RS54867B1 - Dinukleotidni prolekovi - Google Patents

Abstract

Pronukleotid predstavljen formulom (III):ili njegovi racemati, enantiomeri, diastereomeri, geometrijski izomeri, tautomeri,u kojimaX je odsutan, O, NH, NR, S;X1 je odsutan, O, NH;A je odsutan, aril, aralkil;N je 0, 1,2,3,4,5;R je alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, aril, supstituisnai aril, aralkil, heterociklik, O-alkil, O-heteroaril, steroidni;R3 je izabran od vodonika, alkil, substituted alkil, C(O)-alkil, C(O)O-alkil, C(O)-aril, C(O)O-aril, C(O)NHalkil i C(O)NH-aril; iB1 i B2 su nezavisno adenin, guanin, timin, citozin, uracil ili modifikovane nukleobaze.Prijava sadrži još 8 patentnih zahteva.

Description

SRODNE PRIJAVE

|0001]Ova prijava se poziva na SAD privremenu prijavu br. 60/750,036 podnetu 13.12.2005. i SAD privremenu prijavu br. 60/800,294, podnetu 15.05.2006.

PODRŠKA VLADE

[0002]Pronalazak je bio podržan, u celini ili delimično od strane NIH broj odobrenja 5 UOI A1058270-02/03.

OBLAST PRONALASKA

[0003]Predstavljeni pronalazak se odnosi na dizajn, sintezu i procenu proiekova analoga nukleozida, nukleotida i oligonukleotida. Jedinjenja i kompozicije prema predstavljenom pronalasku su korisni za lečenje infekcija virusom hepatitisa B (HBV) i bolesti jetre povezanih sa HBV. Specifično, jedinjenja i kompozicije srodne sa S-alkil estrima novih anti-HBV agenasa fosforotioat di- i tri-nukleotida. Jedinjenja i kombinacije mogu biti primenjivani bilo pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim anti- HBV agensima.

OSNOVA PRONALASKA

[0004]Akutne i hronične infekcije jetre uzrokovane virusom hepatitisa B (HBV) čine glavnu krizu javnog zdravlja raširenu širom sveta, koja pogađa skoro 2 milijarde ljudi uključujući 1.7 miliona u SAD (izveštaj SZO). Procenjeno je da postoji 350 miliona hroničnih nosilaca HBV širom sveta. Prema Centrima za kontrolu bolesti, skoro 3 do 7 miliona ljudi umre svake godine od komplikacija povezanih sa infekcijom kao što je ciroza jetre i hepatoćelijski karcinom. Značajni brojevi primalaca transplanta jetre imaju stalnu potrebu za efikasnom anti-HBV terapijom. HBV se prepoznaje kao važan etiološki agens koji uzrokuje značajan broj humanih kancera. HBV infekcija takođe dovodi do fulminantnog hepatitisa, fatalne bolesti kod koje je jetra uništena. Hronična infekcija hepatitisa dovodi do hroničnog perzistentnog hepatitisa, umora, ciroze jetre, kancera jetre i smrti. Epidemiologija HBV infekcije je slična onoj kod virusa humane imunodeficijencije (H1V). Mnogi nosioci HlV-a su ko-inficirani sa HBV. Međutim, HBV je 100 puta infektivniji od HlV-a.

[0005]Iako su tri anti-HBV leka trenutno odobrena za kliničku upotrebu, postoji značajna neispunjena medicinska potreba zbog brze pojave otpornosti i toksičnosti koja ograničava dozu i koja je povezana sa terapijom. Lekovi odobreni za kliničku upotrebu obuhvataju alfa interferon, genetički konstruisan protein i nukleozidne analoge kao što je lamivudin i entacavir. Drugi odobreni anti-HBV lek je adefovir dipivoksil, koji se smatra mononukleotidnim fosfonatnim analogom.

[0006]Određeni broj sintetičkih nukleozida se razvija kao anti-HBV agensi. Na primer, za (-)-enantiomer BCH-189 (2'3'-dideoksi-3'-tiacitidin), poznat kao lamivudin ili 3-TC, zaštitu su tražili Liotta et al u SAD patentu 5,530,116.

[0007]Za FTC ili beta-2-hidroksimetil-5-(5-fluorocitozin-l-il)-l ,3-oksatiolan zaštitu su tražili Liotta et al., SAD patenti brojevi 5,5814,639 i 5,914,331. Videti takođe Furman ct al., Antimicrobial Agents and Chemotherapv, 2686-2692, 1992. LFMAU ili 2'-fluoro-5-metil-beta-L-arabinofuranoil uridin je opisan u SAD patentima 5,565438, 5,567,688 i 5,587,362.

[0008]Adefovir ili (9-[2-(fosfono-metoksi)etil]adenin takođe označen kao PMEA jc naveden u SAD patentima 5,641,763 i 5,142,051. Odgovarajući prolek, označen kao adefovir dipivoksil, je klinički odobren kao oralno delujući anti-HBV agens.

[0009]SAD Pat 5,444,063 i 5,684,010 opisuju upotrebu enantiomera beta-D-1,3-dioksolan nukleozida za lečenje HBV.

[0010]SAD Pat. br. 6,881,831 za Iyer et al. opisuje jedinjenja koja sadrže dva ili više deoksiribonukleotidna i/ili ribonukleotidna monomera povezana internukleotidnim vezama za upotrebu u lečenju HBV. [00111Za L nukleozide različitih struktura tražena je zaštita kao za anti-HBV agense u podentim prijavama WO 08/40164, WO/95/07287 i WO 00/09531.

[0012]Drugi anti-HBV agensi za koje je tražena zaštita obuhvataju: (1) beta-D-3'azido-2,3-dideoksi 5-fluorocitidin (Mahmoudian, Pharm Research 8, 1198-203. 1991: (2) 2~-beta-D-F-2\3'-dideoksinukleozidne analoge, Tsai et al., Biochem Pharmacol. 48,1477-1481, 1994; (3) 5-karboksimido- ili 5-fluro-2,3 nezasićene ili 3'-modifikovane pirimidin nukleozide.

[0013|Pored adefovira, za nekoliko nukleotidnih analoga je tražena zaštita kao anti-HBV agenasa. Oni obuhvataju 9[l-fosfonometoksiciklopropil)metilguanin], PMCG i njegov

dipivaloksil prolek, PMCDG i trifluorometil analog, MCC-478. Za prikaz, videti: Iyer et al., Current Opinion in Pharmacol 5, 520-528, 2005.

[0014)Ciklični nukleozidni fosfonatni analozi i prolekovi derivati sulakođe nukleotidni analozi sa aktivnošću anti-HBV. Odgovarajući fosforamidatni prolek analozi su prevedeni u fosfonatni derivat pomoću verovatno enzima esteraze. Za prikaz, videti: lyer et al., Current Opinion in Pharmacol., 5, 520-528,2005.

[0015]Koncept upotrebe hemijski modifikovanib lekova kao analoga prolekova jc ustanovljena paradigma u farmaceutskom razvoju određenog broja različitih lekova. Strategije prolekova dozvoljavaju prolaznu modifikaciju fizičkohemijskih osobina leka u cilju: (a) poboljšanja hemijske stabilnosti, (b) promene rastvorljivosti u vodi, (c) poboljšanja biološke dostupnosti (d) ciljno specifičnih tkiva (c) olakšanja sinergističkih kombinacija lekova, (f) prevazilaženja metaboličkih efekata prvog pronalaza, (g) da služi kao lipofilni nosač za hidrofilne lekove i (h) da služi kao hemijski depo za produženo oslobađanje leka.

[0016]Nekoliko strategija prolekova je korišćeno za poboljšanje biološke dostupnosti, za povećanje raspodele u tkivu jetre i za poboljšanje antivirusne potencije. Na primer, modifikacija fosfatne grupe kao odgovarajućeg fosfonoamidata aminokiseline rezultira u potentnijim antivirusnim sredstvima (Gudmundsson et al., Nucleosides, Nucleotides, 23, 1929-1937, 2004. Cahard et al., Mini Rcvievvs Med Chem., 4,371-381, 2004. Gliceril fosfat i fosfolipid prolekovi nukleozida su takođe razvijeni (Hostetler et al., Antimicrob Agents and Chemotherapy, 44, 1064-1069, 2000) za poboljšanje oralne biološke dostupnosti. S-aciltioetil (SATE) i ciklični salicil derivati (ciklozal) su drugi primeri derivatizacije proleka nukleozida i nukleotida (Pevrottes, et al., Mini Rev. Med. Chem., 4, 395-408, 2004) i Meier et al., Mini Rev Med Chem 4, 383-394, 2004. Druge strategije prolekova obuhvataju 4-arilsupstituisane ciklične 1,3-propanil estre (HepDirect analozi) dizajnirane tako da se podvrgnu oksidativnom cepanju pomoću enzima jetre da bi se oslobodio aktivni nukleotid intracelularno (Erion et al., J. Am. Chem. Soc, 126, 5154-5163, 2004).

[0017]Uopšteno, potrebno je da svi nukleozidi budu fosforilisani do nukleozid mono-, di- i trifosfata pre nego što mogu da postanu inhibitori HBV polimerazc. Na taj način, nukleozidi se mogu smatrati prolekovima, koje je potrebno aktiviratiin vivo.S obzirom na to da većina nukleozida ciljno deluju na virusnu polimerazu i deluju pomoću sličnog mehanizma delovanja, postoji potencijal za brzom pojavom otpornosti i pojavom štetnih efekata kao što je mitohondrijalna toksičnost kao posledica inhibicije humane gama polimeraze. Sledeći problem sa antivirusnom terapijom je povratak virusa posle prestanka terapije. |0018|WO98/07734 opisuje oligonukleotidni prolek koji sadrži najmanje šest kovalentno vezanih nukleotida, od kojih je najmanje jedan derivatizovan specifično prema mestu sa lipofilnom hemijskom grupom reverzibilno i kovalentno vezanom za nukleotid na 5"fosfatu, 3'fosfatu ili internukleotidnoj fosfatnoj vezi.

[0019]SAD 5,770,713 opisuje triestar fosforotioatne oligonuklcotide koji sadrže internukleotidne veze koje imaju p-s- vezu zaštićenu bioreverzibilnim grupisanjem u intracelularnom medijumu. Oligonukleotidi koji ima biorevcrzibilnc fosfatne blokirajuće grupe koje sc mogu koristiti kao prolekovi za oligonukleotid su takođe opisani u W097/476637.

[0020]Hemijska stabilnost TpT prolekova je ispitivana od strane Poijarvi et al., Nucleosidcs, Nucleotides & Nucleic acids 20 (1 &2), 77-91 (2001).

[0021]Aciloksiaril i aciloksialkil estri oligonukleotida su opisani od strane Iyer et al., Bioorganic Chemistry, 23, 1-21(1995) i Iyer et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 6(16), 1917-1922 (1996). Barber et al., (Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 5(6) 563-568 (1995)) opisuju alkilaciju ditimidin fosforotioata i fosforoditioata sa različitim jodoalkil analitima.

[0022]Himerni prooligonukleotidi sa 6 enzimolabilnih maskirajućih grupa sintetisani su od strane Tasquellas et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 7(3), 263-268 (1997).

[0023JStrategije prolekova su takođe primenjene u slučaju oligonukleotida (18-30-meri), koji su razvijeni kao potencijalno nova klasa terapeutskih agenasa upotrebom tehnologija kao što su aptameri, antisens, ribozimi, RNK interferncija i imunostimulacija [Za prikaze videti: (a) Szymkowski, D. E, Drug Disc. Today 1996, J, 415; (b) Uhlmann E.; Pevman A. Chem. Rev. 1990, 90, 543 (c) Uhlenbech O. C. Nature 1987, 328, 596; (d) Zamore P. D. Science, 2002, 296, 1265; (e) Manoharan, M. Curr. Op. Chem. Biol. 2004, S, 570; (f) Iyer, R. P.; Kuchimanchi, S.; Pandey, R. K. Drugs of the Future 2003, 28, 51 (g) Uhlmann, E.; Vollmer, J. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2003, 6, 204].

[0024[Pošto su visoko naelektrisana, jedinjenja sa velikom molekulskom težinom, oligonukleotidi imaju nepovoljne fizičkohemijske osobine za prodiranje u ćeliju pomoću pasivne difuzije. Posledično, dizajn analoga prolekova oligonukleotida je uglavnom fokusiran na delimično maskiranje određenog dela njihovog negativno naelektrisanog osnovnog lanca pomoću reverzibilnih, lipofilnih grupa. Nekoliko takvih analoga je sintetisano i bioreverzibilnost je pokazanain vitro.Međutim, izgleda da iako se početno uklanjanje maske jednog ili dva nukleotida odigrava brzo, potpuno demaksiranje traje nekoliko Časova ili čak dana. Na primer, Iyer et al., pripremili su S- aciloksialkil derivat mešanog PO-PS

oligonukleotida i našli suin vitro,da oni mogu da se konvertuju nazad u ishodni oligonukleotid iako sporo. Slična SATE strategija prolekova je korišćena za oligonukleotidne prolekove. Ali, nije pokazan njihovin vivopotencijal bilo prema poboljšanoj farmakokinetici oligonukleotida ili povećanoj biološkoj aktivnosti. Takođe, ne postoje izveštajiin vivostudija oralne biodostupnosti oligonukleotidnih prolekova ili demonstracijain vivobiološke aktivnosti.

[0025]Oligonukleotidi kraćeg lanca (manje od 8-meri) sa manjim brojem naelektrisanja i manjom molekulskom težinom u poređenju sa 20-mernim oligonukleotidima predstavljaju klasu novih molekula sa potencijalnim terapeutskim i dijagnostičkim osobinama. Zaista, nedavni izveštaji sugerišu da mono-, di-, tri- i oligonukleotidi kratkog lanca poseduju značajnu biološku aktivnost koja može biti korišćena za terapeutske primene. |0026|Međutim, nedostatak oralnih, transdermalnih i drugih neinvazivnih, sistema za primenu koji imaju komplajans pacijenta, spojeni sa neefikasnom ćelijskom permeabilnošću, predstavlja značajan teret u terapeutskom unapređenju ovih molekula.

REZIME PRONALASKA

[0027] U naporu da razvijemo oralno biodostupne analoge di- i tri-nukleotida, izvedena je sinteza i procena određenog broja S-funkcionalizovanih, nenaelektrisanih pronukleotidnih derivata model dinukleotida. Dizajn pronukleotidnih derivata je zasnovan na sposobnosti ciljnog enzima da demaskira latentnu funkcionalnost da bi se otkrio ishodni nukleotid in vivo. Ovde su opisani rezultati studija dizajna, sinteze, stabilnosti, bioreverzibilnostt i citotoksičnosti različitih jedinjenja korisnih za, pored drugih stvari, lečenje HBV.

[0028]Predstavljeni pronalazak obezbeđuje pronukleotid formule (III):

ili njihove racemate, enantiomere, điastereomere, geometrijske izomere, tautomcre,

u kome

X je odsutan, O, NH, NR, S;

X| je odsutan, O, NH;

A je odsutan, aril, aralkil;

NjeO, 1,2,3,4,5;

R je alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, aril, supstituisani aril, aralkil, heterociklik, O-alkil, O-heteroaril, steroidan;

R3je izabran od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, C(0)-alkil, C(0)0-alkil, C(O)-aril, C(0)0-aril, C(0)NH-alkil i C(0)NH-aril; Y, Z su nezavisno, O i S;

Bii Bt su nezavisno adenin, guanin, timin, citozin, uracil ili modifikovane nukleobaze.

[0029]Prolekovi u skladu sa pronalaskom, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutski prihvatljive formulacije koje sadrže ova jedinjenja su korisni u prevenciji i lečenju HBV infekcija i drugih stanja uzrokovanih sa HBV kao što je inflamacija jetre, ciroza jetre, akutni hepatitis, fulminantni hepatitis, hronični hepatitis i druge bolesti jetre. Jedinjenja i formulacije prema pronalasku takođe se mogu koristiti profilaktički za prevenciju napredovanja bolesti kod HBV-inficiranih individua. (0030| Postupak za lečenje HBV infekcije kod domaćina, uključujući čoveka, je takođe opisan tako đa obuhvata primenu efikasne količine proleka prema pronalasku uključujući njegovu farmaceutski aktivnu so, primenjenog pojedinačno ili u kombinaciji ili uzastopno sa drugim anti-HBV agensom (agensima). Poželjni prolekovi prema pronalasku sadrže di- i trinukleotide uključujući, ali bez ograničenja na, 3-dApsU2 -omc 3'dApsA7(j0a,ai 3'-dApsTpsC i njihove analoge gde "ps" označava fosforotioatne internukleotidne veze. |0031] U ovom kontekstu, prijavioci su nedavno objavili da određeni di- i tri- nukleozidni fosforotioatni (PS) i fosforoamidatni analozi ispoljavaju potentnu anti-HBV aktivnostin vitroiin vivo.Iako su dimer i trimer PS analozi negativno naelektrisani mali molekuli, studije 35 S-obeležnih jedinjenja kod pacova su otkrile da ova jedinjenja nisu oralno biodostupna. Nedostatak oralne biodostupnosti može biti posledica broja faktora uključujući: (a) kiselu sredinu u želudcu koja izaziva značajnu razgradnju nukleotida, (b) negativno naelektrisanje na osnovnom lancu koje suprimira prodiranje nukleotida kroz intestinalnu mukoznu barijeru i (c) prisustvo različitih digestivnih enzima u GI traktu koji razlažu jedinjenje. Imajući u vidu da oligonukleotidi i dužeg i kraćeg lanca nisu oralno biodostupni, izgleda da u slučaju klase jedinjenja manjih nukelotida, prc naelektrisanje nego veličina jedinjenja može biti značajniji faktor u određivanju biodostupnosti i maskiranje negativnog naelektrisanja na osnovnom lancu može potencijalno da obezbedi oralno biodostupna nukleotidna jedinjenja.

KRATAK. OPIS CRTEŽA

[0032] Gore navedeni i drugi ciljevi, karakteristike i prednosti pronalaska će sada biti jasne iz sledećeg posebnog opisa poželjnih primera izvođenja prema pronalasku, kao što je ilustrovano u pratećim crtežima u kojima slični referentni karakteri označavaju iste delove u različitim prikazima. Crteži nisu neophodno u razmeri, umesto toga istaknuta je ilustracija principa pronalaska.

SI. 1 je<3I>P NMR trag tipičnog pronukleotida.

SI. 2 je grafikon koji predstavlja rezultatin vivoeksperimenata upotrebom kompozicije prema predstavljenom pronalasku.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0033] U prvom primeru izvođenja, jedinjenja prema predstavljenom pronalasku su jedinjenja predstavljena formulom III ilustrovana u prethodnom tekstu, ili njihovi racemati, enantiomeri, diastereomeri, geometrijski izomeri, tautomeri.

[0034]U drugom primeru izvođenja, jedinjenja prema predstavljenom pronalasku su jedinjenja predstavljena formulom IV kao što je ilustrovana u daljem tekstu, ili njihovi racemati, enantiomeri, diastereomeri, geometrijski izomeri, tautomeri.

gde je R4je izabran od vodonika, C(0)-alkil, C{0)0-alkil, C(0)-aril, C{0)0-ariI, C(0)NH-alkil i C(0)NH-aril;

i R, R3, X, X[, A i n su kao Što su prethodno definisani.

|0035] U trećem primeru izvođenja, jedinjenja prema predstavljenom pronalasku su jedinjenja predstavljena formulom V kao Što je ilustrovana u daljem tekstu, ili njegovi racemati, enantiomeri, diastereomeri, geometrijski izomeri, tautomeri.

gde su R, R3, R4, X, Xi, A i n kao što su prethodno definisani.

[0036] Reprezentativna jedinjenja prema pronalasku su ona izabrana iz grupe koja se sastoji od:

Jedinjenja (l)-(8) formule Al:

gde su R, Xi, R3i R4obeleženi za svaki primer u Tabeli 1.

Reprezentativna jedinjenja prema pronalasku su ona izabrana iz grupe koja se sastoji od: Jedinjenja (9)-{16) formule BI: gde su R, X], Rii R4označeni za svaki primer u Tabeli 2.

[0037] Postoji hitna potreba za razvojem anti-HBV lekova, koji su novi hemijski entiteti, sa novim mehanizmom delovanja koji se mogu koristiti u kombinaciji sa drugim lekovima. Di- i tri-nukleotidni analozi prema predstavljenom pronalasku su korisni kao anti-HBV terapeutici i predstavljaju novu paradigmu u otkriću antivirusnih agenasa različitih od klasične nukleozidne klase anti-HBV agenasa. SAD patent 6,881,831, objavljen za lyer et al, opisuje nekoliko di- i tri-nukleotida, koji imaju anti-HBV aktivnost. Mnoga od ovih jedinjenja imaju takođe aktivnost protiv otpornih sojeva HBV (Iyer et I., Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 48, 2199-2205, 2004) i đinukleotid 3-dApsU2'-OMe {3-deoksi adenin vezan za uracil pomoću fosforotioatnog linkera sa uracilom koji je modifikovan na 2<*>položaju šećera sa metoksi grupom) pokazao je odličnu anti-HBV aktivnost u transgenom mišjem modelu HBV infekcije (Iyer et al., Antimicrob. Agents and Chemofherapy, 48, 2318-2320, 2004). [0038|Nekoliko studija sugerišu da se značajan metabolizam 3-dApsU2'-OMe i drugih di-, kao i, tri-nukleotida nc javljain vi trou prisustvu mikrozoma humane i mišje jetre. Ovo bi podržalo hipotezu da je antivirusna aktivnost 3-dApsU2"-OMe i drugih di-, i tri-nukleotida posledica intaktne nukleotidne strukture i nije posledica njegovih metabolita. Ovo je u suprotnosti sa tradicionalnim antivirusnim nukleozidima, koji zahtevaju metaboličku aktivaciju i konverziju u trifosfatne derivate za njihovo delovanje.

[0039] Farmakokinelička studija 3-dApsU2'-OMe kod mrmota pokazuje da posle intravenske (IV) primene, značajni nivoi 3-dApsU2'-OMe u plazmi su zabeleženi sa polu-živolom od oko 1 časa. Dinukleotid 3-dApsU2'-OMc je eliminisan u urinu kao najintaktniji materijal, što sugeriše nedostatak značajnog metabolizma u jetri. Ovo zapažanje je u skladu sa odsustvom značajnog metabolizma 3-dApsU2-oMe? vi troupotrebom mikrozoma humane jetre i prema tome bi podržalo hipotezu da je antivirusna aktivnost 3-dApsU2 -oMe posledica intaktne strukture nukleotida, i nije posledica njegovih metabolita. Ovo je u suprotnosti sa tradicionalnim antivirusnim nukleozidima, koji zahtevaju metaboličku aktivaciju i konverziju u trifosfatne derivate za njihovo delovanje.

(0040)IV primena<35->obeleženih di- i trinukleotida kod pacova sugeriše da su posle apsorpcije, jedinjenja veoma brzo distribuirana iz centralnog odeljka u ekstravaskularna tkiva. Jedinjenja su većinom koncentrovana u jetri i bubrezima, sa manjim količinama zabeležnim u ostalim tkivima. Eliminacija jedinjenja je izgleda spora. Ova studija pokazuje da se značajna distribucija jedinjenja u jetri javlja posle apsorpcije. S obzirom na to da je jetra ciljni organ za HBV, studija je pokazala da di i trinukleotidi lako ulaze u ćelije jetre. Potentna antivirusna aktivnost dinukleotida 3-dApsU2 -oMei u transgenom mišjem modelu podržana je svim gore navedenim studijama.

[0041]In vitrostrudija ćelijske permeabilnosti di- i trinukleotida upotrebom Caco-2 ćelija izgleda da sugeriše da se intestinalna apsorpcija ovih naelektrisanih molekula ne javlja. S obzirom da su Caco-2 ćelije donekle prediktivne za oralnu biodostupnost, studija izgleda da sugeriše da di- i tri-nukleotidi ne moraju biti apsorbovani iz intestinalne mukoze pasivnom difuzijom, osim ukoliko se ne koristi nova strategija formulacije/primene leka. Nedostatak oralne biodostupnosti može biti posledica određenog broja faktora uključujući: (a) kiselu sredinu u želudcu koja izaziva značajnu razgradnju nukleotida, (b) negativno naelektrisanje na osnovnom lancu koje suprimira permeabilnost nukleotida kroz intestinalnu mukoznu barijeru i (c) prisustvo različitih digestivnih enzima u GI traktu koji razlazu jedinjenje. Imajući u vidu da oligonukleotidi kako sa dužim tako i sa kraćim lancem nisu oralno biodostupni, izgleda da u slučaju klase jedinjenja manjih nukleotida, naelektrisanje pre nego veličina jedinjenja može biti važniji faktor u određivanju biodostupnosti i da maskiranje negativnog naelektrisanja na osnovnom lancu može potencijalno da obezbedi oralno biodostupna di- i tri-nukleotidna jedinjenja.

[0042]U tehnici se razume da su nukleozidi, generalno, slabo biodostupni oralno kao takvi, i derivatizacija proleka je prilagođena kao strategija za povećanje oralne biodostupnosti. SAD

Patent 6,875,751 za koji su zaštitu tražili Imbach et al., otkriva 3'-aminokiselinske prolekove 2,-deoksi-beta-L-nukleozida kao prolekove L-nukleozida sa poboljšanom oralnom biodostupnošću. Slično, SATE strategija proleka je takođe slično primenjena za nukleozide.

[0043]Međutim, izazov u slučaju nukleotida i dinukleotida je taj ta oni sadrže visoko osetljive na kiselinu purinske i primidinske grupe u njihovim strukturama. Na taj način, iako maskiranje negativnog naelektrisanja ovih molekula može da pomogne u njihovoj ćelijskoj difuziji preko povećane lipofilnosti, nije poznato da li će oni biti sposobni u želudačnoj mukozi dovoljno dugo da se apsorbuju oralno. Tipično, na primer, dinukleotid 3-dApsU2 -ovio je brzo razložen u simuliranoj želudačnoj tečnosti sa polu-životom od manje od 10 minuta. Poznato je da se takav proces razlaganja javlja početnom protonacijom azota nukleobaze nakon čega sledi depurinacija i cepanje šećernog prstena. |0044]Na taj način, imajući u vidu podložnost 3-dApsLV-oMerazlaganju posredovanom kiselinom, nije bilo predvidljivoa priorida li maskiranje naelektrisanja na osnovnom lancu može da zaštiti protiv njihovog razlaganja, poveća njihovu stabilnost u kiseloj sredini želudca i stoga stimuliše oralnu apsorpciju. Ponovo, dobro je poznato da oralna biodostupnost nije jednostavno povezana sa stabilnošću u želudačnoj mukozi. Na primer, Čak sa povećanom stabilnošću, nije bilo poznato da li bi ovi di- i tri-nukleotidni prolekovi sa relativno većom molekulskom težinom (MW >700 đaltona) mogli biti transportovani kroz mukozne barijere. Zaista, nije puno poznato o tome da li postoje specifični transporteri koji bi mogli da olakšaju transport ovih novih jedinjenja kroz mukozu pomoću mehanizama aktivnog transporta. Prema pravilu Lipinski-og (Lipinski, C. A., Adv. Drug Del. Rev. 23, 3, 1997), molekuli leka bi trebalo da imaju molekulske težine manje od 500 daltona, ne više od 5 donora vodonične veze (OH i NH grupe) ne više od 10 akceptora vodonične veze (posebno N i O), molekulsku težinu ispod 500, LogP ispod 5 za oralnu apsorpciju pasivnom difuzijom. Zaista i di- i trinukleotidni prolekovi su jedinjenja više molekulske težine i ne ispunjavaju mnoge od kriterij uma Lipinski-og za oralnu apsorpciju. |0045]Di- i trinukleotidni prolekovi prema predstavljenom pronalasku imaju nove modifikacije ili supstitucije u prstenu i nukleobaze. S obzirom na to da esteraze ili drugi enzimi imaju specifične strukturne i topološke zahteve za aktivnost, ne bi se moglo predvideti da li bi di- i tri-nukleotidni prolekovi bili supstrati za enzime. Pored toga, s obzirom na to da su mnoga jedinjenja opisana ovde izomerne smeše, i s obzirom na to je poznato da su enzimi stereo-diskriminatorni, nije poznato da li bi pojedinačni izomeri mogli biti supstrati ili da li bi stopa prevođenja u ishodni molekul bila mnogo različita što bi ih činilo manje privlačnim kao kandidata za lek.

[0046] Stoga iako je koncept prolekova poznat i mnoge strategije postoje za pripremu prolekova mnogih jedinjenja uključujući nukleozide i mononukleozide, ne bi moglo da se predvidia priori,niti je očigledno, za neke stručnjake iz date oblasti tehnike, da slični prolekovi di- i tri-nukleotida mogu imati oralnu biodostupnost i posledično bi mogli biti razvijeni kao oralno biodostupni Jekovi. Predstavljeni pronalazak daje takva jedinjenja.

|0047]U jednom primeru, tražena je zaštita za određeni broj S-funkcionalizovanih, nenaelektrisnaih derivata prolekova. Dizajn derivata prolekova je zasnovan na sposobnosti ciljnog enzima da demaskira latentnu funkcionalost da bi sc otkrio ishodni nukleotidin vivo.Kao reprezentativni primeri, izvedena opšta struktura dinkuleotidnih derivata 1-3 i očekivani mehanizam za njihovu konverziju posredovanu esterazom do matičnog dimera 4 prikazani su u Šemi 1, i obuhvataju: (a) S-(aciloksialkil) tiofosfatne analoge 1. Aciloksialkil analozi, ilustrovani antibioticima pivampicilinom i bacampicilinom, kao i, nedavno odobren anti-HBV agens adefovir dipivoksil su klinički korišćeni, oralno biodostupni, analozi estarskog proleka. Posle njegove apsorpcije, veruje se da se konverzija proleka do ishodnog molekula javljaprekohidrolize posredovane esterazom u plazmi i/ili jetri, sa istovremenim oslobađanjem

formaldehida i karboksilne kiseline, (b) S-(aciloksiairl)tiofosfat analozi 2. Aciloksiaril analozi daunorubicina, doksorubicina, fosforodiamida, iperita, acivicina i PEG-daunorubicin konjugata su dobro poznati2*1 i ekstenzivno su procenjivaniin vi troiin vivo[Bundgaard, H. In Bio-reversible carriers in drug design. Theorv and Application. Roche, E.B. Ed.; Pergamon Press: New York, 1987; pp 13-94; Za odlične prikaze videti: Olivai, R.; Stella, V. J. Annu. Rev Pharmacol. Toxicol. 1993, 32, 521; Papot, S.; Tranoy, I.; Tillcquin, F.; Florent, J.-C; Gesson, J.-P. Curr. Med. Chem. 2002, 2, 155]. Iako je reaktivni metilen hinon intermedijer prolazno oslobođen posle hidrolize ovih prolekova, brzo hvatanje molekula vode pomoću semi-hinonskog intermedijera rezultira u njegovoj konverziji u neškodljive benzil alkoholne vrste na taj način minimizujući bilo kakvu ćelijsku povredu. Upotrebom ovog obrazloženja, dizajnirani su određeni nukleotidni analozi ili pronukleotidi prema pronalasku uključujući estarske analoge (koji imaju dugolančanu alkoksi grupu koja pruža veću lipofilnost molekulu), kao i, amidni analog i (c) S-alkil derivate sa terminalnom funkcionalnom grupom 3 su dizajnirani tako da u toku hidrolitičkog procesa posredovanog preko enzima, latentna nukleofilna grupa je otkrivena, koja je postavljena tako da napadne elektrofilni ugljenik alfa doliofosfatne grupe rezultirajući u oslobađanju ishodnog dinukleotida.

[0048]Prolekovi ili pronukleotidi prema predstavljenom pronalasku se takođe odnose na određene derivate i konjugate nukleotida, dinukleotida, trinukleotida i oligonukleotida. Konjugujuća grupa može biti različitih hemijskih i strukturnih tipova i može biti vezana za hidroksi, amino, fosfat ili fosforotioat osnovni lanac nukleotida ili druge funkcionalne grupe u nukleozidu i oligonukleotidima pre estarske, amidne, izocijantne, urea, tiourea, karbamatne ili drugih tipova kovalentnih veza. Imajući u vodi nepredviđenu prirodu enzimatskog delovanja opisanog prethodno, određeni konjugati mogu ili ne moraju hemijski ili enzimatski da regenerišu ishodni nukleotidin vitroiliin vivo,a ipak biološka aktivnost može da boravi u konjugatu ili u ishodnom nukleotidu ili oba. Specifično, nekoliko di-, tri- i tetra-nukleotida i njihovi analozi su prethodno identifikovani kao anti-HBV agensi (SAD patent 6,881,83 i US2003/0109471). Stoga, derivati i konjugati objavljeni u ovom pronalasku su primenljivi na jedinjenja takođe citirana u tim prijavama.

[0049]Svi prolekovi 3-dApsU2\0Mesu smeše Rp, Sp izomera izvedene od izomernih Rp, Sp jedinjenja poreklom od 3-dApsU2"_oMC- Slični argumenti će važiti za tri- i tetranukleotide takođe. |0050]U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, konjugujuća grupa predstavlja "maskirajuću grupu", "R" koja može biti vezana za osnovni lanac formule (A) gde je R=aciloksi alkil, aril i heteroaril estri, karbonati, karbamati, amidi i tako dalje opšte strukture prikazane u Šemi 1. Heterocikličan prsten poželjno sadrži 5 ili 6-članova koji sadrže O, N ili S atome u prstenu slobodne ili fuzionisane za drugi prsten. Maskiranje naeletrisanog osnovnog lanca može povećati stabilnost nukleotida na kiselu ili baznu sredinu gastrointestinalnog trakta (koji ima različite digestivne enzime) na taj način olakšavajući oralnu apsorpciju. Na primer, prisustvo negativno naelektrisanog fosfornog diestra ili fosforotioatne veze veruje se daje esencijalno za razlaganje polinukleotida posredovane preko nukleaze. Međutim, maskiranjem negativnog naelektrisanjaprekopripreme 5-alkilovanog derivata, hemijski i enzimski posredovano razlaganje pomoću polinukleotida može biti inhibirano na taj način povećavajući stabilnost polinukleotida.

[0051]U drugom primeru izvođenja prema pronalasku, konjugujuća grupa bi mogla biti lipofilna grupa koja olakšava transport leka kroz biološke barijere kao što je lipidni dvosloj sisarskib ćelija ili bakterijski ćelijski zid. Primeri takvih lipofilnih grupa obuhvataju, ali bez ograničenja na, polietilen glikol (PEG), holesterol, holnu kiselinu, fosfolipide itd. Lipofilna grupa je vezana za šećerni hidroksil, nukleobazu ili intemukleotidni fosfat i fosforotioatnu vezu na jednom ili više mesta kao Što je prikazano u jedinjenju (B) ilustrujući strukturu analoga holne kiseline od dinukleozid fosforotioata. 3"dApsU2 0Me di u formuli. [0052|Tipične strukture dinukleotida konjugovanog za aminokiseline, i pcptida na šećetnim hidroksilima, nukleobaze i na internukleotidnoj fosforotioatnoj vezi su predstavljene jedinjenjima (C-I).

[0053]U sledećem primeru izvođenja prema pronalasku, konjugujuća grupa bi mogla biti grupa koja olakšava aktivni transport nukleotida kroz različite ćelijske barijere. Takve grupe mogu biti prirodnog ili sintetičkog porekla uključujući aminokiseline, peptide i polipeptide.

|0054] U sledećem primeru izvođenja prema pronalasku, konjugujuća grupa može da olakša ciljno delovanje leka na određeno tkivo ili organ. Takva grupa obuhvata monoklonska antitcla ili druge prirodne proizvode, koji imaju osobinu da se lokalizuju u određenim ciljnim tkivima.

[0055] Dva primcra prirodnih proizvoda, kurkumin i aspirin, konjugovani za trinukleotide su prikazani u Šemama 2 i 3, respektivno. Kao što jc prikazano konjugujuća grupa može bitispojena prekošećernog hidroksila ili nukleobaznih amino grupa. [0056| Nukleozidna jedinica je predstavljena međunarodno prihvaćenom konvencijom linijskog crteža. U primeru dole 2"-supstiuisani ribonukleozid je predstavljen i u konvencionalnoj strukturi i u odgovarajućem formatu linijskog crteža.

[0057] Šećerne jedinice vezane za B| i Btkoje daju a ili fS N- ili C- nukleozid obuhvataju, ali bez ograničenja na, furanozu, deoksiribofuranozu, ribozu i arabinozu.

[0058JTermin "aril," kao šte je ovde korišćen, označava mono- ili policikličan karbocikličan sistem prstena koji ima jedan ili dva aromatična prstena uključujući, ali bez ograničenja na, fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil, idenil i slično.

[0059] Termin "heteroaril," kao što je ovde korišćen, označava mono- ili policikličan (npr. bi-ili tri-cikličan ili više) aromatični radikal ili prsten koji ima od pet do deset atoma u prstenu od kojih su jedan ili više atoma iz prstena izabrani od, na primer, S, O i N; nula, jedan ili dva atoma prstena su dodatni heteroatomi nezavisno izabrani od, na primer, S, O i N; i preostali atomi prstena su ugljenici, pri čemu bilo koji N ili S sadržan unutar prstena može biti izborno oksidovan. Heteroaril obuhvata, ali bez ograničenja na, piridinil, pirazinil, pirimidinil, pirolil, pirazolil, imidazolil, tiazolil, oksazolil, izooksazolil, tiadiazolil, oksadiazolil, tiofenil, furanil, hinolinil, izohinolinil, benzimidazolil, benzooksazolil, hinoksalinil i slično.

[0060]U skladu sa pronalaskom, bilo koji od arila, supstituisanih arila, heteroarila i supstituisanih heteroarila koji su ovde opisani, mogu biti bilo koja aromatična grupa. Aromatične grupe mogu biti supstituisane ili nesupstiluisane.

[0061]Termin "alkil," kao Što je ovde korišćen, označava zasićene, linearne ili granate ugljovodonične radikale koji sadrže između jednog i šest, ili jednog i dvanaest atoma ugljenika, respektivno. Prinieri Cj-Cf, alkil radikala obuhvataju, ali nisu ograničeni na, metil, etil, propil, izopropil, n-butil, fe/T'-butil, neopentil i n-heksil radikale; i primeri za C1-C12alkil radikale obuhvataju, ali bez ograničenja na, etil, propil, izopropil, n-heksil, oktil, decil, dodecil radikale. |0062|Termini "aralkil" ili "arilalkil" obuhvataju aril-supstituisane alkil radikale kao Što su benzil, difenilmetil, trifeniimetil, feniletil i difeniletil. |0063]Termin "heterocikličan" kao što je ovde korišćen, označava nearomatičan 5-, 6- ili 7-člani prsten ili fuzionisani sistem bi- ili tri-ciklične grupe, gde (i) svaki prsten sadrži između jednog i tri heteroatoma nezavisno izabrana od kiseonika, sumpora i azota, (ii) svaki 5-člani prsten ima 0 do 1 dvogubu vezu i svaki 6-člani prsten ima 0 do 2 dvogube veze, (iii) heteroatomi azota i sumpora mogu izborno biti oksidovani, (iv) heteroatom azota može izborno biti kvaternizovan, (iv) bilo koji od gore navedenih prstenova može biti fuzionisan sa benzenovim prstenom i (v) preostali atomi prstena su atomi ugljenika koji mogu biti izborno okso-supstituisani. Reprezantativne heterocikloalkil grupe obuhvataju, ali bez ograničenja na, [ 1,3]dioksolan, pirolidinil, pirazolinil, pirazolidinil, imidazolinil, imidazolidinil, piperidinil, piperazinil, oksazolidinil, izoksazolidinil, morfolinil, tiazolidinil, izotiazolidinil, hinoksalinil, piridazinonil i tetrahidrofuril. Takve heterocikličnc grupe mogu biti dalje supstituisane.

|0064jTermin "cikloalkil," kao što je ovde korišćen, označava monovalentnu grupu poreklom od jedinjenja monocikličnog ili policikličnog zasićenog karbocikličnog prstena pomoću uklanjanja jednog atoma vodonika. Primeri obuhvataju, ali bez ograničenja na, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, biciklo [2.2.1] heptil i biciklo [2.2.2] oktil.

[0065]Termini "supstituisani aril", "supstituisani alkil," "cikloalkil", kao što su ovde korišćeni, označavaju aril, alkil i cikloalkil grupe kao što su prethodno definisane, supstituisane nezavisnom zamenom jednog, dva ili tri ili više atoma vodonika sa supstituentima uključujući, ali bez ograničenja na, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, zaštićeni hidroksil, - N02, -CN, -NH2, zaštićeni amino, -NH -C,-C|2-alkil, -NH-C2-C,2-alkenil, -NH -C2-C,2-alkenil, -NH -C3-Ci2-cikloalkil, -NH -aril, -NH -heteroaril, -NH -heterocikloalkil, - dialkilamino, -diarilamino, -điheteroarilamino, -0-C|-C|2-alkil, -0-C2-C|2-alkenil, -0-C2-Ci2-alkenil, -0-C3-C|2-cikloalkil, -O-aril, -O-heteroaril, -O-heterocikloalkil, -C(O)- CrC|2-alkil, - C(0)-C2-C12-alkenil, -C(O)- C2-C,2-alkenil, -C(0)-C3-C,2-cikloalkil, -C(0)-aril, -C(O)-heteroaril, -C(0)-heterocikloalkil, -CONH2, -CONH- CrC|2-alkil, -CONH- C2-C,2-alkenil, - CONH- C2-C12-alkenil, -CONH-C3-C|2-cikloalkiI, -CONH-aril, - CONH-heteroaril, -CONH-heterocikloalkil, -OC02- Ci-C|2-alkil, -OC02- C2-C|2-alkenil, -OC02-C2-Ci2-alkenil, -OC02-C3-C12-cikloalkil, -OC02-aril, -OC02-heteroaril, -OC02-heterocikloalkiL -OCONH2, - OCONH- C,-C12-alkil, -OCONH-C2-Ci2-alkenil, -OCONH- C2-C,2-alkenil, -OCONH-C3-C|2-cikloalkil, -OCONH-aril, -OCONH- heteroaril, -OCONH- heterocikloalkil, -NHC(O)- C,-C,2-alkil, - NHC(0)-C2-C,2-alkenil, -NHC(0)-C2-C,2-alkenil, -NHC(0)-CrC|2-cik]oalkil-NHC(0)-aril, -NHC(0)-heteroaril, -NHC(Q)-heterocikloaIkil, -NHC02- C,-C,2-alkil, - NHC02- C2-C12-alkenil, NHC02C2-C,2-alkenil -NHC02- C3-C|2-cikloalkil, -NHC02- aril, -NHCO2- heteroaril, -NHCOz- heterocikloalkil, -NHC(0)NH2, -NHC(0)NH- C,-C!2-alkil, - NHC(0)NE-C2-C12-alkenil, - NHC<0)NHC2-C ,2-alkenil, -NHC(0)NH-C3-C,2-cikloalkil, - NHC(0)NH-aril, -NHC(0)NH-heteroaril, -NHC(0)NH-heterocikloaIkil, NHC(S)NH2, - NHC(S)NH-C,-C12-alkil, -NHC(S)NH-C2-Cl2-alkenil, -NHC(S)NH-C2-Cl2-alkenil, - NHC(S)NHC3-C|2-cikIoalkil, -NHC(S)NH-aril, -NHC(S)NH-heteroaril,-NHC(S)NH-heterocikloalkil, -NHC(NH)NH2, -NHC(NH)NH- CrCt2-alkil, - NHC(NH)NH-C2-C,2-alkenil, -NHC(NH)NH-C2-Ci2-alkenil, -NHC(NH)NH-C3-C12-cikloalkil, -NHC(NH)NH-aril, -NHC(NH)NH-heteroaril, -NHC(NH)NH-heterocikloalkil, -NHC(NH)-C,-C|2-alkil, - NHC(NH)-C2-C,2-alkenil, -NHC(NH)-C2-C,2-alkenil, -NHC(NH)-C3-C,2-cikloalkil, - NHC(NH)-aril, -NHC(NH)-heteroaril, -NHC(NH)-heterocikloalkil, -C(NH)NH-C,-C|2-alkil, - C(NH)NH-C2-C, 2-alkenil-C(NH)NH-C2-C|2-alkenil, -C(NH)NH-C3-C|2-cikloalkiI, - C(NH)NH-aril, -C(NH)NH-heteroaril, -C(NH)NH-heterocikloalkil, -S{0)-Ci-C|2-aIkil, -S(O)-C2-C12-alkenil7- S(0)-C2-C12-alkcnil, - S(0)-C3-C,2-cikloalkil, - S(0)-aril,-S(0)-heteroaril, - S(0)-heterocikloalkil -S02NH2, -S02NH- C,-C!2-alkil, -S02NH-C2-Cl2-alkenil, -S02NH- C2-C|2-alkenil, -S02NH- C3-C,2-cikloalkil. -S02NH-aril, -S02NH- heteroaril, -S02NH-heterocikloalkil, -NHS02-Ct-C|2-alkil, - NHS02-C2-Ci2-alkenil, -NHS02-C2-Ci2-alkenil, - NHS02-C3-C|2-cikloalkil, - NHS02-ariI, -NHS02-heteroaril, -NHS02-heterocikloalkil, - CH2NH2,-CH2S02CH3, -aril, -arilalk.il, -heteroaril, -heteroarilalkil, -heterocikloalkil, -C3-C|2-cikloalkil, polialkoksialkil, polialkoksi, -metoksimetoksi, -metoksietoksi, - SH, -S-C|-C|2-alkil, -S-C2-Ci2-alkenil, -S-C2-Cj2-aIkenil, -SC3-C|2-cikloalkil. -S-aril, -S-heteroaril, -S-heterocikloalkil ili metiltiometil Razume se da arili, heteroarili, alkili i slično mogu biti dalje supstituisani.

[0066]Termin "steroidni", kao što se ovde koristi, označava bilo koje od brojnih prirodnih ili sintetičkih, u masti rastvorijivih organskih jedinjenja koja imaju kao osnovu 17 atoma ugljenika raspoređenih u četiri prstena i uključujući sterole i žučne kiseline, adrenalne i polne hormone, određene prirodne lekove kao što su jedinjenja digitalisa, i prekursore određenih vitamina. Primeri steroidne strukture obuhvataju, ali bez ograničenja na, holesterol, holestanol, 3a-ciklo 5 a-holestan-6-p-ol, holnu kiselinu, holesteril formiat, holestanil formiat.

[0067]Termin "modifikovani nukleozid", kao što je ovde korišćen, označava bilo koji nukleozid koji obuhvata modifikovanu heterocikličnu bazu, modifikovanu šećernu grupu ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, modifikovani nukleozid je neprirodni pirimidinski ili purinski nukleozid, kao što je ovde opisan. Primeri modifikovanog nukleozida obuhvataju, ali bez ograničenja na, 2"-supstituisani ribonukleozid arabinonukleozid ili 2'-deoksi-2"-flouroarabinozid, deazaadenin, deazaguanin.

Nui, N112, IN113su nukleotidne jedinice

PRIMERI

PRIMER 1: REAKTANTI I POSTUPCI

[0068]Objavljeni su tipični primeri za sintezu i procenu izabranih prolekova (pronukleotida) i konjugata. Reprezentativni podaci su pokazani za dinukleotid 3-đApsU2 .omc, ali sa odgovarajućim modifikacijama, takođe mogu biti korišćeni za druga jedinjenja za koja je tražena zaštita u ovom pronalasku.

[0069]U predstavljenim studijama,Rp, Spsmeša fosforotioatnog analoga 3-dApsU2 -oMc(5),je sintetisana u velikoj količini (1 milimol nukleozidom punjene staklene podloge sa kontrolisanim porama (CPG)) upotrebom čvrste-faze fosforoamiditne hernije, (Beaucage, S. L.; lyer, R. P. Tetrahedron 1993, 49, 1925) zajedno sa specijalno proizvedenim LOTUSreactor® (Pađmanabhan, S.; Coughlin, J. E.; Iycr, R. P. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 343; Iyer, R. P.; Coughlin, J. E.; Pađmanabhan, S. Org. Prep. Proc. Intl. 2005, 37,205). dA-vezana CPG podloga je pripremljena upotrebom našeg nedavno otkrivenog ultra-brzog procesa funkcionalizacije i punjenja za čvrste podloge. Za sulfurizaciju proizvoda spojenog sa internukleotidinim dinukleozid fosfitom, korišćen je rastvor S/Z-l^-benzoditiol-S-on-l,!,-

dioksida (0.4 M u suvom CH3CN) (Iyer, R. P.; Regan, J. B.; Egan, W.; Beaucage, S. L. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1253). Posle obrade, hromatografskog prečišćavanja i liofdizacije, natrijumova so tfp,5p 5 (-60:40 smeŠa) je dobijena u čistoći >96%, koja je okarakterisana pomoću<31>P i 'H NMR. Tabela 3 daje strukture specifičnih prolekova 5, koji su dizajnirani, sintetisani i procenjeni.

|0070|Pored toga, prolekovi ili pronukleotidni derivati 6a-j su sintetisani u prinosima od 50 do 70% pomoću hemoselektivne S-alkilacije 7?p,5p-5 sa odgovarajućim jodo- ili bromo-

derivatima 7a-j u vodenom rastvoru acetona ili metanola, nakon čega sledi obrada i hromatografsko prečišćavanje.

[0071] Sinteza pronuklcotida: Reprezentativna priprema pronukleotida 6a. U rastvor dinukleotidne natrijumove soli (50 mg, 0.082 mmol) u vodi (1 mL) dodat je rastvor jodometil pivalata (7a (Tabela 4), 85 mg, 0.35 mmol) u acetonu (2 mL). Reakcija je mešana preko noći i koncentrovana sa nekoliko mgs natrijum bisulfita. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografijc na koloni i 6a je eluiran iz smeše DCM/MeOH (90/10). Koncentrovanjein vacuodalo je hromatografski čistu belu čvrstu supstancu (3IP NMR, 28.7, 27.9 8 ppm). Svi analozi su pripremljeni upotrebom sličnih postupaka (Tabela 4).

[0072]Potrebni intermedijeri7a-jsu sintetisani direktno od odgovarajućih hidroksi jedinjenja (Hayat, S.; Rahman, A-U, Khan, K. M.; Choudhary, M. 1.; Maharvi, G. M.; UIlah, Z.; Bayer, E. Synth. Commun. 2003, 33, 2531; Fernandez, I.; Garcia, B.; Munoz, S.; Pedro, R.; de la Salud, R. Svnlett. 1993, 489) ili pomoću reakcije izmene halogena od odgovarajućih hloro derivata (videti Semu 4).

[0073J<3I>P NMR svakog pronukleotidnog analoga 6a-j pokazala je dva pika u opsegu od 28 to do34 ppm(karakteristika tiofosfatne triestarske grupe) koji odgovaraju ~ 55:45 odnosuRp, Spizomera (videti Sliku 1). Procena bioreverzibilnosti pronukleotida je izvedena u zečjem serumu u fosfatnom puferu na 37°C. U cilju praćenja hidrolitičke konverzije pronukleotida do dinkleotida 5, alikvote inkubata su uklonjene u različitim vremenskim tačkama, obrađene i analizirane upotrebom reverzno-fazne HPLC. Nađeno je da su analozi 6a, i 6b lako konvertovani u ishodno 5 sa polu-životom (ti^) od 60 min i 30 min respektivno. Takođe, potpuna konverzija 6a i 6b u ishodno 5 javila se za~3 Časa. Analozi 6a i 6b su bili stabilni do 24 časa u fosfatnom puferu (0.1 M, pH 7.2). Pored toga, nije bilo dokaza za bilo koju značajnu stereodiferencijaciju ili desulfurizaciju u toku hidrolizeRp, Spizomera u smeši. Zanimljivo, oba 6a i 6b su otporni na delovanje hidrolize estreaze jetre svinje (PLE) i goveđeg himotripsina (podaci nisu prikazani), na taj način sugerišući da analozi mogu imati značajan polu-život u GI traktu koji bi mogli da olakšaju oralnu apsorpciju intaktnog pronukleotida. Ova zapažanja su u suprotnosti sa ponašanjem odgovarajućih pronukleotida Rp,Sp TT-PS dimera gde je zabeležena značajna stereodiferencijacija zajedno sa mnogo sporijim stopama hidrolize u serumu i PLE (Iyer, R. P.; Yu, D.; Agrawal, S. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 4, 2471). Moguće je daje kao posledica različitih načina nabiranja šećera u 2"-OMe-uridinu( CT- endo)u poređenju sa timidinom( C2'- endo),globalna konformacija 6a i

6bmože biti značajno različita od one koja odgovara TT dimemim pronukleotidima. Posledično, estarske grupe u6ai6bmogu biti povoljnije uravnotežene za napad nukleofilnim mestom esteraza.

|0074j Pored toga, svi analozi su bili stabilni neograničeno kada su čuvani na -20°C kao liofilizovani prašak. Sledeće smo ispitivali profil citotoksičnosti pronukleotidnih derivata u različitim ćelijskim linijama kao što su MDBK, Vero i HFF. Kao što je prikazano u Semi 4, većina analoga osim6cimali su CC50> 1000 wM u ovim ćelijskim linijama pokazujući visok profil bezbednosti za ova jedinjenja.

PRIMER 2. 5-izopropilkarboniIoksimetil tiofosfatni derivat 6k od 3'dApsU2'OMe

[0075]

[0076]Ciljno jedinjenje6k jepripremljeno u dva koraka.

|0077] Korak 1. Priprema jodometilizopropil karbonata:U rastvor anhidrovanog natrijum jodida (6 g, 40 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (20 mL) ukapavanjem je dodavan hlorometil izopropil karbonat (2.9 g, 19 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (10 mL) tokom 20 min. Reakciona smeša, pokrivena aluminijumskom folijom (zaštićena od svetlosti) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Odvojena čvrsta supstanca je filtrirana, isprana acetonitrilom i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (10 mL) i organske materije su ekstrahovane sa etrom (25 mL). Etarski ekstrakti su isprani natrijum bisulfitom (5%, 10 mL), kasnije fiziološkim rastvorom (10 mL). Organski sloj je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran, koncentrovan i sušen pod visokim vakuumom. Prinos 2.72 g (58%); 'H-NMR 5 1.3 (d, 6H), 4.95 (m. IH), 5.95 (s, 2H).

[0078] Korak 2. Alkilacija dinukleotida, 3'-ApsU2'OMe.U rastvor dinukleotida (60 mg, 0.098 mmol) u vodi (HPLC, 400 mL) pod mešanjem dodat je rastvor jodometil izopropil karbonata (80 mg, 0.0166 mmol, 3.33 ekv.) u acetonu (1 mL). Dodata je nova količina acetona (1 mL) da bi se dobio bistar rastvor da bi se izbeglo svako odvajanje uljanih globula alkilujućcg sredstva. Reakeiona smeša, pokrivena u aluminijumskoj foliji, je mešana 3 časa, koncentrovana pod rotavap uslovima i kasnije u visokom vakuumu da bi se dobila reakeiona smeša kao bela čvrsta supstanca. Ovo je prečišćeno hromatografijom na koloni si lika gela upotrebom početno hloroforma i lagano sa hloroformom koji sadrži 2% do konačno 8% metanola. Frakcije, koje sadrže glavnu komponentu, su spojene, koncentrovane i sušene pod visokim vakuumom preko noći. Željeni čist proizvod 6k je izolovan u skoro kvantitativnom prinosu (68mg);3IP-NMR (MeOH-d4) 8 27.7. 28.6.

PRIMER 3. Priprema estraS- meti\holne kiseline 61 od 3'dApsU2'OMe

[0079]

[0080]Korak 1. Sinteza hlorometil deoksiholata.U deoksiholnu kiselinu (120 mg, 0.306 mmol) u etanolu (4 mL) dodat je rastvor cezijum karbonata (53 mg, 0.160 mmol) u vodi (3 mL). Reakeiona smeša je mešana 30 min i etanol je početno uklonjen pod rotavapom, i kasnije pod visokim vakuumom. Ostatak je liofilizovan da bi se dobila cezijumova so kao beli prašak. U rastvor cezijumove soli u N.A^-dimetilformamidu (DMF, 3 mL) na sobnoj temperaturi dodat je bromohlorometan (10 mL) i reakeiona smeša pokrivena aluminijumskom folijom je mešana na sobnoj temperaturi 24 časa. Rastvarači su uklonjeni i reakeiona smeša je ekstrahovana u dihlorometanu (20 mL), isprana vodom (5 mL), fiziološkim rastvorom (5 mL) i rastvarač je uklonjen posle sušenja preko anhidrovanog natrijum sulfata da bi se dobilo hlorometil jedinjenje (100 mg, 74%). Ovo je korišćeno bez bilo kakvog dodatnog prečišćavanja za konverziju u odgovarajući jodometil derivat. |0081] Korak 2. Priprema jodometil deoksiholataU rastvor natrijum jodida (304 mg, 2.03 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (3mL) lagano su dodati hlorometil estar (438 mg, 0.99 mmol) u smeši acetonitrila (6 mL) i dihlorometan (2 mL). Reakeiona smeša, zaštićena od svetlosti, je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 časa. Posle koncentrovanja, reakeiona smeša je ekstrahovana u dihlorometanu (15 mL), organski sloj je ispran vodom (5 mL), natrijum bisulfitom (5%, 5 mL) i konačno fiziološkim rastvorom (5 mL). Sušen je preko anhidrovanog natrijum sulfata i sirovi proizvod, dobijen posle uklanjanja rastvarača, je prečišćen hromatografijom na silika koloni da bi se dobilo jodo jedinjenje (110 mg, 21%).

|0082) Korak 3. Kuplovanje jodometil deoksiholata. U rastvor 3"dApsU2'OMe (50 mg. 0.082 mmol) u vodi (400 mL) dodat je rastvor jodometil deoksiholata (110 mg, 2.066 mmol) u acetonu (3 mL). Odvojena čvrsta supstanca je rastvorena dodavanjem još acetona (~6 mL) i reakeiona smeša je mešana preko noći. Koncentrovana jc pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na silika koloni upotrebom hloroforma do hloroforma koji sadrži metanol (2 to 10%). Frakcije su spojene, koncentrovane i sušene pod visokim vakuumom da bi se dobio željeni proizvod 61 (40 mg, 49%);3IPNMR (MeOH) 6 28.2. 29.1.

PRIMER 4. Priprema N-(t-butoksikarbonil)-L-fenilalaninat analoga 6m od 3'dApsU2'OMe

[0083}

[0084] Jodometil N-(t-butoksikarbonil)-L-fenilaIaninat.U ^-(/-butoksikarboni^-L-fenilglicin (663 mg, 2.49 mmol) u etanolu (3 mL) dodat je rastvor cezijum karbonata (427 mg, 1.31 mmol) u vodi (2 mL). Pošto je prestalo oslobađanje gasa, reakeiona smeša je mešana 1 Čas. Rastvarači su uklonjeni i liofilizovani da bi se dobila cezijumova so. U rastvor cezijumove soli (270 mg, 0.82 mmol) u Af,Af-dimetilformamidu (DMF, 2 mL) dodat je bromohlorometan (5 mL) i mešan preko noći sa reakcionom smešom pokrivenom aluminijumskom folijom. Odvojena čvrsta supstanca je filtrirana, čvrste supstance su isprane sa DMF (2 mL) i filtrat je koncentrovan pod visokim vakuumom. Nađeno je da proizvod (206 mg, 80%) Čist pomoću TLC (Heks: EtOAc 4:1). Ovaj intermedijer je korišćen za konverziju u jodo jedinjenje bez dodatnog prečišćavanja. U rastvor natrijum jodida (196 mg, 1.31 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (3 mL), dodat je hlorometil fenilalaniat derivat (206 mg, 0.656 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (1 mL). Reakeiona smeša je mešana na sobnoj temperaturi, sa zaštitom od svetlosti, preko noći. Filtrtirana je, čvrsta supstanca je isprana sa DMF (3 mL) i filtrat je koncentrovan pod vakuumom. Ostatak jc ckstrahovan u dihlorometanu (10 mL) i vodi (5 mL), organski sloj je ispran sa NaHS03(5%, 5 mL) i fiziološkim rastvorom (zasićen, 5 mL). Organski sloj je sušen preko anhidrovanog Na2S04, i koncentrovan, da bi se dobilo željeno jodo jedinjenje (199 mg, 75%). [0085| Alkilacija3'dApsU20Me- U rastvor 3'dApsU2'OMe (44 mg. 0.072 mmol) u vodi (400 ul), dodat je jodid (100 mg, 0.25 mmol) u acetonu (800 ul) i reakeiona smeša je mešana preko noći. Reakeiona smeša je koncentrovana pod vakuumom, liofilizovana i prečišćena pomoću hromatografije na silika gelu upotrebom hloroforma i smeše koja sadrži hloroform i metanol (2% do 10%). Frakcije su sakupljene, kombinovane, koncentrovane i sušene pod visokim vakuumom da bi se dobio ć-Boc zaštićeni fenilalanin spojeni proizvod 6m (40 mg, 65%);<3I>P-NMR (MeOH-d4) 5 28.7. 27.9.

PRIMER 5. Priprema 4-acetamidobenzil derivata 6n od3'dApsU2'Omc

[0086J Priprema 4-acetamidobenzil alkohola.U rastvor 4-acetamidobenzaldehida (10 g, 61.3 mmol) u metanolu (100 mL) dodat je natrijum borohidrid (800 mg) na sobnoj temperaturi u porcijama. Reakeiona smeša sc meša preko noći, i napredovanje reakcije je provereno pomoću TLC upotrebom 4:1 heksana:EtOAc kao eluenta. Odsustvo početnog materijala pokazalo je završetak redukcije i reakeiona smeša je koncentrovana u rotavapu. Ostatak je podeljen između vode (25 mL) i etil acetata (4X50 mL) i organski sloj je ispran fiziološkim rastvorom (25 mL). Etil acetatni sloj je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i uklanjanje rastvarača je dalo alkohol kao svetio žutu Čvrstu supstancu, koja je sušena pod visokim vakuumom. 8.6 g (85%); 'H NMR (DMSO-d6): 5 2.0 (s, 3H), 4.5 (d. 211). 5.2 (t, IH), 7.25 (d, 2H), 7.55 (d, 2H), 9.95 (s, IH).

[0087] Priprema 4-acetamidobenzil jodida.U ohlađeni rastvor anhidrovanog DMF (5 mL) dodat je tionil hlorid (0.2 mL, 2.8 mmol). Smeša je mešana 10 min i dodat je rastvor Kl (2.49 g, 15 mmol) u anhidrovanom DMF (12 mL) nakon čega je sledilo dodavanje alkohola (0.165 g, 1 mmol). Reakeiona smeša je mešana u ledenom kupatilu 3 časa i ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Reakeiona smeša je sipana u ledenu vodu (25 mL) i esktrahovana etrom (3X 25 mL). Etarski sloj je ispran fiziološkim rastvorom, sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan da bi se uklonio rastvarač. Proizvod je dobijen (138 mg, 50%) kao čista žuta čvrsta supstanca. (TLC Heks.: EtOAc (1:1). 'H NMR (CDC13): 5 2.17 (s, 3H), 4.45 (s, 2H). 7.17(br.s, IH). 7.33 (d. 2H). 7.43 (d, 2H). Ovo jedinjenje jc takođe pripremljeno sa poboljšanim prinosima (-75%) upotrebom cezijum jodida i bor trifluorid eterata u acetonitrilu. Kuplovanje 4-acetamidobenzil jodida sa 3'đApsU2"OMe izvedeno je kao što je ranije opisano za analog holne kiseline.

PRIMER 6. Sinteza 4-benzamidobutil analoga 60od 3'dApsU2'OMc

[0088|

|0089] Priprema 4-benzamidobutil jodida:U hladan anhidrovani DMF (5 mL) na 0-5°C dodat je tionil hlorid (0.2 mL) i smeša je mešana 15 min. Dodat je rastvor kalij um jodida (2.4 g, 5 mmol) u anhidrovanom DMF (8 mL), a zatim rastvor 4-benzamidobutanola (193 mg, 1 mmol) u anhidrovanom DMF (2 mL). Obojena reakeiona smeša je mešana preko noći. Reakeiona smeša je obrađena sipanjem u ledeno hladnu vodu (—10 mL) i ekstrahovana etrom (3X15 mL). Konačno, etarski sloj je ispran vodom, fiziološkim rastvorom i sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Sirovi proizvod, dobijen posle filtracijc i uklanjanja rastvarača, prečišćen je pomoću hromatografije na koloni upotrebom smeše heksana i etil acetata (4:1) da bi se dobilo jodo jedinjenje kao ulje. 45%; 'H NMR (CDC13): 6 1.77 <m, 2H). 1.93 (m, 2H), 3.23 (t, 2H), 3.55 (q, 2H), 6.26 (br.s, IH), 7.48 (m, 3H), 7.75 (m, 2H).

[0090]Kuplovanje 4-benzamidobutil jodida sa 3'dApsU2<*>OMe izvedeno je kao pre da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 60.

PRIMER7. Sinteza 5-benzoiloksipentiI analog od 3'dApsU2'OMe

[0091]

[0092] Priprema 5-benzoiloksipentan-l-ola:Smeša benzoeve kiseline (1 g), 1,5-pentandiola (5 mL) i/Moluensulfonske kiseline (110 mg) zagrevana je u uljanom kupatilu na 100°C preko noći. Reakeiona smeša je hlađena do sobne temperature, sipana u vodu {50 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (2X25 mL), isprana natrijum karbonatom (5%, 20 mL), a zatim fiziološkim rastvorom (15 mL). Organski sloj je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan da bi se dobio skoro čist proizvod (1.15 g, 67%); |0093] Priprema 5-benzoiloksi-l-jodopentana.36% pnnos. 'H NMR (CDC13): 6 1.57 (m, 2H), 1.85 (m, 4H), 3.22 (t, 2H), 4.33 (t, 2H), 7.44 (m, 2H), 7.57 (m, IH), 8.04 (m, 2H).

[0094]Kuplovanje 5-benzoiloksi-l-jodopentana sa 3'dApsU2'OMe izvedeno je kao ranije.

[0095] Priprema 5-benzoiIoksibutan-l-ola:Ovo jc pripremljeno u prinosu od 73% upotrebom 1,4-butanđiola u postupku za 5-benzoilpentan-l-ol.

PRIMER 8. Sinteza 4-acetoksibcnzil analoga 6q od S'dApsUŽ'OMe

[0096]

[0097] Korak1.Priprema 4-acetoksibenzil alkohola:U ohlađenu suspenziju 4-hidroksibenzil alkohola (1.95 g, 14 mmol) u etil acetatu (25 mL) u ledenom kupatilu, dodat je trietilamin (2.1 mL, 14.9 mmol) u jednoj seriji uz mešanje. Rastvor acetil hlorida (1.1 mL, 15.5 mmol) u etil acetatu (12 mL) dodavanje ukapavanjem iz levka za dodavanje. Reakeiona smeša je mešana preko noći. Čvrsta supstanca je filtrirana, isprana etil acetatom i ostatak, posle koncentrovanja, je prečišćen hromatografijom na koloni upotrebom heksana na početku i kasnije postepeno do 40% etil acetata. Prinos 40%. 'H-NMR (CDC13), 5 2.02 (br. s, 111), 2.29 (s, 3H), 4.65 (s, 2H), 7.07 (d, 2H), 7.36 (d, 2H). |0098J Korak 2. Priprema 4-acctoksibenzil jodida:U rastvor 4-acetoksibenzil alkohola (0.332 g, 2 mmol) i cezijum jodida (0.571 g, 2.2 mmol) u anhidrovanom acetonitrolu (10 mL) pod azotom, uveden je bor trifluorid eterat (0.28 mL, 2.2 mmol) u acetonitrilu (5 mL). Posle mešanja preko noći, reakeiona smeša je sipana u ledeno hladnu vodu (20 mL) i odvojena čvrsta supstanca je filtrirana, isprana vodom i kasnije heksanima. Proizvod je sušen pod visokim vakuumom. Prinos, 0.39 g, 71%; TLC, heksani:EtOAC (4:1). 'H NMR (CDC13): 2.3 (s, 3H), 4.35 (s, 2H), 7.05 (d, 2H), 7.5 (d, 2H). [0099J Korak3.Sinteza 4-acetoksibenzil analog od3'dApsUro!vie> Alkilacija 3,dApslJ2 QMc sa 4-acetoksibenzil jodidom izvedena je kao ranije.

[0100]PRIMER9. Analize citotoksičnosti: Standardne MTT analize su izvedene u 96-komornim pločama upotrebom Promega CellTiter96 neradioaktivnog kita za analizu ćelijske proliferacije zajedno sa uređajem sa očitavanje 96-komorne ploče (ThermoMax, Molecular devices), i upotrebom MDBK, Vero i HFF ćelijskih linija (dobijene iz ATCC).

[0101]Korišćeno je nekoliko kontrola uključujući nukleozidne analoge 3TC, AZT i ddC, kao i, medijume bez lekova. SDS je korišćen kao pozitivna citotoksiČna kontrola. Svi pronukleotidi su testirani u tri kopije u koncentracijama od 100, 300 i 1000 mM. Posle 24-časovne inkubacije ćelija sa test supstancom, izvedena je MTT analiza. Podaci su prikazani u Tabeli 5.

PRIMER 10. Procena bioreverzibilnosti prolekova.

[0102]Studije bioreverzibilnosti su izvedene na sledeći način: Stok rastvor svakog analoga jc pripremljen rastvaranjem 2 mg u 100 uL DMSO. 10 uL alikvote su razblažene sa 90 uL fosfatnog pufera (0.1 M, pH 7.0) i 100 uL alikvote zečjeg seruma. Smeša je inkubirana na 37°C u vodenom kupatilu. Alikvote su uklonjene u različitim vremenskim taČkama i razblažene sa 200 uL metanola da bi se zaustavila reakcija. Inkubat je zatim centrifugiran, supernatant je koncentrovan u „speed vac" i razblažen sa 200 uL 0.1 M amonijum acetatnog pufera pre injekcije u HPLC. Reverzno-fazna HPLC analiza je izvedena upotrebom NVaters Instrument opremljenog sa 600Egradient kontrolerom i 996 photodiode array detektorom sa Millennium softverom. Korišćena je X-terra MS C18 2.5 um, 2.1 X 20 mm kolona i operacioni gradijent od 100% A do 80% B tokom 30 minuta pufera A (0.1 M NhUOAc) i pufera B (80:20, CH3CN:NH4OAc). Vreme zadržavanja za prolekove bilo je u opsegu od 16 do 18 minuta, dok je isto kodRp, Spdinukleotida 5 bilo 13. 5, 13.8 minuta.

[0103]Tipično na primer, prolek 6m izveden od aminokiseline i karbonatni derivat 6k su podvrgnuti skoro kompletnoj konverziji u 3'đApsLVoMeza~3 časa sa tretmanom serumom. Drugi prolekovi imali su različite stope konverzije u ishodni dinukleotid. Neki prolekovi nisu se konvertovali nazad u ishodno pod uslovima eksperimenta.

[0104] PRIMER 11. Stabilnost.Ispitivana je stabilnost prolekova u simuliranoj želudačnoj tečnosti (SGF) i simuliranoj intestinalnoj tečnosti (SIF) na 37°C. SGF i SIF su pripremljeni praćenjem objavljenih postupaka i prolekovi su inkubirani posebno sa SGF i SIF u trajanju od 1 časa na 37°C, obrađeni i analizirani upotrebom reverzno-fazne HPLC. Nađeno je da ishodni dinukleotid 3'"dApsU2-oMenije bio stabilan u SGF razlažući se za oko 15 min, ali je bio relativno stabilan u SIF. Svi prolekovi su bili značajno stabilni u SGF sa polu-životima u opsegu od 1 do 3 časa. U SIF, S-aciloksialkil prolekovi su konvertovani u ishodni dinukleotid sa polu-životom od oko 1 časa. [0105J PRIMER 12. Oralna biodostupnost.Oralna biodostupnost prolekova je određena kod CD-1 miševa. Svaki od reprezentativnih prolekova 6a, 6k, 61 su rastvoreni u vodi i primenjeni na dve grupe miševa putem oralne gavaže. Mužjaci Swiss-Webster miševa telesne težine između 20 do 30 g (Charles River Labs) su korišćeni za studiju. U naznačenim vremenskim tačkama od 5, 15, 30, 60 i 120 minuta, miševi su žrtvovani i krv je sakupljena kardijačnom punkturom. Jetra, bubreg, želudac, duodenum, jejunum, ileum i mozak su uklonjeni i zamrznuti u suvom ledu sve do obrade. Plazma je odvojena od krvi centrifugiranjem i obrađena za analizu sadržaja leka pomoću reverzno-fazne HPLC. Nivoi svakog proleka i/ili ishodnog 3"dApsU2X)Mesu određeni pomoću analitičke HPLC. Uzorci tkiva (uglavnom jetre) su obrađeni posle homogenizacije u 1% SDS u prisustvu 0.1 M NaOAc. Homogenat je dodat u PALL SOK koncentrator i centrifugiran u trajanju od 2 časa na 3000 rpm. Uzorak je analiziran na reverzno-faznoj HPLC koloni (2.1X20 mm X-Terra kolona), stopa protoka 1 ml/min, 30 min gradijent od 100% A (0.1M NH4OAc) do 100% B (acetonitri 1:0.1 M NH4OAC, 80:20). U slučaju krvi, prolek bi mogao biti detektovan u ranim vremenskim tačkama. dok u je u kasnijim vremenskim tačkama, uglavnom ishodni dinukleotid 3'dApsU2 ovie zabeležen. U slučaju jetre, uglavnom je zabeležen 3*dApsU2 0Me-Ova zapažanja su u skladu sa oralnom apsorpcijom proleka nakon čega sledi enzimom-posredovana konverzija proleka u 3'dApsU2-oivie- Najverovatnije, enzimi odgovorni za konverziju proleka u 3'dApsU2402 0Me su esteraze nađene kako u krvi tako i u tkivima. Procena oralne dostupnosti je u opsegu od 5 do 15% u plazmi i jetri. [0106) PRIMER13.Invivoanti-HBV aktivnost prolekova.Određeni prolekovi su procenjeni u transgenom mišjem modelu HBV infekcije. Korišćeni su mužjaci transgenih miševa inficiranog sa HBV, starosti u opsegu od 78 do 108 dana. Prolekovi 6a i 6k su početno procenjeni u jednoj dozi od 300 do 400 mg/kg, primenjeni jednom dnevno u trajanju od 14 dana putem oralne gavaže. Jedinjenja su primenjivana u limunskoj kiselini i adefovir dipivoksil je korišćen kao pozitivna kontrola. Kontrolna grupa koja je primala nosač je korišćena kao negativna kontrola. Posle tretmana, miševi su žrtvovani i tkivo jetre je analizirano za HBV DNK upotrebom Southern blot analize. Podaci su statistički procenjeni upotrebom Kruskall-Wallis neparametarske ANOVA i postavljeni su na grafikon prikazan na Slici 2. Oba proleka 6a i 6k proizvela su do 2 log redukciju jetrene HBV DNK u poređenju sa netretiranom kontrolom, koja je bila statistički značajna sa p vrednostima 0.01 do 0.001.PRIMER 14.Efckat oralne primene jedinjenja 6a i 6k na virus hepatitisa B kod transgenih miševa.

[0107| Mužjaci i ženke transgenih miševa (osnovac 1.3.32) su inficirani virusom humanog hepatitisa B. Posle infekcije, životinje su oralno primale jedinjenja 6a ili 6k, ili placebo od 0.05 M limunske kiseline, pH 2.0 jednom dnevno u trajanju od 14 dana. Doze su bile 400 mg/kg/d, za jedinjenje 6a i 300 mg/kg/d za jedinjenje 6k. Pozitivna kontrola, ADV, je primenjivana u 10 mg/kg/d. Podaci su rezimirani u Tabelama 6 i 7. Statistička značajnost je označena kao<*>P < 0.05,<**>P < 0.01.<***>P < 0.001 u poređenju sa placebo nosačem. Merenja serumskog HBeAg, PEI su objavljena prema International Immuno Diagnostics standardizovanoj analizi upotrebom Paul Ehrlich međunarodnih jedinica (PEI U). Studija je takođe ustanovila da nema vidljive toksičnosti na visokim dozama koje su korišćene.

[0108]Patentna i naučna literatura na koju se ovde pozivamo ustanovljava znanje koje je dostupno onima sa iskustvom u tehnici.

[0109]Dok ovaj pronalazak naročito prikazan i opisan u vezi sa njegovim poželjnim primerima izvođenja, stručnjacima iz date oblasti tehnike će biti jasno da je moguće praviti različite promene u obliku i detaljima bez udaljavanja od obima pronalaska definisanog priloženim patentnim zahtevima.

Claims (9)

1. Pronukleotid predstavljen formulom (III): ili njegovi racemati. enantiomeri. diastereomeri. geometrijski izomeri, tautomeri. u kojima X je odsutan, O, NI I, NR, S; X| je odsutan, O, NH; A je odsutan, aril, aralkil; n jeO, 1, 2, 3. 4, 5; Rje alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, aril. supstituisnai aril, aralkil. heterociklik, O-alkil, O-heteroaril, steroidni; R3je izabran od vodonika, alkil. substituted atkil. C(0)-alkil. C(0)0-alkil, C(0)-ariI, C(0)0-aril, C(0)NHalkil i C(0)NH-aril; i B| i B2su nezavisno adenin. guanin. timin. citozin. uracil ili modifikovane nukleobaze.

2. Pronukleotid prema patentnom m zahtevu 1, predstavljen formulom (IV): u kome R4 je izabran od vodonika, C(0)-aIkiI, C(0)0-a1ki1, C(0)-aril, C(0)0-aril, C(0)NH-alkil i C(0)NH-aril; i R, R3, X, X|, A i n su kao što su prethodno definisani u patentnom zahtevu 1.

3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 koje ima formulu Al, izabranu od jedinjenja 1-8 iz Tabele 1: u kojima R,X\,R3i R4su obeleženi za svaki primer u Tabeli 1.

4.Pronukleotid prema patentnom zahtevu 1, predstavljen formulom (V): u kome R4je izabran od vodonika, C(0)-alkil, C(0)0-alkil, C(0)-aril, C(0)0-aril, C(0)NH-alkil i C(0)NH-aril; i R, R3, X, X|, A i n su kao što su prethodno dcfinisani u patentnom zahtevu 1.

5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 4 koje ima formulu BI, izabrano od jedinjenja 9-16 iz Tabele 2: u kojima R, Xi, R3i R4su označeni za svaki primer u Tabeli 2.

6. Farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu jedinjenja prema patentnim zahtevima 1 do 5 u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom.

7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu u lečenju HBV.

8. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 naznačeno time što sc jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa drugim agensima.

9. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8 naznačeno time što je za upotrebu u lečenju rezistentnih sojeva HBV.