molekula DNK.

U drugom ostvarenju, vezujući molekuli ili njihove funkcionalne varijante mogu se proizvesti pomoću transgenskih sisara koji nisu ljudi, kao što su, primera radi, transgenski miševi ili zečevi, koji ekspresuju gene humanih imunoglobulina. Poželjno, transgenski sisari, koji nisu ljudi, imaju genom, koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca, koji kodiraju sve ili deo humanih vezujućih molekula, kao što je prethodno opisano. Transgenski sisari, a da nisu ljudi, mogu se imunizovati prečišćenim ili obogaćenim preparatom virusa besnila ili njegovog fragmenta. Protokoli za imunizaciju sisara, koji nisu ljudi, dobro su utvrđeni u struci. Vidi Using Antibodies: A Laboratorv Manual, Izdato od strane: E. Harlovv, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, New York i Current Protocols in Immunologv, Izdanje: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., New York. Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za identifikaciju vezujućih molekula, kao što su humana monoklonska antitela ili njihovi fragmenti ili nukleinska kiselina, kao što se zahteva u patentnom zahtevu 1. Korak selekcije se može izvesti u prisustvu virusa besnila. Virus besnila može biti izolovan ili ne-izolovan,npr.prisutan u serumu i/ili krvi inficiranog pojedinca. U drugom ostvarenju, virus besnila je inaktivisan. Alternativno, korak selekcije se može izvesti u prisustvu fragmenta virusa besnila kao što je ekstracelularni deo virusa besnila, jedan ili više (poli)peptida poreklom od virusa besnila, kao što je G protein, fuzioni proteini koji sadrže ove proteine ili (poli)peptide i slično. U drugom ostvarenju, ćelije koje su transfektovane sa G proteinom virusa besnila se krosite za procedure selekcije.

Jednom, kada se ustanovi novo monoklonsko antitelo ili identifikuje gore pomenutim postupkom za identifikovanje vezujućih molekula ili molekula nukleinskih kiselina koje kodiraju vezujuće molekule, može se izolovati DNK koja kodira scFv ili Fab iz bakterije ili genetičkih pakovanja koja se mogu umnožavati i kombinovati sa standardnim molekularnim biološkim tehnikama kako bi se izgradile konstrukcije koje kodiraju bivalentni scFvs ili potpune humane imunoglobuline sa željenom specifičnošću( npr.IgG, IgA ili IgM). Ove konstrukcije se mogu transfektovati u pogodne ćelijske linije i, mogu se proizvoditi potpuna humana monoklonska antitela (vidi Hulset al.,1999; Boelet al,2000).

Genetička pakovanja koja se mogu umnožavati, kako je izraz ovde korišćen, mogu biti prokariotska ili eukariotska i, obuhvataju ćelije, spore, bakterije, viruse, (bakterio)fage i polizome. Poželjno genetičko pakovanje koje se može umnožavati jeste fag. Humani vezujući molekuli, kao što su na primer jedno lančani Fv's, se izlažu na genetičkom pakovanju koje še može umnožavati,tj.vezani su za grupu ili molekul koji su locirani na spoljašnjoj površini pakovanja koje se može umnožavati. Genetičko pakovanje koje se može umnožavati jeste jedinica koja se može skrinirati, koja sadrži humani vezujući molekul koji treba skriniranjem da se veže za molekul nukleinske kiseline koji kodira vezujući molekul. Molekul nukleinske kiseline bi trebalo da može da se umnožava biloin vivo ( npr.,kao vektor) iliin vitro ( npr.,PCR-om, transkripcijom i translacijom).In vivoreplikacija može biti autonomna (kao za ćeliju), uz pomoć faktora domaćina (kao za virus) ili uz pomoć oba i domaćina i helper virusa (kao za fagemid). Genetička pakovanja koja se mogu umnožavati, a koja izlažu zbirku humanih vezujućih molekula, obrazuju se uvođenjem molekula nukleinske kiseline koja kodira egzogene vezujuće molekule koji će biti izloženi u genomima genetičkih pakovanja koja se mogu umnožavati kako bi se formirali fuzioni proteini sa endogenim proteinima koji se normalno ekspresuju sa spoljašnje površine genetičkih pakovanja koja se mogu umnožavati. Ekspresija fuzionih proteina, transport na spoljašnju površinu i združivanje omogućavaju izlaganje egzogenih vezujućih molekula sa spoljašnje površine genetičkih pakovanja koja se mogu umnožavati. U sledećem aspektu pronalazak se odnosi na humani vezujući molekul koji može vezati virus besnila ili na njegov fragment i koji se može dobiti prethodno opisanim postupkom identifikacije.

U pak sledećem aspektu pronalaska, odnosi se na postupak identifikacije vezujućeg molekula koji potencijalno ima neutrališuću aktivnost prema virusu besnila, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake: (a) dovođenje u kontakt zbirke vezujućih molekula na površini genetskih pakovanja koja se mogu umnožavati sa virusom besnila u uslovima koji omogućavaju izvođenje vezivanja, b) razdvajanje i povraćaj vezujućih molekula koji se vezuju za virus besnila od vezujućih molekula koji se ne vezuju za isti, c) izolovanje najmanje jednog povraćenog vezujućeg molekula, d) potvrđivanje da izolovani vezujući molekul ima neutrališuću aktivnost prema virusu besnila, naznačeno time da je virus besnila u koraku inaktivisan. Inaktivisani virus besnila može da se prečisti pre inaktivisanja. Prečišćavanje se može izvesti putem dobro poznatih postupaka prečišćavanja pogodnih za viruse kao što je, na primer, centrifugiranje kroz glicerolski sloj. Inaktivisani virus besnila u koraku a može biti imobilisan na pogodnom materijalu pre korišćenja. Alternativno, virus besnila u koraku a može i dalje biti aktivan. U drugom, alternativnom ostvarenju, fragment virusa besnila, kao što je polipeptid virusa besnila, kao što je G protein, koristi se u koraku a. U pak još jednom ostvarenju, ćelije transfektovane sa G proteinom virusa besnila, koriste se za selekciju vezujućeg molekula koji potencijalno ima neutrališuću aktivnost prema virusu besnila. Kako je ovde indikovano, kada se ćelije koje ekspresuju G protein virusa besnila uključe u postupak selekcije, broj selektovanih neutrališućih antitela je bio veći u poređenju sa selekcionim postupkom u kome su korišćeni samo prečišćeni G protein virusa besnila i/ili inaktivisani virus besnila.

U skladu sa pronalaskom, postupak identifikovanja vezujućeg molekula koji potencijalno ima neutrališuću aktivnost prema virusu besnila kako je prethodno opisano, sastoji se od koraka razdvajanja i povraćaja, i izolovanja, humanih vezujućih molekula koji sadrže varijabilnu tešku 3-30 gensku semenu liniju. Lice iz struke može da identifikuje specifične gene semenske linije postupcima koji su poznati u struci, kao što je, na primer, nukleotidno sekvencioniranje. Korak razdvajanja i povraćaja vezujućih molekula koji sadrže varijabilnu tešku 3-30 gensku semenu liniju, može da se izvede pre ili posle koraka c. Kao što je u nastavku naznačeno, glavnina humanih monoklonskih antitela koja neutrališu virus besnila, a nalaze se u ovom pronalasku, sadrže ove specifične VH gene semene linije.

Postupci izlaganja faga za identifikovanje i dobijanje (neutralisanje) vezujućih molekula,npr.antitela, danas su dobro ustanovljeni postupci poznati stručnim licima. Ovi postupci sunpr.opisani u : US Patentu broj 5,696,108; Burton i Barbas, 1994; de Kruif/saradanici.,1995b; i Phage Displav: A Laboratorv Manual. Edited by: CF Barbas, DR Burton, JK Scott and GJ Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Za konstruisanje izloženih biblioteka faga, zbirka humanih monoklonskih antitela gena varijabilnih regiona teškog i lakog lanca se ekspresuje na površini bakteriofaga, poželjno filamentoznog bakteriofaga, čestica, koje su u, na primer, jedno-lančanom Fv (scFv) ili u Fab formatu (vidi de Kruifet al,1995b). Velike biblioteke fagova koji ekspresuju fragmente antitela obično sadrže više od 1.0<*>IO<9>specifičnosti antitela i mogu biti pridružene iz imunoglobulinskih V regiona ekspresovanih u B limfocitima imunizovanih- ili ne-imunizovanih pojedinaca. U posebnom ostvarenju pronalaska, biblioteka faga humanih vezujućih molekula, poželjno biblioteka scFv faga, priprema se od RNK izolovanih iz ćelija dobijenih od osoba koje su vakcinisane protiv besnila ili su bile izložene virusu besnila. RNK se može izolovati iz,između ostalog,kostne srži ili periferne krvi, poželjno limfocita periferne krvi. Subjekti mogu biti životinje koje su vakcinisane ili su izložene virusu besnila, ali su poželjno ljudi, koji su bili vakcinisani ili su bili izloženi virusu besnila. Poželjno, ljudske individue su bile vakcinisane. Zbirka humanih vezujućih molekula na površini genetskih pakovanja koja se mogu umnožiti, kao što je biblioteka scFv faga, kako je prethodno opisano, jeste još jedan aspekt ovog pronalaska.

Alternativno, izložene fag biblioteke mogu da se konstruišu od imunoglobulinskih varijabilnih regiona koji su delimično udruženiin vitrokako bi se unela dodatna raznolikost u biblioteku (semi-sintetske biblioteke). Na primer,in vitropovezani varijabilni regioni sadrže dužne umetke sintetičkih proizvoda, randomizovanih ili delimično randomizovanih DNK u onim regionima molekula koji su važni za specifičnost antitela,npr.CDR regioni. Fag antitela specifična za virus besnila mogu da se izdvoje iz biblioteka imobilisanjem ciljnih antigena, kao što su antigeni sa virusa besnila na čvrstoj fazi i zatim, ciljni antigeni se izlažu biblioteci faga kako bi se omogućilo vezivanje fagova koji ekspresuju fragmente antitela specifične za antigen(e) vezan(e) za čvrstu fazu. Nevezani fagovi se uklanjaju ispiranjem, a vezani fagovi se eluiraju sa čvrste faze za infekciju bakterijeEscherichia coli ( E. coli)i posledičnu propagaciju. Obično je neophodno više selekcionih krugova i propagacija kako bi se dovoljno obogatilo fagovima koji se specifično vezuju za ciljni antigen(e). Ukoliko se želi, pre izlaganja biblioteke faga ciljnim antigenima, biblioteka faga se može prvo oduzeti putem izlaganja biblioteke faga ne-ciljnim antigenima koji su vezani za čvrstu fazu. Fagovi mogu, isto tako, da se selektuju za vezivanje za kompleks antitela kao što je kompleksna smeša proteina virusa besnila ili (poli)peptida, ćelija domaćina koje ekspresuju jedan ili više proteina virusa besnila ili (poli)peptida virusa besnila, ili samog (inaktiviranog) virusa besnila. Antigen specifična fagna antitela mogu da se selektuju iz biblioteke putem inkubacije čvrste faze na kojoj je vezan preparat inaktivisanih virusa besnila sa bibliotekom fagnog antitela kako bi, na primer, ostao scFv ili Fab deo faga vezan za proteine/polipeptide preparata virusa besnila. Posle inkubacije i nekoliko ispiranja radi uklanjanja nevezanih i labavo vezanih fagova, fagovi koji su se vezali za svoje delove scFv ili Fab u proizvodnji, eluiraju se i koriste za infekcijuEscherichia colikako bi se omogućila amplifikacija nove specifičnosti. Generalno, neophodan je jedan ili više selekcionih krugova za razdvajanje značajnih fagova od velikog viška ne-vezujućih fagova. Alternativno, poznati proteini ili (poli) peptidi virusa besnila mogu da se ekspresuju u ćelijama domaćina i, ove ćelije mogu da se koriste za selekciju fagnih antitela koja su specifična za proteine ili (poli)peptide. Postupak izlaganja faga koji koristi ove ćelije domaćina može da se proširi i poboljša oduzimanjem ne-relevantnih vezivača tokom skrininga dodavanjem viška ćelija domaćina koje sadrže ne-ciljne molekule ili sadrže ne-ciljne molekule koji su slični, ali nisu identični ciljnim, te na taj način veoma uvećavaju šansu pronalaženja relevantnih vezujućih molekula (Ovaj proces se označava kao MAbstract® proces. MAbstract® je zaštićena trgovačka oznaka Crucell Holland B.V., vidi, isto tako, US Patent broj 6,265,150).

Vezujući molekuli ili farmaceutske smeše pronalaska mogu se ispitati na pogodnim sistemima životinjskih modela, pre korišćenja na ljudima. Takavi sistemi životinjskih modela uključuje, ali se njima ne ograničava, miševe, pacove, hrčkove, majmune, itd.

Gore pomenuti molekuli ili smeše mogu biti korišćeni zajedno sa drugim molekulima, koji su od koristi u dijagnostici, profilaksi i/ili lečenju besnila izazvanog virusom besnila. Oni mogu biti korišćeniin vitro, ex vivoiliin vivo.Primera radi, humani vezujući molekuli, funkcionalne varijante, imunokonjugati ili farmaceutske smeše mogu se koristiti zajedno sa vakcinom protiv besnila. Alternativno, vakcina se, isto tako, može koristiti pre ili nakon primene molekula ili smeša. Primena molekula ili smeša sa vakcinom, pogodna je za profilaksu posle izloženosti. Vakcine protiv besnila uključuju, ali se njima ne ograničavaju, prečišćenu vakcinu na ćelijama pilećeg embriona (PCEC) (RabAvert), vakcinu humanih diploidnih ćelija (HDCV; Imovax vaccine) ili adosrbovanu vakcinu protiv besnila (RVA).

Molekuli su obično formulisani u smeše i farmaceutske smeše pronalaska u terapeutski ili dijagnostički efektivnoj količini. Režimi doziranja se mogu podesiti kako bi se obezbedio optimalni željeni odgovor( npr.,terapeutski odgovor). Pogodni raspon dozaže može biti, primera radi, 0.1-100 IJ/kg telesne težine, poželjno 1.0-50 IJ/kg telesne težine i još poželjnije 10-30 IJ/kg telesne težine, kao na primer 20 IJ/kg telesne težine.

Poželjno, primenjuje se pojedinačni bolus vezujućih molekula ili farmaceutskih smeša. Molekuli i farmaceutske smeše su poželjno sterilni. Postupci za održavanje ovih molekula i smeša sterilnim dobro su poznati u struci. Dozni režim u profilaksi posle izloženosti jeste primena pet doza vakcine protiv besnila intramuskularno u deltoidni mišić 0., 3., 7., 14. i 28. dana nakon izlaganja kod pojedinaca koji prethodno nisu imunizovani protiv virusa besnila. Humani vezujući molekuli ili farmaceutske smeše primenjivali bi se u ili oko rana 0. dana, ili na drugi način, što je moguće ranije nakon izlaganja, pri čemu se preostala zapremina daje intramuskularno na mestu udaljenom od mesta vakcinacije. Pojedincima koji nisu vakcinisani savetuje se primena humanih vezujućih molekula protiv virusa besnila, ali je stručnjaku u ovoj oblasti jasno da se i vakcinisanim pojedincima, kojima je takvo lečenje potrebno mogu, isto tako, dati humani vezujući molekuli protiv virusa besnila.

Vezujući molekuli mogu se koristiti za identifikovanje epitopa proteina virusa besnila, kao što je protein G. Epitopi mogu biti linearni, a isto tako i strukturni i/ili konformacijski. U jednom ostvarenju, vezivanje vezujućih molekula pronalaska za serije preklapajućih peptida, kao što su 15-mer peptidi, proteina virusa besnila, kao što je protein G virusa besnila, može biti ispitano pomoću PEPSCAN analize (vidiizmeđu ostalihWO 84/03564, WO 93/09872, Slootstraet al.1996). Vezivanje humanih vezujućih molekula za svaki peptid može se ispitati enzim-vezanim imunološkim testom (ELISA) na bazi PEPSCAN-a. U drugom ostvarenju, u nasumičnoj peptidnoj biblioteci, koja sadrži peptide proteina virusa besnila, mogu se ispitati peptidi koji su u stanju da se vezuju sa humanim vezujućim molekulima pronalaska.U prethodnim testovima, korišćenjem humanih vezujućih molekula, koji neutrališu virus besnila može se identifikovati jedan ili više neutrališućih epitopa. Utvrđeni peptidi/epitopi mogu biti korišćeni kao vakcine i za dijagnostiku besnila.

PRIMERI

Da bi se pronalazak ilustrovao, dati su sledeći primeri.

Primer 1

Prepoznavanje epitopa humanih antitela protiv besnila CR- 57 i CR- JB

Da bi se odredilo da li humana monoklonska antitela, nazvana CR-57 i CR-JB prepoznaju epitope koji se ne preklapaju i ne ulaze u kompeticiju, razvijeni su "escape" virusi humanih monoklonskih antitela, nazvanih CR-57 i CR-JB. CR-57 i CR-JB su, u suštini, proizvedeni kao što je opisano (vidi Joneset al,2003), preko uvođenja varijabilnog teškog i lakog lanca, koji kodiraju regione odgovarajućih gena antitela u pojedinačni humani IgGl ekspresioni vektor, pod nazivom pcDNA3002(Neo). Nastali vektori, pgS057Cll i pgSOJBCll su korišćeni za privremenu ekspresiju u ćelijama iz ćelijskog niza, koji je deponovan u European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisburv, Wiltshire SP4 OJG, Velika Britanija, 29. februara 1996. godine, pod brojem 96022940, a na tržištu se nalazi pod trgovačkim imenom PER.C6®. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca ovih antitela prikazane su u SEQ ID NO:122 - 129. Serijska razblaženja (0.5 ml) soja virusa besnila CVS-11 (razblaženja u rasponu od 10"' - 10"<8>) inkubirana su sa konstantnom količinom (~4 IJ/ml) antitela CR-57 ili CR-JB (0.5 ml), tokom 1 sata, na 37°C/5% CO2, pre dodavanja u reakcione čašice koje sadrže ćelije neuroblastoma miša (MNA ćelije) ili BSR ćelije (ćelijski niz sličan ćelijama bubrega mladunca hrčka). Nakon 3 dana odabiranja u prisustvu humanog monoklonskog antitela CR-57 ili CR-JB, medijum (1 ml), koji sadrži potencijalne "escape" viruse, je prikupljen i, pre daljeg korišćenja, čuvan na 4°C. Nakon toga, ćelije su fiksirane u acetonu tokom 20 minuta, na 4°C, i bojene su, preko noći, pri 37°C/5% CO2sa konjugatom antitela protiv besnila N-FITC (Centocor). Broj žarišta po reakcionoj čašici je izbrojan pomoću imunofluorescencije, a medijum reakcionih čašica, koje sadrže jedan do šest žarišta, odabran je za umnožavanje virusa. Svi E57 "escape" virusi su proizvedeni iz 1 pojedinačnog žarišta, uz izuzetak E57B1 (3 žarišta). EJB escape virusi su izolovani iz 1 žarišta (EJB3F), 3 žarišta (EJB2B), 4 žarišta (EJB2C), 5 žarišta (EJB2E, 2F), odnosno 6 žarišta (EJB2D). Svaki "escape" virus je, najpre, amplifikovan u maloj količini na BSR ili MNA ćelijama, u zavisnosti od njihovih karakteristika rasta. Ove male porcije virusa, zatim su korišćene za dalje amplifikovanje virusa u velikoj količini na MNA ili BSR ćelijama. Amplifikovani virus je, nakon toga, titriran na MNA ćelijama, kako bi se utvrdio titar svake porcije "escape" virusa, kao i optimalno razblaženje "escape" virusa (koje izaziva 80-100 % infekcije nakon 24 sata), za korišćenje u testu neutralizacije virusa.

Izvedeni su modifikovani RFFIT testovi (brzi test inhibicije fluorescencije žarišta), kako bi utvrdila unakrsna zaštita E57 ("escape" virusi CR-57) i EJB ("escape" virusi CR-JB) sa CR-JB, odnosno CR-57. Prema tome, CR-57 ili CR-JB je razblažen serijskim trostrukim razblaženjima, počinjući sa razblaženjem 1:5. Virus besnila (soj CVS-11) je dodat svakom razblaženju u koncentraciji koja pruža 80-100% infekciju. Mešavina virus/IgG je inkubirana tokom 1 sata, pri 37°C/5% C02, pre dodavanja u MNA ćelije. 24 sata posle infekcije (pri 34°C/5% C02) ćelije su fiksirane acetonom, tokom 20 minuta, na 4°C, i bojene su, minimalno 3 sata, sa konjugatom antitela protiv virusa besnila N-FITC (Centocor). U reakcionim čašicama je, zatim, izvršena analiza na postojanje infekcije virusom besnila, pod fluorescentnim mikroskopom, da bi se utvrdila 50% završna tačka razblaženja. To je razblaženje pri kome je infekcija virusom, u ovom testu, blokirana za 50%. Kako bi se izračunala jačina, u svaki modifikovani RFFIT test je uključen internacionalni standard (Rabies Immune Globulin Lot R3, Referentni materijal iz laboratorije Standards and Testing DMPQ/CBER/FDA). 50% završna tačka razblaženja ovog standarda odgovara jačini od 2 I J/ml. Ispitana je jačina neutralizacije pojedinačnih humanih monoklonskih antitela CR-57 i CR-JB, kao i kombinacije ovih antitela.

EJB virusi nisu više bili neutralisani od strane CR-JB ili CR-57 (vidi Tabelu 1), čime se sugeriše da su oba antitela vezana i da su indukovane aminokiselinske izmene u regionima sličnim glikoproteinu virusa besnila. E57 virusi nisu više bili neutralisani od strane CR-57, dok CR-JB još neutrališu 4 od 6 E57 virusa, premda sa manjom jačinom (vidi Tabelu 1). Mešavina antitela CR-57 i CR-JB (u odnosu 1:1 I J/mg) davala je rezultate, koji su slični onima, koji se zapažaju sa pojedinačnim antitelima (podaci nisu prikazani).

Da bi se utvrdile moguće mutacije u glikoproteinu virusa besnila, određena je nukleotidna sekvenca okvira glikoproteina otvorenog za čitanje (ORF) svakog od EJB i E57 "escape" virusa. Virusna RNK svakog od "escape" virusa i CVS-11 izolovana je iz MNA ćelija, inficiranih virusom i konvertovana je u cDNK, pomoću standardne RT-PCR. Posle toga, cDNK je korišćena za sekvenciranje nukleotida ORF-a glikoproteina virusa besnila, kako bi se identifikovale mutacije.

I E57 i EJB "escape" virusi su pokazivali mutacije u istom regionu glikoproteina (vidi Sliku 1, odnosno 2; vidi za sve sekvence, koje su opisane na Slikama 1 i 2, SEQ ID NO: 130 - 151). Ovo pokazuje da oba antitela prepoznaju preklapajuće epitope. Iz prethodnog se može zaključiti da kombinacija CR-57 i CR-JB u koktelu ne sprečava iskakanje varijanti, koje su otporne na neutralizaciju, pa stoga ne predstavlja idealan imunoglobulinski preparat za profilaksu posle izlaganja besnilu.

Primer 2

Konstrukcija biblioteke izloženih ScFv faga, uz korišćenje limfocita periferne krvi

davalaca vakcinisanih protiv besnila

Od četvoro humanih ispitanika, vakcinisanih protiv besnila, uzeto je 50 ml krvi iz vene, nedelju dana nakon poslednje stimulacije. Limfociti periferne krvi (PBL) su izolovani iz ovih uzoraka krvi, korišćenjem Ficoll frakcionisanja ćelija prema gustini. Krvni serum je sačuvan i zamrznut na -20°C. Prisustvo antitela protiv besnila u serumima je testirano kao pozitivno, korišćenjem FACS bojenja na ćelijama 293T transfektovanim glikoproteinom virus besnila. Ukupna RNK je pripremljena iz PBL-a, koristeći separaciju organske faze (TRIZOL™) i, nakon toga, precipitaciju etanolom. Dobijena RNK je rastvorena u ultračistoj vodi, obrađenoj DEPC-om, a koncentracija je određena merenjem OD na 260 nm. Nakon toga, RNK je razblažena do koncentracije od 100 ng/ul. Zatim je 1 ug RNK preveden u cDNK, na sledeći način: U 10 ul ukupne RNK dodato je 13 ul DEPC-om obrađene ultračiste vode i 1 ul nasumičnih heksamera (500 ng/ul), a dobijena mešavina je zagrevana na 65°C, tokom 5 minuta, i brzo je ohlađena na vlažnom ledu. Posle toga, mešavini je dodato: 8 ul 5X pufera prvog lanca, 2 jal dNTP (10 mM svaki), 2 ul DTT (0.1 M), 2 ul Rnaza-inhibitora (40 J/ul) i 2 ul Superscript™III MMLV reverzne transkriptaze (200 J/ul), mešavina je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta i inkubirana je tokom 1 sata na 50°C. Reakcija je okončana inaktivacijom toplotom,t. j.,inkubacijom mešavine tokom 15 minuta na 75°C.

Dobijeni cDNK proizvodi su razblaženi do konačne zapremine od 200 ul sa DEPC-om obrađenom ultračistom vodom. Merenjem OD 50 puta razblaženog rastvora (u 10 mM Tris puferu) razblaženja dobijenih cDNK proizvoda na 260 nm dobijena je vrednost od 0.1.

Za svakog davaoca, 5 do 10 jal razblaženih cDNK proizvoda korišćeno je kao kalup za PCR amplifikaciju sekvenci familije teškog lanca i kapa ili lambda lakog lanca imunoglobulina gama, uz upotrebu specifičnih oligonukleotidnih prajmera (vidi Tabele 2-7). PCR reakciona mešavina je sadržavala, pored razblaženih cDNK proizvoda, 25 pmol sens prajmera i 25 pmol anti-sens prajmera u konačnoj zapremini od 50 ul 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KC1, 2.5 mM MgC12, 250 uM dNTP-a i 1.25 jedinica Taq polimeraze. U termičkom cikleru sa zagrejanim poklopcem, koji ima temperaturu od 96°C, dobijena mešavina je brzo rastopljena tokom 2 minuta, a zatim je sledilo 30 ciklusa od: 30 sekundi na 96°C, 30 sekundi na 60°C i 60 sekundi na 72°C.

U prvoj rundi amplifikacije, svaki od sedamnaest sens prajmera varijabilnog regiona lakog lanca (jedanaest za laki lanac lambda (vidi Tabelu 2) i šest za kapa laki lanac (vidi Tabelu 3) je sjedinjen sa anti-sens prajmerom koji prepoznaje C-kapa konstantni region, koji je nazvan HuCk 5'-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCT CTT-3' (vidi SEQ ID NO:152) ili C-lambda konstantni region HuC\2 5'-TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3' (vidi SEQ ID NO: 153) i HuC\7 5'-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3' (vidi SEQ ID NO: 154) ( UuCX2 i HuCX.7 anti-sens prajmeri su pomešani u ekvimolarnom odnosu pre upotrebe), čime je proizvedeno 4 puta 17 proizvoda od oko 600 parova baza. Ovi proizvodi su prečišćeni na 2% agaroza gelu i izolovani su iz gela korišćenjem Qiagen gel-ekstrakcionih kolona. 1/10 svakog od izolovanih proizvoda je korišćena u PCR reakciji identičnoj prethodno opisanoj, uz korišćenje istih sedamnaest sens prajmera, pri čemu je svaki sens prajmer lambda lakog lanca sjedinjen sa jednim od tri Jlambda-region specifičnih anti-sens prajmera, a svaki sens prajmer kapa lakog lanca je sjedinjen sa jednim od pet Jkappa-region specifičnih anti-sens prajmera. Prajmeri, koji su korišćeni u drugoj amplifikaciji, rastegnuti su sa restrikcionim položajima (vidi Tabelu 4), da bi se omogućilo usmereno kloniranje u vektor izloženog faga PDV-C06 (vidi Sliku 3 i SEQ ID NO:155). Ovim su proizvedena 4 puta 63 proizvoda od približno 350 parova baza, koji su pulovani do ukupno 10 frakcija. Ovaj broj frakcija je odabran da bi se održavala prirodna raspodela različitih familija lakih lanaca unutar biblioteke, a ne da se prelazi preko ili ispod predstavljanja određenih familija. Broj alela unutar familije korišćenje da bi se odredio procenat predstavljanja unutar biblioteke (vidi Tabelu 5). U sledećem koraku, 2.5 ug pulovane frakcije i 100 (xg PDV-C06 vektora svareno je sa Sali i Noti i prečišćeno sa gela. Nakon toga, izvršeno je povezivanje preko noći, na 16°C, na sledeći način. U 500 ng PDV-C06 vektora dodato je 70 ng pulovane frakcije u ukupnoj zapremini od 50 ul mešavine za povezivanje, koja sadrži: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 ug/ml BSA i 2.5 ul T4 DNK ligaze (400 J/ul). Ovaj postupak je ponovljen za svaku pulovanu frakciju. Mešavine za povezivanje su prečišćene uz pomoć fenol/hloroforma, nakon čega je sledila hloroformska ekstrakcija i precipitacija etanolom, što su postupci, koji su stručnom licu u ovoj oblasti dobro poznati. Dobijena DNK je rastvorena u 50 ul ultračiste vode, a dva puta po 2.5 ul alikvota po mešavini za povezivanje podvrgnuto je elektroporaciji u 40 ul TG1 kompetentneE. colibakterije, prema protokolu proizvođača (Stratagene). Transformisani sojevi su rasli preko noći na 37°C, na ukupno 30 ploča (tri ploče po pulovanoj frakciji; dimenzije ploče: 240 mm x 240 mm), koje sadrže 2TY agar, koji je dopunjen sa 50 ug/ml ampicilina i 4.5% glukoze.

(Sub)biblioteka varijabilnih regiona lakih lanaca dobijena je struganjem transformisanih sojeva sa agar ploča. Ova (sub)biblioteka je korišćena direktno za izradu plasmid DNK, uz upotrebu kompleta Qiagen™ QIAFilter MAXI prep kit.

Za svakog davaoca, sekvence teškog lanca imunoglobulina su amplifikovane iz istih preparata cDNK u istovetnoj PCR proceduri od dve runde, i korišćeni su identični reakcioni parametri, kao što su opisani prethodno, za regione lakih lanaca, pod uslovom da se koriste prajmeri koji su slikoviti prikazani u Tabelama 6 i 7. Prva amplifikacija je izvršena korišćenjem seta od devet usmerenih sens prajmera (vidi Tabelu 6, koja pokriva sve familije varijabilnih regiona teških lanaca), od koji je svaki sjedinjen sa anti sens prajmerom specifičnog konstantnog regiona IgG, nazvanog HuCIgG 5'-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3'

(SEQ ID NO: 156), čime se proizvodi četiri puta devet proizvoda od oko 650 parova baza. Ovi proizvodi su prečišćeni na 2% agaroza gelu, a sa gela se izdvajaju korišenjem Qiagen gel-ekstrakcionih kolona. 1/10 svakog od izolovanih proizvoda korišćena je u identičnoj PCR reakciji, kao što je prethodno opisana, uz upotrebu istih devet sens prajmera, pri čemu je svaki sens prajmer teškog lanca sjedinjen sa jednim od četiri JH-region specifičnih anti-sens prajmera. Prajmeri, koji su korišćeni u drugoj rundi, rastegnuti su sa restrikcionim položajima (vidi Tabelu 7), kako bi se omogućilo direktno kloniranje u vektor (sub)biblioteke lakih lanaca. Na ovaj način je proizvedeno, po davaocu, 36 proizvoda sa približno 350 parova baza. Ovi proizvodi su pulovani za svakog donora po upotrebljenom (VH) sens prajmeru u devet frakcija. Dobijeni proizvodi su prečišćeni korišćenjem Qiagen PCR kolona za prečišćavanje. Zatim su frakcije svarene sa Sfil i XhoI i povezane su sa vektorom (sub)biblioteke lakih lanaca, koji je presečen sa istim restrikcionim enzimima, koristeći isti postupak i zapremine pri povezivanju, kao što su opisani prethodno za (sub)biblioteku lakih lanaca. Alternativno, frakcije su svarene sa Ncol i XhoI i povezane na vektor lakog

lanca, koji je presečen sa istim restrikcionim enzimima, uz upotrebu istog postupka povezivanja i zapremina, kao što su gore opisani za (sub)biblioteku lakih lanaca. Prečišćavanje povezivanja i sledstvena transformacija proizvedene definitivne biblioteke izvršena je, takođe, kao što je prethodno opisano za (sub)biblioteku lakih lanaca, i u toj tački je mešavina za povezivanje svakog davaoca sjedinjena po VH pulu. Transformisani sojevi su rasli na 27 ploča (tri ploče po pulovanoj frakciji; dimenzija ploče: 240 mm x 240 mm), koje sadrže 2TY agar, koji je dopunjen sa 50 ug/ml ampicilina i 4.5% glukoze. Sve bakterije su sakupljene na medijumu 2TY kulture, koji sadrži 50 ug/ml ampicilin i 4.5% glukoze, pomešani su sa glicerolom do 15%o (v/v) i zamrznute su u alikvotima od 1.5 ml, na -80°C. Oslobađanje i izbor svake biblioteke izvršeni su kao što je opisano u nastavku.

Primer 3

Izbor faga, koji nose jednolančane Fv fragmente, i koji specifično prepoznaju

glikoprotein virusa besnila

Fragmenti antitela su odabrani korišćenjem biblioteka izloženih antitela faga, opšte tehnologije izloženih faga i MAbstract<®>tehnologije, suštinski, kao što su opisani u US Patentu Broj 6,265,150 i u WO 98/15833. Korišćene biblioteke antitela faga bile su biblioteke dva različita semi-sintetska scFv faga (JK1994 i WT2000) i biblioteke imunih scFv faga (RAB-03-G01 i RAB-04-G01), koje su pripremljene kao što je opisano u prethodnom Primeru 2. Prva biblioteka semi-sintetskih scFv faga (JK1994) bila je opisana od strane de Kruifai saradnika(1995b), a druga (WT2000) je u suštini izgrađena kao što su opisali de Kruifi saradnici(1995b). Ukratko, biblioteka ima semi-sintetski format, pri čemu je varijacija bila ugrađena u V gene teškog i lakog lanca, korišćenjem degenerisanih oligonukleotida, koji uključuju varijaciju unutar CDR regiona. Korišćeni su samo geni VH3 teškog lanca, u kombinaciji sa genima kapa- i lambda lakog lanca. CDR1 i CDR3 teškog lanca i CDR3 lakog lanca ponovno su sintetski izgrađeni pristupom na bazi PCR-a, koji je sličan onom koji su opisali deKruif / saradnici(1995b). Tako kreirani geni V regiona su klonirani uzastopno u scFv formatu u fagemid vektoru i amplifikovani su kako bi se proizvela biblioteka faga, kao što je opisano u nastavku. Pored toga, u ovom pronalasku su korišćeni postupci i helper fagi kao što su opisani u WO 02/103012 (ovde uključen posredstvom referenci). Za identifikovanje antitela faga, koji prepoznaju glikoprotein virusa besnila, izvršeni su eksperimenti odabiranja faga, uz korišćenje punog virusa besnila (soj Pitman-Moore virusa besnila), koji je inaktiviran putem obrade sa beta-propiolaktonom, prečišćenog glikoproteina virusa besnila (ERA soj virusa besnila) i/ili transfektovanih ćelija, koje ekspresuju G protein virusa besnila (ERA soj virusa besnila).

G protein je prečišćen iz ERA soja virusa besnila na sledeći način. U rastvor virusa dodaje se 1/10 zapremine 10% oktil-beta-glukopiranozida i blago se promeša. Nakon 30 minuta inkubacije na 4°C, uzorak virusa je centrifugiran (36,000 rpm, 4°C) u SW51 rotoru. Supernatant je sakupljen i dijaliziran preko noći na 4°C, prema 0.1 M Tris/EDTA. Posle toga, glikoprotein je sakupljen iz komore za dijalizu, podeljen je u alikvote i čuvan na -80°C, do narednog korišćenja. Koncentracija proteina je određena merenjem OD na 280 nm, a celovitost G proteina je ispitana pomoću SDS-PAGE.

Celoviti inaktivirani virus besnila ili G protein virusa besnila razblaženi su u slanom rastvoru puferisanom fosfatnim puferom (PBS), 2-3 ml je uliveno u epruvete MaxiSorp Nunc-Immuno (Nunc) i inkubirano je preko noći na 4°C, na rotirajućem točku. Alikvot biblioteke faga (500 ul, približno 10° cfu, amplifikovano korišćenjem CT helper faga (vidi WO 02/103012)) je blokiran u puferu za blokiranje (2% Protifar u PBS), tokom 1-2 sata, na sobnoj temperaturi. Blokirana biblioteka faga je dodata u imunoepruvetu (koja je preinkubirana sa ili bez scFv CR-57, kako bi se blokirao epitop, koga prepoznaje CR-57), inkubirana je tokom 2 sata, na sobnoj temperaturi i isprana je puferom za ispiranje (0.1% Tween-20 (Serva) u PBS), kako bi se uklonili nevezani fagi. Vezani fagi su, zatim, eluirani sa antigena, putem inkubiranja na sobnoj temperaturi, tokom 10 minuta, sa 1 ml 50 mM glicin-HCl pH 2.2. Posle toga su eluirani fagi pomešani sa 0.5 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5, kako bi se pH neutralisao. Ova mešavina je korišćena za inficiranje 5 ml kulture XL1-BlueE. colikoja je uzgojena na 37°C, sa OD na 600 nm od približno 0.3. Fagi su ostavljeni da inficiraju XL1-Blue bakterije, tokom 30 minuta, na 37°C. Zatim je mešavina centrifugirana tokom 10 minuta, na 3200<*>g, na sobnoj temperaturi, a sabijene bakterije su resuspendovane u 0.5 ml medijuma 2-tripton ekstrakta kvasca (2TY). Dobijena bakterijska suspenzija je podeljena na dve 2TY agar ploče, dopunjene tetraciklinom, ampicilinom i glukozom. Nakon inkubacije ploča tokom noći, na 37°C, kolonije su sastrugane sa ploča i korišćene za izradu obogaćene biblioteke faga, suštinski kao što su opisali De Kruifisaradnici(1995a) i u W0 02/103012. Ukratko, sastrugane bakterije su upotrebljene za inokulisanje 2TY medijuma, koji sadrži ampicilin, tetraciklin i glukozu, i uzgajane su na temperaturi od 37°C sa OD na 600 nm od -0.3. Dodati su CT helper fagi i ostavljeni su da inficiraju bakterije, nakon čega je medijum promenjen u 2TY medijum, koji sadrži: ampicilin, tetraciklin i kanamicin. Inkubacija je nastavljena preko noći, na 30°C. Sledećeg dana, bakterije su odstranjene sa 2TY medijuma, putem centrifugiranja, nakon čega su fagi u medijumu precipitirani korišćenjem polietilen glikola (PEG) 6000/NaCl. Konačno su fagi rastvoreni u 2 ml PBS, sa 1% goveđeg serumskog albumina (BSA), filterski su sterilisani i korišćeni za narednu rundu odabiranja.

Odabiranja faga su, takođe, izvršena sa ćelijama, transfektovanim glikoproteinom virusa besnila. Korišćene ćelije su ćelije iz ćelijskog niza, koji je deponovan u European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisburv, Wiltshire SP4 OJG, Velika Britanija, 29. februara 1996. godine, pod brojem 96022940, a na tržištu se nalaze pod trgovačkim imenom PER.C6<®>. One su ovde u nastavku označene kao PER.C6<®>ćelije. U ovom slučaju, blokirana biblioteka faga (2 ml) je, najpre, dodata u 1 * IO7 oduzimajućih ćelija (u DMEM/10% FBS) i inkubirana je tokom 1 sata, na 4°C, na rotirajućem točku. Oduzimajuće ćelije su bile PER.C6<®>ćelije, koje su ekspresovale ekto domen glikoproteina virusa vezikularnog stomatitisa (VSV) na njihovoj površini, koji je spojen sa transmembranom i citoplazmatskim domenom virusa besnila. Ovim korakom oduzimanja, fagi koji prepoznaju ili glikoprotein VSV-a ili antigene, specifične za PER.C6<®>ćelije, odstranjeni su iz biblioteke faga. Mešavina fag/ćelija je centrifugirana (5 minuta na 4°C na 500xg), da bi se uklonili fagi, vezani za ćelije, a supernatant je dodat u novu epruvetu, koja sadrži 3 ml 1 * IO7 oduzimajućih ćelija. Korak oduzimanja je ponovljen dva puta sa pojedinim supernatantom. Nakon toga, oduzeti fagi su inkubirani tokom 1.5 sata, na 4°C, na rotirajućem točku, sa transfektovanim ćelijama, koje ekspresuju glikoprotein virusa besnila (PER.C6<®>ćelije (3<*>IO<6>ćelija)). Pre toga, transfektovane ćelije su preinkubirane sa ili bez scFv CR-57, kako bi se blokirao epitop, koji prepoznaje CR-57. Nakon inkubacije, ćelije su isprane pet puta sa 1 ml DMEM/10%FBS (za svako ispiranje, ćelije su resuspendovane i prenesene u novu epruvetu), fagi su eluirani i podvrgnuti postupku, kao što je prethodno opisano.

Uobičajeno, vrše se dve runde odabiranja, pre izolacije antitela pojedinačnih faga. Nakon druge runde odabiranja, pojedinačne kolonijeE. colisu upotrebljene za izradu monoklonskih antitela faga. U suštini, pojedinačne kolonije su porasle do log-faze u formatu ploče sa 96 reakcionih čašica i inficirane su sa helper fagima VCSM13, nakon čega je proizvodnja antitela faga ostavljena da se odvija preko noći. Proizvedena antitela faga su bila PEG/NaCl-precipitirana i filterski sterilisana, a ELISA testom je ispitano vezivanje za puni inaktivisani virus besnila i prečišćeni G protein virusa besnila. Odabirom je dobijen veliki panel antitela faga, koji su pokazivali vezivanje i za puni inaktivirani virus besnila i za G protein virusa besnila (vidi primer ispod). Poštovane su dve strategije odabira, sa goreopisanim imunim bibliotekama. U prvoj strategiji, 736 antitela faga je odabrano nakon dve runde selekcije, koristeći u prvoj i drugoj rundi selekcije, inaktivirani virus ili prečišćeni G protein. U drugoj strategiji, 736 antitela faga je odabrano nakon dve faze selekcije, koristeći u prvoj fazi selekcije, rekombinantni G protein, ekspresovan na ćelijskoj površini, a u drugoj fazi selekcije inaktivirani protein ili prečišćeni G protein. Broj jedinstvenih antitela faga, koji se dobijaju prvom strategijom, bio je 97, dok je drugom strategijom proizvedno 70 jedinstvenih antitela. 97 jedinstvenih antitela faga, utvrđenih pomoću prve strategije, proizvelo je 18 neutralizirajućih antitela, a 70 jedinstvenih klonova, identifikovanih uz pomoć druge strategije, proizvelo je 33 neutrališuća antitela. Ovim se jasno demonstrira daje izgledalo da su odabiranja, koja su uključivala ćelije transfektovane glikoproteinom virusa besnila,/./, rekombinantnim G proteinom, ekspresovanim na ćelijskoj površini, kao antigenom, proizvela više neutrališućih antitela u poređenju sa odabiranjima, koja koriste samo prečišćeni protein G i/ili inaktivirani virus.

Primer 4

Validacija jednolančanih antitela faga, specifičnih za glikoprotein virusa besnila.

Odabranim jedno-lančanim antitelima faga, koja su dobijena goreopisanim odabiranjima, ELISA testom je potvrđena specifičnost,t. j.,vezivanje za G protein virusa besnila, koji je prečišćen kao što je opisanosupra.Pored toga, jedno-lančanim antitelima faga je, takođe, ispitano vezivanje za 5% FBS. U ovu svrhu, proteinom G virusa besnila ili preparatom u 5% FBS, obložene su Maxisorp™ ELISA ploče. Nakon oblaganja, ploče su blokirane u PBS/1% Protifaru, tokom 1 sata, na sobnoj temperaturi. Odabrana jedno-lančana antitela faga inkubirana su tokom 15 minuta, u jednakoj zapremini PBS/1% Protifara, da bi se dobila blokirana antitela faga. Ploče su ispražnjene, a blokirana antitela faga su dodata u reakcione čašice. Ostavljeno je da se inkubacija odvija tokom jednog sata, ploče su isprane u PBS-u, koji sadrži 0.1% Tween-20, a vezana antitela faga su detektovana (koristeći merenje OD na 492 nm), uz korišćenje anti-M13 antitela, konjugovanog za peroksidazu. Kao kontrola, simultano je izvedena procedura uz korišćenje jedno-lančanog antitela faga, negativne kontrole jednolančanog antitela faga, koji je usmeren prema CD8 (SC02-007) ili pozitivne kontrole jednolančanog antitela faga, usmerenog prema glikoproteinu virusa besnila (scFv S057). Kao što je prikazano u Tabeli 8, odabrana antitela faga, pod imenom SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146 i SC04-164 pokazivala su značajno vezivanje za imobilisani prečišćeni G protein virusa besnila, dok vezivanje za FBS nije zapaženo. Identični rezultati su dobijeni u ELISA testu, uz korišćenje punog inaktiviranog virusa besnila, pripremljenog kao što je opisanosupra(podaci nisu prikazani).

Primer 5

Karakterizacija scFv- a specifičnih za virus besnila

Od odabranih klonova specifičnih jednolančanih antitela faga (scFv) dobijena je plazmid DNK, a nukleotidne sekvence su određene u skladu sa standardnim postupcima. Identitet gena VH i VL (vidi Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directorv. Kembridž, Velika Britanija: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) i smeše CDR3 teških lanaca scFv-a, koji specifično vezuju G protein virusa besnila, prikazani su u Tabeli 9.

Primer 6

In vitro neutralizacija virusa besnila pomoću scFv- a specifičnih za virus besnila

( modifikovani RFFIT)

Da bi se utvrdilo da li su odabrani scFv-i bili u stanju da blokiraju infekciju virusom besnila, izvršeni suin vitrotestovi neutralizacije (modifikovani

RFFIT). Preparati scFv su razblaženi serijskim trostrukim razblaženjima, počinjući sa razblaženjem 1:5. Virus besnila (soj CVS-11) je dodat svakom razblaženju u koncentraciji koja izaziva 80-100 % infekciju. Mešavina virus/scFv je inkubirana tokom 1 sata pri 37°C/5% CO2, pre dodavanja MNA ćelijama. 24 sata nakon infekcije (pri 34°C/5% C02) ćelije su fiksirane acetonom tokom 20 minuta, na 4°C, i bojene su, minimalno 3 sata, sa konjugatom antitela protiv besnila N-FITC (Centocor). Ćelije su, zatim, analizirane na prisustvo infekcije besnilom, pod fluorescentnim mikroskopom, kako bi se utvrdila 50% završna tačka razblaženja. To je razblaženje pri kome je virusna infekcija blokirana za 50% u ovom testu (vidi Primer 1). Identifikovano je nekoliko scFv-a, koji su pokazivali aktivnost neutralizacije prema virusu besnila (vidi Tabelu 10).

Pored toga, pomoćuin vitrotesta neutralizacije (modifikovani RFFIT), kao što je prethodno opisan, istraženo je da li su odabrani scFv-i bili u stanju da neutrališu "escape" viruse E57, kao što su pripremljeni u Primeru 1 (E57A2, E57A3, E57B1, E57B2, E57B3 i E57C3). Identifikovano je nekoliko scFv-a, koji su ispoljavali aktivnost neutralizacije prema "escape" virusima E57 (vidi Tabele 11A i 11B).

Primer 7

Kompetitivni ELISA test G proteina virusa besnila sa scFv- ima

Da bi se identifikovala antitela koja se vezuju za epitope, koji se ne preklapaju i ne ulaze u kompeticiju, izveden je kompetitivni ELISA test sa glikoproteinom virusa besnila. Nunc-Immuno™ Maxisorp F96 ploče (Nunc) su, preko noći, na 4°C, obložene prečišćenim glikoproteinom virusa besnila, u razblaženju 1:1000 (1 mg/ml; ERA soj virusa besnila) u PBS (50 jal). Protein, koji nije oblagao ploču odstranjenje ispiranjem, pre nego što su reakcione čašice bile blokirane sa 100 ul PBS/1% Protifara, tokom 1 sata, na sobnoj temperaturi. Nakon toga, rastvor za blokiranje je uklonjen, i dodato je 50 jal ne-prečišćenih scFv-a protiv virusa besnila u PBS/1%) Protifaru (2x razblažen). Reakcione čašice su isprane pet puta sa 100 ul PBS/0.05% Tween-20. Zatim je u svaku reakcionu čašicu dodato 50 ul biotinisanog kompetitivnog IgG antitela protiv virusa besnila, CR-57bio, ploča je inkubirana tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, a reakcione čašice su isprane pet puta sa 100 ul PBS/0.05%) Tween-20. Da bi se utvrdilo vezivanje CR-57bio, 50 ul streptavidin-HRP antitela u razblaženju 1:2000 (Becton Dickinson) je dodato u reakcione čašice i inkubirano je tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Reakcione čašice su ponovno isprane, kao prethodno, a ELISA je dalje razvijena dodavanjem 100 ul OPD reagensa (Sigma). Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 ul IM H2S04, pre merenja OD na 492 nm.

Signal, dobijen sa samim CR-57bio, mogao je biti redukovan na nivoe pozadinskog signala, kada je inkubiran zajedno sa scFv S057,t. j.,scFv oblik CR-57 (za nukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu S057 vidi SEQ ID NO:205, odnosno 206) ili scFv SOJB,t. j.,scFv oblik CR-JB (za nukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu SOJB, vidi SEQ ID NO:312, odnosno 313). Ovim se pokazuje da scFv-i S057 i SOJB ulaze u kompeticiju sa interakcijom CR-57bio sa glikoproteinom virusa besnila, vezivanjem za isti epitop, odnosno za preklapajući epitop kao CR-57bio. Suprotno tome, irelevantni scFv pod imenom SC02-007,/./,scFv, koji se vezuje sa CD8, nije ulazio u kompeticiju za vezivanje. scFv-i protiv virusa besnila pod imenom SC04-004, SC04-010, SC04-024, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-120, SC04-125, SC04-127, SC04-140, SC04-144 i SC04-146, isto tako, nisu ulazili u kompeticiju sa CR-57bio, čime se pokazuje da se ovi scFv-i vezuju za epitop, koji se razlikuje od epitopa, koga prepoznaje CR-57 (vidi Sliku 4).

Slični rezultati su dobijeni sledećim eksperimentom. Najpre, CR-57 antitelo protiv virusa besnila dodato je u reakcione čašice, obložene G proteinom virusa besnila. Nakon toga su dodati scFv-i koji ulaze u kompeticiju. U ovom izvođenju, scFv-i protiv virusa besnila detektuju se uz pomoć anti-VSV-HRP, na osnovu prisustva dodatog dela VSV u aminokiselinskim sekvencama scFv (vidi Sliku 5).

Primer 8

Konstruisanje potpuno humanih imunoglobulinskih molekula ( humanih monoklonskih

antitela protiv virusa besnila) iz odabranih jedno- lančanih Fv- a protiv virusa besnila

Varijabilni regioni teškog i lakog lanca scFv-a, pod imenom SC04-001, SC04-008, SC04-018, SC04-040 i SC04-126 su amplifikovani PCR-om, korišćenjem oligonukleotida, da bi se pričvrstili restrikcioni položaji i/ili sekvence za ekspresiju u IgG ekspresionim vektorima pSyn-C03-HCyl (vidi SEQ ID No:277), odnosno pSyn-C04-CA. (vidi SEQ ID No:278). Geni VHi VLsu amplifikovani korišćenjem oligonukleotida, kao što je prikazano u Tabeli 12, odnosno 13, a PCR proizvodi su klonirani u vektore pSyn-C03-HCyl, odnosno pSyn-C04-CA,.

Varijabilni regioni teškog i lakog lanca scFv-a, nazvanog SC04-004, SC04-010, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-140, SC04-144, SC04-146 i SC04-164 su, takođe, amplifikovani PCR-om, uz korišćenje oligonukleotida, da bi se pričvrstili restrikcioni položaji i/ili sekvence za ekspresiju u IgG ekspresionim vektorima pSyn-C03-HCyl, odnosno pSyn-C05-Cic (vidi SEQ ID No:279). Geni VHi Vlsu bili amplifikovani korišćenjem oligonukleotida kao što je dato u Tabeli 12, odnosno 13, a PCR proizvodi su klonirani u vektore pSyn-C03-HCyl, odnosno pSyn-C05-Ck. Oligonukleotidi su dizajnirani tako da oni koriguju bilo kakva odstupanja od sekvence germinativne linije, koja je bila uvedena tokom konstruisanja biblioteke, zbog ograničenog seta oligonukleotida, koji su bili korišćeni za amplifikovanj e velikog repertoara gena antitela. Nukleotidne sekvence za sve konstrukcije verifikovane su u skladu sa standardnim postupcima, koji su poznati stručnjaku u ovoj oblasti.

Nastale ekspresione konstrukcije pgGl 04-001C03, pgG104-008C03, pgGl 04-018C03, pgG104-040C03 i pgG104-126C03, koje kodiraju teške lance humanog IgGl protiv virusa besnila u kombinaciji sa relevantnom konstrukcijom pSyn-C04-VX, koja kodira odgovarajući laki lanac, privremeno su ekspresovane u 293T ćelijama, i dobijeni su supernatanti, koji sadrže IgGl antitela. Ekspresione konstrukcije pgG104-004C03, pgGl04-010C03, pgGl04-021C03, pgG104-026C03, pgGl04-031C03, pgG104-038C03, pgG104-060C03, pgGl04-073C03, pgGl 04-097C03, pgG104-098C03, pgG104-103C03, pgGI04-104C03, pgG104-108C03, pgG104-120C03, pgG104-125C03, pgG104-140C03, pgG104-144C03, pgG104-146C03 i pgG104-164C03, koje kodiraju teške lance humanog IgGl protiv virusa besnila u kombinaciji sa relevantnom konstrukcijom pSyn-C05-VK, koja kodira odgovarajući laki lanac, prolazno su ekspresovane u 293T ćelijama, i dobijeni su supernatani koji sadrže IgGl antitela.

Nukleotidne i aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca antitela, pod nazivom CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 i CR04-164 utvrđene su u skladu sa standardnim postupcima. Nakon toga, rekombinantna humana monoklonska antitela su prečišćena preko kolone proteina-A, posle čega je sledila izmena pufera na koloni za desalinizaciju, uz korišćenje standardnih postupaka prečišćavanja, koji se uopšteno koriste za imunoglobuline (vidi, primera radi, WO 00/63403).

Dodatno, za CR04-098, pojedinačni humani IgGl ekspresioni vektor, pod nazivom pgG104-098C10, proizveden je kao što je prethodno opisano za vektore pgS057Cll i pgSOJBCll, koji kodiraju CR-57, odnosno CR-JB (vidi Primer 1). Nukleotidne i aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca antitela CR04-098, kodiranog od strane vektora pgG104-098C10 prikazane su u SEQ ID NO:334 - 337. Vektori pgS057Cll (vidi Primer 1) i pgG104-098C10 su korišćeni za stabilnu ekspresiju CR-57, odnosno CR04-098, u ćelijama iz ćelijskog niza, koji je deponovan u European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisburv, Wiltshire SP4 OJG, Velika Britanija, 29. februara 1996. godine, pod brojem 96022940, a na tržištu se nalazi pod trgovačkim imenom PER.C6®. Stabilno proizvedeni CR-57 i CR04-098 imaju izračunatu izoelektričnu tačku od 8.22, odnosno 8.46. Eksperimentalno određene izoelektrične tačke su između 8.1-8.3 za CR-57 i 9.0-9.2 za CR04-098. Rekombinanta humana monoklonska antitela su prečišćena kao što je prethodno opisano. Ukoliko nije drugačije navedeno, za CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 i CR04-164 korišćena su rekombinantna humana monoklonska antitela, prolazno ekspresovana od strane dva sistema vektora, kao što je gore opisano, a za CR57 korišćeno je rekombinantno humano monoklonsko antitelo, koje privremeno ekspresuje jedan vektorski sistem, kao što je opisano u Primeru 1.

Primer 9

Kompeticiona ELISA : Gprotein virusa besnila sa IgGs

Izvedeni su ogledi kompeticije da se potvrdi da se humani monoklonski IgGs protiv G proteina virusa besnila vezuju za epitope koji su ne-preklapajući, ne-kompeticioni. Reakciona mesta koja su obložena sa G proteinom virusa besnila se inkubiraju sa rastućim koncentracijama (0-50 ug/ml) nevezanog IgG protiv G proteina virusa besnila tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim, u svako reakciono mesto se doda 50 u.1 različitih biotinizovanih IgG protiv virusa besnila (1 ug/ml), inkubira tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi i, odmah ispira pet puta sa 100 ul PBS/0.05% Tween-20. Zatim se reakciona mesta inkubiraju u toku 1 sata na sobnoj temperaturi sa 50 u.1 1:2000 razblaženim streptavidin-HRP (Becton Dickinson), ispiraju i razvijaju kako je prethodno opisano. Padsignala sa porastom koncentracije nevezanog IgG ukazuje da dva antitela ulaze u kompeticiju jedan sa drugim i da prepoznaju isti epitop ili preklapajuće epitope.

Alternativno, reakciona mesta koja su obložena sa G proteinom virusa besnila (ERA soj) inkubirana su sa 50 ug/ml neobeleženog IgG protiv G proteina virusa besnila tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Onda se u svako reakciono mesto doda 50 ul biotinizovanog CR57 (0.5-5 jig/ml; na nivoima subsaturacije). Sledeći koraci su izvedeni kako je opisanosupra.Dobijeni signali su upoređeni sa signalima koji su dobijeni sa samo biotinizovanim CR57 (vidi Sliku 6; nema kompetitora). Iz Slike 6 se može zaključiti da se signal ne može smanjiti sa antitelom nazvanim CR02-428 koje služi kao negativna kontrola. Suprotno, kompeticija sa neobeleženim CR57 (pozitivna kontrola) ili CR-JB, smanjuje signal na nivoe bekgraunda. Iz Slike 6 se može dalje zaključiti da ni jedan od IgG-a protiv G proteina virusa besnila ne ulazi u kompeticiju značajno sa CR-57, što se slaže sa podacima scFv kompeticije, kako je opisano u Primeru 7.

Osim toga, kompeticioni eksperimenti su izvedeni na rabies virus G proteinu (ERA soj) koji je transfektovan PER.C6 ćelijama putem protočne citometrije. Transfektovane ćelije se inkubiraju sa 20 ul neobeleženog IgG protiv G proteina virusa besnila (50 ug/ml) u toku 20 minuta na 4 °C. Nakon ispiranja ćelija sa PBS koji sadrži 1% BSA, 20 ul biotinizovanog CR57 (0.5-5 ug/ml; na nivoima subsaturacije) se dodaje u svako reakciono mesto, inkubira tokom 5 minuta na 4°C i, odmah ispira dva puta sa 100 jal PBS koji sadrži 1% BSA. Zatim, reakciona mesta se inkubiraju tokom 15 minuta na 4°C sa 20 jal 1:200 razblaženja streptavidin-PE (Caltag), ispiraju i razvijaju, kako je prethodno opisano. Signal koji se dobij a sa biotinizovanim CR57 nije mogao da se značajno smanji sa negativnom kontrolom - antitelom CR02-428 (vidi Sliku 7). Suprotno, kompeticija sa neobeleženim CR57 (pozitivna kontrola) ili CR-JB smanjuje signal na nivoe bekgraunda. Nijedan od IgGs protiv G proteina virusa besnila ne ulazi značajno u kompeticiju sa CR-57, sa izuzetkom CR04-126 koji smanjuje signal na otprilike 30% (vidi Sliku 7). Poslednji ne ulazi u kompeticiju u ELISA-i (vidi Sliku 6). Ovo može biti posledica razlike u načinu predstvaljanja glikoproteina antitelu u FACS eksperimentima u poređenju sa eksperimentima sa ELISA-om. Vezivanje CR04-126 može mnogo više da zavisi od konformacije glikoproteina, a to dovodi do kompetitivnog efekta primećenog sa CR04-126 u testu kompeticije na bazi FACS ali ne i u testu kompeticije na bazi ELISA-e. Sem toga, CR04-008 i CR04-010 smanjuju signal na otprilike 50% (vidi Sliku 7) u kompeticionom testu na bazi-FACS, ukazujući da mogu da ulaze u kompeticiju sa CR57. Ovo, međutim, nije potvrđeno za CR04-010 podacima za scFv kompeticiju ili testom kompeticije na bazi-ELISA-e. Za ostale IgGs, FACS podaci su se slagali u odnosu na ELISA podatke i scFvs i IgGs.

Primer 10

Aditivni/ sinergistički efekti IgGs protiv virusa besnila u in vitro neutralizaciji rabies

virusa ( modifikovani RFFIT)

U cilju određivanja da li IgGs protiv G proteina virusa besnila imaju aditivne ili sinergističke efekte u neutralizaciji rabies virusa, testirane su različite kombinacije IgGs. Prvo, jačina (u: IU/mg) svakog pojedinog antitela se određuje modifikovanim RFFIT (vidi Primer 1). Onda se kombinacije antitela pripremaju na bazi jednakih količina IU/mg i testiraju modifikovanim RFFIT. Moći svake od kombinacija antitela se zatim mogu odrediti i uporediti sa očekivanim moćima. Ukoliko je moć kombinacije antitela jednaka zbiru moći svakog pojedinačnog antitela prisutnog u kombinaciji, antitela imaju aditivni efekat. Ukoliko je moć kombinacije antitela veća, antitela imaju sinergistički efekat u neutralizaciji virusa besnila.

Alternativno, aditivni ili sinergistički efekti mogu se odrediti sledećim eksperimentom. Prvo se odredi jačina antitela koja treba testirati,npr.CR-57 i CR04-098, standardnim RFFIT (vidi: Laboratorv techniques in rabies, Edited by: F.-X Meslin, M.M. Kaplan and H. Koprowski (1996), 4th edition, Chapter 15, World Health Organization, Geneva). Zatim se antitela pomešaju u 1:1 odnosu na bazi IU/ml. Ova smeša antitela, zajedno sa pojedinačnim antitelima, u istoj koncentraciji, testira se u šest nezavisnih RFFIT eksperimenata kako bi se odredila završna tačka za 50%> neutralizaciju. Odmah zatim se određuje indeks kombinacije (CI) za smešu antitela, upotrebom formule CI = (Cl/Cxl) + (C2/Cx2) + (ClC2/CxlCx2) kako je opisao: Chouet al.(1984). Cl i C2 su količine (u: u.g) monoklonskog antitela 1 i monoklonskog antitela 2 koje dovode do 50% neutralizacije kada se koriste u kombinaciji, a Cxl i Cx2 su količine (u: ug) monoklonskog antitela 1 i monoklonskog antitela 2 koje dovode do 50% neutralizacije kada se koriste sama. CI = 1, ukazuje na aditivni efekat, CI < 1 ukazuje na sinergistički efekat, a CI > 1 ukazuje na antagonistički efekat monoklonskih antitela.

Primer 11

Identifikacija epitopa koje prepoznaju rekombinantna humana antitela protiv virusa

besnila pomoću PEPSCAN- ELISA

15-mer linearni i omčasti/ciklični peptidi su sintetisani iz ekstracelularnog domena G proteina virusa besnila soja ERA (vidi SEQ ID NO:207 za potpunu aminokiselinsku sekvencu glikoproteina G virusa besnila soja ERA, ekstracelularni domen se sastoji od aminokiselina 20-458; proteinski id glikoproteina virusa besnila soja ERA u EMBL-bazi podataka je J02293) i skrinirani upotrebom mini-PEPSCAN kartica formata kreditnih kartica (455 peptidnih formata/kartici) kako je prethodno opisano (Slootstraet al,1996; WO 93/09872). Svi peptidi su acetilovani na amino-terminusu. U svim omčastim peptidima pozicija-2 i pozicija-14 je zamenjena cisteinom (acetil-XCXXXXXXXXXXXCX-minicard). Ukoliko su u proizvedenom peptidu bili prisutni drugi cisteini osim cisteina na poziciji-2 i poziciji-14, ti drugi cisteini su zamenjeni alaninom. Omčasti peptidi su sintetisani upotrebom standardne Fmoc-hemije i uklonjena im je zaštita korišćenjem trifluoro kiseline sa čistačima. Zatim su peptidi kojima je uklonjena zaštita reagovali na karticama sa 0.5 mM rastvorom l,3-bis(bromometil)benzena u amonijum bikarbonatu (20 mM, pH 7.9/acetonitril (1:1 (v/v)). Kartice se pažljivo mućkaju u rastvoru u toku 30-60 minuta, pri čemu su potuno prekrivene rastvorom. Konačno, kartice se isperu intenzivno sa viškom H2O i ozvuče u puferu za razbijanje koji sadrži 1%> SDS/0.1% beta-merkaptoetanola u PBS (pH 7.2) na 70°C tokom 30 minuta, a zatim se ozvuče u H2O tokom narednih 45 minuta.

Humana monoklonska antitela su proizvedena kako je gore opisano. Vezivanje ovih antitela za svaki linearni i omčasti peptid je testirano PEPSCAN na bazi enzimimuno-sorbentnog testa (ELISA). Polipropilenske kartice formata kreditnih kartica sa 455 reakcionih mesta, koje sadrže kovalentno vezane peptide, inkubirane su sa antitelima (10 ug/ml; razblaženo u blokirajućem rastvoru, koji je sadržavao 5% konjskog seruma (v/v) i 5% ovalbumina (w/v)) (4°C, preko noći). Nakon ispiranja, peptidi su inkubirani sa peroksidazom protiv humanih antitela (razblaženje 1/1000) (1 sat, 25°C) i zatim, posle ispiranja, dodati su peroksidazni supstrat 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolin sulfonat (ABTS) i 2 ul/ml 3% H202. Kontrole (za linearne i omčaste) su inkubirane samo sa peroksidazom protiv humanih antitela. Posle 1 sata, izmereno je razvijanje boje. Razvijena boja u ELISA-i je izmerena sa CCD-kamerom i image-processing sistemom. Oprema se sastojala od CCD-kamere i 55 mm-skih sočiva (Sony CCD Video Camera XC-77RR, Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8 lens), adaptera kamere (Sony Camera adaptor DC-77RR) i Image Processing Software package Optimas, verzja 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.). Optimas radi na pentijum II kompjuterskom sistemu.

Humana monoklonska antitela protiv G proteina virusa besnila ispitana su na vezivanje za 15-mer linearne i omčaste/ciklične peptide koji su sintetisani kako je opisanosupra.Smatra se da se peptid relevantno vezuje za antitelo kada su OD vrednosti jednake ili veće dva puta od srednje OD-vrednosti svih peptida (po antitelu). Vidi Tabelu 14 za rezultate vezivanja humanih monoklonskih antitela nazvanih CR57, CRJB i CR04-010 za linearne peptide ekstracelularnog domena glikoproteina G virusa besnila soja ERA. Regioni koji pokazuju značajno vezivanje za pojedina antitela su označena sivim (vidi Tabelu 14).

Antitelo CR57 se vezuje za linearne peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu izdvojenu iz grupe, koja se sastoji od: SLKGACKLKLCGVLG (SEQ ID

NO:314), LKGACKLKLCGVLGL (SEQ ID NO:315), KGACKLKLCGVLGLR

(SEQ ID NO:316), GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO:317),

ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO:318), CKLKLCGVLGLRLMD (SEQ ID NO:319), KLKLCGVLGLRLMDG (SEQ ID NO:320), LKLCGVLGLRLMDGT

(SEQ ID NO:321) i KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO:322) (vidi Tabelu 14). Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO:317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO:318) imaju OD-vrednost koja je niža dva puta od srednje vrednosti. Ipak, ovi se peptidi zahtevaju, jer su veoma blizu regiona antigenosti peptida koje prepoznaje antitelo CR57. Vezivanje je najviše istaknuto prema peptidima sa aminokiselinskom sekvencom

KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO:322).

Antitelo CR04-010 se vezuje za linearne peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu izdvojenu iz grupe, koja se sastoji od: GFGKAYTIFNKTLME (SEQ ID NO:323), FGKAYTIFNKTLMEA (SEQ ID NO:324), GKAYTIFNKTLMEAD (SEQ ID NO:325), KAYTIFNKTLMEADA (SEQ ID NO:326), AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO:327), YTIFNKTLMEADAHY

(SEQ ID NO:328), TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO:329),

IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO:330) i FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID

NO:331). Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO:327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO:328) imaju OD-vrednost koja je niža dva puta od srednje vrednosti. Ipak, ovi se peptidi zahtevaju, jer su veoma blizu regiona antigenosti peptida koje prepoznaje antitelo CR04-010. Vezivanje je najviše istaknuto prema peptidima sa aminokiselinskom sekvencom: TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO:329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO:330) i

FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO:331).

CRJB i antitela nazvana: CR04-040, CR04-098 i CR04-103 (podaci nisu prikazani) nisu prepoznali region linearnih antigenskih peptida.

Svaki od prethodnih peptida ili njegovih delova predstavlja dobrog kandidata neutralizacije epitopa rabies virusa i može obrazovati bazu za vakcinu ili za izgradnju neutrališućih antitela za lečenje i/ili prevenciju infekcije virusom besnila.

SLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO:332) i

GFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO:333) su posebno zanimljivi regioni glikoproteina zbog svoje visoke reaktivnosti u PEPSCAN.

Iz gornjih PEPSCAN podataka može se dalje zaključiti da humana monoklonska antitela nazvana CR57 i CR04-010 vezuju različite regione G proteina virusa besnila, ukazujući time da prepoznaju ne-kompetitivne epitope.

Primer 12

Određivanje jačine neutralizacije IgGs protiv G proteina virusa besnila upotrebom

testa in vitro neutralizacije ( modifikovani RFFIT).

Moć neutralizacije za svako proizvedeno humano monoklonsko antitelo je određena modifikovanim RFFIT, kako je opisano u Primeru 1. Šesnaest IgGs neutrališu soj besnila CVS-11 sa jačinom većom od 1000 IU/mg, dok samo dva IgGs imaju jačinu manju od 2 IU/mg (vidi Tabelu 15). Osam od šesnaest antitela dovode do kratkotrajne proizvodnje CR-57 s obzirom na jačinu, sugerišući veću efikasnost u profilaksi po izlaganju virusu besnila od CR-57.Jačina prolazno proizvedenog CR-57 je otprilike 3800 IU/mg proteina (vidi Tabele 1 i 15), dok stabilno proizvedeni CR-57 ispoljava jačinu od 5400 IU/mg proteina (podaci nisu prikazani). Zanimljivo, glavnina identifikovanih neutrališućih humanih monoklonskih antitela sadrži varijabilni gen težak 3-30 germinativnih linija (vidi Tabelu 9).

Na osnovu afiniteta antitela za virus besnila (podaci nisu prikazani) i 100% endpoint razblaženja antitela u modifikovanom RFFIT testu (podaci nisu prikazani), za dalji razvoj je izabran panel od šest jedinstvenih IgGs,tj. :CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104 i CR04-144. U okviru ovog panela, antitelo CR04-098 je bilo posebno interesantno jer je pokazalo najveću jačinu,tj.otprilike 7300 IU/mg proteina (vidi Tabelu 15). Slična jačina je, isto tako, nađena za stabilno proizveden CR04-098 (podaci nisu prikazani).

Primer 13

In vitro neutralizacija E57" escape " virusa IgGs- imaprotiv virusa besnila

Da bi se dalje opisala nova humana monoklonska antitela protiv virusa besnila, testirana je neutrališuća aktivnost IgGs protiv E57 "escape" virusa modifikovanim RFFIT, kako je prethodno opisano. Glavnina IgGs protiv virusa besnila je imala dobru neutrališuću aktivnost prema šest E57 "escape" virusa (vidi Tabelu 16). Suprotno, CR04-008, CR04-018 i CR04-126 nisu neutralisali 6/6, 2/6 i 3/6 E57 "escape" virusa. To što nema neutralizacije znači da 50% završnih tačaka nije dostignuto razblaženjem antitela od 1:100. CR04-021, CR04-108, CR04-120, CR04-125 i CR04-164 ispoljilo je značajan pad neutrališuće aktivnosti prema brojnim "escape" virusima. Ovo sugeriše da je epitop ovih antitela bio napadnut bilo direktno bilo indirektno sa E57 "escape" virusnim glikoproteinom. U osnovi, gornjih nekoliko IgGs protiv virusa besnila mogu biti kompatibilni sa CR-57 u anti-rabies koktelu za profilaktičko lečenje po izlaganju. Posebno, panel od šest jedinstvenih IgGs, kako su prethodno definisani,tj.antitela: CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104 i CR04-144, ispoljava dobru neutrališuću moć prema E57 "escape" virusima, sugerišući da epitop(i) kojeg(e) prepoznaju ova antitela nema(ju) aminokiselinske mutacije koje indukuje CR-57. Antitelo CR04-098 najviše obećava jer ima jačinu veću od 3000 IU/mg za svaki od "escape" virusa.

Primer 14

Prepoznavanje epitopa anti- rabies antitela CR- 57 i CR04- 098

Da bi se potvrdilo da humana monoklonska antitela nazvana CR-57 i CR04-098 prepoznaju ne-preklapajuće, ne-kompetitivne epitope, generisani su "escape" virusi humanog monoklonskog antitela nazvanog CR04-098, suštinski kako je opisano za "escape" viruse CR57 (vidi Primer 1). Ukratko, broj fokusa po reakcionom mestu je izračunat imunofluorescencijom, a središta reakcionih mesta koja su sadržavala poželjno jedan fokus, izabrana su za amplifikaciju virusa. Svi E98 "escape" virusi su generisani iz 1 jedinog fokusa sa izuzetkom E98-2 (2 fokusa) i E98-4 (4 fokusa). Virus je definisan kao "escape" varijanta ukoliko je indeks neutralizacije bio <2.5 logs. Indeks neutralizacije je određen oduzimanjem broja infektivnih virusnih čestica/ml koje su proizvedene u kulturama BSR ćelija inficiranih virusom plus monoklonsko antitelo (~4 IU/ml) iz broja infektivnih virusnih čestica /ml proizvedenih u BSR ili MNA ćelijskim kulturama koje su inficirane samo sa samim virusom ([log "fokus forming units'Vml virusa u odsustvu monoklonskog antitela minus log ffu/ml virusa u prisustvu monoklonskog antitela]). Indeks koji je bio niži od 2.5 logs, smatranje dokazom bega ("escape").

Dalje se istraživalo da li CR04-098 vezuje različit ne-preklapajući, ne-kompetitivni epitop u poređenju sa CR-57, CR-57 je testiran prema E98 "escape" virusima u modifikovanom RFFIT testu, kako je opisano prethodno. Kako je prikazano u Tabeli 17, CR-57 je imalo dobru aktivnost neutralizacije prema svih pet E98 "escape" virusa. Dodatno, antitela CR04-010 i CR04-144 su ispitana na aktivnost neutralizacije E98 "escape" virusa. Oba antitela nisu neutralisala E98 "escape" viruse (podaci nisu prikazani) sugerišući daje epitop kog prepoznaju oba antitela ili direktno ili indirektno napadnut aminokiselinskom mutacijom indukovanom antitelom CR04-098. Antitela CR04-018 i CR04-126 su ispitana na aktivnost neutralisanja samo jednog od E98 "escape" virusa,tj.E98-4. CR04-018 je bilo u stanju da neutrališe "escape" virus, dok je CR04-126 imalo samo neznatnu moć neutralisanja prema "escape" virusu. Ovo sugeriše da epitop kojeg prepoznaje CR04-018 nije pod uticajem mutacije koju indukuje antitelo CR04-098. Osim toga, antitela: CR04-010, CR04-038, CR04-040, CR04-073, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-164 nisu neutralisala E98-4 sugerišući da su prepoznala isti epitop kao i CR04-098 (podaci nisu prikazani).

Da bi se odredile moguće mutacije u glikoproteinu besnila u svakom od E98 "escape" virusa, određena je nukleotidna sekvenca glikoproteinskog okvira otvorenog za čitanje (ORF), kako je opisano prethodno za E57 i EJB "escape" viruse. Svi E98 "escape" virusi su pokazivali mutaciju N u D na aminokiselinskoj poziciji 336 glikoproteina besnila (vidi Sliku 8). Ovaj region glikoproteina je definisan kao antigensko mesto III koje sadrži aminokiseline 330-338 (nabrojano bez signalnog peptida). Suprotno, CR-57 prepoznaje epitop lokalizovan na aminokiselinama 226-231 (nabrojano bez signalnog peptida), koji preklapa sa antigenskim mestom I. Sem N336D mutacije u E98 "escape" virusu nazvanom E98-5, prikazuje se i mutacija H u Q na aminokiselinskoj poziciji 354 (kodon se menja: CAT u CAG) glikoproteina besnila (podaci nisu prikazani).

Sem toga, pepscan analiza vezivanja CR57 za peptide koji poseduju mutiran CR57 epitop (kao stoje zapaženo kod E57 "escape" virusa) jeste pokazala da je interakcija CR57 bila uklonjena (podaci nisu prikazani). Očigledno, CR04-098 se još uvek mogao vezati za mutirani glikoprotein (koji je sadržavao N336D mutaciju) koji se ekspresuje na PER.C6® ćelijama, kako je izmereno protočnom citometrijom (podaci nisu prikazani), iako virusi koji su imali ovu mutaciju nisu više bili neutralisani.

Dalje, ispitivanja mapiranja epitopa i studije svrstavanja po afinitetu, izvedene su upotrebom analize površinske plazmon rezonance, korišćenjem BIAcore3000™ analitičkog sistema. Prečišćen rabies glikoprotein (ERA soj) je imobilisan kao ligand na senzornom čipu istraživačkog stepena CM5 4-protočnog kanala (Fc) (Biacore AB, Sweden) korišćenjem aminskog kuplovanja. Svrstavanje je izvedeno na 25°C, sa HBS-EP (Biacore AB, Sweden) kao puferom za izvođenje. 50 ul svakog antitela je injektovano pri stalnoj brzini protoka od 20 ul/min. Onda je primenjen pufer za izvođenje tokom 750 sekundi, kojeg sledi regeneracija CM5 čipa sa 5 ul 2M NaOH, 5 ul 45 mM HC1 i 5 ul 2 mM NaOH. Rezonantni signali, koji su izraženi kao jedinice rezonance (RU), stavljeni su u funkciju vremena i određeni su porast i pad RU, kao mere asocijacije, odnosno disocijacije i, korišćeni su za svrstavanje antitela. Aktuelne KD vrednosti za CR57 i CR04-098, kako su određene analizom površinske plazmon rezonance, bile su 2.4 nM, odnosno 4.5 nM. Ispitivanja mapiranja epitopa dalje potvrđuju da se CR57 i CR04-098 vezuju za različite epitope na rabies glikoproteinu. Injekcija CR57 dovodi do odgovora 58 RU (podaci nisu prikazani). Posle injekcije CR04-098 dobija se dodatni porast u nivou odgovora (24 RU), sugerišući da vezujuća mesta za CR04-098 nisu bila zauzeta (podaci nisu prikazani). Slični rezultati su zapaženi kada je primenjen reverzni redosled, pokazujući da je svako antitelo postiglo slične RU nivoe bez obzira na redosled injekcija (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati dalje pokazuju da se CR57 i CR04-098 mogu uzastopno vezati i prepoznati različite epitope na glikoproteinu virusa besnila.

Sve u svemu, prethodni podaci dalje potvrđuju da antitela CR-57 i CR04-098 prepoznaju zasebne ne-preklapajuće epitope,npr.epitopi na antigenskom položaju I, odnosno III. Podaci se dobro slažu sa podacima ELISA/FACS kompeticije, ukazujući da CR-57 i CR04-098 ne ulaze u kompeticiju za vezivanje sa ERA G i da antitelo CR04-098 ima dobru neutrališuću aktivnost za sve E57 "escape" viruse. Na osnovu ovih rezultata i činjenice dain vitroizlaganje virusa besnila kombinaciji CR57 i CR04-098 (izbor u prisustvu 4 IU/ml ma kog antitela) ne daje "escape" viruse (podaci nisu prikazani), zaključuje se da antitela CR-57 i CR04-098 prepoznaju ne-preklapajuće, ne-kompetitivne epitope i mogu korisno biti upotrebljena u koktelu anti-rabies virusnih antitela za profilaktičko lečenje posle izlaganja.

Primer 15

Procena konzervacije epitopa kojeg prepoznaju CR57 i CR04- 098

Minimalni vezujući region na CR-57 (aminokiseline KLCGVL u okviru SEQ ID NO:332, region glikoproteina virusa besnila kojeg prepoznaje CR57, kako je određeno putem PEPSCAN i tehnologije skeniranja alanina) naznačen je nukleotidnim sekvencama od 229 izolata virusa besnila genotipa 1 da bi se procenila konzervacija epitopa (vidi Tabelu 18). Set uzoraka je sadržavao humane izolate, izolate slepog miša i izolate iz pasa ili iz domaćih životinja koje su imale najveće izglede da ih ujedu besni psi. Frekvenciona analiza aminokiselina na svakoj poziciji u okviru minimalnog vezujućeg regiona otkriva da su kritični ostaci, koji su činili epitop, bili visoko konzervisani. Lizin na poziciji jedan je konzervisan u 99.6% izolata, dok je u samo 1/229 izolata primećena konzervativna K>R mutacija. Pozicije dva i tri (L i C) bile su u potpunosti konzervisane. Veruje se daje centralni cisteinski ostatak strukturno uključen u presavijanje glikoproteina i, konzervisan je kod svih lvssavirusa (vidi: Badrane and Tordo, 2001). Glicin na poziciji četiri je bio konzervisan u 98.7% izolata, dok su u 3/229 izolata zapažene mutacije u pravcu izmena aminokiselina (G>R u 1/229; G>E u 2/229). Peta pozicija je, isto tako, konzervisana sa izuzetkom jednog izolata u kome je zapažena konzervativna V>I mutacija. U šestoj poziciji, koja nije kritički ostatak, kako je određeno skeniranjem alaninske zamene, zapažena je značajna heterogenost u "street" izolatima: L u 70.7%, P u 26.7%, odnosno S u 2.6% ovih sojeva. Uzeto zajedno, otprilike 99 procenata virusa besnila koji se mogu sresti, mogu da se prepoznaju pomoću CR-57 antitela.

123 od ovih 229 virusnih izolata su analizirani na prisustvo mutacija i u CR-57 i u CR04-098 epitopu. Nijedan od ova 123 "street" virusa nije sadržavao mutacije u oba epitopa. N>D mutacija, kakva je primećena u E98 "escape" virusima, bila je prisutna u samo pet virusnih izolata. Ovi virusi su bili geografski udaljeni i izolovani su iz životinja iz Afrike (vidi Sliku 9 za filogenetsko drvo; pet virusnih izolata,npr.AF325483, AF325482, AF325481, AF325480 i AF325485, naznačeni su potamnjivanjem). Filogenetska analiza glikoproteinskih sekvenci otkriva da su virusi besnila sa mutiranim CR57 epitopima samo slabo povezani sa virusima besnila koji nose mutirani CR04-098 epitop. Prema tome, zaista ne postoji verovatnost nalaženja virusa besnila koji je rezistentan na neutralizaciju koktelom CR-57 i CR04-098.

Claims (5)

1. Postupak identifikovanja vezujućeg molekula koji potencijalno ima aktivnost neutralisanja virusa besnila ili molekula nukleinske kiseline koji kodira vezujući molekul, koji potencijalno ima aktivnost neutralisanja virusa besnila, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake: a) dovođenje u kontakt zbirke vezujućih molekula na površini genetskih pakovanja koja se mogu umnožavati sa virusom besnila u uslovima koji omogućavaju izvođenje vezivanja, pri čemu je zbirka vezujućih molekula proizvedena od izolovanih RNK ćelija dobijenih od ljudi koji su podvrgnuti vakcinaciji protiv besnila ili onih pojedinaca koji su bili izloženi virusu besnila. b) razdvajanje i povraćaj vezujućih molekula koji se vezuju za virus besnila od vezujućih molekula koji se ne vezuju za isti, c) izolovanje najmanje jednog povraćenog vezujućeg molekula, d) potvrđivanje da izolovani vezujući molekul ima neutrališuću aktivnost prema virusu besnila, i dalje obuhvata korak razdvajanja i povraćaja vezujućih molekula koje kodira varijabilna teška 3-30 genska semena linja.

2. Postupak, kao u patentnom zahtevu 1, pri čemu je virus besnila inaktivisan.

3. Postupak, kao u patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je sakupljanje vezujućih molekula na površini genetskih pakovanja koja se mogu umnožavati Fv biblioteka u vidu jednog lanca.

4. Postupak, kao u patentnom zahtevu 1, 2 ili 3, pri čemu je subjekt čovek, pojedinac koji je vakcinisan protiv besnila.

5. Postupak, kao u ma kom od patentnih zahteva 1-4, naznačentimešto se genetsko pakovanje koje se može umnožavati bira iz grupe koju čine: čestica faga, bakterija, kvasac, gljivica, spora mikroorganizma i ribozom.