RS55248B1 - Postupak za biološku kontrolu listeria - Google Patents

Description

[0001]Ovaj pronalazak odnosi se na nov postupak za biološku kontroluListeria,a naročitoListeria monocytogenes,takođe na novu kompoziciju namenjenu za kontrolu proliferacijeListeria

monocytogenes.

[0002]Listeria monocytogenes jeGram-pozitivna bakterija koja pripada familiji listeriacea. Kod ljudi ova bakterija odgovorna je za listeriozu sa prognozom da je često fatalna (10). Često se zapažaju kod preživelih ozbiljne posledice. Ova patogena bakterija može da prođe kroz intestinalnu barijeru i placentnu barijeru i da izazove infekcije fetusa ili novorođenčeta, ili prevremeneporođaje. Listeria monocytogenes jetakođe glavni izazivač neuroinvazivne infekcije sa rastućom prevalencom u poslednjih nekoliko godina (5) (10). Prema tome, praćenje i prevencija listerioze je od rastućeg značaja.

[0003]Listeria monocytogenes jebakterija sa sveprisutnom diseminacijom/distribucijom: prisutna je u zemlji, vodi, kao i u epifitu biljaka, itd. Vrlo je otporna u postupcima čišćenja-dezinfekcije, te prema tome može da perzistira u proizvodnim jedinicama industrije prerade hrane, na primer, u mrežama za distribuciji vode ili kondicioniranje vazduha, na primer.

[0004]Uopšteno i uprkos medicinskom značaju ove bakterije, znanje koje se odnosi na ekologijuListeriaostaje relativno ograničeno (1). Međutim, poznato je da u okruženju,Listeria monocytogenesima sveprisutnu distribuciju (15), jer je ova bakterija izolovana iz zemlje, kanalizacije ili iz industrijske otpadne vode (4), što je karakteristika koju ona deli sa slobodno živećim amebama. Šta više, sposobnostListeria monocytogenesda bude otporna na distribuciju od strane ljudskih makrofaga omogućila je određenim naučnicima da iznezu hipotezu da ova patogena bakterija može da bude otporna prema slobodno živećim amebama u okruženju, po analogiji sa znanjem prikupljenim u oblasti odnosa između parazitskih bakterija i ameba domaćina (6). Tako su Ly i Muller sugerisali daListeriamože biti otporna na slobodno živeće amebe (6, 9). Ove hipoteze mogu se potvrditi kada su ovi autori pokazali da jeListeria monocytogenessposobna da se proliferuje u prisustvu slobodno živećih ameba koje pripadaju roduAcanthamoeba(9) (6). Pored toga, citotoksičan efekatListeria monocytogenesna amebne domaćine je pokazan time što je zapaženo stvaranje cisteAcanthamoebakada se ove poslednje stave u kokulturu sa patogenom bakterijom (6, 9). Zhou et al takođe su pokazali daListeria monocytogenesima sposobnost da bude resistentna na slobodno živeće amebeAcanthamoeba castellanii:(16). Takođe je pokazano da jeListeria monocytogenessposobna da raste u prisustvu biološkog materijala koji oslobađaju amebe tokom stvaranja cisti ili njihove lize (1). Autori ovog zapažanja predložili su da ovi faktori mogu da obezbedeListeriasa pogodnim uslovima za njihovo održavanje i/ili proliferaciju u okolini (1). Ostala zapažanja data od strane Pushkareva i Ermolaeva omogućila su da se pokaže, u drugim slobodno živećim protozoama( Tetrahymena pyriformis),da seListeria monocytogenesustvari efikasno internalizuje (11). InfestacijaTetrahymena pyriformisod straneListeria monocytogenesizaziva stvaranje cisti protozoa (11). Podaci dobijeni od strane ovih istraživača takođe su pokazali daListeria monocytogenesinternalizovane u ovim cistama protozoa ostaju vijabilne, održavaju svoju virulentnost, i sposobne su da izazovu infekcije kod životinjskih modela (11).

[0005]Iz tog razloga jasno sledi da slobodno živeće protozoe i amebe čine važan element ekologijeListeria monocytogenes,tako što promovišu njihovo održanje i njihov rast u okruženju, i promovisanjem pojave osobina bakterijske virulence. Šta više, sposobnost Listeria da inficira protozoe i da preživi u njihovim cističnim formama (11), snažan je indikator da su protozoe faktori koji promovišu otpornostListeriaprema biocidnim tretmanima koji se sada koriste. Amebne ciste ustvari pokazuju veliku otpornost prema hemijskim i/ili fizičkim biocidnim tretmanima trenutno u primeni (7,8,14). Biocidni tremani koji su trenutno u primeni za prevenciju rizika odListerianisu zadovoljavajući jer, pored toga što razvoj otpornosti koji je svojstven bakterijiperse(12,13), bakterije prisutne unutar protozoa i biofilmova (2) jesu relativno zaštićene, i zbog toga će nastaviti da se proliferuju/kolonizuju u okruženju.

[0006]U ovom kontekstu, pronalazači su pokazali, potpuno neočekivano, da amebni rodWillaertia magnaiskorenjuje bakterijeListeria monocytogenes.Ovaj biocidni efekat je dodatan već prikazanoj sposobnostiWillaertia magnaka predaciji prema drugim amebnim agensima koji mogu da posluže kao vektor zaListeria monocytogenes (3).

[0007]Prema tome, predmet ovog pronalaska je pre svega postupak za kontrolisanje proliferacijeListeria,a određenoListeria monocytogenes,koji koristi protozoe rodaWillaertia magna.Postupci u skladu sa ovim pronalaskom ne obuhvataju postupke lečenja koji se primenjuju na ljudskom ili životinjskom telu. U postupku prema ovom pronalasku najčešće se gasna ili tečna struja tretiraju protozoama rodaWillaertia magna,a određeno vrstaWillaertia magna.

[0008]Za svrhu ovog pronalaska, pojamListeriakoristi se za označavanje vrsteListeria,a određenije

Listeria monocytogenes.

[0009]Postupak prema ovom pronalasku naročito se može koristiti za dezinfekciju distributivnih mreža sanitacione vode ili industrijske vode, rashladnih tokova industrijskih pogona, ili mreža za kondicioniranje vazduha ili kao za dezinfekciju površina. Protozoe se mogu direktno uneti u vodu ili tečnosti koje cirkulišu cevima ili mrežama koje treba da budu tretirane. Takođe je moguće da se nanose sprejom, na primer u obliku vodenog rastvora ili aerosola, u industrijskim mrežama, dimnjacima, instalacijama i površinama pogona koji treba da se dezinfikuju.

[0010]Pogodno, protozoe korišćene u kontekstu ovog pronalaska odgovaraju soju deponovanom 26 Avgusta 2006 pod brojemPTA 7824u ATCC ili soju deponovanom 26 Avgusta 2006 pod brojemPTA 7825u ATCC, pri čemu su ova dva soja deponovana u ime CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) - 3 rue Michel Ange - 75794 PARIŠ CEDEX 16 / FRANCUSKA - i UNIVERSITE LYON 1 CLAUDE BERNARD - 43 Boulevard du 11 Novembre 1918 - 69622 VILLEURBANNE Cedex / FRANCUSKA.

[0011]Protozoe rodaVVillaertiakoje odgovaraju soju deponovanom pod brojemPTA 7824u ATCC ili soju deponovanom pod brojemPTA 7825u ATCC čine sastavni deo ovog pronalaska. Pomenuti deponovani sojeviPTA 7824iPTA 7825takođe su opisani u objaci međunarodne prijave PCT VVO2008/043969.

[0012]Prema tome, te protozoe mogu se koristiti kao dezinfektatni, naročito namenjeni za eliminisanje bakterijaListeria,naročitoListeria monocytogenes,i za kontrolu proliferacije i kontaminacije listeriozom.

[0013]Pogodno, dezinfektanti prema ovom pronalasku su obliku rastvora ili vodene suspenzije, na promer u destilovanoj vodi. Dezinfekcioni agens može biti u obliku pogodnom za pulverizaciju, na primer aerosol ili za neki drugi način primene.

[0014]Inhibiciona aktivnost protozoa rodaWillaertiaprema proliferacijiListeria monocytogenes,a naročito vrsteWillaertia magna,pokazana je od strane pronalazača upoređivanjem replikacijeListeria monocytogenesu rodovimaAcanthamoebaiHartmannellakorišćenih kao amebni modeli, sa onom zapaženom kod amebnog rodaVVillaertia.

[0015]Imajući u vidu esencijalnu ulogu koje igraju amebe u proliferaciji i održanjuListeria,a naročitoListeria monocytogenesu spoljašnjem okruženju, elemente koji uslovljavaju epidemiologiju listerioze, budući da nema međuljudske transmisije, postupak i dezinfekcioni agens prema ovom pronalasku imaju brojne prednosti u pogledu troška, efektivnosti i naročito pogodnosti za okolinu.

[0016]Primeri koji slede omogućuju ilustrovanje pronalaska, ali nemaju ograničavajući karakter.

[0017] Fig 1 prikazuje sponatnu evoluciju respektivnih populacija amebaHartmannella, AcanthamoebaiVVillaertiaposle stavljanja u kokulturu saListeria monocytogenessa poečtnim odnosom ameba/bakterija od 10.

[0018] Razne slobodno živeće amebe stavljene su u kokulturu (vreme 0 sati) saListeria monocytogenesu odnosu od 10 (10 bakterija/l ameba) kao što je opisano u delu materijali i postupci. Zatim su uzimani alikvoti ćelijskih suspenzija svaka 3 sata nakon stavljanja u kokulturu, a procenat živih ameba određenje pomoću tripan plava ekskluzionog tetsa i mikroskopskog posmatranja korišćenjem Mallasez ćelije. Podaci su izraženi kao % živih ćelija, negativ u tripan plava ekskluzionom testu.

[0019] Fig 2 prikazuje uporedne kinetike razvojaListeria monocytogenesostvarene u kokulturi sa raznim amebnim rodovima, uključujući rodVVillaertia.

[0020] Razne slobodno živeće amebe odvojeno su unete u kokulturu (vreme 0 sati) saListeria monocytogenesu odnosu od 10 (10 bakterija / 1 ameba). Alikvoti ćelijskih suspenzija uzimani su svka 3 sata posle uvođenja u kokulturu, a koncentracijeListeria monocytogenesutvrđene su kao što je opisano u delu materijali i postupci.

[0021] Fig 3 prikazuje biocidni efekatWillaertia magnana biofilm formiran od straneListeria monocytogenes.Ova slika takođe pokazuje odsustvo efekta slobodno živećih amebaAcantlvameoba castellaniiiHartmanella vermiformis.

[0022]Listeria monocytogenessu inokulisane na TSA agaru, koji je inkubisan na 30 ° C tokom 48 sati kako bi se obezbedilo formiranje gustog biofilma bakterija na agaru. Zatim su 1 x IO<5>ameba( Acanthamoeba castellanii,Pločica A;Hartmanella vermiformis,Pločica B;VVillaertia magnapločice C i D) resuspendovanih u 100 u.1 sterilne dejonizovane vode, inokulisane u centru agara. Posle 24 sata na 30 ° C agari su ispitani pod mikroskopom radi određivanja pojave ameba i njihovog uticaja na biofilm. A: bele strelice prikazuju pojavu grupa cisti formiranih od straneAcanthamoeba castellaniiu prisustvuListeria monocytogenes(Lm.). Treba zapaziti odsustvo sloja plaka bakterijske lize oko grupa amebnih cisti. B: Treba zapaziti prisustvo brojnih cisti formiranih od straneHartmanella vermiformis,gde su neki njihovi primeri označeni belim strelicama. Takođe treba zapaziti veoma veliku gustinuListeria monocytogeneskoje okružuju cisteHartmanella vermiformisi potpuno odsustvo plakova lize bakterijskog biofilma. C: UticajVVillaertia magnana biofilm formiran od straneListeria monocytogenes.Bele strelice prikazuju grupe trofozoitaVVillaertia magnasmeštenih na prednjem delu plakova lize biofilma. Treba zapaziti odsustvo bakterijskog biofilma (zona delimitirana belim krugom na donjem levom uglu mikrofotografija) iznad grupaVVillaertia magnai gustog bakterijskog filma (označenog inicijalima L. m.) dole od grupa ameba (gornji levi ugao mikrofotografije). D: jše jedna mikrofotografija koja prikazuje formiranje plakova lize biofilma formiranog od straneListeria monocvtogenes.Treba zapaziti grupeVVillaertia magnai prednje delove plakova lize bakterijskog biofilma (označeni belim tačkama).

1. MATERIJALI I POSTUPCI

1. 1.Korišćeni sojevi:

[0023]Listeria monocytogenes:korišćeni soj je soj CL 3970 (Oxoid, Francuska). -. Održavan na TSA agaru (Trvptone Soja Agar) (ref PO 5012, Oxoid, Francuska) brzinom od jednog subkulturisanja nedeljno. Soj je inokulisan u širokim prugama na TSA agar ploči i inkubisan 2 dana na 30°C.

- amebe:korišćeni sojevi pripadaju trima različitim amebnim vrstama:

o Hartmannella vermiformis,

o Acanthamoeba castellanii,sojevi deponovani kod ATCC pod Br. 30010

oVVillaertia magna(sojevi deponovani kod ATCC pod Br. PTA7824 i PTA 7825)

[0024]Ovi sojevi kultivisani su aksenično u prisustvu 10% fetalnog goveđeg seruma, na SCGYEM podlozi ®

(Serum Casein Glucose Yeast Extract Medium), distribuirana u Falcon cevčicama (3033) u odnosu od 3

ml po cevčici. Tokom održavanja, vegetativni oblici su subkultivisani svakih 8-9 dana. Za kokultrure, korišćene su 3- do 4-dnevne subkulture tako da postoje trofozoiti upravo u fazi eksponencijalnog rasta. SCGYEM podloga dobijena je kako sledi:

[0025]U 900 ml destilovane vode, dodata su 2.5 ml NaOH (1N), a zatim Na2HP04i KH2P04Smesa je blago zagrevana na vrućoj ploči, a zatim je postepeno dodavan kazein uz magnetno mešanje. Pošto se kazein rastvorio, uključeni su glukoza i ekstrakt kvasca.

[0026]Posle potpunog rastvaranja, mešavina je sukcesivno filtrirana kroz staklena vlakna (SARTORIUS SM 6513400), a zatim kroz 1 u.m membranu (VVhatman 7190 004). Podloga je zatim alikvotirana u staklene bočice. Bočice su sterilizovane u autoklavu tokom 20 minuta pri 120°C. Pre konačne upotrebe i distribucije podloge, uz mešanje je dodat fetalni goveđi serum u kapeli sa laminarnim tokom, u odnosu od 10% od konačne zapremine.

1. 2.monoamembna kokultura Listeria monocvtoaenes .

1. 2. 1.Pripremanje bakterijskog inokuluma:

[0027]SuspenzijaListeria monocytogenesu sterilnoj destilovanoj vodi, pripremljena je od 2-dnevne kulture na TSA agaru, da bi se dobila jedna jedinica optičke gustine pri 550 nm, tj. koncentracija od IO<9>CFU (jedinice koje formiraju koloniju)/ml.

1. 2. 2.Realizacija monoamebnih kokultura

[0028]Ove kokulture realizovane su u cevčicama za kokulture (FALCON<*>3033) koje sadrže 3 ml u autoklavu sterilisane vode. Inokulacija cevčica realizovana je u odnosu 1 x IO<5>ameba/ml, iz aksenične amebne suspenzije prethodno izbrojane na Malassez hemocitometru. Infestacija ameba saListeria monocytogenesizvedena je fiksiranjem odnosaListeria monocytogenes/Amebeod 10, tj. 1 x IO<6>bacterija/ml inkubacione podloge. Odmah posle infestacije, cevčice kokulture centifugirane su malom brzinom (760g tokom 10 min) da bi se ostvario kontakt između ameba i bakterija. Posle 10 min, cevčice su ručno resuspendovane i inkubisane, u nagnutom položaju, u inkubatoru na 30 ° C.

[0029]Postojanje amebai Listeria monocytogenesstavljenih u kokulturu utvrđeno je na sledeći način: Kokulturue su praćene 9 sati posle bakterijske infestacije. U svakom vremenskom intervalu (svaka 3 sata), cevčice kokulture su uzorkovane i ispitane i sa amebne tačke gledišta i sa bakterijske tačke gledišta posle intezivnog mešanja na vorteksu radi razdvajanja ameba od zidova. Za svaku ispitivanu cevčicu:

amebe su brojane direktno na Malassez ćeliji.

koncentracijeListeria monocytogenesodređene su direktnim nanošenjem kulture podloge na TSA agar posle 10-strukog razblaživanja u 10 serija u sterilnoj destilisisanoj vodi, u Eppendorf mikrocevčicama. Svako razblaženje naneto je tri puta na TSA agar u odnosu od 100u.l po pločici.

Pločice su zatim inkubisane na 30 ° C tokom najmanje 48 sati. Prvo očitavanje TSA agara izvedeno je 24 sata posle nanošenja, brojanjem kolonija; to je praćeno drugim očitavanjem 2. dana radi potvrđivanja. KoncetracijeListeria monocytogenesizražene su u CFU/ml inkubacione podloge, uzimajući u obzir faktor razblaženja, i pretpostavljajući da svaka kolonija odgovara 1 bakteriji koja je prethodno bila prisutna u razblaženoj suspenziji.

[0030]Za svaki amebni rod, krive rastaListeria monocytogenes,prikazane su u fuknciji vremena.

[0031]Pored toga, mogući citotoksični efekatListeria monocytogenesna različite amebne vrste, određen je na sledeći način: • brojanjem odnosa ameba koje su pozitivne u tripan plavo ekskluzionom testu. Ovaj test izvodi se pod mikroskopom brojanjem, u Malassez ćeliji, broja tripan plavo pozitivnih ćelija/ukupan broj ćelija.

• utvrđivanjem sklonosti ameba da formiraju ciste u prisustvuListeria monocytogenes.

1. 3.Utkaj VVillaertia magna na biofilmove Listeria monocvtoaenes .

[0032]BiofilmoviListeria monocytogenesformirani su na sledeći način: prethodno utvrđena količinaListeria monocytogenesu lOOul sterilne vode deponuje se i nanosi na TSA agar. Agari se ostave na 30<0>C tokom 48 sati da bi se omogućio razvoj gustog i uniformnog bakterijskog filma po čitavoj površini agara. Zatim se 1 x IO<5>ameba( Acanthamoeba castellanii, Hartmanella vermiformisiliVVillaertia magna)stavlja u centar agara koji se zadržava na 30 ° C tokom 24 sata. Agari se zatim posmatraju po optičkim mikroskopom (uvećanje x 400) da bi se u njima detektovalo formiranje mogućih plakova lize bakterijskog sloja.

2. REZULTATI

2.1.VVillaertia magn<g>pokazuje otpornost no Listeria monocvtoaenes .

[0033]UticajListeria monocytogenesna preživljavanje različitih ispitivanih amebnih vrsta određen je pomoću tripan plavo ekskluzionog testa. Vrlo brzo, po stavljanjuAcanthamoeba castellaniiu kokulturu sa bakterijama, odigrava se značajan citotoksičan efekat u ovoj amebnoj vrsti, sa padom od ~ 50% vijabilnosti posle 3 sata od kokulturisanja (videtiFig 1).Obrnuto, ovaj fenomen nije zapažen kada jeVVillaertia magnastavljena u kokulturu saListeria monocytogenes,uključujući do 9 sati inkubisanja sa vijabilnošću koja se održava bliskom 100%(Fig1). SličnoVVillaertia magna,slobodno živeća amebaHartmanella vermiformisne pokazuje pad u pogledu vijabilnosti utvrđenom tripan plavo ekskluzijom(Fig 1).Međutim, mikroskopsko ispitivanje amebnihListeria monocytogeneskokultura pokazuje veliku naklonost ka formiranju cisti uHartmanella vermiformisi vijabilnimoblicima Acanthamoeba castellanii

(videtiTabelu 1).Ovaj fenomen stvaranja cisti nije zapažen kodVVillaertia magnakada se stavi u kokulturu sa patogenom bakterijom(Tabela 1).

Tabela 1. efekatListeria monocytogenesna izazivanje cističnih oblika kod raznih vrsta slobodno

živećih ameba.

Slobodno živeće amebe stavljene su ukokulturu (vreme 0 sati) saListeria monocytogenesu odnos od 10 (10 bakterija/l ameba) kao što je opisano u delu materijali i postupci. Zatim su uzeti alikvoti ćelijskih suspenzija svaka 3 sata nakon stavljanja u kokulturu, kao što je prikazano u gornjoj tabeli. Gustina amebnih cisti izražena je na sledeći način: ND: nema detektovanih cisti;

+: Prisustvo cisti (odnos manji od 10% vijabilnih oblika);

++: Prisustvo cisti (odnos između 10% i 30% vijabilnih oblika);

+++: Pisustvo cisti (odnos veći od 30% vijabilnih oblika).

[0034]Sva ova zapažanja (nema stvaranja cisti i nema citotoksičnosti izazvaneListeria monocytogenes)jasno pokazuju daVVillaertia magnaza razliku od druge dve amebne vrste, pokazuje inicijalnu sposobnost na rezistenciju premamonocytogenes.

2.2.predacijaListeria monocvtoaenesod straneVVillaertia magna

[0035]RezultatiListeria monocytogeneskokultura realizovanih u prisustvu ameba koje pripadaju rodovimaHartmannella i Acanthamoebapokazuju značano umnožavanje bakterije u prisustvu ova dva amebna roda jer je zapaženo povećanje koje dostiže približno~3 log u bakterijskim koncentracijama tokom 9 sati (videtiFig2). Obrnuto, iako su kokulture realizovane pod strogo identičnim uslovima, zapažen je potpun nestanakListeria monocytogenesu prisustvu amebaVVillaertia magna(videtiFig2). Izmereni pad koncentracijaListeria monocytogenes je~6 Log tokom 3 sata, što pokazuje veliki predacioni efekatVVillaertia magnapremaListeria monocytogenes.

[0036]Ovaj efekatVVillaertia magnanaListeria monocytogenesdalje je ilustrovan naFig3. Dakle, posle 24 sata u prisustvuVVillaertia magna,površine agara sa kojih je nestao bakterijski sloj izgledaju vrlo bistre (ove površine ovde nazivaju slojevi plakova lize/bakterijski biofilm). Mikroskopsko ispitivanje takođe pokazuje da suVVillaertia magnakoncentrisane na granicama tog plaka lize; ovaj efekat prikazan je naFig 3 Pločica C.Distribucija bakterijskog sloja od straneVVillaertia magnatakođe je prikazana naPločici D sa Fig 3gde se jasno razaznaju grupe ameba okružene bakterijskim slojem koji je uništen ili je u procesu uništavanja. Obrnuto, u prisustvuAcanthamoeba castellaniiiliHartmanella vermiformis,nije bilo moguće zapaziti ovaj fenomen. Mikroskopsko ispitivanje agara pokazuje da amebeAcanthamoeba castellaniiiHartmanella vermiformisbrzo stvaraju ciste kada se deponuju na filmListeria monocytogenes.Ovaj fenomen ilustrovan je na pločicamaA iB saFig3. Takođe se zapaža potpuno odsustvo bilo kakvih plakova lize bakterijskog sloja oko cistiAcanthamoeba castellaniiiHartmanella vermiformis,što je suprotno fenomenu zapaženom saVVillaertia magna.Svi ovi podaci i zapažanja jasno pokazuju predacioni efekatVVillaertia magnaprema patogenoj bakterijiListeria monocytogenes.

Literaturne reference

[0037]

1. Akya A, Pointon A, and Thomas C. Viabilitv of Listeria monocvtogenes in co-culture with

Acanthamoeba spp. FEMS Microbiol Ecol 70: 20-29, 2009.

2. Belessi CE, Gounadaki AS, Psomas AN, and Skandamis PN. Efficiencv of different sanitation

methods on Listeria monocvtogenes biofilms formed under various environmental conditions. Int J Food Microbiol 145 Suppl 1: S46-52, 2011.

3. Bodennec J, Dey R, and Pernin P. Novel method for biologically combating the proliferation of

Legionella pneumophila, and novel disinfecting agent containing amoebic protozoa of the VVillaertia genus. edited by University CBL. France: 2010.

4. Dijkstra RG. The occurence of Listeria monocvtogenes in surface vvater of canals and lakes, in

ditches of one big polder and in the effluents and canals of a sewage treatment plant. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg[B] 176: 202-205,1982. 5. Goulet V, Hedberg C, Le Monnier A, and de Valk H. Increasing incidence of listeriosis in France and

other European countries. Emerg Infect Dis 14: 734-740, 2008.

6. Greub G, and Raoult D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin Microbiol Rev 17: 413-433, 2004. 7. Khunkitti W, Lloyd D, Furr JR, and Russell AD. Acanthamoeba castellanii: grovvth, encystment,

excystment and biocide susceptibility. J Infect 36: 43-48,1998.

8. Lloyd D, Turner NA, Khunkitti W, Hann AC, Furr JR, and Russell AD. Encvstation in Acanthamoeba

castellanii: development of biocide resistance, J Eukaryot Microbiol 48:11-16, 2001.

9. Ly TMC, and Muller HE. Ingested Listeria monocytogenes survive and multiply in protozoa. J Med Microbiol 33: 51-54,1990. 10. Mailles A, Lecuit M, Goulet V, Leclercq A, and Stahl JP. Listeria monocvtogenes encephalitis in France. Med Mal Infect In Press. 11. Pushkareva VI, and Ermolaeva SA. Listeria monocvtogenes virulence factor Listeriolvsin 0 favors bacterial grovvth in co-culture with the ciliate Tetrahvmena pvriformis, causes protozoan encvstment and promotes bacterial survival inside cysts. BMC Microbiol 10: 26, 2010. 12. Rajkovic A, Smigic N, Uyttendaele M, Medic H, de Zutter L, and Devlieghere F. Resistance of Listeria monocytogenes, Escherichia coli 0157:H7 and Campylobacter jejuni afterexposure to repetitive cycles of mild bactericidal treatments. Food Microbiol 26: 889-895, 2009. 13. Rakic-Martinez M, Drevets DA, Dutta V, Katic V, and Kathariou S. Listeria monocvtogenes strains selected on ciprofloxacin or the disinfectant benzalkonium chloride exhibit reduced susceptibility to ciprofloxacin, gentamicin, benzalkonium chloride and other toxic compounds. Appl Environ Microbiol In Press, 2011. 14. Thomas V, Bouchez T, Nicolas V, Robert S, Loret JF, and Levi Y. Amoebae in domestic water systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella persistence. JAppl Microbiol 97: 950-963, 2004. 15. VVeis J, and Seeliger HP. Incidence of Listeria monocytogenes in nature. Appl Microbiol 30: 29-32, 1975. 16. Zhou X, Elmose J, and Call DR. Interactions between the environmental pathogen Listeria monocytogenes and a free-living protozoan (Acanthamoeba castellanii). Environ Microbiol 9: 913-922, 2007.

Claims (8)

1. Postupak za kontrolu proliferacijeListeria monocytogenes,izuzev postupaka tretaranja primenjenih na ljudskom ili životinjskom telu,naznačent i me, štose upotrebljava protozoa vrsteVVillaertia magna.

2.Postupak prema zahtevu 1,n az n a č e nt i me,štose struja gasa ili tečnosti ili čvrsta površina tretira protozoom vrsteVVillaertia magna.

3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2,n a z n ače n t i m e, štoove protozoe odgovaraju soju deponovanim pod brojemPTA 7824u ATCC ili soju deponovanom pod brojemPTA 7825u ATCC.

4. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 3, naznačentime, štose primenjuje za dezinfekciju distribucionih mreža sanitacione vode ili industrijske vode, rashladnih tokova industrijskih pogona, ili mreža za kondicioniranje vazduha, ili bilo koje industrijske površine.

5. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 3, n a z n a č en t i me,štose primenjuje za kontrolu formiranja biofilmova u cevima za vodu, ili površinama koje su moguće u kontaktu sa ljudskim ili životinjskim prehrambenim proizvodima.

6. Upotreba dezinfekcionog sredstva koji sadrži protozoe vrsteWillaertia magna,kao biocid zaListeria,izuzev upotrebe za tretiranje koje se primenjuje na ljudskom ili životinjskom telu.

7. Upotreba prema zahtevu 6, n az n ač ena t im e, štoprotozoe odgovaraju soju deponovanom pod brojemPTA 7824u ATCC ili soju deponovanom pod brojemPTA 7825u ATCC.

8. Upotreba prema zahtevu 6 ili 7,n az n a č e n a t i m e,štoje u obliku vodenog rastvora ili suspenzije.