RS55042B1 - Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka - Google Patents

Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka

Info

Publication number
RS55042B1
RS55042B1 RS20160548A RSP20160548A RS55042B1 RS 55042 B1 RS55042 B1 RS 55042B1 RS 20160548 A RS20160548 A RS 20160548A RS P20160548 A RSP20160548 A RS P20160548A RS 55042 B1 RS55042 B1 RS 55042B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mouse
human
gene
light chain
endogenous
Prior art date
Application number
RS20160548A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Cagan Gurer
Andrew J Murphy
Karolina A Hosiawa
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS55042B1 publication Critical patent/RS55042B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Position Input By Displaying (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Electrochromic Elements, Electrophoresis, Or Variable Reflection Or Absorption Elements (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

OBLAST
[0001]Genetski modifikovani miševi koji obuhvataju nepreraspoređeni segment gena ljudskog X lakog lanca imunoglobulina (hV?0 i ljudskiXspojni segment gena( hJX)koji su funkcionalno povezani sa konstantnim regionom mišjeg kappa( X)lakog lanca Genetski modifikovani miševi koji ispoijavaju antitela koja obuhvataju laki lanac imunoglobulina izveden iz hVA,\ nJksekvencu i mišjegCXgena.
PRETHODNO STANJE TEHNIKE
[0002]Miševi koji ispoijavaju antitela koja su potpuno ljudska, ili delimično ljudska i delimično mišja, su poznati u ovoj oblasti. Na primer, transgenski miševi koji ispoijavaju potpuno ljudska antitela iz transgena koji sadrže ljudske gene promenljivog regiona imunoglobulina lakog i teškog lanca. Genetski modifikovani miševi koji sadrže zamenu endogenih mišjih segmenata gena promenljivog regiona teškog lanca (HCVR) i promenljivog regiona kapa (k) lakog lanca (LCVR) segmente gena sa ljudskim HCVR i LCVR segmentima gena i koji prave himerna antitela s himenim ljudskim/mišjim kapa lancem, takođe su poznati.
[0003]Laki lanci antitela se enkodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa: kapa (k) i lambda {?„). Laki lanci mišjeg antitela su primarnoktipa. Odnosk- prema/. upotrebi lakog lanca kod ljudi je oko 60:40, dok je kod miševa oko 95:5. Preferirana upotrebaklakih lanaca kod miševa je prema izveštajima zadržana kod genetski modifikovanih miševa sposobnih da ispolje potpuno ili delimično ljudska antitela Dakle, izgleda da su miševi koji ispoijavaju potpuno ili delimično ljudska antitela ograničeni u pogledu upotrebe promenljivog lambda lanca.
[0004]Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da se genenšu promenljivi regioni lambda lanca, bilo mišjeg ili ljudskog, za upotrebu za pravljenje proteina za vezivanje epitopa. Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike za miševima koji ispoijavaju potpuno ili delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu promenljivu upotrebu lambda (V>.) lanca.
[0005]Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da miševi koji ispoijavaju potpuno ili delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu upotrebu/. promenljivog (V?.). WO 00/26373 se odnosi na ispoljavanje ljudskog IgXlokusa od strane miševa.
[0006]WO 2010/039900 se odnosi na nokin (knock-in) nehumane ćelije i sisare koji imaju genom koji kodira himerne Ig lance i antitela i postupke za proizvodnju nokin ćelija i sisara Opisuje se nokin miš koji ima genom koji obuhvata ljudski VH segment, ljudski JH segment gena i ljudski DH segment gena i deo sinergijskog Ig lokusa teškog lanca, gde ljudski lokus teškog lanca zamenjuje sve ili deo endogenog lokusa teškog lanca tako da životinja može da proizvodi himerne teške lance. Kod specifičnih izvođenja mišji genom još obuhvata ljudski lgX lokus lakog lanca, ili njegov deo, i \ gX 3'LCR, gde ljudski\ gX lokuslakog lanca zamenjuje sve ili deo endogenog Ig lokusa lakog lanca
KRATK OPIS PRONALASKA
[0007]Ovaj je pronalazak u svom najširem smislu kao što je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima. Opisuju se genetski modifikovani miševi, embrioni, ćelije, tkiva, kao i konstrukti nukleinske kiseline za modifikovanje miševa, i postupci i jedinjenja za pravljenje i korišćenje istih. Miševi i ćelije koje generišu ljudskeXpromenljive regione u ovom kontekstu/, lakog lanca, od endogenog mišjeg lokusa lakog lanca, su takođe obezbeđeni kako je formulisano u patentnim zahtevima Takođe su opisani postupci za pravljenje antitela koja obuhvataju lambda promenljive regione Postupci za odabir teških lanaca koji se ispoijavaju sa poznatim lambda promenljivim regionima se takođe opisuju
[0008]Opisuju se himerni i ljudski proteini za vezivanje antigena (npr, antitela), i nukleinske kiseline koje ih kodiraju, koji obuhvata somatski mutirane promenljive regione, uključujući antitela koja imaju lake lance koji obuhvataju promenljivi domen izveden iz ljudskog V) i ljudskog Ja. segmenta gena spojenog na mišji konstantni domen lambda lakog lanca.
[0009]Ovaj pronalazak još daje miša koji obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (VH), raznovrsnih (DH) i spojnih (JH) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih VHlDM, i/ili Ju segmenata gena na endogenom mišjem [okusu imunoglobulina teškog lanca; i (b) endogeniX(lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski lambda promenljivi (hVA) i nepreraspoređeni ljudski lambda spojni (hJX) segment gena,
gde mišji obuhvata brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjegAalela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA. segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji lambda (CA) gen konstantnog regiona pomenute drugeVA-JA-CAskupine gena tako da miš ispoljava laki lanac izveden iz, hVA., hJA i mišjeg CA gena i pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2 4 mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca
[0010]Ovaj pronalazak još obezbeđuje: izolovanu ćeliju koja ispoljava laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CA gena, pri ćemu je ćelija iz, ili može se dobiti iz, miša prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, i pri čemu ćelija obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (VH), raznovrsnih (DH) i spojnih (JH) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih VH, DH, i/ili JHsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca; i (b) endogenomA(lambda) alelu lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski lambda promenljivi (hVA) i preraspoređeni ljudski lambda spojni (hJA) segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjegAalela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute mišje VA-JA-CA skupine gena, pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutomXalelu lakog lanca.
izolovanu mišju embrionsku matičnu (E3) ćeliju koja obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (Vrt), raznovrsnih (DH) i spojnih (J,,) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih VH. DH, i Jh segmenata gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina; i (b) endogeni A (lambda) alel lakog lanca obuhvata nepreraspoređeni ljudski promenljivi lambda (hVA) i nepreraspoređeni ljudski spojni lambda (hJA) segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, Va-Ja segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišjiCAkonstantni region gena pomenute mišjeVA-JA-CA skupine gena, pri ćemu se endogeni pojačavači Enh 2 4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca
mišji embrion koji obuhvata, napravljen iz, ili koji se može dobiti iz. pomenutu mišju ES ćeliju prema ovom pronalasku, pri čemu mišji embrion obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (VH), raznovrsnih (DH) i spojnih (JH) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih VH, DH, i JHsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina; i (b) endogeni X (lambda) alel lakog lanca obuhvata nepreraspoređeni ljudski promenljivi lambda (hVA) i nepreraspoređeni ljudski lambda spojni (hJA) segment gena, i brisanje prve VA-JA-CAskupine gena pomenutog endogenog mišjegXalela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JAsegmenata gena drugeVA-JA-CA skupinegena alela sa pomenutim ljudskim VA. i Ja. segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute mišje VA-JA-CA skupine gena, gde se endogeni pojačavači Enh 2 4 mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3 1 održavaju nedirnuti u pomenutomXalelu lakog lanca
hibridom koji ispoljava laki lanac izveden iz hV>„ hj/. i mišjeg Cagena pri čemu je hibndom iz. ili se može dobiti iz, miša prema ovom pronalasku, pri čemu ćelija obuhvata preraspoređeni ljudski VAi (a) zamenu jednog ili više promenljivih (VH), raznovrsnih (DH) i spojnih (JH) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili vi[e ljudskih VH, DH, i JHsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina; i (b) endogeniX(lambda) alel lakog lanca koji obuhvata preraspoređeni ljudski promenljivi lambda (hVA) i preraspoređeni ljudski spojni lambda (hJA) segment gena. i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg/.alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezane na nedirnuti mišji CA gen konstantnog regiona pomenute druge VA-JA-CA skupine gena, i pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3 1 održavaju nedirnuti u pomenutomA alelu lakog lanca; i
upotreba B ćelije prema ovom pronalasku da se napravi hibridom koji ispoljava laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CA gena pri čemu je hibridom iz, ili se može dobiti iz miša prema ovom pronalasku, pri čemu ova ćelija obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (VH), raznovrsnih (DH) i spojnih (JH) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih VH, DH, i Jusegmenata gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina; i( b)endogeni A (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata preraspoređeni ljudski promenljivi lambda (hVA) i preraspoređeni ljudski lambda spojni (hJA) segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute drugeVA-JA-CA skupine gena i pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2 4 mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom /.alelu lakog lanca
[0011]Ovaj pronalazak još obuhvata postupak za pravljenje antitela u mišu obuhvata: (a) izlaganje miša prema ovom pronalasku antigenu; (b) dozvoljavanje omogućavanje mišu da razvije odgovor imunog sistema na taj anigen; i (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje antigen, ili izolovanje iz miša (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, ili identifikovanje kod miša (b) sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje ovaj antigen, pri čemu ovo antitelo kod miša (b) sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje antigen, pri čemu antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CA gena
[0012]Opisana su antitela koja obuhvataju (a) promenljivi domen ljudskog teškog lanca (hV|-|) spojen na mišji konstantni region teškog lanca, i (b) ljudski VAspojen na mišji Cldomen; uključujući gde su jedan ili više promenljivih domena somatski mutirani, npr. tokom antitela ili odabira imune ćelije kod miša prema ovom pronalasku. Najvažniji nepreraspoređeni hVA i nepreraspoređeni hJA su funkcionalno povezani sa nedirnutim mišjimXkonstantnim regionom(CX)
[0013]Takođe je opisan i miš koji sadrži svoju klicinu liniju, na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, ljudskaXsekvenca promenljivog regiona lakog lanca, pri ćemu se ljudska lambda sekvenca promenljivog regiona ispoljava u lakom lancu koji obuhvata mišju sekvencu gena konstantnog lambda regiona imunoglobulina.
[0014]Endogeni mišji lokus lakog lanca jeXlokus.
[0015]U jednom varijantnom rešenju, mišu nedostaje endogena sekvenca promenljivog lakog lanca na endogenom mišjem lokusu lakog lanca.
[0016]U jednom varijantnom rešenju, svi ili pretežno svi endogeni mišji segmenti gena promenljivog regiona lakog lanca se zamene jednim ili više ljudskihXsegmenata gena promenljivog regiona
[0017]U jednom varijantnom rešenju, ljudska X sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata ljudsku JA sekvencu. U jednom varijantnom rešenju, ljudska JA sekvenca se bira iz grupe koja se sastoji od JA1, JA2, JA3, JA7, i njihove kombinacije.
[0018]U jednom varijantnom rešenju, ljudska A sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata fragment skupine A ljudskog lokusa lakog lanca U specifičnom varijantom rešenju, fragment skupne A ljudskog A lokusa lakog lanca se proteže od hVA.3-27 kroz hVA3-1
[0019]U jednom varijantnom rešenju, ljudskaAsekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata fragment skupine B ljudskog lokusa lakog lanca. U specifičnom varijantom rešenju, fragment skupne B ljudskog A lokusa lakog lanca se proteže od hVA5-52 kroz hVA1-40
[0020]U jednom varijantnom rešenju, ljudska A sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata genomski fragment skupine A i genomski fragment skupine B U jednom varijantnom rešenju ljudska A sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata najmanje jedan segment gena skupine A i najmanje jedan segment gena skupine B.
[0021]U jednom varijantnom rešenju, više od 10% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje dva hVA segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40. 5-45, i 9-49 U jednom varijantnom rešenju, više od 20% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje tri hVA segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom varijantnom rešenju, više od 30% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje četiri hVA segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49.
[0022][Brisano]
[0023][Brisano]
[0024][Brisano]
[0025][Brisano]
[0026][Brisano]
[0027][Brisano]
[0028][Brisano]
[0029][Brisano]
[0030][Brisano]
[0031][Brisano]
[0032][Brisano]
[0033][Brisano]
[0034][Brisano]
[0035][Brisano]
[0036][Brisano]
[0037][Brisano]
[0038]Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata nepreraspoređeni V/, i JA segment gena imunoglobulina funkcionalno povezan na mišji lokus lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji CAgen.
[0039]VA i JA segmenti gena su segmenti ljudskog gena
[0040]Endogeni mišji lokus lakog lanca je A lokus lakog lanca,
[0041][Brisano]
[0042][Brisano]
[0043]Miš još obuhvata i zamenu jednog ili više teških lanaca, V, D i/ili J segmenata gena sa jednim ili više ljudskih V, D, i/ili J segmenata gena na enodgenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca,
[0044][Brisano]
[0045]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata nepreraspoređen ljudski A segment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (VA) iAspojni segment gena (JA) na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji CA gen
[0046][Brisano]
[0047][Brisano]
[0048]Ovaj A lokus promenljivog gena lakog lanca ( "A lokus") obuhvata najmanje jedan hVA segment gena i najmanje jedan ljudski JA (hJA) segment gena. U još jednom varijantnom rešenju, A lokus obuhvata najviše četiri hJA segmenta gena
[0049]U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata više hVA U jednom varijantnom rešenju, više hVA se bira tako da se kao rezultat dobije ispoljavanje A repertoara promenljivog regiona lakog lanca koje odražava oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%. oko 70%, oko 80%. ili oko 90% ili više, upotrebe VA primećene kod čoveka U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata segmente gena hVA 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, i njihovu kombinaciju
[0050]U jednom varijantnom rešenju, hVA obuhvata 3-1. 4-3. 2-8, 3-9, 3-10. 2-11, i 3-12. U specifičnom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog A lakog lanca koja se prostire od VA3-12 do VA3-1. U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata barem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 hVA. U jednom varijantnom rešenju. hVA obuhvata 3-1.4-3, 2-8, 3-9 3-10. 2-11. i 3-12 U specifičnom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog A lokusa koji se prostire od VA3-12 do VA3-1. U specifičnom varijantnom rešenju. endrogeni v lokus se briše delimično ili potpuno
[0051]U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata 13 do 28 ili više hVAs. U specifičnom varijantnom rešenju, hVA obuhvata 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25. i 3-27 U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeniklokus se briše delimično ili potpuno
[0052]U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvatas 29 do 40 hVA U jednom specifičnom izvođenju, cela ili pretežno cela sekvenca između hVA1-40 i hVA3-29 genetski modifikovanom mišu obuhvataju u suštini ljudskuA sekvencuod približno 959 bp pronađenu u prirodi (npr,. u ljudskoj populaciji) nizvodno od hVA1-40 segmenta gena (nizvodno od 3' neprevedenog dela), mesto reakcije enzima (npr., Pl-Scel), posle čega sledi ljudska A sekvenca od približno 3.431 bp uzvodno od hVA3-29 segmenta gena pronađenog u prirodi. U specifičnom izvođenju, endogeni mišji k lokus se briše delimično ili potpuno.
[0053]VA lokus obuhvata najmanje jedan hJA. U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata više hJA. U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata najmanje 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 hJA U specifičnom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata četiri hJA. U specifičnom varijantnom rešenju, četiri hJA su hJA1, hJA2, hJA3, i hJA7. U jednom varijantnom rešenju, VA lokus obuhvata jedan hJA U specifičnom varijantnom rešenju, hJAje hJA1. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni k- lokus se briše delimično ili potpuno.
[0054]VA lokus obuhvata najmanje jedan hVA, najmanje jedan hJA, i nedirnuti mišji CA gen. U specifičnom varijantnom rešenju, nedirnuti mišji CA gen jeCA2
[0055][Brisano]
[0056]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata zamenu endogenih mišjih V/. segmenata gena na endogenom mišjem A lokusu sa jednim ili više ljudskih VA segmenata gena na endogenom mišjem A lokusu, pri čemu su hVA segmenti gena funkcionalno povezani na nedirnuti mišji CA gen regiona, tako da miš preraspoređuje hVA segmente gena i ispoljava reverzni himerni iaki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen i mišjiCX.U specifičnom varijantnom rešenju, nedirnuti mišji CX gen je CA2 U jednom varijantnom rešenju, 90-100% nepreraspoređenih mišjih VA segmenata gena se zameni najmanje jednim nepreraspoređenim hV/.segmentom gena U specifičnom varijantnom rešenju, V/,. segmenti gena se zamene najmanje jednim nepreraspoređenim hV?, segmentom gena U jednom varijantnom rešenju, zamena je sa najmanje 12, najmanje 28, ili najmanje 40 nepreraspoređenih hVA segmenata gena. U jednom izvođenju, zamena je sa najmanje 7 funkcionalnih nepreraspoređenih hVA segmenata gena, najmanje 16 funkcionalnih nepreraspoređenih hVA segmenata gena, ili najmanje 27 funkcionalnih nepreraspoređenih hVA segmenata gena U jednom izvođenju, miš obuhvata zamenu svih mišjih JA segmenata gena sa najmanje jednim nepreraspoređenim hJA segmentom gena U jednom varijantnom rešenju, najmanje jedan nepreraspoređeni hJA segment gena se bira iz JA1. JA2. JA3, JA.4, JA5, JA6. JA7, i njihove kombinacije U specifičnom izvođenju, jedan ili više hVA segment gena se bira iz 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14. 3-16, 2-18. 3 19. 3 21, 3-22. 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44. 45-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51. a 5-52 hVA segment gena. i njihove kombinacije. U specifičnom varijantnom rešenju, najmanje jedan neprerasporešeni hJA segment gena se bira iz JA1, JA2. JA3, JA7, i njihove kombinacije
[0057][Brisano]
[0058][Brisano]
[0059][Brisano]
[0060][Brisano]
[0061][Brisano]
[0062][Brisano]
[0063]Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata ne više od dva alela lakog lanca, pri čemu aleli lakog lanca obuhvataju (a) nepreraspoređeni ljudski imunoglobulin VA i JA segment gena na endogenom mišjem lokusu lakog lanca koji obuhvata mišjiCAgen; i, (b) nepreraspoređeni Vj_ i J|_ segment gena imunoglobulina na endogenom mišjem lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji C|_ gen
[0064]U jednom varijantnom rešenju, endogeni mišji lokus lakog lanca je k lokus. U drugom varijanom izvođenju, endogeni mišji lokus lakog lanca je A lokus.
[0065]U jednom varijantnom rešenju, ne više od dva alela lakog lanca se bira izkalela iAalela, i dva X alela.. U jednom specifičnom varijantnom rešenju, jedan od dva alela lakog lanca jeA alelkoji obuhvata CA2 gen.
[0066][Brisano]
[0067]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata jedan funkcionalni lokus lakog lanca imunoglobulina i jedan nefunkcionalni lokus lakog lanca, pri ćemu funkcionalni lokus lakog lanca obuhvata nepreraspoređeni ljudski imunoglobulin VA i JA segmenta gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišjiCAgen U jednom varijantnom rešenju. nedirnuti CA gen jeCA2.
[0068]Miš još obuhvata barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina. U jednom varijantnom rešenju, barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina obuhvata ljudski VH segment gena, ljudski DH segment gena i ljudski JH segment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata ljudski gen teškog tanca koji ispoljava ljudski /mišji teški lanac U specifičnom varijantnom rešenju. miš obuhvata dva alela teškog lanca imunoglobulina, i miš ispoljava ljudski/mišji teški lanac
[0069][Brisano]
[0070]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata prvi alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVKi nepreraspoređeni hJK, na endogenom mišjemklokusu koji obuhvata endogeni Ck gen; i na drugom alelu lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVA i nepreraspoređeni hJA, na endogenom mišjemAlokusu koji obuhvata nedirnuti endogeni CA gen kako je formulisano u patentnim zahtevima. U specifičnom varijantnom rešenju, prvi i drugi alel lakog lanca su jedini funkcionalni aleli lakog lanca genetski modifikovanog miša. U jednom varijantnom rešenju, endogeni CA gen je CA2
[0071]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata šest alela imunoglobulina, pri čemu prvi alel obuhvata nepreraspoređeni VA i JA segment gena imunoglobulina na endogenom mišjem K lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen, drugi obuhvata nepreraspoređeni Vk- i Jk segment gena imunoglobulina na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ck gen, treći obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin VA i JA segment gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji CA kako je formulisano u patentnim zahtevima, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni Vhi Dhi Jhsegment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata mišji gen teškog lanca, i šesti obuhvata bilo (a) nepreraspoređeni imunoglobulin VA i JA segment gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CAgen, (b) A lokus koji je nefunkcionalni, ili (c) brisanje u celini ili delimično A lokusa.
[0072]U jednom varijantnom rešenju, prvi alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA U jednom varijantnom rešenju, drugi alel obuhvata nepreraspoređeni hVKi hJK Treći alel obuhvata nepreraspoređeni hVAi hJA. U jednom varijantnom rešenju. četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni hVn i hDn i hJ|-|. U jednom varijantnom rešenju, šesti alel obuhvata endogeni mišjiAlokus koji je funkcionalno
[0073]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata šest alela imunoglobulina, pri čemu prvi alel obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin VA i JA segment gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata nedirnuti mišji CA gen. drugi obuhvata nepreraspoređeni imumoglobulin VA i JA segment gena na endogenom mišjemA lokusulakog lanca koji obuhvata mišji CA gen, treći obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin Vki Jksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ck-gen, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni VHi Dhli JH segment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata mišji gen teškog lanca i šesti obuhvata bilo (a) nepreraspoređeni imunoglobulin Vki Jksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen, (b)klokus koji je nefunkcionalan, ili (c) brisanje jednog ili više elemenataklokusa,
[0074]U jednom varijantnom rešenju, prvi alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA segment gena. U jednom varijantnom rešenju, drugi alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA segment gena. U jednom varijantnom rešenju, treći alel obuhvata nepreraspoređeni hVi< i hJksegment gena. U jednom varijantnom rešenju, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni hVn i hDn i hj|-| segment gena. U jednom varijantnom rešenju, šesti alel obuhvata endogeni mišji k lokus koji je funkcionalno neaktivan
[0075]U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš obuhvata B ćeliju koja obuhvata preraspoređeni gen antitela koji obuhvata preraspoređeni hVA domen funkcionalno povezan na nedirnuti mišji CA domen. U specifičnom izvođenju, mišjiCAdomen je izveden izCA2gena
[0076]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređeni ljudsku VA-JA sekvencu i mišju CA sekvencu
[0077][Brisano]
[0078][Brisano]
[0079][Brisano]
[0080][Brisano]
[0081][Brisano]
[0082][Brisano]
[0083][Brisano)
[0084][Brisano]
[0085]Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac izveden iz hVA. hJA i mišji CAgen. U specifičnom varijantnom rešenju, CA domen je CA2 U specifičnom varijantnom rešenju, antitelo još obuhvata teški lanac koji obuhvata promenljivi domen izveden iz ljudskog V, ljudski D i ljudski J segment gena, i konstantni domen teškog lanca izveden iz mišjeg gena konstantnog domena teškog lanca. U jednom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata spoj-CH2-CH3sekvencu konstantnog domena teškog lanca U jednom varijantnom rešenju, rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CHrspoj-CH;rCH3sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH,-CH2-CH3-CHrt sekvencu konstantnog domena teškog lanca U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH2-CH3-CH4sekvencu konstantnog domena teškog lanca
[0086][Brisano]
[0087]U jednom varijantnom rešenju, miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenikpromenljivi region lakog lanca imunoglobulina koji obuhvata ljudskuVA/JAsekvencu izabranu iz 3-1/1. 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1. 3-9/1. 3-10/1, 3-10/3. 3-10/7, 2-14/1. 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1,1-44/7,5-45/1. 5-45/2, 5-45/7 7-46/1, 7-46/2. 7-46/7, 9-49/1. 9-49/2. 9-49/7i 1-51/1.
[0088]Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata (a) teški lanac koji obuhvata promenljivi domen teškog lanca izveden iz nepreraspoređenog segmenta gena promenljivog regiona teškog lanca, pri čemu teški lanac spaja na mišji konstantni region teškog lanca (Ch); i, (b) laki lanac obuhvata promenljivi domen lakog lanca izveden iz nepreraspoređenog hVA1hJA. pri čemu se promenljivi domen lakog lanca spoji na mišjiCkregion.
[0089][Brisano]
[0090]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata (i) lokus teškog lanca koji obuhvata zamenu svih ili pretežno svih svih funkcionalnih endogenih mišjih V, D 1 J segmenata gena sa svim ili pretežon svim funkcionalnim ljudskim V, D, i J segmentima gena. mišji Chgen, (11) prviklokus lakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih V/. 1 JA segmenata gena sa svim, pretežnom svim, ili više, funkcionalnih hVA i hJA segmenata gena,1nedirnutim mišjim CAgenom, (lii) drugoklokus lakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih V?. i JA. segmenata gena sa svim, pretežno svim, ili više, funkcionalnih hVA i hJA segmenata gena, i nedirnutim mišjimCAgenom. U specifičnom varijantnom rešenju, nedirnuti mišji CA gen je CA2
[0091]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata brisanje Ck: gena i/ili Vki/iIi Jk segmenta gena U jednom izvođenju, miš obuhvata nefunkcionalniklokus lakog lanca
[0092]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava antitelo gde je više 10 % više od 15%, više od 20%, više od 25%, više od 30% više od 35%, više od 40%, više od 60%, više od 70%, više od 80%, ili više od 90% ukupnog IgG antitela proizvedenog od strane miša obuhvata A-izvedeni promenljivi domen, i pri čemu miš ispoljava antitela koja obuhvatajuK-izveden promenljivi domen spojen sa mišjim Ckregionom. U specifičnim varijantnim rešenjima, oko 15-40%. 20-40%, 25-40%. 30-40%, ili 35-40% ukupnog antitela proizvedenog pomoću miša obuhvata A-izvedeni promenljivi domen.
[0093]U jednom varijantnom rešenju, A-izvedeni promenljivi domen se izvodi iz hVA i hJA U specifičnom varijantnom rešenju, A-izvedeni promenljivi region je u lakom lancu koji obuhvata mišji CA region. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, CA region je CA2 region. Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt koji obuhvata uzvodni homologm krak i nizvodni homologni krak pri ćemu uzvodni i nizvodni homologni kraci ciljaju konstrukt na mišjemu lokusu, i taj konstrukt obuhvata funkcionalni nepreraspoređeni hVA, segment i funkcionalni nepreraspoređeni hJA segment, i sekvencu odabira ili marker sekvenvcu.
[0094]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišje/.sekvence uzvodno od mišjeg V/.2, odabir kasete prirubnih 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombinaze, i ciljajućim krakom za ciljanje mišje/.sekvence 3' mišjeg JA2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed Hyg-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata mišji C/,2,J/.4, Ck4i mišji pojačavač 2 4
[0095]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegklokusa u vezi sa V/.1 kasetom odabira prurubnih 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišje/, sekvence 3' u vezi sa mišjim JA.1. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je kaseta neomicina u tečnom kiseoniku U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata mišji/. 3'pojačavač i mišjik3' pojačavač 3 1.
[0096]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegklokusa u vezi sa V7.2, kasetu odabira prurubnim 5" i 3' sa mestima prepoznavanja rekombinaze. i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišje/.sekvence 3' u vezi sa mišjim J/.2 i 5' u vezi sa mišjim Ck2. U jednom varijantnom rešenju. kaseta odabira je Frt'ed higromicin-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata mišjeC/.2-J/.4-C/.4segmente gena i mišjikpojačavač 2.4.
[0097]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljajući mišjiklokus 5' u vezi sa V/.2, selekcijom kasete prirubne 5' i 3' sa mesta prepoznavanja rekombinaze, ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskogklokusa lakog lanca od hVX3-12 nizvodno do kraja hJ/.1, i 3' ciljajući krak za ciljanje mišjeksekvence 3' u vezi sa mišjim JA.2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed kaseta neomicina U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljni krak obuhvata mišje C/.2-JX4-CX4 segmente gena i mišjikpojačavač 2.4.
[0098]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskogklokusa lakog lanca, od hVA,3-12 nizvodno do kraja hV/.1
[0099]Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5 do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegklokusa 5' u vezi sa V/,2, kasetom odabira prirubnu 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombinaze, ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskogklokusa lakog lanca od hVA3-27 nizvodno do kraja hV/,2-8 U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed higromicin kaseta. U jednom varijantnom rešenju, ljudski genomski fragment obuhvata 3' ciljajući krak. U specifičnom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata oko 53 kb ljudskogklokusa lakog lanca od hV?,3-12 nizvodno do kraja hJ/,2-8.
[0100]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog/. lokusa lakog lanca od hV/„3-27 donjeg toka do kraja hV>.3-12.
[0101]Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, cijajući krak za ciljanje mišjegklokusa 5' u vezi sa Vž.2. kaseta odabira je prirubna 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombianze, prvi ljudski genomski fragment obuhvata dodirni region ljudskog k lokusa lakog lanca od hV/_5-52 nizvodno prema kraju hVX1-40, mesto ograničenja enzima, i drugi ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskogklokusa lakog lanca od hV/,3-29 nizvodno prema kraju hVX82K. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed kaseta neomicina U jednom varijantnom rešenju. mesto ograničenja enzima je mesto za homing endonukleazu. U specičnom varijantnom rešenju. homing endonukleaza je Pl-Scel U jednom varijantnom rešenju, drugi ljudski genomski fragment je 3' ciljajući krak U specifičnom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata oko 27 kb ljudskogklokusa lakog lanca od h/.3-29 nizvodno do kraja hV/.82K
[0102]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskogklokusa lakog lanca od hVX5-52 donjeg toka do kraja hV/.1-40
[0103]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegklokusa 5' u vezi sa endogenim Vk segmentima gena, dva podređena mesta prepoznavanja rekombinaze, kaseta odabira 3' prema podređenim mestima prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajući krak za ciljanje mišjeksekvence 5' u vezi sa k segmentima gena promenljivog lakog lanca, U jednom varijantnom rešenju, suprotstavljena mesta prepoznavanja rekombinaze su suprotno usmerena jedna prema drugim, U specifičnom varijantnom rešenju, mesta prepoznavanja rekombinaze su različita. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, mesta prepoznavanja rekombinaze sutoxPmesto i /ox511 mesto U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je kaseta neomicina
[0104]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegklokusa 5' u vezi sa mišjim Jksegmentima gena, kasetom odabira, mestom prepoznavanja rekombinaze 3' a kaseti odabira, i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišjeksekvence 3' u vezi sa mišjim Jksegmentima gena i 5' na mišjemkintronskom pojačavaču. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je higromicin-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze je u istom smeru prema transkripciji kao ova kaseta odabira. U specifičnom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze je /oxP mesto
[0105]Takođe, opisan je izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, prvi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 5' endogenih mišjih Vksegmenata gena, prvo mesto prepoznavanja rekombinaze drugo mesto prepoznavanja rekombinaze, i drugi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 3' endogenih mišjih Jk segmenata gena i 5' mišjegkintronskog pojačavača.
[0106]Takođe je opisan, genetski modifikovan miš. pri čemu genetska modifikacija obuhvata modifikaciju sa jednim ili više DNK konstrukata opisanih iznad ili ovde
[0107]Takođe je opisana, upotreba izolovanog DNK konstrukta da se napravi miš kako je ovde opisano. Takođe je opisana upotreba opisanog DNK konstrukta kako je ovde opisan u postupku za pravljenje proteina koji vezuje antigen
[0108]Takođe je opisana matična nehumana ćelija koja obuhvata ciljajući vektor koji obuhvata DNK konstrukt kako je opisano gore i ovde. Takođe je opisana matična nehumana ćelija, pri ćemu je nehumana matična ćelija izvedena iz mišje ovde opisane
[0109]U jednom varijantnom rešenju, nehumana matična ćelija je embrionska matična (ES) ćelija. U specifičnom varijantnom rešenju, ova ES ćelija je mišja ES ćelija
[0110]Takođe je opisana upotreba nehumane matične ćelije kako je opisano ovde da se napravi mišja kako je ovde opisano Takođe je opisana upotreba matične ćelije koja nije ljudska kako je opisano ovde da se napravi protein koji vezuje antigen
[0111]Takođe je opisan mišji embrion, pri ćemu mišji embrion obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisan je domaćin mišjeg embriona koji obuhvata ES ćeliju donatora, pri čemu ES ćelija donator obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano U jednom varijantnom rešenju, mišji embrion je embrion u fazi pre-morule 't.j pre-blastulacije (korak koji prethodi formiranju embriona) U specifičnom varijantnom rešenju, embrion u fazi pre morule je embrion u fazi od 4-ćelije ili embrion u fazi od 8 ćelija. U drugom specifičnom varijantnom rešenju mišji embrion je blastocist.
[0112]Takođe je opisana upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisan da se napravi miš kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisana je upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen
[0113]Takođe je opisana, nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetski modifikovanog miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je B ćelija U jednom varijantnom rešenju, ćelija je hibridom. U jednom varijantnom rešenju, ćelija kodira promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina i/ili promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina koji je somatski mutiran
[0114]Takođe je opisana, nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetski modifikovanog miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je B ćelija, U jednom varijantnom rešenju. ćelija je hibridom. U jednom varijantnom rešenju, ćelija kodira promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina i/ili promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina koji je somatski mutiran
[0115]Takođe je opisana upotreba nehumane ćelije kako je opisano ovde da se napravi mišja kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisuje se upotreba nehumane ćelije kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0116]Takođe je opisana mišja B ćelija koja ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata (a) promenljivi region izveden iz hVA segmenta gena i hJA segment gena; i, (b) mišji CA gen U specifičnom varijantnom rešenju, CAgen je CA2 U jednom varijantnom rešenju, mišja B ćelija još ispoljava poznati teški lanac koji obuhvata (c) promenljivi region izveden iz hVn, hDH, i fđl hJf-| segmenta. U jednom varijantnom rešenju, B ćelija ne obuhvata preraspoređeniAgen U drugom varijantnom rešenju, B ćelija ne obuhvata preraspoređeni k gen
[0117]Takođe je opisan postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) ispoljavanje genetski modifikovanog miša prema antigenu, pri ćemu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVAi barem jedan hJAna endogenom lokusu lakog lanca, pri čemu endogeni lokus lakog lanca obuhvata mišji CA gen; (b) čime se omogućava da genetski modifikovan miš razvije odgovor imunog sistema prema antigenu; i, (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša prema (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo prepoznaje laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišje CA gena
[0118][Brisano]
[0119][Brisano]
[0120]U jednom varijantnom rešenju. opisuje se postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) ispoljavanje genetski modifikovanog miša prema antigenu, pri čemu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVA na A lokusu lakog lanca i barem jedanJknaklokusu lakog lanca, pri čemuklokus lakog lanca obuhvata nedirnuti mišjiClgen; (b) što omogućava genetski modifikovanom mišu da razvije imuni odgovor prema antigenu; i. (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša prema (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje ovaj antigen, ili identifikovanje kod miša B sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje antigen, pri čemu ovo antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVA. hJA i mišjegCkgena,
[0121]Konstantni genk lakoglanca je nedirnuti mišji CA gen. U specifičnom varijantnom rešenju, nedirnuti mišji CAgen je odabran iz CA1, CA2 i CA3 U još specifičnijem varijantnom rešenju, mišji CA gen je CA2.
[0122]Takođe je opisan, postupak za pravljenje gena preraspoređenog antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata; (a) zlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVA i hJA na endogenom lokusu lakog lanca, pri čemu lokus lakog lanca obuhvata mišji CA gen ili njegov funkcionalni fragment; i. (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina kod pomenutog miša, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata A segment gena promenljivog regiona lakog lanca i CA gena ili njegov funkcionalni fragment
[0123]U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz antitela koje obuhvata ljudski VA i mišji CA
[0124] [Brisano]
[0125][Brisano]
[0126] [Brisano]
[0127] [Brisano]
[0128]U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje preraspoređenog gena antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVAi hJA, na mišjemAlokusu lakog lanca, pri čemua.lokus lakog lanca obuhvata nedirnuti mišji CAgen; i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina u pomenutom mišu, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata A segment gena promenljivog regiona lakog lanca i CA gena
[0129]Konstantni gen A lakog lanca je nedirnuti mišji CA gen
[0130]U jednom varijantnom rešenju. postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz antitela koje obuhvata ljudski VAi mišji CA.
[0131]Takođe je opisan postupak za pravljenje antitela, obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigen, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koji specifično vezuje antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koji kodira teški lanac i preaspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koja kodira poznatu sekvencu promenljivog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline promenljivog domena teškog i lakog lanca spojene na ljudske konstantne domene da se napravi željeno antitelo, pri čemu željeno antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata VA domen spojen na CLdomen. VA domen je ljudski i Cldomen je mišji CA domen
[0132][Brisano]
[0133]U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje antitela, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisan antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koje specifično vezuje antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koji kodira promenljivi domen teškog lanca i preraspoređenu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznatu sekvencu promenljivog domena lakog lanca antitela pri čemu antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline spojene na sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski konstantni domen teškog lanca i ljudski konstantni domen lakog lanca da se napravi antitelo izvedeno iz ljudskih sekvenci, pri čemu antitelo koje specifično vezuje ovaj antigen obuhvata laki lanac koji obuhvata ljudski VA domen spojen na mišji CA region
[0134]U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CA region se bira iz CA1, CA2 i CA3. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CA region je CA2
[0135]U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela koji obuhvata (a) izlaganje miša kako je opisano ovde antigenu, (b) omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema; (c) određivanje ćelije kod miša koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira preraspoređen ljudsku sekvencu VA domena spojenu sa mišjim CA domenom, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski VH domen i mišji CHdomen, i pri čemu ćelija ispoljava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA domen i sekvence nukleinske kiseline kodira poznati ljudski VHdomen; i, (e) korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA domen i klonirane sekvence nukleinske kiseline ko|a kodira poznati ljudski VHdomen da se napravi potpuno ljudsko antitelo.
[0136][Brisano]
[0137]U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela koji obuhvata (a) izlaganje miša kako je opisano u ovom opisu antigenu; (b) omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema na antigen, (c) identifikovanje ćelije kod miša koja obuhvata DNK koja kodira preraspoređeni ljudski VA sekvencu domena spojenu na mišji CA domen, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski VH domen i mišji CHdomen, i pri čemu ćelija ispoljava antitelo koje vezuje taj antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira preraspoređeni ljudski VA domen i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VHdomen; i, (e) korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA. domen i kloniranu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VH domen da se napravi potpuno ljudsko antitelo U jednom varijantnom rešenju. mišji CAdomen je mišji C/,2
[0138]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava ljudski/.-izvedeni laki lanac spojen na endogeni konstantni region lakog lanca (CA), pri čemu miš, posle imunizacije sa antigenom, stvara antitelo koje obuhvata ljudski VA domen spojen na mišji CA domen U specifičnom varijantnom rešenju, CA domen je CA2.
[0139]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji obuhvata modifikovani endogeni a lokus lakog lanca kako je ovde opisano, koji ispoljava više A lakih lanaca imunoglobulina povezanih sa više teških lanaca imunoglobulina. U jednom varijantnom rešenju, teški lanac obuhvata ljudsku sekvencu U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca se bira iz promenljive sekvence, CH1. zgloba CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom varijantnom rešenju, više A lakih lanaca imunoglobulina sadrži sekvencu čoveka. U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca čoveka se bira iz promenljive sekvence. konstantne sekvence, i njihove kombinacije. U jednom varijantnom rešenju. miš obuhvata onemogućeni endogeni lokus imunoglobulina i ispoljava teški lanac iz transgena ili ekstrahromozomnog epizoma. U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata zamenu na endogenom mišjem lokusu nekih ili svih endogenih mišjih segmenata gena teškog lanca (t.j., V, D, J), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence konstantnog teškog lanca (npr., CH1 zglob, CH2, CH3, ili njihovu kombinaciju), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence lakog lanca (npr, V, J, konstantne, ili njihove kombinacije), sa jednom ili više sekvenci imunoglobulina čoveka
[0140]Takođe je opisan miš pogodan za pravljenje antitela koja imaju ljudski /.-izveden laki lanac pri čemu su sva ili pretežno sva antitela napravljena kod miša ispoljena sa ljudskim/.-izvedenim lakim lancem. U jednom varijantnom rešenju, ljudski/.-izveden laki lanac se ispoljava iz endogenog lokusa lakog lanca.
[0141]Takođe je opisan postupak za pravljenje/.-izvedenog lakog lanca za ljudsko antitelo, koje obuhvata dobijanje iz miša kako je ovde opisano sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca, i korišćenje sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca za pravljenje ljudskog antitela
[0142]Takođe je opisan, postupak za pravljenje proteina za vezivanje antigena, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema; i dobijanje iz miša proteina za vezivanje antigena koji veže antigen, ili dobijanje iz miša sekvence koju treba koristiti za pravljenje proteina za vezivanje antigena koji veže antigen
[0143]Takođe je opisana ćelija izvedena iz miša kako je ovde opisano U jednom varijantnom rešenju, ta ćelija se bira iz embrionske matične ćelije, višestruko jake ćelije, mdukovane višestruko jake ćelije, B ćelije, i hibridoma.
[0144]Takođe je opisana ćelija koja obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano U jednom varijantnom rešenju, ćelija je mišja ćelija, U jednom varijantnom rešenju, ćelija se bira iz hibridoma i kvadroma. U jednom varijantnom rešenju, ova ćelija ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata ljudsku a promenljivu sekvencu spojenu sa mišjomkkonstantnom sekvencom
[0145]Takođe je opisano tkivo izvedeno iz miša kako je ovde opisano
[0146]Takođe je opisana upotreba miša ili ćelije kako je ovde opisano da se napravi protein za vezivanje antigena. U jednom varijantnom rešenju, protein koji vezuje antigen je ljudski protein U jednom varijantnom rešenju, ljudski protein je ljudsko antitelo
[0147]Takođe se odnosi na protein za vezivanje antigena napravljen pomoću miša, ćelije, tkiva, ili postupka kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, protein koji vezuje antigen je ljudski protein. U jednom varijantnom rešenju, ljudski protein je ljudsko antitelo
[0148][Brisanoj
KRATAK OPIS SLIKA
[0149]
SL. 1pokazuje detaljnu ilustraciju, ne u razmen, ljudskogAlokusa lakog lanca uključujući skupine VA segmenata gena (A, B i C) i parove JA i CA regiona (J-C parove)
SL.2 pokazuje opštu opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenom mišu A lokus lakog lanca,
SL.3 pokazuje opštu opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenog miša« lokus lakog lanca,
SL.2 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri. strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenom mišu A lokus lakog lanca sa ljudskimAsekvencama lakog lanca uključujući 12 hVA segmente gena i hJA1 segmente gena(12/1-Aciljajućivektor).
SL. 4Bpokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri četiri prvobitna ciljna vektora za ciljanje endogenog mišjeg k lokusa lakog lanca sa ljudskimAsekvencama lakog lanca koje obuhvataju 12 hVA segmente gena, i hJA1 segment gena (12/1-kciljajući vektor), 12 hVA segmente gena i hJA1, 2, 3 i 7 segmente gena (12/4-kciljajući vektor). 12 hVA segmente gena, ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu i hJA1 segment gena (12(k)1-k ciljajući vektor) i 12 hVA segmente gena, ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu i hJA1, 2, 3 i 7 segmente gena (12(k)4-kciljajući vektor).
SL. 5Apokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strategije ciljanja za progresivno umetanje 40 hVA segmenata gena i jedan hJA segment gena u mišji A lokus lakog lancaSL. 5Bpokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljne strategije za progresivno umetanje 40 hVA segmenata gena i jedan hJA segment gena u mišjiklokus
SL.6 pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljnih koraka i koraka molekularnog inženjeringa korišćenih da se naprave jedinstveni ljudski A-khibridni ciljajući vektori za izgradnju hibridnog lokusa lakog lanca koji sadrži ljudsku k intergensku sekvencu, više hJA segmenata gena ili obaSL.7A pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strukture lokusa za modifikovani mišji A lokus lakog lanca koji sadrži 40 hVA segmente gena i jedan hJA segment gena funkcionalno povezan na endogeni CA2 gen
SL. 7Bpokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strukture lokusa za četiri nezavisna, mofifikovana mišjaklokusa lakog lanca koji sadrže 40 hVA segmenata gena i bilo jedan ili četiri hJA segmenta gena sa ili bez dodirne ljudske Vk-Jk genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni Ckgen.
SL. 8Apokazuje skice konture lgA<+>i lgK<+>splenocite usmerene na CD19<+>od miša divljeg tipa (VVT). mišjeg homozigota za 12 homozigota za 12 hVAi četiri hJAsegmenta gena koji obuhvataju ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (12hVA-VJK- 4Jk) i mišji homozigotni za 40 hVA i jedan hJA segment gena (40hVA-1hJA).
SL. 8Bpokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 12 hVAi četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (12hVA-VKjK-4hJA) i mišji homozigot za 40 hVA i jedan hJA segment gena (40hVA-1hJA)SL. 9A,na gornjem panelu, pokazuje iscrtanu konturu splenocita usmerenih na smglete i postavljene za B i T ćelije (CD19<+>i CD3+, respektivno) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKJK-4hJA) Donji panel pokazuje iscrtane konture splenocita usmerenih na CD19<+>i postavljenih za lgA+ i lgK+ iispoljavanje iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKjK-4hJA)
SL. 9Bpokazuje ukupan broj CD19<+>, CD19<+>lgK<+>i CD19<+>lgA<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKJK-4hJA)
SL. 9Cpokazuje iscrtanu konturu splenocita usmerenih na CD19<+>i postavljenih za imunoglobulin D
(IgD) i imunoglobulin M (IgM) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri Ja. segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (40hVA-VkJK-4hJA). Zrele (72 za VVT, 51 za 40hVA-VkJK-4riJA) i tranzicione (13 za VVT. 22 za 40hVA-VK-JK-4hJA) B ćelije su navedene na svakoj od iscrtanih kontura.
SL. 9Dpokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija, tranzicionih B ćelija (CD19<+>lgM<n>'lgD<l0>) i zrelih 8 ćelija (CD19<+>lgM'°lgD<ni>) u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri Ja segmenta gena uključujući ljudske Vk-Jkgenomske sekvence (40hVA-VK-Jk-4hJA).SL. 10A,na gornjem panelu, pokazuje iscrtanu konturu koštane srži postavljene za B i T ćelije (CD19<+>i CD3+, respektivno) iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVAi četiri JA. segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VkJK-4hJA). Panel na dnu, pokazuje iscrtanu konturu koštane srži usmerene na CD19+ i postavljene za ckit<+>i CD43 iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVAi četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKjK-4hJA). Pro i Pre B ćelije se označavaju na iscrtanoj konturi na donjoj ploči.
SL. 10Bpokazuje broj Pro (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i Pre (CD19<+>CD43- ckit) B ćelija u koštanoj srži prikupljenoj iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVAi četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKJk-4hJA)
SL. 10Cpokazuje iscrtanu konturu koštane srži na smgletima postavljenim za imunoglobulin M (IgM) i B220 od miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk- Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VK-JK-4hJA) Nezrele, zrele i pro/pre B ćelije su označene na svakoj od iscrtanih kontura
SL. 10Dpokazuje ukupan broj nezrelih (B220<int>lgM<+>) i zrelih (B220<ni>lgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanih iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri JA segmenata gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VkJK-4hJA)
SL. 10Epokazuje iscrtane konture koštane srži usmerene na nezrele (B220'<nt>lgM<+>) i zrele (B220<n>'lgM<+>) B ćelije postavljene za IgA i IgKispoljavanje izolovane iz butnih kostiju miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VkJK-4hJA).
SL.11 pokazuje poravnanje sekvence nukleotida V? -JA-Ck spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačanih iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske A sekvence gena lakog lanca na endogenom mišjemklokusu lakog lanca. A6 - ID BR SEK:57; B6 = ID BR SEK. 58. F6 = ID BR SEK:59; B7 - ID BR SEK:60; E7 = ID BR SEK:61; F7 = ID BR SEK 62; C8 - ID BR SEK 63; E12 - ID BR SEK;64; 1-4 = ID BR SEK:65; 1-20 = ID BR SEK:66; 3B43 = ID BR SEK 67; 5-8 = ID BR SEK:68; 5-19 = ID BR SEK:69; 1010 = ID BR SEK 70; 11A1 = ID BR SEK 71: 7A8 = ID BR SEK 72; 3A3 = ID BR SEK:73; 2-7 - ID BR SEK 74. Baze sa malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FWR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida hJX1 i miša Ck2 su označene na dnu poravnanja sekvence.
SL. 12pokazuje poravnanje sekvence nukleotida VA-JA-Ck spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačanih iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske A sekvence gena lakog lanca uključujući dodirnu ljudsku Ck-Jkgenomsku sekvencu na endogenom mišjemklokusu lakog lanca. 5-2 = ID BR SEK;87; 2-5 = ID BR SEK:88; 1-3 - ID BR SEK:89; 4B-1 - ID BR SEK 90; 3B-5 - ID BR SEK:91; 7A-1 - ID BR SEK:92; 5-1 = ID BR SEK 93; 4A-1 - ID BR SEK;94; 11A-1 - ID BR SEK:95; 5-7 = ID BR SEK;96; 5-4 = ID BR SEK:97; 2-3 = ID BR SEK 98 Baze napisane malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FVVR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida svakog ljudskog JA i mišjeg Cksu označene sa donje strane poravnanja sekvence.
SL. 13pokazuje poravnanje sekvence nukleotida VA-JA-Ck spoja tri nezavisna RT-PCR klona pojačana iz splenocita RNK miševa koji nose ljudskeAsekvence gena lakog lanca na endogenommišjem X lokusulakog lanca. 2D1 = ID BR SEK:101; 2D9 = ID BR SEK;102; 3E15 = ID BR SEK:103. Baze napisane malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FWR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida hJA1 i mišjeg CA2 su označene na dnu poravnanja sekvence
DETALJAN OPIS
[0150]Ovaj pronalazak u svom najširem smislu je kako je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima
[0151]Pojam "dodirno" obuhvata referencu na pojavu istog molekula nukleinske kisleine, npr.. dve sekvence nukleinske kiseline su "dodirne" ako se javljaju na istom nukleinskom molekulu ali su prekiute drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, preraspoređena V(D)J sekvenca je "dodirna" sa sekvencom gena konstantnog regiona, iako finalni kodon V(D)J sekvence nije neposledno praćen prvim kodonom sekvence konstantnog regiona. U drugom pnmeru, dve sekvence V segmenta gena su "dodirne" ako se jave na istom genomskom fragmentu, iako one mogu da budu odvojene sekvencom koja ne kodira kodon V regiona, npr. one mogu da budu odvojene regulatornom sekvencom, npr, promoterom ili drugom nekodirajućom sekvencom U jednom izvođenju, dodirna sekvenca obuhvata genomski fragment koji obuhvata genomske sekvence raspoređene kako se nalaze u genomu divljeg tipa.
[0152]Fraza "izvedeno iz" kada se koristi u vezi sa promenljivim regionom "izveden iz" navedenog gena ili segmenta gena obuhvata sposobnost da se prati sekvenca nazad do određenog nepreraspoređenog segmenta gena ili segmenata gena koji su preraspoređeni da formiraju gen koji ispoljava promenljivi domen (uzimajući u obzir, gde je primenljivo, razlike u spoju i somatskim mutacijama).
[0153]Fraza "funkcionalno" kada se koristi u vezi sa segmentom gena promenljivog regiona ili spojnim segmentom gena odnosi se na upotrebu u ispoljenom repertoaru antitela; npr, kod ljudi V?. segmenti gena 3-1, 4-3, 2-8, itd su funkcionalni, za razliku od njih. VA segmenti gena 3-2. 3-4, 2-5, itd. su nefunkcionalni
[0154]"Lokus teškog lanca" obuhvata lokaciju na hromozomu. npr. mišjem hromozomu, pri čemu su pronađeni promenljivi teški lanac miša divljeg tipa (Vh). raznovrsnost teškog lanca (Dh). spoj teškog lanca (Jh). i sekvence DNK konstantnog regiona teškog lanca (CH)
[0155]" k Lokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr, mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljeg tipakpromenljivi (Vk).kspojni (Jk), ikkonstantni (Ck) region DNK sekvence.
[0156]" XLokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr, mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljeg tipa X promenljiv (VA),Xspojni (JA) i A konstantni (CA) region sekvenci DNK.
[0157]Pojam "nepreraspoređeni" obuhvata stanje lokusa imunoglobulina pri čemu se V segmenti gena i J segmenti gena (za teške lance, D segmenti gena takođe) održavaju odvojeno ali mogu da se spoje da formiraju preraspoređeni V(D)J gen koji obuhvata jedan V,(D) J od ovog V(D)J repertoara
Miševi koji ispoijavaju ljudske A promenljive domene
[0158]Miševi koji ispoijavaju antitela koja nisu potpuno ljudska, ili delimično ljudska i delimično mišja, su prethodno već prikazani VELOOMMUNE® genetski projektovani miševi obuhvataju zamenu nepreraspoređenih V(D)J segmenata gena na endogenim mišjim lokusima sa ljudskim V(D)J segmentima gena. VELOCIMMUNE® miševi ispoijavaju himerna antitela koja imaju ljudske promenljive domene i mišje konstantne domene (videti, npr., US Pat. br 7.605,237) Većina drugih izveštaja se odnosi na miševe koji ispoijavaju potpuno ljudska antitela iz potpuno ljudskih transgena kod miševa koji imaju onemogućene endogene lokuse imunoglobulina
[0159]Laki lanci antitela se kodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa- kapa (k) i lambda (X) Laki lanci antitela miša su primarnoktipa. Miševi koji prave mišja antitela, i modifikovani miševi koji prave potpuno ljudska ili himerna Ijudsko-mišja antitela, prikazuju neuravnoteženost u pogledu upotrebe lakog lanca. Ljudi takođe ispoijavaju neuravnoteženost lakog lanca, ali ne tako izraženu kao kod miševa, odnosklakih lanaca prema A lakim lancima kod miševa je oko 95 5. pri čemu je kod ljudi oko 60:40 Izraženija neuravnoteženost kod miševa se ne smatra da ozbiljno utiče na raznovrsnost antitela, jer kod miševa A. promenljivi lokus nije tako raznovrstan u prvoj instanci Ovo nije tako i kod ljudi Ljudski X lokus lakog lanca obiluje raznovrsnošću,
[0160]Ljudski X lokus lakog lanca se nastavlja preko 1 000 kb i sadrži preko 80 gena koji kodiraju promenljive (V) ili spojne (J) segmente (SL. 1) Unutar ljudskog X lokusa lakog lanca, preko polovine svih primećenih VXdomena se kodira pomoću segmenata gena 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, i 3-21 Sve u svemu, oko 30 ili tako nešto ljudskih VX segmenata gena se smatra funkcionalnim Ima sedam JX segmenata gena, samo njih četiri se smatra generalno funkcionalnim JX segmentima gena, JX1, JX2, JX3, i JX7
[0161]Lokus X lakog lanca kod ljudi je slične strukture kaoklokus kod miševa i ljudi po tome što ljudski X lokus lakog lanca ima nekoliko segmenata gena promenljivog regiona koji su sposobni da se rekombinuju da se formira funkcionalni protein lakog lanca Ljudski X lokus lakog lanca sadrži približno 70 V segmenata gena i 7 parova JX-CX segmenta gena Samo četiri od ovihJX-CXparova segmenta gena se čine funkcionalnim Kod nekih alela, petiJX-CXpar segmenta gena je prema izveštajima pseudo gen (CA6). 70 VXsegmenata gena izgleda da sadrže 38 funkcionalnih segmenata gena, 70 VXsekvenci se raspoređuje u tri skupine, a sve sadrže različite članove distinktivnih grupa familije V gena (skupine A, B i C; SL 1). Postoji potencijalno bogat izvor relativno neiskonšćene raznovrsnosti za generisanje antitela sa ljudskim V regionima kod nehumanih životinja.
[0162]Kao oštar kontrast, mišji X lokus lakog lanca sadrži samo dva ili tri (zavisno od soja) mišja segmenta gena VA regiona (SL . 2). Barem iz ovog razloga, ozbiljnakpnstrasnost kod miševa se ne smatra posebno pogubnom za ukupnu raznovrsnost antitela.
[0163]Prema objavljenim mapamaAmišji lokus lakog lanca, lokus se sastoji u suštini od dve skupine segmenata gena unuar ospega od približno 200 kb (SL 2) Ove dve skupne sadrže dva kompleta V, J. i C gena koji su sposobni za nezavisno preraspoređivanjeVA2-JA2-CA2-JA4-CA4i VA1-JA3-CA3-JA1-CA1. lako je za VA2 utvrđeno da se rekombinuje sa svim JA segmentima gena VA1 se izgleda ekskluzivno rekombinuje sa CA1, Veruje se daje CX4 pseudo gen sa neispravnim mestima spajanja.
[0164]Mišjiklokus lakog lanca je izrazito drugačiji Struktura i broj segmenata gena koji učestvuju u događajima rekombinacije koji vode funkcionalom proteinu lakog lanca iz mišjegklokusa je mnogo složenija (SL. 3). Dakle, mišjiAlaki lanci ne doprinose u velikoj men raznovrsnosti populacije antitela kod tipičnog miša.
[0165]Iskorišćavanje obilate raznovrsnosti ljudskih A lokusa lakog lanca kod miševa bi verovatno kao rezultat dalo, između ostalog, izvor za kompletniji ljudski repertoar V domena lakog lanca Prethodni pokušaji da se dodirne ova raznovrsnost koristila je ljudske transgene koji sadrže blokove ljudskog lokusa A lakog lanca nasumično inkorporirane u mišji genom (videti, npr , US 6,998.514 i US 7,435,871) Miševi koji sadrže ove nasumično integrisane transgene prema izveštajima ispoijavaju potpuno ljudske X lake lance, međutim, u nekim slučajevima, jedan ili oba endogena lokusa lakog lanca ostaje nedirnut. Ova situacija nije poželjna jer se ljudskeAsekvence lakog lanca nadmeću sa mišjim lakim lancem (kili A) u ispoljenom repertoaru antitela miša.
[0166]Nasuprot tome, pronalazači opisuju genetski modfikovane miševe koji su sposobni da ispoijavaju jednu ili višeAsekvenci nukleinske kiseline lakog lanca direktno iz endogenog mišjeg lokusa lambda lakog lanca. Genetski modifikovanih miševa sposobnih da ispolje ljudske X sekvence lakog lanca iz endogenogAlokusa mogu još da budu odgajani na miševima koji obuhvataju ljudski lokus teškog lanca i zato se koriste da ispolje antitela koja obuhvataju V regione (teške i A lake) koji su potpuno ljudski. V regioni se ispoijavaju sa mišjim konstantnim regionima. Kod različitih varijantnih rešenja, nema prisutnih endogenih mišjih segmenata gena imunoglobulina i V regioni se ispoijavaju sa ljudskim konstantnim regionima. Ova antitela će se pokazati korisna u brojnim primenama. i dijagnostičkim i terapijskim.
[0167]Brojne prednosti mogu da se realizuju za različita varijantna rešenja ispoljavanja proteina za vezivanje izvedenih iz ljudskih VA i JA segmenata gena kod miševa. Prednosti mogu da se realizuju postavljanjem ljudskih A sekvenci na endogenom A lokusu lakog lanca. Antitela napravljena od takvih miševa mogu da imaju lake lance, koji obuhvataju ljudske VA domene spojene na mišji CA region. Miševi će takođe ispoljiti ljudske VA domene koji su pogodni za identifikaciju i kloniranje za upotrebu sa ljudskim C|_ regionima, specifično Cki/ili CA regionima Zato što razvoj B ćelije kod takvih miševa jeste inače normalan, moguće je generisati kompatibilne VA domene (uključujući somatski mutirane VA domene) u kontekstu bilo CA ili Ckregiona
[0168]Opisuju se genetski modifikovani miševi koji obuhvataju nepreraspoređeni ljudski VA segment gena i nepreraspoređeni ljudski JA na endogenomAlokusu lakog lanca imunoglobulina. Opisuju se miševi koji ispoijavaju antitela koja obuhvataju laki lanac koji ima ljudski VA domen spojen na CA region.
[0169][Brisano]
[0170][Brisano]
[0171][Brisano]
[0172][Brisano]
[0173][Brisano]
[0174][Brisano]
Pristupi inženjeringu miševa za ispoljavanje ljudskihVAdomena
[0175]Opisuju se različiti pristupi za pravljenje genetski modifikovanih miševa koji prave antitela koja sadrže laki lanac koji ima ljudski VA domen spojen na endogeni CA region. Opisuju se genetske modifikacije koje, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvataju brisanje jednog ili oba endogena lokusa lakog lanca. Na primer, da se eliminišu mišji A laki lanci iz repertoara endogenog antitlea brisanje prve VA-JA-CA skupine gena i zamena, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge skupine gena sa ljudskim VA-JA segmentima gena može da se izvede formulisano ovde u patentnim zahtevima Takođe se opisuju genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljni konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija,
[0176]Brisanje jedne endogene VA-JA-CA skupine gena i zamena VA-JA segmenata gena druge endogene VA-JA-CA skupine gena koristi relativno minimalni prekid u prirodnom udruživanju konstantnog regiona antitela i funkcije kod životinje, kod različitih varijantnih rešenja zbog toga što se endogeni CAgeni ostavljaju nedirnuti i samim tim zadržavaju normalnu funkcionalnost i sposobnost da se udružuju sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca. Dakle, u takvim varijantnim rešenjima, modifikacija ne utiče na druge konstantne regione teškog lanca zavisne od funkcionalnih konstantnih regiona lakog lanca za sklop funkcionalnog molekula antitela koji sadrži dva teška lanca i dva laka lanca. Pored toga. kod različitih varijantnih rešenja ova modifikacija ne utiče na sklop funkciolnalnog molekula antitela vezanog membranom koji obuhvata endogeni teški lanac i laki lanac, npr, hVA domen povezan na mišji CA region. Zbog toga što se najmanje jedan funkcionalan CA gen zadržava na endogenom lokusu, životinje koje sadrže zamenu VA-JA segmenata genaendogene VA-JA-CA skupinegena sa ljudskim VA-JA segmentima gena teba da mogu da naprave normalne A lake lance koji su sposobni za vezivanje antigena tokom odgovora imunog sistema kroz ljudske VA-JA segmente gena prisutne u ispoljenom repertoaru antitela životinje.
[0177]Šematska ilustracija (nije u razmeri) obrisane endogene mišjeVA-JA-CAskupine gena je data na SL 2. Kako je ilustrovano, mišji A lokus lakog lanca se organizuje u dve skupine gena, obe sadrže funkcionalne segmente gena sposobne za rekombinovanje da formiraju funkciju mišjeg A lakog lanca Endogena mišja VA1-JA3-CA3- JA1-CA1 skupina gena se briše ciljnim konstruktom (ciljajući vektor 1) sa kasetom neomicina prirubno postavljenom pomoću mesta rekombinacije. Druga endogena skupina gena (VA2-VA3-JA2-CA2-JA4-CA4) se briše ciljnim konstruktom (ciljajući vektor 2) sa kasetom higromicin-timidin kinaze prirubnom pomoću mesta rekombinacije U ovom drugom postupku ciljanja, zadržava se CA2-JA4-CA4 endogenih segmenata gena. Drugi ciljni konstrukt (ciljajući vektor 2) se konstruiše korišćenjem mesta rekombinacije koja su drugačija u odnosu na mesta kod prvog ciljnog konstrukta (ciljajući vektor 1) čime se omogućava selektivno brisanje kasete odabira pošto je ostvareno uspešno ciljanje. Dobijeni dvostruko ciljani lokus je funkcionalno utišan u tome da nijedan endogeni/.laki lanac ne može da bude proizveden. Ovaj modifikovan lokus može da se koristi za umetanje ljudskih VA. i JA segmenata gena da se stvori endogeni mišji A lokus koji obuhvata ljudske VA i JAsegmente gena, pomoću kojih, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu, životinja proizvodi A lake lance koji obuhvataj preraspoređene ljudske VAi JA segmente gena povezane na endogeni mišji CA segment gena.
[0178]Genetsko modifikovanje miša da se dobiju endogeniAsegmenti gena nefunkcionalni, u različitim varijantnim rešenjima, daje kao rezultat miša koji ispoljava isključivo k lake lance u repertoaru antitela, što čini miša korisnim za procenu uloge A lakih lanaca za odgovor imunog sistema, i korisnim za pravljenje repertoara antiela koji obuhvata Vkdomene ali ne VA domene
[0179]Genetski modifikovan miš koji ispoljava hVA povezan na mišji CA gen koji je rekombinovan na endogeni mišji A lokus lakog lanca može da se napravi pomoću bilo kog postupka poznatog u nauci Šematska ilustracija (ne u razmeri) zamene endogenih mišjih VA2-VA3-JA2 segmenata gena sa ljudskim VA i JA segmentima gena datim na SL. 4A Kako je ilustrovano, endogeni mišji A lokus lakog lanca koji je učinjen nefunkcionalnim se zameni ciljajućim konstruktom (12/1 ciljajući vektor) koji obuhvata kasetu neomicina prirubno postavljenu pomoću mesta rekombinacije Ovi VA2-VA3-JA2 segmenti gena se zamenjuju genomskim fragmentom koji sadrži ljudsku A sekvencu koja obuhvata 12 hVA segmenata gena i samo jedan hJA segment gena.
[0180]Dakle, ovaj prvi pristup pozicionira jedan ili više hVA segmenata gena na endogeni A lokus lakog lanca dodiran jednom hJA segmentom gena (SL 4A)
[0181]Dodatne modifikacije na modifikovani endogeni A lokus lakog lanca mogu da budu ostvarene korišćenjem sličnih tehnika da se ubaci više hVA segmenata gena Na primer, šematske ilustracije dva dodatna ciljna konstrukta (+16-A i +12-Aciljajući vektori) konšćent za progresivno umetanje dodavanja ljudskih hVA segmenata gena su dati na SL 5A Kao što je ilustrovano, dodatni genomski fragmenti koji sadrže specifične ljudske hVA segmente gena se ubacuju u modifikovane endogene A lokuse lakog lanca u uzastopnim koracima korišćenjem homologije obezbeđene prethodnim umetanjem ljudskihA sekvencilakog lanca Posle rekombinacije sa svakim ciljnim ilustrovanim konstruktom, na uzastopan način, 28 dodatnih hVA segmenata gena se umeće u modifikovani endogeni A lokus lakog lanca Ovo stvara himerni lokus koji proizvodiAprotein lakog lanca koji obuhvata ljudske VA-JA segmente gena povezane na mišji CA gen.
[0182]Gornji pristupi ubacivanju ljudskihAsegmenata gena lakog lanca na mišjemAlokusu, zadržava pojačavače pozicionirane nizvodno CA2-JA4-CA4 segmenata gena (naznačene Enh 2 4, Enh i Enh 3.1 SL. 4A i SL. 5A). Ovaj pristup daje kao rezultat jedan modifikovan alel na endogenom mišjemAlokusu lakog lanca (SL. 7A).
[0183]Takođe su opisana jedinjenja i postupci za pravljenje miša koji ispoljava laki lanac koji obuhvata hVA i JAsegmente gena funkcionalno povezane na mišji CA segment gena, uključujući jedinjenja i postupak za pravljenje miša koji ispoljava takve gene iz endogenog mišjeg A lokusa lakog lanca Postupci obuhvataju selektivno pravljenje jedne endogene mišjeVA-JA-CA skupinegena nefunkcionalnom (npr., ciljanjim brisanjem), i korišćenje hVA i JA segmente gena na endogenom mišjem
A lokusu lakog lanca da se ispolji hVA domen kod miša.
[0184]Takođe je opisan drugi pristup gde ljudskiXsegmenti gena lakog lanca mogu da budu pozicionirani na endogenomklokusu lakog lanca Genetska modifikacija, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvata brisanje endogenogklokusa lakog lanca. Na primer. da bi se eliminisali mišji k laki lanci iz repertoara endogenog antitela, moguće je izvesti brisanje mišjih Vk i Jk segmenata gena Takođe se opisuju genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljajući konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija.
[0185]Iz gore navedenih razloga, brisanje mišjih Vk i Jk segmenata gena koristi relativno minimalni prekid. Šematska ilustracija (nije u razmeri) obrisanih mišjih Vki Jksegmenata gena je data na SL. 3. Endogeni mišji Vk i Jksegmentima gena se briše preko rekombinazom posredovanog brisanja mišjih sekvenci pozicioniranih između dva precizno pozicionirana ciljna vektora svaki koristi mesta za rekombinaciju specifičnu za-mesto. Prvi ciljajući vektor (Jkciljajući vektor) se koristi u prvom ciljajućem događaju za brisanje mišjih Jksegmenata gena. Drugi ciljajući vektor (Vkciljajući vektor) se koristi u drugom, uzastopnom procesu ciljanja da briše sekvencu smeštenu 5' od najudaljenijeg mišjeg Vksegmenta gena. Oba ciljajuća vektora sadrže mesta za rekombinaciju specifičnu za mesto čime se omogućava selektivno brisanje obe kasete odabira i sve interventne mišjeksekvence lakog lanca pošto je ciljanje izvedeno uspešno Dobijeni brisani lokus je funkcionalno utišan tako da nijedan endogeniklaki lanac ne može da bude proizveden. Ovaj modifikovan lokus može da se koristi za umetanje hVA iJAsegmenata gena da se stvori endogeni mišjiklokus koji obuhvata hVA i JA segmente gena, pomoću kojih, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu, životinja proizvodiAlake lance koji obuhvataju preraspoređene hVA i JA segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cksegment gena. Različiti ciljajući vektori obuhvataju ljudske A sekvence lakog lanca mogu da se koriste u vezi sa ovim obrisanim mišjimklokusom da se stvori hibridni lokus lakog lanca koji sadrži ljudske A segmente gena funkcionalno povezane sa mišjim C A regionom
[0186]Dakle, treći pristup, jedan ili više ljudskih VA segmenata gena se pozicionira na mišjemklokusu lakog lanca dodirnom sa jednim ljudskimJAsegmentom gena (12/1-kciljajući vektor SL 4B)
[0187]Modifikacije ovog pristupa mogu da budu izvedene da se dodaju segmenti gena i/ili regulatorne sekvence da se optimizuje upotreba ljudskihAsekvenci lakog lanca iz mišjegklokusa unutar repertoara mišjeg antitela.
[0188]Takođe je opisan treći pristup gde se, jedan ili više hVAsegmenata gena pozicionira na mišjemklokusu lakog lanca dodirnom sa četirihJAsekvence gena (12/4-kciljajući vektor SL. 4B).
[0189]U trećem pristupu, jedan ili više hVA segmenata gena se pozicionira na mišjemklokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskom k intergenskom sekvencom i jednom hJA sekvencom gena (12(k)1-kciljajući vektor, SL. 4B)
[0190]Takođe je opisan četvrti pristup, jedan ili više hVAsegmenata gena se pozicionira na mišjemklokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskom A intergenskom sekvencom četiri hJA sekvence gena (12(k)4-kciljajući vektor, SL. 4B).
[0191]Svi gore navedeni pristupi za ubacivanje ljudskihAsegmenata gena lakog lanca na mišjiklokusu, zadržavajukelement intronskog pojačavača uzvodno od Ckgena (naznačen Eki, SL 4B i SL 5B) i 3' k pojačavač nizvodno od CKgena (naznačen Ek-3', SL 4B i SL 5B), Ovaj pristup daje kao rezultat četiri modifikovana alela na endogenom mišjemklokusu lakog lanca (SL. 7B).
[0192][Brisano]
Antitela lambda domena iz genetski modifikovanih miševa
[0193]Miševi koji obuhvataju ljudskeAsekvence na mišjem A lokusu lakog lanca će ispoljiti laki lanac koji obuhvata hVA region spojen na mišjiCAregion Ovo su kao prednost uzgajani miševi koji (a) obuhvataju funkcionalno neaktivni lokus lakog lanca (npr, nokaut (mutirani oblik) endogenog mišakiliAlokus lakog lanca), (b) obuhvataju endogeni mišji A lokus lakog lanca koji obuhvata hVA i hJA segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji CA gen kako je formulisano u patentnim zahtevima; (c) obuhvata endogeni mišjiklokus lakog lanca koji obuhvata hVki hJK- segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Ckgen; i, (d) miš u kom jedankalel obuhvata hVk- i IiJk; drugiKalel obuhvata hVA i hJA; jedan A alel obuhvata hVA i hJA i jedanXalel maktivni ili mutirani, ili obaXalela koja obuhvataju hVA I hJA*, i dva alela teškog lanca koji obuhvataju hVH, hDH, i hJH. ;[0194]Antitela koja obuhvataju hVA domene ispoljene u kontekstu bilo kog od CA se koriste da naprave potpuno ljudska antitela kloniranjem nukleinskih kiselina koje kodiraju hVA domene u ispoljavanje konstrukata koji nose gene koji kodiraju ljudski CA. Konstrukti ispoljavanja koji nastanu kao rezultat se transfektuju u ćelije domaćina pogodne za ispoljavanje antitela koja prikazuju potpuno hVA domen spojen na hCA. ;PRIMERI;[0195]Dati su sledeći primeri tako da se opiše kako da se napravi upotreba postupaka i jedinjenja prema ovom pronalasku, i nisu predviđeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju da je njihov pronalazak. Osim ako nije drugačije navedeno, temperatura je navedena u Celzijusima, i pritisak je na ili blizu atmosferskog. ;Primer I;Brisanje mišjih lokusa lakog lanaca imunoglobulina;[0196]Različiti ciljajući konstrukti su napravljeni korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., US Pat. br. 6,586,251 i Valenzuela et al (2003) High-throughput engmeenng of the mouse genome coupled with high-resolution expression anaivsis, Nature Biotech (Inženjering visokog kvaliteta mišjeg genoma spojen sa analizom velike rezolucije ispoljavanja), Nature Biotech anaivsis. Nature Biotech. 21(6):652-659) za modifikovanje biblioteka mišjih genomskih bakterijskih veštačkih hromozoma (BAC) da se inaktiviraju mišjiki Alokusi lakog lanca, ;[0197] Brisanje mišjeg A lokusa lakog lanca.DNK iz mišjeg BAC klona RP23-135k15 (Invitrogen) je modifikovana homolognom rekombinacijom da se inaktivira endogeni mišji A lokus lakog lanca putem ciljanog brisanja VA-JA-CA skupina gena (SL. 2) ;[0198]Ukratko, cela proksimalna skupina obuhvata VA1-JA3-CA3-JA1-CA1 segmente gena je brisana u jednom ciljnom događaju korišćenjem ciljnog vektora koji obuhvata kasetu neomicina prirubno postavljenu pomoću/oxPmesta sa 5' mišjim homolognim krakom koji sadrži sekvencu 5' VA1 segmenta gena i 3' mišjeg homolognog kraka koji sadrži sekvencu 3' CA1 segment gena (SL 2, ciljajući vektor 1). ;[0199]Drugi ciljajući konstrukt je pripremjen da precizno obriše distalnu endogenu mišjuAskupinu gena koja sadrži VA2-JA2-CA2-JA4-CA4 izuzev one koju je ciljajućii konstrukt sadržao 5' mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5' VA2 segmenta gena i 3' mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5' na endogenom CA2 segmentu gena (SL 2 Ciljajući vektor 2) Dakle, drugi ciljajući konstrukt je precizno izbrisan VA2-JA2, pritom ostavlja CA2-JA4-CA4 nedirnut na endogenom mišjem A lokusu. ES ćelije koje su sadržale neaktivirani endogeniAlokus (kako je gore opisano) su potvrđene putem u tehnici poznatih postupaka karotipovanja i snimanja (npr. TAOMAN®). DNK je zatim izolovana iz modifikovanih ES ćelija i podvrgnuta tretiranju sa CRE rekombinazom čime je posredovala brisanje proksimalne ciljne kasete koja je sadržala gen marker neomicina, ostavljajući samo jedno /oxP mesto u tački brisanja (SL 2, dno). ;[0200] Brisanje mišjegklokusa lakog lanca.Korišćenjem postupaka sličnih gore opisanim postupcima gore opisanim postupcima, napravljeno je nekoliko ciljnih konstrukata da se modifikuje DNK iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04 (Invitrogen) homolognom rekombnacijom da se inaktivira mišjiklokus lakog lanca u dvostepenom procesu (SL. 3) ;[0201]Ukratko, Jk- segmenti gena (1-5) endogenog mišjegklokusa lakog lanca su izbrisani u samo jednom procesu ciljanja korišćenjem ciljnog vektora koji obuhvata kasetu higromicin-timidin kinaze (hyg-TK) koja sadrži jednoioxPmesto 3' na hyg-TK kasetu (SL. 3. Jkciljajući vektor). Homologni kraci korišćeni da se napravi ovaj ciljajući vektor su sadržali mišju genomsku sekvencu 5' i 3' endogenih mišjih Jksegmenata gena. U drugom procesu ciljanja, drugi ciljajući vektor je pripremljen da obriše deo mišje genomske sekvence uzvodno (5') na najudaljenijem endogenom mišjem Vk segmentu gena (SL. 3, Vk ciljajući vektor). Ovaj ciljajući vektor je sadržao invertovano lox511 mesto,loxPmesto i kasetu neomicina. Homologni kraci korišćeni da se napravi ovaj ciljajući vektor su sadržali mišju genomsku sekvencu uzvodno od najudaljenijeg mišjeg Vksegmenta gena. Ciljajući vektori su korišćeni uzastopno (t/, Jk zatim Vk) da ciljaju DNK u embrionskim matičnim (ES) ćelijama. Embnonske matične (ES) koje nose dvostruko ciljani hromozom (t.j., jedan endogeni mišjiklokus ciljan sa oba ciljajuća vektora) su potvrđeni postupcima karotipovanja i snimanja (npr., Taqman™) poznat u ovoj oblasti. DNK je zatim izolovana iz modifikovanih ES ćelija i podvrgnuta tretmanu sa Cre rekombinazom čije je posredovano brisanje endogenih mišjih Vksegmenata gena i obe kasete odabira, pritom ostavljajući dva suprotstavljenaloxmesta suprotno orijentisana jedan u odnosu na drugi (SL 3, dno; ID BR SEK:1) ;[0202]Dakle, dva modifikovana endogena lokusa lakog lanca (ki X) koja sadrže nedirnuti pojačavač i konstantne regione su stvorena za progresivno umetanje nepreraspoređenih ljudskihXsegmenata gena klicine linije na precizan način korišćenjem ciljajućih vektora opisanih dole u tekstu ;Primer II;Zamena mišjih lokusa lakog lanca sa ljudskim X mini-lokusom lakog lanca;[0203]Višestrki ciljajući vektori su projektovani za progresivno umetanje ljudskih X segmenata gena u endogene mišje k iklokuse lakog lanca korišćenjem sličnih postupaka kao što je gore opisano Višestruke nezavisne modifikacije su napravljene na endogenim lokusima lakog lanca proizvodeći himerni lokus lakog lanca koji sadrži hVX i Jk segmente gena funkcionalno povezane na mišje konstantne gene lakog lanca i pojačavače, ;[0204] Ljudski k mini-lokus koji sadrži 12 ljudskih VX i jedan ljudski JX segment gena.Niz ;inicijalnih ciljajućih vektora je projektovan da sadrži prvih 12 uzastopnih ljudskih V/. segmenata gena iz skupine A i hJA1 segmenta gena ili četiri hJX segmenata gena korišćenjem ljudskog BAC klona pod nazivom RP11-729g4 (Invitrogen) SL 4A i 4B pokazuju ciljajuće vektore koji su konstruisani za pravljenje početnog umetanja ljudskihksegmenata gena lakog lanca na mišjim X iklokusima lakog lanca, respektivno. ;[0205]Za prvi komplet početnih ciljajućih vektora, 124,125 bp DNK fragment iz 729g4 BAC klona koji je sadržao 12 hVX segmenata gena i hJX1 segment gena je projektovan da sadrži Pl-Scel mesto 996 bp nizvodno (3') od hJX1 segmenta gena za ligaciju 3' mišjeg homolognog kraka Korišćena su dva različita kompleta homolognih krakova za ligaciju na ovaj ljudski fragment; jedan komplet homolognih krakova je sadržao endogene mišjeksekvenceiz 135k15 BAC klona (SL.4A) i još jedan komplet je sadržao endogenuksekvencu 5' i 3' mišjih Vk i Jksegmenata gena iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04, respektivno (SL. 4B). ;[0206]Za12/1 - k ciljajućivektor (SL. 4A), Pl-Scel mesto je projektovano na 5' kraju 27 847 bp DNK fragmenta koji sadrži mišji CX2-JA4-CA4 i pojačavač 2 4 modifikovanog mišjeg X lokusa opisanog u Pnmeru 1 Korišćen je -28 kb mišji fragment kao 3' homologni krak ligacijom na --124 kb ljudskogXfragmenta, koji je stvorio 3' ukrštanje koje je sadržalo, od 5' do 3', hJX1 segmenta gena, 996 bp ljudskeXsekvence3' hJX1 segmenta gena, 1229 bp mišjeXsekvence5' na mišjem CX2 genu, mišji CA2 gen i preostali deo -28 kb mišjeg fragmenta Uzvodno (5 ) od ljudskog VA3-12 segmenta je bio dodatni 1456 bp ljudske A sekvence pre početka 5' mišjeg homolognog kraka, koji je sadržao 23.792 bp mišje genomske DNK koja odgovara sekvenci 5' endogenog mišjegklokusa. Između 5' homolognog kraka i početka ljudskeXsekvence je bila kaseta neomicina prirubna Frt mestima, ;[0207]Dakle, 12/1 - k ciljajući vektor je obuhvatao, od 5' do 3', 5' homologni krak koji je sadržao -24 kb mišjeXgenomske sekvence 5' endogenog A lokusa, 5' Frt mesto, kaseta neomicina, 3' Frt mesto, -123 kb ljudske genomske A sekvence sadrži prvih 12 uzastopnih hVA segmenata gena i hj/,1 segmenata gena, Pl-Scel mesto, i 3' homologni krak koji sadrži -28 kb mišju genomsku sekvencu koja obuhvata endogene CA2-JA4-CA4 segmente gena, mišji pojačavač 2 4 sekvence i dodanu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3 ) od pojaćavača 2.4 (SL. 4A), ;[0208]Na sličan način, 12/1-k ciljajući vektor (SL. 4B) je koristio isti -124 ljudskik fragmentsa izuzetkom da su mišji homologni kraci koji sadrže mišju sekvencu k korišćeni tako da ciljanje na endogeniklokus može da se ostvari pomoću homologne rekombinacije Dakle. 12/1-kciljajući vektor je obuhvaćen, od 5' do 3', 5' homolognog kraka koji obuhvata -23 kb mišje genomske sekvence 5' endogenog k lokusa, l-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kaseta neomicina, 3' Frt mesto, -124 kb ljudske genomske A. sekvence koja sadrži prvih 12 uzastopnih hVA segmenata gena i hJA1 segment gen, Pl-Scel mesto, i 3' homologni krak koji sadrži -28 kb mišje genomske sekvence obuhvata endogeni mišji Ck-gen, Eki' i Ek3' i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3 ) od Ek3' (SL 4B, 12/1-k ciljajući vektor). ;[0209]Homologna rekombinacija sa bilo kojim od ova dva inicijalna ciljajuća vektora kreirana sa modifikovanim mišjim lokusom lakog lanca (kili A) kja sadrži 12 hVAsegmenata gena i hJA1 segment gena funkcionalno povezan na endogeni mišji konstantni gen lakog lanca i pojačavače (Ckili Ck2 i EK-i/Ek-3' ili Enh 2.4/Enh 3.1) gen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernogklakog lanca. ;[0210] Ljudski Amini-lokus sa 12 ljudski VAi četiri ljudska JAsegmenta gena.U drugom pristupu da se doda raznovrsnost himernog A lakog lanca, treći inicijalni ciljajući vektor je projektovan da se umetne prvih 12 uzastopnih ljudskih VA segmenata gena iz skupine A i hJA1, 2, 3 i 7 segmenata gena u mišjiklokus lakog lanca (SL 4B, 12/4-kciljajući vektor). DNK segment koji sadrži hJA1, JA2, JA3 i JA7 segmenata gena je napravljenade novoDNK sintezom (Integrated DNA Technologies) uključujući svaki JA segment gena i ljudsku genomsku sekvencu -100 bp od i neposrednih 5' i 3' regiona svakog JAsegmenta gena Pl-Scel mesto je projektovano u 3' kraj ovog -1 kb DNK fragment i povezan na kasetu hloroamfenikol, Homologni kraci su PCR pojačani iz ljudske A sekvence na 5' i 3' pozicije relativne prema hJA1 segmentu gena ljudskog BAC klona 729g4 Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom intermedijara je izvedena na modifikovanom 729g4 BAC klonu koji je prethodno ciljan uzvodno (5') od ljudskog VA3-12 segmenta gena sa kasetom neomicina prirubno postavljenom pomoću Frt mesta, koja su takođe sadržala l-Ceul mesto 5 do 5' Frt mesta. Dvostruko ciljani 729g4 BAC klon je obuhvatio od 5' do 3<*>l-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kaseta neomicina, 3' Frt mestom, -123 kb fragment koji sadrži prvih 12 hVA segmenata gena, -1 kb fragment koji sadrži ljudski JA1, 2, 3 i 7 segmente gena, Pl-Scel mesto. i kaseta hloroamfenikola Ovaj ciljajući vektor intermedijara je rastvoren zajedno sa l-Ceul i Pl-Scel i naknadno povezan u modifikovan mišji BAC klon (opisan gore) da se stvori treći ciljajući vektor
[0211]Ova ligacija je dala kao rezultat treći ciljajući vektor za ubacivanje ljudskihAsekvenci u endogeni k lokus lakog lanca, koji je obuhvatio, od 5' do 3', 5' mišji homologni krak koji je sadržao -23 kb genomske sekvence 5' endogenog mišjeg k lokusa, l-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto, -123 kb fragment koji obuhvata prvih 12 hVAsegmenata gena, -1 kb fragment koji obuhvata hJA1, 2, 3 i 7 segmente gena, Pl-Scel mesto i 3' homologni krak koji obuhvata -28 kb mišje genomske sekvence uključujući endogeni mišji Ckgen, Eki i Ek3' i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3') Ek3' (SL. 4B, 12/4-k Ciljajući vektor). Homologna rekombinacija sa ovim trećim ciljajućim vektorom je stvorila modifikovani mišjiklokus lakog lanca koji obuhvata 12 hVA segmenta gena i četiri hJk segmenta gena funkcionalno povezana na endogeni mišji Ckgen koji, posle rekombinacije. vodi formiraju himernog ljudskog A/mišjegklakog lanca
[0212] Ljudski Xmini-lokus sa integrisanom ljudskom ksekvencom lakog lanca.Na sličan način, dva dodatna ciljajuća vektora slična onima koji su projektovani da se napravi početno umetanje ljudskihksegmenata gena u endogeniklokus lakog lanca (SL 4B. 12/1-k i 12/4-kciljajući vektori) su projektovani da progresivno ubacuju ljudskeksegmente gena lakog lanca koristeći jedinstveno konstruisane ciljajuće vektore koji sadrže dodirne ljudske/. ikgenomske sekvence. Ovi ciljajući vektori su konstruisani da obuhvate - 23 kb ljudski k genomsku sekvencu prirodno smeštenu između ljudskih Vk4-1 i Jk1 segmenata gena Ova ljudska k genomska sekvenca je specifično pozicionirana u ova dva dodatna ciljajuća vektora između ljudskih Va i ljudskihJksegmenata gena (SL. 4B, 12(k)1-k- i 12(k)4-k ciljajući vektori)
[0213]Oba ciljajuća vektora koja sadrže ljudsku k genomsku sekvencu su napravljena korišćenjem modifikovanog RP11-729g4 BAC klona opisanog gore (SL 6) Ovaj modifikovani BAC klon je ciljan sa kasetom odabira spektinomicina prirubno postavljenom pomoću Noti i AsiSI mesta ograničenja (SL. 6, gore levo). Homologna rekombinacija sa kasetom spektinomicina dala je kao rezutlat dvostruko ciljani 729g4 BAC klon koji je obuhvatio, od 5' do 3. l-Ceul mesto, 5 Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto,~123 kb fragmenta sa prvih 12 hV/. segmenata gena, Noti mesto oko 200 bp donjeg toka (3') na sekvencu nonamera hVA.3-1 segmenta gena, kasetu spektinomicina i AsiSI mesto. Odvojeni ljudski BAC klon sa ljudskomksekvencom (CTD-2366j12) je ciljan dva nezavisna puta da se projektuju mesta ograničenja na lokacijama između hVK-4-1 i hJk1 segmenata gena da se omogući naknadno kloniranje
-23 kb fragmenta za povezivanje sa hVž. gene segmentima gena sadržanim u dvostruko ciljanim modifikovanom 729g4 BAC klonu (SL. 6, gore desno)
[0214]Ukratko, 2366j12 BAC klon je oko 132 kb veličine i sadrži hVk- segmente gena 1-6, 1-5, 2-4, 7-3, 5-2, 4-1, ljudskukgenomsku sekvencu nizvodno Vksegmenata gena, hJK segmenata gena 1-5, hCKi oko 20 kb dodatne genomske sekvence ljudskog k lokusa Ovaj klon je prvo ciljan sa ciljanim vektorom sa kasetom higromicina prirubnom Frt mestom i Noti mestom nizvodno (3) 3' Frt mesta Homologni kraci za ovaj ciljajući vektor sadržali su ljudsku genomsku sekvencu 5' i 3' Vksegmente gena sa BAC klonom tako da su posle homologne rekombinacije sa ovim ciljajućim vektorom, Vk segmenti gena su brisani i Noti mesto je projektovano~-133 bp nizvodno od hVk-4-1 segmenta gena (SL 6. gore desno) Ovaj modifikovan 2366j12 BAC klon je ciljan nezavisno sa dva ciljajuća vektora na 3' kraju da se brišu hJKsegmenti gena sa kasetom hloroamfenikola koji su takođe sadržali bio hJk-1 segment gena, Pl-Scel mesto i AsiSI mesto ili ljudski genomski fragment koji je sadržao četiri hJk segmenta gena( supra),Pl-Scel mesto i AsiSI mesto (SL, 6, gore desno) Homologni kraci za ova dva slična ciljajuća vektora su sadržali sekvencu 5' i 3' hJKsegmenata gena. Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima i modifikovan 2366J12 BAC klon je dao prinos dvostruko-ciljanog 2366j12 klona koji je obuhvatio, od 5' do 3', 5' Frt mesto, kasetu higromicina, 3' Frt meto, Noti mesto. 22,800 bp genomski fragment ljudskogklokusa koji obuhvata intergenski region između Vk4-1 i Jk1 segmenata gena. bilo hJX1 segment gena ili ljudskik genomskifragment koji obuhvata hJX1. J/,2, JX3 i JX7, Pl-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola (SL. 6, gore desno) Dva finalna ciljajuća vektora da se naprave dve dodatne modifikacije su izvedene u dva koraka povezivanja korišćenjem dvostruko ciljanih 729g4 i 2366j12 klonova.
[0215]Dvostruko ciljani 729g4 i 2366j12 klonovi su rastvoreni sa Noti i AsiSI daje kao prinos jednog fragmenta koji obuhvata kasetu neomicina i hVX segmenata gena i još jedan fragment koji obuhvata -23 kb genomskog fragmenta ljudskogklokusa sa intergenskim regionom između Vk4-1 i Jk1 segmenata gena, bilo hJX1 segment gena ili genomski fragment koji obuhvata hJX1, JX2. JX3 i Ja.7 segmenata gena, Pl-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola, respektivno Povezivanje ovih fragmenata je generisalo dva jedinstvena BAC klona koji obuhvataju od 5' do 3' hV>. segmenata gena, ljudskukgenomsku sekvencu između Vk4-1 i Jk1 segmenata gena, bilo hJX1 segment gena ili genomski fragment koji obuhvata hJA1, JA2, JA3 and J/J segmente gena, Pl-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola (SL 6, dno) Ovi novi BAC klonovi su zatim rastvoreni sa l-Ceul i Pl-Scel da ispuste jedinstvene fragmente koji sadrže kasetu neomicina uzvodno i dodirne ljudske X iksekvence i povezu se u modifikovani mišji BAC klon 302g12 koji je sadržao od 5' do 3' mišje genomske sekvence 5' endogenogklokusa, l-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto, hVAsegmente gena (3-12 do 3-1), Noti mesto 200 bp nizvodno VA3-1,~-23 kb ljudske k sekvence koja se može prirodno naći između ljudskih Vk4-1 i Jk1 segmenata gena, bilo hJA1 segment gena ili genomski fragment sa hJA1, JA2, JA3 iJ/.7segmentima gena, mišji Eki, mišji Ck gen i Ek3' (SL. 4, 12hAA-N/KJk--hJA1 i 12hVA-Vk-JK-4hJA ciljajuće vektore) Homologna rekombinacija sa oba ova ciljajuća vektora je stvorila dva odvojena mišja k lokusa lakog lanca sa 12 hVA segmenata gena, ljudsku k genomsku sekvencu, i jedan ili četiri hJA segmenta gena funkcionalno povezana na endogeni mišji Ckgen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog ljudskogA/mišjegklakog lanca
Primer III
Projektovanje dodatnih ljudskih V1A segmenata gena u ljudskiAmini-lokuslakoglanca
[0216]Dodatni hVA segmenti gena su dodati nezavisno na svaku od početnih modifikacija opisanih u Primeru 2 korišćenjem sličnih ciljajućih vektora i postupaka (SL 5A. + 16-A ciljajući vektor i SL, 5B, +16-Kciljajući vektor)
[0217] Uvođenje 16 dodatnih ljudskihV?. segmenata gena. Uzvodno (5) homologni kraci korišćeni za sklapanje ciljajućih vektora za dodavanje 16 dodatnih hVA segmenata gena na modifikovane lokuse lakog lanca opisane u Primeru 2 su sadržali mišju genomsku sekvencu 5' bilo endogenih k ili A lokusa lakog lanca. 3' homologni kraci su bili isti za sve ciljajuće vektore i sadržali su ljudske genomske sekvence koje se preklapaju sa 5' krajem ljudske A. sekvence modifikacija kako je opisano u Primeru 2,
[0218]Ukratko, dva ciljajuća vektora su projektovana za uvođenje 16 dodatnih hVA segmenata gena na modifikovane mišje lokuse lakog lanca opisane u Primeru 2 (SL, 5A i 5B, + 16-A ili +16-Kciljajući vektor). DNK fragment -172 kb iz ljudskog BAC klona RP11-761113 (Invitrogen) koji je sadržao 21 uzastopnih hVA segmenata gena iz skupine A je projektovano sa 5' homolognim krakom koji obuhvata mišju genomsku sekvencu 5' na bilo endogenikili A lokuse lakog lanca i 3' homologni krak koji je sadržao ljudsku genomsku A sekvencu. 5' mišjikili A homologni kraci korišćeni u ovim ciljajućim konstruktima su bili isti 5' homologni kraci opisani u Primeru 2 (SL. 5A i 5B). Ovaj 3 55' homologni krak je obuhvatio 53.057 bp preklapanja ljudske genomske/..sekvence koja odgovara ekvivalentnom 5' kraju -123 kb fragmenta ljudske genomske A sekvence opisane u Primeru 2. Ova dva ciljajuća vektora su obuhvatila, od 5' do 3', 5' homologni krak koji sadrži bilo -23 kb mišje genomske sekvence 5' endogenog mišjegklokusa lakog lanca ili Dr -24 kb mišje genomske sekvence 5' endogenogAlokusa lakog lanca, 5' Frt mesto, kasetu higromicina, 3' Frt mesto i 171 457 bp ljudske genomskeAsekvence koja obuhvata 21 uzastopnih hVA segmenata gena, -53 kb od tih se preklapa sa 5' krajem ljudske A sekvence opisane u Primeru 3 i služi kao 3' homologni krak za ovaj ciljajući konstrukt (SL 5A i 5B. +16-/,. ili + 16-K vektora ciljanja). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima je stvorila nezavisno modifikovan mišjeki A lokuse lakog lanca svaki sa 28 hVA segmenata gena i hJA1 segment gena funkcionalno povezan na endogene mišje konstantne gene (Ckili CA2) koji, posle rekombinacije, vode formiranju himernog lakog lanca.
[0219]Na sličan način, +16-Kciljajući vektor je takođe korišćen da uvede 16 dodatnih hVA segmenata gena na druge početne modifikacije opisane u Primeru 2 koje su obuhvatile više hJA segmenata gena sa i bez integrisane ljudskeksekvence (SL. 4B). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjemklokusu sa drugim početnim modifikacijama je stvorila mišjeklokuse lakog lanca sa 28 hVA segmenata gena i hJA1, 2, 3 i 7 segmente gena sa i bez ljudske Vk-Jk genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni mišji Ckgen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog A-klakog lanca,
[0220] Uvođenje 12 dodatnih ljudskih V/. segmenata gena. Dodatni hVA segmenti gena su dodati nezavisno na svaku od modifikacija opisanih gore u tekstu korišćenjem sličnih ciljajućih vektora i postupaka. Finalna konstrukcija lokusa koja je nastala iz homologne rekombinacije sa ciljajućim vektorima gde su obuhvaćeni dodatni hVA segmenti gena su prikazani na SL 7A i 7B.
[0221] Ukratko, ciljajući vektor je projektovan za uvođenje 12 dodatnih hVA segmenata gena na modifikovani mišji Ki a lokuse lakog lanca opisane gore u tekstu (SL. 5A i 5B, +12-/. ili 12-k vektora ciljanja). 93,674 bp DNK fragment iz ljudskog BAC klona RP11-22118 (Invitrogen) sa 12 uzastopnih hVA segmenata gena iz skupine B je projektovana sa 5' homolognim krakom koji sadrži mišju genomsku sekvencu 5' na bilo endogene mišjekili X lokuse lakog lance i 3' homologni krak koji obuhvata ljudsku genomsku A sekvencu. 5' homologni kraci korišćeni u ovom ciljajućem konstruktu su bili isti 5' homologni kraci korišćeni za dodavanje 16 hVA segmenata gena opisanih gore u tekstu (SL. 5A i 5B) 3' homologni krak je napravljen projektovanjem Pl-Scel mesta -3431 bp 5' na ljudski VA3-29P segment gena sadržan u 27.468 bp genomskom fragmentu ljudskeAsekvence iz BAC klona RP11-761113. Ovo Pl-Scel mesto je služilo kao tačka spajanja da se pridruži -94 kb fragment dodatne ljudskeAsekvence na -27 kb fragment ljudskeXsekvence koja se preklapa sa 5' krajem ljudske A sekvence u prethodnoj modifikaciji korišćenjem +16-A ili +16-Kciljajućih vektora (SL. 5A i 5B). Ova dva ciljajuća vektora su obuhvatila, od 5' do 3', 5' homologni krak koji sadrži bilo -23 kb mišje genomske sekvence 5' endogenogklokusa lakog lanca ili -24 kb mišje genomske sekvence 5' endogenog A lokusa lakg lanca, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto i 121,188 bp ljudske genomskeAsekvence sa 16 hVA segmenata gena, Pl-Scel mesto; -27 kb kojih se preklapa sa 5' krajem ljudske A sekvence od umetanja 16 dodatnih hVA segmenata gena i služi kao 3' homologni krak za ovaj ciljajući konstrukt (SL 5A i 5B, +12-A ili 12-kvektora ciljanja). Homologna rekombinacija ovih ciljajućih vektora nezavisno je stvorila modifikovane mišjeKi A lokuse lakog lanca sa 40 hVA segmenata gena t ljudski JA1 funkcionalno povezan na endogene mišje konstantne gene (Ckili CA2) koje, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog lakog lanca (dno SL, 5A i 5B).
[0222] Na sličan način, +12-Kciljajući vektor je takođe korišćen da uvede 12 dodatnih hVA segmenata gena na druge početne modifikacije koje su obuhvatile više hJA segmenata gena sa i bez integrisane ljudskeksekvence (SL 4B). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjemklokusu je sadržala druge modifikacije koje su stvorile mišjiklokus lakog lanca sa 40 hVA segmenata gena i hJA1, 2, 3 i 7 segmenata gena sa i bez ljudske Vk-Jk genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni mišji Ckgen koji, posle rekombinovanja, vodi formiranju himernog A-klakog lanca.
Primer IV
Identifikacija ciljanih ES ćelija koje nose ljudske A segmente gena lakog lanca
[0223] Ciljana BAC DNK napravljena prema prethodnim Primerimaje korišćena na elektroponzovanim mišjim ES ćelijama da se stvore modifikovane embrionske matične (ES) ćelije za stvaranje himernih miševa koji ispoijavaju ljudske A segmenata gena lakog lanca. Embrionske matične (ES) ćelije koje obuhvataju umetanje nepreraspoređenih ljudskih A segmenata gena lakog lanca su identifikovane pomoću kvantitativnog TAOMAN® ogleda Kompleti i probe specifičnih prajmera su projektovani za umetanje ljudskihA sekvencii udruženih kaseta odabira (prirast alela, GOA), gubitak endogenih mišjih sekvenci i bilo koje kasete odabira (gubitak alela, LOA) i zadržavanje pnrubnih mišjih sekvenci (zadržavanje alela, AR). Za svako dodatno ubacivanje ljudskih A sekvenci, dodatni kompleti i probe prajmera su korišćeni da se potvrdi prisustvo dodatnih ljudskih/.sekvenci kao i kompleti i probe prethodnih prajmera korišćenih da se potvrdi zadržavanje prethodno ciljanih ljudskih sekvenci. Tabela 1 prikazuje prajmere i sa njima povezane probe korišćene za oglede kvantitativne PCR analize. Tabela 2 iznosi kombinacije korišćene za potvrdu umetanja svakog odeljka ljudskih /.segmenata gena lakog lanca za klonove embrionskih matičnih (ES) ćelija
[0224]ES ćelije koje nose ljudske/. segmente gena lakog lanca se opciono transfektuje sa konstruktom koji ispoljava FLP kako bi se uklonila Frt'ed kaseta neomicina uvedena umetanjem ciljajućeg konstrukta koji sadrži ljudske VA.5-52 - VaJ-40 segmente gena (SL. 5A i 5B). Kaseta neomicina može opciono da bude uklonjena oplemenjivanjem na miševima koji ispoijavaju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, kaseta neomicina je zadržana kod miševa.
Primer V
Generisanje miševa koji ispoijavaju ljudske A lake lance iz endogenog lokusa lakog lanca
[0225]Ciljane ES ćelije opisane gore u tekstu su korišćene kao donor ES ćelije i uveene u embrion miša u staidujumu od 8-ćelija mišjeg embriona postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr. US Pat. br. 7,294,754 i Pouevmirou et al. (2007) FO generation mice that are essentiallv fully derived from the donor gene-targeted ES cells allovving immediate phenotvpic analvses Nature Biotech 25(1 ):91-99). VELOCIMICE® (FO miševi su u potpunosti razvijeni iz donor ES ćelije) nezavisno noseći ljudske A segmente gena identifikovane genotipovanjem korišćenjem modifikacije ogleda alela (Valenzuela et al., supra) koji su detektovali prisustvo jedinstvenih ljudskih A segmenata gena(supra)
[0226] Upotreba mišjegk:A lakog lanca koji nose ljudskeA segmentegena lakog lanca Homozigotni miševi za svaka tri uzastopna umetanja hVA segmenata gena se jednim hJA segmentom gena (SL. 5B) i miševi homozigotni za prvo umetanje hVA segmenata gena sa bilo jednim hJAsegmentom gena ili četiri ljudska JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (SL 4B) su analizirani za k i A ispoljavanje lakog lanca u splenocitima korišćenjem protočne citometrije
[0227]Ukratko, jetre su prikupljene iz grupa miševa (koje se kreću od tri do sedam životinja po grupi) i samlevene korišćenjem staklenih klizišta. Posle lize (destrukcije, razgradnje) crvenih ćelija krvi (RBCs) sa ACK puferskim sredstvom za razgradnju (Lonza VValkersville). splenociti su postavljeni sa antitelima konjugovanim fluorescentnom bojom specifičnim za mišji CD19 (Clone 1 D3; BD Biosciences), mišji CD3 (17A2; Biolegend), mišji IgK (187.1; BD Biosciences) i mišji IgA (RML-42; Biolegend). Podaci su prikupljeni korišćenjem BD™ LSR II protočne citometrije (BD Biosciences) i analizirani korišćenjem FLOVVJO™ softvera (Tree Star, Inc.), Tabela 3 iznosi prosečne procenutalne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), k laki lanac (CD19<+>lgK<+>lgA~)h iAlaki lanac (CD19+lgk1gA+) ispoljavanje pnmećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose različite genetske modifikacije
[0228]U sličnom eksperimentu, sadržaji B ćelije pregrade za jetru iz mišjih homozigota za prvo umetanje 12 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ckgen (dno SL. 4B) i mišji homozigot za 40 hVA i jedan hJA segment gena (dno SL 5B ili vrh SL. 7B) su analizirani za IgK i IgA ispoljavanje korišćenjem protočne citometrije (kako je gore opisano). SL. 8A pokazuje ispoljavanje IgA i IgA u CD19<+>B ćelijama za miša koji je predstavnik za svaku grupu. Broj CD19<+>B ćelija po jetri je takođe zabeležen za svaki mišji (SL. 8B)
[0229]U drugom eksperimentu, sadržaji B ćelije pregrade za jetru i koštanu srž iz mišjih homozigota za prvo umetanje 40 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ckgen (dno SL. 7B) su analizirani za napredovanje kroz razvoj B ćelije korišćenjem protočne citometrije različitih markera površine ćelije
[0230]Ukratko, dve grupe (N=3 svaka 9-12 nedelja stari, muški i ženski) divljeg tipa i miševi homozigotni za 40 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ck- gen su žrtvovani i pokupljene su jetre i koštana srž Koštana srž je prikupljena iz butnih kostiju ispiranjem sa potpunom podlogom RPMImedijum (RPMImedium dopunjen sa serumom telećeg fetusa, natrijum piruvatom, Herpes, 2-merkaptoetanolom, neesencijalmm amino kiselinama, i gentamicinom). RBC preprarati iz jetre i koštane srži su lizovani sa ACK puferskim sredstvom za lizu (Lonza VValkersville), posle čega je usiedilo pranje sa potpunom RPMI podlogom 1x10,6 ćelije su inkubirane sa antitelima koja jako reaguju sa antigenima miša CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu tokom 10 minuta, posle čega je usledio označavanje sa odabranim panelom antitela tokom 30 min. na ledu.
[0231]Panel koštane srži: anti-mišja FITC-CD43 (1 B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-lgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5,5-lgD (11-26c.2a, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3. BD) i Pacific Blue-CD3 (17A2. BioLegend).
[0232]Panel koštane srži i slezine: anti-mišji FITC-lgk(187.1. BD). PE-lgž. (RML-42, BioLegend). PeCy7-lgM (11/41 ebioscience), PerCP-Cy5 5-lgD (11-26c.2a, BioLegend), Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience). APC-H7-CD19 (ID3, BD)
[0233]Posle bojenja, ćelije su oprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Prikupljanje podataka je izvedeno na FACSCANTOII™ protočnoj citometnji (BD Biosciences) i analizirani sa FLOVVJO™ softverom (Tree Star, Inc.). SL. 9A - 9D pokazuju rezultate za slezinsku pregradu jednog miša predstavnika iz svake grupe. SL. 10A - 10E pokazuju rezultate za pregradu koštane srži jednog miša predstavnika za svaku grupu. Tabela 4 iznosi prosećne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), k laki lanac (CD19<+>lgX<+>lg/,_) iXlaki lanac (CD19+lgk~lg/.<+>) ispoljavanje primećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose svaku genetsku modifikaciju. Tabela 5 prikazuje prosečne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), zrele B ćelije (B220<hi>lgM<+>). nezrele B ćelije (B220<int>igM<+>), nezrele B ćelije koje ispoijavaju k laki lanac (B220intlgM+lgk-+) i nezrele B ćelije koje ispoijavaju X laki lanac (B220'<nt>lgM<+>lgX<+>) primećeno u koštanoj srži divljeg tipa i miševima homozigotnim za 40 hV/. i četiri hJA. segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ck gen. Ovaj eksperiment je ponovljen sa dodatnim grupama miševa opisanim gore i pokazao je slične rezultate (podaci nisu prikazani).
[0234] Upotreba ljudskogV?,gena kod miševa koji nose ljudske X segmente gena lakog
lanca.Miševi heterozigotni za prvo umetanje ljudskih A sekvenci (hVA3-12-hVA3-1 i hJA1, SL. 5B) i homozigotni za treće umetanje ljudskih A sekvenci (hVA5-52 - hV/,3-1 i hJA1. SL. 5B) su analizirani za ljudskikgen lakog lanca korišćenjem reverzne polimerazne lančane reakcije transkriptaze (RT-PCR) koršćenjem RNK izolovanih iz splenocita.
[0235]Ukratko, slezine su prikupljene i prelivene sa 10 mL RPMI-1640 (Sigma) sa 5% Hl-FBS u sterilnim vrećama za jednokratnu upotrebu. Svaka vreća koja je sadržala jednu slezinu je zatim postavljena u STOMACHER™ (Seward) i homogenizovana na srednjoj postavci tokom 30 sekundi Homogenizovane slezine su filtrirane korišćenjem 0.7 pm cediljke za ćelije i zatim su peletirane centrifugom (1000 ob/min tokom 10 minuta) i RBCs su lizovane u BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) tokom tri minuta. Splenociti su rastvoreni sa RPMI-1640 i ponovo centrifugirani, posle čega je sledilo vraćanje u suspenziju u 1 mL PBS (Irvine Scientific) RNK je izotovana iz peletiranih splenocita korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici
[0236]RT-PCR je izveden na RNK splenocita korišćenjem prajmera specifičnih za ljudske hVA segmente gena i mišji Cicgen (Tabela 6). PCR proizvodi su bili prečišćeni gelom i klonirani u pCR2.1-TOPO TA vektor (Invitrogen) i sekvencionirani prajmerima napredni M13 Forward (GTAAAACGAC GGCCAG; ID BR SEK: 55) i reverzni M13 Reverse (CAGGAAACAGCTATGAC; ID BR SEK56) su smešteni unutar vektora na lokacijama koje su prirubno postavljene na mesto kloniranja Ukupno osamdeset četiri klona je izvedeno iz prvog i trećeg umetanja ljudskeksekvence su sekvencionirane da se odredi hVA upotreba gena (Tabela 7) Sekvenca nukleotida hVA-hJA1-mCK ukrštanja za odabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL. 11.
[0237]Na sličan način, homozigotni miševi za treće umetanje ljudskihAsekvence gena lakog lanca (tj. 40 hVA segmente gena i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu dno SL. 7B) funkcionalno povezano na endogeni mišji Ckgen su analizirani za upotrebu ljudskog A gena lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore u tekstu). Upotreba ljudskog A segmenta gena lakog lanca za 26 odabranih RT-PCR klonova je prikazana u Tabeli 8. Sekvenca nukleotida hVA-hJA-mCK ukrštanja za odabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL. 12.
[0238]Na sličan način, homozigotni miševi za prvo umetanje ljudskihAsegmenata gena lakog lanca (12 hVA segmenata gena i hJA1, SL. 4A i SL 5A) funkcionalno povezan na endogeni mišji CA2 gen su analizirani za upotrebu ljudskog A gena lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore). Prajmeri specifični za hVA segmente gena (Tabela 6) su spareni sa jednim od dva prajmera specifična za mišji CA2 gen. CA2-1 (ID BR SEK 104) ili CA2-2 (ID BR SEK:105).
[0239]Više hVA segmenata gena preraspoređenih u hA1 je primećeno iz RT-PCR klonova iz miševa koji nose ljudskeAsegmente gena lakog lanca na endogenom mišjemAlokusu lakog lanca. Sekvenca nukleotida hVA- hJA-mCX2 ukrštanja za izabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL 13
[0240]SL. 11 pokazuje sekvencu hVA-hJA1-mCK ukrštanja za RT-PCR klonove iz miševa koji nose prvo i treće umetanje hVA segmenata gena sa jednim hJ?, segmentom gena, Sekvence prikazane na SL 11 ilustruju jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hVA segmente gena sa hJA1 rekombinovanom na mišjem Ck- genu. Heterozigotni miševi koji nose samo jedan modifikovani endogeniklokus sa 12 hVA segmenata gena i hJA.1 i homozigotne miševe koji nose dva modfikovana endogena k lokusa koji sadrže 40 hVA segmenata gena i hJA1 su oba bila sposobna da proizvedu ljudskeAsegmente gena funkcionalno povezane na mišji Ckgen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudske A lake lance. Ova preraspoređivanja pokazuju da su himerni lokusi mogli da nezavisno prerasporede ljudskeAsegmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, ove modifikacije na enogenomklokusu lakog lanca nisu dale nijedan od hVA segmenata gena inoperativan ili sprečile da himerni lokus rekombinuje više hVA i hJA(JA1) segmenata gena tokom razvoja B ćelije kako su potvrdili dokazi pomoću 16 različitih hVA segmenata gena koji su primećeni da se preraspoređuju sa hJA1 (Tabela 7). Dalje, ovi miševi su napravili funkcionalna antitela koja su sadržala preraspoređene ljudske VA-JA segmente gena funkcionalno povezane na mišje Ck gene kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0241]SL. 12 pokazuje sekvencu hVA-hJA-mCK ukrštanja za odabrane RT-PCR klonove iz mišjih homozigotnih za 40 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu Sekvence prikazane na SL. 12 ilustruju dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju više različitih hVA segmenata gena, koji se prostiru kroz ceo raspon himernog lokusa, sa više različitih hJA segmenata gena preraspoređenih i funkcionalno povezanih na mišji Ckgen. Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogene k lokuse koji sadrže 40 hVA i četir hJA segmenata gena su mogli da proizvedu ljudskeXsegmente gena funkcionalno povezane na mišji Ckgen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudskeX,lake lance. Ova preraspoređivanja još pokazuju da su sve faze himernih lokusa mogle da nezavisno prerasporede ljudskeXsegmente gena u više. nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, ove dodatne modifikacije na endogenomklokusu lakog lanca pokazuju da umetanje ljudskih X segmenata gena ne daje nijedan od hVX i/ili JX segmenata gena inoperativnim ili spreče himerni lokus od rekombinovanja hVX i JX segmenata gena tokom razvoja B ćelije kako je potvrđeno pomoću 12 različitih hVX segmenata gena koji su primećem da se prerasporede sa sva četiri hJX segmenta gena (Tabela 8} od 26 odabrana RT-PCR klona. Dalje, ovi miševi su napravili i funkcionalna antitela koja su sadržala ljudskeVA-JAsegmente gena funkcionalno povezane na mišje Ckregione kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0242]SL. 13 pokazuje sekvencu hVA-hJA-mCA2 ukrštanja za tri pojedinačna RT-PCR klona iz mišjih homozigotnih za 12 hVA segmenata gena i hJAl Sekvence prikazane na SL. ilustruje dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hVX segmente gena, u rasponu dužine od prvog umetanja, sa hJX1 preraspoređenim i funkcionalno povezanim na mišji CX2 gen (2D1 = VX2-8JX1; 2D9 = VX3-10JX1; 3E15 = VA3-1JA1). Jedan klon je pokazao neproduktivno preraspoređivanje usled N dodavanja na hVA-hJA ukrštanja (2D1, SL.13) Ovo nije neubičajeno za V(D)J rekombinaciju, kao spajanje segmenata gena tokom rekombinacije se pokazala kao neprecizna, lako ovaj klon predstavlja neproduktivni rekombinant prisutan u repertoaru lakog lanca ovih miševa, ovo pokazuje da genetski mehanizam koji doprinosi raznovrsnosti pri ukrštanju među genima antitela radi normalno kod ovih miševa i vodi do repertoara antitela koji sadrži lake lance sa većom raznovrsnošću.
[0243]Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogene A lokuse sa 12 hVA segmente gena i hJA1 su takođe mogli da proizvedu ljudske X segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišjiCAgen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile reverzne himerneXlake lance koji obuhvataju hVX povezane na mišje CX regione. Ova preraspoređivanja još pokazuju za ljudskeXsegmente gena lakog lanca postavljene na drugom lokusu lakog lanca (t.j., X lokus) da su mogli da se nezavisno prerasporede ljudskiXsegmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa Dalje, modifikacije na endogenom X lokusu lakog lanca pokazuju da je umetanje ljudskihXsegmenata gena ne daje nijedan od hVA i/ili hJA1 segmenata gena inoperativnim ili spreče himerni lokus od rekombinovanja hVA i hJX1 segmenata gena tokom razvoja B ćelije. Pored toga, ovi miševi takođe prave funkcionalna antitela koja obuhvataju ljudske VA-JA segmente gena funkcionalno povezane na mišji CAregion kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina,
[0244]Kao što je prikazano na ovom primeru, miševi koji nose ljudskeAsegmente gena lakog lanca na endogenimki A lokusima lakog lanca su sposobni za preraspoređivanje ljudskihka segmenata gena lakog lanca i njihovo ispoljavanje u kontekstu mišjeg Cki/ili CA regiona kao deo normalnog repertoara antitela miša zato što je funkcionalni laki lanac neophodan na različitim kontrolnim tačkama u razvoju B ćelije za jetru i koštanu srž. Dalje, rani podskupovi B ćelija (npr., pre-, pro- i tranzicione B ćelije) pokazuju normalan fenotip kod ovih miševa u poređenju sa leglom štenaca divljeg tipa (SL 9D, 10A i 10B) Primećen je mali nedostatak u koštanoj srži i perifernih populacija B ćelija, kojima se mogu pripisati deleciji podskupa auto-reaktivmh nezrelih B ćelija i/ili podoptimalnog udruživanja ljudskogXlakog lanca sa mišjim teškim lancem. Međutim, IgK/lgA, upotrebu primećenu u ovim prikazuje situaciju koja je više nalik na ispoljavanje ljudskog lakog lanca nego na ono što je primećeno kod miševa.
Primer VI
Odgajanje mišjeg ispoljavanja ljudskih/.lakih lanaca iz endogenih lokusa lakog lanca
[0245]Da se optimizuje upotreba ljudskihXsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, miševi koji nose nepreraspoređene ljudskeXsegmente gena su odgajani na drugom mišjem koji obuhvata brisanje u suprotnom endogenom lokusu lakog lanca (bilokiliX).Na primer, ljudskiXsegmenti gena pozicionirani na endogenomklokusu bi bili jedini funkcionalni segmenti gena lakog lanca prisutni kod miša koji takođe nose brisanje na endogenom >.. lokusu lakog lanca Na ovaj način, dobijeno potomstvo bi ispoljilo samo ljudskeXlake lance kako je opisano u prethodnim primerima Odgajanje je izvedeno standardnim tehnikama priznatim u tehnici i, alternativno, pomoću komercijalnih kompanija (npr., The Jackson Laboratorv) Mišji sojevi koji nose ljudske sgemente gena lakog lanca na endogenomklokusu i brisanje endogenogXlokusa lakog lanca se skeniraju na prisustvo jedinstvenih reverzno-himemih (Ijudsko-mišjih)Xlakih lanaca i odsustvo endogenih mišjihXlakih lanaca
[0246]Miševi koji nose nepreraspoređeni ljudskiXlokus lakog lanca se takođe odgajaju sa miševima koji sadrže zamenu endogeniog mišjeg lokusa promenljivg gena teškog lanca sa ljudskim lokusom promenljivog gena teškog lanca (videti US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, the VELOCIMMUNE® genetski projektovani miš). VELOCIMMUNE® miš obuhvata, delimično, koji ima genom koji obuhvata ljudske promenljive regione ljudskog teškog lanca koji su funkcionalno povezani na endogena mišje lokuse konstantnog regiona tako da miš proizvodi antitela koja obuhvataju ljudski promenljivi region teškog lanca i mišji konstantni region teškog lanca kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira promenljive regione teških lanaca antitela može da bude izolovana i funkcionalno povezana na DNK koja kodira konstantne regione teškog lanca čoveka DNK može zatim da se ispolji u ćeliji koja je sposobna da ispolji potpuno ljudski teški lanac. Prema odgovarajućem rasporedu odgoja, dobijaju se miševi koji nose zamenu endogenog mišjeg lokusa lakog lanca sa ljudskim lokusom teškog lanca i nepreraspoređenim ljudskim/. lokusom lakog lanca na endogenom k lokusu lakog lanca. Antitela koja sadrže somatski mutirane ljudske promenljive regione teškog lanca i ljudskeXpromenljive regione lakog lanca mogu da se izoluju posle imunizacije sa antigenom od interesa
Primer VII
Generisanje antitela iz miševa koji ispoijavaju ljudske teške lanceiljudskeXlake lance
[0247]Posle uzgajanja miševa koji sadrže nepreraspoređeni ljudskiX lokuslakog lanca na različite željene sojeve koji sadrže modifikacije i brisanja drugih endogenih Ig lokusa (kako je opisano gore), izabrani miševi su imunizovani sa antigenom od interesa
[0248]Generalno, VELOCIMMUNE® miš koji sadrži jedan od pojedinačnih pre raspoređen ih ljudskih regiona lakog lanca klicine linije se izaziva sa antigenom, i limfnim ćelijama (kao što su B ćelije) se oporavljaju iz seruma životinja. Limfne ćelije mogu da se spoje sa ćelijskom linijom mijeloma da se pripreme ćelijske linije besmrtnih hibridoma, i takve ćelijske linije hibridoma se skeniraju i biraju da se utvrde ćelijske linije hibridoma koje proizvode antitela koja sadrže ljudski teški lanac i ljudskiXlaki lanac koji su specifični za antigen korišćen za imunizaciju DNK koja kodira promenljive regione teških lanaca iXlakih lanaca može da bude izolovana i povezana na željene izotipne konstantne regione teškog lanca i lakog lanca. Zbog prisustva dodatnih hVA segmenata gena u poređenju sa endogenim mišjim A lokusom, raznovrsnost repertoara lakog lanca je dramatično povećana i posle imunizacije daje veću raznovrsnost na antigen-specifićnom repertoaru Dobijene sekvence kloniranog antitela mogu da budu naknadno proizvedene u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira himerna antitela specifična za antigen ili promenljive domene lakog lanca i teškog lanca može da bude izolovana direktno iz limfocita specifičnih za antigen (npr., B ćelije).
[0249]U početku, visokoafinitetna himerna antitela su izolovana tako da imaju promenljivi region čoveka i konstantni region miša. Kao što je gore opisano, antitela se karakterišu i odabiraju za poželjne karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd Mišji konstantni regioni se zamenjuju sa željenim ljudskim konstantnim regionom da se generiše potpouno ljudsko antitelo koje sadrži somatski mutirani ljudski teški lanac i ljudskiXlaki lanac izveden iz nepreraspoređenog ljudskogX lokusalakog lanca ovog pronalaska. Pogodni ljudski konstantni regioni obuhvataju, na primer divlji tip ili modifikovan lgG1, lgG2, lgG3, ili lgG4.

Claims (17)

1. Miš, koji obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (VH), raznovrsnih (DH) i spojnih (JH) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih VH, DH. i/ili JHsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca; i (b) endogeni A (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski lambda promenljivi (hVA) i nepreraspoređeni ljudski lambda spojni (hJA) segment gena, gde mišji obuhvata brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA . segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su operativno povezani na nedirnuti mišji lambda (CA) gen konstantnog regiona pomenute druge VA-JA-CA skupine gena tako da miš ispoljava laki lanac izveden iz, hVA. hJA i mišji CAgen, i pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutomAalelulakoglanca.
2. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeni A (lambda) alel lakog lanca obuhvata više ljudskih VA segmenata gena
3. Miš prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu endogeni A (lambda) alel lakog lanca obuhvata: (a) barem 12 nepreraspoređenih ljudskih VA segmenata gena; ili (b) 13 do 28 nepreraspoređenih ljudskih VA segmenata gena
4. Miš prema patentnom zahtevu 3, pri čemu ljudski VA segmenati gena obuhvataju: (a) hVA-1, hVA4-3, hVA2-8, hVA3-8, hVA-10, hVA2-11, i HVA3-12; ili (b) hVA2-14, hVA3-16, hVa2-18, hVA3-19, hVA3-21, hVA3-22, hVA2-23, hVA3-25, i hVA3-27.
5. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeni A (lambda) alel lakog lanca obuhvata jedan nepreraspoređeni JA segmenata gena koji je hJA1
6. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeni A (lambda) alel lakog lanca obuhvata četiri nepreraspoređena ljudska JA segmenta gena
7. Miš prema patentnom zahtevu 6. pri čemu četiri nepreraspoređena ljudska JA segmenta gena jesu JA1, JA2, JA3, i JA7.
8. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeni A (lambda) alel lakog lanca nema endogeni VA segment gena.
9. Miš prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, 5 i 8, pri ćemu se endogeni k (kappa) alel lakog lanca briše.
10. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu endogeni mišji A alel lakog lanca obuhvata: (a) dodirunu sekvencu ljudskog A lokusa lakog lanca koja ima raspon od VA3-12 do VA3-1; (b) dodirunu sekvencu ljudskogX lokusalakog lanca koja ima raspon od VA3-29 do VA3-1; ili (c) dodirnu sekvencu ljudskogXlokusa lakog lanca koja ima raspon od VA3-29 do VA3-1 i dodirnu sekvenculjudskog Xlokusa lakog lanca koja ima raspon od VA5-52 do VA1-40.
11. Izolovana ćelija koja ispoljava laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CX gena, pri čemu je ćelija iz, ili može se dobiti iz, miša prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, i pri čemu ćelija obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (Vh). raznovrsnih (Dh) i spojnih (Jh) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih Vh, Dh, i Jhsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca: i <b) endogeniX(lambda) alel lakog lanca koji obuhvata preraspoređeni ljudski promenljivi lambda (hVA) i preraspoređeni ljudski spojni lambda (hJA) segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjegXalela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su operativno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute druge VA-JA-CA skupine gena, i pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutomA alelulakog lanca.
12. Izolovana ćelija prema patentnom zahtevu 11, pri čemu ćelija jeste B ćelija.
13. Izolovana mišja embrionska matična (ES) ćelija obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (Vh). raznovrsnih (Dh) i spojnih (Jh) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih Vh, Dh, i Jhsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca; i (b) endogenomX(lambda) alelu lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski lambda promenljivi (hVA) i nepreraspoređeni ljudski lambda spojni (hJA) segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjegAalela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su operativno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute druge VA-JA-JA skupine gena, pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca
14. Mišji embrion obuhvata, napravljen iz, ili koji se može dobiti iz, pomenute mišje ES ćelije prema patentnom zahtevu 13. pri čemu mišji embrion obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (Vh), raznovrsnih (Dh) i spojnih (Jh) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih Vh. Dh, i Jhsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca, i (b) endogeni A (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski lambda promenljivi (hVA) i nepreraspoređeni ljudski lambda spojni (hJA) segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su operativno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute druge VA-JA-CA skupine gena, i pri čemu se endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutomAalelu lakog lanca.
15. Upotreba B ćelije prema patentnom zahtevu 12 da se napravi hibridom koji ispoljava laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CA gena pri čemu je hibridom iz, ili se može dobiti iz miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu ćelija obuhvata: (a) zamenu jednog ili više promenljivih (Vh), raznovrsnih (Dh) i spojnih (Jh) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih Vh, Dh, i Jhsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca; i (b) endogeni A (lambda) alel lakog lanca koji obuhvata preraspoređeni ljudski lambda promenljivi (hVA) i preraspoređeni ljudski lambda spojni (hJA) segment gena, i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjeg A alela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskimVA iJA segmentima gena koji su operativno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute druge VA-JA-CA skupine gena i pri čemu endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom X alelu lakog lanca.
16. Hibridom koji ispoljava laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjegCAgena pri čemu je hibridom iz, ili se može dobiti iz miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu ćelija obuhvata (a) zamenu jednog ili više promenljivih (Vh), raznovrsnih (Dh) i spojnih (Jh) segmenata gena teškog lanca sa jednim ili više ljudskih Vh, Dh, i Jhsegmenata gena na endogenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca; i (b) endogeniA(lambda) alel lakog lanca koji obuhvata preraspoređeni ljudski lambda promenljivi (hVA) i preraspoređeni ljudski lambda spojni (hJA) segment gena. i brisanje prve VA-JA-CA skupine gena pomenutog endogenog mišjegAalela lakog lanca i zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge VA-JA-CA skupine gena pomenutog alela sa pomenutim ljudskim VA i JA segmentima gena koji su operativno povezani na nedirnuti mišji CA konstantni region gena pomenute druge VA-JA-CA skupine gena i pri čemu endogeni pojačavači Enh 2.4, mišji lambda 3' pojačavač (Enh) i Enh 3.1 održavaju nedirnuti u pomenutom A alelu lakog lanca.
17. Postupak za pravljenje antitela kod miša koji obuhvata: (a) izlaganje miša prema patentnom zahtevu 1 antigenu; (b) omogućavanje mišu da razvije imuni odgovor na antigen; i (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje antigen, ili izolovanje iz miša (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, ili identifikovanje kod miša (b) sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje antigen, pri čemu antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjeg CA gena.
RS20160548A 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka RS55042B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35731410P 2010-06-22 2010-06-22
US35731710P 2010-06-22 2010-06-22
EP12195716.1A EP2568049B1 (en) 2010-06-22 2011-06-22 Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain with a human variable region

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55042B1 true RS55042B1 (sr) 2016-12-30

Family

ID=44509861

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160496A RS55037B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi
RS20171091A RS56589B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina
RS20160548A RS55042B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka
RS20190533A RS58736B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju imunoglobinski hibrid lakog lanca sa ljudskom varijabilnom regijom
RS20160483A RS54891B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160496A RS55037B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi
RS20171091A RS56589B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190533A RS58736B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju imunoglobinski hibrid lakog lanca sa ljudskom varijabilnom regijom
RS20160483A RS54891B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom

Country Status (30)

Country Link
US (22) US9035128B2 (sr)
EP (7) EP2568049B1 (sr)
JP (17) JP6009441B2 (sr)
KR (16) KR101970944B1 (sr)
CN (4) CN103068994B (sr)
AU (1) AU2011271046B2 (sr)
BR (3) BR112012032991B1 (sr)
CA (2) CA2804311C (sr)
CY (5) CY1117537T1 (sr)
DK (5) DK2905338T3 (sr)
ES (5) ES2570131T3 (sr)
HR (5) HRP20160794T1 (sr)
HU (5) HUE029691T2 (sr)
IL (12) IL313063A (sr)
LT (4) LT3034608T (sr)
ME (5) ME02440B (sr)
MX (6) MX347322B (sr)
MY (6) MY195214A (sr)
NO (1) NO2905338T3 (sr)
NZ (6) NZ627119A (sr)
PL (5) PL2480675T3 (sr)
PT (5) PT3034608T (sr)
RS (5) RS55037B1 (sr)
RU (3) RU2724736C2 (sr)
SG (4) SG10201504324UA (sr)
SI (5) SI2480675T1 (sr)
SM (5) SMT201900241T1 (sr)
TR (1) TR201905992T4 (sr)
WO (2) WO2011163314A1 (sr)
ZA (5) ZA201300062B (sr)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2010039900A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Aliva Biopharmaceuticals, Inc. Non-human mammals for the production of chimeric antibodies
CA2747534C (en) 2008-12-18 2020-08-18 Erasmus University Medical Center Rotterdam Non-human transgenic animals expressing humanised antibodies and use therof
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN102638971B (zh) 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
HRP20151188T4 (hr) 2010-02-08 2021-10-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miš sa zajedničkim lakim lancem
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
PL3251503T3 (pl) 2010-03-31 2024-07-08 Ablexis, Llc Modyfikacja myszy metodami inżynierii genetycznej w celu wytworzenia przeciwciał chimerycznych
SI2480675T1 (sl) 2010-06-22 2016-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miši, ki izražajo lahko verigo s spremenljivo regijo humanega lambda in konstantno mišjo regijo
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
RU2580017C2 (ru) 2010-07-26 2016-04-10 Трианни, Инк. Трансгенные животные и способы применения
KR102306967B1 (ko) 2010-08-02 2021-10-01 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ｖｌ 도메인을 포함하는 결합 단백질을 생성하는 마우스
PT3865581T (pt) 2011-08-05 2024-10-04 Regeneron Pharma Murganhos da cadeia leve universal humanizada
AU2012311286B2 (en) 2011-09-19 2018-07-26 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
EP3741862A1 (en) 2011-09-19 2020-11-25 Kymab Limited Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
PT3527070T (pt) 2011-12-20 2025-12-19 Regeneron Pharma Murganhos de cadeia leve humanizada
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
HK1200271A1 (en) 2012-03-16 2015-08-07 瑞泽恩制药公司 Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics
KR102213535B1 (ko) 2012-03-16 2021-02-08 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 pH-민감성 면역글로불린 서열을 발현하는 비-사람 동물
DK2825036T3 (en) 2012-03-16 2018-07-16 Regeneron Pharma Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents to generate them
EP2831245A1 (en) 2012-03-28 2015-02-04 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) * 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
MY185881A (en) 2013-02-20 2021-06-14 Regeneron Pharma Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
EP4218409B1 (en) * 2013-03-13 2025-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
PL2967012T3 (pl) 2013-03-14 2021-04-19 Erasmus University Medical Center Rotterdam Transgeniczne ssaki inne niż człowiek do wytwarzania przeciwciał
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
JP6621750B2 (ja) * 2013-09-18 2019-12-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ヒスチジン操作軽鎖抗体およびそれを生成するための遺伝子改変非ヒト動物
CA2925723A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US20170101460A1 (en) * 2014-01-10 2017-04-13 Allermabs Co. Ltd. Transgenic animals capable of producing humanized ige at much higher levels than mouse ige
CN106164092A (zh) * 2014-03-21 2016-11-23 瑞泽恩制药公司 表现不同结合特征的vl抗原结合蛋白
CN106255410B (zh) 2014-03-21 2020-01-10 瑞泽恩制药公司 产生单结构域结合蛋白的非人动物
AU2015271709B2 (en) 2014-06-06 2020-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) and uses thereof
KR20170083534A (ko) 2014-09-19 2017-07-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 키메라 항원 수용체
SG10201902924RA (en) 2014-10-03 2019-05-30 Massachusetts Inst Technology Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof
TWI711630B (zh) 2014-11-21 2020-12-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗ｃｄ７３抗體及其用途
CN107278206B (zh) 2014-12-19 2021-04-02 雷根尼桑斯公司 结合人c6的抗体及其用途
MY187045A (en) 2014-12-23 2021-08-27 Bristol Myers Squibb Co Antibodies to tigit
WO2016124709A1 (de) 2015-02-05 2016-08-11 Basf Se Solarkraftwerk mit einem ersten wärmeträgerkreislauf und einem zweiten wärmeträgerkreislauf
US11111314B2 (en) 2015-03-19 2021-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
EA035412B1 (ru) 2015-05-29 2020-06-10 Бристол-Майерс Сквибб Компани Антитела к ox40 и их применение
US10479838B2 (en) 2015-06-29 2019-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to CD40 with enhanced agonist activity
CN105274116B (zh) * 2015-10-21 2020-09-29 重庆金迈博生物科技有限公司 一种制备人源化抗体的核酸分子及其应用
CA3005855A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
WO2017095939A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
AU2017213633B2 (en) 2016-02-04 2023-08-03 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
CA3016187A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy with anti-cd73 antibodies
KR20180114223A (ko) 2016-03-04 2018-10-17 더 락커펠러 유니버시티 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체
US10968279B2 (en) 2016-05-09 2021-04-06 Bristol-Myers Squibb Company TL1A antibodies and uses thereof
US20170332610A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
KR102483193B1 (ko) 2016-06-03 2023-01-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소를 발현하는 비인간 동물
WO2017214089A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing antibodies with human lambda light chains
US20170371963A1 (en) * 2016-06-27 2017-12-28 Facebook, Inc. Systems and methods for identifying matching content
SG11201900026TA (en) 2016-07-14 2019-01-30 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against tim3 and uses thereof
US10981976B2 (en) 2016-08-31 2021-04-20 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus K envelope (HERV-K) and use thereof
CA3040189A1 (en) 2016-10-13 2018-04-19 Massachusetts Institute Of Technology Antibodies that bind zika virus envelope protein and uses thereof
CN109906272A (zh) 2016-10-31 2019-06-18 国立大学法人鸟取大学 产生人抗体的非人动物和使用该非人动物的人抗体制作方法
PT4082334T (pt) 2016-11-04 2025-05-21 Regeneron Pharma Animais não humanos possuindo um lócus da cadeia leve lambda de immunoglobulina geneticamente modificada
EA201991720A1 (ru) 2017-02-17 2020-01-20 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антитела к альфа-синуклеину и их применения
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
TW202438676A (zh) 2017-12-05 2024-10-01 美商再生元醫藥公司 具有經改造免疫球蛋白λ輕鏈的非人類動物及其用途
JP7358361B2 (ja) 2018-01-12 2023-10-10 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用
CA3093407A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against mica and/or micb and uses thereof
SG11202008799PA (en) 2018-03-24 2020-10-29 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals for generating therapeutic antibodies against peptide-mhc complexes, methods of making and uses thereof
WO2019190990A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents for testing therapeutic agents
WO2019236671A1 (en) * 2018-06-08 2019-12-12 Crystal Bioscience Inc. Transgenic animal for producing diversified antibodies that have the same light chain ii
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
US20220003822A1 (en) 2018-10-26 2022-01-06 Vehicle Energy Japan Inc. Battery control device
BR112021009111A2 (pt) 2018-11-16 2021-08-24 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos anti-nkg2a e usos dos mesmos
EP3914622A1 (en) 2019-01-22 2021-12-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against il-7r alpha subunit and uses thereof
SG11202107589PA (en) 2019-02-22 2021-08-30 Regeneron Pharma Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof
SG11202111258TA (en) * 2019-06-05 2021-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals having a limited lambda light chain repertoire expressed from the kappa locus and uses thereof
FI3993623T3 (fi) * 2019-07-01 2025-05-25 Zoetis Services Llc Muuntogeeniset jyrsijät ja niiden käyttömenetelmät
IL293330A (en) 2019-12-02 2022-07-01 Regeneron Pharma mhc ii peptide protein structures and uses thereof
WO2021231732A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
WO2021261620A1 (ko) * 2020-06-25 2021-12-30 주식회사 휴맵 이형접합성 형질전환 동물
KR20230066386A (ko) 2020-09-11 2023-05-15 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항원 특이적 항체의 확인 및 제조
AU2021400584A1 (en) 2020-12-16 2023-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
KR20230124594A (ko) 2020-12-23 2023-08-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 막관통 단백질 및 이를 생산하는 세포에 결합하는 항체를 수득하는 방법
US20240317849A1 (en) 2020-12-23 2024-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
WO2023199655A1 (ja) 2022-04-13 2023-10-19 日本精工株式会社 軸受装置の状態の検出方法、検出装置、およびプログラム
USD999969S1 (en) * 2022-04-29 2023-09-26 Shenzhen Intellirocks Tech. Co., Ltd. Lamp
WO2024163477A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 University Of Rochester Immune checkpoint blockade therapy for treating staphylococcus aureus infections
EP4705342A2 (en) 2023-05-04 2026-03-11 Novasenta, Inc. Anti-cd161 antibodies and methods of use thereof
US20250361320A1 (en) 2024-02-27 2025-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof
US20260123608A1 (en) 2024-08-06 2026-05-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof
WO2026096736A1 (en) 2024-10-31 2026-05-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents expressing humanized polymeric immunoglobulin receptor

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7041871B1 (en) * 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU662148B2 (en) 1991-04-10 1995-08-24 Scripps Research Institute, The Heterodimeric receptor libraries using phagemids
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
ATE549918T1 (de) * 1996-12-03 2012-04-15 Amgen Fremont Inc Menschliche antikörper, die ausdrücklich menschliches tnf alpha binden
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
CN101498731A (zh) * 2000-05-18 2009-08-05 日本烟草产业株式会社 抗协同刺激信号转导分子ailim的人单克隆抗体及其药物用途
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
IL155977A0 (en) * 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
GB0031284D0 (en) * 2000-12-21 2001-01-31 Ks Biomedix Ltd High affinity antibodies
EP1970448A1 (en) * 2001-05-11 2008-09-17 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Human artificial chromosome containting human antibody lambda light chain and non-human animal containting the human artificial chromosome capable of genetic transmission
GB0115256D0 (en) * 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
EP3698626A1 (en) 2001-11-30 2020-08-26 Amgen Fremont Inc. Transgenic animals bearing human ig lambda light chain genes
US20030217171A1 (en) 2002-05-17 2003-11-20 Von Stuermer Wolfgang R. Self-replicating and self-installing software apparatus
CN103205436B (zh) * 2003-07-15 2016-05-25 人类多克隆治疗公司 人源化免疫球蛋白基因座
CN1605628A (zh) * 2003-09-03 2005-04-13 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Cho细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体
PT1773885E (pt) * 2004-08-05 2010-07-21 Genentech Inc Antagonistas anti-cmet humanizados
WO2006044962A1 (en) 2004-10-19 2006-04-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
CN101111521B (zh) * 2004-12-29 2011-08-24 株式会社柳韩洋行 肿瘤坏死因子-α特异性人源化抗体
JP5514539B2 (ja) 2006-03-31 2014-06-04 メダレックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー ヒト抗体の調製に用いるためのキメラ抗体を発現するトランスジェニック動物
WO2008022391A1 (en) * 2006-08-22 2008-02-28 G2 Inflammation Pty Ltd Method for producing antibodies
LT2769992T (lt) 2006-10-02 2021-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Didelio afiniškumo žmogaus antikūnai, atpažįstantys žmogaus il-4 receptorių
US7864492B2 (en) 2006-10-31 2011-01-04 Siemens Industry, Inc. Systems and methods for arc fault detection
DE102007045897A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren zur mikroskopischen dreidimensionalen Abbildung einer Probe
EP2271758B1 (en) * 2008-04-14 2018-09-12 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
ES2436044T3 (es) * 2008-05-23 2013-12-26 Ablexis, Llc Procedimiento de generación de anticuerpos de dominio VL individual en animales transgénicos
WO2010039900A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Aliva Biopharmaceuticals, Inc. Non-human mammals for the production of chimeric antibodies
CA2747534C (en) * 2008-12-18 2020-08-18 Erasmus University Medical Center Rotterdam Non-human transgenic animals expressing humanised antibodies and use therof
CN102638971B (zh) * 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
HRP20151188T4 (hr) * 2010-02-08 2021-10-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miš sa zajedničkim lakim lancem
CN103228130B (zh) 2010-06-17 2016-03-16 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
SI2480675T1 (sl) 2010-06-22 2016-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miši, ki izražajo lahko verigo s spremenljivo regijo humanega lambda in konstantno mišjo regijo

Also Published As

Publication number Publication date
NZ626979A (en) 2015-05-29
CN103068994B (zh) 2016-01-20
AU2011271043A8 (en) 2016-01-21
CA2804311A1 (en) 2011-12-29
PL3034608T3 (pl) 2019-08-30
KR20180135996A (ko) 2018-12-21
NZ605758A (en) 2014-08-29
US20200239837A1 (en) 2020-07-30
RU2016119423A3 (sr) 2019-11-19
MY194456A (en) 2022-11-30
AU2011271043A9 (en) 2015-10-01
PT2480676E (pt) 2016-06-09
SI2905338T1 (sl) 2017-12-29
US9226484B2 (en) 2016-01-05
JP6963542B2 (ja) 2021-11-10
HRP20160794T1 (hr) 2016-08-12
IL291301A (en) 2022-05-01
EP2480675A1 (en) 2012-08-01
ME02902B (me) 2018-04-20
US9150662B2 (en) 2015-10-06
US20190153384A1 (en) 2019-05-23
MX347318B (es) 2017-04-21
US20150246977A1 (en) 2015-09-03
KR20180135997A (ko) 2018-12-21
US20140137275A1 (en) 2014-05-15
IL264634B (en) 2019-09-26
JP6243384B2 (ja) 2017-12-06
US20240327785A1 (en) 2024-10-03
DK3034608T3 (da) 2019-05-06
CY1118126T1 (el) 2017-06-28
US20150089680A1 (en) 2015-03-26
US9006511B2 (en) 2015-04-14
MY157477A (en) 2016-06-15
KR20190014576A (ko) 2019-02-12
RU2016119423A (ru) 2018-11-07
US20170258059A1 (en) 2017-09-14
LT2480675T (lt) 2016-10-10
KR20210134424A (ko) 2021-11-09
ZA201300063B (en) 2014-09-25
IL300712B1 (en) 2024-07-01
CN104342455B (zh) 2017-05-31
CY1119478T1 (el) 2018-03-07
US20130323790A1 (en) 2013-12-05
CA2804311C (en) 2017-09-12
IL282872A (en) 2021-06-30
PL2905338T3 (pl) 2018-01-31
SG186390A1 (en) 2013-01-30
RU2724736C2 (ru) 2020-06-25
HK1183321A1 (en) 2013-12-20
US20120073004A1 (en) 2012-03-22
JP6341972B2 (ja) 2018-06-13
NO2905338T3 (sr) 2017-12-30
EP2905338B8 (en) 2018-01-24
JP2018201528A (ja) 2018-12-27
JP5988969B2 (ja) 2016-09-07
EP2905338A1 (en) 2015-08-12
IL259965B (en) 2019-02-28
US20150173331A1 (en) 2015-06-25
JP2017006152A (ja) 2017-01-12
MY195217A (en) 2023-01-11
US9035128B2 (en) 2015-05-19
SMT201600213B (it) 2016-08-31
PT3034608T (pt) 2019-05-28
SMT201600229B (sr) 2016-08-31
WO2011163314A1 (en) 2011-12-29
ES2646052T3 (es) 2017-12-11
KR20130027555A (ko) 2013-03-15
JP2026066390A (ja) 2026-04-16
ME03386B (me) 2020-01-20
US9394373B2 (en) 2016-07-19
HUE036597T2 (hu) 2018-07-30
JP6545773B2 (ja) 2019-07-17
US20170107484A1 (en) 2017-04-20
US20160057979A1 (en) 2016-03-03
IL269078B (en) 2021-05-31
IL282872B (en) 2022-04-01
JP2018201527A (ja) 2018-12-27
SMT201600212B (it) 2016-08-31
KR102506001B1 (ko) 2023-03-07
LT2905338T (lt) 2017-12-27
US20130326647A1 (en) 2013-12-05
CN104342455A (zh) 2015-02-11
SMT201900241T1 (it) 2019-05-10
CA2803864A1 (en) 2011-12-29
ES2570131T3 (es) 2016-05-17
JP2016010415A (ja) 2016-01-21
AU2011271046B2 (en) 2015-10-01
DK2568049T3 (en) 2016-08-01
US9163092B2 (en) 2015-10-20
ME02444B (me) 2016-09-20
DK2905338T3 (da) 2017-11-06
ME02440B (me) 2016-09-20
CN104404050B (zh) 2018-06-08
CY1122877T1 (el) 2021-05-05
HRP20160865T1 (hr) 2016-10-07
ZA201300062B (en) 2014-09-25
HRP20190807T1 (hr) 2019-08-23
IL223719A (en) 2016-10-31
US9066502B2 (en) 2015-06-30
KR102118565B1 (ko) 2020-06-03
RU2013102596A (ru) 2014-07-27
US20160060359A1 (en) 2016-03-03
KR20200064166A (ko) 2020-06-05
US9012717B2 (en) 2015-04-21
JP2018023403A (ja) 2018-02-15
IL259965A (en) 2018-07-31
MX2012015298A (es) 2013-05-01
US9206263B2 (en) 2015-12-08
EP3205726A1 (en) 2017-08-16
ZA201404601B (en) 2016-02-24
ZA201404600B (en) 2015-09-30
RS54891B1 (sr) 2016-10-31
DK2480675T3 (en) 2016-08-01
KR20200143511A (ko) 2020-12-23
US9206262B2 (en) 2015-12-08
IL223720A (en) 2017-05-29
PL2568049T3 (pl) 2017-03-31
BR122020013427B1 (pt) 2021-08-03
PL2480676T3 (pl) 2016-10-31
KR101991234B1 (ko) 2019-06-20
IL291301B2 (en) 2023-07-01
CA2803864C (en) 2017-05-16
KR101975884B1 (ko) 2019-05-10
LT3034608T (lt) 2019-05-27
SG10201504568YA (en) 2015-07-30
KR20190049932A (ko) 2019-05-09
JP2013531501A (ja) 2013-08-08
NZ707200A (en) 2016-04-29
KR20210013376A (ko) 2021-02-03
KR102211911B1 (ko) 2021-02-05
IL247386A (en) 2017-07-31
KR102059909B1 (ko) 2019-12-27
US10266803B2 (en) 2019-04-23
US20180064078A1 (en) 2018-03-08
HK1170766A1 (zh) 2013-03-08
TR201905992T4 (tr) 2019-05-21
KR102320944B1 (ko) 2021-11-04
KR102193823B1 (ko) 2020-12-22
SI2480675T1 (sl) 2016-08-31
MX336344B (es) 2016-01-15
PT2480675T (pt) 2016-07-11
EP2480676B1 (en) 2016-04-06
HK1226766A1 (en) 2017-10-06
IL255179B (en) 2018-06-28
US9334333B2 (en) 2016-05-10
JP6009441B2 (ja) 2016-10-19
US20150246976A1 (en) 2015-09-03
JP2021061863A (ja) 2021-04-22
KR20190014578A (ko) 2019-02-12
BR112012032991A2 (pt) 2015-10-06
IL300712B2 (en) 2024-11-01
CN103068994A (zh) 2013-04-24
JP2019033765A (ja) 2019-03-07
IL255179A0 (en) 2017-12-31
KR101934852B1 (ko) 2019-01-04
RS55037B1 (sr) 2016-12-30
KR20130121814A (ko) 2013-11-06
LT2568049T (lt) 2016-10-10
MX347322B (es) 2017-04-21
BR112012032991A8 (pt) 2020-09-29
EP3034608B1 (en) 2019-01-30
JP2020062061A (ja) 2020-04-23
BR112012033248A2 (pt) 2017-11-28
PL2480675T3 (pl) 2017-03-31
PT2568049T (pt) 2016-07-11
US20150176002A1 (en) 2015-06-25
US9850462B2 (en) 2017-12-26
JP2017012204A (ja) 2017-01-19
US20120070861A1 (en) 2012-03-22
JP2020128440A (ja) 2020-08-27
JP2023133554A (ja) 2023-09-22
CN103068993B (zh) 2016-01-06
BR112012032991B1 (pt) 2021-08-10
KR20190142436A (ko) 2019-12-26
RU2013102595A (ru) 2014-07-27
JP2013532974A (ja) 2013-08-22
JP2022066449A (ja) 2022-04-28
ZA201506598B (en) 2017-03-29
CN103068993A (zh) 2013-04-24
US20150320023A1 (en) 2015-11-12
RS58736B1 (sr) 2019-06-28
HRP20160497T1 (hr) 2016-07-15
HUE029692T2 (en) 2017-03-28
AU2011271043A1 (en) 2013-01-31
EP3034608A1 (en) 2016-06-22
JP7236409B2 (ja) 2023-03-09
ME02442B (me) 2016-09-20
IL300712A (en) 2023-04-01
MY195214A (en) 2023-01-11
KR102462042B1 (ko) 2022-11-03
KR102001430B1 (ko) 2019-07-18
KR20210073609A (ko) 2021-06-18
CY1117537T1 (el) 2017-04-26
ES2575223T3 (es) 2016-06-27
KR101945352B1 (ko) 2019-02-07
NZ627119A (en) 2015-05-29
KR102266097B1 (ko) 2021-06-18
PT2905338T (pt) 2017-11-10
RS56589B1 (sr) 2018-02-28
NZ605751A (en) 2014-10-31
IL269078A (en) 2019-11-28
JP6073441B2 (ja) 2017-02-01
HUE044001T2 (hu) 2019-09-30
AU2011271046A1 (en) 2013-01-31
CN104404050A (zh) 2015-03-11
SI3034608T1 (sl) 2019-06-28
US9206261B2 (en) 2015-12-08
JP2025027148A (ja) 2025-02-26
IL291301B1 (en) 2023-03-01
WO2011163311A1 (en) 2011-12-29
US9029628B2 (en) 2015-05-12
AU2011271043B2 (en) 2015-10-01
US9399683B2 (en) 2016-07-26
SG186391A1 (en) 2013-01-30
SI2480676T1 (sl) 2016-10-28
MX348942B (es) 2017-07-04
MX2012015300A (es) 2013-05-01
US20150351371A1 (en) 2015-12-10
CY1117692T1 (el) 2017-05-17
KR101970944B1 (ko) 2019-04-23
US9844212B2 (en) 2017-12-19
EP2568049A1 (en) 2013-03-13
US20150173332A1 (en) 2015-06-25
KR20190073584A (ko) 2019-06-26
IL244450A0 (en) 2016-04-21
MY165287A (en) 2018-03-21
EP2568049B1 (en) 2016-04-13
MX2022002117A (es) 2022-03-17
KR20220150430A (ko) 2022-11-10
US9540452B2 (en) 2017-01-10
EP2480675B1 (en) 2016-04-06
SG10201504324UA (en) 2015-07-30
RU2590594C2 (ru) 2016-07-10
ES2576928T3 (es) 2016-07-12
HUE029691T2 (en) 2017-03-28
ES2721749T3 (es) 2019-08-05
HK1168384A1 (zh) 2012-12-28
RU2601297C2 (ru) 2016-10-27
NZ707198A (en) 2016-04-29
HUE030285T2 (en) 2017-05-29
SI2568049T1 (sl) 2016-10-28
IL313063A (en) 2024-07-01
EP2480676A1 (en) 2012-08-01
SMT201700506T1 (it) 2018-01-11
HRP20171666T1 (hr) 2017-12-15
JP2016010417A (ja) 2016-01-21
IL244450A (en) 2017-11-30
EP3456832A1 (en) 2019-03-20
EP2905338B1 (en) 2017-08-02
US20190203171A1 (en) 2019-07-04
KR20230036157A (ko) 2023-03-14
MY195212A (en) 2023-01-11
DK2480676T3 (en) 2016-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6963542B2 (ja) ハイブリッド軽鎖マウス
RS58709B1 (sr) Miševi koji čine antitela teškog lanca
AU2011271043B8 (en) Mice expressing a light chain with human lambda variable and mouse constant regions
HK40010621A (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain
HK1242732A1 (en) Mice with humanised lambda variable gene segments
HK1170766B (en) Mice expressing a light chain with human lambda variable and mouse constant regions
HK1226766B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain with a human variable region
HK1183321B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain with a human variable region
AU2015275242A1 (en) Hybrid light chain mice
HK1168384B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain
AU2015275243A1 (en) Mice expressing a light chain with human lambda variable and mouse constant regions