RS54840B1 - 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido(2,3-d)pirimidin-6-il)fenil)urea kao inhibitor raf kinaze za tretman kancera - Google Patents

Abstract

Jedinjenje, naznačeno time što je to 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, ili njena farmaceutski prihvatljiva so.Prijava sadrži još 11 patentnih zahteva.

Description

[0001]Kaskada signala kinaze Ras/Raf/mitogen-aktivirane protein kinaze (takođe poznata kao MAP2K; MAPK kinaza; i MAPK/ERK kinaza ili MEK)/kinaze regulisanog ekstracelularnog signala (ERK) (ovđe označena kao "Ras/Raf/MEK/ERK" ili "Ras/Raf/MEK/MAPK") je evolucijski zatvoren put koji igra integralnu ulogu u razvoju i homeostazi tkiva kod sisara. Ovaj put signalizacije sadrži kaskadu kinaze koja prenosi ekstracelulame signale do nukleusa kako bi se regulisale ekspresija gena i osnovne ćelijske funkcije. Ekspresija gena kontrolisana pomoću Ras/Raf/MEK/ERK puteva signalizacije reguliše fundamentalne ćelijske procese, uključujući proliferaciju, diferencijaciju, apoptoze i angiogeneze. Ove različite uloge Ras/Raf/MEK/ERK signalizacije su nenormalno aktivirane kod različitih tipova kancera. Mutacije u genima u okviru ovog puta mogu da dovedu do suštinski aktivnih proteina što dovodi do povećanja proliferacije ćelija i rezistencije na apoptoze.

[0002]Raf (serin/treonin-protein kinaza) je enkodirana sa familijom gena koja se sastoji od tri gena koja daju tri Raf izoformna člana (B-Raf, C-Raf (Raf-1) i A-Raf). Svaki od ovih proteina deli strogo zatvorene amino-terminalne regulatorne regione i kataliliČke domene na karboksi završetku. Ukoliko nije drugačije navedeno. Raf se odnosi na sva tri Člana. Mada svaki izoform igra ulogu u Ras/Raf/MEK/ERK putu, pokazano je daje B-Raf glavni aktivator MEK. B-Raf je privučen od strane Ras:GTP na intracelularnu ćelijsku membranu gde se B-Raf aktivira. Nasuprot tome, B-Raf je odgovoran za aktivaciju MEKI/2, a MEKI/2 aktivira ERK1/ERK2. Mutacije u B-Raf genu omogućavaju da B-Raf šalje signal nezavisno od signala koji idu unapred. Kao rezultat toga, mutirani B-Raf protein (kao što je V600E) dovodi do prekomeme signalizacije MEK i ERK unazad. Ovo dovodi do prekomerne proliferacije i preživljavanja ćelija i onkogeneze. Prekomerna aktivacija kaskade signalizacije mutiranim B-Raf je implicirana u višestrukim malignitetima.

[0003]Receptor tirozin kinaze (RTK) c-Kit (takode poznat kao CD 117), se pojavljuje na velikom broju različitih tipova ćelija, Eigand za c-KIT je faktor stem ćelija (FSC). Vezivanje FSC za ekstracelularni domen c-KIT-a indukuje dimerizaciju receptora i aktivaciju signalizacije puteva unazad, uključujući RAS/RAF/MEK/ERK put. Mutant c-KIT je impliciran u patogenezama više kancera.

[0004]Uprkos B-Raf specifičnim inhibitorima (kao što je vemurafenib) i jedinjenjima kao što sujedinjenja otkrivena u WO 2006/039718 i WO 2008/034008, postoji potreba za Raf inhibitorom aktivnim u inhibiciji svih izoformnih oblika Raf proteina, uključujući A-Raf, B-Raf, C-Raf i B-Raf V600E mutaciju. Postoji dalja potreba za Raf inhibitorom koji deluje na ćelije tumora sa aktivacijom puteva unapred. deluje na mutacije N-Ras, mutacije K-Ras i cKit mutacije. Osim toga, ostaje potreba da se obezbede alternativni Raf inhibitori za tretman kancera. Takođe ostaje potreba da se obezbede Raf inhibitori aktivni u inhibiciji A-Raf, B-Raf, C-Raf i B-Raf V600E mutacije za tretman kancera. U skladu sa tim, ovaj pronalazak obezbeđuje Raf inhibitor koji može da deluje na inhibiciju svih izoformnih oblika Raf proteina. Takođe, ovaj pronalazak obezbeđuje Raf inhibitor koji može da deluje na ćelije tumora aktivacijom puteva unapred N-Ras mutacije, K-Ras mutacije i cKit mutacije. Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje alternativni inhibitor za Raf. Osim toga, ovaj pronalazak obezbeđuje alternativni inhibitor za Raf koji može da bude koristan za lečenje kancera. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje alternativni inhibitor za Raf koji deluje na inhibicijuA-Raf, B-Raf, C-Raf i B-Raf V600E mutacije. Isto tako, ovaj pronalazak obezbeđuje alternativni inhibitor za Raf koji deluje na inhibiciju A-Raf, B-Raf, C-Raf i B-Raf V600E mutacije, što može da bude korisno za lečenje kancera.

[0005]Slika 1 predstavlja difrakciju X-zraka praškastog uzorka za Primer1.

[0006]Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je l-(3,3-dimetilbutil)-3- (2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d|pirimidin-6-il)fenil)urea. ili njena farmaceutski prihvatljiva so.

[0007]Kao poseban aspekt, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-mctil-5-(7-metiI-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin- 6-il)fenil)urea.

[0008]Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metiI-2-(metilamino)pirido[2,3-d]piriniiđin-6-il)fenil)ureu. ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje l-(3.3-dimetiIbu(il)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metiI-2- (metilamino)pirido|2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)ureu, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0009] Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-dJpirimiđin-6-il)fenil)ureu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijenl. Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)ureu i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.

[0010] Kao poseban aspekt, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)ureu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so i polivinil pirolidon vinil acetat (PVP-VA). Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja ulkjučuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metii-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-iI)fenil)ureu i polivinil pirolidon vinil acetat (PVP-VA). Osim toga, ovaj pronalazak obezbeđuje preferirane aspekte farmaceutskih kompozicija koje su prethodno ovde opisane, u kojima je PVP-VA izabran iz grupe koja sadrži Kollidon® VA 64 i Plasdone™ S-630 kopovidon. Preferirano, PVP-VA je Kollidon® VA 64.

[0011] Savremena preferirana formulacija uključuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-{2-fluoro-4- metil-5-f7-metil-2-(metil-amino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il]fenil}ureu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa Kollidon® VA 64 (BASF Corporation Product No. 95405-2-43), kopolimerom l-vinil-2-pirolidona i vinil acetata u odnosu 60:40 i sa 1-2% (m/m) natrijum lauril sulfata. Izradi se čvrsta disperzija koja može da sadrži 20% ili 40% leka i može da uključi 0-2% natrijum lauril sulfata ili odgovarajuću količinu drugog pogodnog farmaceutski prihvatljivog sredstva za vlaženje, plastifikator, pomoćna tehnološka sredstva ili drugi pogodni ekscipijent(e).

[0012] Ovaj pronalazak otkriva postupak za lečenje kancera koji uključuje primenu na pacijentu kome je to potrebno, efektivne količine l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil- 5-(7-metil-2-(melilamino)pirido[2.3-d]pirimidin-6-il)fenil)uree, ili njene farmaceutski prihvatljive soli. Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje kancera koji uključuje primenu na pacijentu kome je to potrebno, efektivne količine l-(3,3- dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-mctil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6- il)fenil)uree.

[0013] Ovaj pronalazak obezbeđuje 1-(3,3-dimetilbiml)-3-(2-fluoro-4-metil-5- (7-metii-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)ureu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u terapiji. Ovaj pronalazak obezbeđuje l-(3,3-dimetiIbutil)- 3-(2-fluoro-4-mctil-5-(7-mctil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)ureu. ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u tretmanu kancera. Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju kancera, farmaceutsku kompoziciju koja uključuje 1 -(3.3-dimetiIbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metiI-2-(metilamino)pirido[2,3- dJpirimidin-6-il)fenil)ureu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

[0014] Ovaj pronalazak obezbeđuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-lfuoro-4-metil-5-(7-metil- 2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)ureu za upotrebu u terapiji. Ovaj pronalazak obezbeđuje 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)ureu za upotrebu u tretmanu kancera. Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju kancera, farmaceutsku kompoziciju koja uključuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(mctilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)feni])ureu.

[0015] Ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5- (7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)uree, ili njene farmaceutski prihvatljive soli, u proizvodnji medikamenta za tretman kancera. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5- (7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)uree u proizvodnji medikamenta za tretman kancera.

[0016] Ovaj pronalazak obezbeđuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-lfuoro-4-metil-5-(7-metiI- 2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)ureu u kristalnom obliku. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3- d]pirimiđin-6-il)fenil)ureu u kristalnom obliku koji karakteriše difrakcija X-zraka praškastog uzorka sa karakterističnim pikovima u 20 ± 0.2, koji se javljaju na 16.0 ijedan ili više na 6.9, 7.0, 18.2 i 23.2.

[0017] Osim toga, ovaj pronalazak otkriva preferirane aspekte postupaka i upotrebe koji su ovde opisani, pri čemu je kancer izabran iz grupe koja sadrži akutnu mijelogenu leukemiju (AML, akutna mijeloidna leukemija), hroničnu mijeloiđnu leukemiju (HML), hroničnu limfoblastnu leukemiju (HLL), mijeloiđnidisplaslični sindrom, kancer jajnika, melanomu, kancer malih ćelija pluća, kancer ne-malih ćelija pluća, kancer kolorektuma, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jetre i kancer Štitaste žlezde. Još preciznije, kancer je izabran iz grupe koja sadrži kancer štitaste lezde, kancer jajnika, melanomu, akutnu mijelogenu leukemiju (AML, akutna mijeloidna leukemija) i kancer kolorektuma. Čak još preciznije, kancer je melanoma ili kancer kolorektuma.

[0018] Ovaj pronalazak otkriva postupak za lečenje kancera kao što su kancer štitaste žlezde. kancer jajnika, melanoma, AML ili kancer kolorektuma kod pacijenata, koji uključuje primenu na pacijentu kome je to potrebno, efektivne količine l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(melilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)uree, ili njene farmaceutski prihvatljive soli.

[0019] Jedinjenje koje je l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, ili njene farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u terapiji.

[0020] Jedinjenje koje je l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-mctil-5-(7-metil-2-(mctilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fcnil)urea, ili njena farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretmanu kancera koji je kancer štitaste žlezde, kancer jajnika, melanoma, AML ili kancer kolorektuma.

[0021] Upotreba 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)uree, ili njene farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman kancera koji je kancer štitaste žlezde, kancer jajnika, melanoma, AML ili kancer kolorektuma.

[0022] U posebnom aspektu, farmaceutska kompozicija uključuje l-(3,3- dimetilbutil)-3-{2-fluoro-4-metil-5-[7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-dJpirimidin-6- il]fenil}ureu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i opciono drugim terapeutskim sastojcima.

[0023] U posebnom aspektu, farmaceutska kompozicija uključuje 1-(3,3-dimetilbutil)-3-{2-fluoro-4-metil-5-[7-metil-2-(metiIamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il]fenil}ureu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i opciono drugim terapeutskim sastojcima, posebno za tretman kancera uopšte ili specifičnog tipa kancera.

[0024] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule:

ili njegovunu farmaceutski prihvatljivu so.

[0025]Naziv "pacijent" označava sisare a "sisar" obuhvata, ali bez ograničenja na, ljude.

[0026]"Tcrapcutski efektivna kolčina" ili "efektivna količina" označava dozu jedinjenja, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži navedeno jedinjenje, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, neophodnu da inhibira B-Raf. C-Raf, A-Raf i/ili B-Raf V600H signalizaciju kod pacijenata sa kanecrom i ili uništi ciljane ćelije kancera ili uspori ili zaustavi progresiju kancera kod pacijenata. Anticipirane doze jedinjenja iz primera ili njegove farmeeutski prihvatljive soli. su u rasponu od 300 do 1500 mg/pacijent/dan. Predviđene su preferirane doze u rasponu od 400 do 1400 mg/pacijent/dan. Najpoželjnije predviđene doze su u rasponu od 600 do 1200 mg/pacijent/dan. Tačno predviđenu dozu za lečenje pacijenta i dužinu trajanja tretmana će da odredi lekar u zavisnosti od stanja i težine bolesti kao i specifičnih potreba i odgovora pojedinačnog pacijenta i u zavisnosti od određenog jedinjenja koje se primenjuje. Mada je određena kao doza na bazi dana, režim doziranja može da se podesi tako da obezedi mnogo optimalniju terapeutsku korist za pacijenta. Pored dnevnog doziranja, i doziranje dva puta dnevno (BID) ili tri puta dnevno (T1D) može da bude odgovarajuće. BID je trenutno preferirano.

[0027]Nazivi "treatman," "lečenje" i "tretiranje," treba da obuhvate čitav spektar intervencija za kancer od koga pacijent boluje, kao što su primena aktivnog jedinjenja kako bi se ublažio, usporio ili zaustavio jedan ili više simptoma kancera i da se uspori progresija kancera Čak i ukoliko kancer nije trenutno eliminisan.

[0028]Jedinjenje iz ovog pronalaska pokazano u primeru je preferirano formulisano kao farmaceutska kompozicija uz korišćenje farmaceutski prihvatljivog nosača ili uz korišćenje jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata i koja se primenjuje različitim putevima. Preferirano, ove kompozicije su za oralnu primenu. Ovakve farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici.Videti, na primer,REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro i saradnici, eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005).

[0029]Jedinjenje iz ovog pronalaska pokazano u primeru je sposobno da reaguje sa brojnim neorganskim i organskim kiselinama da formira farmaceutski prihvatljive soli nastale dodatkom kiseline. Ovakve farmaceutski prihvatljive soli i uobičajena metodolotija za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici.Videti, na primer,P. Stahl i saradnici,

HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE.

(VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge i saradnici, "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, januar 1977.

[0030] Treba da se razume da l-{3.3-dimeti!butil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil- 2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimiđin-6-il)fenil)urea, ili njena farmaceutski prihvatljiva so, može da se izradi različitim procedurama poznatim u tehnici, kao što su procedure opisane u daljem tekstu.

[0031] Primer 1 ima naziv: l-(3;3-dimetilbutil)-3-{2-fluoro-4-metil-5-[7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-dJpirimidin-6-il]fenil}urea; a takođe može da se nazove: N-(3,3-dimetilbutil)-N'-[2-fluorO'4-metil-5-[7-metil-2-(metilamino)piriđo["2,3d]pirimidin-6-il]fenil]urea; i drugi nazivi mogu da se koriste za nedvosmislenu identifikaciju Primera 1.

[0032] Jedinjenja korišćena kao osnovni početni materijali u sintezi l-(3,3- dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)piridof2,3-d]pirimidin-6- il)fenil)uree su dobro poznati i, kada nisu raspoloživi na tržištu, lako se sinletiŠu uz korišćenje datih specifičnih referenci, standardnim procedurama koje uobičajeno koristi stručnjak sa iskustvom u tehnici ili koje mogu da se nađu u opštim uputstvima.

[0033] Primeri poznatih procedura i postupaka obuhvataju one koji su opisani u referencama opštih uputstava kao Što su Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Ine, 1989; Compendium of Organic Svnthetic Methods, Volumcs 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistrv, Reactions Mechanisms and Structure, 5th Edition, Michacl B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4th Edition, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000, itd. i u referencama u njima naznačenim.

[0034] Kako se ovde koristi, sledeći nazivi imaju navedena značenja: "d6-DMSO" se odnosi na heksadeutero-dimetilsulfoksid; "DCM" se odnosi na đihlormetan; "DMSO" se odnosi dimetilsulfoksid; "F'tOAc" se odnosi etil acetat; "EtOH" se odnosi etanol; "HPLC" se odnosi visoko efikasnu tečnu hromatografiju; "IPAC" se odnosi izopropil acetat; "KF" se odnosi Karl Fischer; "MS" se odnosi masenu spektroskopiju; "MeOH" se odnosi metanol; "MTBE" se odnosi terc-butil metil etar; "NMR" se odnosi nuklearnu magnetnu rezonancu; "RT" se odnosi sobnu temperaturu; "THF" se odnosi tetrahidrofuran.

[0035] Ukoliko nije drugačije navedeno, ovde ilustrovana jedinjenja su imenovana i označena ili po ACDLABS ili po Symyx Draw 3.2.

Izrada 1

5-Bromo-2-fluoro-4-metilanilin

[0036]

Postupak A:

[0037]l-bromo-4-fluoro-2-mctilbenzen (30.0 g, 159 mmol) u koncentrovanoj sumpornoj kiselini (100 mL) se ohladi do približno -5°C i tretira u kapima sa azotnom kiselinom (11.00 mL, 174 mmol) u toku 20 minuta. Reaktivna smeša se ostavi da se zagreje na RT i meša 30 min. Sipa se preko izmrvljenog leda, uz mešanje i podeli pomoću terc-butil metil etra (MTBE) (200 mL). Vodeni sloj se izdvoji i ekstrahuje sa MTBE (2 x 50 mL). Organski slojevi se kombinuju., suše i koneenlruju pod sniženim pritiskom da se dobije l-bromo-4-fluoro-2- metil-5-nitrobenzen kao narandžasto obojeno viskozno ulje (39.0 g).

[0038]U boci za mućkanje se spoje sirovi l-bromo-4-fluoro-2-metil-5-nitrobenzen (32.4 g, 138 mmol), etanol (100 mL) i Raney Nickel (1.00 g, 17.04 mmol). Boca se napuni sa vodonikom (275 kPa) i mućka sve dok ne prestane apsorpcija vodonika. U reaktivnoj boci se pritisak normalizujc, katalizator se ukloni filtriranjem i filtrat upari do sušenja. Doda se MTBE, nakon toga ponovo filtrira i Filtrat upari. Ostatak se meša u heksanima. Čvrste supstance se sakupe filtriranjem, isperu sa hladnim heksanima i suše pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (17.8 g, 63% prinos) kao tamna čvrsta supstanca. MS (m/z): 204.0 (M+l)/206.0 (M+3).

Postupak B:

[0039]U bocu okruglog dna sa 4 grla opremljenu sa mehaničkom meŠalicom, termometrom, ispunjenu sa N2i u ledenom kupatilu se doda l-bromo-4-fluoro-2-metilbenzen (1.4kg, 7.4 mol), nakon toga se na 0-10°C doda koncentrovana H2SO4(6.3kg). Nakon mešanja u toku 10-20 minuta, smeša se ohladi na - 10~0°C i u porcijama se, u toku približno 6 sati, dodaje KNO3(0.82kg, 7.8 mol, 1.05 equiv.), održavajući temperaturu na -10~0°C. Nakon dodavanja, reaktivna smeša se zagreje na 10-20°C i prati pomoću TLC (EA: PE=1:20) i HPLC sve dok sadržaj 1 -bromo-4-fiuoro-2-metilbenzena nije <0.5 %. Smeša se sipa u smešu leda i vode (11.2kg, led: voda=l :1) i ekstrahuje dva puta sa MTBE (4.7L i 1.9L). Organski slojevi se kombinuju, isperu sa zasićenim slanim rastvorom (5.6kg) i koncentruju do 1.5—2V na temperaturi ispod 45°C, pod sniženim pritiskom. Ostatak se razblaži sa EtOAc (5.6L) i dobijeni rastvor se direktno koristi u sledećoj fazi (1.22kg (mt% korigovan), 70.5% prinos i 68.3% čistoća dctektovana apsorpcijom UV na 210 nm). 'H NMR (400 MHz, CDCb): 5 8.35 (s, J = 7.1 Hz, IH), 7.29 (d, J = 11.3 I Iz. IH), 2.59 (d, J = 6.8 Hz, 3H).

[0040]U bocu okruglog dna sa 4 grla opremljenu sa mehaničkom mešalicom, termometrom i ispunjenu sa N2se doda rastvor l-bromo-4-fluoro-2-metil-5-nitrobenzena (l.lćkg, 4.96 mol.) u EtOAc (5L) i 36% rastvor HC1 (4.9kg, 49.6 mol, 10.0 equiv.). Nakon mešanja od 5-10 minuta na 20-30°C, u porcijama se doda Fe prah (1.34kg, 24.0 mol, 4.8 equiv.), održavajući temperaturu na 20-30°C. Reakcija se prati pomoću TLC (EA: PE=1:10). Po završetku reakcije, pll vrednost se podesi na 2-3 koristeći NaHCO^i doda se Celite® (0.56kg). Smeša se meša 0.5-1 sat i filtrira. Čvrsta supstanca se ispere sa toluenom (2 x 2.6L). Fillrati se kombinuju i mešaju narednih 0.5-1 h pre nego što se slojevi razdvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa toluenom (2.6L). Organski slojevi se kombinuju, isperu sa slanim rastvorom (3L) i filtriraju kroz ploču silika gela (2-3 cm). Filtrat se koncentruje do 2-2.5L a ostatak se izmeša sa n-heptanom (3.3L). Nakon ponovne koncentracije do 2-2.5L, doda se n-heptan (1.65L). Smeša se ohladi na -10~0°C i meša 1 sat. Precipitat se sakupi filtriranjem, ispere sa n-heptanom (0.5L, prethodno ohlađen na -10—0°C) i suši da se dobije sirovi produkt naslovljenog jedinjenja kao smeđa čvrsta supstanca. Rekristalizacijom sirovog produkta sa n-heptanom (3.3L) dobija se beličasta do smeđa Čvrsta supstanca naslovljenog jedinjenja (527g, 52% prinos i 98% čistoća detektovana apsorpcijom U V na 210 nm). 'H NMR (400 MHz, d6-DMSO): 5 6.97 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 2.16 (s, 3H); l3C NMR (500MHz, CDCb): 5 21.41,

116.60, 118.30, 119.66, 127.22, 132.88,(149.37, 151.12); 19F NMR (400 MHz, CDCb): 5 151.14

Izrada2

2-Fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-l ,3,2-dioksaborolan-2-il)anilin

[0041]

Postupak A:

[0042J Kombinuju se 5-bromo-2-fluoro-4-mctilanilin (3.1 g, 15.2 mmol), bis(pinakolato)dibor (4.24 g, 16.7 mmol) i kalijum acetat (4.47 g, 45.6 mmol) u dioksanu (40 mL) i poprskaju sa argonom. Doda se [Lr-bis(difenilfosftno)ferocen]-dihIorpaladijum(lI)-dihlomietan kompleks (0.620 g, 0.760 mmol), poprska ponovo sa argonom i zagreva na 100°C u toku noći. Reaktivna smeša se izdvoji filtriranjem i koncentruje pod vakuumom. Prečisti se hromatografijom na silika gelu (0-50% EtOAc/heksani) da sc dobije naslovljeno jedinjenje (3.24 g, 85% prinos). MS (m/z): 252.1 (M+l).

Postupak B:

[0043] U bocu okruglog dna sa 4 grla, opremljenu sa mehaničkom meŠalicom, termometrom i ispunjenu sa N2se dodaju 5-bromo-2-fluoro-4-metilanilin (200g, 0.98 mol), CH3COOK (192g, 1.95 mol, 2.0eq), bis(pinakolato)đibor (248g. 0.98 mol, L0eq) i IPAC (3L). Nakon 30 min degasiranja sa N2, smeša se zagreje na 50°C i doda se Pd(dppf)Cb (8g, 4mt%). Reaktivna smeša se zagreva pod refluksom najmanje lOh dok sadržaj početnog materijala ne bude <2%

(GC). Smeša se ohladi na 20~30°C, filtrira preko Celite® ploče i ispere sa IPAC (1L). Filtrat se koncentruje do 400-500ml ostatka. Ostatak se izmeša sa n-heptanom (700ml), filtrira kroz Si02ploču i eluira sa IPAC/n-heptan (prvo 1/5, ~2L i nakon toga 2/5,~3L). Filtrat se koncentruje do 350-400ml. Doda se n-heptan (300ml) i smeša se ponovo koncentruje do 350-400ml). Ostatak (suspenzija) se ohladi na -I0~20°C, mesa 2-5 h i nakon toga filtrira. Sirovi produkt se rastvori u MeOH (200 ml) na 30-40 °C, nakon toga se polako, u kapima u toku 0.5-lh, dodaje H2O (600 ml). Suspenzija se ohladi na 20-30 °C. meša 1-2 h i nakon toga filtrira. Čvrsta supstanca se suši pod visokim vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca (183g, 74% prinos i 99% čistoća detektovana apsorpcijom UV na 210 nm); 'H NMR (400 MHz, CDCb): 8 7.42 (d, J = 10.2 Hz, IH), 7.01 (d, J = 12.4 Hz, IH), 3.76 (s, 2H), 2.64 (s, 3H), 1.55 (s, 12H);<l3>C NMR (500MHz, CDCb): 5 20.66. 20.67. 24.40, 82.93, 116.20, 124.37, 130.64, 135.02.(151.93, 153.37); 19F NMR (400 MHz, CDCb): 5 145.72

Izrada 3

Prop-l-en-2-il 2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5.5-tetrametil-l ,3,2-dioksaborolan-2-il)fenilkarbamat

[0044]

[0045]Kombinuju se 2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioksaborolan-2-il)aniIin (5.0 g, 19.91 mmol) i izopropenil hlorformat (2.40 mL, 21.90 mmol) u EtOAc (60 mL) sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO:?(60 mL) i meša na RT u toku 6 h. Slojevi se razdvoje, vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (2x), kombinovani organski slojevi se isperu sa slanim rastvorom, suše preko Na2S04i koncentruju da se dobije naslovljeno jedinjenje. Koristi se u narednoj reakciji bez naknadnog prečišćavanja (pretpostavljeni prinos 100%). MS (m/z): 336.2 (M+l).

Izrada 4

3,3-Dimetilbutan-1 -amin hidrohlorid

[0046]

[0047]U bocu okruglog dna sa 4 grla opremljenu sa mehaničkom mešalicom, termometrom i ispunjenu sa N2se doda 3,3-dimetilbutanal (200g, 2.0 mol). Nakon toga se u kapima doda 1 - fenilmetanamin (214g, 2.0mol, 1.0 equiv.). Reaktivna smeša se meša na 20~30°C u toku 2-5 sati sve dok se pomoću GC ne registruje više od 99% završene konverzije. Doda se NaCl (4 g) i vodena faza se odbaci. Doda se THF (800 ml) i smeša se koncentruje do 400ml. Ova operacija se ponavlja sve dok je KF ostatka manji od 0. 2%. Dodaju se TUF (800 ml) i t-BuOK (44.8g, 0.4 mol, 0.2eq). Smeša se zagreje na 60-65°C i meša sve dok se pomoću GC ne registruje sadržaj N-benziI-3,3-dimetil-butan-l-imina manji od 1%. Nakon hlađenja na 10-20°C, doda se voda (1500 ml) i smeša se ekstrahuje sa MTBE (2 x 1500 ml). Kombinovana organska faza se ispere sa zasićenim rastvorom NaCl (800 mi), ispita se uzorak na sadržaj vode i osigura sadržaj KF od 1% -2%. Dobijeni N-(3,3-dimetilbutil)-l-fenil- metanimin sc koristi direktno u narednoj fazi. (83% čistoće pomoću GC; GC- MS m/z 188.2 [M-II]+).

[0048]U bocu okruglog dna sa 4 grla opremljenu sa mehaničkom mešalicom, termometrom i ispunjenu sa N2se doda prethodno dobijeni rastvor N-(3,3-dimetilbutil)-l-fenil-metanimina

(412g, 2.18mol). 3.27L MTBE 1.3L THF) i HC1/MTBE rastvor (16%,398g, 1.74 mol, 0.8cq) se doda u kapima na 20-30°C. U toku dodavanja se precipitira bela čvrsta supstanca. Nakon mešanja u toku l-2h, alikvot uzorka suspenzije se filtrira. Osnovna tečnost se proveri pomoću GC. Ukoliko je sadržaj N-(3,3-dimetilbutil)-l-fenil-metanimina veći od 30%. dodaje se dodatna količina HC1/MTBE rastvora (45g, 0.10eq) sve dok je sadržaj N-(3,3-dimetilbulii)-l-fenil-metanimina između 20%~30%, kontrolisano sa GC. Čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem, ispere sa MTBE (870 ml) i suši pod N2da se dobije željeno naslovljeno jedinjenje kao beli kristalni materijal (195g, 65% prinos;<!>H NMR (400 MHz, d6-DMSO): 5 7.90 (s, 3H), 2.74 (m. 2H), 1.47 (m, 2H), 0.89 (s, 9H);<13>C NMR (500 MHz, d6-DMSO): 5 28.98,29.31,35.49, 40.34.

Izrada 5

l-(3,3-Dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetramctil-l,3,2-dioksaborolan-2-il)fenil)urea

[0049]

PostupakA:

[0050]Rastvor prop-1 -en-2-il 2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrameliI-l ,3,2-dioksaborolan-2-il)feniikarbamata (6.67 g, 19.90 mmol) u dioksanu (60 mL) se tretira sa 3,3-dimetilbutan- 1-aminom (2.42 g, 23.9 mmol) i 1-metilpirolidinom (0.169 g, 1.99 mmol) i zagreva na 75°C u toku noći. Smeša se ohladi na RT, čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem i ispere sa dietil etrom da se dobije naslovljeno jedinjenje (6.62 g, 88%) prinos nakon dve faze). MS (m/z): 379.2 (M+l).

Postupak B:

[0051]U bocu okruglog dna sa 4 grla opremljenu sa mehaničkom mešalicom, termometrom i ispunjenu sa N2 se dodaju 2-f1uoro-4-metil-5-(4,4.5,5-tetrametil-1.3,2-dioksaborolan- 2-il)anilin (40g, 0.159 mol), THF (600 ml) i NaIICO3(16.0g, 0.19 mol. 1.20eq). Smeša se ohladi na0~5°C i doda se u kapima fenil hlorformat (26.14g, 0.167 mol, 1.05eq). Reaktivna smeša se zagreje na 60°C i meša sve dok sadržaj 2-fluoro-4-metil-5-(4.4.5.5-tetrametil- 1,3.2-dioksaborolan-2-il)anilina ne bude <2%.Smeša se filtrira i čvrsta supstanca (so) se ispere sa THF (120 ml). Filtrat se koncentruje do 65~80ml. U ostatak se dodaju loluen (720 ml), 3,3-dimetilbutan-l-amin (HC1 so, 26.14g, 0.19 mol. 1,2eq) i TKA (20.87g. 0.21 mol, 1.3eq). Dobijena smeša se zagreva na 90°C i meša sve dok sadržaj međuproizvoda ne bude < 2%.Smeša se ohladi na 15~20°C, meša 2h i filtrira. Čvrsta supstanca se ispere sa toluenom (120 ml), H2O (2 x 400 ml) i suši pod visokim vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bcla Čvrsta supstanca. (54.9g, 91.3% prinos i 99% Čistoća detektovana aapsorpcijom UV na 210 nm); 'H NMR (400 MHz, dć-DMSO): 8 8.34 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.08 (s, 1H), 6.98 (d, J = 12.3 Hz, IH), 6.41 (s, IH), 3.08 (s, 2H), 2.38 (s, 3H), 1.36 (m, 14H), 0.90 (s, 9H);<l3>C NMR (500MHz, d6-DMSO): 8 21.12,24.65,29.37,29.58, 35.65,43.50,83.25, 104.32116.09, 125.02, 128.19. 138.71,(152.40.154.34), 154.81; 19FNMR(400 MHz, d6-DMSO): 8 136.34Izrada6

Etil 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-karboksilat

[0052]

Postupak A:

[0053]U intenzivno izmešanu suspenziju etil 4-hlor-2-(metiltio)pirimidin-5-karboksilata (200 g, 860 mmol) u etanolu (EtOH) (450 mL) se doda koncentrovani amonijum hidroksid (335 mL, 8.60 mol) i ostavi da se meša u toku noći. Čvrste supstance se sakupe filtriranjem, isperu sa EtOH (2 x 100 mL) i H30 (3 x 200 mL) i suše u vakuum sušnici (65~70°C) u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje (164.4 g, 90% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (m/z): 214.1 (M+l).

Postupak B:

[0054]Reaktivna posuđa se napuni sa ) 190g THF i 660g etil 4-hlor-2-(metilsulfanil)pirimidin-5-karafoksilata (1.0eq. 2.84 mol). Meša se u toku 20-30 minuta na 10-20 °C a nakonloga se u smešu doda 907 g NH3-H2O i 989 g EI3N. Smeša se zagreje na 45-55°C i mesa u toku 2-6h na 45-55°C. Nakon završene reakcije, smeša se ohladi na 8-I2°C i doda se 4000g vode. Mesa se 4-8h na 8-12°C, filtrira i ispere sa 200g vode. Fillcr pogača se suši pod vakuumom u toku 8-24h na 80°C da se dobije naslovljeno jedinjenje (560g; 98.8% Čistoća u 92% prinosa; [M+l]=213.8, 'H NMR (d6-DMSO, 400 MHz): 5 = 8.564 (s, IH), 8.278 (s, IH). 8.011 (s, IH), 7.649 (s, IH), 4.293-4.240 (dd, Ji=6.8. J2=14, 2H), 2.462 (s, 3H), 8 1.308-1.272 (m, 3H)).

Izrada7

4-Amino-2-(metiltio)pirimidin-5-il)metanol

[0055|

[0056]Rrastvor etil 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-karboksilata (72.3 g, 339 mmol) u tetrahidrofuranu (THF) (900 mL) se ohladi na 0°C. U kapima se u toku 1 h dodaje rastvor L1A1H4(2 M u THF) (195 mL, 390 mmol). Meša se 2 h na 0°C i reakcija ostavi u toku noći da se zagreje na RT. Smeša se ohladi na 0°C i pažljivo neutrališe dodavanjem po redu vode (15 mL), 20% vodenog rastvora KOH (15 mL) i vode (30 mL). Dobijena smeša se mesa 1 h. Suši se preko MgS04, filtrira, koncentruje pod sniženim pritiskom i suši pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (55.85 g, 96% prinos). MS (m/z): 172.1 (M+l).

Izrada 8

4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-karbaldehida

[0057]

Postupak A:

[0058] U suspenziju 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-iI)metanola (28 g, 164 mmol) u hlorformu (818 mL) se doda MnCh(49.8 g. 572 mmol) i reakcija zagreva 4 h na 55 °C (mereno iznutra). Vruća reaktivna smeša se filtrira a filter pogača se ispere sa toplim hloroformom i THF. Kombinovani filtrati se koncentruju pod sniženim pritiskom i suše pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (26.7 g, 96% prinos) kao bledo žuta čvrsta supstanca. MS (m/z): 170.1 (M+l).

Postupak B:

J0059]Reaktivna posuda se napuni sa 450 g (2.08 mol, 1.0 eq.) etil 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-karboksilata i 6750 mL (15.0 V) THF. U posebnu reaktivnu posudu se stavi 88.1 g (1.1 cq.) LiAlH4i 2250 g (5.0 V) THF. Ova LiAHU smeša se ohladi na -5~5°C. THF rastvor etil 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-karboksilata se u kapima doda u LiAlH4smešu na temperaturi ispod 10°C. Nakon dodavanja, smeša se meša 2-3 sata na 5-15°C. Ohladi se na -5-5°C i u kapima se doda 279 g (1.5 eq.) EtOAc na temperaturi nižoj od 20°C. Smeša se meša 1-2 sata na 10~20°C. U porcijama se doda 450 g (0.66 eq.) Na2S04.1 IOH2O na temperaturi nižoj od 20°C. Smeša se meša 1-2-sata na 10-20°C. Suspenzija se filtrira kroz diatomejsku zemlju. Filter pogača se i spere sa THF. U filtrat koji sadrži rastvor 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-il)metanola se doda 734 g (4.0 eq.) Mn02. Smeša se zagreje na 40°C. Smeša se mesa 6-8 sati na 40-45°C. Suspenzija se filtrira kroz diatomejsku zemlju. Filter pogača se ispere sa THF. Filtrat se kombinuje, koncentruje i u kapima se doda 1530 g (5.0 V) n-heptana. Smeša se meša 3-4 sata na 10~20°C. Suspenzija se filtrira a filter pogača se ispere sa heptanom. Filter pogača se suši pod sniženim pritiskom 10-16 h na 40-50°C da se dobije naslovljeno jedinjenje (276g; 97.9% čistoće u 75% prinosa; [M+l]=171.8, 'H NMR (d6-DMSO. 400 MHz): 8 = 7.887 (s, IH), 6.704 (s. 211), 5.066-5.042 (m, IH), 8 4.292-4.280 (d, 211), 2.392 (s, 3H); [M+l]=169.8, 'H NMR (CDCb, 400 MHz): 8 = 9.769 (s, IH), 8.414 (s, IH), 8.190 (s, IH), 5.772 (s, 111), 2.540 (s, 3H)).

Izrada 9

7-Metil-2-(metillio)pirido[2,3-đ]pirimidin-6-ol

[0060]

Postupak A;

[0061] U rastvor natrijum hidroksida (23.64 g. 591 mmol) i vode (200 mL) se dodaju 1 - hidroksipropan-2-on (24.3 mL, 355 mmol) i 4-amino-2-(metiltio)pirimiđin-5-karbaIdehiđ (50 g, 296 mmol). U suspenziju se doda EtOH (600 mL) i meša na RT u toku noći. Pažljivo se doda rastvor koncentrovane HC1 (50 mL) u vodi (350 mL). Doda se 1:1 smeša EtOH/H^O (100 mL) i čvrste supstance sakupe filtriranjem. Čvrsta supstanca se ispere sa smešom 1:1 KtOH/rhO (250 mL), ledeno hladnim EtOH (4 x 25 mL) i heksanima (2 x 250 mL). Suši se na 30-35°C u vakukum sušnici da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto smeđa čvrsta supstanca (34 g, 56% prinos). MS(m/z):208.1 (M+l).

Postupak B:

[0062| U reaktivnu posudu se sipa 2400 g (8.0 V) H20. 177.3 g (2.5 eq.) NaOH, 300.0 g (1.77moI, 1.0 eq.) 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-karbaldehida i 157.6 g (1.2 eq.) hidroksiacetona. Smeša se zagreje na 35-45°C i meša 10-20 h na 35-45°C. Smeša se ohladi na 5-15°C. U kapima se doda 4500 mL 1N HC1 i pH podesi na 3-4 na temperaturi nižoj od 15°C. Meša se 1-2 h na 10-15°C. Filtrira se i filter pogača ispere sa 300g vode. Filter pogača se suši pod sniženim pritiskom 16-24 h na 50~60°C da se dobije naslovljeno jedinjenje (372 g smeđe Čvrste supstance; 98.0% HPLC oblasti (analiza: 90.0%); 90% prinos; !H NMR (d6-DMSO,400 MHz): 5= 10.864 (s, IH), 9.276 (s, III), 7.529 (s, IH), 2.570 (s, 6 H)).

Izrada 10

7-Mctil-2-(metiltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il trifluorometansulfonat [0063[

Postupak A:

[0064] Kombinuju se 7-metil-2-(metiltio)piriđo[2,3-d]pirimidin-6-ol (25 g, 121 mmol), DCM (1100 mL) i piridin (98 mL, 1206 mmol) i smeša hladi u ledenom kupatilu sve dok unutrašnja temperatura ne bude <3°C. Anhidrid trifluorometansulfonske kiseline (24.5 mL, 145 mmol) se dodaje polako špricem takvom brzinom da se unutrašnja temperatura održava ispod 5°C. Reaktivna smeša se meša 2 h na 0°C. Ispere sa vodom (3 x 300 mL) i slanim rastvorom (300 mL), suši preko MgSCHi filtrira. Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom (temperatura vodenog kupatila - 35°C) i suši pod visokim vakuumom 2-3 h na RT. Ostatak se rastvori u DCM i prečisti hromatografijom na silika gelu (EtOAc/heksani). Frakcije se koncentruju da se dobije polu-čista čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca se triturira sa 20% EtOAc/heksani (100 mL), sakupi filtriranjem, ispere sa 20% EtOAc/heksani (2x10 mL) i suši pod vakuumom na RT da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo ružičasta čvrsta supstanca (28.6 g, 70% prinos). MS (m/z); 340.0 (M+l).

Postupak B:

[0065] U reaktivnu posudu sipa se 4000 mL (20.0 V) DCM i 208 g (1.0 mol, 1.0 eq.) 7-metil-2-(meliltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-ola. Smeša se meša 10-20 min. Na temperaturi nižoj od 20°C se doda 312 g (4.0 eq.) piridina. Smeša se ohladi na -5-0°C i u kapima se doda rastvor 416 g anhidrida trifluorometansulfonske kiseline (1.5 eq.) u DCM (2000 mL, 10.0 V) na temperaturi nižoj od 0°C. Nakon dodavanja, smeša se meša 2-3 sata na 0-5°C. Reakcija se neutrališe sa 2000 mL 1N rastvora FIC1 (2X). Ispere dva puta sa po 500 mL FLO. Doda se 100.0 g silika gela i meša 1-2-sata na 10-20 °C. Smeša se filtrira kroz diatomejsku zemlju. Filtrat se koncentruje i uz mešanje se u kapima, na 10-20°C doda n-heptan 1000 mL (5.0 V). Smeša se meša 3-4 sata na 10-20°C. Filtrira se i filter pogača se suši 8-12 h pod sniženim pritiskom na 35-40°C da se dobije naslovljeno jedinjenje (307 g smeđe čvrste supstance); 99.1% HPLC oblasti (analiza: 96.8%); 86% prinos; 'H NMR (CDCb, 400 MHz): 5 = 9.216 (s, III), 8.120 (s, IH), 2.890 (s, 3H), 2.773 (s, 3H).

Izrada 11

7-Metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il trifluorometansulfonat

[0066]

Postupak A:

[0067] Smeša 7-metiI-2-(metiltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il trifluorometansulfonata (28.6 g, 84 mmol), dimetilformamida (74 mL) i glacijalne sirćetne kiseline (9.61 mL, 169 mmol) se zagreje na 45 °C a nakon toga se u toku 2 h u kapima doda 6.35% vodeni rastvor NaOCl (izbeljivač, 612 g, 506 mmol). Smeša se zagreva 2 h na 45-50 °C, ohladi na RT, Čvrste Čestice se sakupe filtriranjem i isperu sa vodom (300 mL). U Čvrste čestice sc doda DCM (200 mL), suspenzija se ohladi u ledeno-vodenom kupatilu i tretira sa 2.0 M rastvorom N-metilamina u THF (126 mL, 253 mmol). Smeša se ostavi da sc polako zagreje na RT i meša 2 b. Rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom, ostatak se tretira sa metanolom (MeOH) (50 mL) i meša 30 min na RT. Čvrste čestice se sakupe filtriranjem i isperu sa MeOH. Čvrsti deo se tretira sa EtOAc (30 mL) i meša 30 min na RT. Čvrsti deo se izdvoji filtriranjem i ispere sa EtOAc da se dobije naslovljeno jedinjenje (19.82 g, 73% prinos). MS (m/z): 323.0 (M+l).

Postupak B:

[0068] U reaktivnu posudu se stavi 150 g (0.442 mol, 1.0 eq. Limited Reagent) 7-metil-2-(metiltio)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il trifluorometansulfonata, doda sc 3000 mL DCM da se smeša izbistri i smeša ohladi na -5~5°C. Na temperaturi ispod 5°C se u porcijama doda 105 g (0.442 mol, 1.0 eq.) m-CPBA. Smeša se meša 3-4 sata na 0~5°C (E/A=l%). U kapima se doda 660 mL (1.326 mol, 3.0 eq.) metilamina u 2M THF na temperaturi ispod 10°C i smeša se meša 3-4 sata na 0-10°C. Uz mešanje se doda 1500 mL DCM i 1000 mL H2O i vodeni sloj se izdvoji. Organski sloj se četiri puta ispere sa po 500 mL H2O i koncentruje do 600g na temperaturi ispod 40°C. Rastvarač se dva puta zameni sa n-heptanom i smeša mesa 3-4 sata na 10-20°C. Suspenzija se filtrira. Ispere sa 150 g n-heptana i filter pogača suši pod sniženim pritiskom na 65-75 °C u toku 10-16 h da se dobije naslovljeno jedinjenje (129.6 g, 96.5% čistoće u 82% prinosa; LC-MS (MS+=371.8); 'H NMR (CDCI3, 400 MHz): 5 = 8.932 (s, IH), 7.86 (m, III), 5.707 (s, IH), 3.192-3.180 (d, 3H), 2.754 (s, 3H).

Izrada 12

N,7-Dimctilpirido[2,3- đ]pirimidin-2-amin

[0069]

[0070]Rastvor 4-amino-2-(metiltio)pirimidin-5-karbaldehida (10 g, 59.1 mmol) u acetonu (100 mL) se tretira sa KOH (3.32 g, 59.1 mmol), meša 10 min na RT, a nakon toga koncentruje do sušenja. Ostatak se tretira sa EtOAc, ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaHC03, nakon toga sa slanim rastvorom, suši preko Na?S04i koncentruje da se dobije 7-metil-2-(mctiltio)pirido[2,3-dJpirimidin. MS (m/z): 192.1 (M+l). Doda se rastvor metilamina u etanolu (33%, 80 mL) i zagreva na 110°C u toku noći u kiveti pod pritiskom. Rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom i sirovi produkt prečisti hromatografijom na silika gelu (50-100% EtOAc/heksani) da se dobije naslovljeno jedinjenje (6.73 g, 65%. nakon dve faze). MS (m/z): 175.1 (M+l).

Izrada 13

6-Bromo-N.7-dimetilpirido[2,3-d]pirimidin-2-amin

[0071]

[0072] Rastvor N,7-dimetilpirido[2,3-d]pirimidin-2-amina (6.73 g, 38.6 mmol) u acetonitrilu (160 mL) se ohladi u ledenom kupatilu i zaštiti od svetla aluminijumskom folijom. Doda se N-bromosukcinimid (6.88 g, 38.6 mmol) i meša 2 h na 0°C. Reakcija se prenese u frižider i ostavi 4 dana na 5 °C. Čvrsti deo se izdvoji filtriranjem. Čvrsti deo se ispere sa DCM i ispirak se koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje (3.0 g, 31% prinos). MS (m/z): 253.0/255.0

(M+I).

Primer 1

l-(3,3-Dimetiibutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea

(0073]

[0074]Primer 1 može da se izradi po Postupku A, Postupku Bili Postupku C.

Postupak A:

(0075]Izmešaju se l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioksaborolan-2-il)fenil)urea (25.9 g, 68.5 mmol), 7-metil-2-(mctilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il trifluorometansulfonat (22.09 g, 68.5 mmol) i NaHCC>3 (17.28 g, 206 mmol) u 1,4-dioksanu (500 mL) i vodi (125 mL) i smeša prska 20 minuta argonom. Doda sc tetrakis(trifenilfosfin)paladijum (3.96 g, 3.43 mmol) i nakon toga se smeša zagreva na 50 °C u atmosferi argona. Doda se dodatna porcija 7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il trifluorometansulfonata (300 mg, 0.55 mmol) i zagrevanje nastavi na 50 °C u toku noći. Smeša se ohladi na RT, Čvrsti deo sakupi fdtriranjem i ispere sa vodom a nakon toga sa dietil etrom, Čvrsti deo se tretira sa acetonitrilom (50 mL) i žitka masa sc zagreva 30 minuta na 80 °C. Čvrsti deo se izdvoji filtriranjem, ispere sa acetonitrilom i suši pod vakuumom na 80 °C da se dobije bledo žuta čvrsta supstanca. Čvrsti deo se tretira sa MeOH (50 mL) i smeša zagreva 1 sat na 80 °C. Ohladi se na RT, čvrsti deo sakupi filtriranjem, ispere sa MeOH (20 mL) i suši pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (22.5 g, 77% prinos) kao bledo žuta čvrsta supstanca. MS (m/z): 425.2 (M+l).

Postupak B:

[0076]Suspenzija 1 -(3,3-đimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-melil-5-(4,4,5,5-tetrametil-l ,3,2-dioksaborolan-2-il)fenil)uree (4.48 g, 11.8 mmol), 6-bromo-N,7-dimetilpirido[2,3-d]pirimidin-2-amina (3.0 g, 11.8 mmol) i K.2C03(4.91 g, 35.6 mmol) u dioksanu (80 mL) i vodi (20 mL) se poprska sa argonom, tretira sa tetrakis(trifenilfosfin)paladijumom (0.685 g, 0.593 mmol) i zagreva na 85 °C u toku noći. Dioksan se ukloni pod sniženim pritiskom, smeša se tretira sa EtOAc i slanim rastvorom, slojevi se razdvoje, organski sloj se suši preko Na2S04, koncentruje i prečisti hromatografijom na silika gelu (40% do 100% EtOAc/heksan, 100% EtOAc, 5% MeOH/ EtOAc). Dobijeni materijal se tretira sa CH3CN, zagreva 1 sat na 80°C, ohladi na RT i čvrsti deo sakupi filtriranjem da se dobije naslovljeno jedinjenje (3.52 g, 70% prinos) kao bledo žuta čvrsta supstanca. MS (m/z): 425.2 (M+l).

Postupak C:

[0077] Kroz smešu rastvarača 1, 4-dioksana (1250 g) i vode (200 g) sc u reaktivnoj posudi propuste mehurići N2. Smeša se zagreje na 80-85°C. Doda selOO g (0.31 mol, 1.0 eq. limitiran reagens) 7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il trifluorometansulfonata, 117.4 g (0.31 mol. 1.0 eq.) l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametii-l,3,2-dioksaborolan-2-iI)fenil)uree, 128.7 g (0.93 mol. 3.0 eq.) K2CO3i 6.81 g (0.0093 mol, 0.03 eq.) Pđ(dppf)Ch u atmosferi azota. Smeša se meša 4-6 sati na 80-90°C. Smeša se ohladi na 40~50°C. Koncentruje se i u kapima sc doda 2000 g vode na temperaturi ispod 30°C. Nakon dodavanja, smeša se meša 6-8 sati na 10~30°C. Smeša se filtrira i ispere sa 200 g vode, a nakon toga se ispere filter pogača. Filter pogača se suši pod sniženim pritiskom 14-16 h na 60~70°C da se dobije Tech Grade API naslovljenog jedinjenja (158g, 90.4% čistoće, ispitivanje: 63.4%, KF: 5%-6%). Tech Grade API naslovljenog jedinjenja se rastvori u 1000 mL DCM i 1000 mL EtOH na 10-30°C. Doda se 50 g silika gela. 80 g Na2S2O3.5H20 i 10 g aktivnog uglja. Smeša se zagreva i meša 3-5 sati na 40-50°C i ohladi na 10-30°C. Smeša se filtrira i filter pogača ispere sa 200 g smeše DCM/EtOH (1:1). Izmeša sa 5 g SilicaThiol na 40-50°C i filtrira. Rastvarač se dva puta zameni sa 390.0 g EtOH. Suspenzija se koncentruje i filtrira, a nakon toga se filter pogača ispere sa 39.0 g EtOH. Filter pogača se suši pod sniženim pritiskom 14-16 h na 65-75 °C da se dobije API naslovljenog jedinjenja (61 g, 98.5% čistoće, ispitivanje: 97.5%, 65% prinos; 'H NMR (d6-DMSO, 400 MHz): 5 = 9.077 (s, IH), 8.278 (s, IH), 7.968-7.947 (d, IH), 7.893 (s, IH), 7.680 (s, IH), 8 7.193-7.162 (d, IH), 6.512-6.485 (m, IH), 3.088-3.035 (m, 2H), 2.924-2.914 (d, 3H). 2.296 (s, 3H), 1.955(s, 311), 1.344-1.304 (m, 211), 0.875 (s, 9 H).

Difrakcija X- zrakapraška

[0078]DXZ uzoraka kristalnih čvrstih supstanci su dobijene na Bruker D4 Endcavor difraktometru X-zraka praska, opremljenim sa CuKa izvoromX =1.54060 A i Vantcc detektorom, koji radi na 35 kV i 50 mA. Uzorak se skenira između 4 i 40° u 29, sa veličinom faze od 0.009° u 20 i brzinom skeniranja od 0.5 sekundi/faza i sa 0.6 mm odstupanja, 5.28 fiksnog sprečavanja rasejanog zračenja i 9.5 mm detektora proreza. Suvi prašak se pakuje na kvarcnom nosaču uzoraka a ravna površina se dobija pomoću staklene Ijuspice. Difrakcija uzoraka kristalnog oblika se određuje na sobnoj temperaturi i pri relativnoj vlažnosti. U tehnici kristalografije je dobro poznato da, za bilo koji dati kristalni oblik, relativni intenziteti pikova difrakcije mogu da variraju u zavisnosti od preferirane orijentacije koja je rezultat faktora kao što su morfologija i sastav kristala. Kada su prisutni efekti preferirane orijentacije, intenziteti pikova su izmenjeni, ali su pozicije karakterističnih pikova polimorfa nepromenjene. Videti,na primer,The United States Pharmacopeia #23, National Formularv #18, stranice 1843-1844, 1995. Osim toga. u tehnici kristalografije je takođe dobro poznato da za bilo koji dati oblik kristala pozicije ugaonih pikova mogu blago da variraju. Na primer, pozicije pikova mogu da se pomere zbog varijacija u temperaturi ili vlažnosti na kojima se uzorak ispituje, zbog pomeranja uzorka ili zbog prisustva ili nedostatka unutrašnjeg standarda. U ovom slučaju, promena pozicije pika od ± 0.2 u 20 će uzeti u obzir ove potencijalne promene bez ometanja jasne identifikacije određenog kristalnog oblika. Potvrda kristalnog oblika može da se zasniva na bilo kojoj kombinaciji istaknutih pikova (u jedinicama od<0>29), obično više istaknutih pikova. Difrakcija uzorka kristalnog oblika, đobijena na sobnoj temperaturi i pri relativnoj vlažnosti, se podesi na bazi NIST 675 standardnih pikova na 8.853 i 26.774 stepeni 2-tcta.

Slobodna baza kristalnog čvrstog oblika

[0079]Prema tome, izrađeni uzorak slobodne baze kristalnog čvrstog oblika iz Primera 1 se karakteriše DXZ uzorka koristeći CuKa zračenje koji ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj Tabeli 1, a koji posebno imaju pikove na 16.0 u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 6.9, 7.0, 18.2 i 23.2; uz toleranciju za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

[0080]Opšte je poznato da bioraspoloživost slabo rastvorljivog jedinjenja može da se poveća njegovom formulacijom u obliku čvrste disperzije u polimernom matriksu. Ovakve čvrste disperzije su disperzije leka u inertnom matriks nosaču izrađene topljenjem (fuzijom) smeša lek-polimer a nakon toga očvršćavanjem homogene otopljene smeše brzim hlađenjem (na

primer, korišćenjem procesa kao što je ekstruzija topljenjem), ili rastvaranjem leka i polimera u odgovarajućem organskom rastvaraču a nakon toga ili uklanjanjem rastvarača evaporacijom (na primer, sušenje raspršivanjem) ili precipitacijom pomoću antirastvarača. Čvrste disperzije

obično daju lek u amorfnom obliku što za rezultat ima veću brzinu rastvaranja i/ili veći stcpen (opseg) i trajanje supersaturacije, što dovodi do povećane oralne bioraspoloživosti slabo rastvorljivih jedinjenja u odnosu na nedispergovan kristalni lek. Polimeri koji se uspešno koriste za Čvrste disperzije uključuju (ali bez ograničenja na) polivinil pirolidon (PVP), polivinil pirolidon-vinil acetat (PVP-VA), hiđroksipropil metilcelulozu (HPMC), hidroksipropil metilceluloza acetat sukcinat (HPMCAS), hiđroksipropil melilceluloza flalat (HPMCP-55), celuloza acetat ftalat (CAP) i Eudragit® EPO.

[0081J Fizička i hemijska stabilnost Čvrste disperzije su faktori od kojih zavisi pogodnost ovih formulacija. Lek koji se koristi u disperziji je naredna promenljiva koja može da utiče na fizičku stabilnost metastabilnog amorfnog oblika leka kao i na njegovew vivoperformanse. Preferirani način za primenu čvrste disperzije kod ljudi je da se dalje formulišu kao kapsula,

tableta ili neki drugi čvrsti oralni dozni oblik dodavanjem farmaceutski prihvatljivog nosača i opciono, drugih ekscipijenata pogodnih za proizvodnju i performanse takvog doznog oblika. Čvrste disperzije mogu da se doziraju punjenjem praškaste ili granulirane smeše u kapsule, kao suspenzije u odgovarajućem vehikulumu ili kao bilo koji drugi pogodan oralni farmaceutski dozni oblik kao što su (ali bez ograničenja na) tablete, sahete, granule, posipi, itd.

[0082] Zbog male bioraspoloživosti Primera 1, što je posledica njegove male rastvorljivosti, poželjno je da se omogući formulacija kojom bi se postiglo ciljano prisustvo jedinjenja iz Primera 1 kod pasa i pacovapri studijama na malim životinjama i za klinička ispitivanja. Neutralnim polimerom PVP-VA (Kollidon® VA 64) se dobijaju čvrste disperzije koje su i hemijski i fizički stabilne u uslovima ubrzanog testa stabilnosti (40°C; relativna vlažnost 75% u toku jednog meseca), kao i nakon dugotrajnog čuvanja (11 meseci za sadržaj sa 20% leka i 10 meseci za sadržaj sa 40% leka) pod ambijentalnim uslovima.

Primer kompozicije 1: 20% čvrsta disperzija koja sadrži Primer 1:PVP-VA (20:80)

[0083] Za izradu Čvrste disperzije se koristi kristalni oblik Primera 1. Polivinil pirolidon vinil acetat (PVP-VA) je raspoloživ na tržištu pod zaštićenim nazivom Kollidon® VA 64 proizvođača BASF Corporation. Rastvarač je smeša 1:1 dihlormetana i metanola, izrađen mešanjem jednakih zapremina dihlormetana (Fisher Scientific) i metanola (Om-niSolv). Natrijum lauril sulfat (Fisher Scientific) je raspoloživ na tržištu.Procedura:Čvrsta disperzija se izrađuje i suši raspršivanjem u dve pod-serije. Za prvu pod-seriju u bocu zapremine 2000 mL se doda Primer 1 (22.22 g). Doda se 3180 mL rastvaraČa (dihlormetan : metanol, 1:1) i uzorak se sonicira u kupatilu u toku približno 20 minuta, sve dok se ukupna količina jedinjenja ne rastvori, Čime se dobija teoretska koncentracija od 19 mg/mL. U ovaj rastvor se doda 88.86 g PVP-VA i rastvara mešanjem sve dok se ne dobije homogeni rastvor. Rastvor Primera 1 i PVP-VA (20:80) u smeši dihlormetan: metanol (1:1) se suši raspršivanjem koristeći mini-sprej-sušać (Buchi Mini Spray Dryer 290). Brzina protoka rastvora je 9-12 ml/min, a unutrašnja temperatura se podesi na 100°C-110°C što za rezultat ima spoljašnju temperaturu od 37-55°C. Zadrugu pod-seriju se u bocu zapremine 2000 mL doda Primer 1 (34.62 g). Doda se 1820 mL rastvaraČa (smeša dihlormetan: Metanol. 1:1) i uzorak se sonicira u kupatilu u toku približno 20 minuta, sve dok se ukupna količina jedinjenja ne rastvori, čime se dobija teoretska koncentracija od 19 mg/mL. U ovaj rastvor se doda 138.48 g PVP-VA i rastvara mešanjem sve dok se ne dobije homogeni rastvor. Rastvor Primera 1 i PVP-VA (20:80) u smeši dihlormetan: metanol (1:1) se suši raspršivanjem koristeći mini-sprej-sušać (Buchi Mini Spray Dryer 290). Brzina protoka rastvora je 14-15 ml/min, a unutrašnja temperatura se podesi na 100°C-110°C, što za rezultat ima spoljašnju temperaturu od 62-70°C. Materijal osušen raspršivanjem iz ove pod-serije se sakupi i meša a nakon toga dalje suši u vakuum sušnici u toku noći. na temperaturi između 40-60°C, nakon čega se čuva pod vkuumom još jedan dan na sobnoj temperaturi.

[0084] U 236.28g čvrste disperzije koja sadrži Primer 1 :PVP-VA (20:80), doda se 4.278 g natrijum lauril sulfata i temeljno izmeša u velikoj posudi za kristalizaciju koristeći špatuiu, da se dobije finalna kompozicija koja sadrži 98% čvrste disperzije i 2% natrijum lauril sulfata.

[0085] Ova formulacija može da se dozira punjenjem meŠavine praška u kapsule ili kao suspenzija suspenđovanjem u vehikulumu, na primer, 1% hidroksietilceluloza/ 0.25% polisorbat 80/0.05% Dow Corning antifoam 1510-US.

Primer kompozicije 2: 40% čvrsta disperzija koja sadrži Primer 1: PVP-VA (40:60)

[0086] Kristalni oblik Primera 1, polivinil pirolidon vinil acetat (PVP-VA), rastvarač i natrijum lauril sulfat su kako je opisano za Primer kompozicije 1.

Procedura: Čvrsta disperzija se izrađuje procesom sušenja raspršivanjem na isti način kako je opisano za Primer kompozicije 1, koristeći 3.79 g Primera 1, odgovarajuću zapreminu rastvaraČa (smeša dihlormetan : metanol, 1:1) da se dobije rastvor koncentracije 20 mg/mL. U ovaj rastvor se doda 5.68 g PVP-VA i rastvori mešanjem sve dok se ne dobije homogeni rastvor. Rastvor se suši raspršivanjem na isti način kako je opisano za Primer kompozicije 1. Brzina protoka rastvora se podesi na 40% korišćenjem silikonskog creva promera 2 mm, unutrašnja temperatura se podesi na 80°C što za rezultat ima spoljašnju temperaturu od 34°C. Materijal osušen raspršivanjem se sakupi i dalje suši 3 4 sati u vakuum sušnici na sobnoj temperaturi, uz sporo punjenje azotom i u prisustvu sredstva za isušivanje.

[0087] U 6.64 g čvrste disperzije koja sadrži Primer 1 :PVP-VA (40:60) se doda 0.0665 g natrijum lauril sulfata i sve se temeljno izmeša u polu-zatvorenoj posudi koristeći špatulu, čime se dobija finalna kompozicija koja sadrži čvrstu disperziju i natrijum lauril sulfat u odnosu 99:1.

[0088]Ova formulacija može da se dozira punjenjem mešavine praška u kapsule ili kao suspenzija suspendovanjem u vehikulumu, na primer, 1% hidroksietilcciuloza/ 0.25% polisorbat 80/0.05% Dow Corning antifoam 1510-US.

[0089]Kancer se sve više smatra kao zbir heterogenih bolesti čiji su početak i progresija indukovani nenormalnom funkcijom jednog ili više gena koji regulišu obnovu DNK, stabilnost genoma, proliferaciju ćelija, smrt ćelija, adheziju, angiogeneze, širenje i metastaze u mikrosredini ćelija i tkiva. Promene ili nenormalna funkcija "kancer" gena mogu da nastanu iz prirodno nastalog DNK polimorfizma, promena u broju kopija genoma (kroz amplifikaciju, brisanje, gubitak hromozoma ili dupliranje), promena u strukturi gena i hromozoma (zbog hromozomne translokacije, inverzije ili drugih preraspodela koje dovode do deregulacije ekspresije gena) i tačke mutacija. Kancerogene neoplazme mogu da budu indukovane jednom nenormalnom funkcijom gena i da se održavaju istom nenormalnom funkcijom gena ili da se održavanje i progresija pogoršaju dodatnim nenormalnim funkcijama gena.

[0090]Pored prethodno pomenutih genetičkih hromozomnih aberacija, svaki od kancera može takođe da uključi epigenetske modifikacije genoma, uključujući DNK metilaciju, genomični otisak i modifikaciju histona acetilacijom, metilacijom ili fosforilacijom. Epigenična modifikacija može da igra ulogu u indukciji i/ili održavanju maligniteta.

[0091]Formirani su sveobuhvatni katalozi citogenetskih aberacija kancera kod ljudi i redovno se ažuriraju online (videti The Mitelman Database Chromosome Aberrations in Canccr at the US National Cancer Institute (NCI) Cancer Genome Anatomv Project (CGAP) Web site: http:// cgap. nci. nih. aov). Baza podataka uključuje hromozomne aberacije za neke od maligniteta iz ovog pronalaska. The vVellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project održava detaljne podatke online "Cancer Gene Census" za sve humane gene koji su uzročno povezani sa tumorogenezama (viđeti http://\ vw\ v. sanger. ac, uk/ genetics/ CGP/ Census) kao i COSMIC (Calalogue Somatic Mutations in Cancer) baza podataka somatskih mutacija kod humanih kancera (videti hupr/ Zvvvvvv. sanger. ac. uk/ aenetics/ CGP/ cosmic), Naredni izvor koji sadrži obimne informacije o citogenetskim promenama koje su uzročno povezane sa različitim kancerima je Atlas Gcnctics and Cytogenetics in Oncology and Haematology ( http:// atlas- aeneticsoncologv. Org// Anomalies/ Anomliste. html# MDS). Ove baze podataka takođe uključuju hromozomne aberacije za neke od maligniteta iz ovog pronalaska.

[0092] Dijagnostikovanja kancerogenih maligniteta biopsijom, određivanjem imunofenotipa i drugim testovima su poznata i rutinski se koriste. Pored visoke rezolucije različitog bojenja hromozoma i naprednih tehnologija projektovanja hromozoma. aberacije hromozoma u slučajevima kada se sumnja na kancer, mogu da se odrede citogenetskim analizama kao što su fluorescentna in situ hibridizacija (FISH), kariotipizacija, spektralna kariotipizacija (SKY), višestruka FISH (V-FISH), komparativna genomska hibridizacija (KGH), tipovi polimorfizma pojedinačnih nukleotida (SNP Chips) i drugi poznati dijagnostički i analitički testovi koje stručnjak sa iskustvom u tehnici može da koristi.

[0093] Ras/Raf/MEK/MAPK putevi signalizacije povezuju ekstracelularni stimulans sa nukleusom, i na taj način regulišu različite ćelijske odgovore, uključući proliferaciju, diferencijaciju i apoptoze ćelija. Narušavanje ovih procesa nenormalnom MAPK signalizacijom, kao što su genetičke alteracije, često dovodi do malignih transformacija. Važnost ovog puta signalizacije u neoplazmama je evidentna iz otkrića brojnih mutanta alela koji aktiviraju ovaj put kod brojnih humanih maligniteta. Onkogenične mutacije u receptoru tirozin kinaza (RTKa), kao što su EGFR i cMet, ili prekomerna ekspresija RTKa i njihovih liganda nenormalno aktiviraju Ras i komponente unazad. Aktivacija Ras mutacija je otkrivena u približno 30% kancera kod ljudi. Ove mutacije značajno umanjuju aktivnost GTPaze, i na taj način prevode Ras u GTP-vezu i aktivno stanje. Kod sisara, Ras familija se sastoji od tri gena: K-Ras, N-Ras i H-Ras. K-Ras Često mutira kod epitelijalnih kancera, kao što su kancer pankreasa, pluća i kolorektuma, dok se mutacije N-Ras Često pojavljuju u melanomi, karcinomu jetre i mijeloidnim (AML, CML) malignitetima. Otkriveno je da se aktivacije mutacija B-Raf, člana Raf familije, često pojavljuju kod melanome i karcinoma štitaste žlezde, a u manjoj meri kod kancera kolorektuma, jajnika i pluća. Somatske mutacije MEKI i MEK2 su identifikovane kod pacijenata sa melanomom. Konačno, gubitak negativnih regulatora, kao što su članovi Sprouty familije i GAPa (GTPaza-aktivirajući proteini), kao što je NF1, može indirektno da aktivira ovaj put signalizacije. Veruje se da mnogi tumori ispoljavaju deregulaciju Ras/Raf/MEK/MAPK puta, Čime postaju atraktivni cilj terapeutske intervencije.

[0094]Raf proteini se sastoje od tri Člana, A-Raf, B-Raf i C-Raf (takođe označen kao Rafl), koji imaju ključnu ulogu u transdukciji signala od Ras do komponenti unazad MEK 1/2 i ERK1/ERK2. Pokazano je da Raf protein kinaze imaju ulogu u tumorogenezama, uključujući proliferaciju, preživljavanje, širenje i angiogeneze ćelija tumora. Sebolt-Eeopold i saradnici, Nat Rev Cancer, 2004, 4: 937-947; VVellbrock i saradnici, Nat Rev Mol Cell Biol. 2004, 5: 875-885. Sve aktivacije MAPK puta u ćelijama tumora višestrukim mehanizmima kao što su mutacije ili preterana ekspresija RTKa i Ras mutacije, idu preko Raf proteina. Još važnije, aktivacije mutacija B-RAF, Davies i saradnici, Nature, 2002, 417: 949-954, su često uočene u većem broju maligniteta, uključujući melanomu, karcinome kolorektuma, pluća, jajnika i štitaste žlezde. Skoro 90% B-Raf mutacija su T1799A promene u eksonu 15 Što za rezultat ima supstituciju Val do Glu amino kiselina (B-Raf V600E). Ova mutacija u B-Raf dovodi do bitne aktivnosti kinaze približno 500 puta veće od aktivnosti izvornog tipa proteina i do transformacije maligniteta. Dodatne mutacije, kao što je T529I, treonin do izoleucina B-Raf "vratar" mutacija i G468A, B-Raf sekundarna mutacija G1403C u eksonu 11 su takođe poznate i veruje se da igraju ulogu u izazivanju, održavanju ili pogoršanju transformacije maligniteta, VVhittaker i saradnici. Sci. Transi. Med., 2010, 2(35) ra41; Wan i saradnici, Cell, 2004, 116: 855-867.

[0095]Nedavno je United States Food i Drug Administration (FDA) odobrila specifični inhibitor B-Raf kinaze vemurafenib (takođe označen kao PLX-4032) za tretman pacijenata sa melanomom sa B-Raf V600E mutacijom. Vemurafenib je efikasan i obezbeđuje preživljavanje ovih pacijenata. Međutim, kod pacijenata koji odgovaraju na ovaj lek se generalno razvija rezistencija na lek, što dovodi do povraćaj a bolesti u prošeku za 7 meseci. Slično mnogim drugim ciljanim terapijama, stečena rezistencija na B-RAF inhibiciju predstavlja terapeutski izazov za dugotrajno preživljavanje ovih pacijenata.

[0096]Za povećanje pozitivnih efekata B-Raf inhibitora, istraživači nastavljaju da identifikuju mehanizme kojima se omogućava ekspresija mutanta B-RAF ćelija melanoma rezistentnih na vemurafenib. Savremene studije su ukazale daje reaktivacija MAPK puteva mehanizam rezistencije za B-RAF inhibiciju. Mehanizmi rezistencije prvenstveno uključuju reaktivaciju ERK signalizacije zaobilaznim mehanizmima koji su ili Ras/RAF zavisni, kao što su N-Ras aktivacija, Nazarian i saradnici. Nature. 2010, 468: 973-7, H-Ras aktivacija (Su i saradnici, New England Journal Medicine. 2012. 366: 207-215) ili C-RAF nadregulacija,

(Johanncssen i saradnici, Nature. 2010, 468: 968-72; Montagut i saradnici, Cancer Res. 2008, 68: 4853-61), aberantno spojene varijante B-RAF V600E (Poulikakos i saradnici. Nature. 2011, 480: 387-390 ili Ras/RAF nezavisni (Tpl2/COT prekomerna ekspresija) Johannessen i saradnici. Nature. 2010, 468: 968-72. Prema tome. višestruki mehanizmi mogu da umanje efekat B-RAF inhibicije na MAPK signalizaciju u B-RAF mutant kancerima. Mada "vratar" mutacija B-RAF (T529I), koja može da dovede do rezistencije na BRAF inhibiciju, još uvek nije klinički identifikovana, eksperimentalno je pokazano da ova mutacija dovodi do rezistencije, VVhittaker i saradnici, Sci Transi Med. 2010, 2(35): ra41. Savremcnc studije takođe ukazuju da aktivacija MAPK-prekomernih puteva signalizacije sa RTKa, kao što su IGF-1R ili PDGFRp, može da igra ulogu u stečenoj rezistenciji na B-RAF inhibiciju; Nazarian i saradnici, Nature. 2010, 468: 973-7; Villanueva i saradnici, Cancer Cell. 2010. 18: 683-95; Shi i saradnici. Cancer Res. 2011,71: 5067-74. Jasno je da je reaktivacija MAPK uključena u mnoge od ovih mehanizama rezistencije. Očekuje se da pan Raf inhibitor blokira MAPK reaktivaciju.

[0097]Pored toga, B-Raf specifični inhibitori, uključujući vemurafenib i njegove bliske analoge N-[3-(5-hlor-lH-pirolof2,3-b]piridin-3-karbonil)-2,4-dilfuorofenil]propan-l-sulfonamid (PLX4720; komercijalno raspoloživ selektivni B-Raf inhibitor). su pokazali da indukuju aktivaciju paradoksikalnog puta preko dimerizacije sa drugim Raf izooblicima čije je poreklo izvorni tip B-Raf, Hatzivassiliou G i saradnici Nature, 2010, 464: 431-435; Poulikakos i saradnici. Nature, 2010, 464: 427-430; Heidorn, i saradnici, Cell, 2010, 140: 209-221. Veruje se da vemurafenib aktivira Raf/MEK/ERK put vezivanjem izvornog tipa B-Raf i stimulacijom dimerizacije B-Raf-C-Raf. Smatra se daje ova aktivacija paradoksikalnog puta specifičnom inhibicijom B-Raf osnovni razlog neželjenih dejstava na koži (kao što je karcinom skvamoznih ćelija) kod nekih pacijenata sa melanomom tretiranih sa vemurafenibom. Vemurafenib nije odobren za tretman kancera kod pacijenata sa izvornim tipom B-Raf genetskog porekla zbog njihove aktivnosti na aktivaciju paradoksikalnog puta u slučaju ovog genetskog porekla.

[0098]Testirano jedinjenje iz primera je inhibitor Raf kinaze koji inhibira sve izooblike Raf proteina, uključujući A-Raf, B-Raf, C-Raf i B-Raf V600E mutaciju. Zbog sveobuhvatnog aktiviranja Raf, testirano jedinjenje iz primera deluje na ćelije tumora aktivacijom MAPK puta signalizacije unapred, kao što su N-Ras mutacija i K-Ras mutacija, obe sa B-Raf izvornog tipa genetskog porekla. Prema tome, testirano jedinjenje iz primera ima potencijal za lečenje pacijenata koji boluju od kancera sa B-Raf mutacijom (kao što su melanoma. karcinom kolorektuma, pluća, jajnika i štitaste žlezde). N-Ras mutacijom, B-Raf izvornog tipa (kao što su melanoma, AML, CML, ALL, CLL. kancer jetre). (Schubbcrt i saradnici. Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylayeva-Gupla i saradnici. Nature Revievvs Cancer, 2011, 11: 761); ili K-Ras mutacijom, B-Raf izvornog tipa (kao što su kancer Žučnog trakta, grlića materice, kolorektuma, zida materice, pluća, jajnika, pankreasa i jetre; Schubbert i saradnici. Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylaycva-Gupta i saradnici. Nature Revievvs Cancer, 2011, 11: 761) ili drugim mehanizmom Raf aktivacije, uključujući aktivaciju ka unapred, ka 5' kraju, RTK mutacije/prekomerne ekspresije. Testirano jedinjenje iz primera takođe deluje na ćelije tumora melanoma koje su razvile rezistenciju na vemurafenib. Prema tome, veruje se da će testirano jedinjenje iz primera biti efikasno kod pacijenata sa melanomom kod kojih vemurafenib ili drugi B-Raf inhibitori nisu deiovali.

[0099] Testirano jedinjenje iz primera je takođe inhibitor c-Kit. C-Kit je receptor tirozin kinaze koja normalno kontroliše funkciju osnovnih hematopoictičnih ćelija, melanocita i germ ćelija. Nakon vezivanja sa svojim ligandom faktora stem ćelija (FSC), c-Kit se podvrgava dimerizaciji/oligomerizaciji i autofosforilaciji. Genetske mutacije (kao što su L576P, K642E, T670I i V654A) c-Kit-a koje konstitutivno aktiviraju c-Kit mogu da dovedu do melanome, akutne mijelogene leukemije i gastrointestinalnih stromalnih tumora (GlS'f), i prema tome, testirano jedinjenje iz primera ima potencijal za lečenje melanome, akutne mijelogene leukemije i GIST kod pacijenata, Lennartsson i saradnici. Current Cancer Drug Targets, 2006, 6: 65..

[0100] Jedinjenje iz primera može da se koristi kao pojedinačno sredstvo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih odobrenih lekova za tretman pacijenata sa kancerom. U ove pacijente sa kancerom spadaju: pacijenti sa melanomom sa B-Raf V600E mutacijom, pacijenti sa melanomom kod kojih nije uspelo lečenje sa vemurafenibom ili drugim B-Raf inhibitorima, pacijenti sa melanomom sa N-Ras mutacijom B-Raf izvornog oblika, pacijenti sa melanomom sa prckomernom ekspresijom c-Kit ili cKit mutacijom; pacijenti sa kancerom kolorektuma sa B-Raf V600E mutacijom ili K-Ras mutacijom B-Raf izvornog oblika; pacijenti sa kancerom jajnika sa B-Raf V600E mutacijom ili K-Ras mutacijom B-Raf izvornog oblika; pacijenti sa kancerom pluća sa B-Raf V600E mutacijom ili K-Ras mutacijom B-Raf izvornog oblika; pacijenti sa mijeloidnom leukemijom sa N-Ras mutacijom B-Raf izvornog oblika, ili c-Kit prekomernom ekspresijom ili c-Kit mutacijom; pacijenti sa kancerom jetre sa N-Ras ili K-Ras mutacijom B-Raf izvornog oblika; pacijenti sa kancerom pankreasa sa K-Ras mutacijom B-Raf izvornog oblika; pacijenti sa karcinomom štitaste žlezde sa B-Raf V600E ili N-Ras mutacijom B-Raf izvornog oblika; pacijenti sa kancerom žučnog trakta sa K-Ras mutacijom B-Raf izvornog oblika; GIST pacijenti sa c-Kit mutacijom ili prekomernom ekspresijom.

[0101]Naredne in vitro i in vivo studije pokazuju inhibitornu aktivnost jedinjenja iz primera na Ras/Raf/MEK/ERK signalizaciju puteva. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da prepozna da su ova ispitivanja generalno indikativna za kliničko hemoterapcutsko delovanje na ljude. Ispitivanja koja evidentiraju inhibiciju celokupnih Raf i inhibitornu aktivnost puteva signalizacije mogu uglavnom da se izvedu kako sledi ili sličnim ispitivanjima koja daju slične vrednosti. Ukoliko nije drugačije navedeno, objavljene IC50 vrednosti su apsolutne.

Enzimatska ispitivanja aktivnosti kinaza B-Raf, C-Raf i B-Raf mutacija

[0102]Test jedinjenje se procenjuje prema svojim inhibitornim aktivnostima na humani izvorni oblik B-Raf, humani izvorni oblik C-Raf, humani B-Raf V600E, humani B-Raf V600E+T529I ili humani B-Raf V600E+G468A. T529I je mutacija treonina do izoleucina B-Raf vratara, a G468A je B-Raf sekundarna mutacija na G1403C u eksonu 11. Enzimatska ispitivanja B-Raf, C-Raf i B-Raf mutacija procenjuju osobine Raf i MEKI kompleksa koji, u prisustvu ATP, katalizuje pojačanu hidrolizu ATP (Romingcr, i saradnici, Arch. Biocbcm. Biophvs. 2007, 464: 130-137; US Patent Publication No. 2006/0211073). Nastali ADP se prati pomoću dobro poznatog sistema udvajanja PK/LDH (piruvat kinaza/laktat dehidrogenaza) u obliku NADH oksidacije, Što može da se prati i detektuje spektrofotometrijski apsorpcijom na 340nm (A340; za principe postupka videti Schindler i saradnici, Science, 2000, 289: 1938-1942). Aktivnost Raf aktivirane MEKI ATPaze je osobina koja je zajednička za sve oblike Raf proteina.

Ekspresija i prečišćavanje Raf proteina

[0103]Generalno, ćelijske linije se generišu korišćenjem komercijalno raspoloživih materijala procedurama koje su poznate i stručnjaci sa iskustvom u tehnici ih rutinski koriste. Poznate su nukleotidne sekvence koje enkodiraju celu dužinu B-Raf izvornog oblika DNK (National Center for Biotechnologv Information (NCBI), Referentna sekvenca NC 000007.13), C-Raf (National Center for Biotechnologv Information (NCBI), Referentna sekvenca NC 000003.11) i A-Raf (National Center for Biotechnology Information (NCBI), Referentna sekvenca NC 000023.10). Videti takode, na primer, za B-Raf: S. Ikawa i saradnici, "B-raf, a new member thc raf familv, is activaled by DNK rearrangcmcnt," Mol Cell Biol, 8(6):2651-4

(1988); za C- Raf: M. Fukui i saradnici, "Molecnlar cloning and characterization an activated human c-raf-1 gene," Mol Cell Biol, 7(5): 1776-81 (1987): Bonner i saradnici. "The complete coding sequcnce the human raf oneogene and the corresponding strueture the c-raf-1 gene," Nucleic Acids Res., 14 (2), 1009-101 5 (1986); za MEKI: CP. Zheng i saradnici. "Cloning and characterization two distinet human extracellular signal-regulated kinaza aclivator kinazas, MEKI i MEK2," J. Biol. Chem., 268 (15), 11435-11439 (1993); za informacije o repicu: J. Tsai i saradnici, "Discovery a seleetive inhibitor oneogenic B-Raf kinaza with potent antimelanoma activity," Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 105(8), 3041-3046 (2008); G. Hatzivassiliou i saradnici, "RAF inhibitors prime wild-type RAF to activatc the MAPK pathway and enhance grovvth," Nature, 464 (7287). 431-435 (2010).

[0104]B-RalV600E (ostaci 433-726 koji sadrže V600E mutaciju) koji sadrži prečišćeni repić na N-završetku se pojavljuje i u osnovi prečišćava kako je prethodno opisano (Wan i saradnici, Cell, 2004, 116, 855-867).

[0105]B-Raf V600E konstrukcija koja sadrži sekkundarau T529I mutaciju ili G468A mutaciju se generiše mutagenezama na osnovu bRaf (433-726, V600E) konstrukcije.

[0106]U skvence koje se ovde koriste spadaju:B-RafV600E (ostaci 433-726 koji sadrže V600E mutaciju) bez prečišćavanja repića N-zavrŠetka; B-RafV600E (ostaci 433-726 koji sadrže V600E i T529I mutacije) bez prečišćavanja repića N-završetka; B-RafV600E (ostaci 433-726 koji sadrže V600E i G468A mutacije) bez prečišćavanja repića N-završetka; BRAF-V600E; BRAF-V600E+T529I; BRAF-V600E+G468A; BRAF-izvorni oblik, ukupna dužina;

C-RAF; MEKI protein sekvenca se koristi za proveravanje.

Enzimatska ispitivanja kojima sc meri aktivnost Raf kinaze

[0107]Test jedinjenje se procenjuje na inhibitorne aktivnost na izvorni oblik B-Raf, izvorni

oblik C-Raf, B-Raf V600E, B-Raf V600E+T529I i B-Raf V600E+G468A. T529I je mutacija B-Raf vratara a G468A je B-Raf sekundarna mutacija. Enzimatska ispitivanja B-Raf, C-Raf i B-Raf mutacija procenjuju osobine Raf i MEKI kompleksa, koji u prisustvu ATP, katalizuje i pojačava hidrolizu ATP (Rominger, i saradnici, Arch. Biochem. Biophys. 2007. 464: 130-137). Nastali ADP sc prati pomoću dobro poznatog sistema udvajanja PK7LDH (piruvat kinaza/laktat dehidrogenaza) u obliku NADH oksidacije, što može da se prati i detektuje apsorpcijom na 340nm (A340; za principe postupka videti Schindler i saradnici, Science.

2000, 289: 1938-1942). Aktivnost Raf aktivirane MEKI ATPaze je osobina koja je zajednička za sve oblike Raf proteina. U enzimatičkom ispitivanju B-Raf izvornog oblika, reaktivna smeša sadrži 1.2 nM B-Raf. 30 nM MEKI, 1 OOOuM ATP. 3.5 jedinica (po 100 ul) PK, 5 jedinica (po 100 ul) LDH, 1 mM ibsfoenol piruvata (PEP) i 280 uM NADU. U ispitivanju C-Raf, reaktivna smeša sadrži 0.6 nM C-Raf, 26 nM MEKI, 2000 uM ATP i istu količinu PK, LDH, PEP i NADH kao prethodno. U ispitivanju B-Raf V600E, reaktivna smeša sadrži 1.6 uM B-Raf V600E, 26 nM MEKI, 200uM ATP i istu količinu PK, LDH, PEP i NADH kao prethodno. U ispitivanju B-RafV600E+T529I, reaktivna smeša sadrži 6.2 nM B-Raf V600E+T5291, 30 nM MEKI, 200uM ATP i istu količinu PK, LDH, PEP i NADH kao prethodno. U ispitivanju B-Raf V600E+G468A, reaktivna smeša sadrži 3.5 nM B-Raf, 30 nM MEKI, 200uM ATP i istu količinu PK, LDH, PEP i NADH kao prethodno. Sva ispitivanja počinju mešanjem prethodno navedene smešc sa test jedinjenjem i kontinuiranim praćenjem na A340 u toku približno 5h. Vrednosti reakcije u okviru vremena 3 do 4 sata se uzimaju za izračunavanje IC50 vrednosti.

[0108]Za Primer 1, ICso vrednost enzima za B-Raf V600E je 6 nM a za C-Raf je 15 nM. Ovi rezultati pokazuju da jedinjenje iz primera inhibira B-Raf V600E i C-Raf u ovim ispitivanjima.

[0109]Primer 1 sc procenjuje i u drugim enzimaliČkim ispitivanjima koja se izvode potpuno istim postupcima kao stoje prethodno opisano. Primer 1 inhibira izvorni oblik B-Raf, B-Raf V600E+T529I i B-Raf V600E+G468A sa IC5o vrednostima od 9.8, 15.47 i 16.9 nM, tim redom. Ovi rezultati pokazuju daje Primer 1 B-Raf inhibitor u ovim ispitivanjima.

Enzimatičko ispitivanjeaktivnostic-Kitkinaze

[0110]c-Kit je važan onkogen a njegova prckomerna ekspresija i genetičke mutacije sc često dešavaju kod pacijenata sa melanomom i gastrointestinalnim stromalnim tumorom (GIST). U enzimatičkom ispitivanju c-Kit, spcklrofotometrijski se prati fosforilacija poly E4Y sa ATP, katalizacijom sa humanim c-Kit. Nastali ADP iz reakcije kinaze se udvaja reakcijama piruvat kinaza/laktat đehidrogenaza (PK/LDH) gde se NAD formira od piruvata i NADH. NADH može da se detektuje apsorpcijom na 340nm. kako je prethodno opisano za enzimatička ispitivanja aktivnosti kinaze B-Raf, C-Raf i B-Raf mutacija.

Ekspresija i prečišćavanje receptora c-Kit izvornog oblika

[0111]Generalno, ćelijske linije sc gcnerišu korišćenjem komercijalno raspoloživih materijala procedurama koje su poznate i koje stručnjak sa iskustvom rutinski koristi.

[0112]Poznata je nukleotidna sekvenca koja enkodira celu dužinu humanog izvornog oblika c-Kit receptora DNK (National Center for Biotechnologv Information (NCBI) Referentna sekvenca NC_000004.11). Videti takođe, na primer, za humanu cKit protein sekvencu: Y. Yarden, Y. i saradnici, "Human proto-oneogene c-kit: a new cell surface receptor tirozin kinaza for an unidentified ligand," EMBO J. 6 (11), 3341-3351 (1987); za GST fuziju proteina: D.B. Smith i saradnici, "Single-step purification polvpeptides expressed in Escherichia coli as fusions vvith glutathione S-transferase," Gene 67 (1988) 31-40; D.B. Smith, "Purification glutathione S-transferase fusion proteins," Methods Mol. Cell Biol. 4

(1993)220-229.

Ispitivanja c-Kita

[0113]Reaktivna smeša za ispitivanje uključuje 6 nM humanog izvornog oblika c-KIT, 1 mg/mL Poly (Glu,Tyr) (Sigma), lmM fosfoenol-piruvata, 280 uM NADU, 5U/3.5U (po 100 ul) Piruvat kinaza/laktat đehidrogenaza, 85 mM Tris, pH 7.5, 17 mM MgCh, 0.0042 % Triton® X-100, 0.005% BSA, 1% DMSO. Test jedinjenje se inkubira 0.5 sati sa reaktivnom smešom a nakon toga se doda 200uM ATP da se započne reakcija na 30°C. Brzina reakcije u vremenskom okviru od 0.5 do 1 h se koristi za izračunavanje % inhibicije i IC50vrednosti.

[0114)Sekvenca koja se ovde koristi uključuje c-Kit sa GST fuzijom na N-završetku.

[0115]Za Primer 1, vrednost IC50za inhibiciju humanog c-Kit je 21 nM. Ovaj rezultat pokazuje da je testirano jedinjenje iz primera u ovom ispitivanju inhibitor humanog izvornog oblika c-Kit.

[0116]Za dalju procenu test jedinjenja, jedinjenje se testira na c-Kit mutacije koje se obično dešavaju kod melanoma i/ili GIST. Ba/F3 ćelijska linija (od ATCC) sc transfektuje sa izvornim oblikom (IO) c-Kit, c-Kit L576P (Willmore-Payne i saradnici. Human Pathology, 2005, 36(5), 486; Willmore-Payne i saradnici. Human Pathology, 2006, 37. 520), c-Kit K642E (VVillmore i saradnici, Am J Clin Pathol, 2004. 122(2), 206; Monsel i saradnici, Oncogene, 2010, 29, 227), c-Kit T670I (Tamborini i saradnici, Oncogene, 2006, 25, 6140), ili c-Kit V654A (Tamborini i saradnici, Oncogene, 2006, 25, 6140). tim redom i utvrđeni su postupcima retrovirusne transfekcije koji su dobro poznati i koje koriste stručnjaci sa iskustvom u tehnici. Mutacije se generišu reakcijom mutagenoznog lanca polimeraze (PLR) i potvrđene su automatskim sekvenciranjcm konstrukcije PLR-pojačane c-Kit ekspresije. Ba/F3 stabilne ćelijske linije se generišu transfekcijom sa plazmiđom DNK. Ekspresija odgovarajućih c-Kit mutanta se potvrđuje VVestern blot analizama.

[0117]Rast izvornog oblika Ba/F3 ćelija generalno zavisi od 1L-3. Nakon transfekcije c-Kit, ove ćelije rastu u Ba/F3 ATCC preporučenom medij umu za rast u prisustvu faktora stem ćelija (FSC), liganda c-Kit. Antiproliferativna delovanja test jedinjenja na ove ćelije se ispituju u prisustvu IL-3 ili FSC.

[0118]Rezultati u Tabeli 2 pokazuju da Primer 1 ima inhibitorno delovanje na proliferaciju i sposobnost preživljavanja ćelija izvornog oblika c-Kit i identifikovanih c-Kit genetičkih mutacija u Ba/F3 ćelijama.

Mcrenje aktivnosti Raf Kinaze sa nativnim ceiim enzimima koristeći KiNativ analizu ActivX Biosciences Inc.

[0119] Za dalju procenu aktivnosti test jedinjenja na celokupnu enzimatičku aktivnosti pan Raf, ona se procenjuje u KiNativ analizi razvijenoj i izvedenoj pomoću ActivX Biosciences Inc. koristeći lizate celih A375 ćelija. A375 ćelije su ćelije humane melanome sa B-Raf V600E mutacijom, A-Raf izvornim oblikom i C-Raf izvornim oblikom. Izrada uzorka: A375 (B-Raf V600E) ćelije nabavljene od ATCC se liziraju sonikacijom u komercijalno raspoloživom puferu za liziranje, ostaci ćelija se uklone centrifugiranjem a dobijeni supernatant gel se filtrira u komercijalno raspoloživom puferu za reakciju kinaze koji sadrži 20 mM MnCb. Finalna koncentracija proteina lizata iznosi 10 mg/mL. Iz osnovnih rastvora koncentracija 100 pM, 30 pM, 1 uM ili 0.1 uM u DMSO sc po 5 pL svakog test jedinjenja doda u 500 uL lizata u duplikatima do finalnih koncentracija od 1 uM, 0.1 uM, 0.01 pM i 0.001 uM. Za kontrole se po 5 uL DMSO doda u 500 uL lizata u u četvorostrukim serijama. Nakon 15 minuta inkubacije, u svaki uzorak se doda destiobiotin-ATP acilfosfat proba do finalne koncentracije od 5 pM i inkubira 10 minuta sa uzorcima. Nakon probne reakcije, uzorci se pripreme za analizu određenim masenim spektrom koristeći ActivX standardni protokol. Ukratko, uzorci se pripreme za digestiju tripsina (denaturišu, redukuje alkilat), peptidi digestovani sa tripsinom i đestio-biotinilizirani peptidi se obogate na streptavidin smoli. Sakupljanje rezultata: Uzorci obogaćenih peptida se analiziraju pomoću LC-MS/MS na Thermo-LTQ Velos masenom spektrometru sa hvatanjem jona, koristeći metodologiju ActivX sakupljanja uzoraka za A375 V600E ćelije. Analiza rezultata: Sve kvantifikacije su izvršene ekstrakcijom karakterističnog fragmenta jonskih signala od traženog MS/MS spektra i upoređivanjem signala u kontroli i u tretiranim uzorcima. ActivX softver je korišćen sa manuelnom validacijom/vizuelnim pregledom kada je to potrebno. Svi važni podaci inhibicije su vizuelno verifikovani, kao i svi važni podaci koji pokazuju odstupanja izvan uobičajenih vrednosti. Značaj izabranih podataka koji pokazuju

>35% inhibicije je utvrđen u skladu sa sledećom formulom: prošek oblasti kontrolnog pika - prosečne oblasti tretiranog pika|/(2<*>StdDev(oblasti kontrolnog pika) + joblast jednog pika tretiranog replikata - oblast dva pika tretiranog replikata| > 0.8. ICso vrednosti su određene pomoću IGOR® software.

[0120] Kako je pokazano u Tabeli 3, Primer 1 inhibira A-Raf, B-Raf V600E i C-Raf sa IC50vrednostima 44, 31-47 i 42 nM, tim redom. Ove vrednosti su dokaz da Primer 1 inhibira A-Raf, C-Raf i B-Raf V600E u analizi lizata cele ćelije.

Primer 1 inhibira fosfo-ERK aktivnost u ćeliji

[0121] Za ispitivanje da li se in vitro biohemijske aktivnosti Primera I prenose u ćelijske aktivnosti, Primer 1 se koristi za tretiranje ćelija melanoma, A375 V600E i VVM-266-4 V600E, A375 V600E-PLX4032 rezistentnih ćelija (A375-res; generisanih kako je niže opisano) i HCT-116 (K-Ras mutant B-Raf izvornog oblika) ćelija, ćelija tumora kolona sa K-Ras mutacijom. A375 V600E, WM-266-4 V600E, HCT-116 K-Ras mutant B-Raf izvornog oblika su nabavljeni od ATCC. Ćelijsko delovanje se procenjujc pomoću ELISA testa za merenje fosfo-ERK vrednosti svakog tipa ćelija, nabavljenog od TGR Biosciences.

[0122] A375 V600E, A375 V600E-PLX4032 rezistentne ćelije, VVM-266-4 V600E, ili HCT-116 (K-Ras mutant B-Raf izvornog oblika) ćelije se uzgajaju u medijumu za rast (niže opisan za CellTiterGlo Assay) u pločama sa 96 otvora proizvođača PerkinElmer, u toku noći, a nakon toga se tretiraju sa Primerom 1 pri 0 i 11 različitih serijskih razblaženja. sa koncentracijama u rasponu od 0.17 do 10000 nM u toku 1 sat. Ćelije u svakom otvoru se nakon toga Iiziraju sa po 50pl pufera za liziranje proizvođača TGR Biosciences. Fosfo-ERK aktivnosti se određuju sa SureFire phospho-ERK AlphaScreen kit testom proizvođača TGR Biosciences po uputstvu proizvođača.

[0123] Primer 1 inhibira nivo fosfo-ERK u zavisnosti od doze u svim testiranim ćelijskim linijama. IC50vrednosti za A375 V600E, WM-266-4 V600E, A375 V600E-res i HCT-116 (K-Ras mutant B-Raf izvorni oblik) ćelije su 3, 4.9. 9.7 i 132.8 nM, tim redom. Ovi rezultati dokazuju da u ovoj analizi Primer 1 inhibira signalizaciju unazad u A375 V600E, VVM-266-4 V600E. A3 75 V600E-rcs i HCT-116 K-Ras mutant B-Raf izvornog oblika ćelijama kao rezultat Ras inhibicije.

CellTiter-Blue analiza proliferacije i sposobnosti preživljavanja ćelija

Analiza proliferacije A375 ćelija

[0124] A375 ćelije (kataloški broj CRL-1619) su đobijene od American Tvpe Culturc Collection (ATCC, Manassas, VA). Ukratko, ćelije se uzgajaju u DMEM High Glucose medijumu obogaćenom sa 10% označenog seruma fetusa govečeta (Invitrogen. Carlsbad, CA) i 1% Penicillin/Streptomycin/L-Glulamin na 37 stepeni Cclzijusovih, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Ćelije se ostave da se šire sve dok ne dostignu 70-95% površine, kada se podvrgnu subuzgajanju ili se pokupe za analizu. Serijsko razblaženje test jedinjenja se pripremi u crnim pločama sa 384 otvora sa providnim dnom u triplikatu. Šesto dvadeset pet ćelija se doda po otvoru u 50 pL pripremljenog medijuma za rast u pločama sa 384 otvora. Ploče se inkubiraju 67 sati na 37 °C, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Po završetku perioda inkubacije, u svaki otvor ploče se doda lOpL 440 pM rastvora resazurina (Sigma. St. Louis, MO) u PBS i ploče se inkubiraju još 5 sati na 37 °C, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Ploče se očitavaju na Synergy2 čitaču (Biotek, Winooski, VT) uz ekscitaciju na 540 nm i emisiju na 600 nm. Rezultati su analizirani pomoću Prism softvera (Graphpad, San Diego, CA) da se izračunaj u IC50vrednosti.

Analiza proliferacije CoIo- 205 ćelija

[0125] Colo205 ćelije (kataloški broj HB-8307) su dobijene od American Type Culturc Collection (ATCC, Manassas, VA). Ukratko, ćelije se uzgajaju u RPMI 1640 medijumu obogaćenom sa 10% označenog seruma fetusa govečeta (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 mM natrijum piruvata i 1% Penicillin/Strcptomycin/L-G3utamin na 37 stepeni Celzijusovih, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Ćelije se ostave da se šire sve dok ne dostignu 30-60% površine, kada se podvrgnu subuzgajanju ili se pokupe za analizu. Serijsko razblaženje test jedinjenja se pripremi u crnim pločama sa 384 otvora sa providnim dnom. u triplikatu. Hiljadu dvest pedeset ćelija se doda po otvoru u 50 pL pripremljenog medijuma za rast u pločama sa 384 otvora. Ploče se inkubiraju 67 sati na 37 °C, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Po završetku perioda inkubacije, u svaki otvor ploče se doda 1 OpL 440 pM rastvora resazurina (Sigma. St. Louis. MO) u PBS i ploče se inkubiraju još 5 sati na 37 °C, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Ploče se očitavaju na Synergy2 čitaču (Biotek, VVinooski, VT), uz ekscitaciju na 540 nm i emisiju na 600 nm. Rezultati su analizirani pomoću Prism softvera (Graphpad. San Diego. CA) da sc izraČunaju IC50 vrednosti.

Analiza proliferacije HT- 29 ćelije

[0126] HT-29 ćelije (kataloški broj HTB-38) su nabavljene od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ukratko, ćelije se uzgajaju u McCoy's 5A medijumu obogaćenom sa 10% označenog seruma fetusa govečeta (Invitrogen. Carlsbad, CA) i 1% Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin na 37 stepeni Celzijusovih, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Ćelije se ostave da se šire sve dok ne dostignu 75-90% površine, kada se podvrgnu subuzgajanju ili se pokupe za analizu. Serijsko razblaženje test jedinjenja se pripremi u crnim pločama sa 384 otvora sa providnim dnom, u triplikatu. Hiljadu dvesta pedeset ćelija se doda po otvoru u 50 pL pripremljenog medijuma za rast u pločama sa 384 otvora. Ploče se inkubiraju 67 sati na 37 °C, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Po završetku perioda inkubacije, u svaki otvor ploče se doda lOpL 440 pM rastvora resazurina (Sigma, St. Louis. MO) u PBS i ploče se inkubiraju još 5 sati na 37 °C, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Ploče se očitavaju na Synergy2 čitaču (Biotek, VVinooski. VT) uz ekscitaciju na 540 nm i emisiju na 600 nm. Rezultati su analizirani pomoću Prism softvera (Graphpad, San Diego, CA) da se izraČunaju IC50vrednosti.

Analiza proliferacije HCT- 116 ćelija

[0127] HCT-116 ćelije (kataloški broj CCL-247) su nabavljene od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ukratko, ćelije se uzgajaju u McCoy's 5A medijumu obogaćenom sa 10% označenog seruma fetusa govečeta (Invitrogen, Carlsbad. CA) i 1 % Penicillin/Streptomycin/L-GIutamin na 37 stepeni Celzijusovih, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Ćelije se ostave da se šire sve dok ne dostignu 75-90% površine, kada se podvrgnu subuzgajanju ili se pokupe za analizu. Serijsko razblaženje test jedinjenja se pripremi u crnim pločama sa 384 otvora sa providnim dnom, u triplikatu. Šest stotina dvadeset pet ćelija se doda po otvoru u 50 pL pripremljenog medijuma za rast u pločama sa 384 otvora. Ploče se inkubiraju 67 sati na 37 °C, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Po završetku perioda inkubacije, u svaki otvor ploče se doda lOpL 440 pM rastvora resazurina (Sigma, St. Louis, MO) u PBS i ploče se inkubiraju još 5 sati na 37 °C. uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Ploče se očitavaju na Synergy2 Čitaču (Biotek, VVinooski. VT) uz ekscitaciju na 540 nm i emisiju na 600 nm. Rezultati su analizirani pomoću Prism softvera (Graphpad, San Diego, CA) da se izraČunaju IC50vrednosti.

Analiza proliferacije SK- Mel- 2 ćelija

[0128]Sk-Mel-2 ćelije (kataloški broj HTB-68) su nabavljene od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ukratko, ćelije sc uzgajaju u MEM medijumu obogaćenom sa 1 0% označenog seruma fetusa govečeta (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 mM natrijum piruvata, 0.1 mM ne-esencijalnim amino kiselinama i 1% Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin, na 37 stepeni Celzijusovih, uz 5% CO2 i 95% vlažnosti. Ćelije se ostave da se šire sve dok ne dostignu 70-95% površine, kada se podvrgnu subuzgajanju ili se pokupe za analizu. Serijsko razblaženje test jedinjenja se pripremi u crnim pločama sa 384 otvora sa providnim dnom, u triplikatu. Hiljadudvesta pedeset ćelija se doda po otvoru u 50<p>L pripremljenog medijuma za rast u pločama sa 384 otvora. Ploče se inkubiraju 67 sati na 37 °C, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Po završetku perioda inkubacije, u svaki otvor ploče se doda lOpL 440 pM rastvora resazurina (Sigma, St. Louis, MO) u PBS i ploče sc inkubiraju još 5 sati na 37 °C, uz 5% CO2i 95% vlažnosti. Ploče se očitavaju na Synergy2 Čitaču (Biotek, VVinooski, VT) uz ekscitaciju na 540 nm i emisiju na 600 nm. Rezultati su analizirani pomoću Prism softvera (Graphpad, San Diego, CA) da se izraČunaju IC50vrednosti.

[0129]A375, HT-29 i Colo-205 ćelije (ATCC) su podvrgnute V600E mutaciji. HCT-116 ćelije (ATCC) su podvrgnute K-Ras mutaciji B-Raf izvornog oblika i SK-Mel-2 ćelije (ATCC) su podvrgnute N-Ras mutaciji B-Raf izvornog oblika.

[0130]Rezultati u Tabeli 4 dokazuju da jedinjenje iz primera inhibira proliferaciju i sposobnost preživljavanja navedenih ćelija podvrgnutih navedenim mutacijama u ovom ispitivanju.

Inhibitorno delovanje na proliferaciju i sposobnost preživljavanja

[0131]Primer 1 je testiran na inhibitorno delovanje na proliferaciju i sposobnost preživljavanja kroz široki panci ćclijskih linija humanih tumora u CellTitcr-Glo analizama.

[0132]Generalno, za CellTitcr-Glo analizu (Promega), ćelije se uzgajaju Dulbccco-vom modifikovanom Eagle medijumu (DMEM, Thermo Scientific) obogaćenom sa 10% seruma fetusa govečeta (FBS, Invitrogen). Ćelije (5X10<3>), održavane u medijumu za rast, se nanesu na ploče sa 96 otvora obložene sa poli-D-lizinom (BD Biosciences), dan prc tretmana. Ćelije se tretiraju u toku 48-72-sata a nakon toga analiziraju na proliferaciju i sposobnost preživljavanja pomoću CellTiter-Glo Luminescent Cell Viabilitv Assay, u skladu sa uputstvom proizvođača (Promega) i SpectraMax Čitača ploča (Molecular Devices). Krive ne-linearne regresije i sigmoidalnih doza-odgovora se koriste za izračunavanje polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) sa GraphPad Prism 4 softverom.

[0133]Pored toga, ćelijske linije N-RAS mutant B-Raf izvornog oblika hematološkog kancera se testiraju na osetljivost na Primer 1. N-Ras aktivirajuće mutacije su česte kod hematoloških kancera i javljaju se u 10-30% slučajeva. Testirane su dve ćelijske linije B-Raf V600E mutant melanoma (A-375 i SK-Mel-28), devet ćelijskih linija N-Ras hematoloških mutanta (HL-60, THP-1,TALL-1, C8166, 119, IM-9, GA-10 clone 4, P31-FUJ, MOLT-4) i sedam ćelijskih linija N-Ras izvornog oblika (LOUCY, HEL, U266, EB2, P30-OHK, NOMO-1, CCRF-CEM) i date su vrednosti IC50. Mada postoji raspon u osetljivosti između ovih ćelijskih linija, 7 od 9 ćelijskih linija hematološkog kancera sa N-Ras mutacijama B-Raf izvornog oblika su osetljive na submikromolarne koncentracije Primera 1 (IC5o<l pM).

[0134]Prethodno dati rezultati dokazuju da su A375 ćelije melanome osetljive na Primer 1. Između najosetljivijih ćelijskih linija u ovom istraživanju su HepG2 i THP-1 ćelije. HepG2 su izdvojene iz hepatocelularnog karcinoma, THP-1 je AML ćeiijska linija i obe imaju aktivirane N-RAS mutacije B-Raf izvornog oblika. U ovoj analizi, rezultat dokazuje da Primer 1 ima pan Raf inhibitorno delovanje i utiče na aktivaciju signalizacije unapred.

Primer 1 inhibira ćelijski rast HCT-116 ćelija sa K-Ras mutacijom:

[0135]K-Ras mutacija B-Raf izvornog oblika je jedna od najčešćih i najvažnijih mutacija kod brojnih tipova kancera, uključujući kancer pankreasa, pluća i kolorektuma (Bos, Cancer Research, 1989, 49(37): 4682). K-Ras mutacija dovodi do aktivacije Ras/Raf/MEK/MAPK kaskade što doprinosi transformaciji ćelija i malignitetu. Za ispitivanje anti-proliferativnog delovanja Primera 1 u K-Ras mutantu B-Raf izvornog oblika ćelija, koriste se HCT-116 ćelije tumora kolona (ATCC) kod kojih postoji K-Ras mutacija B-Raf izvornog oblika, u CellTiter-Glo ispitivanju proliferacije i procene preživljavanja ćelije. Primer 1 inhibira proliferaciju i sposobnost preživljavanja HCT-116 K-Ras mutacije B-Raf izvornog oblika na način koji zavisi od doze sa IC50od 178 nM. Ovi rezultati dokazuju Raf inhibitorno delovanje Primera 1 koji deluje na neodgovarajuće aktiviranu signalizaciju unapred, u ovom ispitivanju.

Primer 1 inhibira rast kod ćelija tumora sa N-Ras mutacijom:

[0136] N-Ras Često mutira kod melanome, akutne mijeloidne leukemije (AML) i kancera jetre (Bos, Cancer Research, 1989, 49(17): 4682). N-Ras mutacije B-Raf izvornog oblika dovode do aktivacije MAPK preko Raf proteina, posebno C-Raf. Anti-proliferativno delovanje Primera I na ćelije tumora N_Raf mutantu B-Raf izvornog oblika, ćelijske linije humane melanome SK-Mel-2 koja ima N-Ras mutaciju Q61R i B-Raf izvornog oblika (ATCC), se testira CellTiter-Glo analizom za inhibiciju proliferacije i sposobnosti preživljavanja ćelija a sprovodi se i VVestern blot analiza.

Imunobloting (Western blot) anlize

[0137] Testiranje se izvodi u dozama od 0 i 11 serijskih razblaženja u rasponu od 0.17 do 10000 nM. Lizati proteina se generišu tretmanom ćelija sa RIPA puferom za liziranaje proizvođača Millipore. Westem blotting analiza se izvodi u potpunosti kako su opisaliYadav i saradnici, Molecular Carcinogenesis, 2011, 50: 346-52. Ukratko, SDS-PAGE se izvodi na lizatima ćelija koji sadrže 20 ug ukupnog proteina koristeći 4-20%Novex® tri-glicin gradijent gele (Invitrogen). Protein sc prenese na nitrocelulozne membrane promera 0.45 pM koristeći NuPAGE® Transfer Buffer (Invitrogen) i 10% metanol na 100 V, 1 h na 4 °C. Generalno, primarno antitelo se koristi u razblaženju 1:1000 a drugo antitelo u razblaženju 1:20000. Proteini se detektuju pomoću Odyssey Infrared Imaging Svstem (Li-COR Biosciences). Antitela na ERK1/2, fosfo-ERK 1 12, fosfo-MEKl/2 i aktini su dobijena primenom tehnologije signalizacije ćelija. 10138] Primer 1 ispoljava doza-zavisnu fosfo-MEK i fosfo-ERK inhibiciju u SK-Mel-2 ćelijama sa N-Ras mutacijom Q61R i B-Raf izvornim oblikom, kako je određeno VVestern Blot analizama. Fosfo-ERK aktivnost je potpuno eliminisana pri dozi od 370 nM.

[0139]Primer 1 inhibira proliferaciju i sposobnost preživljavanja SK-Mel-2 ćelija u CellTiter-Glo analizi sa IC50od 188 nM. Ovi rezultati potvrđuju da Primer 1 inhibira sposobnost preživljavanja i proliferaciju ćelija u SK-MEL-2 ćelijama kod kojih postoji izvorni oblik B-Raf i N-Ras mutacija Q61R, u ovom ispitivanju.

Delovanje Primera 1 na inhibiciju vemurafenib-rezistcntnih ćelija melanoma:

[0140]Vemurafenib (PLX4032) i PLX4720 su inhibitori mutanta B-Raf V600E (Johannessen i saradnici. Nature, 2010, 468: 968-72; Montagut i saradnici, Cancer Res. 2008. 68: 4853-61; VVagle i saradnici, Journal Clinical Oncologv, 2011. 29: 3085-96). Kod nekih od pacijenata koji su u početku odgovarali na terapiju vemurafenibom sc javlja rezistencija na lek i postaju refraktorni u toku približno 7 meseci, VVhittaker i saradnici, Sci Transi Med. 2010, 2: 35-41. Vemurafenib-rczistenhtna ćelijska linija se generiŠe trajnim tretmanom humane melanoma ćelijske linije A375 (ATCC) sa B-Raf V600E mutacijom uz povećanje koncentracija PLX4720.

Generisanje B-RAF V600E melanoma ćelijskih linija rezistentnih na B-RAF inhibiciju

[0141]Za generisanje rezistencije ćelija, A375 B-Raf V600E ćelije (ATCC) se uzgajaju u medijumu za rast, kako je prethodno opisano za CellTiter-GIo analizu, u prisustvu postepeno rastućih koncentracija N- [3-(5-hlor-l I I-pyrrolo[2,3-b]piridin-3-karbonil)-2,4-difluorofeniI]propan-l-sulfonamida (PLX4720; komercijalno raspoloživ selektivni B-Raf inhibitor) od 0.02 do 2 pM u toku približno 4 meseca i 30 prolazaka da se dobije rezistentna ćelijska linija označena kao A375res. Rezistencija A375rcs na vemurafenib i PLX4720 je potvrđena reaktivacijom MAPK Western blot analizama i promenama ICso vrednosti u CellTiter-GIo analizi proliferacije i sposobnosti ćelija za preživljavanje.

[0142]U ovim A375rcs ćelijama, PLX4032 gubi mnogo od svoje aktivnosti promenama skoro 30 puta od 252 nM do više od 7 pM. Aktivnost Primera 1 na ove rezistentne ćelije se dokazuje pri ICso od 34 nM uz promene samo 3 puta od 11 nM. Ovi rezultati dokazuju da Primer 1 inhibira proliferaciju i sposobnost preživljavanja ćelija u A375res ćelijama u ovoj analizi.

Primer 1 ima minimalnu aktivaciju paradoksikalnog puta:

[0143]Savremene objavljene studije (videti prethodno) ukazuju da B-Raf specifični inhibitori kao Što je vemurafenib (PLX-4032) indukuju "aktivaciju paradoksikalnog puta" dimerizacijom B-Raf sa drugim Raf izooblicima poreklom od B-Raf izvornog oblika. Vemurafenib nije odobren za tretman melanoma kancera kod pacijenata sa B-Raf izvornim oblikom genetskog porekla. Takodc se veruje da ovo aktiviranje paradoksikalnog puta izaziva neželjene efekte na koži (kao stoje karcinom skvamoznih ćelija) kod nekih pacijenata sa melanomom tretiranom sa vemurafenibom.

[0144]Primer 1 je testiran na HCT-116 (ATCC) ćelijama koje imaju B-Raf izvorni oblik i K-Ras mutaciju, ispitivanjem sposobnosti preživljavanja CellTiter-GIo analizom. Testiranje sc izvodi u dozama od 0 i 11 serijskih razblaženja u rasponu od 0.17 do 10000 nM. Fosfo-MEK i fosfo-ERK aktiviranja sc procenjuju imunobloling (VVestern Blot) analizama.

[0145]Za Primer 1 je dokazana minimalna aktivacija paradoksikalnog puta i održavanje fosfo-MEK i fosfo-ERK inhibicijom aktivnosti u HCT-116 ćelijama koje imaju B-Raf izvorni oblik i K-Ras genetskog porekla. U ovoj analizi, Primer 1 skoro potpuno eliminiše fosfo-ERK signal u dozama iznad 41 nM. Kako je za Primer 1 takođe dokazana C-Raf inhibicija (prethodne analize), veruje se da ne dolazi do aktivacije paradoksikalnog puta.

Primer 1 inhibira ćelijski rast ćelija tumora sa B-Raf V600E mutacijom:

[0146]B-Raf mutacije, posebno B-Raf V600E, u kancerima kod ljudi su često uočene u humanim malignitetima, uključujući melanomu, kancere kolorektuma, pluća i jajnika. Ova mutacija u B-Raf može da dovede do konsitutivne aktivacije kinaze i transformacije maligniteta. Primer 1 je testiran CellTiter-GIo analizom u tri ćelijske linije melanoma A375 (ATCC), VVM-266-4 (ATCC) i SK-Mel-28 (ATCC) i dve ćelijske linije tumora kolona HT-29 (ATCC) i Colo-205 (ATCC); svih pet ćelijskih linija imaju B-Raf V600E mutaciju.

[0147]Primer 1 inhibira sposobnost preživljavanja ćelija u tri ćelijske linije melanoma. A375, WM-266-4 i SK-Mel-28 sa IC50vrcdnostima od 9.2, 52.9 i 29 nM, tim redom. Slično tome, Primer 1 inhibira sposobnost preživljavanja ćelija u dve ćelijske linije karcinoma kolona, HT-29 i Colo-205 sa IC50vrcdnostima od 7.3 i 27 nM. U ovoj analizi, rezultati dokazuju daje Primer 1 aktivan u inhibiciji sposobnosti preživljavanja ćelija i rastu ćelija tumora sa B-Raf V600E mutacijom.

[0148]Primer 1 takodc inhibira aktivaciju fosfo-MEK i fosfo-ERK u prethodno testiranim A375 ćelijama stoje dalje procenjeno VVestern Blot analizom koja je dokazala inhibiciju signalizacije unazad, u zavisnosti od doze. Aktivnost fosfo-ERK je skoro potpuno eliminisana na 41 nM.

Aktivnost In Vivo

[0149]Za procenu in vivo aktivnosti Primera 1, koriste se modeli A375 V600E (ATCC) i HCT-116 K-Ras mutant B-Raf izvornog oblika (ATCC) ksenograft tumora. Ukratko, 10 x IO6 ćelija (A375) ili 5 x IO6 ćelija (HCT-116) u smeši medijuma i matriksgela u odnosu 1:1 (0.2 mL ukupna zapremina) se subkutanom injekcijom implantiraju u zadnju nogu obrijanih ženki pacova (NIH model broj NIHRNU-M firme Taconic). Za studije efikasnosti se koristi ukupno po 8 pacova u svakoj grupi a ukupno 3-4 pacova u svakoj grupi se uzima za studiju farmakodinamike. Eli Lilly i Company Animal Care i Use Committee su odobrili sve eksperimentalne protokole. Tretman počinje oralnom primenom (gavažom) Primera 1 ili vehikuluma (20% Captizol®, 25 mM fosfata, pH 2.0) u zapremini od 0.6 mL kada tumor dostigne veličinu približno 500 mg. Primer 1 se oralno dozira dva puta dnevno po 5, 10, 15 i 20 mg/kg u toku 21 dan za A375 kscnograft model ili 15 i 30 mg/kg u toku 21 dan za HCT-116 ksenograft model. Rast tumora i telesna težina se prate u toku tog vremena kako bi se procenila aktivnost i znaci toksičnosti. Dvodimenzionalna merenja tumora se vrše dva puta nedeljno i zapremine tumora se izračunavaju na bazi najveće dužine i najveće širine. Rezultati zapremine tumora se prevedu u log skalu da se izjednače promenljivc u odnosu na vreme i tretirane grupe. Rezultati log zapremine se analiziraju analizom promenljivih merenja ponavljanih na dva načina po vremenu i tretmanu koristeći MIXED® procedure u SAS® softveru (verzija 8.2). Korelacioni model za ponovljena merenja je prostorni model. Tretirane grupe se po rede sa kontrolnom grupom u svakoj vremenskoj lački. MIXED® procedura se takođe koristi odvojeno za svaku tretiranu grupu za izračunavanje podešene srednje vrednosti i standardne greške u svakoj tački vremena. Broje se analize koje dovode do autokorelacije za svaku životinju i gubitak vrednosti do kojih dolazi kada se životinje sa velikim tumorima ranije uklone iz studije. Podešene srednje vrednosti i standardne greške se nanose u sistem odnosu na vreme, za svaku tretiranu grupu.

[0150]U A375 ksenograft modelima sve grupe koje su dobijale dozu Primera 1 su pokazale inhibiciju rasta tumora i regresiju rasta tumora i nije bilo gubitka telesne težine životinja ni u jednoj od ovih grupa. U HCT-116 ksenograft modelu, grupa koja je primala 30 mg/kg pokazuje statistički značajnu inhibiciju rasta tumora. Ovi rezultati dokazuju in vivo aktivnost Primera 1 i podržavaju mišljenje da su rezultati enizmatičkih reakcija, reakcija lizata ćelija i proliferacije ćelija u korelaciji sa aktivnišću in vivo.

[0151]U odvojenoj studiji za procenu farmakodinamičkog (FD) efekta Primera 1 na A375 ksenograft modelu, izvodi se studija pojedinačne doze sa dozama u rasponu od 3.125 do 50 mg/kg.

[0152]Dva sata nakon tretmana pojedinačnom dozom, uočeni su doza-zavisni FD efekti kako je pokazano VVestern Blot analizama. Fosfo-MEK i fosfo-ERK inhibicija je uočena u svim doznim grupama a doza od 25 mg/kg skoro potpuno eliminišc fosfo-MEK i fosfo-ERK aktivnosti u ovom modelu.

Claims (12)

1. Jedinjenje, naznačeno time što je to 1 -(3,3-dimetilbutil)-3-(2-lfuoro-4-metil-5-(7-metii-2-(metilamino)pirido[2,3-đ]pirimidin-6-il)fenil)urea, ili njena farmaceutski prihvatljiva so.

2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to 1 -(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metiIamino)pirido[2.3-d]pirimidin-6-il)fenil)urca.

3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time sto je to l-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-dJpirimidin-6-il)fenil)urca u kristalnom obliku okarakterisana difrakcijom X-zraka praškastog uzorka koji ima karakteristične pikove, u 28 ± 0.2, koji se javljaju na 16.0 i jedan ili više na 6.9. 7.0, 18.2 i 23.2.

4. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

5. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje ili so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.

6. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje ili so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 i polivinil pirolidon vinil acetat (PVP-VA).

7. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačena time što je PVP-VA Kollidon® VA 64.

8. Jedinjenje ili so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.

9. Jedinjenje ili so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu kancera.

10. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačeno time stoje kancer izabran iz grupe u koju spadaju kancer štitaste žlezde, kancer jajnika, melanoma. akutna mijclogcna leukemija (AML) i kancer kolorektuma.

11. jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačeno time što je kancer melanoma.

12. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačeno time što je to kancer kolorektuma.