RS55121B1 - Terapeutska primena proteina ss2-mikroglobulina - Google Patents

Description

(00011Predmetna patenta prijava odnosi se na polje medicine, konkretno, na tretman autoimunskih oboljenja.

[0002JKonkretnije, pronalazak se odnosi na primenu beta2-mikroglobulinskog proteina (|32m) kao aktivnog sastojka farmaceutske kompozicije namenjene tretmanu autoimunskih oboljenja, kao što su multipla skleroza ili Kronova bolest.

PREAMBULA

|0003]Molekul (32m je protein sa prosečnom molekulskom masom od oko 11.6 kDa, sastavljen od 99 aminokiselina, a koji se nalazi u sastavu glavnog kompleksa tkivne kompatibilnosti (MHC 1 ili HLA 1) [Cunningham B.A. et al.. The complete amino acid sequence of beta-2-microglobulin (1973) Biochemistry 12: 4811-4821],

[0004jPodsetićemo se da MHC I kompleks tkivne kompatibilnosti igra značajnu ulogu u prepoznavanju "sopstva" od "ne-sopstva" od strane imunskog sistema. Ovi kompleksi su prisutni na površini većine ćelija ljudskog organizma, osim na eritrocitima. Ćelije na svojoj površini ispoljavaju brojne antigene na osnovu kojih T limfociti (CD8) razlikuju sopstvene ćelije od onih koje su mu strane, bolesne ili koje se podlegle tumorskoj transformaciji.

|0005)MHC I kompleks sastavljen je od glikozilovanog teškog lanca (HC), molekulske težine 44 kDa i lakog lanca, koji nosi oznaku p2m, koji se ne-kovalentno povezuje sa vanćelijskim domenom teškog lanca, a-lanac MHC I sastavljen je od tri vanćelijska domena (al, a2 and a3) i transmembranskog segmenta, kao što je prikazano na Slici 1A. Lanac p2m povezuje se sa sekvencom aminokiselina koja se nalazi u zoni u kojoj se kraj al domena i početak a3 domena HC nalaze u međusobnoj apoziciji [Gussov, D. et al. (1987), The human beta-2-microglobulin gene: primarv structure and definition of transcriptional unit (1987) Journal of Immunologv 139:3132-3138]. Geni koji kodiraju MHC I molekule nose brojčane oznake na osnovu redosleda otkrivanja, klasifikovani su u grupe (A, B i C) i komplekse (D, H i G).

[0006]Antigen-prezentijuće ćelije (APCs) posredstvom MHC 1 kompleksa prezentuju antigene T-ćelijama (CD8) imunskog sistema. Antigeni koje MHC 1 prezentuje načelnu su mali polipeptidi sastavljenih od 8 do 10 aminokiselina, koji nastaju degradacijom endogenih proteina u proteazomima, Antigeni se unose u takozvane peptidne "špilje", koje nastaju na površini subjedinica (HC i p2m) MHC I kompleksa, tokom njegovog formiranja unutar endoplazminog retikuluma. Kada se antigeni unesu u ove površinske špilje. MHC kompleksi se iznose na površinu ćelije. Ugrađivanje MHC I kompleksa u ćelijsku membranu omogućeno je transmembranskim domenom teškog lanca u u3 domenu. [0007|Subjedinica koju formira p\2m protein, razlikuje se od teških lanaca, jer poseduje gotovo ne-varijabilnu sekvencu, dok sam polipeptid nije giikozilovan. |0008|Iako fiziološka uloga još uvek nije potpuno razjašnjena, pokazano je da f32m protein igra dominantnu ulogu u odnosu na druge proteine koji formiraju MHC I kompleks, s jedne strane nakon sklapanja MHC l/antigen kompleksa [Androlewicz MJ., et al. (1994) MHC class 1/(32-microglobulin complexes associate with TAP transporters before peptide binding. Nature 368, 864-867], u kojem se P2m protein specifično vezuje za TAP-1 protein, [Corr et al. 1992. Endogenous peptides of a soluble major histocompatibilitv complex class I molecule H-2Lds: sequence motif, quantitative binding and molecular modeiing of the complex, JEM. 176(6) : 1981-92], što osigurava održavanje pravilne konfonnacije antigen-vezujućeg mesta [Ljunggren, H-G. (1990) Empty MHC class I molecules come out in the cold. Nature. 346, 476 - 480] i, s druge strane, kada se MHC l/antigen kompleks eksportuje na površinu ćelije. p\2m je uključen u pravilno sklapanje teškog lanca, a utvrđeno je da je uključen u prezentaciju antigena T-ćelijama (CD8). p2m takođe doprinosi održavanju stabilnosti MHC-l/antigen kompleksa [Neefjes, F.F. et al. (1993) Selective and ATP-dependent translocation of peptides by the MHC-encoded transporter. Science. 261 (5122): 769-771]. |0009)Transgene životinje sa potpuno inaktiviranim (32m genom sposobne su za život, ali imaju izuzetno slab imunski odgorov, zbog Čega su podložnije virusnim i parazitskim infekcijama. Slabljenje imunskog odgovora kod ovih životinja u vezi je sa činjenicom da njihove ćelije prezentuju malo antigena u odnosu na njihov MHC I kompleks, te da većina T limfocita kod ovih životinja nije funkcionalna [Pereira P., et al. (1992) Blockade of transgenic gamma delta T cell development in beta 2-microglobulin deficient miče, EMBO Journal 11:25-31].

[0010]Postoje podaci da je P2m protein uključen u glikolizaciju teških lanaca u Goldžijevom aparatu [Sege et al. (1981) Role of beta2-microglobulin in the intracellular processing of HLA antigens. Bioehemistrv. 20 (16), pp 4523-4530]. 10011]Protein p2m je takođe uključen u odvijanje drugih procesa, kao što su regulacija unutarćelijske signalizacije i pravilno savijanje ključnih proteina, kao što je HFE (engl. Human hemochromatosis protein - čovečji hemohromatozni protein), koji kontroliše procese ulaska gvožđa u ćelije.

[0012]Od kraja 1980-tih godina poznato je da p2m može povoljno da utiče na antigeni odgovor, pa se od tada koristi kao adjuvans za vakcine, u cilju stimulacije imunskog odgovora vezanog za T limfocite (CD8). |0013|Brojni dokumenti ukazuju da p2m može biti uključen u sastav vakcina, zajedno sa drugim molekulima čiji je zadatak da indukuju imunsku reakciju, kao što su specifični virusi ili tumorski antigeni. [0014JU takvom sastavu vakcije, P2m može biti prisutan u različitim formama, prečišćen ili rekombinantan. Opisane su genetičke konstrukcije u kojima je gen koji kodira p2m fuzionisan sa genetičkom sekvencom koja kodira imunogene peptide. sa ciljem da eksprimiraju fuzioni proteini koji će izazvati specifične imunske reakcijein- vivo[WO 99/64957]. |0015|Budući da nije glikozilovan, p2m protein je veoma slab imunogen. Stoga se u sastavu vakcina, p2m koristi samo kao adjuvans, a ne kao aktivni sastojak.

[0016]To je najverovatnije zbog činjenice da do danas nije uočen terapeutski efekat p2m koji bi opravdao njegovu primenu u farmaceutskim kompozici jama.

(0017)Osim u vakcinaciji, neka prethodna dokumenta u stanju tehnike pominju prisustvo inaktiviranih ili modifikovanih formi p2m proteina u terapeutskim kompozicijama.

(00181Međunarodna prijava WO 02/102840 stoga opisuje inaktivirani p2m protein koji formira neaktivne MHC I komplekse, koji ne mogu da aktiviraju CD8 T limfocite. Ovako formirani MHC kompleksi koriste se kao"mamac" za imunski sistem sa ciljem da se ostvari imunosupresivni efekat.

|0019]Druga međunarodna prijava WO 02/24929 opisuje terapeutske kompozicije u kojima je P2m konjugovan za HFE proteinom, koji ima ulogu vektora za isporuku leka (aktivnog sastojka ovih kompozicija) u unutarćelijski odeljak.

[0020]Treba naglasiti da se u ovim prijavama P2m protein ne koristi u svojoj izvornoj (wild-type) funkcionalnoj formi kao aktivni sastojak, već kao farmaceutska potpora ili vektor, u prisustvu aktivnih sastojaka koji nisu usmereni na MHC. (00211Štaviše, osim u terapijske svrhe, p2m protein se često koristi kao marker različitih patologija, konkretno, kao dijagnostičko sredstvo. |0022|Na primer, poznato je da sindromu imunodeftcijencije u AIDS, koji se ispoljava i nekoliko godina nakon infekcije HIV virusom, prethodi nagli skok koncentracije p2m u krvi.

[0023|Neke publikacije [Wu C.H. et al. (2001) Oncogene 20:7006-20] naglašavaju da povećanje koncentracije P2m korelira i verovatno je vezano za razvoj nekih kancera, konkretno kancera kostiju i kancera prostate [Gross M. et al. (2007) Clin. Cancer Res., 13:1979-1986]. Kada je reć o drugim kancerima, uočeno je smanjenje P2m koncentracije u serumu, kao što je kancer debelog creva [Kaklamanis L. et al. (1992) Int. J. Cancer 57:379-385].

|0024]U dijagnostikovanju nekih infektivnih i parazitskih bolesti često se određuje nivo p2m u krvi (konkretno u krvnom serumu), cerebrospinalnoj tečnosti ili u ispljuvku, pre svega u dijagnozi nekih bolesti bubrega i limfnog sistema, reumatizma, infiamatornih bolesti i neuroloških bolesti, kao što je Alchajmerova bolest i čeono-slepoočna demencija [Davidsson P. et al. (2002), Proteome analvsis of cerebrospinal fluid proteins in Alzheimer patients Clinical Neuroscience and Pathologv 13: 611-615; Hansson S.F. et al. (2004), Validation of a prefractionation method followed by two-dimensional electrophoresis-Applied to cerebrospinal fluid protein from frontotemporal dementia patients Proteome Science 2:1-11].

[0025JKod zdravih osoba, prosečna koncentracija P2m u krvi ostaje relativno konstantna, u vrednosti koja je manja ili jednaka 2 mg/I, što nije slučaj kod prethodno pomenutih bolesti, kod kojih koncentracija može dostići vrednost od čak 4.0 mg/l.

[0026JKod nekih patologija, povećanje serumskog nivoa P2m može biti uzrokovano povećanim uklanjanjem p2m (oslobađanjem sa površine ćelije) [Bellotti V., et al. (1999) Cell. Mol. Life Sci., 55-977-991].

[0027|p2m koji se nalazi u cirkulaciji i u plazmi normalno se filtrira preko bubrega u glomerulima, zatim se reapsorbuje i razlaže u kanaiićima.

|0028]Izučunavanja su pokazala da polovina ukupnog P2m nivoa u plazmi (slobodna forma p2m), koja se obnavlja svaki dan, potiče od reciklovanja MHC-1 kompleksa. Ovo obnavljanje samo po sebi doprinosi visokoj produkciji serumskog P2m od oko 150 mg/24 h za osobe normalnog stasa. Međutim,"obrt" se stabilizuje na nivou serumske koncentracije od 2 mg/l.

[0029]Kod pacijenata na dijalizi, kod kojih se p2m ne elimniše u bubrezima, akumulacija p2m u telesnim tečnostima ima pogubne efekte. Konkretno, visoka koncentracija p2m indukuje artropatije i neuropatije, usled formiranja amiiodinih plaka u nekim vezivnim tkivima (nervno i artikuiamom) [Ohshi K., et al. Pathogenesis of beta2-microgiobulin amyloidosis (2001) Pathol. Int. 51 :1 -101. [0030|Kod osteoartritisa (artroze). p2m ostvaruje inhibitorni uticaj na proliferaciju hondrocita, usled čega propada hrskavičavo tkivo [WO 2004/020586].

[0031]Promene koncentracije |32m uobičajeno se prate kod pacijenata obolelih od autoimunskih bolesti, kao što je multipla skleroza (MS). kako bi se predvideo početak inflamatornih epizoda [Bagnato, F., (2003), beta-2 microglobulin and neopterin as markers of disease activity in multiple sclerosis Neurol. Sci. 24 :5i 301 -51304]. Poželjno je da se u tim slučajevima koncentracija p2m meri u u cerebrospinalnoj tečnosti. jer se smatra da koncentracija p2m u krvi isuviše varira. [Caudie C. et al. (2005), Valeurs usuelles et utilite diagnostique de la (32-microglobuline dans le liquide cephalorachidien Ann. Biol. Clin. 63(6):631-637; Ryu O.H.. et al.

(2006) Rheumatology, 45:1077-1086].

[0032[Uloga P2m u razvoju autoimunskih bolesti ostala je nepoznata i zahteva dodatna istraživanja.

[0033)Autoimunske bolesti čine veliku grupu bolesti čiji se simptomi mogu pripisati hiperaktivnosti imunskog sistema, uz prisustvo ili odsustvo antitela usmerenih protiv molekula ili tkiva koje su normalno prisutne u organizmu.

[0034]Sa sigurnošću je utvrđeno da je imunski odgovor protiv sopstvenih antigena u autoimunskim bolestima rezultat aktivacije T limfocita posredstvom MHC sistema, što može biti uslovljeno aktivacijom nekoliko mehanizama.

• U imunskom sistemu:

- Indukcijom autoantitela pomoću T ćelija, prezentacijom antigena koje prepoznaju pomenuta autoantitela. Ovo je slučaj kod sistemskog eritematoznog iupusa (SLE), HaŠimoto tireoditisa, multiple skleroze (MS), insulin-zavisnog dijabetesa (tip I), i td.

• U ćelijama:

- Indukcija autoimunskog odgovora aktivacijom T ćelija specifičnih za virusni antigen:

- Promena APC-MHC-I /TcR (receptor T ćelija) prepoznavanja i signalnih kaskada aktiviranih T limfocita.

- Neodgovarajuće povezivanje komponenti MHC-I sistema u APC ćelijama.

- Defekt(i) u funkcionisanju regulatornih ćelija.

• Na molekulskom nivou:

- Molekulska mimikrija ili tolerancija; - MHC I kao autoantigen;

(0035| Načelno se smatra da su autoimunske bolesti nastaju usled interakcija genetičke predispozicije i infektivnog događaja tokom kojeg organizam počinje da razvija imunsku reakciju na sopstvene antigene. Međutim, tačni uzroci ovih bolesti nisu precizno utvrđeni.

|0036|Najrasprostranjenije autoimunske bolesti su reumatoidni poliartritis, Sjogrenov sindrom, Hašimotov tiroiditis, Adisonova bolest, sistemski eritematozni lupus, skleroderma, fibromialgija, miozitis, ankilozni spondilitis, insulin-zavisni dijabetes tipa 1, Kronova bolest, celijačna bolest i multipla skleroza (MS).

|0037] Među poremećajima koji se nazivaju bolesti'"siročad", brojne su one za koje se veruje da su po svojoj prirodi takođe autoimunske bolesti. Amitrofna lateralna skleroza (ALS) je jedna od bolesti za koju još uvek ne postoji adekvatna terapija.

(0038] Razlikuju se dva tipa autoimunskih bolesti: specifične autoimunske bolesti i nespecifične autoimunske bolesti.

[0039|Kod nespeciifčnih bolesti pogođeni su brojni organi, što izaziva sistemsku bolest, kao što je reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus, Sjogrenov sindrom i skleroderma.

|0040]Specifične bolesti su prevashodno ograničene na pojedinačne organe. Najčešći je insulin-zavisni dijabetes tip I, tiroidna bolest, Adisonova bolest, i nekoliko bolesti bubrega, pluća, digestivnog sistema i naročito, multipla skleroza.

(0041]Trenutne terapije obuhvataju širok opseg pristupa, od anti-inflamatomih agenasa i imunosupresornih agenasa, do antimetabolita i anti-kancerskih lekova. Za potrebe ilustrovanja pomenuti su sledeći pristupi: ne-steroidni anti-inflamatorni iekovi (NSAlDs), glukokortikoidi, antimetaboliti (metotreksat, azatioprin), cikiofosfamid, sulfasalazin, soli zlata, ciklosporin A, mikofenolat i leflunomid.

[0042]Od nedavno se pacijentima od MS preporučuje interferon (3, dok se bolesnicima od eritematoznog lupusa i reumatoidnog poliartritisa preporučuju derivati hlorokvina (koji se koristi protiv malarije).

|0043]Pomenuti tretmani, koji se koriste u terapiji mnogih bolesti, nisu sasvim dobro prilagođeni i izazivaju brojne sporedne efekte, naročito kada se primenjuju tokom dužeg

vremena. Takođe. iako delimično umanjuju simptome bolesti, oni ne dovode do izlečenja i remisije.

[0044] Autori ove aplikacije obralili su posebnu pažnju na četiri pacijenta koja boluju od različitih autoimunskih bolesti: - Prvi pacijent (Pl) boluje od ne-specifične autoimunske bolesti, koja ne pogađa specifični organ i od Hašimotovog tiroiditisa i primarnog Sjogrenovog sindroma; - Drugi pacijent (P2) boluje od MS, a naknadno je oboleo od infiltracije limfocita u dvanaestopalačno crevo; - Treći pacijent (P3) boluje od celijačne bolesti;

- Četvrti pacijent (P4) boluje od Hašimotovog tiroditisa i od celijačne bolesti.

[0045| Pronalazači su kod ovih pacijenata želeli da ustanove odnos količina HC (MHC-ABC) / p2m poreklom od limfocita izolovanih iz njihove krvi, primenom konvencionalnih postupaka koji će kasnije biti opisani.

[0046[ Neočekivano, izmerena vrednost HC/p2m odnosa bila je uvećana kod sva četiri pacijenta u odnosu na kontrolne donore, dok je serumska koncentracija p2m bila u skladu sa prosečnim vrednostima: 1.9 mg/l kod Pl, 1.8 mg/l kod P2, 1.1 mg/l kod P3 i 1.1 mg/l kod P4. (uporediti u Tabeli I).

[0047]Rezultati prikazani u Tabeli 1 prikazuju disbalans odnosa HC7p2m. Resultati su neočekivano ukazali da membranski MHC-I kompleksi kod ova četiri pacijenta sadrže značajno manji nivo p2m u odnosu na HC, dok je nivo slobodnog pm u krvi nepromenjen. |0048|Ovi nalazi su upoređeni sa zdravim kontrolama, koje pokazuju vrednost HC7f32m odnosa od oko 1. Suprotno tome, izgleda da se p2m sekvestrira u unutarćelijskom odeijku kod pacijenata sa autoimunskim bolestima. |0049|Ovi rezultati su naveli pronalazače da formulišu hipotezu da pacijenti koji boluju od četiri autoimunske bolesti ispoljavaju deficit p2m unutar membranskih MHC-I komplekasa. Uopšteno govoreći, poremećen odnos HC/p2m u MHC kompleksima u membrani ćelija može da doprinese nastanku poremećaja koji se uočavaju kod autoimunskih bolesti. |0050jU skladu sa postavljenom hipotezom, autoimunska reakcija, u kontekstu patologija od kojih boluju ova četiri pacijenta, očigledno nije posledica generalnog povećanja slobodnog p2m u krvi, već. suprotno, može da bude uzrokovana lokalnim deficitom p2m u membranskim MHC-I kompleksima, usled čega se menja način prezentacije antigena T ćelijama (CD8). |00511Treba naglasiti da ova hipoteza ne isključuje ulogu p2m u aktivaciji T limfocita i u infiamatornim procesima, na način koji je ranije opisan u stanju nauke. |0052|Imajući u vidu prva saznanja, pronalazači su sproveli analizu HC/p2m u ukupnim proteinima limfocita kod drugih pacijenata koji boluju od MS ili Kronove bolesti, i uspeli su da utvrde daje HC/p2m odnos u limfocitima ovih pacijenata takođe veći nego kod zdravih kontrola.|0053]Na osnovu ovih rezultata, pronalazači su razvili farmaceutske kompozicije čiji je osnovni aktivni sastojak p2m protein u funkcionalnoj formi. (0054]Svrha ovih kompozicija je da ublaže deficit p2m u membranskim MHC-I kompleksima kod pacijenata koji boluju od autoimunskih bolesti.

Slika 1:Dijagramsko predstavljanje MHC kompleksa tipa I u ravni (A) i u prostoru(B).Teški lanac (HC) sačinjen je od 3 vanćelijska domena (aI, a2 and rx3) i jednog transmembranskog domena. Laki lanac (P2m) je vanćelijski i umetnut je između membrane i mesta gde se a i i u3 teškog lanca nalaze u međusobnoj apoziciji. Slika B prikazuje poziciju peptida (antigena) prezentovanih od strane teškog lanca.

Slika 2:Mikrografija (*630) limfocita koji su u kontaktu sa lipozomima, saglasno pronalasku. Lipozomi su pripremljeni postupkom dijalize, koji je opisan u Primeru 2. Lipozomi (svetle tačke) su apsorbovani na membranu limfocita (HLA-ABC). Ćelijska jedra su intaktna (sivo).

Slika3: Mikrografija (*630) limfocita koji je u kontaktu sa lipozomima koji sadrže albumin, saglasno pronalasku. Protein (albumin) je obeležen fluorescencijom pomoću

DAP1 boje. Protein se vidi u obliku tamno obojenih tačaka koje se đetektuju imunofluorescencijom, koje ulaze u svetlije obojene limfocite (HLA-ABC pozitivni). Slika 4: Fotografija (*630) lipozoma pripremljenih postupkom istiskivanja (zeleno), koji sadrže fluorescentni p2m (TRITC). A: Fluorescenca emitovana od fluorescentnog lipida NBD-PC-Oleil koji se nalazi u lipozomima. B: Fluorescenca potiče od fluorofore (rodamin B isotiocijanat) spegnute sa p2m. C: Preklapanje dve fluorescencije A i B.Slika5: Mikrografija (*630) prečišćenih limfocita uzetih od pacijenta (Pl) i inkubiranih sa lipozomima, koji su dobijeni postupkom istiskivanja i koji sadrže fluorescentno obeleženi p2m (TRITC). A: Fluorescenca koja potiče od Hoechst 33342 markera koji boji jedra limfocita u plavo. B: Fluorescenca koja potiče od fluorofore (rodamin B isotiocijanat) spregnute sa P2m. Bojenje prikazuje ugrađivanje p2m u limfocite koji su obojeni u crveno. C: Fluorescenca koja potiče od zelenog fluorescentnog lipida NBD-PC-Oleila koji se nalazi u lipozomima. Ovo bojenje prikazuje asocijaciju lipozoma sa limfocitima. D: preklapanje B i C bojenja (žuta boja) - Oznaka skale: 10 um.

Slika6: Mikroskopsko analiziranje fluorescencije lipozoma koji sadrže albumin (TRITC), 30 dana nakon skladištenja na dve različite temperature (25°C and 37°C). Nisu uočene razlike koje potiču od različitih tipova pripreme i čuvanja uzorka. A i B: Serija 30 (30 mg prot./l 50 ml). C i D: Serija 60 (60 mg prot./15() ml).Dole:Fluorescenca poreklom od fluorescentnog lipida NBD-PC-Oleila koji se nalazi u lipozomima.Gore:Fluorescenca poreklom od fluorofore (rodamin B izotiocijanat) spregnute sa albuminom. Oznaka skale: 200 nm. Uvećanje:*630.

Slika7: Distribucija veličine (%) lipozoma (<50 nm, između 50 i 100 nm, > 100 nm) koji sadrže albumin, u funkciji vremena skladištenja (2, 30 i 60 dana) i temperature (25°C i 37°C). A i B: Serija 30 (30 mg prot./l 50 ml), C i D: Serija 60 (30 mg prot./l 50 ml). Slika 8: Distribucija veličine (%) lipozoma (<50 nm, između 50 i 100 nm, > 100 nm) napunjenih p2m (Serija 80 mg prot./I50 ml), tokom vremena skladištenja na temperaturi od 25°C, 6 i 40 dana nakon skladištenja.

Slika9: Profili razgrađivanja čistog p2m ili p2m obloženom lipozomom u serumu pacijenata i zdravih donora u funkciji vremena. A i B: čisti p2m / lipozomski preparat p2m (serum Pacijenta 1 - žena stara 51 godinu, koja boluje od Hašimotove bolesti). C i D: čisti p2m / lipozomski preparat p2m (serum Pacijenta 2 - žena starosti 73 godine, reumatoidni poliartritis). E i F: kontrolni pacijent - zdrav muškarac star 62 godine.

Slika 10:Gel elektroforeza proteina prikazuje asocijaciju p2m (lipozomski preparat) i teškog lanca MHC-1 na površini limfocita prečišćenih iz uzorka pacijenata. A: U prisustvu glutaraldehida. HLA-p2m kompleks se uočava na molekulskoj težini od 55 kDa i slobodni p2m na 12 kDa. Traka na 12 kDa bez prisustva glutaraldehida predstavlja ćelijski P2m (linija 3). B: Kvantifikacija membranske ekspresije p2m. Ova kontrola omogućava da se potrvdi validnost primene glutaraldehida za pripremu HLA-p2m kompleksa. C: Upoređivanje limfocita dobijenih od pacijenata koji boluju od multiple skleroze (žena, 39 godina) i od zdravog donora (muškarac, 67 godina) nakon inkubacije sa lipozomskim preparatom P2m tokom 90 minuta. p2m koji se nalazi u lipozomima više se vezuje za limfocite koji potiču od pacijenta (u prisustvu glutaraldehida) nego kod kontrolnog donora.

Slika 11:"In vitro"test toksičnosti slobodnog p2m ili p2m u lipozomima na kulturi hepatocita i bubrežnih ćelija poreklom od čoveka. A, C i E: test na HH hepatocitama 24, 48 i 72 sata nakon izlaganja. B, D i F: HREpiC ćelije bubrega, 24, 48 i 72 sata nakon od izlaganja. 1. kontrola. 2. Kontrola i nenapunjeni lipozomi. 3. 3 pg slobodnog p2m. 4. 3 ug P2m u formi lipozoma (Serija 66 ug/150 ml). 5. 6 pg slobodnog p2m. 6. 6 pg [i2m u formi lipozoma (serija 132 jLig/' 150 ml). Sadržaj ukupnih proteina određen je BCA postupkom.

Figure 12:" In vitro"test toksičnosti slobodnog p2m ili p2m u lipozomima, na kulturi hepatocita i ćelija bubrega poreklom od čoveka. Korišćene su iste oznake kao na Slici 11. Rezultati MTT testa vijabilnosti.

DETALJAN OPIS

|0055)Predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski proizvod koji kao aktivni sastojak, sadrži, p2-mikroglobulin ili funkcionalnu varijantu tog proteina koja ispoljava najmanje 70% istovetnosti sa čovečjim p2-mikroglobulinom, u farmaceutski prihvatljivom nosaču, naznačeno time daje farmaceutski prihvatljivi nosač lipozom.

|0056] Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutski proizvod, koji, kao aktivni sastojak, sadrži P2-mikroglobulin ili neku funkcionalnu varijantu tog proteina, koja ispoljava najmanje 70%

istovetnosti sa Čovečjim p2-mikroglobu1inom, u farmaceutski prihvatljivom nosaču, za primenu u terapiji autoimunskih bolesti.

(0057)Poželjno je da p2m protein predstavlja čovečju formu ovog proteina, prečišćenu ili rekombinantnu. čije su referentna polipeptidna sekvenca i genetičke determinate deponovane u GENEBANK bazi podataka, pod pristupnim brojem CAG33347.

[0058J Uprečišćenom obliku p2m se može dobiti iz seruma zdravih davalaca.

[0059)Takođe je predviđena hemijska sinteza, s obzirom na to da se protein može koristiti i u neglikolizovanoj formi.

|0060|Trenutna terapeutska primena p2m proširuje se na funkcionalne varijante ovog proteina, odnosno, na njegove izoforme. na mutirane kopije ili na fragmente ovog proteina, naznačeno time da sve navedeno poseduje ista funkcionalna svojstva kao i izvorni protein, odnosno, da ispoljava iste terapeutske efekte kao što je opisano sadašnjom prijavom, uz mogućnost da se intenzitet tog efekta smanji ili poveća u odnosu na izvorni protein.

(0061JKonkretnije, functionalna varijanta označava polipeptid sposoban da se poveže sa MHC kompleksima na ćelijskoj membrani, a čija je polipeptidna sekvenca najmanje 70 %, poželjno najmanje 80 %, poželjnije najmanje 90 %, i još poželjnije, najmanje 95 %, istovetna sa polipeptidnom sekvencom čovečjeg p2m proteina {kada se sekvence upoređuju pomoću, na primer, ClustalVV softverske aplikacije).

|0062]Funkcionalna varijanta p2m poželjno sadrži fragment P2m proteina, koji ispoljava isti terapeutski efekat, ili istu biološku aktivnost.

|0063]Ovakve fukcionalne varijante mogu nastati usled ekspresije nukleotidne sekvence klonirane u neki ekspresioni vektor ili u vektoru za gensku terapiju.

|0064|Brojne publikacije opisuju, na primer, prisustvo izoformi p2m kod glodara [Goding J.W. and Walker l.D. Allelic forms of p2-microglobulin in mouse (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7395-7399] i ljudi [Davidsson P. et al., Proteome analvsis of cerebrospinal fluid proteins in Alzheimer patients (2002) Clinical Neuroscience and Pathology 13: 611-615 ; Hansson S.F. et al., Validation of a prefractionation method follovved by two-dimensional electrophoresis-Applied to cerebrospinal fluid protein from frontotemporal dementia patients (2004) Proteome Science 2:1-11]. Ove izoforme, koje se razlikuju na osnovu različitih izoelektričnih tačaka (pi), smatraju se funkcionalnim varijantama p2m proteina.

|0065| Pomenute funkcionalne varijante mogu imati neke prednosti u odnosu na prečišćeni čovečji protein, u smislu efikasnosti proizvoda ili formulacije (na primer, solubilnost, veća stabilnost, smanjena proteolitička degradacija).

[0066| Predmetni pronalazak razmatra farmaceutske proizvode koji, kao aktivni sastojak sadrže (32-mikroglobulin ili neku funkcionalnu varijantu ovog proteina, koja ispoljava najmanje 70% istovetnosti sa Čovečjim (32-mikroglobulinom, u nekom farmaceutski prihvatljivom nosaču, naznačeno time daje farmaceutski prihvatljivi nosač lipozom.

[0067j Pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju koja sadrži farmaceutski proizvod, kao šio je prethodno opisano.

|0068| p2m protein ili njegova funkcionalna varijanta čini jedini aktivni sastojak naznačenih kompozicija.

[0069| U značenju koje je ovde primenjeno, aktivni sastojak je supstanca koja ulazi u sastav kompozicije leka i koja je odgovorna za njegova farmakodinamička i terapeutska svojstva. U kontekstu predmetnog pronalaska, adjuvans se ne smatra aktivnim sastojkom.

J0070) Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži p2m ili neku funkcionalnu varijantu p2m. sadržanu u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili rastvaraču, naznačeno time da je farmaceutski prihvatljiv nosač ili rastvarač lipozom.

[0071J Saglasno poželjnom obliku izvođenja. p2m se administrira u sastavu naznačenog farmaceutski prihvatljivog nosača ili u fiziološkom rastvoru, u skladu sa regulatornim preporukama i zahtevima.

[0072| Saglasno pronalasku, P2m se primenjuje sa ciljem da uspostavi normalan odnos HC/p2m u sastavu membranskih MHC-I kompleksa kod pacijenta koji se tretira.

[0073| Poželjno je da se tretira odnos HC/p2m u limfocitima i posebno u B ćelijama. HC/p2m odnos odgovara molekulskom odnosu HC i P2m subjedinica u prečišćenim MHC I kompleksima.

|0074|Poželjno je da se ovaj odnos vrati na nivo koji je sličan nivou kod osobe koja ne boluje od bolesti. Poželjnije, p2m se primenjuje sa ciljem da se kod pacijenta smanju odnos HC/p2m na vrednost molamog odnosa blizu 1.

10075[ Predmetni pronalazak je konkretno usmeren na sprečavanje nastanka deficita P2m u sastavu MHC-I kompleksa kod pacijenata koji boluju od autoimunskih bolesti.

[0076]Još konkretnije. primena p2m saglasno pronalasku namenjena je tretmanu autoimunskih bolesti.

[0077|Pronalazak se dakle, odnosi na farmaceutski proizvod koji, kao aktivni sastojak sadrži P2-mikroglobulin ili neku funckionalnu varijantu tog proteina, koja ispoljava najmanje 70% istovetnosti sa čovečjim p2-mikroglobulinom, u farmaceutski prihvatljivom nosaču, za primenu u terapiji autoimunskih oboljenja.

[0078]Pronalazači su bili u mogućnosti da utvrde da deficit unutarćelijskog ili membranskog p2m proteina kod pacijenata koji boluju od autoimunskih bolesti može da uslovi povećanje odnosa HC/p2m na vrednost veću od I ili čak veću od 2. Ovaj pronalazak je dakle, usmeren na uspostavljanje fiziološke vrednosti HC/p2m odnosa, to jeste, poželjno manje od 2. poželjnije manje od 1.5 i najpoželjnije na vrednost manju od l .2.

[0079]Osim kod autoimunskih bolesti, ovaj pronalazak može da se primeni u terapiji svake bolesti koja je povezana sa neravnotežom odnosa HC/p2m u MHC I kompleksima.

[0080|U značenju koje je ovde primenjeno. patologije povezane sa transplantacijom organa ili odbacivanjem translantata ne smatraju se autoimunskim bolestima, niti bolestima koje su uslovljene defektima u prepoznavanju "ne-sopstva<*>od strane imunskog sistema. Preciznije, odbacivanje transplanta uzrokovano je prepoznavanjem "ne-sopstva<*>od strane imunskog sistema, a ne defektom u prepoznavanju "sopstva".

[0081]Analize koje su pronalazači sproveli na pacijenatima koji boluju od različitih bolesti ukazuju da se HC/p2m odnos veći od 1.2, iskazan u odnosu na ukupne proteine limfocita, može uočiti u sledećim bolestima: reumatoidni poliartritis, sistemski eritematozni lupus, Sjogrenov sindrom, skleroderma, fibromialgija, miositis, ankilozni spondilitis, insulin-zavisni dijabetes tipa 1, Hašimotov tireoiditis, Adisonova bolest. Kronova bolest, celijačna bolest, amiotrofna lateranla skleroza (ALS) i multipla skleroza (MS). Iako postoje debate u naučnoj javnosti, ALS je u sklopu predmetnog pronalaska i dobijenih rezultata, uključen u grupu autoimunskih bolesti.

[0082]Konkretnije, pronalazak razmatra razvoj medikamenata za povećanje koncentracije p2m u krv i na vrednost između 2.5 i 12 mg/l, poželjno između 3 i 8 mg/l, još poželjnije između 3 i 5 mg/l, kako bi se ublažio deficit HC/p2m u membranskim MHC-I kompleksima. [0083|Kao što će biti kasnije opisano, eksperimentalni deo predmetnog pronalaska, medikament u skladu sa pronalaskom sastoji se od preparata lipozoma koji sadrže i p2m protein ili neku njegovu funkcionalnu varijantu. Lipozomi se mogu proizvesti primenom različitih postupaka poznatih u stanju tehnike i poznatih stručnjaku, kao što su oni postupci ilustrovani u primerima predmetne aplikacije. Za konstituisanje lipozoma moguće je koristiti različite lipide [Medical Application of Lipozomi (1986) edited by Kunio Yagi, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Karger]. |0084|Poželjan medikament u skladu sa predmetnim pronalaskom sastoji se od lipozoma napunjenih p2m proteinom. [00851Poželjno je da p2m ili funkcionalna varijanta ovog proteina bude jedini aktivni sastojak u navedenom preparatu lipozoma. |0086]Saglasno ovom pronalasku poželjna je primena lipozoma u pripremi medikamenta, jer lipozomi omogućavaju da se p2m zaštiti od proteoiitičke razgradnje i stoga što oni omogućavaju da se P2m na ciljani način isporuči MHC-I kompleksima, konkretno, fuzionisanjem lipozoma sa fosfolipidima koji su osnovni konstituenti ćelijskih membrana. [0087|Saglasno predmetnom pronalasku, pacijent koji se podvrgava tretmanu može se perfundovati rastvorom lipozoma koji sadrže p2m ili može primiti transfuziju limpfocita koji su prethodno bili u kontaktu sa p2m. Dovođenje u kontakt može se sprovesit" ex vivo",inkubacijom limfocita ekstrahovanih iz uzoraka krvi uzetih od istog pacijenta.

[0088]Saglasno poželjnom aspektu pronalaska, medikament koji sadrži p2m. priprema se u formi fiziološkog rastvora. Poželjan postupak za dobijanje medikamenta sastoji se od inkubacije P2m proteina u fiziološkom rastvoru, ex-vw;, sa serumom dobijenim od pacijenta kojem je ovaj medikament namenjen.

[0089]Prethodno opisana farmaceutska kompozicija saglasno predmetnom pronalasku može se naći i u nekoj drugoj odgovarajućoj formi poznatoj stručnjaku u stanju tehnike, pogodnoj za oralnu administraciju, administraciju injektovanjem, perfuzijom ili inhalacijom.

[0090]Naredni aspekt pronalaska odnosi se na dijagnostikovanje autoimunskih bolesti, konkretnije dijagnostikovanje prethodno pomenutih bolesti, pomoćuin- vivoiliin- vitroodređivanja HC/p2m odnosa u MHC I kompleksima.

[0091]Postupak dijagnostikovanja autoimunske bolesti saglasno pronalasku obuhvata korak koji se sastoji od određivanja unutarćelijskog ili membranskog odnosa HC/p2-mikroglobulina u MHC-I kompleksima iz ćelija koje su izolovane od pacijenata.

[0092|Postupak dijagnostikovanja saglasno pronalasku obuhvata:

i) ekstrakciju MHC I kompleksa iz ćelija, poželjno limfocita pacijenata kod kojih se dijagnostikuje autoimunska bolest;

ii) određivanje količina HC i f32m u sastavu navedenih kompleksa;

iii) uspostavljanje HC/p2m molamog odnosa; i

iv) upoređivanje dobijenog HC/p2m odnosa sa prethodno dobijenim rezultatima drugih

pacijenata.

[0093JHC/p2m odnos može se odrediti za cele ćelije (ćelijski HC/p2m odnos), ili poželjno, za membrane (HC/p2m odnos u membranskim MHC 1 kompleksima). Poželjno je da postupak za dijagnostikovanje saglasno predmetnom pronalasku sadrži korak uporedivanja dobijenog HC7p2m odnosa sa kontrolom, ili sa nekim drugim prethodno određenim nivoom, u kontekstu praćenja stanja pacijenta.

[0094|Nivoi HC i p2m proteina mogu se odrediti na standardan način, primenom postupaka poznatih u stanju tehnike, na primer, kvantitativnom imunodetekcijom (na primer, ELISA, Imunodot, "VVestern Blot", mikroredne analize autoantigena i drugo). Izolovanje MHC-I kompleksa se sprovodi primenom poznatih protokola za ekstrakciju ćelijskih i membranskih proteina.

|0095)Postupak dijagnostikovanja saglasno pronalasku može se primeniti u kontekstu terapijskog praćenja pacijenta koji boluje od različitih autoimunskih bolesti.

|0096]Naredni primeri imaju za cilj da dopune opis pronalaska i ni na koji način ne ograničavaju domet predmetnog pronalaska.

PRIMERI

1 -Analiza komponenti HLA-I membranskog kompleksa limfocita pacijenata koji boluju

od autoimunskih bolesti

[0097]Bez ograničenja koje postavlja teorija, pronalazači su razvili radnu hipotezu da povećanje odnosa HC/p2m može da dovede do reakcija autoimunskog tipa. Konkretno, pronalazači su pretpostavili da povećanje nivoa HC, smanjenje nivoa p2m u MHC-I kompleksima ili oba u isto vreme, mogu da izazovu fenomen preterane izloženosti sopstvenih antigena ("over-exposure" of "self") komponentama TcRs. Naglašavamo da p2m štiti neke regione HC i konkretno određuje prezentaciju"ne-sopstva" T ćelijama CD8 tipa [Hill, D.M. et al. (2003), A dominant negative mutant p2-microgobulin blocks the extracellular folding of major histocompatibilitv compiex class I heavy chain. JBC. 278: 5630-5638]. |0098)Da bi dokazala ova hipoteza, sprovedena je prva analiza, sa ciljem da se odrede molarne količine HC i f32m u sastavu MHC I kompleksa izolovanih iz limfocita četiri pacijenta. Rezultati ove analize predstavljeni su u Tabeli 1. koja je prethodno komentarisana.

[0099]Limfociti su izolovani iz uzoraka krvi zdravih davalaca i pacijenata, primenom postupka opisanog kod Lightbodv J. [Manual of Clinical Immunologv, Rose NR., Friedman H. Editors American Societv for Microbiologv VVashington (DC), 1976, pages 851-857] i modifikovanog od strane Hofmana F.M. i saradnika [Ann. J. Clin. Pathol. (1982) 77:710-716]. MHC-I kompleksi su detektovani na celim limfocitima ili na ćelijskim membrana dobijenom primenom postupka opisanog od strane Warley A. i saradnika [Biochim. Biophys-Acta (1973),323: 55-66], sa nekoliko manjih modifikacija. Detekcija proteinskih komponenti MHC-I kompleksa sprovedena je elektroforezom (SDS-PAGE sistem), pramenom postupka po Laemmli-ju U.K.

[Nature (1970) 227:680-685], nakon čega je sledio elektro-transfer na PVDF membrane i imunobloting, saglasno postupku opisanom od strane Towbin H. i saradnika [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:4350-4354]. Proteini su vizuelizovani pomoću sekundarnih antitela povezanih sa alkalnom fosfatazom, i primenom mešavine NBT-DCIP, kao supstrata.

|0100|Primenom postupka vezivanja za glutaraldehid na uzorku ćelijskih membrana, koji će biti opisan kasnije, pokazano je daje višak teških lanaca kompleksa zaista membranskog porekla.J0101]Kao što je prethodno naznačeno, u četiri dodatna slučaja MS-a i u dva slučaja Kronove bolesti pokazan je odnos HC/|32m >1. Ova otkrića su navela pronalazače da razviju eksperimentalni pristup koji će omogućiti uspostavljanje ravnoteže HC/p2m (MHCI), konkretno primenom lipozoma.

2 -Priprema lipozoma napunjenihp2mproteinom:

2. 1-Praćena količine §2m koju treba primeniti kod pacijenata

[0102]Da bi se p2m isporučio na površinu limfocita u dovoljnoj količini, njegova koncentracija u krvi treba da se poveća unutar "razumnih" granica, kako se ne bi aktivirala signalna kaskada na ćelijama koje imaju potencijal da se dele. [0103)Imajući u vidu lakoću kojom se<p>2m odvaja od membrane i eirkuliše u krvnom i bubrežnom sistemu, koncentracija p2mu krvi treba da iznosi između 3 mg/l i 8 mg/l (normalna koncentracija varira oko nivoa od 2 mg/l krvi). Ovo povećanje dovodi do adsorpcije |32m na površinu ćelija. 101041Treba naglasiti da je glavni kompleks tkivne kompatibilnosti tip 1 sačinjen od ekvimolarnih količina (mol/mol) teškog lanca (MW - 43kDa) i p2m (MW = 12kDa). Formira se kompleks (MVV = 55kDa) koji je prema masi sačinjen od 79% teških lanaca i 21 % lakog lanca.

[0105|Prosečan sadržaj proteina u limfocitu je 650 * IO"<12>g, pri čemu sadržaj proteina u membranama limfocita predstavlja samo 1% ukupnog sadržaja proteina, odnosno. 6.5 x 10"<12>g. Ako se pretpostavi da MHC-I čini najviše 1 % ukupnog sadržaja membranskih proteina mirujućih limfocita, maseni sadržaj p2m iznosi oko 1.4 x IO"14 g po limfocitu.

|0106|Uzimajući prosečne fiziološke parametre. 2 - IO6 limfoeita/ml krvi i 5 litara krvi po osobi, opseg"masa" ukupnih MHC-l/osoba (imajući u vidu limfocite) iznosio bi 1.4 * IO"<6>g do 1.8 x 10 6 g p2m poreklom od limfocita Ove vrednosti predstavljaju maksimalne vrednosti. imajući u vidu da su naša prve procene pokazale da se vrednosti kod pacijenata kreću od 0.2 x I0"<4>to 500

* 10"y g u prošeku. S obzirom na to da je prosečna količina u krvi oko 10 mg p2m po osobi, odnosno, da količina značajno više varira od one prisutne na površini limfocita. izgleda daje normalnim uslovima odnos između membranskog p2m i serumskog P2m daleko manji od 1. Stoga nije nerazumno povećati odnos p2m u krvnoj cirkulaciji (povećavajući onkotički parcijalni pritisak), kako bi se nadoknadio deficit membranskog P2m.

|0107|Adminsitracija p2m može se sprovesti na dva načina:

(1) Administracija lipozoma napunjenih p2m. Ovaj tip farmaceutskog nosača trenutno se koristi za administraciju peptida, antitela. genetičkog materijala i td. Primena lipozoma ("veštačkih" ili sintetičkih membrana) podstiče kontakt aktivnog sastojka sa površinom ćelije: (2) Inkubacija aktivnog sastojka u fiziološkom rastvoru sa serumom pacijenta pre

primene. Cilj inkubacije je da lipoproteini seruma đeluju kao vektori na način sličan

lipozomima.

[0I08|Stepen ugradnje P2m u limfocite nakon administracije postupkom 1 ili 2 može da se uporedi sa kontrolnom administracijom; u slučaju drugog načina primene, perfuzijom p2m u fizološkom rastvoru, adminsitrira se 0.10 mg/ml (ukupna zapremina 150 ml), što obezbeđuje 3 mg p2m po litri krvi (serija sa 15 mg P2m /150 ml rastvora lipozoma sa oznakom "Batch 15").

2. 2 Formulaciju lipozoma

[0109]Za pripremu lipozoma (za 1 ml): nakon potpunog uparavanja dihlorometana (CHiCK) u kome su se nalazili konstituenti pod azotom, konstituisan jc tanak film od fosfatidilholina, sa ili bez dodavanja holesterola, sa ili bez dodavanja sfingomijelina ili uz dodavanje holesterola i sfingomijelina. Za ova tri jedinjenja (fosfatidil-holin. holesterol i sfingomijeiin) primenjeni su sledeći odnosi. 10 M, 2 M i 1 M - odnosno, za 1 ml finalnog rastvora 7.60 mg, 0.76 mg i 0.38 mg. U ovaj film dodat je 1 ml fiziološkog rastvora (PBS 10 mM, pH=7.4; HANKS, Tris/Glicin ili DMEM) koji je sadržao 2 mg [32m. Molamost za svako jedinjenje ostaje nepromenjena, ukoliko su lipozomi sačinjeni od fosfatidilholina (10 M). od fosfatidilholina (10 M) i holesterola (2 M), od fosfatidilholina (10 M) i od sfingomijelina (1 M). Moguće je primeniti i druge molarne koncentracije lipidnih komponenti. Količine proteina mogu varirati, a zavisno od slučaja i pH vrednost može biti veća od 7.4. Disperzija lipidnog filma se sprovodi mešanjem 3 sata na temperaturi od 20 do 37°C.

(0110)Lipozomi se formiraju "'deterdžent/dijaliza" postupkom ili postupkom "istiskivanja". U slučaju "istiskivanja", rastvor (Lipofasf<*>, Sodexim S.A., 51140 Muizon, France) propušta se 41 put kroz filter membrane od 100 nm u polikarbonatu, pod pritiskom od 69 bara. Tako dobijeni lipozomi su homogene veličine. Lipozomi se u ovom slučaju čuvaju 2 dana na 4°C i dodaju se suspenziji limfocita (diametar < 100 nm; Slika 4). Za dobijanje većih količina, rastvor (31/hr; sodeksim 2770 ; emulzifleks e3 ; sodeksim s.a.) propušta se 4 puta pri pritisku od 450 bara, kako bi se dobio SUV (small unilamellar vesicules - male jednolamelarne vezikule). [01111Da bi dokazali ugrađivanje p2m u iipozome, adsorpcija lipozoma na ćelijsku površinu i transfer proteina sa lipozoma u unutrašnjost ćelije, u "pre-pilot" testu proizvedeni su fluorescentni lipozomi. Za potrebe testa, proizvedeni su lipozomi koji fluoresciraju na 520 nm ili 572 nm. U lipidnu smešu. pre uparavanja. dodati su 0.5 M NBD-PC ( l-oleil-2-(-6-(((7-nitro-2-l,3-benzoksadiazol-4-il)amino)heksanoil)-sn-glicero-3-fosfoholin) (eksitacija na 490 nm i emisija na 520 nm) ili 0.5 M Liss Rhod PE r (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfatidiletolamin-N-(lizamin rodamin B sufonil) (amonijumova so) (eksitacija na 541 nm i emisija na 572 nm) i dobijen je lipidni film (videti ranije). |0112]Za potrebe pre-pilot eksperimenta, proizvedeni su lipozomi primenom postupka deterdžent/dijaliza. Ovim postupkom takođe su dobijene kalibrisane i stabilisane SUV.

(0113)Ukratko, nakon mešanja tokom 3 sata na temperaturi između 20 i 37°C, micelama suspenzija je dijalizirana nasuprot fiziološkog rastvora koji je sadržao p2m, zajedno sa 4 pM (0.8 mg/ml) n-heksil- pD-glukopiranozidom, tokom 12 h na 4°C u aparatu za mikrodijalizu. Membrana za dijalizu imala je propusni prag od 3.5 kDa, a n-heksil-pD-glukopiranozid (deterdžent) je razblažen na najmanje 1 ppm u finalnim rastvorima. 10114]Dobijeni su lipozomi okvirne veličine od 200 nm u dijametru. Oni su stabilni najmanje 3 meseca, na sobnoj temperaturi i sadrže najmanje 0.1 mg ({32m) /ml inicijalnog rastvora. 10115]Alternativno, primenom postupka istiskivanja (Lipofast) dobijeni su zeleni fluorescentni lipozomi, koji su sadržali J32m prečišćen iz čovečjeg urina (Sigma, USA), pri koncentraciji od 0.6 mg/ml. (32m je obeležen rodamin-B-izotiocijanatom, koji fluorescira crveno (TRITC eksitacija na 540 nm, emisija na 625 nm). Povezivanje p2m i rodamina sprovedeno je saglasno postupku opisanom od strane Riggs, JL, Seiwald, JH, Bruckhalter, JH, Downs, CM i Metcalf TG [Am. J. Pathol. 1958, 34: 1081-1097]. Nakon vezivanja, protein je prečišćen na Sephadex koloni (Pharmacia, Svveden; G-10. zapremina zrnaca 9 ml; unutrašnji dijametar 0.7 mm). Kolona je nabubrela u PBS (Biorad, 10 ml fosfata, 150 mM NaCl, pH 8.3). Protein je eluiran (4.5 - 7.0 ml) u PBS razblaženom sa Milliq vodom (1:1). Lipozomi (Sl.g 4A) su prečišćeni na identičnoj koloni (2.5 - 6.5 ml) i dva puta koncentrovani u rotovaporu (Buchi, Svvitserland). Limfociti izolovani iz krvi pacijenta Pl inkubirani su kao što je prethodno opisano, tokom 90 minuta i analizirani su pod fluorescentnim mikroskopom (SI. 4B). Naši rezultati su pokazali da je 89 % limfocita ugradilo (32m (SI. 4 i 5).

2, 3 - Primena test lipozoma na limfocite održavane " ex vivo" u kulturi

|0116]Da bi prikazali značaj pripreme p2m proteina sa ciljem ugrađivanja u MHC komplekse limfocita. u formi suspenzije lipozoma, limfociti su inkubirani sa lipozomima napunjenim albuminom, proteinom koji je moguće detektovati fluorescencijom na relativno jednostavan način.

(0117)Ugrađivanje proteina u lipozome, kao i primena lipozoma dobijenih prethodno opisanim protokolom na bazi fosfatidil-holina sa Liss Rhod PE, testirani suex- vivo.

[0118)Protein je obeležen fluorescentnim markerom fluoreskaminom. jedinjenjem čija je fluorescencija slična DAPI (Di-Amino Phenyl Indol; eksitacija na 372 nm i emisija na 456 nm). Albumin kristalizovan iz goveđeg seruma markiran je fluorescencijom pomoću fluoreskamina. kovalentno vezanog za N-terminalni kraj proteina, primenom postupka opisanog od strane Hames B.D. i sar. [Gel Electrophoresis of Proteins, a practical approach, Hames BD. and Rickwood D. eds.The practical Approach Series,2<nd>Edition. IRL Press, Oxford, Nevv York, Tokyo. p.67], osim što je markiranje izvedeno u Tris-HCl (25 mM) /Glicinskom puferu (192

mM) (pH=8.3). bez sadržaja deterdženta (SDS). Lipozomi formirani na prethodno opisani način, sadrže 2 mg fluorescentnog albumina po ml rastvora lipozoma.

(0119]Dalje, 0.2 ml suspenzije limfocita (Hank/0.5 mM EDTA, pH=7.4), koja je sadržala 250 000 limfocita, inkubirana je sa 0.2 ml lipozoma koji su formirani da sadrže albumin (pufer 25 mM Tris-Hcl/ 192 mM Glicin, pH=8.3), tokom I sata na 37° C u vlažnoj atmosferi zasićenoj ugljen-dioksidom (CO2, 5%).

[0120*Konačno, kontrolni lipozomi (200 ul), kontrolni limfociti (200 pl) i limfociti tretirani lipozomima napunjenim proteinom (200 ul) postavljeni su na pokrovne pločice prekrivene polilizinom i lamininom, postupkom opisanim od strane Rakotoarivelo C i saradnika [Receptors to steroid hormones and aromatase are expressed by cultured motoneurons but not by glial cells derived from rat embryo spinal cord (2004) Neuroendocrinology 80 :284-297].

|0121]Preparati su analizirani direktno pomoću epifluorescentnog mikroskopa (Axiovert; Zeiss, Germany) ili su fiksirani u rastvoru 4 % (plv) paraformaldehida u vodi tokom 30 minuta, pokrovne pločice su isprane 3 puta u PBS (160 mM, pH=7.2). Preparati su blago permeabilizovani, u 0.1% rastvoru Triton X-100 (v/v), pripremljenom u PBS, tokom 5 min.

[0122]Ćelije su obeležene primamim anti-HLA-ABC antitelima. U nekim slučajevima, ćelijska jedra su markirana fluorescentnom bojom Hoechst (fluorescencija 450 nm plava emisija, DAPI). Korišćena su ista primarna antitela proizvedena u zecu koja su prethodno korišćena za VVestern blot. Primarna antitela su razblažena na 1/50. dok su sekundarna antitela obeležena FITC-om (zelena fluorescencija) i proizvedena u kozi. razblažena na 1/160. Inkubacija je sprovedena u PBS koji je sadržao 2 % albumin iz goveđeg seruma. Pokrovna stakla su obložena Fluorsave-om (Calbiochem. USA) i posmatrana pri uvećanju x63.

[0123]Fotografije na Slikama 2 i 3 prikazuju lipozome adsorbovane na površinu limfocita i deponovanje obeleženog proteina koji se nalazi u lipozomima na ćelijsku membranu tih limfocita.

[0124]Rezultati jasno pokazuju izvodljivost predloženog eksperimentalnog pristupa sa ciljem uspostavljanja ravnoteže HC/p2m u ćelijskoj membrani.

2. 4 - Stabilnost lipozoma ( Slike 6 to 8)

[0125|Prethodno dobijeni"test"-lipozomi napunjeni albuminom, testirani su u različitim uslovima, kako bi se procenila njihova stabilnost tokom vremena.

(0126]Stabilnost je testirana u serijama 30 {koja odgovara koncentraciji 30 mg albumina na 150 ml lipozoma) i 60 (koja odgovara koncentraciji 60 mg albumina na 150 ml lipozoma), u funkciji trajanja inkubacije i temperature pri kojoj se ona odvija.

|0127|Lipidi u sastavu lipozoma su sačinjeni od 636 nmol PC-a i 31.8 nmol NBD-PC-Oleila. Nakon uparavanja do potpune suve materije u struji azota, smeša je rastvorena dodavanjem, kap po kap, i uz snažno mešanje, 1 mi PBS (pH podešen na 7.2), koji je sadržao 200 ili 400 pg albumina (Sigma, USA) (serije 30, odnosno, 60). Lipozomi su zatim dobijeni mehaničkim istiskivanjem pomoću Liposofast-basic sistema (Sodexim. France). Svaka serija je prečišćena na Sephadex G10 koloni. U zadato vreme, 50 u! svake serije je naneseno na pokrovne pločice obložene poli-D-lizin/lamininom i inkubirano je na 37°C tokom 12 h. Biološki materijal je vezan glutaraldehidom tokom 30 minuta na 4°C. Snimci (stabilnost nakon 1 meseca skladištenja. Slika 6) načinjeni su na Axiovert 200 (Zeiss) epifluorescentnom mikroskopu i snimljeni su pomoću Axion vision softverskog paketa. Kada je reč o statističkim analizama (Slika 7), dijametar lipozoma je izmeren pomoću Serf softvverskog paketa (http://www.org/serf). U svakoj seriji« populacija lipozoma je podeljena u tri klase: <50 nm, između 50 i 100 nm i > 100 nm u dijametru. Visina stubića na graficima predstavlja procenat zastupljenosti svake od sub-populacija. Serija 60 koja je čuvana na 37°C pokazuje najveću stabilnost tokom 60 dana skladištenja: 95 % lipozoma ima dijametar <100 nm, sto je idealna veličina za transfer proteina na ćelijsku membranu.

|0I28|I za seriju 80 (80 mg p2m; Slika 8), sproveden je isti test skladištenja na 25°, kako bi se na minimum svela kontaminacija i uparavanje, tokom 6 i 40 dana. Primenjen je isti postupak kao što je prethodno opisano za serije 30 i 60 (albumin). osim što je korišćen nefluorescentni (i2m (533 pg/ml PBS), dok je prečišćavanje izvedeno pomoću kasete za dijalizu (membrana koja propušta molekule do maksimalno 20 kDa, Thermo Scientific, USA). Grafik predstavljen na Slici 8 jasno pokazuje da 98% lipozoma održava idealnu veličinu i do 40 dana skladištenja, za transfer (32m u limfocite (odnosno, dijametar <100 nm).

2. 5 - Zaštita egzogenog (32m sadržanog u lipozomima od proteolitičke degradacije čovečjim

serumom ( Slika 9)

|0129]Serumi su uzeti od zdravih davalaca, kao i od davalaca koji boluju od autoimunskih bolesti (Hašimotov tireoditis, reumatoidni poliartritis). Serumi su inkubirani (90 pl) tokom 15 dana na 25°C, u prisustvu 2 pg prečišćenog f32m (Sigma-Aldrich, USA) ili u formi lipozoma

(Serija 30 lipozomi odgovaraju koncentraciji 30 mg p2m na 150 ml lipozoma). Ukupna zapremina reakcione smeše bila je 130 pl, dopunjena, ako je potrebno dodavanjem PBS (natrijum-fosfat, 10 mM, natrijum-hlorid 150 mM, pH=7.2). Zapremina od 10 pl reakcionog medijuma (odgovara količini od 150 ng), dopunjena do 30 pl denaturišućim puferom (SDS-PAGE, Laemmli), sa 6 M ureom, uzeta je redom, 0, I, 2, 3, 6, 10. i 15. dana. Ovi uzorci su čuvani na -20°C do analize.

[0130]Nakon prikupljanja uzoraka, oni su inkubirani 1 h na 50°C. Proteini su zatim razdvojeni SDS-PAGE elektroforezom, na 12 % akralamidnom gelu (% T '" 12. % C~2.6), koji je sadržao 4 M ureu. |0131]Nakon elektro-elucije na membrane od poliviniliden-difluorida (PVDF), prisustvo p2m detektovano je imunoblotingom, dok je intenzitet signala koji odgovara specifičnoj traci kvantifikovan primenom softverskog paketa ImageJ (NIH, USA). Broj piksela dobijen na ovaj način konvertovan je u pmol p2m proteina (IO"<12>mola), pomoću standardne krive. Grafici predstavljeni na Slikama 9A - F ilustruju dobijene rezultate i prikazuju količinu p2m (izraženu u pikomolima) tokom vremena. Treba naglasiti da se kod osoba koje boluju od autoimunskih bolesti, slobodni p2m dodat u serum degradira tokom vremena, što nije slučaj sa zdravim kontrolama. [0132|U zaključku, postoji progresivna i značajna degradacija slobodnog P2m u serumu poreklom od pacijenata koji boluju od autoimunskih bolesti, što nije uočeno kod kontrola. S druge strane, ova degradacija nije uočena kada se p2m ugradi u lipo zorne. Preciznije, pokazalo se da lipozomi štite P2m od degradacije u serumu, s obzirom na to da nije uočeno značajno smanjenje njegove količine.

[0133]U zaključku, lipozomi štite p2m od degradacije u serumu.

2. 6 - Asocijacija f} 2m sadržanog u lipozomoma, HL A l teškim lancima lokalizovanim na ćelijskoj

membrani (Slika10).

(0134)Kod zdravih osoba i u fiziološkim uslovima, molekuli p2m eksprimirani na membrani limfocita ne-kovalentno su vezani za teške lance HLA. u odnosu 1:1.

[0135)Da bi se ove proteinske asocijacije videle i kvantitiifkovale, razvili smo postupak koji omogućava da se ovi proteini, među kojima se dimeri HLA-P2m. povežu međusobno kovalentnim vezama.

|0136|Razvoj ovog postupka bio je neophodan da bi se izračunao tačan membranski odnos HC/p2m i da bi se pokazalo da se dodati (32in u formi lipozomima. specifično vezuje za teške lance HLA-I.

[0137]Zbog toga smo istražili sposobnost dialdehida, glutaraldehida, da veže amino-grupe proteina svojim dvema aldehidnim grupama. Ove aldehidne grupe povezane su fleksibilnim lancem tri meti lena, što omogućava glutaraldehidu da unakrsno poveže dve amino-grupe koje se nalaze na dva proteina koja stupaju u međusobne interakcije (Sun, T.T.. et al. (1974) Protein-protein proximity in the association of ribosomal subunits of Escherichia coli: crosslinking of 30S protein S16 to 50S proteins by glutaraldehyde or formaldehyde. J. Mol. Biol. 87(3): 509-22).|0138|Saglasno ovom postupku, 5 miliona limfocita prečišćenih MSL-om. isprano je u PBS (pH=7.2) kako bi se eliminisali slobodni amini prisutni u tragovima, a zatim su staloženi centrifugiranjem na 10 000^tokom 10 min i supernatant je odbačen. Ćelije su zatim inkubirane tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, u 1 ml PBS. koji je sadržao 0.25 % glutaraldehida. Tokom inkubacije, tube su okrenute nekoliko puta.

[0139]Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 pl Tris 1 M (pH-7.2), višak amino-grupa nastalih Tris puferom koje je neutralisao glutaraldehid. Limfociti su izolovani centrifugiranjem na 10 000gtokom 10 min, zatim su isprani u I ml PBS kako bi se eliminisali tragovi glutaraldehida. Nakon centri fugiranj a, talog je rastvoren u 400 pl Lemmli pufera. koji je sadržao 4 M ureu, inhibitore proteaza (Roche Diagnostics GmBH, Gennany) i 5 % P-merkaptoetanol, a zatim su zamrznuti na -20°C i Čuvani do analize. [0140|Ćelije su lizirane naizmeničnim smrzavanjem i odnnrzavanjem uzoraka tokom tri uzastopna ciklusa, a zatim su snažno vorteksovane. Uzorci su potom inkubirani 5 min na 95°C i centrifugirani tokom 10 min na 4000g,kako bi se uklonili svi nerastvorni ostaci. Proteini (10 pl homogenata što odgovara broju od 125 000 limfocita) razdvojeni su SDS-PAGE elektroforezom na akrilamidnim gelovima od 10% (% T = 10,% C = 2.6) koji su sadržali 4 M ureu, pri konstantnom naponu (120V). Tako razdvojeni proteini su transferirani polu-suvim postupkom, tokom 40 min na 13 V, u prisustvu tris-glicinskog pufera sa 10 % metanolom, na PVDF membrane aktivirane metanolom pre korišćenja.

[0141]Detekcija p2m izvršena je inkubacijom na sobnoj temperaturi tokom 1 sata u primarnom anti-p2m antitelu, razblaženom na 1/600 (DakoCvtomation, Denmark), a zatim ponovo 1 sat sa sekundarnim anti-zečjim antitelom. spregnutim sa alkalnom fosfatazom. razblaženim na 1/20 000 (Sigma-Aldrich, USA). Kvantitfikacija intenziteta dobijenih traka izvršena je pomoću ImageJ softverske aplikacije (NIH, USA). |0142)Slika 10A prikazuje fotografiju dobijenog gela. U prisustvu glutaraldehida, vidljiva je traka na 55 kDa, uz uobičajenu traku na 12 kDa. Ova traka na 55 kDa odgovara HLA-p2m kompleksu, čija molekulska masa odgovara zbiru molekulskih masa p2m i molekula teškog lanca: 12+43 kDa = 55 kDa. U istom bunariću, vidljiva je proteinska traka na 12 kDa, koja odgovara slobodnoj, ne-kompleksovanoj formi p2m proteina. Nakon kvantifikacije intenziteta pojedinačnih traka, provereno je da li kumulativni intenzitet dve trake od 12 i 55 kDa odgovara intenzitetu trake od 12 kDa u bunariću "bez glutaraldehida". što je intenzitet ukupnog p2m proteina. U oba bunarića, sa i bez glutaraldehida, utvrđena je ista količina ukupnih proteina koji odgovaraju istom broju limfocita nanetih u tim bunarićima. |0143|Da bi se dokazalo da kvantifikacija trake od 55 kDa zaista odgovara količini HLA-P2m kompleksa prisutnog na membrani limfocita, paralelno je primenjen postupak izolovanja prečišćenih ćelijskih membrana limfocita. Ovaj postupak omogućava da se izučavaju proteini prisutni u ćelijskoj membrani limfocita. Određeno je i kvantifikovano prisustvo membranskog P2m proteina (vidi Sliku 10B). Dobijeni rezultati su slični kvantifikaciji trake na 55 kDa, što potvrđuje da ova traka zaista odgovara membranskom HLA-p2m kompleksu. Takođe, odnos membranskog p2m i ukupnog P2m (Slika 10B) jednak je odnosu intenziteta traka na 55 kDa i ukupnog P2m na 12 kDa (Slika 10A). |0144)Tako je proverena ispravnost postupka sa glutaraldehidom, koji je primenjen kako bi se uočio i kvantifikovao stepen ugrađivanja p2m sadržanog u lipozomima, na membrane limfocita izolovanih iz ljudske krvi.J0145)Izabrana su dva donora - jedan zdrav, koji je korišćen kao kontrola i drugi koji boluje od multiple skleroze. Drugi donor je izabran na osnovu deficita membranskog p2m u odnosu na teški lanac HLA-I. Kod ovog pacijenta odnos membranskog HC/p2m iznosio je 1.7. što znači da membrane limfocita sadrže 69 % više teških lanaca nego P2m. |0146)Limfociti dobijeni od dva davaoca (25 ml krvi) podeljeni su u dve serije, od po 4 ml svaki; 2 ml lipozoma koji sadrže p2m u koncentraciji od 40 mg na 150 ml (Serija 40), dodato je u 4 ml limfocita. T(l limfociti su trenutno prikupljeni i isprani PBS-om. Limfociti uzorkovani na Ti«), inkubirani su sa lipozomima tokom 90 min na 37°C pre nego što su prikupljeni i isprani u PBS, kako bi se uklonio višak lipozoma koji nije stupio u reakciju. |0147|Pri ovim uslovima, analizirali smo dve populacije limfocita koje jesu ili nisu tretirane glutaraldehidom (videti prethodni protokol).

[0148]Ukupni proteini, u svakom od ovih uslova inkubacije, razdvojeni su SDS-PAGE eiektroforezom, a zatim se vizuelizovani vvestern blotom. Dobijene rezultate smo ilustrovali na Slici 10C i oni pokazuju da nakon kvantifikacije, za razliku od kontrola, i u prisustvu glutaraldehida, intenzitet trake od 55 kDa (koja predstavlja HLA-p2m kompleks) povećava se za 55 % kod Tw u odnosu na T(1. [0149jOvo povećanje je u skladu sa deficitom [}2m kod ovog pacijenta, koji uslovljava prisustvo slobodnih HLA-I lanaca na membrani limfocita. Time je pokazano da se teški lanci zaista povezuju sa egzogenim p2m proteinom sadržanim u lipozomima.

|0150|Primenjeni eksperimentalni pristup omogućio je dobijanje dokaza za terapeutski koncept ovog pronalaska, odnosno, daje:

• Moguće uspostaviti ravnotežni odnos HLA-p2m kompleksa, dodavanjem ćelijskoj membrani limfocita egzogenog p2m u formi lipozoma. • Pacijent koji ispoljava nedostatak p2m može da ugradi veću količinu p2m od kontrole koja nema potrebu za ovim proteinom. • Ugrađeni p2m zaista se povezuje sa slobodnim HLA molekulima i formira HLA-p2m

dim ere.

[0151)Ukratko, dobijeni eksperimentalni podaci potvrđuju da je moguće, koristeći preparat lipozoma koji sadrže p2m, ciljano delovati na limfocite koji eksprimiraju samo teške lance (HC/p2m > 1), sa ciljem uspostavljanja odnosa HC7p2m koji je blizak fiziološkoj vrednosti. odnosno, ima vrednost blizu1.

3-Analiza toksičnostip2mu formi lipozomske kompozicije

[01521p2m u formi lipozoma testiranje" in vitro"u smislu moguće toksičnosti na kulturi ćelija jetre, bubrega, skeletnih mišića i srčanog mišića poreklom od čoveka.

3. 1 - Tipovi testiranih ćelija

[0153|Testirane ćelijske linije i medij umi za gajenje kultura nabavljeni su od Sciencell Research Laboratories (6076 Corte Del Cedro, Carlsbad, California).

a.HCF:Primarni srčani fibroblasti čoveka, serijski broj No. 2136, Medium: FM (fibroblasni medijum), serijski broj. No. 5673 + rastvor fibroblastnog faktora rasta,

serijski broj. No. 5863 + FBS 10% + rastvor penicilina (100U/ml)-streptomieina (100 pg/ml), serijski broj, No. 5917

b. HREpiC:primarne bubrežne epitelne ćelije čoveka. senjski broj No. 0546 medijum kulture - Medijum epitelnih ćelija, serijski broj No. 5967 + Rastvor epitelnog faktora rasta, serijski broj No. 5855 + FBS 10% + PS c.HH:primarne hepatocite čoveka. serijski broj No. 4607 Medijum kulture: HM (Medijum hepatocita), serijski broj No. 5933 + Rastvor hepatocitnog faktora rasta, serijski broj No. 5722 + FBS 10% + PSd. HSkMC:primarne skeletne mišićne ćelije čoveka. serijski broj. No. 5606 Medijum

kulture: Medijum skeletnih mišićnih ćelija + SkMGS + FBS 10 % + PS

|0154]Flaskovi ili posude za kulturu su postavljeni u inkubator (Sanyo) na 37°C, 5 % CO2i zasićen vodenom parom, (kupatila sa ultra-čistom vodom filtriranom kroz 0.22 pm, Nanopure, Thermo-Fisher).

|0155|Navedene primarne ćelije gajene na podlozi od tretirane plastika za ćelijsku kulturu (TPP, Switzerland) i inkubirane sa poli-L-lizinom pri 2 pg/cirT (Clinisciences; Scienceil Research Laboratories, serijski broj No. 5826, rastvor: 10 mg/ml) tokom noći u inkubatoru, a zatim isprane dva puta sterilnom ultra-čistom vodom pre inokulacije.

3. 2 Odvajanje i disocijacija ćelijskog sloja

|0156jOdvajanje ćelijskog sloja izvedeno je nakon uklanjanja pripremljenog medijuma iz flaska i ispiranja sloja sa ćelijama sterilnim PBS-om (SIGMA. batch No. 088K2356), a zatim njihovog tretiranja rastvorom 0.05 % tripsina (SIGMA Trvpsin Ref T-1426, serijski broj No. 020M7354), EDTA 0.2 g, NaCl 8 g, KCI 0.4 g, NaHC03 0.58 g, glukoza Ig (SIGMA), qs 1 litar ultra-čiste vode, rastvor je sterilisan membranskom filtracijom (PES) kroz filter poroznosti 0.22 p, CML serijski broj No. 668919), zapremina rastvora tripsina je podešena zavisno od tipa flaska (na primer, 1 ml za flask od 25 cm'), zatim je flask postavljen na 37°C (Sanyo inkubator) na tri do četiri minuta.

[0157|Kada su ćelije odvojene od podloge, izvršena je disocijacija ćelija u prisustvu medijuma sa serumom (inhibicija enzimske aktivnosti tripsina). uvlačenjem i izbacivanjem rastvora nekoliko puta kroz pipetu (od 5 do 10 ml, zavisno od tipa ćelija).

3. 3 Test toksičnosti

|0158|Ćelije su izbrojane pomoću Thoma cell (Thermo Fisher), pod svetlosnim mikroskopom (Nikon), a zatim se sejane u gustini od 5000 ćelija po bunariću u 200 ul odgovarajućeg medijuma u posudama sa ravnim dnom na pločama za kulturu od 96 bunarića od tretirane plastike (NUNC, serijski broj No. 114754), a zatim su posude stavljene u inkubator tokom 24 h. Različita razblaženja supstanci koje će biti ispitane koncentrovana su tri puta u 100 pl medijuma bez antibiotika, a zatim su dodate u 200 pl svakog bunarića (ukupna zapremina: 300 pl). Nakon 24 h, 48 h i 72 h, tretirani bunarići i kontrolni bunarići su ispitani primenom protokola za MTT (Tiazolvl Blue Tetrazolium Bromide) [Liu Y. et al. (1997) Mechanism of cellular MTT reduction. J. Neurochem. 69 : 581-593] and for the dosage of the proteins (Ref 23227, BCA protein Assay kit; Pierce), kako bi se odredila cititoksičnost:

• Dodavanje rastvora MTT do finalne koncentracije od 25 pg/mL

• Inkubacija 1 h na 37°C

• Usisavanje medijuma

• Dodavanje 100 uL DMSO (200 pL u slučaju saturacije DO)

• Očitavanje posuda (Biorad) na 490 nm

• Kompjuterska obrada u Excel.

• Oduzimanje pozadinskog šuma (background noise) izmerenog u praznom bunariću

(blank)

• Određivanje odnosa DO X bunarića/DO kontrolnih bunarića

• Iscrtavanje krive tog odnosa u funkciji koncentracije

|0159|Toksičnost je ispitana nakon 24 h i 48 h tretmana, odnosno tu+ 48 h i t() + 72 h|0160|Slike 11 i 12 jasno pokazuju da, čak i pri visokim dozama (Serija 132), lipozomima obložen p2m ne utiče na vijabilnost hepatocita i bubrežnih ćelija, koje su inače osetljive na [32m. Isto se odnosi na ćelije srčanog porekla i skeletne mišićne ćelije (rezultati nisu prikazani).

Claims (21)

1. Farmaceutski proizvod,naznačen time dakao aktivni sastojak sadrži p2-mikroglobulin ili neku funkcionalnu varijantu ovog proteina, koja ispoljava najmanje 70 % istovetnosti sa |32-mikroglobulinom poreklom od čoveka. u farmaceutski prihvatljivom nosaču, naznačenom time daje farmaceutski prihvatljiv nosač lipozom.

2. Farmaceutski proizvod saglasno zahtevu 1. naznačen time da je aktivni sastojak čovečji p2-mikroglobulin.

3. Farmaceutski proizvod saglasno zahtevima 1 ili 2. naznačen time da je pomenuti aktivni sastojak neka funkcionalna varijanta proteina p2-mikroglobulina, koja ispoljava najmanje 80 %, i poželjno 90 % istovetnosti sa čovečjim p2-mikroglobulinom.

4. Farmaceutski proizvodnaznačen time dakao aktivni sastojak sadrži p2-mikroglobulin ili funkcionalnu varijantu ovog proteina, koja ispoljava najmanje 70 % istovetnosti sa čovečjim p2-mikroglobulinom, u farmaceutski prihvatljivom nosaču, za primenu u terapiji neke autoimunske bolesti.

5. Farmaceutski proizvod saglasno zahtevu 4, naznačen time da je navedeni aktivni sastojak čovečji p2-mikroglobulinski protein.

6. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno zahtevu 4 ili 5, naznačen time da je aktivni sastojak funkcionalna varijanta p2-mikroglobulina koja ispoljava najmanje 80 %, i poželjno 90 % istovetnosti sa čovečjim p2-mikroglobulinom.

7. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno nekom od zahteva 4, 5 ili 6,naznačen time dase tretira autoimunska bolest reumatoidni poliatritis, sistemski eritematozni lupus, Sjogrenov sindrom, skleroderma, fibromialgija, miozitis, ankilozni spondilitis, insulin-zavisni dijabetes tipa 1. Hašimotov tiroiditis, Adisonova bolest, Kronova bolest, celijačna bolest, multipla skleroza ili amiotrofna lateralna skleroza.

8. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno nekom od zahteva 4, 5 ili 6, u terapiji amiotrofne lateralne skleroze (ALS).

9. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno nekom od zahteva 4, 5 ili 6, u terapiji multiple skleroze.

10. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno nekom od zahteva 4, 5 ili 6, u terapiji Kronove bolesti.

11. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno nekom od zahteva 4. 5 ili 6, u terapiji reumatoidnog poliartritisa.

12. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno nekom od zahteva 4, 5 ili 6, u terapiji insulin-zavisnog dijabetesa tipa 1.

13. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno nekom od zahteva 4. 5 ili 6. za povećanje koncentracije p2-mikroglobulina u krvi na nivo koji se nalazi između 2.5 i 12 mg/i, poželjno između 3 i 8 mg/l, poželjnije između 3 i 5 mg/l, kod pacijenta koji boluje od neke autoimunske bolesti.

14. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno bilo kojem od zahteva 4, 5 ili 6. u uspostavljanju normalnog molarnog odnosa HC/p2-mikroglobulina u sastavu membranskih MHC-1 kompleksa, kod pacijenta koji boluje od neke autoimunske bolesti.

15. Farmaceutski proizvod za primenu saglasno nekom od zahteva 4, 5 ili 6, u sprečavanju nastanka deficita |32-mikroglobulina u MHC-I kompleksima kod pacijenta koji boluje od neke autoimunske bolesti.

16. Farmaceutski proizvod saglasno bilo kojem od zahteva 1 do 3,naznačen time dase sastoji od lipozoma napunjenih (32-mikroglobulinom ili nekom funkcionalnom varijantom tog proteina.

17. Farmaceutski proizvod saglasno jednom od zahteva 1 do 3,naznačen time daje (32-mikroglobulin pripremljen u formi soli i prethodno inkubiranex- vivosa krvlju, serumom ili limfocitima pacijenta koji se tretira ovim proizvodom.

18. Kompozicija koja sadrži farmaceutski proizvod saglasno jednom od zahteva 1 do 3.

19. Postupak dijagnostikovanja autoimunske bolesti,naznačen time daobuhvata korak određivanja unutarćelijskog ili membranskog odnosa HC/p2-mikroglobuIina u MHC-I kompleksima ćelija poreklom od pacijenta.

20. Postupak dijagnostikovanja saglasno zahtevu 19,naznačen time da jeodnos HC/p2-mikroglobulina MHC-I kompleksima, membranski odnos.

21. Postupak saglasno zahtevu 20,naznačen time daobuhvata korake: i) izolovanje MHC-1 kompleksa iz ćelija, poželjno iz limfocita poreklom od pacijenta kod kojeg se ispituje postojanje autoimunske bolesti; ii) određivanje količina HC i p2-mikroglobulina u sastavu naznačenih MHC-I kompleksa; iii) uspostavljanje molarnog odnosa HC/p2-mikroglobu1ina naznačenih MHC-I kompleksa; iv) upoređivanja dobijenog odnosa HC/p2-mikroglobulina sa istim odnosom u kontrolnom uzorku.