RS54225B1 - Autohtoni lactobacillus sojevi i njihova upotreba kao probiotika - Google Patents

Abstract

Autohtoni probiotički Lactobacillus sojevi, izolovani iz oralnih briseva zdravih humanih subjekata, naznačeni time, što su okarakterisani i identifikovani kao Lactobacillus plantarum GAL-1 CBS 125647 i Lactobacillus casei GAL-2 CBS 125646. Prijava sadrži još 2 nezavisna i 7 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Oblasttehnike

Pronalazak pripada oblasti biotehnologije i odnosi se na biološki materijal, nove autohtone bakterije mlečne kiseline i njihovu upotrebu u tehnološkom postupku za dobijanje novih aktivnih i stabilnih probiotičkih proizvoda u formi praška i liofilizata, pogodnih za formulisanje oralnih probiotika.

Pronalazak prema MKP pripada klasi C 12 N.

Tehnički problem

Ovim pronalaskom se rešava problem proizvodnje probiotika na bazi smeše autohtonih sojeva mlečno-kiselinskih bakterija iz rodaLactobacillussa izraženom antimikrobnom aktivnošću, odabirom bitnih parametara procesa u svim fazama tehnološkog postupka od predfermentacije, fermentacije, preko izbora zaštitnog agensa i sušenja probiotičke smeše, u cilju očuvanja vijabilnosti i visokog sadržaja laktobacila, čime se obezbeđuje efikasan i ekonomičan tehnološki postupak.

Stanje tehnike

Najčešće korišćeni probiotički sojevi pokazuju širok spektar antimikrobne aktivnosti prema Gram-pozitivnim i Gram-negativnim patogenim bakterijama, posebno premaStaphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonellasp. iClostridium sporogenes(Al-Allafet ah,2009). Poznato je da se probiotički sojevi, posebno iz rodaLactobacillusiBifidobacterium,koriste kao starter kulture u prehrambenoj industriji i kao farmaceutski formulisani oblici za oralnu upotrebu. Humani izolati laktobacila, među njima i sojevi koji pripadaju vrstamaLb. plantarumiLb. casei,najčešće se koriste u praškastim probiotičkim preparatima i to posebno sojevi koji pripadaju vrstiLb. casei(Rybka and Kallasapathv, 1995; Betoret, 2003; Huli, 2004).

Pored izbora soja zahtevanih probiotičkih karakteristika, u postupku dobijanja kvalitetnog probiotika, neophodno je definisanje optimalnih tehnoloških parametara u svim fazama procesa. Za dobijanje vijabilnih laktobacila od značaja je tehnika kultivacije, izbor hranljivog medijuma, vremena i temperature kultivacije u fazama pripreme inokuluma i fermentacije. Tako je dodavanje Tvveen 80 ili kalcijuma (u obliku rastvorne soli kalcijuma) u fermentacioni medijum, pokazalo pozitivne efekte na preživljavanje bakterija za vreme zamrzavanja (Wright and Klaenhammer, 1983; Fonsecaet al,2001). Starost kulture, tj. faza rasta bakterija, temperatura inkubacije i pH fermentacione podloge su takođe važni parametri, koji utiču na preživljavanje bakterija u stresnim uslovima sušenja (Bealet al,1989; Palmfeldt and Hahn-Hagerdal, 2000; Peter and Reichart, 2001). Bakterije su u stacionarnoj fazi rasta manje osetljive nego u logaritamskoj fazi. Za zaštitu i očuvanje vijabilnosti laktobacila u toku sušenja, od izuzetnog je značaja izbor zaštitnog agensa/agenasa, koji sprečavaju dehidrataciju ćelija i štite ćelijske proteine. Najčešće su korišćeni proteini mleka, šećeri i polihidroksilni alkoholi, odnosno krioprotektanti koji ulaze i oni koji ne ulaze u ćeliju (Daemenet al,1982). Proces zaštite laktobacila je najveći pri korišćenju metoda sušenja zamrzavanjem (liofilizacije), sušenja u vrelom vazduhu (spray drving) i enkapsulacije ćelija u zaštitnom matriksu. Kritična tačka u procesu liofilizacije laktobacila uglavnom je stvaranje krupnih kristala, koji mogu oštetiti ćelijsku membranu i izazvati smrt ćelija (Karlsson and Toner, 1996). Liofilizacija jc proces koji dugo traje (36-48 sati), stoga nije ekonomičan za industrijsku primenu. Polazeći od osnovnih kritičnih tačaka u toku procesa sušenja laktobacila u struji vrelog vazduha, razvijen je postupak (Ananta 2005) dobijanja vijabilnih i stabilnih laktobacilaLb. rhamnosusGG (ATCC 53103). Pre sušenja, dobijena biomasa laktobacila je resuspenovana u 20%-tnom obranom mleku (Croweet al,1998). Proces sušenja se obavlja pri ulaznoj temperaturi 130°C i izlaznoj 80°C, protok 5ml/min, pri čemu je preživljavanje bilo<>>50%, a ukupan broj vijabilnih laktobacila 10<9>/g praha i vlažnost praha do 4%. Sa povećanjem čvrstog sadržaja preko 20% opada preživljavanje bakterija u toku sušenja. Teixeira i saradnici (1995) su poredili liofilizaciju i spray drying-sušenje, korišćenjem kultureLb. bulgaricus.Shah (1995) je potvrdio da je za industrijsku primenu proces spray drying - sušenja 6 puta ekonomičniji u odnosu na proces liofilizacije, što je pokazano sa sojevimaLb. salivariusiLb. paracasei.

Brojni su patenti u kojima se štite novi izolovani sojeviLactobacillus-^,koji se koriste kao probiotičke starter kulture u različitim prehrambenim proizvodima, kao i za medicinski tretman. U patentu US 4,314,995 autori su opisali primenu novih izolataLactobacillus,koji se koriste pojedinačno ili u smeši, u farmaceutskim preparatima (suvi prah, solucije i kreme) za tretman različitih infektivnih oboljenja. Pokazano je da su izabrani sojevi sposobni da rastu u siromašnoj hranjljivoj podlozi, da se brzo multipliciraju i da produkuju antibiotike koji ubijaju patogene bakterije, a posebno bakterije prisutne u intestinalnom traktu. Prikazana je antimikrobna aktivnost izolovanih laktobacila samo premaS. aureusiE. coli.Kultivacija bakterija u toku pripreme inokuluma, kao i u toku fermentacije je trajala po 72 sata, na temperaturi 37°C, zatim je biomasa odvojena centrifugiranjem uz hlađenje i osušena uz vakum. U patentu nisu dati ključni procesni parametri. Dug period kultivacije (6 dana) nije ekonomičan za industrijsku primenu.

U patentu US 4,806,368 predstavljena je primena liofiliziranih oblikaLb. acidofilusu kombinaciji sa bifido bakterijama, leukonostokom i propionskim bakterijama, u formi tableta. Veliki tehnološki problem, koji predstavlja slaba vijabilnostLb. acidofilusu dužem vremenskom periodu, kao i rapidna inaktivacija u stomaku pri pH 2-9, rešen je obogaćivanjem podloga za kultivaciju bakterija različitim ingredijentima (vitamini, minerali, dijatalna vlakna, L-cistin, lecitin), što znatno poskupljuje proces proizvodnje. Prikazani su zadovoljavajući efekti preživljavanja bakterija u finalnim preparatima samo nakon tri meseca, uz smanjenje broja vijabilnih bakterija za 1-1,5 logaritamskih jedinica.

U patentu US 5,474,932 opisana je primenaLb. plantarum299 (DSM 6595) iLb. casei ssp. rhamnosus271 (DSM 6594) u profilaksi bakterijskih infekcija, specijalno u formi fermentisane hranljive kompozicije. Nedostatak opisanog rešenja je postignuto slabo preživljavanje (80%) u prisustvu 0,1% žučne soli, a posebno u prisustvu 0,15 % žučnih soli (18%).

U patentu US 5,501,857 je predstavljena primena kompleksne kompozicije probiotičkih kultura, koja sadrži različite vrste laktobacila{ Lb. acidofilus, Lb. casei, Lb. lactis),streptokoka, bifido bakterija, propionskih bakterija, kvascaSaccharomyces ceravisaei gljiviceAspergillus oryzae,u liofiliziranim dijetetskim preparatima, obogaćenim različitim vitaminskim i mineralnim saplementima. Prikazano je preživljavanje liofiliziranih bakterija u enkapsuliranom obliku, u različitim vremenskim periodima čuvanja: nakon jedne nedelje -100 % ; nakon 4 meseca - 72%; nakon 6 meseci - 53%, dok je u kontrolnom uzorku nakon 32 dana preživljavanje svega 0,7%. U WIPO patentnoj aplikaciji WO 2003/00231 štiti se probiotički sojLb. fermentumME-3, kao novi antimikrobni i antioksidativni probiotik, koji se koristi za proizvodnju funkcionalne hrane ili za intestinalnu i urinarnu profilaksu, kao i u prevenciji i tretmanu hroničnih oboljenja uzrokovanih prolongiranim oksidativnim stresom.

U patentnoj prijaviWO 2005/123100autori su prikazali mogućnost primene bakterija mlečne kiseline, posebnoLb. acidofilusiLb. casei,pojedinačno i u smeši (najmanje 80%Lb. acidofilus 1najmanje5% Lb. casei;10 8 -10 10 CFU/ 98 g smeše), u prevenciji i tretmanu dijareja povezanih sa upotrebom različitih antibiotika, posebno tzv. "putničkih" dijareja, kao i dijareja izazvanih virusima ( najčešće rotavirusima) i parazitima. Prikazani farmaceutski oblici dijetetskih preparata su u formi kapsula, tableta, tečnih bakterijskih suspenzija i suvih ili vlažnih oralnih saplemenata. Doziranje kod prevencije ili tretmana dijareja je 98g /dan, najmanje 10 dana, dok je preporučena dnevna doza kod konstipacija, najmanje 14 dana.

U patentuEP 1005353je predstavljena primena sojaLb. casei rhamnosusLB21 (NCIMB 40564) u farmaceutskim preparatima u formi kapsula, tableta i suspenzija (10<6->10<10>CFU/ml) za prevenciju i tretman dijareja. Prikazani su statistički značajni antimikrobni efekti premaE. coli,

Clostridium difficileiHelicobacter pylori.

U patentnoj prijaviWO 2007/003917se opisuje sposobnost starter kulturaLb. plantarum pentosusda vrše acidifikaciju, odnosno snižavanje pH vrednosti u mesu i mesnim proizvodima, supresiju rasta neželjenih mikroorganizama u hrani, preživljavanje u GIT čoveka, pri čemu laktobacili vrše supresiju ili inhibiciju rasta patogenih mikroorganizamaBacillus cereus, S. typhimurium, Listeria monocitogenesiE. coli.U ovom pronalasku se štiti i farmaceutska formulacija, koja sadrži jedan ili više liofiliziranih sojevaLb. plantarum pentosus,sa nosačima ili ekscipiensima prihvatljivim u farmaceutskoj industriji. Za oralnu primenu u profilaktičke ili terapeutske svrhe preporučuje se doza od IO9 CFU/dan, posebno kod dijareja izazvanih rotavirusima. Logaritam redukcije broja vijabilnih bakterija nakon 4 sata izlaganja medijumu pH vrednosti 2,5 je 3-4 logaritamske jedinice, a nakon 2 sata 1-2 logaritamske jedinice. Antimikrobna aktivnost, merena zonom inhibicije rasta patogenih bakterija, najčešće je samo 1-2 mm.

U patentuEP 2000530autori su predstavili primenu smeše liofilizovanih sojevaZ&. fermentum57A,Lb. plantarum57B iLb. gasseri57C u farmaceutskim preparatima (IO<9>CFU/kapsuli) za obnavljanje prirodne bakterijske flore vagine i anusa. Prikazani rezultati testa rezistancije korišćenih pojedinačnih sojeva laktobacila na niskoj pH vrednosti želudačnog soka (pH 1,2), kao i želudačnog soka sa pepsinom (pH 2,5), ukazuje da je stepen redukcije broja vijabilnih laktobacila nakon 20 minuta do 2 logaritamske jedinice. Rezultati semikvantitativnog testa rezistancije korišćenih pojedinačnih sojeva laktobacila, u opsegu koncentracija žučnih soli 1-20 g/l (odnosno 0,1-2%), pokazuju da su sojeviLb. fermentum 57A, Lb. plantarum57B rezistentni na žučne soli, dok jeLb. gasseri57C osetljiv (nema preživljavanja sa 0,5% žučnih soli).

Opis pronalaska

Pronalazak se odnosi na nove autohtone bakterije mlečne kiseline, izolovane iz oralnih briseva zdravih humanih subjekata, identifikovanih i deponovanih u međunarodnoj kolekciji mikroorganizama a u skladu sa Budimpeštanskim sporazumom u CBS - Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal Biodiversitv Centre, Institute of the Royal Nederlands Academy of Arts and Science (KNAW), Utrecht, Nederlands, kao

Lactobacillus plantarumGAL-1 CBS 125647, datum deponovanja 03.12.2009.g. iLactobacillus caseiGAL-2 CBS 125646, datum deponovanja 22.01.2010.g. i njihove upotrebe u tehnološkom postupku dobijanja nove, aktivne probiotičke biomase i aktivnih probiotičkih formi, praška i liofilizata.

Prema definiciji FAO/WHO (2002) probiotici su živi mikroorganizmi, koji uneti u organizam u odgovarajućem broju, imaju koristan efekat na domaćina. Osnovni kriterijumi za selekciju probiotičkih sojeva za humanu upotrebu zahtevaju da su sojevi humanog porekla, da su identifikovani, stabilni, rezistentni na kiselu sredinu proksimalnog dela digestivnog trakta i na žučne soli u distalnom delu digestivnog trakta, adhezivni za površinu crevnog epitela, da produkuju antimikrobne supstance, kao što su organske kiseline, bakteriocini i vodonik peroksid (Morelli, 2000; Al-Allafet al.,2009), kao i da su vijabilni u dužem periodu (Ananta, 2005) i zdravstveno bezbedni (Ishibashi and Yamazaki, 2001; Reid, 2005; Anadonet al.,2006).

Ovim pronalaskom zadovoljeni su zahtevani kriterijumi u primeni bakterija u probiotičkim proizvodima, izvršena je selekcija i izbor probiotičkih sojeva dobijenih iz oralnih briseva zdravih humanih subjekata i rešeni problemi vezani za kvalitet i stabilnost probiotika za oralnu upotrebu. Takođe, razvijen je tehnološki postupak dobijanja nove aktivne probiotičke smeše, na proizvodnom nivou, ko-kultivacijom dva autohtona soja laktobacila, koji su identifikovani kaoLactobacillus plantarumiLactobacillus casei,deponovani u međunarodnoj kolekciji mikroorganizama( Lb. plantarumGAL-1 CBS 125647 iLb. caseiGAL-2 CBS 125646) i liofilizovani za duži rok čuvanja, što je neophodno za industrijske mikroorganizme.

Ovim pronalaskom se odabirom tehnoloških parametara u svim fazama procesa, posebno u fazi kultivacije laktobacila, izbora i pripreme zaštitnog medijuma, u fazi sušenjaspray dryingpostupkom ili postupkom liofilizacije, u cilju očuvanja vijabilnosti laktobacila, postiglo dobijanje zdravstveno bezbednih novih probiotičkih proizvoda u formi praška i liofilizata, pogodnih za formulisanje oralnih probiotika zahtevanog farmaceutskog kvaliteta, stabilnih u periodu čuvanja od 12 meseci.

Izolovanjelaktobacila sa briseva, uzetih sa oralne mukoze zdravih humanih subjekata, izvršeno je tako što je materijal sa brisa resuspendovan u PBS puferu pH vrednosti 7,0. Napravljena je serija decimalnih razblaženja, koja su zasejana na MRS Petri šolje. Izrasle pojedinačne kolonije su pokupljene ubodnom ezom i ponovo zasejavane na sveže MRS Petri šolje. Ovako prečišćene pojedinačne kolonije su bile polazne kulture za karakterizaciju bakterija. Od ukupno 20 izolata, 18 izolata su bile Gram pozitivne nehemolitične koke i 2 izolata Gram-pozitivni, katalaza negativni, nesporulativni, nehemolitični bacili, koji rastu na semiselektivnoj hranljivoj podlozi MRS agaru i MRS bujonu (DeManet al, 1960),u anaerobnim, mikroaerofilnim i slabije u aerobnim uslovima kultivacije. Odabrani laktobacili su poreklom iz uzoraka oralne mukoze zdrave odrasle osobe GAL-1 CBS 125647, i oralne mukoze zdravog deteta GAL-2 CBS 125646.

Morfološko-fiziološka i biohemijska karakterizacija odabranih izolata izvršena je primenom standardnih mikrobioloških testova prema Bergev's Manual of Svstematic Bacteriology (Kandler and Weiss, 1986; Hammes and Hertel, 2009) i urađena je identifikacija do nivoa roda. Ispitivanje fermentativnih osobina izabranih laktobacila izvršeno je primenom standardnog API CH 50 kita i API CHL medijuma. Ispitivana je sposobnost izolovanih laktobacila da fermentišu ugljene hidrate. Testovi su izvedeni prema proceduri proizvođača (BioMerieux, Marcy l'Etoile, France) u triplikatu. Fermentativne osobine izolovanih laktobacila prema rezultatima API 50 CHL testa su: SojLactobacillus plantarumGAL-1 CBS 125647 fermentiše: glicerol (GLY), L-arabinozu (DARA), ribozu (RIB), D-galaktozu (GAL), D-glukozu (GLU), D-fruktozu (FRU), D-manozu (MNE), D-manitol (MAN), D-sorbitol (SOR), metil-a-D-glukopiranozid (MDG), N-acetil glukozamin (NAG), amigdalin (AMY), arbutin (ARB), eskulin citrat (ESC), salicin (SAL), D-celiobiozu (CEL), D-maltozu (MAL), D-laktozu (LAC), D-milibiozu (MEL), D-saharozu (SAC), D-trehalozu (TRE), D-melezitozu (MEL), D-rafinozu (RAF), gentiobiozu (GEN), D-turanozu (TUR), D-arabitol (DARL) i kalij um glukonat (GNT).

SojLactobacillus caseiGAL-2 CBS 125646 fermentiše: ribozu (RIB), D-galaktozu (GAL), D-glukozu (GLU), D-fruktozu (FRU), D-manozu (MAL), D-manitol (MAN), D-sorbitol (SOR), N-acetil glukozamin (NAG), arbutin (ARB), eskulin citrat (ESC), salicin (SAL), D celiobiozu (CEL), D-maltozu (MAL), D-laktozu (LAC), D-melibiozu (MEL), D-saharozu (SAC), D-trehalozu (TRE), inulin (INU), D-melezitozu (MRL), D-rafinozu (RAF), gentiobiozu (GEN), D-turanozu (TUR), D-tagatozu (TAG) i kalijum glukonat (GNT).

Molekularno genetička identifikacijado nivoa vrste se odnosi na izolaciju ukupne DNK iz odabranih laktobacila (Hopwood, 1985), koja je korišćena kao matrica za rep-PCR analizu (Jovčicet al,2009). Identifikacija je urađena sekvenciranjem PCR produkata i analizom dobijenih sekvenci 16S rDNK. Prečišćeni PCR fragmenti su sekvencirani u MACROGEN INC., Seoul, Korea. Dobijene sekvence fragmenata su analizirane korišćenjem NCBI baze podataka, BLAST programom za pretraživanje homologih nukleotidnih sekvenci.

Na osnovu homologije DNK sekvenci izolat GAL-1 CBS 125647 je identifikovan kaoLactobacillus plantarum,a izolat GAL-2 CBS 125646 kaoLactobacillus casei.

Ispitivanje antimikrobne aktivnostije izvršeno primenom standardne difuzione metode u bunarčićima (Harriset al,1989). Prisustvo antimikrobnih supstanci je detektovano na osnovu pojave svetle zone oko bunarčića, koja se javlja kao posledica inhibicije rasta senzitivnog bakterijskog indikator soja.

Odabrani laktobacili pokazuju širok spektar antibakterijske aktivnosti na Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije, ali ne pokazuju antigljivičnu aktivnost premaCandida albicans.

Određivanje sadržaja mlečne kiseline,koja je kao antimikrobni agens indikator antibakterijske aktivnosti, rađeno je HPLC metodom (Huhet al,2006) sa Diodaarrav detektorom (Hewlett Packard, USA), na jonoizmenjivačkoj koloni tip H<+>(Supelco,USA). Sadržaj mlečne kiseline izračunat je na osnovu površine pika iz standardne prave za mlečnu kiselinu.

U definisanim uslovima kultivacije smeše bakterijaLactobacillusGAL-1 CBS 125647 i GAL-2 CBS 125646, produkuje se nakon 14-16 sati fermentacije 24-26 g/l mlečne kiseline, čime se obezbeđuje visoka antibakterijska aktivnost.

U cilju simulacije uslova gastrointestinalnog trakta čoveka kao što je niska pH želuca, prisustvo žučnih soli u crevima i vremena zadržavanja hrane u procesu varenja (2 sata), rađena suin vi troispitivanja, preživljavanje laktobacila u veštačkom želudačnom soku i u prisustvu žučnih soli.

Preživljavanje laktobacila u veštačkom želudačnom sokuje ispitano primenom standardnogin vitrotesta (Fernandezet al.,2003). Preživljavanje bakterija je određeno iz odnosa broja preživelih (logio) u odnosu na početni broj laktobacila.

Ukupan stepen redukcije (logioredukcije) vijabilnih bakterijaLb. plantarumGAL-1 CBS 125647 je 1,94, dok je kodLb. caseiGAL-2 CBS 125646 stepen redukcije 1,74.

Dobijeni rezultatiin vitroispitivanja osetljivosti primenjenih bakterija na veštački želudačni sok pokazuju da su odabrani laktobacili otporni na kiselu sredinu želuca

Preživljavanje laktobacila u prisustvu žučnih solije ispitano primenom standardnogin vitrotesta (Fernandezet al.,2003). Ukupan broj preživelih bakterija određen je iz odnosa broja preživelih bakterija u odnosu na početni broj unetih bakterija.

Nakon 120 minuta izlaganja bakterija 0.5%-tnom rastvoru žučnih soli (pH 7,4), logioredukcije je 0,45z& Lb. plantarumGAL-1 CBS 125647, a 0,22zaLb. caseiGAL-2 CBS 125646. Dobijeni rezultatiin vitroispitivanja osetljivosti primenjenih bakterija na žučne soli pokazuju da su odabrani laktobacili otporni na žučne soli.

U cilju ispitivanja zdravstvene bezbednosti, rađeni su testovi ispitivanja gastrointestinalne subakutne lokalne podnošljivosti i abnormalne toksičnosti.

Ispitivanja gastrointestinalne subakutne lokalne podnošljivostismeše odabranih laktobacilaLb. plantarumGAL-1 CBS 125647 iLb. caseiGAL-2 CBS 125646 su urađena primenom standardnein vivometode ispitivanja (Vogel and Vogel 1997). Za ispitivanja su korišćeni miševi (8) soja NMRI Ham, oba pola, koji su klinički zdravi. Miševi su hranjeni i pojeni u toku eksperimentaad libidum.Gastričnom sondom je svakom od eksperimentalnih miševa aplikovan ispitivaniuzorak per os,svakodnevno u toku šest dana, u koncentraciji od IO<7>CFU/0,5 ml. Kontrolnoj grupi miševa je aplikovano 0,5 ml fiziološkog rastvora. Svakodnevno su praćeni znaci eventualne toksičnosti i beležene su sve promene. Životinje su sedmog dana žrtvovane u etarskoj anesteziji. Želudac i duodenum su isprani vodom od sadržaja, nakon čega su posmatrani pod lupom, radi uočavanja eventualnih promena. Ispitana je mogućnost pojave znakova iritacije sluzokože gastrointestinalnog trakta (hiperemija, hemoragija, ulceracija). Dobijeni rezultatiin vivobiomedicinskih ispitivanja pokazuju da su ispitivani probiotički preparati sa smešom odabranih izolata laktobacila GAL-1 CBS 125647 i GAL-2 CBS 125646, gastrointestinalno podnošljivi u dozi koja odgovara 10<11>CFU/kg/dan za odraslog čoveka.

Ispitivanje abnormalne toksičnostismešeLb. plantarumGAL-1 CBS 125647 iLb. caseiGAL-2 CBS 125646 urađeno je primenom standardnogin vivotesta za ispitivanje neškodljivosti, odnosno abnormalne toksičnosti, prema instrukcijama i zahtevima Evropske farmakopeje (EP. 6, 2008).

Ovim testom ispitan je efekat jednokratne peroralne primene odabranih laktobacila GAL-1 CBS 125647 i GAL-2 CBS 125646 u dozi 10<7>CFU/0,5 ml, koja bi preračunato na telesnu masu čoveka od 70 kg, odgovarala dnevnoj primeni probiotika u dozi 10<U>CFU. Za ispitivanja su korišćeni beli laboratorijski miševi (5) soja NMRIHam,oba pola, koji su klinički zdravi. Miševi su hranjeni i pojeni u toku eksperimentaad libidum.Dobijeni rezultatiin vivobiomedicinskih ispitivanja pokazuju da korišćeni laktobacili GAL-1 CBS 125647 i GAL-2 CBS 125646, nisu škodljivi u dozi 1011 CFU/kg, što je 100 puta više od najčešće preporučene doze probiotika za dnevnu upotrebu (109CFU).

U okviru sprovedenihanalitičkih ispitivanjadefinisani su zahtevi specifikacija za aktivnu probiotičku biomasu, kao i probiotičke forme dobijene njenim sušenjem,Lactobacillus -prašak iLactobacillus- liofilizat: ukupan broj vijabilnih laktobacila, mikrobiološka čistoća proizvoda - odsustvo patogenih bakterija, sadržaj vlage. Izvršena ispitivanja kvaliteta potvrđuju da testirani uzorci biomase, praška i liofilizata, za po tri reproduktivne šarže, odgovaraju svim zahtevima specifikacija.

Razvojna studija stabilnostije rađena prema smernicama ICH regulative (na temperaturama od 5°C, 25°C i 30°C) na tri reproduktivne serije (prašak, liofilizat), u cilju ispitivanja kvaliteta, određivanja roka trajanja i uslova čuvanja ovih probiotičkih formi. Rezultati, nakon 1, 3, 6, 9 i 12 meseci, ukazuju da su dobijene stabilne probitičke forme praška i liofilizata sa visokim stepenom preživljavanja probiotičkih bakterija (>95%), odgovarajućim sadržajem vlage (<7%)

i zahtevanom mikrobiološkom čistoćom.

Pronalazak uključuje sledeće glavne faze tehnološkog procesa: predfermentacija, fermentacija, separacija biomase, homogenizacija u zaštitnom medijumu, sušenjeu Spray Dryer- uili liofilizacija i pakovanje.

Za kultivaciju odabranih laktobacila korišćena je podloga (MRS bujon, pH 6,40±0,20) i definisani su uslovi za pripremu inokuluma za fermentaciju (8 sati kultivacije u mikroaerofilnim uslovima na 37°C, kasna log. faza rasta bakterija), fermentaciju (temperatura: 36,0+1°C; početna pH vrednost 6,40±0,20; mešanje: 150 o/min; aeracija: 3 NI vazduha/min; vreme kultivacije: 14-16 sati), faznu kontrolu procesa fermentacije (pH vrednost, CFU/ml), separaciju (temperatura: 10°C, 3 000 o/min) i ispiranje vlažne biomase (u sterilnom fosfatnom puferu (PBS), pH 7,0).

Izvršena jeselekcija i izbor zaštitnih agenasaza očuvanje vijabilnosti laktobacila u procesu sušenja, na osnovu stepena preživljavanja bakterija u toku procesa i sadržaja vlage. U tu svrhu testirani su: 10%-tno sojino mleko, 2-20%-tno obrano mleko, 10%-tno obrano mleko sa 5%-glicerola, 10%-tno obrano mleko sa 2%-manitolom, 5%-tno obrano mleko sa 5%-trehaloze, 10%-tna saharoza sa 1% želatina. Najveći procenat preživljavanja laktobacila bio je u smeši 5%-tnog obranog mleka sa 5% trehaloze (98.8%), 10 % obranom mleku sa 2% manitola (98.8%) i 12%-tnom obranom mleku u prahu (veće od 98%). Na osnovu rezultata ispitivanja stabilnosti preparata u kontrolisanim uslovima, favorizovani zaštitni agens je 12%-tno obrano mleko u prahu.

Processušenjaje rešen kao postupak kratkotrajnog sušenja vijabilnih laktobacila u struji vrelog vazduha ili kao postupak primarnog i sekundarnog sušenja zamrzavanjem (liofilizacija), radi obezbeđenja dugotrajne stabilnosti laktobacila.

Postupaksušenjau Spray dryer- uje programiran i vodi se automatski prema zadatim parametrima (ulazna temperatura 115°C, izlazna temperatura 60±5°C, protok vazduha 600 l/min 1 protok suspenzije 10 ml/min). U toku procesa se prati trend promene izlazne temperature i održava promenom protoka suspenzije.

Postupakliofilizacije jeprogramiran i vodi se pri izabranim uslovima (temperatura: od -32°C do +25°C, vreme:0-42 sati,vakuum: 9 x IO"<2>mbar, brzina zamrzavanja: 0,5°C/min, debljina sloja: 0,75 cm). Preživljavanje smeše laktobacilaLb. caseiGAL-1 CBS 125647 iLb. plantarumGAL-2 CBS 125646 u oba postupka sušenja je veće od 98% i sadržaj vlage ispod 5% i obezbeđuje stabilnost proizvoda u dužem periodu čuvanja (12 meseci) i zahtevani kvalitet proizvoda (ukupan broj vijabilnih bakterija: >95%, sadržaj vlage: <7%, odsustvo patogenih bakterija). Za očuvanje ovako propisanog kvaliteta proizvoda definisano je primarno (polietilenske - PE kese) i sekundarno pakovanje proizvoda (PVC kantica sa silika gelom), kao i uslovi čuvanja (na suvom mestu, zaštićenom od svetlosti i vlage, na temperaturi do +5 °C).

Tehnološki postupak, koji je opisan ovim pronalaskom i kojim su dobijeni stabilni, aktivni probiotički proizvodi, razvijen je na laboratorijskom nivou, a zatim transferisan na polupogonski i proizvodni nivo. Primena pronalaska na proizvodnom nivou omogućava dobijanje stabilnih aktivnih probiotičkih proizvoda u formi praška i liofilizata, koji sadrže 100 puta više vijabilnih laktobacila (1011 CFU/g) od najčešće preporučene doze probiotika za dnevnu upotrebu (10<9>CFU), koji poseduju željene funkcionalne karakteristike, potvrđene u navedenimin- vitroiin- vivoispitivanjima.

Pronalazak je značajan i za proširenje palete probiotičkih proizvoda za različite ciljne grupe: zdrava populacija - preventivno, deo populacije sa narušenom crevnom mikroflorom, posebno posle dugotrajne upotrebe antibiotika, osobe koje imaju problem sa fermentacijom mlečnog šećera laktoze - "laktoza netolerantne" osobe, posebno zbog činjenice da sadrži autohtone probiotičke sojeve.

Pronalazak će dalje biti prikazan kroz primere izvođenja bez namere da se na njih ograniči.

Primer 1.Dobijanje aktivne probiotičke biomase

Podloga za kultivaciju bakterijaLactobacilluspriprema se tako što se odmeri 28 g praha podloge MRS bujona za pripremanje 1 1 podloge za inokulum, rastvori, podesi pH vrednost na 6,40±0,20, razlije u erlenmajere za sterilizaciju i steriliše.

Zaseje se po 150 ml MRS podloge liofiliziranim bakterijamaLactobacillusGAL-1 CBS 125647 i bakterijamaLactobacillusGAL-2 CBS 125646. Inkubira se 8 h, na 37°C, u mikroaerofilnim uslovima. Ukupan broj živih ćelija u pojedinačnim kulturama bakterijaLactobacillusGAL-1 CBS 125647 iLactobacillusGAL-2 CBS 125646 je u opsegu 1-9 x IO<9>CFU/ml (CFU/ml-Colonv Forming Units). Predfermentacione kulture bakterijaLactobacillusGAL-1 CBS 125647 iLactobacillusGAL-2 CBS 125646 (inokulum) se spoje.

U staklenu čašu od 5 1 sipa se 0,447 kg praha podloge MRS bujon (Torlak) i resuspenduje uz stalno mešanje u 2 1 česmenske vode. Suspenzija se prenese u fermentor u kome se nalazi 8 1 česmenske vode, koja se postepeno zagreva do 50°C. Dolije se čemenska voda do ukupne zapremine od 16 1. Koriguje se pH vrednost nesterilne podloge na 6,40±0,20 sa rastvorom 4N NaOH ili 4N HC1 i izvrši mešanje podloge u toku od 15 min. Podloga se steriliše na 121°C, u toku 20 minuta, a zatim ohladi na 36±1°C. Ako pH vrednost nakon sterilizacije opadne ispod 6,20 koriguje se sa 4N NaOH (do pH 6,40±0,20). Podloga u fermentoru se zaseje sa 300 ml inokuluma pri sledećim procesnim uslovima: režim temperature - 36,0+1°C; mešanje - 150 o/min; aeracija - 3 NI vazduha/min. Tokom procesa fermentacuje održava se režim temperature, mešanja i aeracije u zadatim vrednostima i prati se prirodan pad pH vrednosti dok ne dostigne vrednost 3,5. Trend pada pH vrednosti ispod 0,1 jedinica po satu ukazuje na završeteak procesa, ili ako dođe do porasta pH vrednosti, proces se prekida.

Fazna kontrola procesa fermentacije obuhvata merenja pH i CFU/ml (ukupan broj ćelijaLactobacillus-^po ml fermentacione kulture) na svaka 2 sata do 12-og sata fermentacije, a od 12-og sata na 1 sat u cilju održavanja zadatih parametara.

Na kraju procesa fermentacije je CFU/ml fermentacione kulture u opsegu 1-9 x IO<9>.

Sadržaj u fermentoru se ohladi na 22±2°C i izvrši separacija biomase centrifugiranjem fermentacione kulture na 10°C, pri 3 000 o/min. Vlažna biomasa se resuspenduje u sterilnom fosfatnom puferu, pH vrednost 7,0 (PBS 7,0), u aseptičnim uslovima. Potrebna zapremina sterilnog PBS 7,0 za ispiranje jednaka je 1/10 obrađene zapremine fermentacione kulture, odnosno 1,6 1.

Prinos vlažne biomase: 8.0±1,0 g/l (70+5 % vlage). Prinos suve biomase je 2,2+0,2 g./l.

Primer2. Pobijanje aktivne probiotičkeforme - Lactobacillusprašak

U 1,6 1 destilovane vode se doda 192 g obranog mleka (12%-tno), kao izabranog zaštitnog agensa, dotera se pH vrednost do 7,0 sa 4N NaOH, suspenzija profiltrira kroz sinter (B0 ili BI) i steriliše u autoklavu 20 minuta na 121°C. Isprana vlažna biomasa se snažno homogenizuje u 1,6 1 pripremljenog zaštitnog medij uma.

Proces sušenja je programiran i vodi se automatski naSpray Dryer- u,u trajanju od 3,5 sata, prema zadatim startnim parametrima: ulazna temperatura vazduha je 115°C; protok vazduha je 600 l/min; aspiracija je 100%; protok suspenzije je 30 % (10 ml/min).

U toku procesa prati se trend izlazne temperature i održava na 60±5°C, podešavanjem protoka suspenzije.

Ukupan prinos u procesu dobijanja probiotičkog preparataLactobacillus- praška je 165±10 g. Na kraju procesa sušenja CFU/g suvog praška je u opsegu 1-9 x 10<11>sa sadržajem vlage <5%. Preživljavanje smeše laktobacilaLb. caseiGAL-1 CBS 125647 iLb. plantarumGAL-2 CBS 125646 u procesu sušenja je veće od 98%.

Osušeni prah se pakuje u polietilenske (PE) kese (primarno pakovanje). PE kese se zapertlaju kopčom i pakuju u polivinil-hloridnu (PVC) kanticu (sekundarna ambalaža). U sekundarnoj ambalaži se nalazi absorber vlage silika gel (60g).

Proizvod se čuva na suvom mestu, zaštićenom od svetlosti i vlage, na temperaturi do 5°C.

Primer 3. Dobijanje aktivne probiotičkeforme - Lactobacillusliofilizat

Aktivna probiotička biomasa (dobijena prema primeru 1.) se homogenizuje u prethodno pripremljenom zaštitnom medijumu (prema primeru 2.).

Proces sušenja zamrzavanjem (primarno i sekundarno sušenje) je programiran i vodi se u liofilizatoru (Edvvards, model Lyoflex 04). Kapacitet uređaja iznosi 8 kg leda, uz mogućnost postizanja temperature u intervalu od +70°C do -50°C. Proces se vodi automatski u trajanju od 46 sati, prema zadatim startnim parametrima iz definisane krive liofilizacije, prethodno učitanih u memoriju računara (Tabela 3.)

Liofilizacija aktivne probiotičke biomase, homogenizovane u zaštitnom medijumu (12% obrano mleko), vrši se u 3 sloja (3x11), debljine 0,75 cm. Brzina procesa zamrzavanja je 0,5°C / min. U toku procesa zamrzavalja proizvod se nalazi u atmosferi inertnog gasa. Proces primarnog sušenja obavlja se pri vakuumu ne manjem od 9x10" mbar. Proces sekundarnog sušenja završava se na temperaturi +25°C.

Ukupan prinos u procesu dobijanja probiotičke formeLactobacillus -liofilizat je 320±10 g. Na kraju procesa liofilizacije dobija se 1-9x10" CFU/g suvog liofilizata sa sadržajem vlage <5%. Preživljavanje smeše laktobacilaLb. caseiGAL-1 CBS 125647 iLb. plantarumGAL-2 CBS 125646 u procesu liofilizacije je veće od 98%.

Claims (10)

1. Autohtoni probiotičkiLactobacillussojevi, izolovani iz oralnih briseva zdravih humanih subjekata, naznačeni time, što su okarakterisani i identifikovani kaoLactobacillus plantarumGAL-1 CBS 125647/Lactobacillus caseiGAL-2 CBS 125646.

2. Postupak za dobijanje probiotičke biomase, prema zahtevu 1., naznačen time, što kultivacija odabranihLactobacillussojeva u podlozi MRS bujon, pH 6,40 ± 0,20, podrazumeva predfermentaciju u trajanju od 8 sati u mikroaerofilnim uslovima na 37 °C, sa 1-9 x 10<9>CFU u kasnoj log. fazi rasta bakterija, fermentaciju, koja se izvodi postupkom ko-kultivacije smeše kultivisanih sojeva u mikroaerofilnim uslovima na temperaturi od 36,0 ±1 °C, pri početnoj pH vrednosti podloge 6,40 ± 0,20 uz mešanje 150 o/min i aeraciju 3 NI vazduha/min sa vremenom kultivacije 14-16 sati, separacija centrifugiranjem na temperaturi od 10 °C, pri 3000 o/min, a ispiranje vlažne biomase sterilnim fosfatnim puferom, pH 7,0.

3. Probiotička biomasa, prema zahtevu 2., naznačena time, što u fazi fermentacije, nakon 14-16 sati produkuje 24-26 g/l mlečne kiseline.

4. Probiotička biomasa, naznačena time, što je dobijena ko-kultivacijom bakterija, prema zahtevima 2. i 3., i koja sadrži ukupan broj živih ćelija od 1-9 x 10<9>CFU/ml fermentacione kulture.

5. Probiotičke formeLactobacillusprašak i liofilizat, naznačena time, stoje preživljavanje smeše laktobacila nakon procesa sušenja i liofilizacije veće od 98 %, i iznosi 1-9 x 10<11>CFU/g praška.

6. Probiotičke formeLactobacillusprašak i liofilizat, prema zahtevu 5., naznačene time, što se za očuvanje vijabilnosti laktobacila primenjuju zaštitni agensi odabrani iz grupe: 10 %-tno sojino mleko, 2-20 %-tno obrano mleko, 10 %-tno obrano mleko sa 5 % glicerola, 10 %-tno obrano mleko sa 2 % manitola, 5 %-tno obrano mleko sa 5 % trehaloze, 10 %-tna saharoza sa 1 % želatina.

7. Probiotičke formeLactobacillusprašak i liofilizat, prema zahtevima 5. i 6., naznačene time, što je zaštitni agens 12 % obrano mleko pri čemu je preživljavanje laktobacila veće od 98 %.

8. Probiotičke formeLactobacillusprašak i liofilizat, prema zahtevima 5.-7., naznačene time, što su prilikom čuvanja na suvom mestu, zaštićenom od svetlosti, vazduha i vlage, na temperaturi do +5 °C, stabilni 12 meseci pri čemu vijabilnost laktobacila iznosi više od 95 %.

9. Preparat koji sadrži probiotičke formeLactobacillusprašak i liofilizat, prema zahtevima 5.-8., naznačen time, što je pogodan za oralnu primenu.

10. Preparat prema zahtevima 5.-9., naznačena time, što se primenjuju kod zdrave populacije preventivno, kod populacije sa narušenom crevnom mikroflorom i osoba salaktoznom intolerancijom.