RS54846B1

RS54846B1 - Novo anti-dr5 antitelo

Info

Publication number: RS54846B1
Application number: RS20160449A
Authority: RS
Inventors: Toshiaki Ohtsuka; Takeshi Takizawa; Akiko Oguni; Tatsuji Matsuoka; Hiroko Yoshida; Yumi Matsui
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2016-10-31
Also published as: US20160068603A1; MY158499A; SI2636736T1; US9127070B2; JP6124377B2; KR101814852B1; RU2644678C1; AU2016203575A1; CN103282495B; EP3020812B1; JP5918143B2; NZ610153A; KR20140027050A; NZ623347A; JPWO2012057288A1; CN107188963A; TWI507417B; SMT201600193B; TW201305216A; AU2016203575B2

Abstract

Antitelo sposobno za vezivanje za DR5, naznačeno time da:Sekvenca teškog lanca sadrži varijabilni region sa CDRH1, CDRH2 i CDRH3, i CDRH1 sadrži sekvencu aminokiseline koja je predstavljena pomoću sekvence identifikacionog broja: 82, CDRH2 sadrži jednu od dve sekvence aminokiselina predstavljene pomoću sekvenci identifikacionih brojeva: 89 i 83, i CDRH3 sadrži sekvencu aminokiseline predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 84; iSekvenca lakog lanca sadrži varijabilni region sa CDRL1, CDRL2 i CDRL3, i CDRL1 sadrži bilo koju od sekvenca aminokiselina predstavljenih pomoću sekvence identifikacionih brojeva: 87, 85, 86, 88 i 79, CDRL2 obuhvata sekvencu aminokiseline predstavljenu pomoću sekvence identifikacionog broja: 80, i CDRL3 sadrži sekvencu aminokiseline predstavljenu pomoću sekvence identifikacionog broja: 81, ili funkcionalni fragment antitela koji poseduje aktivnost vezivanja antigena.Prijava sadrži još 22 patentna zahteva.

Description

Opis pronalaska

Tehnička oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitelo koje se vezuje za receptor na površini ćelije koji učestvuje u indukciji apoptoze i koristan je kao terapeutik i/ili preventivni agens za tumore, i takođe se odnosi na metodu za lečenje i/ili prevenciju kancera, autoimunog oboljenja, ili antiinflamatornog oboljenja korišćenjem antitela.

STANJE TEHNIKE

[0002] Apoptoza je pojava koja je veoma bitna za fiziološki proces uklanjanja nepotrebnih ćelija ili oštećenih ćelija i održavanja broja normalnih ćelija in vivo. Zahvaljujući napretku u rasvetljavanju Činjenice daje regulatorni mehanizam apoptoze često inhibiran kod kancera ili imunih oboljenja i takođe rasvetljavanju regulatornog puta u apoptozi, napredovao je razvoj novog izazivača apoptoze koji može biti korišćen u lečenju kancera ili imunih oboljenja. Posebno, antitelo koje ima afinitet za vezivanje za ligand za receptor na površini ćelije koji učestvuje u indukciji apoptoze predstavljeno kao receptor smrti ili antitelo koje poseduje afinitet za vezivanje za pomenuti receptor smrti očekuje se da poseduje terapijski efekat kod ovih oboljenja (videti, na primer, nepatentni dokument 1). Receptor smrti 5 (DR5) koji je jedan od receptora smrti ponekad se takođe naziva KILLER, TRICK 2A, TRAIL-R2, TRICK B, ili CD262, i poznato je mnoštvo antitela - agonista koji indukuju apoptozu u ćelijama (videti, na primer, nepatentni dokument 2 ili 3, ili Patentne dokumente 1 do 6). Neka antitela se trenutno razvijaju u kliničkim studijama kao kandidati za terapijske agense i očekuje se da poseduju terapijski efekat takav da antitela specifično deluju kao agonisti na ćelije (kancer ćelije ili ćelije povezane sa imunološkim oboljenjem) koji eksprimiraju receptor kako bi došlo do smrti ćelija. Kako bi takvo antitelo imalo antitumorsko dejstvo, neophodno je da ćelije eksprimiraju DR5, međutim, otriveno je da ne postoji korelacija između dejstva i nivoa ekspresije DR5 u prekliničkim studijama (Nepatentni dokument 4). Smatra se da je razlog tome stoje ćelijski odgovor regulisan mnogim faktorima kao što je nivo ekspresije molekula unutarćelijske signalizacije (kao što je kaspaza-8 ili Bcl-2) koji učestvuju u putevima apoptoze (Nepatentni dokument 5).

Dokument stanja tehnike

[0003]

[Patentni dokument 1]

WO 98/51793

[Patentni dokument 2]

WO 2001/83560

[Patentni dokument 3]

WO 2002/94880

[Patentni dokument 4]

WO 2003/54216

[Patentni dokument 5]

WO 2006/83971

[Patentni dokument 6]

WO 2007/22157

[Nepatentni dokument1 ]

Ćelija Death and Različitiation, 10: 66-75 (2003)

[Nepatentni dokument 2]

Journal of Immunology, 162: 2597-2605 (1999)

[Nepatentni dokument 3]

Nature Medicine, 7(8): 954-960 (2001)

[Nepatentni dokument 4]

Cell Death and Differentiation, 10: 66-75 (2003)

[Nepatentni dokument 5]

Journal of Clinical Oncoiogv, 26: 3621-3630 (2008)

REZIME PREDMETNOG PRONALASKA

PROBLEMI KOJE PREDMETNI PRONALAZAK RESA VA

[0004]Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi antitelo ili funkcionalni fragment antitela za korišcenje u farmaceutskim preparatima koji imaju terapijski efekat na kancer, i polinukleotid koji kodira antitelo ili funkcionalni fragment antitela.

SREDSTVAZAREŠENJE PROBLEMA

[0005]Pronalazači predmetnog pronalaska su izvršili intenzivna ispitivanja kako bi ostvarili gore pomenuti cilj, i kao rezultat, pronašli su antitelo koje ispoljava potentnu aktivnost izazivanja apoptoze u ćelijama, i time okončali pronalazak. Ovo takođe dovodi do efikasnog terapijskog efekta kod pacijenata kod kojih dovoljan terapijski efekat trenutno dostupnih antitela ne može biti postignut.

[0006] Stoga, predmetni pronalazak uključuje sledeće pronalaske.

(1) Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za DR5, naznačeno time da:

sekvenca teškog lanca sadrži varijabilni region koji poseduje CDRH1, CDRH2, i CDRII3, i CDRH1 sadrži sekvencu aminokiselina koja je predstavljena identifikacionim brojem sekvence (SEQ ID NO): 82, i CDRH2 sadrži bilo koju od sekvenci aminokiselina koje su predstavljene identifikacionim brojevima sekvenci (SEQ ID NOS): 83 i 89, i CDRH3 sadrži sekvencu aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 84; i

sekvenca lakog lanca sadrži varijabilni region koji poseduje CDRIJ, CDRL2, i CDRL3, i CDRL1 sadrži bilo koju od sekvenci aminokiselina koje su predstavljene pomoću SEQ ID NOS: 79, 85, 86, 87, i 88, CDRL2 sadrži sekvencu amino kiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 80, i CDRL3 sadrži sekvencu amino kiselina koja jc predstavljena pomoću SEQ ID NO: 81, ili funkcionalni fragment antitela.

(2) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (1), naznačeno time da sadrži

sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SKQ ID NO: 16.

(3) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (1) ili (2), naznačeno time daje

antitelo himerno antitelo.

(4) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (3), naznačeno time da sadrži

sekvencu teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 20 i sekvencu lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 16.

(5) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (1), naznačeno time da je antitelo

humanizovano.

(6) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (5). naznačeno time da sadrži: (a) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih sekvenci aminokiselina: al) sekvence aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 42;

a2) sekvence aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 70;

a3) sekvence aminokiselina koja ima najmanje 95% homologije sa sekvencom aminokiselina koja je izabrana od al) i a2);

a4) sekvence aminokiselina koja ima najmanje 99% homologije sa sekvencom aminokiselina koja je izabrana od al) i a2); i a5) sekvence aminokiselina uključujući i supstituciju, deleciju, ili adiciju jednog do nekoliko ostataka aminokiselina u bilo kojoj od

sekvenci aminokiselina koja je izabrana od al) i a2); i

(b) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih sekvenci aminokiselina: bi) sekvence aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 28;

b2) sekvence aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 52;

b3) sekvence amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 58;

b4) sekvence aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja jc predstavljena pomoću SEQ ID NO: 62;

b5) sekvence amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 66;

b6) sekvence amino kiselina koja ima najmanje 95% homologije sa bilo kojom od sekvenci aminokiselina koja je izabrana od bi ) do b5);

bi) sekvence amino kiselina koja ima najmanje 99% homologije sa bilo kojom od sekvenci aminokiselina koja jc izabrana od bi) do b5); i b8) sekvence amino kiselina uključujući i supstituciju, deleciju, ili adiciju jednog do nekoliko ostataka aminokiselina u bilo kojoj od

sekvenci aminokiselina koja je izabrana od bi) do b5).

(7) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6), naznačeno time da sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 42 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 28. (8) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6), naznačeno time da sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 70 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 52. (9) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6), naznačeno time da sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 70 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 58. (10) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6), naznačeno time da sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 70 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 62. (11) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6), naznačeno time da sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 70 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 66. (12) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6), naznačeno time da sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 42 i sekvencu lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 sekvence aminokiselina koja jc predstavljena pomoću SEQ ID NO: 28. (13) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6), naznačeno time da sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 70 i sekvencu lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 52. (14) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6), naznačeno time da sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 70 i sekvencu lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 58. (15) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6). naznačeno time da sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 70 i sekvencu lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 62. (16) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (6), naznačeno time da sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 70 i sekvencu lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 66. (17) Funkcionalni fragment antitela prema bilo kom od (1) do (16), koji je izabran iz grupe koja se sastoji od Fab, F(ab')2, Fab' i Fv. (18) Farmaceutska kompozicija naznačena vreme da sadrži najmanje jedno od antitela ili funkcionalnih fragmenata antitela prema (1) do (17). (19) Farmaceutska kompozicija prema (18). naznačena lime da je farmaceutska kompozicija za lečenje i/ili prevenciju kancera. (20) Farmaceutska kompozicija za lečenje i/ili prevenciju kancera, naznačena vreme da sadrži najmanje jedno od antitela ili funkcionalnih fragmenata antitela prema (1) do (17) i najmanje jedan Član koja je izabran iz grupe koja se sastoji od paklitaksela, karboplatine. CPT-11, i vinblastina. (21) Farmaceutska kompozicija prema (19) ili (20), gde je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera pluća, prostate, tiroidne žlezde, želuca, jetre, jajnika, debelog creva, dojke, pankreasa, bubrega, materice, melanoma, fibrosarkoma, glioblastoma, i kancera krvnih ćelija. (22) Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji poseduje aktivnost vezivanja antigena prema bilo kom od (1) do (17) za primenu u lečenju i/ili prevenciji kancera. 19 i nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 15. (28) Polinukleotid prema (26), naznačeno time da sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence koja je predstavl jena sa SEQ ID NO: 19 i nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 15.

(29) Polinukleotid prema (26), naznačeno time da sadrži:

(a) polinukleotid koji je izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih nukleotidnih sekvenci: al) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene sa SEQ ID NO: 41; a2) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene sa SEQ ID NO: 69; a3) nukleotidna sekvenca polinukleotida koji hibridizuje za polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu komplementarnu nukleotidnoj sekvenci koja jc izabrana od al) i a2) pod striktnim uslovima; i a4) nukleotidna sekvenca uključujući supstituciju, đeleciju ili adiciju jednog do nekoliko nukleotida u nukleotidnoj sekvenci koja je izabrana od al) i a2); i (b) polinukleotid koja je izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih nukleotidnih sekvenci: bi) nukleotidne sekvence koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene sa SEQ ID NO: 27;

b2) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 51;

b3) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 57;

b4) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 61;

b5) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 65;

b6) nukleotidna sekvenca polinukleotida koji hibridizuje za polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna bilo kojoj od nukleotidnih sekvenci koje su izabrane od bi) do a5) pod striktnim uslovima; i b7) nukleotidna sekvenca uključujući supstituciju, deleciju ili adiciju jednog do nekoliko nukleotida u bilo kojoj od nukleotidnih sekvenci koje su izabrane

od bi) do b5).

(30) Polinukleotid prema (29), naznačeno time da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 41. i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 27. (31) Polinukleotid prema (29), naznačeno time da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 51. (32) Polinukleotid prema (29), naznačenolime da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ IDNO: 57. (33) Polinukleotid prema (29), naznačeno time da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ IDNO:61. (34) Polinukleotid prema (29), naznačeno time da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ IDNO: 65. (35) Polinukleotid prema (29), naznačeno time da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SJEQ ID NO: 41, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 27. (36) Polinukleotid prema (29), naznačeno time da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 69. i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ IDNO: 51. (37) Polinukleotid prema (29), naznačeno time da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ IDNO: 57. (38) Polinukleotid prema (29), naznačeno time da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 61. (39) Polinukleotid prema (29), naznačeno time da sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence koja je predstavljena sa SEQ IDNO: 65.

(40) Vektor koji sadrži bilo koji od polinukleotida prema (26) do (39).

(41) Transformisana ćelija domaćina koja sadrži bilo koji od polinukleotida prema (26) do (39).

(42) Transformisana ćelija domaćina koja sadrži vektor prema (40).

(43) Metoda za proizvodnju antitela prema bilo kom od (2), (4), i (6) do (16), koja

obuhvata korak gajenja ćelije domaćina prema (41) ili (42) i prečišćavanja antitela iz. dobijenog proizvoda kultivacije.

[0007] Takođe, ovde je stavljeno na uvid javnosti: (44) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela. naznačeno vezivanjem za isti epitop

kao antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 20 i sekvencu lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 16.

(45) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela, naznačeno kompeticijom sa antitelom

koje sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 20 i sekvencu lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 16.

(46) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (44) ili (45), naznačeno time da

je Fab fragment antitela pripremljen papain digestijom, kada je vezivanje rekombinantnog proteina koji je predstavljen pomoću SEQ ID NO: 23, smešteno susedno glicin ostatku na položaju 26. izoleucin ostatku na položaju 34, ostatku glutaminske kiseline na položaju 36, ostatku asparaginske kiseline na položaju 37, glicin ostatku na položaju 38, ostatku asparaginske kiseline 56, leucin ostatku na položaju 57, leucin ostatku na položaju 58, fenilalanin ostatku na položaju 59, leucin ostatku na položaju 61, i arginin ostatku na položaju 62 rckombinatnog proteina koje je predstavljeno sa SEQ ID NO: 23 na rastojanju od 4 A ili manje.

(47) Antitelo ili funkcionalni fragment antitela prema (46), naznačeno time da je

rastojanje između svakog aminokiselinskog ostatka koji čini rekombinantni protein predstavljeno sa SEQ ID NO: 23 i Fab fragment je određen kompleksnom strukturnom analizom korišćenjem podataka dobijenih difrakcijom X-zraka.

Prednost predmetnog pronalaska

[0008]Prema predmetnom pronalasku može biti dobijen terapijski agens za kancer čiji mehanizam dejstva je primarno preko indukcije apoptoze.

KRATAK OPIS SLIKA

[SU]

SU je slika koja prikazuje citocidni efekat B273 antitela miša.

[S1.2]

51.2 je slika koja prikazuje aktivnosti vezivanja cB273 antitela i sTRAIL za DR5 protein sa ekstracelularnim domenom.

[S1.3J

51.3 je slika koja prikazuje aktivnosti vezivanja cB273 antitela za humani DR5 korišćenjem Biacore-a. Na gornjoj strani slike, prikazanje a grafik, kod koga ordinata predstavlja jedinice rezonance (RU), a apsica predstavlja vreme (sek). Na donjoj strani slike, prikazane su Kon, Koff, i KD vrednosti cB273 antitela izračunate korišćenjem analitičkog softvera.

[SU]

51.4 je slika koja prikazuje in vitro citocidni efekat cB273 antitela na ćelijske linije humanog kancera. A) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog kancera ovarijuma, B) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog kancera debelog creva, C) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog kancera pluća, i D) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog kancera dojke.

[SU]

51.5 je slika koja prikazuje in vitro citocidni efekat cB273 antitela na humane kancerske ćelijske linije. A) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog kancera pankreasa, B) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog melanoma, C) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog glioblastoma, i D) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog kancera endometrijuma.

[S1.6]

51.6 jc prikaz strukture DR5-cB273 Fab kompleksa.

[S1.7]

SI.7 je prikaz interakcije između DR5 i H ili L lanca cB273 Fab. A) je prikaz koji ilustruje aminokiselinske ostatke II lanca cB273 Fab koji se nalazi na rastojanju od 4 A ili manje od DR5 i obrnuto kao štapićasti model. Ile34, Glu36, Asp37, Gly38, Asp56, Leu57, Leu58, Phe59, Lcu61, i Arg62 koji su prikazani na levoj strani slike su aminokiselinski ostaci dobijeni od DR5, i odgovarajući broj aminokiselinskog ostatka odgovara onom u sekvenci aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 23 u Listi Sekvenci. Dalje, Phe33, Arg50, Asn52, Tyr54, Asn55, Phe59, Tyrl01, Tyrl02, Phel03, i Aspl04 na desnoj strani slike su aminokiselinski ostaci dobijeni od teškog lanca cB273, i odgovarajući brojevi aminokiselinskih ostataka su dodeljeni korišćenjem ostatka glutaminske kiseline na položaju 20 SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci kao polazne tačke. B) je prikaz koji ilustruje aminokiselinske ostatke L lanca cB273 Fab koji se nalazi na rastojanju od 4 A ili manje od DR5 i obrnuto od koji su neki kao štapićasti model a drugi kao trakasti model. Gly26. GIu36, Asp37, i Gly38 na levoj strani slike su aminokiselinski ostaci dobijeni od DR5, i odgovarajući brojevi aminokiselinskih ostataka odgovaraju onima u sekvenci aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 23 u Listi Sekvenci. Dalje, His31, Asn33. Val99, i Trpi01 na desnoj strani slike su aminokiselinski ostaci dobijeni od lakog lanca cB273, i odgovarajući brojevi aminokiselinskih ostataka su dodeljeni korišćenjem ostatka asparaginske kiseline na položaju 21 SEQ ID NO: 16 u Listi Sekvenci kao polazne tačke. Aminokiselinski ostaci DR5 koji se nalaze na rastojanje od 4 A ili manje od Fab fragmenta cB273 su ostatak glicina na položaju 26, ostatak izoleucina na položaju 34, ostatak glutaminske kiseline na položaju 36, ostatak asparaginske kiseline na položaju 37, ostatak glicina na položaju 38, ostatak asparaginske kiseline na položaju 56, ostatak leucina na položaju 57, ostatak leucina na položaju 58, ostatak fenilalanina na položaju 59, ostatak leucina na položaju 61, i ostatak arginina na položaju 62 sekvence aminokiselina koja je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 23 u Listi Sekvenci.

[Sl.8-1]

SI.8-1 je slika koja prikazuje aktivnosti vezivanja hB273 antitela za humani DR5 korišćenjem Biacore-a, i prikazuje grafike za odgovarajuća antitela.

[Sl.8-2]

SI.8-2 je tabela koja prikazuje aktivnosti vezivanja hB273 antitela za humani DR5 korišćenjem Biacore-a, i prikazuje Kon, Koff, i KD vrednosti odgovarajućih antitela izračunate korišćenjem analitičkog softvera. Slučajno, broj dodeljen svakom grafiku na SI.8-1 odgovara broju unosa tabele na slici SI.8-2.

[S1.9]

S1.9 je slika koja prikazuje in vitro citocidnu aktivnost B273 antitela na Jurkat ćelije koje predstavljaju humanu ćelijsku liniju izvedenu od T limfoma.

[Sl.10-1]

SI. 10-1 je slika koja prikazuje aktivnosti vezivanja hB273 antitela za humani DR5 korišćenjem Biacore-a, i prikazuje grafike za odgovarajuća antitela.

[SI. 10-2]

SI. 10-2 je tabela koja prikazuje aktivnosti vezivanja hB273 antitela za humani DR5 korišćenjem Biacore-a, i prikazuje Kon, Koff, i KD vrednosti za odgovarajuća antitela koje su izračunate korišćenjem analitičkog softvera. Slučajno, broj koji je dodeljen svakom grafiku na Sl.10-1 odgovara broju unosa na tabeli na SI. 10-2.

[Sl.ll]

Sl.l 1 je slika koja prikazuje in vitro citocidnu aktivnost B273 antitela na Jurkat ćelije koje predstavljaju ćelijsku liniju izvedenu iz T limfoma.

[SI. 12-1 j

SI. 12-1 je prikaz aktivnosti vezivanja CDR-modifikovanog hB273 antitela za humani DR5 korišćenjem Biacore-a, i prikazuje grafike za odgovarajuća antitela.

[SI. 12-2]

SI. 12-2 je tabela koja prikazuje aktivnosti vezivanja CDR-modifikovanog hB273 antitela za humani DR5 korišćenjem Biacore-a, i prikazuje Kon, Koff. i KD vrednosti za odgovarajuća antitela koje su izračunate korišćenjem analitičkog softvera. Slučajno, broj koji je dodeljen svakom grafiku na SI. 12-1 odgovara broju unosa na tabeli na SI. 12-2.

[SI. 13-1]

SI. 13-1 je slika koja prikazuje procenu termalne stabilnosti CDR-modifikovanog hB273 antitela korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC), i prikazuje grafike za odgovarajuća antitela.

[SI. 13-2]

SI. 13-2 je slika koja prikazuje procenu termalne stabilnosti CDR-modifikovanog hB273 antitela korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC), i prikazuje grafike za odgovarajuća antitela.

[SI. 13-31

SI. 13-3 prikazuje Tm vrednosti odgovarajućih antitela koje su izračunate pomoću grafika koji su prikazani na slikama 13-1 i 13-2. Slučajno, broj koji je dodeljen svakom grafiku na slikama 13-1 i 13-2 odgovara broju unosa na tabeli na SI. 13-3.

[SI. 14]

SI. 14 je slika koja prikazuje in vitro citocidne aktivnosti CDR-modifikovanog hB273 antitela na Jurkat ćelije koje predstavljaju ćelijsku liniju izvedenu iz humanog T limfoma.

[SI. 15]

SI. 15 je prikaz efekta aktivacije kaspaze-3/7 i in vitro citocidne aktivnosti hB273_H2-1-NE/LI-NK antitela na humane kancerske ćelijske linije. A) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog kancera debelog creva HCT-15, i B) prikazuje rezultate za ćelijsku liniju humanog glioblastoma U-87MG.

[SI.16]

SI. 16 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost cB273 antitela kod golih miševa (nude miševi) implantiranih sa ćelijskom linijom COLO 205 humanog kancera debelog creva.

[SI.17]

SI. 17 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost cB273 antitela kod golih miševa (nude miševi) implantiranih sa ćelijskom linijom MIAPaCa-2 humanog kancera pankreasa.

[SI. 18]

Sl.l8 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost cB273 antitela kod golih miševa (nude miševi) implantiranih sa ćelijskom linijom U-87MG humanog glioblastoma.

[SI. 19]

SI. 19 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost cB273 antitela kod golih miševa (nude miševi) implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera pluća NCI-H2122 (u kombinaciji sa paklitakselom i karboplatinom).

[SI.20]

51.20 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost cB273 antitela kod golih miševa (nude miševi) implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera pluća NCI-H460 (u kombinaciji sa paklitakselom i karboplatinom).

[S1.21]

51.21 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost cB273 antitela kod golih miševa (nude miševi) implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera debelog creva DLD-1 (u kombinaciji sa CPT-11).

[S1.22]

51.22 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost cB273 antitela kod golih miševa (nude miševi) implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera debelog creva HCT-15 (u kombinaciji sa CPT-11).

[S1.23]

51.23 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost cB273 antitela kod golih miševa (nude miševi) implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera debelog creva HCT-116 (u kombinaciji sa CPT-11).

[S1.24J

51.24 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost cB273 antitela kod golih miševa (nude miševi) implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera debelog creva A375 (u kombinaciji sa vinblastinom).

[S1.25]

51.25 je slika koja prikazuje poređenje in vivo antitumorske aktivnost kod golih miševa implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera debelog creva HCT-15 između cB273 antitela i conatumumab-a.

[S1.26]

51.26 je slika koja prikazuje poređenje in vivo antitumorske aktivnost kod golih miševa implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera pluća NCI-H1975 između cB273 antitela i conatumumab-a.

[S1.27]

51.27 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost hB273_112-1-NE/LI-NK antitela (označenog kao "hB273" na slici) kod golih miševa implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera debelog creva COLO 205.

[S1.28J

51.28 jc slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu cDNA koja kodira teški lanac antitela B273 miša i sekvencu aminokiselina teškog lanca antitela B273 miša.

[S1.29|

51.29 jc slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu cDNA koja kodira laki lanac antitela B273 miša i sekvencu aminokiselina lakog lanca antitela B273 miša.

[S1.30]

51.30 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira B273 laki lanac himernog tipa i sekvencu aminokiselina B273 lakog lanca himernog tipa.

[S1.31]

51.31 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira B273 težak lanac himernog tipa i sekvencu aminokiselina B273 teškog lanca himernog tipa.

[S1.32]

51.32 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_Ll-tip lakog lanca i sekvencu aminokiselina lakog lanca hB273_Ll-tipa.

[S1.33]

51.33 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_L2-tip lakog lanca i sekvencu aminokiselina lakog lanca hB273_L2- tipa.

[S1.34]

51.34 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_L3-tip lakog lanca i sekvencu aminokiselina lakog lanca hB273_L3-lipa.

[S1.35]

51.35 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_Hl-tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273_Hl- tipa.

[S1.36J

51.36 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_H2-tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273_H2- tipa.

[S1.37]

51.37 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_H3-tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273_H3-tipa.

[S1.38]

51.38 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_Hl-l-tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273 Hl-1 -tipa.

[S1.39]

51.39 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_H2-l-tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273_H2-1 -tipa.

[SMO]

51.40 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_H2-2-tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273_H2-2-tipa.

[S1.41]

51.41 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_H2-3-tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273 H2-3-tipa.

[S1.42]

51.42 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_H2-4- tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273_H2-4-tipa.

[S1.43]

51.43 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_H2-5-tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273_H2-5-tipa.

[S1.44J

51.44 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_Ll-NE-tip lakog lanca i sekvencu aminokiselina lakog lanca hB273_Ll-NE-tipa.

[S1.45]

51.45 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_Ll-NF-tip lakog lanca i sekvencu aminokiselina lakog lanca hB273-Ll-NF-tipa.

[SI.46]

51.46 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_Ll-NK-tip lakog lanca i sekvencu aminokiselina lakog lanca hB273_L 1-NK-tipa.

[S1.47]

51.47 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_Ll-NL-tip lakog lanca i sekvencu aminokiselina lakog lanca hB273_Ll-NL-tipa.

[S1.48]

51.48 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira hB273_H2-l-NE-tip teškog lanca i sekvencu aminokiselina teškog lanca hB273 H2-l-NE-lipa.

[S1.49]

51.49 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu cDNA koja kodira laki lanac conatumumab-a i sekvencu aminokiselina lakog lanca conatumumab-a.

[S1.50]

51.50 je slika koja prikazuje nukleotidnu sekvencu cDNA koja kodira težak lanac conatumumab-a i sekvencu aminokiselina teškog lanca conatumumab-a.

[S1.51]

51.51 je slika koja prikazuje in vitro citocidnu aktivnost hB273_H2-I-NE/hB273_Ll-NK antitela na humane kancerske ćelijske linije A) prikazuje rezultate za humanu ćelijsku liniju kancera želuca, B) prikazuje rezultate za humanu ćelijsku liniju kancera bubrega, C) prikazuje rezultate za humanu ćelijsku liniju kancera jetre, i D) prikazuje rezultate za humanu ćelijsku liniju fibrosarkoma.

[S1.52J

51.52 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitela (označenog kao "hB273" na slikama) u kombinaciji sa 5-FU kod golih miševa implantiranih sa ćelijskom linijom humanog kancera debelog creva HCT-15 i poređenje ove aktivnosti sa conatumumab-om.

[S1.53]

51.53 je slika koja prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitela (označenog kao "hB273" na slikama) u kombinaciji sa paklitakselom kod golih miševa implantiranih sa ćelijskom linijom humanog nesitnoćelijskog karcinoma pluća NCI-H1975 i poređenje ove aktivnosti sa conatumumab-om.

Način sporovođenja pronalaska

[0010]Termini "kancer" i "tumor" kao što je ovde korišćcno su upotrebljeni sa istim značenjem.

[0011[Termin "gen" kao što je ovde korišćeno uključuje ne samo DNK, ali takođe njenu mRNK, njene cDNA i cRNA.

[0012]Termin "polinukleotid" kao što je ovde korišćeno je upotrebljen sa istim značenjem kao "nukleinska kiselina" i takođe uključuje DNA, RNA, probe, oligonukleotide, i prajmere.

[0013]Termini "p°nPeptid" i "protein" kao stoje ovde korišćeno su korišćeni bez razlike.

[0014]Termin "RNA frakcija" kao što je ovde korišćeno se odnosi na frakciju koja sadrži

RNK.

[0015]Termin "ćelija" kao što je ovde korišćeno takođe uključuje ćelije individualne životinje i ćelije u kulturi.

[0016]Termin "maligna transformacija ćelije" kao što je ovde korišćeno se odnosi na stanje u kome ćelije pokazuju abnormalnu proliferaciju, na primer, ćelije gube svoju senzitivnost na pojavu kontaktne inhibicije, ćelije pokazuju proliferaciju nezavisnu od podloge, i tako dalje, i ćelije koje pokazuju takvu abnormalnu proliferaciju sc nazivaju "kancerske ćelije".

[0017]Termin "povreda ćelije" kao što je ovde korišćeno se odnosi na stanje u kome je patološka promena prouzrokovana u ćelijama u vidu neke vrste promene, i povreda ćelije nije ograničena na direktnu povredu i uključuje sve vrste oštećenja strukture i funkcije ćelije kao što je DNA cepanje, formiranje baznog-dimera, hromozomsko cepanje, povrede mehanizama deobe ćelija, i smanjenje različitih enzimskih aktivnosti.

[0018]Termin "citotoksična aktivnost" kao što je ovde korišćeno sc odnosi na aktivnost koja pro uro kuje gore opisanu povredu ćelije.

[0019]Termin "receptor koji sadrži domen smrti" (koji uključuje Fas, TNFRI, DR3, DR4, DR5, i DR6, iako nije ograničen na njih) kao što je ovde korišćeno se odnosi na molekul receptora koji poseduje region signalne transdukcije apoptoze koji se naziva "domen smrti" koji pokazuje homologiju sa Drosophila suicide genom, reaper, u intraćelijskom domenu.

[0020]Termin "funkcionalni fragment antitela" kao što je ovde korišćeno se odnosi na parcijalni fragment antitela koji poseduje aktivnost vezivanja antigena i uključuje Fab, F(ab')2i scFv, Termin takođe uključuje Fab' koji jc monovalentni fragment u varijabilnom regionu antitela dobijenim tretiranjem F(ab')2pod redukcionim uslovima. Međutim, termin nije ograničen na one molekule sve dok fragment poseduje afinitet za vezivanje za antigen. Dalje, ovi funkcionalni fragmenti uključuju ne samo fragment dobijen tretiranjem potpunog lanca molekula antitela proteina sa odgovarajućim enzimom, ali takođe protein proizveden u odgovarajućim ćelijama domaćina korišćenjem genetski modifikovanog gena antitela. {0021]Termin "Fab"' kao što je ovde korišćeno sc odnosi na monovalentni fragment u varijabilnom regionu antitela koji je dobijen tretiranjem F (ab')2pod redukcionim uslovima kao što je gore opisano. Međutim, Fab' proizveden korišćenjem gentski modifikovanog gena antitela je takođe u okviru Fab' predmetnog pronalaska.

[0022]Termin "jednolančani varijabilni fragment antitela" kao što je ovde korišćeno je upotrebljen sa istim značenjem kao jednolančani Fv (scFv).

[0023]Termin "epitop" kao što je ovde korišćeno sc odnosi na parcijalni peptid ili parcijalnu tercijernu strukturu antigena za koju se vezuje specifično antitelo. Epitop koji je parcijalni peptid antigena može biti određen metodama koje su dobro poznate poznavaocima ove oblasti kao što je imunoesej, i na primer, naredna metoda može biti korišćena. Prvo, različite parcijalne strukture antigena su proizvedene. U proizvodnji parcijalnih struktura, poznata tehnika sinteze oligopeptida može biti korišćena. Na primer, serije polipeptida koje imaju odgovarajuće smanjene lance dobijene sekvencijalnim skraćenjem antigena na C- terminusu ili N-terminusu su proizvedene korišćenjem tehnike genetske rekombinacije koja je poznata poznavaocima oblasti predmetnog pronalaska. Posle toga, reaktivnost antitela nasuprot ovih polipeptida je ispitana i grubo je određeno mesto vezivanja. Onda, peptidi koji imaju kraće lance su sintetisani i reaktivnost na ove peptidc je ispitana, pri Čemu epitop može biti određen. Dalje, epitop koji je parcijalna tercijerna struktura vezivanja antigena za specifično antitelo može biti određena navođenjem aminokiselinskih ostataka antigena koji su pored antitela prema strukturnoj analizi X-zracima.

[0024]Termin "antitela koja se vezuju za isti epitop" kao što je ovde korišćeno se odnosi na različita antitela koja se vezuju za zajednički epitop. Ukoliko se drugo antitelo veže za parcijalni peptid ili parcijalnu tercijernu strukturu za koju se prvo antitelo veže, može biti određeno da se prvo antitelo i drugo antitelo vezuju za isti epitop. Dalje, potvrđivanjem da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za antigen (što je, drugo antitelo inhibira vezivanje između prvog antitela i antigena), može biti određeno da se prvo antitelo i drugo antitelo vezuju za isti epitop čak i ukoliko specifična sekvenca epitopa ili struktura nije određena. Dalje, kada se prvo antitelo i drugo antitelo vezuju za isti epitop i takođe prvo antitelo poseduje specijalni efekat kao što je aktivnost indukcije apoptoze, može biti očekivano da drugo antitelo takođe poseduje istu aktivnost.

[0025]Termin "CDR" kao što je ovde korišćeno se odnosi na regione koji određuju komplementarnost (CDR), i poznato je da svaki težak i lak lanac molekula antitela poseduje tri regiona koji određuju komplementarnost (CDRs). CDR se takođe naziva hipervarijabilni domen, i prisutan jc u varijabilnom regionu svakog teškog i lakog lanca antitela. To je mesto koje poseduje neobično visoku varijabilnost u svojoj primarnoj strukturi, i postoje tri odvojena CDR u primarnoj strukturi svakog teškog i lakog polipeptidnog lanca. U ovoj specifikaciji, kao i za CDRs antitela, CDR-i teškog lanca su predstavljeni sa CDRH1, CDRH2, i CDRH3 sa amino-terminalnog kraja sekvence aminokiselina teškog lanca, i CDR-i lakog lanca su predstavljeni sa CDRL1, CDRL2. i CDRL3 sa amino-terminalnog kraja sekvence aminokiselina lakog lanca. Ova mesta su u blizini jedan drugomutercijernoj strukturi i određuju specifičnost za antigen za koji se antitelo veže.

[0026] Termin "sekundarno antitelo" kao što je ovde korišćeno se odnosi na antitelo koje se veže specifično za molekul antitela. time povezujući molekule antitela.

[0027]Fraza "hibridizacija je izvedena pod striktnim uslovima" kao što je ovde korišćeno se odnosi na proces u kome je hibridizacija izvedena pod uslovima pod kojima identifikacija može biti postignuta izvođenjem hibridizacije na 68°C u komercijalno dostupnom rastvoru za hibridizaciju ExpressHyb Hybridization Solution (proivodi Clontech, Inc.) ili izvođenjem hibridizacije na 68°C u prisustvu 0.7 do 1.0 M NaCl korišćenjem filtera koji poseduje imobilisanu DNK, koja je praćena ispiranjem na 68°C korišćenjem 0.1 do 2 x SSC rastvora (1 x SSC rastvor se sastoji od 150 mM NaCl i 15 mM natrijum citrata) ili pod uslovima koji su slični ovima.

[0028]Termin "nekoliko aminokiselina" u opisu "sekvenca aminokiselina uključujući supstituciju, deleciju, ili adiciju jedne do nekoliko aminokiselina" kao što je ovde korišćeno se odnosi na proizvoljni broj aminokiselinskih ostataka koji je izabran od 2 do 10. Specifičnije, kada je 10 ili manje aminokiselina, 5 do 6 ili manje aminokiselina, ili 2 do 3 ili manje aminokiselina supstituisano, uklonjeno ili dodato, opis "sekvenca aminokiselina uključujući supstituciju, deleciju, ili adiciju nekoliko aminokiselina "je korišćen.

[0029]Opis, na primer, "težak lanac varijabilnog regiona koji ima sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 sekvence SEQ ID NO: 34" kao što je ovde korišćeno jc upotrebljen sa istim značenjem kao opis "sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 sekvence SEQ ID NO: 34". Dalje, opis, na primer, "težak lanac koji poseduje sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence SEQ ID NO: 34" je upotrebljen sa istim značenjem kao opis "sekvenca teškog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 sekvence SEQIDNO: 34".

1. Povodom gena u vezi sa apoptozom

[0030]Antitelo prema predmetnom pronalasku treba da se veže za specifični antigen i ispoljava citotoksičnu aktivnost preko antigena. Dalje, neophodno je da se izabere antigen specifično prisutan u tumorskim ćelijama kako bi se sprečila smrt normalnih ćelija. Jedan primer takve grupe antigena može da uključuje receptorske grupe liganada koji indukuju apoptozu (u daljem tekstu, nazvani "TRAIL" u specifikaciji) koje su povezane sa faktorom nekroze tumora (u daljem tekstu, nazvan "TNF" u specifikaciji). TRAIL je Član TNF familije proteina i uključuje Fas ligande i TNF-a (Wiley SR, et al., lmmunity 1995 Dec; 3 (6) : 673-82). Ovi proteini su snažni faktori koji indukuju apoptozu.

[0031]Receptori za ove proteine TNF familije su okarakterisani pomoću ponavljajućih sekvenci bogatih ciste inom u ekstracelularnom domenu. Medu njima, Fas koji je receptor za Fas ligande, i TNF receptor I (u daljem tekstu, naznačen kao "TNFRI" u specifikaciji) koji je receptor za TNFa poseduje, u intracelularnom domenu, region esencijalan za signalnu transdukciju apoptoze koji je nazvan "domen - smrti" koji je region koji pokazuje homologiju sa Drosophila suicide genom, rcaper, (Golstein, P.. et al., (1995) Cell. 81, 185-186; i White, K, et al., (1994) Science 264, 677-683), i kolektivno su nazvani receptori koji poseduju domen smrti.

[0032]Pet receptora za TRAIL je identifikovano. i među njima, dva receptora (DR4 (TRAIL-R1) i DR5 (TRAIL-R2)) su sposobna za prenošenje signala apoptoze, a druga tri receptora (DcRl (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4), i osteoprotegerin (OPG)) ne prenose signale apoptoze. Slično kao Fas i TNFRI, i DR4 i DR5 poseduju domen smrti u intracelularnom segmentu i prenose signale apoptoze putem koji sadrži protein sa domenom smrti koji je povezan sa Fas (u daljem tekstu nazvan "FADD" u specifikaciji) i kaspazom 8 (Chaudhary PM, et al., Immunity 1997 Dec; 7 (6) : 813-20; i Schneider P, et al. Immunity 1997 Dec; 7 (6) : 821-30). Za Fas, TNFRI, DR4, ili DR5 koji su gore opisani, poznato je da antitelo koje se veže za bilo koji od ovih molekula i funkcionišc kao agonist ispoljava aktivnost indukcije apoptoze kod ćelija koje poseduju molekul na površini ćelije (Joumal of Cellular Physiology, 209: 1221-1028 (2006); Leukemia, Apl; 21 (4): 805-812 (2007); Blood, 99: 1666-1675 (2002); i Cellular Immunology, Jan; 153 (1): 184-193 (1994)). Farmakološki efekat gore opisanog agonističkog antitela je povećan povezivanjem sa sekundarnim antiteiom ili ćelijom efektorom (Journal of ImmunoIogy, 149: 3166-3173 (1992); i European Journal of Immunology, Oct; 23 (10): 2676-2681 (1993)).

[0033]Nukleotidna sekvenca humanog DR5 (receptor smrti 5) gena i sekvenca aminokiselina tog gena je registrovana kao GL22547118 (Pristupni Br: NM_147187) u Banci Gena. Slučajno, nukleotidna sekvenca koja kodira protein, koji ima sekvencu aminokiselina uključujući supstituciju, deleciju, ili adiciju jedne do nekoliko aminokiselina u sekvenci aminokiselina DR5 i takođe ima biološku aktivnost ekvivalentnu DR5 je takođe uključena u značenje termina "nukleotidna sekvenca DR5 gena". Dalje, protein koji ima sekvencu amino kiselina uključujući supstituciju, deleciju, ili adiciju jedne do nekoliko aminokiselina u sekvenci aminokiselina DR5 i takođe ima biološku aktivnost ekvivalentnu DR5 je takođe uključena u značenje termina "DR5".

2. Proizvodnja anti-DR5 antitela

|0034] Antitelo na DR5 predmetnog pronalaska i kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti može biti dobijeno imunizacijom životinje sa DR5 ili proizvoljnim polipeptidom koji je izabran od sekvenca aminokiselina DR5 i sakupljanjem i prečišćavanjem antitela koje je proizvedeno in vivo prema uobičajenoj proceduri. Biološke vrste DR5 koje treba da se koriste kao antigen nisu ograničene na ljude, a životinja može biti imunozovana sa DR5 koji je dobijen od životinjske vrste izuzev ljudske kao što je miš ili pacov. U ovom slučaju, ispitivanjem unakrsne reaktivnosti između antitela koje se vezuje za dobijeni heterologi DR5 i humani DR5, antitelo koje se može primeniti kod humane bolesti može biti izabrano.

[0035] Dalje, monoklonsko antitelo može bili dobijeno fuzionisanjem ćelija koje proizvode antitelo koje proizvode antitelo na DR5 sa mijeloma ćelijama kako bi se uspostavio hibridom prema poznatoj metodi (na primer, Kohler i Milstein. Nature, (1975) 256, str. 495-497, Kennet, R. ed. , Monoklonski Antitela, str. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).

[0036] Slučajno, DR5 koji treba koristiti kao antigen može biti dobijen genetičkim inženjeringom kako bi se prozrokovalo da ćelija domaćin eksprimira DR5 gen.

[0037] Specifično, vektor sposoban za eksprimiranje DR5 gena je proizveden, i rezultujući vektora je transfektovan u ćeliju domaćina da eksprimira gen, i onda je eksprimirani DR5 prečišćen. U daljem tekstu. Metoda za dobijanje antitela na DR5 će biti specifično opisana.

(1) Priprema antigena

[0038] Primeri antigena koje treba koristiti za proizvodnju anti-DR5 antitela uključuju DR5, polipeptid koji sadrži parcijalnu sekvencu aminokiselina koja sadrži najmanje 6 uzastopnih aminokiselina DR5, i derivat dobijen dodavanjem date sekvence aminokiselina ili njegovog nosača.

[0039] DR5 može biti prečišćen direktno iz humanih tumorskih tkiva ili tumorskih ćelija i korišćen. Dalje, DR5 može biti dobijeno sintetisanjem in vitro ili prouzrokovanjem da ga ćelija domaćin proizvodi genetičkim injženjeringom.

[0040] Što se tiče genetičkog injženjeringa, specifično, DR5 cDNA je integrisan u vektor koji može da eksprimira DR5 cDNA i DR5 je sintetisan u rastvoru koji sadrži enzim, supstrat, i energetsku supstancu koja je neophodna za transkripciju i translaciju, ili jc druga prokariotska ili eukariolska ćelija domaćin transformisana da eksprimira DR5. pri čemu antigen može biti dobijen.

[0041]Dalje, antigen može takode biti dobijen kao sekretorni protein ekspresijom fuzionisanog proteina koji je dobijen spajanjem ekstracelularnog domena DR5, koji je membranski protein, sa konstantnim regionom antitela u odgovarajućem domaćin-vektor sistemu.

[0042]DR5 cDNA može biti dobijena, na primer, takozvanom PCR metodom u kojoj se reakcija lančane polimerizacije (u daljem tekstu naznačena kao "PCR") izvodi korišćenjem cDNA biblioteke koja sadrži DR5 cDNA kao uzorak i prajmere koji specifično amplifikuju DR5 cDNA (videti Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, str. 487-489).

[0043]Kao sistem za in vitro sintezu polipeptida, Rapid Translation System (RTS) koji proizvodi Roche Diagnostics, Inc. može biti korišćen kao šablon, ali nije na njega ograničen.

[0044]Primeri prokariotskih ćelija domaćina uključuju Eschcrichia coli i Bacillus subtilis. Kako bi se transformisala ćelija domaćin sa ciljnim genom, ćelija domaćin je transformisana korišćenjem plazmid vektora koji sadrži replikon, tj., početak replikacije dobijen iz vrste koja je kompatibilna sa domaćinom, i regulatornu sekvencu. Dalje, vektor poželjno ima sekvencu koja je sposobna za uspostavljanje fenotipske selektivnosti kod transformisane ćelije.J0045]Primeri eukariotske ćelije domaćina uključuju ćelije kičmenjaka, ćelije insekata, i ćelije kvasca. Kao ćelije kičmenjaka, na primer. Često su korišćeni sojevi deficijentni dihidrofolat reduktazom (Urlaub, G. i Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, str. 4126-4220) COS ćelija majmuna (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, str. 175-182, ATCC CRL-1650), mišji fibroblasti N1U3T3 (ATCC No. CRL-1658), i ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO ćelije; ATCC: CCL-61) su Često korišćene. međutim, nisu njima ograničene.

[0046]Tako dobijeni transformant može biti gajen prema uobičajenoj proceduri, i gajenjem transformanta, ciljni polipeptid je proizveden intracelularno ili ekstracelularno.

[0047]Pogodan medijum koji treba da bude korišćen za gajenje može biti izabran od različitih uobičajeno korišćenih medijuma za kulturu u zavisnosti od korišćene ćelije domaćina. Ukoliko se koristi Escherichia coli. na primer. LB medijum sa dodatkom antibiotika kao što je ampicilin ili IPMG, po potrebi, može biti korišćen.

[0048]Rekombinantni protein proizveden intracelularno ili ekstracelularno od strane transformanta takvim gajenjem može biti izolovan i prečišćen bilo kojom od poznatih metoda za izolovanje koje koriste fizičke ili hemijske karakteristike proteina.

[0049]Specifični primeri metoda uključuju tretiranje sa uobičajenim precipitatom proteina, ultrafiltraciju, različite tipove tečne hromatografije kao Što je hromatografija na molekularnim sitima (gel filtracija), adsorpciona hromatografija, hromatografija sa jonskom izmenom, i afinitetna hromatografija, dijaliza, i njihove kombinacije.

[0050]Dalje, vezivanjem obeleživača od šest hislidin ostataka za rekombinantni protein koji treba da bude eksprimiran, protein može biti efikasno prečišćen pomoću nikal afinitetne kolone. Alternativno, vezivanjem IgG Fc regiona za rekombinantni protein koji treba da bude eksprimiran, protein može biti efikasno prečišćen sa protein A kolonom.

[0051]Kombinovanjem gore opisanih metoda, velika količina ciljnog polipeptida može biti lako proizvedena u velikom prinosu i sa visokom čistoćom.

(2)Proizvodnja anti-DR5 monoklonskog antitela

[0052]Primeri antitela koja specifično vezuju DR5 uključuju monoklonsko antitelo koje specifično vezuje DR5, a metoda za dobijanje antitela je kao stoje dole opisano.

[0053]Proizvodnja monoklonskog antitela uopšteno zahteva sledeće korake postupka: (a) prečišćavanje biopolimera koji treba da bude korišćen kao antigen; (b) pripremanje ćelija koje proizvode antitelo imunizacijom životinje injekcioniranjem antigena, sakupljanjem krvi, ispitivanjem njenog titra antitela radi određivanja kada slezina treba da bude odstranjena; (c) pripremanje ćelija mijeloma (u daljem tekstu naznačeno kao "mijelom"); (d) fuzionisanje ćelija koje proizvode antitelo sa mijelomom; (e) skrining grupe hibridoma koji proizvode ciljno antitelo; (f) deljenje hibridoma u klonove pojedinačnih ćelija (kloniranje); (g) po izboru, gajenje hibridoma ili životinje kod koje jc implantiran hibridom za proizvodnju velike količine monoklonskog antitela; (h) ispitivanje tako proizvedenog monoklonskog antitela na biološku aktivnost i specifičnost vezivanja, ili ispitivanje istih na karakteristike kao obeleženih reagenasa.

[0054]U daljem tekstu, metoda za proizvodnju monoklonskog antitela će biti detaljno opisana prateći gornje korake, međutim, metoda nije time ograničena, i, na primer, ćelije koje proizvode antitelo osim ćelija slezine i mijeloma mogu biti korišćene.

(a) Prečišćavanje antigena

|0055]Kao antigen, DR5 pripremljen metodom kao što je gore opisano ili njegov parcijalni peptid može biti korišćen.

|0056]Dalje, membranska frakcija pripremljena od rekombinantnih ćelija koje eksprimiraju DR5 ili rekombinantne ćelije koje same eksprimiraju DR5, i takođe parcijalni peptid proteina predmetnog pronalaska hemijski sintetisan meotodom koja je pozanta poznavaocima ove oblasti može takođe biti korišćen kao antigen.

(b) Pripremanje ćelija koje proizvode antigen

|0057] Antigen dobijen u koraku (a) je pomešan sa ađjuvansom kao što je Frojndov kompletan ili nekompletan adjuvans, ili aluminijum kalijum sulfat i rezultujuća smeša je korišćena kao imunogen za imunizaciju eksperimentalne životinje. Kao eksperimentalna životinja, bilo koja životinja korišćena u poznatoj metodi za produkciju hibridoma može biti korišćena bez bilo kakvih smetnji. Specifično, na primer, miš. pacov, koza. ovca, stoka, konj, ili slično može biti korišćena. Međutim, sa stanovišta lake dostupnosti mijeloma ćelija koje treba da budu fuzionisane sa ekstrahovanim ćelijama koje proizvode antitela, miš ili pacov je poželjno korišćen kao životinja koja treba da bude imunizovana.

[0058jDalje, soj miša ili pacova koji treba da bude korišćen nije naročito ograničen, i u slučaju miša, na primer, različiti sojevi kao što su A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III. SJL, SWR, WB, i 129 mogu biti korišćeni, i u slučaju pacova, na primer, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer, i slično mogu biti korišćeni.

[0059jMeđu njima, u razmatranju kompatibilnosti fuzionisanja sa mijeloma ćelijama kao što je dole opisano, u slučaju miša, BALB/c soj, i u slučaju pacova, Wistar i Low sojevi su naročito poželjni kao životinje koje treba da budu imunizovane.

[0060]Dalje, u razmatranju antigenske homologije između ljudi i miševa, takođe je poželjno koristiti miša koji ima smanjenu biološku funkciju za uklanjanje autoantitela, što je, miš sa autoimunim oboljenjem. [0061 ]Starost miša ili pacova u vreme immunizacije je poželjno 5 do 12 nedelja, poželjnije 6 do 8 nedelja starosti.

[0062]Za imunizaciju životinje sa DR5 ili njegovim rekombinantnim proteinom, na primer, poznata metoda detaljno opisana u, na primer, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. i Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry. Charies C Thomas Publisher Springficld. Illinois (1964), ili slično može biti korišćena. [00631Ćelije slezine ili limfociti uključujući ćelije koje proizvode antitela su aseptično uklonjene iz imunizovane životinje. U ovo vreme, titar antitela je izmercn. i ukoliko je životinja koja ima dovoljno povećan titar antitela korišćena kao izvor ćelija koje proizvode antitelo, sledeća procedura može biti izvedena efikasno.

[0064]Primeri metoda za merenja titra antitela koje treba da bude korišćeno ovde uključuju RIA meotodu i ELISA metodu, ali metoda nije ovim ograničena.

|0065]Izolovanje ćelija koje proizvode antitelo iz ćelija slezine ili limfocita imunizovane životinje može biti izvedeno prema poznatoj metodi (na primer. Kohler et al.. Nature (1975). 256, str. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6. str. 511; Milstein et al.. Nature (1977), 266, str. 550; Walsh. Nature (1977), 266, str. 495).

(c)Ćelije mijeloma (u daljemtekstunaznačeno kao "mijelom")

[0066]Ćelije mijeloma koje treba da korišćene za fuziju ćelija nisu naročito ograničene i pogodne ćelije mogu biti izabrane od poznatih ćelijskih linija. Međutim, u razmatranju pogodnosti kada je hibridom izabran od fuzionisanih ćelija, poželjno je koristiti HGPRT (hipoksantin-guanin fosforibozil transferazu) deficijentni soj čija je procedura za selekciju ustanovljena.

[0067]Specifičnije, primeri HGPRT-deficijentnih sojeva uključuju X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NSI), P3X63-Ag8.Ul (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Agl4 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6G), F0, S149/5XXO, i BU.l dobijene od miševa; 210.RSY3.Ag. 1.2.3 (Y3) dobijeni od pacova; i U266AR (SKO-007), GM1500 GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2) i 8226AR/NIP4-1 (NP41) dobijeni od ljudi.

(d) Ćelijska fuzija

[0068]Fuzija između ćelija koje proizvode antitelo i ćelije mijeloma može biti odgovarajuće izvedena prema poznatoj metodi (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackvvell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. i Mayer, M. M.. Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Spigfield, Illinois (1964), etc), pod uslovima takvim da stopa preživljavanja ćelija nije prekomerno smanjena.

[0069]Kao takva metoda, na primer, hemijska metoda u kojoj su ćelije koje proizvode antitelo i mijeloma ćelije pomešane u rastvoru koji sadrži polimer kao što je polietilen glikol pri visokoj koncentraciji, fizička metoda korišćenja električne stimulacije, ili slično može biti korišćena.

(e) Selekcija grupe hibridoma

[0070] Metoda za selekciju hibridoma dobijenih gore opisanom fuzijom ćelija nije naročito ograničena. Obično, HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin) metoda za selekciju (Kohler et al., Nature (1975), 256, str. 495; Milstein et al.. Nature (1977), 266, str. 550) je korišćena.

[0071] Ova metoda je efikasna kada su hibridomi dobijeni korišćenjem mijeloma ćelija HGPRT-deifcijentnog soja koji ne može da preživi u prisustvu aminopterina.

[0072] To znači, kultivisanjem nefuzionisanih ćelija i hibridoma u HAT medijumu, samo hibridomima rezistentnim na aminopterin je selektivno omogućeno da prežive i proliferišu.

(f) Deoba u klon pojedinačnih ćelija (kloniranje)

[0073J Kao metoda za kloniranje za hibridome, poznata metoda kao što je metilcelulozna metoda, metoda meke agoroze, ili limitirajuća diluciona metoda može biti korišćena (videti, na primer, Barbara, B. M. i Stanlev, M. S.: Izabran Methods in Cellular Immunologv, W. H. Freeman i Companv, San Francisco (1980)). Među ovim metodama, naročito, trodimenzionalna metoda kultivacije kao što je metilcelulozna metoda je poželjna. Na primer, grupa hibridoma proizvedenih fuzijom ćelija je suspendovana u metilceluloznom medijumu kao što je Clonacell-HY Selection Medijum D (proizvodi StemCell Technologies, ine, #03804) i kultivisana. Onda, formirane hibridoma kolonije su sakupljene, pri čemu monoklonski hibridomi mogu biti dobijeni. Sakupljene odgovarajuće hibridoma kolonije su kultivisane, i hibridom za koji je potvrđeno da ima stabilan titar antitela u dobijenom supernatantu hibridoma kulture je izabran kao hibridoma soj koji proizvodi DR5 monoklonsko antitelo.

[0074] Primeri tako ustanovljenog hibridoma soja uključuju DR5 hibridom B273. Slučajno, u ovoj specifikaciji, antitelo proizvedeno hibridomom B273 je naznačeno kao "B273 antitelo" ili jednostavno "B273". Težak lanac B273 antitela ima sekvencu aminokiselina predstavljenu sa SEQ ID NO: 8 u Listi Sekvenci. Dalje, lak lanac B273 antitela ima sekvencu aminokiselina predstavljenu sa SEQ ID NO: 10 u Listi Sekvenci. Slučajno, u teškom lanacu sekvenca aminokiselina predstavljena sa SEQ ID NO: 8 u Listi Sekvenci, sekvenca aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 1 do 19 je signalna sekvenca, sekvenca aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 je varijabilni region, i sekvenca aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 142 do 465 je konstantni region. Dalje, u lakom lancu sekvenca aminokiselina predstavljena sa SEQ ID NO: 10 u Listi Sekvenci, sekvenca aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 1 do 19 jc signalna sekvenca, sekvenca aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 133 je varijabilni region, i sekvenca aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 134 do 238 je konstantni region.

[0075]Sekvenca aminokiselina teškog lanca predstavljena sa SEQ ID NO: 8 u Listi Sekvenci je kodirana nukleotidnom sekvencom predstavljenom sa SEQ ID NO: 7 u Listi Sekvenci. U nukleotidnoj sekvenci predstavljenoj sa SEQ ID NO: 7 u Listi Sekvenci, nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 1 do 57 kodira signalnu sekvencu antitela, nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 58 do 423 kodira težak lanac varijabilnog regiona antitela, i nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 424 do 1395 kodira težak lanac konstantnog region antitela.

[0076]Sekvenca aminokiselina lakog lanca predstavljena sa SEQ ID NO: 10 u Listi Sekvenci je kodirana nukleotidnom sekvencom predstavljenom sa SEQ ID NO: 9 u Listi Sekvenci. U nukleotidnoj sekvenci predstavljenoj sa SEQ ID NO: 9 u Listi Sekvenci, nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 1 do 57 kodira lak lanac signalne sekvence antitela, nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 58 do 399 kodira lak lanac varijabilnog regiona antitela, i nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 400 do 714 kodira lak lanac konstantnog regiona antitela.

(g)Priprema monoklonskiog antitela kutivisanjem hibridoma

[0077]Kutivisanjem tako izabranog hibridoma, monoklonsko antitelo može biti efikasno dobijeno. Međutim, pre kultivisanja, poželjno je da se izvrši skrining hibridoma koji prozvodi ciljno monoklonsko antitelo.

[0078]U takvom skriningu, poznata metoda može biti korišćena.

[0079]Merenje titra antitela u predmetnom pronalasku kmože biti izvedeno pomoću, na primer, ELISA Metode koja je objašnjena pod (b), kako je gore opisano.

[0080]Hibridom dobijen metodom opisanom gore može biti čuvan u zamrznutom slanju u tečnom azotu ili u zamrzivaču na -80°C ili manje.

[0081]Nakon završetka kloniranja, medijum je promenjen od HT medijuma do normalnog medijuma, i hibridom je kultivisan.

[0082]Kultivisanje na velikoj skali je izvedeno pomoću rotirajuće kulture korišćenjem velike flaše za kulturu ili kulture koja se mesa. Od supernatanta koji je dobijen iz kulture na velikoj skali, monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za protein predmetnog pronalaska može biti dobijeno prečišćavanjem korišćenjem Metoda koje su poznate poznavaocima ove oblasti kao Što je gel filtracija. (0083]Dalje, hibridom je injekcioniran u abdominalnu Šupljinu miša istog soja kao što je hibridom (na primer, gore opisani BALB/c) ili Nu/Nu miš kako bi proliferisao do hibridoma, pri čemu ascites koji sadrži veliku količinu monoklonskog antitela predmetnog pronalaska može biti dobijen.

[0084]U slučaju kada je hibridom adminislriran u abdominalnu šupljinu, ukoliko je mineralno ulje kao što je 2,6,10,14-tetrametil pentadekan (pristan) administrirano pre (3 do 7 dana pre) administracije hibridoma, velika količina ascitesa može biti dobijena.

[0085]Na primer, imunosupresant je prethodno injekcioniran u abdominalnu šupljinu miša istog soja kao što je hibridom kako bi se inaktivirale T ćelije. 20 dana posle toga, IO<6>do IO<7>klonskc ćelije hibridoma su suspendovane u medijumu bez seruma (0.5 ml), i suspenzija je injekcionirana u abdominalnu šupljinu miša. UopŠteno, kada je abdomen proširen i ispunjen sa ascitesom, ascites je sakupljen iz miša. Ovom metodom, monoklonsko antitelo može biti dobijeno na koncentraciji koja jc oko 100 puta ili više veća od one u rastvoru kulture.

[0086]Monoklonsko antitelo dobijeno gore opisanom metodom može biti prečišćeno meotodom opisanom u, na primer, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunologv Vol.I,II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).

[0087]Tako dobijeno monoklonsko antitelo ima visoku antigensku specifičnost za DR5.

(h) Test monoklonskog antitela

[0088]Izotip i podklasa tako dobijenog monoklonskog antitela može biti određena kao što sledi.

[0089]Prvo, primeri metoda za identifikaciju uključuju Ouchterlonv metodu, ELISA Meotodu i RIA metodu.

[0090]Ouchterlonv metoda je jednostavna, ali kada je koncentracija monoklonskog antitela niska, kondenzacija je neophodna.

[0091]Sa druge strane, kada je ELISA metoda ili RIA metoda korišćena, direktnom reakcijom supernatanta kulture sa čvrstom fazom sa adsorbovanim antigenom i korišćenjem antitela koja odgovaraju različitim tipovima izotipova imunoglobulina i podklasa kao sekundarnih antitela, izotip i podklasa monoklonskog antitela može biti identifikovana.

[0092]Dodatno, kao jednostavnija metoda, komercijalno dostupni identifikacioni kit (na primer, Miš Typer Kit koji proizvodi Bio-Rad Laboratories, Inc.) ili slično može takođe biti korišćen.

[0093]Dalje, kvantitativno određivanje proteina može biti izvedeno po Folin Lowry metodi i metodi kalkulacije koja se bazira na absorbanci na 280 nm [1.4 (OD 280) = Imunoglobulin 1 mg/mlj.

[0094]Dalje, čak kada je monoklonsko antitelo odvojeno i nezavisno dobijeno izvođenjem ponovo koraka (a) do (h) u gornjem (2), moguće je dobiti antitelo koje ima citotoksičnu aktivnost ekvivaletnu sa B273. Kao jedan primer takvog antitela, antitelo koje se vezuje sa isti epitop kao B273 antitelo može biti navedeno kao primer. Ukoliko se novo proizvedeno monoklonsko antitelo veže za parcijalni peptid ili parcijalnu tercijernu strukturu za koju se B273 antitelo veže, može biti određeno da se to monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao B273 antitelo. Dalje, potvrđivanjem da se monoklonsko antitelo takmiči sa B273 antitelom za vezivanje za DR5 (to je, monoklonsko antitelo inhibira vezivanje između B273 antitela i DR5), može biti određeno da se to monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao B273 antitelo čak i ukoliko specifična sekvenca epitopa ili struktura nije određena. U slučaju gde se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao B273 antitelo, izrazito se očekuje da monoklonsko antitelo ima citotoksičnu aktivnost ekvivalentnu sa B273.

[0095]Dalje, kao što je pokazano u primeru 4, moguće je tačno oderediti aminokiselinski ostatak na strani DR5 koji je lociran susedno Fab fragmentu antitela na osnovu podataka đobijenih diffrakcijom X-zraka kompleksa između Fab fragmenta i DR5. Specifično, u slučaju gđe je Fab fragment koji je dobijen dobijen iz proizvoljnog antitela lociran susedno glicin ostatku na položaju 26, izoleucin ostatku na položaju 34, ostatku glutaminske kiseline na položaju 36, ostatku asparaginske kiselinena položaju 37, glicin ostatku na položaju 38, ostatku asparaginske kiseline na položaju 56, leucin ostatku na položaju 57, leucin ostatku na položaju 58, fenilalanin ostatku na položaju 59, leucin ostatku na položaju 61, i arginin ostatku na položaju 62 sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 23 u Listi Sekvenci, na rastojanju od 4 A ili manje, može biti određeno da antitelo ima specifičnost za isti epitop kao B273.

(3)Druga antitela

[0096]Antitelo predmetnog pronalaska uključuje ne samo gore opisano monoklonsko antitelo na DR5 ali takođe rekombinantno antitelo dobijeno veštačkom modifikacijom u cilju smanjenja hcterologe antigenosti kod ljudi kao sto je himerno antitelo, humanizovano antitelo i humano antitelo. Ova antitela mogu biti proizvedena korišćenjem poznate metode.

[0097] Kao himerno antitelo, antitelo u kome su varijabilni i konstantni regioni antitela dobijeni od različitih vrsta, na primer, himerno antitelo u kome jc varijabilni region antitela dobijen od miša ili pacova vezan za konstantni region dobijen iz čoveka može biti navedeno kao primer (videti Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81. 6851-6855, (1984)). Himerno antitelo dobijeno od mišjeg anti-humanog DR5 antitela B273 je antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 20 i lak lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 16, i može imati proizvoljni konstantni region. Kao jedan primer takvog himernog antitela, antitelo koji sadrži težak lanac koji ima sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci i lak lanac koji ima sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 16 može biti navedeno kao primer. Slučajno, u sekvenci teškog lanca koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci, sekvenca amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 1 do 19 je signalna sekvenca, sekvenca amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 je varijabilni region, a sekvenca amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 142 do 471 je konstantni region. Dalje, u sekvenci aminokiselina lakog lanca koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 16 u Listi Sekvenci, sekvenca amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 1 do 20 je signalna sekvenca, sekvenca amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 je varijabilni region, a sekvenca amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 135 do 239 je konstantni region.

[0098] Sekvenca aminokiselina teškog lanca predstavljena sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci je kodiranaa nukleotidnom sekvencom predstavljenom sa SEQ ID NO: 19 u Listi Sekvenci. U nukleotidnoj sekvenci predstavljenoj sa SEQ ID NO: 19 u Listi Sekvenci, nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 1 do 57 kodira težak lanac signalne sekvence antitela, nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 58 do 423 kodira varijabilni region teškog lanca antitela, a nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 424 do 1413 kodira konstantni region teškog lanca antitela.

[0099] Sekvence aminokiselina lakog lanca predstavljena sa SEQ ID NO: 16 u Listi Sekvenci je kodirana nukleotidnom sekvencom koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 15 u Listi Sekvenci. U nukleotidnoj sekvenci predstavljenoj sa SEQ ID NO: 15 u Listi Sekvenci, nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide l do 60 kodira lak lanac signalne sekvence antitela, nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 kodira varijabilni region lakog lanca antitela, a nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 403 do 717 kodira konstantni region lakog lanca antitela.

[0100]Kao humanizovano antitelo, antitelo dobijeno integrisanjem samo regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) u antitelo dobijeno od čoveka (videti Nature (1986) 321, str. 522-525), i antitelo dobijeno ubacivanjem dela aminokiselinskih ostataka okvira kao i CDR sekvenci u humano antitelo pomoću CDR-grafting metode (WO 90/07861) može biti navedeno kao primer.

[0101]Međutim, humanizovano antitelo dobijeno od B273 antitela nije ograničeno na specifično humanizovano antitelo sve dok humanizovano antitelo ima svih 6 tipova CDR sekvenci B273 i poseduje aktivnost indukcije apoptoze u ćelijama. Slučajno, varijabilni region teškog lanca B273 antitela ima CDRH1 (GYFMN) koji se sastoji od sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 82 u Listi Sekvenci, CDRH2 (RFNPYNGDTFYNQKFKG) koji se sastoji od sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 83, i CDRH3 (SAYYFDSGGYFDY) koji se sastoji od sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 84. Dalje, varijabilni region lakog lanca B273 antitela ima CDRL1 (RSSQSLVHSNGNTYLH) koji se sastoji od sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 79 u Listi Sekvenci, CDRL2 (KVSNRFS) koji se sastoji od sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 80, i CDRL3 (SQSTHVPWT) koji se sastoji od sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 81.

[0102]Dalje, sekvenca uključujući supstituciju, deleciju, ili adiciju jedne do nekoliko aminokiselinskih ostataka u gore opisanim CDR regionima može biti korišćena kao CDR sekvenca koju poseduje CDR-modifikovano antitelo dobijeno od B273 antitela. Primeri sekvence uključujući supstituciju jednog aminokiselinskog ostatka u CDRL1 uključuju sekvencu (RSSQSLVHSNENTYLH) koja se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 85 u Listi Sekvenci, sekvencu (RSSQSLVHSNFNTYLH) koja se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 86, sekvencu (RSSQSLVHSNKNTYLH) koja se sastoji od sekvence aminokiselina koja jc predstavljena sa SEQ ID NO: 87, i sekvencu (RSSQSLVHSNLNTYLFI) koja se sastoji od sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 88. Dalje, primeri sekvence uključujući supstituciju jednog aminokiselinskog ostatka u CDRH2 uključuju sekvencu

(RFNPYNEDTFYNQKFKG) koja se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 89.

[0103)Uopšteno, deamidacija asparagina u proteinu dovodi do formiranja tranzicionog stanja cikličnog sukcinimida između asparagina i suseđne aminokiseline na C-terminalnoj strani (Geiger, T. and Clarke, S. (1987) Deamidation, Isomerization, and racemization at asparaginvl and aspartyl residues in peptides. Sukcinimid-povezane reakcije koje doprinose degradaciji proteina. J. Biol. Chem. 262, 785-794). Ograničavajući faktor za formiranje tranzicionog stanja cikličnog sukcinimida je veličina bočnog lanca susedne aminokiseline, i stoga, glicin koji ima najmanji bočni lanac može da postigne najbržu deamidaciju. Sa druge strane, supstitucijom susedne grupe na C-terminalnoj strani sa aminokiselinom koja ima veliki bočni lanac, deamidacija može biti potisnuta. B273 antitelo ima -N-G- (asparagin-glicin) sekvencu koja je podložna deaminaciji u oviru CDRL1 i CDRH2. Stoga, pronalazači su proizveli mutante koji nose tačkastu mutaciju u kojima je susedna grupa promenjena iz glicina u lizin, fenilalanin, leucin, ili glutaminsku kiselinu, od koji svaka ima veći bočni lanac od glicina. To je, u CDRH2, -N-G-(asparagin-glicin) sekvenca je mutirana u -N-E-(asparagin-glutaminska kiselina) sekvencu, a u CDRL1, -N-G-(asparagin-gHcin) sekvenca je mutirana u-N-L-(asparagin-leucin) sekvencu, -N-F-(asparagin-fenilalanin) sekvencu, -N-K-(asparagin-Iizin) sekvencu, ili -N-E- (asparagin-glutaminska kiselina) sekvencu, pri čemu je deamidacija antitela potisnuta.

[0104]Kao primer antitela koje ima gore opisane CDR regione, antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 82 u Listi Sekvenci, CDRH12 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 83, i CDRH3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 84, i varijabilni region lakog lanca koji ima CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 79 u Listi Sekvenci, CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 80. i CDRL3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 81; antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 82 u Listi Sekvenci, CDRH2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 89, i CDRH3 koji se sastoji od sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 84, i varijabilni region lakog lanca koji ima CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 85 u Listi Sekvenci, CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 80, i CDRL3 koji sc sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 81; antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 82 u Listi Sekvenci. CDRH2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 89, i CDRH3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 84, i varijabilni region lakog lanca koji ima CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 86 u Listi Sekvenci, CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 80, i CDRL3 koji sc sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 81; antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 82 u Listi Sekvenci, CDRH2 koji se sastoji od sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 89, i CDRH3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 84, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 87 u Listi Sekvenci, CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 80, i CDRL3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 81; i antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 82 u Listi Sekvenci, CDRH2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 89, i CDRH3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 84, i varijabilni region lakog lanca koji ima CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 88 u Listi Sekvenci. CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 80, i CDRL3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina predstavljena sa SEQ ID NO: 81 može biti navedeno kao primer.

[0105] Kao primer humanizovanog antitela mišjeg antitela B273 (uključujući CDR-modifikovano antitelo), proizvoljna kombinacija teškog Čanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, i 70 u Listi Sekvenci sa lakim lancem koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 28, 30, 32, 52, 58, 62, i 66 može biti navedena kao primer.

[0106] Kao stoje ovde stavljeno na uvid javnosti, antitelo može biti naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 34 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 34 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 30; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 34 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 32; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 30; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 32; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 30; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 32; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 40 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEO ID NO: 42 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 44 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 46 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 48 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 50 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 70 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 52; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 70 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 58; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 70 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 62; i antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 70 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 66 može biti navedeno kao primer.

[0107| Kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti, antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 34 i lak

lanac koji ima sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 đo 471 od SEQ ID NO: 34 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 30; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 34 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 32; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 36 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 36 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 30; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 36 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 32; antitelo koje sadrži težak lanac koji ima sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 38 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 38 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 30; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 38 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 32; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 40 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 42 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji ima sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 44 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 46 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od

SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 48 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 50 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 70 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 52; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 70 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 58; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 70 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 62; i antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 70 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 66 može biti navedeno kao primer.

[0108] Kao dalja poželjnija kombinacija, antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 42 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 28; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 70 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 52; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 70 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 58; antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 70 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 62; i antitelo naznačeno time da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 70 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 od SEQ ID NO: 66 može biti navedeno kao primer.

[0109]Kao najpoželjnija kombinacija, antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 42 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 28; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 70 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 52; antitelo koji sadrži teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 70 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 58; antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 70 i lak lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 62: i antitelo koje sadrži težak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 471 od SEQ ID NO: 70 i lak lanac koji sadrži sekvencu amino kiselina koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 od SEQ ID NO: 66 može biti navedeno kao primer.

[0110]Kombinovanjem sekvence koja poseduje visoku homologiju sa gore opisanom sekvencom aminokiselina teškog lanca sa sekvencom koja poseduje visoku homologiju sa gore opisanom sekvencom aminokiselina lakog lanca, moguće jc izabrati antitelo koje ima citotoksičnu aktivnost ekvivalentnu svakom od gore opisanih antitela. Homologija je uopšteno homologija od 80% ili više, poželjno homologija od 90% ili više, poželjnije homologija od 95% ili više, najpoželjnije homologija od 99% ili više. Dalje, kombinovanjem sekvence amino kiselina koja uključuje supstituciju, deleciju, ili adiciju jedne do nekoliko aminokiselinskih ostataka u teškom lancu ili lakom lancu sekvence aminokiselina, takođe je moguće izabrati antitelo koje ima citotoksičnu aktivnost ekvivalentnu svakom od gore opisanih antitela. Broj aminokiselinskih ostataka koje treba supstituisati, ukloniti, ili dodati je uopšteno 10 ili manje, poželjno 5 do 6 ili manje, poželjnije 2 do 3 ili manje, najpoželjnije 1.

[0111JHomologija između dve sekvence aminokiselina može biti određena korišćenjem Blast algoritma, verzija 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, i David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new genration of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) sa uobičajenim parametrima. Blast algoritam može takođe biti

korišćen preko Interneta putem sajta www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Slučajno, dva tipa procenata vrednosti identiteta (ili više identiteta) i pozitivnosti (ili više pozitivnosti) je računato Blast algoritmom. Prvo je vrednost kada se aminokiselinski ostaci poklapaju jedan sa drugim u dve sekvence aminokiselina za koje stepen homologije treba da sc bude određen, a poslednje je vrednost dobijena takođe razmatranjem aminokiselinskih ostataka koji imaju sličnu hemijsku strukturu. U ovoj specifikaciji, vrednost identiteta kada se aminokiselinski ostaci poklapaju jedan sa drugim je korišćena kao vrednost homologije.

[0112]Slučajno, u sekvenci teškog lanca aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, ili 70 u Listi Sekvenci, sekvenca aminokiselina koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 19 je signalna sekvenca, sekvenca amino kiselina koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 141 je varijabilni region, i sekvenca aminokiselina koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 142 do 471 je konstantni region. Dalje, u sekvenci aminokiselina lakog lanca koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 28, 30, 32, 52, 58, 62, ili 66 u Listi Sekvenci, sekvenca amino kiselina koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 20 je signalna sekvenca. sekvenca amino kiselina koja sc sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 134 je varijabilni region, i sekvenca amino kiselina koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 135 do 239 je konstantni region.

[0113]Sekvenca aminokiselina teškog lanca koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, ili 70 u Listi Sekvenci je kodirana nukleotidnom sekvencom koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, ili 69 u Listi Sekvenci. U svakoj od gornjih nukleotidnih sekvenci, nukleotidna sekvenca koji se sastoji od nukleotida 1 do 57 kodira signalnu sekvencu teškog lanca antitela, i nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida 58 do 423 kodira varijabilni region teškog lanca antitela, a nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida 424 do 1413 kodira konstantni region teškog lanca antitela.

[0114]Sekvenca aminokiselina lakog lanca koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 28, 30, 32, 52, 58, 62, ili 66 u Listi Sekvenci je kodirana nukleotidnom sekvencom koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 27. 29, 31, 51. 57. 61, ili 65 u Listi Sekvenci. U svakoj od gornjih nukleotidnih sekvenci, nukleotidna sekvenca koja se sastoji od nukleotida 1 do 60 kodira signalnu sekvencu lakog lanca antitela, i nukleotidna sekvenca koji se sastoji od nukleotida 61 do 402 kodira varijabilni region lakog lanca antitela, a nukleotidna sekvenca koji se sastoji od nukleotida 403 do 717 kodira konstantni region lakog lanca antitela.

[0115]Homologija između bilo koje od ovih nukleotidnih sekvenci i nukleotidne sekvence drugog antitela može takođe biti određena korišćenjem Blast algoritma.

[0116]Dalje, antitelo predmetnog pronalaska uključuje humano antitelo koje se vezuje za isti epitop kao B273 antitelo, gde je humano anititelo naznačeno time da sekvenca teškog lanca sadrži varijabilni region koji sadrži CDRH1, CDRH2. i CDRH3, i CDRH1 sadrži sekvencu amino kiselina koja je predstavljena sa SHQ ID NO: 82. CDRH2 sadrži bilo koju od sekvenci aminokiselina koje su predstavljene sa SEQ ID NO: 89 i 83, i CDRH3 sadrži sekvencu amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 84; i sekvenca lakog lanca sadrži varijabilni region koji sadrži CDRL1, CDRL2, i CDRL3, i CDRL1 sadrži bilo koju od sekvenci aminokiselina koje su predstavljene sa SEQ ID NO: 87, 85, 86, 88 i 79, CDRL2 sadrži sekvencu amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO; 80, i CDRL3 sadrži sekvencu amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 81, ili funkcionalni fragment antitela koji poseduje antigen-vezujuću aktivnost. Humano anti-DR5 antitelo se odnosi na humano antitelo koje samo poseduje gensku sekvencu antitela dobijenu od humanog hromozoma. Humano anti-DR5 antitelo može biti dobijeno metodom uz korišćenje miša koji proizvodi humano antitelo koji sadrži humani hromozomski fragment sa genima teškog i lakog lanca humanog antitela (videti Tomizuka, K. et al.. Nature Gentics (1997) 16, str. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Kiseline Res. (1998) 26, str. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technologv: Basic and Applied Aspects vol. 10, str. 69-73 (Kitagavva, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluvver Acadcmic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, str. 722-727, itd.). [01171Takav miš koji proizvodi humano antitelo može biti kreiran specifično kao što sledi. Genetski modifikovana životinja kod koje je endogeni genski lokus teškog i lakog lanca imunoglobulina prekinut, i umesto njega, genski lokus teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina uveden putem veštačkog hromozoma kvasca (ycast arteficial chromosome-YAC) vektor ili slično je kreiran pravljenjem "knockout" životinje i transgene životinje i parenjem ovih životinja. [01181Dalje, prema tehnici genetskog inženjeringa, korišćenjem cDNK koja kodira takav težak lanac i lak lanac humanog antitela, redom, i poželjno vektor koji sadrži cDNK, eukariotske ćelije su transformisane, i transformant koji proizvodi rekombinantno humano monoklonsko antitelo je kultivisan, pri čemu antitelo može takođe biti dobijeno iz supematanta kulture.

[0119]Ovde, kao domaćin, na primer, eukariotske ćelije, poželjno ćelije sisara kao Što su CHO ćelije, limfociti ili mijeloma ćelije mogu bili korišćene.

[0120]Dalje, metoda za dobijanje humanog antitela dobijenog ispoljavanjem na fagima skriningom iz biblioteke humanih antitela (videti Wormstone. I. M. ct al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7). str. 2301-2308; Carmen, S. el al.. Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), str. 189-203; Sirivvardcna, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), str. 427-431, elc.) je takođe poznata.

[0121]Na primer, metoda ispoljavanja na fagima u kojoj je varijabilni region humanog antitela eksprimiran na površini faga kao jednolančano antitelo (scFv), i fag koji se vezuje za antigen izabran (Nature Biotechnology (2005). 23, (9). str. 1105-1116) može biti korišćena.

[0122]Analiziranjem gena faga izabranog na osnovu vezivanja za antigen, DNK sekvenca koja kodira varijabilni region humanog antitela koja se vezuje za antigen može biti određena.

[0123]Ukoliko je DNK sekvenca scFv koja se vezuje za antigen određena, humano antitelo može biti dobijeno pripremanjem ekspresionog vektora koji sadrži sekvencu i uvođenjem tog vektora u odgovarajućeg domaćina da ga eksprimira (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438. WO 95/15388. Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, str. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), sir. 1105-1116).

[0124]Ukoliko se novo proizvedeno humano antitelo veže za parcijalni peptid ili parcijalnu tercijernu strukturu za koju se vezuje B273 antitelo, može biti otvrđeno da se humano antitelo i B273 antitelo vezuju za isti epitop. Dalje, potvrđivanjem da se human antitelo takmiči sa B273 antitelom za vezivanje za DR5 (to je, humano antitelo inhibira vezivanje između B273 antitela i DR5), može biti otvrđeno da se humano antitelo i B273 antitelo vezuju za isti epitop Čak i ukoliko specifična sekvenca epitopa ili struktura nije određena. Kada je potvrđeno da se humano antitelo i B273 antitelo vezuju za isti epitop, jako se očekuje da humano antitelo poseduje citotoksičnu aktivnost ekvivalentnu B273.

[0125]Dalje, kao što je pokazano u primeru 4. moguće je odrediti aminokiselinski ostatak na strani DR5 koji je susedan Fab fragmentu antitela na osnovu podataka dobijenih difrakcijom X-zraka kompleksa između Fab fragment i DR5. Specifično, u slučaju gde je Fab fragment dobijen od proizvoljnog antitela lociran susedno glicin ostatku na položaju 26, izoleucin ostatku na položaju 34, ostatku glutaminske kiseline na položaju 36, ostatku asparaginske kiseline na položaju 37, glicin ostatku na položaju 38. ostatku asparaginske kiseline na položaju 56, leucin ostatku na položaju 57, leucin ostatku na položaju 58. fenilalanin ostatku na položaju 59, leucin ostatku na položaju 61, i arginin ostatku na položaju 62 sekvence amino kiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 23 u Listi Sekvenci, na rastojanju od 4 A ili manje, može biti određeno da se to antitelo vezuje za isti epitop kao B273. (0126]Himerna antitela, humanizovana antitela, ili humana antitela dobijcna gore opisanom metodom su procenjena na osnovu osobine vezivanja za antigen putem metode koja je prikazana u Primeru 3 ili slično, i poželjno antitelo može biti izabrano. Kao jedan primer drugog indeksa za primenu u poređenju karakteristika antitela, stabilnost antitela može biti navedena kao primer. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) prikazana u Primeru 10 je uređaj koji omogućava brzo i tačno merenje srednje temperatura termalne denaturacije (Tm) koji je korišćen kao pogodan indeks relativne konformacione stabilnosti protina. Merenjem Tm vrednosti korišćenjem DSC i poređenjem ovih vrednosti, razlika u termalnoj stabilnosti može biti poređena. Poznato je da stabilnost čuvanja antitela pokazuje u određenoj meri korelaciju sa termalnom stabilnosti antitela (Lori Burton, et. al.. Farmaceutskoj Development and Technologv (2007) 12, str. 265-273), i poželjno antitelo može biti izabrano korišćenjem termalne stabilnosti kao indeksa. Primeri drugih indeksa za izbor antitela uključuju sledeće faktore: prinos u odgovarajućoj ćeliji domaćinu je visok i agregacija u vodenom rastvoru je niska. Na primer, antitelo koje pokazuje najveći prinos ne pokazuje uvek najveću termalnu stabilnost, i stoga, neophodno je izabrati antitelo koje je najpogodnije za administraciju kod ljudi izvođenjem sveobuhvatne procene na osnovu gore opisanih indeksa.

[0127]Dalje, metoda u kojoj su celokupne sekvence teškog i lakog lanca antitela povezane korišćenjem odgovarajućeg veznika, pri čemu je dobijen jednolančani imunoglobulin je takođe poznata (Lee, H-S, et. al., Molecular Immunologv (1999) 36, str. 61-71; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) str. 1-4). Dimerizacijom takvog jednolančanog imunoglobulina, rezultujući dimer može imati strukturu i aktivnost sličnu onoj kod antitela koje je tetramer samo po sebi. Dalje ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje poseduje jedan varijabilni region teškog lanca i nema sekvencu lakog lanca. Takvo antitelo se naziva antitelo sa jednim domenom (sdAb) ili nanoantitelo, i u stvari, takvo antitelo je primećeno kod kamila i lama i pokazano je da poseduje antigen-vezujući afinitet (Muyldemans S. et. al.. Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). Gore opisana antitela su uključena u antitelo prema predmetnom pronalasku.

[0128JDalje, kontrolom glikozilacije kojom se glikan vezuje za antitelo predmetnog pronalaska, moguće je unaprediti citotoksičnu aktivnost koja zavisi od antitela. Kao tehnika

za kontrolisanje glikozilacije antitela, WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, itd. Su poznali. Međutim, nije time ograničena.

[0129]U slučaju gde je antitelo proizvedeno prvo izolovanjem gena antitela i onda uvođenjem gena u odgovarajućeg domaćina, kombinacija odgovarajućeg domaćina i odgovarajućeg ekspresionog vektora može biti korišćena. Specifični primeri gena antitela uključuju kombinaciju gena koji kodiraju sekvencu teškog lanca antitela koja je opisana u ovoj specifikaciji i gena koji kodiraju sekvencu lakog lanca tog antitela. Kada je ćelija domaćina transformisana, moguće je insertovati gen sekvence teškog lanca i sekvence lakog lanca u isti ekspresioni vektor, i takođe u različite ekspresione vektore odvojeno. U slučajevima kada su eukariotske ćelije korišćene kao domaćin, ćelije životinja, ćelije biljaka, i eukariotski mikroorganizmi mogu biti korišćeni. Kao ćelije životinja, (1) ćelije sisara, na primer, sojevi sa deficijentnom dihidrofolat reduktazom (Urlaub. G. i Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, str. 4126-4220) COS ćelija majmuna (Gluzman, Y., Cell,

(1981) 23, str. 175-182, ATCC CRL-1650), mišji fibroblasti NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), i ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO ćelije; ATCC: CCL-61) mogu biti navedeno kao primer. Dalje, u slučaju gde su prokariotske ćelije korišćene, na primer, Escherichia coli i Bacillus subtilis mogu biti navedene kao primer. Uvođenjem ciljnog gena antitela u ove ćelije putem transformacije, i kultivisanjem tako transformsanih ćelija in vitro, antitelo može biti dobijeno. U gore opisanoj metodi za kultivisanjc, prinos može da varira u zavisnosti od sekvence antitela, i stoga, moguće je izabrati antitelo koje je lako proizvedeno kao farmaceutski preparat korišćenjem prinosa kao indeksa između antitela koja imaju sličnu aktivnost vezivanja.

[0130]Ne postoji ograničenje u vezi sa izotopom antitela predmetnog pronalaska, i njegovi primeri uključuju IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgAl, IgA2), IgD, u IgE. a poželjni primeri uključuju IgG i IgM, i dalji poželjniji primeri uključuju IgGl i lgG2.

[0131]Dalje, antitelo predmetnog pronalaska može biti funkcionalni fragment antitela koji poseduje antigen-vezujuće mesto antitela ili njegov modifikovani fragment. Fragment antitela može biti dobijen tretiranjem antitela sa proleazom kao što je papain ili pepsin, ili modifikovanjem gena antitela prema tehnici genetskog inženjeringa i ekspresijom modifikovanog gena u pogodnim kultivisanim ćelijama. Među ovim fragmentima antitela, fragment koji ima sve ili delimične funkcije celokupnog molekula antitela može biti nazvan funkcionalni fragment antitela. Kao funkcije antitela, uopšteno antigen-vezujuća aktivnost, aktivnost neutralizacije aktivnosti antigena, aktivnost povećanja aktivnosti antigena, citotoksična aktivnost koja zavisi od antitela, citotoksična aktivnost koja zavisi od komplemcnta. i ćelijska citotoksična aktivnost koja zavisi od kompiementa može biti navedena kao primer. Funkcija funkcionalnog fragmenta antitela prema predmetnom pronalasku je aktivnost vezivanja za DR5, poželjno aktivnost indukcije apoptoze u ćelijama, poželjnije citotoksična aktivnost putem indukcije apoptoze u kancer ćelijama. Međutim, antitelo predmetnog pronalaska može imati citotoksičnu aktivnost koja zavisi od antitela, citotoksičnu aktivnost koja zavisi od kompiementa, i/ili ćelijsku citotoksičnu aktivnost koja zavisi od kompiementa kao i aktivnost indukcije apoptoze u ćelijama.

[0132] Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, F(ab')2, Fv, jednolančani Fv (scFv) u kome su Fv molekuli teškog lanca i lakog lanca povezani preko odgovarajućeg veznika, dimernog fragmenta antitela (đimernih fragmenata antitela), linearnog antitela, i polispecifičnog antitela koje se sastoji od fragmenta antitela. Dalje, Fab' koji je monovalentni fragment u varijabilnom regionu antitela dobijen tretiranjem F(ab')2 pod redukcionim uslovima je takođe uključujen u fragmentu antitela.

[0133]Dalje, antitelo predmetnog pronalaska može biti polispecifično antitelo sa specifičnosti za najmanje dva različita antigena. Uopšteno, takav molekul se vezuje za dva antigena (to je, bispecifično antitelo), međutim, termin "polispecifično antitelo" kao što je ovde korišćeno uključuje antitelo koje poseduje specifičnost za dva ili više (na primer, tri) antigena.

[0134]Polispecifično antitelo predmetnog pronalaska može biti celokupno antitelo ili fragment takvog antitela (na primer, F(ab')2 bispecifično antitelo). Bispecifično antitelo može biti proizvedeno povezivanjem teških i lakih lanaca (HL parova) dva tipa antitela, ili može takođe biti proizvedeno korišćenjem hibridoma koji proizvode različita monoklonska antitela kako bi se pripremile fuzionisane ćelije koje proizvode bispecifična antitela (Millstein et al., Nature (1983) 305, str. 537-539).

[0135]Antitelo predmetnog pronalaska može biti jednolančano antitelo (takođe nazvano scFv). Jednolančano antitelo može biti dobijeno povezivanjem varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca antitela preko polipeptidnog veznika (Pluckthun, The Pharmacologv of Monoclonal Anlibodv, 113 (edited by Rosenburg and Moore), Springer Verlag, New York, str. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, str. 1126-1136). Dalje, BiscFv fragment proizveden povezivanjem dva scFv molekula preko polipeptidnog veznika može takođe biti korišćen kao bispecifično antitelo. [0136jMetoda za proizvodnju jednolančanog antitela je poznata u ovoj oblasti tehnike (videti, na primer, američke patente sa brojevima. 4. 946. 778, 5,260,203, 5.091,513. 5,455,030, itd.). U ovom scFv, varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca su povezani preko veznika koji ne formira konjugat, poželjno preko polipeptidnog veznika (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85. str. 5879-5883). U ovom scFv, varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca mogu biti dobijeni od istog antitela ili različitog antitela.

[0137]Kao veznik polipeptida koji se koristi za povezivanje varijabilnih regiona, dati jednolančani peptid koji se sastoji od 12 do 19 ostataka je korišćen, na primer.

[0138]DNK koja kodira scFv može biti dobijena izvođenjem amlifikacije korišćenjem DNK koja kodira čitavu sekvencu aminokiselina ili željenu parcijalnu sekvencu aminokiselina DNK koja je izabrana od DNK koja kodira težak lanac ili varijabilni region teškog lanca gore opisanog antitela i DNK koja kodira njegov lak lanac ili varijabilni region lakog lanca kao uzorak putem PCR metoda korišćenjem para prajmera koji defmiše oba njegova kraja, i dalje izvođenjem amlifikacije kombinovanjem DNK koja kodira polipeptidni vezni deo i par prajmera koji definiše oba njegova kraja tako da poveže oba kraja sa teškim lancem i lakim lancem, redom.

[0139]Dalje, jednom kada je scFv kodiran pomoću DNK proizveden, ekspresioni vektor koji sadrži isti i domaćin transformisan sa ekspresionim vektorom može biti dobijen prema uobičajenoj proceduri. Dalje, korišćenjem dobijenog domaćina, scFv može biti dobijen prema uobičajenoj proceduri. Njegov fragment antitela može biti proizveden u domaćinu dobijanjem gena i ekspresi jom gena na isti način kao što je gore opisano.

[0140]Antitelo predmetnog pronalaska može biti multimerizovano kako bi se povećao afinitet za antigen. Antitelo koje je multimerizovano može biti jedan tip antitela ili mnoštvo antitela koja prepoznaju mnoštvo epitopa istog antigena. Kao metoda za multimerizaciju antitela, vezivanje IgG CH3 domena za dva scFv molekula, vezivanje za streptavidin, uvođenje heliks-zavoj-heliks motiva može biti navedeno kao primer.

[0141]Antitelo može biti poliklonsko antitelo koje je smeša različitih tipova anti-DR5 antitela koja imaju različitu sekvencu aminokiselina. Kao jedan primer poliklonskog antitela, smeša različitih tipova antitela koja imaju različit CDR može biti navedena kao primer. Kao takvo poliklonsko antitelo, antitela dobijena kultivisanjem smeše ćelija koje proizvode različita antitela i onda prečišćavanjem antitela iz rezultujuće kulture mogu biti korišćena (videti WO 2004/061104).

[0142]Kao modifikovano antitelo, antitelo koje jc vezano za bilo koji od različitih tipova molekula kao što je polietilen glikol (PFG) može takođe biti korišćen.

[0143]Dalje, antitelo predmetnog pronalaska može biti u obliku konjugata koji je formiran između bilo kojeg od ovih antitela i drugih medicinskih agenasa (imunokonjugat). Primeri takvog antitela uključuju onaj u kome je antitelo konjugovano sa radioaktivnim materijalom ili jedinjenje koje poseduje farmakološko dejstvo (Nature Biotechnologv (2005) 23, str. 1137-1146).

[0144]Dobijeno antitelo može biti prečišćeno do homogenosti. Izolovanje i prečišćavanje antitela može biti izvedeno korišćenjem metoda za konvencionalno izolovanje proteina i prečišćavanje. Na primer, antitelo može biti izolovano i prečišćeno odgovarajućim izborom i kombinovanjem hromatografije na koloni, filter filtracije, ultrafiltracije, precipitacije soli, dijalize, preparativne poliakrilamiđ gel elektroforeze, elektroforeze sa izoelektričnim fokusiranjem, i slično (Strategies for Protein Purification anđ Characterizalion; A Laboratorv Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds.. Cold Spring Harbor Laboratorv Press (1996); Antibodies: A Laboratorv Manual. Ed Harlovv and David Lane. Cold Spring Harbor Laboratorv (1988)), ali metoda nije time ograničena.

[0145]Primeri takve hromatografije uključuju afinitetnu hromatografiju, hromatografiju sa jonskom izmenom, hidrofobnu hromatografiju, hromatografiju sa gel filtracijom, hromatografiju reverznih faza, i adsorpcionu hromatografiju.

[0146]Takva hromatografija može biti izvedena korišćenjem tečne hromatografije kao što je HPLC ili FPLC.

[0147]Kao kolona koja treba da bude korišćena u afinitetnoj hromatografiji. Protein A kolona i Protein G kolona može biti navedena kao primer.

[0148]Na primer, kolona koja koristi Protein A kolonu, Hyper D, POROS i Sefarozu FF (Pharmacia) može biti navedena kao primer. Dalje, korišćenjem nosača koji ima vezani antigen, antitelo može takođe biti prečišćeno korišćenjem sposobnosti vezivanja antitela za antigen.

(4) Specifični primeri drugih anti-DR5 antitela

[0149]Anti-DR5 antitela koja indukuju apoptozu u DR5-eksprimiranim ćelijama su opisana u, na primer, WO 98/51793, WO 2001/83560, WO 2002/94880, WO 2003/54216, WO 2006/83971, i WO 2007/22157. Dalje, anti-DR5 antitela koja se nazivaju tigatuzumab (CS-1008), lexatumumab (HGS-ETR2). HGS-TR2J, drozitumab (APOMAB), conatumumab

(AMG-655), i LBY135 su još uvck u kliničkim studijama ili su bila u kliničkim studijama u prošlosti. Anti-DR5 antitela koja su i dalje bila u kliničkim studijama na datum kada je ova prijava podneta su tigatuzumab, lcxatumumab, i conatumumab. Nova anti-DR5 antitela opisana u ovoj specifikaciji imaju bolju in vitro i/ili in vivo antitumorsku aktivnost u poređenju sa gore opisanim tigatuzumabom, lexatumumabom, conatumumabom, i drozitumabom.

3. Farmaceutski preparati kojisadržeanti-DR5 antitelo

[0150JAntitela dobijena metodom koja je opisana gore pod "2. Proizvodnja anti-DR5 antitela" može biti korišćena kao farmaceutski, naročito terapijski i/ili preventivni agens za kancer pošto svako antitelo funkcioniše kao agonist za receptor koji je povezan sa apoptozom, DR5, in vivo i indukuje apoptozu u kancer ćelijama putem receptora kako bi se ispoljila citotoksična aktivnost.

[0151]Citocidna aktivnost koju ispoljava antitelo in vitro može biti određena merenjem njihove aktivnosti u inhibiciji proliferacije ćelije koja prekomerno eksprimira receptor koji je povezan sa apoptozom.

[0152]Na primer, linija kancer ćelija koja prekomerno eksprimira DR5 je kultivisana, antitelo je dodato kultivisanom sistemu na različitim koncentracijama, i inhibitorna aktivnost na formiranje fokusa, kolonija, i sferoidne proliferacije može biti izmerena.

[0153]In vivo terapijski efekat antitela na kancer korišćenjem eksperimentalnih životinja može biti određen, na primer, merenjem promene u kancer ćelijama administracijom antitela golim miševima (nude miševi) sa implantiranom tumor ćelijskom linijom koja prekomerno eksprimira DR5. (0154]Primeri tipova kancera uključuju kancer pluća, kancer prostate, kancer štitne žlezde, kancer želuca, kancer jetre, kancer ovarijuma, kancer debelog creva, kancer dojke, kancer pankreasa, kancer bubrega, kancer materice uključujući endometrijalni kancer, melanokarcinom uključujući melanom, Fibrosarkom, glioblaslom, i kancer krvnih ćelija (kao Što je leukemija i limfom), međutim, tip kancera nije time ograničen sve dok kancer ćelija koja se tretira eksprimira DR5.

[0155] Dalje, poznato je da antitelo na DR5 indukuje apoptozu u inflamatomim ćelijama (J. Clin. Invest. 1996, 98 (2), 271-278; Int. Immunol. 1996, 8 (10), 1595-1602). Stoga, antitelo predmetnog pronalaska i antitela kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti mogu biti takođe korišćena kao terapijski agens za autoimuno oboljenje ili inflamatorno oboljenje. Primeri autoimunog oboljenja ili inflamatornog oboljenja uključuju eritemski sistemski iupus , Hašimoto oboljenje, reumatoidni artritis, kalem-protiv-domaćina bolest, Sjogrenov sindrom, pernicioznu anemiju, Adisonovo oboljenje, sklerodermu, Goodpasture sindrom, Kronovu bolest, autoimunu hemolitičku anemiju, sterilitet, miasteniju gravis, multiplu sklerozu, Bazedovo oboljenje, trombcilopeniju purpuru, insulin-zavisni dijabetes melitus. alergiju, astmu, alopijsko oboljenje, arteriosklerozu, miokarditis. kardiomiopatiju, glomerulonefritis, aplastičnu anemiju, i odbacivanje nakon transplatacije organa.

[0156] Supstanca koja treba da bude korišćena u pripremi koja je prihvatljiva u farmaceutskoj kompoziciji prema predmetnom pronalasku je poželjno netoksična za osobu kojoj je farmaceutska kompozicija administrirana u smislu doze i koncentracije.

[0157] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži supstancu za farmaceutsku primenu koja je sposobna za promenu ili održavanje pH, osmotskog pritiska, viskoziteta, transparentnosti, boje, izotoničnosti, aseptičnih uslova, stabilnosti, rastvorljivosli, stope oslobađanja, stope apsorpcije, ili permeabilnosti kompozicije. Primeri takve supstance za farmaceutsku primenu uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline kao što je glicin, alanin, glutamin, asparagin, arginin, i lizin; antimikrobne agense; antioksidante kao Što su askorbinska kiselina, natrijum sulfat, i natrijum hidrogen sulfit; puferi kao Stoje fosfat, citrat, boratni puferi, natrijum hidrogen karbonat, i Tris-HCl rastvori; punioci kao što je manitol i glicin; helatni agensi kao što je etilendiamin tetraacetat (EDTA); kompleksirajući agensi kao što je kafein, polivinilpirolidin, p-ciklodekstrin, i hiđroksipropil-P-ciklodekstrin; sredstva za povećanje mase kao što je glukoza, manoza, i dekstrin; drugi ugljeni hidrati kao što su monosaharidi i disaharidi; sredstva za bojenje; sredstva za poboljšanje ukusa; razblaživači; emulgatori; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidin; konzervansi kao što su polipeptidi male molekularne mase, suprotno naelektrisani joni koji formiraju soli, benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksiđin, sorbinska kiselina, i vodonik peroksid; rastvarači kao što je glicerin, propilen glikol, i polietilen glikol; šećerni alkoholi kao što je manitol i sorbitol; sredstva za suspendovanje; surfaktanti kao što je sorbitan estar, polisorbati uključujući polisorbat 20 i polisorbat 80, Triton, trometamin, lecitin, i holesterol; sredstva za povećanje stabilnosti kao što su sukroza i sorbitol; sredstva za povećanje elastičnosti kao što su natrijum hlorid, kalijum hlorid, i manitol i sorbitol; sredstva za transportovanje; ekscipijensi; i/ili farmaceutski adjuvansi. Poželjna količina ovih supstanci za farmaceutsku primenu je od 0.01 do 100 puta, naročito poželjno od 0.1 do 10 puta u odnosu na masu anti-DR5 antitela. Osobe koje poznaju ovu tehničku oblast mogu na odgovarajući način da odrede poželjnu formulaciju farmaceutske kompozicije u preparatu u zavisnosti od oboljenja kod koga se kompozicija primenjuje, puta administracije koji se primenjuje, ili slično.

[0158]Ekscipijens ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti u obliku tečnosti ili čvrste supstance. Odgovarajući ekscipijens ili nosač može biti injekciona voda, fiziološki rastvor, veštačka cerebralno spinalna tečnost. ili druga supstanca uobičajeno korišćena za parenteralnu administraciju. Dalje, neutralni fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor koji sadrži serumski albumin može takođe biti korišćen kao nosač. Farmaceutska kompozicija može da sadrži Tris pufer Čija je vrednost pH 7.0 do 8.5, acetatni pufer Čija je vrednost pH 4.0 do 5.5, ili citratni pufer čija je vrednost pH 3.0 do 6.2. Dalje, takav pufer može bili upotpunjen sorbitolom ili drugim jedi nj enj em.

[0159]Primeri farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska uključuju farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-DR5 antitelo i farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-DR5 antitelo i najmanje jedan terapijski agens za kancer. Farmaceutska kompozicija može biti pripremljena u obliku liofiliziranog proizvoda ili tečnosti kao medicinskog agensa koji sadrži izabranu kompoziciju i potrebnu čistoću. Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-DR5 antitelo i farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-DR5 antitelo i najmanje jedan terapijski agens za kancer može takođe biti formirana kao liofilizirani proizvod korišćenjem odgovarajućeg ekscipijensa kao što je sukroza.

[0160]U gore opisanoj farmaceutskoj kompoziciji, terapijski agens za kancer koji treba da bude inkorporiran zajedno sa anti-DR5 antitelom može biti administriran istovremeno sa, odvojeno od, ili jedan za drugim sa anti-DR5 antitelom, ili terapijski agens i anti-DR5 antitelo mogu biti administrirani u različitim doznim intervalima. Primeri takvog terapijskog agensa za kancer uključuju abraksan, karboplatin. cisplatin, gemcitabin, irinotecan (CPT-11), paklitaksel, pemetreksed, sorafenib, vinblastin, 5-FU, i medicinske agense koji su opisani u WO 2003/038043, međutim, agens nije ograničen time sve dok je agens medicinski agens koji poseduje antitumorsku aktivnost.

[0161]Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti pripremljena za parenteralnu administraciju ili za gastrointestinalnu apsorpciju putem oralne administracije. Sastav i koncentracija preparata mogu biti određeni u zavisnosti od metoda administracije. Što je veći afinitet anti-DR5 antitela koji jc u sastavu farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska za DR5, to je, niža njegova konstanta disocijacije (Kd vrednost) za DR5, više anti-DR5 antitelo može da ispolji svoju efikasnost leka čak i kada se smanjuje doza za ljude. Stoga, doza farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska kod ljudi može takođe biti određena na osnovu ove činjenice. Što se tiče doze. u slučaju gde je humano anli-DR5 antitelo administrirano ljudima, antitelo može biti adminislrirano u dozi od oko 0.1 do 100 mg/kg jednom dnevno ili u 180 dana.

[0162]Primeri doznog oblika farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska uključuju injekcije uključujući infuzije, supozitorije, transnazalne agense, sublingvalne agense, i perkutane absorbente.

[0163]U daljem tekstu, predmetni pronalazak će biti specifičnije opisan uz napomenu na primere, međutim, predmetni pronalazak nije time ograničen. Treba primetiti da su odgovarajuće radnje koje se tiču genske manipulacije u sleđećim Primerima izvedene prema metodama opisanim u "Molecular Cloning" (napisali Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., objavio Cold Spring Harbor Laboratorv Press 1989. godine), ili u slučaju korišćenja komercijalno dostupnih reagenasa ili kitova, oni su korišćeni prema protokolima koji dolaze sa njima ukoliko drugačije nije naglašeno.

[Primer 1] Proizvodnja mišjeg antitela B273

1) -1 Proizvodnja humanog DR5 proteina (humani DR5 ekstraccluiarni domen/humani Fc fuzionisani protein) 1) -1-1 Proizvodnja ekspresionog vektora sa humanim DR5 ekstracelularnim domenom

[0164]Vektor koji eksprimira humani DR5 protein (izoforma 2: NP 671716) je konstruisan insercijom gena, gde je humani DR5 ekstracelularni domen fuzionisan sa humanim IgGl/Fc regionom, nizvodno od CMV promotera.

l)-l-2 Proizvodnja humanog DR5 proteina

[0165]Uvođenje ekspresionog vektora u 293 FrecStvlc ćelije i sakupljanje supernatanta kulture je izvedeno od strane Invitrogen Corporation (trenutno Life Technologies Japan Ltd.). I)-1-3 Prečišćavanje humanog DR5 proteina

[0166]Supernatant kulture koji je dobijen kako je opisano gore pod b) je prečišćen korišćenjem Protein A afinitetne hromatografije na koloni. 5 L supernatanta kulture je primenjeno na "HiTrap Protein AFF" (GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., kataloški br. 17-5079-01) ekvilibrisano sa PBS-om, praćeno ispiranjem sa PBS-om. Zatim, 2 M rastvor arginina (pH 4.0) je dodat koloni, i frakcija koja sadrži humani DR5 protein je sakupljena. Frakcija je dodata uređaju za centrifugalno filtriranje (Amicon Ultra-4, frakciona molekulska masa: 10 K, Millipore Co., Ltd.), i zamena tečnosti sa PBS-om i kondenzacija je izvedena. Konačna zapremina je podešena na 6 ml. što jc korišćeno kao prečišćen uzorak (rDR5-hFc). Kvantitativno određivanje prečišćenog proizvoda proteina je izvedeno korišćenjem "Micro BCA Protein Assav Kit" (PIERCE #23235). Kao referentni standard. "Albumin Standard" koji je sastavni deo kita je korišćen.

1 )-2 Imunizacija

[0167JBALB/cAJcl miševi (CLEA Japan. Inc.) starosti 5 do 6 nedelja su korišćeni. Na dan 0, smeša od 50 ug rDR5-hFc pripremljena u l)-l-3 i Frojndov kompletni adjuvans (proizvodi Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (pri odnosu zapremina 1:1) je subkutano administriran u blizini vrata svakog miša. Na dane 14 i 28, smeša 50 ug rDR5-hFc i Frojndovog kompletnog adjuvansa (proizvodi Wako Pure Chemical Industries, Ltđ.) (pri odnosu zapremina 1:1) jc subkutano administriran u dorzalni deo svakog miša. Na dan 42, 50 u.g rDR5-hFc je administrirano u abdominalnu šupljinu svakog miša, i na dan 45. slezina je isečena iz svakog miša i korišćena za proizvodnju hibridoma.

l)-3 Proizvodnja hibridoma

[0168]Ćelije slezine i ćelije mišjeg mijeloma P3X63Ag8U.l su podvrgnute ćelijskoj fuziji korišćenjem PEG 4000 (proizvodi Immuno-biological Laboratories Co.. Ltd.), i rczultujuće fuzionisane ćelije su razblažene sa CIonaCell-IIY Selection Medijum D (proizvodi StemCell Technologies, Inc., #03804) i kultivisane. Zatim, kolonije hibridoma koje su formirane su sakupljene, pri čemu je monoklonski hibridom proizveden. Sakupljene kolonije hibridoma su odvojeno kultivisane, i korišćenjem dobijenog supernatanta kulture svakog hibridoma, hibridom koji proizvodi anti-DR5 antitelo je podvrgnut skriningu.

l)-4 Skrining antitela pomoću ćelijske-ELISA metode

l)-4-l Konstrukcija humanog DR5 mutant ekspresionog vektora (pcDNA3.1-DR5M)

[0169]cDNA koja kodira humani DR5 protein (izoform 2: NP 671716) jc klonirana u pcDNA3.1(+) vektor, i konstruisan je modifikovani domen smrti ekspresioni vektor pcDNA3.1-DR5M koji je dizajniran tako da eksprimira protein u kome je amino kiselina L na položaju 334 u domenu smrti supstituisana sa D.

l)-4-2 Piprema ćelija koje ekspirimiraju gene antigena

[0170JHEK 293 ćelije su pripremljene pri 7.5 x 10^ ćelije/ml u DMEM medijumu koji sadrži 10% FBS. Onda, HEK 293 ćelije su transfektovane ekspresionim vektorom pcDNA3.1-DR5M ili pcDNA3.1-MOCK sa modifikovanim domenom smrti DR5 koja služi kao kontrola korišćenjem reagensa Lipofectamine 2000 (proizvodi Life Technologies Japan Ltd.), i svaka

ćelijska suspenzija je sipana u polovinu površine mikrotitar ploče sa 96-bunarića u količini 50 ul/bunariću (proizvodi Corning Incorporated). Ćelije su kultivisane preko noći u DMEM medijumu koji sadrži 10% FBS pod uslovima 37°C i 5% CO2. Tako dobijene transfektovane ćelije u adheriranom stanju su korišćene kao takve u ćelijskoj ELISI.

l)-4-3 Ćelijska ELISA

[0171]Nakon što jc supernatant uklonjen iz kulture HEK 293 ćelija transfektovanih sa ekspresionim vektorom koji je pripremljen u 1) -4-2, supernatant kulture hibridoma je dodat svakoj HEK 293 ćeliji koja je transfektovana sa pcDNA3.1-DR5M i HEK 293 ćeliji koja jc transfektovana pcDNA3.1-MOCK, i ploča je ostavljena da stoji na 4°C tokom I sata. Nakon Što su ćelije u svakom bunariću isprane jednom sa PBS-om koji sadrži 5% FBS, kozji anti-miš IgG, konjugovan sa peroksidazom (proizvodi Chemicon Co., Ltd., #AP181P) razblažen 500-puta sa PBS-om koji sadrži 5% FBS je dodat svakom bunariću, i ploča je ostavljena da stoji na 4°C tokom 1 sata. Nakon što su ćelije u svakom bunariću isprane 5 puta sa PBS-om koji sadrži 5% FBS, OPD rastvor koji razvija boju (o-fenilenediamin dihidrohlorid (proizvodi Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i H2O2su rastvoreni pri 0.4 mg/ml i 0.6% (v/v), redom, u rastvoru za rastvaranje OPD (0.05 M trinatrijum citrat i 0.1 M dinatrijum hidrogen fosfat dodekahidrat, pH 4.5)) je dodat 25 ul/bunariću. Reakcija razvijanja boje je dozvoljena uz povremeno mešanje reakcine smeše, i razvoj boje je zaustavljen dodavanjem 1 M IIC1 25 pl/bunariću. Posle toga, apsorbancija na 490 nm je izmerena korišćenjem čitača ploča (ARVO, proizvodi Perkin Elmer, Inc.). Kako bi se izbrao hibridom koji proizvodi antitelo koje se specifično vezuje za DR5 eksprimiran na ćelijskoj membrani, hibridom koji proizvodi supernatant kulture koji pokazuje višu absorbanciju u HEK 293 ćelijama transfektovanim sa pcDNA3.1-DR5M ekspresionim vektorom u poređenju sa HEK 293 ćelijama transfektovanim sa pcDNA3.1-MOCK (kontrola) je izabrana da bude pozitivna za proizvodnju anti-DR5 antitela.

1 )-5 Skrining antitela metodom protočne citometrije

l)-5-l pripremanje ćelija koje ekspirimiraju gene antigena

[0172]293T ćelije su zasejane pri koncentraciji 5 x 104 ćelije/cm<2>u 225-cm<2>erlenmajeru (proizvodi umitomo Bakelite Co., Ltd.), i kultivisane preko noći u DMEM medijumu koji sadrži 10% FBS pod uslovima od 37°C i 5% CO2. Sledećeg dana, 293T ćelije su transfektovane sa pcDNA3.1-DR5M ili pcDNA3.1-mock koji služi kao kontrola korišćenjem Lipofectamine 2000 reagensa, i dalje kultivisane preko noći pod uslovima od 37°C i 5% CO2. Sledećeg dana, 293T ćelije transfektovane sa ekspresionim vektorom su tretirane sa TrvpLE Express (proizvodi Life Technologies Japan Ltd.). Zatim, ćelije su isprane sa DMEM-om koji sadrži 10% FBS, i posle toga suspendovane u PBS-u koji sadrži 5% FBS. Tako dobijena ćelijska suspenzija je korišćena u analizi protočnom citometrijom.

l)-5-2 analiza protočnom citometrijom

[0173]T293T ćelijska suspenzija pripremljena u l)-5-l je centrifugirana i supernatant je uklonjen. Zatim, supernatant kulture hibridoma je dodat svakoj od 293T ćelija transfektovanih sa pcDNA3.1-DR5M i 293T ćelija transfektovanih sa pcDNA3.1-mock da bi se suspenovale ćelije, i ćelije su ostavljene da stoje na 4°C tokom 1 sala. Nakon što su ćelije isprane dvaput sa PBS-om koji sadrži 5% FBS, fluorescein-konjugovana kozja IgG frakcija na mišji IgG (ceo molekul) (proizvodi Cappel Co., Ltd., #55493) razblažena 1000-puta sa PBS-om koji sadrži 5% FBS je dodata radi suspendovanja ćelija, i ćelije su ostavljene da stoje na 4°C tokom 1 sata. Nakon što su ćelije isprane 3 puta sa PBS-om koji sadrži 5% FBS, ćelije su resuspendovane u PBS-u koji sadrži 5% FBS sa dodatkom 2 (ig/ml 7-aminoactinomicina D (proizvodi Invitrogen (Molecular Probes) Corporation), i detekcija je izvedena korišćenjem protočnog citometra (FC500, Beckman Coulter, Inc.). Podaci su analizirani korišćenjem Flowjo (Tree Star, Inc.). 7-Aminoactinomicin D-positivne mrtve ćelije su isključene korišćenjem kapije. Zatim, kreirani su histogrami intenziteta FITC fluorescencije živih ćelija. Hibridom koji je proizveo uzorak koji je dao viši intenzitet fluorescencije na histogramu intenziteta fluorescencije 293T ćelija koje su transfektovane sa pcDNA3.1-DR5M nego na histogramu intenziteta fluorescencije 293T ćelija koje su transfektovane sa pcDNA3.1-mock koje služe kao kontrola je izabran da bude pozitivan za prouzvodnju anti-DR5 antitela.

l)-6 Skrining u smislu citocidnog efekta

[0174]Korišćenjem supernatanata kultura hibridoma koji su izabrani kao pozitivni za proizvodnju anti-DR5 antitela u l)-4 i l)-5, efekat indukcije ćelijske smrti na humanoj T-limfom ćelijskoj liniji Jurkat je potvrđen. AffiniPurc kozji Fc specifični anti-mišji IgG (proizvodi Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #115-005-071) pripremljena pri koncentraciji 50 ug/ml sa 5 mM Tris-HCl (pH 8.5) je sipan u količini 25 uL/bunariću u polovinu površine mikroploče sa 96-bunarića (proizvodi Corning Incorporated), i ploča je ostavljena da stoji preko noći na 4°C. Nakon što je svaki bunarić ispran dva puta sa PBS-om, supernatant kulture hibridoma je dodat svakom bunariću i ploča jc je ostavljena da stoji preko noći na 4°C. Nakon što je svaki bunarić ispran dva puta sa PBS-om, Jurkat ćelije pripremljene pri koncentraciji 4.0 x 10<4>ćelije/ml u RPMI 1640 medijumu koji sadrži 10% FBS su dodate u količini 25 ul/bunariću i kultivisan pod sledećim uslovima: 37°C i 5% CO2tokom 20 sati. Citocidni efekat anti-DR5 monoklonskog antitela koje je prisutno u supernatantu kulture hibridoma je procenjeno kvantitativnim određivanjem količine ATP-a koji je dobije od živih ćelija korišćenjem CellTiter-Glo kila za luminescentno određivanje ćelijske vijabilnosti (proizvodi Promega Corporation, #G7571). Kao rezultat, hibridomi koji proizvode 5 tipova monoklonskih antitela (B086, B139, B192, B273, i B467), od kojih svako ispoljava smanjenje količine ATP-a za 80% ili više u poredenju sa slučajem dodavanja medijuma za kultivisanje hibridoma, su ustanovljeni.

l)-7 određivanje izotipa monoklonskog antitela

[0175]Izotipovi monoklonskih antitela su određeni korišćenjem kita za određivanje mišjeg monoklonskog izotipa (proizvodi AbD Serotec, Inc.). Kao rezultat, izotip B086. BI39, BI92, B273, i B467 je potvrđen da je IgGl,klanac.

l)-8 Pripremanje monoklonskog antitela

[0176]Monoklonsko antitelo je prečišćeno iz ascitesa miša sa implantiranim hibridomom (u daljem tekstu, nazvan kao "početni materijal za prečišćavanje antitela").

[0177]Ascites miša je pripremljen kao što sledi. Prvo, BALB/cAJcI-nu/nu (Japan SLC, Inc.) miševi od 7 do 8 nedelja starosti su tretirani sa pristanom (proizvodi Sigma Co., Ltd.), i posle oko 3 nedelje, hibridom ispran sa fiziološkim rastvorom je implantiran u abdominalnu šupljinu u količini 1 x IO<7>ćelija po mišu. Posle 1 do 2 nedelje, ascites akumuliran u abdominalnoj šupljini je sakupljen i sterilisan kroz 0.22-um mrežasti filter, i nastali materijal je korišćen kao početni materijal za prečišćavanje antitela.

[0178]Antitelo je prečišćeno pomoću Hitrap MabSelect SuRe (proizvodi GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.). To je, početni materijal za prečišćavanje antitela je dodat koloni, i kolona je isprana sa PBS-om, i posle toga, elucija je izvedena sa 2 M Arginin-HCl pFI 4.0. Nakon što je eluirano rastvor antitela neutralizovan, pufer je zamenjen sa PBS-om. Koncentracija antitela je dobijena elucijom antitela vezanog za POROS G 20 um Kolonu PEEK, 4.6 mm x 50 mm, 0.83 ml (Applied Biosistems, Inc.) i merenjem absorbancije (O.D. 280 nm) cluata. Specifično, uzorak antitela razblažen sa PBS-om je dodat u POROS G 20 u.m koji je ekvilibrisan sa ekvilibrišućim puferom (30. 6 mM natrijum dihidrogen fosfat dodekahidrat, 19.5 mM monokalijum fosfat, 0.15 M NaCl, pH 7.0). Zatim, kolona je isprana sa ekvilibrišućim puferom, i antitelo vezano za kolonu je onda eluirano sa eluentom (0.1% (v/v) HC1, 0.15 M NaCl). Površina ispod pika absorbancije (O.D. 280 nm) eluata je izmerena, i koncentracija je izračunata prema sledećoj jednačini: Koncentracija uzorka antitela (mg/ml) =

(Površina ispod pika uzorka antitela) / (Površina ispod pika referentnog standarda (humani IgGl)) x Koncentracija referentnog standarda (mg/ml) x Faktor razblaživanja uzorka. Šlaviše, koncentracija endotoksina u dobijenom antitelu je izmerena korišćenjem Limulus ES-II Single Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 295-51030 koji sadrži kontrolni standardni endotoksin) i toksinometar (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., ET-301 ili ET-5000) i potvrđeno je daje 1 EU/mg ili manje. Rezultujuće antitelo je korišćeno u sledećem eksperimentu.

1) -9 In vitro citocidna aktivnost antitela B273 miša na humane kancerske ćelijske linije

[0179]Svaka od humane T-limfom ćelijske linije Jurkat i humane glioblastom ćelijske linije U-87MG je pripremljena pri koncentraciji 4.4 x IO<4>ćelija/ml u RPMI 1640 medijumu koji sadrži 10% FBS ili MEM (Minimum Essential Medium) medijuma koji sadrži 10% FBS-a i dodata u mikroploču sa 96-bunarića sa belim prozirnim dnom (proizvodi Corning Incorporated) u količini 45 ul/bunariću, i kultivisana preko noći pod sledećim uslovima: 37°C i 5% CO2. B273 antitelo miša ili IgGl antitelo miša (proizvodi R&D Sistems, Inc.) je pomešano sa istom koncentracijom AffiniPure kozjeg Fc specifičnog anti-mišjeg IgG (proizvodi Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #115-005-071), i rezultujuća smeša je dodata u količini 5 ul/bunariću tako daje finalna koncentracija B273 antitela miša ili IgGl antitela miša bila 10,000 do 0.01 ng/ml, i ćelije su kultivisane pod sledećim uslovima: 37°C i 5% CO2tokom 24 sata. Količina ATP-a dobijena od živih ćelija u svakom bunariću je izmerena luminometrom (proizvodi Perkin Elmer, Inc.) korišćenjem CellTiter-Glo kita za luminescentno određivanje ćelijske vijabilnosti (proizvodi Promega Corporation, #G7571) prema prisutnom protokolu. Citocidna aktivnost je procenjena uzimanjem vrednosti koja je dobijena iz bunarića kome je medijum dodat umesto rastvora antitela kao 100% (Sl.l). na svakom grafiku, ćelijska vijabilnost je izražena kao srednja vrednost ± standardna devijacija (n = 3). Kao rezultat ustanovljeno je da B273 antitelo miša ispoljava citocidni efekat na obe ćelijske linije, koji zavisi od koncentracije antitela.

[Primer 2] Kloniranje gena antitela B273 miša i proizvodnja gena humanog himernog antitela 2) -1 Kloniranje cDNA antitela B273 miša i određivanje sekvence

2)-1-1 Određivanje N-terminalnih aminokiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca antitela B273 miša

[0180] U cilju određivanja N-terminalnih aminokiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca antitela B273 miša, antitelo B273 miša koje je prečišćeno u Primeru 1-8 je izolovano pomoću SDS-PAGE. Protein u gelu je prenesen sa gela, posle razdvajanja, na PVDF membranu (veličina pora: 0.45 um, proizvodi Invitrogen Corporation). Membrana je isprana sa puferom za ispiranje (25 mM NaCl, 10 mM natrijum boratni pufer pH 8.0), i posle toga obojena potapanjem u rastvor za bojenje (50% metanol, 20% sirćetna kiselina, 0.05% Coomassie brilliant blue) tokom 5 minuta, što je praćeno uklanjanjem boje pomoću 90% metanola. Delovi traka koji odgovaraju teškom lancu (traka sa manjom pokretljivošću) i traka koja odgovara lakom lancu (traka sa većom pokretljivošću) vizuelizovani pomoću PVDF membrane su isečeni, i učinjen je pokušaj da se identifikuje njima odgovarajuća N-terminalna sekvenca aminokiselina automatskom Edmanovom metodom (videti Edman et al. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80) korišćenjem Procise (registrovan žig) cLC Protein Sequenccr Modela 492cLC (Applied Biosistems, Inc.). Kao rezultat, N-terminalna aminokiselinska sekvenca trake koja odgovara teškom lancu antitela B273 miša bila je EVQLQQSGPELVKPG (SEQ ID NO: I u Listi Sekvenci), i N-terminalna aminokiselinska sekvenca trake koja odgovara lakom lancu antitela B273 miša je bila DVVMTQTPLSLPVSLGDQAS (SEQ ID NO: 2 u Listi Sekvenci).

2) -1-2 Pripremanje mRNA od hibridoma koji proizvodi antitelo B273 miša

[0181] U cilju kloniranja cDNK koje kodiraju težak lanac i lak lanac antitela B273 miša, redom, mRNK je pripremljena od hibridoma koji proizvodi antitelo B273 miša korišćenjem Quick Prep mRNK Kita za prečišćavanje (GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.).

2)-l-3 Kloniranje cDNK antitela B273 miša i određivanje sekvence

[0182] Uz napomenu na otkrića da su izotipovi teških i lakih lanaca antitela B273 miša yl ikkoji se nalaze u Primeru 1-7, i N-terminalne aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca određene gore pod 2)-1-1, i bazu podataka aminokiselinskih sekvenci antitela koju je pripremio Kabat et al. (videti Kabat, E. A. et al., (1991) u knjizi Sequences of Proteins of Immunological Interest tom I i II, U.S. Department of Flealth and Human Services), nekoliko oligonukleotidnih primera koji hibridizuju sa 5'-terminalnim regionom kodirajućeg regiona gena antitela i 3'-terminalnim regionom istog koji sadrži stop kodon, redom, je sintetisano, i cDNK koja kodira težak lanac i cDNK koja kodira lak lanac su amplifikovani korišćenjem mRNK koja je pripremljena pod 2)-1-2 i TaKaRa One Step RNA PCR Kita (AMV) (TaKaRa Bio, Inc.). Kao rezultat, cDNK koja kodira težak lanac antitela i cDNK koja kodira lak lanac antitela bi mogla biti amplifikovana sledećim setom prajmera.

Prajmer set za težak lanac

5'-aagaattcatgggatggagctgtatc-3' (MH258E1F1: SEQ ID NO: 3 u Listi Sekvenci) 5'-aagatatcttatttaccaggagagtgggagag-3' (G1EVR1 : SEQ ID NO: 4 u Listi Sekvenci) Prajmer set za lak lanac

5'-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3' (MK19EIF1: SEQ IDNO: 5 u Listi Sekvenci) 5'-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3' (KEVR1: SEQ ID NO: 6 u Listi Sekvenci)

[0183]Svaka od cDNK koja kodira težak lanac i cDNK koja kodira lak lanac amplifikovan pomoću PCR-a je klonirana korišćenjem pEF6/V5-His TOPO TA Expression Kit-a (Invitrogen Corporation), i svaka od nukleotidnih sekvenci teškog lanca i lakog lanca koja je klonirana je određena korišćenjem analizatora genske sekvence ("ABI PRISM 3700 DNK Analizator; Applied Biosistems" ili "Applied Biosistems 3730x1 Analizator; Applied Biosistems"). U reakciji sekvencioniranja, GenAmp 9700 (Applied Biosistems, Inc.) je korišćen.

[0184]Određena nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira težak lanac antitela B273 miša je predstavljena sa SEQ ID NO: 7 u Listi Sekvenci, i odgovarajuća sekvenca aminokiselina je predstavljena sa SEQ ID NO: 8. Nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira lak lanac antitela B273 miša je predstavljena sa SEQ ID NO: 9 u Listi Sekvenci, a odgovarajuća sekvenca aminokiselina je predstavljena sa SEQ ID NO: 10 u Listi Sekvenci. Sekvence sa brojevima SEQ ID: 7 i 8 su prikazane na S1.28, i sekvence sa brojevima SEQ ID: 9 i 10 su prikazane na S1.29.

[0185]Dalje, aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca su analizirane poređenjem uz korišćenje KabatMan (videti PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133), koji je baza podataka aminokiselinskih sekvenci antitela. Kao rezultat, pronađeno jc da je u teškom lancu antitela B273 miša, sekvenca aminokiselina predstavljena sa aminokiselinama sa brojevima 20 do 141 od SEQ ID NO: 8 u Listi Sekvenci, varijabilni region. Takođe je pronađeno daje u lakom lancu antitela B273 miša, sekvenca aminokiselina predstavljena aminokiselinama sa brojevima 20 do 133 od SEQ ID NO: 10 u Listi Sekvenci, varijabilni region.

2)-2 Proizvodnja ekspresionog vektora himernog antitela B273

2)-2-l Proizvodnja univerzalnog ekspresionog vektora pEF6KCL i pEFlFCCU

2)-2-l-l Konstrukcija ekspresionog vektora himernog i humanizovanog lakog lanca pEF6KCL

[0186] Izvođenjem PCR-a korišćenjem plazmida pEF6/V5-HisB (Invitrogen Corporation) kao uzorka i takođe korišćenjem sledećih prajmera, DNK fragment od odmah nizvodno od BGHpA (Položaj Sekvence: 2174) do Smal (Položaj Sekvence: 2958) (DNK fragment koji sadrži fl početak replikacije i SV40 promoter i početak, u daljem tekstu naznačen kao "fragment A") je dobijen.

5'-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3' (prajmer EFF1: SEQ ID NO: 11 u Listi Sekvenci)

5'-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3' (prajmer EFsmaR: SEQ ID NO: 12 u Listi Sekvenci)

[0187] Dobijeni fragment A i DNK fragment (SEQ ID NO: 13, u daljem tekstu naznačen kao "fragment B") koji sadrži DNK sekvencu koja kodira sekretorni signal humanogklanca, konstantni region humanogklanca, i humani poli-A adicijalni signal su vezani jedan za drugi pomoću preklapajuće ekstenzione PCR metode. Tako dobijeni DNK fragment u kome su fragment A i fragment B povezani jedan za drugi su digestirani pomoću restrikcionih enzima KpnI i Smal, koji su povezani za plazmid pEF6/V5-HisB (Invitrogen Corporation) koji je digestiran pomoću restikcionih enzima KpnI i Smal, pri čemu ekspresioni vektor himernog i humanizovanog lakog lanca pEF6KCL koji sadrži signalnu sekvencu, mesto kloniranja, konstantni region humanogklanca, i humanu poli-A dodatnu signalnu sekvencu nizvodno od EF1 promotera jc konstruisan.

2)-2-l-2 Konstrukcija pEFl/KCL

[0188] DNK fragment dobijen cepanjem pEF6KCL dobijenog gore opisanom metodom sa restrikcionim enzimima KpnI i Smal je povezan sa pEFl/myc-HisB (Invitrogen Corporation) koji je digestiran sa KpnI i Smal, pri čemu je plazmid pEFl KCL konstruisan.

2)-2-l-3 Konstrukcija ekspresionog vektora himernog i humanizovanog teškog lanca pEFlFCCU

[0189] DNK fragment (SEQ ID NO: 14) koji sadrži DNK sekvencu koja kodira aminokiseline signalne sekvence i konstantni region humanog IgGl je digestiran sa restrikcionim enzimima Nhel i PmeI i povezan za plazmid pEFIKCL koji je digestiran sa Nhel i PmeI, pri čemu ekspresioni vektor himernog i humanizovanog teškog lanca pEFlFCCU koji sadrži signalnu sekvencu, mesto kloniranja, konstantni region humanog teškog lanca, i humanu poli-A adicijalnu signalnu sekvencu nizvodno od EF1 promotera je konstruisan.

2)-2-2 Konstrukcija ekspresionog vektora lakog lanca himernog tipa B273

[0190) Korišćenjem cDNK koja kodira laki ianac antitela B273 miša kao šablon i takođe korišćenjem KOD-Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.) i sledećeg seta prajmera, region koji sadrži cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca je amplifikovan. DNK fragment dobijen cepanjem amplifikovanog proizvoda sa restrikcionim enzimima Ndel i BsiWI je inserlovan u ekspresioni vektor lakog lanca univezalnog himernog i humanizovanog antitela (pEF6KCL) na mestu cepanja sa restrikcionim enzimima Ndel i BsiWI, pri čemu je konstruisan ekspresioni vektor lakog lanca himernog tipa B273. Tako dobijeni ekspresioni vektor je nazvan "pEF6KCL/B273L". Nukleotidna sekvenca lakog lanca himernog tipa B273 je predstavljena sa SEQ ID NO: 15 u Listi Sekvenci, i njena aminokiselinska sekvenca je predstavljena sa SEQ ID NO: 16. Sekvence sa brojevima SEQ ID NO: 15 i 16 su prikazane na SI.30. Slučajno, aminokiselinski ostatak na položaju 134 u sekvenci aminokiselina lakog lanca himernog tipa koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 16 u Listi Sekvenci jc locirana na karboksil kraju varijabilnog regiona lakog lanca i odgovara alanin ostatku na položaju 133 u sekvenci aminokiselina lakog lanca antitela B273 miša koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 10 u Listi Sekvenci, međutim, u sekvenci aminokiselina koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 16, ostatak je već supstituisan sa treonin ostatkom koji je dobijen od lakog lanca humanog antitela.

Prajmer set za laki lanac:

5'-aaacatatggcgatgttgtgatgacccaaactccactctcc-3' (B273LF: SEQ ID NO: 17 u Listi Sekvenci)

5'-aaacgtacgtttgatttccagcttggtgcctccaccgaacg-3' (B273LR: SEQ ID NO: 18 u Listi

Sekvenci)

2)-2-3 Konstrukcija ekspresionog vektora teškog lanca himernog tipa B273

[0191] Korišćenjem cDNK koja kodira težak lanac antitela B273 miša kao uzorak i takođe korišćenjem KOD-Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.) i sledećeg seta prajmera. region koji sadrži cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca je amplifikovan. DNK fragment dobijen cepanjem amplifikovanog proizvoda sa restrikcionim enzimom BlpI je insertovan u ekspresioni vektor teškog lanca univerzalnog himernog i humanizovanog antitela (pEFlFCCU) na mestu cepanja pomoću restrikcionog enzima BlpI, pri čemu je ekspresioni vektor teškog lanca himernog tipa B273 konstruisan. I ako dobijeni ekspresioni vektor je nazvan "pEFlFCCU/B273H". Nukleotidna sekvenca teškog lanca himernog tipa B273 je predstavljena sa SEQ ID NO: 19 u Listi Sekvenci, i njena aminokiselinska sekvenca je predstavljena saS EQ ID NO: 20. Sekvence SEQ ID NO: 19 i 20 su prikazane na SI.31.

Parjmer set za težak lanac:

5'-aaagctgagcgaggttcagctgcagcagtctggacctgagc-3' (B273IIF: SEQ ID NO: 21 u Listi Sekvenci)

5'-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccagtag-3' (B273HR: SEQ ID NO: 22 u Listi

Sekvenci)

2)-3 Pripremanje himernog antitela B273

2)-3-l Proizvodnja himernog antitela B273

[0192] 1.2 * IO<9>FreeStvle 293F ćelija (Invitrogen Corporation) u logaritamskoj fazi rasla su zasejane u 1.2 L svežeg FreeStvle 293 F2xpression Medijuma (Invitrogen Corporation) i kultivisane tokom 1 sata uz mešanje 90 rpm na 37°C u 8% CO2inkubatoru. 3.6 mg polietilenimina (Polvscience #24765) je rastvoreno u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma (Invitrogen Corporation). Zatim, pEFlFCCU/B273H (0.4 mg) i pEF6KCL/B273L (0.8 mg) koji su pripremljeni sa PureLink HiPure Plazmid Kit-om (Invitrogen Corporation) su suspendovani u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma. Zatim, 20 ml dobijenih ekspresionih vektora/Opti-Pro SFM smeša tečnosti je dodato u 20 ml dobijenog polietilenimin/Opti-Pro SFM smešu tečnosti, i rezultujuća smeša je polako mešana i onda ostavljena tokom 5 minula. Posle toga, smeša je dodata FreeStvle 293F ćelijama, i mešanje kulture na 90 rpm je izvedeno u trajanju od 7 dana na 37°C u 8% CO2inkubatoru. Rezultujući supernatant kulture je filtriran preko filtera sa kapsulom za jednokratnu upotrebu (Advantec #CCS-045-ElH).

[0193] Himerno antitelo B273 dobijeno kombinacijom pEFlFCCU/B273H i pEF6KCL/B273L je nazvano "cB273*'.

2)-3-2 Prečišćavanje cB273

[0194] Supernatant kulture dobijen gore pod 2) -3-1 je prečišćen dvostepenim procesom uključujući rProtein A afinitetnu hromatografiju (na 4 do 6°C) i keramički hidroksiapatit (na sobnoj temperaturi). Korak zamene pufera posle prečišćavanja rProtein A afinitetnom hroniatografijom i posle prečišćavanja keramičkim hidroksiapatitom je izvedeno na sobnoj temperaturi. Prvo, 1100 do 1200 ml supernatanta kulture je primenjeno na MabSelect SuRe (proizvodi GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone (zapremina: 1 ml) povezane u serijama) ekvilibrisane sa PBS-om. Pošto je čitav rastvor kulture sipan u kolonu, kolona je isprana sa 15 do 30 ml PBS-a. Zatim, eluiranje je izvedeno sa 2 M arginin hidrohloridnim rastvorom (pH 4.0), i frakcija koja sadrži antitelo je sakupljena. Frakcija je primenjena na kolonu za desalinizaciju (proizvodi GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je pufer zamenjen sa puferom koji sadrži 5 mM natrijum fosfat, 50 mM MES, i 20 mM NaCl pri pH 6.5. Dalje, rastvor antitelo podvrgnut zameni pufera je primenjen na kolonu sa keramičkim hidroksiapatitom (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1 hidroksiapatit kolona (zapremina: 2 ml)) ekvilibrisanu sa puferom koji sadrži 5 mM NaPi, 50 mM MES. i 20 mM NaCl pri pH 6.5. Zatim, izvedena je linearna koncentraciona gradijentna elucija sa natrijum hloridom, i frakcija koja sadrži antitelo je sakupljena. Frakcija je primenjena na kolonu za desalinizaciju (proizvodi GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je tečnost zamenjena sa CBS-om (10 mM citratni pufer sadrži 140 mM natrijum hlorid, pH 6.0). Konačno, rezultujući rastvor je koncentrovan korišćenjem Ccntrifugal UF Filter Uređaja VIVASPIN 20 (frakciona molekulska masa: 30 K, Sartorius Co., Ltd., na 4°C), i IgG koncentracija je podešena na 1.0 mg/ml ili više, i tako dobijeni rastvor je korišćen kao prečišćeni uzorak.

[Primer 3] Merenje aktivnosti humanog himernog B273 (cB273) antitela (in vitro)

3) -1 Studija sposobnosti selektivnog vezivanja cB273 antitela za humani DR5 ekstracelulami domen

[0195] Sposobnost vezivanja cB273 za proteine sa ekstracelularnim domenom humanog TRAIL Rl do R4 i mišjeg TRAIL R2 (proizvodi R&D Sistems, Inc.) je istraživana direktnom ELISA metodom koja je opisana dole. Prvo, svaki od proteina sa ekstracelularnim domenom TRAIL Rs je razblažen do 1 p-g/ml sa PBS-om, i razblažen rastvor je nanet u količini 50 ul/bunariću na imunoploče (proizvodi Nunc, Inc., #442404), i ploča jc ostavljena đa stoji preko noći na 4°C, pri čemu je protein apsorbovan na ploči. Sledećeg dana, tečnost u svakom bunariću je uklonjena i svaki bunarić je ispran jednom sa PBS-om. Posle toga, kako bi se smanjila nespecifična adsorpcija proteina, PBS koji sadrži 3% fetalni goveđi serum je nanet u količini 200 ul/bunariću, i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 1.5 sat. Tečnost u svakom bunariću je uklonjena i cB273 ili soiubilni humani TRAIL (proizvodi ALEXIS Corporation, #ALX-522-003) razblažen sa PBS-om koji sadrži 3% fetalni goveđi serum je dodat u količini 50 ul/bunariću. Posle je ploča ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1.5 sata, PBS je dodat u svaki bunarić, i onda, tečnost u bunariću je uklonjena i bunarić je ispran dva puta sa PBS-om. Zatim, bunariću kome jc cB273 antitelo dodato, dodat je F(ab')2fragment specifični, peroksidazom konjugovan kozji anti-Humani IgG (proizvodi Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #109-035-097) razblažen 2500-puta sa PBS-om koji sadrži 3% fetalni goveđi serum, u količini 50 ul/bunarić, a u bunariće u koje je TRAIL dodat, anti-FLAG M2 monoklonsko anlitelo-peroksidazom konjugovano razblaženo 2000-puta je dodato u količini 50 ul/bunariću, i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon što je PBS dodat svakom bunariću, tečnost u bunariću je uklonjena, i bunarić je ispran dva puta sa PBS-om. Posle toga, OPD tečnost za razvoj boje je dodata u količini 100 ul/bunariću, pri čemu se razvila boja. Zatim. 1 M HC1 je dodata u količini 100 ul/bunariću, pri čemu je reakcija sa razvijanjem boje zaustavljena. Posle toga, absorbancija na 492 nm je izmerena korišćenjem čitača ploča. S1.2A prikazuje rezultate za cB273, a S1.2B prikazuje rezultate za solubilni TRAIL. Podaci na graficima su predstavljeni srednjom verđnošću ± standardnom devijacijom (n = 3). Kao rezultat pokazano je da se cB273 selektivno veže za ekstracelularni domen humanog TRAIL R2.

3)-2 Procena aktivnosti vezivanja cB273 antitela korišćenjem Biacore-a

3)-2-l Pripremanje humanog DR5 proteina sa ekstracelularnim domenom

3)-2-l-I Proizvodnja ekspresionog vektora DR5 proteina sa ekstracelularnim domenom

[0196] Kako bi se konstruisao vektor koji eksprimira region (u daljem tekstu naznačen kao "sDR5") koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja je prikazana brojevima aminokiselina 1 do 130 humanog DR5 koja je predstavljena sa SEQ ID NO: 23 u Listi Sekvenci, PCR reakcija je izvedena korišćenjem seta prajmera za amplifikaciju sDR5: DR5 Ndefvv: 5'-gtggcatatggctctgatcacccaacaa-3' (SEQ ID NO: 24 u Listi Sekvenci) i DR5 Xhorv: 5'-cgcctcgagtgattctttgtggacaca-3' (SEQ ID NO: 25 u Listi Sekvenci) i takođe korišćenjem cDNK koja kodira humani DR5 ekstracelularni domen kao šablon. Rezultujući PCR proizvod je cepan sa Ndel i XhoI i kloniran u NđeI/XhoI mesto na pET21b(+) (proizvodi Novagen, Inc.)

(u daljem tekstu skraćeno kao "pET21b(+)-sDR5"). Dalje, rekombinantni protein eksprimiran pomoću "pET21b (+) -sDR5" je naznačen kao "rsDR5" (SEQ ID NO: 26 u Listi Sekvenci) u daljem tekstu i na slikama.

3)-2-l-2 Proizvodnja proteina DR5 sa ekstracelularnim domenom (rsDR5)

[0197] Escherichia coli Origami B (DE3) (proizvodi Novagen, Inc.) je transformisana sa exprcsionim plazmidom pET21b(+)-sDR5 i kultivisana u 2-YT medijumu upotpunjenim sa 100 ug/ml ampicillina (proizvodi Sigma Co., Ltd.) i 15 ug/ml kanamicina (proizvodi Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), i ekspresija parcijalnog proteina DR5 jc indukovana adicijom 0.5 mM IPTG. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 6000 rpm tokom 20 minuta i suspendovane u puferu za vezivanje (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl), što je praćeno ultrasoničnom homogenizacijom na ledu. Rezultujući homogenat je centrifugiran na 25000 rpm tokom 20 minuta. Supernatant je obnovljen i primenjen na Ni-NTA (proizvodi Invitrogen Corporation). Nakon što je ispiranje izvedeno sa puferom za vezivanje, elucija je izvedena sa puferom za eluaciju (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl i 300 mM imidazol). Eluirani uzorak je podvrgnut dijalizi sa puferom za dijalizu (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM NaCl) i primenjen na MONO Q, i gradijent elucija je izvedena sa puferom za eluaciju (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M NaCl). Eluirani uzorak je dalje prečišćen gel filtracionom hromatografijom na koloni (Superdex 75 16/60, proizvodi GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.) korišćenjem PBS-a kao rastvarača. Koncentracija tako dobijenog rekombinantnog proteina je izmerena na UV 280 nm (konstanta molarne absorbancije: 14855).

3)-2-2 Mercnje aktivnosti vezivanja korišćenjem Biacore-a

[0198]Konstanta disocijacijc svakog od cB273 antitela i rsDR5 je izmerena korišćenjem Biacore-a 3000 (GE Healthcare Bio-Sciences Co.. Ltd.) pomoću metode hvatanja u kojoj je antitelo hvatano pomoću imobilisanog anti-humanog IgG (Fc) antitela i merenje je izvedeno korišćenjem antigena kao analita. Anti-humano IgG (Fc) antitelo (HumantiteloCapture Kit. GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.) je kovalentno imobilisano na senzorski čip CM5 (BIAcore, Inc.) na oko 8000 RU pomoću metode amino vezivanja. Imobilizacija je izvedena takođe na referentnim ćelijama na isti način. Kao "running" pufer, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, i 0.05% surfaktant P20) je korišćen. Na čip koji ima imobilisano anti-humano IgG (Fc) antitelo, 50 nM cB273 rastvor antitela je dodat sa brzinom protoka od 10 ul/min tokom 60 sekundi i onda, serije razblaženja rsDR5 (0. 63-20 nM) su dodate sa brzinom protoka od 30 (jl/min tokom 60 sekundi i zatim, faza disocijacije je praćena tokom 300 sekundi. Kao rastvor za regeneraciju, 3 M magnezijum hlorid je dodavan sa brzinom protoka od 10 ul/min tokom 30 sekundi. Za analizu podataka, softver za analizu (BIA evaluation software, verzija 3.1) je korišćen sa modelom vezivanja jedan-na-jedan i konstanta stope asocijacije (kon), konstanta stope disocijacije (koff), i konstanta disocijacije (KD; KD = koff/kon) je izračunata. Rezultati dobijeni merenjem pomoću koriŠćenja Biacore-a za cB273 antitelo su prikazani na SI.3.

3) -3 In vitro citocidni efekat cB273 antitela na humane kancerske ćelijske linije

[0199]Citocidni efekat cB273 antitela na različit kancer ćelijske linije je proučavan sledećom metodom. A2780, SK-OV-3, SK-CO-1, Caov-3. i NIII:OVCAR-5 (od koji su sve humane ćelijske linije kancera ovarijuma), HCT-15, COLO 205, HT29, SW480, SW620, DLD-1, COLO 201, i WiDr (od koji su sve humane ćelijske linije kancera debelog creva), NCI-Hl975, NCI-H292, NCI-H460, i NCI-H358 (od koji su sve humane ćelijske linije kancera pluća), MDA-MB-231 i ZR-75-1 (od kijih su obe humane ćelijske linije kancera dojke) su nabavljene od Američke Kolekcije Tipova kultura (American Type Culture Collection - ATCC). Svaka od ovih ćelijskih linija je pripremljena pri 1xIO""<1>ćelija/ml sa medijumom koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (proizvodi HvClone Laboratories, Inc.) (u daljem tekstu naznačen kao "medijum") i zasejane u količini 50 ul/bunariću u mikroploči sa 96-bunarića sa belim prozirnim dnom (proizvodi Corning Incorporated). cB273 antitelo je pripremljeno pri 20000 ng/ml sa 1 ug/ml rastvora sekundarnog antitela (kozji anti-human IgG Fc, proizvodi MP Biomedicals, LLC), i onda pripremljeno pri 2000, 200, 20, i 2 ng/ml sa medijumom, i svaki rezultujući rastvor je dodat ploči u količini 50 ul/bunariću (finalna koncentracija antitela: 10000, 1000, 100, 10, i 1 ng/ml). Nakon sto je ploča inkubirana pod uslovima: 37°C i 5% CO2tokom 72 sata, količina ATP-a dobijena od vijabilnih ćelija u svakom bunariću je izmerena korišćenjem CellTiter-Glo kita za luminescentno određivanje vijabilnosti ćelija (proizvodi Promega Corporation, #G7571) pomoću luminometra (proizvodi Berthold Technologies) prema prisutnom protokolu. Bunarić u koji su medijum i ćelijska suspenzija dodati je pripremljen kao negativni kontrolni bunarić a bunarić u koji je samo medijum dodat je pripremljen kao pozadinski bunarić, i vijabilnost ćelija u svakom test bunariću je izračunata. Na SI.4, srednja vrednost ± standardna greška (n = 3) ćelijske vijabilnosti za svaku kancer ćelijsku liniju tretiranu sa cB273 antitelom je prikazana. cB273 antitelo je pokazalo citocidnu aktivnost na ćelijske linije osim na SK-CO-1.

[0200] In vitro citocidan efekat na različite kancer ćelijske linije jc proučavan korišćenjem BxPC-3 i MIA PaCa-2 (od kojih su obe humane ćelijske linije kancera pankreasa), A2058 i A375 (od kojih su obe humane ćelijske linije melanoma), IJ-87MG (humana ćelijska linija glioblastoma), AN3CA (humana ćelijska linija endometrijalnog kancera) kao testiranih subjekata. Svaka od ovih ćelijskih linija je pripremljena pri koncentraciji 4.4 * 10<4>ćelija/ml sa medijumom koji sadrži 10% FBS i dodata u količini 45 ul/bunariću u mikroploču sa 96-bunarića sa belim prozirnim dnom (proizvodi Corning Incorporated), i ploča je inkubirana preko noći pod sledećim uslovima: 37°C i 5% CO2. cB273 antitelo jc pomešano sa istom koncentracijom kozjeg anti-humanog IgG Fc (proizvodi MP Biomedicals, LLC), i onda je rezultujuća smeša dodata ploči u količini 5 ul/bunariću tako da je finalna koncentracija cB273 antitela bila od 10,000 do 1 ng/ml, i ploča inkubirana pod uslovima: 37°C i 5% CO2tokom 24 sata. Količina ATP-a dobijena od vijabilnih ćelija u svakom bunariću je izmerena korišćenjem CellTiter-Glo kita za luminescentno određivanje vijabilnosti ćelija (proizvodi Promega Corporation, #G7571) pomoću luminometra (proizvodi Perkin Elmer Inc.) prema prisutnom protokolu. Svaki grafik prikazuje ćelijsku vijabilnost izraženu kao srednja vrednost±standardna devijacija (n = 3). Kao rezultat cB273 antitelo je ispoljilo citocidni efekat na sve kancerske ćelijske linije korišćene u studiji (SI.5).

[Primer 4] Identifikacija epitopa cB273 antitela 4)-l Proizvodnja Fab fragmenta cB273

[0201]cB273 je podrvgnut dijalizi sa PBS-om, i onda razblažen do 2 mg/ml sa PBS-om i

pripremljen do konačne zapremine od 17 ml. Cistein (proizvodi Sigma Co., Ltd.) pripremljen u koncentraciji 0.1 mM sa PBS-om u količini od 1.7 ml i papain (proizvodi Sigma Co., Ltd.) razblažen do 0.1 mg/ml sa PBS-om u količini od 2.04 ml su dodati, i reakcija je ostavljena da se nastavi na 37°C tokom 5 sati. Posle 5 sati, N-etilmaleimid (proizvodi Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) rastvoren do 120 mM u PBS-u u količini od 6.33 ml je dodat da se zaustavi reakcija. Rcakcioni rastvor je dodat u Superdex 200 26/60 (proizvodi GE Healthcare, Co., Ltd.) koji je ekvilibrisan sa 50 mM Tris-HCl koji sadrži 20 mM NaCl, i 14 ml frakcije koja odgovara Fab fragmentu je sakupljeno.

4)-2Pripremanje uzorka kompleksa cB273 Fab fragment-rsDRS

[0202]cB273 Fab fragment je koncentrovan do 9.46 mg/ml korišćenjem Amicon Ultra-15

(MWCO: 10 K) (proizvodi Millipore Co.. Ltd.), i 2 ml tako koncentrovanog cB273 Fab fragmenta je pomešano sa 2 ml rsDR5 koji je koncentrovan do 5.6 mg/ml korišćenjem Amicon Ultra-15 (MWCO: 3 K), i rczultujuća smeša je dodata u Superdex 200 16/60 koji je ekvilibrisan sa 20 mM Tris-HCl koji sadrži 50 mM NaCl.

[0203]8 ml frakcije koja odgovara kompleksu je sakupljeno.

4)-3 Kristalizacija i strukturna analiza kompleksa cB273 Fab fragment-rsDR5

[0204]Tako dobijeni rsDR5-cB273 Fab kompleks je koncentrovan do 25 mg/ml, koji je korišćen za kristalizaciju. Za kristalizaciju, metoda difuzije vodene pare je korišćena. Rastvor dobijen dodavanjem jednake količine precipitiranog rastvora (6 do 8% (w/v) polietilen glikol 4000, 20% (v/v) izopropanol, 0.1 M litijum hlorid, 0.1 M citratni pufer (pH 5.6)) u 0.45 do 1.0 ul rastvor proteina je smešten u hermetički zatvorenu posudu, u kojoj je 0.45 ml precipitiranog rastvora već smešteno, tako da oba rastvora nisu došla u kontakt jedan sa drugim, i posuda je ostavljena da stoji na 22°C. Posle 3 dana, kristal u obliku ploče (0.4 mm x 0.3 mm x 0.03 mm) je dobijen.

|0205]Tako dobijeni kristal je uronjen u precipitirani rastvor koji je upotpunjen sa 30% (v/v) glicerola, i onda smrznut u pari azota na -180°C. Podaci dobijeni difrakcijom X-zracima su

sakupljeni u pari azota na 95 K na BL17A u ustanovi Photon Factorv of the Institute of Materials Structure Science in the High Energv Accelerator Research Organization. Na osnovu dobijene slike diffrakcije, intenzitet difrakcije je kvantifikovan korišćenjem IIKL-2000 softvera (proizvodi HKL Research, Inc.). i faktori kristalne strukture su izračunati. Dobijeni kristal je pripadao monokliničkom sistemu, prostorna grupa je bila C2, i kristal je imao parametre jedinične ćelije: a = 152.0 A, b = 75.5 A, c = 116.3 A, i P = 110.2.

[0206]Metoda molekularne zamene je izvedena korišćenjem tako dobijenih strukturnih faktora i tri-dimenzionalnih strukturnih koordinata DR5 (PDB kod: 2H9G) i Herceptin Fab (PDB kod: 1N8Z), i faze su određene. U proračunu, softvvare phaser (CCP4: Collaborative Computational Project No. 4) je korišćen. Kristal je posedovao dva kompleksa u asimetričnoj jedinici.

[0207]Struktura je prerađena korišćenjem CNX softvera (Accerlvs Inc.), i model je korigovan korišćenjem Coot softvera. Ova procedura je ponovljena, i konačna R vrednost od 25.0% i slobodna R vrednost od 28.7% je dobijena pri rezoluciji od 2.1 A. Konačni model se sastojao od dva kompleksa, i sadrži aminokiselinske ostatke 1 do 218 cB273 Fab L lanca (oba molekula), aminokiselinske ostatke 1 do 222 H lanca (oba molekula), aminokiselinske ostatke 18 do 92 i 98 do 127 jednog molekula DR5 od dva molekula, aminokiselinske ostatke 21 do 92 i 98 do 127 drugog molekula DR5, i 324 molekula vode. Nije opažena jasna elektronska gustina za aminokiselinske ostatke 93 do 97 od DR5, 17 ili 20 ostatke u N terminusu DR5, 6 ostatak i His tag u C terminusu DR5, jedan ostatak u C terminusu cB273 Fab L lanca i 5 ostatak u C terminusu cB273 Fab H lanca, i stoga, model nije konstruisan. Model je validiran pomoću Ramachandran dijagrama, i pronađeno je da je samo Val 56 L lanca lociran van dozvoljenog regiona, i ova amino kiselina Val 56 ima strukturnu karakteristiku od CDR L2.

[0208]Interakcije određene između DR5 i cB273 Fab su bile suštinski jednake kod dva molekula u asimetričnoj jedinici. Aminokiselinski ostaci (položaj svakog aminokiselinskog ostatka odgovara tom od SEQ ID NO: 23) od DR5 koji su na rastojanju od 4 A ili manje od cB273 Fab su bili kao što sledi: Gly26, Ile34, Glu36. Asp37, Gly38, Asp56, Leu57, Leu58, Phe59, Leućl, i Arg62. SI.6 prikazuje trakasti model čitavog kompleksa i njegove površine, i SI.7 prikazuje interakciju između DR5 i H ili L lanca cB273 Fab.

[Primer 5] Humanizovanje cB273 antitela (1)

5) -1 Konstruisanje humanizovanog B273 (hB273)

5)-l-l Molekularno Modeliranje varijabilnih regiona B273

(0209]Molekularno modeliranje varijabilnih regiona B273 je izvedeno prema metodi koja je uopšteno poznata kao modeliranje homologije (Methods in Enzymology, 203. 121-153,

(1991)). Primarne sekvence (trodimenzionalne strukture dobijene X-zracima kristalnih struktura su dostupne) varijabilnih regiona humanog imunoglobulina koji je registrovan u proteinskoj banci podataka (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)) su poređene sa varijabilnim regionima B273 određenim gore. Kao rezultat 1T66 je izabran kao sekvenca koja ima najveću homologiju sekvence sa varijabilnim regionom lakog lanca B273. Dalje, 1XIW je izabran kao sekvenca koja ima najveću homologiju sekvence sa varijabilnim regionom teškog lanca B273. Trodimenzionalna struktura okvirnog regiona je pripremljena na osnovu "okvirnog modela" kombinovanjem koordinata 1T66 i 1XIW koje odgovaraju lakom lancu i teškom lancu B273. Za B273 CDRs, CDRL1. CDRL2, CDRL3, CDRH1, i CDRH2 su dodeljene grupe 16A, 7A, 9A, 10A, i 10A, redom, prema klasifikaciji od Thornton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)). CDRH3 je klsaifikovan u k(ll) - prema 113 pravilima (FEBS letters 399, 1-8 (1996)). Zatim, reprezentativna potvrda svakog CDR je ugrađena u okvirni model.

[0210]Konačno, kako bi se dobio mogući molekularni model varijabilnog regiona B273 u energetskom smislu, izračunavanje energije je izvedeno radi isključivanja nepovoljnog kontakta medu atomima. Gornja procedura je izvedena korišćenjem komercijalno dostupnog programa Prime za predviđanje tercijerne strukture proteina i programa za pretragu koordinata MacroModel (Schrodinger, LLC).

5)-l-2 Konstrukcija sekvence aminokiselina humanizovanog B273

[0211]Humanizovano B273 antitelo je konstruisano prema metodi koja je uopšteno poznata kao CDR grafting (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Akceptor antitelo je izabrano na osnovu homologije aminokiselina unutar okvirnog regiona.

[0212]Sekvenca okvirnog regiona B273 je poređena sa svim humanim okvirnim sekvencama u Kabat bazi podataka (Nuc. Kiselina Res. 29, 205-206 (2001)) sekvence aminokiselina antitela. Kao rezultat HuMc3 antitelo jc izabrano kao akceptor na osnovu homologije sekvenci od 76% u okvirnom regionu. Aminokiselinski ostaci u okvirnom regionu HuMc3 su poravnati sa aminokiselinskim ostacima B273, i položaji gde su različite aminokiseline korišćene su identifikovani. Položaji ovih ostataka su analizirani korišćenjem trodimenzionalnog modela B273 koji je gore konstruisan. Zatim, donor ostaci koji treba da budu dodati na akceptor su bili izabrani prema kriterijumu koji je obezbedio Queen et al.

(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)).

[0213] Prenošenjem nekih izabranih ostataka donora akceptorskom antitelu, humanizovane B273 sekvence su konstruisane kao stoje opisano u sledećem Primeru.

5)-1-2 Humanizovanje lakog lanca B273

5)-1-2-1 hB273_Ll-tip lakog lanca:

[0214] Humanizovani laki lanac B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 22 (valin), 27 (treonin), 34 (serin), 35 (leucin), 37 (asparaginska kiselina), 38 (glutamin), 70 (lizin), 108 (leucin), 110 (izoleucin), 112 (fenilalanin), 125 (glicin), i 129 (leucin) lakog lanaca cB273 koji je predstavljen sa SEQ ID NO: 16 u Listi Sekvenci sa izoleucinom, serinom, treoninom, prolinom, glutaminskom kiselinom, prolinom, glutaminom, valinom, valinom, tirozinom, prolinom, i valinom, redom, je nazvan "hB273_Ll-tip lakog lanca".

[0215] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_Ll-tip lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 27 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_Ll-tipa lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 28 u Listi Sekvenci. Sekvence sa brojevima SEQ ID NO: 27 i 28 su takođe prikazane na S1.32.

5)-1-2-2 hB273_L2-tip lakog lanca:

[0216] Humanizovani laki lanac B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 37 (asparaginska kiselina), 38 (glutamin), 108 (leucin), 110 (izoleucin), 125 (glicin), i 129 (leucin) lakog lanaca cB273 koji je predstavljen sa SEQ ID NO: 16 u Listi Sekvenci sa glutaminskom kiselinom, prolinom, valinom, valinom, prolinom, i valinom, redom, je nazvan "hB273_L2- tip lakog lanca".

[0217] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_L2-tip lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 29 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_L2- tipa lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 30 u Listi Sekvenci. Sekvence sa brojevima SEQ ID NO: 29 i 30 su takođe prikazane na SI.33.

5)-1-2-3 hB273_L3-tip lakog lanca:

[0218] Humanizovani laki lanac B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 37 (asparaginska kiselina), 38 (glutamin), 108 (leucin), 110 (izoleucin), i 129 (leucin) lakog lanca cB273 koji je predstavljen sa SEQ ID NO: 16 u Listi Sekvenci sa glulaminskom kiselinom, prolinom, vaiinom, valinom. i valinom, redom, je nazvan "hB273_L3-tip lakog lanca".

[0219] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_L3-tip lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 31 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB27_3 L3-tipa lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 32 u Listi Sekvenci. Sekvence sa brojevima SHQ ID NO: 31 i 32 su takođe prikazane na SI.34.

5)-1-3 Humanizovanje B273 teškog lanca

5)-1-3-1 hB273_Hl-tip teškog lanca:

[0220JHumanizovani težak lanac B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 20 (glutaminska kiselina), 24 (glutamin), 28 (prolin), 30 (leucin), 31 (valin). 39 (izoleucin), 56 (metionin), 57 (lizin), 59 (serin), 60 (histidin), 62 (lizin), 63 (serin), 67 (izoleucin), 86 (lizin), 87 (alanin), 95 (serin), 96 (trconin), 99 (histidin), 103 (leucin), 106 (treonin), 110 (serin), 114 (fenilalanin), 116 (glicin), 136 (treonin), i 137 (leucin) teškog lanca cB273 koji je predstavljen sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci sa glutaminom. valinom, alaninom, valinom, lizinom, valinom, valinom, argininom, alaninom, prolinom, metioninom, glicinom, metioninom, argininom, valinom, trconinom, serinom, tirozinom, serinom, argininom, treoninom, tirozinom, alaninom, leucinom, i valinom, redom, je nazvan "hB273_Hl -tip teškog lanca".

[0221JNukleotidna sekvenca koja kodira hB273_Hl- tip lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 33 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_Hl-tipa teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 34 u Listi Sekvenci. Sekvence sa brojevima SEQ ID NO: 33 i 34 su takođe prikazane na SI.35.

5)-1-3-2 hB273_H2-tip teškog lanca:

[0222]Humanizovani težak lanac B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 20 (glutaminska kiselina), 24 (glutamin), 28 (prolin), 30 (leucin), 31 (valin), 39 (izoleucin), 60 (histidin), 62 (lizin), 95 (serin), 96 (treonin), 99 (histidin). 103 (leucin), 106 (treonin), 110 (serin), 116 (glicin), 136 (treonin), i 137 (leucin) cB273 teškog lanca koji je predstavljen sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci sa glutaminom. valinom, alaninom. valinom. lizinom, valinom, prolinom, metioninom, treoninom, serinom, tirozinom, serinom, argininom, treoninom, alaninom, leucinom, i valinom, redom, je nazvan "hB273_H2-tip teškog lanca".

[0223] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_H2-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 35 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273 H2-lipa teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 36 u Listi Sekvenci. Sekvence sa brojevima SEQ ID NO: 35 i 36 su takođe prikazane na SI.36.

5)-l-3-3 hB273_H3-tip teškog lanac:

[0224] Humanizovani težak lanac B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 24 (glutamin), 28 (prolin), 30 (leucin), 31 (valin), 39 (izoleucin), 60 (histidin); 95 (serin), 96 (treonin), 103 (leucin), 10.6 (treonin). 110 (serin), 136 (treonin), i 137 (leucin) teškog lanca cB273 koji je predstavljen sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci sa valinom, alaninom, valinom, lizinom, valinom, prolinom, treoninom, serinom, serinom, argininom, treoninom, leucinom, i valinom, redom, je nazvan "hB273_II3-tip teškog lanca".

[0225] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_II3-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 37 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_H3-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 38 u Listi Sekvenci. Sekvence sa brojevima SEQ ID NO: 37 i 38 su takođe prikazane na SI.37.

5)-2 Konstrukcija ekspresionih vektora hB273 LI, hB273_L2, i hB273_L3-tipa lakog lanca

[0226] DNK molekuli koji sadrže gen koji kodira hB273_Ll, hB273_L2, ili hB273 L3-tipove varijabilnog regiona lakog lanca predstavljenog sa aminokiselinama sa brojevima 21 do 134 od SEQ ID NO: 28, aminokiselinama sa brojevima 21 do 134 od SEQ ID NO: 30. ili aminokiselinama sa brojevima 21 do 134 od SEQ ID NO: 32 su sintetisani (GENART, Inc. Artificial Gen Svnthesis Service). Zatim, svaki od DNK fragmenata koji je dobijen cepanjem sintetisanih DNK sa restrikcionim enzimima Ndel i BsiWI je insertovan u ekspresioni vektor lakog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEF6KCL) na mestu cepanja sa restrikcionim enzimima Ndel i BsiWI, pri čemu su ekspresioni vektori lakog lanca hB273_Ll, hB273_L2, i hB273_L3-tipova konstruisani. Tako dobijeni ekspresioni vektori su nazvani "PEF6KCL/hB273_Ll", "pEF6KCL/hB273_L2", i "PEF6KCL/hB273_L3", redom.

5)-3 Konstrukcija ekspresionih vektora hB273_Hl, hB273_H2, i hB273_H3-tipa teškog lanca

[0227] DNK molekuli koji sadrže gen koji kodira hB273_Hl, hB273_H2, ili hB273_II3-tipovc varijabilnog regiona teškog lanca predstavljenog sa aminokiselinama sa brojevima 20 do 141 od SEQ ID NO: 34 u Listi Sekvenci, aminokiselinama sa brojevima 20 do 141 od SEQ ID NO: 36, ili aminokiselinama sa brojevima 20 do 141 od SEQ ID NO: 38 su -73- EP 2636736 sintctisani (GENART, Inc. Artificial Gen Svnlhesis Service). Zatim, svaki od DNK fragmenata koji jc dobijen cepanjem sintetisanih DNK sa restrikcionim enzimom BlpI je insertovan u ekspresioni vektor teškog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEFlFCCU) na mestu cepanja sa restrikcionim enzimom BlpI, pri čemu su ekspresioni vektori hB273_FIl, hB273_H2, i hB273_H3-tipa teškog lanca konstruisani. Tako dobijeni ekspresioni vektori su nazvani "pEFIFCCU/hB273_Hl", "pEFIFCCU/hB273_H2", i<M>pEFlFCCU/hB273_H3", redom.

5)-4 Pripremanje humanizovanog antitela

5)-4-l Proizvodnja humanizovanog antitela

[0228]1.2 x IO<9>ćelije FreeStvle 293F ćelija (Invitrogen Corporation) u logaritamskoj fazi rasta su zasejane u 1.2 L svežeg FreeStvle 293 Ekspresionog Medijuma (Invitrogen Corporation) i kultivisane tokom 1 sata uz mešanje na 90 rpm na 37°C u 8% CO2inkubatoru. 3.6 mg polietilenimina (Polvscience #24765) je rastvoreno u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma (Invitrogen Corporation). Zatim, ekspresioni vektor teškog lanca (0.4 mg) i ekspresioni vektor lakog lanca (0.8 mg) pripremljeni sa PureLink HiPure Plazmid Kit-om (Invitrogen Corporation) su suspendovani u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma. Onda, 20 ml od dobijene smeše tečnosti ekspresionih vektora/Opti-Pro SFM je dodato 20 ml dobijenoj polietilenimin/Opti-Pro SFM smeši tečnosti, i rezultujuća smeša je nežno mešana i onda ostavljena tokom 5 minuta. Posle toga, smeša je dodata u FreeStvle 293 F ćelije. Posle 3 sata, Z-VAD-FMK (PEPTID INSTITUTE, Inc.) je dodat tome u finalnoj koncentraciji od 10 uM, i kultura je šejkirana na 90 rpm tokom 7 dana na 37°C u 8% CO2inkubatoru. Rezultujući supernatant kulture je filtriran kroz filler sa kapsulom za jednokratnu upotrebu (Advantec #CCS-045-ElH).

[0229]Humanizovano antitelo cB273 dobijeno kombinacijom pEFlFCCU/hB273_Hl i pEF6KCL/hB273_Ll jc nazvano "hB273_Hl/hB273_Ll", humanizovano antitelo cB273 dobijeno kombinacijom pEFl FCCU/hB273-Hl i pEF6KCL/hB273_L2 je nazvano "hB273_Hl/hB273_L2", humanizovano antitelo cB273 dobijeno kombinacijom pEF3FCCU/hB273_Hl iPEF6KCL/hB273_L3 je nazvano "hB273_Hl/hB273_L3", humanizovano antitelo cB273 dobijeno kombinacijom pEFlFCCU/hB273_H2 i pEF6KCL/hB273_Ll je nazvano "hB273_H2/hB273_Ll", humanizovano antitelo cB273 dobijeno kombinacijom pEFlFCCU/hB273_H2 i pEF6KCL/hB273_L2 je nazvano "hB273_FI2/hB273_L2", humanizovano antitelo cB273 dobijeno kombinacijomPEFlFCCU/hB273_H2 i pEF6KCL/hB273_L3 jc nazvano "hB273_H2/hB273_L3<M>, humanizovano antitelo cB273 dobijeno kombinacijom pEFlFCCU/hB273_H3 i pEF6KCL/hB273_Ll je nazvano "hB273_H3/hB273_L!", humanizovano antitelo cB273 dobijeno kombinacijomPEFlFCCU/hB273_H3 i pEF6KCL/hB273_L2 je nazvano "hB273JH3/hB273_L2", i humanizovano antitelo cB273 dobijeno kombinacijom pEFlFCCU/hB273_F13 i pEF6KCL/hB273_ L3 je nazvano "hB273_H3/hB273_L3".

5) -4-2 Prečišćavanje humanizovanog antitela

[0230] Supernatant kulture dobijen gore pod 5)-4-l je prečišćen dvostepenim procesom uključujući rProtein A afinitetnu hromatografiju (na 4 do 6°C) i keramički hidroksiapatit (na sobnoj temperaturi). Korak zamcne pufera posle prečišćavanja rProtein A afinitetnom hromatografijom i posle prečišćavanja keramičkim hidroksiapatitom je izveden na sobnoj temperaturi. Prvo, 1100 do 1200 ml supernatanta kulture je primenjeno na MabSelect SuRe (proizvodi GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone (zapremina: 1 ml) povezane u serijama) koje su ekvilibrisane sa PBS-om. Pošto je rastvor svih kultura sipan u kolonu, kolona je isprana sa 15 do 30 ml PBS-a. Zatim, elucija je izvedena sa 2 M arginin hidrohlorid rastvorom (pH 4.0), i frakcija koja sadrži antitelo je sakupljena. Frakcija je primenjena na kolonu za desalinizaciju (proizvodi GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je pufer zamenjen sa puferom koji sadrži 5 mM natrijum fosfat, 50 mM MES, i 20 mM NaCl na pH 6.5. Dalje, rastvor antitela koji je podvrgnut zameni pufera je primenjen na kolonu keramičkog hidroksiapatita (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1 hidroksiapatit kolona (zapremina: 2 ml) koja je ekvilibrisana sa puferom koji sadrži 5 mM NaPi, 50 mM MES, i 20 mM NaCl na pH 6. 5. Zatim, elucija sa linearnim koncentracionim gradijentom sa natrijum hloridom je izvedena, i frakcija koja sadrži antitelo je sakupljena. Frakcija je primenjena na kolonu za desalinizaciju (proizvodi GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je tečnost zamenjena sa CBS-om (10 mM citratni pufer koji sadrži 140 mM natrijum hlorid, pH 6.0). Konačno, rezultujući rastvor je koncentrovan korišćenjem Centrifugal UF Filter Uređaja VIVASPIN 20 (molekulska masa frakcije: 30 K, Sartorius Co., Ltd., na 4°C), i koncentracija IgG je podešena na 1.0 mg/ml ili više, i tako dobijeni rastvor je korišćen kao prečišćen uzorak.

[Primer 6] Merenje aktivnosti humanizovanog B273 (hB273) antitela (1)

6) -l Procena vezivanja aktivnosti hB273 antitela korišćenjem Biacore-a

[0231]Konstanta disocijacije svakog od humanizovanih anti-DR5 antitela i rsDR5 je izmerena korišćenjem Biacore-a TI00 (GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.) metodom hvatanja u kojoj je antitelo hvatano imobilisanim anti-humanim IgG (Fc) antitelom i merenje je izvedeno korišćenjem antigena kao analita. Anti-humano IgG (Fc) antitelo (Human Antibodv Capture Kit, GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.) je kovalentno imobilisano na senzor čipu CM5 (BIAcore, Inc.) na oko 10,000 RU pomoću metode vezivanja amina. Imobilisanje je takođe izvedeno na referentnim ćelijama na isti način. Kao "ruiining'1 pufer, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, i 0.05% surfaktant P20) je korišćen. Na čip sa imobilisanim anti-humanim IgG (Fc) antitelom, rastvor antitela od oko 20 nM je dodavan sa brzinom protoka od 10 ul/min tokom 60 sekundi i zatim, serije razblaženja rsDR5 (3.13-50 nM) su dodavane sa brzinom protoka od 30 ul/min tokom 120 sekundi i zatim, faza disocijacije je praćena tokom 180 sekundi. Kao rastvor za regeneraciju, 3 M magnezijum hlorid je dođavan sa brzinom protoka od 10 ul/min tokom 30 sekundi. U analizi podataka, softver za analizu (Biacore TI00 Evaluation softvvare, verzija 2.0.1) je korišćen sa modelom za vezivanje jedan-na-jedan, i asocijacija, konstanta brzine (kon), konstanta brzine disocijacije (koff), i konstanta disocijacije (KD; KD = koff/kon) su izračunate. Rezultati dobijeni merenjem pomoću korišćenja Biacore-a za 9 tipova humanizovanog DR5 antitela su prikazani na SI.8.

6)-2 In vitro citocidna aktivnost hB273 antitela na humanoj kancerskoj ćelijskoj liniji

[0232]AffiniPure F(ab')2 fragment kozjeg anti-humanog IgG specifičnog za Fc fragment (proizvodi Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #109-006-098) pripremljen kao 50 ug/ml sa 50 mM Tris-HCl (pH 8.5) je nanet u količini 45 uL/bunariću u mikroploču sa 96-bunarića (proizvodi Corning Incorporated), i ploča jc ostavljena da stoji preko noći na 4°C. Nakon što je svaki bunarić ispran dva puta sa PBS-om. supernatant kulture 293F kome je dopušteno da proizvodi antitelo pod 5)-4-l, prečišćeno cB273 antitelo (Primer 2-3-2), ili komercijalno dostupno humano IgG (proizvodi Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #009-000-003) je dodato u količinui 50 uL/bunariću tako da je konačna koncentracija antitela bila od 150 do 1.5 ng/ml, i ploča je ostavljena da stoji preko noći na 4°C. Nakon što jc svaki bunarić ispran dva puta sa PBS-om, Jurkat ćelije pripremljene u koncentraciji 4.0 x IO<4>ćelija/ml u RPMI 1640 medijumu koji sadrži 10% FBS-a su dodate u količini 50 ul/bunariću i kultivisane pod uslovima 37°C i 5% CO2tokom 23 sata. Količina ATP-a dobijena od živih ćelija je kvantitativno određena korišćenjem CellTiter-Glo kita za luminiscentno određivanje vijabilnosti ćelija (proizvodi Promega Corporation, #G7571), i citocidni efekat svakog hB273 antitela je procenjen uzimanjem vrednosti dobijene iz bunarića kome je dodat medijum umesto rastvora antitela kao 100%. Kao rezultat, kao stoje prikazano na SI.9. sa obzirom na humanizovanje teškog lanca B273, primećena je tendencija da antitela koja sadrže III -tip teškog lanca ispoljavaju malo niži citocidni efekat u odnosu na antitela koja sadrže 112 ili H3-tip teškog lanca. Sa druge strane, što se tiče humanizovanja lakog lanca B273, pronađeno je da antitela koja sadrže bilo koji od konstruisanog LI, L2, i L3-tipa lakog lanca mogu da ispoljavaju suštinski isti citocidni efekat.

[Primer 7] Humanizovanje cB273 antitela (2)

7)-l Konstrukcija humanizovanog B273 (hB273)

7)-l-l Konstrukcija sekvence aminokiselina humanizovanog B273

[0233] Na osnovu rezultata konstrukcije humanizovanog antitela (1) prikazanog u Primerima 5 i 6, pomoću transfera nekih donorskih ostataka do antitela akceptora, sekvenca humanizovanog B273 je konstruisana kako je opisano u sledećem primeru.

7)-l-2 Konstrukcija sekvence aminokiselina humanizovanog B273

7V-1-2-1 hB273_Hl-l-tip teškog lanca:

[0234] Težak lanac humanizovanog B273 konstruisan je supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 20 (glutaminska kiselina), 24 (glutamin), 28 (prolin), 30 (leucin), 31 (valin), 39 (izoleucin), 57 (lizin), 59 (serin), 60 (histidin), 62 (lizin), 63 (serin), 67 (izoleucin), 86 (lizin), 87 (alanin), 95 (serin), 96 (treonin), 99 (histidin), 103 (leucin), 106 (treonin), 110 (serin), 136 (treonin), i 137 (leucin) teškog lanca cB273 predtsavljene sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci sa - glutamin, valin, alanin, valin, lizin, valin, arginin, alanin, prolin, metionin, glicin, metionin, arginin, valin, treonin, serin, tirozin, serin, arginin, treonin, leucin, ivalin, odgovarajuće, je nazvan "hB273_Hl-l-tip teškog lanac".

[0235] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_Hl-l-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 39 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_Hl-l-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 40 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 39 i 40 su takođe prikazane na SI. 38.

7)-l-2-2 hB273_H2-l-tip teškog lanca:

[0236] Težak lanac humanizovanog B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 24 (glutamin), 28 (prolin), 30 (leucin), 31 (valin), 39 (izoleucin), 60 (histidin), 62 (lizin), 95 (serin), 96 (treonin), 99 (histidin), 103 (leucin), 106 (treonin), 110 (serin), 116 (glicin), 136 (treonin), i 137 (leucin) teškog lanca cB273 predstavljena sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci sa - valin, alanin, valin, lizin, valin, prolin. metionin, treonin, serin. tirozin, serin, arginin, treonin, alanin, leucin, i valin, odgovarajuće, je nazvan "hB273 112-1 -tip teškog lanca". [0237JNukleotidna sekvenca koja kodira hB273_H2-l-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 41 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_H2-l-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 42 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 41 i 42 su takođe prikazane na SI. 39.

7)1-2-3 hB273_H2-2-tip teškog lanca:

[0238]Težak lanac humanizovanog B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 20 (glutaminska kiselina), 24 (glutamin), 28 (prolin), 30 (leucin), 31 (valin). 39 (izoleucin), 60 (histidin), 62 (lizin), 95 (serin), 96 (treonin), 103 (leucin), 106 (treonin), 110 (serin), 116 (glicin), 136 (treonin), i 137 (leucin) teškog lanca cB273 predstavljene sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci sa - glutamin, valin, alanin. valin, lizin, valin, prolin, metionin, treonin, serin. serin, arginin, treonin, alanin, leucin. i valin, odgovarajuće, je nazvan "hB273_H2-2-tip teškog lanca". [0239JNukleotidna sekvenca koja kodira hB273_H2-2-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 43 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_H2-2-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 44 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 43 i 44 su takođe prikazane na SI. 40.

7)1-2-4 hB273_H2-3-tip teškog lanca:

[0240]Težak lanac humanizovanog B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 24 (glutamin), 28 (prolin), 30 (leucin), 31 (valin), 39 (izoleucin), 60 (histidin), 62 (lizin), 95 (serin), 96 (treonin), 103 (leucin), 106 (treonin), 110 (serin), 116 (glicin), 136 (treonin), i 137 (leucin) teškog lanca cB273 predstavljene sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci with valin, alanin, valin, lizin. valin, prolin, metionin, treonin, serin, serin, arginin, treonin, alanin, leucin, i valin, odgovarajuće, je nazvan "hB273_H2-3-tip teškog lanca".

[0241]Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_H2-3-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 45 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_H2-3-lip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 46 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 45 i 46 su takođe prikazane na SI. 41.

7)-1-2-5 hB273_H2-4-tipteškoglanca:

[0242] Težak lanac humanizovanog B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 20 (glutaminska kiselina). 24 (glutamin), 28 (prolin), 30 (leucin). 31 (valin), 39 (izoleucin), 60 (histidin), 62 (lizin), 95 (serin). 96 (treonin), 99 (histidin), 103 (leucin), 106 (treonin), 110 (serin), 136 (treonin), i 137 (leucin) teškog lanca cB273 predstavljene sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci sa - glutamin, valin, alanin, valin, lizin, valin, prolin, metionin, treonin, serin, tirozin, serin, arginin, treonin, leucin, i valin, odgovarajuće, je nazvan "hB273_H2-4-tip teškog lanca".

[0243] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_H2-4-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 47 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_H2-4-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 48 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 47 i 48 su takođe prikazane na SI. 42.

7) -1-2-6 hB273_H2-5-tip teškog lanca:

[0244] Težak lanac humanizovanog B273 konstruisan supstituisanjem aminokiselina sa brojevima 20 (glutaminska kiselina), 24 (glutamin), 28 (prolin), 30 (leucin). 31 (valin), 39 (izoleucin), 60 (histidin), 95 (serin), 96 (treonin), 99 (histidin), 103 (leucin), 106 (treonin). 110 (serin), 136 (treonin), i 137 (leucin) teškog lanca cB273 predstavljene sa SEQ ID NO: 20 u Listi Sekvenci sa - glutamin, valin, alanin, valin, lizin, valin, prolin, treonin, serin, tirozin, serin, arginin, treonin, leucin, i valin, odgovarajuće, je nazvan "hB273_H2-5-tip teškog lanca". (0245] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_H2-5-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 49 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273__H2-5-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 50 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 49 i 50 su takođe prikazane na SI. 43.

7)-2 Konstrukcija ekspresionih vektora hB273_Hl-l, hB273 H2-1, hB273_H2-2, hB273_H2-3, hB273_H2-4, i hB273_H2-5-tipa teškog lanca

[0246] DNK molekuli koji sadrže gen koji kodira varijabilni region hB273_Hl-l, hB273_H2-l, hB273_H2-2, hB273_H2-3. hB273_H2-4, ili hB273_H2-5-tipa teškog lanca predstavljeni su sa brojevima amino kiselina 20 do 141 od SEQ-ID NO: 40 u Listi Sekvenci, brojevima amina kiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 42, brojevima amino kiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 44, brojevima amino kiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 46, brojevima amino kiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 48, ili brojevima amino kiselina 20 do 141 od SEQ ID NO: 50 su sintetisani (GENART, Inc. Artificial Gen Svnthesis Service). Zatim, svaki od DNK fragmenata dobijen cepanjem sintetisanih DNK sa restrikcionim enzimom BlpI je insertovan u ekspresioni vektor teškog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEFlFCCU) na mestu iscepanom pomoću restrikcionog enzima BlpI. pri čemu su konstruisani ekspresioni vektori hB273_Hl-l, hB273_H2-L hB273_H2-2, hB273_H2-3, hB273_H2-4, i hB273_H2-5-lip teškog lanca. Tako dobijeni ekspresioni vektori su nazvani MpEFlFCCU/hB273_Hl-r, "pEFlFCCU/hB273_H2-l", "PEFlFCCU/hB273_H2-2",<M>pEFlFCCU/hB273_H2-3", "PEFlFCCU/hB273_H2-4". i "pEFl FCCU/hB273_H2-5", odgovarajuće.

7)-3 Priprema humanizovanog antitela

7)-3-l Proizvodnja humanizovanog antitela

[0247] 1.2 x IO<9>ćelija od FreeStvle 293F ćelija (Invitrogen Corporation) u logaritamskoj fazi rasta su zasejane u 1.2 L svežeg FreeStvle 293 Expression Medijuma (Invitrogen Corporation) i kultivisane tokom 1 sata šejkiranjem na 90 rpm na 37°C u 8% CO2inkubatoru. 3.6 mg polietilenimina (Polvscience #24765) je rastvoreno u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma (Invitrogen Corporation). Zatim, ekspresioni vektor teškog lanca (0.4 mg) i ekspresioni vektor lakog lanca (0.8 mg) koji pripremljeni sa PureLink HiPure Plazmid Kitom (Invitrogen Corporation) su suspendovani u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma. Onda, 20 ml od dobijenih ekspresionih vektora/Opti-Pro SFM smeše tečnosti jc dodato u 20 ml dobijene polietilenimin/Opti-Pro SFM smeše tečnosti, i rezultujuća smeša je nežno mešana i zatim ostavljena tokom 5 minuta. Posle toga, smeša je dodat u FreeStvle 293F ćelije. Posle 3 sata, Z-VAD-FMK (PEPTID INSTITUTE, Inc.) je dodat tome u finalnoj koncentraciji od 10 uM, i šejkiranje kulture na 90 rpm je izvedeno tokom 7 dana na 37°C u 8% CO2inkubatoru. Rezultujući supernatant kulture je filtriran kroz filter sa kapsulom za jednokratnu upotrebu (Advantec #CCS-045-ElH).

[0248] Humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijom pEFlFCCU/hB273_Hl-l i pEF6KCL/hB273_Ll je nazvan "hB273_Hl-l/hB273_Ll", humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijom pEFlFCCU/hB273_H2-l i pEF6KCL/hB273_Ll je nazvano "hB273_H2-l/hB273_L l", humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijomPEFlFCCU/hB273_H2-2 i pEF6KCL/hB273_Ll je nazvano "hB273_H2-2/hB273_Ll". humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijom pEFlFCCU/hB273_H2-3 i pEF6KCL/hB273 LI je nazvano "hB273_H2-3/hB273_Ll", humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijom od pEFlFCCU/hB273_H2-4 i pEF6KCL/hB273_Ll je nazvano "hB273_H2-4/hB273_Ll", i humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijom od pEFlFCCU/hB273_H2-5 i pEF6KCL/hB273_Ll je nazvano "hB273_H2-5/hB273_Ll".

7) -3-2 Prečišćavanje humanizovanog antitela

[0249] Supernatant kulture dobijen u gornjem 7) -3-1 je prečišćen procesom od dva koraka uključujući rProtein A afmitetnu hromatografiju (na 4 to ć°C) i keramički hidroksiapatit (na sobnoj temperaturi). Korak zamene pufera posle prečišćavanja pomoću rProtein A afinitetne hromatografije i posle prečišćavanja pomoću keramičkog hidroksiapatita jc izveden na sobnoj temperaturi. Prvo, 1100 do 1200 ml supernatanta kulture je primenjeno na MabSelect SuRe (proizvedeno od strane GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone (zapremina: 1 ml) povezane u serijama) koji je ekvilibrisan sa PBS. Nakon Što je sav rastvor kulture nanet na kolonu, kolona je isprana sa 15 do 30 ml PBS. Zatim, elucija je izvedena sa 2 M rastvora arginin hidrohlorida (pH 4.0), i frakcija koja sadrži antitelo je sakupljena. Frakcija je primenjena na koloni za desalinizaciju (proizvedeno od strane GE Healthcare Bio-Sciences Co.. Ltd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je pufer zamenjen sa puferom koji sadrži 5 mM natrijum fosfata, 50 mM MES, i 20 mM NaCl pri pH 6.5. Dalje, rastvor antitela koji je podvrgnut zameni pufera je primenjen na koloni od keramičkog hidroksiapatita (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1 kolona od hidroksiapatita (zapremina: 2 ml)) koja je ekvilibrisana sa puferom koji sadrži 5 mM NaPi, 50 mM MES, i 20 mM NaCl na pH 6.5. Zatim, linearna koncentraciona gradijentna elucija sa natrijum hloridom je izvedena, i frakcija koja sadrži antitelo je sakupljena. Frakcija je primenjena na koloni za desalinizaciju (proizveo GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je tečnost zamenjena sa CBS (10 mM citratni pufer sadrži 140 mM natrijum hlorida, pH 6.0). Konačno, rezultujući rastvor je koncentrovan korišćenjem uređaja Centrifugal UF Filter Device V1VASPIN 20 (frakciona molekulska masa: 30 K, Sartorius Co., Ltd., na 4°C). i koncentracija IgG je podešena na 1.0 mg/ml ili više, i tako dobijen rastvor je korišćen kao prečišćeni uzorak.

[Primer 8] Merenje aktivnosti humanizovanog B273 (hB273) antitela (2)

8) -l Procena vezivanja aktivnosti hB273 antitela korišćenjem Biacore-a

[0250] Konstanta disocijacije svakog od humanizovanih anti-DR5 antitela i rsDR5 je izmerena korišćenjem Biacore-a T100 (GE Healthcare Bio-Sciences Co.. Ltd.) pomoću metode hvatanja u kojoj su antitela uhvaćena od strane imobilisanog anti-humanog IgG (Fc) antitela i merenje je izvedeno korišćenjem antigena kao analita. Anti-humano IgG (Fc) antitelo (Human Antibodv Capture Kit. GE Healthcare Bio-Sciences Co.. Ltd.) je kovalentno imobilisano na senzorski čip CM5 (BlAcore, Inc.) na oko 10.000 RU pomoću metode aminskog kuplovanja. Imobilizacija je takođe izvedena na referentnoj ćeliji na isti način. Kao "running" pufer, HBS-EP (10 mM HEPES pll 7.4. 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, i 0.05% surfaktant P20) je korišćen. Na čip koji ima anti-humano IgG (Fc) antitelo imobilisano na njemu, rastvor antitela na oko 20 nM je dodat sa brzinom protoka od 10 ul/min za 60 sekundi i onda, serija razblaženja rsDR5 (3.13-50 nM) je dodata sa brzinom protoka od 30 ul/min za 120 sekundi i zatim, faza disocijacije je praćena tokom 180 sekundi. Kao rastvor za regeneraciju, 3 M magnezijum hlorid je dodat sa brzinom protoka od 10 ul/min tokom 30 sekundi. U analizi podataka, softver za analizu (Biacore TI00 Evaluation softvvare. verzija 2.0.1) je korišćen sa modelom vezivanaj jedan-na-jedan, i konstanta brzine asocijacije (kon), konstanta brzine disocijacije (koff), i konstanta disocijacije (KD; KD = koff/kon) su izračunate. Rezultati dobijeni merenjem uz pomoć Biacore-a za 6 tipova humanizovanih DR5 antitela su prikazani na SI. 10.

8)-2Invitro citocidna aktivnost B273 antitela protiv humane kancerske ćelijske

linije

[0251J AffiniPure F(ab')2fragment kozjeg anti-humanog IgG specifičnog za Fc fragment (proizveo Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.. #109-006-098) pripremljen na 50 ug/ml sa 50 mM Tris-HCl (pH 8.5) je nanet u 45 u.L/bunarić u mikro ploči sa 96-bunarića (proizveo Corning Incorporated), i ploča je ostavljena da stoji preko noći na 4°C. Nakon Što je svaki bunarić ispran dva puta sa PBS, supernatant kulture od 293F kome je dozvoljeno da proizvede antitelo u 7)-3-l je dodat na 50 uL/bunarić tako daje finalna koncentracija antitela bila od 150 do 1.5 ng/ml, i ploča je ostavljena da stoji preko noći na 4°C. Nakon stoje svaki bunarić ispran dva puta sa PBS, Jurkat ćelije pripremljene na 4.0 x IO<4>ćelija/ml u RPMI 1640 medijuma koji sadrži 10% FBS su dodate u 50 ul-/bunarić i kultivisane pod uslovima 37°C i 5% CO2tokom 23 sata. Količina ATP dobijenog od vijabilnih ćelija je kvantitativno određena korišćenjem kita za testiranje vijabilnosti ćelija luminiscencijom CellTiter-Glo assay kit (proizveo Promega Corporation, #G7571), i citocidni efekat svakog od hB273 antitela je procenjen uzimanjem vrednosti koja je dobijena od bunarića kome je dodat medijum umesto rastvora antitela kao 100%. Kao rezultat, prikazan na SI. 11, primećena je tendencija za hB273_Hl-l/LI antitelo da pokazuje višu citiocidnu aktivnost nego hB273_Hl/Ll antitelo, na osnovu kojih je hB273_Hl-l/Ll antitelo bilo konstruisano. Sa druge strane, hB273_H2-l/Ll to hB273_H2-5/Ll antitela pokazala su suštinski isti citocidni

efekat kao hB273_H2/Ll antitelo, na osnovu kojih su antitela hB273_112-l/L 1 do hB273_H2-5/Ll bila konstruisana.

[Primer 9] Uklanjanje mesta deamidacije iz CDR cB273 antitela 9) -1 Konstrukcija mutanta i konstrukcija ekspresionog vektora

9)-l-l Konstrukcija mutanta

[0252] Uopšteno, deamidacija asparagina u proteinu se nastavlja kroz formiranje prelaznog stanja cikličnog sukcinimida između asparagina i susedno amino kiselini na C-terminalnoj strani (Geiger, T. and Clarke, S. (1987) Deamidation, Isomerization, and racemization at asparaginvl and aspartvl residues in peptids. Sukcinimid-linked reactions that contribute to protein degradation. J. Biol. Chem. 262, 785-794). Faktor ograničavanja brzine formiranja prelaznog stanja je veličina bočnog lanca seusedne amino kiseline, i stoga, glicin koji ima najmanji bočni lanac može da dostigne najveću brzinu deamidacije. Sa druge strane, supstitucijom susedne grupe na C-terminalnoj strani sa amino kiselinom koja ima veliki bočni lanac, brzina deamidacije može biti potisnuta. B273 antitelo ima -N-G- (asparagin-glicin) sekvencu koja je podložna deamidaciji i u L lancu i u H lancu. Stoga, postojeći pronalazači proizveli su mutante sa tačkastom mutacijom u kojima je susedna grupa izmenjena iz glicina u lizin, fenilalanin, leucin, ili glutaminsku kiselinu, svaka od kojih ima veći bočni lanac nego glicin. Tako jc, konstrukcija mutanata izvedena tako daje u II lancu, -N-G-(asparagin-glicin) sekvenca bila mutirana u -N-E-(asparagin-glutaminska kiselina) sekvencu, i u L lancu, -N-G-(asparagin-glicin) sekvenca je bila mutirana u -N-L-(asparagin-leucin) sekvencu, -N-F-(asparagin-fenilalanin) sekvencu, -N-K-(asparagin-lizin) sekvencu, ili -N-E- (asparagin-glutaminska kiselina) sekvencu.

9)-l-2 Konstrukcija ekspresionog vektora lakog lanca hB273_Ll-NE-tipa

[0253] Korišćenjem pEF6KCL/hB273_Ll koji je ekspresioni vektor lakog lanca hB273_Ll-tipa proizvedenog u Primeru 5 kao šablona, DNK fragment koji je dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera A i DNK fragment je dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera B su vezani jedan za drugi pomoću preklapajuće ekstenzione PCR metode korišćenjem seta prajmera C. DNK fragment dobijen cepanjem tako dobijenog DNK fragmenta sa restrikcionim enzimima Nhel i PmeI je insertovan u ekspresioni vektor lakog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEF6KCL) na mestu koje je iscepano pomoću restrikcionih enzima Nhel i PmeI, pri čemu je konstruisan ekspresioni vektor lakog lanca hB273_Ll-NE-u kome je glicin na amino kiselini broj 54 od SEQ ID NO: 28 bio supstituisan sa glutaminskom kiselinom. Tako dobijeni ekspresioni vektor je nazvan "PEF6KCL/hB273_Ll-NE".

[0254] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_Ll-NE-tip lak lanac je predstavljena sa SEQ ID NO: 51 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina lakog lanca hB273_Ll-NE-tipa je predstavljena sa SEQ ID NO: 52 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 51 i 52 su takođe prikazane na SI. 44.

Set prajmera A

5'-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3' (L-Fl: SEQ ID NO: 53 u Listi Sekvenci)

5'-ccaatgcaggtaagtgttctcattgctatggaccagtgactg-3' (L-NE-R2: SEQ ID NO: 54 u Listi Sekvenci)

Set prajmera B

5'-cagtcactggtccatagcaatgagaacacttacctgcattgg-3' (L-NE-F2: SEQ ID NO: 55 u Listi Sekvenci)

5'-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3' (L-Rl: SEQ IDNO: 56 u Listi Sekvenci)

Set prajmera C

5'-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3' (L-Fl: SEQ ID NO: 53 u Listi Sekvenci) 5'-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3' (L-Rl: SEQ ID NO: 56 u Listi Sekvenci)

9)-l-3 Konstrukcija ekspresionog vektora lakog lanca hB273_Ll-NF-tipa

(0255] Korišćenjem pEF6KCL/hB273_Ll koji je ekspresioni vektor lakog lanca hB273_Ll-tipa proizveden u Primeru 5 kao šablon, DNK fragment dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera A i DNK fragment dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera B su vezani jedan za drugi pomoću preklapajuće ekstenzione PCR metode korišćenjem seta prajmera C. DNK fragment dobijen cepanjem tako dobijenog DNK fragmenta sa restrikcionim enzimima Nhel i PmeI je insertovan u ekspresioni vektor lakog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEF6KCL) na mestu koje je iscepano pomoću restrikcionih enzima Nhel i PmeI, pri čemu je konstruisan ekspresioni vektor lakog lanca hB273_Ll-NF-tipa u kome je glicin na amino kiselini broj 54 od SEQ ID NO: 28 bio supstituisan sa fenilalaninom. Tako dobijeni ekspresioni vektor je nazvan "pEF6KCL/hB273_Ll -NF".

[0256] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_Ll-NF-tip lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 57 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_LI-NF-tipa lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 58 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 57 i 58 su takođe prikazane na SI. 45.

Set prajmera A

5'-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3' (L-Fl: SEQ ID NO: 53 u Listi Sekvenci)

5'-ccaatgcaggtaagtgttgaaattgctatggaccagtgactg-3' (L-NF-R2: SEQ ID NO: 59 u Listi Sekvenci)

Set prajmera B

5'-cagtcactggtccatagcaatttcaacacttacctgcattgg-3' (L-NF-F2: SEQ ID NO: 60 u Listi Sekvenci)

5'-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3' (L-Rl: SEQ IDNO: 56 u Listi Sekvenci)

Set prajmera C

9)-l-4 Konstrukcija ekspresionog vektora lakog lanca hB273_Ll-NK-tipa

[0257]Korišćenjem pEF6KCL/hB273_L1 koji je ekspresioni vektor lakog lanca hB273_Ll-tipa proizveden u Primeru 5 kao šablon, DNK fragment dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera A i DNK fragment dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera B su vezani jedan za drugi pomoću preklapajuće ekstenzione PCR metode korišćenjem seta prajmera C. DNK fragment dobijen cepanjem tako dobijenog DNK fragmenta sa restrikcionim enzimima Nhel i PmeI je inscrtovan u ekspresioni vektor lakog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEF6KCL) na mestu koje je iscepano pomoću restrikcionih enzima Nhel i PmeI pri čemu je konstruisan ekspresioni vektor lakog lanca hB273_Ll-NK-tipa u kome je glicin na amino kiselini broj 54 od SEQ ID NO: 28 bio supstituisan sa lizinom. Tako dobijeni ekspresioni vektor je nazvan "pEF6KCL/hB273-Ll-NK". |0258]Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_Ll-NK-tip lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 61 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_Ll-NK-tipa lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 62 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 61 i 62 su takođe prikazane na SI. 46.

Set prajmera A

5'-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3' (L-Fl: SEQ ID NO: 53 u Listi Sekvenci)

5'-ccaatgcaggtaagtgttcttattgctatggaccagtgactg-3' (L-NK-R2: SEQ II) NO: 63 u Listi Sekvenci)

Set prajmera B

5'-cagtcactggtccatagcaataagaacacttacctgcattgg-3' (L-NK-F2: SHQ ID NO: 64 u Listi Sekvenci)

5'-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3' (L-Rl: SEQ IDNO: 56 u Listi Sekvenci)

Set prajmera C

5'-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3' (L-Fl: SEQ ID NO: 53 u Listi Sekvenci) 5'-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3' (L-Rl: SEQ IDNO: 56 u Listi Sekvenci) 9)-l-5 Konstrukcija ekspresionog vektora lakog lanca hB273_Ll-NL-tipa

[0259] Korišćenjem pEF6KCL/hB273_Ll koji je ekspresioni vektor hB273_Ll-tipa lakog lanca proizveden u Primeru 5 kao šablon, DNK fragment dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera A i DNK fragment dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera B su vezani jedan za drugi pomoću preklapajuće ekstenzione PCR metode korišćenjem seta prajmera C. DNK fragment dobijen cepanjem tako dobijenog DNK fragmenta sa restrikcionim enzimima Nhel and PmeI je insertovan u ekspresioni vektor lakog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEF6KCL) na mestu koje je iscepano pomoću restrikcionih enzima Nhel i PmeI, pri čemu je konstruisan ekspresioni vektor lakog lanca hB273_Ll-NL-tipa u kome je glicin na amino kiselini broj 54 od SEQ ID NO: 28 bio supstituisan sa leucinom. Tako dobijeni ekspresioni vektor je nazvan "pEF6KCL/hB273_Ll-NL".

[0260] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_Ll-NL-tip lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 65 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_Ll-NL-tipa lakog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 66 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 65 i 66 su takođe prikazane na SI. 47.

Set prajmera A

5'-aggtaagcttgctagcgccaccat-ggtgctgc-3' (L-Fl: SEQ ID NO: 53 u Listi Sekvenci)

5'-ccaatgcaggtaagtgttcagattgctatggaccagtgactg-3' (L-NL-R2: SEQ ID NO: 67 u Listi Sekvenci)

Set prajmera B

5'-cagtcactggtccatagcaatctgaacacttacctgcattgg-3' (L-NL-F2: SEQ ID NO: 68 u Listi Sekvenci)

5'-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3' (L-Rl: SKQ ID NO: 56 u Listi Sekvenci)

Set prajmera C

5'-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3' (L-Fl: SEQ IDNO: 53 u Listi Sekvenci) 5'-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3' (L-Rl: SEQ ID NO: 56 u Listi Sekvenci) 9)-l-6 Konstrukcija ekspresionog vektora teškog lanca hB273_H2-l-NE-tipa

[0261] Korišćenjem pEFlFCCU/hB273_H2-l koji je ekspresioni vektor teškog lanca hB273_H2-l-tipa proizveden u Primeru 7 kao šablon, DNK fragment dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera A i DNK fragment dobijen izvođenjem PCR reakcije korišćenjem seta prajmera B su vezani jedan za drugi pomoću preklapajuće ekstenzione PCR korišćenjem seta prajmera C. DNK fragment dobijen dobijen cepanjem tako dobijenog DNK fragmenta sa restrikcionim enzimima Nhel i PmeI je insertovan u ekspresioni vektor teškog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEFlFCCU) na mestu koje je iscepano pomoću restrikcionih enzima Nhel i PmeI, pri Čemu je konstruisan ekspresioni vektor hB273_H2-l-NE-tipa teškog lanca u kome je glicin na amino kiselini broj 75 od SEQ ID NO: 42 bio supstituisan sa glutaminskom kiselinom. Tako dobijeni ekspresioni vektor je nazvan "pEF 1 FCCU/hB273_H2-1 -NE".

[0262] Nukleotidna sekvenca koja kodira hB273_H2-l-NE-tip teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 69 u Listi Sekvenci. Dalje, sekvenca aminokiselina hB273_H2-l-NE-tipa teškog lanca je predstavljena sa SEQ ID NO: 70 u Listi Sekvenci. Sekvence SEQ ID NOS: 69 i 70 su takođe prikazane na SI. 48.

Set prajmera A

5'-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3' (H-Fl: SEQ ID NO: 71 u Listi Sekvenci)

5'-ctggttgtagaaggtgtcctcgttgtaggggttgaaccggcc-3' (H-NE-R2: SEQ ID NO: 72 u Listi Sekvenci)

Set prajmera B

5'-ggccggttcaacccctacaacgaggacaccttctacaaccag—3'(H-NE-F2: SEQ IDNO: 73 u Listi Sekvenci)

5'-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3' (H-Rl: SEQ ID NO: 74 u Listi Sekvenci)

Set prajmera C

5'-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3' (H-Fl: SEQ ID NO: 71 u Listi Sekvenci) 5'-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3' (H-Rl: SEQ ID NO: 74 u Listi Sekvenci)

9)-2Priprema CDR-modifikovanog hB273 antitela

9)-2-l Proizvodnja CDR-modifikovanog hB273 antitela

[0263] 1.2 x 10<g>ćelija od FreeStvle 293F ćelija (Invitrogen Corporation) u logaritamskoj fazi rasta su zasejanc u 1.2 L svežeg FreeStvle 293 Expression Medijuma (Invitrogen Corporation) i kultivisane tokom 1 sata šejkiranjem na 90 rpm na 37°C u 8% CO2inkubatoru. 3.6 mg polielilenimina (Polvscience #24765) je rastvoreno u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma (Invitrogen Corporation). Zatim, ekspresioni vektor teškog lanca (0.4 mg) i ekspresioni vektor lakog lanca (0.8 mg) koji je pripremljen sa setom PureLink HiPurc Plazmid Kit (Invitrogen Corporation) su suspendovani u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma. Onda, 20 ml dobijenih ekspresionih vektora/Opti-Pro SFM smeše tečnosti je dodato u 20 ml dobijenog polietilenimin/Opti-Pro SFM smeše tečnosti, i rezultujuća smeša je ncžno mešana i zatim ostavljena tokom 5 minuta. Posle toga, smeša je dodata u FreeStvle 293F ćelije. Posle 3 sata, Z-VAD-FMK (PEPTID INSTITUTE, Inc.) je dodat tome u finalnoj koncentraciji od 10 |aM, i šejkiranje kulture na 90 rpm je izvedeno tokom 7 dana na 37°C u 8% CO2inkubatoru. Rezultujući supernatant kulure je filtriran kroz filter sa kapsulom za jednokratnu upotrebu (Advantec #CCS-045-ElH).

[0264] Humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijom od pEFlFCCU/hB273_H2-1-NE i pEF6KCL/hB273_Ll-NE je nazvano<*>'hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NE", humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijom od pEFlFCCU/hB273_H2-l-NE i pEF6KCL/hB273_Ll-NF je nazvano "hB273 II2-l-NE/hB273_Ll-NP", humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijom od pEFl FCCU/hB273_H2-l-NE i pEF6KCL/hB273_Ll-NK je nazvano "hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK". i humanizovano antitelo od cB273 dobijeno kombinacijom od pEFl FCCU/hB273_H2-l-NE i ppEF6KCE/hB273_Ll-NLje nazvano<M>hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NL".

9)-2-2 Prečišćavanje CDR-modifikovanog hB273 antitela

[0265] Supernatant kulture dobijen iznad u 9) -2-1 je prečišćen procesom od dva koraka uključujući rProtein A afinitetnu hromatografiju (na 4 do 6°C) i keramički hidroksiapatit (na sobnoj temperaturi). Korak zamene pufera posle prečišćavanja pomoću rProtein A afinitetne hromatografije i posle prečišćavanja sa keramičkim hidroksiapatitom je izvedeno na sobnoj temperaturi. Prvo, 1100 do 1200 ml supernatanta kulture je primenjeno na MabSelect SuRe (proizveo GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone (zapremina: 1 ml) povezane u serijama) koji je ekvilibrisan sa PBS. Nakon što je celokupan rastvor kulture nanet na kolonu, kolona je isprana sa 15 do 30 ml PBS. Zatim, elucija je izvedena sa 2 M arginin hidrohlorid rastvorom (pH 4.0), i frakcija koja sadrži antitelo je sakupljena. Frakcija je primenjena na koloni za desalinizaciju (proizveo GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je pufer zamenjen sa puferom koji sadrži 5 mM natrijum fosfata, 50 mM MES, i 20 mM NaCl na pH 6.5. Dalje, rastvor antitela podvrgnut zameni pufera je primenjen na kolonu od keramičkog hidroksiapatita (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1 hidroksiapatit kolona (zapremina: 2 ml)) koji je ekvilibrisan sa puferom koji sadrži 5 mM NaPi, 50 mM MES, i 20 mM NaCl na pH 6.5. Onda, linearna koncentraciona gradijentna elucija sa natrijum hloridom je izvedena, i frakcija koja sadrži antitelo jc sakupljena. Frakcija je primenjena na koloni za desalinizaciju (proizveo GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je tečnost zamenjena sa CBS (10 mM citratni pufer sadrži 140 mM natrijum hlorida, pH 6.0). Konačno, rezultujući rastvor je koncentrovan korišćenjem Centrifuga! UF Filter Device VIVASPIN 20 (frakcijska molekulska masa: 30 K, Sartorius Co.. Ltd., na 44°C), i koncentracija IgG je podešena na 1.0 mg/ml ili više, i tako dobijeni rastvor je korišćen kao prečišćeni uzorak.

[Primer 10] Merenje aktivnosti CDR-modiifkovanog hB273 antitela

10)-1 Procena aktivnostivezivanjaCDR-modifikovanog hB273 antitela

korišćenjem Biacore-a

[0266)Konstanta disocijacije svakog od humanizovanih anti-DR5 antitela i rsDR5 je izmerena korišćenjem Biacore-a TI 00 (GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.) pomoću metode hvatanja u kojoj jc antitelo uhvaćeno pomoću anti-humanog IgG (Fc) antitela i merenje je izvedeno korišćenjem antigena kao analita. Anti-humano IgG (Fc) antitelo (Human AntibodvCapture Kit. GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.) je kovalentno imobilisano na senzorskom čipu CM5 (BIAcore, Inc.) na oko 10,000 RU pomoću metode amino kuplovanja. Imobilizacija je izvedena takođe na referentnoj ćeliji na isti način. Kao "running" pufer, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, i 0.05% surfaktant P20) je korišćen. Na čip koji ima anti-humano IgG (Fc) antitelo imobilisano na njemu, rastvor antitela od oko 20 nM je dodat sa brzinom protoka od 10 ul/min tokom 60 sekundi i onda, serija razblaženja od rsDR5 (3.13-50 nM) je dodata sa brzinom protoka od 30 ul/min za 120 sekundi i zatim, faza disocijacije je praćena tokom 180 sekundi. Kao regeneracioni rastvor, 3 M magnezijum hlorid je dodat sa brzinom protoka od 10 ul/min tokom30 sekundi. U analizi podataka, softver za analizu (Biacore TI00 Evaluation softvvare,

verzija 2.0.1) je korišćen sa modelom vezivanja jedan-na-jedan, i konstanta brzine asocijacije (kon), konstanta brzine disocijacije (koff), i konstanta disocijacije (KD; KD = koff/kon) su izračunate. Rezultati dobijeni merenjem uz pomoć Biacore-a za 4 tipa humanizovanih antitela su prikazani na Si. 12.

10)-2 Merenje termalne stabilnosti humanizovanog anti-DR5 antitela i njegovog mutanta korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC)

[0267] Merenje termalne stabilnosti je izvedeno korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC). Uzorak je rastvoren u CBS puferu (sadrži 10 mM limunske kiseline i 140 mM NaCl i pripremljen jc na pH 6.0) pri 0.5 mg/ml, i 400 pl njegovih alikvota su korišćeni kao rastvori uzoraka za DSC merenje. Uslovi DSC nterenja su postavljeni kao što sledi: inicijalna temperatura: 20°C; finalna temperatura: 100°C; stopa povećanja temperature: 200°C/sat; period filtriranja: 2 sekunde; i režim povratne sprege: nizak. Kao referentni rastvor, CBS je korišćen. Kao uređaj za DSC merenje, VP-Capillary DSC Platform proizveo MicroCal, Inc. (US) (trenutno GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.) je korišćen za sva merenja. Osnovna korekcija je izvedena pomoću oduzimanja osnove (skenirajuća kriva je dobijena takođe popunjavanjem ćelije uzorka sa referentnim ratsvorom) od skenirajuće krive koja je dobijena od rastvora uzorka. Vrednost najviše temperature pika u ćelom termogramu je definisana kao srednja tačka termalne denaturacije Tm u Fab regionu. Rezultati DSC merenja 4 tipa humanizovanih DR5 antitela su prikazani na SI. 13.

10)-3Invitro citocidna aktivnost CDR-modifikovanog hB273 antitela protiv humane kancerske ćelijske linije

[0268] AffiniPure F(ab')2 fragment kozjeg anti-humanog IgG specifičnog za Fc fragment (proizveo Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #109-006-098) koji je pripremljen na 50 p.g/ml sa 50 mM Tris-HCl (pFI 8.5) je nanet u 45 uL/bunarić u mikroploču sa 96-bunarića (proizveo Corning Incorporated), i ploča je ostavljena da stoji preko noći na 4°C. Nakon što je svaki bunarić ispran dva puta sa PBS, supernatant kulture ođ 293F kojoj je dozvoljeno da proizvede antitelo u 9)-2-l je dodato u 50 uL/bunariću tako da je finalna koncentracija antitela bila ođ 150 do 1. 5 ng/ml, i ploča je ostavljen da stoji preko noći na 4°C. Nakon što je svaki bunarić ispran dva puta sa PBS, Jurkat ćelije koje su pripremljene u broju 4.0 x 10<4>ćelija/ml u RPMI 1640 medijumu koji sadrži 10% FBS su dodate u 50 ul/bunariću i kultivisane pod uslovima 37°C i 5% COi tokom 23 sala. Količina ATP-a dobijenog od vijabilnih ćelija je kvantitativno određena korišćenjem seta za testiranje luminescentnosti ćelija CellTiter-Glo kit (proizveo Promega Corporation, #G7571), i citocidni efekat svakog od hB273 antitela je procenjena uzimanjem vrednosti koja je dobijena od bunarića u koji je dodat medijum umesto rastvora antitela kao 100%. Citocidna aktivnost svakog od 4 tipa CDR-modiifkovanog antitela je prikazana na SI. 14.

10) -4 Efekat aktivacije Kaspaza-3/7invitro citocidna aktivnosthB273_H2-l-NE/L1-NK antitelana humanekancerske ćelijskelinije

[0269|Svaka od humane ćelijske linije kancera kolona HCT-15 i humane ćelijske linije glioblastoma U-87MG je pripremljena u broju 1.1 x 10<5>ćelija/ml u RPMI 1640 medijuma koji sadrži 10% FBS ili MEM (Minimum Essential Medijum) medijuma koji sadrži 10% FBS i dodat je u belu mikroploču sa prozirnim dnom sa 96-bunarića (proizveo Corning Incorporated) u količini 45 ul/bunariću, i kultivisane su preko noći pod uslovima 37°C i 5% C02. hB273_H2-l-NE/LI-NK antitelo, cB273 antitelo, ili humani IgG (proizveo Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) je pomešan sa istom koncentracijom AffiniPure kozjeg anti-humanog IgG specifičnog za Fcy fragment (proizveo Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #109-005-098), i rezultujuća smeša je dodata u količini 5 ul/bunarić tako da finalna koncentracija hB273_H2-1 -NE/L 1 -NK antitela, cB273 antitela, ili humanog IgG je bila 10,000 do 0.1 ng/ml, i ćelije su kultivisane pod uslovima 37°C i 5% CO2tokom 4 sata. Aktivnost kaspaze-3/7 u svakom bunariću jc izmeren pomoću luminometra (proizveo Perkin Elmer, Inc.) korišćenjem seta Kaspaza-Glo 3/7 Assay kit (proizveo Promega Corporation, #G8093). Merenje je izvedeno posle inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta prema protokolu koji je dobijen uz set. Zatim, aktivnost kaspaze-3/7 je procenjena uzimanjem vrednosti dobijene iz bunarića u koji je dodat medijum umesto rastvora antitela kao 100%. Dalje, in vitro citiocidna aktivnost je procenjena uz pomoć merenja količine ATP-a na 24 sata posle tretmana sa antitelom prema metodi prikazanoj u Primeru 3-3. Kao rezultat nađeno je da hB273_H2-l-NE/LI-NK antitelo ima efekat aktivacije kaspaze-3/7 i citocidni efekat koji se može uporediti sa onim od cB273 antitela (SI. 15).

[Primer 11] Invivoantitumorskiefekat cB273antitela.

11) -1 Antitumorska aktivnost cB273 antitela

11V-1-1 Antitumorska aktivnost u nude miševima koji su implatiranisa

humanomćelijskomlinijomkancera kolonaCOLO205

[0270] 2 x IO6 ćelija humane ćelijske linije kancera kolona COLO 205 (kupljena od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa (CAnN.Cg-Foxnr7CrlCrlj, kupljene od Charles River Laboratories Japan. Inc.). Na dane 7, 14, i 21 posle implantacije, cB273 antitelo je administrirano miševima koji nose tumor putem vene na repu u dozi od 1. 3, ili 10 mg/kg (n = 10). Glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene dva puta nedeljno korišćenjem elektronskog digitalnog kalipera (šestara) (proizveo Mitutovo Corporation), i zapremina tumora je izračunata prema sledećoj formuli za izračunavanje.

zapremina tumora (mm<3>) = 1/2 x ( manjaosa )z (mm) x (plavna osa)2 (mm)

[0271]Rezultati su prikazani na SI. 16. Potpuna degeneracija tumora je primećena kod svih miševa u grupi kojima je administrirano cB273 antitelo.

ll)-l-2 Antitumorska aktivnost u nudemiševimaimplantiranimsahumanom

ćelijskom linijom pankreasa MIAPaCa-2

[0272] 3 x IO<5>ćelija humane ćelijske linije kancera pankreasa MIAPaCa-2 (kupljene od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dane 11, 19, 26, i 33 posle implantacije, cB273 antitelo je administrirano miševima koji nose tumor putem vene na repu u dozi od 3 ili 10 mg/kg (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i izračunata je zapremian tumora.

[0273]Rezultati su prikazani na SI. 17. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 39 posle implantacije, koja je bila zadnji dan merenja, bila je 73.5% u grupi kojoj je administrirano 3 mg/kg i 77.4% u grupi kojoj je administrirano 10 mg/kg.

11) -1-3 Antitumorska aktivnost kod nude miševa kojisuimplantiranisa

humanom ćelijskom linijom glioblastoma U-87MG

[0274]5 x IO6 ćelija humane ćelijske linije glioblastoma U-87MG (kupljene od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dane 4, 11, 18, i 25 posle implantacije, cB273 antitelo je administrirano miševima koji nose tumor kroz venu na repu u dozi od 1,3, ili 10 mg/kg (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i izračunata je zapremina tumora.

[0275] Rezultati su prikazani na SI. 18. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 32 posle implantacije, koja je bila zadnji dan merenja, bila je 99. 7% u grupi kojoj je administrirano 1 mg/kg, 97.8% u grupi kojoj je administrirano 3 mg/kg, i 98.0% u grupi kojoj je administrirano 10 mg/kg. Dalje, potpuna degeneracija tumora je primećena kod 2 od 10 miševa u grupi kojoj je administrirano 1 mg/kg, 5 od 10 miševa u grupi kojoj je administrirano 3 mg/kg, i 3 od 10 miševa u grupi kojoj je administrirano 10 mg/kg. ll)-l-4Antitumorska aktivnost kod nude miševa koji su impiantirani sa humanom ćelijskom linijom kancera pluća NCI-H2122 (u kombinaciji sa paklitakselom i karboplatinom)

[0276] 5 x IO6 ćelija humane ćelijske linije kancera pluća NCI-H2122 (kupljene od ATCC) su impiantirani subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dane 13 i 20 posle implantacije, cB273 antitelo je administrirano miševima koji nose tumor kroz venu na repu u dozi od 10 mg/kg. Paklitaksel je subkutano administriran u dozi od 6.25 mg/kg na dane 13, 14, 15, 16, i 17 posle implantacije. Karboplatina je intraperitonealno administrirana u dozi od 100 mg/kg na dan 13 nakon implantacije (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora je izračunata.

[0277] Rezultati su prikazani na SI. 19. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 41 nakon implantacije, koji je zadnji dan merenja, bio je 99.6% u grupi kojoj je administrirano cB273 antitelo, 10.2% u grupi kojoj su kombinovano administrirani paklitaksel i karboplatina, i 99. 7% u grupi sa kombinovanom administracijom cB273 antitela, paklitaksela, i karboplatine. ll)-l-5 Antitumorska aktivnost kod nude miševa koji su impiantirani sa humanom ćelijskom linijom kancera pluća NCI-H460 (u kombinaciji sa paklitakselom i karboplatinom)

[0278] 5 x IO6 ćelija humane ćelijske linije kancera pluća NCI-H460 (kupljene od ATCC) su impiantirani subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dan 6 nakon implantacije, cB273 antitelo je intraperitonealno administrirano miševima koji nose tumor u dozi od 10 mg/kg. Paklitaksel je subkutano administriran u dozi od 6.25 mg/kg na dane 6, 7, 8, 9, i 10 nakon implantacije. Karboplatina je intraperitonealno administrirana u dozi od 100 mg/kg na dan 6 nakon implantacije (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora je izračunata.

[0279] Rezultati su prikazani na SI. 20. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 16 nakon implantacije, koji je bio poslednji dan merenja, bila je 43.3% kod grupe kojoj je administrirano cB273 antitelo, 66.4% u grupi kojoj su kombinovano administrirani paklitaksel i karboplatina, o 79.6% u grupi sa kombinovanom administracijom cB273 antitela, paklitaksela, i karboplatine.

ll)-l-6 Antitumorska aktivnost kod nude miševa koji su impiantirani sa humanom ćelijskom linijom kancera kolona DLD-1 (u kombinaciji sa CPT-11)

[0280]5 x IO6 ćelija humane ćelijske linije kancera kolona DLD-1 (kupljene od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dan 35 nakon implantacije, cB273 antitelo je intraperitonealno administrirano miševima koji nose tumor u dozi od 10 mg/kg. CPT-11 je intraperitonealno administriran u dozi od 80 mg/kg na dane 35, 40, i 43 nakon implantacije (n - 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora je izračunata.

[0281]Rezultati su prikazani na SI. 21. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 55 nakon implantacije, koji je bio poslednji dan merenja, bila je 25.9% kod grupe kojoj je administrirano cB273 antitelo, 29.5% u grupi kojoj je administriran CPT-11, i 72.7% u grupi sa kombinovanom administracijom cB273 antitela i CPT-11.

ll)-l-7 Antitumorska aktivnost kod nude miševa kojisuimpiantiranisa

humanom ćelijskom linijom kancera kolona HCT-15 (u kombinaciji sa CPT-11)

[0282]5 x IO6 ćelija humane ćelijske linije kancera kolona HCT-15 (kupljene od ATCC) su impiantirani subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dan 7 nakon implantacije, cB273 antitelo je administrirano miševima koji nose tumor kroz venu na repu u dozi od 10 mg/kg. CPT-11 je intraperitonealno administriran u dozi od 80 mg/kg na dane 7, 10, i 14 nakon implantacije (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora je izračunata.

[0283]Rezultati su prikazani na SI. 22. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 31 nakon implantacije, koji je bio poslednji dan merenja, bila je 52.8% kod grupe kojoj je administrirano cB273 antitelo, 83.5% kod grupe kojoj je administrirano CPT-11, i 97.8% u grupi sa kombinovanom administracijom cB273 antitela i CPT-11.

ll)-l-8 Antitumorska aktivnost kod nudemiševakoji su impiantiranisahumanom

ćelijskom linijom kancera kolona HCT-116 (u kombinacijisaCPT-11)

[0284]1 x 107 ćelija humane ćelijske linije kancera kolona HCT-116 (kupljene od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dan 7 nakon implantacije, cB273 antitelo je administrirano miševima koji nose tumor kroz venu na repu u dozi od 10 mg/kg. CPT-11 je intraperitonealno administriran u dozi od 65 mg/kg na dane 7, 10, i 14 nakon implantacije (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora je izračunata.

[0285|Rezultati su prikazani na SI. 23. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 28 nakon implantacije, koji je bio poslednji dan merenja, bila je 13.9%> kod grupe kojoj je

administrirano cB273 antitelo, 89.8% kod grupe kojoj je administrirano CPT-11, i 99.7% u grupi sa kombinovanom administracijom cB273 antitela i CPT-11.

ll)-l-9 Antitumorska aktivnost kod nude miševa koji su impiantirani sa humanom ćelijskom linijom melanoma A375 (u kombinaciji savinblastine)

[0286] 2 x IO<6>ćelije humane ćelijske linije melanoma A375 (kupljene od ATCC) su impiantirani subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dane 10, 17, i 24 nakon implantacije, cB273 antitelo je administrirano miševima koji nose tumor kroz venu na repu u dozi od 10 mg/kg. Vinblastin je administriran krpz venu na repu od 10 mg/kg na 10 dana nakon implantacije (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora jc izračunata.

[0287] Rezultati su prikazani na SI. 24. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 46 nakon implantacije, koji je bio poslednji dan merenja, bila je 53.1% kod grupe kojoj je administrirano cB273 antitelo, 43.6% kod grupe kojoj je administriran vinblastin, i 100% u grupi sa kombinovanom administracijom cB273 antitela i vinblastina, i kompletna degeneracija tumora je primećena kod svih miševa u grupi sa kombinovanom administracijom cB273 antitela i vinblastina.

ll)-2 Poređenje antitumorske aktivnosti između cB273 antitela i conatumumab-a

ll)-2-l Priprema conatumumab-a

[0288] Conatumumab je pripremljen na osnovu sekvence aminokiselina lakih lanaca i teških lanaca opisanih u WHO Drug Information, Vol. 22, Br. 2, 2008, strane. 129-130.

ll)-2-l-l Konstrukcija ekspresionog vektora lakog lanca conatumumab-a

[0289) DNK koja sadrži gen koji kodira varijabilni region lakog lanca conatumumab-a sa brojevima amino kiselina 21 do 130 of SEQ ID NO: 76 je sintetisan (GENART, Inc. Artificial Gen Svnthesis Service). Onda, DNK fragment dobijen cepanjem sintetisane DNK sa restrikcionim enzimima Ndel i BsiWI jc insertovan u ekspresioni vektor lakog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEF6KCL) na mestu iscepanom sa restrikcionim enzimima Ndel i BsiWI, pri čemu ekspresioni vektor lakog lanca conatumumab-a je konstruisan. Tako dobijen ekspresioni vektor je nazvan "pEF6KCL/Conatumumab_L".

ll)-2-l-2 Konstrukcija ekspresionog vektora teškog lanca conatumumab-a

[0290] DNK koja sadrži gen koji kodira varijabilni region teškog lanca conatumumab-a predstavljena je amino kiselinama sa brojevima 20 do 141 od SEQ ID NO: 78 u Listi Sekvenci jc sintetisana (GENART, Inc. Artificial Gen Svnthesis Service). Onda, DNK fragment dobijen dobijen cepanjem sintetisane DNK sa restrikcionim enzimom BlpI je insertovan u ekspresioni vektor teškog lanca univerzalnog humanizovanog antitela (pEFlFCCU) na mestu iscepanom sa restrikcionim enzimom BlpI, pri čemu ekspresioni vektor teškog lanca conatumumab-a je konstruisan. Tako dobijeni ekspresioni vektor je nazvan "pEF 1 FCCU/ConatumumabH".

H)-2-l-3Proizvodnja conatumumab-a

[0291] 1.2 x IO<9>ćelija od FreeStvle 293F ćelija (Invitrogen Corporation) u logaritamskoj fazi rasta su zasejane u 1.2 L svežeg FreeStvie 293 Expression Medijuma (Invitrogen Corporation) i kultivisane tokom 1 sata šejkiranjem na 90 rpm na 37°C u 8% CO2inkubatoru. 3.6 mg polietilenimina (Polvscience #24765) je rastvoreno u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma (Invitrogen Corporation). Zatim, ekspresioni vektor teškog ianca pEFlFCCU/ConatumumabH (0.4 mg) i ekspresioni vektor lakog lanca pEF6KCL/Conatumumab L (0.8 mg) pripremljeni sa PureLink HiPure Plazmid Kit (Invitrogen Corporation) su suspendovani u 20 ml Opti-Pro SFM medijuma. Onda, 20 ml dobijenih ekspresionih vektora/Opti-Pro SFM smeše tečnosti je dodato do 20 ml dobijeen polietilenimin/Opti-Pro SFM smeše tečnosti, i rezultujuća smeša je nežno mešana i ostavljena tokom 5 minuta. Posle toga, smeša je dodat u FreeStvle 293F ćelije, i kultura je šejkirana na 90 rpm tokom 7 dana na 37°C u8% CO2inkubatoru. Rezultujući supernatant kulture je filtriran kroz filter sa kapsulom za jednokratnu upotrebu (Advantec #CCS-045-El H).

ll)-2-l-4 Prečišćavanje conatumumab-a

[0292] Supernatant kulture dobijen iznad u ll)-2-l-3 je prečišćen procesom od dva koraka uključujući rProtein A afinitetnu hromatografiju (na 4 do 6°C) i keramički hidroksiapatit (na sobnoj temperaturi). Korak zamene pufera posle prečišćavanja pomoću rProtein A afinitetne hromatografije i posle prečišćavanja sa keramičkim hidroksiapatitom je izvedeno na sobnoj temperaturi. Prvo, 1100 do 1200 ml supernatanta kulture je primenjeno na MabSelect SuRe (proizveoGE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd.. dve HiTrap kolone (zapremina: 1 ml) povezane u serijama) koji je ekvilibrisan sa PBS. Posle je celokupan rastvor kulture nanet na kolonu, kolona je isprana sa 15 do 30 ml PBS-a. Zatim, elucija je izvedena sa 2 M arginin hidrohlorid rastvor (pH 4.0), i frakcija koja sadrži antitelo je sakupljena. Frakcija je primenjena na kolonu za desalinizaciju (proizveo GE Healthcare Bio-Sciences Co., Ltd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je pufer zamenjen sa puferom koji sadrži 5 mM natrijum fosfata, 50 mM MES. i 20 mM NaCl na pH 6.5. Dalje, rastvor antitelo koji je povrdgnut zameni pufera je primenjen na keramičku kolonu od hidroksiapatita (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc.. Bio-Scale CHT2-1 hidroksiapatit kolona (zapremina: 2 ml)) koji je ekvilibrisan sa puferom koji sadrži 5 mM NaPi, 50 mM MES, i 20 mM NaCl na pH 6.5. Onda, linearna koncentraciona gradijentna elucija sa natrijum hloridom je izvedena, i frakcija koja sadrži antitelo je sakupljena. Frakcija je primenjeno na koloni za desalinizaciju (proizveo GF' Healthcare Bio-Sciences Co.sLtd., dve HiTrap kolone za desalinizaciju (zapremina: 5 ml) povezane u serijama), pri čemu je tečnost jc zamenjena sa CBS (10 mM citratni pufer sadrži 140 mM natrijum hlorida, pH 6.0). Konačno, rezultujući rastvor je koncentrovan korišćenjem Centrifugal UF Filter Device VIVASPFN 20 (frakcijska molekulska masa: 30 K, Sartorius Co., Ltd., at 4°C), i koncentracija IgG jc podešena na 1.0 mg/ml ili više, i tako tako dobijen rastvor je korišćen kao prečišćeni uzorak. 11) -2-2 Poređenje antitumorske aktivnosti kod nude miševa koji su impiantirani sa humanom ćelijskom linijom kancera kolona HCT-15 između cB273 antitela and conatumumab-a

[0293] 1 x IO<7>ćelija humane ćelijske linije kancera kolona HCT-15 (kupljene od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dane 6, 13, i 20 nakon implantacije, cB273 antitelo ili conatumumab je administriran miševima koji nose tumor kroz venu na repu u dozi od 3, 10, ili 30 mg/kg (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora je izračunata.

[0294] Rezultati su prikazani na SI. 25. Stopa inhibicije rasla tumora na dan 30 nakon implantacije, koji je bio poslednji dan merenja, bila je 57.9% u grupi kojoj je administrirano cB273 antitelo u 3 mg/kg, 56.0% u grupi kojoj je administrirano cB273 antitelo u 10 mg/kg, 53.6% u grupi kojoj je administrirano cB273 antitelo u 30 mg/kg, 27.4% u grupi kojoj je administriran conatumumab u 3 mg/kg, 26.9% u grupi kojoj je administriran conatumumab u 10 mg/kg, i 20.3% u grupi kojoj je administriran conatumumab u 30 mg/kg. 11) -2-3 Poređenje antitumorske aktivnosti kod nude miševa koji su impiantirani sa humanom ćelijskom linijom kancera pluća NCI-H1975 između cB273 antitela and conatumumab-a

[0295] 3 x IO6 ćelija humane ćelijske linije kancera pluća NCI-H1975 (kupljene od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dane 12, 19, i 26 nakon implantacije, cB273 antitelo ili conatumumab je administriran miševima koji nose tumore kroz venu na repu u dozi od 3 ili 10 mg/kg (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora je izračunata.

[0296] Rezultati su prikazani na SI. 26. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 32 nakon implantacije koji je bio poslednji dan merenja, bila je 71.5% u grupi kojoj je administrirano cB273 antitelo u 3 mg/kg, 73.3% u grupi kojoj je administrirano cB273 antitelo u 10 mg/kg, 13. 5% u grupi kojoj je administriran conatumumab u 3 mg/kg, i 12.6% u grupi kojoj je administriran conatumumab u 10 mg/kg.

[Primer 12]Invivo antitumorski efekat od hB273_H2-l-NE/ hB273-Ll-NK antitela

12)-1 Antitumorska aktivnost hB273 H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitela kod nude miševa koji su impiantirani sa humanom ćelijskom linijom kancera kolona COLO 205

[0297] 2 x IO6 ćelija humane ćelijske linije kancera kolona COLO 205 (kupljene od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dane 8, 15. i 22 nakon implantacije, hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitelo ili cB273 antitelo je administrirano miševima koji nose tumore kroz venu na repu u dozi od 0.3 ili 3 mg/kg (n = 10). Na isti način kao što je gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora je izračunata.

[0298] Rezultati su prikazani na SI. 27. Kompletna degeneracija tumora je primećena kod svih miševa u grupi kojoj je administrirano hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitelo pri 3 mg/kg i grupa kojoj je administrirano cB273 antitelo u dozi 0.3 mg/kg. Dalje, kompletna degeneracija je primećena kod 9 od 10 miševa u grupi kojoj je administrirano hB273_H2-l-NE/ hB273_Ll-NK antitelo u 0.3 mg/kg, i 8 od 10 miševa u grupi kojoj je administrirano cB273 antitelo u 3 mg/kg.

[Primer 13]Invitro citocidna aktivnost hB273_H2-l-NE/ hB273-Ll-NK antitela protiv humanih kancerskih ćelijskih linija

[0299] NCI-N87, KATO-III, i SNU-16 (od kojih je svaka humana ćelijska linija kancera želuca), Caki-1, ACETN, i 786-0 (od kojih je svaka humana ćelijska linija kancera bubrega), Hep3B, SK-HEP-1, i HepG2 (C3A) (od kojih je svaka humana ćelijska linija kancera jetre), i HT-1080 (koja je humana ćelijska linija fibrosarkoma) su kupljene od Američke Kolekcije tipova kultura (American Tip Culture Collection - ATCC). GCIY (koja je humana ćelijska linija kancera želuca) je kupljena od RIKEN. HuH-7 (koja je humana ćelijska linija kancera jetre) je kupljena od Nacionalnog Instituta za Biomedicinske Inovacije (National Institute of Biomedical Innovation). [0300jIn vitro citocidne activnosti protiv različitih tipova ćelijskih linija su izmerene pomoću sledećih metoda. Kao za ćelijsku liniju kancera želuca, ćelijska linija kancera bubrega, i ćelijska linija fibrosarkoma, odgovarajuće subkultivisane ćelije su izbrojane pomoću metode bojenja sa tripan plavom bojom, i posle toga pripremljene u broju 1 x 1C<P>ćelija/ml u medijumu koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (proizveo HvClone Laboratories, Inc.) (u daljem tekstu naziva se "medijum"). U medijumu, hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitelo 20 ug/ml i sekundarno antitelo (kozje anti-humano IgG antitelo, proizveoMP Biomedicals, LLC.) 40 pg/ml su pomešani. Onda, rezultujuća smeša je razblažena sa medijumom, pri čemu su rastvori pripremljeni tako daje koncentracija hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitela bila 2000, 200, 20, ili 2 ng/ml. Svaki od rezultujućih rastvora koji ima odgovarajuće koncentracije je dodat transparentoj mikroploči sa 96-bunarića (proizveo Corning Incorporated) u količini 50 ul/bunarić (3 bunarića po grupi), i ćelijska suspenzija je zasađena u količini 50 ul/bunarić

(5 x IO3 ćelija) (finalna koncentracija hB273_H2-I-NE/hB273_Ll-NK antitela: 10000, 1000, 100, 10, ili 1 ng/ml).

[0301]Kao za ćelijsku liniju kancera jetre, odgovarajuće subkultivisane ćelije su izbrojane pomoću metode bojenja sa tripan plavom bojom, i posle loga pripremljene u broju 4 x 10<4>ćelija/ml u medijumu. U medijumu, hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitelo u 2 ug/ml i sekundarno antitelo u 4 ug/ml su izmešani. Onda, rezultujuća smeša je razblažena sa medijumom, pri čemu su rastvori pripremljeni tako da je koncentracija hB273 H2-1-NE/hB273_Ll-NK antitela bila 200, 20, 2, 0.2, ili 0.02 ng/ml. Svaki od rezultujućih rastvora koji ima odgovarajuće koncentracije je dodat u crnu mikroploču sa 96-bunarića (proizveo Corning Incorporated) u količini 50 ul/bunarić (2 bunarića po grupi), i ćelijska suspenzija je zasađena u 50 ul/bunariću (2 x 10<3>ćelija) (finalna koncentracija antitela: 1000, 100, 10, 1, 0.1, ili 0.01 ng/ml).

[0302]Ćelije su kultivisane na 37°C u prisustvu 5% CO2tokom 72 sata, i količina ATP-a u svakom bunariću je izmerena. Merenje količine ATP-a je izvedeno korišćenjem luciferaznog luminescentnog reagensa (CellTiter-Glo, proizvodi Promega Corporation) prema prikačenom protokolu. Tako je, test rastvor sastavljen od komponente ćelijskog lizata i komponente luminescentnog substrata je dodat na ploču u 100 ul po bunariću, što je praćeno mešanjem. Posle toga, luminescencija od svakog od bunarića je izmerena korišćenjem luminometra (proizvodi Berthold Technologies). Kao za kancersku ćelijsku liniju bubrega, ćelijska linija kancera jetre, i ćelijska linija fibrosarkoma, test rastvor u količini od 100 pl po bunariću je prebačen od transparente mikroploče sa 96-bunarića do bele mikroploče sa 96-bunarića (proizvodi Corning Incorporated), i onda je, luminescenca izmerena.

[0303]Bunarić u koji su dodati medijum i ćelijska suspenzija je pripremljen kao bunarić negativna kontrola, bunarić u koji je dodat samo medijum je pripremljen kao pozadinski bunarić, i ćelijska vijabilnost u svakom testiranom bunariću je izračunata prema sledećoj fomuli.

[0304]Ćelijska vijabilnost (%) = (Intentitct Luminescencije test bunarića - srednji intenzitet luminescencije pozadinskog bunarića) / (srednji intenzitet luminescencije bunarića negativne kontrole - srednji intenzitet luminescencije pozadinskog bunarića) x 100

[0305]Na SI. 51, srednja ćelijska vijabilnost od svake ćelijske linije za odgovarajuće koncentracije antitela korišćenog u lečenju je prikazana. Kao za ćelijsku liniju kancera želuca, ćelijsku liniju kancera bubrega, i ćelijsku liniju fibrosarkoma, standardna greška je predstavljena sa stubićem greške. hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitelo pokazalo je citotoksičnu aktivnost protiv svih ćelijskih linija koje su testirane osim u slučaju 786-0.

[Primer 14] Merenjein vivoaktivnosti hB273_H2-l-NE/hB273 Ll-NK antitela u kombinacijisaahemoterapijskimagensom

14)-1 Antitumorska aktivnost hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitela u

kombinacijisa 5-FUkod nude miševiva koji su impiantiranisahumanom ćelijskom

linijom kancera kolona HCT-15 i poređenje aktivnostisaconatumumab-om

[0306]1 x IO7 ćelija humane ćelijske linije kancera kolona HCT-15 (kupljene od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa (CAnN.Cg-FoxnI<nu>/CrlCrlj, kupljene od Charles River Laboratories Japan, Inc.). Na dane 7. 14, i 21 nakon implantacije, hB273_H2-l-NE/ hB273_Ll-NK antitelo ili conatumumab je administriran miševima koji nose tumore kroz venu na repu u dozi od 3 mg/kg. 5-FU je administriran putem vene na repu na dan 7 nakon implantacije u dozi od 160 mg/kg. Eksperiment je izveden pri n = 6. Glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene dva puta nedeljno korišćenjem elektronskog digitalnog kalipera (šestara) (proizvodi Mitutovo Corporation), i zapremina tumora je izračunata prema sledećoj formuli za izračunavanje.

zapremina tumora (mm<3>) = 1/2 x (manja osa)3 (mm) x (glavna osa)2 (mm)

[0307]Rezultati su prikazani na SI. 52. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 28 nakon implantacije, koji je bio poslednji dan merenja, bila je 62% u grupi kojoj jc administrirano hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitelo, 27% u grupi kojoj je administriran conatumumab, 54% u grupi kojoj jc administriran 5-FU, 91% u grupi kojoj su administriram kombinovano hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitelo i 5-FU. i 78% u grupi kojoj su administrirani kombinovano conatumumab i 5-FU. Tako je, kombinovani efekat hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitela i 5-FU bio primećen, i dalje, visa antitumorska aktivnost je primećena u grupi sa kombinovanom administracijom hB273_H2-l-NE/ hB273_Ll-NK antitela i 5-FU nego u grupi sa kombinovanom administracijom conatumumab-a i 5-FU. 14)-2 Antitumorska aktivnost hB273_H2-I-NE/hB273_Ll-NK antitela u kombinaciji sa paklitakselom kod nude miševa implantiranih sa humanom ćelijskom linijom nesitnoćelijskog kancera pluća NC1-H1975 i poređenje aktivnosti sa conatumumab-om

[0308] 3 x IO<6>ćelija humane ćelijske linije nesitnoćelijskog kancera pluća NCI-H1975 (kupljene od ATCC) su implantirane subkutano u aksilarni region nude miševa. Na dan 11, 18, i 25 nakon implantacije, hB273_H2-l-NE/ hB273-Lt-NK antitelo ili conatumumab je administriran miševima koji nose tumore kroz venu na repu u dozi od 3 mg/kg. Paklitaksel je administriran miševima koji nose tumore kroz venu na repu na dane 11, 12, 13, i 14 nakon implantacije u dozi od 6.25 mg/kg. Eksperiment je izveden pri n = 6. Na isti način kao stoje gore opisano, glavna osa i manja osa implantiranog tumora su izmerene, i zapremina tumora je izračunata.

[0309] Rezultati su prikazani na SI. 53. Stopa inhibicije rasta tumora na dan 32 nakon implantacije, koji jc bio poslednji dan merenja, bila je 66% u grupi kojoj je administrirano hB273_H2-I-NE/hB273_Ll-NK antitelo, 40% u grupi kojoj je administriran conatumumab, 49%o u grupi kojoj je administriran paklitaksel, 91% u grupi kojoj jc kombinovano administrirano hB273_H2-l-NE/hB273_Ll-NK antitelo i paklitaksel, i 79% u grupi kojoj je kombinovano administriran conatumumab i paklitaksel. Tako je, kombinovani efekat hB273_II2-l-NE/hB273_Ll-NK antitela i paklitaksela primećen. i dalje, viša antitumorska aktivnost je primećena u grupi sa kombinovanom administracijom hB273_H2-l-E/hB273_Ll-NK antitela i paklitaksela nego u grupi sa kombinovanom administracijom conatumumab-a i paklitaksela.

Claims

1. Antitelo sposobno za vezivanje za DR5,naznačeno timeda: Sekvenca teškog lanca sadrži varijabilni region sa CDRH1, CDRH2 i CDRH3, i CDRH1 sadrži sekvencu aminokiseline koja je predstavljena pomoću sekvence identifikacionog broja: 82, CDRH2 sadrži jednu od dve sekvence aminokiselina predstavljene pomoću sekvenci identifikacionih brojeva: 89 i 83, i CDRH3 sadrži sekvencu aminokiseline predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 84; i Sekvenca lakog lanca sadrži varijabilni region sa CDRL1, CDRL2 i CDRL3, i CDRL1 sadrži bilo koju od sekvenca aminokiselina predstavljenih pomoću sekvence identifikacionih brojeva: 87, 85, 86, 88 i 79, CDRL2 obuhvata sekvencu aminokiseline predstavljenu pomoću sekvence identifikacionog broja: 80, i CDRL3 sadrži sekvencu aminokiseline predstavljenu pomoću sekvence identifikacionog broja: 81, ili funkcionalni fragment antitela koji poseduje aktivnost vezivanja antigena.

2. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji poseduje aktivnost vezivanja antigena prema patentnom zahtevu1, naznačeno time dasadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 aminokiselinske sekvence koja jc predstavljena sekvencom identifikacionog broja: 20 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 aminokiselinske sekvence koja je predstavljena sekvencom identifikacionog broja: 16.

3. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji poseduje aktivnost vezivanja antigena prema patentnom zahtevu 1 ili 2,naznačeno timedaje antitelo himerno.

4. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji poseduje aktivnost vezivanja antigena prema patentnom zahtevu 3,naznačeno timeda sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 471 aminokiselinske sekvence predstavljene sekvencom identifikacionog broja: 20 i sekvencu lakog lanca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 239 aminokiselinske sekvence predstavljene sekvencom identifikacionog broja: 16.

5. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji poseduje aktivnost vezivanja antigena prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time daje antitelo humanizovano.

6. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji poseduje aktivnost vezivanja prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time da sadrži: (a) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od sledećih aminokiselinskih sekvenci: al) aminokiselinska sekvenca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 70; a2) aminokiselinska sekvenca koja sadrži ostatke aminokiselina 20 do 141 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 42; a3) aminokiselinska sekvenca koja pokazuje homologiju od najmanje 95% sa aminokiselinskom sekvencom koja je izabrana od al) i a2); a4) aminokiselinska sekvenca koja pokazuje homologiju od najmanje 99% sa aminokiselinskom sekvencom koja je izabrana od al) i a2); i a5) aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju, deleciju, ili adiciju jednog do nekoliko aminokiselinskih ostataka u bilo koju od aminokiselinskih sekvenci koje su odabrane od al) i a2); i (b) sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca odabranu iz grupe koja sc sastoji od sledećih aminokiselinskih sekvenci: bi) aminokiselinska sekvenca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 62; b2) aminokiselinska sekvenca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 52; b3) aminokiselinska sekvenca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 58; b4) aminokiselinska sekvenca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 66; b5) aminokiselinska sekvenca koja sadrži ostatke aminokiselina 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 28; b6) aminokiselinska sekvenca koja pokazuje homologiju od najmanje 95% sa aminokiselinskom sekvencom koja je izabrana od bi) do b5); b7) aminokiselinska sekvenca koja pokazuje homologiju od najmanje 99% sa aminokiselinskom sekvencom koja je izabrana od bi) do b5); i b8) aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju, deleciju, ili adiciju jednog do nekoliko aminokiselinskih ostataka u bilo koju od aminokiselinskih sekvenci koje su odabrane od bi) do b5).

7. Antitelo ili funkcionalni fragment antitela koji ima aktivnost vezivanja antigena prema patentnom zahtevu 6, naznačenotime dasadrži: i) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 141 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 70 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 62; ii) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 141 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 70 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 52; iii) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 141 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 70 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 58; iv) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 141 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 42 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 28; v) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 141 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 70 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 134 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 66; vi) sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 471 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 70 i sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 239 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 62; vi i) sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 471 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 70 i sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 239 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 52; viii) sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 471 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja 70 i sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 239 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 58; ix) sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 471 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 42 i sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 239 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 28; ili x) sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 471 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 70 i sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 239 aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 66.

8. Funkcionalni fragment antitela poseduje aktivnost vezivanja antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, koje je odabrano iz grupe koja se sastoji od Fab, F (ab')2, Fab' i Fv.

9. Farmaceutska kompozicijanaznačena time dasadrži najmanje jedno od antitela ili funkcionalnih fragmenata antitela koja poseduju aktivnost vezivanja antigena prema patentnim zahtevima 1 do 8.

10. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 9,naznačena timeda je farmaceutska kompozicija za lečenje i/ili prevenciju kancera.

11. Farmaceutska kompozicija za lečenje i/ili prevenciju kancera,naznačena time dasadrži najmanje jedno od antitela ili funkcionalnih fragmenata antitela koja poseduju aktivnost vezivanja antigena prema patentnim zahtevima 1 do 8 i najmanje jedan član odabran iz grupe koja se sastoji od paklitaksela, karboplatine, CPT-13, i vinblastina.

12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10 ili 11, gde je kancer odabran iz grupe koja se sastoji od kancera pluća, kancera prostate, tiroidnog kancera, kancera želuca, kancera jetre, kancera ovarijuma, kancera kolona, kancera dojke, kancera pankreasa, kancera materice, melanoma, glioblastoma, i kancera krvnih ćelija.

13. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji poseduje aktivnost vezivanja antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za primenu u lečenju i/ili prevenciji kancera.

14. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji poseduje aktivnost vezivanja antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za primenu u lečenju i/ili prevenciji kancera,naznačenosimultanom ili sekvencijalnom administracijom antitela ili funkcionalnog fragmenta koji poseduje aktivnost vezivanja antigena i najmanje jedan član odabran iz grupe koja se sastoji od paklitaksela, karboplatine, CPT-11, vinblastina, i 5-FU.

15. Proizvod odabran iz grupe koja se sastoji od paklitaksela. karboplatine, CPT-11, vinblastina, i 5-FU za primenu u lečenju i/ili prevenciji kanceranaznačenosimultanom ili sekvencijalnom administracijom antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji poseduje aktivnost vezivanja antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8.

16. Antitelo ili proizvod za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 15, gde je kancer odabran iz grupe koja se sastoji od kancera pluća, kancera prostate, tiroidnog kancera, kancera želuca, kancera jetre, kancera ovarijuma, kancera kolona, kancera dojke, kancera pankreasa, kancera bubrega, kancera materice, melanoma, fibrosarkoma, glioblastoma, i kancera krvnih ćelija.

17. Polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 2. 4. 6 ili 7.

18. Polinukleotid prema patentnom zahtevu 17,naznačen time dasadrži: i) nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 19 i nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 15; ili ii) nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 19 i nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 to 717 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 15.

19. Polinukleotid prema patentnom zahtevu 17,naznačen time dasadrži: (a) polinukleotid odabran iz grupe koja se sastoji od sledećih nukleotidnih sekvenci: al) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 69; a2) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 41; a3) nukleotidna sekvenca polinukleotida koji hibridizuje do polinukleotida koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci odabranoj od al) i a2) pod striktnim uslovima; i a4) nukleotidna sekvenca koja uključuje supstituciju, deleciju, ili adiciju od jednog do nekoliko nukleotida u okviru nukleotidne sekvence koja je odabrana od al) i a2); i (b) polinukleotid odabran iz grupe koja se sastoji od sledećih nukleotidnih sekvenci: bi) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 61; b2) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 51; b3) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 57; b4) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 65; b5) nukleotidna sekvenca koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 27; b6) nukleotidna sekvenca polinukleotida koji hibridizuje do polinukleotida koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci koje su odabrane od bi) do b5) pod striktnim uslovima; i b7) nukleotidna sekvenca koja uključuje supstituciju, deleciju, ili adiciju od jednog do nekoliko nukleotida u okviru bilo koje od nukleotidnih sekvenci odabrane od bi) do b5).

20. Polinukleotid prema patentnom zahtevu 19,naznačen time da sadrži:i) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 63; ii) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 51; iii) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 57; iv) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 41, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 27; v) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 423 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 402 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 65; vi) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 69. i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 61; vii) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 51; viii) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 57 ix) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 41, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 27; ili x) polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 58 do 1413 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 69, i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži nukleotide 61 do 717 nukleotidne sekvence predstavljene pomoću sekvence identifikacionog broja: 65.

21. Vektor koji sadrži bilo koji od polinukleotida prema patentnim zahtevima 17 do 20.

22. Transformisana ćelija domaćina koja sadrži bilo koji od polinukleotida prema patentnim zahtevima 17 do 20, ili vektor prema patentnom zahtevu 21.

23. Metoda za proizvodnju antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 2, 4. 6 ili 7, koja sadrži korak kultivacije ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 22 i prečišćavanje antitela iz dobijenog proizvoda kultivacije.