RS54845B1

RS54845B1 - Kompozicije plazme obogaćene tromobicitima

Info

Publication number: RS54845B1
Application number: RS20160446A
Authority: RS
Inventors: Sanchez Julian Agut; Navarro Carlos Fernandez; Trullas Joan Cos; Safont Laura Ocana; Corominas Elsa Genove
Original assignee: Opko Lab Europe Sl
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2016-10-31
Also published as: EP2628484B9; EP2628484A1; CL2013000426A1; SI2628484T1; EP2628484B1; US9233126B2; CO7030201A1; HRP20160719T1; DK2628484T3; PL2628484T3; BR102013003570A8; US20130216626A1; MX341202B; HUE030322T2; BR102013003570A2; ES2579857T3; MX2013001842A

Abstract

Farmaceutska kompozicija koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima (PRP), naznačena time, što je dobijena iz heterologog izvora za upotrebu u tretmanu ili prevenciji bola povezanog sa bolestima, poremećajima ili povredama zglobova ili tetiva pri čemu se kompozicija ima dati oralno.Prijava sadrži još 5 patentnih zahteva.

Description

Tehnička oblast pronalaska

Sadašnji pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije za oralno davanje koje se sastoje od plazme obogaćene trombocitima i na njihovu upotrebu. Ovaj pronalazak takođe opisuje nutricione kompozicije koje sadrže plazmu obogaćenu trombocitima.

Stanje tehnike

Plazma obogaćena trombocitima (PRP) je proizvod izveden iz krvi koji je obogaćen trombocitima. PRP se tipično dobija iz krvi pacijenta i koristi se u regenerativnoj medicini.

Trombociti igraju fundamentalnu ulogu u hemostazi i prirodni su izvor faktora rasta. Oslobađanje ovih faktora rasta se pokreće aktivacijom trombocita koja može biti inicirana različitim substancama ili stimulusima kao što su trombin, kalcijum hlorid ili kolagen. Faktori rasta su prirodno nastali proteini sposobni da stimulišu ćelijsku proliferaciju i diferencijaciju. U studijama je pronađeno da su faktori rasta važni u različitim fazama kaskade zarastanja rane i da uveliko utiču na mitogene aktivnosti i aktivnosti ćelijske diferencijacije (Pierce et al., Proc Natl. Acad Sci. U.S.A. 86(7), 2229-2233 (1989) i J. Cell Biol. 109(1), 429^40 (1989) i D. L. Steed etal., Surg, Clin. North Am. 77, 575-586 (1997)). Prema tome, faktori rasta su potencijalno korisni za specifično promovisanje zarastanja rana i popravku tkiva. PRP generalno mogu da uključe jedan ili više transformišući faktor rasta (TGF), fibroblast faktor rasta (FGF), iz trombocita izveden faktor rasta (PDGF), epidermalni faktor rasta (EGF), vaskularno endoteiijalni faktor rasta (VEGF), insulinu sličan faktor rasta (IGF), iz trombocita izvedeni endoteiijalni faktor rasta (PDEGF), iz trombocita izveden faktor angiogeneze (PDAF), trombocit faktor 4 (PF-4) i hepatocit faktor rasta (HGF).

Posebno, trasformišući faktori rasta (TGF) pristutni u PRP-u posebno uključuju one iz TGF-p familije. TGF-p je protein koji kontroliše proliferaciju, diferencijaciju i druge funkcije ćelija. On takođe može da se ponaša kao negativni autokrini faktor rasta. Za TGF-p je poznato da aktivira fibroblaste da se formira prokolagen rezultirajući u taloženju kolagena u okviru rane. Drugi faktori rasta kao što je PDGF su aktivatori kolagenaze tokom zarastanja rane koji dopuštaju preoblikovanje kolagena radi snage (jačine) rane.

PRP ima mnoštvo medicinskih primena, primarno u konstruktivnoj oralnoj hirurgiji i kao deo kompozicije koja se koristi kao hirurški adheziv. Za PRP je otkriveno da formira adheziv fibrin tkiva kroz aktivaciju PRP-a upotrebom trombina i kalcijuma, što aktivira trombocite da oslobode svoje sadržaje kao što su citokini i drugi faktori rasta. Na primer, U.S. 6,322,785 otkriva autologi gel trombocita koji sadrži PRP za izvlačenje kosti i primene dentalnih implanta.

Upotreba PRP je proširena na nove primene, kao što je inženjering bio-tkiva ili autologa ili alogena presađivanja tkiva, kao i regeneracija tkiva (Oikarinen et al., Dent. Traumatol. 19, 19-29 (2003)). Ove primene uključuju PRP kao deo kompozicije za zarastanje rane (U.S. 5,599,558) i popravku tkiva (U.S. 6,811,777), za upotrebu kao zaptivna smesa tkiva (U.S. 5,585,007) ili u kombinaciji sa bioplimerom da se privremeno blokiraju arterije i vene (U.S. 5,614,204). Štaviše, WO 2011/127071 se odnosi na formulacije PRP i njihovu upotrebu u tretiranju ishemične povrede, posebno oštećenog vezivnog tkiva, kardijačkog tkiva ili tkiva pluća.

U.S. 6,811,777 otkriva kompoziciju plazme obogaćene trombocitioma za tretiranje povređenog tkiva kao što je vezivno tkivo, srčani mišić, skeletni mišić, materijal pršljena, vertebralno telo, mozak, kičmena moždina i vaskularno tkivo uvođenjem kompozicije plazme obogaćene trombocitima na i oko položaja povređenog tkiva.

Najbrži izvor PRP je iz krvi ekstrakovane iz pacijenta, pa PRP tako može biti dobijen i aktiviran za upotrebu na istom pacijentu; postupci upotrebe pacijentove sopstvene krvi se nazivaju „autologi" ili „autogeni" donorski postupci. Kada je krv donirana od strane ljudi, ali ne istog ljudskog bića koje se tretira, naziva se „homologa". Homologi izvori PRP mogu biti biološki ili imunološki inkompatibilni sa pacijentom i mogu da podrazumevaju potencijalni rizik od kontaminacije sa hepatitis i HIV zagađivačima. Autologa PRP ima nekoliko bezbednosnih prednosti. Na primer, pošto je PRP generalno nusproizvod iz pacijentove sopstvene krvi, prenos bolesti ili imunološke reakcije nisu problem. Ipak, pacijenti sa kompleksnim sistemskim bolestima mogu da utiču na koncentraciju faktora rasta u njihovoj krvi i bilo kojim drugim preparatima izvedenim iz krvi, pa prema tome neće biti benefita iz prednosti ovog tipa tretmana. Štaviše, određeni tretmani zahtevaju kompozicije trombocita koje moraju biti pripremljene na dnevnoj osnovi i tako zahtevaju redovno vađenje krvi iz pacijenta.

U svetlu gore navedenog, „heterologi" izvori PRP (od stranih vrsta) mogu biti od interesa pošto oni mogu da obezbede pouzdan, u velikoj meri dostupan i izvor sirovog materijala koji se do krajnih granica može rep rod u kovati. Na primer, za svinjsku krv postoji manja verovatnoća da nosi rizik od humane viralne infekcije (HIV, hepatitis, itd.), proizvodnja faktora rasta je gotovo 100% identična sa njihovim humanim duplikatima i izvor je efikasne i konstantne koncentracije faktora rasta. Dodatno tome, u mnogim zemljama, krv od klanja se odbacuje kao otpadni materijal zbog manjka mogućnosti korišćenja krvi.

Tako bi bilo krajnje poželjno da se dobije kompozicija koja sadrži PRP bez potrebe pacijentove sopstvene krvi i iz dostupnijeg, pristupačnijeg i ekonomski prihvatljivog izvora kao što je svinjska krv.

Štaviše, upotreba autologe PRP za tretiranje pacijenata pod uticajem degeneracije kolena sa PRP sa unutar zglobnim ubrizgavanjima je opisana od strane G. Filardo et

al., Knee Surg. Sports Traumatol. Arthosc. 19(4), 528-35 (2011). Osteoartritis je bolest zglobova sa visokom incidencom i rasprostranjenošću u populaciji. Glavni simptom je bol, koji izaziva gubitak sposobnosti i često ukočenost. Nema leka i palijativni tretmani kao što su davanje analgetika i anti-inflamatornih sredstava se uglavnom koriste da se tretiraju simptomi. Naravno, neprekidno oslobađanje faktora rasta koji se nalaze u PRP ima preventivna dejstva protiv progresije osteoartritisa. Tretman sa PRP ubrizgavanjima može da smanji bol i poboljša funkciju kolena i kvalitet života sa kratkotrajnom efikasnošću. Do ovih preventivnih dejstava izgleda da dolazi zbog stimulacije matabolizma matrice hrskavice, izazvane faktorima rasta koji se nalaze u PRP (Salto et al., Clin. Exp. Rheumatol. 27(2), 201-7 (2009)).

VVO2009/016451 otkriva postupak za tretman bolesti zgloba ili bola u zglobu, koji se sastoji od infiltracije u zglob jedinjenja koje sadrži bar jednu autologu iz krvi izvedenu supstancu.

Kao što je u gornjem tekstu objašnjeno, za faktore rasta se zna da su korisni za promovisanje zarastanja rana i popravke tkiva. Za dodavanje egzogenih faktora rasta rani je pokazano da povećava brzinu kojom se rana zatvara, broj ćelija u oblasti zarastanja, rast krvnih sudova u jačinu ožiljka (Čarter et al., Biolog, and Clinical Implications 303 (1988)).

Formula za zarastanje rane izvedena iz trombocita u obliku melema ili masti za lokalnu primenu je opisana od strane Knighton et al., Ann. Surg. 204, 322-330

(1986).

Kao što je otkriveno u gore pomenutom stanju tehnike, najveći broj bioloških sredstava, kao što su peptidi i proteinski lekovi, se trenutno koriste za parenteralne formulacije zbog njihove slabe oralne biodostupnosti. Glavni razlozi za nisku biodostupnost bioloških sredstava su njihove nepovoljne fizičko-hemijske osobine, što uključuje enzimsku degradaciju, slabu propustljivost membrane creva i veliku molekularnu veličinu (R.l. Mahato et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 20, 153-214 (2003) i J.H. Hamman et al., BioDrugs 19, 165-177 (2005)). Plazma obogaćena trombocitima (PRPI sadrži visoke nivoe bioloških entiteta, kao što su trombociti i faktori rasta. Pronalazači sadašnjeg pronalaska su iznenađujuće pronašli da se faktor rasta TGF-p 1 ne degradira pod želudačnim i gastrointestinalnim uslovima i shodno tome se na TGF-p1 nivoe ne utiče varenjem. Rezultat je potpuno neočekivan, posebno u pogledu slabe oralne biodostupnosti prikazane od strane bioloških sredstava.

Opis pronalaska

Pronalazači su iznenađujuće pronašli da farmaceutske kompozicije koje sadrže plazmu obogaćenu trombocitima mogu biti formulisane za oraino davanje i da su korisne u tretmanu nekoliko tipova bolesti ili povrede tkiva.

Tako, sadašnji pronalazak se odnosi na oralno datu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima (PRP). Ova farmaceutska kompozicija sadrži heterologu PRP koja se daje oralno i efektivna je u tretmanu ili prevenciji bola povezanog sa bolestima, poremećajima i povredama zgloba i tetive.

lako nije obuhvaćeno zahtevima, takođe je otkrivena farmaceutska kompozicija koja sadrži heterologu PRP koja može biti data oralno i efektivna je u tretmanu ili prevenciji bola povezanog sa bolestima, poremećajima i povredama vezivnog tkiva.

Takođe je otkrivena kozmetička kompozicija i nutriciona kompozicija ili nutricioni suplement za oralno davanje koji sadrže plazmu obogaćenu trombocitima.

Farmaceutska kompozicija za oralno davanje sadašnjeg pronalaska sadrži plazmu obogaćenu trombocitima iz heterologog izvora. Pretpostavljeno, navedena plazma obogaćena trombocitima je iz cele krvi životinja. Poželjnije, cela krv koja se koristi je od stoke ili svinja.

U sledećoj realizaciji, farmaceutska kompozicija pronalaska dalje sadrži faktore rasta. Pretpostavljeno, navedena farmaceutska kompozicija sadrži faktore rasta odabrane od grupe koja sadrži transformišući faktor rasta (TGF), fibroblast faktor rasta (FGF), iz trombocita izveden faktor rasta (PDGF), epidermalni faktor rasta (EGF), vaskularno endoteiijalni faktor rasta (VEGF), insulinu sličan faktor rasta (IGF), iz trombocita izvedeni endoteiijalni faktor rasta (PDEGF), iz trombocita izveden faktor angiogeneze (PDAF), trombocit faktor 4 (PF-4) i hepatocit faktor rasta (HGF) i njihove smeše.

Za oralno davanje, farmaceutska kompozicija koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima prema pronalasku može biti inkorporisana u formulaciju koja može da uključi jedan ili više agensa, nosača i inertnih punilaca kao što su inertni razređivači, sredstva za dezintegrisanje, vezivna sredstva, sredstva za podmazivanje (lubrikanti), zaslađivači, sredstva za davanje ukusa, sredstva za davanje boje i konzervansi da bi se obebedili ukusni preparati. Formulacija može biti oralno isporučena u obliku zatvorenih želatinskih kapsula ili kompresovanih tableta. Kapsule i tablete mogu biti pripremljene bilo kojom konvencionalnom tehnikom. Tablete mogu da sadrže farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku u smeši sa netoksičnim prihvatljivim inertnim puniocima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Ovi inertni punioci mogu biti, na primer, inertni razređivači, kao što je kalcijum karbonat, natrijum karbonat, laktoza, kalcijum fosfat ili natrijum fosfat; sredstva za granuliranje ili dezintegraciju, na primer, kukuruzni škrob, natrijum karboksimetilceluloza, krospovidon, natrijum škrob glikolat ili alginska kiselina; lubrikanti (npr., magnezijum stearat, silicijum dioksid), i vezivna sredstva, na primer magnezijum stearat, stearinska kiselina, laktoza monohidrat, mikrokristalna celuloza ili talk. Kapsule i tablete mogu biti obložene različitim oblogama poznatim u nauci kako bi se modifikovale arome, ukusi, boje i oblici kapusla i tableta. Kapsule i tablete mogu takođe biti obložene poznatim tehnikama radi odlaganja dezintegracije i adsorbcije u gastrointestinalnom traktu, čime se obezbeđuje odloženo dejstvo tokom dužeg vremenskog perioda. Na primer, može biti upotrebljen materijal za vremensko odlaganje kao što je glicerin monostearat ili glicerin distearat. Formulacije za oralnu upotrebu mogu takođe biti date kao tvrde želatinske kapsule pri čemu je farmaceutska kompozicija smešana sa inertnim čvrstim razređivačem, na primer, kalcijum karbonatom, kalcijum fosfatom ili kaolinom, ili kao meke želatinske kapsule pri čemu je farmaceutska kompozicija smešana sa vodom ili uljanim medijumom, na primer arahisovim uljem, tečnim parafinom ili maslinovim uljem. Pogodne oralne formulacije mogu takođe biti u obliku suspenzije, sirupa, gume za žvakanje, oblande, eliksira i slično. Ukoliko se to želi, konvencionalni agensi za modifikovanje aroma, ukusa, boja i oblika specijalne forme mogu takođe biti uključeni. Dodatno tome, radi pogodnog davanja putem cevi za enteralno hranjenje kod pacijenta koji ne mogu da gutaju, farmaceutska kompozicija može biti rastvorena u prihvatljivom nosaču lipofiličnog biljnog ulja kao što su maslinovo ulje, kukuruzno ulje i suncokretovo ulje.

Farmaceutska kompozicija koja sadrži PRP za oralnu upotrebu može takođe biti vodena suspenzija koja sadrži navedenu farmaceutsku kompoziciju u smeši sa inertnim puniocima pogodnim za proizvodnju vodenih suspenzija. Takvi inertni punioci su sredstva za suspendovanje, na primer natrijum karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidroksipropil metilceluloza, natrijum alginat, polivinilpirolidon, tragant guma, guma arabika; sredstva za dispergovanje ili vlaženje može biti prirodno nastali fosfatid, na primer, lecitin, ili proizvodi kondenzacije. Vodene suspenzije mogu takođe da sadrže jedan ili više prezervativa, na primer, etil, ili n-propil p-hidroksibenzoat, jedno ili više sredstava za davanje boje, jedno ili više sredstava za davanje arome, i jedno ili više sredstava za zaslađivanje, kao što su saharoza, fruktoza ili saharin.

Praškovi i granule koji se mogu dispergovati za pripremanje vodene suspenzije dodavanjem vode obezbeđuju farmaceutsku kompoziciju sadašnjeg pronalaska u smeši sa sredstvom za dispergovanje ili vlaženje, sredstvom za suspendovanje i sa jednim ili više prezervativa. Odgovarajuća sredstva za dispergovanje ili vlaženje i sredstva za suspendovanje su data primerima koji su već pomenuti u gornjem tekstu. Dodatni inertni punioci, na primer, sredstva za zaslađivanje, davanja arome i boje, mogu takođe biti prisutni.

U skladu sa tim, u sledećoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, farmaceutska kompozicija koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima koja je ovde opisana je u čvrstom oralnom obliku doze. Pretpostavljeno, navedena farmaceutska kompozicija je u obliku tablete, kapsule ili suvog praška koji može biti suspendovan i rekonstituisan u vodi.

U skladu sa pronalaskom, farmaceutska kompozicija za oralno davanje koja sadrži PRP kako je opisan ovde u gornjem tekstu, može biti upotrebljena u tretmanu ili prevenciji bola povezanog sa bolestima, poremećajima ili povredama zglobova ili tetiva. Primeri takvih bolesti, poremećaja ili povreda zgloba ili tetiva uključuju, bez ograničavanja, povređene tetive, artritis, osteohondrične lezije, osteoartritis, tendonitis, tenosinovitis, bursitis i povrede ligamenata. Pretpostavljeno, oralno data farmaceutska kompozicija za upotrebu u tretmanu ili prevenciji bola povezanog sa bolestima, poremećajima ili povredama zglobova ili tetiva sadrži heterologu plazmu obogaćenu trombocitima.

U skladu sa tim, u jednoj pretpostavljenoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje oralno datu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima za upotrebu u tretmanu ili prevenciji bola povezanog sa osteoartritisom. Pretpostavljeno, navedena farmaceutska kompozicija sadrži heterologu plazmu obogaćenu trombocitima. Još poželjnije, plazma obogaćena trombocitima je svinjskog porekla.

U sledećoj realizaciji, farmaceutska kompozicija prema pronalasku se daje oralno u rasponu doze od 0,2 g do 5 g na dan.

U sledećoj realizaciji, farmaceutska kompozicija prema pronalasku može biti data oralno jedanput ili više puta na dan tokom godinu dana ili duže.

U sledećoj realizaciji, sadašnji pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju za oralno davanje koja sadrži između 1 i 25 masenih % PRP u odnosu na ukupnu težinu kompozicije. Pretpostavljeno, navedena farmaceutska kompozicija sadrži između 1 i 25 masenih % heterologe PRP u odnosu na ukupnu težinu kompozicije.

U sledećoj realizaciji, farmaceutska kompozicija za oralno davanje kako je ovde opisana, dalje sadrži između 1 i 25 masenih % punioca i između 50 i 98 masenih % bar jednog inertnog punioca ili nosača odabranog od grupe koja se sastoji od vezivnih sredstava, punilaca, razređivača, sredstava koja formiraju film, lubrikanata, glidanata, sredstava za dezintegraciju, prezervativa, stabilizatora, antioksidanata, obloga, sredstava protiv spajanja, aroma, zaslađivača, boja i njihovih smeša. Primeri takvih punilaca uključuju bez ograničenja, manit, sorbit, fruktozu, glukozu, manozu, sorbozu, ksilozu, maltozu, laktozu, saharozu, dekstran, inozitol, dulcitol, ksilitol, arabitol, trehalozu, arginin, glicin, histidin, dekstran i polietilen glikol. Bez ograničenja, inertni punilac ili nosač može biti jedan ili više od sledećih jedinjenja: mikrokristalna celuloza, trikalcijum fosfat, laktoza monohidrat, hidroksipropilceluloza, natrijum kroskarameloza, natrijum škrob, koloidna silika, Aerosil 200, magnezijum stearat, fruktoza, aroma ananasa, natrijum askorbat i njihove smeše.

Farmaceutska kompozicija koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima sadašnjeg pronalaska može biti upotrebljena zajedno sa drugim poznatim terapijama, jedinjenjima ili formulacijama. Na primer, navedena farmaceutska kompozicija može biti oralno data u kombinaciji sa jednim ili više sredstava odabranih od antiinflamatornih sredstava, antireumatika, steroida, hondrogenih stimulišućih faktora, monosaharida, oligosaharida i polisaharida (npr. glukozamin), glikozaminoglikana (npr. hijaluronska kiselina i hondroitin sulfat), proteina (npr. hidrolizovani kolagen), esencijalnih masnih kiselina i antioksidanata odvojeno ili u jednoj formulaciji.

Farmaceutska kompozicija koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima za oralno davanje sadašnjeg pronalaska može biti za humanu ili veterinarsku primenu. Za veterinarsku primenu, farmaceutska kompozicija kako je ovde opisana se daje oralno kao odgovarajuća pogodna formulacija za veterinarsku primenu.

U sledećem aspektu, nutriciona kompozicija ili nutricioni suplement za oralno davanje sadrži plazmu obogaćenu trombocitima. Pretpostavljeno, nutriciona kompozicija ili nutricioni suplement koji se oralno daju sadrže heterologu PRP. Još poželjnije, nutriciona kompozicija ili nutricioni suplement koji sadrže plazmu obogaćenu trombocitima za oralno davanje sadrže plazmu obogaćenu trombocitima svinjskog porekla.

Nutriciona kompozicija ili nutricioni suplement koji sadrži PRP kako je ovde opisano, dalje sadrže faktore rasta. Pretpostavljeno, navedena nutriciona kompozicija ili nutricioni suplement sadrže faktore rasta odabrane od grupe koja se sastoji od transformišućih faktora rasta (TGF), fibroblast faktora rasta (FGF), iz trombocita izvedenih faktora rasta (PDGF), epidermalnih faktora rasta (EGF), vaskularno endotelijalnih faktora rasta (VEGF), insulinu sličnih faktora rasta (IGF), iz trombocita izvedenih endotelijalnih faktora rasta (PDEGF), iz trombocita izvedenih faktora angiogeneze (PDAF), trombocit faktora 4 (PF-4), hepatocit faktora rasta (HGF) i njihovih smeša.

Oralno data nutriciona kompozicija ili nutricioni suplement koji sadrži PRP kako je ovde opisano, dalje se sastoji od jednog ili više prihvatljivih aditiva ili nosača.

Postupak pripremanja farmaceutske kompozicije koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima se sastoji od: a) centrifugiranja cele krvi svinje da se pripremi talog plazme obogaćene trombocitima,

b) dodavanja punioca taloga iz koraka a), i

c) liofilisanja rastvora taloga iz koraka b).

Gore opisane realizacije se u svakom pogledu smatraju ilustrativnim bez

ograničavanja, a obim pronalaska je naznačen u zahtevima koji slede pre nego u prethodnom opisu.

Kratak opis slika

U svrhu boljeg ilustrovanja prednosti i osobina kompozicije koja je predmet pronalaska, nekoliko grafikona i slika je prikačeno kao neograničavajući primeri: Slika 1 prikazuje srednje VAS rezultate pri vizitama 1, 2 i 3, koje korespondiraju sa danima 0, 15 i 30, svaka posebno. (Ograde od greške, 95% Cl,<**>p<0,05).

Slika 2 prikazuje srednje VVOMAC TOTAL rezultate pri vizitama 1, 2 i 3, koje korespondiraju sa danima 0, 15 i 30, svaka posebno. (Ograde od greške, 95% Cl,

<**>p<0,05).

Slika 3 prikazuje srednje VVOMAC BOL rezultate pri vizitama 1, 2 i 3, koje korespondiraju sa danima 0, 15 i 30, svaka posebno. (Ograde od greške, 95% Cl,

<**>p<0,05).

Slika 4 prikazuje srednje VVOMAC UKOČENOST rezultate rezultate pri vizitama 1, 2 i 3, koje korespondiraju sa danima 0, 15 i 30, svaka posebno. (Ograde od greške, 95% Cl).

Slika 5 prikazuje srednje VVOMAC FUNKCIONALNA NESPOSOBNOST rezultate pri vizitama 1, 2 i 3, koje korespondiraju sa danima 0, 15 i 30, svaka posebno.

(Ograde od greške, 95% Cl,<**>p<0,05).

Slika 6 prikazuje procenu subjektivne efikasnosti prema mišljenju doktora pri vizitama 2 i 3 koje korespondiraju sa danima 15 i 30, svaka posebno.

Slika 7 prikazuje procenu subjektivne efikasnosti prema mišljenju pacijenta. Posete 2 i 3 korespondiraju sa danima 15 i 30, svaka posebno.

Detaljno objašnjenje pronalaska

Heterologi izvori plazme obogaćene trombocitima mogu biti od bilo koje životinjske vrste od koje je moguće dobiti neophodnu količinu krvi, ali najpoželjnije je od svinje. Životinje namenjene sadašnjem pronalasku mogu u osnovi biti sve životinje, kako mlade tako i odrasle. Pretpostavljeno se koristi krv ekstrakovana nakon klanja, i krv uglavnom dolazi od odraslih životinja. Primeri životinja koje su pogodne za upotrebu u sadašnjem pronalasku su zaklane životinje i druge domaće životinje kao što su stoka, svinje, ovce i koze. Pretpostavljeno se koristi celokupna krv stoke ili svinja.

Poreklo krvi od svinje, u skladu sa sadašnjim pronalaskom, garantuje: 1) totalno odsustvo potencijalne transmisije humanih viralnih agenasa (Hepatitis, HIV, itd.), 2) proizvodnju faktora rasta blizu 100% identičnih sa njihovim humanim odgovarajućim duplikatima i, 3) pouzdan, uveliko dostupan i krajnje izvodljiv izvor sirovog materijala.

Postupci pripremanja plazme obogaćene trombocitima su već opisani u mnogim izveštajima. Plazma obogaćena trombocitima, pretpostavljeno svinjskog porekla, se priprema centrifugiranjem malom brzinom da bi se formirao pelet i uklonila crvena krvna zrnca i bela krvna zrnca iz celokupne krvi. Izolovani talog plazme obogaćene trombocitima se rastvori u puniocu (n.pr., manit) i onda se podvrgava postupku liofilizacije. Aktivacija faktora rasta može da se pojavi na različite načine, tipično, putem različitih supstanci za koje je poznato da su aktivatori. Poznato je da je TGF-p1 prisutan u granulama trombocita i da se oslobađa nakon aktivacije trombocita sa CaCb- Nasuprot tome, u sadašnjem pronalasku nisu potrebni aktivatori pošto liofilizacija PRP izaziva mehanički stres koji razbija i oslobađa faktore rasta trombocita.

Kompozicije sadašnjeg pronalaska rezultiraju u poboljšanoj kompoziciji plazme obogaćene trombocitima koja sadrži faktore rasta. Posebno, nivoi TGF-p (posebno pi izoforme) se procenjuju zbog toga što TGF-p promoviše proizvodnju ekstracelularne matrice da se pojača pro I iterativna aktivnost fibroblasta, da se stimuliše biosinteza kolagena Tip I i fibronektina i da se izazove deponovanje matrice kosti. Sa druge strane, faktori rasta mogu da inhibiraju formiranje osteoklasta i resorpciju kosti tako favorizujući formiranje kosti u odnosu na resorpciju.

Kako je dato detaljno u donjoj Tabeli 2, rezultati pokazuju da TGF-pi nivoi u liofilisanju PRP rezultiraju u 4,1-puta povećanju upoređeno sa PRP osnovnom vrednošću (neaktivirano). Štaviše, nisu primećene razlike kada se TGF-p 1 nivoi iz liofilisane PRP (neaktivirano) uporede sa TGF-p1 nivoima iz PRP aktivirane sa CaCI2.

Kao što je u gornjem tekstu objašnjeno, oralno davanje tekova je daleko najčešći put davanja. Za razliku od konvencionalnih malih molekularnih lekova, oralna isporuka bioloških lekova kao što su peptidi, proteini ili makromolekularni lekovi, generalno nije izvodljiva bez iste vrste sofisticirane farmaceutske tehnologije. Glavni razlog za nisku oralnu biodostupnost je presistemska enzimska degradacija i slaba penetracija intestinalne membrane.

Pronalazači su iznenađujuće pronašli da kompozicija koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima sadašnjeg pronalaska zadržava svoje funkcionalne osobine kada se daje oralno.

Da bi se procenila gastrointestinalna stabilnost kompozicije koja sadrži PRP prema pronalasku, TGF-p1 nivoi se mere pod gastrointestinalnim i želudačnim uslovima (videti Tabelu 1).

PRP uzorci se inkubiraju pod želudačnim i gastrointestinalnim uslovima kako je prethodno opisano od strane E. Pena et al., J. Agric. Food Cehm., 52(15), (2004). Da se proceni želudačna stabilnost, liofilisana PRP (151 mg/mL) se inkubira pri pH=2,0 sa svinjskim pepsinom (PEP; Sigma Aldrich P-7000, EC 3.4.23.1 pri finalnoj koncentraciji od 3,8 U/mL) tokom 50 minuta na 37°C. Uzorci se dalje neutrališu upotrebom NaHC03i inkubiraju pod intestinalnim uslovima upotrebom pankreatina (PAN; Sigma-Aldrich P-1750 pri finalnoj koncentraciji od 9,3 ug/mL) tokom 30 minuta na 37°C da se proceni gastrointestinalna stabilnost.

U svim slučajevima, enzimski tretmani se zaustavljaju postavljanjem svarenih proizvoda u ledeno kupatilo da se ohlade.

Kontrolni uzorci (bez enzimskog tretmana) se ispituju (kontrola za želudačnu stabilnost: PRP pri pH = 2, tokom 50 minuta i kontrola za gastrointestinalnu stabilnost: PRP pri pH = 2,0 (50 min) + pH 7 0 min) (Tabela 1).

Uzorci se centrifugiraju pri 10000 xg tokom 30 minuta na 4°C da se dobije TGF-il rastvorljiva frakcija. TGF-p 1 se analizira EUSA-om praćenjem proizvođačkih instrukcija (Ouantikine Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-p1; R&D Systems). Tabela 1 prikazuje TGF-p 1 nivoe u kontrolnim uzorcima (liofilisana PRP bez enzimskog tretmana) i u uzorcima pod želudačnim uslovima (PEP) i gastrointestinalnim uslovima (PEP + PAN).

Iznenađujuće, rezultati pokazuju da su TGF-pi nivoi u liofilisanoj PRP prema ovom pronalasku uporedivi i da na njih ne utiče pH ili enzimski tretman. Ova zapažanja sugerišu da je TGF-pi prisutan u liofilisanoj PRP stabilan nakon gastrointestinalnog tretmana.

Osim kompozicije, pronalazak takođe upućuje na upotrebu bilo koje farmaceutske kompozicije koja sadrži PRP prema ovom pronalasku za tretman ili prevenciju bola povezanog sa bolestima, poremećajem ili povredom zglobova ili tetiva, posebno u tretmanu bola povezanog sa osteoartritisom. Iznenađujuće, pronalazači su otkrili da je oralno davanje farmaceutske kompozicije prema pronalasku tokom 30 dana efektivno u smanjenju bola u kolenu pacijenata sa osteoartritisom. Poboljšanje u srednjoj vrednosti VAS i VVOMAC rezultata je primećeno kroz celu studiju. Naveći broj promenljivih su značajno različite u odnosu na osnovne rezultate na kraju studije. Ovi rezultati su potvrđeni subjektivnom procenom kako doktora tako i pacijenta, koji smatraju tretman efektivnim kroz proces evaluacije. Tretman se vrlo dobro toleriše i nisu primećeni škodljivi događaji.

Pojmovi „oralno davanje", „oralno dati" ili „oralna isporuka" kako se ovde koriste, uključuju bilo koji oblik isporuke farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom subjektu ili životinji, pri čemu se kompozicija postavlja u usta subjekta ili životinje, bilo da kompozicija jeste ili nije progutana. Tako „oralno davanje" uključuje bukalno (u usnu šupljinu) i podjezično kao i davanje u jednjak.

Svi procenti kako se ovde koriste a odnose se na navedene komponente kompozicija u skladu sa pronalaskom su u masenim procentima, izračunati na osnovu ukupne težine navedene kompozicije osim ukoliko nije drugačije specifikovano.

Sledeći primeri koji su dati dalje ilustruju farmaceutsku kompoziciju prema sadašnjem pronalasku i druge kompozicije koje sadrže PRP. Primeri koji su u donjem tekstu dati su ilustrativni i njima se nema namera da se ograniči obim pronalaska za koji se traži zaštita.

Primer 1. Pripremanje plazme obogaćene trombocitima ( PRP)

a) Sakupljanje krvi

Koristi se u eksperimentalne svrhe 24 velikih belih svinja namenjenih potrošnji od

strane ljudi. Ukupno 1968,20 ± 322,66 ml svinjske krvi se sakupi smrtnim krvarenjem iz vratne vene. Krv se skladišti u sterilne kontejnere i meša se sa dekstroza-citratom u razmeri 1:9 v/v (1 dekstroza citrat: 9 krv). Uzorci se čuvaju na 4°C do daljeg obavljanja postupka.

b) Izračunavanje vrednosti trombocita

Analiza izračunavanja vrednosti trombocita iz krvi i plazme se obavlja upotrebom

ABX Pentra DX 120 SPS (HORIBA Medical). Podaci pokazuju ukupno 4,18 ± 1,54 x 10<11>trombocita/svinja (raspon: 2,04 - 8,04 x 10<11>) u krvi i 1,51 ± 0,87 x 1011trombocita/svinja (raspon: 0,48 -3,35 x 10<11>) u plazmi (ponovno dobijanje: 36,12%).

c) Postupak dobijanja PRP

Sakupljena sterilna svinjska krv se centrifugira na 780 g tokom 10 minuta na sobnoj

temperaturi da se uklone crvena krvna zrnca i limfociti. Talog (776,96 ± 184,15 mL PRP/svinja) se sakupi i manit se doda kao punilac pri finalnoj koncentraciji od 8 %

(w/v). Rastvor se meša 15-30 minuta pre liofilizacije.

d) Liofilizacija svinjske plazme

Količina od 4700 mL svinjske plazme sa manitom se upotrebljava u svakom od

postupaka liofilizacije. Ovaj postupak se obavlja upotrebom TELSTAR L-3 modela. Svinjska plazma se zamrzne na -56°C. Postupak sublimacije se obavlja na 30-32°C a onda se proizvod osuši na 26-32°C. Ukupni čvrsti sadržaj dobijen nakon liofilizacije (50% plazme obogaćene trombocitima i 50% manita) iznosi 3050,23g; od čega 70,48% protein, 18,81% uljeni hidrati, 0,05% masne kiseline, 5,80% vlaga i 4,86% pepeo.

g) Merenje faktora rasta

Da bi se kvantifikovali TGF-131 nivoi liofilisane PRP, uzorci se rekonstituišu sa

Dulbecco-ovim modifikovanim fosfatnim puferom (PBS) bez kalcijuma i magnezijuma (92 mg PRP/mL PBS-a) i onda centrifugiraju na 10000 g tokom 10 minuta da se uklone ćelijske krhotine. Talog se čuva na -80°C do dalje analize. TGF-p1 se analizira ELISA-om praćenjem proizvođačkih instrukcija (Ouantikine Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-p1; R&D Svstems). U svrhe upoređenja dobijena PRP pre liofilizacije se aktivira mešanjem 1 mL PRP sa 50 uL 10% CaCI2. Nakon što se PRP pretvori u gel, uzorci se centrifugiraju na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta na 4000 g i talog se sakupi. Frakcija sa CaC^ aktiviranog taloga se upotrebljava da se kvantifikuje TGF-pi.

TGF-p 1 nivoi u liofilisanoj PRP se upoređuju sa onima dobijenim iz osnovne PRP (neaktivirane) i sa CaCI2aktiviranom PRP (Tabela 2).

Mehanički pritisak tokom postupka liofilizacije izaziva aktiviranje i oslobađanje faktora rasta, pa samim tim dodavanje aktivatora kao što je CaCb nije neophodno da se oslobode faktori rasta.

Primer 2. Oralna kompozicija

Dobijena PRP se formuliše prema sledećem sastavu da se dobije prašak koji se ima koristiti kao čvrsta formulacija koja može biti suspendovana u vodi.

Primer 3. Oralna kompozicija kao tableta

Liofilisana PRP dobijena kako je opisano u primeru 1 se formuliše prema sledećem sastavu da se dobije tableta.

Primer 4. Kapsule

PRP dobijena kako je opisano u primeru 1 se formuliše prema sledećem sastavu da se dobije kapsula.

Primer 5. Procena tretmana

Kompozicija opisana u Primeru 2 se daje oralno kod 8 pacijenata sa klasom ll-lll (ACR rezultat) osteoartritisom kolena. Pacijentima se daje jedna doza dnevno tokom mesec dana. Klinički rezultati u vezi sa funkcijom zgloba i bolom se mere upotrebom VAS i VVOMAC skala. Dodatno tome, analizira se subjektivno mišljenje u pogledu efikasnosti i tolerancije od strane doktora i pacijenta. Svi klinički rezultati se mere na dan 0, 15 i 30.

Opisna statistika, srednje, standardno odstupanje, i 95% interval poverenja, se izračunavaju za sve kvantitativne promenljive. Kvantitativne promenljive se analiziraju putem tabela nepredvidljivih slučaja i grafikona.

Razlike između grupa se analiziraju sa ANOVA radi ponovljenih merenja sa Bonferroni korekcijom uzimajući prvu vizitu kao kontrolu za VAS i VVOMAC skale.

Statistički značajno smanjenje u rezultatu VAS bola je primećeno od vizite 2 (dan 15) pa nadalje (Slika 1). Slično tome, ukupan VVOMAC indeks (Slika 2), koji je u vezi sa pogoršanjem kvaliteta života usled osteoartritisa, je značajno smanjen od vizite 2 (dan 15) pa nadalje.

Studija individualnih komponenti VVOMAC skale (bol, krutost i funkcija) otkriva smanjenje u rezultatima za bol (Slika 3), krutost (Slika 4) i funkcionalnu nesposobnost (Slika 5), koji su značajno različiti od osnovnih rezultata od vizite 3, vizite 2 i vizite 3 pa nadalje za svaku posebno.

Subjektivna efikasnost prema doktoru je blago efektivna prema mišljenju 62,5% doktora a dobra je ili blago efektivna prema 75% pacijenata tokom vizite 2 (dan 15). Nakon 30 dana, 100% doktora smatralo je tretman dobrim ili blago efektivnim a 66,7% pacijenata je smatralo tretman dobrim ili idealnim (Tabela 3 i 4, Slike 6 i 7).

U proceni tolerantnosti kroz studiju, 100% doktora i pacijenata smatralo je tolerantnost odličnom. Nisu zabeleženi škodljivi događaji (Tabela 5 i 6).

Claims

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži plazmu obogaćenu trombocitima (PRP),naznačena time,što je dobijena iz heterologog izvora za upotrebu u tretmanu ili prevenciji bola povezanog sa bolestima, poremećajima ili povredama zglobova ili tetiva pri čemu se kompozicija ima dati oralno.

2. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 1,naznačena time,što je bolest, poremećaj ili povreda osteoartritis.

3. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 2,naznačena time,što je plazma obogaćena trombocitima svinjskog porekla.

4. Farmaceutska kompozicja prema bilo kom od prethodnih zahteva,naznačena time,što navedena kompozicija dalje sadrži faktore rasta a faktori rasta su odabrani od grupe koja sadrži transformišući faktor rasta (TGF), fibroblast faktor rasta (FGF), iz trombocita izveden faktor rasta (PDGF), epidermalni faktor rasta (EGF), vaskularno endoteiijalni faktor rasta (VEGF), insulinu sličan faktor rasta (IGF), iz trombocita izvedeni endoteiijalni faktor rasta (PDEGF), iz trombocita izveden faktor angiogeneze (PDAF), trombocit faktor 4 (PF-4) i hepatocit faktor rasta (HGF) i njihove smeše.

5. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4,naznačena time,što navedena kompozicija sadrži: a) između 1 i 25 masenih % plazme obogaćene trombocitima (PRP), b) između 1 i 25 masenih % punioca, i c) između 50 i 98 masenih % bar jednog inertnog punioca ili nosača odabranog od grupe koja se sastoji od vezivnih sredstava, punilaca, razređivača, sredstava koja formiraju film, lubrikanata, glidanata, sredstava za dezintegraciju, prezervativa, stabilizatora, antioksidanata, obloga, d) sredstava koja sprečavaju spajanje, aroma, zaslađivača, boja i njihovih smeša.

6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 5,naznačena time,što je navedena kompozicija u obliku granula, tablete, suspenzije u tečnom nosaču, kapsule ili praška.