RS54776B1 - Fosforoamidatni derivati 5-fluoro-2'-dezoksiuridina za upotrebu u tretmanu kancera - Google Patents

Fosforoamidatni derivati 5-fluoro-2'-dezoksiuridina za upotrebu u tretmanu kancera

Info

Publication number
RS54776B1
RS54776B1 RS20160211A RSP20160211A RS54776B1 RS 54776 B1 RS54776 B1 RS 54776B1 RS 20160211 A RS20160211 A RS 20160211A RS P20160211 A RSP20160211 A RS P20160211A RS 54776 B1 RS54776 B1 RS 54776B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fluoro
deoxyuridine
phosphate
naphthyl
group
Prior art date
Application number
RS20160211A
Other languages
English (en)
Inventor
Christopher Mcguigan
Jan Balzarini
Magdalena Slusarcyzk
Blanka Gonczy
Paola Murziani
Original Assignee
Nucana Biomed Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45841523&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS54776(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB1103582.1A external-priority patent/GB201103582D0/en
Priority claimed from GBGB1105660.3A external-priority patent/GB201105660D0/en
Application filed by Nucana Biomed Ltd filed Critical Nucana Biomed Ltd
Publication of RS54776B1 publication Critical patent/RS54776B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/65515—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a five-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65586—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system at least one of the hetero rings does not contain nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6564—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6581—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and nitrogen atoms with or without oxygen or sulfur atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6584—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and nitrogen atoms with or without oxygen or sulfur atoms, as ring hetero atoms having one phosphorus atom as ring hetero atom
    • C07F9/65842—Cyclic amide derivatives of acids of phosphorus, in which one nitrogen atom belongs to the ring
    • C07F9/65844—Cyclic amide derivatives of acids of phosphorus, in which one nitrogen atom belongs to the ring the phosphorus atom being part of a five-membered ring which may be condensed with another ring system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Jedinjenje opšte formule (I):naznačeno time, štoAr označava fuzionisanu bicikličnu ili monocikličnu aril grupu, a bilo koja od navedenih aril grupa označava karbocikličnu ili heterocikličnu grupu i opciono je supstituisana; R3 označava alkil grupu koja je opciono supstituisana; R4 označava H ili alkoil grupu;R1 i R2 su nezavisno izabrani iz grupe koju čine H i alkil grupa ili R1 i R2zajedno obrazuju alkilenski lanac tako da obezbeđuju, zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani, cikličan sistem, ili pak jedan od R1 i R2 sadrži alkilen lanac vezan za N, pri čemu H atom vezan za N izostaje, a jedan od R1 i R2 sadrži H ili alkil grupu; bilo koja alkil grupa ili alkilen lanac može biti supstituisan;ili njihov farmaceutski prihvatljivi derivat, naznačen time, što navedeni farmaceutski prihvatljiv derivat označava bilo koju farmaceutski prihvatljivu so, hidrat, solvat ili kristalni oblik jedinjenja,naznačen time, što jedinjenje ne označava jedinjenje koje sadrži, u kombinaciji, Ar kao nesupstituisani fenil, R3 kao CH3, R4 kao H, a jedan od R1 i R2 kao H i jedan od R1 i R2 kao CH3.Prijava sadrži još 17 patentnih zahteva.

Description

Opis pronalaska
[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na hemijska jedinjenja korisna u tretmanu kancera.
[0002]Godine 1957. otkrivena je antitumorska aktivnost 5-fluorouracila (5-FU). lako je prošlo više od pedeset godina od kada je prvi put sintetisan, 5-FU je i dalje u širokoj upotrebi u tretmanu solidnih tumora uključujući kancere dojke, gastrointestinalnog sistema, glave, vrata i jajnika, a pre svega kolorektalnog karcinoma, što je odobreno i od strane Američke agencije za hranu i lekove (FDA) 1962. godine. Fluotopiiimidin 5-lluorouracil (5-FU) i 5-fluoro-2'-đezoksiuridin (5-FdUrd) se koriste u kombinaciji sa folnom kiselinom kao standardan vid tretmana različitih karcinoma poput karcinoma želuca, debelog creva i dojke. Štaviše, kombinacija 5-FU sa leukovorinom (LV) smatra se standardnom hemioterapijom kancera debelog creva. Uobičajeno je da se lek 5-FU primenjuje u vidu intravenskog bolusa ili kontinuirane infuzije.
[0003]Antitumorska aktivnost 5-FU se može upoređiti sa aktivnošću njegovog a naloga 5-FdUrd koji delimično predstavlja i prolek 5-FU. 5-FdUrd je odobren od strane FDA 1970. godine i intenzivno je upotrebljavan u kliničkim tretmanima karcinoma jajnika, dojke i gastrointestinalnog trakta. Pored toga, zbog značajne ekskrecije putem jetre, 5-FdUrd je koristan i kao lek za hemioterapiju hepatičkih arterija prilikom metastaza u jetri, a iz razloga što se efikasnije metabolišeujetri nego što je to slučaj sa 5-FU.
[0004]Međutim, problem predstavlja činjenica da aktivnost oba navedna agensa, 5-FU i 5-FdUrd, može biti umanjena usled razvoja rezistencije u tumorskim ćelijama. Pokazano je i da tretman kancera sa 5-FU dovodi do pojave neurotoksičnih i kardiotoksičnih neželjenih efekata. Toksičnost vodi dalje i nedostatku selektivnosti tumora na 5-FU.
[0005]Internacionalni patentni spis (WO) br,99/37753 prijavljuje jedinjenje 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'[fenil-(rnetoksi-L-alaninil)]-fosfat, a predmet pronalaska je rezistencija prilikom tretmana kancera. Internacionalni patentni spis WO 2005/012327 A2 prijavljuje specifične fosforamidate 5-bromovinil-2'-dezoksiuridina za upotrebu u tretmanu kancera.
[0006]Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi jedinjenja izvedena iz 5-fluoro-2'-dezoksiuridina koja ispoljavaju pojačanu aktivnost i/ili smanjenu toksičnost prilikom primene u tretmanu kancera u odnosu na akivnost samog 5-fluoracil ili 5-fluoro-2'-dezoksiuridina.
[0007]Dalji cilj predmetnog pronalaska je da se obezbede jedinjenja izvedena iz 5-fluorr>2'-dezoksiuridina koja dovode do rezistencije u tumorskim ćelijama u manjem stepenu, a pre svega do stepena rezistencije u tumorskim ćelijama koji je manja od onog koji je karakterističan za 5-FU ili 5-FdUrd. Prema predmetnom pronalasku, obezbeđeno je jedinjenje opšte formule (I):
naznačeno time, što
Ar označava fuzionisanu bicikličnu ili monocikličnu aril grupu, a bilo koja od navedenih grupa označava karbocikličnu ili heterociklićnu grupu i opciono je supstituisana;
R3 označava alkil grupu koja opciono može biti supstituisana;
Rioznačava H ili alkoil grupu; a
Ri i Rzsu nezavisno izabrani iz grupe koju čine H i alkil grupa ili R, i R? zajedno obrazuju alkilenski lanac tako da obezbeđuju, zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani, cikličan sistem, ili pak jedan od Rii R? sadrži alkilen lanac vezan za N, pri čemu H atom vezan za N izostaje, a jedan od R( i R?sadrži H ili alkil grupu; bilo koja alkil grupa ili alkilen lanac mogu biti supstituisani,
ili farmaceutski prihvatljivi derivat, naznačen time, što navedeni farmaceutski prihvatljiv derivat označava bilo koju farmaceutski prihvatljivu so, hidrat, solvat ili kristalni oblik jedinjenja,
naznačen time, što jedinjenje ne označava jedinjenje koje sadrži, u kombinaciji, Ar kao nesupstituisani fem'l, R3kao CH3, R4kao H, jedan od R, i R;kao H ijedan od Ri i R?kao CH3.
[0008]Utvrđeno je da jedinjenja predmetnog pronalaska ispoljavaju aktivnost koja ih čini korisnim u profilaksi ili tretmanu kancera kod ljudi( homo sapiens).Preciznije, jedinjenja predmetnog pronalaska ispoljavaju korisna svojstva koja ukazuju na njihovu sposobnost tretmana kancera kod pacijenata, ali u isto vreme i sposobnost smanjenja rezistencije u tumorskim ćelijama. Naime, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu ispoljiti aktivnost u ćelijama koja se može uporediti ili je bolja od aktivnosti koju ispoljava 5-fluoracil, dok je rezistentnost uporediva sa ili manja od rezistentnosti do koje dovode 5-fluoracil i 5-fluoro-2'-dezoksiuridin.
[0009]U tekstu predmetne prijave, termin "rezistencija" označava nizak ili smanjen odgovor na terapiju. Rezistencija može biti urođena ili stečena Urođena rezistencija pod razume va smanjen odgovor u odnosu na druge uzorke ili pacijente. Stečena rezistencija označava smanjenje efikasnosti tretmana tokom vremena kod datog pacijenta, bez obzira na to da li je ista stečena ili ne, odnosno tokom terapije koja podrazumeva primenu nekog tretmana zarad tretmana kancera, na primer, terapijskog protokola koji je podrazumeva primenu 5-FU i/ili 5-FdUrd. I urođena i stečena rezistencija mogu biti posledica smanjene ekspresije ili aktivnosti transporterskih proteina, uključujući proteine koji su transporteri nukteozida, ili smanjene ekspresije neophodnih anabolićkih enzima, ili pak povećanja ekpresije kataboličkih enzima.
[0010]lako namera podnosioca predmetne prijave nije bila da se ograniči bilo kojom teorijom, postavljena je hipoteza, kao što je to i diskutovano u tekstu koji sledi, da uzroci rezistencije na aktivnost 5-FU i/ili 5-FdUrd u tumorskim ćelijama mogu biti: a) delecija aktiviraju će kinaze poput timidin kinaze (TK), ključnog enzima neophodnog za početni korak fosforilacije 5-FdUrd u 5-FdUMP; b) prekomema sinteza timidilat sintaze (TS); i/ili c) nedovoljan transport molekula u ciljne ćelije.
[0011]Iznenađujuće, utvrđeno je da jedinjenja predmetnog pronalaska mogu ispoljiti značajnu citostatsku aktivnost u ćelijama sa smanjenom nivoom transporterskih proteina nukleozida i/ili kod ćelija deficijentnih u nukleozid kinazi i/ili u ćelijama inficiranim mikoplazmom.
[0012]Svojstvo jedinjenja predmetnog pronalaska koje predstavlja prednost jeste njegova sposobnost da zadrži značajnu citostatsku aktivnost u ćelijama deficijentnim u nukleozid kinazi, ain vivoto može biti od kliničkog značaja u ćelijskom okruženju u kome nukleozid kinaza nedostaje ili u kome je nivo nukleozid kinaze smanjen čime zapravo ne može doći do efikasne aktivacije 5-FdUrd.
[0013]Kod ćelija inficiranih mikoplazmom značano je smanjena aktivnost nukleozida poput 5-FdUrd zbog, kako se pretpostavlja, prekomerne produkcije timidilat sintaze (TS). Stoga, trenutno predložena upotreba jedinjenja predmetnog pronalaska u ćelijama inficiranim mikoplazmama, takođe se pretpostavlja, zasniva se na korisnim osobinama jedinjenja predmetnog pronalaska da deluju dodatno i kao inhibitori TS, omogućavajući tako da jedinjenja predmetnog pronalaska zadrže citostatsku aktivnost u ćelijama inficiranim mikoplazmom. Prolekovi koji sadrže jedinjenja predmetnog pronalaska, zbog svoje lipofilne prirode, mogu biti preuzeti od strane ciljnih ćelija barem delimično na način koji je nezavisan od traspomih nosača, a tako se mogu zaobići upravo mogući mehanizami rezistencije koji nastaju kao posledica smanjenja nivoa nukleozida ili nosača koji su transporteri nukleobaza u membranama ciljnih ćelija.
[0014]Pored toga, prolekovi koji sadrže jedinjenja predmetnog pronalaska iznenađujuće su neosetljivi na dejstvo kataboličkog enzima timidina fosforilaze (TP) koji je često prekomemo eksprimiran u tumorima. Na taj način, prolekovi su još manje zavisni od prisustva ovog kataboličkog enzima nego što je to slučaj sa 5-FdUrd.
[0015]Primećeno je da infekcija ćelija mikoplazmama može značajno smanjiti aktivnost nukleozida, uključujući 5-FdUrd. Primena TP inhibitora vraća citostatsku aktivnost 5-FdUrd u kulturama ćelija inficiranih mikoplazmom na kontrolni nivo, obe2beđujući time dokaz štetnog dejtva TP prilikom eventualne citostatske aktivnosti 5-FdUrd. Navedeno može predstavljati ograničenje prilikom primene kod pacijenata koji su inficirani mikoplazmama. Za razliku od 5-FdUrd, prolekovi 5-FdUrd predmetnog pronalaska mogu očuvati visoku aktivnost u ćelijama inficiranim mikoplazmama.
[0016]Jedinjenja predmetnog pronalaska dakle imaju potencijal da prevaziđu mnoga ograničenja 5-FU i 5-FdUrd.
[0017]5-Fluorouracil (5-FU) predstavlja jedan od prvih primera antikancerogenog leka. Dizajn 5-FU se zasnivao na dostupnim biohemijskim informacijama: atom ftuora i atom vodonika su slične veličine, međutim, veza ugljenik-fluor je znatno jača od veze ugljenik-vodontk. Timidilat sintaza deluje tako što katalizuje zamenu vodonika na poziciji 5 dezoksiuridin monofosfata sa metil grupom dobijenom iz metilen tetrahidrofolata, a da bi se sintetisao timidilat. 5-FU ispoljava svoje citotoksične efekte dejstvom na tri različita metabolička puta. Nukleobaza 5-FU i dezoksiribonukleozid 5-FdUrd ulaze u ćelije olakšano, putem nukleozidnih transportnih sistema. Jedan od mehanizama dejstva ovih agenasa je i inhibicija enzima timidilat sintaze (TS). Nukleobaza 5-FU se prevodi u dezoksinukleozid 5-fluoro-2'-dezoksiuridin (5-FdUrd) dejstvom timidin fosforilaze. Slede a fosforilacija dezoksinukleozid a 5-FdURd dejstvom timidin kinaze dovodi do obrazovanja citotoksičnog nukleotida 5-fluoro-2'-dezoks!uridin-5'-monofosfata (5-FdUMP). U prisustvu redukovanog folata, 5,10-metilen-tetrahidrofolata (mTHF), nukleotid (5-FdUMP) inhibira timidilat sintazu (TS) usled nemogućnosti enzima da ukloni atom fluora sa pozicije 5. Dakle, prvi i najvažniji mehanizam dejstva 5-FU i FdUrd predstavlja inhibicija enzima timidilat sintaze (TS). Timidilat sintaza (TS) ima afinitet za dva supstrata (dUMP i mTHF), pri čemu se oba vezuju za katalitičko mesto enzima čime je omogućena sinteza dTMP. 5-FdUMP formira dalje kovalentni temarni kompleks sa timidilat sintazom (TS), inhibirajući aktivnost ovog enzima i vodeći smanjenju količine dezoksitimidin trifosfata neophodnog za sintezu DNK. Alternativno, (5-FdUMP) se sintetiše nakon prevođenja 5 FU u 5-FUMP od strane OPRT, a potom do fluorouridin difosfata (FUDP), fluorodezoksiuridin difosfata (5-FdUDP) dejstvom ribonukleotid reduktaze (RR) i eventualno 5-FdUMP. Primećeno je da nakon izlaganja leka 5-FU ili 5-FdUrd, ćelije razvijaju rezistenciju na ove hemioterapijske agense. Prekomerna ekspresija timidilat sintaze (TS) umanjuje terapijski efekat leka koji predstavlja inhibitor TS što dalje vodi rezistenciji. Zapaženo je takođe da su neke individue rezistentnije na TS ciljanu terapiju u odnosu na druge. Drugo, dezoksinukleozid 5-fluoro-2'-dezoksiuridin (5-FdUrd) se može prevesti u svoj trifosfatni oblik 5-FdUTP koji se može ugraditit u DNK dovodeći do oštećenja ćelije. Treće, 5-FU takođe može inhibirati sintezu RNK svojom konverzijom u FUMP dejstvom OPRT, a potom, u dva koraka, može se prevesti i u fluorouridin trifosfat (FUTP) koji se može ugradili u RNK. Pretpostavlja se da navedeni mehanizam predstavlja drugi potencijalni mehanizam dejstva 5-FU.
[0018]Molekul 5-FU dakle ne predstavlja optimalan inhibitorni lek za TS obzirom da se neefikasno prevodi u 5-FdUMP, upravo zbog nekoliko neophodnih metaboličkih koraka potrebnih za metaboličku aktivaciju 5-FU. Do razvijanja dalje rezistencije može doći ukoliko ćelije proizvode prekomemu količinu dUMP koja bi bila u kompeticiji sa lekom u vezivanju za aktivno mesto enzima.
[0019]5-FdUrd predstavlja relativno dobar supstrat za timidin kinazu koja ga direktno prevodi u 5-FdUMP.In vitrostudije, u nekoliko ćelijskih linija kancera, su pokazale da je 5-FdURd oko 5000 puta potentniji kao inhibitor rasta ćelija od 5-FU. Dalje, prolek 5-FdURd ne karakteriše značajan stepen prevođenja u ribonukleotidne metabolite u citotoksičnim koncentracijama,In vivostudije su pokazale i da se značajna količina 5-FdUrd razlaže do svoje odgovarajuće baze 5-FU dejstvom timidin fosforilaze, enzima prema koma 5-FdUrd ispoljava veliki afinitet. Ovako brzo fosfolitičko cepanje 5-FdUrd u 5-FUin vitroiin vivopredstavlja veliku prepreku prilikom isporuke intaktnog 5-FdUrd u ćelije zarad poboljšanog citotoksičnog dejstva. Pored toga, razlaganje 5-FdUrd u intestinalnim homogenatima pacova i kod ljudi, nakon oralne primene, ukazuju da se 5-FdUrd uglavnom ne apsorbuje kao intaktan 5-FdUrd.
[0020]Prema daljem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku profilakse ili tretmana kancera kod ljudi( homo sapiens).U skladu sa tim, kancer je izabran iz grupe koju čine leukemija, kancer pankreasa, prostate, pluća, dojke i grlića materice,
[0021]Preciznije, jedinjenje predmetnog pronalaska je za upotrebu u postupku profilakse ili tretmana kancera kod pacijenta koji je razvio ili će razviti rezistenciju u tumorskim ćelijama na aktivnost 5-fluoro-2'-dezoksiuridina tokom profilakse ili tretmana tumora. Na primer, jedinjenje predmetnog pronalaska se može upotrebiti u postupku profilakse ili tretmana kancera kod pacijenta sa ćelijama koje imaju smanjen nivo transporterskih proteina nukleozida i/ili ćelijama deficijentnim u nukleozid kinazi i/ili ćelijama inficiranim mikoplazmama, pre svega kada je kancer tipa leukemije. Jedinjenje predmetnog pronalaska može umesto toga ili isto tako biti za upotrebu u postupku profilakse ili tretmana kancera kod pacijenta čije ćelije sadrže povišen nivo timidilat sintaze (TS).
[0022]U kontekstu pronalaska, termin "tumor" ili "tumorska ćelija", ukoliko nije drugačije naznačeno, se odnosi I na solidne tumore i na kancere poput leukemije.
[0023]Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti za tretman pacijenta sa kancerom bilo samostalno bilo u kombinaciji sa drugom terapijom za kancer. Na primer, jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u terapijskom režimu tretmana kancera u kombinaciji sa drugim antitumorskim lekovima, kao što su to 5-FU i/ili 5-FdUrd, sa ili bez leukovorina (LV), i/ili pak sa drugim antitumorskim lekovima. Alternativno, jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti kada pacijent ne odgovara dobro na terapiju drugim antitumorskim lekovima, kao što su na primer 5-FU i/ili 5-FdUrd sa ili bez leukovorina (LV), ili pak kada pacijent ispoljava rezistentnost na druge antitumorske lekove poput 5-FU i/ili 5-FdUrd sa ili bez leukovorina (LV).
[0024]Jedinjenja predmetnog pronalaska u kojima Ar označava 1-naftil grupu, bilo da je ona supstituisana ili nesupstituisana, naročito su pogodna za upotrebu u primenama koje su prethodno navedene, kao i postupcima predmetnog pronalaska, pre svega kod pacijenta koji je razvio ili koji ima potencijal da razvije rezistenciju u tumorskim ćelijama, kao što je, na primer, pacijent sa ćelijama koje imaju snižen nivo transporterskih proteina nukleozida i/ili sa ćelijama deficijentnim u kinazi i/ili sa ćelijama inficiranim mikoplazmama i/ili pak pacijent čije tumorske ćelijama imaju povišen nivo timidilat sintaze (TS).
[0025]Prema daljem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je farmaceutski preparat koji sadrži jedinjenje predmetnog pronalaska u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, diluentom ili ekscipijensom.
[0026]Prema siedećem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak pripreme farmaceutskog preparata koji podrazumeva korak kombinovanja jedinjenja predmetnog pronalaska sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, nosačem ili diluentom.
[0027] Prema drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je proces pripreme jedinjenja predmetnog pronalaska koji obuhvata reakciju jedinjenja opšte formule (II) sa jedinjenjem opšte formule (III)
naznačenim time, što su Ar, R3, FL, R, i R2kao što je to opisano u prethodnom tekstu i u Patentnom zahtevu 1.
[0028] Grupa Ar sadrži supstituisanu ili nesupstituisanu aril grupu, pri čemu je "aril grupa", kao i moguća supstitucija navedene grupe, kao što je to definisano u tekstu. Naime, Ar označava aromatični prsten sa od 5 do 14 članova. Prioritetno, Ar označava karbocikličnu grupu. Alternativno, jedan ili dva prstena mogu sadržavati 1, 2, 3 ili 4 heteroatoma, prioritetno 1, nezavisno izabrana iz grupe koju čine O. S i N. Prioritetno, Ar označava fuzionisani karbociklićni aril ostatak. Još prioritetnije, Ar označava naftil grupu, a još prioritetnije 1-naftil odnosno naftil grupu vezanu za P atom preko atoma O koji je na 1-naftil položaju. Pogodno je i da Ar alternativno označava fenil grupu.
[0029] Jedan, dva, tri ili četiri supstituenata, koji mogu biti isti ili različiti, mogu biti prisutna u Ar, a izabrani su iz grupe koju čine atom halogenog elementa, što mogu biti -F, -Cl, -Br ili -J; -NO?; -NH2; opciono supstituisana -C^alkil; opciono supstituisana -Ci-3alkoksi, prvenstveno metoksi grupa (-OCH3); opciono supstituisana -SCi-3alkil; -CN; opciono supstituisana -COCi3alkil; i opciono supstituisana -COjCi.3alkil grupa; pri čemu navedene opciono supstituisane grupe mogu biti supstituisane sa jednom ili više, do šest, grupa, a prioritetno sa tri, pri čemu supstituenti mogu nezavisno biti izabrani iz grupe koju čine halogeni elementi koji mogu biti F, Cl, Br i J, kao i N02. Naročito prioritetni supstituenti u Ar označavaju grupe koje privlače elektrone kao što su to radikali halogenih elemenata (prioritetno htora ili fluora), trihalometil (prioritetno trifiuorometil), cijano i nitro grupa.
[0030] Supstituenti mogu biti u bilo kom položaju na Ar - aril ostatku. Kada Ar označava 1-naftil grupu, prioritetnim se smatra jedan supstituent na bilo kojoj poziciji, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8. Kada Ar označava fenil grupu, prioritetnim se smatra jedan supstituent na poziciji 2( orto)Ili 4( para), aprioritetnijim na poziciji 4. Na primer, kada Ar označava supstituisanu fenil grupu, Ar može biti 3,5-dihloro-fenil, g-trifluorometil-fenil, n-cijano-fenil ili g-nitro-fenil grupa.
[0031] U skladu sa navedenim, Raoznačava C) )Eprimarnu, sekundarnu ili tercijarnu alkil grupu i može sadržavati karbociklične ostatke; C5.r cikličnu alkil grupu; ili Ci.6alkilC61iaril grupu. Još prioritetnije, R3 označava C,.10alkil grupu ili Cn.3alkilC5.7ari! grupu poput benzil grupe (-CH2-C6H5). Ciklična alkil grupa može biti karbociklićna grupa ili može sadržavati, ukupno, jedan, dva ili tri heteroatoma u prstenu nezavisno odabrana iz grupe koju čine O, N i S. Prioritetno R3označava nesupstituisanu grupu. Kada je supstitucija prisutna, supstituenti mogu biti kao što je to definisano u tekstu koji sledi.
[0032] U skladu sa navedenim, R4označava H ili alkoil odnosno alkil-C(=0)- grupu, naznačenu time, što alkil označava od C,do C,oalkil grupu.
[0033] Kada Rti/ili R?označavaju alkil grupu, svaka od njih nezavisno je izabrana na odgovarajući način iz grupe koju čine od C, do C16, još prioritetnije od Cido C6alkil grupe. Kada Rii Rs zajedno čine alkitenski lanac, pogodno je da lanac bude sa od CidoCB a može da sadrži nezasićenu vezu ili pak, ukupno, jedan, dva ili tri heteroatoma u lancu, nezavisno izabrana iz grupe koju čine O, N i S Kada je jedan od R, i R?vezan za N, pogodno je da ukupna veličine prstena, uključujući N i C atom za koji su R, i R2 vezani, bude sa od 4 do 7 članova, najpogodnije 5 članova. Bilo koji alkil ili alkilen lanac koji sadrži Rt i/ili R2 može biti supstituisan sa jednim ili sa više supstituenata koji su navedeni u tekstu.
[0034]Kada Rii R2označavaju različite grupe, C atom za koji su vezani predstavlja hiralni molekul. Prioritetno, stereohemija u asimetričnom centru -CR5R2odgovara sterohemiji L-aminokiseline. Stereohemija u asimetričnom centru -CRiR2, međutim, može odgovarati i sterohemiji D-aminokiseline. Alternativno, mogu se koristiti smeše jedinjenja sa asimetričnim centrima koji odgovaraju i L- i D-aminokiselinama.
[0035]U skladu sa navedenim. Rti R2mogu označavati grupe vezane za alfa atom ugljenika u prirodnim aminokiselinama. Termin "prirodna alfa aminokiselina" označava alanin, arginin, asparagin, asparaginsku kiselinu, cistein, cistin, glicin, glutaminsku kiselinu, glutamin, histidin, hidroksilizin, hidroksiprolin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin. Jedan od Rii R2tako može označavati H i jedan od Rii R3 može biti H ili alkil grupa, izabrana iz grupe koju čine radikali koji slede ili Rii R2 zajedno mogu obrazovati alkilenski lanac izabran iz grupe koju čine ostaci koji slede:
CH3- kao što je ostatak prisutan u alaninu
H2NC(=NH)NH[CH2jrkao što je ostatak prisutan argininu
NH2C(0)CH2- kao što je ostatak prisutan asparaginu
H02CH2- kao što je ostatak prisutan asparaginskoj kiselini
HSCH2- kao što je ostatak prisutan cisteinu
H02CH(NH2)CH2SSCH2- kao što je ostatak prisutan čistinu
H- kao što je ostatak prisutan glicinu
HOjCH2CH;- kao što je ostatak prisutan glutaminskoj kiselini
H2N(0)CCH?CH;- kao što je ostatak prisutan glutaminu
C3N2HCH2- kao što je ostatak prisutan histidinu
H2NCH2CH(OH}CH2CH2- kao što je ostatak prisutan hidroksilizinu
-CH2CH(OH)CH2- kao što je ostatak prisutan hidroksiprolinu
CH3CH2CH(CH3)- kao što je ostatak prisutan izoleucinu
(CH3)2CHCH2- kao što je ostatak prisutan leucinu
HjNCH?(CH2)rkao što je ostatak prisutan lizinu
CH3SCH2CH2- kao što je ostatak prisutan metioninu
PhCHr kao što je ostatak prisutan fenilalaninu
-C H2C H 2C H2- kaoštojeostatakprisutanprolinu
OHCH2- kao što je ostatak prisutan serinu
CH3CH(OH)- kao što je ostatak prisutan treoninu
CbNHsCH;- kao što je ostatak prisutan triptofanu
HOC6H4CH2- kao što je ostatak prisutan tirozinu
(CH3)2CH- kao što je ostatak prisutan valinu.
[0036]U specifikaciji predmetnog pronalaska, upućivanje na alkil grupu označava prav ili razgranat, cikličan ili acikličan, zasićen ili nezasićen {npr alkenil ili alkinil) ugljovodonični radikal. Kada označava cikličnu grupu, alkilen grupa prioritetno označava alkilen grupe sa od C3do Ci2, prioritetnije sa od Csdo Ci0, a još prioritetnije sa od C5 do C7. Kada označava acikličnu grupu, alkil grupa je prioritetno alkil grupa sa od Ctdo C16, a prioritetnije sa od C, do C5.
[0037]U specifikaciji predmetnog pronalaska, upućivanje na aril grupu označava aromatičnu grupu koja sadrži, u skladu sa navedenim, 5 do 14 atoma u prstenu. Na primer, Ar označava fenil ili naftil grupu. Aromatična grupa može označavati heteroaromatičnu grupu koja sadrži jedan, dva, tri ili četiri, a prioritetno jedan heteroatom nezavisno izabran iz grupe koju čine O, N i S. Primeri ovakvih heteroarom a ličnih grupa su piridil, pirolil, furanil i tiofenil grupa.
[0038]Alkil i aril grupe mogu biti supstituisane ili nesupstituisane. Kada su supstituisane, u pricipu će biti prisutan jedan do trt supstituenta, a prioritetno jedan supstituent. Supstituenti mogu označavati atome halogena, pod čime se podrazumevaju atomi F, Cl, Br i J, kao i halometil grupe kao što su to CF3 i CCI3 grupa; grupe koje sadrže kiseonik poput okso, hidroksi, karboksi, karboksiCi.i6alkil, alkoksi, alkoil, alkoiloksi, ariloksi, ariloil i ariloiloksi grupe; grupe koje sadrže azot poput amino, C^alkilamino, diCi.6alkilamino, cijano, azidne i nitro grupe; grupe koje sadrže sumpor poput tiolne, CieCalkiltiolne, sulfonilne i sulfoksidne grupe; het ero ciklične grupe koje same po sebi biti supstituisane; alkil grupe kao što je to definisano prethodno, koje same po sebi mogu biti supstituisane; i aril grupe kao što je to definisano prethodno, koje same po sebi mogu biti supstituisane, poput fenil i supstituisane fenil grupe. Supstituenti navedenih heterocikličnih, alkil i aril grupa označavaju grupe koje su upravo definisane. Supstituenti u Ri i/ili R?označavaju radikale koji obezbeđuju jedinjenja u kojima Rii R2odgovaraju ostacima vezanim za alfa atom ugljenika u prirodnim alfa aminokiselinama.
[0039]U specifikaciji predmetnog pronalaska, upućivanje na alkoksi i ariloksi grupe označava, lim redom, alkil-O- (na primer, alkil označava alkil grupu sa od Ctdo Ci6, prioritetno sa od Cido C$) i aril-O- grupu (na primer, aril označava radikal mono ili difuzionisanog aromatičnog prstena sa od 5 do 14 članova koji opciono sadrži 1, 2, 3 ili 4 heteroatoma nezavisno izabrana iz grupe koju čine O, S i N, a prioritetno aril označava fenil).
[0040]U specifikaciji predmetnog pronalaska, upućivanje na alkoil i ariloil grupe označava, tim redom, alktl-CO- (na primer, alkil označava alkil grupu sa od Cido Ci5, prioritetno sa od CidoCe)i aril-CO- (na primer, aril označava radikal mono ili bifuzionisanog aromatičnog prstena sa od 5 do 14 članova koji opciono sadrži 1.2. 3 ili 4 heteroatoma nezavisno izabrana iz grupe koju čine O, S i N, a prioritetno aril označava fenil).
[0041]U specifikaciji predmetnog pronalaska, upućivanje na alkoiloksi i ariloiloksi grupu označava, tim redom, alkil-CO-O (na primer, alkil označava alkil grupu sa od d do C,6, prioritetno sa od Ci do C6) i aril-CO-O (na primer, aril označava radikal mono ili difuzionisanog aromatičnog prstena sa od 5 do 14 članova koji opciono sadrži 1,2, 3 ili 4 heteroatoma nezavisno izabrana iz grupe koju čine O, S i N, a prioritetno aril označava fenil).
[0042]U specifikaciji predmetnog pronalaska, upućivanje na heterociklične grupe označava grupe koje sadrže jednu ili više grupa izabranu iz grupe koj čine pirolil, imidazolil, piraziolil, tiazolil, izotiazolil, oksazolil, pirolidinil, pirolinil, imidazolidinil, imidazolinil, pirazolidinil, tetrahidrofuranil, piranil, pironil, piridil, pirazinil, piridazinil, piperidil, piperazinil, morfolinil, tionaftil, benzofuranil, izobenzofuril, indolil, oksiindolil, izoindolil, indazolil, indolinil, 7-azaindolil, izoindazolil, benzopiranil, kumarinil, izokumarinil, hinolil, izohinolil, naftidinil, kinolinil, hinazolinil, piridopiridil, benzoksazinil, hinoksadinil, hromenil, hromanil, izohromanil i karbolinil grupa.
[0043]U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, Ar označava odgovarajuću naftil, pre svega 1-naftil grupu odnosno naftil grupu vezanu za P atom preko atoma O koji se nalazi na 1-naftil položaju.
[0044]U drugom primeru primene predmetnog pronalaska, Ar označava odgovarajuću fenil grupu.
[0045]U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, Ar je supstituisan. Pogodni supstituenti su navedeni u tekstu.
[0046] Ujednom primeru primene predmetnog pronalaska, Ar označava nesupstituisanu 1-naftil grupu.
[0047]U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, Ar označava nesupstituisanu fenil grupu.
[0048]U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, R„ je izabrano iz grupe koju čine H i acetil (CH3C(=0)-), a priortietno R4označava H.
[0049]U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, R3je izabrano iz grupe koju čine benzil grupa i članovi grupe od Cido Cioalkila, a prioritetno je R3izabran iz grupe koju čine n-propil, n-butil, n-pentil i n-heksil grupa. Još prioritetnije R3označava n-pentil grupu.
[0050]U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, R, i R2 odgovaraju ostacima vezanim za alfa atom ugljenika u prirodnim alfa aminokiselinama, kao što je to i navedeno u tekstu. Posebno pogodna prirodna alfa aminokiselina je L-alanin, a u skladu sa time, pogodno je da jedan od R, i R2označava H, jedan od R, i R? označava CH3, a da je C atom za koji su oni vezani u L hiralnom obliku. U drugim primerima primene, R, i R2 odgovaraju ostacima vezanim za alfa atom ugljenika u alfa aminokiselinama koje se ne javljaju u prirodi, na primer i Rii R2označavaju odgovarajuću CH3grupu.
[0051]Specifične karakteristike navedene u prethodno navedenim primerima primene prijavljene su detaljno jer se u jedinjenjima predmetnog pronalaska mogu kombinovati zajedno sa bilo kojom ili pak sa svim kombinacijama.
[0052]Prioritetno pogodna jedinjenja predmetnog pronalaska predstavljaju jedinjenja u kojima Ar označava 1-naftil, R3označava benzil grupu, jedan od Ri i R?označava H, jedan od Rti R2označava metil grupu, a C atom za koji su Rii R2vezani se nalazi u L-hiralnom obliku, kao i jedinjenja u kojima Ar označava 1-naftil, R3n-pentil grupu, jedan od Ri i R2označava H, jedan od Ri i R2označava metil grupu, a C atom za koji su R, i R?vezani se nalazi u L-hiralnom obliku. Za svako jedinjenje, R4 prioritetno označava H.
[0053]Konvencionalne terapije kancera upotrebom nemioferapeutika uglavnom se zasnivaju na korišćenju nukleozidnih analoga. Ovi molekuli su dizajnirani tako da imitiraju prirodne pirimidinske i purinske nukleozide. Nakon preuzimanja od strane ćelije, oni su fosforilišu dejstvom ćelijskih enzima kao što su to (dezoksi)citidin kinaza (dCK). timidin kinaza (TK) i/ili nukleo(z)/(t)idna kinaza. Ovi a n ti meta boli ti dalje mogu da ometajuđe novosintezu DNK/RNK prekursora i eventualno uopšte sintezu DNK/RNK, a rezultat toga je njihova citotoksična/citostatska aktivnost (Hatse i saradnici. 1999; Galmarini i saradnici, 2002).
[0054]Antimetaboliti zasnovani na fluoropirimidinu poput fluorouracila (5-FU), kapecitabina i 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (5-FdUrd) uglavnom se koriste u tretmanu karcinoma kolona, dojke i jajnika (de Bruin i saradnici, 2006; lshikawa i saradnici, 1998, VValko i saradnici, 2005). Unutar ćelije, ovi lekovi se metabolišu do 5-FdUMP, koji dalje formira stabilan inhibitorni kompleks sa timidilat sintazom (TS), kao i redukovanim ko-supstratom 5,10-metilenletrathidrofolatom, čime se blokira vezivanje uobičajenog supstrata dUMP za enzim (Beck i saradnici, 1994; Tanaka i saradnici, 2000; Longlev i saradnici, 2003). TS predstavlja enzim odgovoran za prevođenje dUMP u TMP i stoga neophodan za proliferaciju ćelija, što ga čini zanimljivim ciljnim molekulom u dizajnu lekova. Među fluoropirimidtnima koji su prethodno navedeni, 5-FdUrd zahteva samo jednu metaboličku konverziju, fosforilaciju katalizovanu sa TK, a da bi se sintetisao 5-FdUMP (Longlev i saradnici, 2003). Ova obavezna fosforilacija često predstavlja ograničavajući korak u metabolizmu mnogih antitumorskih lekova (uključujući 5-FdUrd), i stoga je i dalje jedan od ograničavajućih faktora terapijske upotrebe nukleozidnih analoga. To je i razlog opsežnih ispitivanja različitih strategija za poboljšanje antitumorske efikasnosti nukleozidnih analoga (Galmarini i saradnici. 2002).
[0055]Naelektrisanje koje karakteriše nukleozid monofosfate u fiziološkim uslovima razlog je lošeg, ako upošte, prolaska ovih molekula kroz ćelijske membrane (Metiellou i saradnici, 2009). Zbog loga, direktna primena fosforilisanih molekula, a da bi se zaobišao prvi korak fosforilacije, predstavlja jedan od vidova terapijske strategije za poboljšanje efikasnosti ovih molekula prilikom njihove primene. Istraživane su stoga različite strategije za prevaziiaženje navedenog ograničavajućeg koraka fosforilacije upotrebom raznih vrsta nukleozidnih 5'-monofosfatnih prolekova zarad njihove efikasnije isporuke u ćelije (Hecker i Erion, 2008). Primena lipofilnih fosforoamidat nukleotidnih prolekova (ProTides) pokazala se uspešnom za nekoliko molekula sa antiviralnom/tumorskom aktivnošću (Harris i saradnici, 2001; Congiatu i saradnici, 2006; McGuigan i saradnici, 2010). Maskiranjem naelektrisanja fosfatne grupe može se postići dobra pasivna difuzija prolekova kroz membrane što omogućava da se prolek unutar ćelije enzimskim cepanjem brzo prevede u nukleozid monofosfat (Mehellou i saradnici, 2009).
[0056] Mikoplazme predstavljaju najmanje sa more pliku ju će organizme na zemlji i karakteriše ih nedostatak ćelijskog zida i značajno manji genom (600-1,200 kb) u odnosu na druge žive organizme. Mnoge od ovih bakterija imaju parazitski način života i žive u ljudskom telu uzrokujući nesimptomatske infekcije (Ražin i saradnici, 1998). Pokazano je da ovi prokarioti imaju tendenciju da preferencija I no kolonizuju tkivo tumora: Huang i saradnici (2001) navode da je 39.7-56% kancera želuca, debelog creva, jednjaka, pluća i dojke kod ljudi zaraženo mikoplazmama, dok je taj procenat 20.9-30% u netumorskim tkivima. Pehlivan i saradnici (2005) su utvrdili da je više od 80% uzoraka tkiva bubrega kod bolesnika sa karcinomom bubrega bilo zaraženo mikoplazmama, dok je u kontronim uzorcima taj procenat iznosio 14%. Chan i saradnici (1996) su prijavili stopu infekcije od 59% u tkivu kancera jajnika, a druge studije su takođe prijavile visoku stopu infekcije mikoplamama u tkivu želuca (Sasaki i saradnici, 1995; Yang i saradnici, 2010) i kondiloma grlića materice (Kidder i saradnici, 1998). Zbog njihovog smanjenog seta gena, mikoplazmama nedostaju enzimi uključeni u putće novosinteze pirimidina i purina i zbog toga je kod njih eksprimiran veliki broj enzma uključenih u metabolički put spašavanja (eng,salvage)nukleo(z)/(t)ida, kao što su to timidin fosforilaza (TP), dezoksicitidinska deaminaze itd (Razina, 1978; Charron i Langelier, 1981; Neale i saradnici, 1983; Tham i saradnici, 1993). Već 1985. godine je primećeno da enzimi koje kodiraju mikolazme (npr. TP), prisutni u kontaminiranim kulturama ćelija, dovode do smanjene ugradnje dTTP u limfocitima (Sinigaglia i Talmadge, 1985). Nedavno je pokazano i da ovi enzimi, pre svega timidin fosforilaza kodirana od strane mikoplazmi,in vitroometaju citostatsku aktivnost nekoliko hemioterapeutika, uključujući 5-trifluorotimidin (Bronckaers i saradnici, 2008; Jette i saradnici, 2008; Liekens i saradnici, 2009). Stoga je postavljenja hipoteza da uklanjanje mikloplazmi antibioticima ili supresija enzima kodiranih od strane mikoplazmi u tkivu tumora, kod ljudi može dovesti do optimizacije tretmana pacijenata sa karcinomom upotrebom purinskih i pirimidinskih a n ti meta bo lita (Liekens i saradnici, 2009).
[0057]Predmetni pronalazak je nastao kao rezultat razvoja i ispitivanja TK-nezavisnih fosforoamidatnih prolekova 5-FdUrd i obezbeđuje jedinjenja koja takođe mogu biti neosetljiva na TP-zavisnu inaktivaciju njegovih slobodnih nukleozidih analoga. Jedinjenja predmetnog pronalaska stoga mogu obezbediti prolekove nukleozidnih analoga neosetljive na mikoplazme što može doprineti optimizaciji tretmana kancera kod pacijenata upotrebom pirimidinskih antimetabolita. Od svih trenutno sintetisanih fosforoamidatnih prolekova 5-FdUrd, CPF-373 (u daljem tekstu i prethodno označen kao posebno pogodno jedinjenja pronalaska u komeR„označava H) je izabran za dalje, detaljnije studije. Ovaj molekul sadrži naftil i benzilalaninil grupu koje maskiraju naelektrisanje 5'-fosfata u 5-FdUMP.
[0058]Opisani su razni mehanizmi rezistencije tumorskih ćelija na Ruoropirimidine poput 5-FU, 5-FdUrd i trifluoortimidina (TFT), uključujući smanjenje aktivnosti ključnih enzima za aktivaciju leka (npr TK i orotat fosforiboziltransferaze), povećanje aktivnosti enzima koji lek inaktiviraju (tj timidin fosforilaze) i/ili povećanje ekspresije ciljnih enzima (npr TS) (Agarwal i saradnici, 1999; Murakami i saradnici, 2000; Kosaka i saradnici, 2004). Takođe, prijavljeno je da, u nekoliko tipova tkiva kancera, utvrđeni visoki nivoi TP predstavljaju prediktivni faktor odnosno da visok nivo TP označava lošiji faktor prognoze nakon tretmana fluoropirimidinima (Kamoshida i saradnici, 2005; Ciaparrone i saradnici, 2006; Koopman i saradnici, 2009), mada druge studije nisu potvrdili ovakve nalaze (Ciccolini i saradnici, 2004; Koopman i saradnici, 2009). Predmetni pronalazak proizilazi iz razvoja proleka za 5-FdUrd kada je kao cilj bilo postavljeno da se zaobiđu mogući mehanizmi rezistencije i podložnost degradaciji anaboti kim enzimima prisutnim u mikrookruženju tumora.
[0059]Jedinjenja implementirana predmetnim pronalaskom, na primer CPF-373, predstavljaju fosforoamidatne prolekove 5-FdUrd, a opisani su u tekstu prijave i mogu ispuniti navedene ciljeve. Nakon preuzimanja u ćelije tumora, CPF-373. na primer, generiše 5-FdUMP unutar ćelije dejstvom enzima. Studije stabilnosti i enzimske/serumske studije upotrebom 31P NMR tehnologije otkrile su da je prolek CPF-373, na primer, potpuno stabilan u kiselim i baznim uslovima, ali i da podležu hidrolizi u prisustvu seruma ili karboksipeptidase Y što dovodi do formiranja nukleozid 5'-fosforoamidatnih derivata. Dok TK predstavlja ključni enzim u aktivaciji 5-FdUrd, utvrđeno je da CPF-373, na primer, mnogo manje zavisi od TK da bi ispoljio svoje citostatsko dejsvo i u mišjim (L1210) i humanim (CEM) ćelijskim kulturama. Zbog lipofilne prirode ProTide jedinjenja, ovi molekuli mogu isporučiti nukleozid-monofosfate direktno u intaktne tumorske ćelije nakon prevođenja u njihove nukleozid fosforoamidatne derivate dejstvom enzima poput karboksiesteraza ili karboksipeptidaza (npr karboksipeptidazeY), eliminišući time potrebu za inicijalnom fosforilacijom dejstvom specifičnih nukleozid kinaza poput TK. Stoga, CPF-373, na primer, može biti adekvatno sredstvo za tretman ćelija tumora sa modifikovanom TK aktivnošću (bilo da je ona stečena ili nasledna). Takođe, imajući u vidu da je TK ekspresija zavisna od S-faze ćelijskog ciklusa, očekuje se da CPF-373. na primer, može efikasno isporučiti 5-FdUMP u tumorske ćelije koje nisu u S-fazi njihovog ciklusa replikacije. Studije aktivnosti TS su pokazale da je CPF-373, na primer, bio u stanju da inhibira TS u normalnim i TK-deficijentnim tumorskim ćelijskim linijama, ponovo ukazujući na efikasnu unutarćelijsku isporuku 5-monofosfata 5-FdUrd, kao i na njegovu praktičnu nezavisnost od metaboličke aktivacije ćelijske TK.
[0060]Jedinjenja predmetnog pronalaska poput CPF-373 verovatno neće biti inaktivirana dejstvom kataboličkih enzima koji su uključeni u metabolizam nukleozida. Zaista, dok je 5-FdUrd veoma osetljiv na enzimsku hidrolizu dejstvom TP što dovodi do obrazovanja 5-FU i 2-dezoksiriboza-1-fosfata, njegov prolek, na primer CPF-373, ne predstavlja supstrat za prokariotsku (npr izE. coli)ili sisarsku {npr iz humanih eritrocita) TP. Takođe, uridin fosforilaza ne prepoznaje, na primer CPF-373, kao supstrat, dok 5-FdUrd (slabo, ali merljivo) podleže hidrolizi ovim enzimom. Nekoliko studija je pokazalo da mnoge tumorske ćelije imaju povišene nivoe TP koji takođe može delovati i kao angiogeni faktor (Koopman i saradnici, 2009; Bronckaers i saradnici, 2009). Osim toga, postoji nekoliko studija u kojima je prijavljena preferencijalna kolonizacija tkiva tumora mikoplazmama (Sasaki i saradnici, 1995: Chan i saradnici, 1996; Huang i saradnici, 2001; Pehlivan i saradnici, 2005) što ometa citostatsku aktivnost nekoliko konvencionalnih hemoterapeutikain vitrodejstvom TP kodirane od strane tumora (Bronckaers i saradnici, 2008; Jette i saradnici. 2008; Liekens i saradnici, 2009). Navedena zapažanja da 5-FdUrd, ali ne, na primer, CPF-373, značajno gubi citostatsku aktivnost kada su tumorske ćelije inficirane (TP-eksprimirajućim) mikoplazmama, u potpunosti je u skladu sa ovim zapažanjima. Dakle, pokazano je da je davanje antitumorskog proleka neosetljivog na TP kao što je CPF-373, hemijski stabilno pri ekstremnim uslovima pH, kao i da može dalje poboljšati hemioterapiju kancera. U zaključku, ProTide jedinjenja, kao što je CPF-373, obezbeđuju zanimljiv nov pristup razvoju otpornijih antitumorskih lekova. Na primer, CPF-373 može imati najmanje nekoliko prednosti u odnosu na svoj matični lek 5-FdUrd: ispoljava citostatsku aktivnosti nezavisnu od TK i rezistentan je na metaboličku razgradnju dejstvom TP, enzima koji je često povišeno eksprimiran u tumorima ili pak može biti eksprimiran van ćelija od strane mikoplazmi koje inficiraju tkivo tumora.
[0061]Jedinjenje opšte formule I ili farmaceutski preparati predmetnog pronalaska se mogu primenjivati pacijentu (čoveku) na bilo koji pogodan način primene poznat u tehnici.
[0062]Medikamenti upotrebljeni u predmetnom pronalasaku mogu se primenjivati oralno ili parenteralno, uključujući tu inlravensku. intramuskularnu, intraperitonealnu, subkutanu, transdermalnu, inhalatornu (u vidu aerosola), rektalnu, vaginalnu i topikalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu) primenu.
[0063]Za oralnu primenu, jedinjenja predmetnog pronalaska će u principu biti obezbeđena u vidu tableta ili kapsula, prašaka ili granula, ili pak kao vodeni rastvor ili suspenzija.
[0064]Tablete za oralnu upotrebu mogu sadržavati aktivni sastojak pomešan sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima kao što su to inertni diluenti, agensi za razlaganje, sredstva za vezivanje, sredstva za podmazivanje, zaslađivači, agensi za ukus, boju i konzervansi. Pogodne inertne razblaživače predstavljaju natrijum i kalcijum karbonat, natrijum i kalcijum fosfat i laktoza, dok kukuruzni škrob i alginska kiselina predstavljaju pogodne agense za razlaganje Agensi za povezivanje mogu biti škrob i želatin, dok agens za podmazivanje, ukoliko je prisutan, u principu može biti magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Ukoliko je to poželjno, tablete mogu biti obložene materijalima poput gliceril monostearata ili gliceril distearata, a radi odlaganja apsorpcije u gastrointestinalnom traktu.
[0065]Kapsule za oralnu upotrebu podrazumevaju tvrde želatinske kapsule u kojima je aktivni sastojak pomešan sa čvrstim diluentom. kao i meke želatinske kapsule u kojima je aktivni sastojak pomešan sa vodom ili uljem poput ulja kikirikija, tečnog parafina ili maslinovog ulja.
[0066]Formulacije za rektalnu primenu mogu biti u formi supozitorija sa pogodnim nosačem koji sadrži na primer kakao puter ili salicilat.
[0067]Formulacije pogodne za vaginalnu primenu mogu biti u vidu uloška, tampona, krema, gela, paste, pene ili spreja, a koji, pored aktivnog sastojka, sadrže i nosač koji je u tehnici dobro poznat kao odgovarajući.
[0068]Za intramuskularnu, intraperitonealnu, subkutanu i intravensku primenu, jedinjenja predmetnog pronalaska će u principu biti obezbeđena u vidu sterilnih vodenih rastvora ili suspenzija, puferisanih tako da pH bude odgovarajući i izotoničan. Pogodni vodeni nosači su Ringerov rastvor i izotonični natrijum hlorid. Vodene suspenzije prema predmetnom pronalasku mogu sadržavati sredstva za resuspendovanje poput derivata celuloze, natrijum alginata, potivinil-pirolidona i tragakant gume, kao i agens za vlaženje poput lecitina. Pogodni konzervansi za vodene suspenzije su etil i n-propil p-hidroksibenzoat.
[0069]Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti i u vidu lipozomskih formulacija.
[0070]U principu, pogodna doza za primenu je u opsegu od 0,1 do 300 mg po kilogramu telesne težine primaoca na dan. Prioritetna niža doza iznosi 0,5 mg po kilogramu telesne težine primaoca dnevno, p rio rite ntnija niža doza je 6 mg po kilogramu telesne težine primaoca na dan, a još prioritetnija niža doza iznosi 10 mg po kilogramu telesne težine primaoca dnevno. Pogodna doza prioritetno je u opsegu od 6 do 150 mg po kilogramu telesne težine dnevno, a najprioritetnije u opsegu od 15 do 100 mg po kilogramu telesne težine dnevno. Željena doza prioritetno je podeljena u dve, tri, četiri, pet ili šest ili više doznih jedinica koje se primenjuju u odgovarajućim intervalima tokom dana. Navedene dozne jedinice se mogu davati u doznim oblicima koji, na primer, sadrže od 10 do 1500 mg; prioritetno 20 do 1000 mg; a najprioritetnije 50 do 700 mg aktivnog sastojka po jediničnom doznom obliku.
[0071]Primeri predmetnog pronalaska će dalje biti opisani tekstom koji sledi, kroz primere, i pozivajući se na priložene crteže date u vidu Slika od 1 do 11, naznačenih time, što: Slika 1 prikazuje strukturnu formulu 5-FdUrd i njenog fosforoamidatnog proleka CPF-373; Slika 2 prikazuje efekal timidin fosforilaze i uridin fosforilaze na dThd, Urd, 5-FdUrd i CPF-373, pri čemu navedeni podaci označavaju srednju vrednost dobijenu iz najmanje 2 nezavisna eksperimenta (± S.D.); Slika 3 prikazuje inhibiciju TS sa 5-FdUrd i CPF-373, merenu oslobađanjem tricijuma iz [5-<3>H]dUrđ (paneli A i B) i [5-<3>H]dCyd (paneli C i D) u L1210/0 ćelijskim kulturama, kao i oslobađanjem tricijuma iz [5-<3>H]dCyd (paneli E i F) u L1210/TK ćelijskim kulturama, pri čemu navedeni podaci označavaju srednju vrednost dobijenu iz najmanje 2 nezavisna eksperimenta (± S.E.M.);
Slika 4 prikazuje predložen moguć mehanizam aktivacije 5-FdUrd ProTide jedinjenja;
Slika 5 pokazuje stepen cepanja proleka CPF-373 posredovanog karboksipeptidazom, praćen primenom<31>P NMR-a;
Slika 6 je prikaz<31>P NMR spektra jedinjenja CPF-373 u serumu;
Slika 7 je prikaz<31>P NMR spektra jedinjenja CPF-373 u puferu ćiji je pH = 1;
Slika 8 je prikaz 31P NMR spektra jedinjenja CPF-373 u puferu čiji je pH = 8;
Slika 9 prikazuje spektre nukleozida i odgovarajuće baze praćene<19>F NMR-om: a) 5-FdUrd podvrgnut fosforilaznom testu (A); b) 5-FdUrd i baza 5-FU u uslovima eseja u kome je enzim izostavljen (TP) (B);
Slika 10 prikazuje spektre nukleozida i baza u kalijum fosfatnom puferu (205 nM) praćene "F NMR-om: a) 5-FdUrd podvrgnut fosforilaznom testu (A); b) Rezultat nakon dodavanja enzima (TP) (B); i
Slika 11 prikazuje spektre proleka CPF373 u fosforilaznom testu: a) prolek CPF373 u uslovima eseja kada je enzim (TP) odsutan (A); b) prolek CPF373 podvrgnut dejstvu timidin fosforilaze (TP)(B).
Sinteza jedinjenja
[0072]Kao što je prikazano na Slici 1 i Šemama od 1 do 3 koje su date u tekstu koji sledi, jedinjenja predmetnog pronalaska su, kao što je ilustrovano jedinjenjem CPF-373 (1), sintetisana upotrebom fosforohloridatne hernije, a kao što je to ranije prijavljeno od strane McGuigan-a i saradnika (1993, 1996, 1997). Na primer, arilfosforodihlorofosfat (2) je pripremljen kuplovanjem 1-naflola (3) sa fosfor oksihloriđom (4) u prisustvu Et^N (Sema 1) i smela je ostavljena da reaguje sa tozilatom L-alanin benzil estra (5) u prisustvu EtjN, a da bi se dobio derivat fosforohloridata (6) (šema 2). Nukleozid 5-FdUrd (7) preveden je u 5' ProTide jedinjenje kuplovanjem sa derivatom fosforohloridata (6) u THF, u prisustvu W-metil imidazola (NMI) da bi se dobilo ciljno jedinjenje CPF-373 (1) (Šema 3). Uzorak je dobijen kao smeša dva dijastereoizomera što je potvrđeno prisustvom dva pika na<3>,P NMR spektru.
[0073]Anhidrovani raslvarači su nabavljeni od firmeAldrichi korišćeni bez daljeg prečišćavanja. Sve reakcije su izvedene u atmosferi zasićenoj argonom. Reakcije su praćene analitičkim TLC-om na Silika gel 60-F254 prevučenim aluminijumskim pločama, a vizuelizacija je rađena pod UV svetlom (254 nm) i/ili putem<3>,P NMR spektara. Hromatografija na koloni je izvedena na kolonama sa silika gelom (35-70 uM). NMR spektri protona ('H), ugljenika (13C), fosfora f'<P>) i fluora (<1S>F) snimljeni su naBruker Avance 500spektrometru na 25°C. Spektri su autokalibrisani u odnosu na pik deuterizovanog rastvarana i svi<13>C NMR i<3>,P NMR spektri su proton-dekuplovani. Analitička HPLC analiza je sprovedena na aparatuVariari Prostar ( LC VVorkstation- Varian Prostar 335 LCdetektor) koristećiVarian PolarisC18-A (10 uM) kao analitičku kolonu.
[0074]Maseni spektri niske i visoke rezolucije uslužno su urađeni na Birminghamskom univerzitetu, uptrebom elektrosprej masene spektroskopije (ES). CHN mikroanaliza uslužno je urađena u firmi MEDAC Ltd., Surrey.StandardnaproceduraA: Sintezadihlorofosfata(2).
[0075]Fosfor oksihlorid (1,0 ekv) je dodat u rastvor 1-naftola (1,0 ekvivalent) u dietil etru, u atmosferi argona, a zatim je u kapima dodavan anhidrovani trietilamin (1,0 ek) na -78°C, pa je dobijena reakciona smeša mešana 1 h. Zatim je reakciona smeša ostavljena da se polako zagreje do sobne temperature tokom 3 h. Obrazovanje željenog jedinjenja je praćeno pomoću<3>,P NMR-a. Dobijena smeša je profiltrirana i dalje uparenain vacuopod azotom da bi se dobio produkt u vidu neprečišćenog bezbojnog ulja koje je u sledećem koraku korišćeno bez daljeg prečišćavanja.
[0076] Sinteza 1-naftil dihlorofosfata (2):pripremljen je u skladu sa standardnom procedurom A, od 1-naftola (3,00 g; 20,81 mmol), fosfor oksihlorida {1,94 mL; 20,81 mmol). trietilamina (2,9 mL; 20.81 mmol) i anhidrovanog dietil etra {70 mL). Nakon 1 h na 78°C reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana 3 h. Dobijen je sirov produkt u vidu ulja. Dobijena smeša je profiltrirana i potom uparenain vacuo,nakon prečišćavanja hromatografijom na koloni eluiranjem sa heksan-EtOAc (11), a da se dobilo bezbojno ulje (4,59 g; 84%) [Rr =0,93 (heksan-EtOAc, 1:1)], 3,P NMR (202 MHz, CDCI3): 6P5,07;<1>H NMR (500 MHz, CDCI3): 5H 7,52-7.71 (m, 4H, ArH), 7,86-7,89 (m, 1 H, ArH), 7,95-7,98 (m, 1 H, ArH), 8,16-8,19 (m, 1 H, ArH).
Standardna procedura B: Sinteza fosforohloridata(6).
[0077] Rastvor aril fosforodihloridata (1,0 ekviv.) i odgovarajuće soli estra aminokiseline (1,0 ekviv) u dihlorometanu dodat je ukapavanjem u atmosferi argona u anhidrovan trietilamin (2,0 ekviv.) na -78°C. Nakon 1 sata, reakciona smeša je ostavljena da se polako zagreje do sobne temperature tokom 3 h, a obrazovanje željenog jedinjenja je praćeno putem 31P NMR-a. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je ponovo rastvoren u dietiletru, pa je profiltriran i uparenin vacuo uatmosferi zasićenoj azotom, a da bi se dobilo neprečišćeno bezbojno ulje koje je u nekim slučajevima korišćeno bez daljeg prečišćavanja u sledećem koraku. Sintetisan aril fosforohloridat je prečišćen hromatografijom na koloni eluiranjem sa smešom heksana i EtOAc (7:3) da bi se dobilo jedinjenje navedeno u naslovu u vidu bezbojnog ulja.
Sinteza l-naftil(benzil-L-alaninil) fosforohloridata(6):
[0078]Fosforohloridat je pripremljen upotrebom 1-naftil dihlorofosfata (2,50 g; 9,57 mmol), tozilatne soli L-alanin benzil estra (3.36 g; 9,57 mmol), suvog trietilamina {2,66 mL; 19,14 mmol) i suvog dihlorometana (35,7 mL) prateći opštu proceduru B Prečišćavanje hromatografijom na koloni, eluiranjem sa smešom heksana i EtOAc (7:3) obezbedilo je traženo jedinjenje u vidu bezbojnog ulja (1,82 g; 47%) [R,= 0,90 (heksan-EtOAc, 7:3)],<3>,P NMR (202 MHz, CDCh, mešavina dijastereoizomera): 5P7,92, 8,14 (Int.: 1,00:1,00); 'H NMR (500 MHz, CDCI3, smeša dijastereoizomera u odnosu 1:1): 5H 1,42-1,45 (m, 3H, CHCH3), 4,20-4,23 (m, 1H,CHCH3), 4,78-4,81 (m, 1H, NH), 5,09 (s, 2H, OCHjPh), 7,09-7,73 (m, 11H, ArH), 7,97-8,12 {m, 1 H, ArH).
Standardna procedura C: Sinteza nukleozida fosforoamidata (1).
[0079]Rastvor odgovarajućeg nukleozida (1,0 ekviv.) u suvomTHF(10 mL) je dodat u NM1 (5,0 ekv.) na sobnoj temperaturi pod atmosferom argona. Nakon 10 min reakciona smeša je u kapima dodata u rastvor fosforohloridata (3,0 ekviv.) u anhidrovanom THF. Reakcija se odvijala mešanjem na sobnoj temperaturi preko noći, a smeša je zatim uparenain vacuo.Dobijeno ulje je rastvoreno u CH2CI2, isprano dva puta sa H20, a zatim sa 0.5M HCI ili je neprečišćen proizvod pak ispran dietil etrom. Neprečišćeni proizvod je dalje prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom uz gradijent eluciju smešom CH2CI2-MeOH da bi se dobilo fosforoamidat.
Sinteza 5-fluoro-2'dezohsiuridin-5'-0-[a-naftil(benzil-L-alaninil)] fosfata (1):
[0080]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), NMI (0,40 mL; 5,07 mmol) i naftil(benzil-L-alaninil)fosforohloridata (0,82 g; 3,04 mmol) praćenjem opšte procedure C. Prečišćavanjem gradijent hromatigrafijom na koloni, eluiranjem od CH2CI2do smeše CH^Cb-MeOH (95:5), dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (47,0 mg; 8%) [R, = 0,19 (CH2CI2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa<*>, 636,1520. CzaHraN^OaFNaP zahteva [MNa<*>], 636,1523); 3,P NMR (?07 MHz, MeOD, smeša dijastereoizomera): Op4,24-4,59;<10>F NMR (470 MHz, MeOD): 6V-167,36, -167.18: 'H NMR (500 MHz, MeOD): 5H 1,34-1,38 (m, 3H, CHCH3), 1,67-1,79 (m, 1H,H-2'),2,08-2,17 {m, 1H, H-2'), 4,03^f,15 (m, 2H, CHCH3, H-4'). 4,24-4,36 {m, 3H,CH2OP H-3'), 5,08 (d, 1H,J =12,0 Hz, OCHHPh). 5,13 (d, 1H,J =12,0 Hz, OCHHPh), 6,09-6.16 (m, 1H, H-1 ), 7,27-7,45 (m, 6H, ArH), 7.47-7,55 (m, 3H, ArH), 7,67-7,72 (m, 2H, ArH, H-6), 7,86-7,90 (m, 1 H, ArH), 8,12-8,18 (m, 1 H, ArH) ; "C NMR (125 MHz, MeOD): 5C20,3 (d,<3>JC.P= 7,6Hz, CH3), 20,5 (d, 3JC.P= 6,5 Hz, CH3), 40,8 (CH2), 40,9 (CH,), 51.8 (CH), 51,9 (CH), 67,6 (d,<2>Jc-P=5.3 Hz, CH2), 67,8 (d, 2JC.P = 5,2 Hz, CH2), 68,0 (CH2), 68,1 (CH2), 72,0 (CH), 72,1 (CH), 86,7(d, 3JC-p =8,1 Hz, CH), 86,8 (d, 3JC-p = 8,1 Hz, CH), 86,9 (CH), 87,0 (CH), 116,2 (d, 3JCP = 3,3 Hz, CH), 116,5 (d,<3>Jt.P= 3,5 Hz, CH), 122.6 (CH), 125,3 (CH), 125,4 (CH), 125,6 (CH), 125,7 (CH), 126,2 (CH), 126,5 (CH), 126,6 (CH), 127,6 (CH), 127,7 (CH), 127,8 (C), 127,9 (C), 128,0 (CH), 128,1 (CH), 128,9 (CH), 129,0 (CH), 129,4 (CH), 129,5 (CH), 129,6 (CH), 129.7 (CH). 136,2 (C), 137,1 (C), 137,2 (C), 141,6 (d, 'JC.F= 233,8 Hz, C), 141,7 (d,,Jc.f= 233,9 Hz, C), 147,8(d, ?Jc-P= 7,7 Hz, C), 147,9(d, 2JCP=7,4Hz, C), 150,5 (d, 4JC.F=4,0 Hz, C), 159,3 (d,2JCF = 26,1 Hz, C), 174,6(d, 3JCP=5,0 Hz, C), 174,9 (d,<3>Jc.p= 4,3 Hz, C>. m/z (ES) 636 (MH<*>, 100%), revezni HPLC eluiranjem sa (H20/MeOH od 100/0 do 0/100) u 45 min. je pokazao je dva pika dijastereoizomera sa fa 34,23 min. i !R 34,59 min. Analitički izračunato za C2S)H29FN309P: C, 56,77; H, 4,76; N, 6,85. Utvrđeno: C, 56,57; H. 5,06; N, 6,72.
Radioaktivni pirimidinski dezoksinukleozidi
[0081][5-<3>H]dCyd (radiospecifičnost: 22 Ci/mmol) i [5-<3>H]dUrd (radiospecifičnost: 15,9 Ci/mmol) dobijen i su od firmeMoravek Biochemicals Inc.(Brea, Kalifornija).
Standardna procedura D: sinteza fosforamidata(NMImetod)
[0082]U rastvor 5-F-dUrd (1,0 ekv.) u anhidrovanom THF, tokom mešanja je u kapima dodat odgovarajući fosforohloridat (3,0 ekv.) rastvoren u anhidrovanom THF pod parom Ar. U ovakvu reakcionu smešu na -78°C je zatim u kapima dodavan NMI (5,0 ekv.) tokom 5 minuta. Nakon 15 minuta, reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i potom je ista mešana preko noći. Rastvarač je uklonjenin vacuo,a ostatak je ponovo rastvoren u DCM i ispran sa 0,5M HCI tri puta. Organski sloj je osušen pomoću MgSOj, profiltriran, redukovan do suva i dalje prečišćen hromatografijom na koloni sa gradijentom eluenta {DCM/MeOH 99:1 do 97:3 pa do 95:5).
Standardna procedura E: sinteza fosforamidata (rBuMgCI metod)
[0083]U rastvor 5-FdUrd (1,0 ekv.) u anhidrovanom THF, tokom mešanja je u kapima dodat rBuMgCI (1,1 mol ekv., 1M rastvor u THF) u atmosferi argona, nakon čega je sledilo dodavanje (nakon 30 min.) odgovarajućeg fosforohloridata (2,0 mol ekv.) rastvorenog u anhidrovanom THF. Dobijena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni koristeći gradijent eluenta (DCM/MeOH 99:1 do 97:3 pa do 95:5)
S-Fluoro-a'-dezoksiuridin-S'-O-ffenilfbenzoksi-L-alaninil^fosfat (CPF381)
[0084]
[0085]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,40 g; 1,62 mmol). ferc-butifmagnezijum hlorida u tetrahidrofuranu ('BuMgCI) (1,0 M; 2,43 mL; 2,43 mmol) i fenil(benzoksi-L-alaninil) fosforohloridata (1,08 g; 3,20 mmol) prateći opšti postupak E. Prečišćavanje je zatim sprovedeno gradijent hromatografijom na koloni sa silika gelom, eluiranjem od CH2CI2do CH2CI2-MeOH (95:5) i tako je dobijeno jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (71,0 mg; 8%) [R, = 0,35 (CH2CI2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa", 586,1360. CttHj7N309NaPF zahteva [MNa<*>], 586,1367);<3>,P NMR (202 MHz, MeOD): ™P3,74, 4,14; ,3F NMR (470 MHz, MeOD): ™F- 157,57, - 167,46;<1>H NMR (500 MHz, MeOD): ™H 1,35 (d. 3H,J= 7,4 Hz, CHCH,, jedan dijastereoizomer), 1,37 (d, 3H,J =6,9 Hz, CHCH3, jedan dijastereoizomer), 1,96-2,32 (m, 2H,H- 2'),3.95A08 (m, 2H, CHCH3, H-4'j,4,23A34 (m, 3H,CH2OPH- 3'),5,13 (br d, 1H,J = 12,3Hz, OCHHPh), 5,16 (br d, 1H,J =12,3 Hz,OCHHPh, jedandijastereoizomer), 5,17 (br d, 1H,J= 12,2 Hz,OCHHPh,jedan dijastereoizomer), 6,16-6,22 (m, 1H,H-1'),7,17-7,25 (m, 3H, Ar), 7,26-7,40 (m, 7H, Ar), 7,81-7,85 (m, 1H, H-6); "C NMR (125 MHz, MeOD): ™c20,2 (d,* Jcr =7,5 Hz, CH3), 20,4(d, 3Jt^=6,2 Hz, CHa), 40,6 (CH2), 40,9 (CH2), 51,6 (CH), 51,8 (CH), 67.5 (d, 7JCP = 5,3 Hz, CH2), 67.6 (d, !JC.P= 5,5 Hz, CH7), 68,0 (CH2), 71.8 (CH), 71,9 (CH), 86,6(d,3JCP =8,0 Hz, CH), 86,8 (d,3Jc-P =8,3 Hz, CH), 86,9 (CH), 87,0 (CH), 121,4 (d, 3JCP= 5.1 Hz, CH), 121,5 (d,3Jcp= 5,6Hz. CH), 125,5 (d,5J^P= 3.2 Hz, CH), 125,8(d, SJC. P=3,2 Hz, CH), 126,3 (CH). 129,0 (CHx2), 129,3 (CHx2), 129,6 <CHx2), 130,8 (CHx2), 140,9 (C), 141,6 <d,Vc.F = 233,6 Hz, C), 141,7 (d, 'Jc-F = 233,6 Hz, C), 150,7 (d, 'JC.P=5,7 Hz, C), 152,1 (d, 2Jcf = 6,5 Hz, C), 159,2 (d, ?JC.P = 26,3 Hz. C), 174,6 (d, 3JC.P = 4,9 Hz, C), 174,7 (d, 3JCP = 4,9 Hz, C), m/z (ES) 586 (MNa<*>, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H20/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je jedan pik smeše dijastereoizomera sa fn25,08 min.
(97%).
S-Fluoro^'-dezoksiuridin-S'-O-peniHmetoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF382) (referentni primer)
[0086]
[0087]Fosforoamidat je pripremljen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), /V-metilimidazola (NMI) (0,40 mL; 5,07 mmol) i fenil(metoksi-L-alaninil) fosforohloridata (0,84 g; 3,04 mmol) praćenjem opšteg postupka D. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CH2C!2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (16,0 mg; 4%) [R, = 0.30 (CH2CI2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa-, 510,1045. C19H?3N309NaPF zahteva [MNa'], 510,1054); 3,P NMR (202 MHz, MeOD): ™P3,79, 4,09;<1S>F NMR (470 MHz, MeOD): ™F-167,78, -167,72; 'H NMR (500 MHz, MeOD): ™H1,34 (d, 3H. J = 7,1 Hz, CHCH3, jedan dijastereoizomer), 1,36 (d, 3H,J= 7,1 Hz, CHCH3, jedan dijastereoizomer), 2,02-2,16 (m, 1H,H- 2'),2,25-2,34 (m, 1H,H- 2'),3,69 (s, 3H, OCH3, jedan dijastereoizomer), 3,70 (s, 3H, OCH3, jedan dijastereoizomer), 3,93-4,02 (m, 1H, CHCH3), 4,08^,13 (m, 1H, H-4'), 4,27^1,45 (m, 3H,CH2OP H-3'), 6,20-6,29 (m, 1H,H-1'),7,18-7,28 (m, 3H, ArH), 7,35-7,40 (m, 2H, ArH). 7,85 (d, 1H. 3JHJ== 6,4 Hz, H-6); 13C NMR (125 MHz, MeOD): ™c20,2(d, 3JC. P=7,5 Hz, CH,), 20,5 (d,<3>Jc.P= 6,7 Hz, CH3), 40,8 (CH,), 40,9 (CH2), 51,5 (CHj), 51.6 (CH3), 52,7 (CH), 52,8 (CH), 67,5 (d,<2>JCP= 5,5 Hz, CH2), 67,6 (d,<2>JCp=5,1 Hz, CH2), 72,0 (CH), 72,1 (CH), 86,7 (d,<3>JC.P= 8,2 Hz. CH), 86,8 (d, Vc.<p>= 8,2 Hz, CH), 86,9 (CH), 87,0 (CH), 121,2 (d, 3JC.P= 4,5 Hz, CH), 121,4 (d,<3>Jc.P= 4,7 Hz, CH), 125,6 (d,<5>JC.P= 2,9 Hz, CH), 125,9 (d,<5>Jc-p=2,9 Hz. CH), 126,2 (CH), 130,8 (CH), 130,9 (CH), 141,6 (d, VC.F = 233,8 Hz, C), 141,7 (d, 1Jc,-= 233,9 Hz, C), 150,6 <d,AJc. r=3,6 Hz, C), 152,1 (d,<2>JtP=6,8 Hz, C), 152,2 (d,<2>Jcp=6,8Hz, C), 159,4 (d,<2>JCr=26,0 Hz, C). 175,2 (d, JJCP = 4,8Hz, C), 175,5 (d,3 JC- r =3,7 Hz, C), m/z (ES) 510 (MNa<*>. 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H20/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, je pokazao je dva pika dijastereoizomera sa fR23,11 min. i '„24,11 min. (74%:24%).
S-Fluoro-r-dezoksiuridin-S'-O-IfeniHetoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF383)
[0088]
[0089]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'dezoksiuridina (0,10 g; 0,40 mmoi), N-metilimidazola (NMI)
(0,16 mL; 2,03 mmol) i fenil(etoksi-L-aianinil) fosforohloridata (0,35 g; 1.21 mmol) prateći opšti postupak D. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CHjCIj-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (10,0 mg; 5%) [Rr = 0,11 (CH2CI2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa", 524,1202. CmH»N309NaPF zahteva [MNa<*>], 524,1210); 3,P NMR (202 MHz, MeOD): ™P 3,83, 4,11; "F NMR (470 MHz, MeOD): ™F - 167,67-167,61; 'H NMR (500 MHz, MeOD): ™M 1,25 (t, 3H,J =7,1 Hz, CH2CH,, jedan dijastereoizomer), 1,26 (t, 3H,J =7,1 Hz, CH?CH3, jedan dijastereoizomer), 1,34 (d, 3H,J= 7,2 Hz, CHCH3, jedan dijastereoizomer), 1.36 (d, 3H,J= 7,2 Hz, CHCH3, jedan dijastereoizomer), 2,02-2,15 (m, 1H,H- 2'),2,24-2,34 (m, 1H,H- 2'),3,90-4,00 (m, 1H,CHCH,,), 4.08-4,19 (m, 3H,CH2CH3,H- 4'),4,27-4,45 (m. 3H,CH2OP, H-3'), 6,20-6,28 (m, 1H,H-1'),7,18-7,28 (m, 3H, ArH), 7,34-7,39 (m, 2H, ArH), 7,85 (d, 1H, 3J„.f = 6,4 Hz, H-6); "C NMR (125 MHz, MeOD): "V 14,4 (CH3), 15,4 (CH3), 20,3 (d,3JC- p=7,6Hz. CH3), 20,5 (d, Vc-P=6,5 Hz, CH3), 40,8 (CH2), 40,9 (CH2). 51,6 (CH), 51,7 (CH), 62,4 (CH,), 62,5 (CH2), 67,5 (d,<2>JCP=5,4 Hz, CH,), 67,6 (d,?J^ =5,4 Hz, CH;), 72,0 (CH), 72,1 (CH), 86,7 (d,3J(-.,.=8,1 Hz, CH), 86.8 (d,<3>Je.P=8,3Hz, CH), 86,9 (CH), 87,0 (CH), 121,3(d, 3JCP=4.8Hz. CH), 121,4 (d. Vc.p=4,6 Hz, CH), 125,6 (d, 5JC.P = 4,6 Hz, CH), 125,8 (d,5Jc.P = 4,8 Hz, CH), 126,3 (CH), 130,8 (CH), 130,9 (CH), 141,6(d, Vc.f=233,7 Hz, C), 141,8 (d,<V>c-r= 233.8 Hz, C), 150,8 (br C), 152,0(d,2JCP =7,1 Hz, C). 152.1 (d.2JC.P =7,1 Hz, C). 159,6 (d,<2>JC.P=26.0 Hz, C). 174,8 (d,<3>JC.P= 5,4 Hz, C), 175,1 (d,<3>JC.P= 4,4 Hz, C), m/z (ES) 524 (MNa<*>, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H20/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera sa fR25,63 min. i fR26,40 min. (71% : 27%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[fenil(izopropoksi-L-alaninil)]fosfat(CPF384)
[0090]
[0091]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), W-metilimidazola (NMI)
(0,40 mL; 5,07 mmol) i fenil(izopropoksi-L-alaninil) fosforohloridata (0,93 g; 3,04 mmol) prateći opšti postupak D. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH?CI3 do CH2CI2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (31,0 mg; 6%) [R( = 0,21 (CH2Cl2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa<*>, 538,1370. C2,H27N309NaPF zahteva [MNa<*>], 538,1367);<3>,P NMR (202 MHz, MeOD): ™P3,87, 4,13; "F NMR (470 MHz, MeOD): ™P-167,64, -167,56; 1H NMR (500 MHz, MeOD): ™H1,22-1,26 (m, 6H, CH (CH3)2), 1,33 (d. 3H. J = 7,1 Hz, CHCH3, jedan dijastereoizomer), 1,35 (d, 3H,J= 7,1 Hz, CHCH3, jedan dijastereoizomer), 2,00-2,15 (m, 1H,H-2'),2,23-2,34 (m. 1H. H-2'), 3,88-3,96 fm, 1H,CHCH3), 4,08-4,14 (m, 1H, H-4'), 4,27-1,45 (m, 3H,CH2OP, H-3'), 4,98 (hept, 1H,J =6,1 Hz, CH(CH3)2). 6.20-6,29 (m, 1H,H-1'),7,17-7,29 (m, 3H, Ar-H), 7,34-7,40 (m, 2H, Ar-H), 7.84 (d,1H, 5JHr=6,4 Hz, H-6); 13C NMR (125 MHz, MeOD): ™c20,3 (d, 3JC.P= 7,6Hz, CH3), 20,5(d,3Jc-P=6,4 Hz, CH3),
21,9 <CH3x2), 22,0 {CH,x2), 40,8 (CHS), 40,9 {CHS), 51,7 (CH), 51,8 (CH), 67,5 (d,2JC- r =5.4 Hz, CH,), 67,6 (d. 2JCP = 5,2 Hz. CH,), 70,2 (CH), 70,3 (CH), 72,0 (CH), 72,1 (CH), 86,6 (d,<3>JC-p= 8,2 Hz, CH), 86,8 (d,<;>,Jc.p= 8,2 Hz, CH), 86,9 (CH), 87,0 (CH), 121,2(d, 3JC- P=4,7 Hz, CH), 121,4 (d, 3JC.F = 4,9 Hz, CH), 125,6 (d,5Jc-P = 7,1 Hz, CH), 125,9 (d,<S>JC.P= 7,1 Hz, CH), 126,3 (CH), 130.8 (CH), 130,9 (CH), 141,8 (d, 1JCF= 234,5 Hz. C). 141,9(d,234.4 Hz, C), 150,7(d, <JC. F =3,7 Hz, C), 152.0 (d, 3JCP = 6,2 Hz, C), 152,1 (d, 3JC.P= 6,2 Hz, C), 159,3 (d,'' Jc- f=26,3 Hz, C). 159,4 (d,<2>JC.F=26,Q Hz, C), 174,3 (d, 3Jc.p= 5,6 Hz, C), 174,6 (d, Vc-P= 4,6 Hz, C), m/z (ES) 538 (MNa<*>, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H2OZMeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera sa fH 28,93 min. i fR29,45 min. (44% : 52%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[fenil(cikloheksoksi-L-aianinil)] fosfat (CPF508)
[0092]
[0093]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,30 g; 1,21 mmol), /V-metilimidazola (NMI)
(0,48 mL; 6,09 mmol) i fenil(cikloheksoksi-L-alaninil) fosforohloridata (1,026 g; 3,65 mmol) prateći opšti postupak D. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CH2Ci2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (6,7 mg; 3%) [R,= 0,45 {CH2Cl2-MeOH, 95:5)]; (Utvrđeno: MNa<*>, 565,48. CZ4H3,N309NaPF zahteva [MNa<*>]. 565,49); 3,P NMR (202 MHz, MeOD): ™P3,86, 4,15;<1S>F NMR (470 MHz, MeOD): ™<F>-167,68-167,62; 'H NMR (500 MHz, MeOD): ™„ 1,26-1,40 (m, 3H, CHCH3), 1,41-1,50 (m. 4H, CHfCH^), 1,52-1,61 (m, 1H, CH(CH,)5), 1,70-1,88 (m, 5H, CH(CH?)5), 2,00-2.14 (m, 1H, H-2'), 2,23-2,34 (m, IH, H-2'), 3,90-3,98 (m, 1H, CHCH3), 4,07-4,14 (m, 1H, H-4'), 4,29-4,39 (m, 2H, CH2OP), 4,40-4,45 (m, 1H,H-3'),4,72^,78 (m, 1H, CH(CH,)6), 6,20-6,28 (m, 1H. H-1'), 7,18-7,29 (m, 3H. ArHJ, 7,34-7,39 (m. 2H, ArH), 7,85 (d, 1H, 3JH.F = 6,6 Hz, H-6); ,3C NMR (125 MHz, MeOD): ™c20,3 (d. 3JC.P= 7,3 Hz, CH3), 20,6(d, 3JC-p=6,5 Hz, CH3), 24,6 (CH,), 26,4 (CH2), 32,3 (CH,), 32,4 (CH2), 40,9 (CH2), 51,7 (CH), 51,9 (CH), 67,5(d, 2JC. P=5,3 Hz, CH2), 67,7(d, 2JC- P =5,3 Hz. CH2). 72,0 (CH), 72,1 (CH), 74.9 (CH), 86,6 (d,<3>JC.P= 8,5 Hz, CH), 86,8 (d,<3>JCJ== 8,5Hz, CH), 86,9 (CH), 87,0 (CH), 121,3 (CH), 121,4 (CH), 121,5 (CH), 121,6 (CH), 125,6 (CH), 125,7 (CH), 125,8 (CH), 125,9 (CH), 126,3 (CH), 130,1 (CH), 141,5 (d, 1JC.F= 234.0Hz, C), 150,7 (d,<4>JC.P=4,0 Hz, C), 152,0 (d,<3>Jc.P=7,2 Hz, C), 152,1 (d,2Jc. p=7,2Hz, C), 159,4(d, ' Je-F =26,3 Hz, C), 174,3 (d.<3>JC-P= 4,6 Hz, C). 174,5(d, 3JC.P=4,3 Hz. C); m/z (ES) 565 (MNa*, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H?0/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm. pokazao je dva pika dijastereoizomera sa f„ 30,00 min. i fR30,45 min (33% : 65%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-O-[p-nitro-fenil(etoksi-L-alaninil)]fosfat(CPF430)
[0094]
[0095]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), /V-metilimidazola (NMI)
(0,40 mL; 5.07 mmol) i p-nitro-fenil(etoksiL-alaninil) fosforohloridata (1.02 g; 3,04 mmol) prateći opšti postupak D. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CH2CI2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (77,0 mg; 14%) [R, = 0,24 (CH2CI2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa", 569,1066. CjoH^OnNaPF zahteva [MNa'], 569.1061); " P NMR (202 MHz, MeOD): ,HP3,53, 3,67; ,aF NMR (470 MHz, MeOD): ™F -167,89-167,82; 'H NMR (500 MHz, MeOD): 1MH 1,24 (t, 3H,J =7,0 Hz, CH2CH3), 1,25 (t, 3H,J =7,0 Hz, CH2CH3), 1,36-1,40 (m, 3H. CHCH3), 2,16-2,25 (m, 1H,H- 2'),2,30-2,38 (m, 1H, H-2'), 3,95-4,00 (m, 1H. CHCH3), 4,09-4,19 (m, 3H,CH2CH2,H-4 ).4,32-1,48 (m, 3H,CH2OP, H-3'), 6,21-6,29 (m, 1H,H-1<1>),7,46 (d, 1H,J- 8,7 Hz,ArH),7,49 (d, 1H, J = 8,7 Hz,ArH),7,85 (đ, 1H,<3>Jh-f= 6,6 Hz, H-6), 7,87 (d. 1H, 3JH.F = 6,6 Hz, H-6), 8,29 (d, 2H,J =8,7 Hz,ArH) ;"C NMR (125 MHz, MeOD): ™c14,5 (CH,), 14,6 (CH3), 20,3 (d,VC.P=7,5 Hz, CH3), 20,4 (d,<3>Jr.p=6,4 Hz, CH3), 40,8 (CH2), 51,6 (CH), 51,7 (CH), 62,5 (CH2), 67,8 (d,?Jc-^5,5 Hz, CH2), 68,0 (d,2Jc-P =5,2Hz, CH2), 71,8 (CHx2), 86,4 (CH), 86,5 (CH), 87,0(đ, VC-P =7,5 Hz, CH), 122,1 <d,3JCP = 5,2Hz, CH), 122.5(d, 3Jcp=5,0 Hz, CH), 125,7 (CH), 126,0 (CH), 126,6 (CH), 141,3 (d. 'Jc.f= 233,6 Hz, C), 141,5 (d,1Jn.F=233,7 Hz, C), 146,2 (C). 150,6 (d,iJCp=4,6 Hz, C), 156,9 (d,<2>JCP=2,6 Hz, C), 157,0(d, 7Jc. i>-2,6 Hz, C), 159,3 (d,<2>JC-f=26,3 Hz, C), 174,6(d, 3Jw=4,6 Hz, C), 174,9 (d,<3>JC.F= 3,7 Hz, C), m/z (ES) 569 (MNa<*>, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H20/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 min., 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera sa fR31,63 min. i rR31,89 min. (11% : 85%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[1 -naftil(benzoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF373)
[0096]
[0097]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), /V-metilimidazola (NMI)
(0,40 mL; 5,07 mmol) i l-naftil(benzoksi-L-alaninil) fosforohloridata (0.82 g; 3,04 mmol) prateći opšti postupak D. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI?do CH,CI2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (47,0 mg; 8%) [R, = 0,19 (CH2CI2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa', 636,1520. C,9H?sN309NaPF zahteva [MNa<*>]. 636,1523);3, PNMR (202 MHz, MeOD): "V4.24, 4,59; 1E,F NMR (470 MHz, MeOD): ™F -167,36-167,18; 'H NMR (500 MHz, MeOD): ™H1,34-1,38 (m, 3H, CHCH3), 1,67-1,79 (m, 1H,H- 2').2,08-2,17 (m, 1H,H- 2'),4,03-4,15 (m. 2H, CHCH3,H-4').4.24-4.36 (m, 3H, CH2OP H-3'), 5,08 (d, 1H.J =12,0 Hz, OCHHPh), 5.13 (d, 1 H J = 12,0 Hz,OCHHPh),6,09-6,16 (m, 1H,H-1"),7,27-7,45 (m, 6H, ArH), 7,47-7,55 (m, 3H, ArH), 7,67-7,72 (m, 2H, ArH, H-6), 7,86-7,90 (m, 1 H, ArH), 8,12-8,18 (m, 1 H, ArH); ,3C NMR (125 MHz, MeOD): ™c20,3 (d, 3Jc.p= 7,6Hz, CH3), 20,5 (d,<3>Jc-P=6,5 Hz, CH3), 40,8 (CH2), 40,9 (CH2), 51,8 (CH), 51,9 (CH), 67,6 (d,Vc-P= 5,3 Hz, CH2), 67,8 (d,<?>JC-<p>=5,2Hz, CH2), 68,0 (CH2), 68,1 (CH,). 72,0 (CH), 72,1 (CH). 86.7 (d,3JC. P=8,1 Hz, CH), 86,8 (d,<3>JC-p=8,1 Hz, CH), 86,9 (CH), 87,0 (CH), 116,2 {d,3JCP=3,3 Hz. CH), 116,5 (d,<3>JC-p=3,5 Hz, CH), 122,6 (CH), 125,3 (CH), 125,4 (CH), 125,6 (CH), 125,7 (CH), 126,2 (CH), 126,5 (CH), 126,6 (CH), 127,6 (CH), 127,7 (CH),
127.8 (C), 127,9 <C), 128,0 (CH), 128,1 (CH), 128,9 (CH), 129,0 (CH), 129,4 (CH), 129,5 (CH), 129,6 (CH), 129,7 (CH), 136,2 (C), 137,1 (C), 137,2 (C), 141,6 (d, VC-F = 233,8 Hz, C), 141,7 (d, 'Jc, =233,9 Hz, C), 147.8(d, 2JC. P=7,7 Hz, C), 147,9 (d,<2>JCP=7,4 Hz, C), 150.5(d,Vc.,= =4,0 Hz, C), 159,3 (d,Vcf =26,1 Hz, C), 174,6 (d,3JCP =5,0 Hz, C), 174.9 (d,<3>JCP=4,3 Hz, C), m/z (ES) 636 (MNa<*>, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H20/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera sa (R 34,23 min. i /R 34,59 min. (23% : 76%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil(metoksi-L-alaninil)] fosfat(CPF385)
[0098]
[0099]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), N-metilimidazola (NMI)
(0,40 mL; 5,07 mmol) i l-naftil(metoksi-L-alaninil) fosforohloridata (0,99 g; 3,04 mmol) prateći opšti postupak D. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH?CIZdo CHzCfeMeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (7,0 mg; 1%)[ R, =0,23 (CH2CI2MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa<*>, 560,1198. CjsHpsNsOsNaPF zahteva [MNa<*>], 560,1210);<31>P NMR {202 MHz, MeOD): ™P 4,31, 4,56;,<9>F NMR (470 MHz, MeOD): ™F-167,51, -167,37; 'H NMR (500 MHz, MeOD): ™H1,34 (d, 3H,J= 6,7 Hz, CHCH3, jedan dijastereoizomer), 1.36 (d. 3H.J =6,7 Hz, CHCH,. jedan dijastereoizomer). 1.76-1,87 (m, 1H,H- 2'),2,12-2,22 (m, 1H, H-2<1>), 3,64 (s, 3H, OCH3, jedan dijastereoizomer), 3,65 (s, 3H, OCH3, jedan dijastereoizomer), 4,03-4,13 (m, 2H, CHCH3, H-4'), 4.30-4.38 (m, 2H. CH2OP), 4,41 (dd. 1H. J = 2,5 Hz,J =5,8 Hz, H-3'). 6,12-6.19 (m, 1H,H- V),7,41-7,46 (m, 1 H, ArH), 7,50-7,58 (m, 3H, ArH), 7,70-7,76 (m, 2H, H-6,ArH),7,87-7,91 (m, 1 H, ArH), 8,15-8,20 (m, 1 H, ArH); ,3C NMR (125 MHz, MeOD): ™c20,3(d, 3JCF.= 7,1Hz, CH3), 20,4(d. 3JC. P =6,5 Hz, CH3), 40,7 (CH2), 40,8 (CH,), 51,6 (CH3), 51,7 (CH3), 52,7 (CH), 52,8 (CH). 67,8 (d, 2Jc.p = 5,7 Hz, CH?), 67,5 (d,' JCP=5,7 Hz, CH2), 72,0 (CH), 72,1 (CH), 86,7 (d, Vc-p = 7,9 Hz.CH).86,9(d, 3Jc- p=8,5Hz.CH), 86,9 (CH), 87,0 (CH), 116,2 (d,<3>JCP= 3,1 Hz, CH), 116,5 (d, 3Jc.p= 3,5 Hz, CH), 122,5 (CH), 122,6 (CH), 125,4 (CH), 125,5 (CH), 125,6 (CH), 125,7 (CH), 126,1 (CH), 126,2 (CH), 126,5 (CH) , 126,6 (CH), 127,6 (CH). 127,7 (Cx2), 127.8 (CH), 127,9 (CH), 128,9 (CH), 129,0 (CH), 136,3 (C), 141,6(d, Vc-F=233,4 Hz, C), 141,7 (d, VCr= 234,1 Hz, C), 147,8(d, JJC.P=7,9 Hz, C), 148,0 (d,<?>JCP= 7,2Hz, C), 150,6 (C), 159,4 (d,<2>JCF= 27,0 Hz, C), 175,2 (d,<5>JCP= 3,9 Hz, C), 175,5 (d.3JC. °=3.9 Hz, C), m/z (ES) 560 (MNa<*>, 100%), reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H;0/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min,<L>= 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera sa fR 28,45 min. i fR 28,85 min. (73% : 25%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil(etoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF386)
[0100]
[0101]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), /V-metilimidazola (NMI)
{0,40 mL, 5,07 mmol) i l-naftil(etoksi-L-alaninil) fosforohloridata (1,04 g; 3,04 mmol) prateći opšti postupakD.Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CH2CI2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (47,0 mg; 4%) [R, = 0,25 (CH2CI2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa<*>, 574,1360. C„H27N303NaPF zahteva [MNa<*>], 574,1367); 31P NMR (202 MHz, MeOD): ™P4,34, 4,55;,<9>F NMR (470 MHz, MeOD): ™F-167,31, -167,16; 'H NMR (500 MHz, MeOD): ™H1.20 (t, 3H, J = 7,0 Hz, CHCH3, jedan dijastereoizomer), 1,21 (t,3H, J = 7,0Hz, CH2CH3, jedan dijastereoizomer), 1,33-1,37 (m, 3H, CHCH3), 1,73-1,86 (m, 1H, H-2'), 2,12-2,21 (m, 1H, H-2'), 4,01^1,07 (m, 1H,CHCH3), 4,08-4,13 (m, 3H,CH2CH3, H-4'), 4,3H,43 (m, 3H,CH,OP H-3'), 6.11-6,19 (m. 1H H-1'), 7,39-7,46 (m, 1 H, ArH), 7,50-7,57 (m. 3H, ArH), 7,68-7,75 (m, 2H, ArH, H-6), 7,86-7,91 {m, 1 H, ArH), 8,15-8,20 (m, 1 H, ArH); 13C NMR (125 MHz. MeOD): ™n 14.4 (CH3), 20.3 (d. 3JCP= 7,4 Hz, CH3), 20,5 (d,<3>JC-<p>=6,2 Hz, CH3), 40,8 (CH2), 40,9 (CH2), 51,8 (CH), 51,9 (CH). 62,4 (CH2), 62,5 (CH;), 67,8 (d,VCP=4,6 Hz, CH,), 67,9 (d,2JCP =4,6 Hz, CH,), 72,0 (CH), 72,1 (CH), 86,7 (d,3JV. P=8,4 Hz, CH), 86,8 (d,'VCP= 8,4 Hz, CH), 86,9 (CH), 87,0 (CH), 116,1(d, 3JCP=3,5 Hz, CH). 116.5 (d, 3JCp=3,5 Hz, CH), 122,6 (CH). 125,4 (CH), 125,5 (CH), 125,7 (CH), 125,8 (CH), 126,1 (CH), 126,2 (CH), 126,5 (CH). 125,6 (CH) , 127,5 (CH), 127.6 (C). 127,7
(C). 127,8 (CH), 127,9 (CH). 128,9 (CH), 129,0 (CH), 136,3 (C), 141,6 (d," JC- f=233,3 Hz, C), 141,7 (d,<1>JCr= 233,4 Hz, C), 147,8 (d,2JC. P=6,9 Hz, C), 148,0 (d,<J>JC-<p>=6,9 Hz, C), 150,6 (C), 159,3 (d,2JCf= 26,3Hz, C), 174,8 (d, 3JCp =
4,8Hz, C), 175,1 (d, 3JC-P = 4,0 Hz, C); m/z (ES) 574 (MNa+, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H?0/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera sa fR30,//min. if„ 31,20 min. (51% : 48%).
5-Fluoro-2'dezoksi uridin-5"-0-[1 -naftil(izopropoksi-L-ala ninil)] fosfat (C PF387)
[0102]
[0103]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,10 g; 0,40 mmol), /erc-butilmagnezijum hlorida u tetrahidrofuranu {'BuMgCI) (1,0 M, 0,61 mL; 0,51 mmol) i l-naftil(izopropoksi-L-alaninil) fosforohloridata (0,31 g; 0,89 mmol) praćenjem opšteg postupka E. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CH2Cl2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (71,0 mg; 17%) [Ri = 0,21 (CH?CI?-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa<*>, 588,1521. C2&H29N3OslNaPF zahteva [MNa<*>], 588,1523); 3,P NMR (202 MHz, MeOD): ™P4.38, 4,58; 19F NMR (470 MHz. MeOD): ™r-167,43, -167,26; 1H NMR (500 MHz, MeOD): ™H 1,19-1,23 (m, 6H, CH(CH3)2), 1,34-1,38 (m, 3H, CHCH3), 1,68-1,84 (m, 1H,H-2'),2,09-2,20 (m, 1H, H-2'), 3.96-4,05 (m, 1H, CHCH,). 4,07-4,12 (m, 1H, H-4'), 4,29-4,38 (m, 2H. CH?OP). 4.39-4,42 <m. 1H. H-3'), 4,93-5.01 (m, 1H, CH(CH3),), 5,10-6,18 (m, 1H,H-1'),7,40-7,46 (m, 1 H, ArH), 7,50-7,57 (m, 3H, ArH), 7,70-7,75 (m, 2H, H-6,ArH),7,87-7,92 (m, 1 H, ArH), 8,16-8,20 (m. 1 H, ArH); 13C NMR (125 MHz, MeOD): ™c20,3 (d, 3JCJ>= 7,1 Hz, CH3), 20,5 (d, 3JC.P= 6,6 Hz. CH3), 21,8 (CH3), 21,9 (CH3), 22.0 (CH3), 22,1 (CH3), 40,8 (CH2), 40,9 (CH2), 51,9 (CH), 52,0 (CH), 67.8(d. 2Jc- P=4,5 Hz, CH2), 67,9 (d,<2>JCP=4,8 Hz, CH,), 70,2 (CH), 70,3 (CH), 72,0 (CH), 72,1 (CH), 86,6 (CH), 86,7 (CH). 86,9 (d,<3>JCP= 8,6 Hz, CH), 87,0(d, 2JC. P= 8,6Hz, CH), 116,2 (d,<3>JC-P= 2,5 Hz, CH), 116,5{d, ~' JC. P=2,7 Hz, CH), 122.6 (CH). 125.5 (CH), 125,7 (CH), 126,1 (CH), 126,2 (CH), 126,5 (CH), 127.5 (CH), 127,6 (C), 127,7 (C), 127,8 (CH), 127.9 (CH), 128,9 (CH), 129,0 (CH), 136,3 (C), 141,6 (d, 1Jcf = 233,2 Hz, C), 141,7 (d, 'Jt, = 233,4 Hz, C), 147,7 (d,2JC. P=7,6 Hz, C), 147,9(d, ' JC- p=7,7 Hz, C), 150.5 (C), 159,4(d. 7Jcr=26,2 Hz, C). 174,4 (d,<3>Jt.P= 5,0 Hz. C), 174,7 (d, 3JC.P= 5.1 Hz, C); m/z (ES) 588 (MNa+, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H20/MeO od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera sa tn32,20 min. i fR32,80 min. (27% : 69%).
5-Fluoro-2'de2oksiuridin-5'-0-[1-naftil{cikloheksoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF509)
[0104]
[0105]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,30 g; 1,21 mmol), N-melilimidazola (NMI)
(0,48 mL; 6,09 mmol) i fenil(cikloheksoksi-L-alaninil) fosforohloridata (1,45 g; 3,65 mmol) prateći opšti postupak D. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CH2CI2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (6,7 mg; 3%) [Rr= 0,47 (CHjCIj-MeOH, 95:5)]; (Utvrđeno: MNH/, 623,2261. Cjel-br^OsNaPF zahteva [MNrV], 623,2282);<31>P NMR (202 MHz, MeOD): ™r4,35, 4,52; "F NMR (470 MHz. MeOD): ™F-167,31, -167,17; 'H NMR (500 MHz, MeOD): ™H 1,30-1,43 (m, 3H, CHCH,), 1,44-1,56 (m, 4H, CH(CH;)6), 1,57-1,66 (m, 1H, CH(CH2)5), 1,67-1,83 (m, 5H, CH(CH?)5), 1,84-1,93 (m, 1H. H-2'), 2,09-2,20 (m, 1H,H-2'),3,98-4,06 (m, 1H, CHCH3), 4,07-1,15 (m, 1H, H-4'), 4,29-4,38 fm, 2H, CH2OP), 4,39^1,44 (m, 1H, H-3'), 4,67-4,76 (m, 1H, CH(CH?)S), 6,09-6,19 (m, 1H. H-1'), 7,38-7,57 (m, 5H, ArH), 7,68-7,75 (m, 1 H, ArH), 7,79-7,92 (m, 1 H, ArH), 8,17 (d, 1H,VH-f =6,6 Hz,H-6);13C NMR (125 MHz, MeOD): ™c20,4 (d, 3JC.P = 8,0 Hz, CH3), 20,6 (d,<3>JCP=6,5 Hz, CH3), 24,5 (CH2), 26,3 (CH2), 32,3 (CH2), 40,8 (CH?), 51,8 (CH), 51.9 (CH). 67,8 (CH2), 72,0 (CH), 72,2 (CH), 75,0 (CH), 86,7 (d, 3Jc.p= 8,2 Hz, CH), 87,0 (CH), 116,1(d, VC.P=2,5 Hz, CH), 116,4 (d, 3JCP= 3,0 Hz, CH), 122,6 (CH), 124,8 (CH), 125,9 (CH), 126,1 (CH), 126,2 (CH), 126,4 (CH), 126,5 (CH), 126,6 (CH), 127,6 (CH), 127,7 (Cx2), 127,8 (CH), 127,9 (CH), 128,9 (CH), 129,0 (CH), 136,3 (C), 141,6 (C), 148,0 (d.?JC-p= 7,2 Hz, C), 150,6 (C), 159,4 (d, 2JCP = 27,0 Hz, C), 175,2 (d,<3>Jc-P=3,9 Hz, C), 175,5 (d, 3JC.P= 3,9 Hz, C); m/z (ES) 623 (MNH,\ 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H?0/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera sa rR 30,50 min. i fR31,48 min. (27% : 69%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[Fenil (benzoksi-a, a-dimetilglicin)] fosfat (CPF393)
[0106]
[0107]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,40 g; 1,62 mmol), /erc-butilmagnezijum hlorida u tetrahidrofuranu (BuMgCI) (1,0 M. 2,43 mL; 2,43 mmol) i fenil(benzoksi-a,a-dimetilglicin) fosforohloridata (1,17 g; 3,20 mmol) praćenjem opšteg postupka E. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CHjCI^MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (69,0 mg; 7%) [Rf = 0,27 (CH2CI2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa*, 600,1527. CjeH^NjOgNaPF zahteva [MNa<*>], 600,1523); 31P NMR (202 MHz, MeOD): Temp 2,42, 2,47;,<S>F NMR (470 MHz, MeOD): ™F-167,80. -167,62; 'H NMR (500 MHz, MeOD): ™« 1,51-1,60 (m, 6H, C(CH3)2, 1,89-1,97 (m, 1H,H-2',jedan dijastereoizomer), 2,07-2,15 (m, 1H,H-2',jedan dijastereoizomer), 2,21 (ddd,1 H, J= 3,4 Hz, 5,9 Hz. 13,5 Hz. H-2', jedan dijastereoizomer), 2,29 (ddd, 1 H, J = 3,2 Hz, 6,1 Hz, 13,5 Hz, H-2', jedan dijastereoizomer), 4,00-4,07 (m, 1H, H-4'), 4,22A31 (m, 2H, CH»OP), 4,32-4,36 (m, 1H, H-3', jedan dijastereoizomer), 4,37-1,41 (m, 1H, H-3', jedan dijastereoizomer), 5,08-5,18 (m, 2H, OCH2Ph). 6.19-6,25 (m, 1H, H-1'), 7,20-7,26 (m, 3H, ArH), 7,27-7,39 (m, 7H, ArH), 7,74 (đ,<3>JH.F= 6,4 Hz. H-6, jedan dijastereoizomer), 7,80 (d,<3>JMF= 6,4 Hz, H-6, jedan dijastereoizomer); 13C NMR (125 MHz, MeOD): ™c27,5 (CH3), 27,7 (d,<3>JCP=7.1 Hz. CH3), 27,8 (d,VC.P=7,1 Hz, CH3), 40,8 (CH2), 40,9 (CH2), 58,2 (C), 58,3 (C), 67,6(d, ?JC-p=5.5Hz, CH2), 67,7 (d,'Jc.F = 5,5 Hz, CH2), 68,3 (CH2), 71,9 (CH), 72,0 (CH), 86,6 (d,<3>J„= 8,1 Hz, CH), 86,8(d, 3JC.P = 7,3Hz, CH), 86,9 (CH), 121,4 (d, VC.P= 4,8Hz, CH), 121,6 (d, 3JC.P=4,5 Hz, CH), 125,6 (CH), 125,8 (CH), 125,9 (CH), 126,1 (CH), 126,2 (CH), 129,3 (CH), 129,4 (CH), 129,6 (CH), 130,7 (CH), 130,8 (CH), 137,2 (C), 137.3 (C), 141,8 (d,, Jc- f=233,7 Hz, C), 150,6 (C), 152,1 (d, 4JC.F = 7,0 Hz, C), 152,1 (d,1 Jc.f =7,6Hz, C), 159,3 (d,* JCr=26,1 Hz, C), 159,4 (d, = 26,1 Hz, C), 176,5 (d, 3JCr = 4,0 Hz, C), 176,6 (d, VCP = 3,8 Hz, C), m/z (ES) 600,1 (MNa+, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H2Q/MeOH od 100/0 do 0/100 u 35 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je jedan pik smeše dijastereoizomera sa /R 17,71 (96%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[fenil(etoksi-a,a-dimetilglicin)] fosfat (CPF394)
[0108]
[0109]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,20 g; 0,80 mmol), N-metilimidazola (NMI)
(0,31 mL; 4,0 mmol) i fenil(etoksi-a,a-dimetilglicin) fosforohloridata (0,73 g; 2,40 mmol) prateći opšti postupak D, Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH;CI2do CH2CI2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (25,0 mg; 6%) [R( = 0,24 (CHjCb-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa<*>, 538,1367. C2,H2TN309NaPF zahteva [MNa<*>], 538,1367);<3>,P NMR (202 MHz, MeOD): ™P2,49. 2,52;,<9>F NMR (470 MHz, MeOD); ™F -167,62, -167,58, 'H NMR (500 MHz, MeOD): ™H 1,24 (t, 3H,J =7,1 Hz, CH2CH3, jedan dijastereoizomer), 1,26 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH2CH3, jedan dijastereoizomer), 1,44-1,54 (m, 6H. C(CH3)2), 1,95-2,04 (m, 1H,H- 2',jedan dijastereoizomer), 2,13-2,21 (m, 1H,H- 2',jedan dijastereoizomer), 2,24 (ddd, 1 H, J = 3,1 Hz,J= 6,3 Hz.J= 13,5Hz. H-2', jedan dijastereoizomer), 2,31 (ddd, 1 H, J = 3,2 Hz,J =6,1 Hz, J = 13,7 Hz, H-2', jedan dijastereoizomer), 4,08^,19 (m, 3H, CH2CH3,H4'),4,33-4,49 (m, 3H,CH2OP H-3'). 6,20-6.30 (m, 1H, H-V), 7,23-7,28 (m, 3H. Ar«), 7,33-7,40 (m, 2H, ArH), 7,80 (d,<3>J„.F=6,4 Hz, H-6, jedan dijastereoizomer), 7,88 (d, 3JM.F = 6,4 Hz,H-6,jedan dijastereoizomer); "C NMR (125 MHz, MeOD): ™c14,4 (CH3), 14,5 (CH3), 27,5 (d,<3>JC-p= 7,3 Hz, CH3), 27,7 (d,<3>JCP=7,6Hz, CH,), 27,8 (d, 3JC.P = 7,6Hz, CH3), 40,8 (CH,), 40,9 (CH2), 58,1 (C), 62,6 (CH?), 62,7 <CH2), 67,6 (d.<?>JC-P= 6,7 Hz, CH2), 67,7 (d,<2>JC.P= 5,8 Hz, CH2), 71,9 (CH), 72,0 (CH), 86,6 (d, 3JCP= 8,1 Hz, CH), 86,8 (d,<3>JCp=7,6Hz, CH). 86.9 (CH), 121,4(d. 3JC. P=4,4 Hz. CH). 121,6 {d, 3JSP= 4,4 Hz, CH), 125,6 (CH), 125,8 (CH), 125,9 (CH), 126,1 (CH), 126,2 (CH), 130,7 (CH), 130,8 (CH), 130,9 (CH). 141,8 (d ,<1>JCF= 233,5 Hz, C), 150,6 (C), 150,7 (C), 152,2 (d.
' JC. F=7,3 Hz. C), 152,3 (d,* JC- r=6,9 Hz, C), 159,2(d, Vc-F=20,3 Hz, C), 159,4(d, ?JC-F=20,4 Hz, C), 176,6 (d,~ Jr,- r =4,2 Hz, C), 176,8 (d. 3JC.P= 4,6 Hz, C), m/z (ES) 538,1 (MNa+, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H20/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera sa fe 18,76 min. ifR20,44 min. (68% : 30%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil(benzoksi-a,a-ditnetilgiicin)] fosfat (CPF395)
[0110]
[0111]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fkioro-2'-dezoksiuridina (0,40 g; 1,62 mmol), Af-metilimidazola (NMI)
(0,64 mL; 8,0 mmol) i 1-naftil(benzoksi- a,a-dimetilglicin) fosforohloridata (2,00 g; 4.80 mmol) prateći opšti postupak D. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CH2CI2-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (16,4 mg; 6%) [R, = 0,15 (CH2CI2-MeOH, 95:5)], {Utvrđeno: MNa<*>, 650,1678. C30H3,N3OsNaPF zahteva [MNa<*>], 650,1680);<3>,P NMR {202 MHz, MeOD): ™p2,S7, 3,03; 1T NMR (470 MHz, MeOD): ™F -167,95, -167,13; 1H NMR (500 MHz, MeOD): ™„ 1,37-1,42 (m, 6H, C(CH3)2), 1,61-1,69 (m, 1H, H-2', jedan dijastereoizomer), 1,79-1,87 (m, 1H, H-2', jedan dijastereoizomer), 2,06 {ddd, 1 H,J =3,0 Hz,J =6,1 Hz,J =13,6 Hz, H-2', jedan dijastereoizomer), 2,15 (ddd, 1 H,J =3,2 Hz,J =5,9 Hz,J= 13,7 Hz,H-2',jedan dijastereoizomer), 3,98-4,04 (m, IH, H4 ), 4,19-4,35 (m, 3H,CH2OP H-3'), 5,09-5,13 (m, 1H, OCHHPh), 5,18-5,19 (m, IH, OCHHPh), 6,05-6,15 (m, 1H,H-1'),7,28-7,40 (m, 7H, ArH), 7,48-7,55 (m, 3H, ArH), 7,62(d, 3JHF =6,4 Hz, H-6, jedan dijastereoizomer), 7,70 (d, Vnf= 6,4 Hz, H-6, jedan dijastereoizomer), 7,86-7,90 (m, 1 H, ArH), 8,17-8,22 (m, 1 H, ArH); ,3C NMR (125 MHz, MeOD): ™c27,5(d, 2JC- p=4,4 Hz, CH3), 27,9 (d, VC.P= 7,3 Hz. CH-,), 28,0(d, 3JCP= 7,3Hz, CH3), 40,7 (CH2), 40.8 (CH2), 65,2 (C), 67,8( d, 2JC- r=6,5 Hz, CH2), 68,3 (CH2), 72,0 (CH), 72,1 (CH), 86,6 (d, 3JCP = 8,2 Hz. CH). 86,8 (d,iJc. P =7,8Hz, CH), 86.9 (CH), 116,3 (d. 3JCP = 3,2 Hz, CH), 116,7 (d,<3>JCP= 2,9 Hz, CH), 122,8 (CH), 122,9 (CH), 125,4 (CH), 125,5 (CH), 125,6 (CH), 126,0 (CH), 126,1 (CH), 126,4 (CH), 126,5 (CH), 127,4 (CH), 127,5 {CH), 127,7 (CH), 127,8 (CH), 127,9 <C), 128,0 {CH), 128,9 (CH), 129,3 (CH), 129,4 (CH), 129,6 (CH), 136,2 (C), 137,3 (C), 141,8 (d,'JCP=234,4 Hz, C), 147,9 (d, VCiP=7,7 Hz, C), 148,0 (d,<3>JCp= 8,2 Hz, C), 150,7 (d.<V>c.r =3,7 Hz, C), 159,5 (d, 2Jcf = 25,8 Hz, C). 159,6 (d, ?JCf = 25,8 Hz, C), 176,5 (C), 176,6 (C), m/z (ES) 650,0 (MNa+,
100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H20/MeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je dva pika dijastereoizomera satK 20,80min. i fR21,00 min. (72% . 24%).
5-Fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil(etoksi-a,a-dimetilglicin)] fosfat (CPF396)
[0112]
[0113]Fosforoamidat je dobijen upotrebom 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,40 g; 1,62 mmol), ferc-butilmagnezijum hlorida u tetrahidrofuranu ('BuMgCI) (1,0 M, 2,43 mL; 2,43 mmol) i 1-naftil(etoksi-a,a-dimetilglicin) fosforohloridata (1,14 g; 3,20 mmol) praćenjem opšteg postupka E. Prečišćavanjem gradijent hromatografijom na koloni eluiranjem sa CH2CI2do CHjCI?-MeOH (95:5) dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (54,0 mg; 2%) [R, = 0,10 (CH?CI2-MeOH, 95:5)], (Utvrđeno: MNa', 588,1528. C25H25N309NaPF zahteva [MNa<*>], 588.1523); 3,P NMR {202 MHz, MeOD): ™P 2,91, 3,03; 19F NMR (470 MHz, MeOD): ™F-167.38, -167,21; 1H NMR (500 MHz, MeOD): ™n1,24 (t, 3H,J= 7,1 Hz, CH2CH3, jedan dijastereoizomer), 1,25 (t, 3H,J= 7,1 Hz, CH2CH3, jedan dijastereoizomer), 1,50-1,55 (m, 6H, C(CH3)2), 1,68-1,76 (m, 1H, H-2', jedan dijastereoizomer), 1,87-1,94 (m, 1H, H-2', jedan dijastereoizomer), 2,09 (ddd, 1 H, J = 2,9 Hz,J =6,3 Hz,J =13,4 Hz, H-2' jedan dijastereoizomer), 2,19 (ddd, 1 H, J = 3,0 Hz,J =6,3 Hz,J =13,8Hz, H-2', jedan dijastereoizomer). 4,07-4.10 (m, 1H, H-4 ). 4,16 {q. 2H.J =7.1 Hz, CH2CH3), 4,36-4,41 (m, 3H,CH?OP H-3'), 6,10-6.18 (m, 1H,H-1'),7,40-7,46 (m, 1 H, ArH), 7,50-7,59 (m, 3H. ArH), 7.66-7,72 (m, 2H, ArH, H-6), 7,85-7,91 (m, 1 H, ArH), 8.18-8,24 (m, 1 H, ArH); ,3C NMR (125 MHz, MeOD): ™c14,4 (CH3), 27,5 (br s, CH3), 27,9(d. Vn. P =6,1 Hz, CH3), 28,0(d, 2JC- p = 6,1Hz. CH3), 40,7 (CH;), 40,8 (CH2), 58,2 (C), 58.3 (C), 62,6 (CH2), 67,8(d, 7JC. P= 4,9Hz, CH2), 67,9 (d,?JC-p = 4,5 Hz, CH2), 72,0 (CH), 72,1 (CH), 86,7(d, 2JC- P= 7,7Hz, CH), 86,9(d, 3Jc<p>=7,3 Hz, CH), 87,0 (CH), 116,3 (d, 3J0P = 3,2 Hz, CH), 116,6(d, 3Jc- p =2,9 Hz, CH), 122,8 (CH). 122,9 (CH), 125,4 (CH), 125,6 (CH), 125,7 (CH), 126,0 (CH), 126,1 (CH), 126,5 (CH). 127,4 (CH), 127,5 (CH), 127,7 (CH), 127,8 (CH), 127.9 (C), 128.0 (C), 128,9 (CH), 136,2 (C), 141,8 (d, VC.F= 233.5 Hz, C), 148,0 (d,?JC.P =7,3 Hz. C). 148,1 (d,2Jc- P=7,6Hz, C), 150,5 (C), 150,6 (C), 159.3 (d,2JCF=26,2 Hz, C), 159,4 (d, !JCJ-= 26,6 Hz, C), 176,8 (C), 176,9 (C); m/z (ES) 588,1 (MNa+, 100%); reverzno-fazni HPLC eluiranjem sa H2OZMeOH od 100/0 do 0/100 u 45 minuta, 1 mL/min, L = 275 nm, pokazao je jedan pik smeše dijastereoizomera sa tR 16,05 min. (96%).
5-Fluoro-2"-dezoksiuridin-5'-0-[fenil(benzoksi-L-prolinil)] fosfat (CPF583)
[0114]
[0115]Pripremljeno standardnom procedurom D od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), NMI (0,41 g; 5,07 mmol, 0,40 mL) i fenil(benzoksi-L-prolinil)-fosfohloridata (0,77 g: 2.03 mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni prećenoj prečišćavanjem u dva preparativna TLC-a dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,010 g; 2%),
<31>P-NMR (MeOD, 202 MHz) 5 1,82
,<9>F-NMR (MeOD, 470 MHz) 5 - 167,91
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 7,84 (d, J^7,18 Hz, 1 H, H-baza), 7,39 - 7,33 (m. 7H, H-Ar), 7,22 - 7.19 (m, 3H, H-Ar), 6,26 - 6,23 fm, 1H,H-1<1>),5,22 - 5,13 (m. CH2Ph estar), 4,40 - 4,35 {m, 3H, NCH. 2 x H-5'), 4,33 - 4,28 (m, 1H, H-3'), 4,06-4,04 (m, 1H, H-4'). 3,36 - 3,32 (m. 2H, NCH2), 2,26 - 2,19 (m, 1H, H-21), 2,18 - 2,13 <m, 1H,CH2-L-Pro), 2,00 - 1,81 (m, 4H, 3xH, C/vL-Pro, 1 x H, H-2')
"C-NMR (MeOD, 125 MHz) 5 174,81 (C=0, estar), 159,40 (C=0, baza), 152,0(d, JJCP =6,32 Hz, OC-Ar), 150,71 (C=0 baza), 141,88('JC-f =232 Hz, CF, baza), 137,23 (C-Ar), 131,33, 129,70, 129,48, 129,45, 129,30, 126.45 (CH-Ar). 125,80, 125,53 (2 x d,<2>JCF=29,0 Hz, CH-baza). 121,00, 120,96 (CH-Ar), 87,80 (C-1'), 86,80 (C-4'), 72.02 (C-3'), 68,16 (CH2Ph), 67,64 (d,2JC. P = 4,65Hz, C-5'), 62,40 (d,<2>Jcf== 5,60 Hz, NCH). 48,03 (d,2JC. P=4,80 Hz, NCH?), 41,07 (C-2'), 32,18, 32,11 (CH2-L-Pro), 26,29, 26,21 (CH2-L-Pro).
MS (ES+) m/e: 612 (MNa+, 100%), 590 (MH+. 1%) Precizna masa: za C^H^FNjOsP, potrebno 589,51.
5-Fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1 -naftil(bertzoksi-L-prolinil)] fosfat (CPF577)
[0116]
[0117] Pripremljen standardnom procedurom D od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol). NMI (0,41 g; 5,07 mmol, 0,40 mL) i 1-nafti!(benzoksi-L-prolinil)-fosfohloridata (0,84 g: 2.03 mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni prećenoj prečišćavanjem u dva preparativna TLC-a dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,006 g; 1%),
<31>P-NMR (MeOD, 202 MHz) 5 2,27
"F-NMR (MeOD, 121 MHz) 6 - 167,46
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 8,14 - 8,12 (m, 1H, H-Ar), 7,90 - 7,89 (m, 1H, H-Ar), 7,74 - 7,71 (m, 2H, 1 xH- Ar,1 x H-baza), 7,56 - 7,42 (m. 4H, H-Ar), 7,36 - 7,33 (m, 5H, H-Ar), 6.13 (t, J = 6,38 Hz, H-1<1>), 5,22 - 5,13 (m, 2H, CH2Ph), 4.49 - 4,46 (m, 1H, NCH), 4.42 - 4,33 (m, 2H, H-5'), 4,25 - 4,23 (m, 1H, H-3'). 4,06 - 4,04 (m, 1H,H-4'),3,36 - 3,34 (m, 2H, NCH?), 2,23-2,15 (m, 1H, CHj-L-Pro), 2,10 - 2,02 (m, 2H, 1 x H, CH2-L-Pro, 1 x H, H-2'). 1,97- 1,77 (m, 2H. CH2-L-Pra). 1.63 - 1,57 (m, 1H, H-2')
"C-NMR (MeOD, 125 MHz) o 174,82 (C=0, estar), 159,52 (C=0. baza), 150,54 (CO, baza), 147,84, 147,78 (d,2JC- r= 6,03 Hz, OC-Ar), 141,75, 139,97 (2 x d, UCr= 232 Hz, CF. baza), 137.20. 136.34 (C-Ar), 129,76, 129,65. 129.44, 129,36, 129,27, 129,06, 128,95, 128,04, 128,75, 126,56 (CH-Ar), 125.41 (d,<2>JCF= 30,0 Hz, CH-baza), 122,13 (CH-Ar), 115,76(d, 3Jcp=3,3 Hz, CH-Ar). 87,06 (C-1 ), 86,79 (C-4'), 72,23 (C-3'), 68,15 (d,<?>JCP= 5,45 Hz, C-5'), 68,08 (CH5Ph), 62,53 (d, 2JC.P = 5,60 Hz, NCH), 48,26 (d,<2>JCp= 5,34 Hz, NCH2), 40,97 (C-2'), 32,16, 32,09 (CH2L-Pro), 26.22, 26,15 (CH2-L-Pro).
5-Fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil(3,3-dimetil-1-butoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF585)
[0118]
[0119]Pripremljen standardnom procedurom D od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), NMI (0,41 g; 5.07 mmol, 0,40 mL) i 1-naftil-(3,3-dimetil-1-butoksi-L-alaninil)-fosfohloridata (1,21 g; 3,04 mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni prećenoj prečišćavanjem u dva preparativna TLC-a dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,010 g; 2%),
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) 5 4,48, 4,33
"F-NMR (MeOD, 470 MHz) 6- 167,30, - 167,47
<1>H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 8,20 - 8,17 (m, 1H, H-Ar), 7,91 - 7,89 (m, 1H, H-Ar), 7,77 - 7,72 (m, 2H, H-Ar), 7,58 - 7,51 (m, 3H, H-baza, 2 x H-Ar), 7,46-7,41 (2 x t, 1H, J = 7,8 Hz, H-Ar), 6,19- 6,13 (m, 1H, H-1'), 4,42 - 4,40 (m, 1H, 1 x H-5'), 4,38-4,32 (m, 2H, H-3', 1 x H-5'), 4,14 - 4,00 (m, 4H, H-4', CHCH3, OCH2CH2(CH3)3). 2,21 -2,13 (m, 1H, 1 xH-2'),1,91-1,76 (m, 1H, 1 x H-2';,1.52 - 1,48 (m, 2H, OCH2CH2(CH3)s), 1,37 - 1,35 (m, 3H, CHCH3), 0,92, 0,91 (2 x s, 9H, OCH2CH2(CH3)3)
"C-NMR (MeOD, 125 MHz) 5 175,16, 174,84 (2 x d,<3>JCP =4,75 Hz, C=0, estar), 159,56, 159,35 (C-O, estar), 150,61 (CO, estar), 148,00, 147,86 (2 x d, 2JC-f = 6,25 Hz, OC-Ar), 141,78, 141.73 (2 x d, 'Jc.f = 232 Hz, CF, baza), 136,28 (C-Ar), 128,98, 128,95, 127,92, 127,90, 127,58, 126.57. 126.20, 126,14 (CH-Ar), 125.63. 125.55(2 xd. 2Jcr = 34 Hz,CH,baza), 122,65, 122,63 (CH-Ar), 116,48, 116,15 (2 x d, 3Jc.p = 3,0 Hz, CH-Ar), 87,01, 86,94 (C-1 ), 86,73, 86,68 (d, :,J&P= 7,75 Hz, C-4'), 72,18, 72,07 <C-3'). 67.87, 67,85 (2 x d,5JC.P =5,0 Hz, C-5'), 64,08, 64,05 (OCHjCH;(CH3)3), 51,86 (d, Vc<p>- 5.5 Hz, CHCH3), 42,74 (OCH2CH2(CH3)s), 40,91, 40,83 (C-2'), 29,96 (OCH3CH2(CH3)3), 20,50, 20,34 (2 xd, 3JC.P=6,5 Hz, CHCHj).
MS(ES+) m/e: 630 (MNa+, 100%), 608 (MH+, 10%) Precizna masa: za CHsH3bFN3OsP, potrebno 607,56.
5-Fluoro-2--dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(cikfobutoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF578)
[0120]
[0121]Pripremljen standardnom procedurom D od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,23 g; 0,93 mmol), NMI (0,38 g; 4,67 mmol, 0,37 mL) i 1-naftil-(ciklobutoksi-L-alaninil)-fosfohloridata (0,85 g; 2,33 mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni prećenoj prečišćavanjem u dva preparativna TLC-a dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,010 g; 2%),
3,P-NMR (MeOD, 202 MHz) 5 4,54, 4,36
"F-NMR (MeOD, 470 MHz) 6- 167.12, -167,29
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 8,18 - 8,17 (m, 1H,H- Ar),7,81- 7,87 (m, 1 H, H-Ar), 7,74 - 7,71 (m, 2H, 1 x H-Ar, 1x H-baza), 7.60 -7,53 (m, 3H, H-Ar), 7,46 -7.43 (2 x t, J = 8,0 Hz, 1H, H-Ar), 6,18-6,12 (m, 1H, H-1'), 5,00 -4 95 (m, 1 H, OCH estar), 4,41 - 4.36 (m, 3H, 2 x H-5',H-3'),4,11 - 4,00 (m, 2H,H-4',CHCH3), 2,36 - 2,27 (m, 2H,CH,},2,18 - I, 98 (m, 3H,CH2estar, 1 xH- 2'), 1,82 - 1,56(m, 3H,CH,estar,1 xH- 2'), 1,36 - 1,34(m, 3H, CHCH3)
,JC-NMR (MeOD, 125 MHz) 5 175,97, 173,34 (C=0, eslar), 159,88 (C=0. baza), 151,64 (C=0, baza), 146,58 (OC-Ar). 141.15(d. 1JCF=220 Hz. CF, baza). 136.28 (CAr), 128,93, 127,89, 127,54, 126,52, 126,18, 126,14 (CH-Ar), 125,53, 125,44 (2 x d, 2JCF = 32,5 Hz, CH-baza), 122,63 (CH-Ar), 116,46, 116,44 (2 x d, 3JC-p = 2,5 Hz, CH-Ar), 86,98 (d,<3>Jcp= 6,25 Hz, C-4'), 86.71( C- V),72,14, 72,04 (C-3'), 71,07 (OCH estar), 67.83 (d,2Jc. p=7.38 Hz. C-5'}, 51,66 (d,<2>JCp= 8,75 Hz, CHCHj), 40,89, 40,83 (C-2'), 31,03 (OCHCH2), 20,43 (CHCH3), 14,23 (CH; estar).
MS (ES+) m/e: 600 (MNa+, 100%), 578 (MH+, 10%) Precizna masa: za CKH2aFN3OaP, potrebno 577,50.
5-Fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(ciklopropilmetanoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF579)
[0122]
[0123]Pripremljen standardnom procedurom D od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), NMI (0,41 g; 5.07 mmol, 0,40 mL) i 1-naftil-(ciklopropilmetanoksi-L-alaninil)-fosfohloridata (0,93 g; 2,54 mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,056 g; 10%).
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) č 4,58, 4,30
"F-NMR (MeOD, 470 MHz) 5 -167,18, -167,22
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 8,18 (d,J = 7,0 Hz,1H, H-Ar), 7,89 - 7,87 (m, 1H, H-Ar), 7,73-7,70 (m, 2H, H-Ar), 7,58 - 7,53 (m, 3H. H-Ar), 7,45 - 7,40 (2 x t,J= 8,0 Hz, 1H, H-Ar), 6,17 - 6,11 (m, 1H, H-1'}, 4,43 - 4,41 (m, 1H,H-5'),4.38 -4,32 (m, 2H, H-5', H-3'), 4,11 - 4,04 (m, 2H, H-4', CHCH3), 3,95- 3,85 (m, 2H, OCH,estar), 2,19-2,11 (m, 1H.H 2'),
1.84 - 1,72 (m, 1H, H-2'), 1,38, 1,36 (2 x d,J =5,0 Hz. 3H. CHCH3), 1,15 - 1,07 (m. 1H, OCH2CH estar), 0,59 - 0,50 (m, 2H, CH?estar), 0,30 - 0,24 (m, 2H, CH2estar)
,<3>C-NMR (MeOD, 125 MHz) 5 175,25, 174,94 (2 x d, 3JCP= 4,75 Hz, C-O, estar), 159,54, 159,35 (C=0, baza), 150,60, 150,56 (C=0, baza), 148,05, 147,86 (2 x d,<2>JC-P- 7,5 Hz, OC-Ar), 141,79, 141,73 (2 xd, ' Jvf■=232 Hz, CF, baza), 136,29 (C-Ar), 128,94 (d,3Jc- r =4,4 Hz, CH-Ar), 127,89 (d,<JC. P =3,7 Hz, CH-Ar), 127,56, 126,55, 126,52, 126,19, 126,16 (CH-Ar), 125,64, 125,53{ 2JC. F =34 Hz. CH-baza), 122,65 (CH-Ar), 116,54, 116,24 (2 x d,lJc- r =2,6 Hz, CH-Ar), 87,04, 86.99 (C-1'), 86,90, 86,73 (2 xd, 3Jcf> =7,1 Hz, C-4'), 72,18, 72,07 (C-3), 71,21, 71,18 (OCH2, estar), 67,87, 67,84 (prividan t,' JC. P =5,0 Hz, C-5'), 51,88 (d,2JC! > =10,0 Hz, CHCH3), 40,91.40,83 (C-2 ), 20.60.20,46 (2 xd, 3Jc.p=6,5 Hz, CHCH3), 10,69 (OCH?CH estar), 3,70, 3,65 (2 x CH2, estar).
MS (ES+) m/e: 600 (MNa<*>, 100%), 578 (MH+, 15%) Precizna masa: za C!6HMFN30,P, potrebno 577,50. HPLCs(H20/acetonitril od 100/0 do 0/100 u 35 min) Rt 12,91 min.
5-Fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(tetrahidropiroksi-L-a[aninil)] fosfat (CPF580)
[0124]
[0125]Pripremljen standardnom procedurom E od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), rBuMgCI (1,1 ml; 1,1 mmol) i 1-naftil-(tetrahidropiroksi-L-alaninil)-fosfohloridata (0,80 g; 2,03 mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni prećenoj prečišćavanjem u dva preparativna TLC-a dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0.010 g; 1,6%).
3,P-NMR (MeOD, 202 MHz) 5 3,77, 3,22
"F-NMR (MeOD, 470 MHz) 5 - 168,27, -168,35
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 8,60 (d,J= 7,0 Hz, 2H, H-Ar), 8,22 - 8,19 (m, 1H, H-Ar), 7,92 - 7,91 (d,J = 5,50 Hz, 1H, H-Ar), 7,60 - 7,45 (m. 4H. H-ar, H-baza). 6,29 - 6,25 (m, 1H, H-1'). 5,25 - 5,17 (m, 1H, H-3'), 4,96 - 4,87 (m, 1H,H-estar), 4,28 - 4,26 (m, 1H, H-4'), 4,11 - 4,03 (m, 1H, CHCH_3), 3,88 - 3,66 (m, 4H, 2 xOCH2A .star,2 xH-5'),3,55 - 3,50 (m, 2H, 2 x OCH,a-, estar), 2,63 - 2,30 (m, 2H,H-2'),1.91 - 1,85 (m, 2H. 2 x CH* estar), 1.65 - 1.54 (m, 2H. CH2b-estar), 1.39- 1,35 (m, 3H, CHCH3),
"C NMR (MeOD, 125 MHz) 5 174,34 (C=0, estar), 159,24 (C=0, baza). 150,76 (C=0, baza). 148,03 (oC-Ar), 141,97 (d, 'Jc-F= 238 Hz.CF, baza), 136,37 (C-Ar), 128,97, 128,56, 127,61, 127,57, 126,58, 126,23, 126,16, 126,12, 125,84 (CH-Ar), 122,70 (d,<2>Jc-F= 24,0 Hz, CH-baza), 116,62, 116,37 (CH-Ar), 87,54(d, 3Jc-p=5,40 Hz, C-4'). 86,60, 86,57(C-1'),79,82, 79,47 (C-3 ), 71,45 (CH-estar), 66.12, 66,08 (2 x OCH?a estar), 66,02 (C-5'), 51,83 (CHCH3), 39,97, 39,94 (C-2 ), 32,65, 32,57 (2 x CH?„estar), 20,45, 20,30 (CHCH3).
MS (ES+) m/e: 630 (MNa<*>, 100%), 608 (MH+, 10%) Precizna masa: za C^H^PNjOmP. potrebno 607,52.
5-Fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(pentoksi-L-alaninil)J fosfat (CPF581)
[0126]
[0127]Pripremljen standardnom procedurom E od 5-fruoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), /BuMgCI (1,1 mL; 1,1 mmol) i 1-naftil-(pentoksi-L-alaninil)-fosfohloridata (0,78 g; 2,03 mmol) u THF (10 mL), Prečišćavanjem hromatografijom na koloni dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,047 g; 8%).
31P-NMR (MeOD, 202 MHz) 5 4,48, 4,32
"F-NMR (MeOD, 470 MHz) 5 -167,18, -167,29
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 8,25 - 8,17 (m, 1H, H-Ar), 8,05 - 7 95 (m, 2H, H-Ar), 7.85 - 7,60 (m, 2H, H-Ar, H-baza), 7,65 - 7,48 (m, 3H, H-Ar), 6,30 - 6,18 (m, 1 H, H-V), 4,60 - 4,37 (m. 3H, 2 xH-5<1>,H-3'), 4,28 - 4,00 (m, 4H,HA\CHCH3, OCH2CH2CH2CH2CH3), 2,32 - 2,12 (m, 1H,H- 2'),1,95 - 1,75 (m, 1H,H- 2),1,70 - 1,55 (m, 2H, OCH2CH;CH2CH?CH3), 1,50 - 1,28 (m, 7H, 4 x H OCH?CH?CH?CH2CH3KBCH3), 0,83, 0,82 (2 x d,J= 7,9Hz, 3H, OCH?CH2CH2CH2CH3)
,<3>C-NMR (MeOD, 125 MHz) 5 175,22, 174,91 (OO, estar), 159,5 (C=0, baza), 150,54 (C=0, baza), 147,90. 147,88 (OC-Ar), 141,75 (d,'JC-F =225 Hz, CF, baza), 136,37 (C-Ar), 128,95, 127,90, 127,56, 126,55, 126,19 (CH-Ar), 125,64, 125,53 (2 x d,2JC. F =34,0 Hz, CH-baza), 122,65 (CH-Ar), 116,51, 116.21 (CH-Ar), 87,03, 86,96 (C-1<1>), 86,85, 86,74 (C-4'), 72,16, 72,05 (C-3 ), 67,87 (d,<;>JCP= 5,0 Hz, C-5'), 66,54 (OCH2), 51,87, 51,81 (d,2JC. P =7,5 Hz, CHCH3). 40,87, 40,80 (C-2'), 29,35, 29,10 (CH? estar), 23,33 (CH?estar), 20,60, 20,43 (2 x d,<3>JC-p= 6,5 Hz, CHCH3), 14,28 (CH3, estar).
MS (ES+) m/e: 616 (MNa<*>, 100%), 594 (MH+, 10%) Precizna masa: za C37H33FN3OsP, potrebno 593,54. HPLCb(H?0/acetonitril od 100/0 do 0/100u35 min) Rt 15,55 min.
5-Fluoro-2"-dezoksiuridin-5'-0-[1 -naftil-(ciklopentoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF582)
[0128]
[0129]Pripremljen standardnom procedurom E od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), /BuMgCI (1,1 mL; 1,1 mmol) i 1-naftil-(ciklopentoksi-L-alaninil)-fosfohloridata (0,77 g; 2,03 mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,030 g; 5%).
<3>,P-NMR (MeOD, 202 MHz) 5 4,53, 4,37
"F-NMR (MeOD, 470 MHz) 6 - 167.07, -167,19
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 8,18 - 8,16 (m, 1H, H-Ar). 7.89 - 7,85 (m, 1H, H-Ar), 7,70 (prividan t,J= 6,50 Hz. 2 H, H-Ar), 7,57 - 7,50 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-baza), 7,45 - 7,40 (m, 1 H, H-Ar), 6,16 - 6,11 (m, 1H,H-1'),5,15 - 5,09 (m, 1H, OCH estar), 4,41 -4,30 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4,11 - 4,08 (m, 1H, H-4'), 4,04 - 3,98 (m, 1 H.CHCHj), 2,19 - 2,10 (m, 1 H, H-2';, 1,86 - 1,73 (m, 3H, OCHCH? estar), 1,73 - 1,56 (m, 6H,H2', CH? estar),1,35. 1,34 (2 x d,J= 6,57 Hz, CHCH3)
"C-NMR (MeOD, 125 MHz) 5 174,68, 174,64 (C=0, estar), 159,27 (C=0, baza), 150,51 (C=0, baza), 147,86 (d,2JC. P =7,5 Hz, OC-Ar), 141,78, 141,72 (2 x d,Vc-f =232 Hz, CF-baza), 136,30 (C-Ar), 128,95, 128,54, 127,94, 127,80, 127,60, 127,56, 127,17, 126,80, 126,54, 126,19, 126,16 (CH-Ar), 125,66, 125,53 (2 x d, 7JCF = 34 Hz, CH-baza),
122,65, 122,61 (CH-Ar), 116,53, 116,22 (2 x d, VCP= 3,75 Hz, CH-Ar), 86,99, 86,96 (C-V), 86,70 (d, 3JCP= 7,50 Hz, C-4'), 79,64, 79,61 (OCH estar), 72.21, 72,07 (C-3'), 67,89, 67,85 (2 x d,<!>JCP= 5,0 Hz, C-5'), 51,92 (d,lJc. P =5,0 Hz, CHCH3), 40,92,40,86 (C-2'), 33,65, 33,61, 33,52, 33,47 (2 x CH3 estar), 24,68, 24,66(CH2estar),20,45, 20,30 (2 x d,Vc-p=6,25 Hz,CHCH3).
MS (ES+) m/e: 614 (MNa", 100%), 592 (MH+, 30%) Precizna masa: za C?,H31FN3OsP, potrebno 591,52. HPLCt,(H20/acetonitril od 100/0 do 0/100 u 35 min) Rt 14,03 min.
5-FIuoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1 -naftil- (2-indanoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF597)
[0130]
[0131]Pripremljen prema standardnoj proceduri E od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,30 g; 1,22 mmol), (BuMgCI (1,34 mL; 1,34 mmol) i 1-naftil-(2-indanoksi-L-alaninil)-fosfohloridat (1,06 g; 2,43 mmol) u THF (20 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,045 g; 6%).
"P-NMR (MeOD, 202 MHz) 6 4,62, 4,30
<19>F-NMR (MeOD. 470 MHz) 6 - 167,14, - 167,34
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 6 8,15-8,12 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7,89 - 7,87 (m, 1H, HAr, Naph), 7,72 - 7,67 (m, 2H, H-Ar, Naph), 7,56- 7,46 (m, 3H, 2x H- Ar. H-baza),7.40 - 7,37 (m, 1H, H-Ar), 7,20 - 7,12 (m,4H, H-Ar. Ph), 6,14 - 6,08 (m,1H, H-1'),5,49- 5,46 (m, 1H, OCH estar), 4,32 - 4,26 (m, 3H, 2 x H-5', H-3'), 4 04 - 3,98 (m, 1 H, H-4', CHCH3), 3,30 - 3,24 (m,2H, 2 xCH estar), 2,99-2,91 (m, 2H, 2xCHestar), 2,14-2,07 (m, 1H,H-2'), 1.75- 1,64 (m, 1 H, H-2'), 1,33- 1,29 (m, 3H, CHCH3)
<13>C-NMR (MeOD, 125 MHz) 5 175,02, 174,66 (2 x d.<3>JCJ.=3,75 Hz,C=0, estar), 159,48[ 7Jc. e=25,0 Hz. C=0. baza), 150,57 (C=0, baza), 147,97, 147,80 (2 x d, 2JCP = 7,5 Hz, OC-Ar), 141,73, 141,68 (2 x d, Vc-f= 232,5 Hz, CF-baza), 141,54, 141,49, 141,48, 139,10, 136,27, 136,26 (C-Ar), 129,01, 128,94, 128,91, 127,91, 127,87, 128,85. 127,80, 127,77, 127,60, 127,57, 127,50, 126,20, 125,18, 125,69 (CH-Ar), 125,50, 125,43 (2 x d,<?>Jcf=25 Hz, CH-baza), 122,64, 122,60, 121,85 (CH-Ar), 116,57, 116,26 (2 xd, VC.P=2,5 Hz, CH-Ar), 86,96 ( C- V), 86,87, 86,66 (2 x d, 3JC.P = 7,50 Hz, C-4'), 77,85, 79. (OCH estar), 72,21, 72,07 (C-3'), 67,77, 67,75 (2 x d, 2JC-p = 6.25 Hz, C-5'), 51,97, 51,82 (CHCH3), 40,91, 40,86 (C-2'), 40,44, 40,43, 40,38, 40,34 (2 x CH?estar), 20,30, 20,16 (2 xd, VC. P=6,25 Hz, CHCH3)
5-Fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[fertil- (benzoksi-L-metioninil)] fosfat(CPF586)
[0132]
[0133]Pripremljen standardnom procedurom D od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), NMI (0,41 g; 5,07 mmol, 0,40 mL) i fenil-(benzoksi-L-metioninil)-fosfohloridata (0,7 g; mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni dobijeno je jedinjenje iz naslova kao žućkasta čvrsta supstanca (0.014 g; 2%)
3,P-NMR (MeOD, 202 MHz) 5 4,34, 3,94
"F-NMR (MeOD, 470 MHz) 5 - 167,40, - 167,69
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 7,83 - 7,80 (m, 1H, H-Ar), 7,74 - 7,72 (m, 1H, H-Ar), 7,64 - 7,62 (m, 1H, H-Ar), 7,37 - 7,32 (m, 6H, H-ar, H-baza), 7,26 - 7,17 (m, 2H, HAr), 6,25 - 6,17 (m, 1H,H-1'),5,18, 5,13 (AB sistem, JAB= 12,0 Hz, 2H, CH2Ph), 4,40 - 4,35 (m, 1H, H-3'), 4,32 - 4,22 (m, 2H, H-5 ), 4,16 - 4,03 (m, 2H, NHCH, H-4'), 2,44, 2,36 (2 x t,J= 7,50 Hz, CH;S), 2,18 - 2,08 (m, 1H, 1 x H-2'), 1,98 - 1,82 (m, 6H, 1 x H-2', NHCHCH?CH2SCH3),
MS (ES+) m/e: 646 (MNa', 100%), 624 (MH+, 10%) Precizna masa: za C2,H3,FN309PS potrebno 623,56.
5-Fluoro-2'-dezoksiurtdin-5'-0-[1-naftil- (benzoksi-L-fenilalaninil)] fosfat (CPF5B7)
[0134]
[0135]Pripremljen standardnom procedurom D od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol),NMI(0,41 g; 5,07 mmol, 0,40 mL) i 1-naftil- (benzoksi-L-fenilalaniniljVfosfohbridata (1,45 g; mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,007 g; 1%).
<3>'P-NMR(MeOD, 202 MHz) 5 4,27, 4,14
"F-NMR (MeOD, 470 MHz) 5 - 166,99, - 167,18
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 5 8,11 - 8,00 (m, 1H, H-Ar, Ar), 7,89 - 7,85 (m, 1H, H-Ar), 7,69 - 7,67 (m, 1H, H-Ar), 7,60 - 7,49 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-baza), 7,37 - 7,33 (m, 2H, H-Ar), 7,25 - 7,12 (m, 10H, H-Ar), 6,09 - 6,04 (m, 1H, H-1'), 5,11 - 5,01 (m,2H, CH2Ph), 4,29- 4,18 (m, 1H, CHCHj), 4,15 - 4,08 (m, 1H, H-3 ), 4,02-3,95 (m. 2H. H-5'), 3,86-3,67 (m, 1H, H-4'), 3,14-3.10 (m, 1H, 1 x NHCHCH2Ph), 2,91 -2,82 (m, 1H. 1 x NHCHCH2Ph), 2,12-2,06,2,00- 1,95 (2xm. 1H, H-2'), 1,68- 1.62, 1,42- 1,36 (2 x m, 1H.H-2')
5-Fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(2,2-dimetilpropoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF588)
[0136]
[0137] Pripremljen standardnom procedurom D od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), NMI (0,41 g, 5,07 mmol, 0,40 mL) i 1-naftil-(2,2-dimelil-L-alaninil)-fosfohloridata (0,77 g; mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,006 g; 1%).
3'P-NMR (MeOD, 202 MHz) 6 4,56,4,33
'T-NMR (MeOD, 470 MHz) 5 - 167.32, - 167,43
'H-NMR (MeOD. 500 MHz) 5 8,19-8,16 (m, 1H, H-Ar, Ar). 7,91 - 7,89 (m, 1 H, H-Ar), 7,74 - 7,71 (m, 2H. H-Ar), 7.57
- 7,51 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-baza), 7,46 - 7.41 (m, 1H, H-Ar), 6,17 - 6,10 (m, 1H, H-1'), 4,42 - 4,30 (m, 3H, H-3', 2 x H-5'), 4,13-4,07 (m, 2H, H-4', CHCH3), 3,86. 3,75 (AB sistem, JAB= 10,50 Hz, 2H. CH?C(CH3)3), 2,18-2,10 (m, 1H,H-2 ), 1,81 - 1,70 (m, 1H, H-2'), 1,41 - 1,38 (m, 3H, CHCHs). 0,95, 0,94 (2 x s, 9H, CH2C(CH3)3)
5-Fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(butoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF589)
[0138]
[0139]Pripremljen standardnom procedurom D od 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (0,25 g; 1,01 mmol), NMI (0,41 g; 5,07 mmol, 0,40 mL) i 1-naftil-(butoksi-L-afaninil)-fosfohloridata (0,75 g; mmol) u THF (10 mL). Prečišćavanjem hromatografijom na koloni dobijeno je jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (0,006g, 1%).
3,P-NMR (MeOD, 202 MHz) 6 4,52, 4,35
"F-NMR (MeOD, 470 MHz) 5- 167,36, - 167,49
'H-NMR (MeOD, 500 MHz) 6 8,19 - 8.16 (m, 1H, H-Ar, Naph), 7,1 - 7,89 (m, 1 H, HAr, Naph). 7,75 - 7,72 (m, 2H,H-Ar, Naph), 7,58 - 7,51 (m, 3H, 2 x H-Ar, H-baza), 7,46-7,41 (m, 1H, H-Ar). 6,18 - 6,11 (m, 1H, H-1 ), 4,42-4,40 (m, 1H, 1 x H-5'), 4,37-4,32 (m, 2H, 1 x H-5', H-3'), 4,12-4,01 (m, 4H.H^4\ CHCH3, OCH;CH?CH2CH3),2.20-2,12 (m, 1H, H-2'), 1,85 - 1.73 (m, 1H. H-2'), 1,61 - 1,54 (m, 2H, OCH2CH2CH?CH3), 1,39 - 1,31 (m, 5H, OCH2CH;CH2CH3, CHCH3), 0,93 - 0,89 (m, 3H, OCH2CH2CH2CH3)
Biološki testovi
[0140]Eksperimentalni podaci koji se odnose na jedinjenja implementirana predmetnim pronalaskom opisani su u tekstu koji sledi.
Ćelijske kulture
[0141]Kultura ćelija mišje leukemije L1210/0 i humani T-limfociti CEM/0 nabavljeni su od firme Američka kolekcija kultura ćelija (ATCC od eng. American Type Culture Collection) (Rockville, MD). Humane glioblastoma U87 ćelije su dobijene Ijubaznošću dr E. Menue (Institut Paster, Pariz, Francuska). Ćelije deficijentne u timidin kinazi, CEM/TK-ćelije, dobijene su kao ljubazan poklon od Prof. S. Eriksson-a (trenutno na Univerzitetu u Upsali, Upsala, Švedska) i prof. A. Karlsson-a (Institut Karolinška, Stokholm, Švedska). Timidin kinaza-deficientne, L1210/TK- ćelije su izvedene iz L1210/0 ćelija nakon selekcije i sticana rezistencije na 5-bromo-2'-dUrd (Balzarini i saradnici, 1982). Infekcija relevantnih ćelijskih linija saMycoplasma hyorhinis(ATCC) urađena je zarad dobijanja hronično-inficiranih ćelijskih linija u daljem tekstu označenih kao L1210.Hyor i U87,Hyior. Sve ćelije su gajene u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle-ovom medijumu (DMEM) (Invitrogen, Carisbad, CA) sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS) (Biochrom AG, Berlin, Nemačka), 10 mM Hepes-om i 1 mM natrijum piruvatom (Invitrogen). Ćelije su gajene u inkubatoru na 37°C u atmosferi koja je sadržavala 5% C02.
Citostatski testovi
[0142]Ćelije (U87 i U87.Hyor) su zasejane u mikrotitarske ploče sa 48 bunarića (Nunc™, Roskilde, Danska) u jednom sloju, pri gustini od 10,000 ćelija/bunaruću. Nakon 24 sata, dodata je jednaka zapremina svežeg medijuma koji je sadržavao jedinjenja koja su testirana. Petog dana po dodavanju jedinjenja, ćelije su tripsinizovane i izbrojane upotrebomCoulterbrojača (Analis, Suarlee, Belgija). Suspenzije ćelija (L1210/0, L1210/TK-, L1210.Hyor, CEM/0, CEM/TK-) su zasejane u mikrotitarske ploče sa 96 bunarića (Nunc™) pri gustini od 60,000 ćelija/bunaruću u prisustvu navedenih količina jedinjenja koja su lestirana. Ćelije su ostavljene da proliferišu tokom 48 h (L1210) ili 72 sata (CEM), a zatim je broj ćelija određen upotrebomCoulterbrojača. Inhibitorna koncentracija od 50% (ICso) je definisana kao koncentracija jedinjenja koja je potrebna da se broj živih ćelija smanji za 50%.
[0143]Ogled1.Biološka aktivnost uzorka testirana je na velikom broju tumorskih ćelijskih linija, a dobijeni podaci su navedeni u Tabeli 1 koja je data ispod. Podaci su izraženi kao CCso u pM, odnosno kao citostatska koncentracija potrebna da se proliferacija ćelija inhibira za 50%. Korišćene ćelijske linije su bile L1210/0 (leu kemijska ćelijska linija), FM3A/0 (ćelijska linija kancera dojke), Cem/0 (akutna limfoblasna leukemijska ćelijska linija) i HeLa (ćelijska linija kancera grlića materice).
[0144]Tabela 1 sadrži i podatke za 5-FU, 5-FdUrd i referentna jedinjenja CPF 382, CPF 437 i CPF 438, a da bi se efekti mogli uporediti. Struktura CPF 382 je navedena prethodno. Struktura CPF 437 i CPF 438 je sledeća:
[0145]Kao što se može uočiti iz podataka u Tabeli 1, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu ispoljavati citostatsku aktivnost koja je uporediva sa ili je bolja u odnosu na aktovnost 5-FU, pri čemu ispoljavaju i izražena citostatsku aktivnost u ćelijama deficijentnim u nukleozid kinazi. Ovakva citostatska aktivnost u ćelijama deficijentnim u nukleozid kinazi je u direktnoj suprotnosti sa aktivnošću koju ispoljava 5-FdUrd.
[0146]Kao što se takođe može uočiti u Tabeli 1, aktivnost jedinjenja implementiranih predmetnim pronalaskom u TK-ćelijama može biti značajno veća u odnosu na aktivnost koju ispoljavaju referentna jedinjenja CPF 382, CPF 437 i CPF 438.
[0147] Ogled2. Uzorci su ispitani i u pogledu njihove sposobnosti zadržavanja aktivnosti u ćelijama inficiranim mikoplazmama (%). Rezultati su prikazani u Tabeli 2 koja je data u nastavku teksta. Rezultati pokazuju da jedinjenja predmetnog pronalaska mogu zadržati visoku aktivnost u ćelijama inficiranim mikoplazmama, za razliku od aktivnosti koji pokazuje 5-FdURD. Primena inhibitora timidin fosforilaze (TP) vraća citostatsku aktivnost 5-FdUrd u ćelijskim kulturama inficiranim mikoplazmama, obezbeđujući dokaze o štetnoj ulozi TP u eventualnoj citostatskoj aktivnosti 5 FdUrd. Kako je poznato da infekcija ćelija mikoplazmama znatno smanjuje aktivnost nukleozida, uključujući 5-FdUrd, aktivnost nekih nukleozida obezbeđuje potencijalnu dobrobit kod pacijenata koji su inficirani mikoplazmama.
[0148]Dalji eksperimenti (Ogledi do 3 do 8 navedeni u nastavku) su izvedeni sa jedinjenjem CPF 373 implementiranim predmetnim pronalazaskom.
Ogled 3. Citostatska aktivnost 5-FdUrd i njegovog proleka CPF-373uTK-kompetentnimiTK-deficijentnim
tumorskim ćelijskim linijama
[0149]Citostatska aktivnost 5-FdUrd i CPF-373 je određena u različitim TK-eksprimirajućim i TK-deficijentnim tumorskim ćelijskim linijama. Kao što je prikazano u Tabeli 3, citostatska aktivnost 5-FdUrd jako zavisi od ekspresije TK. Njegova ICsoje povećana za 4,000 puta u L1210/TK- ćelijama (ICso: 3.1 uM) u odnosu na matične L1210/0 ćelije (ICso: 0,0008 uM), a za 50 puta u CEM/TK- ćelijama (ICM: 1,5 uM) u odnosu na neizmenjene CEM/0 ćelije (ICm: 0,028 pM). Nasuprot tome, citostatska aktivnost 5-FdUrd proleka CPF-373 ostaje praktično nepromenjena u TK-deficijentnim ćelijama u poređenju sa neizmenjenim ćelijama (ICso: 0,027 i 0,011 uM u L1210/TK- i L1210/0. i 0,32 i 0,089 pM u CEM/TK- i CEM/0 ćelijama, tim redom), lako je citostatska aktivnost CPF-373 od 3 do 10 puta lošija u odnosu na 5-FdUrd u neizmenjenim L1210/0 i CEM/0 ćelijama, pokazano je da je aktivnost od 5 do 100 puta superiornija u odnosu na 5-FdUrd u TK-deficijentnim tumorskim ćelijskim linijama (pogledati Tabelu 3).
Ogled 4. Uticaj infekcije tumorskih ćelijskih kultura mikoplazmama na citostatsku aktivnosti 5-FdUrd i
njegovog proleka CPF-373
[0150]Ćelijski kulture L1210/0 su inficirane mikoplazmama vrsteM. Hyorhinis (
elije označene kao L1210.Hyor). Primena 5-FdUrd pokazala je da je njegova aktivnost znatno smanjena u inficiranim L1210.Hyor ćelijama, za 300 puta (ICm: 0,24 uM). Takođe, citostatska aktivnost 5-FdUrd je bila za 400 puta manja u U87.Hyor ćelijskim kulturama u odnosu na neinficirane U87 ćelije (pogledati Tabelu 3). Nasuprot navedenom, 5-FdUrd prolek CPF-373 je očuvao sličan citostatski potencijal i u L1210/0 i L1210 Hyor ćelijskim kulturama (IC5o: 0,011 i 0,025 uM, tim redom). Slično zapažanje je uočeno za ovaj prolek kada je njegova citostatska aktivnosti ispitana u U87 i U87.Hyor ćelijskim kulturama (ICsc: 0,035 i 0,039 uM, tim redom). Stoga, dok je slobodan nukleozid 5-FdUrd značajno izgubio svoj citostatski potencijal uMycoplasmafryorf7/n<s-inficiranim tumorskim ćelijskim linijama, antiproliferativni potencijal njegovog proleka CPF-373 je bio nezavisan od infekcije mikoplazmama.
[0151] Ogled5. Sprovedeni su eksperimenti i za procenu stabilnosti CPF 373 u prisustvu timidin fosforilaze (TP). Eksperimenti su ilustrovani kroz podatke prikazane na Slikama od 9 do 11, od kojih svaka predstavlja NMR spektar, kao što je to i diskutovano u teksu koji sledi. Navedeni test pokazuje da neosetljivost jedinjenja implementiranih predmetnim pronalaskom na dejstvu kataboličkog enzima TP, koji se često povećano eksprimiran u tumorima, čini jedinjenja predmetnog pronalaska nezavisnim od kataboličkog enzima TP više nego što je to slučaj sa 5-FdUrd.
Fosforilazni esej za 5-FdUrd i njeno ProTide jedinjenje CPF373 satimidin fosforilazom (TP) prečišćenom iz
Escherichia coli.
[0152]Nukleozid 5-FdUrd se može razgraditi do svoje odgovarajuće baze 5-FU fosforililičkom reakcijom, upotrebom timidin fosforilaze prečišćene izEscherichia coli,kao i uridin fosforilaza prečišćena iz Ehriich-ovog ascitnog tumora. Pretpostavlja se da je navedeno razlaganje jedan od razloga ograničene terapijske efikasnosti 5-FdUrd, a u skladu sa šemom koja sledi:
[0153]Fosforilaza esej je izveden putem fosforolizetimidin fosforilazomprečišćenom iz bakterije sojaEscherichia coliupotrebomin situ<19>F NMR-a. Primena na ProTide jedinjenja CPF 373 je bio pokušaj da se spreči cepanje strukture i time zaobiđe dejstvo ovog enzima.
[0154]Dva katijum fosfatna pufera pH = 7,4, rastvori koncentracija 200 nM i 300 nM, tim redom, koršćena su kao donori fosfata. Jedinice enzima defnisane kao količina enzima potrebnog za hidrolizu oko 0,25 mg inozina po minutu, korišćene su kao standard. Ogledi su sprovođeni tokom 30 minuta.
Fosforilazni test za5-FdUrd
[0155] Na početku, snimljeni su<19>F NMR (470 MHz) spektri 5-FdUrd i 5-FU, prethodno rastvorenih u deuterizovanom metanolu. 5-FdUrd spektar je sadržavao singlet na - 5-167,21 ppm, a 5-FU na - 5-169,30 ppm. Dakle, fosforilazni test je izveden rastvaranjem 5-FdUrd u deuterizovanom metanolu, u prisustvu kalijum fosfatnog pufera (200 nM rastvor; pH - 7,4) i snimljen je blank uzorak pre dodavanja enzima timidin fosforilaze (TP) (20,7 UNI). "F NMR spektar, snimljen na 25°C, pokazao je prisustvo singleta 5-FdUrd na - 5-165,17 ppm i novog pika na - 5-169,50 pp koji se pripisuje 5-FU, kao što je to prikazano na Slici 9 u okviru spektra označenog kao A.
[0156]Zatim, da bi se dokazalo cepanje nukleozida u odgovarajuću bazu, izveden je nov eksperiment rastvaranjem jednakih molova nukleozidnih analoga 5-FdUrd i odgovarajuće baze 5-FU, a u istim uslovima kao što su uslovi koji su prethodno opisani, bez TS enzima, kao što je to prikazano na Slici 9, spektar B, Ovaj spektar sadrži dva singleta sa istim hemijskim pomerajem kao što je to uočeno prethodno na Slici 9, spekta A. Navedeni podaci su potvrdili da 5 FU ima hemijski pomeraj od - 5-169,50 ppm, a samim tim i da je prisutno fosforolitičko dejstvo enzima (TP). Konverzija nukleozida 5-FdURd u slobodnu bazu 5-FU je bila 66%.
[0157] Kada je početna koncentracija kalijum fosfatnog pufera povećana sa 200 nM na 205 nM, supstrat 5-FdUrd je bio u potpunosti preveden u bazu 5-FU kao što je prikazano na Slici 10.
Fosforilazni test za ProTide jedinjenje CPF 373
[0158]Fosforilazni test je primenjen na benzil L-alanin fenilni derivat CPF 373 kako bi se ispitala njegova stabilnost, a prateći proceduru i uslove koji su prethodno opisani. Test je dokazao da je ProTide jedinjenjeCPF373 potpuno stabilno, a što je utvrđeno poređenjem hemijskog pomeraja uzorka analiziranog bez TP enzima, kao što je to prikazano na slici 11, spektar A, i u prisustvu TP, kao što je prikazano na slici 11, spektar B.<19>F NMR je ponovljen nakon 4 dana i još jednom je pokazano da je ProTide jedinjenjeCPF373 stabilno.
[0159]Navedeni eksperimenti su potvrdili da se nukleozid 5-FdUrd brzo razgrađuje u svoju odgovarajuću bazu 5-FU fosforolitičkom reakcijom, u prisustvu timidina fosforilaze, sa vremenom poluraspada manjim od 30 minuta, dok je prolekCPF373 pokazao jasnu stabilnost u odnosu na TP enzimsku aktivnost tokom dužeg vremenskog izlaganja do 3 dana. Navedeni važan rezultat je zapravo pokazao da 5-FdUrd ProTides derivati implementirani predmetnim pronalaskom favorizuju terapijski efekat 5-FdUrd.
Ogled 6. Izlaganje 5-FdUrd i CPF-373TPkodiranoj od straneE. Coli,kaoihumanim TP i UP
[0160]Specifičnost timidin fosforilaze za supstrate, prirodni timidin (dThd), uridin (Urd), 5-FdUrd i CPF-373 ispitivana je upotrebom tečne hromatografije pod visokim pritiskom (HPLC). Reakcione smeše koje su sadržavale 100 uM jedinjenja koje je testirano i rekombinantni TP ili UP (humani TP: 8,6 ng/pL;E. ColiTP: 3,0 ng/pL; humani UP: 4 ng/mL) u ukupnoj zapremini od 500 uL reakcionog pufera (10 mM TrisHCI; 300 uM NaCI; 1 mM EDTA; 2 mM KH2P04/K2HPO«) inkubirane su na sobnoj temperaturi. U različitim vremenskim tačkama (tj 0, 20, 40 min) iz reakcione smeše su uzimani alikvoti od po 100 uL koji su dalje grejani na 95°C tokom 3 min da bi se inaktivirao enzim. Dobijeni reakcioni proizvodi su zatim razdvojeni na reverzno-faznoj RP-8 koloni (Merck, Darmstadt, Nemačka) i kvantifikovani upotrebom HPLC-a (Alliance 2690, VVaters, Milford, MA). Razdvajanje dThd od timina izvedeno je linearnom gradijentom elucijom polazeći od 98% pufera za razdvajanje (50 mM NaH2POa i 5 mM heptan sulfonska kiselina, pH 3,2) sa 2% acteonitrila, do 20% pufera za razdvajanje + 80% acetonitrila (8 min 98% pufer za razdvajanje + 2% acetonitril; 5 min linearni gradijent od 98% pufera za razdvajanje + 2% acetonitrila do 20% pufera za razdvajanje + 80% acetonitril; 10 min 20% pufera za razdvajanje + 80% acetonitrila, zatim uravnotežavanje na 98% pufera za razdvajanje + 2% acetonitrila). UV detekcija je urađena na 267 nm. Razdvanje Urd od uracita je urađeno linearnom gradijent elucijom polazeći od 100% pufera za razdvajanje (pogledati iznad) do 60% pufera za razdvajanje + 40% acetonitrila (3 min 100% pufera za razdvajanje; 6 min linearni gradijent od 100% pufera za razdvajanje do 60% pufera za razdvajanje + 40% acetonitrila; 6 mm 60% pufer za razdvajanje + 40% acetonitril. zatim uravnotežavanje u 100% puferu za razdvajanje). UV detekcija je urađena na 258 nm.
Fosforoliza 5-FdUrdiCPF-373 timidiniuridin fosforilazama
[0161]5-FdUrd i njegov prolek CPF-373 su izloženi dejstvu prečišćene timidin fosforilaze poreklom izE. Coliili humanih eritrocita, kao i dejstvu prečišćene uridin fosforilaze poreklom iz humanih tumora. DokE. Coli ihumani TP brzo konvertuju dThd i 5-FdUrd u njihove slobodne baze, CPF-373 ostaje potpuno stabilan u prisustvu ovih enzima {Slika 2). U sličnim eksperimentalnim uslovima, uridin se prevodio u uracil dejstvom humanog UP, ali ne i TP poreklom izE. Coliili humanog TP. Kada su oba jedinjenja izložena dejstvu UP, dThd i CPF-373 nisu podlegli dejstvu enzima, dok je 5-FdUrd neznatno hidrolizovao (Slika 2, panel C).
Ogled 7. Merenje aktivnosti timidilat sintaze (TS)
[0162]Aktivnost TS kod intaktnih L1210/0 i L1210/TK- ćelija je merena posredno, procenom oslobadjanja tricijuma iz [5-<3>H]dUMP-a (nastalog u ćelijama od [5-<3>H]dUrd ili [5-<3>H]dCyd) u reakciji katalizovanoj sa TS. Postupak je detaljno opisan od strane autora Balzarini i De Clercq (1984). Ukratko, ćelijske kulture (500 ul_ DMEM medijuma za kulture) su pripremljene tako da sadrže - 3 x 10<6>L1210 ćelija i odgovarajuće količine jedinjenja koja su testirana (5-FdUrd i CPF-373). Nakon 30 min. 2 h i 4 h preinkubacije ćelija sa jedinjenjima na 37°C, u ćelijske kuture je dodato 1 pCi [5-<3>H]dUrd ili [5-<3>H] dCyd. Po završetku inkubacije u trajanju od 30 min, uzimano je po 100 uL suspenzije elija koja je dodavana u 500 uL hladne suspenzije aktivnog uglja (VWR, Haasrode, Belgija) (100 mg/ml u TCA 5%). Posle 10 min, suspenzija je centrifugirana na 13,000 rpm tokom 10 min. nakon čega je određena radioaktivnost u 400 uL supernatanta upotrebom tečnog sinctilatora OptiPhase HiSafe (Perkin Elmer, Waldham, MA).
Inhibicijatimidilat sintaze (TS)sa5-FdUrd i CPF-373
[0163]Glavna meta citostatske aktivnosti 5-FdUrd je timidilat sintaza (TS). Aktivnost TS u intaktnim tumorskim ćelijama može se direktno pratiti merenjem oslobađanja tricijuma u intaktnim L1210/0 ćelijskim kulturama koje su bile izložene [5-<3>H]dezoksiuridinu ([5-<3>H]dUrd) ili [5-<3>H]dezoksicitidinu ([5-<3>H]dCyd). Zaista, nakon konverzije [5-<3>H]dUrđ ili [5-<3>H]dCyd u [5-<3>H]dUMP unutar ćelije, tokom TS-katalizovane reduktivne metilacije se oslobađa C-5 atom tricijuma u pirimidinskoj bazi. Sposobnost 5-FdUrd i njegovog proleka CPF-373 da inhibiraju otpuštanje tricijuma iz [5-<3>H]dUrd i [5-<3>H]dCyd stoga je korišćena za procenu efekata raznih koncentracija jedinjenja u L1210/0 ćelijskim kulturama. Pokazano je tako da je 5-FdUrd potentan inhibitor TSin situ.Negova IC^za oslobađanje tricijuma iz [5-<3>H]dCyd i [5-<3>H]dUrd je iznosila oko 0,0007 - 0,0009 uM (pogledati Tabelu 4).
[0164]Inhibitoma aktivnost CPF-373 na oslobađanje tricijuma je znatno manje (- 200 puta) izražena u odnosu na 5-FdUrd, posebno nakon samo 30 min prethodne inkubacije ćelija sa lekovima (ICso: 0.16-0,19 uM). Međutim, duže vreme prethodne inkubacije ćelija {do 4 h) sa 5-FdUrd i CPF-373 pre merenja TS aktivnosti u intaktnim tumorskim ćelijama dovela je do znatno izraženije inhibitorne aktivnosti proleka za TSin situ(SI,3). Zaista, dok je inhibicija 3H oslobađanja bila samo 2 puta veća nakog dužeg preinkubacionog vremena sa 5-FdUrd, inhibitorni potencijal CPF-373 je bio povećan 10 puta (Slika 3, paneli A i B, i C i D).
[0165]Preinkubacija tumorskih ćelija sa 5-FdUrd i CPF-373 tokom najmanje 4 sata dovela je do inhibicije TS u intaktnim tumorskim ćelijama pri koncentracijama koje su vrlo uporedive sa koncentracijama koje predstavljaju 50% citostatske aktivnosti ovih lekova.
[0166]Navedena zapažanja stoga ukazuju da je 5-FdUrd proleku potrebno nekoliko metaboličke koraka konverzije pre nego što dođe do konverzije sa TS kao ciljnim enzimom za inhibiciju, a to podržava stav da CPF-373 deluje kao efikasan prolek 5-FdUrd koji podržava njegovu eventualnu citostatskog aktivnost.
[0167]Aktivnost TS u prisustvu 5-FdUrd i CPF-373 merena je i u intaktnim L12107TK- ćelijama upotrebom [5-<3>H]dCyd kao supstrata koji je dodat spolja (zbog nedostatka TK, [5-<3>H]dUrd se ne može koristiti). Kao što je pokazano u Tabeli 5 i na Slici 3 (paneli E i F), koncentracija 5-FdUrd potrebna da dovede do 50% inhibicije TS smanjivala se za faktor 5700 u TK-deficijentnim L1210/TK- ćelijama (ICS0: 1,4 uM), a poredeći sa koncentracijom koja je bila potrebna u neizmenjenim L1210/0 ćelijama (ICM: 0,0003 uM). Nasuprot tome, TS inhibitorna aktivnost CPF-373 je ostala praktično nepromenjena u L1210/TK- ćelijama (ICM: 0,053 pM u L1210/TK- ćelija naspram 0,013 uM u L1210/0 ćelijama).
Ogled 8. Testovi stabilnosti
Karboksipeptidaza Y (EC 3.4.16.1)test
[0168]Enzimska stabilnost proleka CPF-373 u odnosu na dejstvo karboksipeptidaze Y je ispitivana korišćenjemin situ<31>P NMR-a (202 MHz). Eksperiment je sproveden rastvaranjem CPF-373 (3,0 mg) in d6-acetonu (150 ul_) i dodavanjem TRIZMA pufera pH 7,6 (300 pL). Dobijeni rastvor je zatim stavljen u NMR tubu i snimljen je<31>P-NMR spektar na 25°C kao blank eksperiment. Enzim karboksipeptidaza Y (0,2 mg) je rastvorena u TRIZMA puferu (150 uL), pa je dodata u rastvor derivata fosforoamidata u NMR tubi. Zatim je tuba stavljena u NMR aparat koji je podešen za<31>P-NMR eksperiment (64 skeniranja) tako da se snimanje vrši na svaka 4 minuta tokom 14 sati na 25°C. Podaci su obrađeni i analizirani kompjuterskim programom Bruker Topspin 2.1. Karboksipeptidaza Y i TRIZMA pufer nabavljeni su od firmeSigma- Aldrich.
Humaniserum
[0169]Stabilnost proleka CPF-373 u prisustvu humanog seruma je ispitivana upotrebomin situ<3>,P NMR-a (202 MHz). ProTide CPF-373 (1) (5,0 mg) je rastvoren u DMSO (0,05 mL) i D70 (0,15 mL). Zatim je uzorak prebačen u NMR tubu koja je ubačena u NMR komoru na 37°C (sa dovoljno rasivarača da se dobije kontrolno, blank NMR očitavanje). Zatim je 0,3 ml humanog seruma brzo dodato u uzorak u NMR tubi. NMR eksperimenti su programirani tako da se snimanje podataka odvija na svakih 15 minuta tokom 12 sati i 30 minuta. Zbog viška pozadinskog signala i siromašnih profila optimizacije (najverovatnije zbog prisustva bioloških medijima i njihove koncentracije), pojedinačni spektri su dalje obrađivani. Nakon normalne Fourier-ove transformacije, svaki spektar je raščlanjen (Lorentz-Gauss-ovo raščlanjivanje) da bi se dobiila samo učestalost i površina spektralnih pikova bez osnovne linije. Snimljeni podaci su obrađeni i analizirani upotrebom Bruker Topspin 2.1 kompjuterskog programa.
Puferna pH 1
[0170]Stabilnost proleka CPF-373 da hidrolizuje pri pH = 1 je ispitivana upotrebomin situ<3>,P NMR-a (202 MHz). ProTide CPF-373 (1) (2,6 mg) je rastvoren u MeOD (0,1 mL) posle čega je dodato 0,5 ml pufera (pH = 1)
(pripremljenog od jednakih delova 0,2 M HCI i 0,2 M KCI). Zatim je uzorak je prebačena u NMR tubu, a<31>P NMR esperiment je urađen na 37°C. Snimanje je rađeno na svakih 12 minuta tokom 14 sati. Podaci su obrađeni i analizirani upotrebom Bruker Topspin 2.1 kompjuterskog programa.
Puferu na pH 8
[0171]Stabilnost proleka CPF-373 da hidrolizuje pri pH = 8 je ispitivana upotrebomin situ<31>P NMR-a (202 MHz). ProTide CPF-373 (1) (4,9 mg) je rastvoren u MeOD (0,1 mL) posle čega je dodato 0,5 ml pufera (pH = 8)
(pripremljenog od rastvora 0,1 M Na2HPO<i podešenog sa 0,1 M HCI). Zatim je uzorak je prebačena u NMR tubu, a 31P NMR esperiment je urađen na 37°C. Snimanje je rađeno na svakih 12 minuta tokom 14 sati. Podaci su obrađeni i analizirani upotrebom Bruker Topspin 2.1 kompjuterskog programa.
Studije stabilnosti
[0172]Studije hemijske stabilnosti proleka CPF-373 (1) su urađene izlaganjem jedinjenja humanom serumu i vodenim puferima (pH 1,0 i 8.0) upotrebomin situ<3>,P NMR-a. Svaki eksperiment je urađen rastvaranjem ProTide jedinjenja u pogodnom deuterizovanom rastvaraču i analizom uzoraka na 37°C tokom oko 14 sati, pri čemu su skeniranja rađena u pravilnim vremenskim intervalima. Zarad boljeg pregleda, dati su originalni spektri (donji grafikoni) i onih koji su dobijeni nakon raščlanjivanja (gornji grafikoni). Studija stabilnosti fosforoamidata CPF-373 (1), posle inkubacije u humanom serumu, pokazala je da je nakon 12 sati i 30 minuta ostalo 73% nepromenjenog jedinjenja, kao što je to prikazano na Slici 6.
[0173] Na spektu se može uočiti jedan pik svojstven humanom serumu na - 5 2,00, kao i dvostruki pik na - 5 4,50 koji se nakon 4 sata i 15 minuta hidrolizuje u aminoacil fosforoamidatni intermedijarni produkt prikazan kao samostalni pik na 5 7,20.
[0174]Kada je hemijska hidroliza procenjivana u ekstremnim eksperimentalnim uslovima, odnosno na pH 1,0 i pH 8.0 na 37°C, uočena je puna stabilnost proleka CPF-373 (1) i u kiselim i u baznim uslovima. Spektri su snimani tokom 14 sati skeniranja na svakih 12 minuta u pravilnim vremenskim intervalima, kao što je prikazano na Slikama 7 i 8. ProTide (1) hidroliza ispitana na pH 1,0 pokazale je stalno prisustvo duplog pika dijastereoizomera na 5 4,35; 4,50 tokom celog vremena trajanja testa (Slika 7). Takođe, na pH 8,0 na spektru se mogao uočiti perzistentan pik proleka (1) na 5 4,48, kao i jedan pik na 5 2,55 koji odgovara piku pufera (Slika 8).
Metabolizam 5-FdUrd fosforamidata
[0175]Kao što je prikazano na Slici 4, pretpostavljeni mehanizam aktivacije ProTide jedinjenja unutar ćelije, a nakon preuzimanja, podrazumeva prvi enzimski korak aktivacije posredovan ezimima tipa karboksipeptidaze koji hidrolizuju estre aminoacil grupe (korak a), što je praćeno spontanom ciklizacijom i naknadnim spontanim premeštanjem aril grupe (korak b), te vodom posredovanim otvaranjem nestabilnog prstena (korak c). Poslednji korak podrazumeva hidrolizu P-N veze posredovanu enzimima tipa fosforamidaza (korak d) uz oslobađanje nukleozid monofosfata u intaktnoj ćeliji (Slika 4) (McGuigan i saradnici, 2009; Mehellou i saradnici, 2010).
[0176]Da bi se predložena metabolička šema dokazala za CPF-373 (1), kao i da bi se utvrdilo da li se estarski motiv derivata 5-FdUrd fosforoamidata izdvaja ili ne, osmišljen je eksperiment inkubacije sa enzimom tako da se imitiraju prve etape pretpostavljene aktivacije u intaktnim tumorskim ćelijama. Jedinjenje (1) je inkubirano sa karboksipeptidazom Y (poznatom i kao katepsin A) u TRIZMA puferu, a prevođenje (1) je praćeno upotrebom 3,P NMR-a. Spektri su snimani tokom 14 h, u periodičnim intervalima od 4 minuta kao što je prikazano na Slici 5. Za bolje razdvajanje podataka navedeni su originalni (donji grafikoni) i spektri dobijeni raščlanjivanjem (gornji grafikoni).
[0177] Na<3>,P NMR spektru, prolek CPF-373 (1) se javio u vidu dva pika na 5 4,07; 4,23 koji odgovaraju pikovima dva dijastereoizomera, a kao zapis sličan obliku originalnog pika sa kakterističnim dupliranjem hiralnog fosfatnog centra u fosforoamidatu. Po dodavanju katepsina A, jedinjenje je brzo hidrolizovalo (nakon 4 minuta) do intermedijera 5 4.95; 5,16 kome nedostaje estarski motiv, a ovaj međuprodukt nije perzistentan i brzo se metaboliše u aminoacil fosforoamidatni intermedijer, finalni produkt koji se dobija u ovom testu gubitkom aril grupe (koraci od a do c na Slici 4). Intermedijer se javio kao jedan pik na 5 6,85 zbog ahiralnog fosfatnog centra. Dakle, spektri enzimske studije su pokazali brz metabolizam osnovnog jedinjenja - 64,00 sa kompletnom konverzijom u pretpostavljeni intermedijer u roku od 26 minuta, koji dalje dosledno ostaje prisutan tokom 14 h merenja, Raskidanje P-N veze otpuštanjem nukleozid monofosfata nije detektovano u enzimskom eksperimentu, kao što je i očekivano. Ovaj eksperiment ukazuje da prvi korak aktivacija ProTide CPF-373 (1) može biti dovoljno efikasan i stoga, da omogućava eventualnu isporuku nukleozid monofosfatnog metabolita u intaktne tumorske ćelije
Zaključak
[0178]U zaključku, predmetni pronalazak obezbeđuje nove fosforoamidat nukleotidne prolekove antitumorskih nukleozidnih analoga 5-fluoro-2'-dezoksiuridina (5-FdUrd), koji su sintetisani i procenjeni po svojoj citostalskoj aktivnosti. Dok 5-FdUrd značajno gubi citostatski potencijal u timidin kinaza (TK)-deficijentnim ćeliijskim kulturama mišje leukemije L1210 i humanih limfocita CEM, jedinjenja predmetnog pronalaska, na primer CPF-373, značajno zadržavaju antiproliferativnu aktivnost i kod intaktnih i kod TK-deficijentnih tumorskih ćelija i na taj način su u velikoj meri nezavisni od TK aktivnosti unutar ćelije da bi ispoljili svoje citostatsko dejstvo. Utvrđeno je i da CPF-373, na primer, inhibira timidilat sintazu (TS) u TK-deficijentnim i intaktnim ćelijskim linijama u koncentracijama leka koje dobro korelišu sa njegovom citostatskom aktivnošću u ovim ćelijama. Izgleda da CPF-373 nije podložan inaktivaciji dejstvom kataboličkih enzima kao što su timidin fosforilaza (TP) i uridin fosforilaza (UP). Navedeni podaci su u skladu sa zapažanjima da 5-FdUrd, ali ne CPF-373, značajno gubi citostatski potencijal u prisustvu mikoplazmi koje eksprimiraju TP u tumorskim ćelijskim kulturama. Zbog toga, jedinjenja predmetnog pronalaska poput CPF-373 predstavljaju nove 5-FdUrd fosforoamidatne prolekove koji (i) mogu prevazići potencijalne mehanizmi rezistencije tumorskih ćelija (npr usled smanjenja TK aktivnost) i (ii) ne podležu razlaganju dejstvom kataboličkih enzime poput TP čija je aktivnost esto povećana u tumorskim ćelijama ili izražena u tumorskom tkivu inficiranom mikoplazmama. Referenca za dalje detalje u potpunosti predstavlja rad autora Vande Voorde J i saradnika, Biochemicat Pharmacologv 82 (2011) 441-452
[0179]Primeri primene predmetnog pronalaska, kako je navedeno u daljem tekstu, prijavljeni su u publikaciji McGuigan C. i saradnici, J.Med. Chem, 2011, 54 7247-7258 (objavljeno 5. Septembra 2011. godine).
[0180]Tabela 6 data u tekstu koji sledi prikazuje meru citostatske aktivnosti 5-FU, 5-FdUrd, referentnog primera CPF382 i jedinjenja implementiranih predmetnim pronalaskom u ćelijskim linijama tumora, a u vidu ICso ili koncentracija jedinjenja potrebnih da se inhibira proliferacija ćelija tumora za 50%. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti (± SD) merenja dobijenih iz najmanje dva do četiri nezavisna eksperimenta. Tabela 6 idenlifikuje fosforoamidatne motive referentnog primera CPF382 i jedinjenja implementiranih predmetnim pronalaskom, pri čemu: "aril" označava Ar grupu kao što je Ar grupa definisana u opisu opšte Formule I, odnosno označava bilo fenil(Ph) ili 1-naftil (Nap) grupu; "estar" označava R3grupu definisanu u opisu opšte Formule I; a "AA" označava aminokiselinu čiji alfa C atom i supstituenti na alfa C atomu odgovaraju CR,R2grupi Formule I. Tabela 6 prijavljuje jedinjenja implementirana predmetnim pronalaskom koja nisu prethodno navedena u Tabeli 1, kao i dodatne podatke za neka od jedinjenja navedena u Tabeli 1.
[0181]Tabela 7 koja sledi sadrži podatke o citostatskoj aktivnosti 5-FdUrd, referentnog primera CPF382, kao i jedinjenja implementiranih predmetnim pronalaskom u neizmenjenim ćelijskim kulturama mišje leukemije L1210 (L121070) i L1210 ćelijskim kulturama zaraženimMicoplasma hiorhinis<L1210.Hyor) i to u vidu ICM ili koncentracija jedinjenja potrebnih da se proliferacija ćelija inhibira za 50%. Podaci su predstavljeni kao srednje vređnosti (± SD) podataka dobijenih u najmanje dva do četiri nezavisna eksperimenta. Tabela 7 identifikuje fosforoamidatne motive referentnog jedinjenja CPF382 i jedinjenja implementiranih predmetnim pronalaskom, kao što je to navedeno u opisu za Tabelu 6, s time da "Naph" označava 1-naftil grupu. Tabela 7 prijavljuje jedinjenja implementirana predmetnim pronalaskom koja nisu prethodno navedena u Tabeli 2, kao i dodatne podatke za neka od jedinjenja navedena u Tabeli 2.
[0182] Tabela 8 data u tekstu koji sledi sadrži podatke o citostatskoj aktivnosti 5-FdUrd i jedinjenja implementiranih predmetnim pronalaskom u CEM ćelijskim kulturama koje sadrže (Cem/hEnt-1) ili im nedostaje (Cem/hEnt-0) transporter hEntl, a podaci su u vidu ICMili koncentracija jedinjenja potrebnih da se inhibira proliferacija tumorskih ćelija za 50%. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti (± SD) dobijene u najmanje dva do četiri nezavisna eksperimenta. Tabela 8 identifikuje fosforoamidatne motive jedinjenja implementiranih predmetnim pronalaskom, kao što je to definisano prethodno za Tabelu 6, s time da temin "Naph" označava 1-naftil grupu. Podaci iz Tabela 8 pokazuju da jedinjenja implementirana predmetnim pronalaskom manje zavise od prisustva hENT1 transportera u odnosu na 5-FdUrd, imajući u vidu da se gubi antiproliferativnu aktivnost u CEM ćelijma deficijentnim u hENT1 za samo od 7 do 15 puta. Ova zapažanja su u saglasnosti sa od samo 2 do 7 puta smanjenom citostatskom aktivnošću jedinjenja implementiranih predmetnim pronalaskom u prisustvu inhibitora transporta (tj dipiridamola i NBMPR), u poređenju sa 20- do 60-strukim gubitkom antiproliferativne aktivnosti 5-FuDrd i FdUMP u sličnim eksperimentalnim uslovima.
[0183]Studije su sprovedene za jedinjenje CPF 381 na sleđeći način
Enzimski fosforilazni test je izveden upotrebom timidin fosforilaze (TP, prečišćen izEsherichia coli)u prisustvu kalijum fosfatnog pufera (300 nM rastvor, pH 7,4).<19>F NMR spektar poste 5 min, 14 h i 72 h nije pokazao nikakve dokaze fosforolize. Za razliku od 5-FdUrd, CPF 381 je u najboljem slučaju vrlo loš, ukoliko je uopšte, supstrat za timidin fosforilazu.
[0184]Hemijski hidroliza je procenjivana u eksperimentalnim uslovima pri pH 1 i pH 8 i praćena je putem<3t>P NMR-a. Tokom testa (14 h) u kiselim uslovima (pH 1) snimljena su samo dva pika koji predstavljaju dva dijastereoizomera. Nedostatak obrazovanja novih signala na<3>,P NMR spektru ukazuje da je jedinjenje CPF 381 veoma stabilno u kiseloj sredini, tsti rezultat je uočen kada je jedinjenje CPF 381 podvrgnuto ispitivanju u umereno baznim uslovima (pH 8).
[0185]Studije su urađene za jedinjenje CPF 581 na sledeći način: Urađena je enzimska studija upotrebom testa sa karboksipeptidazom Y u kome su jedinjenje CPF 581, karboksipeptidaza Y i TRIZMA pufer (pH 7,6) rastvoreni u acetou-d6pa je<3>,P NMR spektar (202 MHz) sniman u pravilnim vremenskim intervalima (svakih 7 min) tokom 14 h. Jedinjenje CPF 581 je brzo hidrolizovalo u prvi metabolit kome nedostaje estarski (R5) ostatak, pri čemu su oba dijastereoizomera procesuirana otprilike u sličnoj količini. Dalja obrada prvog metabolita dovela je do obrazovanja drugog, anjonskog metabolita kome nedostaje Ar, a u vremenu od oko 45 minuta i sa procenjenim poluživotom manjim od 5 min. Stopa početnog koraka aktivacije se može stoga smatrati u principu kao jedan od neophodnih uslova za dobru biološku aktivnost fosforamidata. Hemijska hidrolizu jedinjenja CPF 373 u prisustvu trietilamina i vode dovela je do obrazovanja diamonijumske soli drugog anjonskog metabolita, a isti je dalje dodat u finalni test uzorka izvedenog iz jedinjenja CPF 373, odnosno testiran je uzorak koji sadrži samo enzimski obrađen drugi metabolit izveden iz jedinjenja CPF 581 u TRIZMA puferu. Uzorak je imao 3,P NMR spektar sa samo jednim pikom na 5P6,85 ppm, što dalje snažno podržava hipotezu važnosti ovog metaboličkog puta i aktiviranja fosforoamidata jedinjenja predmetnog pronalaska.
[0186]Studije su urađene za jedinjenje CPF 386 na sledeći način: Stabilnost jedinjenja CPF 386 u prisustvu humanog seruma je ispitivana upotrebomin situ31P NMR-a. Kontrolni<31>P NMR podaci za jedinjenje CPF 386 u DMSO i D20 su zabeleženi. NMR uzorak je zatim tretiran humanim serumom i odmah podvrgnut daljim 31P NMR eksperimentima na 37°C.<31>P NMR podaci su snimani svakih 15 minuta tokom 14 h. Na spektrima se mogu uočiti jedan pik koji odgovara humanom serumu na - 6V2.00 ppm i dva pika koja odgovaraju jedinjenju CPF 386 na - 5P4,59 i 4,84 ppm. Nakon oko 6 h i 45 min. jedinjenje je delimično hidrotizovano do intermedijera kome nedostaje R3(Et), što se detektuje kao pojedinačni pik na 5P5,79 ppm. Nakon 11 h i 30 min, obrazuje se drugi metabolit kome nedostaje Ar (1-naftil), što se ogleda u postojanju pojedinačnog pika na 5P7,09 ppm. Posle 13 h i 30 min, reakciona smeša sadrži 96% matičnog jedinjenja CPF 386 zajedno sa predloženim prvim metabolitom (3%) i drugim metabolitom (1%).

Claims (18)

1.Jedinjenje opšte formule (I): naznačeno time, što Ar označava fuzionisanu bicikličnu ili monocikličnu aril grupu, a bilo koja od navedenih aril grupa označava karbocikličnu ili heterocikličnu grupu i opciono je supstituisana; R3označava alkil grupu koja je opciono supstituisana; R4označava H ili alkoil grupu; Ri i Rjsu nezavisno izabrani iz grupe koju čine H i alkil grupa ili R, i R2 zajedno obrazuju alkilenski lanac tako da obezbeđuju, zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani, cikličan sistem, ili pak jedan od R:i R2 sadrži alkilen lanac vezan za N, pri čemu H atom vezan za N izostaje, a jedan od R. i R? sadrži H ili alkil grupu; bilo koja alkil grupa ili alkilen lanac može biti supstituisan; ili njihov farmaceutski prihvatljivi derivat, naznačen time, što navedeni farmaceutski prihvatljiv derivat označava bilo koju farmaceutski prihvatljivu so, hidrat. solvat ili kristalni oblik jedinjenja, naznačen time. što jedinjenje ne označava jedinjenje koje sadrži, ti kombinaciji, Ar kao nesupstituisani fenil, R3kao CH3, R4kao H, a jedan od R, i R2kao H i jedan od R, i R2kao CH3.
2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što Ar označava naftil, a prioritetno 1-naftil grupu.
3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što Ar označava fenil grupu.
4. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, naznačeno time, što je Ar grupa supstituisana.
5. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4, naznačeno time, što jeRaizabran iz grupe koju čine H i acetil grupa, a prioritetno označava H.
6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, naznačeno time, što je R3 izbarano iz grupe koju čine benzil grupa i članovi grupe od Cido doalkila, prioritetno n-propil, n-butil, n-pentil ili n-heksil. a prioritetnije n-pentil grupa.
7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6, naznačeno time, što R:i R2odgovaraju ostacima vezanim za alfa C atom u prirodnim alfa aminokiselinama. a prioritetna prirodna alfa aminokiselina je L-alanin.
8 Jedinjenje prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time, što Ar označava 1-naftil grupu, a R-i Rzodgovaraju ostacima vezanim za alfa C atom L-alanina.
9. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što Ar označava 1-naftil grupu, R3označava benzil ili n-pentil grupu, a jedan od Ri i R2označava H, jedan od Rii R2označava metil grupu i C atom za koji su R, i R?vezani je u L hiralnom obliku.
10. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, izabrano iz grupe koja sadrži: 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[fenil(ben2oksi-L-alanintl)] fosfat (CPF 381) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[fenil(etoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF383) 5-fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[fenil(izopropoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF384) 5-fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[fenil(cikloheksoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF508) 5-fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[p-nitro-fenil(etoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF430) S-fluoro^'dezoksiuridin-S'-O-II-naftiKbenzoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF373) 5-fluoro-2'dezoksiundin-5'-0-[1-naftil(metoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF385) 5-fluoro-2'dezoksiundin-5'-0-[1-naftil(etoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF386) 5-fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil(izopropoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF387) 5-fluoro-2'dezoksiuridin-5<*->0-[1-naftil(cikloheksoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF509) 5-fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[fenil(benzoksi-a,a-dimetilglicin)3 fosfat (CPF393) 5-f!uoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[fenil(etoksi-a,a-dimetilglicin)] fosfat (CPF394) 5-fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[1-naftii(benzoksi-a,a-dimetilglicin)] fosfat (CPF395) 5-fluoro-2'dezoksturidin-5'-0-[1 -naftil(etoksi-a,a-dirnetilglicin)] fosfat (CPF396) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[fenil(benzoksi-L-prolinil)] fosfat (CPF583) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil(benzoksi-L-prolinil)J fosfat (CPF577) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1 -naftii(3,3-dimeti!-1 -butoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF585) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(ciklobutoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF578) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1 -naftil-(ciklopropilmetanoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF579) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(tetrahidropiroksi-L-alaninil)] fosfat (CPF580) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(pentoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF581) S-fluoro^'-dezoksluridin-S'-O-fl-naftil-iciklopentoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF582) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1 -naftil-(2-indanoksi-t_-alaninil)] fosfat (CPF597) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[fenil-(benzoksi-L-metioninil)] fosfat (CPF586) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(benzoksi-L-fenilalaninil)] fosfat (CPF587) 5-fluoro-2'-dezokstuirdin-5'-0-[1-naftil-(2,2-dimetil-L-alaninil)] fosfat (CPF58S) 5-fluoro-2'-dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil-(butoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF589) i njihove farmaceutski prihvatljive derivate, naznačene time, što navedeni farmaceutski prihvatljivi derivati označavaju bilo koju farmaceutski prihvatljivu so, hidrat, solvat ili kristalni oblik jedinjenja.
11. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 10 koje označava 5-fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil(benzoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF373) ili njegov farmaceutski prihvatljiv derivat, naznačen time, što navedeni farmaceutski prihvatljiv derivat označava bilo koju farmaceutski prihvatljivu so, hidrat, solvat ili kristalni oblik jedinjenja.
12. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 11, naznačeno time, što označava 5-fluoro-2'dezoksiuridin-5'-0-[1-naftil(benzoksi-L-alaninil)] fosfat (CPF373).
13. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 12 za upotrebu u postupku profilakse ili tretmana kancera kod čoveka, prioritetno naznačenog time, što je kancer izabran iz grupe koju čine leukemija, kancer pankreasa, prostate, pluća, dojke i grlića materice.
14. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13, u postupku profilakse ili tretmana kancera kod pacijenta: (I) koji je razvio ili ima potencijal da razvije rezistenciju u tumorskim ćelijama u odnosu na aktivnost 5-fluoracil ili 5-fluoro-2'-dezoksiuridina u profilaksi ili tretmanu kancera; (II) sa ćelijama koje sadrže snižen nivo transportnih proteina nukleozida; (III) sa ćelijama deficijentnim u nukleozid kinazi; (IV) sa ćelijama inficiranim mikoplazmama; i/ili (V) sa ćelijama koje sadrže povišen nivo timidilat sintaze (TS).
15. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 13 do 14 u kombinaciji sa drugom antitumorskom terapijom.
16. Farmaceutski preparat koji sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 12 u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem, diluentom ili ekscipijensom.
17. Postupak pripreme farmaceutske kompozicije koja podrazumeva korak kombinovanja jedinjenja prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 12 sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, nosačem ili diluentom.
18. Postupak pripreme jedinjenja opšte formule l u skladu sa patentnim zahtevom 1, koji podrazumeva reakciju jedinjenja opšte formule (II) sa jedinjenjem opšte formule (III)III naznačenim time, što Ar, R3, Ra, Rii R? imaju značenja opisana u patentnom zahtevu 1.
RS20160211A 2011-03-01 2012-02-29 Fosforoamidatni derivati 5-fluoro-2'-dezoksiuridina za upotrebu u tretmanu kancera RS54776B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1103582.1A GB201103582D0 (sr) 2011-03-01 2011-03-01
GBGB1105660.3A GB201105660D0 (en) 2011-04-01 2011-04-01 Chemical compounds
EP12709146.0A EP2681227B1 (en) 2011-03-01 2012-02-29 Phosphoramidate derivatives of 5-fluoro-2'-deoxyuridine for use in the treatment of cancer
PCT/GB2012/050457 WO2012117246A1 (en) 2011-03-01 2012-02-29 Phosphoramidate derivatives of 5 - fluoro - 2 ' - deoxyuridine for use in the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS54776B1 true RS54776B1 (sr) 2016-10-31

Family

ID=45841523

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160211A RS54776B1 (sr) 2011-03-01 2012-02-29 Fosforoamidatni derivati 5-fluoro-2'-dezoksiuridina za upotrebu u tretmanu kancera
RS20211549A RS62721B1 (sr) 2011-03-01 2012-02-29 Farmaceutska formulacija koja sadrži fosforamidatni derivat 5-fluoro-2’-deoksiuridina za upotrebu u lečenju kancera

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211549A RS62721B1 (sr) 2011-03-01 2012-02-29 Farmaceutska formulacija koja sadrži fosforamidatni derivat 5-fluoro-2’-deoksiuridina za upotrebu u lečenju kancera

Country Status (28)

Country Link
US (7) US8933053B2 (sr)
EP (4) EP2681227B1 (sr)
JP (1) JP5978232B2 (sr)
KR (1) KR101885940B1 (sr)
CN (2) CN104974206B (sr)
AU (1) AU2012223012C1 (sr)
BR (1) BR112013021986B1 (sr)
CA (1) CA2828326C (sr)
CL (1) CL2013002517A1 (sr)
CY (2) CY1117445T1 (sr)
DK (3) DK3447061T3 (sr)
ES (4) ES2569185T3 (sr)
HR (2) HRP20160346T1 (sr)
HU (2) HUE029022T2 (sr)
IL (1) IL228169A (sr)
LT (1) LT3447061T (sr)
MX (1) MX339822B (sr)
NZ (1) NZ615270A (sr)
PH (2) PH12013501723A1 (sr)
PL (3) PL3447061T3 (sr)
PT (2) PT3447061T (sr)
RS (2) RS54776B1 (sr)
RU (1) RU2614406C2 (sr)
SG (1) SG192841A1 (sr)
SI (2) SI3447061T1 (sr)
SM (2) SMT202100715T1 (sr)
WO (1) WO2012117246A1 (sr)
ZA (2) ZA201306468B (sr)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201016855D0 (en) 2010-10-06 2010-11-17 Nucana Biomed Ltd Chemical compounds
HRP20160346T1 (hr) 2011-03-01 2016-05-06 Nucana Biomed Limited Fosforoamidatni derivati 5-fluoro-2'-deoksiuridina za upotrebu u tretmanu raka
SI3150616T1 (sl) 2012-11-16 2017-08-31 University College Cardiff Consultants Limited Mešanica rp/sp gemcitabin-(fenil-(benziloksi-l-alaninil))-fosfata
WO2015013352A2 (en) * 2013-07-25 2015-01-29 Patel Hasmukh B Nucleoside phosphoramidates and phosphoramidites
CN104447923B (zh) * 2013-09-23 2018-03-30 中国药科大学 2’‑脱氧‑2’‑氟‑2’‑甲基核苷衍生物及其制备方法与在制药中的用途
RU2553996C1 (ru) * 2013-11-27 2015-06-20 Андрей Александрович Иващенко Замещенные (2r,3r,5r)-3-гидрокси-(5-пиримидин-1-ил)тетрагидрофуран-2-илметил арил фосфорамидаты
SG11201608303QA (en) 2014-04-04 2016-11-29 Del Mar Pharmaceuticals Use of dianhydrogalactitol and analogs or derivatives thereof to treat non-small-cell carcinoma of the lung and ovarian cancer
CA2947939A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 Idenix Pharmaceuticals Llc Nucleoside derivatives for the treatment of cancer
CN105153257B (zh) * 2014-06-12 2019-03-05 正大天晴药业集团股份有限公司 索非布韦的制备方法
SI3160978T1 (sl) 2014-06-25 2020-11-30 NuCana plc Gemcitabin predzdravila
PL225283B1 (pl) * 2014-07-24 2017-03-31 Univ Im Adama Mickiewicza W Poznaniu Pochodne 2,3’-anhydro-2’-deoksy-5-fluorourydyny o działaniu cytotoksycznym, sposób wytwarzania i zastosowanie
WO2016083830A1 (en) 2014-11-28 2016-06-02 Nucana Biomed Limited New 2' and/or 5' amino-acid ester phosphoramidate 3'-deoxy adenosine derivatives as anti-cancer compounds
DK3265102T3 (da) 2015-03-06 2025-10-13 Atea Pharmaceuticals Inc Beta-d-2'-deoxy-2'alpha-fluoro-2'-beta-c-substituerede-2-modificerede-n6-substituerede purinnukleotider til hcv-behandling
HK1252245A1 (zh) * 2015-05-27 2019-05-24 Idenix Pharmaceuticals Llc 用於治疗癌症的核苷酸
US10745435B2 (en) 2015-11-16 2020-08-18 Cerecor, Inc. Nucleic acid prodrugs
GB201522764D0 (en) 2015-12-23 2016-02-03 Nucana Biomed Ltd Formulations of phosphate derivatives
GB201609600D0 (en) * 2016-06-01 2016-07-13 Nucuna Biomed Ltd Cancer treatments
GB201609601D0 (en) * 2016-06-01 2016-07-13 Nucana Biomed Ltd Phosphoramidate compounds
US10711029B2 (en) 2016-07-14 2020-07-14 Atea Pharmaceuticals, Inc. Beta-d-2′-deoxy-2′-alpha-fluoro-2′-beta-c-substituted-4′fluoro-n6-substituted-6-amino-2-substituted purine nucleotides for the treatment of hepatitis c virus infection
SMT202200072T1 (it) 2016-09-07 2022-03-21 Atea Pharmaceuticals Inc Nucleotidi purinici 2'-sostituiti-n6-sostituiti per il trattamento dei virus rna
AU2017357052B2 (en) 2016-11-13 2022-03-24 Imagine Pharma, Llc Compositions and methods for treating diabetes, hypertension and hypercholesterolemia
AU2017378959B2 (en) 2016-12-23 2021-09-09 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. Nucleoside phosphate compound and preparation method and use thereof
RU2644156C1 (ru) * 2017-02-28 2018-02-08 Александр Васильевич Иващенко Пролекарство ингибитора NS5B HCV полимеразы, способ его получения и применения
GB201709471D0 (en) * 2017-06-14 2017-07-26 Nucana Biomed Ltd Diastereoselective synthesis of hosphate derivatives
WO2019028646A1 (en) * 2017-08-08 2019-02-14 Sun Yat-Sen University METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF TUMORS WITH MULTIPLE DRUG RESISTANCE
GB201713916D0 (en) * 2017-08-30 2017-10-11 Nucana Biomed Ltd Treatment regimens
GB201715011D0 (en) * 2017-09-18 2017-11-01 Nucana Biomed Ltd Floxuridine synthesis
GB201720279D0 (en) 2017-12-05 2018-01-17 Nucana Biomed Ltd Anticancer compounds
EP3763724A4 (en) * 2018-03-09 2022-01-12 Japan Science and Technology Agency SS-MODIFIED PHOSPHORIC ACID COMPOUND PRECURSOR, SS-MODIFIED PHOSPHORIC ACID COMPOUND, RESPONSE INHIBITOR AND DRUG THEREOF, AND RESPONSE INHIBITION METHOD
CN110387226A (zh) * 2018-04-20 2019-10-29 天津大学 一种用于检测肿瘤的荧光探针及用途
JP7525161B2 (ja) * 2018-11-30 2024-07-30 国立大学法人 東京大学 カルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ
GB201904544D0 (en) 2019-04-01 2019-05-15 NuCana plc Anticancer compounds
CN110840907B (zh) * 2019-08-16 2022-11-25 南京医科大学 一类自由基敏感的尿嘧啶类ProTide前药及其药物用途
WO2021173713A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Atea Pharmaceuticals, Inc. Highly active compounds against covid-19
US10874687B1 (en) 2020-02-27 2020-12-29 Atea Pharmaceuticals, Inc. Highly active compounds against COVID-19
AU2021331658A1 (en) * 2020-08-31 2023-03-30 Emory University 5'-substituted nucleoside monophosphates, prodrugs thereof, and uses related thereto
CN120584123A (zh) 2022-12-07 2025-09-02 努卡那有限公司 核苷衍生物nuc-3373的合成

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2802005A (en) 1957-08-06 S-eluorourace
US1002239A (en) 1902-04-11 1911-09-05 Stromberg Carlson Telephone Telephone system.
US2945038A (en) 1956-09-26 1960-07-12 Hoffmann La Roche 5-fluorocytosine and preparation thereof
US3201387A (en) 1963-09-18 1965-08-17 Heidelberger Charles 5-trifluoromethyluracil, derivatives thereof, and processes for preparing the same
US3792039A (en) 1971-12-27 1974-02-12 Miles Lab Poly 2'-fluoro-2'-deoxyuridylic acid
DD279248A1 (de) 1989-01-01 1990-05-30 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung von 2',3'-didesoxythymidin-5'-diamidophosphaten
GB9505025D0 (en) * 1995-03-13 1995-05-03 Medical Res Council Chemical compounds
RU2197964C2 (ru) * 1995-04-12 2003-02-10 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Фармацевтическая композиция, композиция стандартной лекарственной формы и способ лечения злокачественных новообразований, опухолей и вирусных инфекций
WO1999037753A1 (en) * 1998-01-23 1999-07-29 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic agents
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
HK1053126A1 (zh) 1999-07-22 2003-10-10 新生物生物公司 酶催化的治疗活化
DE10109657A1 (de) 2001-02-28 2002-09-05 Menarini Ricerche Spa Verfahren zur Herstellung von (E)-5-(2-Bromvinyl)-2`-desoxyuridin
JP2004534830A (ja) 2001-06-21 2004-11-18 グラクソ　グループ　リミテッド Ｈｃｖにおけるヌクレオシド化合物
GB0317009D0 (en) 2003-07-21 2003-08-27 Univ Cardiff Chemical compounds
WO2006063149A1 (en) 2004-12-09 2006-06-15 Regents Of The University Of Minnesota Nucleosides with antiviral and anticancer activity
GB0505781D0 (en) 2005-03-21 2005-04-27 Univ Cardiff Chemical compounds
CA2618335C (en) 2005-08-15 2015-03-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Antiviral phosphoramidates of 4'-substituted pronucleotides
WO2007056596A2 (en) 2005-11-09 2007-05-18 Wayne State University Phosphoramidate derivatives of fau
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
TWI583692B (zh) 2009-05-20 2017-05-21 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
CN101922935B (zh) 2010-07-16 2012-07-18 北京大学 一种最小互易结构干涉型全光纤陀螺仪
US9090642B2 (en) 2010-07-19 2015-07-28 Gilead Sciences, Inc. Methods for the preparation of diasteromerically pure phosphoramidate prodrugs
US20120070411A1 (en) 2010-09-22 2012-03-22 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleotide analogs
JP6012605B2 (ja) 2010-09-22 2016-10-25 アリオス バイオファーマ インク． 置換されたヌクレオチドアナログ
GB201016855D0 (en) 2010-10-06 2010-11-17 Nucana Biomed Ltd Chemical compounds
WO2012048013A2 (en) 2010-10-06 2012-04-12 Inhibitex, Inc. Phosphorodiamidate derivatives of guanosine nucleoside compounds for treatment of viral injections
ES2558779T3 (es) 2011-03-01 2016-02-08 Janssen Pharmaceutica, N.V. Derivados de 6,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]piracin-4-ilamina útiles como inhibidores de ß-secretasa (BACE)
HRP20160346T1 (hr) * 2011-03-01 2016-05-06 Nucana Biomed Limited Fosforoamidatni derivati 5-fluoro-2'-deoksiuridina za upotrebu u tretmanu raka
NO3119794T3 (sr) 2014-06-25 2018-03-10
WO2016083830A1 (en) 2014-11-28 2016-06-02 Nucana Biomed Limited New 2' and/or 5' amino-acid ester phosphoramidate 3'-deoxy adenosine derivatives as anti-cancer compounds
LT3197456T (lt) 2015-05-14 2018-07-10 NuCana plc Vėžio gydymas
GB201522764D0 (en) 2015-12-23 2016-02-03 Nucana Biomed Ltd Formulations of phosphate derivatives
GB201609600D0 (en) 2016-06-01 2016-07-13 Nucuna Biomed Ltd Cancer treatments
GB201709471D0 (en) 2017-06-14 2017-07-26 Nucana Biomed Ltd Diastereoselective synthesis of hosphate derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
ES2569185T3 (es) 2016-05-09
US10022390B2 (en) 2018-07-17
PL3447061T3 (pl) 2022-01-31
SMT201600132B (it) 2016-07-01
US20190201432A1 (en) 2019-07-04
HRP20211967T1 (hr) 2022-03-18
MX2013009815A (es) 2014-03-21
KR20140023913A (ko) 2014-02-27
US9221866B2 (en) 2015-12-29
SMT202100715T1 (it) 2022-01-10
JP5978232B2 (ja) 2016-08-24
BR112013021986A2 (pt) 2016-11-16
HK1192758A1 (zh) 2014-08-29
BR112013021986B1 (pt) 2021-07-27
CN103403013B (zh) 2016-03-16
PH12015500485B1 (en) 2017-04-10
CN103403013A (zh) 2013-11-20
SI3447061T1 (sl) 2022-02-28
CY1124871T1 (el) 2022-11-25
US20230165886A1 (en) 2023-06-01
US11925658B2 (en) 2024-03-12
ES2686219T3 (es) 2018-10-16
ZA201306468B (en) 2015-04-29
PH12013501723A1 (en) 2013-10-07
CA2828326C (en) 2019-05-07
US20150183817A1 (en) 2015-07-02
PH12015500485A1 (en) 2017-04-10
HUE029022T2 (en) 2017-02-28
RS62721B1 (sr) 2022-01-31
EP4023299C0 (en) 2025-08-20
EP3031812A1 (en) 2016-06-15
US20140057866A1 (en) 2014-02-27
DK3447061T3 (da) 2022-01-03
EP3031812B1 (en) 2018-08-01
EP4023299A1 (en) 2022-07-06
WO2012117246A1 (en) 2012-09-07
PT3031812T (pt) 2018-10-18
RU2013143862A (ru) 2015-04-10
HUE060127T2 (hu) 2023-02-28
EP4023299B1 (en) 2025-08-20
ES2903097T3 (es) 2022-03-31
PT3447061T (pt) 2021-12-23
US9655915B2 (en) 2017-05-23
JP2014506913A (ja) 2014-03-20
US10993957B2 (en) 2021-05-04
DK3031812T3 (en) 2018-09-17
US20170312302A1 (en) 2017-11-02
EP2681227A1 (en) 2014-01-08
MX339822B (es) 2016-06-13
DK2681227T3 (da) 2016-02-22
SG192841A1 (en) 2013-09-30
CY1117445T1 (el) 2017-04-26
CN104974206B (zh) 2019-08-23
ZA201409013B (en) 2016-02-24
US20160166596A1 (en) 2016-06-16
PL3031812T3 (pl) 2018-12-31
EP3447061B1 (en) 2021-11-24
EP2681227B1 (en) 2016-02-10
HRP20160346T1 (hr) 2016-05-06
US8933053B2 (en) 2015-01-13
CA2828326A1 (en) 2012-09-07
US20220023330A1 (en) 2022-01-27
SI2681227T1 (sl) 2016-04-29
PL2681227T3 (pl) 2016-08-31
CN104974206A (zh) 2015-10-14
KR101885940B1 (ko) 2018-08-06
EP3447061A1 (en) 2019-02-27
RU2614406C2 (ru) 2017-03-28
ES3039965T3 (en) 2025-10-28
US11559542B2 (en) 2023-01-24
AU2012223012A1 (en) 2013-05-02
NZ615270A (en) 2015-09-25
LT3447061T (lt) 2022-01-25
AU2012223012B2 (en) 2015-06-18
IL228169A (en) 2016-07-31
CL2013002517A1 (es) 2014-07-25
AU2012223012C1 (en) 2015-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS54776B1 (sr) Fosforoamidatni derivati 5-fluoro-2&#39;-dezoksiuridina za upotrebu u tretmanu kancera
HK40069170A (en) Phosphoramidate derivatives of 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine for use in the treatment of cancer
HK40001167A (en) Pharmaceutical formulation comprising a phosphoramidate derivative of 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine for use in the treatment of cancer
HK40001167B (en) Pharmaceutical formulation comprising a phosphoramidate derivative of 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine for use in the treatment of cancer
HK1192758B (en) Phosphoramidate derivatives of 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine for use in the treatment of cancer