RS55154B1

RS55154B1 - Interferon beta za upotrebu u lečenju bolesti donjeg respiratornog trakta uzrokovane gripom

Info

Publication number: RS55154B1
Application number: RS20160753A
Authority: RS
Inventors: Victoria Jane Tear; James Jonathan Welch Roberts; Phillip David Monk
Original assignee: Synairgen Res Ltd
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2011-03-10
Publication date: 2017-01-31
Also published as: DK2544705T3; EP2544705B1; JP2013522282A; ES2592528T3; HRP20161158T1; SMT201600334B; SI2544705T1; CN107050431A; WO2011110861A3; PL2544705T3; CA2792727A1; US9421243B2; CA2792727C; EP2544705A2; PT2544705T; LT2544705T; WO2011110861A2; HUE029250T2; JP5926200B2; US20130064792A1

Description

Oblast pronalaska

[00011Ovaj pronalazak se odnosi na lečenje pojedinaca sa oboljenjem donjeg respiratornog trakta koje se razvilo tokom ili nakon uspostavljanja bolesti poput gripa (ILI). Po uspostavljanju bolesti poput gripa, mislimo na bolest u kojoj su simptomi poslali očigledni, tj. izraženi na pojedincu ili na nosiocu, u toku najmanje 48 sati. Preciznije, ovaj pronalazak se odnosi na lečenje pojedinaca sa oboljenjem donjeg respiratornog trakta koje je razvijeno tokom ili praćenjem ILI. posebno hospitalizovanih bolesnika, isporukom interferona-P (1FN-P) pomoću aerosola u donjem respiratornom traktu. Bolest poput influence je bolest koju karakteriše groznica> 37.8 °C plus dva od sledećih simptoma: (glavobolja, kašalj, upala grla i mijalgija) i potvrđena infekcija gripom.

Stanje tehnike

[00021Sezonski grip je česta infekcija, posebno tokom zime. Svake godine sojevi gripa (tip A ili B) cirkulišu, što dovodi do porasta kliničkih konsultacija u primarnoj zdravstvenoj zaštiti, epizoda bolničkog lečenja (uglavnom kod starijih osoba i male dece. ali povremeno kod odraslih srednjih godina) i smrti (uglavnom kod starijih). Lečenje u primarnoj zdravstvenoj zaštiti i bolnici mogu biti potrebni zbog direktnih efekata infekcije virusom influence ili njegovih mogućih komplikacija, najčešće sekundarnih bakterijskih infekcija. Povećanje konsultacija ti primarnoj zdravstvenoj zaštiti za ILI i pritisaka zimi usled ležanja su često povezani sa periodima poznate aktivnosti zajednice gripa.

(0003)Pandemija gripa se javlja kada se pojavi novi podtip virusa gripa koji se značajno razlikuje od nedavno cirkulišućih podtipova i sojeva, i sposoban je da: • inficira ljude; • širi se efikasno sa osobe na osobu;

• uzrokuje značajno kliničko oboljenje u velikim razmerama kod obolelih.

[0004|Jer je virus nov kod ljudi, visok procenat populacije će imati malo ili nimalo imunitet, proizvodi veliki fond od osetljivih osoba; shodno tome, bolest se širi široko i brzo.

[0005|Interferoni su prethodno predloženi bilo za profl taktičke ili intervencije ranog stadij uma u lečenju gripa, ali sa ograničenim uspehom.

[0006]Visoko patogeni grip je zarazni oblik gripa, kao što je I I5N1. koji dovodi do brzog i visokog nivoa morbiditeta.

(0007] ILI uključuje sezonski grip. pandemijski grip i visoko patogeni grip.

[0008|Sada smo pronašli novu metodu lečenja pojedinaca, naročito hospitalizovanih bolesnika sa bolestima donjeg respiratornog trakta koja se razvila tokom ili nakon II I.

Rezime pronalaska

|0009|Prema tome, pronalazak obezbeđuje interferon-P (1FN-|:>) za upotrebu u lečenju bolesti donjeg respiratornog trakta koje su se razvile tokom ili posle uspostavljanja bolesti poput gripa (11-1). pri čemu navedeni tretman je pomoću aerosol isporuke navedenog leka do donjeg respiratornog trakta: pri čemu je ILI definisan kao (a) groznica >37.8 "C plus dva od sledećih simptoma: glavobolja, kašalj, upala grla i mijalgija i/ili (b) potvrđen grip: pri čemu uspostavljen ILI označava bolest u kojoj su simptomi postali očigledni u toku najmanje 48 sati; pri čemu je bolest donjeg respiratornog trakta uzrokovana gripom; i pri čemu se IFN43 isporučuje do donjeg respiratornog trakta pomoću aerosola najmanje 48 sati nakon što su simptomi ILI postali očigledni.

Pronalazak dalje obezbeđuje proizvod za upotrebu u lečenju bolesti donjeg respiratornog trakta koje su se razvile tokom ili posle uspostavljanja bolesti poput gripa (ILI) koji sadrži (i) IFN-{3 i (ii) inhalirani inhibitor neuraminidaze, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu aerosol primenu do donjeg respiratornog trakta pri čemu je ILI definisan kao (a) groznica >.17,8 °C plus dva od sledećih simptoma: glavobolja, kašalj, upala grla i mijalgija i/ili (b) potvrđen grip; pri čemu uspostavljen ILI označava bolest u kojoj su simptomi postali očigledni u toku najmanje 48 sati; pri čemu je bolest donjeg respiratornog trakta uzrokovana gripom; i pri čemu se IFN-p isporučuje do donjeg respiratornog trakta pomoću aerosola najmanje 48 sati nakon što su simptomi ILI postali očigledni.

Kratak opis Slika

|0010|

Slika la prikazuje povećanje procenta humanih plućnih bronhijalnijh epitelnih ćelija inficiranih tokom perioda od 96 sati nakon infekcije sa virusom gripa A i efekat tretmana IFN-P od 48 sati nakon infekcije (n = 1 eksperiment).

Slika lb pokazuje povećanje procenta humanih plućnih bronhijalnih epitelnih ćelija inficiranih tokom perioda od 96 sati nakon infekcije sa virusom gripa A i efekat tretmana IFN-p od 48 sati nakon infekcije (n ? 3 eksperimenta uključujući originalne podatke).

Slika 2a prikazuje virusno širenje tokom perioda od 96 sati nakon infekcije humanih plućnih bronhijalnih epitelnih ćelija sa virusom gripa A i efekat tretmana IFN-p od 48 sati nakon infekcije. Virusni platoi širenja između 48 i 96 sati. (n = 1 eksperiment).

Slika 2b prikazuje virusno sirenje tokom perioda od 96 sali nakon infekcije humanih plućnih bronhijalnih epitelnih ćelija sa virusom gripa A i efekat tretmana IFN-p od 48 sati nakon infekcije. Virusni platoi širenja između 48 i 96 sati. (n 3 eksperimenta uključujući originalne podatke).

Slika 3 pokazuje efekat tretmana humanim IFN-p na ekspresiju IFN43-zavisnog antivirusnog gena miksovirusa otpornog proteina I (MxA) (n - 3) u krvnim ćelijama od zdravih humanih dobrovoljaca ili cinomolgus makakija. Cela krv je tretirana sa IFN- p (0-1000 II /ml) tokom 4 sati, RNK ekstrahovana i efekat na ekspresiju MxA gena je izmeren.

Slika 4 pokazuje efekat lečenja humanim IFN-p na ekspresiju IFN- p-zavisnog antivirusnog gena 2'-5'oligoadenilat sintetaze (2'-5'OAS) (n - 3) u krvnim ćelijama od zdravih humanih dobrovoljaca ili cinomolgus makakija. Cela krv je tretirana sa IFN-p (0-1000 UJ/ml) tokom I sati. RNK ekstrahovana i efekat na 2'-5'OAS ekspresiju gena je izmeren.

Slika 5 prikazuje zaštitni efekat humanog IFN-p u cinomolgus makaki ćelijama inficiranim sa sezonskim gripom {n = 4). Cinomolgus makaki ćelije su prethodno tretirane sa IFN-p (0. 100 ili 1000 lU/ml) tokom 24 časa pre infekcije sa sojem gripa AVictoria/3/75 (I13N2) na MOI od 0.01. Supernatanti su sakupljeni 48 sati nakon virusne infekcije i virusno proiivanjc je mereno pomoću testa plaka. <<*>> označava p <0.05. ;Kratak opis listinga sekvenci ;[0011] SEK 1D BR: I prikazuje nukleotidnu sekveneu humanog IFN-pla. SI K ID BR: 2 prikazuje aminokiselinsku sekveneu humanog IFN-pa. SEK ID BR: 3 prikazuje nukleotidnu sekveneu humanog IFN-pb. SEK ID BR: 4 prikazuje aminokiselinsku .sekvenci!humanog IFN-pb. IFN-pb je identičan humanom IFN-la osim zamene cisteina na ostatku 1 7 sa serinom. ;Detaljan opis pronalaska ;[0012] Kao šta je ovde prethodno navedeno, predmetni pronalazak se odnosi na nove terapeutske upotrebe IFN-p. Posebno se odnosi na terapeutsku upotrebu IFN-p pomoću aerosol isporuke do donjeg respiratornog trakta za lečenje pojedinaca sa dijagnozom bolesti donjih đisajnth puteva koja se razvila tokom ili nakon bolesti poput gripa, posebno kod onih pacijenata koji su primljeni u bolnicu. [0013| Kao što je gore navedeno, interferoni su prethodno predloženi za profilaksu ili u ranoj fazi tretmana ILI. Shodno tome, interferoni su predloženi za upotrebu bilo pre ispoljavanja simptoma ILI ili pri početnoj pojavi takvih simptoma. Generalno, ovi interferoni se prtmenjuju u gornjem respiratornom traktu, npr nazalnom ždrelu. Obično započinjanje lečenja sa interferoni ma počinje u okviru 24 sata od pojave simptoma. ;[0014]Suprotno otkrili smo da pacijenti koji su hospitalizovani sa komplikacijama koje proistiću iz ILI, posebno sa bolešću donjeg respiratornog trakta mogu biti lečeni putem aerosol isporuke agensa interferon-p do donjeg respiratornog trakta. Obično se hospitalizacija dešava tipično 48 sati posle prve pojave simptoma. ;DefinicijaIFN-0. ;|00I5|Izraz IFN-P kako se ovde koristi biće shvaćen da se odnosi na bilo koju forinti ili analog IFN-p koji zadržava biološku aktivnost prirodnog IFN-P i poželjno zadržava aktivnost IFN-p koji je prisutan u plućima i, naročito, bronhijalna i/ili alveolarnom epitetu. IFN-p može bili identičan ili sadrži sekveneu humanog IFN-pla (SEK ID BR: 2) ili humanog IFN-p tb (SEK ID BR: 4). IFN-p se takođe odnosi na varijante polipeptida koji imaju sekveneu aminokiseline koja varira od SFK ID BR: 2 ili 4. Alternativno, IFN-može biti hemijski-modiflkovan. Varijanta IFN-može biti varijanta koja se javlja prirodno, na prinier varijanta koja je izražena od strane ne-humanih vrsta. Takode, varijante IFN-P obuhvataju sekvence koje variraju od SEK ID BR: 2 ili 4 ali se ne jav ljaju nužno prirodno. Preko cele dužine aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 2 ili 4. varijanta će pretpostavljeno biti najmanje 80% homologna toj sekvenci na osnovu aminokiselinske identičnosti. Poželjnije, polipeptid je najmanje 85% ili 90%, a još poželjnije najmanje 95%, 97% ili 99% homologan na osnovu identičnosti aminokiseline do aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 2 ili 4 preko cele sekvence. Tu može bili najmanje 80%, na primer najmanje 85%, 90% ili 95%, aminokiselinske identičnosti koje se protežu preko 40 ili više. na primer 60. 80, 100, 120, 140 ili 160 ili više, susednih amino kiselina ("teška homologija"). Homologija se može odredili korišćenjem bilo kog postupka koji je poznal u tehnici. Na primer l'VGCG paket pruža program BESTFIT koji se može koristiti za izračunavanje homologije. na primer korišćenjem standardnih postavki (Devereu.\ et al (1984) Nucleie Acids Research 12, p3 87-3 95). Algoritmi PILE UP i BLAST se mogu koristiti za izračunavanje homologije ili redanje sekvenci (kao Sto je prepoznavanje ekvivalentnih ostataka ili odgovarajućih sekvenci (tipično na njihove standardne postavke), na primer kao što je opisano u Altschul S.F. (1993) .1 Mol Evol 36: 290- 300: AltschuL S F et al (1990) J. Mol Biol 215: 403-10. Softver za obavljanje BLAST analize je javno dostupan preko Nacionalnog Centra za Biotehnološke Informacije (htlp://vvwv\ .ncbi.nhn.nih.gov■•'). Ovaj algoritam obuhvata prvo identifikaciju visokog bodovanja sekvence pan: (FISPs) pomoću identifikacije kratkih reci dužine W u ispitivanoj sekvenci koji ili odgovara ili zadovoljava neke. pozitivne vrednosti praga rezultata T kada su poravnane sa rećju iste dužine u bazi podataka sekvence. I se odnosi kao susedno bodovanje praga reci (Altschul et al, gore). Ove početne susedne reči pregledano cleluju kao semena za pokretanje- pretrage da nađu HSP-ove koji ih sadrže. Pogodci reči se produžuju u oba smera duž svake sekvence za koliko kumulativni rezultat poravnanja može biti povećan. Nastavci za pogođke reči u svakom pravcu se zaustavljaju kada: rezultat kumulativnog poravnanja padne ispod količine X od svoje maksimalne ostvarene vrednosti: kumulativni rezultat ide na nulu ili niže, zbog akumulacije jednog ili više negativno bodujućih ostataka poravnanja; ili je dostignut kraj bilo koje sekvence. Parametri BLAST ;algoritma W, T i X određuju osetljivosl i brzinu poravnanja. Program Blast koristi kao zadanu dužinu reči (W) od ;11, B LOS UM 62 matrica bodovanja (videti Henikof'f i I lenikofT (1 992) Prce. Nali. Acad. ScL USA 89: 10915-10919) poravnanja (B) od 50. očekivanje (E)od 10. M = 5. N = 4. i poređenje oba lanca. BLAST algoritam vrši statističku analizu sličnosti između dve sekvence: videti. na primer. Karlin i Altschul ;(1993) Proe.Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Jedna mora sličnosti koju obezbeđuje BLAST algoritam je najmanja suma verovatnoće (P (N)). koja daje indikaciju\erovatnoće kojom bi se spoj između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence dogodio slučajno. Na primer. sekvenca se smatra sličnom drugoj sekvenci ako je najmanja suma verovatnoće u poređenju prve sekvence prema drugoj sekvenci manja od oko 1. poželjno manja od oko 0.1. još poželjnije manje od oko 0.01. a najpoželjnije manje od oko 0.001. Aminokiselinske supstitucije mogu biti sa aminokiselinskom sekvencom SEK ID BR: I ili 2, na primer od 1. 2. 3. 4 ili 5 do 10. 20 ili 30 supstitucija. Konzervativne supstitucije mogu biti napravljene, na primer, prema kabeli I. Aminokiseline u istom bloku u drugoj koloni i poželjno u istoj liniji u trećoj koloni se mogu zameniti jedne drugima: Tabela I - Konzervativne supstitucije aminokiselina NE A ROM ATIČN E Ne-polarne G A P 1 I. V Polarne - bez naboja C S T M N O Polarne ;- naelektrisane D E II KR AROMATIČNE H F W Y ; ;[00161 Jedan ili više aminokiselinskih ostataka aminokiselinske sekvence SEK ID BR: I ili 2 može alternativno ili dodatno biti uklonjen. Od 1, 2, 3. 4 ili 5 do 10. 20 ili 30 ostataka može biti uklonjeno, ili više. IFN-P takode obuhvata fragmente gore pomeimtih sekvenci. Takvi fragmenti zadržavaju IFN-p aktivnost. Fragmenti mogu biti najmanje od 120 ili 140 aminokiselina u dužini. Takvi fragmenti mogu đa se koriste za proizvodnju himernih agenasa kao što je opisano u v iše detalja ti daljem tekstu. IFN-p uključuje himerne proteine koji sadrže fragmente ili deiove SEK ID BR: 2 ili -I. Jedna ili više aminokiselina može alternativno ili dodatno dodata polipeptidima gore opisanim. Produženje može biti obezbedeno na N-završetku ili C-završetku aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 2 ili 4 ili njihovoj varijanti polipeptida ili fragmenta. Produženje može biti sasvim kratko, na primer od I do 10 aminokiselina u dužini. Alternativno, produženje može bili duže. Nosač protein može biti luzionisan sa aminokiselinskom sekvencom gore opisanom. Fuzioni protein uključuje jedan od polipeptida opisanih ;gore koji se može na taj način koristiti u pronalasku. IFN-p takode uključuje SEK ID NO: 2 ili 4 Ili njihove varijante koje su hemijski-mođifikovane. Jedan broj bočnih modiifkacija lanaca je poznat u tehnici i može biti na bočnim lancima proteina ili peptida gore razmotrenih. Takve modifikacije uključuju, na primer. glikozilaciju. fosforilaciju. modifikacije aminokiselina reduktlvnom alkilacijom reakcijom sa aldehidoin praćeno redukcijom sa NaBlli. amiđinaciju sa metilaeetimiđatom ili acilovanje sa anhidridom sirćetne kiseline. Modifikacija je poželjno glikozilacija. IFN-p može biti proizveden sintetički ili rekombinantnim sredstvima korišćenjem postupaka poznatih u tehnici. Aminokiselinske sekvence proteina i polipeptida mogu biti modifikovane da uključuju aminokiseline koje se ne javljaju prirodno ili da povećaju stabilnost jedinjenja. Kada se proteini ili peptidi proizvode sintetičkim putem, takve aminokiseline mogu da se uvode tokom proizvodnje. Proteini ili peptidi mogu takode biti modifikovani praćenjem ili sintetičke ili rekombinantne proizvodnje. IFN-p se takode može proizvesti pomoću D-amino kiseline. U takvim slučajevima aminokiseline će biti povezane obrnutim redosledom sekvence u C do N orijentaciji. Ovo je uobičajeno u tehnici za proizvodnju takvih proteina ili peptida. IFN-p može biti proizveden u ćeliji pomoću in situ ekspresije polipeptida iz rekombinantnog ekspresionog vektora. Ekspresioni vektor opeiono nosi inducibilni promotor da kontroliše ekspresiju polipeptida. IFN-P ili njegov analog mogu biti proizvedeni u velikim razmerama bilo kojim sistemom tečne hromatografije proteina nakon rekombinantne ekspresije. Poželjni sistemi tečne hromatografije proteina uključuju FPLC, AKTA sisteme. Bio-C'ad sistem. Bio-RadBiol .ouic sistem i Gilson UPI U sistem. Komercijalno dostupni oblici IFN-p ili njegovih analoga mogu biti korišćeni u ovom pronalasku. Primeri uključuju Betaseron® i Avone\ «. ;|0017] IFN-p se može primeniti u leku ili farmaceutskoj kompoziciji pogodnoj za isporuku putem udisaja koja će obično uključivati i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Takav "ekscipijens" se generalno odnosi na suštinski inertan materijal koji je netoksičan i ne stupa u interakciju sa drugim komponentama kompozicije na štetan način. Farmaceutski prihvatljivi ekseipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, lećnosti kao što su voda, slani rastvor, polietilengiikol, hijaluronska kiselina, glicerol i etanol. Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti uključene u njoj. na primer. soli mineralnih kiselina kao što su hidrohloridi, hidrobromidi. fosfati, sulfati, i slično: i soli organskih kiselina kao što su acetati. propionati, malonati. benzoati. i slično. Takode je poželjno, ali nije obavezno, da će kompozicija ili lek koji sadrži terapeutsko sredstvo sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač, koji služi kao stabilizator, posebno za peptid, protein, polinukleotid ili druge slične agense. Primeri pogodnih nosača koji takođe deluju kao stabilizatori za peptidc uključuju, bez ograničenja, farmaceutskog kvaliteta dekstrozu. saharozu, laktozii. trehalozu, manitol. sorbitol. inozitol. dekstran. i slično. Drugi pogodni nosači uključuju, ponovo bez ograničenja, škrob, celulozu, natrijum ili kalcijum fosfate, limunsku kiselinu, vinsku kiselinu, glicin, polietilenglikole velike molekulske mase (PEG). i njihove kombinacije. Takode može biti korisno angažovanje naelektrisanog lipida i/ili deterdženta. Pogodni naclektrisani lipidi uključuju, bez ograničenja, fosfat i d i I ho I i ne (lecitin), i slično. Deterdženti će obično biti nejonski, anjonski, katjonski ili amfotemi surfaktanti. Primeri pogodnih površinski aktivnih materija uključuju, na primer, Tergitol® i Tri ton® surfaktante (Union Carbide Chemicals anaplastics. Danburi. CT), ;polioksietilenesorbitane. na primer. TWEEN<!i surlaktante ( Atlas Chemical Industries. Wilmington. DE), polioksietilen etre. na primer Brij. estre farmaceutski prihvatljivih masnih kiselina, na primer, lauril sulfat i njihove soli (SDS), i slične materijale. Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima, nosačima, stabilizatorima i drugim pomoćnim supstancama je dostupna u izdanju Remingtons Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. C'o. N..1.1991 ). ;[0018]Pogodna kompozicija za isporuku putem inhalacije IFN-p1 može. na primci, biti formulisana kao što je opisano u US palentu br 6,030.609 rastvaranjem liotlliziranog IFN-p1 u farmaceutski prihvatljivom nosaču kao što je sterilna destilovana voda ili sterilan fiziološki rastvor, opciono uz dodatak jednog ili više nosača, stabilizatora, surfaktanata ili drugih sredstava u cilju poboljšanja efikasnosti aktivnog agensa IFN-(3. Pogodna kompozicija ima pFI od 5 do 8, poželjnije 5.5 do 7.5. Poželjno, kompozicija je puferovana. npr korišćenjem citratnog pufera. [0019|Rentschler kompozicija, koja je bazirana na formulaci jama opisanim u US 6.030.609, ima pH od 6,5 i osmolarnost od 290 mOsm/kg. Kompozicija je požel jno obezbeđena kao sterilni, bistar i bezbojan, spreman za upotrebu vodeni rastvor nebulizatora predstav Ijenog u raspoloživom staklenom špricu. ;|0020]Pored aktivnog sastojka, kompozicija poželjno sadrži puferski sistem koji održava pll između 5 i 8, poželjnije 5,5 i 7,5, posebno 6,5. Kompozicija takode poželjno sadrži anlioksidans. na primer, DL-metionin. ;|0021jPoželjna kompozicija sadrži: ; ;[00221Kompozicija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu IFN-p1. ovde opisanog može pogodno biti dostavljena disajnim putevima u plućima pomoću uređaja za inhalaciju koji je sposoban da isporuči fine Čestice aktivnog sastojka do donjeg respiratornog trakta ili disajnih puleva. Tipično čestice aktiv nog sastojka će imati maseni srednji prečnik od i -10 mikrona. Pogodni uređaji za inhalaciju uključuju uređaje za inhalaciju suvog praška (DPI), merno dozne inhalatore pod pritiskom (pMDI) i aerosol nebulizatore. ;|0023|Tipično, inhalacioni uređaj će proizvesti aerosol sa veličinom čestica, kao što je određeno pomoću Malvern Masterizera S, sa masenim srednjim prećnikom od I -10 mikrona, poželjno 3-8 mikrona, u kome maseni procenat koji ima prećnik ispod 5 mikrona je od 25-80%. poželjno 30-65%. Pogodan nebulizator je 1-neb uređaj, nebulizator sa oznakom CH proizvođača Philips Respironics. ;[0024]Odgovarajuća efikasna količina može se odrediti odgovarajućim kliničkim testiranjem i vari rače sa na primer aktivnošću primenjenog IFN-P ili indukovnnog. IFN-P se može na primer. primeniti u mikrogramskim količinama. ;(0025)Oni se primenjuju na subjektu koji će biti tretiran na način kompatibilan sa đoznom formulacijom, i u količini koja će biti efikasna da dovede do željenog efekta. Količina koja će biti isporučena po dozi može biti 0,1 |ig do 500 ug. na primer I do 50 ug. u zavisnosti od subjekta koji se tretira. (0026}Tretman obično traje od 5-7 dana. i može se nastaviti do 11 dana ako simptomi postoje. Tretman može primenjen od svakog drugog dana do nekoliko puta dnevno. Poželjno, lečenje se primenjuje jednom dnevno. ;[0027]IFN-p se može priinenjivati sam ili simultano, sekvencijalno ili odvojeno u kombinaciji sa drugim terapeutskim jedinjenjem. Posebno. IFN-p može biti primenjen zajedno sa terapeutskim jedinjenjem koje se koristi za lečenje respiratorne bolesti ili antivirusno kod pojedinca. IFN-p i dodatno terapeutskojeđinjenje mogu biti formulisani u istim ili različitim kompozicijama. ;[0028]U jednom izvođenju. IFN-p se primenjuje kod pojedinca sa astmom u kombinaciji sa inhalacionim kortikosteroidima. ;[0029]U daljem ostvarenju. IFN-se može primenjivaii simultano, sekvencijalno ili odvojeno sa inhaliranim inhibitorom neuraminidaze. Tako. u daljem aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen jc proizvod za upotrebu u lečenju bolesti donjeg respiratornog trakta {ili simptoma) koji su razvijeni tokom ili nakon uspostavljanja bolesti poput gripa koji obuhvata istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu do donjih disajnih puteva (i) IFN-p-a i (ii) inhalirauog inhibitora neuraminidaze. Poželjno, takav proizvod će obezbediti istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu administraciju IFN-P i inhalirauog inhibitora neuraminidaze. na primer. zanamivir. IFN-P i inhalirani inhibitor neuraminidaze mogu. na primer. da se obezbede u obliku pojedinačne farmaceutske kompozicije pogodne za isporuku putem aerosola do disajnih puteva. npr pomoću inhalalora suvog praška, merno doznog inhalatora pod pritiskom ili aerosol nebulizitora. ;[0030]Alternativno, IFN-P može biti primenjen istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno sa oralnim inhibitorom neuraminidaze. kao što je oseltamivir. ;[0031]Alternativno, IFN-p može biti primenjen istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno sa sistemski primenjenim inhibitorom neuraminidaze, kao sto je peramivir. ;[00321IFN-p može biti primenjen istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno sa inhibitorom vezivanja inhalirauog virusa gripa. Stoga, obezbeđen je proizvod za lečenje pojedinaca sa dijagnozom oboljenja donjeg respiratornog trakta (ili simptoma) koji su razvijeni tokom ili nakon uspostavljanja bolesti poput gripa koji obuhvata istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu u donjim disajnim putevima (i) ;IFN-p-a i (ii) inhibitora vezivanja inhalirauog virusa gripa. Poželjno, takav proizvod će obczbcditi istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu IFN-p i inhibitora vezivanja virusa gripa, na primer. sijalidaza fuzioni protein, DASI 81 (Fludase"). IFN-p i inhibitor vezivanja inhalirauog virusa gripa mogu. na primer, da se obezbede u obliku pojedinačne farmaceutske kompozicije pogodne za isporuku u obliku aerosola do disajnih puteva. ;10033]IFN-p može biti primenjen istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno sa antibaklerijskim antibiotikom. Poželjno antibaklerijski antibiotik se primenjuje inhalacijom. ;[0034]U daljem ostvarenju, IFN-p može bili primenjen istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno sa antigljivičnim antibiotikom. Poželjno, antigljiv ični antibiotik se primenjuje inhalacijom. ;[0035|Deca mlađa od 5, a naročito deca mlađa od 2 godine starosti, odrasli starosti 65 godina i stariji, trudnice i oni sa komorbiditetima (nprhronične plućne bolesti, neurološki i neurorazvojni uslovi, srčane bolesti, poremećaji krvi, endokrini poremećaji, oboljenja bubrega, poremećaji jetre, poremećaji metabolizma, maligniteti i oslabljeni imuni sistem zbog bolesti ili lekova) su pod najvećim rizikom od razvoja komplikacija rezultirajući hospitalizacijom i imaju najslabije rezultate i predstavljaju posebnu ciljnu grupu ovog pronalaska. Starije osobe, na primer one sa više od 60 godina starosti su posebna ciljna grupa, kao što su pacijenti koji boluju od astme i; ili COPD. ;[0036|Dalja rizična grupa su pacijenti koji nisu bili prethodno izloženi ILI-ju. ;Primer 1;|0037JSposobnost egzogenog IFN-p za suzbijanje infekcije gripa uhi vilromodelu utvrđene infekcije donjeg respiratornog trakta je ilustrovana u sledećeni primeru. ;Pregled;|0038JBolest donjeg respiratornog trakta (ili simptomi i koji se razvijaju tokom ili nakon bolesti poput gripa (ILI) su često praćene širenjem virusne infekcije iz gornjeg do donjeg respiratornog trakta. Pored toga, produžetak simptoma i. kod hospitalizovanih pacijenata, produženi boravak u bolnici su povezani sa upornim virusnim širenjem u donje disajne puteve. Koristeći humane plućne bronhijalne epitelne ćelije, važno mesto replikacije virusa gripa kod ćoveka, razvili smo model uspostavljene infekcije gripa donjeg respiratornog trakta. Efekat IFN-p-a u ovom modelu je ispitiv an. ;Mctod;Celijsku kulturu i protokol infekcije;[0039]Humane plućne bronhijalne epitelne (IIBE) ćelije su kullivisane u minimalnom esencijalnom medij umu (MEM) koji sadrži glutamaks (Invitrogen). 10% fetalni goveđi serum (FBS) (Invitrogen). ;penicilin (50 U/mL) i streptom icin (50 pg/ml) (Invitrogen). 1IRI: ćelije su nanesene u količini l.5xlO'/bazeiieiĆLi, prolaz 41-49. na ploču od 24 bazenčiea. Na otprilike 60-70% konfluencije. ćelije su kultivisane u smanjenom serumskom medijumu (MFV1 sadrži ghitumaks (Invitrogen) i 0.75-1%) FBS (Invitrogen)) tokom 24 sata. Ćelije su inficirane sa aktiviranim sojem gripa (influenca A/VVSN/33 (HINI) (Retroscreen)) pri 0.0001 MOI na 37°C. Posle jednog sata. nevezani virus je uklonjen ispiranjem. Smanjeni serumski med i juni je dodat i ćelije su inkubirane na 37 °C još četiri dana. Ćelije su tretirane sa lOOOlU/ml humanog IFN-pla (Rentschler) 48 časova posle infekcije virusom. Kada je tretman IFN-P počeo doza se ponavlja svakih 24 sata. ;Protočna citometrija za utvrđivanje procenta influence pozitivnih ćelija;[0040|Celijski medijum je sakupljan u toku 24. 48. 72, i 96 sata nakon infekcije i čuvan na ;-80°C. U toku 24, 48, 72 i 96 sata posle infekcije ćelije su iripsinizovanc. izbrojane i isprane u fosfatnom slanom puteni (PBS). Do 2.\ I(f ćelija je uzeto za analizu protočnom cilometrijom. Ćelije su bile centrifugirane na 400g i supernatant je bio odbačen. Obojenost živih/mrtvih ćelija (molekulskih proba) je bila rekonstituisana u dimetilsulfoksidu (DMSO) (500 pl) i razblažena 1: 100 u PBS-u. Razblažena mrlja žive/mrtve ćelije (100 ul) je inkubirana sa ćelijama na sobnoj temperaturi tokom 30 minula. Ćelije su isprane u PBS-u. centrifugirane na 400g. i supernatant je bio odbačen. 250 ul Cytonx/Cytoperm (BD Biosciences) je dodato po epruveti i ćelije levo su bile na 4 0 C tokom 20 minuta. Ćelije su isprane dva puta sa 2 ml Perm/VVash (BD Biosciences) rastvora centri fugiranjem na 500g. Nakon drugog ispiranja, ćelije su ponovo suspendovane u 100 ul rastvora Pcrm/ Wash i ostavljene na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Anti-intluenza A malriksno proteinsko antitelo (Serotec) je razblaženo do 2.5 ug/nil u Perm/Vv'ash rastvoru i 100 ul dodalo u ćelije tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane dva puta sa 2 ml rastvora Perm/ Wash centri fugiranjem na 500g. Anti-mišiji IgG-FITC (Sigma) je razblažen do 5 ug/ml u Perm/Wash rastvoru i 100 pi je dodato u ćelije tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi zaštićeno od svetlosti. Ćelije su isprane dva puta sa 2 ml rastvora Perm/VVash centrifugiranjem na 500«. Ćelije su resuspendovane u Perm/Vv'ash rastvoru i analizirane protočnom citometrijom korišćenjem FACSCaliburn (BD Biosciences) i CellQuest Pro softvera. Podaci su potom analizirani korišćenjem softvera Vv'inMDI. ;Određivanje plaka za utvrđivanje virusnog širenja;[00411Vladin Darbi psećeg bubrega (MDCK) ćelije su kultivisane u MFM-ti koji sadrži glutamaks (Invitrogen), 10% FBS (Invitrogen), neesencijalne aminokiseline (Invitrogen). i penicitin/streptomicin (Invitrogen). MDCK ćelije su nanesene u količini 1\I(F eelija/bazenčieu. prolaz 25-30. na ploču od 12 bazenčića. Kada je dostignuta konfluencija 100% ćelije su isprane dva puta sa PBS-om. Celijski medijum sakupljen tokom infekcije u eksperimentu je razblažen ti medijumu bez seruma (DMEM (Invitrogen), penicilin/streptomieinu (Invitrogen). I ,-glutaminu (Invitrogen). neesencijalnim ;aminokiselinama (Invitorgen). i natrij um piruvntu (Invitrogen)) da bi se dobio opseg razblažcnja od desctostrukog razblažcnja između 1:10 do I: 10". Razblažen i celijski medijum (200 ul) je dodat u duplikatu bazenčićima. Ploče su inkubirane na 37 ° C tokom 1 sata. Virus je usisan i ćelije su isprane sa PBS-om. Dopunski medijum (100 ml 10 puta koncenlrovana MI N! (Invitrogen). 20 ml 7,5% natrijum bikarbonata (Sigma). 10 ml i M HEPF.S (Fluka). 28 ml 7.5% goveđeg serumskog albumina (BSA) frakcija V (Sigma), 5 ml 1% DEAE-dekstrana (Sigma). 20 ml penicilin/streptomicina (Invitrogen). 10 ml 200 niM glutamina (Invitrogen). 507 ml d.1120) je pripremljen i 1 7.5 mije dodalo u 12.5 ul 1 mg/ml tripsina tretiranog sa L-(tozi!amido-2-fenil) etil hlorometil ketonom (IRIPCK tripsin) (VVorthington Biochemical Corp.) i 7,5 ml Avicel suspenzije (4.8g Avicela (FMC biopolimera) u 186 ml d. 1120). Dopunski medijum je pomešan obrtanjem i I mi je dodai po bazenćiću. Ploče su inkubirane tokom 2 dana bez pomeranja ili trešenja. Dopunski medijum je usisan i ćelije su isprane dva puta sa PBS-om. Kristal violet rastvor je dodat (0.5 ml) (0.65g kristal violet (Sigma), 25 ml Ibrmaldehida (Sigma), 25 ml 100% etanola (Sigma), 450 ml 1 xPBS (5 DulA PBS tablete (Sigma) * 500 ml d.1120)) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Kristal violet je uklonjen i ploče isprane u vodi. Ploče su ostavljene da se osuše i plakovi su izbrojani.

[00421Tri nezavisna eksperimenta su vođena. Podaci iz prvog eksperimenta i zbirni podaci su predstavljeni.

Analiza podataka

[0043]Podaci su analizirani korišćenjem Grafpad Prizm softvera

Rezultati

10044)U ovom modelu protočna citometrijska analiza ukazuje da je između 5 i 40% ćelija inficirano između 48 i 96 časova (odnosi se na slike I a i lb) koji je sličan nivoima produktivno inficiranih ćelija zabeleženih u kliničkom okruženju pri najvišoj tački infekcije (Baccam et al.

(2006) Journal of Virologv, 80: 7590-7599). II skladu sa tim ovaj period je takođe povezan sa najvišim nivoima virusnog Širenja u našem modelu (Slika 2a i 2bi.

[0045|Tretman ćelija sa IFN-p za 48 sati posle infekcije, modelovani tretman utvrđene infekcije, je uzrokovao veliko smanjenje proporcije inficiranih ćelija i virusnog širenja (Slike la. lb, 2a i 2b). Smanjenje virusnog opterećenja veće od 10 puta se smatra klinički značajnim ( Barnett i sar.

(2000) Antimicrob. Agents Chemother 44: 78-87).

Zaključak

[0046JOvi rezultati pokazuju da tretman INF-p ima potencijal da i/meni tok uspostavljene infekcije gripa u plućima i na taj način smanjuje bolest respiratornog trakta koja se razvila tokom ili nakon

utvrđenja bolesti poput gripa (ILI). Stariji pacijenti i oni koji pate od astme i/i!i COPD verovatno imaju teškoća u stvaranju IFN-|3 kada je potrebno, upotrebe i postupci koji su o\đe opisani su od posebne primene namenjene takvim ugroženim grupama.

In vivostudija:

Uvod

|0047| Glavna komplikacija bolesti nalik gripu je virusna pneumonija koja se razvija nakon širenja

virusa do donjeg respiratornog trakta.

|0048)Humani IFN-p1 je visoko specifičan za vrste u svojoj biološkoj aktivnosti. Cinomolgus makaki majmun je odgovarajuća vrsta za proučavanje elekala humanog IFN-p\ Humani IFN-p je pokazao ushodnu regulaciju interferon oselljivih antivirusnih gena miksovirus rezistentnog proteina I (MxA)

(Slika 3) i 2'-5'oligoađenilat sintetaze (2'-5' OAS) (Slika 4) u istoj meri kod cinomolgus makakijev ih krvnih ćelija i humanih krvnih ćelija. Osim toga. um vilro ispitivanjimahumani IFN-p" štiti cinomolgus makaki ćelije od infekcije gripom (Slika 5).

[0049|PrclkliniČki modeli bolesti donjeg respiratornog trakta su razvijeni korišćenjem cinomolgus makaki majmuna za visoko patogeni grip A (II5N I) (Rimmclzvvaan et al. (2001 ) J Virol. 75: 6687-91) i pandemije 2009 gripa A (HINI) (Hertst et al. (2010) Vet. Pathol. 47: 1040-7) virusa. Ovi modeli su predvideli kliničku efikasnost inhibitora neuraminidaze protiv gripa kada su prinienjeni pre infekcije.

[00501Ova studija istražuje efekat plućne isporuke IFN-p u sličnom modelu kod cinomolgus makaki majmuna kod indukovane bolesti donjeg respiratornog trakta uzrokovane gripom. Izazov ni sojevi v irusa su A Indonezija/5/05 (H5NI) i A IIolandija/602 2009 (panđemijski HINI) koja su oba pokazala replikaciju u donjem respiratornom traktu i izazvala značajnu plućnu patologiju (Herfsl et a!.(20IO) Vet. Pathol. 47:1040-7: Rimmelzvaan et al. (2001) J Virol. 75:6687-91).

[00511Studija obuhvata dve faze. U prvoj fazi uspešna isporuka inhaliranog IFN-P je uspostavljena pokazujući ushodnu regulaciju IFN-p-zavisnih antivirusnih markera u plućnim ćelijama dobijenim bronho-alveolarnim ispiranjima (BAL). Slični povlaci u kliničkim studijama su podržali dalji razvoj inhaliranog IFN-B kao antivirtisne terapije. U drugoj fazi efekat prolllaklićkog i terapcutskog lečenja sa plućnom isporukom IFN-p na influenca indukovanu plućnu patologiju i plućno virusno opterećenje.

Faza I: P otvrd a uspešne isp oruke IF N-p u p I u ć i ma

[0052]Ukratko. IFN-p, u rastvoru, se primenju pomoću nebulizatora u dve prilike u plućima cinomolgus makaki majmuna. BAL je sakupljen pre i nakon sv ake doze. Ekspresija gena IFN-p-zavisnih antivirusnih markera (MxA. 2'-5' OAS i interferon gama-inđukovanog proteina 10 kDa (IP-10) u BAL ćelijama je određena korišćenjem kvantitativ nih PCR metoda. Niv oi ushodne regulacije su poređeni u odnosu na podatke dobijene u kliničkim studijama kako bi se izabrala doza za sledeću fazu.

Raspored studija i više detalja o postupcima je opisano u nastavku.

[0053|Sedam dana pre primene inhalacijom IFN-p. pet mužjaka cinomolgus makaki majmuna, uzrasta oko tri godine, su anestezirana sa ketaminom-đormitorom. krv i bronho-alveolarno ispiranja (BAL) su sakupljena i njihova težina je izmerena. BAL obuhvata ispiranje pluća sa 10 niL fbsfatnim-puferovanim slanim rastvorom sa predviđenim oporavkom od približno 5 ml.. Svaki put uzorci BAL-a su podeljeni u supernatant i ćelijsku frakciju, Celijske frakcije su ti/irane u RI T puferu (Qiagen) i analizirane na IFN-(3-zavisne antivirusne biomarkere M.\A, 2'-5' OAS. i IP-10 korišćenjem kvantitativnih PCR metoda.

[0054| Na dan 0, pod anestezijom, krv je sakupljena, težina izmerena i 3 ml inhaliranog IFN-p (Rentschler) isporučeno je svakom makakiju. 1NF-P rastvor se pomoću nebulizatora dostavlja inhalacijom korišćenjem Lneb uređaja (Philips Respironics) povezanog na pedijatrijsku masku za lice (Philips Respironics, deo broj HSS I 11OEU-OOI). Uređaj l-neb je programiran da generiše kontinualni mlaz aerosola kada se uključi.

[0055| Na dan I. pod anestezijom, krv i BAL se sakupljaju i težina je izmerena.

[0056| Na dan 8, pod anestezijom, krv je sakupljena, težine izmerena i 1.5 ml ili 4.5 ml inhaliranog IFN-P je isporučeno svakom makakiju. Izabrana doza IFN-P će zav isiti od rezultata dobijenih od doze 1.

[0057]Na dan 9. pod anestezijom, krv i BAL se sakupljaju i težina je izmerena.

Faza 2 : Efekat proti laktiekog i ter;meutskoglečenja sa plućnom isporukom IFN-p kod gripom

indukovane pl ućne patologij e i plućnog širenja virusa

[0058]Druga faza studije uključuje tri grupe u tretmanu: Grupa 1 primalaćeno: Grua 2 prima inhalirani IFN-P u tretmanu 24 časa pre nego što su zaraženi izazvanim virusom i naknadno dnevni tretman sa IFN-p; Grupa 3 prima inhalirani IF<N>-bela u tretmanu 4 sati nakon sto sli zaraženi sa izazvanim virusom i naknadno dnevni tretman sa ll-N-Jl Icrapcutski tretmani se primenjuju 4 sali posle infekcije kao u ovom modelu relativno visoka doza virusa se primenjuje direktno do donjeg respiratornog trakta prema modelu utvrđenom za bolest donjih disajnih puteva. Izračunavanje veličine uzorka pokazuje da je za 9 životinja po grupi potrebno da se v idi efekat tretmana za razliku od 1,5 log u virusnom titru između tretiranih i kontrole (netretiranih) životinja. Ovo se smatra klinički značajnim na osnovu rezultata kliničkih studija sa inhibitorima neuraminidaze (Barnetl et al. (2000) Antimicrob.Agents Chemother. 44:78-87). Raspored Studija je prikazan ispod:

Sinairgen Interferon Beta H5N1/H1N1 'tretman. Izazivanjećt Raspored l zorkovanja j

[0059|Zbog broja životinja uključenih u studiji koristi se blok dizajn. Studija je sprovedena u tri bloka, sa svakim blokom koji se sastoji od devet životinja, tri životinje iz svake grupe tretmana.

[0060|Četrnaest dana pre izazivanja virusa devet cinomolgus makaki maj inima potvrdjenih da su seronegativni za cirkulišuće viruse gripa su opremljeni sa preprogramiranim temperaturnim senzorom u trbušnoj duplji i krv je sakupljena pod ketaminom i Dormilor anesiezi jom.

[00611Na dan -1, posle potpunog oporavka od operacije. s\e životinje su anestezirane, izmerene i uzorci (cela krv za serum i nazalni/grleni brisevi) su sakupljeni. Životinjama koje pripadaju grupama I i 2 primenjen je raspršeni plaeebo ili IFN-p (u dozi utvrđenoj u fazi 1) pod anestezijom.

[0062] Na dan 0 životinje iz grupe I i 2 se tretiraju raspršenim plaćenom ili IFN-p kao što je opisano gore. Sve životinje su zatim izlagane intratrahealno virusu influence (10'1(11). I U\". ili 10 I'CII)-.. HINI). Četiri sata nakon intratrahealnog izlaganja kod životinja Grupe 3 primenjuju se raspršeni IFN-P kao što je gore opisano. |0063] U danima I, 2. 3 i 4 sve životinje su anestezirane, izmerene. sakupljeni su uzorci (cela krv za serum i nazalni/grleni brisevi) i tretirane su sa raspršenim placebom ili IFN-p kao što je opisano gore.

[0064] Pet dana posle infekcije sve životinje su anestezirane, izmerene i eutanazirane usled iskrvavljenosti. Puna bruto patologija se vrši. svi glavni organi proveravaju i plućne lezi je se opisuju. Uzorci su sakupljeni od svih životinja uključujući: celu krv za serum, nazalni / grleni brisevi i tkiva sa desnih pluća. Tamponi sakupljeni tokom eksperimenta i sekcija desnih pluća su podvrgnuli kvantitativnoj PCR i virusnoj titraciji za određivanje virusa. I.eva sirana pluća se nađuvava sa 10% formalinom za kasniju histopatološku procenti. [0065JGlavne završne tačke su virusno opterećenje pluća i rezultat patologije pluća. Brisevi grla koji su uzeti svakodnevno daće indikaciju vremenskog trajanja virusne infekcije. Pozitivni podaci, smanjenje virusnog opterećenja u plućima ili patologije pluća, posebno nakon terapijskog tretmana sa IFN-P, će podržati razvoj inhalacionog IFN-p za lečenje bolesti donjeg respiratornog trakta izazvane gripom.

Claims

1. Interferon-p (IFN-P) za upotrebu u lečenju bolesti donjeg respiratornog trakta koja se razvila tokom ili posle uspostavljanja bolesti poput gripa (11.1). pri čemu je navedeni tretman pomoću aerosol isporuke navedenog leka do donjeg respiratornog trakta: pri čemu je II I definisan kao (a) groznica >37,8°C plus dva od sledećih simptoma: glavobolja, kašalj, upala grla i mijalgija i/ili (b) potvrđen grip: pri čemu uspostavljen 11.1 označava bolest u kojoj su simptomi postali očigledni u toku najmanje 48 sati: pri čemu je bolest donjeg respiratornog trakta uzrokovana gripom; i pri čemu je IFN-p isporučen do donjeg respiratornog trakta pomoću aerosola za najmanje 48 sati nakon što su simptomi II I postali očigledni.

2. IFN-p za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži sekveneu: (a) humanog IFN-pla (SEK ID BR : 2); ili (b) humanog IFN-p lb (SEK ID BR : 4).

3. IFN-P za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva u kombinaciji sa inhibitorom neuraminidaze.

4. IFN-p za upotrebu prema patentnom zahtevu 3. gđe je inhibitor neuraminidaze lokalno aktivan.

5. IFN-P za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 4. gđe je inhibitor neuraminidaze zanam ivir.

6. IFN-P za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5. naznačen time da pacijent boluje od astme i/ ili COPD.

7. IFN-p za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6. gde pacijent ima više od 60 godina starosti.

8. Proizvod za upotrebu u lečenju bolesti donjeg respiratornog trakta koja se razvila tokom ili nakon uspostavljanja bolesti poput gripa (II I) sadrži (i) IFN-p i (ii) inhalirani inhibitor neuraminidaze za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu aerosol primenu do donjeg respiratornog trakta; pri čemu je ILI definisan kao (a) groznica >37.8°C plus dva od sledećih simptoma; glavobolja, kašalj, upala grla i mijalgija i/ili (b) potvrđen grip: pri čemu uspostavljen ILI označava bolest u kojoj su simptomi poslali očigledni u toku najmanje 48 sati: pri čemu je bolest donjeg respiratornog trakta uzrokov ana gripom: i pri čemu je IFN-p isporučen do donjeg respiratornog trakta pomoću aerosola za najmanje 48 sati nakon što su simptomi ILI postali očigledni.