RS54992B1 - Oligopeptidna jedinjenja i njihove upotrebe - Google Patents

Description

[0001]Ovaj pronalazak odnosi se na nove agense, farmaceutske kompozicije koje ih sadrže, i njihovu upotrebu u terapiji, naročito anti-mikrobijalnoj i anti-kancer terapiji. Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na nova jedinjenja na bazi peptida koja su iznenađujuće pokazala da imaju inhibitorne efekte na rast i/ili vijabilnost ćelija, naročito bakterijske i kancerogene ćelije. Novi peptidi prema ovom pronalasku pokazali su da imaju citotoksične efekte na bakterijske i kancerogene ćelije i da inhibiraju rast tumora. Takvi peptidi, ili njihovi mimetici, mogu se koristiti u terapiji kancera ili kao anti-mikrobijalni agensi, određenije kao anti-tumor ili anti-bakterijski agensi. Takođe su obezbeđeni terapeutski i ne-terapeutski postupci koji obuhvataju upotrebu peptida iz prema ovom pronalasku.

[0002]Kancer je stanje u kojem ćelije pokazuju nekontrolisani rast i upad u i destrukciju susednih tkiva. U nekim slučajevima kancerogene ćelije metastaziraju i putuju na druge lokacije, formirajući sekundarna mesta kancera. Kancer pogađa ljude svih uzrasta, pri čemu se rizik od svih vrsta povećava sa godinama. Kancer je izazvao oko 13% svih smrti kod ljudi 2007 (7.6 million). Zaista, godišnje 600,000 ljudi umre od kancera samo u US.

[0003]Kanceri su izazvani abnormalnostima u genetskom materijalu ćelija. Ove abnormalnosti mogu se dogoditi usled efekata kanecrogeničnosti, kao što je duvanski dim, radijacija, hernije, ili infektivni agensi. Ostale genetske abnormalnosti koje promovišu kancer mogu se nasumično dogoditi putem grešaka u DNK replikaciji, ili su nasledne, i samim tim prisutne u svim ćelijama od rođenja. Heratibilnost kancera obično je pod uticajem kompleksnih interakcija između kancerogena i genoma domaćina.

[0004]Poznato je da ljudski imuni sistem može prepoznati i uništiti kancerogene ćelije, uglavnom preko receptor-posredovanih mehanizama (1-3). Međutim, i pored imunološkog nadzora, kancerogene ćelije da zaobiđu imunološku kontrolu domaćina, pa je obično potrebna hirurška intervencija ili tretiranje kancera.

[0005]Na osnovu istraživanja i napredovanja u medicini, većina kancera može se tretirati u nekom obliku, a manji broj kancera može se izlečiti u zavisnosti od specifične vrste, mesta, i stadijuma. Kada se dijagnostikuje, kancer se obično tretira kombinacijom operacije, hemoterapije i radioterapije. Međutim, veliki broj kancera trenutno se me može izlečiti traidicionalnim postupcima, i zbog toga su potrebni alternativni tretmani za kancera za pacijente kojima je to potrebno. Imunološka kontrola domaćina često je posredovana odbranom-izvedenim citolitičkim polipeptidima domaćina a oni, između ostalog, doveli su do predloga da se u tretiranju kancera koriste anti-kancer peptidi. Takvi peptidi inicijalno su otkriveni usled njihove uloge klirensu bakterija (4-7). Međutim, izgleda da tumori prevazilaze ove mehanizme kontrole domaćina putem, još uvek nepoznatih, ne-receptor posredovanih mehanizama (8-13). US7307143 opisuje provođenje proteina i povezanog agensa za dijagnostikovanje i tretiranje tumornih bolesti. Određenije, US7307143 opisuje upotrebu RGS domena sprovođenja/Axin2 za borbu protiv tumornih bolesti.

[0006]Poznato je da peptidi koji pokazuju inhibitorni efekat protiv kancerogenih ćelija ("inhibitorni peptidi") snažno se vezuju za negativno naelektrisane membrane (4, 5,14-18) i može nastati lizija membrane (19, 20). Obično mnogi anti-kancer peptidi su katjonski. Plazma membrana kancerogenih ćelija sadrži male količine negativno naelektrisanog fosfatidilserina (3-9%; ref. 21, 22), zbog čega su kancerogene ćelije malo više negativnije od većine ne-malignih eukariotskih ćelija. Još uvek nije jasno da li ova mala razlika u kompoziciji membrane obezbeđuje objašnjenje za sposobnost nekih katjonskih peptida koji su preferencijalni da ubiju kancerogene ćelije (23-25).

[0007]Fosfatidilserin izložen na površini takođe služi kao marker za klirens kancerogenih iz krvotoka od strane urođenih imunoloških efektora kao što su monociti, iako putem potpuno drugih (receptor-posredovanih) mehanizama (26). U stanju tehnike je predloženo daje stvarno uništavanje ćelija tumora katjonskim peptidima rezultat jednog od dva proseca: (i) indukcija nekroze koja rezultira iz prekida citoplazmične membrane (20, 25) ili (ii) indukcija apoptoze koja je trigerovana vezivanjem peptida za mitohondrijalnu membranu (9, 27). Smatra se da mnogi anti-kancer peptidi opisani u stanju tehnike pokazuju svoje efekte putem mehanizma koji uključujuje liziju ćelija.

[0008]Uprkos potentnoj anti-kancer aktivnosti takvih određenih peptidain vitro,ispitivanjain vivosu ograničena. Trenutno, samo nekoliko ispitivanja je sprovedenoin vivosa peptidima koji su sposobni da prekinu ćeljske membrane kancera i i nakon toa izazovu smrt ćelija kancera. Ova ispitivanja uključuju (i) sistemsko tretiranje čvrtsih tumora litičnim peptidima, ali samo kada su konjugovani sa navodećim (ciljanim) domenima ili kada se koriste kao propeptidi (12, 27) budući da se litički entitet inaktivira u serumu i da mu nedostaje specifičnost tumora; (ii) tertiranje kancera jajnika sa magaininom i njegovim enantiomerom D-amino kiseline , ali samo kada se injektijuje i.p. u visokim dozama (28); i (iii) intratumorno davanje 69-amino-kiselinskog pora-formirajućeg peptida protiv ksenografta humanog kancera grudi (11).

[0009]Svi ovi tretmani utiču samo malo, ako uopšte utiču, na rasprostranjenje metastaze (27) bilo zbog njihove ograničene suštinski lokalizovane aktivnosti ili zbog njihove nesposobnosti da dostignu prilično velike metastaze kod netaknutih životinja. Do danas, selektivnost citotoksičnih peptida za kancerogene ćelije, i njihova toksičnost prema ostalim zdravim organima, još uvek nije ima obimno ispitana. Međutim, u slučaju jednog peptida, određenije D-K6L9, a kratak 15-mer D,L-amino kiselinski peptid, pokazano je da intra-tumoralna injekcija inhibira rast primarnih humanih kancera prostate bez uticanja na ne-maligne susedne ćelije (13). Pokazano je na miševima da peptid D-K6L9 specifično cilja i inhibira rast primarnih i metastatičnih tumora kada se daje sistemski. Čini se da ovaj peptid deluje na fosfatidilserin u plazma membrani depolarzujući litičke mehanizme.

[0010]Prema tome, dok su neki progresi učinjeni u polju anti-kancer peptida, još uvek postoji potreba za novim peptidima koji su efektivni u uništavanju ili inhibiranju rasta kancerogenih ćelija, a koji ne pokazuju citotoksičnost za ne-kancerogene ćelije.

[0011]Kao što je prethodno pomenuto, rad na razvoju anti-kancer peptida principijelno se fokusirao na citolitičkim anti-mikrobijalnim peptidima i određen roj takvih peptida pokzao je da delujein vitroprotiv različitih tipova kancerogenih ćelija. Takvi peptidi imaju određenu ulogu u urođenom imunitetu organizama koji uključuju insekte, amfibije i sisare. Primeri uključuju humane defensine, cekropine, cekropin-magainin hibride, magainine, i takve peptide konjugovane za ciljane domene i propeptide. Kako je prethodno diskutovano, ovi peptidi preferencijaln ose vezuju i prekidaju negativno naelektrisane fosfolipidne membrane, glavnu komponentu bakterijske citoplazmične membrane.

[0012]Mikroorganizmi kao što su bakterije razlog su mnogih infektivnih bolesti, i odgovorne su za veliki broj smrti svake godine. Na primer, patogen bakterije izazivaju bolesti kao što je tuberkuloza. Kako su mikroorganizmi odovorni za mnoge infektivne bolesti, i otpornost na patogen mikroorganizme je ozbiljan problem sa kojim se susreće moderna medicina, stoga su novi alternativni tretrmani protiv mikroorganizama veoma poželjni.

[0013]Ovaj pronalazak usmeren je na ove potrebe, i obezbeđuje nova jedinjenja bazirana na peptidima koja su začuđujući efektivni novi anti-kancer i anti-mikrobijalni agensi.

[0014]Prma tome, novi peptid je napravljen, a peptidi bazirani na njemu začuđujuće su se pokazali kao efektivni i protiv kancerogenih i bakterijskih ćelijain vitroi da inhibiraju rast tumorain vivo.Kako je opisano u primerima ispod, peptidi bazirani na sekvencama ovog novog peptida pokatali su citotoksičnu aktivnost protiv razlilitih ćelijskih linija kancera, dok pokazuju veoma malu aktivnost protiv normalnih ćelija i nisku toksičnost. Citotoksični efekat takođe pokazan protiv raznih bakterijskih vrsta, uključujući obe i Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije. Dalje, u životinjskim modelima kancera, primećen je jak anti-tumor efekat, sa značajnim i obeleženim inhibitornim efektom na rast tumora. Tretirane životinje imale su značajnu prednost preživljavanja u poređenju sa netretiranom grupom, i zaista, ispitivanja su sugerisala da životinje mogu biti izlečene od tumora. Prema tome, pokazan je dramatični anti-kancer, ili anti-tumor, efekat. (U ovom smislu, "anti-kancer" se odnosi na negativan efekat na kancerogene ćelije, određenije na rast i/ili vijabilnost kancerogenih ćelija, i određenije citotoksičan efekat na kancerogene ćelije).

[0015]Pronalazači su inicijalno tražili da stvore peptide koji imaju "tumor supresorski" efekat, bazirane na sekvencama amino kiselina poznatih tumor supresorskih proteina. Prema tome, nadali su se da će stvoriti peptide koji bi se vezivali za receptore tumor supresorskih proteina i na taj način blokirali rast tumora. Panel od 96 peptida pripremljen je posmatran na anti-kancer i anti-mikrobijalnu aktivnost. Peptid koji podvlači ovaj pronalazak indetifikovan je u ovom posmatranju, jedan od jedina tri peptida koji su pokazivali značajne nivoe aktivnosti. Peptid prema ovom pronalasku pokazao je neočekivano visoku citotoksičnu aktivnost i za kancerogene ćelije i mikrobne ćelije, kakoin vitrotako iin vivou slučaju kancerogenih ćelija. Začuđujuće, imajući u vidu obrazloženje dizajna peptidne biblioteke, pronađeno je da peptid ima litičku aktivnost, da prekida plazma membranu kancerogenih ćelija i liziju bakterije. Dalje, apoptičan efekat je takođe začuđujuće primećen, sugerišući da ovi peptidi mogu da trigeruju ili indukuju apoptozu. Kao šti je prethodno pomenuto, dalja ispitivanja pokazju da ovaj anti-kancer efekat može biti selektivan za kancerogene ćelije, ostavljajući ne-kancerogene ćelije netaknute, što predstavlja značajnu prednost u tretiranju kancera, gde su negativni sporedni efekti tretiranja, na primer hemoterapijskog tretiranja, često značajni. Jedinjenja na bazi peptida prema ovom pronalasku takođe su pokazala da iskorenjuju nekoliko bakterijskih sojeva, i da mogu da obezbede efektivno oruđe protiv multi-rezistentnih bakterija.

[0016]Na osnovu ovih začuđujućih i neočekivanih rezultata, pronalazači su predložili da se peptidi i jedinjenja na bazi peptida bazirani na ovoj novoj peptidnoj sekvenci, odreženije sekvenca SEQ ID NO. 1:

KTLRVAKAIYKRYIE (SEQ ID NO:l)

Mogu koristiti terapeutski u tretiranju kancera i mikrobne infekcije, i uopštenije kao anti-mikrobijalni agensi, što takođe obuhvata ne-terapeutske upotrebe, na primer u borbi protiv mikrobne kontaminacije ili kolonizacije, npr. kao dezinfektanti itd.

[0017]Shodno tome, u jednom aspektu ovaj pronalazak obezbeđuje oligopeptidno jedinjenje koje obuhvata: i) sekvencu amino kiseline YGRKKRRQRRRGKTLRVAKAIYKRYIE (SEQ ID NO: 40; ili ii) sekvencu amino kiseline koja ima najmanje 85% sekvencijalnog identiteta sa sekvencom SEQ ID

NO: 40;

u kojem jedinjenje iz (i) ili (ii) ima aktivnost u inhibiranju rasta i/ili vijabilnosti mikrobnih i kancerogenih ćelija.

Alternativno, jedinjenje može imati anti-tumor i anti-mikrobijalnu aktivnost, u slučaju poslednjeg, poželjno anti-bakterijsku aktivnost.

[0018]Oligopeptidno jedinjenje of SEQ ID NO:40 odgovara to HIV-TAT sekvenca of SEQ ID NO:36 (see further ispod) joined to N-terminalni kraj of SEQ ID NO:l. HIV-TAT sekvenca ima "cell-penetrating" aktivnost (as defined further ispod). A peptid konstruisanih na ova basis is investigated in Primeri ispod i ima been shown to be naročito efficacious.

[0019]Prema tome, oligopeptidna jedinjenja prema ovom pronalasku imaju inhibitorni efekat na rast i/ili vijabilnost kancera i mikrobne ćelije, naročito bakterije. Prema tome, jedinjenja imaju citostatičnu ili citotoksičnu aktivnost, poželjno citotoksičnu aktivnost, protiv kancerogenih i mikrobnih ćelije, npr. protiv tumora. U jednom aspektu jedinjenja su bakteriostatična ili bakteriocidalna, poželjno bakteriocidalna.

[0020]"Inhibiranje rasta" ćelije znači da bilo koji aspekt rasta ćelije, bilo da je u pitanju povećanje u veličini ćelije ili u količini i/ili zapremini njenog konstituenta, ali određenije povećanje u broju ćelija, je redukovan, određenije merljivo redukovan. Izraz "rast" na ovaj način eksplicitno uključuje replikaciju ili reprodukciju ćelije. Brzina rasta ćelije, npr. u smislu brzine povećanja broja ćelija može se smanjiti. Kao reprezentativni primer, rast (npr. broja ćelija, ili brzina rasta) može se smanjiti za najmanje 50, 60, 70, 80, 90 ili 95 %. U određenim slučajevima, rast se može smanjiti za 100% tj. rast prestaje ili se kompletno inhibira. Na taj način, replikacija, ili reprodukcija ćelije može se smanjiti ili inhibirati. Prema tome, izraz "inhibitirati" uključuje bilo koj ifazaen redukovanja rasta (u poređenju na primer sa rastom koji se može posmatrati u odsustvu oligopeptidnog jedinjenja). Brzina replikacije ili reprodukcije može se odrediti ili prikazati u smislu vremena generisanja, naročito u sličaju mikrobnih ćelija (tj. vremena koje je potrebno da mikroorganizam generiše svoju kopiju). U smislu kancerogenih ćelija, rast se može proceniti određivanjem broja ćelija ili procenjivanjem veličine tumora ili njegove brzine rasta.

[0021]"Inhibiranje vijabilnosti" ćelije uključuje bilo koji efekat koji smanjuje vijabilnost ćelije, ili koji je čini manje mogućom za preživljavanje, ili ne-vijabilnu. Vijabilnost ćelije može se videti kao sposobnost ćelije da preživi pod datim uslovima. Određenije ona uključuje ubijanje ili uništavanje ćelije tj. izazivanje njene smrti. Smrt se može odrediti nemogućnosti da raste, uključujući i to da se replicira, ili koristi ili asimilira nutrijente, ili morfološkim promenama na ćeliji, ili tkivu u kojem je sadržana ćelija npr. tumoru, gde može na primer biti promećena nekroza. Tipično, ćelija se može smatrati mrtva ako je izgubila integritet ćelijske membrane.

[0022]Izrazi "citostatičan" i "citotoksičan" mogu se tumačiti analogno.

[0023]Postupci za određivanje vijabilnosti ili rasta kancerogenih ili mikrobnih ćelija dobro su poznati u ovoj oblasti. Mnogi rutinski ogledi dostupni su za određivanje da li je ćelija živa (vijabilna) ili mrtva. Jedna opcija je da se ćelija smesti u uslove koji bi normalno podržali rast te ćelije i praćenje rasta ćelije odgovarajućim standardnim sredstvima, npr. praćenjem veličine ćelije, morfologije ćelije, broja ćelija kroz reme, konzumiranje nutrijenata u medijumu kulture, itd. Još jedna opcija je da se odredi ćelija za karakteristike morfologije ćelijske smrti, npr. nekrotična ili apoptotna tela, plikovi membrane, nuklearna kondenzacija ili cepanje DNK na fragmente regularne veličine, napukli ćelijski zidovi ili membane i curenje ćelijskog sadržaja u spoljašnju okolinu.

[0024]Ostali postupci koriste karakteristični gubitak integriteta ćelijske membrane kod mrtve ćelije. Boje za nepropustivost membrane (npr. tripan blue i propidijum jodid) rutinski se koriste za određivanje integriteta membrane. Ove boje su isključene iz netaknutih ćelija te ne dolazi do bojenja ovakvih ćelija. Ukoliko je integritet membrane kompromitovan, ove boje mogu prići ćeliji i obojiti njihove intrracelularne komponente. Alternativno, ili dodatno, boje koje boje samo ćelije sa netaknutim membranama mogu se koristiti kako bi se dobila indikacija vijabilnosti ćelije. Ogled života/ smrti od Invitrogen Ltd je ogled koji koristi ove dve boje, jedna da oboji mrtve ćelije, a druga da oboji žive ćelije. Još jeedan pristup da se odredi integritet membrane je da se detektuje oslobađanje ćelijskih komponenti u medijum kultrure, npr. laktatna dehidrogenaza.

[0025]Još dalja opcija je da se meri metabolizam ćelije. Ovo se može izvesti rutinski na mnogo načina. Na primer, mogu se izmeriti nivoi ATP. Samo žive ćelije sa netaknutim membranama mogu da sisntetišu ATP, a kako ATP nije uskladišten u ćeliji, nivoi ATP rapidno opadaju nakon smrti ćelije. Praćenje nivoa ATP stoga pruža indikaciju statusa ćelije. Još dalja opcija je da se meri redukcioni potencijal ćelije. Vijabilne ćelije metaolišu nutriente promenom redukujućih reakcija i shodno tome primenjujući maker koji daje različite outpute bilo u redukovanom ili oksidovanom obliku (npr. fluorescentna boja) u ćeliji, pri čemu se redukujući potencijal u ćeliji može odrediti. Ćelije kojima nedostaje sposobnost da redukuju marker mogu se smatrati mrtvim. MTT i MTS ogledi su zgodni primeri ove vrste ogleda.

[0026]"Anti-tumor" efekat ili aktivnost mogu se videti kao efekat na rast i/ili vijabilnost tumora. Izraz uključuje bilo koji negativan efekat ili aktivnost na tumoru. Ćelije tumora mu se ubiti ili uništiti. Rast tumora može se inhibirati, na primer tumor može prestati da raste ili se brzina rasta tumora može smanjiti (na primer u poređenju sa tumorom pre tretmana sa jedinjenjem, ili sa ekvivalentnim ili odgovarajućim netretiranim tumorom). Veličina tumora može se smanjiti, ili u poćeljnijim situacijama tumor može nestati (tj. može biti istopljen ili uništen). Anti-tumor efekat može u određenim slučajevima da uključi efekat u redukovanju širenja kancerogenih ćelija iz tumora, npr. metastatičan potencijal tumora može se smanjiti. Ostale patogen osobine ili ponašanje tumora takođe se mogu redukovati, na primer njegova sposobnost da napadne ili da se infiltrira u susedna tkiva.

[0027]Pozivajući se na definicije koje su prethodno date, "anti-mikrobna" aktivnost ima značenje bilo kojeg efekta u ubijanju ili uništavanju, ili inhibiranju rasta mikroorganizma, i analognio anti-bakterijska aktivnost je bilo koji efekat u ubijanju ili uništavanju, ili inhibiranje rasta bakterija.

[0028]Poželjno, oligopeptidna jedinjenja prema ovom pronalasku deluju direktno na ćelije tj. oni mogu direktno da inhibiraju rast i/ili vijabilnost ćelija. Pod "direktno" podrazumeva se da jedinjenja ne upoščjavaju fiziološke sisteme ili mehanizme (npr. imuni sistem) da ispolje svoje efekte (npr. njihove citotoksične ili citostatične efekte). Pre svega, jedinjenja deluju direktno na ćeliju.

[0029]Kako bi se pomoglo da oligopeptidno jedinjenje ispolji svoje efekte, ili kako bi se olakšali, ili u određenim slučajevima kako bi se onemogućili ovi efekti, jedinjenje se mogu obezbediti sredstvima da olakšaju, poboljšaju ili omoguće svoju dostavu u ćelije (intracelularna dostava).

[0030]Shodno tome, oligopeptidno jedinjenje može dalje da obuhvata sekvencu koja penetrira u ćeliju (peptid koji penetrira u ćeliju). U skladu sa ovim pronalaskom, oligopeptidno jedinjenje obuhvata sekvencu koja penetrira u ćeliju koja je bazirana na HIV-TAT sekvenci, naročito amino kiseline 47-58.

[0031]Prema tome, može se videti da oligopeptidna jedinjenja mogu biti u obliku konstrukta koji sadrži (tj. koji obuhvata) oligopeptidno jedinjenje zajedno sa sekvencom ili peptidom koji penetrira u ćeliju. Kako se koristi u kontekstu "peptid koji penetrira u ćeliju", izraz "peptid" nije ograničen isključivo na peptid koji ima peptidne veze, već uključuje i ostala jedinjenja nalik peptidu ili jedinjenja na bazi peptida npr. peptidomimetične strukture, kako će biti opisano u nastavku. Drugim rečima, "peptid koji penetrira u ćeliju" može uključiti bilo koje oligopeptidno jedinjenje koje ima aktivnost koja penetrira u ćeliju.

[0032]Prema tome, peptid koji penetrira u ćeliju može biti sekvenca koja deluje na transport oligopeptidnog jedinjenja u ćeliju, ili preko ćelijske membrane (tj. u unutrašnjost ćelije). Prema tome, on može biti takozvana sekvenca "koja penetrira u ćeliju" (ili određenije "peptid koji penetrira u ćeliju") takođe poznata u stanju tehnike kao proteiniski transdukcioni domen (PTD) ili proteinika transdukciona sekvenca.

[0033]Tehnologija peptida koji penetrira u ćeliju (CPP) dostaje razvijena tokom poslednjih godina i širok spektar peptida koji penetrira u ćeliju su poznati i opisani u stanju tehnike, a širok spektar ovih peptida komnercijalno je dostupan. Peptid koji penetrira u ćelije može značajno da varira u veličini, sekvenci i naelektrisanju, i zaista u njihovom mehanizmu funkcionisanja (koji je trenutno poznat za neke peptide i nije potpuno objašnjen za ostale), ali koji dele istu sposobnost da se translociraju kroz plazma membranu i dostave prikačenu ili pridruženu grupu (takozvanu "kargo") u citoplazmi, ili čak i u nekim slučajevima u nukleusu, ćelije. CPP su stoga vektori za isporuku na bazi peptida.

[0034]CPP mogu biti izvedeni iz prirodnih proteina koji mogu da translociraju preko ćeljske membrane kao što jeDrosophilahomeobox protein Antennapedia (transkripcioni faktor), virusni proteini kao što su HIV-1 transkripcioni faktor TAT i kapsid protein VP22 iz HSV-1, ili mogu biti sintetički-izvedeni, npr. iz himernih proteina ili sintetičkih polipeptida kao što je poliarginin. Kako je prethodno promećeno, ne postoji pojedinačan mehanizam odgovoran za transdukcioni efekat i i stoga dizajniranje CPP može biti bazirano na različitim strukturama i sekvencama. Peptid koji penetrira u ćelije razmatran je u Jarver et al. 2006 Biochimica et Biophvsica Acta 1758, strane 260-263, a Tabela 1 ispod navodi razne reprezentativne peptide. US 6,645,501 dalje opisuje razne peptide koji penetriraju u ćelije koji se mogu koristiti.

[0035]Sekvence bazirane na HIV-TAT sekvenci i HIV-TAT i njihovi fragmenti predstavljaju klasu CPP. Razni CPP na bazi TAT opisani su u US 5,656,122. Primerni HIV-TAT peptid kako se koristi u Primerima ispod je YGRKKRRQRRRG (SEQ ID. No. 36). Sekvenca amino kiseline HIV-TAT može biti modifikovana i/ili skraćena, ili peptid može biti hemijski-modifikovan ili retro-, inverzo- ili retro-inverzo analozi mogu se napraviti zadržavajući aktivnost prodiranja u ćelije.

[0036]Još jedna grupa peptida koji penetrira u ćelije su Antennapedia-izvedeni CPP (Antp klasa) na bazi oko 16 amino kiselinske penetratin sekvence kako je prikazano u Tabeli 1, koja odgovara trećem krugu antennapedia proteina i pokazan je da je odgovoran za translokaciju proteina. Penetratin je obimno razvijen kao vozilo za dostavu, uključujući naročito za farmaceutsku upotrebu, a širok spektar derivata penetratina i modifikovanih sekvenci predloženi su i opisani. Određenije, mogu se pogledati WO 91/1891, WO 00/1417, WO 00/29427, WO 2004/069279 i US 6,080,724. Prema tome, 16 amino kiselinska sekvenca penetratina može biti modifikovana i/ili skraćena, ili peptid može biti hemijski-modifikovan ili se mogu izraditi retro-, inverzo- ili retro-inverzo analozi zadržavajući aktivnost prodiranja u ćelije.

[0037]Kako je prethodno navedeno, ni jedna određena strukturalna osobina ili motivi sekvence nisu zajednički svim CPP. Međutim, razne klase CPP mogu biti inditifikovane određenim karakteristikama, kao što su na primer peptidi koji su amfipatični i net pozitivno naelektrisan. Druge grupe CPP mogu imati strukture koje pokazuju visok a-helikalni sadržaj. Još jedna grupa mogu biti peptidi okarakterisani visokim sadržajem osnovnih amino kiselina. CPPprema tome mogu biti ili mogu obuhvatati oligomere osnovnih amino kiselina kao što je arginin npr. 5 do 20, 6 do 15 ili 6 do 12 R ostaci npr. R7(SEQ ID NO: 35), R8(SEQ ID NO: 37) ili Ru (SEQ ID NO: 38) ili QSR8(SEQ ID NO: 39).

[0038]Prolinom-bogati amfipatični peptidi su još jedna klasa CPP i takvi peptidi okarakterisani prisustvom pirolidin prstenja iz prolina opisani su u Pujals et al. 2008 Advanced Drug Deliverv Reviews 60, pages 473-484.

[0039]Drugi uspeđni razvijeni CPP uključuju pVEC (Elmquist et al. 2003 Biol. Chem 384, pages 387-393; Holm et al. 2005 Febs Lett. 579, pages 5217-5222) i calcitonin-izvedeni peptidi (Krauss et al. 2004 Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, pages 51-54).

[0040]Komercijalno dostupni CPP uključuju kariot, baziran na Pep-1 peptidu (Active Motif, France), Sin-vektori bazirani na protegrin peptidu PG-1 (Svntem, France), i Express-si Dostavu baziranu na MPG peptidu iz Genospectra, USA.

[0041]Dodatno javno dostupnim i prijavljenim CPP, novi ili derivativni CPP peptidi mogu se konstruisati i sintetizovati bazirani na poznatim ili prijavljenim kriterijumima (npr. poznate CPP sekvence ili osobine kao stoje osnovni amino kiselinski sadržaj, a-helični sadržaj itd. kako je prethodno diskutovano). Dodatno, nasumično konstruisani ili drugi peptidi mogu se ispitati na CPP aktivnost, na primer združivanjem ili pričvršćivanjem takvog peptida koji sadrži prijavljeni molekul npr. detektabilno obeležje ili oznaku kao što je fluorescentna oznaka na željenom teretu i testiranjem kako bi se videlo da li je konstrukt translociran preko ćelijske membrane, na primer dodavanjem ovih peptida živim ćelijama nakon čega sledi ispitivanje celularnog importa npr. primenom konfokalnom mikroskopijom.

[0042]Zaista, dok je generalno slučaj da će CPP penetrirati ili ući virtuelno u bilo koji tip ćelije, u nekim slučajevima može se primetiti da uspešna ili efikasna dostava može biti zavisna, ili može varirati u zavisnosti, od precizne prirode tereta (npr. teretna peptidna sekvenca) i/ili CPP koji se koriste. Bilo bi dorbo da u okviru veštine stručnjaka u ovoj oblasti da se odrede optimalne peptidne sekvence i kombinacije itd., i da se testira i/ili modifikuje teret i/ili CPP sekvenca ili struktura itd.

[0043]Reprezentativno oligopeptidno jedinjenje (ili konstrukt) prema tome može da obuhvata:

(a) prvu oligopeptidnu sekvencu koja obuhvata:

(i) celu ili deo sekvence amino kiseline SEQ ID NO. 1; ili

(ii) sekvencu amino kiseline koja ima najmanje 85% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:l; ili (iii) sekvencu amino kiseline koja je cela ili deo obrnute sekvenca SEQ ID NO. 1 (određenije celu ili deo SEQ ID NO. 2: EIYRKYIAKAVRLTK) ili koja je obrnuta sekvenca rug amino kiseline koja ima najmanje 85% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:l; i

(b) drugu oligopeptidnu sekvencu koja je peptid koji penetrira u ćeliju sekvenca.

[0044]Komponenta (b) može biti odabrana iz bilo kojeg od CPP gore navedenih, i određenije bilo koju od HIV-TAT-baziranih ili izvedenih sekvenci.

[0045]CPP (tj. komponenta (b) u gornjoj definiciji) može biti prikačen ili obezbeđen bilo na N- ili C-terminalnom kraju oligopeptidnog jedinjenja, npr. na N-terminalnom kraju. Prema tome, komponente (a) i (b) mogu biti prikačeni ili povezani u bilo kom redosledu, ali poželjno u redosledu (a)-(b).

[0046]Komponente ili elementi oligopeptidnog jedinjenja (ili konstrukta) mogu biti prikačene ili povezane jedan za drugi na bilo koji pođeljan ili pogodan način u skladu sa tehnikama koje su dobro poznate u stanju tehnike. Prema tome, komponente ili odvojeni delovi mogu biti povezani ili konjugovani hemijski npr. primenom poznatih tehnologija hemijskog združivanja ili konstrukti mogu biti formirani kao pojedinačna celina primenom tehnika genetskog inženjeringa npr. tehnike za formiranje fuzionih proteina, ili se mogu jednostavno sintetizovati kao celina npr. primenom tehnike sinteze peptida.

[0047]Odvojeni delovi ili komponente mogu biti povezani direktno jedan za drugi ili mogu biti povezani indirektno pomoću jedne ili više vezne (ili razdvajajuće) sekvence. Prema tome, vezna sekvenca može praviti međuprostor ili odvajati dva dela jedinjenja (ili dve odvojene komponente u oligopeptidnom konstruktu). Tačna priroda vezne sekvence nije kritična i može biti varijabilne dužine i/ili sekvenca, na primer može imati 0-15, 0-12,0-10, 0-8, 0-6, 0-4 ili 0-3 ostataka npr. 1, 2 ili 3 ili više ostataka. Kao reprezentativni primer vezna sekvenca, ukoliko je prisutna, može imati 1-15,1-12, 1-10,1-8,1-6 ili 1-4 ostataka itd. Priroda ostataka nije kritična i oni mogu na primer biti bilo koja amino kiselina, npr. neutralna amino kiselina, ili alifatična amino kiselina, ili alternativno mogu biti hidrofobne, ili polarne ili naelektrisane ili koje formitaju strukturu npr. prolin. Primerne vezne sekvence prema tome uključuju bilo koju pojedinačni amino kiselinski ostatak npr. A, I, L, V, G, R, O, T, ili W, ili di-, tri- tetra- penta- ili heksapeptid sastavljen od ovakvih ostataka.

[0048]Kada oligopeptidno jedinjenje obuhvata sekvencu koja je obrnuta sekvenca SEQ ID NO: 1 (ili njene funkcionalno-ekvivalentne varijante koja ima najmanje 85% sekvencijalnog identiteta), tada je poželjno da je sekvenca CPP (npr. komponente (b)) takođe obrnuta, i da je prikačena u obrnutom redosledu. Drugim rečima, poželjno je daje sekvenca celog jedinjenja (ili konstrukta) koja obuhvata dva dela obrnuta. Međutim, nije isključeno da samo jedan od delova je obrnut, ili da su oba dela obrnuta, ali prikačeni u "ne-obrnutom" redosledu.

[0049]Reprezentativno poželjno jedinjenje prema ovom pronalasku ima sekvencu:

YGRKKRRQRRRGKTLRVAKAIYKRYIE (SEQ ID NO: 40)

[0050]Kancerogena ćelija prema ovom pronalasku može biti ćelija iz bilo kog kancera, npr. bilo koji od doled opisanih kancera. Ona može biti tumorna ćelija. Ćelija može biti ćelija u ili iz kliničkog tumora ili kancerogenog tkiva ili može biti ćelija iz kancerogene ćelijske linije.

[0051]Izraz "mikrobna ćelija" kako se ovde koristi uključuje bilo koji mikroorganizam. Prema tome ćelija može biti eukariotska ili prokariotska i uključuje bakterije, gljive, alge, arhaea i protista. Izraz prema tome uključuje organizme koji su tipično unicelularni, ali koji mogu imati sposobnost organizovanja u jednostavne kooperatovne kolonije ili strukture kao što su filamenti, hifee ili micelie (ali ne pravo tkivo) pod određenim uslovima. Mikroorganizam može biti iz bilo koje klase, roda ili vrste mikroorganizma. Primeri prokariotskih mikroorganizama uključuju, ali nisu ograničeni na, bakterije, uključujući mikcoplazme, (npr. Gram-pozitivne, Gram-negativne bakterije ili Gram test ne-odzivne bakterije) i arhaeobakterije. Eukariotski mikroorganizmi uključuju gljive, alge i druge koji su, ili su bili, klasifikovani u taksonomskom kraljevstvu jkednoćelijskog organizma ili što se tiče protista, a uključuju ali nisu ograničeni na, na primer, protozoe, dijatome, protofit, i plesan nalik gljivicama. Mikroorganizam može biti aerobičan ili anaerobičan. Mikroorganizam može biti patogen ili ne-patogen, ili biti kvarući ili indikatorski mikroorganizam. Određenije, poželjna ostvarenja mikroorganizma je patogeno.

[0052]Organizmi rezistentni na više lekova (MDRO) generalno su bakterije koje nisu pogođene kliničkim dozama klasičnih antibiotika. Bakterije koji su rezistentne na tri ili više klasa antibiotika eneralno se mogu odnositi na MDRO. Oligopeptidna jedinjenja prema ovom pronalasku mogu se koristiti u tretiranju ili prevenciji infekcije od strane MDRO, naprimer Salmonellaspp.,Campylobacter spp., Escherichia coli, StaphylococcusiEnterococcusspp. koji su MDR. MRSA je primer bakterije koja je rezistentna na više lekova. U jednom ostvarenju prema ovom pronalasku mikrobne ćelije su bakterije rezistentne na više lekova.

[0053]Bakterije ili gljive predstavljaju poželjne klase mikrobne ćelije, naročito bakterije.

[0054]Primeri rodova ili vrsta bakterija uključuju, ali nisu ograničenina, Abiotrophia, Achromobacter,

Acidaminococcus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinobaculum, Actinomadura,

Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agrobacterium, Alcaligenes, Alloiococcus, Alteromonas,

Amycolata, Amycolatopsis, Anaerobospirillum, Anaerorhabdus, Arachnia, Arcanobacterium, Arcobacter,

Arthrobacter, Atopobium, Aureobacterium, Bacteroides, Balneatrix, Bartonella, Bergeyella,

Bifidobacterium, Bilophila Branhamella, Borrelia, Bordetella, Brachyspira, Brevibacillus, Brevibacterium,

Brevundimonas, Brucella, Burkholderia, Buttiauxella, Butyrivibrio, Calymmatobacterium, Campylobacter,

Capnocytophaga, Cardiobacterium, Catonella, Cedecea, Cellulomonas, Centipeda, Chlamydia,

Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium,

Collinsella, Comamonas, Corynebactehum, Coxiella, Cryptobacterium, Delftia, Dermabacter,

Dermatophilus, Desulfomonas, Desulfovibrio, Dialister, Dichelobacter, Dolosicoccus, Dolosigranulum,

Edwardsiella, Eggerthella, Ehrlichia, Eikenella, Empedobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia,

Erysipelothrix, Escherichia, Eubacterium, Ewingella, Exiguobacterium, Facklamia, Filifaktor, Flavimonas,

Flavobacterium, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Globicatella, Gemella, Gordona, Haemophilus,

Hafnia, Helicobacter, Helococcus, Holdemania, Ignavigranum, Johnsonella, Kingella, Klebsiella, Kocuria,

Koserella, Kurthia, Kytococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lautropio, Leclercia, Legionella, Leminorella,

Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Megasphaera, Methylobacterium,

Microbacterium, Micrococcus, Mitsuokella, Mobiluncus, Moellerella, Moraxella, Morganella,

Mycobacterium, Mycoplasma, Myroides, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Ochrobactrum, Oeskovia,

Oligella, Orientia, Paenibacillus, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Pediococcus, Peptococcus,

Peptostreptococcus, Photobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Porphyrimonas, Prevotella,

Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter,

Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rhodococcus, Rickettsia Rochalimaea Roseomonas, Rothia,

Ruminococcus, Salmonella, Selenomonas, Serpulina, Serratia, Shewenella, Shigella, Simkania, Slackia,

Sphingobacterium, Sphingomonas, Spirillum, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Stomatococcus,

Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Succinivibrio, Sutterella, Suttonella, Tatumella, Tissierella,

Trabulsiella, Treponema, Tropheryma, Tsakamurella, Turicella, Ureaplasma, Vagococcus, Veillonella,

Vibrio, Weeksella, Wolinella, Xanthomonas, Xenorhabdus, Yersinia, i Yokenella;npr. Gram-pozitivne bakterije kao što jeClostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, M. tuberculosis, M. bovis, M. typhimurium, M. bovis strain BCG, BCG subsoja, M. avium, M. intracelularnae, M.

africanum, M. kansasii, M. morinum, M. ulcerans, M. avium subvrste paratuberculosis, Staphylococcus

aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equi, Streptococcus pyogenes, Streptococcus

agalactiae, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bacillus anthracis, B. subtilis, Nocardia asteroides,

Actinomyces israelii, Propionibacterium acnes, i Enterococcus vrstei Gram-negativne bakterije kao što je

Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella haemolitičkia,

Pasteurella multocida, Legionella pneumophila, Salmonella typhi, Brucella abortus, Chlamydi

trachomatis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetti, Escherichia coli, Neiserria meningitidis, Neiserria

gonorrhea, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Yersinia enterolitica,

Escherichia coli, E. hirae, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis,

Bacteroides fragilis, Fusobascterium nucleatum, Cowdria ruminantium.

[0055]Prema tome, kao reprezentativni primer, mikrobna ćelija može biti bakterija rodaStaphylococcus, Pseudomonas, Legionella, Mycobacterium, Proteus, Klebsiella, Fusobacteriumili druge enterične ili koliformne bakterije.

[0056]Mikrobna ćelija takođe može biti, ili iz, gljiva, uključujući na primer gljive koje mogu biti, ili su mogle biti, klasifikovane kao jednoćelijski organizam, npr. gljive iz rodovaCandida, Aspergillus, Pneumocystis, PenicilliumiFusarium.Reprezentativne glivične vrste uključuju, ali nisu ograničene na,

Candida albicans, Candida dubliniensis, Cryptococcus neoformans, Histoplama capsulatum, Aspergillus

fumigatus, Coccidiodes immitis, Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomyces dermitidis, Pneomocystis

carnii, Penicillium marneffi, Alternaria alternate.

[0057]Mikrobna ćelija takođe može biti, ili iz, alga, uključujući na primer alge koje mogu biti, ili su mogle biti, klasifikovane kao jednoćelijski organizam. Reprezentativne vrste algi uključujuChaetophora,

Chlorella protothecoides, Coleochaete scutata, Coleochaete soluta, Cyanidioschyzon merolae

Aphanochaete, Gloeotaenium, Oedogonium, Oocystis, Oscillatoria, Paradoxia multisitia, Phormidium,

Chroococcus, Aphanothece, Fragillaria, Cocconis, Navicula, Cymbella, Phaeodactylumkao i cijanobakterije (plavo-zelene alge) i dijatome kao što jeNitzschia polea.

[0058]Mikrobna ćelija takođe može biti protozoa, npr. član grupe Amoebae, Sporozoa, Ciliates, i Flagellates. Reprezentativne protozoe uključujuToxoplasmavrste npr.Toxoplasma gondii, Plasmodiumvrste kao što jePlasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Trypanosomavrste npr.Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmaniavrste kao što jeLeishmania major,iEntamoebavrste kao što jeEntamoeba histolitičkia.

[0059]Poželjno, mikrobna ćelija je odabrana iz sledećih rodova:Citrobacter, Enterobacter, Escherichia,

Hafnia, Serratia, Yersinia, Peptostreptococcus, Bacteriodes, Pseudomonas, Legionella, Staphylococcus,

Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Candida, Proteus, Burkholderia, Fusobacterium i

Mycobacterium, na primer Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Legionella pneumophila,

Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia i Streptococcus pyogenes.

[0060]U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid kako je prethodno definisan u odnosu na oligopeptidno jedinjenje prema ovom pronalasku kako je ovde definisano. Takođe je obezbeđen komplement takvog molekula nukleinske kiseline. U poželjnom ostvarenju, molekul nukleinske kiseline takođe enkodira peptid koji penetrira u ćeliju kako je prethodno definisano.

[0061]Molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku poželjno obuhvata najmanje 30 nukleotida i poželjno ne više od 800 nukleotida, poželjnije ne više od 700, 650, 600, 550, 500,450,400, 350, 300, 250, 200,150,100 ili 50. Molekul nukleinske kiseline je poželjno izolovani molekul.

[0062]Dalji aspekt odnosi se na vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline kako je ovde definisan. Ovaj vektor može takođe da sadrži dalje elemente koji se obično mogu naći u vektoru kao što je poreklo replikacije, selektivan marker kao što je rezistencija na antibiotik, i/ili višestruko mesto kloniranja. Ovaj vektor može dalje da bude ekspresioni vektor, i može da obuhvata dalje elemente, npr. transkripcione i/ili translacione kontrolne ili regulatorne elemente za ekspresiju molekula nukleinskih kiselina. Takvi kontrolni elementi, npr. promotorui, mesta vezivanja ribozoma, pojačivači, terminatori itd. dobro su poznati i široko opisani u stanju tehnike.

[0063]Vektor može biti na primer plazmid ili virus, poželjnoje odabran između retrovirusa, adenovirusa i virusa povezanog sa adenovirusom.

[0064]U još jednom aspektu, obezbeđena je rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline i/ili vektor kako je ovde opisano. Ćelija domaćin može biti ćelija životinje, na primer ćelija sisara, npr. pacovska, murisnka ili humana ćelija, ili može biti mikrobna ćelija npr. bakterijska ćelija.

[0065]Pod "rekombinantno" podrazumeva se da je molekul nukleinske kiseline i/ili vektor uveden u ćeliju domaćina.

[0066]U daljem aspektu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja obuhvata oligopeptidno jedinjenje kako je ovde definisano, molekul nukleinske kiseline kako je ovde definisan i/ili vektor kako je ovde definisan, zajedno sa farmakološki (ili farmaceutski) prihvatljivim ekscipijens.

[0067]Ekscipijens može uključiti bilo koje ekscipijense poznate u stanju tehnike, na primer bilo koji nosač ili razblaživač ili bilo koji drugi sastojak ili agens kao što je pufer, antioksidana, helator, vezivo, obloga, dezintegrant, šunilac, aroma, boja, glidant, mazivo, prezervativ, sorbent i/ili zaslađivač itd.

[0068]Ekscipijens može biti odabran između, na primer, mlečne kiseline, dekstroze, natrijum metabisulfata, benzil alkohola, polietilen glikola, propilen glikola, mikrokristalne celuloze, laktoze, škroba, hitosana, preželatiniziranog škroba, kalcijum karbonata, kalcijum sulfata, dekstrata, dekstrina, dekstroze, dvobaznog dihidrata kalcijum fosfata, tribazog kalcijum fosfata, magnezijum karbonata, magnezijum oksida, maltodekstrina, manitola, celuloze u prahu, natrijum hlorida, sorbitola i/ili talka.

[0069]Oligopeptidna jedinjenja prema tome mogu se dostaviti različitim putanjama, u zavinsoti od stanja koje želi da se tretira ili prevenira, i/ili efekta koji želi da se postigne, pacijenta koji se tretiraitd.Tako na primer, putanja dostave ili način davanja mogu biti odabrani kako bi se obezbedio sistemski ili lokalni efekat. Tako na primer, oligopeptidna jedinjenja mogu se davati subjektu tako da se mogu dostaviti sistemski, na primer oralnom ili parenteralnom putanjom davanja. Alternativno, i u nekim slučajevima poželjno, oligopeptidna jedinjenja mogu se dostaviti ili dati lokalno na mesto infekcije ili kancera, npr. lokalno na tumor. Tako na primer, mogu se dostaviti topikalnim ili direktnim davanjem npr. injekcijomn ili infuzijom, ili inhalacijomitd.do mesta kancera (npr. tumora), naravno u zavisnosti od mesta kancera (tumora). Lokalno davanje je poželjno u tretiranju kancera.

[0070]Farmaceutska kompozicija može biti obezbeđen u bilo kom obliku poznatom u stanju tehnike, na primer kao tableta, kapsula, obložena tableta, tečnost, suspenzija, pločica, kesica, implant, inhalant, prah, pelet, emulzija, liofilizat, šumeće tablete, sprej, melem, emulzija, balzam, gips ili bilo koje njihove mešavine. Ona može biti obezbeđena npr. kao preparat rezistentan na želudačnu tečnost i/ili u obliku sa produženim dejstvom. Ona može biti obliku pogodnom za oralno, parenteralno, topikalno, rektalno, genitalno, subkutano, transuretralno, transdermalno, intranazalno, intraperitonealno, intramuskularno i/ili intravensko davanje i/ili za davanje inhalacijom.

[0071]Farmaceutska kompozicija može biti u obliku pogodnom za lipozomalno davanje, tako da se mogu obezbediti lipozomi koje sadrži farmaceutska kompozicija. Kada se koriste lipozomi, nije potrebno uključivati dodatni ekscipijensi, tako da se takođe obezbeđuju lipozomi koji sadrže oligopeptidno jedinjenje kako je ovde definisano, molekul nukleinske kiseline kako je ovde definisan i/ili vektor kako je ovde definisan.

[0072]Dalji aspekt prema ovom pronalasku obezbeđuje postupak borbe protiv kancera i/ili mikrobne infekcije, naročito bakterijske infekcije, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje (naročito davanje efektivne količine) oligopeptidnog jedinjenja kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline kako je ovde definisan, subjektu kome je to potrebno.

[0073]U još jednom aspektu, obezbeđeno je oligopeptidno jedinjenje kako je ovde definisano, ili molekul nukleinske kiseline kako je ovde definisan, za upotrebu u terapiji, naročito za upotrebu u borbi protiv kancera i/ili mikrobne infekcije, naročito bakterijske infekcije.

[0074]U još jednom aspektu, obezbeđena je upotreba oligopeptidnog jedinjenja kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline kako je ovde definisan, u proizvodnji leka za upotrebu u borbi protiv kancera i/ili mikrobne infekcije, naročito bakterijske infekcije.

[0075]Izraz "borba protiv" kako se ovde koristi uključuje oba i terapeutski tretiranje i prevenciju. Određenije pronalazak obezbeđuje postupke i upotrebe za tretiranje kancera, na primer u tretiranju tumora, i/ili borbu protiv mikrobne infekcije, naročito bakterijske infekcije.

[0076]Oligopeptidna jedinjenja (uključujući konstrukte) prema ovom pronalasku prema tome ima have terapeutsku korisnost u tretiranju ili vođenju kancera i/ili mikrobne infekcije. Ona prema tome mogu da se koriste kao anti-kancer, ili određenije kao anti-tumor, i/ili anti-mikrobni, određenije anti-bakterijski, agensi.

[0077]Oligopeptidna jedinjenja mogu prema tome da se koriste u tretiranju bilo kojeg stanja (kako se ovde široko koristi da uključi bilo koju bolest ili poremećaj ili bilo koju kliničku situaciju) koji bi imalo korist od citotoksičnog efekta jedinjenja prema ovom pronalasku. Oligopeptidna jedinjenja shodno tome imaju korisnost u bilo kojoj terapiji (ili tretmanu) koji cilja ćelije, a naročito kancerogene ćelije, npr. ćelije tumora , i/ili mikroorganizme, naročito bakterije.

[0078]Izraz "tretiranje" kako se ovde koristi odnosi se široko na bilo koji efekat ili fazu (ili intervenciju) korisna u vođenju kliničkog stanja. Tretiranje može uključiti smanjivanje, ubklažavanje, poboljšavanje, usporavanje razvoja, ili eliminisanje stanja ili jednog ili više njegovih sim,ptoma, koje se tretira, u odnosu na stanje ili simptom pre tretiranja, ili bilo kakvog poboljšavanja kliničkog statusa subjekta. Tretiranje može uključiti bilo koju kliničku fazu ili intervenciju koja doprinosi, ili je deo, tretmanskog programa ili režima.

[0079]"Prevencija" ili "profilaksa" može uključiti odlaganje, ograničavanje, smanjivanje ili preveniranje stanja ili početka stanja, ili jedan ili više njegovih simptoma, na primer u odnosu na stanje ili simptom pre davanja jedinjenja. Profilaksa na ovaj način eksplicitno uključuje oba i apsolutnu prevenciju pojavljivanja ili razvoja stanja, ili njegovog simptoma, i bilo koje odlaganje početka ili razvoja stanja ili simptoma, ili smanjenje ili ograničavanje razvoja ili progresije stanja ili simptoma.

[0080]Tretiranje prema ovom pronalasku prema tome uključuje ubijanje, inhibiranje ili usporavanje rasta ćelija, ili povećanja u veličini tela ili populacije ćelije (npr. u tkivu, tumoru ili rastu), smanjivanje broja ćelija ili sprečavanja širenja ćelija (npr. do drugog anatomskog mesta), smanjivanje veličine rasta ćelije itd. Izraz "tretiranje" ne podrazumeva izlečenje ili potpuno ukianje oli eliminaciju ćelijskog rasta, ili rasta ćelija.

[0081]Uključeno je tretiranje svih vrsta kancera, uključujući npr. čvrste tumore i hematološke kancere. Izraz "kancer" stoga se široko koristi da uključi bilo koje neoplastično stanje; maligno, pred-maligno ili ne-maligno. Reprezentativne vrste kancera uključuju kancer grlića materice, kanver materice, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer bubrega, kancer žučne kese, kancer jetre, kancer glave i vrata, karcinom skvamoznih ćelija, gastrointestinalni kancer, kancer dojke, kancer prostate, kancer testisa, kancer pluća, nemikrocelularni karcinom pluća, ne-Hodgkin-ov limfom, višestruk mijelom, leukemiju (kao što je akutna limfocitna leukemija, hronična limfocitna leukemija, akutna mijelogena leukemija, i hronična mijeloidna leukemija ), kancer mozga ( npr. astrocitom, glioblastom, meduloblastom ), neuroblastom, sarkom, kancer kolona, kancer rektuma, kancer želuca, analni kancer, kancer bešike, kancer pankreasa, kancer endometrijuma, plazmacitom, limfome, retinoblastom, Vilmov tumor, Eving-ov sarkom, melanom i drugi kanceri kože.

[0082]Takođe se mogu pomenuti sinusni tumori, ureteralni i genito-urinarni kanceri, kancer jednjaka, mijelom, endokrini kanceri, osteosarkom, angiosarkom, i fibrosarkom, i bilo koji tumor perifernog ili centralnog nervnog sistema, maligni ili benigni, uključujući gliom i neuroblastome.

[0083]Kanceri naročitog interesa uključuju kancer mozga, pluća i kolona i melanom.

[0084]Kako je prikazano u primerima ispod, jedinjenja prema ovom pronalasku imaju citotoksične efekte, naročito protiv kancerogenih ćelija, ili tumora, i/ili protiv mikrobne ćelije, naročito bakterije.

[0085]Određenije, jedinjenja mogu biti sposobna selektivno da ciljaju kancerogene ćelije. Drugim rečima jedinjenja prema ovom pronalasku su selektivna za kancerogenu ćeliju i shodno tome mogu imati nikakv ili minimalne efekte na normalne (ne-kancerogene) ćelije. Na ovaj način, poželjno se mogu zaobići neželjeni citotoksični efekti na ne-kancerogene ćelije. Jedinjenja prema ovom pronalasku stoga poželjno pokazuju slektivnost za kancerogene ćelije. Takve ćelije mogu se naći unutar čvrstog tumora, ili mogu biti metastatične ćelije. Jedinjenja prema ovom pronalasku poželjno ne pokazuju citotoksičnost za ne-kancerogene ćelije.

[0086]Dalje u kontekstu terapije kancera, jedinjenja prema ovom pronalasku poželjno su efektivna u poboljšanju ili produžavanju preživljavanja, na primer kako je procenjeno u ekperimentalnom životinjskom modelu, npr. kod životinje kod koje je tumor indukovan ili u kojoj je tumor ili ćelije tumora uvedeni. Takav životinjski model opisan je u primerima ispod. Dalje, jedinjenja su poželjno efektivna u inhibiranju rasta tumora, npr. u iskorenjivanju tumora ili smanjivanju veličine tumora ili zaustavljanju ili smanjivanju rasta tumora, na primer u životinjskom modelu kako je prethodno diskutovano. Alternativno ili dodatno, jedinjenja su takođe poželjno efektivna u sprečavanju ili smanjivanje širenja tumora, ili metastatičnog potencijala tumora. Ponovo, ovo može biti procenjeno u životinjskom modelu kako je prethodno diskutovano.

[0087]Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu izazvati liziju i/ili apoptozu kancerogenih ćelija. Primeri ispod pokazuju da su oba i litički efekti i apoptoični efekti primećeni kada su jedinjenja prema ovom pronalasku primenjena na razne vrste ćelija. Prema tome, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu izazvati liziju kancerogene (tumorne) ćelije. Lizija se deđava kao rezultat dezintegracije ćelijske membrane, koja rezultira kao ćelijska smrt. Postupci određivanja ćelijske lizije poznati su stručnjacima iz ove oblasti. Primeri ispod ilustruju kako se to može izvesti.

[0088]Alternativno ili dodatno jedinjenja prema ovom pronalasku mogu izazvati apoptozu kancerogenih ćelija. Apoptoza je proces programirane ćelijske smrti (PCD) koja se može dogoditi u višećelijskim organizmima. Programirana ćelijska smrt uključuje serije biohemijskih događaja koji vode do karakteristične morfologije i smrti; uključujući stvaranje plikova, promene na ćelijskoj membrani kao što je gubitak membranske asimetrije i pričvršćenja, smanjivanje ćelija, nuklearna fragmentacija, hromatinska kondenzacija, i hromozomalna DNK fragmentacija. Eksperimenti koji određuju da lije ili ne ćelija u , ili bila u apoptozi, dobro su poznati u stanju tehnike (i videti Primere ispod). Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu biti litička i/ili apoptoična za kancerogene ćelije, poželjno ijedno i drugo.

[0089]U poželjnom aspektu prema ovom pronalasku, oligopeptidna jedinjenja prema ovom pronalasku su citotoksična protiv bakterija, to jest ona su baktericidna. Lizija raznih vrsta bakterija jedinjenjima prema ovom pronalasku pokazana je u Primerima. Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu se koristiti u tretiranju ili prevenciji infekcije bilo kog mikroorganizma, uključujući bilo koji od mikroorganizama prethodno pomenutih, ali požečjno bakterijskih, uključujući bilo koju od prethodno navedenih bakterija. Određenije, infekcija može biti patogena infekcija. Napominju se infekcije izazvane od strane

Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Serratia, Yersinia, Peptostreptococcus, Bacteriodes,

Pseudomonas, Legionella, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Candida, Proteus,

Burkholderia, FusobacteriumiMycobacterium,na primer,Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis, Legionella pneumophila, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia i

Streptococcus pyogenes.

[0090]Infekcija može biti akutna, ili alternativno hronična, npr. infekcija koja je uporna najmanje 5 ili najmanje 10 dana, naročito najmanje 20 dana, određenije najmanje 30 dana, naročito najmanje 40 dana.

[0091]U jednom ostvarenju, ovaj aspekt prema ovom pronalasku može da obuhvata fazu u kojoj je subjekat dijagnostikovan kao kandidat koji je pod rizikom od razvijanja infekcije ili koji bi imao korist u tretiranju postojeće infekcije.

[0092]Uključeno je tretiranje septikemije, septičkog šoka, sepse, meningitisa, ili trovanja mikrobnim toksinima, npr. toksin kolere i toksin botulinuma, kao i tretiranje više lokalizovanih infekcija, npr. određenih mesta, tkiva ili organa.

[0093]Infekcija se može pojaviti kod bilo kog subjekta, ali neku subjekti su podložniji infekciji od drugih. Subjekti koji su podložniji infekciji uključuju, ali nisu ograničeni na, subjekti čija je epitelna i/ili endotelijalna barijera oslabljena ili kompromitovana, subjekti čije su odbrane bazirane na sekreciji prema mikrobnoj infekciji ukinute, narušene, oslabljene ili ugrožene, i subjekti koji su imunokompromitovani, imunodeficijentni ili imunosupresivni (tj. subjekt kod koga bilo koji deo imunološkog sistema ne radi normalno, ili ili radi subnormalno, drugim rečima kod koga bilo koji deo imunološkog odgovora, ili imunološke aktivnosti je redukovan ili oslabljen, bilo zbog bolesti ili kliničke intervencije ili drugim tretiranjem, ili na bilo koji drugi način).

[0094]Reprezentativni primeri subjekata koji su podložni infekciji uključuju, ali nisu ograničeni na, subjekti sa prethodno utvrđenom infekcijom (npr. sa bakterijama, virusima, gljivama ili parazitima kao što je protozoa), naročito subjekti sa HIV, subjekti sa sepsom i subjekti sa septičnim šokom; subjekti sa imunodeficijencijom, npr. subjekti koji se spremaju za, u toku su ili se oporavljaju od hemioterapije i/ili radioterapije, subjekti sa transplantiranim organom (npr. koštana srž, jetra, pluća, srce, srčani zalistak, bubreg, itd.) (uključujući autograft, alograft i ksenograft pacijente), subjekti sa AIDS; subjekti koji se nalaze u zdravstvenoj ustanovi, npr. bolnici, pogotovo subjekti na intezivnoj nezi ili kritičnoj nezi (tj. one jedinice koje se tiču obezbeđivanja održavanja života ili sistemi za održavanje nekih organa kod pacijenta); subjekti koji su doživeli neku traumu; subjekti sa opekotinama, subjekti sa akutnim i/ili hroničnim ranama; neonatalni subjekti; stariji subjekti; subjekti sa kancerom, pogotovo oni sa kancerima imunološkog sistema (npr. leukaemije, limfomi i drugi hematološki kanceri); subjekti koji pate od auto-imunološki stanja kao što je reumatoidni artritis, dijabetes melitus tip I, Kronova bolest, naročito oni koji su pod imunosupresivnim tretmanom za te bolesti; subjekti smanjenom ili ukinutom epitelnom ili endotelijalnom sekrecijom (npr. mukoze, suza, pljuvačke) i/ili izbijanje sekrecije (npr. subjekti sa cilijama koje slabo funkcionišu na sluzokoži tkiva i/ili pacijenti sa hiperfiskoznom mukozom (npr. pušači i subjekti sa HOBP, bronhitisom, cističnom fibrozom, emfizemom, kancerom pluća, astmom, upalom pluća ili sinuzitisom) i subjekti kojima je ugrađen medicinski uređaj.

[0095]Prema tome, subjekti kod kojih se infekcije mogu naročito pobediti prma ovom pronalasku uključuju pacijente koji su oslabljeni, bilo zbog slabe perfuzije, ponavljajuće traume, slabe nutricije, slabe oksigenacije ilidisfunkcije belih ćelija.

[0096]Posebno su naznačeni subjekti koji su pod fizičkom traumom. Trauma sama po sebi može da izazove slabljenje u ili kompromitovanje epitelne i/ili endotelijalne barijere subjekta ili subjekt može postati imunokopromitovan kao odgovor na traumu ( odgovor na šok). Izraz "trauma" odnosi se široko na ćelijski napad stranih tela i/ili fizičku povredu ćelija. Uključeni među stranim telima su mikroorganizmi, određene materije, hemijski agensi, i slično. Uključeni među fizičkim povredama su mehaničke povrede; termalne povrede, kao što su one koje su rezultat preterane toplote ili hladnoće; električne povrede, kao što su one izazvane dolaženjem u kontakt sa izvorom električnog potencijala; i radijacione povrede izazvane, na primer, produženim, dužim izlaganjem infracrvenim, ultraljubičastim ili jonizirajućim zračenjem.

[0097]Takođe su posebno naznačeni subjekti sa opekotinama. Bilo koja opekotina, određenije teška opekotina, ima značajan udar na integritet epitelne i/ili endotelijalne barijere subjekta, a subjekat će često postati imunokopromitovan kao odgovor na opekotinu ( odgovor šoka).

[0098]Tipični agensi koji izazivaju opekotine su ekstremne temperature (npr. vatra i tečnosti i gasovi na ekstremnim temperaturama), struja, korozivne hemikalije, frikcija i zračenje. Stepen i trajanje izloženosti, zajedno sa intezitetom/jačinom agensa, rezultiraju kao opekotine različitih stepeni. Prženje (tj. trauma koja je povezana sa tečnostima i/ili gasovima visoke temperature) smatra se opekotinom.

[0099]Pronalazak se takođe može koristiti za tretiranje ili prevenciju infekcije rana, bilo akutnih ili hroničnih. Akutne rane su rane koje prolaze redom kroz tri porepoznatljive faze zarastanja (tj. upalna faza, proliferativna faza i faza remodelovanja) bez produženog vremenskog toka. Hronične rane, međutim, su one koje ne ispune redoslednu sekvencu biohemijskih događaja procesa zarastanja jer rana ostaje u jednoj od faza zarastanja. Često, hronične rane se zadržavaju u zapaljenskoj fazi. Hronična rana može se definisati kao rana koja se ne zaleči u roku od najmanje 40 dana, naročito najmanje 50 dana, određenije najmanje 60 dana, naročito najmanje 70 dana. Rane su idealno okruženje za infekciju, naročito hroničnu infekciju, zbog nedostatka epitelne barijere i pogodnosti za substraciono i mikrobno kačenje i kolonizaciju. Problematično, infekcija rane često odlaže zarastanje dalje i prema tome čini da je rana podložnija utvrđenoj infekciji.

[0100]Jedinjenja mogu prema tome da se koriste za tretiranje infekcije gde god da se dogodi na ili u telu. Prema tome, u još jednom ostvarenju, infekcija može biti infekcija medicinskog uređaja, naročito permanentnog medicinosg uređaja.

[0101]Jedinjenja se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskim kao oralni zdravstveno zaštitini agensi, na primer u kontroli dentalnog plaka, npr. da ga redukuju ili da spreče, smanje ikli odlože njegov razvoj, ubijajući mikroorganizme u plaku ili u inhibiranju replikacije ili rasta pomenutih mikroorganizama. Alginatni oligomeri takođe se mogu koristiti u tretiranju i prevenciji infekcije ili infektivne bolesti koja se može pojaviti u oralnoj šupljini, na primer gingivitis i periodontitis.

[0102]Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu da se koriste kao profilaktičko tretiranje, na primer da spreči, ili najmanje minimizira rizik, infekcije ili kontaminaciju (npr. od strane patogena). Ovo može biti korisno za negu hospitalizovanih pacijenata kako se rizik od dobijanja nozokomijalne infekcije (često poznat i kao infekcija povezana/stečena u bolnici ili infekcija povezana sa zdravstvenom negom), npr.Staphylococcus aureus,MethicillinRezistentne Staphylococcus aureus(MRSA),Pseudomonas

aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Clostridium ditficile,

Mycobacterium tuberculosis i Vancomycin- Rezistentne Enterococcus,može minimizirati sa profilaktičkim režimom jedinjenja koje je ovde definisano. Ovaj aspekt prema ovom pronalasku takođe je koristan u nezi subjekata koji imaju neku traumu, subjekti sa opekotinama i subjekti sa ranama, svi od onih, kako je prethodno diskutovano, koji su podložniji mikrobnim infekcijama od subjekta koji nije isto pogođen.

[0103]"Farmaceutski efektivna" količina oligopeptidnog jedinjenja je količina koja obezbeđuje merljiv efekat (npr. citotoksičan ili citostatičan efekat) na ciljanu ćeliju i/ili merljiv efekat na stanja koja su ciljana. Poželjno to je količina dovoljna direktno da ubije ćeliju ili inhibira njen rast. Ova količina može se odrediti referencom prema standardim praksama practices određivanje dozne količine, a stručnjak će biti u mogućnosti da detektuje dokaz uspešnog tretiranja na osnovu svog iskustva i pomoću rutinskih testova koji su mu dostupni.

[0104]Subjekat može biti bilo koji humani ili ne-humani životinjski subjekt, ali određenije može biti kičmenjak, npr. životinja odabrana od sisara, ptica, amfibija, riba i reptila. Životinja može biti stoka ili domaća životinja ili životinja za komercijalne vrednosti, uključujući laboratorijske životinje ili je životinja u zoološkom vrtu ili zabavnom parku. Reprezentativne životinje stoga uključuju pse, mačke, zečeve, miševe, zamorce, hrčke, konje, svinje, ovce, koze, krave, piliće, ćurke, morka, patke, guske, papagaje, kanarince, golubove, losose, pastrmku, bakalar, bakalare, brancin i šaran. Veterinarske upotrebe prema ovom pronalasku su prema tome pokrivene. Subjekat se može videti kao pacijent. Poželjno subjekat je čovek.

[0105]Kako je prethodno navedeno, u smislu anti-mikrobnih efekata jedinjenje ovog pronalaska nije ograničeno na medicinske upotrebe (tj. tretiranje ili prevencija infekcija) i ne-medicinske upotrebe su takođe pokrivene, na primer za borbu proitv mikrobne kontaminacije ili kolonizacije (npr. kod, u, ili na neživotnim mestima i lokacijama) npr. u svrhe dezinfekcije ili čišćenja.

[0106]Prema tome uopštenije pronalazak uključuje postupak za inhibiranje vijabilnosti i/ili rasta mikrobne ćelije (ili alternativno, mikroorganizam, pri čemu pomenuti postupak obuhvata dovođenje u kontakt pomenute ćelije (or mikroorganizma) sa oligopeptidnim jedinjenjem kako je ovde definisano. Određenije, postupak jein vitropostupak. Prema tome, ovaj aspekt može se alternativno videti kao postupak za inhibiranje vijabilnosti i/ili rasta mikroorganizma, ili borbe protiv mikrobne kontaminacije ili kolonizacije, na neživom mestu, pri čemu pomenuti postupak obuhvata dovođenje u kontakt pomenutog mesta sa oligopeptidnim jedinjenjem kako je ovde definisano. "Borba protiv" akako se koristi u ovom kontekstu uključuje inhibiranje (tj. smanjivanje ili sprečavanje) mikrobne kontaminacije ili kolonizacije, kao i tretiranje postojeće kontaminacija ili kolonizacija.

[0107]Izraz "dovođenje u kontakt" obuhvata bilo koje sredstvo isporuke jedinjenje do mikroorganizma ili mesta, bilo direktno ili indirektno, i prema tome bilo koje sredstvo primenjivanja jedinjenja do mikroorganizma ili mesta ili izlaganja mikroorganizma ili mesta jedinjenjem npr. primenjivanje jedinjenja direktno na mikroorganizam ili mesto.

[0108]Određenije mikroorganizam ili mesto biće dovedeno u kontakt sa efektivno količinom alinatnog jedinjenja, određenije količina jedinjenja efektivna direktno da inhibira vijabilnost (npr. da ubije) mikroorganizma ili da inhibira direktno rast mikroorganizma.

[0109]Mesto ili lokacija mikroorganizma nisu ograničeni. Mikroorganizam može biti prisutan na površini. Mesto nije ograničeno i uključuje bilo koje mesto na ili u kom se mikroorganizam može pojaviti ili koje može biti izloženo mikrobnom kontaktu ili kontaminaciji. Prema tome, naročito su uključena (na mestu) mašina, naročito industrijskih mašina, ili medicinske opreme ili bilo kom mestu izloženom vodenoj sredini (npr. pomorska oprema, ili brodovi ili čamci ili njihovi delovi ili komponente), ili bilo koje mesto izloženo bilo kom delu sredine, npr. cevi ili na građevinama. Takva beživotna mesta izložena mikrobnom kontaktu ili kontaminaciji uključuju određenije bilo koji deo: proizvodnja hrane i pića, mašina ili oprema za pripremanje, skladištenje ili isporučivanje, uređaji za kondicioniranje vazduha, industrijske mašine, npr. hemjska ili biotehnološka proizvodna postrojenja, rezervoari za skladištenje, medicinska ili hirurška oprema i oprema za kultivisanje ćelija i tkiva. Bilo koji aparat ili oprema za nošenje ili transport ili dostavu materijala podložan je mikrobnoj kontaminaciji. Takve površine uključuju naročito cevi (koji izraz se široko koristi da uključi bilo koji vid ili liniju). Reprezentativne beživotne ili abiotičke površine uključuju, ali nisu ograničene na proizvodnju hrane, skladištenje, oprema ili površine za isporučivanje ili pripremanje, rezervoari, tnsporteri, podovi, odvodi, hladnjaci, zamrzivači, površina opreme, zidovi, ventili, kaiševi, cevi, vodovi za kondicioniranje vazduha, aparati za hlađenje, linije za isporučivanje hrane ili pića, izmenjivači toplote, brodska korita ili bilo koji deo kontrukcije broda koji je izložen vodi, dentalne linije za vodu, vodovi za bušenje naft, sočiva i i kutij za odlaganje.

[0110]Kako je gore navedeno, medicinska ili hirurška oprema ili uređaji predstavljaju određenu klasu površine nakojoj se može formirati mikrobna kontaminacija. Ovo može uključiti bilo koju vrstu linije, uključujući katetere (npr. centralni venske i urinarne katetere), protetske uređaje npr., srčane zalistke, veštačke zglobove, veštačke zube, zubne krunice, zubne navlake i implante mekog tkiva (npr. implanti dojke, zadnjice ili usana). Bilo koja vrsta implantabilnog (ili "na-mestu") medicinskog uređaja je uključena (npr. stentovi, intrauterinski uređaji, pejsmejkeri, intubacione cevi, proteze ili protetski uređaji, linije ili kateteri). "Na-mestu" medicinski uređaj može uključiti uređaj kod koga je bilo koji deo sadržan unutar tela, tj. uređaj može biti ceo ili delimični na-mestu.

[0111]Mesto takođe može biti hrana, na primer, govedina, živina, svinjetina, povrće, voće, riba, školjke, njihove kombinacije, i slično, proizvodi za ličnu higijenu, sredstva za higijenu, kozmetika itd.; hemijski ili industrijski proizvoda i reagensi itd.; klinički, naučni ili industrijski otpadni materijali itd. Prema tome, jedinjenja se mogu koristiti kao konzervans ili agens za dekontaminaciju u materijalima, posebno tečnosti i rastvori.

[0112]U određenim poželjnim ostvarenjima prema ovom pronalasku jedinjenja se mogu koristiti u kojnjukciji ili kombinaciji sa drugim ili dodatnim anti-mikrobnnim agensom (od sada pa nadalje "dodatni anti-mikrobni agens").

[0113]U kontekstu medicinske upotrebe, takav anti-mikrobni agens može biti bilo koji klinički-koristan anti-mikrobni agens i naročito antibiotik ili antivirusni ili antigljivični agens. U kontekstu ne-kliničke upotrebe, anti-mikrobni agens može ponovo biti bilo koji anti-mikrobni agens upotrebljen za takve svrhe, npr. bilo koji dezifektant ili antiseptik ili agens za čišćenje ili sterilisanje. Agensi mogu biti upotrebljeni odvojeno, ili zajedno u istoj kompoziciji, simultano ili sekvencijalno ili odvojeno, npr. u bilo kom željenom vremenskom intervalu.

[0114]Izbor anti-mikrobnog agensa naravno mora da odgovara tretiranju ili upotrebi o kojoj se radi, pa na primer anti-mikrobni agensi, npr. antibiotici, antifungali, antivirali, antiseptici mogu se upotrebiti i/ili sterilišući uslovi kao što je zračenje (npr. UV, X-zracima, gama), ektremne temperature, i ekstremne pH.

[0115]Dodatni anti-mikrobni agens može se pogodno primeniti pre, simultano sa ili nakon jedinjenja. Pogodno, dodatni anti-mikrobni agens se primenjuje suštinski u isto vreme kao i jedinjenje ili nakon toga. Kako bi se optimizovao anti-mikrobni efekat dodatni anti-mikrobni agens može se primenjivati (npr. dati ili dostaviti) ponavljanjem u vremenskim tačkama pogodne za primenu agensa. Stručnjak će biti sposoban da osmisli odgovarajuće doziranje ili režim upotrebe. U dugoročnim tretiranjima, jedinjenje se takođe može koristiti sa ponavljanjem. Frekventnost koja je potrebna zavisiće od mikroorganizma, mesta, bolesti, korisnosti, kompozicije i upotrebljenih anti-mikrobaitd. A stručnjak će moći da optimizuje shemu doziranja ili upotrebe kako bi opimizovao rezultate.

[0116]Slično i analogno, u kontekstu kancer therapija ovde opisanih, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu biti upotrebljena u kombinaciji ili u konjukciji sa drugim anti-kancer agensima, na primer hemoterapijski agens ili anti-neoplastični agens ili bilo koji agens koji može biti indikovan za onkolološku ili hematološku indikaciju.

[0117]Prema tome, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu biti upotrebljena u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima, na primer da se daju zajedno, u pojedinačnoj farmaceutskoj formulaciji ili kompoziciji, ili odvojeno (tj. za odvojeno, sekvencijalno ili simultano davanje). Prema tome, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu biti kombinovana sa drugim (ili dodatnim) terapeutski aktivnim agensom, npr. u farmaceutskom kitu ili kao kombinovani ("kombinacioni") proizvod.

[0118]Prema tome, dalji aspekt prema ovom pronalasku obezbeđuje proizvod koji sadrži oligopeptidno jedinjenje ili molekul nukleinske kiseline kako je ovde definisan i drugi aktivni agens (npr. anti-kancerogeni ili anti-mikrobni agens) kao kombinovani preparat za odvojenu, simultanu ili sekvencijalnu upotrebu (npr. primena na mikroorganizam ili mesto i/ili davanje subjektu) u inhibiranju vijabilnosti i/ili rasta kancerogene ili mikrobne ćelije, ili određenije u tretiranju kancera ili borbi protiv mikrobne infekcije ili mikrobne kontaminacije ili kolonizacije mesta, ili zaista bilo koju od upotreba ovde opisanih ili definisanih.

[0119]Stručnjak će biti svestan odgovarajućih postupaka za uvođenje oligopeptidnog jedinjenja ili molekula nukleinske kiseline u ćelije. Primera radi, nekoliko odgovarajućih postupaka ukratko su opisani ispod. Kako je detaljnije opisano gore, postupci dostave posredovani peptidom mogu da se koriste, naročito peptida koji penetrira u ćelije (CPP), koji su kako je prethodno diskutovano, kratke, u nekim slučajevima polikatjonske, sekvence koje mogu olakšati ćelijsko preuzimanje molekula peptida, proteina ili nukleotida koji sadrže CPP ili za koje su CPP povezani, na primer pojačanim preuzimanjem u endozomima ćelija sisara. Mikroenkapsulacija obezbeđuje jednostava i simple i jeftin način da se obuhvate bioaktivni materijali umutar polu-proustljive polimerne membrane radi zaštite bioaktivnih materijala i oslobađanje obuhvaćenih supstanci ili njihovih proizvoda na kontrolisan način. U fotohemijskoj internalizaciji (PCI) i molekul od interesa i fotosenzitirajuće jedinjenje preuzimaju se od strane ćelije u lizozomu ili endozomu. Ćelije su zatim izložene svetlu odgovarajućih talasnih dužina kako bi se aktiviralo fotosenzitirajuće jedinjenje, izazivajući fotosenzitirajuće jedinjenje da prekine membranu lizozoma ili endozoma, čime se oslobađa molekul od interesa u citozolne ćelije.

[0120]Drugi postupci uključuju mikroinjekciju, fuziju crvenih krvnih ćelija posredovana duhovima, lipozomska fuzija, osmotska lizija of pinozoma, unošenje krou pukotine, elektroporacija, transfekcija posredovana kalcijum fosfatom i virusima i upotreba of kopolimernih nosača.

[0121]Htosan i u vodi rastvorljivi derivati hitosana, određenije glikol hitosan, javljaju se kao izbor za nosače leka zbog njihove biokompatibilnosti i biorazgradljivostiin vivo.Poželjan primer je glikol hitosan hidrofobno modifikovan sa 5 B-holnom kiselinom.

[0122]"Oligopeptidno jedinjenje" prema ovom pronalasku može inkorporirati jednu ili više, npr. najmanje 1, 2, 3,4 ili 5 amino kiseline koje imaju bočni lanac koji nije kodiran standardnim genetskim kodom, kako se ovde nazivaju "ne-kodirane amino kiseline". One mogu biti odabrane između amino kiselina koje su formirane kroz metaboličke procese kao što je ornitin ili taurin, i/ili veštački modifikovanih amino kiselina kao što je 9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonil (Fmoc), (tert)-(B)util (o)ksi (k)arbonil (Boe), 2,2,5,7,8-pentametilhroman-6-sulfonil (Pmc) zaštićene amino kiseline, ili amino kiseline koje imaju benziloksi-karbonil (Z) grupu.

[0123]In vitroi/iliin vivostabilnost oligopeptidnih jedinjenja prema ovom pronalasku može biti poboljšana ili pojačana upotrebom sredstava za stabilizaciju ili zaštitu poznata u stanju tehnike, na primer dodavanjem zaštitnih ili stabilišućih grupa, inkorporacijom derivata amino kiselina ili analoga ili hemijskom modifikacijom amina kiselina, Tpri čemu takve zaštitne ili stabilišuće grupe mogu biti dodate na primer na N i/ili C-terminusu. Primeri takvih grupa kao što je acetilna grupa i druge zaštitne grupe ili grupe koje mogu da stabilišu peptid poznati su u stanju tehnike.

[0124]Primeri ispod pokazuju modifikovans oligopeptidna jedinjenja prema ovom pronalasku koja su modifikovana da uključuju D-amino kiseline mogu zadržati anti-kancerogenu i anti-mikrobnu aktivnost prema ovom pronalasku.

[0125]Prema tome, u jednom ostvarenju oligopeptidna jedinjenja prema ovom pronalasku obuhvataju samo amino kiseline koje imaju L-konfiguraciju, ali u daljem ostvarenju jedna ili više amino kiselina koje imaju D konfiguraciju su prisutne. Oligopeptidno jedinjenje može da sadrži najmanje 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 ili 12 D-amino kiselina. Poželjno, oligopeptidno jedinjenje sadrži sve D-amino kiseline. Prema tome, uključeni su naročito inverzo oligopeptidna jedinjenja ili inverzo analozi oligopeptidnih jedinjenja prema ovom pronalasku (a određenije inverzo peptidi).

[0126]"Retro" oligopeptidna jedinjenja (ili retro peptidi) su ona u kojima su ostaci (npr. ostatak amino kiseline) postavljeni na suprotnom mseru u odnosu na parentalno ili referentno jedinjenje (npr. peptid). Na primer, kada se sekvenca SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 40 obrne, dobijaju se sekvence koje su naznačene u SEQ ID NO. 2 i 41, respektivno.

[0127]Retro-inverzo oligopeptidna jedinjenja uključuju D-amino kiseline u obrnutu (suprotnom) redosledu u odnosu na sekvencu parentalnog ili referentnog jedinjenja. Retro-inverzo analog prema tome ima obrnute termine i obrnute redosled npr. peptidne veze, dok otprilike održavaju topologiju bočnih lanaca kao i parentalna ili referentma sekvenca.

[0128]Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu uključiti delimilčne inverzosekvence. U poželjnom ostvarenju jedinjenje je inverzo. Pod "oligopeptidno jedinjenje" podrazumeva se jedinjenje koje je sastavljeno od amino kiseline ili ekvivalentnih podjedinica, koji su povezani zajedno peptidom ili ekvivalentnim vezama. Prema tome, izraz "oligopeptidno jedinjenje" uključuje peptide i peptidomimetike.

[0129]Pod "ekvivalentna podjedinica" podrazumeva se podjedinica koja je strukturno i funkcionalno slična amino kiselini. Grupa kičme podjedinica može se razlikovati od standardnih amino kiselina, npr. mogu inkorporirati jedan ili više atoma azota umesto jednog ili više atoma ugljenika.

[0130]Pod "peptidomimetikom" se podrazumeva jedinjenje koje je funkcionalno ekvivalentno ili slično peptidu i koje može da usvoji tro dimenzinalnu strukturu sličnu svom peptidu parnjaku, ali koje nije u potpunosti sastavljen od amino kiselina povezanih peptidnim vezama. Poželjna klasa peptidomimetika su peptoidi, tj. A/-supstituisani glicini. Peptoidi su blisko povezani sa svojim paptidnim parnjacima, ali se mogu razlikovati hemijski na taj način da su njihovi bočni lanci prikačeni za atome azota zajedno sa kičmom molekula, pre nego za a-karbone kao što je slučaj sa amino kiselinama.

[0131]Peptidomimetici obično imaju duži životni vek u telu pacijenta, pa su zato poželjni u ostvarenjima gde je poželjan dugoročniji efekat.To može pomoći u redukovanju frekventnosti na kojoj se kompozicija ponovo daje. Međutim, iz bio-sigurnosnih razloga, u drugim ostvarenjima kraći ivotni vek može biti poželjan; u tim ostvarenjima poželjni su peptidi.

[0132]Najpoželjnije, oligopeptidno jedinjenje je peptid. Oligopeptidno jedinjenje može inkorporirati di-amino kiseline i/ili B-amino kiseline. Najpoželjnije, oligopeptidno jedinjenje se sastoji od a-amino kiseline.

[0133]Prefiks "oligo" upotrebljava se kako bi označio relativno mali broj podjedinica kao što su amino kiseline, tj. manje od 200, poželjno manje od 100, 90, 80, 70 60 ili 50 podjedinica. Oligopeptidno jedinjenje prema ovom pronalasku može prema tome da obuhvata ne više od 50,45,40, 35, 30, 29, 28, 27, 26 ili 25 podjedinica. Reprezentativni opsezi podjedinica prema tome uključuju 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, 25-32 i 25-30.

[0134]Oligopeptidna jedinjenja prema ovom pronalasku mogu da obuhvataju ili da se sastoje od sekvence amino kiseline koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sa sekvenca navedenom u SEQ ID NO 40.

[0135]Sekvencijalni identitet može biti procenjen bilo kojim pogodnim postupkom. Međutim, za određivanje stepena sekvencijalnog identiteta između sekvenci, korisni kompjuterski programi koji prave višestruka upoređivanja sekvenci, na primer Clustal W (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680). Programi koji porede ili podvlače parove sekvenci, kao ALIGN (Mvers et al., (1988) CABIOS, 4: 11-17), FASTA (Pearson et al., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 63-98) i gapped BLAST (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402) takođe su korisni za ove svrhe. Nadalje, Dali server sa European Bioinformatics institute nudi podvlačenja sekvenci na bazi strukture (Holm (1993) J. Mol. Biol., 233: 123-38; Holm (1995) Trends Biochem. Sci., 20: 478-480; Holm (1998) Nucleic Acid Res., 26: 316-9).

[0136]Višestruko poravnavanje sekvenci i kalkulacije pocenta identiteta mogu se odrediti primenom standardnih BLAST parametara, (primenom sekvence iz svih dostupnih organizama, matriks Blosum 62, rashod praznine: postojanje 11, produženje 1). Alternativno, sledeći program i parametri mogu se upotrebiti: Program: Align Plus 4, verzija 4.10 (Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite). DNK upoređivanje: Globalno upoređivanje, Standardi Linearni matriks ocenjivanja, Neslaganje penala = 2, penali otvorene praznine = 4, penali prošerene praznine = 1. Upoređivanje amino kiseline: Globalno upoređivanje, BLOSUM 62 matriks ocenjivanja.

[0137]Prema tome uključeni u ovaj opis su varijante naznačenih ili datih sekvenci, sve dok varijanto oligopeptidno jedinjenje zadržava funkcionalnu aktivnost roditeljske tj. varijante su funkcionalno ekvivalentne, drugim rečima imaju ili pokazuju aktivnost roditeljskog jedinjenja kako je ovde definisano (npr. inhibitorni efekat na rast i/ili vijabilnost kancera i/ili mikrobnih ćelija, citotoksična aktivnost, anti-tumor ili anti-bakterijska aktivnost itd. Takve varijante mogu da obuhvataju amino kiselinske supstitucije, dodatke ili delecije (uključujući skraćenja na jednom ili oba kraja) roditeljske sekvence npr. jedne ili više npr. 1 do 6 amino kiselina.

[0138]Takođe su uključeni funkcionalno-ekvivalentni derivati u kojima su jedna ili više amino kiselina hemijski derivatizovane, npr. supstituisane hemijskom grupom.

[0139]Oligopeptidna jedinjenja mogu obuhvatati fragmente SEQ ID NO:l, 2, 40 ili 41 pod uslovom da jedinjenje zadržava potrebnu aktivnost. Fragmenti SEQ ID NO:l ili 2 mogu na primer biti od 7 do 14 ostataka u dužini, npr. 12 ili 13 ostataka u dužini. Fragmenti SEQ ID NO: 40 ili 41 mogu biti od 13 do 26 ostataka u dužini, npr. 13,14,15,16 ili 17 do 26 ostataka u dužini.

[0140]Kako je opisano u donjim Primerima, peptid iz SEQ ID NO: 40 je snažan katjonski peptid koji ima neto nalektrisanje pri pH 7.0 od 12 i visoku izoelektričnu tačku (pl) od 12.4. Poželjno je da jedinjenja ovog pronalaska, i samim tim i njene funkcionalno ekvivalentne varijante, uključujući njihove fragmente, imaju slične karakteristike. Drugim rečima, poželjno je da varijante, uključujući fragmente, zadržavaju fizičko-hemijske karakteristike roditeljskog jedinjenja. Takve karakteristike uključuju određenije da su katjonska. Peptid iz SEQ ID NO. 40 ima a-helikalnu strukturu. U određenim ostvarenjima, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu imati a-helikalnu strukturu, ali to nije esencijalna karakteristika; u drugim ostvarenjima jedinjenja mogu imati B-listastu strukturu, ili mogu imati drugu ili neurednu strukturu npr. a kalemastu, ili jedinjenje može imati a kompozitnu strukturu sa domenima različite strukture.

[0141]U poželjnim reprezentativnim ostvarenjima, jedinjenja ovog pronalaska, uključujući funkcionalno ekvivalentne varijante iz SEQ ID NO. 40, mogu imati jednu ili više od sledećih osobina: neto naelektrisanje pri pH 7.0 od 10-13, npr. 11-12.5;

pl od 12 do 13;

prosečnu hidrofilnost od 0.7 do 1.0 npr. 0.8 do 1.0;

odnos hidrofilnih ostataka/ukupan broj ostataka od 45-60%, npr. 46-58%, 48-58%, ili 50-56%.

[0142]Oligopeptidno jedinjenje prema ovom pronalasku može formirati deo veće jedinice, npr. može biti fuzionisano za polipeptid radi formiranja rekombinantnog fuzionog proteina ili ili prikačeni na skelu radi formiranja peptiddnog aptamera. Prema tome, fuzioni proteini ili aptameri koji su inkorporirani u oligopeptidno jedinjenje prema ovom pronalasku formiraju dalje aspekte prema ovom pronalasku. Još dalji aspekti uključuju farmaceutske kompozicije koje obuhvataju takve fuzione proteine ili aptamere i upotrebu takvih fuzionih proteina ili aptamera u terapiji ili u postupku tretiranja kako je ovde opisano.

[0143]Takođe je razmatranoin vitrodavanje oligopeptidnog jedinjenja, molekula nukleinske kiseline i/ili vektora kako je ovde definisano ćeliji ili ćelijskoj kulturi. Takviin vitropostupci mogu biti upotrebljeni u ispitivanji citotoksičnih efekata jedinjenja prema ovom pronalasku.

[0144]Pronalazak će detaljnije biti opisan u sledećim neograničavajućim Primerima, sa pozivom na sledeže crteže na kojima: Fig. 1 prikazuje efekat na preživljavanje ćelija nakon 24 sata tretiranja sa 96 sintetičkih peptida konstruisanih za skrining. Peptid iz SEQ ID NO. 40, inditifikovan kao "Peptid 1", rezultirao je sa najnižom apsorbancijom, pokazujući najniže preživljavanje ćelija (Peptid 1 je indikovan strelicom pored najkraćeg stuba na grafikonu sa Fig. 1). Fig. 2 prikazuje morfološke efekte određene lakom mikroskopijom na ćelijama nakon 20 minuta kultivisanja sa tri od 96 peptida. Fig. 3 prikazuje efekte na ćelije u monoslojnoj kulturi Peptida 1 u svim L-amino kiselinskim oblicima (SEQ ID NO. 40), Peptida 1 u retro-inverzo (ri) obliku, koji je sve D-amino kiseline u obrnutoj sekvenci (SEQ ID NO. 41) i Peptida 1 (SEQ ID NO. 40) u svim D-amino kiselinskim oblicima. Fig. 4 prikazuje MTT analize Peptida 1 na HFF1 (fibroblastima ljudske kožice) T986 (neuroblastoma), GaMG (glioblastoma) i A172 (glioblastoma) pri različitim peptid koncentracijama davanih u različitim vremenskim tačkama. Frakcija sa najnižim preživljavanjem primećena je za tumor ćelijske linije u poređenju sa HFF1 ćelijama. Fig. 5 prikazuje rezultati iz ogleda ŽIVE/MRTVE vijabilnosti dve normalne ćelijske linije (142 ćelije i HFF1 ćelije) kao i dve kancerogene ćelijska linije, 143 kanceroene ćelije i HOS sarkoma ćelijske linije) ćelije tretirane sa 2.5- to 30 u.g/ml Peptida respektivno. U poređenju sa normalnim ćelijskim linijama, snažna citotoksičan akcija primećena je za dve kancerogene ćelijske linije. Fig. 6 (A) prikazuje ćelijske slike elektronske mikroskopije visokim rezolucionim skeniranjem nakon tretiranja sa Peptidom 1. (B) prikazuje obeleženi N-terminalni deo peptida sa fluorescentnim tiocijanatom. Fig. 7 prikazuje da lokalna injekcija Peptida 1 unutar 4T1 tumora kod miševa indukuje jak rast-inhibitorni efekat 4T1 tumora. Fig. 8 prikazuje rezultate Kaplan Meier eksperimenata preživljavanja, poređenjem tretiranih i netretiranih životinja subkutano injektovan sa 4T1 kancerogenim ćelijama. Životinje su žrtvovane kada su pokazale vnakove sistemske bolesti, bazirane na ozbiljnim tumornim opterećenjem.

Fig. 9 prikazuje histološku analizu tumora iz Kaplan Meier eksperimenata preživljavanja.

Fig. 10 prikazuje 200nm lipozome koji su sadržani u različitim kompozicijama fosfolipida u lipidnom bi-sloju. Lipozomi su napunjeni sa a fluorescnentom bojom, a isticanje boje izmereno je nakon tretiranja Peptida 1 (Peptid X na Fig. 10). Boja se odnosi na fluorofor ANTX, i gasilac, DPX, a oslobađanje boje se odnosi na % ukupnog oslobađanja sa deterdžentom (Triton xl00). Fig. 11 prikazuje vremenski interval konfokalne mikroskopije koja vizulizuje prekidanje membrane i oslobađanje ds Red iz ćelija u različitim vremenskim tačkama. Bele streilce obeležavaju ćelije koje naprasno gube citoplazmični sadržaj ds Red izazvano prekidanjem membrane.

Fig. 12 prikazuje teoretsko objašnjenje za primećene efekte prekida membrane.

Fig. 13 prikazuje rezultate na rast tri soja bakterija kada su inkubirane sa i bez Peptida 1 tokom dva sata. Fig. 14 prikazuje neto naelektrisanje pri pH7.0 Peptida 1 od 12; izo-električnu tačku od 12.4; prosečnu hidrofilnost od 1; i odnos hidrofilnih ostataka/ukupan broj ostataka od 56%.

Primeri

Primer 1 - Inicijalno konstruisanje i skrining 96 peptida i efekti na preživljavanje kancerogene ćelije i

morfologija

Konstruisanje i proizvodnja Peptida

[0145]Mogući konzervirani elementi i aktivna mesta iz poznatih tumor supresora (videti Tabelu 2) su inditifikovani primenom programa za pretragu Expasy i Swissprot. 96 peptida je inditifikovano. TAT sekvenca je prikačena na N-terminal za intracelularnu dostavu. Peptidi su sintetizovani na Cambridge Peptidima (Cambridge, UK) i Genscript (NJ, USA). Svi su amidirani i acetilovani. Sintetizovani peptidi su rastvoreni u vodi do konačne koncentracije od 1 mg/ml.

Ćelijska kultura

[0146]Ćelijske linije U87, MCF7, SF295. T47D i 4T1 su dobijene iz tumor banke na Univerzitetu Bergen, Norvvav. Fibroblasti su dobijeni od zdravih donora. Sve ćelijske linije su uzgajane u DMEM (Sigma, St. Louis, MO, USA) koji sadrži 10% fetalnog govežeg seruma dopunjenog sa NEAA, 100 U/ml Pen/Strep i 400 u.M L-glutaminom, svi iz Cambrex (East Rutherford, NJ, USA). U svim eksperimentima 1 x IO<4>ćelije su distribuirane u ploču sa 96 bunarčića.

Ćelijsko preživljavanje

[0147]Rezultati preživljavanja ćelija u inicijalnom posmatranju glioma ćelijske linije u87 nakon 24 sata kultivisanja sa 96 peptida koji su inditifikovani prikazani su na Fig. 1. Tri peptida su pokazala da imaju obeleženi negativni efekat na vijabilnost kancerogene ćelije. Od njih Peptid 1 (SEQ ID NO. 41) je odabran za dalje ispitivanje. "Peptid 1" odgovara peptidnoj sekvence iz SEQ ID NO:l sa HIV-TAT sekvencom iz SEQ ID NO.36 na njenom N-terminalnom kraju.

Ćelijska morfologija

[0148]Ćelijska morfologija nakon 20 minuta kultivisanja sa tri 96 peptida određena je lakom mikroskopijom i vremenskom mikroskopijom, a rezultati su pokazani u Fig. 2. Rezultati pokazuju masivnu kontrakciju ćelijskih procesa i prisustvo piknotične ćelije, što ukazuje na ćelijsku smrt.

Peptidna stabilizacija

[0149]Glavni problem sa peptidima generalno je što su podvrgnuti proteolitičkoj degradaciji, naročito proteazom prisutnom u serumu. Pronalazači su stoga dizajnirali strategiju za stabilisanje peptida supstituisanjem L-amino kiseline sa D-amino kiselinom. Ispitivanja pokazuju dat peptidi nisu izgubili svoj efekat efekatu u medijumu suplementiranom sa serumom. Zapravo, peptidi su takođe rezistentni na proteolitičku degradaciju u tripsinu. Fig. 3 pokazuje efikasnost supstituisanih peptida u monoslojnim kulturama što pokazuje da supstituisani peptidi rade čak i bolje od originalnih peptida.

Primer2 - In vitroefekti Peptida 1 na kancerogene ćelije.

Ćelijska vijabilnost, poređenje između normalnih ćelija i kancerogenih ćelijskih linija in vitro. Ogled

MTT ćelijske vijabilnosti:

[0150]MTT (Tiazolil Blue tetrazolijum bromid) može biti upotrebljen za merenje ćelijske proliferacije u ispitivanjima koja tradicionalno koriste inkorporaciju radioizotopa kao merenje ćelijske divizije. MTT je žućkasti ratsvor i konvertovan je u vodo-nerastvorni MTT-formazan tamno plave boje mitohondrijalnim dehidrogenazama živih ćelija. Plavi kristali su rastvoreni sa zakišeljenim izopropanolom, a intezitet je izmeren kolorimetrično pri talasnoj dužini od 570nm (protokol za MTT ogled je upotrebljen u skladu sa instrukcijama proizvođača). Primenom ogleda MTT ćelijske vijabilnosti, poređenje je izvedeno između normalnih fibroblasta ljudske kožice (HFF1) i tri kancerogene ćelijske linije T986 (ćelije neuroblastoma), GaMG (glioblastom), i A172 (glioblastom). Pri koncentraciji od 20u.g/ml frakcija preživljavanja bila je između 19 i 43% nakon izlaganja Peptida 1 tokom 90 minuta. U poređenju, frakcija preživljavanja za normalne HFF1 ćelije bila je 58% što pokazuje jači efekat Peptida na kancerogene ćelije (videti Fig. 4).

Poređenje ćelijske vijabilnosti primenom molekularnih proba ( živ/ mrtav kit).

[0151]Kit za ŽIVU/MRTVU<®>Vijabilnost/Citotoksičnost upošljava fluorescnentu boju da odredi ćelijsku vijabilnost kod sisara. Kalcein AM i etidiujm homodimer-1 (EthD-1) nađeni su da su optimalne boje za ovu svrhu. Žive ćelije su izdvojene od mrtvih ćelija prisustvom intracelularne esteraza aktivnosti, određene enzimatičnom konverzijom ne-fluorescnentog kalceina AM do intenzivnog fluorescnentog kalceina. Kalcein, koji je polianjonska boja, je dobro zadržavan unutar živih ćelija proizvodeći intenzivnu uniformnu zelenu fluorescentnost. EthD-1 je ekskludiran netaknutim membranama vijabilnih ćelija, ali će ući u ćelije sa oštećenom ćelijskom membranom i vezati se za nukleinske kiseline, proizvodeći svetio crvenu fluorescenciju u mrtvim ćelijama. Protokol za primenu živ/mrtav kit dobijen je od proizvođača.

[0152]Da bi se kvantifikovala citotoksična akcija Peptida 1, 20 000 ćelija je smešteno u 24 bunarčića posuda sa više bunarčića. Nakon 48 sati, peptid 1 je dodat u bunarčiće pri koncentracijama koje se kreću od, 0.1 do 35u.g/ml. Nakon 1-3-6 sati ćelijska vijabilnost procenjena je primenom Molecular Probes ŽIV/MRTAV kitom. Ćelije su kratko oprane u fosfatnom puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS) nakon čega je dodato 10u.M EthD-1 i 5u.M kalceina u bunarčiće. Ćelije su zatim inkubirane inkubatoru sa kulturom tkiva na 37°C tokom 30 min.

[0153]Ćelije su zatim procenjene primenom invertnog fluorecentnog mikroskopa (Nikon Eclipse 2000E, Tokyo, Japan) opremljen sa FITC (zelena fluorescencija) i TRITC (crvena fluorescencija) filter optikama. Fluorescnente ćelije su zatim fotografisane na 100x uvećanju. Proporcija vijabilnih ćelija (ćelija sa zelenom fluorescencijom) i proporcija mrtvih ćelija (crvena fluorescencija) zatim su procenjene brojanjem 100 ćelija.

[0154]Kontrolne ćelije pokazale su konfluentni monosloj koji sadrže ćelije sa zelenom fluorescencijom. Nisu primećene ćelije sa crvenom fluorescnencijom što ukazuje na 100% vijabilnost (Fig. 5). Ista fluorescencija primećena je u ćelijama koje su primile 0.1,1, i 5 u.g/ml Peptida. Međutim neke crvene ćelije su primećene u monoslojevima koji su primili 10u.g/ml Peptida što ukazuje na blagu citotoksičnu akcija pri ovoj koncentraciji. Nasuprot tome, ćelije koje su primile 15u.g/ml Peptida pokazale su značajno veliku proporciju mrtvih ćelija (Fig. 5). Monoslojevi koji su primili 30u.g/ml Peptida pokazali su snažnu citotoksičnu akciju indikovanu sa blizu 100% mtrvih ćelija (videti Fig. 5).

[0155]Procenti živih i mrtvih ćelija u različitim koncentracijama pokazani su u Tabeli 3. Litička akcija Peptida desila se nakon 1 sata, a dalje promene nisu na 3 i 6 sati.

Morfologija

[0156]Elektronska mikroskopija visokog rezolucionog skeniranja pokazala je ukupnu dezintegraciju plazma membrane nakon peptidnog tretiranje ukazujući da peptid pokazuje snažnu citolitičku akciju koja utiče na plazma membranu (Fig. 6A). Detaljnom morfološkom analizomin vitro,postojalo je nekih dokaza ćelijske fragmentacije koja pokazuje indukciju apoptoze. Zbog toga, obeležen je N-terminalni deo peptida sa fluorescentnim tiocijanata (FITC) i tretiran njimain vitro.Imunofluorescencija kratko nakon tretiranja indikovaala je da su peptidi takođe akumulirani u nukleusu. Stoga postoje neki dokazi da peptidi takođe trigeruju apoptozu kroz interakcije sa nuklearnim proteinima. Kao što se može videti na Fig. 6B, Peptid 1 se takođe akumulira u nukleusu. Bazirani na morfološkim opservacijama učinjene na kulturi tkiva, takođe se može videti dokaz da peptid takođe trigeruje apoptozu.

Primer 3 -In vivoefekti Peptida 1 na kancerogene ćelije.

[0157]4T1 karcinom dojke je transplatabilna tumor ćelijska linija koja je veoma tumorgenična i invazivna i, za razliku od mnoih tumornih modela, može spontano da metastazira iz primarnog tumora u žlezde dojke na više udaljenih mesta uključujući limfne čvorove, krv, jetru, pluća, mozak, i kosti. 4T1 tumor ima nekoliko karakteristika koji ga čine pogodnim za eksperimentalni životinjski model za humani kancer dojki. Prvo, tumor ćelije se lako transplantiraju u žlezde dojki tako da primarni tumor raste na anatomski tačnom mestu. Drugo, kao i kod humanog raka dojki, 4T1 metastatična bolest se razvija spontano iz primarnog tumora. Takođe, progresivno širenje 4T1 metastaza u odvodne limfne čvorove i druge organe je veoma slično onom kod humanog kancera dojke. Ixl06 4T1 ćelije su injektovane subkutano unutar 12 ženki BALBc miševa. 6 životinja u tretiranoj grupi i 6 životinja u kontrolnoj grupi koja je primila izokrenutu peptidnu sekvencu. Kada su tumori dostigli veličinu od 0.8 cm, (nakon 10 dana) tumori su primili lokalne injekcije od 400u.g peptida davanih u 100u.l. Ukupna koncetracija davanih Peptida bila je 1200u.g. Tumori su zatim usnimljeni sa kaliperom svakog 4-tog dana.

Rats Tumora.

[0158]Kao što je prikazano na Fig. 7, lokalna injekcija Peptida unutar 4T1 tumora indukovala je jak rast-inhibitorni efekat 4T1 tumorain vivo.Tačke podataka predstavljaju prosečne vrednosti od šest životinja u kontrolnoj grupi i tretiranoj grupi.

Preživljavanje Životinja.

[0159]Izvedeni su Kaplan Meier eksperimenti preživljavanja, poređenjem tretiranih i netretiranih životinja subkutano injektovanih sa 4T1 kancerogenim ćelijama. Životinje su žrtvovane kada su životinje pokazale znakove sistemske bolesti, bazirane na ozbiljnim tumornim opterećenjem. Kao što se može videti na Fig. 8, tretirana grupa ima je značajnu prednost preživljavanja u poređenju sa netretiranom grupom. Tumori su sakupljeni za histološku analizu. Isečeni tumori su fiksirani u 4% puferovanom formaldehidom. Parafinom-utvrđene 5-u.m sekcije obojene su sa H&E. Ćelijske kulture su fiksirane u 4% PFA i usnimljene pod Nikon Eclipse TE2000-E fluorescencionom mikroskopu (Nikon, Tokyo, Japan). Kao što se može videti na Fig. 9, ozbiljna nekroza primećena je nakon masivne ćelijske smrti, ukazujući na snažnu citotoksičnu akciju Peptida.

Primer 4- In vitroiin vivoeksperimenti prekidanja membrana.

[0160]200nm lipozomi su pripremljeni koji sadrže različite kompozicije fosfolipida u lipidnom bi-sloju. Lipozomi su napunjeni sa fluorescnentom bojom, a isticanje boje izmereno je nakon tretiranja sa Peptidom 1 (Peptid X na Fig. 10). Boja se odnosi na fluorofor ANTX, i gasilac, DPX, a oslobađanje boje se odnosi na % ukupnog oslobađanja sa deterdžentom (Triton xl00). Kao što je prikazano na Fig. 10, Peptid 1 ima ozbiljnu funkciju kao prekidač vezikula, određenije ako su fosfolipidi negativno naelektrisani (PBPS:EYL; plavi simboli; S0.5 (za pola maksimalana efekat)= 8.5u.g/ml; 2,46u.M). Peptid je takođe imao neke efekte na neutralne (polarne) fosfolipide (EYL: zeleni simboli) ali ovaj efekat bio je manju od onog na negativno naelektrisanim fosfolipidima. Kontrolni peptid (peptid A) upotrebljen je kao referenca koja ima iszu veličinu ali različitu sekvencu. Peptid A nije imao efekte pri ispitnim koncentracijama.

[0161]Ćelije 4T1 karcinoma dojke su stabilno transfektovane, primenom lentivirusnog vektora, kako bi ispoljile fluorescnenti marker dsRed. Transfektovane ćelije akumuliraju dsRed u citoplazmi i može se lako videti pod fluorescnentim mikroskopom (videti Fig. 11). Ćelije su zatim izložene sa 20u.g/ml Peptida 1, a vremenska konfokalna mikroskopija izvođena je tokom perioda od 3 sata. Ovo ispitivanje omogućava direktnu vizualizaciju prekidanja membrane kod kancerogenih ćelija.

[0162]Fig. 12 prikazuje teoretsko objašnjenje za primećene efekte. Poznato je da kancerogene ćelije često imaju ćeljske membrane koje su negativno naelektrisane u poređenju sa normalnim ćelijama. Katjonski peptid će imati malo efekta na normalne ćelije koje imaju ćelijske membrane koje su manje naelektrisane u poređenju sa kancerogenim ćeljskim membranama, koje imaju više kiselih fosfolipida i fosfatidilserina na spoljašnjoj površini, najverovatnije zbog povećane flip-flop aktivnosti u fosfolipidnom bisloju. Peptid 1 se najverovatnije vezuje za negativno naelektrisan fosfolipid stvarajući rupe u fosfolipidnom bi-sloju. Kako su mnoe bakterijske ćeljske membrane negativno naelektrisane, takođe je procenjena akcija Peptida na razne bakterijske sojeve.

Primer 5-Efekti Peptida 1 na bakterije

[0163]Peptid 1 takođe pokazuje bakteriocidnu aktivnost, ubijajući bakterije unutar dva sata. Testirani sojevi su biliE. coli, S. aureusiEnterococcus.Ovo ukazuje da peptid takođe pokazuje litičku aktivnost i protiv Gram-pozitivne kao i Gram-negativne bakterije. Fig. 13 prikazuje rezultate kada su gore pomenuti sojevi bakterija inkubirani sa i bez Peptida 1 tokom dva sata.

Primer 6 - Fizičke karakteristike Peptida 1

[0164]Određeno je da neto naelektrisanje pri pH7.0 Peptida 1 iznosi 12; izo-električna tačka je 12.4; prosečna hidrofilnost je 1; i odnos hidrofilnih ostataka/ukupnog broja ostataka je 56%. Peptid 1 je prema tome jako katjonski i ima visoku izo-električnu tačku. Rezultati su pokazani u Fig. 14.

Diskusija

[0165]Eksperimenti pokazuju da se Peptid 1, i modifikovani peptidi baziraju na osnovu toga što su pokazali anti-tumoralne efekte na razne kancer ćelijske linijein vitrokao iin vivo.Štaviše, peptidi pokazuju veoma malu toksičnost na humane fibroblastein vitrokao i kod intraperitonealne injekcija kod miševa. Zapravo, nije primećena toksičnost injektovanjem 1000u.g peptida subkutano u 18gr, nod-scid miševima. Peptidi zaustavljaju rast više kancerogenih ćelijskih linijain vitro,pri čemu su normalne ćelije manje pogođene istim koncentracijama. Direktnom peptidnom injekcijom u čvrste tumore kod miševa, primećena je ozbiljna nekroza 24sata sa naknadnom inhibicijom rasta. Štaviše, ovo vodi do produženog preživljavanja životinja u poređenju sa netretiranim životinjama. Skenirajuća elektronska mikroskopija, kao i funkcionalna ispitivanja, pokazuju da peptid utiče na plazma membrane kancerogenih ćelija izazivajući prekid membrane. Štaviše, peptid se takođe translocira u nukleus trigerujući apoptoične mehanizme kod kancerogenih ćelija. Prema tome, Peptid 1, i njegove modifikacije, koje imaju nove sekvence, predstavljaju terapeutske molekule koji inhibiraju rast tumora raznih kancera (na primer, mozga, pluća, dojke i kolona). Rezultati takođe pokazuju jednostavnom manipulacijom, da se peptidi mogu stabilizovati (učiniti rezistentnim) za proteolitičku degradaciju koja dalje povećava njihov potencijal kao anti-tumor jedinjenja. Štaviše, rezultati pokazuju da peptidi pokazuju bakteriocidne efekte i na gram-pozitivne kao i gram negativne bakterije. Peptidi se stoga mogu koristiti protiv raznih bakterijskih infekcija kod ljudi.

Reference.

[0166]

1. Dunn GP, Bruce AT, Ikeda H, Old U, Schreiber RD. Cancer immunoediting: from

immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 2002;3:991-8.

2. Mocellin S, Rossi CR, Nitti D. Cancer vaccine development: on the way to break immune tolerance

to malignant cells. Exp Cell Res 2004;299:267-78.

3. Blattman JN, Greenberg PD. Cancer immunotherapy: a treatment for the masses. Science

2004;305:200-5. 4. Boman HG. Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Annu Rev Immunol 1995;13:61-92.

5. Hancock RE. Peptide antibiotics. Lancet 1997;349: 418-22.

6. Ganz T, Lehrer Rl. Antimicrobial peptides of vertebrates. Curr Opin Immunol 1998;10:41-4.

7. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002;415:389-95.

8. Ohsaki Y, Gazdar AF, Chen HC, Johnson BE. Antitumor activity of magainin analogues against

human lung cancer cell lines. Cancer Res 1992;52:3534-8

9. Chen Y, Xu X, Hong S, et al. RGD-Tachyplesin inhibits tumor growth. Cancer Res 2001;61:2434-8. 10. Street SE, Cretney E, Smyth MJ. Perforin and interferon-g activities independently control tumor

initiation, grovvth, and metastasis. Blood 2001;97:192-7.

11. Ellerby HM, Lee S, Ellerby LM, et al. An artificially designed pore-forming protein with anti-tumor

effects. J Biol Chem 2003;278:35311-6.

12. Leuschner C, Enright FM, Gawronska B, Hansel W. Membrane disrupting lytic peptide conjugates

destroy hormone dependent and independent breast cancer cells in vitro and in vivo. Breast Cancer Res Treat 2003; 78:17-27.

13. Papo N, Braunstein A, Eshhar Z, Shai Y. Suppression of human prostate tumor growth in mice by

a cytolytic D-, L-amino acid peptide: membrane lysis, increased necrosis, and inhibition of prostate-specific antigen secretion. Cancer Res 2004;64:5779-86.

14. Ganz T, Lehrer Rl. Defensins. Curr Opin Immunol 1994;6:584-9.

15. Epand RM, Vogel HJ. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim

Biophys Acta 1999;15:1-2.

16. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer

membranes by a-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. Biochim Biophys Acta 1999;1462:

17. Tossi A, Sandri L, Giangaspero A. Amphipathic, a-helical antimicrobial peptides. Biopolvmers 2000;55:4-30. 18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunol Rev 2004; 198:169-84. 19. Shai Y. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Biopolvmers 2002;66:236-48. 20. Papo N, Shahar M, Eisenbach L, Shai Y. A novel Ivtic peptide composed of D, L amino acids selectivelv kills cancer cells in culture and in mice. J Biol Chem 2003; 278:21018-23. 21. Zwaal RF, Schroit AJ. Pathophvsiologic implications of membrane phospholipid asvmmetrv in blood cells. Blood 1997;89:1121-32. 22. Zwaal RF, Comfurius P, Bevers EM. Surface exposure of phosphatidvlserine in pathological cells. Cell Mol Life Sci 2005;62:971-88. 23. Chen HM, Wang W, Smith D, Chan SC. Effects of the anti-bacterial peptide cecropin B and its analogs, cecropins B-l and B-2, on liposomes, bacteria, and cancer cells. Biochim Biophvs Acta 1997;1336:171-9. 24. Chan SC, Yau WL, Wang W, Smith DK, Sheu FS, Chen HM. Microscopic observations of the different morphological changes caused by anti-bacterial peptides on Klebsiella pneumoniae and HL-60 leukemia cells. J Pept Sci 1998;4:413-25. 25. Papo N, Shai Y. New Ivtic peptides based on the D, L amphipathic helix motif preferentiallv kili tumor cells compared to normal cells. Biochemistry 2003;42:9346-54. 26. Manno S, Takakuwa Y, Mohandas N. Identification of a functional role for lipid asymmetry in biological membranes: phosphatidylserine-skeletal protein interactions modulate membrane stability. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:1943-8. 27. Ellerby HM, Arap W, Ellerby LM, et al. Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides. Nat Med 1999;5:1032-8. 28. Baker MA, Maloy WL, Zasloff M, Jacob LS. Anticancer efficacy of magainin 2 and analogue peptides. Cancer Res 1993:53:3052-7.

Claims (15)

1. Oligopeptidno jedinjenje koje obuhvata: (i) sekvencu amino kiseline YGRKKRRQRRRGKTLRVAKAIYKRYIE (SEQ ID NO: 40; ili (ii) sekvencu amino kiseline koja ima najmanje 85% sekvencijalnog identiteta sa sekvencom SEQ ID NO:

40; u kojem jedinjenje iz (i) ili (ii) ima aktivnost u inhibiranju rasta i/ili vijabilnosti mikrobnih i kancerogenih ćelija, pri čemu oligopeptidno jedinjenje poželjno ima sekvencu SEQ ID NO: 40.

2. Oligopeptidno jedinjenje prema zahtevu 1, u kojem jedinjenje obuhvata jednu ili više D-amino kiselina, u kojem je jedinjenje poželjno inverzno jedinjenje koje sadrži sve D-amino kiseline.

3. Oligopeptidno jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 ili 2 u kojem jedinjenje ima jednu ili više od sledećih osobina: a) neto naelektrisanje pri pH 7.0 od 10-13, b) pl od 12 do 13; c) prosečnu hidrofilnost od 0.7 do 1.0 i/ili d) odnos hidrofilnih ostataka/ukupan broj ostataka od 45-60% .

4. Oligopeptidno jedinjenje prema svakom od zahteva 1 do 3 u kojem je jedinjenje anti-bakterijsko i citotoksično.

5. Oligopeptidno jedinjenje prema svakom od zahteva 1 do 4 koje je selektivno citotoksično za kancerogene ćelije, i/ili u kojem jedinjenje može smanjiti veličinu tumora.

6. Molekul nukleinske kiseline koji kodira sekvencu amino kiseline kako je definisano prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, ili komplement pomenutog molekula nukleinske kiseline.

7. Vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 6.

8. Izolovana ćelija koja je modifikovana uvođenjem molekula nukleinske kiseline ili vektora prema zahtevu 6 ili 7.

9. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata oligopeptidno jedinjenje ili molekul nukleinske kiseline prema svakom od zahteva 1 do 7, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

10. Oligopeptidno jedinjenje, molekul nukleinske kiseline ili kompozicija prema svakom od zahteva ldo 9 za upotrebu u terapiji, poželjno za upotrebu u borbi protiv mikrobne infekcije ili za upotrebu u tretiranju kancera; u kojem kada se koristi u tretiranju kancera, kancer je poželjno odabran između kancera mozga, pluća, dojke ili kolona ili melanoma i/ili u kojem je oligopeptidno jedinjenje, molekul nukleinske kiseline, kompozicija ili lekza lokalnu isporuku do kancera; ili u kojem kada se koristi za borbu protiv mikrobne infekcije, mikrobna infekcija je poželjno bakterijska infekcija.

11. Upotreba oligopeptidnog jedinjenja ili molekula nukleinske kiseline prema svakom od zahteva 1 do 9 u proizvodnji leka za borbu protiv mikrobne infekcije i/ili tretiranje kancera.

12. Proizvod koji obuhvata oligopeptidno jedinjenje, molekul nukleinske kiseline ili kompoziciju prema svakom od zahteva 1 do 9 i drugi terapeutski aktivni agens kao kombinovani preparat za odvojenu, simultanu ili sekvencijalnu upotrebu u inhibiranju vijabilnosti i/ili rasta kancerogenih ili mikrobnih ćelija.

13. Kit koji obuhvata oligopeptidno jedinjenje, molekul nukleinske kiseline ili kompoziciju prema svakom od zahteva 1 do 9 i drugi terapeutski aktivni agens.

14. Kit ili proizvod prema zahtevu 12 ili 13 u kojem je drugi terapeutski aktivni agens aktivan protiv kancerogenih ili mikrobnih infekcija ili kancera, i/ili u kojem je drugi terapeutski aktivni agens hemoterapijski agens, anti-neoplastični agens, antibiotik, ili antivirusni ili antigljivični agens.

15.In vitroiliex vivopostupak za inhibiranje vijabilnosti i/ili rasta mikroorganizma ili ćelije kancera, pri čemu pomenuti postupak obuhvata dovođenje u kontakt pomenutog mikroorganizma sa oligopeptidnim jedinjenjem, ili dovođenje u kontakt pomenute ćelije kancera sa oligopeptidnim jedinjenjem ili molekulom nukleinske kiseline, prema svakom od zahteva 1 do 6.