RS54777B1 - Postupak za biološku borbu protiv pseudomonas - Google Patents

Abstract

Postupak za suzbijanje proliferacije Pseudomonas, izuzimajući postupke tretiranja koji se primenjuju na ljudskom ili životinjskom telu, naznačen time, što ovaj postupak koristi protozoe roda Willaertia magna.Prijava sadrži još 7 patentnih zahteva.

Description

Opis pronalaska

Ovaj pronalazak odnosi se na nov postupak za biološku kontrolu prisustvaPseudomonasai njegovu proliferaciju.

Pseudomonas jegram-negativna bakterija koja pripada familijiPseudomonadaceae.Kod ljudi ova bakterija je odgovorna za razne kožne, viscelarne i plućne infekcije, naročito za cističnu fibrozu (4, 19). Ove bakterije uspešno se opiru brojnim antisepticima i antibioticima (2) (7), što bez sumnje objašnjava njihovo rastuće često prisustvo u bolnicama gde se mogu izolovati iz vlažnih sredina (lavaboi, sifoni, vaze, peškiri i predmeti koji se peru, kontejneri sa vodom itd). Neke vrste takođe imaju patogenu snagu prema biljkama {8), nematodama {10) i amebama (1,11,16). Prema tome, nadgledanje i kontrolisanje ove bakterije čini sve značajniju preokupaciju.

Uopšteno, poznato je da u okruženjuPseudomonasima sve prisutnu distribuciju (5), jer je ova bakterija izolovana iz zemlje, kanalizacije ili iz industrijskih otpadnih voda i biofilmova, što su karakteristike koje deli sa amebama iz okruženja. Nekoliko potencijalno patogenih bakterija( Legionella pneumophila, Mycobacterium spp., i Escherichia coli 0157:H7)razvilo je mehanizam preživljavanja i replikovanja u amebama u okruženju (15).Pseudomonasmože da razvije nekoliko strategija koje mu omogućavaju da izbegnu predaciju od strane ameba iz okruženja (12,13, 18). Određenije, formiranje biofilma od stranePseudomonas aeruginosaje jedan od mehanizama koji omogućava toj bakteriji da efektivno izbegne predaciju od strane ameba iz okruženja kao što jeAcanthamoeba polyphaga(18). lako je poznato da neke amebe iz okruženja kao što jeAcanthamoebamogu da razviju hemotaktički odgovor premaPseudomonasui prema ishrani tim bakterijama (17,18) takođe je pokazano daPseudomonas aeruginosabrzo inhibira rast ovih ameba i indukuje njihov encistment i smrt izlučenim toksinima (11-13, 17,18). Toksični efekatPseudomonasatakođe je pokazan i kod protozoa sa cilijama (9).

Zbog toga je jasno da slobodne protozoe i amebe čine važan element ekologijePseudomonasa.Šta više sposobnostPseudomonasada inficira i intracelularno preživi u protozoama je moćan indikator da su ove protozoe faktori koji promovišu otpornostPseudomonasaprema biocidnim tretiranjima kakva se danas koriste, kao što je ukazao Michel et al., (14).

U ovom kontekstu pronalazači su demonstrirali potpuno neočekivano da rod amebaWillaertia magnauništava bakterijuPseudomonas.Ovaj biocidni efekat dodaje se već prikazanoj sposobnostiWillaertia magnaza predaciju prema drugim amebnim agensima koji mogu da služe kao vektor za

Pseudomonas (3).

Predmet ovog pronalaska je zbog toga prvenstveno da obezbedi postupak za kontrolisanje proliferacijePseudomonasakoji koristi protozoe rodaWillaertia magna.Postupci prema ovom pronalasku ne uključuju postupke lečenja koji se primenjuju na ljudskom ili životinjskom telu. U postupku prema ovom pronalasku najčešće se tretira struja gasa ilitečnosti protozoama vrsteWillaertia

magna.

Postupak prema ovom pronalasku naročito se može primeniti za dezinfekciju sanitarne vode ili distribucionih mreža industrijske vode, rashladne tokove za industrijske pogone ili mreže za kondicioniranje vazduha. Protozoe se mogu dodavati direktno vodi ili tečnostima koje cirkulišu kroz cevi mreža koje treba da budu tretirani. Takođe je moguće da se prskaju, na primer u obliku vodenog rastvora kao aerosol, u industrijske mreže, dimnjake i pogone i na industrijske površine koje treba da se dezinfikuju.

Pogodne protozoe za korišćenje u kontekstu ovog pronalaska odgovaraju soju deponovanom 26. avgusta 2006. godine pod brojem PTA 7824 u ATCC, ili soj deponovan 26. avgusta 2006. godine pod brojem PTA 7825 u ATCC, gde su ta dva soja deponovani u ime CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFiaUE (CNRS) - 3 rue Michel Ange 75794 Pariš Cedex 16 / France i UNIVERSITE LYON 1 Claude Bernard -43 Boulevrad du 11 Novembre 1918 - 69622 Villeurbanne Cedex / France.

Protozoe koje pripadaju roduWillaertia,a koje odgovaraju soju deponovani pod brojem PTA 7824 u ATCC ili soju deponovanom pod brojem PTA 7825 u ATCC čine sastavni deo ovog pronalaska. Pomenuti deponovani sojevi PTA 7824 i PTA 7825 takođe su opisani u objavi PCT međunardone prijave WO 2008/043969.

Te protozoe se stoga mogu koristiti u dezinfekcionim agensima koji su naročito namenjeni za eliminisanjePseudomonasbakterije i za kontrolisanje proliferacije i kontaminacije od strane

Pseudomonas.

Pored toga predmet ovog pronalaska je dezinfekcioni agens koji sadrži protozoe vrsteWillaertia magna.Pogodne su protozoe koje odgovaraju soju deponovanom pod brojem PTA 7824 u ATCC ili koje odgovaraju soju deponovanom pod brojem PTA 7825 kod ATCC. Pogodan je dezinfekcioni agens prema ovom pronalasku u obliku vodenog rastvora ili suspenzije, na primer u destilovanoj vodi. Dezinfekcioni agens može biti u obliku pogodnom za raspršivanje, na primer kao aerosol ili bilo koje drugo sredstvo primene.

Inhibirajuća aktivnost proliferacijePseudomonasakoju pokazuje protozoa vrsteWiilaertia magna, jedemonstrirana od strane pronalazača upoređivanjem replikacijePseudomonasau rodovimaAcanthamoebaiHartmannellakorišćenim u amebnim modelima sa onom zapaženom kod amebnog rodaWillaertia.Aktivnost protozoe vrsteWiSlaertia magnatakođe je prikazana pokazivanjem efekta predacijeWillaertia magnana biofilmovima formiranim od stranePseudomonas aeruginosas.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na upotrebu dezinfekcionog agensa ili protozoana kakav je gore opisan, kao biocida protivPseudomonasa.

Budući da esencijalnu ulogu na proliferaciju i održavanjePseudomonasau spoljašnjem okruženju igraju amebe, postupak i dezinfekcioni agens prema ovom pronalasku imaju brojne prednosti u pogledu cene, efektivnosti, a naročito ekološke prihvatljivosti.

Primeri koji slede ilustruju pronalazak, ali nemaju ograničavajuću prirodu.

Fig. 1 prikazuje spontanu evoluciju respektivne populacijeHartmannella vermiformis("kvadratni" simbol ■ )Acanthamoeba castellanii("dijamantski" simbol ♦) iWillaertia(VViilaertia magna "trouglasti" simbol A) amebe posle stavljanja u kokulturu saPseudomonasomsa početnim odnosom ameba/bakterija od 10.

Razne amebe iz okruženja stavljene su u kokulturu (vreme 0 sati - TO} saPseudomonasomu odnosu od 10 {10 bakterija / 1 ameba) kao što je opisano u delu materijali i postuci. Uzeti su alikvoti suspenzija kokulture svaka 3 sata: tj TO, T0+3h, T0+6h. Procenat živih ameba utvrđen je puten tripan plavo testa isključenja i putem mikroskopskog posmatranja korišćenjem Mallasez ćelije. Rezultati su izraženi u % živih ćelija, negativ u tripan plavo testu isključenja.

Fig. 2 prikazuje rastPseudomonasau kokulturi saAcanthamoebaiHartmannella,ali ne i sa

VViilaertia.

Amebe (5x10'') suspendovane su u vodi i inokulisane u mreži. Posle jednog sata dodat jePseudomonas ubunarčiće da bi se postigli različiti MOI kao što je prikazano na ploči A. Kokulture su inkubisane na 30°C i ispitane posle 24 i 48 sati. A. Treba zapaziti odsustvo proliferacije bakterije u bunarčiću koji sadržiWillaertiasaPseudomonasom.B. 100 ul supernatanta bunarčića koj sadrži 100 bakterija /1 ameba i 10 bakterija / 1 ameba (MOI 100 i MOI 10 respektivno) su sukcesivno razblaživani (razblaženja u opsegu od IO"<6>do 10<8>sterilnom dejonizovanom vodom) i inokulisani na TSA agar. Treba zapaziti odsustvo razvoja kolonija bakterija u supernatantu kokultura saWillaertia magna(W), i obrnuto, jak razvojPseudomonasau prisustvuHartmannella(H).

Fig. 3 prikazuje uporednu kinetiku razvojaPseudomonas("dijamantski" simbol♦)razvoja dobijenog u kokulturi sa različitim rodovima ameba, uključujući rodVViilaertia ( VViilaertia magna -"ukršteni" simbol X).

Različite amebe iz okruženja su zasebno stavljene u kokulture (vreme 0 sati = TO) saPseudomonasomu odnosu od 10 (10 bakterija / jedna ameba). Alikvoti suspenzija kokultura uzimani su svaka 3 sata: tj TO, T0+3h, T0+6h, a koncentracijePseudomonasaodređivane su kao stoje opisano u delu materijali i postupci. Pozitivna kontrola koja obuhvata samo bakterijePseudomonas ukoncentracijama ekvivalentnim onim kokultura, služe kao kontrola za rastPseudomonasau medijumu. Treba zapaziti multiplikaciju bakterija u kokulturama saAcanthamoeba castellanii{"kvadratni" simbol ■ ) iHartmannella vermiformis("trouglasti" simbol A).

Fig. 4 prikazuje biocidni efekatVViilaertia magnana biofilm formiran odPseudomonasa.

PseudomonasiVViilaertia magnainokulisani su na TSA agar i inkubisani na 30°C tokom 24h. A.Pseudomonasbiofilm prekrivne lize stvaraju se na i izvan naslagaWillaertia magnai obeležene strelicama na Fig. 4A. B. Prednji deo biofilm prekrivnih liza označen strelicom. Treba zapaziti na desnoj strani mesto naslageVViilaertia magnau odsustvu bakterijskog filma. Treba zapaziti, na levoj strani sloj

Pseudomonasa.

1. MATERIJALI I POSTUPCI

1.1Korišteni sojevi:

Pseudomonas:korišćeni soj je soj CL 5210 (Oxoid, France).

Održava se na TSA (Trvptone Soja Agar) (ref PO 5012 Oxoid, France) brzinom od jedne subkulture nedeljno. Soj je inokulisan širokim zasejavanjima na TSA ploči i inokulisan 2 dana pri 30°C.

Amebe:korišćeni sojevi pripadaju trima amebnim vrstama:

oHartmannella vermiformis,

oAcanthamoeba castellanii,(ATCC 30010)

oVViilaertia magna(sojevi deponovani u ATCC pod br, PTA 7824 i PTA 7825).

Ova tri soja kuitivisana su aksenično u prisustvu 10% fetalnog goveđeg seruma na SCGYEM (Serum Casein Glucose Yeast Extract Medium) hranljivoj podlozi smeštenoj u FALCON<®>epruvete

(3033) u porcijama od 3ml po epruveti. U održavanju, vegetativne forme su subkulturisane svakih 8-9

dana. Za kokulture korišćene su 3- do 4-dnevne subkulture tako da se dobiju trofozoite u fazi eksponencijalnog rasta.

SCGYEM hranljiva podloga dobijena je kao što sledi:

U 900ml destilovane vode dodato je 2,5 ml NaOH (1N), a zatim Na;HP04j KHZP04. Mešavina je blago zagrevana na toploj ploči, a zatim je postepeno dodavan kazein uz magnetno mešanje. Pošto se kazein rastvorio, inkorporisani su glukoza i ekstrakt kvasca.

Posle potpunog rastvaranja mešavina sukcesivno filtrirana kroz staklena vlakna (SARTORIUS SM 6513400), a zatim kroz membranu lum (vVHATMAN 7190 004). Hranljiva podloga je alikvotirana u staklene boce. Boce su sterilizovane u autoklavu 20 minuta pri 120°C. pre konačne upotrebe i distribucije hranljive podloge sterilno je dodat fetalni goveđi serum ispod haube sa laminarnim tokom, u odnosu od 10% od konačne zapremine,

1.2. Monoamebna kokultura Pseudomonasa

1.2.1. Pripremanje bakterijskog inokuluma:

SuspenzijaPseudomonasau sterilnoj destilovanoj vodi pripremljena je od 2-dnevne kulture na TSA, tako da se dobije 1 jedinica optičke gustine na 550nm, tj koncentracija od 10<9>CFU (jedinice koje obrazuju koloniju) /ml.

1.2.2. Izvođenje monoamebnih kokultura

Kokulture su izvedene u epruvetama za kulture ćelija {FALCON<®>3033) koje sadrže 3ml autoklavom sterilisane vode. Inokulisanje epruveta izvedeno je u odnosu od lxl0<5>ameba/ml, iz aksenične amebne suspenzije prethodno izlivene na Malassez hemocitometar. Infestacija amebaPseudomonasomizvedena je fiksiranjem odnosaPseudomonas/ amebaod 10, tj lxl0<6>bakterija/ml inkubacione podloge. Odmah posle infestacije epruvete sa kokulturama su centrifugirane malom brzinom (760g tokom 10 min) da bi se ostvario kontakt između ameba i bakterija. Posle 10 minuta epruvete su ručno resuspendovane i inkubisane, u nagnutom položaju u inkubatoru na 30°C. Nastanci kokultura u koje su stavljene amebe iPseudomonasodređeni su na sledeći način: Kokulture su posmatrane 6 sati posle bakterijske infestacije. U svakom intervalu vremena (svaka 3 sata), epruvete kokulture su uzorkovane i ispitane i na amebe i na bakterije posle brzog mešanja na vorteksu kako bi se amebe razdvojile od zidova. Za svaku ispitanu epruvetu:

Amebe su brojane direktno na Malassez ćeliji.

KoncentracijePseudomonasaodređene su direktnim prevlačenjem podloge kulture na TSA

posle 10 do 10-strukih razblaživanja u sterilnoj destilisanoj vodi, u Eppendorf mikroepruvetama. Svako razblaženje je prevučeno tri puta na TSA u odnosu od lOOu.1 po ploči. Ploče su zatim inkubisane na 30°C tokom najmanje 48 sati. Prvo očitavanje TSA izvedeno je 24 sata posle prevlačenja, brojanjem kolonija; njega je pratilo drugo očitavanje drugog dana radi potvrđivanja. KoncentracijePseudomonasaizražene su u CFU/ml inkubisanog medijuma uzimajući u obzir faktor razređenja uz pretpostavku da svaka kolonija odgovara jednoj inicijalno prisutnoj bakteriji u razblaženoj suspenziji.

Za svaki amebni rod krive rastaPseudomonasaprikazane su u funkciji vremena.

Pored toga mogući citotoški efekatPseudomonasana razne amebne vrste utvrđen je na sledeći način: • brojanjem odnosa ameba koje su pozitivne u tripan plavom testu isključenja. Ovaj test izvodi se pod mikroskopom brojanjem, u Malassez ćeliji broja tripan pfavo pozitivnih ćelija / ukupnog broja ćelija.

1.3.EfekatVViilaertia magnana biofilmovePseudomonasa

VViilaertiasu deponovane u slojPseudomonasakoji je upravo prevučen preko TSA. Agari su stavljeni na 30"C tokom 24 sata kako bi se omogućio razvoj filma bakterija na površini agara. Agari su zatim posmatrani pod optičkim mikroskopom (uvećanje 400x) kako bi se u njima detektovalo formiranje mogućih prevlaka liza bakterijskog sloja.

2. REZULTATI

2.1.VViilaertia magnapokazuje otpornost naPseudomonas

EfekatPseudomonasana preživljavanje raznih testiranih amebnih vrsta određen je putem tripan plavo testa isključenja. Vrlo brzo posle stavljanjaAcanthamoeba castellaniiu kokulturu sa bakterijom dešava se glavni citotoksični efekat u amebnim vrstama, uz pad od~30% u održivosti posle 3 sata kokulture (videti Fig. 1). Obrnuto, ovaj fenomen nikada se ne zapaža kada seVViilaertia magnastavi u kokulturu saPseudomonasomuključujući inkubaciju do 9 sati sa održivošću koja se održava blisko 100%

(Fig. 1). Slično kaoVViilaertia magnaamebaHartmannella vermiformisiz okruženja ne pokazuje bilo kakav pad u pogledu održivosti kada se utvrđuje tripan plavo isključenje (Fig. 1). Sva ova zapažanja (ne postoji encistment i ne indukuje se citotoksičnostPseudomonasom)jasno pokazuju daVViilaertia magnaiHartmannella vermiformis,za razliku od drugih amebnih vrstatipa Acanthamoeba castellaniipokazuju početnu sposobnost da se opiruPseudomonasu.

2.2.PredacijaPseudomonasaod straneVViilaertia magna

Rezultati kokulturaPseudomonasadobijeni u prisustvu ameba koje pripadaju roduHartmannella i Acanthamoebapokazuju značajnu multiplikaciju bakterije u prisustvu ova dva amebna roda, jer se zapaža porast bakterijske koncentracije za 6 sati (videti Fig. 2). Obrnuto, (iako su kokulture izvedene pod striktno identičnim uslovima) zapaža se smanjenje od oko jednog logaritma u koncentracijamaPseudomonasakoje se mogu detektovati u prisustvu amebeVViilaertia magnau poređenju sa kontrolom koja sadrži samoPseudomonas(videti Fig. 2 i Fig. 3). Izmereni pad koncentracijaPseudomonasapokazuje veliki efekat predacijeVViilaertia magnapremaPseudomonasu.

VViilaertia magnaiHartmannella vermiformispreživljavaju ali samoVViilaertia magnasprečava bakterijsku proliferaciju. Ovaj efekatVViilaertia magnaenaPseudomonasdalje je ilustrovan na Fig. 3 i 4. Posle inkubacije od 48 sati u vodi kokultureAcanthamoebaiHartmannellasa bakterijom pokazuju proliferacijuPseudomonasa(zapaziti mutan izgled bunarčića koji sadržePseudomonasiHartmannellailiAcanthamoeba,usled bakterijske proliferacije) (Fig. 3, ploča A). KoncentracijePseudomonasautvrđene u supernatantu bunarčića kokulture pokazuju odsustvo bakterija saVViilaertia magna(Fig. 3, ploča B) kada su pomenute bakterije inkubisane pri MOI od 10 (10 bakterija/ jedna ameba).

Efekat predacijeWillaertia magnapremaPseudomonasutakođe je prikazan na Fig. 4. Stvarno, posle 24 sata u prisustvuVViilaertia magna,površine agara gde je bakterijski sloj nestao izgedaju vrlo bistro (ove zone se označavaju ovde kao bakterijski sloj - biofilm prevlake liza - Fig. 4 ploča A). Mikroskopska ispitivanja agara takođe pokazuju da jeVViilaertia magnakoncentrisana na granici ovih prevlaka liza; ovaj efekat takođe je ilustrovan na Fig. 4, ploča B, gde je nestanak bakterijskog sloja pod dejstvomVViilaertia magna \ asnouočljiv. Svi ovi podaci i zapažanja jasno pokazuju efekat predacijeVViilaertia magnaprema patogenoj bakterijiPseudomonaskoja se razvila u biofilmu.

Bibliografske reference

1. Abd H, VVretlind B, Saeed A, Idsund E, Hultenbv K, and Sandstrom G.Pseudomonasaeruginosa

utiltses its type III secretion svstem to kili the free-living amoeba Acanthamoeba castellanii. J Eukarvot Microbiol 55: 235-243, 2008.

2. Ashish A, Shaw M, Winstanley C, Ledson MJ, and VValshavv MJ. Increasing resistance of the

Liverpool Epidemic Strain (LES) ofPseudomonasaeruginosa (Psa) to antibiotics in cystic fibrosis (CF)-A cause for concern? J Cyst Fibros 2011.

3. Bodennec J, Dey R, and Pernin P. Nove! method for biologically combating the proliferation of

Legionella pneumophila, and novel disinfecting agent containing amoebic protozoa of the VViilaertia genus. edited by University CBL. France: 2010.

4. Bodey GP, Bolivar R, Fainstein V, and Jadeja L. Infections caused by Pseudomonas aeruginosa. Rev

Infect Dis 5: 279-313, 1983.

5. Bredenbruch F, Geffers R, Nimtz M, Buer J, and Haussier S. The Pseudomonas aeruginosa

quinolone signal (PQS) has an iron-chelating activity. Environ Microbiol 8: 1318-1329, 2006.

6. Davies B, Chattings LS, and Edvvards SW. Superoxide generation during phagocvtosis by

Acanthamoeba castellanii: similarities to the respiratory burst of immune phagocyt.es. J Gen Microbiol 137: 705-710, 1991.

7. Fernandez M, Conde S, de la Torre J, Molina-Santiago C, Ramos JL, and Duque E. Mechanisms of resistance to chloramphenico! by Pseudomonas putida KT2440. Antimicrob Agents Chemother 2011. 8. Fones H, and Preston GM. Reactive oxygen and oxydative stress toierance in plant pathogenic pseudomonas. FEMS Microbiol Lett doi: 10.1111/j. 1574-6968.2011.02449.x.[Epub ahead of print]: 2011. 9. Hahn MvV, Moore ER, and Hofle MG. Role of Microcolony Formation in the Protistan Grazing Defense of the Aquatic Bacterium Pseudomonas sp. MWH1. Microb Ecol39: 175-185, 2000. 10. lrazoqui JE, Troemel ER, Feinbaum RL, Luhachack LG, Cezairlivan BO, and Ausubel FM. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aure us. PloS Pathog 6:el000982, 2010. 11. Julia AG, and Morgan BM. The effects of selected strains of pigmented microorganisms on small free-living amoeba. Can J Microbiol 10: 579-584, 1964. 12. Matz C, Bergfeld T, Rice SA, and KjeilebergS. Microcolonies, quorum sensing and cytotoxiđty determine the survival of Pseudomonas aeruginosa biofilms exposed to protozoan grazing. Environ Microbiol 6: 218-226, 2004. 13. Matz C, Moreno AM, Alhede M, Manefield M, Hauser AR, Givskov M, and Kjelleberg S. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kili biofilm-associated amoebae. Isme J 2: 843-852, 2008. 14. Michel R, Burghardt H, and Bergmann H. Acanthamoeba, naturally intracellularly infected with pseudomonas aeruginosa, after their isolation from a microbiologically contaminated drinking water svstem ina hospital. Zentralbl Hyg Umweltmed 196: 532-544,1995. 15. Molmeret M, Horn M, VVagner M, Santic M, and Abu Kwaik Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl Environ Microbiol 71: 20-28, 2005. 16. dureshi MN, Perez AA, 2nd, Madayag RM, and Bottone EJ. Inhibition of Acanthamoeba species by Pseudomonas aeruginosa: rationale for their selective exclusion in corneal ulcers and contact lens care systems.J Clin Microbiol 31 :1908-1910, 1993. 17. Wang X, and Ahearn DG. Effect of bacteria on survival and grovvth of Acanthamoeba castellanii. Curr Microbiol 34: 212-215, 1997. 18. vveitere M, Bergfeld T, Rice SA, Matz C, and Kjelleberg S. Grazing resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms depends on type of protective mechanism, developmental stage and protozoan feeding mode. Environ Microbiol 7: 1593-1601, 2005. 19. Yang L, Jelsbak L, and Molin S. Mtcrobial ecology and adaptation in cystic fibrosis airways. Environ Microbiol 13: 1682-1689, 2011.

Claims (8)

1. Postupak za suzbijanje proliferacijePseudomonas,izuzimajući postupke tretiranja koji se primenjuju na ljudskom ili životinjskom telu, naznačen time, što ovaj postupak koristi protozoe rodaVViilaertia magna.

2.Postupak prema zahtevu1, naznačentime, što se gasoviti ili tečni tok ili čvrsta površina tretiraju protozoama rodaVViilaertia magna.

3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, n az n ače n t i me, što ove protozoe odgovaraju soju deponovanom pod brojem PTA 7824 u ATCC ili soju deponovanom pod brojem PTA 7825 u ATCC.

4. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 3, naznačen time, što se sprovodi radi dezinfekcije sistema za distribuciju sanitarne vode ili industrijske vode, rashladnih kola industrijskog postrojenja ili sistema za kondicioniranje vazduha.

5. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 3, n a z n a č e nt i me, što se sprovodi za suzbijanje formiranja biofilmova u vodovodnim cevima i na površinama koje su ili nisu u kontaktu sa ljudskim ili životinjskim namirnicama.

6. Upotreba dezinfektanta koji sadrži protozoe rodaVViilaertia magna,kao biocid naPseudomonas,izuzimajući upotrebu tretiranja koji se primenjuje na ljudskom ili životinjskom telu.

7. Upotreba prema zahtevu 6, n a z n a č e n a t i m e, što protozoe odgovaraju soju deponovanom pod brojem PTA 7824 u ATCC ili soju deponovanom pod brojem PTA 7825 u ATCC.

8. Upotreba prema zahtevu6 ili 7, n a z n a č e n a t i m e,što je dezinfektant u obliku rastvora ili vodene suspenzije.