RS54944B1 - Oligonukleotidi za pravljenje promena u sekvencama ciljanih rnk molekula prisutnih u živoj ćeliji - Google Patents

Oligonukleotidi za pravljenje promena u sekvencama ciljanih rnk molekula prisutnih u živoj ćeliji

Info

Publication number
RS54944B1
RS54944B1 RS20160489A RSP20160489A RS54944B1 RS 54944 B1 RS54944 B1 RS 54944B1 RS 20160489 A RS20160489 A RS 20160489A RS P20160489 A RSP20160489 A RS P20160489A RS 54944 B1 RS54944 B1 RS 54944B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
oligonucleotide
sequence
seq
nucleotides
target rna
Prior art date
Application number
RS20160489A
Other languages
English (en)
Inventor
Boer Daniel Anton De
Tita Ritsema
Original Assignee
Proqr Therapeutics Ii Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Proqr Therapeutics Ii Bv filed Critical Proqr Therapeutics Ii Bv
Publication of RS54944B1 publication Critical patent/RS54944B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
[0001]Ovaj pronalazak vezuje se za polje genske terapije, preciznije oligonukleotide za pravljenje pramena u sekvenci ciljanog RNK molekula prisutnog u živoj ćeliji,
POZADINA PRONALASKA
[0002]Brojne genetske bolesti izazvane su mutacijama u genomu. Nađeno je da nekoliko tipova modifikacija dovodi do mutacija u genomu: delecija jednog ili više baznih parova, jedna ili više supstitucija u sekvenci gena, umetanje jednog iii više nukleotida ili ponavljanje iteracija tripleta i odsustvo ili duplikacija celog ili dela gena.
[0003]Genetske bolesti izazvane supstitucijom, delecijom ili insertacijom jednog ili više baznih parova uključuju cističnu fibrozu, distrofiju mišića, srpastu anemiju, hemofiliju, B-talasemiju, fragilni X sindrom (Martin-Belov sindrom).
[0004]RNK reparacija koristi se kako bi se popravili genetski defekti na RNK nivou.
[0005]Oligonukleotidi i njihovi kopleksi koriste se kao terapeutski molekuli za popravku DNK modifikacija (I Papaioannou, JP Simons, JS Owen Oligonucleotide-directed gene-editing technologv: mechanisms and future prospects Expert Opin. Biol. Ther. (2012) 12(3):329-342). Ovi oligomeri mogu da sadrže RNK i/ili DNK nukleotide. Oni se koriste za dobijanje reparacije defektne DNK na tečno određenom mestu. Očekuje se da se reparacija javi kroz aktivaciju endogenih DNK reparativnih mehanizama posle prepoznavanja pogrešno sparenih nukleotida (Missmatch repair).
[0006]Oligonukleotidi koji formiraju tripleks koriste se za specifično sekvenciranje genskog mapiranja. Tripleks koji formiraju nukleotidi najviše se vezuju u maniru dvolančane DNK sa visokim afinitetom. Zbog ove karakteristike, tripleks koji formiraju oligonukleotidi predloženi su kao alat za korekcije na tačno određenom mestu ciljanih gena (Knauert et al., Hum Mol Genet. (2001) 10, 2243-2251; Richardson et al, Drug Target(2002) 10, 133-134; Thoung et al., (1993) Angevvandte Chemie. Intl. Ed. Eng., 32, 666-690.). Sadašnje metode reparacije nisu veoma efikasne i/ili nije dokazano da funkcionišu u živim ćelijama in situ, ostavljajući prostor za druge mehanizme reparacije genskih defekata.
[0007]Objavljena je reparacija defektnih gena na RNK nivou. Specifična reparacija iRNK kompleksnim ili dvostrukim oligonukleotidima koristi se npr. za umetanje nukleotida u AF508 CFTR iRNK in vitro. Pretpostavlja se da mehanizam koji je ovim posredovan predstavlja RNKazu H-posredovanu degradaciju praćenu RNK reparacijom (PC Zamecnik, MK Raychowdhury, DR Tabatadze, HF Cantietlo Reversal of cvstic fibrosis phenotvpe in a cultured AF508 cvstic fibrosis transmembrane conductance regulator cell line by oligonucleotide insertion Proc Natl Acad Sci 2004 101(21) 8150-8155; WO2005094370, oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools).
[0008]Ying Shen et al., Mutation Research (2011), 717(1-2): 91-98 opisuju upotrebu jednolančanog RNK oligonukleotida okruženim DNK regionima kao alat genske izmene u bakterijskim i humanim ćelijama.
OPIS PRONALASKA
[0009]Ovaj pronalazak definiše se prema zahtevima i odnosi se na metode za reparaciju ciljanih gena u živim ćelijama, poželjnije u živim ćelijama u višećelijskom organizmu (in vivo). Pronalazak se konkretno odnosi na pravljenje izmena u ciljanoj RNK u živim ćelijama in vivo višećelijskih organizama kod životinja, pretežno sisara, ali najviše kod ljudi. Uprkos ranijim radovima o genskoj reparaciji u živim ćelijama, veruje se da ovaj pronalazak po prvi put otkriva mogućnost izmena ciljanog RNK molekula u živoj ćeliji in vivo višećelijskih organizama, time menjajući fenotip tog organizma koristeći oligonukleotide, poželjno jednolančane oligonukleotide, čak i specifičnije hemijski modifikovane jednolančane oligoribonukleotide. Iznenađujuće, oligonukleotidi prema pronalasku mogu da se administriraju in vivo bez gubitka aktivnosti i u takvim količinama mogu bitno da povrate zaraženi fenotip organizma subjekta. Pronalazak je ilustrovan kroz administraciju u pluća organizma koji pati od cistične fibroze i kroz hemijski modifikovane oligoribonukleotide koji su sposobni za vraćanje RNK sekvence kodirane za CFTR, time obnavljajući proteinsku funkciju CFTR-a i CF fenotip iii barem ublažavajući stanja organizma.
[0010]Nakon uvođenja ovakvih, poželjno jednolančanih antisens oligonukleotida u ćeliju, poželjno kod ćelija sisara, najpoželjnije kod humanih ćelija, usmereni su na RNK, prekursor ili njihov šablon na mesto na kome je potrebna reparacija RNK i moguće je da se ponašaju kao vodeći lanac za reparaciju RNK. Specifični mehanizam reparacije je nepoznat, ali oligonukleotidi prema pronalasku, poželjno kao jednolančani molekuli reparacije, ne dozvoljavaju da RNKaza H ima ulogu u procesu reparacije. Posredovane promene u ciljanom RNK mogu da budu direktno na RNK nivou ili indirektno preko DNK koji se potom transkribuje u RNK molekul ili je njegov prekursor. Oligonukleotidi koji su ovde opisani generalno se odnose na oligonukleotide prema pronalasku i mogu da se koriste u svim oblicima ovog pronalaska.
[0011]Svi oblici ovog pronalaska mogu da se koriste in vitro, in vivo ili ex vivo.
[0012]Ovaj pronalazak može konvencionalno da se koristi u tretmanu cistične fibroze, poželjno reparacijom deltaFS08 mutacije u ekson 10 CFTR-a (regulator cistično fibrozne transmembranske provodnosti). Prema načinu delovanja primera oligonukleotida prema pronalasku, molekul u SEQ ID NO: 1, prikazan je na slikama 1-3 i 7A. Prema aktivnosti primera oligonukleotida prema pronalasku, molekul prikazan u SEQ ID NO: 1 poređen sa prethodno opisanim dupleksom (Zamecnik et al, supra) ilustrovan je na slici 4. Stepeničast grafik pokazuje da je trenutno opisan jednolančani antisens oligonukleotid (AON) barem aktivan kao, a čini se i da je još aktivniji u reparaciji CFTR poređen sa prethodno opisanim dupleks molekulom (PC Zamecnik, MK Raychowdhury, DR Tabatadze, HF Cantiello Reversal of cvstic fibrosis phenotype in a cultured AF508 cvstic fibrosis transmembrane conductance regulator cell line by oligonucleotide insertion Proc Natl Acad Sci 2004 101(21) 8150-8155; WO2005094370, oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools). Aktivnost SEQ ID NO: 1 određuje se komparativnim testom kao što je opisano u Zamecnik et al, supra, videti npr. sliku 4, strana 8153.
[0013]Ovaj pronalazak takođe može da se koristi u pravljenju izmene u još jednom ciljanom RNK molekulu i/ili za tretman drugih bolesti koje su vezane za (genetičke) poremećaje kao što su, ali nisu ograničeni na njih, albinizam, nedostatak alfa-l-antitripsina, Alchajmerova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, astma, B-talasemija, CADASIL sindrom, Charcot-Marie-Toothova bolest, hronična opstruktivna plućna bolest (HOPB), distalna spinalna mišićna atrofija (DSMA), Duchenne/Beckerova mišićna distrofija, distrofična bulozna epidermoliza, bulozna epidermoliza, Fabrijeva bolest, familijalna adenomatozna polipoza, galaktosemija, Gaucherova bolest, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, hemofilija, nasledna hematohromatoza, Hunterov sindrom, Hantingtonova bolest, Hurlerov sindrom, upalne bolesti creva (UBC), nasledni poliaglutinacioni sindrom, Lesch-Nyhanov sindrom, Lvnchov, Marfanov sindrom, mukopolisaharidoza, mišićna distrofija, miotonična distrofija tip I i II, Niemann-Pickova bolest tipa A, B i C, kanceri povezani sa NY-esol, Parkinsonova bolest, Peutz-Jeghersov sindrom, fenilketonurija, Pompeova bolest, primarna cilijarna bolest, plućna hipertenzija, retinitis pigmentosa, Sandhoffova bolest, Glanzmann-Rinikerov sindrom, srpasta anemija, spinalna muskulatoma atrofija, Stargardtova bolest, Tay-Sachsova bolest, X-povezana imunodeficijencija, različiti oblici kancera (npr. BRCA1 i 2 povezuju rak dojke i jajnika) i si.
[0014]Prema jednim od poželjnih oblika pronalaska, promena u ciljanoj RNK sekvenci sadrži insertaciju jednog ili više nukleotida što dovodi do insertacije najmanje jedne sekvence aminokiseline u polipeptidnu sekvencu kodiranu pomoću ciljane RNK sekvence. Prema najpoželjnijem obliku, insertacija sekvence aminokiseline je razlog zbog kog se kodirani polipeptid vraća u polipeptid koji normalno funkcioniše u višećelijskom organizmu. Prema tome, najpoželjniji oblici pronalaska su oni gde je ciljana RNK sekvenca u višećelijskom organizmu povezana sa poremećajem izazvanim nefunkcionisanjem ciljane RNK sekvence, a genetski poremećaji su izabrani iz grupe poremećaja izazvanih ciljanom RNK sekvencom kojoj nedostaje jedan ili više nukleotida kada se porede sa ciljanim RNK sekvencama koje normalno funkcionišu. Dakle, prema pronalasku poželjne su one ciljane RNK sekvence kojima nedostaje najmanje deo kodona koji se obnavlja promenom u RNK sekvenci koristeći oligonukleotide.
[0015]Ovaj pronalazak pokazuje da reparacija RNK može da se postigne in vivo sistemskom administracijom oligonukleotida prema pronalasku. U zavisnosti od tkiva ili organa za koji se vezuje poremećaj ili generalno u kome može da se postigne promena ciljane RNK, način administracije može da se odredi kako bi se optimizovalo otpuštanje oligonukleotida prema pronalasku. Za poremećaje pluća ili drugih respiratornih oboljenja, oligonukleotidi prema pronalasku mogu pogodno da se administriraju direktno u pluća, na primer inhalacijom. Alternativno, u zavisnosti od poremećaja i/ili ciljanog tkiva, administracija može da se vrši topikalno (npr. na kožu) ili sistemski kao što je intradermalno, subkutaneo, intramuskulatorno, intravenozno, oralno, rektalno, intrakranijalno i si.
[0016]Pronalazak koristi jednolančane oligonukleotide u kojima su svi nukleozidi 2'-0 alkil riboza ribonukleozidi. Oligonukleotidi prema pronalasku mogu npr. da sadrže inozin i/ili mogu da sadrže modifikovane nukleotide, poželjno izabrane iz grupe koju čine 2'-0-metil riboza, fosforotioat, metilfosfonat, 5-metil-dC, 2-amino-dA, C5-pirimidin. Ovakav jedan poželjan primer stabilizovanog nukleotida je 2'-0-metil modifikovani nukieotid. Druge mere za povećanje stabilnosti mogu da budu, na primer, fosforotioat veze između nukleotida. Oligonukleotidi prema pronalasku mogu da se pripreme bilo kojim metodama poznatim u praksi. Stručnjaci u praksi znaju kako da sintetišu oligonukleotide prema pronalasku.
[0017]Prema tome, oligonukleotid prema pronalasku poželjno je hemijski modifikovan kako bi pružio otpor endonukleazama, egzonukleazama i RNazaH i kako bi unapredilo (RNK) vezivanje i stabilnost dupleksa. Određene karakteristike izabrane hernije, barem delom utiču na otpuštanje oligonukleotida do cilja prema ovom pronalasku: način administracije, biostabilnost, biodistribucija, intratkivna distribucija i ćelijsko preuzimanje i prenošenje. U dodatku, dalja optimizacija hernije oligonukleotida može da se primeni za povećavanje afiniteta vezivanja i stabilnosti, povećavanje aktivnosti, poboljšavanja bezbednosti i/ili redukciju troškova, smanjivanjem dužine ili poboljšavanjem sinteza i/ili procedura prečišćavanja. Višestruke hemijske modifikacije su generalno komercijalno dostupne stručnjacima u praksi (kao što su 2'- O-metil RNK, 5-supstituisani pirimidini i 2,6-diaminopurini).
[0018]Oligonukleotid prema pronalasku može da ima najmanje jedan glavni deo i/ili najmanje jednu modifikaciju baze.
[0019]Modifikacija baze uključuje modifikovanu verziju prirodnih purinskih i pirimidinskih baza (npr. adenin, uradi, guanin, citozin i timin) kao što su hipoksantin, orotična kiselina, agmatidin, iisidin, 2-tiopirimidin (npr. 2-tiouracil, 2-tiotimin), G-clamp i njegovi derivati, 5-supstituisani pirimidin (npr. S-halouracii, 5-propiniluracil, 5-propinilcitozin, 5-aminometiluracil, 5-hidroksimetiluracil, 5-aminometil citozin, S-hidroksimetilcitozin, Super T), 7-deazaguanin, 7-deazaadenin, 7-aza-2,6-diaminopurin, 8-aza-7-deazaguanin, 8-aza-7-deazaadenin, 8-aza-7-deaza-2,6-diaminopurin, Super G, Super A i N4-etilcitozin ili njihovi derivati; N2-ciklopentilguanin (cPent-G), N2-ciklopentil-2-aminopurin (cPent-AP) i N2-propil-2-aminopurin (Pr-AP) ili njihovi derivati; i degenerisane ili univerzalne baze, kao 2,6-difluorotoluen ili odsustvo baza kao što su abazična stanja (npr. l-deoksiriboza, 1,2-dideoksiriboza, l-deoksi-2-O-metilriboza; ili derivati pirolidina gde je u prstenu kiseonik zamenjen azotom (azariboza)). Primeri derivata Super A, Super G i Super T mogu da se nadu u US patent 6,683,173 (Epoch Biosciences). cPent-G, cPent-AP i Pr-AP pokazali su da redukuju imunostimulatorne efekte kada su inkorporirani u siRNK (Peacock H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200).
[0020]Modifikacije šećera uključuju 2'-0-alkil modifikovane verzije ribozil ostatka npr. 2'-0-metil, 2'-0-(2-cijanoetil), 2'-0-(2-metoksi)etil (2-MOE), 2'-0-(2-b'ometil)etil, 2'-0-butiril, 2'-0-propargil, 2'-0-alil, 2'-0-(2-amino)propil, 2'-0-(2-(dimetilamino)propil), 2'-0-(2-amino)etil, 2'-0-(2-(dimetilamino) etil); 2'-deoksi (DNK); 2'-0-(haioalkoksi)metil (Arai K. et al. Bioorg. Med. Chem. 2011, 21, 6285) npr. 2'-0-(2-hloroetoksi)metil (MCEM), 2'-0-(2,2-dihloroetoksi)metil (DCEM); 2'-O-alkoksikarboni npr. 2'-0 -[2-(metoksikarbonil)etil] (MOČE), 2'-0-[2-(N-metilkarbamoil)etil] (MCE), 2'-0-[2-(N,N-d i meti I ka rbam oi I )eti I ] (DCME); i njihovi derivati. Još jedna modifikacija uključuje "premošćene" ili "biciklične" nukleinske kiseline, npr. zaključana nukleinska kiselina (LNA), ksilo-LNA, o-L-LNA, S-DLNA, cEt (2'-0,4'-C ograničen etilom) LNA, cMOEt (2'-0,4'-C ograničen metokdietilom) LNA, etilen-premošćena nukleinska kiselina (ENA), triciklo DNK; i njihovi derivati. Ovim pronalaskom takođe je obuhvaćeno uvođenje više od jedne modifikacije šećera u oligonukleotidu. BNA derivati, na primer, opisani su u WO 2011/097641.
[0021]Glavna modifikacija uključuje modifikovane verzije fosfodiestara, kao što su fosforotioat (PS), hiralno Čist fosforotioat, fosforoditioat (PS2), fosfonoacetat (PACE), fosfonoacetamid (PACA), tiofosfonoacetat, tiofosfonoacet- amid, fosforotioat prolek, H-fosfonat, metil fosfonat, metil fosfonotioat, metil fosfat, metil fosforotioat, etil fosfat, etil fosforotioat, boranofosfat, boranofosforotioat, metil boranofosfat, metil boranofosforotioat, metil boranofosfonat, metil boranofosfonotioat i njihovi derivati. Druge modifikacije uključuju fosforamidit, fosforamidat, NS'-'PS' fosforamidat, fosfordiamidat, fosforotiodiamidat, sulfamat, dimetilensulfoksid, sulfonat, triazol, oksalil, karbamat, metilenimino (MMI) i tioacetamido nukleinska kiselina (TANA); i njihovi derivati. Ovim pronalaskom takođe je uključeno više od jedne posebne, glavne modifikacije u oligonukleotidu.
[0022]Oligonukleotidi prema pronalasku sadrže sekvencu komplementarnu ciljanoj RNK koju treba popraviti i poželjno kodirati sa polipeptidnom sekvencom divljeg tipa. Prema tome, zbog degeneracije kodona, oligonukleotid može da sadrži jedan ili više degenerisanih komplementarnih kodona. Komplementarni nukleotidi mogu da budu prisutni sa obe strane mesta koje se popravlja, npr. sekvenca bočne sekvence koja se menja, poželjno na 3', 5' ili na oba, krajeva sekvence koji se menjaju. Nakon osnovnog sparivanja ovih komplementarnih sekvenci, reparacija RNK je aktivirana.
[0023]Sekvenca ciljane RNK poželjno se razlikuje od popravljene ili od sekvence divljeg tipa. Nepopravljena ciljana RNK poželjno je mutirana sekvenca. Poželjno, mutacija je supstitucija, delecija ili insertacija normalnih sekvenci divljeg tipa. Popravljena ciljana RNK poželjno je sekvenca divljeg tipa gena iii druge željene sekvence.
[0024]Prema pronalasku, oligonukleotidi imaju poželjnu dužinu od 15 do 100 nukleotida, a najmanje 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili barem 40 nukleotida u dužinu, od kojih je najmanje 10 komplementarno sa ciljanom RNK sekvencom. Neki drugi nukleotidi mogu da se koriste kao umetak za reparaciju. Sparivanje baza sa ciljanom sekvencom iRNK javlja se prvenstveno u ćeliji, ćelija može da bude ćelija sisara i može da bude prisutna u ćelijskoj kulturi (in vitro) ili u telu (in vivo).
[0025]Ovaj pronalazak prvenstveno se vezuje za metod lečenja cistične fibroze, gde je genetski poremećaj deltaF508 mutacija i sekvenca koja se menja poželjno (pre-)iRNK CFTR koja skriva deltaF508 mutaciju. Ovaj pronalazak koristi se za reparaciju RNK kod pacijenata sa regulatorom cistično fibrozne transmembranske provodnosti (CFTR) mutacijom &F508. Uvođenjem 5'-UUU-3' ili 5-CUU-3' na mesto tri izbrisana nukleotida rezultovaće u reparaciji RNK koja vraća nedostajuću aminokiselinu fenilalanin (F ili Phe) u sekvencu proteina i stoga rezultuje u formiranju proteina divljeg tipa.
[0026]CFTR AF508 RNK može na primer da se popravi u kontaktu i/ili sa transfekovanim ćelijama, poželjno ćelijama sisara, a najpoželjnije humanim ćelijama, in vitro ili in vivo sa oligonukleotid ima prema pronalasku.
[0027]Prioritetan oligonukleotid prema pronalasku je komplementaran sekvenci koja ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili 100% identičnosti sa nukleotidima 16-30 i 34-48 SEQ ID NO: 6 i izmenjena sekvenca poželjno je izabrana kao 5'-UUU-3' i 5'-CUU-3', poželjnije 5'-CUU-3'. Još poželjniji oligonukleotidi prema pronalasku sadrže ili se sastoje od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3, poželjno, SEQ ID NO: 1; ili oligonukleotid koji sadrži ili se sastoji od skraćene varijante SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3, poželjno SEQ ID NO: 1. Ovakve skraćene varijante uklanjaju neke, npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nukleotide sa 3' i/ili 5' kraja SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3. Poželjna varijanta oligonukleotida prema pronalasku sadrži od 7 do 29 nukleotida SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3, poželjno SEQ ID NO: 1.
[0028]SEQ ID NO: 1; 5'-AUCAUAGGAAACACCAAAGAUGAUAUUUUCUUU-3' (CAPS nukleotidi su poželjno 2'-0-Me modifikovana RNK).
[0029]SEQ ID NO: 3; 5'-AUCAUAGGAAACACCAAAAAUGAUAUUUUCUUU-3' (CAPS nukleotidi su poželjno 2'-0-Me modifikovana RNK).
[0030]Dalje, poželjni oligonukleotid prema pronalasku uključuje oligonukleotid koji sadrži ili se sastoji od nukleotida sa sekvencom izabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 24, ili oligonukleotid koji sadrži ili se sastoji od skraćene varijante oligonukleotida sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 24. Ovakve skraćene varijante uklanjaju neke, npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nukleotide iz 3' i/ili 5' krajeva SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 24. Ovakvi oligonukleotidi mogu da se koriste za pravljenje izmene u sekvenci ciljanog RNK molekula pomoću npr. frameshift insertacije 1 ili 2 bazna para pri deleciji kodona za fenilalanin (u ilustrativne svrhe), u "frame" insertaciji tripleta nukleozida koji stvara kodon za fenilalanin na poziciji 508 aminokiseline CFTR proteina, u "frame" insertaciji tripleta nukleozida koji stvara kodon za leucin na poziciji 508 aminokiseline ili na drugoj poziciji aminokiseline CFTR proteina, umetanjem stop kodona u CFTR kodirajuću sekvencu. Način delovanja ovih primera oligonukleotida prema pronalasku, molekuli prikazani u SEQ ID NO: 16 do 24, prikazani su na slikama 7B-8F.
[0031]Svi nukleozidi oligonukleotida su 2'-0 alkil riboza ribonukleozidi, poželjno, 2'-0 metil riboza nukleozidi. Druge karakteristike koje povećavaju stabilnost, opisane iznad, mogu da se dodaju sekvencama, kao što su fosforotioat veze između nekih ili svih nukleotida. Sve ili pojedinačne opisane modifikacije mogu da se kombinuju u jednom antisens molekulu.
[0032]Modifikacije opisane iznad mogu da povećaju apsorbovanje kod epitelnih ćelija. Alternativno, molekul može da bude skraćen uklanjanjem nekih, npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nukleotida iz 3' i/ili 5' krajeva kako bi se povećala apsorpcija u ćelijama.
[0033]Za primenu in vivo, oligonukleotid prema pronalasku može da bude spakovan za otpuštanje (administraciju) u lipozom, polizom, nanočesticu ili u neku drugu pogodnu česticu kao što je virusna čestica. Alternativno, ili u kombinaciji sa nosačem, popravljeni molekuli mogu da grade kompleks sa polietilen-iminom (PEI) i/ili polietilen glikolom (PEG). Oligonukleotidi prema pronalasku mogu da se sintetišu unutar ćelije, čak i in vivo, na primer, inficiranjem ćelija virusom česticom ili česticama nalik virusu koje kodiraju oligonukleotid. Alternativno, žive ćelije mogu da budu transfekovane - in vitro ili in vivo - sa (virusnom) DNK, plazmidom ili si. Nakon infekcije ili transfekcije živih ćelija, oligonukleotidi prema pronalasku sintetišu se unutar žive ćelije kroz normalnu transkripciju i/ili replikaciju.
[0034]Prema tome, oligonukleotid prema pronalasku može da se prenese, kao takav, direktno u ćeliju, tkivo ili organ višećelijskog organizma. Oligonukleotid prema pronalasku može, na primer, da se prenese ćeliji, tkivu ili organu višećelijskog organizma u formi vektora ili ekspresije vektora gde ove forme sadrže molekul nukleinske kiseline kodirane oligonukleotidom. Vektor ekspresije poželjno se uvodi u ćeliju, tkivo, organ višećelijskog organizma preko genskog nosača. U jednom obliku, obezbeđen je virusni vektor koji sadrži ekspresionu ili transkripcionu kasetu koje pobuđuju ekspresiju ili transkripciju oligonukleotida prema pronalasku. Poželjni nosač je virusni vektor koji je adeno-asocirani virusni vektor ili retrovirusni vektor kao što je lenti virusni vektor i si.
[0035]Ovaj oblik pronalaska tiče se upotrebe vektora koji sadrži molekul nukleinske kiseline, kao što je opisano iznad, gde je vektor onaj vektor koji je pogodan za gensku terapiju. Vektori koji su pogodni za gensku terapiju opisani su u Anderson 1998, Nature 392: 25-30; VValther and Stein, 2000, Drugs 60: 249-71; Kay et al, 2001, Nat. Med. 7; 33-40; Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81 : 2573-604; Amado and Chen, 1999, Science 285: 674-6; Federico, 1999, Curr. Opin. Biotechnol.10: 448-53; Vigna and Naldini, 2000, J. Gene Med. 2: 308-16; Marin et al, 1997, Mol. Med. Today 3: 396-403; Peng and Russell, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 454-7; Sommerfelt, 1999, 1 Gen. Virol. 80 : 3049-64; Reiser, 2000, Gene Ther. 7: 910-3; i reference su ovde citirane.
[0036]Posebno pogodna genska terapija vektora uključuje adenovirusne i adeno-asocirane virusne vektore. Ovi vektori inficiraju veliki broj tipova ćelija koje mogu i koje ne mogu da se dele. U dodatku, adenovirusni vektori sposobni su za ekspresiju visokog nivoa transgena. Međutim, zbog epizomalne prirode adenovirusnih i adeno-asociranih virusnih vektora posle ulaska u ćeliju, ovi virusni vektori su najpogodniji za terapeutske primene kojima je potrebna samo prolazna ekspresija transgena (Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81 : 2573-2604; Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43) kao što je naznačeno iznad. Prioritetni adenovirusni vektori modifikovani su da redukuju odgovor domaćina što je objavljeno od strane Russella (2000, supra).
[0037]Poželjni retrovirusni vektor za primenu u ovom pronalasku je konstrukcija lentivirusa bazirana na ekspresiji. Lentivirusni vektori imaju jedinstvenu sposobnost da inficiraju ćelije koje se ne dele (Amado and Chen, 1999 Science 285: 674-6). Metode za konstrukciju i primenu konstrukcije lentivirusa bazirane na ekspresiji opisane su u U.S. Patent No.'s 6,165,782, 6,207,455, 6,218,181, 6,277,633 and 6,323,031 and in Federico (1999, Curr Opin Biotechnol 10: 448-53) and Vigna et al. (2000, J Gene Med 2000; 2: 308-16).
[0038]Generalno, vektori genske terapije smatraju se ekspresijom vektora opisanim iznad, u smislu da sadrže molekul nukleinske kiseline koja kodira oligonukleotid, gde je pomenuti molekul nukleinske kiseline operativno povezan za odgovarajuće regulatorne sekvence. Ovakve regulatorne sekvence barem sadrže promotor. Pogodni promotori za ekspresiju sekvence nukleotida kodiraju polipeptid iz vektora genske terapije uključujući npr. intermedijar citomegalovirus (CMV) kao rani promotor, virusne LTR regione, kao što su oni iz mišjeg "molonev" leukemija virusa (MMLV), rous sarkoma virusa ili HTLV-1, simian virusa 40 (SV 40) i promotor herpes simpleks virusa, timidin kinaza promotor.
[0039]Mnogi medikamenti za pluća mogu da se primene putem disajnih puteva. Takav jedan u medicini može da sadrži popravljen RNK molekul, npr. oligonukleotid prema pronalasku. Za otpuštanje oligonukleotida poželjno se koristi inhalator u vidu aerosola kroz disajne epitelne ćelije. Alternativno, kao inhalaciona formulacija može da se koristi suvi prašak. Upotreba jednolančanog oligonukleotida prema pronalasku u sistemu disajnih puteva umanjuje mogućnost dezintegracije molekula pomoću smicajnih sila tokom administracije.
[0040]Kod mnogih bolesti mukozni sloj je povećane debljine, dovodeći do smanjene apsorpcije lekova preko pluća. Jedna od ovih bolesti je hronični bronhitis, a kao još jedan primer cistična fibroza. Različite forme normalizatora sluzi su dostupni, kao što su DNKaze, hipertonični rastvor ili manitol, koji su komercijalno dostupni pod imenom Bronhitol. Kada se normalizatori sluzi koriste u kombinaciji sa jedinjenjima za reparaciju RNK, kao što su oligonukleotidi prema ovom pronlasku, oni mogu da povećaju efikasnost ovih lekova. Prema tome, administracija ovog oligonukleotida subjektu, poželjno ljudskom subjektu, kombinuje se sa normalizatorima sluzi, posebno sa onima koji su ovde opisani. U dodatku, administracija oligonukleotida može da se kombinuje sa administracijom malih molekula za lečenje CF, kao što su potencijatorska jedinjenja, na primer, Kalvdeco (ivacaftor; VX-770), ili korektorska jedinjenja, na primer VX-809 (Lumacaftor) i/ili VX-661.
[0041]Alternativno, ili u kombinaciji sa normalizatorima sluzi, otpuštanje u sluzne penetrirajuće čestice ili nanoČestice može da se primeni za efikasno dovođenje RNK popravljenih molekula epftelnim ćelijama ili na primer, plućima ili crevu. Prema tome, administacija oligonukleotida subjektu, poželjno ljudskom subjektu, koristi dovođenje u sluzne penetrirajuće čestice ili nanočestice.
[0042]Hronične ili akutne plućne infekcije često su prisutne kod pacijenata sa bolestima kao što je cistična fibroza. Tretmani antibioticima smanjuju bakterijske infekcije i njihove simptome kao što su mukozna zadebljanja i/ili formiranje biofilma. Upotreba antibiotika u kombinaciji sa molekulima reparacije RNK mogu da povećaju efikasnost RNK popravke zbog lakšeg pristupa reparacionog molekula ciljanim ćelijama. Stoga, administracija oligonukleotida subjektu, poželjno ljudskom subjektu, kombinuje se sa tretmanom antibioticima kako bi se smanjile bakterijske infekcije i simptomi kao što su mukozno zadebljanje i formiranje biofilma. Antibiotici mogu da se administriraju sistemski, lokalno ili na oba načina.
[0043]Za primenu oligonukleotida prema ovom pronalasku kod pacijenata sa cističnom fibrozom, ili pakovani ili kompleksni oligonukleotidi mogu da se kombinuju sa bilo kojim mukoznim normalizatorima kao što su DNKaze, manitol, hipertonični rastvor i/ili antibiotici i/ili mali molekuli za lečenje CF, kao što su potencijatori jedinjenja, na primer, Kalvdeco (ivacaftor; VX-770), ili korektori jedinjenja, na primer, VX-809 (Lumacaftor) i/ili VX-661.
[0044]Za povećanje pristupa ciljanim ćelijama može da se primeni "Broncheo-Alveolar Lavage" (BAL) kako bi očistio pluća pre administracije oligonukleotida opisanih pronalaskom.
[0045]Kapsula za kontrolisano otpuštanje može da se koristi za dovođenje oligonukleotida do crevnih epitelnih ćelija. Reparacija CFTR-a u ovim ćelijama možda može da poveća unošenje nutrijenata. Ovo može da bude kombinovano uz upotrebu preparacije pankreasnih enzima biološkog ili sintetskog porekla, kao što su pankrelipaza ili Creon koji su komercijalno dostupni i generalno se koriste da pomognu varenju pacijentima sa CF.
[0046]U svim oblicima ovog pronalaska, oligonukleotidi mogu da budu prisutni kao kompozicija hipertoničnog rastvora, npr. kompozicija koja sadrži oligonukleotide pronalaska i dalje sadrži 2% - 9% rastvora, poželjno 3% ■ 8% rastvora, poželjnije 4% - 8% rastvora, 5% - 8% rastvora, najpoželjnije 6% - 8% rastvora (kao što je 6.1%, 6.2%, 6.3%, 6.4%, 6.5%, 6.6%, 6.7%, 6.8%, 6.9%, 7.0%, 7.1%, 7.2%, 7.3%, 7.4%, 7.5%, 7.6%, 7.7%, 7.8%, 7,9% ili 8.0%), 6% - 7% rastvora, još poželjnije oko 7% rastvora, najpoželjnije 7% rastvora. Procenat rastvora ovde je opisan kao masa rastvora/ukupna zapremina kompozicije, npr. 7% rastvora odgovara 70 g rastvora/litru kompozicije. Hipertonični slani rastvor poželjno je NaCI rastvor.
[0047]U bilo kom obliku ovog pronalaska, oligonukleotidi i/ili kompozicije mogu da se administriraju načinima poznatim stručnjacima u praksi koji uključuju, ali nisu ograničeni na njih, administraciju u pluća, poželjno disajnim putevima i sistemsku administraciju, poželjno intravenoznu, intramuskulatornu, intradermalnu ili subkutaneo administraciju,
[0048]Stručnjaci u praksi znaju da gore opisane metode otpuštanja, inertni medijumi i kombinacija administracija mogu dalje da se kombinuju prema ovom pronalasku, npr. oligonukleotidi i/ili kompozicije sadrže takve oligonukleotide koji mogu da grade kompleks sa jedinjenjem koje se otpušta kao što je ovde opisano mogu da budu upakovani u nosač opisan i/ili upakovani u kapsulu za kontrolisano otpuštanje.
[0049]Jedan poželjan metod otpuštanja je u formi virusne čestice, sekvence viralne nukleinske kiseline koja kodira oligonukleotid prema pronalasku čija se ekspresija oligonukleotida ispoljava pri infekciji žive ćelije virusnom česticom ili transfekcijom žive ćelije sekvencom viralne nukleinske kiseline; poželjno kao što je opisano iznad.
[0050]Otpuštanje olinukleotida prema pronalasku u pluća vrši se disajnim putevima i/ili kroz creva. Administracija može da bude kombinovana sa normalizatorima sluzi i/ili sa antibioticima, poželjno, može da se kombinuje sa administracijom preparata pankreasnog enzima i/ili može da se kombinuje sa "Broncheo-Alveolar Lavage" kako bi se povećao pristup ciljanim ćelijama.
[0051]Stručnjaci u praksi znaju da dva ili više oligonukleotida prema pronalasku mogu da se kombinuju. Stručnjaci u praksi shvataju da kada se ovde nešto odnosi na oligonukleotid da kompozicija ili farmaceutska kompozicija poželjno mogu naizmenično da se koriste u metodama i primenama pronalaska.
[0052]U aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje oligonukleotide za pravljenje izmene u sekvenci ciljanog RNK molekula prisutnog u živoj ćeliji koji sadrži korak obezbeđivanja oligonukleotida u živoj ćeliji pod uslovima koji dozvoljavaju unos oligonukleotida u žive ćelije, gde pomenuti oligonukleotid sadrži sekvencu koja je barem parcijalno komplementarna molekulu ciljanog RMK, tako da hibridizacija oligonukleotida do ciljane RNK ili njihov prekursor, ili šablon stoga, zauzima mesto u pomenutoj živoj ćeliji, dozvoljavajući biohemijskom mehanizmu prisutnom u živoj ćeliji da kopira razliku u sekvenci oligonukleotida relativnih za sekvencu ciljanog RNK molekula na RNK molekul, ili direktno ili preko njihovih prekursora ili šablona tako da dovedu do promene u sekvenci pomenute ciljane RNK.
[0053]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, oligonukleotid je oligonukleotid koji je prethodno opisan.
[0054]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, oligonukleotid je oligoribonukleotid.
[0055]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, oligonukleotid u živoj ćeliji je u jednolančanoj formi.
[0056]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, živa ćelija je deo višećelijskog organizma.
[0057]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, živa ćelija je animalna ćelija, ali poželjnije humana ćelija.
[0058]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, promene u sekvenci ciljane RNK izazivaju da ćelija menja svoj fenotip.
[0059]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, promena u pomenutoj ciljanoj RNK potvrđena je određivanjem sekvence te ciljane RNK, njenih prekursora ili šablona.
[0060]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, promena u pomenutoj ciljanoj RNK potvrđena je određivanjem sekvence proizvoda polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline kodiranjem polipeptida koji kodira pomenutu ciljanu RNK.
[0061]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, promena u pomenutoj ciljanoj RNK potvrđuje se promenama u fenotipu živih ćelija ili organizama koji sadrže pomenute ćelije.
[0062]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, promena je poboljšanje poremećaja, često vezana za sekvencu ciljane RNK pre promene.
[0063]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, poremećaj je genetski poremećaj.
[0064]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, oligonukleotid ima dužinu od 15 - 100 nukleotida. Poželjnije, dužina oligonukleotida je između 20 i 50, između 25 i 45 nukleotida, između 27 i 35 nukleotida.
[0065]Poželjno, u oblicima ovih aspekata, oligonukleotid sadrži inozin i/ili sadrži modifikovane nukleotide, poželjno izabrane iz grupe koju čine 5-metil-dC, 2-amino-dA, C5-pirimidin i/ili modifikovane veze internu kleozida izabrane iz grupe koju čine fosforotioat veze, metilfosfonat veze.
[0066]Svi nukleozidi oligonukleotida su 2'-0 alkil riboza nukleozidi, poželjno 2'-0 metil riboza nukleozidi.
[0067]Svi nukleozidi su ribonukleozidi.
[0068]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, promena sekvence ciljanog RNK molekula sadrži insertaciju ili supstituciju jednog ili više nukleozida.
[0069]U svim oblicima prema pronalasku, oligonukleotidi se tipično administriraju u dozama u opsegu od l ug do 1000 mg, poželjnije od 10 ug do 1000 mg, još poželjnije od 100 pg do 10 mg, a najpoželjnije od 500 ug do 5 mg, što zavisi od ćelije (tkiva) koja se tretira, težine organizma, načina i/ili mesta administracije (lokalni naprema sistemskom, mesto administracije (irttraperitonealno, intramuskulatorno, pulmonarno itd.), poremećaj koji se leći, režim primene (pojedinačno ili ponovljeno bolusno ili kontinualno doziranje i si). Stručnjaci u praksi biće sposobni za ustanovljivanje optimalne doze koristeći metod probe i greške.
[0070]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, ciljana RNK kodira humani CFTR i promena rezultuje u stvaranju ili obnavljanju tripleta nukleozida kodiranog za fenilalanin na poziciji aminokiseline 508 CFTR proteina.
[0071]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, promena sadrži insertaciju tripleta nukleozida izabranih iz grupe koju čine 5'-UUU-3' i 5'-CUU-3'.
[0072]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, oligonukleotid je komplementaran sekvenci koja ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identičnih sekvenci kao i nukleotidi 16-30 i 34-48 SEQ ID NO: 6 i promena sadrži insertaciju tripleta nukleozida izabranog iz grupe koju čine 5'-UUU-3' i 5'-CUU-3'.
[0073]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, oligonukleotidi sadrže ili se sastoje od nukleotida 7-29, poželjno nukleotida 1-33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3, poželjnije SEQ ID NO: 1. Sledeći prioritetni oligonukleotidi uključuju oligonukleotide koji sadrže ili se sastoje od oligonukleotida sa sekvencama izabranim iz grupe SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 24, ili od oligonukleotida koji sadrže ili se sastoje od skraćene varijante oligonukleotida sa sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 24. Ovakve skraćene varijante uklanjaju neke, npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nukleotide sa 3' i/ili 5' krajeva SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 24.
[0074]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, oligonukleotidi se nalaze u nosaču, poželjno lipozomu, polizomu, ili nanočesticama gde oligonukleotid i/ili gradi kompleks za otpuštanje jedinjenja, poželjno polietilen-imina (PEI), polietilenglikola (PEG), i/ili je vezan za sterol, poželjno holesterol.
[0075]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, oligonukleotidi se dovode do respiratornog trakta ili pluća preko disajnih puteva u suvoj formulaciji ili kao aerosol koristeći inhalator, a poželjno je i da se oligonukleotid dovodi zajedno sa posrednikom transfekcije i/ili lekom za cističnu fibrozu poznatim stručnjacima u praksi, kao što su DNaze, manitol (poželjno Bronhitol) i/ili mali molekuli za lečenje CF, poželjno "Kalvdeco" (ivacaftor; VX-770), VX-809 (Lumacatfor) i/ili VX-661.
[0076]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, oligonukleotid se dobija u hipertoničnim fiziološkim rastvorima, poželjno između 2% - 9% koncentracije rastvora, 3% - 8%, još poželjnije 4% - 8%, 5%- 8%, 6% - 8%, 6% - 7%, a najpoželjnije od oko 7% koncentracije rastvora, gde je hipertonični rastvor poželjno fiziološki i farmaceutski prihvatljivi rastvor.
[0077]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, hipertonični rastvor je u suštini NaCI rastvor,
[0078]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, oligonukleotid se nalazi u penetrirajućim česticama sluzi, poželjno u penetrirajućim nanočesticama sluzi.
[0079]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, administracija oligonukleotida kombinovana je sa antibioticima kako bi se smanjile bakterijske infekcije i simptomi kao što su zadebljanje sluzi i/ili formiranje biofilma.
[0080]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, "Broncheo-Alveolar Lavage" (BAL) primenjena je pre administracije oligonukleotida prema pronalasku.
[0081]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, oligonukleotid se administrira kapsulom pomoću sistema otpuštanja kako bi se poboljšalo otpuštanje do crevnih ćelija.
[0082]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, administracija oligonukleotida kombinovana je sa administracijom bioloških ili sintetskih pankreasnih enzima kao što su pankrelipaza ili "Creon".
[0083]U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje to da farmaceutska kompozicija sadrži oligonukleotide koji su definisani u prethodnom aspektu ovog pronalaska, farmaceutski prihvatljive nosače i/ili hipertonične fiziološke i farmaceutski prihvatljive rastvarače, poželjno između 2% - 9% koncentracije rastvora, 3% - 8% , poželjnije od 4% - 8%, 5% - 8%, 6% - 8%, 6% - 7%, a najpoželjnije 7% koncentracije rastvora.
[0084]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, farmaceutska kompozicija dalje sadrži posrednika transfekcije.
[0085]Poželjno, u oblicima ovog aspekta, farmaceutska kompozicija dalje sadrži lekove protiv cistične fibroze poznatim stručnjacima u praksi, poželjno DNazu, manitol i/ili mali molekul za lečenje CF, poželjno "Kalvdeco" (ivacaftor; VX-770), VX-809 (Lumacaftor) i/ili VX661.
[0086]U daljem aspektu, ovaj pronalazak pokazuje da su oligonukleotidi definisani u različitim aspektima i oblicima i/ili kao farmaceutske kompozicije koje sadrže ovakve oligonukleotide. Poželjno, ovakvi oligonukleotidi ili kompozicije su jednolančani oligonukleotidi ili farmaceutske kompozicije koje sadrže jednolančani oligonukleotid komplementaran sekvenci koja ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identične sekvence sa nukleotidima 16-30 i 34-48 SEQ ID NO: 6. Poželjnije, ovakvi oligonukleotidi ili kompozicije prema pronalasku su jednolančani oligoribonukleotidi ili farmaceutske kompozicije koje sadrže jednolančani oligoribonukleotid koji ima nukleotide 7-29, poželjno nukleotide 1-33, SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3, poželjno SEQ ID NO: 1. Drugi poželjni oligonukleotid uključuje oligonukleotid koji sadrži ili se sastoji od oligonukleotida sa sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 24. Ovakve skraćene varijante uklanjaju neke, npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nukleotide sa 3' i/ili 5' kraja SEQ ID NO: 16 do SEQ ID NO: 24.
[0087]U svim oblicima ovog pronalaska, ekscipijens može da se koristi dalje kao pomoć u povećavanju stabilnosti, rastvorljivosti, apsorpcije, bioraspoloživosti, aktivnosti, farmakokinetike, farmakodinamike i otpuštanja nukleotida na ćeliju i u ćeliju, posebno ekscipijensi sposobni za formiranje kompleksa, vezikula, nanočestica, mikročestica, nanocevi, nanogelova, hidrogelova, poloksamera ili pluronika, polimerzomera, koloida, mikromehurića, vezikula, micela, lipopleksa i/ili lipozoma koji otpuštaju jedinjenja, supstanci i/ili oligonukleotida u kompleksu ili unutar vezikule ili lipozoma kroz ćelijsku membranu. Primeri nanočestica uključuju zlatne nanočestice, magnetne nanočestice, silika nanočestice, lipidne nanočestice, čestice šećera, proteinske nanočestice i peptidne nanočestice. Još jedna grupa nanočestica su polimerne nanočestice. Mnoge od ovih polimernih supstanci poznate su u praksi. Pogodne supstance sadrže npr. polietilenimin (PEI), ExGen 500, polipropilenimin (PPI), poli(2-hidroksipropilenimin (pHP)), derivate dekstrana (npr. polikacije kao što su dietil amino etil amino etil (DEAE)-dekstran, koji su dobro poznati kao reagensi DNK transfekcije koji mogu da se kombinuju sa butilcijanoakrilatom (PBCA) i heksilcijanoakrilatom (PHCA) kako bi se dobile katjonske nanočestice koje mogu da dovedu pomenuto jedinjenje duž ćelijske membrane u ćelije), butilcijanoakrilatom (PBCA), heksilcijanoakrilatom (PHCA), poli(laktik-koglikolnnom kiselinom) (PLGA), poliaminima (npr. spermin, spermidin, putrescin, kadaverin), hitozanom, poli(amidoaminom)(PAMAM), poli(estaraminom), polivinil etrom, polivinil pirolidonom (PVP), polietilen glikolom (PEG) ciklodekstrinima, hijaluronskom kiselinom, kolominskom kiselinom i njihovim derivatima), dendrimerima (npr. poli(amidoamin), lipidima {npr. l,2-dioleoil-3-dimetilamonijum propan (DODAP), dioleoildimetilamonijum hlorid (DODAC), fosfatidilholin derivatima [npr. l,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC)], lizo-fosfatidilholin derivat [npr. 1-stearoil-2-lizo-sn-glicero-3-fosfoholin (S-LysoPC)], sfingomijelin, 2-{3-[bis-(3-aminopropil)-amino]-propilamino}-N-ditetracedilkarbamoil metilacetamid (RPR209120), derivatima fosfoglicerola [npr. l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol, solima natrijuma (DPPG-Na), derivatima fosfatidinske kiseline [l,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidinska kiselina, natrijumovim solima (DSPA), derivatima fosfatidiletanolamin [npr. dioleoil-J-R-fosfatidiletanolamin (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DSPE),2-diritanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DPhvPE)], JV-[l-(2,3-dioleoiloksi)propil]-N,N,N-trimetil amonijum (DOTAP), l,3-di-oleoiloksi-2-(6-karboksi-spermil)-propilamid(DOSPER), (1,2-dimiristioloksi propil-3-dimetilhidroksi etil amonijum (DMRIE), (Nl-holesteriloksikarbonil-3,7-diazanonan-l,9-diamin (CD AN), dimetildioktadecilamonijum bromid (DDAB), l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfoholin (POPC), (b-L-arginil-2,3-L-diaminopropionska kiselina-N-palmitil-N-olelil-amid trihidrohlorid (Atu-FECTOI), derivati N,N-dimetil-3-aminopropan [npr. l,2-distearoiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DSDMA), l,2-dioleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DoDMA), 1,2-dilinoleiloksi-N,N-3-dimetilaminopropan (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminomer.il [l,3]-dioksolan (DLin-K-DMA), derivati fosfatidilserina [l,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfo-L-serin, natrijumove soli (DOPS)], holesterol}, sintetskim amfifilima (SAINT-18), lipofektinom, proteinima (npr. albumin, želatini, atelokolagen), peptidima (npr. PepFects, NickFects, poliarginin, polilizin, CADY, MPG)", njihove kombinacije i/ili proteinima viralnog kapsida koji su sposobni za samosastavljanje u čestice koje mogu da dovedu ćeliji pomenuto jedinjenje ili oligonukleotid. Lipofektin predstavlja primer agensa lipozomalne transfekcije. Sastoji se od najmanje dve lipidne komponente, katjonskog lipida N-[l-(2,3-dioleoiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorida (DOTMA) (cp. DOTAP koja je so metilsulfata) i neutralnog lipida dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Neutralna komponenta posredovana je intracelularnim otpuštanjem. U dodatku ovim nanočestičnim materijalima, katjonski peptid protamin daje alternativni pristup za formulisanje oligonukleotida kao koloida. Sistem koloidnih nanočestica može da formira takozvane čestice i može da bude pripremljen jednostavnim samosastavljajućim procesom za pakovanje i posredovanje intracelulatnog otpuštanja jedinjenja kao što je ovde opisano. Stručnjaci mogu da izaberu i da prilagode bilo koji od gore opisanih komercijalno dostupnih ili komercijalno nedostupnih alternativnih ekscipijenasa i sistema otpuštanja.
[0088]U opisu pronalaska, reč "genetski" stavlja se u zagradu kako bi se naglasilo da mutacije u ciljanom RNK molekulu ne moraju obavezno da budu genetski kodirane. One bi mogle da budu zbog (netačne) RNK promene, aberantnog pre-RNK deljenja, procesa ili bilo kog (nepoznatog) mehanizma.
[0089]U ovom dokumentu i njegovim zahtevima, glagol "sadržati" i njegove konjugacije koriste u svom neograničavajućem smislu što znači da stavke koje prate reč su uključene, ali stavke koje nisu specijalno napomenute nisu isključene. Reči "oko" ili "približno" kada se koriste sa numeričkom vrednošću (npr. oko 10) znači da je ta data vrednost (npr. 10) data sa greškom ±0.1% od vrednosti.
[0090]Informacija sekvence kao što je ovde data ne treba da bude tako usko interpretirana da zahteva pogrešno identifikovane nukleotide. Stručnjaci su sposobni da identifikuju ovakve pogrešno identifikovane nukleotide i znaju kako da isprave ovakve greške. U slučaju greški kod sekvenci, genomska DNK, iRNK sekvence polinukleotida CFTRa treba da preovlađuju.
[0091]Ovaj pronalazak je dalje opisan sledećim primerima koje ne bi trebalo tumačiti kao ograničenja obima pronalaska. Ukoliko nije drugačije naglašeno, u praksi će da se koriste standardne konvencionalne metode molekularne biologije, mikrobiologije i/ili biohemije. Ovakve tehnike opisane su u Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratorv Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor Laboratorv Press; in Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, NY; in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biologv, Current Protocols, USA; and in Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biologv LabFax, Second Edition, Academic Press (UK); Oligonucleotide Svnthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hvbridization (Hames and Higgins, eds.).
Primer 1
In vivo procena QR- 010
[0092]Fenotip u cističnoj fibrozi (CF) izazvan je odsustvom funkcionalnog CFTR proteina rezultujući u smanjenom proticanju hlorida. CFTR je takođe negativni regulator natrijumovog kanala ENaC. Odsustvo CFTR indukuje ENaC, rezultujući u hiperapsorpciji natrijuma, disbalansu osmotske ravnoteže i pogoršanju CF fenotipa. Reparacija CFTR-a povećava transport hlorida i ima dodatni efekat, kojim je hiperapsorpcija natrijuma umanjena.
[0093]Efikasnost agensa za lečenje CFTR može da se meri određivanjem nazalne razlike potencijala (NRP) kod miševa sa cističnom fibrozom (Leal et al, 2006, Lab animals 40: 43-52). NRP merenje je način za merenje struja preko nazalnog epitela kod životinja i ljudi. Ovde, trag koji se generiše tokom merenja transporta natrijuma određen je računanjem razlike između struje na početku i nakon dodavanja ENaC blokatora. Za CFTR aktivnost se određuje razlika između Cl pufera pre i posle i/ili primena forskolina.
[0094]Smanjenje potencijala ukazuje na efikasni tretman zbog smanjivanja ENaC hiperaktivnosti posmatrane u CF. Natrijum se transportuje pomoću ENaC koji se reguliše pomoću CFTR. Zbog odsustva funkcionalnog CFTR u CF, ENaC nije smanjen što rezultuje u hiperapsorpciji natrijuma, što zauzvrat pogoršava CF fenotip.
[0095]Povećanje potencijala indukcijom forskolina takođe ukazuje na efikasni tretman. Tipično, kod miševa sa CF nema Cl CFTR reakcije i nema odgovora kod CFTR indukovanog forskolinom, ako statistički značajna korekcija forskolin indukovanog CFTR odgovora može da se posmatra nakon tretmana, onda je ovo efikasan tretman.
[0096]Ukratko, osam CF-dF508 miševa tretira se ProCjR's QR-010 molekulom (oligonukleotid sa sekvencom kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1). Miševi su imali višestruku administraciju 40pg QR-010 rastvorenog u 2pl vode. Miševima u pred tretmanu merena je NRP nultog dana, molekul je administriran drugog, četvrtog i sedmog dana, a posle tretmana merena je NRP devetog dana. Kod tri miša naknadno se uzima doza desetog, trinaestog i petnaestog dana, a merenje posle tretmana sedamnaestog dana. NRP merenja vrše se prema Leal et al, 2006, Lab animals 40: 43-52, sa nekim modifikacijama i koristeći voltmetar visoke impedanse (Knick Portamesss 913, Elektronische Mebgerate, Berlin, Germanv). Ukratko, miševi se postavljaju na leđa na grejnu površinu, a šape i rep se sklanjaju sa puta. Intravenozni kateter leptir tipa (0.719mm, Insyte-Wt, Becton Dickinson, UT, USA), napunjen razblaženom elektrodnom kremom (Signa [Parker Labs, Fairfield, NJ, USA] krema/KCI lmol/l 1:1 vol/vol) stavlja se u zadnju nogu koja služi kao elektrodni most između Ag/AgCI elektrode (SLE Instruments, South Crovdon, UK). Dupli kateter (spoljašnji prečnik [OD] r0.3mm) postavlja se u nazalni prolaz, jedan ulaz katetera se koristi za perfuziju izotoničnih rastvora sa puferom, a drugi kraj kao elektroda na kojoj se meri. Njena impedansa je <1.0 E+6Q.Jezik životinje pomera se sa strane i šiljati deo fllter papira postavlja se u usta na oko 1 cm prema grlu kako bi se apsorbovao višak tečnosti iz usne duplje. Višak tečnosti koja curi iz nozdrve apsorbuje se fllter papirom koji se drži na vrhu nosa na takav način da druga nozdrva ostane bez rastvora. Obično 5 minuta posle injektiranja leka, grejna površina se lagano iskosi za oko 30°, pri čemu se glava životinje naginje nadole i nazalna perfuzija počinje pri brzini od 15 ml/min koristeći peristaltičku pumpu (Pl, Amersham Biosciences, Roosendaal, The Netherlands). Pre početka perfuzije, osnovna NRP se meri, dok se ne dobije stabilna vrednost. Rastvori se menjaju samo posle stabilizacije voltaže. Bazni izotonični rastvor sastoji se od (mmol/l): Na<*>140, Cl 120, K<+>5.2, HCOy 25, UP04<J>2.4, H, pOi 0.4, Ca<i+>1.2 i Mg<;+>1.2. Rastvor koji ne sadrži hloride koristi se da detektuje isticanje iz nazalnog epitela i priprema se supstitucijom NaCI i CaCh sa ekvimolamim glukonatom i MgCh sa MgSOi. Osmolaritet je 275mOsm/l i pH je 7.4. Početna NRP vrednost je uglavnom zbog struje natrijuma generisanom pomoću ENaC. Kanal se blokira alimoridom kako bi se potencijal smanjio do nule. Pufer bez hlorida se dodaje za merenje hlorida transportovanih pomoću CFTR-a, a forskolin se koristi za aktivaciju CFTR-a. Na kraju eksperimenta, fiksna doza naloksona (4 mg), kompetitivnog morfinskog antagonista i atipamezola, medetomidin-specifični protivotrov (5 puta jača doza od medetomidina) administrira se i životinja se drži u tamnoj sobi na grejnoj površini do potpunog oporavka, koji se obično javlja nakon 3 do 4 sata. Rezultat NRP merenja prikazan je na slikama 5 i 6. ;[0097]Na slici 5, jasno je označeno da je transport natrijuma kod CF miševa izmenjen pod tretmanom QR-010 (p=0.0002; n=8), pomerajući se prema nivoima divljeg tipa. Ovo je konkretan pokazatelj da se CFTR aktivnost vraća tretmanom sa QR-010. Na grafikonu 6, jasno je prikazano da je odgovor forskolin indukovanog CFTR-a poboljšan nakon 3 doze QR-010 (p=0.019; n=8), sa daljim poboljšanjem nakon 6 doza QR-010 (p=0.11, n=3). Tipično, kod CF miševa nema forskolin indukovanog CFTR odgovora; međutim, posle tretmana posmatra se korekcija forskolin indukovanog CFTR-a. Ovo je konkretna indikacija da se CFTR aktivnost vraća pod tretmanom sa QR-010. ;[0098]Sve zajedno, ovaj eksperiment jasno pokazuje da oligonukleotidi prema pronolasku kao što su QR-010 su efektivni u reparaciji genskih defekata. ;Primer 2 ;Aktivnost u obnavljanju RNK sekvence kodirane za divlji tip CFTR- a oligonukleotida prikazanih u SEO ID br: 51. 56. 61 i ;[0099]Oligonukleotidi prikazani u SEQ ID br: 51, 56, 61 i 66 testirani su za aktivnost u obnavljanju RNK sekvence kodirane za CFTR divljeg tipa u primarnim epitelnim ćelijama pluća dobijenih od pacijenata koji nose ciljane mutacije najmanje na jednom alelu. Ćelije se gaje prema metodama poznatim stručnjacima u praksi u odgovarajućem medijumu. Oligonukleotidi prema pronalasku uvode se transfekcijom u ćelije. Transfekcija se vrši prema metodama poznatim stručnjacima u praksi uz pomoć transfekcionog reagensa lipofektamina, u opsegu koncentracija od 1 do 500 nM. Kompleks oligo-transfekcionog reagensa dodaje se ćelijama u odgovarajućem medijumu I spira se sa ćelija nakon 24 sata inkubacije. ;[0100]Aktivnost obnavljanja RNK sekvence koja kodira CFTR divljeg tipa oligonukleotida određena je nakon gajenja ćelija od 1 do 4 dana posle transfekcije. Ćelije se skupljaju i aktivnost oligonukleotida procenjuje se na molekularnom nivou koristeći RNK reparaciju kao primarno očitavanje. RNK reparacija određena je sekvenciranjem i/ili Q-PCR metodama. RNK se prečišćava iz ćelija koristeći metode poznate stručnjacima u praksi. Zatim, deo CFTR RNK gde je ciljana mutacija prisutna pojačana je pomoću RT-PCR. RT-PCR proizvodi su sekvencirani da pokažu da su mutacije popravljene kao što je to prikazano na slikama 9A - D. ;LEGENDA SLIKA;[0101] Slika 1.Parcijalne sekvence divljeg tipa i AF508 (Mut) CFTR RNK okružuju mesto delecije. Tri uklonjena nukleotida u mutantu prikazani su podebljano u sekvenci divljeg tipa.Slika 2.Šematski prikaz RNK menjanja mutantne AF508 CFTR RNK koristeći oligonukleotid sa SEQ ID NO: 1. Popravljen RNK molekul ima 3 umetnuta nukleotida, koji predstravljaju RNK sekvencu identičnu kao i onu CFTR divljeg tipa.Slika 3.Parcijalna RNK i proteinske sekvence divljeg tipa, mutantni i popravljeni molekuli. Mutantu nedostaje fenilalanin na poziciji 508. Reparacija RNK rezultuje u insertaciji fenilalanina rezultujući u proteinskoj sekvenci divljeg tipa.Slika 4.Aktivnost jednolančanog oligonukleotida u endogenom AF508 mutantnom CFTR ispoljava ćelijske kulture. Porede se jednolančani oligonukleotid i prethodno opisan dupleks oligonukleotida. Aktivnost se meri detekcijom aktivnosti CFTR hloridnog transportera.Slika 5.ENaC aktivnost predstavljena je kao potencijal (mV) za miševe divljeg tipa (VvT), CF miševe (CF) i CF miševe tretirane sa QR-010 (CF-tretirane).<*>P<0.01; ns=nije značajno. Stupci pokazuju standardnu grešku srednje vrednosti (SEM); p-vrednosti dobijaju se nesparenim T-testom.Slika 6.Odgovor forskolin-indukovanog CFTR-a prikazan je kao relativni procenat za miševe divljeg tipa (VvT), netretirane CF miševe (CF), CF miševe tretirane sa 3 doze QR-010 (CF 3D) i CF miševe tretirane sa 6 doza QR-010 (CF 6D), Miševi divljeg tipa prikazani su kao 100%.Slika 7A.Prikazana je reparacija CFTR delta F508 mutacije u ciljanoj RNK pomoću OlOg oligonukleotida (SEQ ID NO: 1); prikazan je deo RNK koji okružuje mesto delecije. Insertovan trinukleozid CUU rezultuje u pojavi fenilalanina (F) na poziciji 508 (UUU) koja je naglašena tako što je podebljana.Slika 7B.Prikazana je insertacija dva nukleozida na poziciji 508 u delta F508 CFTR ciljanoj RNK pomoću nukleotida sa sekvencom SEQ ID NO: 16; prikazan je deo RNK koji okružuje mesto delecije. Prikazana je insertacija dva nukleozida CU na na poziciji 508, izazivajući "frameshift" u kodirajućoj sekvenci.Slika 7C.Prikazana je insertacija jednog nukleozida na poziciji 508 u delta F508 CFTR ciljanoj RNK pomoću oligonukleotida sa sekvencom SEQ ID NO: 17; prikazan je deo RNK koji okružuje mesto delecije; Prikazana je insertacija nukleozida C na poziciji 508, izazivajući "frameshift" u kodirajućoj sekvenci, na kraju stvarajući stop kodon na poziciji 512.Slika 7D.Prikazana je insertacija jednog nukleozida na poziciji 508 u delta F508 CFTR ciljanoj RNK pomoću oligonukleotida sa sekvencom SEQ ID NO: 18; prikazan je deo RNK koji okružuje mesto delecije. Prikazana je insertacija nukleozida C na poziciji 508, izazivajući "frameshift" u kodirajućoj sekvenci, na kraju stvarajući stop kodon na poziciji 512.
Slika 8.Prikazane su različite insertacije na poziciji 508 u divljem tipu (VVT) CFTR ciljane RNK.
Slika 8A.Prikazana je insertacija stop kodona na poziciji 508 (ATCATCTGATTTGGTGTT); SEQ ID NO: 33) u WT CFTR ciljanoj RNK pomoću oligonukleotida sa sekvencom SEQ ID NO: 19; prikazan je deo RNK koji okružuje poziciju 508. Insertacija stop kodona izaziva kraj translacije posle I 507.
Slika 8B.Prikazana je insertacija dva nukleozida na poziciji 508 u VVT CFTR ciljanoj RNK pomoću oligonukleotida sa sekvencom SEQ ID NO; 20; prikazan je deo RNK koji okružuje poziciju 508. Prikazana je insertacija dva nukleozida GA na poziciji 508, izazivajući "frameshift" u kodirajućoj sekvenci.
Slika 8C.Prikazana je insertacija jednog nukleozida na poziciji 508 u VVT CFTR ciljanoj RNK pomoću oligonukleotida sa sekvencom SEQ ID NO: 21; prikazan je deo RNK koji okružuje poziciju 508. Prikazana je insertacija nukleozida A na poziciji 508, izazivajući "frameshift" u kodirajućoj sekvenci, na kraju stvarajući stop kodon na poziciji 513.
Slika 8D.Prikazana je insertacija leudn kodona (ATCATCCTCTTTGGTGTT; SEQ ID NO: 40) na poziciji 508 u WT CFTR ciljanoj RNK pomoću oligonukleotida sa sekvencom SEQ ID NO: 22; prikazan je deo RNK koji okružuje poziciju 508. Prikazani su insertacija leucin kodona i rezultujući polipeptid.
Slika 8E.Prikazana je insertacija stop kodona na pola puta u ekson 10 VVT CFTR ciljanoj RNK pomoću oligonukleotida sa sekvencom SEQ ID NO: 23; prikazan je deo RNK koji okružuje poziciju 508. Insertacija stop kodona izaziva zaustavljanje translacije posle pozicije aminokiseline F 494.
Slika 8F.Prikazano je uvođenje leucin kodona (CUU) u ekson 10 WT CFTR ciljanog RNK pomoću oligonukleotida sa sekvencom SEQ ID NO: 24. Prikazano je uvođenje leucin kodona i rezultujući polipeptid.
Slika 9A.Prikazana je reparacija CFTR R117H mutacije u ciljanoj RNK pomoću CFTR-R117 oligonukleotida (SEQ ID NO: 51); prikazan je deo RNK koji okružuje mesto mutacije. Supstitucijom "A" za "G" transformiše se CAC kodon (His) u CGC kodon (Arg) što je naglašeno podebljanim slovima.
Slika 9B.Prikazana je reparacija CFTR G542X mutacije u ciljanoj RNK pomoću CFTR-G542 oligonukleotida (SEQ ID NO: 56); prikazan je deo RNK koji okružuje mesto mutacije. Supstitucija "U" za "G" transformiše UGA kodon (stop) u GGA kodon (Gly) što je naglašeno podebljanim slovima.Figure 9C.Prikazana je reparacija CFTR W1282X mutacije u ciljanoj RNK pomoću CFTR-VV1282 oligonukleotida (SEQ ID NO: 61); prikazan je deo RNK koji okružuje mesto mutacije. Supstitucija "A" za "G" transformiše UGA kodon (stop) u UGG kodon (Tryp) što je naglašeno podebljanim slovima.Figure 9D.Prikazana je reparacija CFTR N1303K mutacije u ciljanoj RNK pomoću CFTR-N1303 oligonukleotida (SEQ ID NO: 66); prikazan je deo RNK koji okružuje mesto mutacije. Supstitucija "G" za "C" transformiše AAG kodon (Lvs) u AAC kodon (Asn) Što je naglašeno podebljanim slovima.

Claims (17)

1. Jednolančani oligonukleotid gde su svi nukleozidi oligonukleotida 2'-0-alkil riboza ribonukleozidi za upotrebu u tretmanu ljudskog ili životinjskog tela, pri čemu su spomenuti oligonukleotidi sposobni da naprave izmenu sekvence ciljanog RNK molekula prisutnog u živoj ćeliji kod spomenutih tela ljudi ili životinja, obezbeđujući oligonukleotid živoj ćeliji pod uslovima koji dozvoljavaju unos pomenutog oligonukleotida u živu ćeliju, pri čemu rečeni oligonukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje parcijalno komplementarna ciljanom RNK molekulu kao što su hibridizacija oligonukleotida do ciljane RNK ili njegov prekursor, ili šablon, koji zauzimaju mesto u pomenutoj živoj ćeliji, dozvoljavajući biohemijskim mehanizmima prisutnim u živoj ćeliji da kopiraju razliku u sekvenci oligonukleotida relativnog za ciljani RNK molekul na RNK molekul, ili direktno, preko njihovih prekursora ili preko šablona tako da bi se dobila promena pomenutog ciljanog RNK.
2. Oligonukleotid za upotrebu prema zahtevu 1 gde: (a) promena u sekvenci ciljane RNK izaziva aiteraciju ćelijskog fenotipa; (b) promena u sekvenci pomenute ciljane RNK potvrđena je određivanjem sekvence navedene RNK, ili prekursora ili šablona od nje; (c) promena u sekvenci pomenute ciljane RNK potvrđena je određivanjem sekvence proizvoda polipeptida kodiranih pomoću ove RNK; (d) promena u sekvenci pomenute ciljane RNK potvrđena je određivanjem promene fenotipa u spomenutoj živoj ćeliji ili organizmu koji sadrži rečenu ćeliju, idealno gde promena fenotipa dovodi do poboljšanja poremećaja uzročno povezanih sa sekvencom ciljane RNK pre promene npr. gde je poremećaj genetski poremećaj.
3. Oligonukleotid za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čemu je je oligonukleotid dužine od 15 do 100 nukleotida; na primer, dužina oligonukleotida je između 20 i 50, više poželjno između 25 i 45 nukleotida i više poželjno između 27 i 35 nukleotida.
4. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu oligonukleotid sadrži inozin i/ili modifikovane nukleotide, poželjno izabrane iz grupe koju čine 5-metil-dC, 2-amino-dA, C5-pirimidin i/ili modifikovane internukleozidne veze izabrane iz grupe koju čine fosforotioat veze i metilfosfonat veze.
5. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od prethodnoih zahteva, pri čemu su svi nukleozidi oligonukleotida 2 -0-metil riboza nukleozidi.
6. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde promena sekvence ciljanog RNK molekula sadrži insertaciju ili supstituciju jednog ili više nukleozida; na primer, gde ciljana RNK kodira humani CFTR i izmene rezultuju u stvaranju ili obnavljanju tripleta nukleozida kodiranih za fenilalanin na poziciji 508 aminokiseline CFTR proteina, npr. gde promena sadrži insertaciju tripleta nukleozida izabranih iz grupe koju čine 5'-UUU-3' i 5-CUU-3'.
7. Oligonukleotid za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu je oligonukleotid komplementaran sekvenci koja ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identične sekvence sa nukleotidima 16-30 i 34-48 od sekvence SEQ ID NO: 6 i promena sadrži insertaciju tripleta nukleozida izabranog iz grupe koju čine 5'-UUU-3' i S'-CUU-3'.
8. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu oligonukleotid sadrži ili se sastoji od 7-29 nukleotida, poželjno 1-33 nukleotida iz SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3, poželjno iz SEQ ID NO: 1.
9. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se oligonukleotid nalazi u nosaču, poželjno lipozomu, polizomu ili nanočestici i/ili oligonukleotid gradi kompleks sa jedinjenjem otpuštanja, poželjno polietilen-iminom (PEI), polietilenglikolom (PEG), i/ili je vezan za sterol, poželjno holesterol.
10. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu se oligonukleotid dovodi respiratornom traktu ili plućima, poželjno disajnim putevima, u suvoj formulaciji ili u aerosolu, poželjno koristeći inhalator, poželjno je da se obezbedi oligonukleotid zajedno sa posrednikom transfekcije i/ili sa lekom za cističnu fibrozu poznatim stručnjacima u praksi, poželjno DNazom, manitolom (poželjno Bronhitol) i/ili malim molekulom za lečenje CF, poželjno Kalvdeco (ivacaftor; VX-770), VX-309 (Lumacaftor) i/ili VX-661; na primer, kada se oligonukleotidi nalaze u hipertoničnom rastvoru, poželjno između 2% - 9% koncentracije rastvora, poželjnije 3% - 8%, još poželjnije 4% - 8%, još poželjnije 5% - 8%, još poželjnije 6% - 8%, još poželjnije 6% - 7%, a najpoželjnije oko 7% koncentracije rastvora, gde je hipertonični rastvor poželjno fiziološki Ili farmaceutski prihvatljivi rastvor (npr. hipertonični rastvor je obično NaCI rastvor).
11.Oligonukleotid za upotrebu prema zahtevu 10, gde se oligonukleotid nalazi u sluz penetrirajućim česticama, poželjno u sluz penetrirajućim nanočesticama.
12.Oligonukleotid za upotrebu prema zahtevima 10 ili 11, gde je: (i) administracija oligonukleotida kombinovana sa tretmanom antibioticima kako bi smanjila bakterijske infekcije i simptome od takvih kao što su zadebljanje sluzi i/ili formiranje biofilma; i/ili (ii) "Broncheo-Alveolar Lavage" (BAL) primenjena pre administracije oligonukleotida prema pronalasku.
13.Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čenu se oligonukleotid administrira pomoću kapsule sistemom za vremenski kontrolisano otpuštanje kako bi se doveo do crevnih ćelija; i, opciono, administracija oligonukleotida kombinovana je sa administracijom bioloških ili sintetske pankreasne enzimske kompozicije kao što su pankreplipaza ili Creon.
14.Farmaceutska kompozicija koja sadrži oligonukleotid za upotrebu kao što je definisano u bilo kom od u zahteba od 1 do 13, farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili hipertonični fiziološki ili farmaceutski prihvatljiv rastvor, poželjno između 2% - 9% koncentracije rastvora, poželjno 3% - 8% , više poželjno 4% - 8%, više poželjno 5% - 8%, više poželjno 6% - 8%, više poželjno 6% - 7%, a najpoželjnije oko 7% koncentracije rastvora; na primer, hipertonični rastvor je obično NaCI rastvor.
15.Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 14, koja dalje sadrži posrednika transfekcije.
16.Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, koja dalje sadrži lek protiv đstične fibroze, poželjno Dnazu, manitol i/ili mali molekul za tretman CF, poželjno Kalydeco (ivacaftor; VX-770), VX-809 (Lumacaftor) i/ili VX-661.
17. Jednolančanioligoribonukleotid ili farmaceutska kompozicija koja sadrži: (a) jednolančani oligoribonukleotid koji je komplementaran sekvenci koja ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identične sekvence sa 16-30 nukleotidima i 34-48 iz sekvence SEQ ID NO: 6, pri čemu su svi nukleozidi od oligoribonukleotida 2'-0 alkil riboza ribonukleozidi. (b) jednolančani oligoribonukleotid koji sadrži nukleotide 7-29, poželjno nukleotide 1-33 iz SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3, poželjno iz SEQ ID NO: 1, pri čemu su svi nukleozidi od oligoribonukleotida 2'-0 alkil riboza ribonukleozidi.
RS20160489A 2012-07-12 2013-07-12 Oligonukleotidi za pravljenje promena u sekvencama ciljanih rnk molekula prisutnih u živoj ćeliji RS54944B1 (sr)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261670681P 2012-07-12 2012-07-12
US201261718801P 2012-10-26 2012-10-26
EP13166465 2013-05-03
EP13172515 2013-06-18
EP13173818 2013-06-26
PCT/NL2013/050534 WO2014011053A1 (en) 2012-07-12 2013-07-12 Oligonucleotides for making a change in the sequence of a target rna molecule present in a living cell
EP13760133.2A EP2852668B1 (en) 2012-07-12 2013-07-12 Oligonucleotides for making a change in the sequence of a target rna molecule present in a living cell

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS54944B1 true RS54944B1 (sr) 2016-11-30

Family

ID=49916369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160489A RS54944B1 (sr) 2012-07-12 2013-07-12 Oligonukleotidi za pravljenje promena u sekvencama ciljanih rnk molekula prisutnih u živoj ćeliji

Country Status (23)

Country Link
US (2) US9605255B2 (sr)
EP (2) EP2852668B1 (sr)
JP (1) JP6373833B2 (sr)
KR (1) KR20150037968A (sr)
CN (1) CN104640986B (sr)
AU (1) AU2013287353B2 (sr)
BR (1) BR112015000710A8 (sr)
CA (1) CA2878934A1 (sr)
CY (1) CY1117858T1 (sr)
DK (2) DK2852668T3 (sr)
ES (2) ES2698522T3 (sr)
HR (1) HRP20160854T1 (sr)
HU (1) HUE029977T2 (sr)
IL (1) IL236654B (sr)
MX (1) MX356625B (sr)
NZ (1) NZ703824A (sr)
PL (1) PL2852668T3 (sr)
PT (1) PT2852668T (sr)
RS (1) RS54944B1 (sr)
RU (1) RU2663110C2 (sr)
SI (1) SI2852668T1 (sr)
SM (1) SMT201600234B (sr)
WO (1) WO2014011053A1 (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007079139A2 (en) 2005-12-28 2007-07-12 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Solid forms of n-[2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-5-hydroxyphenyl]-1,4-dihydro-4-oxoquinoline-3-carboxamide
US8563573B2 (en) 2007-11-02 2013-10-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Azaindole derivatives as CFTR modulators
US8802868B2 (en) 2010-03-25 2014-08-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Solid forms of (R)-1(2,2-difluorobenzo[D][1,3]dioxo1-5-yl)-N-(1-(2,3-dihydroxypropyl-6-fluoro-2-(1-hydroxy-2-methylpropan2-yl)-1H-Indol-5-yl)-Cyclopropanecarboxamide
ES2608474T3 (es) 2010-04-22 2017-04-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Proceso de producción de compuestos indol cycloalkylcarboxamido
RS54944B1 (sr) 2012-07-12 2016-11-30 Proqr Therapeutics Ii Bv Oligonukleotidi za pravljenje promena u sekvencama ciljanih rnk molekula prisutnih u živoj ćeliji
ES2885181T3 (es) 2014-04-15 2021-12-13 Vertex Pharma Composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades mediadas por el regulador de la conductancia transmembrana de fibrosis quística
KR102589295B1 (ko) 2014-05-14 2023-10-13 타르그이뮨 테라퓨틱스 아게 개선된 폴리에틸렌이민 폴리에틸렌글리콜 벡터
KR20170063954A (ko) 2014-10-07 2017-06-08 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절자의 조정제의 공-결정
GB201418892D0 (en) * 2014-10-23 2014-12-10 Proqr Therapeutics B V DNA editing
US12359197B2 (en) * 2014-12-12 2025-07-15 Etagen Pharma, Inc. Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
EP3234134B1 (en) * 2014-12-17 2020-05-27 ProQR Therapeutics II B.V. Targeted rna editing
US20210401869A1 (en) * 2015-02-20 2021-12-30 Rosalind Franklin University Of Medicine And Science Antisense Compounds Targeting Genes Associated with Cystic Fibrosis
GB201507926D0 (en) * 2015-05-08 2015-06-24 Proqr Therapeutics N V Improved treatments using oligonucleotides
EP3359667A1 (en) 2015-10-05 2018-08-15 ProQR Therapeutics II B.V. Use of single-stranded antisense oligonucleotide in prevention or treatment of genetic diseases involving a trinucleotide repeat expansion
CN108367021A (zh) * 2015-10-15 2018-08-03 希望之城 包含硫代磷酸化寡脱氧核苷酸的化合物和组合物及其使用方法
CA3022319A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-09 Tod M. Woolf Improved methods for genome editing with and without programmable nucleases
WO2017220751A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
CN110352244B (zh) * 2016-09-01 2023-03-21 ProQR治疗上市公司Ⅱ 化学修饰的编辑rna的单链寡核苷酸
EP3571300A1 (en) 2017-01-19 2019-11-27 ProQR Therapeutics II B.V. Oligonucleotide complexes for use in rna editing
CN110612353A (zh) 2017-03-03 2019-12-24 加利福尼亚大学董事会 经由抑制性tRNAs和脱氨酶对突变进行RNA靶向
CN107267516B (zh) * 2017-07-28 2020-09-29 佛山科学技术学院 双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用
WO2019076919A1 (en) * 2017-10-17 2019-04-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) COMBINED TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS
WO2019156726A1 (en) * 2018-02-09 2019-08-15 Ohio State Innovation Foundation Rna nanostructures, methods of making, and uses thereof
JP7478923B2 (ja) 2018-03-27 2024-05-08 ユニバーシティ オブ ロチェスター シュードウリジン化のための核酸分子
GB201808146D0 (en) 2018-05-18 2018-07-11 Proqr Therapeutics Ii Bv Stereospecific Linkages in RNA Editing Oligonucleotides
EP3914260A4 (en) 2019-01-22 2023-05-17 Korro Bio, Inc. RNA-EDITING OLIGONUCLEOTIDES AND THEIR USE
AU2020395113A1 (en) 2019-12-02 2022-06-09 Shape Therapeutics Inc. Therapeutic editing
CN113397996A (zh) * 2021-07-23 2021-09-17 河南省人民医院 一种抗菌漱口水及其制备方法
CN114917227B (zh) * 2022-05-19 2023-10-31 中国人民解放军海军军医大学 依伐卡托在制备抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒感染药中的应用
EP4432289A1 (en) 2023-03-15 2024-09-18 Shape Therapeutics Inc. Generative sequence screening with conditional gans, diffusion models, and denoising diffusion conditional gans

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP930935A2 (en) * 1992-06-11 1994-12-31 Astra Ab New dna sequences
DE69435005T2 (de) 1993-05-11 2008-04-17 The University Of North Carolina At Chapel Hill Antisense Oligonukleotide die anomales Splicing verhindern und deren Verwendung
US6207455B1 (en) 1997-05-01 2001-03-27 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
IL132463A0 (en) 1997-05-13 2001-03-19 Univ North Carolina Lentivirus - based gene transfer vectors
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6218181B1 (en) 1998-03-18 2001-04-17 The Salk Institute For Biological Studies Retroviral packaging cell line
US6683173B2 (en) 1998-04-03 2004-01-27 Epoch Biosciences, Inc. Tm leveling methods
DE19909769A1 (de) 1999-03-05 2000-09-07 Bundesrepublik Deutschland Let Von SIVagm abgeleitete lentivirale Vektoren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Genübertragung in Säugerzellen
WO2005094370A2 (en) * 2004-03-29 2005-10-13 The General Hospital Corporation Oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools
EP2151248A1 (en) 2008-07-30 2010-02-10 Johann Bauer Improved pre-mRNA trans-splicing molecule (RTM) molecules and their uses
JP2013518603A (ja) 2010-02-08 2013-05-23 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 反復伸張に関連する疾患または病態の治療に有用な方法および組成物
DK2561077T3 (en) * 2010-04-23 2016-08-01 Arrowhead Res Corp Organic compositions for the treatment of beta-ENaC-related diseases
KR20200133284A (ko) 2010-05-28 2020-11-26 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
US20150209448A1 (en) 2012-07-12 2015-07-30 Proqr Therapeutics N.V. Exon replacement with stabilized artificial rnas
RS54944B1 (sr) 2012-07-12 2016-11-30 Proqr Therapeutics Ii Bv Oligonukleotidi za pravljenje promena u sekvencama ciljanih rnk molekula prisutnih u živoj ćeliji

Also Published As

Publication number Publication date
US9605255B2 (en) 2017-03-28
SI2852668T1 (sl) 2016-09-30
EP3103872A1 (en) 2016-12-14
DK3103872T3 (en) 2018-10-22
MX356625B (es) 2018-06-06
AU2013287353A1 (en) 2015-02-26
DK2852668T3 (en) 2016-05-30
US20170152518A1 (en) 2017-06-01
ES2698522T3 (es) 2019-02-05
EP2852668A1 (en) 2015-04-01
HK1208491A1 (zh) 2016-03-04
SMT201600234B (it) 2016-08-31
US20150197744A1 (en) 2015-07-16
CN104640986A (zh) 2015-05-20
PT2852668T (pt) 2016-07-13
IL236654B (en) 2018-02-28
ES2584856T3 (es) 2016-09-29
MX2015000506A (es) 2015-06-03
US9994856B2 (en) 2018-06-12
HUE029977T2 (en) 2017-04-28
WO2014011053A1 (en) 2014-01-16
JP2015523082A (ja) 2015-08-13
KR20150037968A (ko) 2015-04-08
PL2852668T3 (pl) 2016-11-30
RU2663110C2 (ru) 2018-08-01
EP2852668B1 (en) 2016-04-27
BR112015000710A8 (pt) 2018-04-03
HRP20160854T1 (hr) 2016-09-23
IL236654A0 (en) 2015-02-26
AU2013287353B2 (en) 2018-11-08
NZ703824A (en) 2018-06-29
CY1117858T1 (el) 2017-05-17
EP3103872B1 (en) 2018-08-29
JP6373833B2 (ja) 2018-08-15
CN104640986B (zh) 2018-08-28
BR112015000710A2 (sr) 2017-08-15
CA2878934A1 (en) 2014-01-16
RU2015104763A (ru) 2016-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2852668B1 (en) Oligonucleotides for making a change in the sequence of a target rna molecule present in a living cell
AU2022206704B2 (en) Nanoparticle formulations for delivery of nucleic acid complexes
ES2397113T3 (es) Composiciones y procedimientos para modular el corte y empalme de SMN2
JP2023524071A (ja) 嚢胞性線維症を治療するための核酸及び方法
CN105658797A (zh) 用于调节rna的组合物和方法
US20250228883A1 (en) Process to Inhibit or Eliminate Eosinophilic Diseases of the Airway and Related Conditions
US20240415857A1 (en) Antisense-induced exon exclusion in type vii collagen
EP4243776A1 (en) Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
HK1208491B (en) Oligonucleotides for making a change in the sequence of a target rna molecule present in a living cell
WO2025111297A1 (en) Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
WO2025212607A1 (en) Lipid nanoparticles for aerosol delivery of base editors
WO2024175707A1 (en) A synthetic oligonucleotide for treating nidovirales infections
WO2025240355A1 (en) Lipid nanoparticles for extrahepatic delivery
CA3003267C (en) Nanoparticle formulations for delivery of nucleic acid complexes
HK40119835A (zh) 用於靶向pcsk9的组合物和方法
WO2021114227A1 (zh) 一种含胺转染试剂和制备方法及转染复合物