RS55309B1

RS55309B1 - Kompozicije kvasca isprepletane glinom i postupci za upotrebu istih

Info

Publication number: RS55309B1
Application number: RS20160927A
Authority: RS
Inventors: Alexandros Yiannikouris; Ursula Anne Thielen
Original assignee: Alltech Inc
Priority date: 2009-01-14
Filing date: 2010-01-14
Publication date: 2017-03-31
Also published as: KR20110102914A; DK2387410T3; ES2597505T3; JP2012515001A; KR101389240B1; EP2387410B1; AU2010204637B2; RU2011128783A; BRPI1006830A2; CN102548568A; CA2749376C; HUE030657T2; ZA201104898B; PL2387410T3; WO2010083336A2; AU2010204637A1; RU2481117C2; EP2387410A4; JP5829917B2; MY156370A

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na kompozicije koje sadrže ćelije kvasca i/ili komponente ćelija kvasca i postupke za proizvodnju i upotrebu istih. Naročito, opis daje novi kvasac koji sadrži promenjenu strukturu ćelijskog zida (npr., ćelijski zid (zidove) koji sadrže integrisanu glinu (npr., isprepletanu)), postupke za proizvodnju istog, kompozicije koje sadrže i/ili su poreklom od istog, i na postupke za upotrebu istog (npr., za vezivanje i/ili adsorbovanje mikotoksina). Kompozicije i postupci prema pronalasku nalaze upotrebu u različitim primenama uključujući ishranu (npr., mešanje sa hranom ili na drugi način hranjenje životinja), terapeutske, profilaktičke (npr. mešanje sa materijalima od kojih se prave prostirke za životinje i/ili drugim materijalima koji dolaze u kontakt sa životinjama, upotreba u toku obrade i proizvodnje hrane i pića, i upotreba u toku filtracije tečnosti) kao i u istraživačkim primenama.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Gljive su sveprisutne širom sveta, i nevidljive jer su najčešće mikroskopske veličine. Mikotoksini su sekundarni metaboliti koje izlučuju gljive. Mikotoksini su toksična i/ili karcinogena jedinjenja koja proizvode različite vrste gljiva koje rastu na različitim poljoprivrednim artiklima. Primeri mikotoksina, obuhvataju, ali bez ograničenja na, aflatoksine, fumonizine, ohratoksin A, deoksinivalenol (takođe poznat kao "DON" ili "vomitoksin"), patulin i zearalenon. Miotoksini se često proizvode u zrnama žitarica kao i u stočnoj hrani pre, u toku i posle žetve. Neki mikotoksini su letalni, neki izazivaju bolesti ili zdravstvene probleme koji se mogu identifikovati, neki slabe imuni sistem bez proizvodnje simptoma specifičnih za taj mikotoksin, neki deluju kao alergeni ili iritanti, i neki nemaju poznati efekat na životinje ili ljude. Najveći ekonomski uticaj kontaminacije mikotoksinima osećaju proizvođači kulturnih biljaka i živine, kao i proizvođači hrane i stočne hrane. Mikotoksini mogu da se jave u lancu ishrane kao rezultat gljivične infekcije biljnih proizvoda, i mogu biti ili pojedeni od strane ljudi, ili uvedeni putem kontaminacije hrane za životinje. Mikotoksini kontaminiraju organske materijale (npr. prostirku za životinje) kao i vodu, i veoma su otporni na razlaganje u toku varenja tako da ostaju u lancu ishrane u jestivim proizvodima (npr. mesu, jajima i mlečnim proizvodima). Nijedan region u svetu nije bezbedan od mikotoksina i njihovog negativnog uticaja na zdravlje ljudi i životinja. Razvoj globalnog tržišta hrane za životinje povećava šanse da će mešavine zrna rezultirati u kombinacijama mikotoksina u datoj hrani i da će neobični i neočekivani mikotoksini biti prisutni u datom regionu bez obzira na njegove klimatske uslove. [0003J Strategije korišćene za izbegavanje pojave mikotoksina obuhvataju kontrolu elemenata koji omogućavaju proizvodnju mikotoksina, kontrolu rasta buđi kao i izvođenje kontrole kvaliteta hrane i stočne hrane preko adekvatnog uzorkovanja, detekcije i metodologije kvantitativnog određivanja. Međutim, kontaminacija mikotoksinima je neizbežna.

[0004] U cilju smanjenja negativnih efekata mikotoksina, neorganski materijali kao što su gline, bentoniti i aluminosilikati, poznati zbog svojih adsorptivnih osobina, istorijski su dodavani hrani za žiovotinje. Aditivi za hranu za životinje, u velikim količinama, vezuju neke mikotoksine u gastrointestinalnom traktu životinje i minimizuju njihove toksične efekte. Međutim, aditivi ometaju apsorpciju mnogih korisnih hranljivih sastojaka koji su važni za životinje kao što su vitamini, minerali i aminokiseline na taj način smanjujući gustinu hranljivih sastojaka hrane. Pored toga, aditivi za hranu za životinje, naročito u fecesu životinja, imaju ekstremno štetan uticaj na životnu sredinu.

[0005] Hemijska sredstva kao što su kiseline, baze (npr., amonijak, kaustična soda), oksidanti (npr., vodonik peroksid, ozon), redukciona sredstva (npr., bisulfiti), hlorisana sredstva i formaldehid, korišćena su za razgradnju mikotoksina u kontaminiranoj stočnoj hrani, naročito aflatoksina (videti, npr., Hagler 1991; Phillips et al 1994; Lemke et al 2001). Međutim, ove tehnike nisu efikasne, skupe su, stvaraju značajnu količinu hemijskog otpada i često su generalno nebezbedne.

[0006] Određeni sojevi mlečnokiselinskih bakterija, propionibakterija i bifidobakterija imaju strukture ćelijskog zida koje vezuju mikotoksine (videti, npr., Ahokas et al 1998; El-Nemazi et al 1998; Yoon et al 1999) i ograničavaju njihovu biodostupnost u telu životinje. Međutim, ovi biološki procesi su generalno spori, proizvode toksične metabolite i neefikasni su.

[0007] Bauman et al., J. Basic Microbiol. 41 (2001) 1, 7-16 opisuju uticaj zeolita na oblik i veličinu ćelije; Karmelic et al., P15, Naunvn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacologv, vol. 374, no. 4, pages 317-346 opisuju zavisnost koncentracije sfingoidnih baza od faze rasta i dodavanja zeolita u pivski kvasac. US6045834 opisuje uklanjanje mikotoksina iz stočne hrane koje sadrži primenu ekstrakta poreklom iz ćelijskog zida kvasca u kombinaciji sa glinom.

REZIMEPRONALASKA

[0008] Predmetni pronalazak je opisan u patentnim zahtevima 1 do 16.

[00091 U nekim primerima izvođenja, predmetni opis daje ćeliju kvasca koja sadrži ćelijski zid kvasca koji sadrži glinu isprepletanu u ćelijski zid kvasca. Ćelija kvasca je kultivisana u medijumu ćelijske kulture koji sadrži glinu. U nekim primerima izvođenja, glina je mineralna glina ili sintetička glina koja pripada silikatnoj grupi. U nekim primerima izvođenja, glina je izabrana od zeolita, bentonita, aluminosilikata, montmorilonita, smektita, kaolinita, organske gline i njihove smeše. U nekim primerima izvođenja, glina je aluminosilikatna glina. U nekim primerima izvođenja, količina gline u medijumu ćelijske kulture je od 0.125% do 4.0%. U nekim primerima izvođenja, količina gline u medijumu ćelijske kulture je od 0.125% do 4.0%. U nekim primerima izvođenja, količina gline u medijumu ćelijske kulture je od 0.5% do 2.0%. U nekim primerima izvođenja, količina gline u medijumu ćelijske kulture je od 0.5% do 2.0%. U nekim primerima izvođenja, kvasac je izabran odSaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Torulasporai njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, kvasac je

Saccharomyces cerevisiae.

[0010] U nekim primerima izvođenja, predmetni opis daje kompoziciju koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom. Ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom je poreklom od ćelije kvasca kultivisane u medijumu za rast koji sadrži glinu. U nekim primerima izvođenja, staklene kuglice i šejker sa kuglicama su korišćeni za pripremu ekstrakta ćelijskog zida kvasca. U nekim primerima izvođenja, enzimatski tretman je korišćen za pripremu ekstrakta ćelijskog zida kvasca. U nekim primerima izvođenja, ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom je dodat u hranu za životinje. U nekim primerima izvođenja, hrana za životinje je izabrana od Totalnog mešanog raciona (TMR), krme, peleta, koncentrata, premiksa, koprodukta, zrna, džibre, melase, vlakna, krmnih biljaka, trave, sena, jezgra, listova, brašna, rastvorljivih materija i suplementa. U nekim primerima izvođenja, ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom je dodat u organski materijal. U nekim primerima izvođenja, ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom je dodat u vodu. U nekim primerima izvođenja, tečnost je filtrirana kroz ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom. U nekim primerima izvođenja, tečnost je sok, voda, pivo ili vino. U nekim primerima izvođenja, kompozicija je formulisana za ishranu bilo kog člana carstva Animalia. U nekim primerima izvođenja, član carstva Animalia je izabran od vrste ptica, goveda, svinja, konja, ovaca i koza, riba, mekušaca, kamila, mačaka, pasa i glodara. Ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom vezuje jedan ili više mikotoksina. U nekim primerima izvođenja, mikotoksin je izabran od aflatoksina, zearalenona, trihotecena, fumonizina i ohratoksina. U nekim primerima izvođenja, mikotoksin je izabran od acetoksiscirpendiola, acetildeoksinivalenola, acetilnivalenola, acetilneosolaniola, acetil T-2 toksina, prošireno na aflatoksine, aflatoksina BI, B2, Gl i G2, afiatrema, altenuinske kiseline, alternariola, austdiola, austamida, austocistina, avenaceina +1, beauvericina +2, bentenolida, brevianamida, butenolida, kalonektrina, hetoglobozina, citrinina, citreoviridina, kohliodinola, citohalazina E, ciklopiazonske kiseline, deacetilkalonektrina, deaktilneosolaniola, deoksinivalenol diacetata, deoksinivalenol monoacetata, diacetoksiscirpenola, destruksina B, eniatina, prošireno na sve ergot toksine i endofite, fruktigenina +1, fumagilina, fumonizina, fumonizina BI i B2 i B3, Fuzarenona-X, Fuzarohromanona, fuzarinske kiseline, fuzarina, gliotoksina, HT-2 toksina, ipomeanina, islanditoksina, lateritina +1, likomarasmina +1, malformina, maltorizina, moniliformina, monoacetoksiscirpenola, neosolaniola, nivalenola, NT-1 toksina, NT-2 toksina, prošireno na sve ohratoksine, oosporeina, oksalne kiseline, patulina, penicilinske kiseline, penitrema, roridina E, rubratoksina, rubroskirina, rubrosulfina, rugulozina, sambucinina +1, satratoksina, F,G,H, scirpentriola, slaframina, sterikoncentrovanog modifikovanog ćelijskog zida kvascva ekstraktocistina, T-l toksina, T-2 toksina, triacetoksiscirpendiola proširenog na sve trihotecene, trihodermina, trihotecina, trihoverina, trihoverola, triptokvivalena, verukarina, verukulogena, viopurpurina, viomeleina, viriditoksina, ksantocilina, javanicina+1 i zearalenola i zearalenona.

[0011]Predmetni opis daje kompozicije koje sadrže ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom, pri čemu je ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom prisutan u količini koja je efikasna u izolaciji mikotoksina. Na primer, u nekim primerima izvođenja, ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom je prisutan u količini od 0.0125% do 10% prema težini hrane za životinje. U nekim primerima izvođenja, ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom je prisutan u količni od 0.0125% do 4.0% prema težini hrane za životinje. Predmetni pronalazak nije ograničen tipom hrane za životinje.

[0012]U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak daje postupak za smanjenje biodostupnosti mikotoksina kod životinje ili čoveka koji sadrži: (a) obezbeđivanje: (i.) kompozicije koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom i (ii) materijala koji jedu životinja ili čovek; (b) ugradnju ekstrakta ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom u materijal da bi se proizveo materijal koji sadrži inkorporisan ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom; i (c) omogućavanje životinji ili čoveku da pojede materijal koji sadrži inkorporisan ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom. U nekim primerima izvođenja, materijal je hrana za životinje. U nekim primerima izvođenja, 0.0125%) do 0.4% prema težini kompozicije koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom se dodaje u hranu za životinje. U nekim primerima izvođenja, materijal je prostirka za životinje. U nekim primerima izvođenja, 0.0125% do 99. 0% kompozicije koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom je dodato prema težini u prostirku za životinje. U nekim primerima izvođenja, materijal je tečnost. U nekim primerima izvođenja, 0.0125% do 99.0% kompozicije koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom je dodato prema težini u tečnost. U nekim primerima izvođenja, životinja je izabrana od vrsta vrste ptica, goveda, svinja, konja, ovaca i koza, riba, mekušaca, kamila, mačaka, pasa i glodara. Kompozicija koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom izoluje jedan ili više tipova mikotoksina. U nekim primerima izvođenja, mikotoksini su aflatoksini, zearalenon, trihoteceni, fumonizini, ohratoksini ili njihove kombinacije. U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak dalje daje ugradnju dodatnog sredstva u materijal koji sadrži inkorporisan ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom, pri čemu je sredstvo izabrano od esteraze, epoksidaze, soja kvasca i/ili bakterije.

[0013] Predmetni opis daje postupak za proizvodnju količine komercijalnih razmera ekstrakta ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom koji sadrži: (a) obezbeđivanje: (i) kvaščeve starter kulture i (ii) medijuma za kulturu ćelija kvasca, pri čemu medijum kulture ćelije kvasca sadrži potrebne hranljive sastojke za rast kvasca i glinu; (b) uvođenje kvaščeve starter kulture u medijum za kulturu ćelija kvasca; (c) inkubaciju kvasca u fermentoru industrijskih razmera pod uslovima podešenim da omoguće rast kvasca, pri čemu kvasac ugrađuje glinu u ćelijski zid kvasca u toku rasta; (d) dodavanje sredstva protiv penušanja u fermentor; (e) liziranje ćelijskih zidova kvasca isprepletanih glinom; i (f) odvajanje ćelijskih zidova kvasca isprepletanih glinom od drugih komponenti kvasca. U nekim primerima izvođenja, kvasac je izabran odSaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Torulasporaili njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, glina je mineralna glina ili sintetička glina koja pripada silikatnoj grupi. U nekim primerima izvođenja, glina je zeolit, bentonit, aluminosilikat, montmorilonit, smektit, kaolinit, organska glina ili njihova smeša. U nekim primerima izvođenja, glina je aluminosilikatna glina. U nekim primerima izvođenja, količina gline u medijumu ćelijske kulture je od 0.125% do 4.0%. U nekim primerima izvođenja, količina gline u medijumu ćelijske kulture je od 0.5% do 2.0%. U nekim primerima izvođenja, količina gline u medijumu ćelijske kulture je od 0. 125% do 4.0%. U nekim primerima izvođenja, količina gline u medijumu ćelijske kulture je od 0.5% do 2.0%. U nekim primerima izvođenja, fermentor industrijskih razmera je između jedne hiljade i pet miliona litara. U nekim primerima izvođenja, sredstvo protiv penušanja je dodato da bi se ublažili efekti gline na proces inkubacije. U nekim primerima izvođenja, sredstvo protiv penušanja je nesilikonsko molekularno sredstvo protiv penušanja, sredstvo protiv penušanja na bazi ulja, sredstvo protiv penušanja u prahu, sredstvo protiv penušanja na bazi vode, sredstvo protiv penušanja na bazi silikona, sredstvo protiv penušanja na bazi polietilen glikola, sredstvo protiv penušanja na bazi polipropilen glikola ili alkil poliakrilati. U nekim primerima izvođenja, sredstvo protiv penušanja je nesilikonsko molekularno sredstvo protiv penušanja. U nekim primerima izvođenja, liziranje sadrži tretman staklenim kuglicama, kuglicama i/ili enzimski tretman.

OPISCRTEŽA

[0014] Slika 1 prikazuje A) prikaz ćelije kvasca sa glinom isprepletanom u ćelijski zid kvasca, i B) komparativni opis (a) ćelijskog zida kvasca ćelije kvasca kultivisane u odsustvu gline i (b) ćelijskog zida kvasca ćelije kvasca gajene/kultivisane u prisustvu gline. Slika 2 prikazuje skenirajuću elektronsku mikrografiju (A) gline bentonita (Fluka); (B) ćelija kvasca kultivisanih u odsustvu gline i detaljan prikaz glukanskog dela ćelijskog zida kvasca; (Cl) ćelije kvasca kultivisane u prisustvu 2% bentonit gline sa detaljima formiranja konglomerata od nekoliko ćelija kvasca uhvaćenih u lamelarnu strukturu bentonita; (C2) ćelije kvasca kultivisane u prisustvu 2% bentonit gline sa detaljima uključenja gline direktno u strukturu ćelijskog zida kvasca. Slika 3 daje karakteristike ekstrakata ćelijskog zida kvasca pripremljene upotrebom staklenih kuglica i šejkera sa mini-kuglicama iz ćelija kvasca kultivisanih u odsustvu gline (samo ćelijski zid kvasca "YCW"), ćelija kvasca kultivisanih u prisustvu 0.5% gline (YCW +5%), ćelija kvasca kultivisanih u prisustvu 1% gline (YCW+1.0%) i ćelija kvasca kultivisanih u prisustvu 2.0%) gline. Pored toga, procenti adsorpcije mikotoksina zearalanona za svaki od uzoraka. Slika 4 daje karakteristike ekstrakata ćelijskog zida kvasca pripremljenih upotrebom proteaze koja vrši isecanje iz ćelija kvasca kultivisanih u odsustvu gline (samo YCW), ćelija kvasca kultivisanih u prisustvu 1% gline (YCW+1.0%) i ćelija kvasca kultivisanih u prisustvu 2.0% gline.

Slika 5 prikazuje anatomiju ćelije kvasca.

Slika 6 prikazuje kompoziciju dve serije ĆZKIG proizvedene u polu-industrijskim razmerama.

Slika 7 prikazuje rezultate efikasnosti izolacije dobijene sa ćelijskim zidom kvasca u polu-industrijskim razmerama, sa i bez smektitne gline i koji su ili nisu ekstrahovani enzimskom hidrolizom. Nivoi uključenosti proizvoda vezivanja za AFB1 i ZEA bili su respektivno od 0.1 i 0.4% u reakcionom medijumu koji je održavan na konstantnoj pH od 4.0. Analiza je izvedena pod orbitalnim mešanjem u toku 90 min na 37°C i količina vezanog toksina je procenjivana upotrebom HPLC opremljene fluorescentnim detektorom.

Slika 8 prikazuje rezultate efikasnosti vezivanja dobijenih sa proizvodnjom zida ćelije kvasca sa smektitnom glinom i koja je ekstrahovana enzimskom hidrolizom. Nivoi uključenosti proizvoda vezivanja za AFB1 i ZEA bili su respektivno od 0.1 i 0.4% u reakcionom medijumu koji je održavan na konstantnoj pH od 4.0. Analiza je izvedena pod orbitalnim mešanjem u toku 90 min na 37°C i količina vezanog toksina je procenjivana upotrebom HPLC opremljene sa fluorescentnim deketorom.

Slika 9 prikazuje rezultate adsorpcije dobijene sa različitim ćelijskim zidom kvasca koji dolazi iz tri soja gajena sa ili bez gline MBB02 i koji je ili nije ekstrahovan enzimskom hidrolizom. Nivo uključenosti proizvoda vezivanja za AFB1 i ZEA bio je respektivno od 0.1 i 0.4% u reakcionom medijumu koji je održavan na konstantnoj pH od 4.0. Analiza je izvedena pod orbitalnim mešanjem u toku 90 min na 37°C i količina vezanog toksina je procenjivana upotrebom HPLC opremljene fluorescentnim detektorom.

DEFINICIJE

[0015]Kao što je ovde korišćen, termin "kvasac" i "ćelije kvasca" označava eukariotske mikroorganizme klasifikovane u carstvo gljiva, koji imaju ćelijski zid, ćelijsku membranu i intracelularne komponente. Kvasci ne formiraju specifično taksonomsko ili filogenetsko grupisanje. Trenutno je poznato oko 1,500 vrsta; procenjeno je da je samo 1% svih vrsta kvasca opisano. Termin" kvasac"se često uzima kao sinonim zaS. cerevisiae,ali je filogenetska raznovrsnost kvasaca prikazana njihovom zamenom u oba razdela Ascomvcota i Basidiomvcota. Kvasci koji se razmnožavaju pupljenjem ("pravi kvasci") su klasifikovani u red Saccharomvcetales. Većina vrsta kvasca se razmnožavaju aseksualno pupljenjem, iako se neki razmnožavaju binarnom fisijom. Kvasci su jednoćelijski, iako neke vrste postaju višećelijske preko formiranja niza spojenih ćelija koje pupe koje su poznate kaopseudohife, ili lažne hife.Veličina kvasca može veoma da varira u zavisnosti od vrste, tipično 3-4 um u prečniku, iako neki kvasci mogu da dostignu preko 40 um.

[0016]Kao što je ovde korišćen, termin "ćelijski zid kvasca" takođe označen kao "YCW" označava ćelijski zid organizma kvasca koji okružuje plazmatičnu membranu i intracelularne komponente kvasca. Ćelijski zid kvasca obuhvata i spoljašnji sloj (uglavnom manan) i unutrašnji sloj (uglavnom glukan i hitin) ćelijskog zida kvasca. Funkcija ćelijskog zida je obezbeđivanje strukture i zaštita unutrašnjosti kvasca (njegovog centra metaboličke aktivnosti). Putevi prenosa signala i prepoznavanja su u ćelijskom zidu kvasca. Sastav ćelijskog zida kvasca varira od soja do soja i prema uslovima za rast kvasca.

[0017]Kao što je ovde korišćen, termin "ekstrakt ćelijskog zida kvasca" označava ćelijski zid kvasca koji je prekinut ili "liziran" (npr., u toku stadijuma prekida i liziranja) i odvojen od rastvorljivih intracelularnih komponenti ćelije kvasca.

[0018]Termin "izolovan" kada se koristi u vezi sa ćelijskim zidom kvasca, kao u "izolovani ćelijski zid kvasca" ili "izolovani ćelijski zid kvasca sa integrisanom glinom" ili "izolovani ćelijski zid kvasca koji sadrži promenjenu glukammanan strukturu" označava ćelijski zid kvasca ili njegovu komponentu koja je identifikovana i odvojena od najmanje jedne komponente sa kojom je obično povezana u svom prirodnom izvoru. Na taj način, izolovan ćelijski zid kvasca je takav prisutan u obliku ili postavci da se razlikuje od onoga koji se nalazi u prirodi (npr., koji je odvojen od intracelularnih komponenti kvasca). Nasuprot tome, neizolovani ćelijski zid kvasca je ćelijski zid kvasca ili njegova komponenta nađeni u stanju u kome postoje u prirodi. U nekim primerima izvođenja, izolovani ćelijski zid kvasca je korišćen za opisivanje ekstrakta ćelijskog zida kvasca.

[0019]Kao što je ovde korišćen, termin "prečišćen" ili "prečistiti" označava uklanjanje komponenti iz uzorka. Na primer, ćelijski zidovi kvasca ili ekstrakti ćelijskog zida kvasca su prečišćeni uklanjanjem komponenti ćelijskog zida ne-kvasca (npr., plazmatične membrane i/ili intracelularnih komponenti kvasca); oni su takođe prečišćeni uklanjanjem kontaminanata ili drugih sredstava koja nisu ćelijski zid kvasca. Uklanjanje komponenti ćelijskog zida koji nije od kvasca i/ili kontaminanata ćelijskog zida koji nije od kvasca rezultira u povećanju procenta ćelijskog zida kvasca ili njegovih komponenti u uzorku. U drugom primeru, ćelijski zidovi kvasca koji sadrže glinu integrisanu/isprepletanu u ćelijski zid kvasca su prečišćeni uklanjanjem komponenti ćelijskog zida koji nije od kvasca (npr., plazmatične membrane i/ili intracelularnih komponenti kvasca), čime je procenat ćelijskog zida kvasca koji sadrži glinu integrisanu/isprepletanu u ćelijski zid povećan u uzorku.

[0020]Kao što je ovde korišćen, termin "koncentrovan ekstrakt ćelijskog zida kvasca" označava ekstrakt ćelijskog zida kvasca koji je koncentrovan preko jedne ili više procedura (npr., sušenjem (npr., u toku stadijuma sušenja i koncentrovanja)). U sledećem primeru, koncentrovani ekstrakt ćelijskog zida kvasca je preparat ćelijskog zida kvasca ili ekstrakt ćelijskog zida kvasca koji je prečišćen uklanjanjem komponenti ćelijskog zida koji nije od kvasca.

[0021]Kao što su ovde korišćeni, termini "modifikovani kvasac" i "promenjeni kvasac" označavaju kvasac kultivisan na način koji menja sastav, strukturu i/ili funkciju kvasca (npr., koji menja sastav, strukturu i/ili funkciju ćelijskog zida kvasca (npr., ćelijski zid kvasca koji sadrži promenjeni odnos glukana:manana i/ili glinu integrisanu/isprepletanu u ćelijski zid kvasca koji funkcioniše različito od ćelijskog zida kvasca bez promenjenog odnosa glukana:manana i/ili ćelijski zid kvasca u koji nije integrisana/isprepletana glina).

[0022]Kao što je ovde korišćen, termin "modifikovani ćelijski zid kvasca" označava ćelijski zid kvasca modifikovanog ili promenjenog kvasca.

[0023]Kao što je ovde korišćen, termin "ekstrakt modifikovanog ćelijskog zida kvasca" označava ekstrakt ćelijskog zida kvasca modifikovanog ili promenjenog kvasca.

[0024]Kao što je ovde korišćen, termin "koncentrovan ekstrakt modifikovanog ćelijskog zida kvasca" kao što je ovde korišćen označava koncentrovani ekstrakt ćelijskog zida kvasca poreklom od modifikovanog ili promenjenog kvasca, na primer, u SAD pat. br. 6,045,834.

[0025]Kao što su ovde korišćeni, termini "kvasac isprepletan glinom," "kvasac sa integrisanom glinom," označava kvasac gajen ili kultivisan u prisustvu gline koji ima integrisanu ili isprepletanu glinu u ćelijski zid kvasca. Kvasac sa isprepletanom glinom je specifičan tip modifikovanog kvasca.

[0026]Kao što je ovde korišćen, termin "isprepletana" kao u "ekstraktu ćelijskog zida kvasca isprepletan glinom", označava integrisanje gline u ćelijski zid kvasca. Iako mehanizam nije neophodan za izvođenje pronalaska i pronalazak nije ograničen na bilo koji određeni mehanizam delovanja, u nekim primerima izvođenja, isprepletanje gline u ćelijski zid kvasca se javlja u toku rasta kvasca (npr., posle njegovog bespolnog ciklusa razmnožavanja (pupljenje) (npr., kako ćerka ćelija raste i formira svoju mrežu ćelijskog zida kvasca, glina se integriše u ćeliju kvasca)). U jednom primeru, produženje lanaca glukana i/ili hitina obezbeđuje mesto (mesta) integrisanja uključena u integrisanje gline u toku pupljenja, što ima za rezultat da ćerka ćelija sadrži glinu integrisanu u svom ćelijskom zidu. U sledećem primeru, makromolekulska struktura gline hvata ćelije kvasca u svoju lamelarnu mrežu, pri čemu ćelija kvasca nastavlja preko pupljenja, da dalje integriše glinu u ćelijski zid kvasca. Integrisana/isprepletana glina ćelijskog zida kvasca ostaje integrisana/isprepletana u ćelijskom zidu kvasca posle ekstrakcije ćelijskog zida.

[0027]Kao što su ovde korišćeni, termini "ćelijski zid kvasca isprepletan glinom," i "ćelijski zid kvasca sa integrisanom glinom" označava ćelijski zid kvasca gajenog ili kultivisanog u prisustvu gline koji ima inkorporisanu ili isprepletanu glinu u ćelijski zid kvasca. [00281 Kao što su ovde korišćeni, termini "ekstrakt ćelijskog zida kvasca sa isprepletanom glinom," "ekstrakt ćelijskog zida kvasca sa integrisanom glinom," označavaju ekstrakt ćelijskog zida kvasca (npr., gde je kvasac od koga je pripremljen ekstrakt ćelijskog zida gajen ili kultivisan u prisustvu gline) koji ima inkorporisanu ili isprepletanu glinu u ćelijskom zidu kvasca.

[0029] Kao što su ovde korišćeni, termini "koncentrovani ekstrakt isprepletanog ćelijskog zida kvasca" i "koncentrovani ekstrakt integrisanog ćelijskog zida kvasca" označavaju koncentrovani ekstrakt ćelijskog zida kvasca gajenog ili kultivisanog u prisustvu gline koji ima inkorporisanu ili isprepletanu glinu u ćelijski zid kvasca.

[0030] Kao što je ovde korišćen, termin "in vivo" označava studije i/ili eksperimente izvedene unutar živog organizma, koji se javlja unutar biološkog organizma.

[0031] Kao što je ovde korišćen, termin "in vitro" označava veštačku sredinu izvan živog organizma i na biološke procese ili reakcije koji bi se normalno javili unutar organizma, ali su napravljeni da se jave u veštačkoj sredini. In vitro sredina može da sadrži, test epruvete i ćelijsku kulturu.

[0032] Kao što je ovde korišćen, termin "tečna hromatografija visokog učinka" i termin "HPLC" označavaju oblik tečne hromatografije za odvajanje jedinjenja. Jedinjenja su rastvorena u rastvoru. Jedinjenja su odvojena injektiranjem čepa smeše uzorka na kolonu. HPLC instrumenti sadrže rezervoar pokretne faze, pumpu, injektor, kolonu za odvajanje i detektor. Prisustvo analita u efluentu kolone je beleženo kvantitativnom detekcijom promene u refraktivnom indeksu, apsorpciji UV-VIS na postavljenoj talasnoj dužini, fluorescenciji posle ekscitacije sa pogodnom talasnom dužinom ili elektrohemijskog odgovora.

[0033] Kao što je ovde korišćen, termin "skenirajuća elektronska mikroskopija" i termin "SEM" označavaju tip elektronskog mikroskopa koji slika površinu uzorka njenim skeniranjem sa snopom elektrona visoke energije u rasterskom obrascu skeniranja. Elektroni interaguju sa atomima koji grade signale koje proizvodi uzorak koji sadrže informaciju o topografiji površine uzorka, sastavu i drugim osobinama kao što je električna provodljivost.

[0034] Kao što je ovde korišćen, termin "sredstvo za fiksaciju" označava hemikaliju koja je sposobna da fiksira jednu supstancu za drugu u cilju da je "fiksira", stabilizuje ili na drugi način konzerviše supstancu u njenom trenutnom obliku da bi se sprečila razgradnja ili druga promena supstance. Cesto, sredstva za fiksaciju su korišćena u skenirajućoj elektronskoj mikroskopiji (SEM) da bi se pripremio uzorak. Primarno sredstvo za fiksaciju: kao što su ovde korišćeni, termini "primarno sredstvo za fiksaciju" označava prvo sredstvo za fiksaciju korišćeno da "fiksira" supstancu. Sekundarno sredstvo za fiksaciju: kao što su ovde korišćeni, termini "sekundarno sredstvo za fiksaciju" označava drugo sredstvo za fiksaciju korišćeno da "fiksira" supstancu. Tercijarno sredstvo za fiksaciju: kao što je ovde korišćen, termin "tercijarno sredstvo za fiksaciju" označava treće sredstvo za fiksaciju korišćeno za "fiksiranje" supstance. [0035J Kao što je ovde korišćen, termin "analit" označava atom, molekul, grupu atoma i/ili molekula, supstancu ili hemijski sastavni deo. Analit, sam po sebi ne može biti meren, već pre, aspekti ili osobine (fizičke, hemijske, biološke) analita mogu biti određeni upotrebom analitičkog postupka, kao što je HPLC. Na primer, nije moguće meriti "stolicu" (komponentu analita) samu po sebi, već, moguće je meriti visinu, širinu, itd. stolice. Slično, nije moguće meriti mikotoksin, već je moguće meriti fluorescenciju mikotoksina koja je povezana sa njegovom koncentracijom.

[0036] Kao što je ovde korišćen, termin "signal" je korišćen generalno u vezi sa bilo kojim detektabilnim procesom koji ukazuje na to da se reakcija javila (na primer, vezivanje antitela za antigen). Signali mogu biti procenjeni kvalitativno kao i kvantitativno. Primeri tipova "signala" obuhvataju, radioaktivne signale, fluorimetrijske signale ili kolorimetrijske signale proizvoda/reagensa.

[0037] Kao što je ovde korišćen, termin "biodostupnost" označava frakciju molekula ili komponente koja je dostupna organizmu ili koja dolazi do sistemske cirkulacije. Kada se molekul ili komponenta primenjuje intravenski, njegova/njena biodostupnost je 100%. Međutim, kada se molekul ili komponenta primenjuje preko drugih puteva (kao što je oralno), njegova/njena biodostupnost se smanjuje (kao posledica nepotpune apsorpcije i metabolizma prvog prolaza).

[0038] Kao što je ovde korišćen, termin "apsorbuje" označava proces pomoću koga materijal "prima" ili "usisava" drugu supstancu. Na primer, "apsorpcija" može da označava postupak apsorpcije ili asimilacije supstanci u ćelije ili kroz tkiva i organe preko difuzije ili osmoze (npr. apsorpcija hranljivih sastojaka od strane digestivnog sistema ili apsorpcija lekova u krvotok).

[0039] Kao što je ovde korišćen, termin "adsorpcija" označava proces koji se javlja kada je materijal vezan sa, i/ili se akumulira na površini, čvrste supstance ili tečnosti (sekvestrant i/ili adosrbent) (npr. na taj način formirajući film od molekula ili atoma (adsorbat)).

[0040]Kao što je ovde korišćen, termin "vezati" i/ili termin "vezivanje" označava fizičku vezu (npr., preko spajanja ili oblaganja) dva ili više entiteta koji dolaze u međusobni kontakt (npr., na taj način formirajući stabilan kompleks). Primeri oblika vezivanja obuhvataju, vodoničnu vezu, koordinacionu vezu i formiranje jonskog para. Interakcije vezivanja mogu da uključuju različit broj hemijskih interakcija (npr., hemijske veze) u zavisnosti od stereohemije i geometrije svakog entiteta (npr., dalje definišući specifičnost vezivanja). Kada su dva ili više entiteta vezani oni mogu biti vezani pomoću hemijskih veza, ali takođe mogu biti vezani preko naelektrisanja ili drugog tipa interakcija.

[0041] Kao što je ovde korišćen, termin "sredstvo za vezivanje" i/ili "sredstvo za sekvestraciju", označava entitet koji je sposoban da indukuje ili na drugi način je uključen u vezivanje i/ili formiranje kompleksa sa drugim entitetom.

[0042] Kao što je ovde korišćen, termin "sorpcija" označava i adsorpciju i apsorpciju.

[0043] Kao što je ovde korišćen, termin "efikasna količina" označava količinu kompozicije (npr., koja sadrži ćeliju kvasca, ćelijski zid kvasca ili modifikovanu komponentu ćelijskog zida kvasca prema pronalasku) koja je dovoljna da se postignu korisni ili željeni rezultati. Efikasna količina može biti primenjivana i/ili kombinovana sa drugim materijalom u jednoj ili više primena, aplikacija ili doza i nije bila namera da bude ograničena na određenu formulaciju ili put primene.

[0044] Kao što je ovde korišćen, termin "varenje" označava prevođenje hrane, hrane za životinje ili drugih organskih jedinjenja u apsorbujući oblik; smekšavanje, razlaganje ili razbijanje toplotom i vlagom ili hemijskim delovanjem.

[0045] Kao što je ovde korišćen, "digestivni sistem" označava sistem (uključujući gastrointestinalni sistem) u kome se varenje javlja ili može da se javi.

[0046] Kao što je ovde korišćen, termin "hrana za životinje" označava materijal(e) koje unose životinje i doprinose energiji i/ili hranljivim sastojcima životinjskoj ishrani. Primeri hrane za životinje obuhvataju, totalni mešani racion (TMR), krmu(e), pelet(e), koncentrat(e), premiks(e), koproizvod(e), zrno(a), džibru(e), melasu(e), vlakno(a), krmno bilje, travu(e), seno(a), jezgro(a), listove, brašno, rastvorljivu materiju(e) i suplement(e).

[0047] Kao što je ovde korišćen, termin "životinja" označava one iz carstva Animalia. Ovo obuhvata, ali bez ograničenja na stoku, životinje na farmama, domaće životinje, životinje kućne ljubimce, morske i slatkovodne životinje, i divlje životinje.

[0048] Kao što su ovde korišćeni, termini "primena" i termin "primenjivati" označavaju akt davanja supstance, uključujući lek, prolek ili drugo sredstvo, ili terapeutskog tretmana subjektu (npr., subjektu ili in vivo, in vitro ili ex vivo ćelijama, tkivima i organima). Primeri puteva primene mogu biti kroz oči (oftalmički), usta (oralno), kožu (topikalno ili transdermalno), nos (nazalno), pluća (inhalant), oralne mukoze (bukalno), uha, rektalno, vaginalno, preko injekcije (npr., intravenski, subkutano, intratumorski, intraperitonealno).

[00491 Kao što je ovde korišćen, termin "ko-primena" i termin "ko-primenjivati" označavaju primenu najmanje dva sredstva ili terapije na subjekta i/ili materijal (npr., hranu za životinje). Ko-primena dva ili više sredstava ili terapije može biti istovremena, ili se prvo sredstvo/terapija može primenjivati pre drugog sredstva/terapije.

[0050J Kao što je ovde korišćen, termin "tretman" označava poboljšanje i/ili reverziju simptoma bolesti (npr., mikotoksikoze). Termin "tretman" označava kako terapeutski tretman tako i profilaktičke i preventivne mere. Na primer, subjekti koji mogu da imaju korist od tretmana sa kompozicijama i postupcima prema predmetnom pronalasku obuhvataju one u kojima se bolest i/ili poremećaj sprečava (npr., upotrebom profilaktičkog tretmana prema predmetnom pronalasku).

[0051] Kao što je ovde korišćen, termin "u riziku od bolesti" označava subjekta koji je predisponiran da ima određenu bolest. Ova predispozicija može biti genetička (npr., određena genetička tendencija da ima bolest, kao što su nasledni poremećaji), ili kao posledica drugih faktora (npr., starost, telesna težina, uslovi u životnoj sredini, izlaganje štetnim jedinjenjima prisutnim u životnoj sredini).

[0052] Kao što je ovde korišćen, termin "bolest", termin "infekcija" i termin "patološko stanje ili odgovor" označavaju stanje, znakove i/ili simptome koji su povezani sa pogoršanjem normalnog stanja žive životinje ili bilo kog od njenih organa ili tkiva koji prekidaju ili modifikuju izvođenje normalnih funkcija, i mogu biti odgovor na sredinske faktore (kao što je pothranjenost, industrijske opasnosti i klima, uključujući mikotoksikozu), specifične infektivne agense (kao što su crvi, bakterije ili virusi), do inherentnog defekta organizma (kao što su različite genetičke anomalije), ili kombinacije ovih i drugih faktora.

[0053] Kao što je ovde korišćen, termin "mikotoksikoza" označava stanje u kome mikotoksini prolaze barijere otpornosti ljudskog ili životinjskog tela. Mikotoksini se mogu smatrati bilo infekcijom ili bolešću i mogu imati štetan efekat na one koji su pogođeni.

[0054] Kao što je ovde korišćen, termin "mikotoksin" označava toksično i/ili karcinogeno jedinjenje(a) proizvedena od starne različitih vrsta gljiva.

[0055] Kao što je ovde korišćen, termin "koji pati od bolesti" označava subjekta (npr., životinjskog ili ljudskog subjekta) koji ima određenu bolest i nije ograničen na bilo koje određene znakove ili simptome, ili bolest.

[0056]Kao što je ovde korišćen, termin "toksičan" označava bilo koji štetan ili na drugi način negativan efekat (efekte) na subjektu, ćeliji ili tkivu u poređenju sa istom ćelijom ili tkivom pre kontakta ili primene toksina/toksikanta. [00571 Kao što je ovde korišćen, termin "kiselina" kao što je ovde korišćen označava bilo koje hemijsko jedinjenje koje može da daje proton(e) i/ili uzme elektron(e). Kiseline obuhvataju, hlorovodoničnu, bromovodoničnu, sumpornu, azotnu, perhlornu, fumarnu, maleinsku, fosfornu, glikolnu, mlečnu, salicilnu, ćilibarnu, toluen-p-sulfonsku, tartarnu, sirćetnu, limunsku, metansulfonsku, etansulfonsku, mravlju, benzoevu, malonsku, sulfonsku, naftalen-2-sulfonsku, benzensulfonsku kiselinu. Druge kiseline, kao što je oksalna, koje nisu same po sebi farmaceutski prihvatljive, mogu biti korišćene u pripremi soli korisnih kao intermedijeri u dobijanju jedinjenja prema pronalasku i njihovih farmaceutski prihvatljivih kiselih adicionih soli.

[0058] Kao što je ovde korišćen, termin "baza" označava bilo koje hemijsko jedinjenje koje može da primi proton(e) i/ili da daje elektron(e) ili jone hidroksida. Baze obuhvataju, hidrokside alkalnih metala (npr., natrijuma), hidrokside zemnoalkalnih metala (npr., magnezijuma), amonijak i jedinjenja formule NW/, gde W je Cm alkil.

[0059] Kao što je ovde korišćen, termin "so" označava jedinjenja koja mogu biti poreklom od neorganskih ili organskih kiselina i baza. Primeri soli obuhvataju, acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butirat, citrat, kamforat, kamforsulfonat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecilsulfat, etansulfonat, fumarat, flukoheptanoat, glicerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hlorid, bromid, jodid, 2-hidroksietansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat, palmoat, pektinat, persulfat, fenilpropionat, pikrat, pivalat, propionat, sukcinat, tartrat, tiocijanat, tozilat, undekanoat. Drugi primeri soli obuhvataju anjone jedinjenja prema predmetnom pronalasku sa pogodnim katjonom kao što je Na<+>, NH4+ i NW4+ (gde W je Cm alkil grupa).

[0060] Kao što je ovde korišćen, termin "farmaceutska kompozicija" označava kombinaciju aktivnog sredstva (npr., kombinaciju koja sadrži vijabilnu ćeliju kvasca, ćelijski zid kvasca ili modifikovanu komponentu ćelijskog zida kvasca prema pronalasku) sa nosačem, inertnim ili aktivnim, čineći kompoziciju naročito pogodnom za dijagnostički ili terapeutsku upotrebu in vitro, in vivo ili ex vivo.

[0061] Kao što je ovde korišćen, termin "farmaceutski prihvatljiv" i termin "farmakološki prihvatljiv" označava kompoziciju koja značajno ne proizvodi više poznatih štetnih reakcija od poznatih korisnih reakcija.

[0062]Kao što je ovde korišćen, termin "sredstvo protiv penušanja" označava aditiv korišćen za sprečavanje formiranja pene ili se dodaje za razlaganje pene koja je već formirana. "Sredstvo protiv penušanja" označava aditiv koji smanjuje površinski napon rastvora ili medijuma ili emulzije ili buljona fermentora zbog aeracije ili mešanja, na taj način inhibirajući ili modifikujući formiranje pene. Uobičajeno korišćena sredstva su nerastvorljiva ulja, dimetil polisiloksani i drugi silikoni, određeni alkoholi kao što je stearildekanol, oktal dekanol, sulfonati, stearati i glikoli.

[0063]Kao što je ovde korišćen, termin "ćelija" označava autonomnu samo-replicirajuću jedinicu koja može da postoji kao funkcionalno nezavisna jedinica života (kao u slučaju jednoćelijskog organizma, npr. kvasca), ili kao podjedinica u višećelijskom organizmu (kao što u biljkama i životinjama) koja je specijalizovana u izvođenju određenih funkcija prema organizmu kao celini. Postoje dva posebna tipa ćelija: prokariotske ćelije i eukariotske ćelije.

[0064]Kao što je ovde korišćen, termin "aukariota" označava organizme čije ćelije su organizovane u složene strukture zatvorene unutar membrana. "Eukarioti" se mogu razlikovati od "prokariota." Termin "prokariota" označava organizme kojima nedostaje ćelijsko jedro ili druge organele okružene membranom. Termin "eukariota" označava sve organizme sa ćelijama koje ispoljavaju tipične karakteristike eukariota, kao što je prisustvo pravog jedra okruženog jedarnom membranom, unutar koje leže hromozomi, prisustvo organela okruženih membranom i drugih karakteristika se često beleže u eukariotskim organizmima. Na taj način, termin obuhvata, takve organizme kao što su gljive, protozoe i životinje.

[0065]Kao što je ovde korišćen, termin "ćelijska kultura" označava bilo koju in vitro kulturu ćelija. Unutar ovog termina su uključene kontinuirane ćelijske linije (npr., sa besmrtnim fenotipom), primarne ćelijske kulture, transformisane ćelijske linije, ograničene ćelijske linije (npr., netransformisane ćelije), i bilo koja druga ćelijska populacija održavana in vitro.

[0066]Kao što je ovde korišćen, termin "ćelijska reprodukcija" označava proces ćelijskog razmnožavanja koji ima tri primarna stadijuma. Prvi stadijum ćelijske reprodukcije obuhvata replikaciju "DNK ćelije roditelja. Drugi stadijum je odvajanje duplicirane DNK u dve grupe hromozoma iste veličine. Treći stadijum je fizička deoba celih ćelija, obično označena kao citokineza. Ćelijska reprodukcija je složenija od eukariota nego kod drugih organizama. Ne-eukariotske ćelije kao što su bakterijske ćelije se razmnožavaju binarnom fisijom, procesom koji obuhvata replikaciju DNK, segregaciju hromozoma i citokinezu. Razmnožavanje eukariotske ćelije obuhvata mitozu ili složeniji proces pod nazivom mejoza. Mitoza i mejoza se nekada označavaju kao dva procesa "jedarne deobe". Binarna fisija je slična razmnožavanju eukariotskih ćelija koja obuhvata mitozu. Oba dovode do proizvodnje dve ćerke ćelije sa istim brojem hromozoma kao roditeljska ćelija. Mejoza je korišćena za specijalan proces razmnožavanja ćelija diploidnih organizama. Ona proizvodi četiri specijalne "ćerke ćelije" (gamete) koji imaju polovinu normalne ćelijske količine DNK. Muški i ženski gamet mogu zatim da se kombinuju da proizvedu zigot, ćeliju koja ponovo ima normalnu količinu hromozoma.

[0067] Kao što je ovde korišćen, termin "razmnožavanje kvasca" označava ciklus razmnožavanja kvasca, koji ima bespolni i polni ciklus razmnožavanja, međutim najčešći način vegetativnog rasta kod kvasca je bespolno razmnožavanje putem "pupljenja" ili "fisije" sa "ćerkom ćelijom" koja je formirana na "roditeljskoj ćeliji". Jedro roditeljske ćelije se deli u ćerkino jedro i migrira u ćerku ćeliju. Pupoljak nastavlja da raste sve dok se ne odvoji od "roditeljske ćelije", formirajući novu ćeliju. Pod uslovima visokog stresa haploidne ćelije će generalno umreti, međutim pod istim uslovima diploidne ćelije mogu da prođu kroz sporulaciju, da uđu u polno razmnožavanje (mejozu) i proizvedu različte haploidne spore, koje mogu da nastave da se sparuju (konjuguju), ponovo formirajući diploidnu.

[0068] Kao što je ovde korišćen, termin "pupljenje" označava tip ćelijske deobe kod gljiva (npr. kvasca) i kod protozoa u kojima jedna od "ćerki ćelija" razvija manje ispupčenje iz druge. Obično položaj ćelije koja pupi je definisan polaritetom u "roditeljskoj ćeliji". Kod nekih protozoa napupela ćerka može da leži unutar citoplazme druge ćerke.

[0069] Kao što je ovde korišćen, termin "ćerka ćelija" označava jednu od dve ili više ćelija formiranih u deobi roditeljske ćelije.

[0070] Kao što je ovde korišćen, termin "roditeljska ćelija" i termin "majka ćelija" označavaju ćeliju koja daje ćerke ćelije putem ćelijske deobe.

[0071] Kao što je ovde korišćen, termin "inokulacija" označava akt uvođenja mikroorganizma ili suspenzije mikroorganizama (npr. kvasca, gljiva, bakterija) u medijum kulture. Inokulacija je akt ili proces uvođenja nečega tamo gde će ono rasti ili se razmnožavati.

[0072] Kao što je ovde korišćen, termin "inokulum" i termin "pre-inokulum" označavaju ćelije korišćene u inokulaciji, kao što su ćelije koje se dodaju da bi se započela kultura.

[0073] Kao što je ovde korišćen, termin "procedura rasta" označava razmnožavanje živih ćelija primenjen na ćelije kvasca gde je izraz "ćelijski rast" skraćenica za ideju "rasta u ćelijskim brojevima pomoću ćelijskog razmnožavanja." U toku ćelijskog razmnožavanja jedna ćelija ("roditeljska ćelija" ili "majka ćelija") se deli tako da proizvodi "ćerke ćelije".

[0074] Kao što je ovde korišćen, termin "kultivacija kvasca" i termin "gajenje kvasca" označavaju akt naseljavanja i/ili propagacije kvasca.

[0075]Kao što je ovde korišćen, termin "centrifugiranje" označava odvajanje molekula prema veličini ili gustini upotrebom centrifugalnih sila generisanih od strane rotirajućeg rotora koji postavlja objekat u rotaciju oko fiksirane ose, primenjujući silu vertikalno na osu. Centrifuga radi upotrebom sedimentacionog principa, gde je centripetalno ubrzanje korišćeno za jednaku raspodelu supstanci veće i manje gustine u slojeve različite gustine.

[0076] Kao što je ovde korišćen, termin "koncentracija" označava količinu supstance po definisanom prostoru. Koncentracija je obično izražena prema masi po jedinici zapremine. Da bi se rastvor razblažio, mora se dodati još rastvarača, ili smanjiti količina supstance koja se rastvara (npr., selektivnim isparavanjem, sušenjem raspršivanjem, sušenjem zamrzavanjem, npr., koncentrovani ekstrakt ćelijskog zida kvasca ili koncentrovani ekstrakt modifikovanog ćelijskog zida kvasca). Nasuprot tome, da bi se rastvor koncentrovao, mora se dodati još supstance koja se rastvara ili smanjiti količina rastvarača.

[0077] Kao što je ovde korišćen, termin "sloj" označava obično horizontalne naslage organizovane u sloju materijala koji formira prekrivajući deo ili segment dobijen posle odvajanja putem centrifugiranja u vezi sa osobinama gustine materijala.

[0078] Kao što je ovde korišćen, termin "sakupljanje" označava akt sakupljanja ili spajanja materijala koji su proizvedeni (npr. spajanje materijala proizvedenih u toku proizvodnje kvasca).

[0079] Kao što je ovde korišćen, termin "glina" označava mineralne gline, sintetičke, organske gline i bilo koju njihovu smešu(e).

[0080] Kao što je ovde korišćen, termin "mineralna glina" označava prirodni ili sintetički materijal sastavljen primarno od fino mlevenih minerala (silikata) koji pokazuju splastičnost preko promenljivog opsega sadržaja vode (koji može biti rezultat vode uhvaćene u strukturu putem polarnog privlačenja) i može biti stvrdnut kada se osuši i/ili upali. Primeri silikata obuhvataju filosilikat, bentonit, zeolit, aluminosilikat, montmorilonit, smektit, kaolinit.

[0081] Kao što je ovde korišćen, termin "organska glina" i termin "modifikovana glina" označavaju organsko modifikovani filosilikat, poreklom od prirodne mineralne gline. Izmenom originalnih katjona između slojeva za organske katjone (tipično kvaternarne alkilamonijum jone) ili polisaharide, generisana je organofilna površina, koja se sastoji od kovalentno vezanih organskih grupa. Lamelama struktura ostaje analogna ishodnom filosilikatu.

[0082] Kao što je ovde korišćen, termin "sušenje" označava sušenje raspršivanjem, sušenje zamrzavanjem, sušenje na vazduhu, vakuumsko sušenje ili bilo koju drugu vrstu procesa koji smanjuje ili eliminiše tečnost u supstanci.

[0083]Kao što je ovde korišćen, termin "sušenje raspršivanjem" označava uobičajeno korišćeni postupak sušenja supstance koja sadrži tečnost upotrebom vrelog gasa da bi se isparavala tečnost da bi se smanjila ili eliminisala tečnost u supstanci. Drugim rečima materijal je sušen putem raspršivanja ili atomizacije u struji zagrevanog toplog vazduha.

[0084] Kao što je ovde korišćen, termin "sušenje zamrzavanjem" i termin "liofilizacija" i termin "kriodesikacija" označavaju uklanjanje rastvarača iz materije u zamrznutom stanju putem sublimacije. Ovo je postignuto zamrzavanjem materijala koji se suši ispod njegove eutektičke tačke i zatim obezbeđivanjem latentne toplote sublimacije. Tačna kontrola unosa toplote omogućava sušenje od zamrznutog stanja bez topljenja proizvoda. U praktičnoj primeni, postupak je ubrzan i tačno kontrolisan pod uslovima sniženog pritiska.

[0085] Kao što je ovde korišćen, termin "suvog slobodno protočnog praha" označava slobodno protočni suvi prah.

[0086] Kao što je ovde korišćen, termin "mlevenje" označava smanjenje veličine čestica putem udara, smicanja ili osipanja.

[0087] Kao što je ovde korišćen, termin "ispiranje" označava uklanjanje ili čišćenje (npr., upotrebom bilo kog tipa supstance koja se rastvara (npr. destilovana voda, pufer ili rastvarač) ili smeša) nečistoća ili rastvorljive neželjene komponente preparata (npr., ekstrakt ćelijskog zida kvasca može biti ispran da bi se uklonile komponente ćelijskog zida koji nije od kvasca iz uzorka).

[0088] Kao što je ovde korišćen, termin "enzim" označava protein ili molekul na bazi proteina sa karakterističnom sekvencom aminokiselina koja se savija tako da proizvede specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja daje molekulu jedinstvene osobine i deluje kao katalizator ili hemikalija za specifične hemijske reakcije, prevodeći specifičan set reaktanta (pod nazivom supstrati) u specifične proizvode.

[0089] Kao što je ovde korišćen, termin "peptid," termin "polipeptid" i termin "protein" označavaju primarnu sekvencu aminokiselina koje su spojene kovalentnim "peptidnim vezama." Generalno, peptid se sastoji od nekoliko aminokiselina, tipično od 2-50 aminokiselina, i kraći je od proteina. Termin "polipeptid" obuhvata peptide i proteine. Peptidi, polipeptidi ili proteini mogu biti sintetički, rekombinanti ili prirodni. Sintetički peptid je proizveden pomoću veštačkih sredstava in vitro (npr., nije proizveden in vivo).

[0090] Kao što je ovde korišćen, termin "proteaze" označava bilo koji od različitih enzima, uključujući endopeptidaze i egzopeptidaze koje katalizuju hidrolitičko razlaganje proteina u peptide ili aminokiseline.

[0091]Kao što je ovde korišćen, termin "liza" označava raspadanje ili prekidanje ćelijske membrane kvasca i ćelijskog zida kvasca što rezultira u oslobađanju intracelularnih komponenti. Kao što je ovde korišćena, "liza" se javlja kao rezultat fizičkih/mehaničkih, enzimatskih (uključujući autolizu i hidrolizu) ili osmotske mehanizme (uključujući "alkoholno šokiranje" i hidrolizu).

[0092] Kao što je ovde korišćen, termin "autoliza" označava razlaganje dela ili cele ćelije ili tkiva samo-proizvedenim enzimima.

[0093] Kao što je ovde korišćen, termin "hidroliza", označava proces deljenja jedinjenja u fragmente sa dodavanjem vode (npr., koji je korišćen za razlaganje polimera u prostije jedinice (npr. škroba u glukozu)).

[0094] Kao što je ovde korišćeno, "alkoholno šokiranje" označava osmotski stres generisan dodavanjem alkohola (npr. etanola) u medijum za rast da bi se stvorila razlika između osmotskog pritiska medijuma i osmotskog pritiska unutar ćelija (npr., ćelija kvasca) koje rastu u medijumu. Alkoholno šokiranje može dovesti do lize ćelija (npr., ćelija kvasca) gajednih u medijumu.

[0095] Kao što je ovde korišćen, termin "osmoza" označava difuziju rastvarača (npr., vode) kroz polu-propustljivu membranu, iz rastvora niske koncentracije supstance koja se rastvara (visok vodeni potencijal) u rastvor sa visokom koncentracijom supstance koja se rastvara (nizak vodeni potencijal), uz gradijent koncentracije supstance koja se rastvara. To je fizički proces u kome se rastvarač kreće, bez ulaska energije, kroz polu-propustljivu membranu (propustljiva za rastvarač, ali ne za supstancu koja se rastvara) odvajajući dva rastvora različitih koncentracija. Pomeranje rastvarača je iz manje koncentrovanog (hipotoničnog) u koncentrovani)i (hipertoničan) rastvor, koji teži da smanji razliku u koncentracijama.

[0096] Kao što je ovde korišćen, termin "osmotski stres" i termin "osmotski šok" označavaju iznenadnu promenu u koncentraciji supstance koja se rastvara oko ćelije, uzrokujući brzu promenu u kretanju vode kroz njenu ćelijsku membranu. Pod uslovima visokih koncentracija soli, supstrata ili bilo koje supstance koja se rastvara u supernatantu voda je izvučena iz ćelija preko osmoze. Ovo takođe inhibira transport supstrata i kofaktora u ćeliju na taj način "šokirajući" ćeliju. Alternativno, na niskim koncentracijama supstanci koje se rastvaraju, voda ulazi u ćeliju u velikim količinama, uzrokujući njeno bubrenje i pucanje ili apoptozu.

[0097] Kao što je ovde korišćen, termin "uzorak" je korišćen u širokom smislu uključujući primerak ili kulturu dobij enu iz bilo kog izvora, kao i biološke uzorke i uzorke iz životne sredine. Biološki uzorci mogu biti dobijeni od životinja (uključujući ljude) i obuhvataju tečnosti, čvrste uzorke, tkiva i gasove. Biološki uzorci obuhvataju proizvode krvi, kao što su plazma, serum. Uzorci iz životne sredine obuhvataju materijal iz životne sredine kao što je površinska materija, zemljište, voda, kristali i industrijski uzorci.

[0098] Kao što je ovde korišćen, termin "složen" označava entitet formiran spajanjem dva ili više posebna entiteta (npr., spajanjem dva ili više entiteta gde su entiteti isti ili različiti (npr., iste ili različite hemijske vrste). Veza može biti preko kovalente veze ili nekovalentne veze (npr., preko van der Waals-ovih sila, elektrostatička, interakcija naelektrisanja, hidrofobna interakcija, dipolna interakcija i/ili sile vodonične veze (npr., uretanske veze, amidne veze, estarske veze i njihova kombinacija)).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0099] Predmetni opis daje nove ćelije kvasca koje sadrže strukturu ćelijskog zida koja je modifikovana (npr., glina je isprepletana u ćelijski zid kvasca), postupke za proizvodnju istih, kompozicije koje sadrže i/ili su poreklom od istih i postupke za upotrebu istih (npr., za vezivanje mikotoksina).

[0100] Predmetni opis daje ekstrat ćelijskog zida kvasca (npr., izolovan, prečišćen, modifikovani i/ili koncentrovani ekstrakt ćelijskog zida) koji sadrži glinu isprepletanu u ćelijski zid (npr., kao posledica kultivacije ćelije kvasca u prisustvu gline). U nekim primerima izvođenja, ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom koji sadrži glinu isprepletanu u ćelijski zid kvasca je pomešan ili na drugi način dodat u hranu za životinje, organsku materiju (npr., prostirku za životinje), i/ili vodu na taj način vezujući mikotoksine (npr., dok su u gastrointestinalnom traktu životinje ili u toku filtracije) i poništavanjem ili smanjivanjem negativnih efekata mikotoksina. Na taj način, u nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak daje postupke koji značajno poboljšavaju adsorptivne/vezujuće osobine materijala na bazi ćelijskog zida kvasca prema mikotoksinima (npr., koji značajno adsorbuje i/ili vezuje i/ili ograničava biodostupnost različitih mikotoksina (npr., koji nisu adsorbovani za i/ili nisu vezani upotrebom samo gline, samo ekstrakta ćelijskog zida kvasca, kombinacije ekstrakta ćelijskog zida u koju je kasnije dodata glina na bazi suve mešavine; i/ili hemijskog graftinga polisaharidnih materijala na vrh proizvoda na bazi gline) u digestivnom traktu životinje).

[0101] Predmetni opis daje novu pripremu ćelija kvasca gajenih u prisistvu jedne ili više glina. U nekim primerima izvođenja, isprepletani ćelijski zidovi kvasca su ekstrahovani iz ćelija kvasca isprepletanih glinom gajenih u prisustvu jedne ili više glina. U nekim primerima izvođenja, ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom je prečišćen i/ili koncentrovan. U nekim primerima izvođenja, izvor gline je standardni izvor gline komercijalnih razmera (npr., izabran od ispoljavanja in vitro, in vivo i/ili ex vivo osobina prema mikotoksinima, ili izvor gline izabran zbog toga što on ne ispoljava in vitro, in vivo i/ili ex vivo osobine prema mikotoksinima). Kompozicije i postupci prema predmetnom pronalasku se mogu koristiti za adsorbovanje i/ili vezivanje mikotoksina kod različitih subjekata. Predmetni pronalazak može biti od koristi za sve životinje, međutim, primeri subjekata obuhvataju ljude, ptice, goveda, svinje, konje, ovce, koze, pse, mačke, ribe, kamile, glodare kao i ribe i mekušce. U nekim primerima izvođenja, kada se mešaju sa organskom materijom (npr., uključujući prostirku za životinje, hranu za životinje), i/ili vodu, i/ili kada se subjekat njima direktno hrani, kompozicije prema predmetnom opisu smanjuju apsorpciju ili unos mikotoksina od strane subjekta, na taj način ublažavajući smanjeni učinak, zdravlje i/ili smanjujući pojavu bolesti i patoloških odgovora povezanih sa mikotoksinom kod subjekta.

[0102] Predmetni opis daje postupak za pripremu i/ili generisanje ćelija kvasca koji sadrži glinu isprepletanu u ćelijski zid kvasca. Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetni opis daje ćeliju kvasca generisanu i/ili kultivisanu u prisustvu gline pri čemu ćelijski zid kvasca sadrži odnos glukana:manana koji je veći od (npr., 2.5% veći, 5% veći, 10%> veći, 15%), 20%o veći, 25% veći, 30% veći, 40% veći, 50% veći ili više) odnosa glukana:manana ćelija kvasca generisanih/kultivisanih u odsustvu gline (videti, npr., Primer 2). Predmetni opis daje ekstrakt ćelijskog zida kvasca dobijen od (npr., izolovan, prečišćen i/ili koncentrovan oblik) vijabilne ćelije kvasca generisane i/ili kultivisane u prisustvu gline, pri čemu ćelijski zid kvasca sadrži odnos glukana:manana koji je veći (npr., 2.5% veći, 5% veći, 10% veći, 15%, 20% veći, 25% veći, 30% veći, 40% veći, 50% veći ili više) od odnosa glukana:manana ćelija kvasca generisanih/kultivisanih u odsustvu gline (videti, npr., Primer 2).

[0103] Na taj način, predmetni opis daje novi, ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom iz kvasca kultivisanog u prisustvu gline, i postupke za generisanje istog. U nekim primerima izvođenja, postupak za generisanje ćelija kvasca sadrži kultivaciju ćelija kvasca uključujući vrsteSaccharomyces, Candida, KluyveromycesiTorulasporau prisustvu jedne ili više glina u cilju promene ili na drugi način modifikacije ćelijskog zida kvasca (npr., u cilju povećanja sposobnosti ćelijskog zida kvasca da adsorbuje i/ili vezuje mikotoksine (npr., kao posledica ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom). Predmetni opis daje mešanje jednog ili više materijala na bazi gline uključujući, silikate (npr., grupe tektosilikata (npr., zeolite, kvare, feldspate); filosilikate (npr., kaolinit, haloisit, diktit, nakrit, hizotil, antigorit, lizardit, talk), pirofilite, smektite (npr., montmorilonit, beidelit, nontronit; vermikulite, mikasantigorit, muskovit, ilit, fengit, biotit); sepiolit, paligorskit, atapulgit), i/ili hidratisani aluminijum silikat

(npr., montmorilonite, bentonit)) u medijum ćekijske kulture kvasca (npr., kao što je opisano u Primerima 1, 5 i 6). Vijabilne ćelije kvasca inkorporišu glinu u strukturu ćelijskog zida kvasca (npr., kao što je prikazano na Slikama 1A i 1B i Slici 2). U nekim primerima izvođenja, jedan ili više glina pomešanih u medijum ćelijske kulture kvasca su prisutne u koncentraciji od 0.075%, 0.1%, 0.125%, 0.25%, 0.5%, 1%, 2%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, ili više ukupnog medijuma za rast. U nekim primerima izvođenja, količina jedne ili više gline pomešanih u medijum ćelijske kulture kvasca ne prelazi 2% krajnjeg sadržaja reaktora u kome se ćelije kvasca gaje. U nekim primerima izvođenja, količina gline koja se dodaje u medijum za ćelijsku kulturu kvasca je izabrana tako da ne dovodi do bubrenja medijuma ćelijske kulture kvasca (npr., 2.0% ili manje). U nekim primerima izvođenja, količina gline koja se dodaje medijumu ćelijske kulture kvasca je izabrana tako da proizvodi ekstrakt ćelijskog zida kvasca sakupljen iz kvasca koji sadrži količinu gline koja ima regulatorno odobrenje za upotrebu kao aditiv za stočnu hranu u ne-medicinskoj životinjskoj hrani (npr., ne prelazi 2% u ukupnom odnosu). U nekim primerima izvođenja, sredstvo protiv penušanja za upotrebu u hrani dodaje se u medijum ćelijske kulture (npr., uključujući nesilikonska molekulska sredstva protiv penušanja, sredstva protiv penušanja na bazi ulja (npr., mineralno ulje, biljno ulje, belo ulje ili drugo ulje koje je nerastvorljivo u medijumu koji penuša) ili sredstva protiv penušanja na bazi silikonskog jedinjenja (npr., primenjeno kao emulzija na bazi ulje ili vode)). U nekim primerima izvođenja, voskovi (npr., etilen bis stearamid (EBS), parafinski voskovi, estarski voskovi ili voskovi masnih alkohola) i/ili hidrofobni silicijum dioksid dodaju se da bi se poboljala emulzifikacija i širenje u medijumu koji penuša.

[0104] Eksperimenti izvedeni u toku razvoja primera izvođenja pronalaska identifikovali su određeni broj faktora kao važne za rast ćelija kvasca u prisustvu jedne ili više glina. Na primer, u nekim primerima izvođenja, poželjno je održavati (tež./zapr.) vezu (npr., koja odgovara gramima/kubnim centimetrima (g/cc)) između potpornog materijala od gline i vode na ili ispod 3% (npr., da bi se izbeglo dostizanje čvrstog ili polu-čvrstog stanja (npr., kao posledica apsorpcije vode i retentivnosti materijala od gline)). Na taj način, sorpcija vode hidratisanog aluminijum silikata koji bubri od vode je ograničavajući faktor koji utiče na odnos potpornog materijala od gline prema vodi u formulaciji medijuma za kulturu prema predmetnom pronalasku. U nekim primerima izvođenja, korišćeni medijum kulture i bočice su sterilizovani, i inokulacija sa mikoroorganizmima je postignuta u skladu sa standardnim postupcima. Na primer, u nekim primerima izvođenja, pre-inokulum je pripremljen sa aktivnim suvim kvascem u boci sterilne dejonizovane vode i inkubiran na oko 25-30°C (npr., 28°C) tokom određenog vremenskog perioda (npr., 20 min). U nekim primerima izvođenja, inokulacija pre-inokuluma je izvedena aseptički (npr., na temperaturi od oko 30°C). U nekim primerima izvođenja, pH i nivoi glukoze su praćeni i održavani. U nekim primerima izvođenja, mešanje kulture je povećano postepeno (npr., od 100 do 500 rpm) u toku rasta. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više glina su dodavane aspetički u kulturu u toku rasta (npr., kada je manje od polovine, oko polovine ili više od polovine hranljivih sastojaka kulture potrošeno). [0105JU nekim primerima izvođenja, kako se količina gline izmešane u medijumu ćelijske kulture kvasca povećava (npr., u količini koja zavisi od tipa korišćene gline ili glina) tako osobine bubrenja materijala od gline inhibiraju rast ćelija kvasca.

[0106]U nekim primerima izvođenja, gajenje kvasca u medijumu ćelijske kulture sa pomešanom glinom daje uslove koji predstavljaju stres za gajeni kvasac. Iako razumevanje mehanizma delovanja nije neophodno za izvođenje predmetnog pronalaska, u nekim primerima izvođenja, stres primenjen na kvasac preko medijuma ćelijske kulture pomešanog sa glinom uzrokuje to da kvasac proizvodi više glukana, što rezultira u povećanim odnosima glukana:manana.

[0107]Predmetni opis obezbeđuje da ćelije kvasca kultivisane u prisustvu jedne ili više glina ne samo da isprepleću glinu u ćelijski zid kvasca, već takođe ispoljavaju promenjeni sastav ćelijskog zida (npr., okarakterisan promenjenim odnosima glukana:manana, ukupnim sadržajem proteina i/ili količinama ostatka). Na primer, predmetni opis daje ćelije kvasca koje sadrže odnos glukana:manana koji je veći (npr., 2.5% veći, 5% veći, 10% veći, 15%, 20% veći, 25% veći, 30% veći, 40% veći, 50% veći ili više) od odnosa glukana:manana ćelija kvasca kultivisanih u odsustvu gline (videti, npr., Primer 2). Predmetni opis takođe daje ćelije kvasca i ekstrakte ćelijskog zida kvasca koji sadrže povećani ukupni sadržaj proteina (npr., 100%, 200%, 300%, 400%), 500%> ili više povećan sadržaj proteina) u poređenju sa ukupnim sadržajem proteina ćelija kvasca i/ili ekstrakata ćelijskog zida kvasca generisanog u odsustvu gline (videti, npr., Primer 2).

[0108]U nekim primerima izvođenja, predmetni opis daje ekstrakte ćelijskog zida kvasca koji sadrže glinu isprepletanu u ćelijski zid kvasca i sadrži promenjeni odnos glukana:manana strukture, koja obezbeđuje bolje osobine vezivanja mikotoksina od konvencionalnih kompozicija. Različiti postupci se mogu koristiti za generisanje ekstrakata ćelijskog zida kvasca uključujući upotrebu staklenih kuglica i šejkera sa kuglicama, enzimatski tretman proteazom (npr., proteazom (npr., papainom)), mehaničku lizu, autolizu i hidrolizu, i druge postupke poznate u tehnici (videti, npr., Peppler, H. J. 1979. Production of veasts and yeast products. Page 157 in: Microbial Technologv & Microbial Processes, Vol.l (2d Ed.), Academic Press). Posle lize i ekstrakcije, ćelijski zid kvaca sa isprepletanom/integrisanom glinom je ispran da bi se uklonile intracelularne komponente i da bi se prečistio i koncentrovao ekstrakt. Rezultirajući ekstrakt može biti sušen pomoću bilo kog broja postupaka uobičajnih u tehnici uključujući sušenje zamrzavanjem i/ili sušenje raspršivanjem (npr., da bi se formirao higroskopan prah nerastvorljiv u vodi).

[0109]Prema tome, opis daje, u nekim primerima izvođenja, ekstrakt ćelijskog zida kvasca koji sadrži glinu isprepletanu direktno u ćelijski zid kvasca. U nekim primerima izvođenja, kompozicija koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca prema opisu koja sadrži glinu integrisanu direktno u ćelijski zid kvasca sadrži manje od 0.5% gline, 0.5-1%, 1-2%, 2-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70% ili više gline kao deo ekstrakta ćelijskog zida kvasca (na bazi tež./tež. %). U nekim primerima izvođenja, povećanje količine gline u medijumu kulture povećava količinu sadržaja gline u ekstraktu ćelijskog zida kvasca.

[0110]U nekim primerima izvođenja, glina koja se dodaje medijumu za rast ćelije kvasca koja nije inkorporisana u ćeliju kvasca je sakupljena i korišćena u kasnijem postupku gajenja ćelije kvasca (npr., neinkorporisani materijal od gline je recikliran). Na primer, reciklaža materijala od gline je olakšana sedimentacionim osobinama gline u poređenju sa kvascem. Zaista, eksperimenti izvedeni u toku razvoja primera izvođenja prema pronalasku proizveli su dva nadoknadiva sloja, (i) donji sloj koji sadrži materijal od gline samo (u 99%); i (ii) gornji sloj koji sadrži frakciju gline inkorporisanu u kvasac. Na taj način, iako mehanizam nije neophodan za izvođenje predmetnog pronalaska, u nekim primerima izvođenja, predmetni opis daje direktno uključenje čestica gline u i/ili na ćelijski zid kvasca (npr., koji preživljava postupke pripreme ekstrakta ćelijskog zida kvasca (npr., preko direktnog isprepletanja gline u lance polimera glukana ćelijskog zida kvasca)). U drugim primrima izvođenja, frakcija gline hvata ćeliju kvasca u toku kultivisanja i posle pupljenja, zajedno sa ćerkama ćelijama, ćelije kvasca su zatvorene u makrostrukturu koja sadrži glinu pre liziranja i uklanjanja njegovih intracelularnih komponenti ispiranjem. U nekim primerima izvođenja, lanci glukana rastu između lamelarne strukture gline.

[0111]U nekim primerima izvođenja, komponenta ćelije kvasca ili ćelijskog zida kvasca (npr., ekstrakt ćelijskog zida kvasca generisan i izolovan kao što je ovde opisano (npr., koji sadrži glinu isprepletanu u ćelijski zid kvasca i koji sadrži promenjenu strukturu glukana i/ili manana)) je kombinovana sa jednim ili više drugih sredstava uključujući enzim (npr., esteraza, epoksidaza), bakterije, kvasac ili komponentu kvasca, glinu, (npr., pre mešanja sa stočnom hranom, inkorporiše se u peletiranu stočnu hranu i/ili se životinje njime hrane)).

[0112] U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak koristi ćelije kvasca koje sadrže promenjenu strukturu ćelijskog zida kvasca (npr., glina je isprepletana u ćelijske zidove kvasca i ćelijski zidovi koji sadrže promenjenu strukturu glukana i/ili manana), kompozicije koje sadrže iste i/ili kompozicije poreklom od istih, koje se koriste sa jednim ili više postupaka i/ili materijala opisanih ovde za upotrebu u kompozicijama i/ili postupcima za smanjenje, uklanjanje i/ili eliminaciju mikotoksina (npr., fizički, mešanje, hemijski, mikrobiološki postupci koji su ovde opisani (npr., da se adsorbuju i/ili izoluju mikotoksini)). Na primer, u nekim primerima izvođenja, ćelija kvasca ili komponenta ćelijskog zida kvasca (npr., ekstrat ćelijskog zida kvasca proizveden kao što je ovde korišćeno (npr., koji sadrži glinu isprepletanu u ćelijski zid kvasca i koji sadrži promenjenu strukturu glukana i/ili manana)) je korišćen sa jednim ili više fizičkih postupaka, postupaka mešanja, hemijskih ili mikrobioloških postupaka koji su ovde opisani za izolaciju mikotoksina.

[0113] Kompozicije prema predmetnom pronalasku (npr., ekstrakti ćelijskog zida kvasca isprepletani glinom) mogu biti korišćene za adsorbovanje i/ili izolaciju različitih mikotoksina uključujući acetoksiscirpendiol, acetildeoksinivalenol, acetilnivalenol, acetilneosolaniol, acetil T-2 toksin, prošireno na aflatoksine, aflatoksin BI, B2, Gl i G2, aflatrem, altenuinsku kiselinu, alternariol, austdiol, austamid, austocistin, avenacein +1, beauvericin +2, bentenolid, brevianamid, butenolid, kalonektrin, hetoglobosin, citrinin, citreoviridin, kohliodinol, citohalazin E, ciklopiazonsku kiselinu, deacetilkalonektrin, deaktilneozolaniol, deoksinivalenol diacetat, deoksinivalenol monoacetat, diacetoksiscirpenol, destruksin B, eniatine, prošireno na sve ergot toksine i endofite, fruktigenin +1, fumagilin, fumonizine, fumonizine BI i B2 i B3, Fuzarenon-X, Fuzarohromanon, fuzarinsku kiselinu, fuzarin, gliotoksin, HT-2 toksin, ipomeanin, islanditoksin, lateritin +1, likomarazmin +1, malformin, maltorizin, moniliformin, monoacetoksiscirpenol, neozolaniol, nivalenol, NT-1 toksin, NT-2 toksin, prošireno na sve ohratoksine, oosporein, oksalinsku kiselinu, patulin, penicilinsku kiselinu, penitrem, roridin E, rubratoksin, rubroskirin, rubrosulfin, rugulosin, sambucinin +1, satratoksine, F,G,H, scirpentriol, slaframin, sterikoncentrovani ekstraktocistin modifikovanog ćelijskog zida kvasca, T-l toksin, T-2 toksin, triacetoksiscirpendiol prošireno na sve trihotecene, trihodermin, trihotecin, trihoverine, trihoverole, triptokvivalen, verukarin, verukulogen, viopurpurin, viomelein, viriditoksin, ksantocilin, javanicin+1, zearalenole, zearalanone, zearalenon i podfamilije i/ili derivate istih. U nekim primerima izvođenja, kompozicije i postupci prema pronalasku su korišćeni za apsorbovanje i/ili vezivanje aflatoksina, zearalenona, ohratoksina, trihotecena, fumonizina, patulina i/ili egota povezanog sa endofitama i mogućih konjugata i metabolita gore navedenih mikotoksina. Eksperimenti izvedeni u toku razvoja pronalaska pokazuju korist(i) upotrebe predmetnog pronalaska u poređenju sa istorijskim ili konvencionalnim postupcima. Na primer, kao što je ovde opisano, nedostatak upotrebe kompozicije koja sadrži samo (1) glinu, (2) kompozicju koja sadrži samo ekstrakt ćelijskog zida kvasca, kao i (3) kompoziciju koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca kome je dodata glina, je taj što su takve kompozicije i postupci upotrebe istih manje efikasna sredstva od predmetnog pronalaska za redukciju negativnih efekata mikotoksina i imaju više nedostataka. Međutim, ekstrakti ćelijskog zida kvasca isprepletani glinom prema predmetnom pronalasku (npr., koji sadrže glinu isprepletanu u ćelijski zid kvasca i koji sadrže promenjenu strukturu glukana i/ili manana) ispoljavaju neočekivanu sposobnost da vezuju različite mikotoksine, i takođe ispoljavaju upadljivo pojačanu sposobnost da adsorbuju mikotoksine u poređenju sa konvencionalnim kompozicijama (npr., kompozicija koja sadrži samo glinu(e), kompozicija koja sadrži samo ekstrakt ćelijskog zida kvasca, kao i kompozicija koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca u koji je dodata glina(e), videti Primere 2-3). Na taj način, predmetni opis daje kompozicije i postupke koji ispoljavaju neočekivane i bolje osobine vezivanja i/ili adsorpcije u odnosu na različite mikotoksine koji se ne nalaze u konvencionalnim kompozicijama i postupcima. Na taj način, predmetni pronalazak daje upotrebe glinom isprepletanih materijala na bazi ćelijskog zida kvasca da bi se obezbedio efikasan postupak za vezivanje mikotoksina u digestivnom traktu životinja i ljudi (npr., preko adsorpcije mikotoksina prisutnih u hrani za životinje, druge organske materije i/ili vode) dok istovremeno obezbeđuje nižu apsoipciju ili bez apsorpcije korisnih nutrijenata i manje ili bez negativnih efekata na životnu sredinu.

[0114] U nekim primerima izvođenja, poželjan fizički oblik opisa je suvi slobodno protočni prah pogodan za direktno uključenje u hranu za životinje, drugu organsku materiju (npr., prostirku za stoku) ili kao direktni suplement za životinju. Kompozicija opisa se može dodati u bilo koju organsku materiju (npr., prostirka, hrana za životinje, hrana za ljude) i/ili vodu (npr., voda korišćena za potrošnju od strane životinja i/ili ljudi, voda iz životne sredine (npr., bare, jezera, rezervoari, ribnjaci)) za uklanjanje mikotoksina iz materije. Kada je ugrađena direktno u hranu za životinje, kompozicija prema opisu se dodaje u količinama u opsegu od 0.0125% do 0.4% prema težini hrane. Kada je ugrađena u drugu organsku materiju (npr., prostirku za životinje), kompozicija prema opisuje dodata u količinama u opsegu od 0.0125% do 99.9%. Kada je ugrađena u tečnost (npr., vodu (npr., za filtraciju)), kompozicija prema opisu se dodaje u količinama u opsegu od 0.0125% do 100%. U nekim primerima izvođenja, kompozcija prema opisu se dodaje u hranu u količinama od 0.025% do 0.2%> prema težini hrane. Alternativno, kompozicijama opisa su direktno hranjene životinje kao suplementom (npr., u količini u opsegu od 2.5 do 20 grama po životinji na dan). Stručnjak iz date oblasti tehnike odmah razume da količina kojom se hrane varira u zavisnosti od životinjske vrste, veličine, tipa hrane kojoj se dodaje kompozicija prema pronalasku, materijala za prostirke, izvora vode, itd.

[0115]Kompozicijama opisa mogu biti hranjene bilo koje životinje i ljudi. Kada se mešaju sa hranom ili se koriste kao hranljivi suplement, kompozicje opisa smanjuju biodostupnost mikotoksina, apsorpciju ili unos mikotoksina od strane životinje, poboljšavaju učinak i/ili zdravlje i smanjuju incidencu bolesti. U nekim primerima izvođenja, kada su kompozicije opisa dodate u organski materijal sa kojim životinje i ljudi dolaze u kontakt (npr. prostirka), kompozicije opisa smanjuju biodostupnost mikotoksina (npr., smanjenje apsorpcije i/ili unos mikotoksina od strane životinje) na taj način poboljšavajući učinak i zdravlje i smanjujući pojavu bolesti. U nekim primerima izvođenja, kompozicije opisa se dodaju u vodu koja je namenjena za upotrebu od strane životinja ili ljudi (npr., za piće ili druge namene), na taj način smanjujući biodostupnost mikotoksina (npr., smanjujući apsorpciju i/ili unos mikototoksina od strane životinjskog ili ljudskog subjekta) i poboljšavajući učinak i zdravlje i smanjujući pojavu bolesti (npr., kompozicije prema opisu smanjuju biodostupnost, apsorpciju ili unos mikotoksina. U nekim primerima izvođenja, kompozicija prema opisu je dodata u vodu za piće od strane ljudi (npr., voda korišćena za proizvodnju soka, vina, boca vode, kafe, čaja, mleka ili drugog tipa tečnosti za piće). U nekim primerima izvođenja, kompozicija opisa se dodaje u vodu iz životne sredine (npr., bare, jezera, rezervoari, reke, potoci, irigacioni kanali, rezervoari koji se koriste za smeštaj ribe ili drugog tipa akvatičnih vrsta). Na taj način, u nekim primerima izvođenja, kompozicija opisa (npr., ekstrakt ćelijskog zida kvasca koji sadrži glinu integrisanu u ćelijski zid) je korišćena u filtraciji tečnosti (npr., tečnosti za piće (npr., voda koja se koristi u proizvodnji napitaka, napici)). Na primer, u nekim primerima izvođenja, kompozicija opisa se koristi kao ili u filteru, pri čemu je tečnost (npr., tečnost za piće (npr., sok od narandže, sok od jabuke, sok od suve šljive, sok od grejpfruta, sok od brusnice ili drugi tip soka, pivo, vino, destilovana tečnost)) obrađena kroz filter koji sadrži kompoziciju opisa, gde kompozicija uklanja jedan ili više tipova mikotoksina iz tečnosti.

[0116]Kao što je opisano u Primerima 1-4, kultivacija kvasca u prisustvu gline obezbeđuje dramatično povećanje u adsorpciji mikotoksina od strane ćelijskog zida kvasca (npr., od 6.917%o kada kvasac nije kultivisan sa glinom, i dostižući 73.553%) i 79.337%) kada je 1.0 i 2.0% gline respektivno uključeno u medijum bez specifične ekstrakcije glukana untrašnjeg sloja ćelijskog zida kvasca (videti, npr., Primer 2)). Pored toga, odnos glukana:manana se povećava od 1.066 do 1.366 sa dodavanjem gline. Uprkos smanjenju manana, koncentracija proteina ćelijskog zida se povećala. Takođe, frakcija koja je preostala (npr., koja predstavlja gubitke glukana, manana, proteina, gline, N-acetilglukozamina i/ili hitina prisutne u ćelijskom zidu kvasca u toku postupka ekstrakcije) povećala je prisustvo i specifičnu površinu gline. Iako mehanizam nije potreban da bi se izveo pronalazak i pronalazak nije ograničen na bilo koji određeni mehanizam delovanja, u nekim primerima izvođenja, povećanje je posledica povećanja frakcije hitina uključene u kompenzatorni mehanizam kvasca kao posledica promena u životnoj sredini i uslova rasta. Pored toga, kompozicije prema predmetnom opisu (koje sadrže ekstrakt ćelijskog zida kvasca iz promenjenih ćelija kvasca (npr., ćelija kvasca koje sadrže glinu isprepletanu u ćelijske zidove kvasca i ćelijske zidove koji sadrže promenjenu strukturu glukana i/ili manana)) obezbedile su značajnu i neočekivanu sposobnost da adsorbuju i/ili vezuju mikotoksine (npr., zearalenon (npr., ispoljavajući efikasnost od 79.33% u poređenju sa samo 44.7% efikasnosti za konvencionalnu kompoziciju koja sadrži kombinaciju ekstrakta ćelijskog zida kvasca u koju je kasnije dodata glina na bazi suve mešavine, videti Primere 1-4)).

[0117]Ispitivana je upotreba alternativnog postupka za ekstrakciju ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom upotrebom isecanja proteazom (videti Primer 3). Specifična ekstrakcija unutrašnjeg sloja (glukana) ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom generisala je povećanje vezujućih i adsorpcionih osobina ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom za mikotoksine (npr., zearalenon). Pored toga, kultivacija ćelija kvasca u medijumu ćelijske kulture koji sadrži glinu u 1.0% i 2.0% značajno je pojačala aktivnost vezivanja i adosrpcije ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom sa mikotoksinima, (npr. zearalenon). Na primer, konvencionalna kompozicija koja sadrži kombinaciju ekstrakta ćelijskog zida kvasca u koji je glina kasnije dodata na bazi suve mešavine daje 44.7%> stopu efikasnosti za vezivanje mikotoksina, u poređenju sa stopom efikasnosti od 85.89%) za vezivanje mikotoksina dobijenih sa kompozicijom prema predmetnom pronalasku i povećanje adsorpcije aflatoksina BI od 2.65 do 53.70% (videti, npr., Primer 3).

[0118]Predmetni opis daje postupke za proizvodnju ćelija kvasca koje sadrže ćelijski zid kvasca isprepletan glinom. U nekim primerima izvođenja, ćelije kvasca koje sadrže ćelijski zid kvasca isprepletan glinom proizvedene su u različitim razmerama (npr. test razmera, razmera serije, pilot razmera, pre-proizvodna razmera, proizvodna razmera, komercijalna razmera, industrijska razmera). U nekim primerima izvođenja, kvasac je gajen u fermentoru. Fermentor može biti bilo koje pogodne veličine (npr. 5 litara...10 litara... 25 litara...50 litara...

100...500 litara... 1000 litara...5000 litara... 10000 litara...50000 litara... 100000 litara...500000 litara... 1 milion litara) da bi se proizvela željena razmera kvasca za upotrebu sa predmetnim pronalaskom (npr. test razmera, pilot razmera, industrijska razmera). U nekim primerima izvođenja, medijumi za gajenje kvasca mogu biti od bilo kog pogodnog sastava za gajenje kvasca u skladu sa predmetnim pronalaskom. Pogodne hranljive materije su izvori ugljenika, azota, fosfora, magnezijuma, sumpora, kalijuma i mikroelemenata. U nekim primerima izvođenja, hranljive materije se dodaju u kulturu u koncentracijama (% tež./tež. izvornog jedinjenja) unutar opsega (težinski procenti): izvor ugljenika 0.01 - 20% (npr. 0.05 - 10%>), Izvor azota 0.001 - 10% (npr. 0.001 - 3%), izvor fosfora 0.001 - 5% (npr. 0.01 - 0.5%), izvor magnezijuma 0.001 - 0.2% (npr. 0.001 - 0.2%), izvor sumpora 0.01 - 0.25% (npr. 0.01 - 0.25%), izvor kalijuma 0.001 - 05% (npr. 0.01 - 0.25%), izvor organskog azota 0.001 - 5%

(npr. 0.01 - 5%) i mikroelementi se dodaju u višku. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu kvasca sadrži vodu, izvod ugljenika (npr. šećer, glukoza, dekstroza, šećerna trska, melase), pogodan izvor azota (npr. amonijak, urea), izvor aminokiselina (npr. pepton), soli (npr. natrijum hlorid, kalcijum hipohlorid, magnezijum hlorid, magnezijum sulfat, cink sulfat, itd.), i izvor gline (npr. zeolit, bentonit, aluminosilikat, montmorilonit, smektit, kaolinit, organska glina, njihove smeše). U nekim primerima izvođenja, komponetne medijuma kulture kvasca mogu biti prisutne u bilo kojim pogodnim količinama za rast ćelija kvasca (videti npr. Primer 5). U nekim primerima izvođenja, prisustvo gline u medijumu kulture kvasca predstavlja neočekivane komplikacije standardnih protokola gajenja kvasca. U nekim primerima izvođenja, prisustvo gline u medijumu kulture ima za rezultat neobično velike količine penušanja u fermentoru. U nekim primerima izvođenja, predmetni opis daje sredstva protiv penušanja u medijumu ćelijske kulture (npr. nesilikonska molekulska sredstva protiv penušanja, sredstva protiv penušanja na bazi ulja (npr. mineralnog ulje, biljnog ulja), sredstva protiv penušanja u prahu (npr. silicijum dioksid), sredstva protiv penušanja na bazi vode, sredstva protiv penušanja na bazi silikona, polietilen glikol polipropilen glikol kopolimeri, alkil poliakrilati). U nekim primerima izvođenja, sredstva protiv penišanja su potrebna za povećanje razmere predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, upotreba sredstva protiv penušanja je povazana sa pojačanom sposobnošću da se srazmerno poveća proizvodnja kompozicije prema opisu.

EKSPERIMENTALNI DEO

[0119]Sledeći primeri su dati u cilju prikazivanja i daljeg ilustrovanja određenih poželjnih varijanti i aspekata predmetnog pronalaska.

Primer 1

Materijal i metode

[0120]Kultura kvasca.Sledeći protokol je korišćen za svaki Bioflow fermentor (BioFlow III, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, New Jersev, U.S.A.) za gajenje kvascaSacchromvces cerevisiae(aktivni suvi kvasac (ADY) iz Fermin, Alltech Inc., serija #689, broj ćelija kvasca: 2.38xl0<10>ćelija/gramu, vijabilnost: 92.6%). Inokulum kvasca je pripremljen prebacivanjem 28 g svežeg ADY Fermina u prethodno zagrejanu bocu od 250 ml sterilne dejonizovane vode. Zatim, rastvor je inkubiran na 30°C (u vodenom kupatilu) 20 min i nekoliko puta zakovitlan. BioFlow medijum je sastavljen od 66 g ekstrakta kvasca, 10 g peptona, 4 g dekstroze, 4 g azotne baze kvasca i 1750 mL dejonizovane vode. Kontrolna serija je proizvedena gajenjem samog kvasca, što je zahtevalo dodatnih 250 mL dejonizovane vode u zapremini reaktora. Tri serije koje sadrže kvasac i bentonit K10 (Fluka) su proizvedene dodavanjem 8, 16 i 32 g u reaktor. Medijum Bioflow reaktora je zagrejan na 30°C i vazduh je injektiran na stopi protoka od lL/min u toku 10 min pre inokulacije. Mešanje je podešeno na 300 rpm i medijum je praćen i održavan na minimalno pH 5.0 u toku celog rasta. Dodato je sredstvo protiv penušanja (sredstvo protiv penušanja AES, 1:10, prema potrebi). Amonijum fosafat dvobazni (DAP) je zatim injektiran aseptički (4 g u 10 mL na pH 4.0). Prethodno resuspendovani kvasac je dodat u fermentor. Nivo glukoze je testiran u toku rasta sa dijabetičkim trakama (OneTouch, UltraMini, LifeScan, Inc., Milpitas, California, U.S.A.) i dopunska glukoza je dodata kada je nivo glukoze pao ispod 0.8 mg/mL. Mešanje je progresino povećano do 500 rpm tokom 2 časa inkubacije kao i protok vazduha (do 4 L/min tokom 3 časa). Kada je polovina supstrata dopunske glukoze potrošena, dodata je nova količina bentonita (8, 16, 32 g u 250 ml dejonizovane vode) u reaktor za krajnju koncentraciju od 0.5%; 1.0%; i 2.0%, respektivno, gline u krajnjem medijumu.

[0121]Kulture kvasca su sakupljene kada je sav šećer iskorišćen. Sadržaj BioFlow je sakupljen u sterilne bočice i centrifugiran na 4000 g u trajanju od 20 min. Supernatant je uklonjen i talog je ispran sa 0.125 % NaCl u H20. Talog je odvojen u 2 frakcije distinktivnim formiranjem 2 sloja posle centrifugiranja:(/)sloj koji sadrži glinu i(//)sloj koji sadrži kvasac i glinu. Kvasac je zatim ispran tri puta sa 0.125% rastvorom NaCl.

[0122]Postupak ekstrakcije ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom.Dva posebna postupka su korišćena za izolaciju frakcija ćelijskog zida kvasca iz kvasca proizvedenog kao što je opisano u prethodnom tekstu.

[0123] U prvom postupku, korišćen je 'mikro-postupak' u kome se upotrebljavaju staklene kuglice i šejker sa mini-kuglicama (Bead-Beater, Model #1107900, Biospec Products, Inc., Hamilton Beach/Proctor-Silex, Inc., Southern Pines, North Carolina, U.S.A.). Talog je resuspendovan sa dve zapremine lOmM Tris-Cl, pH 7.4 sa fenilmetilsulfonofluoridom (PMSF) i šejkiran sa staklenim kuglicama (50:50, suspenzija kvasca:kuglice) u ukupnoj zapremini od 5mL za 30 sekundi sa 1 min intervalom odmora, sve dok je na ledu. Sejkiranje je ponavljano 10 puta ili sve dok 95% ćelija nije bilo prekinuto. Kuglice su ponovo sakupljene i isprane. Frakcije su sakupljene i centrifugirane na 4000 g u trajanju od 20 min. Taloži su zatim sakupljeni, sušeni zamrzavanjem i mleveni.

[0124] U drugom postupku, kvaščev talog je resuspendovan sa sterilnom dejonizovanom vodom do koncentracije od 13 do 15 % suve materije. Kvaščeva suspenzija je mešana na 60°C. pH je podešen upotrebom 10 % NaOH do 8.0 pre dodavanja enzima u 0.3 mL/L. Temperatura i uslovi mešanja su održavani tokom 8 časova. pH je praćena i podešavana svakih 15 min (upotrebom 10% NaOH) tokom prva dva časa, i zatim je pH praćena i podešavana svakih 1 čas tokom sledećih šest časova. Suspenzija je prebačena u sterilne bočice za centrifugu i centrifugirana na 4000 g u trajanju od 20 min. Supernatant je odbačen i talog je ispran sa tri zapremine hladne sterilne vode, i zatim centrifugiran ponovo na 4000 g u trajanju od 20 min. Korak ispiranja je ponovljen dva puta pre nego što je talog zamrznut, osušen zamrzavanjem i mleven.

PRIMER 2

Karakterizacija ekstrakata ćelijskog zida kvasca izolovanih korišćenjem staklenih kuglica i šejkera sa mini-kuglicama iz ćelija kvasca kultivisanih u odsustvu i prisustvu gline

[0125] Ćelije kvasca su prekinute posle resuspendovanja ćelija u Tris-HCl puferu, pH 7.4 sa PMSF upotrebom mikro-postupka upotrebom šejkera sa kuglicama i staklenih kuglica kao što je opisano (videti Primer 1). Lizati ćelijskog zida kvasca su zatim analizirani u cilju karakterizacije ćelijskih zidova kvasca i njihove sposobnosti da adsorbuju mikotoksine

(izraženo kao procenat efikasnosti u poređenju sa ukupnim mikotoksinima koji su prisutni)

pod uslovima fiziološke pH za svaki pojedinačni razmatrani mikotoksin. Ukupna aktivnost adsorbovanja/vezivanja je procenjivana kinetički. Test utorci su sadržali minimum od 5 nivoa do 10 nivoa koncentracija mikotoksina testiranih sa različitim preparatima ćelijskog zida kvasca korišćenih u koncentraciji između 0.25 i 4g/L dispergovanim u vodenom medijumu sa fiksiranom vrednošću od pH 4 koja je reprezentativan za digestivne uslove pH u traktu životinja. Procena adsorpcije je izračunavana upotrebom tečne hromatografije visokog učinka spojene sa fluorometrijskim detektorima i detektorima sa diodnim-nizom (npr., da bi se detektovale količine mikotoksina i adsorbovanog/vezanog mikotoksina).

[0126] Rezultati su prikazani na Slici 3. Esktrakti ćelijskog zida kvasca dobijeni iz ćelija kvasca kultivisanih u prisustvu gline (ćelija kvasca isprepletanih glinom) ispoljavaju značajnu, neočekivanu, sposobnost da vezuju i da adsorbuju zearalenon (npr., ispoljavaju 79.33% efikanosti za ekstrate ćelijskog zida kvasca iz ćelija kvasca kultivisanih u prisustvu 2% gline u poređenju sa samo 6. 91% efikasnošću ćelijskih zidova kvasca ekstrahovanih iz ćelija kvasca kultivisanih u odsustvu gline. Stopa efikasnosti od 79.33 % za kompozicije ćelijskog zida kvasca ekstrahovane iz ćelija kvasca kultivisanih u prisustvu 2% gline je takođe značajno viša od prethodno dokumentovanih stopa efikasnosti od samo 44.7% za konvencionalnu kompoziciju koja sadrži kombinaciju ekstrakta ćelijskog zida kvasca u koji se glina kasnije dodaje na bazi suve mešavine. Nivo uključenosti proizvoda vezivanja za AFB1 i ZEA bili su respektivno od 0.1 i 0.4% u reakcionom medijumu koji je održavan na konstantnoj pH od 4.0. Analiza je izvedena pod orbitalnim mešanjem u toku 90 min na 37°C i količina vezanog toksina procenjena je upotrebom HPLC opremljene fluorescentnim detektorom.

[0127] Dodatno, kvasac gajen/kultivisan u prisustvu gline ispoljavao je značajnu promenu u komponenti/strukturi ćelijskog zida. Na primer, kako se količina gline povećava, tako odnos manana:glukana raste (npr., kako glina raste od nula, 0.5%, 1.0% do 2.0%, odnos manana:glukana se povećava od 1.01 do 1.2, 1.35 i 1.45, respektivno. Ukupna količina proteina se takođe povaćava sa rastućim količinama gline dodate u medijum ćelijske kulture.

PRIMER 3

Karakterizacija ekstrakata ćelijskog zida kvasca izolovanih upotrebom isecanja proteazom iz ćelija kvasca gajenih/kultivisanih u odsustvu i prisustvu gline

[0128]Ćelije kvasca su tretirane proteazom kao što je opisano u Primeru 1. Lizati ćelijskog zida kvasca su zatim analizirani u cilju karakterizacije ćelijskih zidova kvasca i njihove sposobnosti da adosrbuju mikotoksine (izraženo kao procenat efikasnosti u poređenju sa ukupnim mikotoksinima koji su prisutni) pod uslovima fiziološke pH za svaki razmatrani pojedinačni mikotoksin. Ukupna adsorbujuća aktivnost je procenjivana kinetički. Test uzorci su sadržali minimum od 5 nivoa do 10 nivoa koncentracija mikotoksina testiranih sa različitim preparatima ćelijskog zida kvasca korišćenim u koncentraciji između 0.25 i 4g/L dispergovanoj u vodenom medijumu sa fiksiranom vrednošću od pH 4) koja je reprezantativna za uslove pH u digestivnom traktu životinja. Procena adsorpcije je izračunavana upotrebom tečne hromatografije visokog učinka spojene sa fluorometrijskim detektorima i detektorima sa diodnim nizom (npr., za detekciju količina mikotoksina i adsorbovanog/vezanog mikotoksina).

[0129]Rezultati su prikazani na Slici 4. Esktrakti ćelijskog zida kvasca isprepletani glinom dobijeni iz ćelija kvasca kultivisanih u prisustvu gline ispoljili su značajnu, neočekivanu, sposobnost da vežu i/ili adsorbuju zearalenon i aflotoksin BI. Na primer, ekstrakti ćelijskog zida kvasca iz kvasca gajenog u prisustvu 2.0% gline ispoljili su 85.89% efikasnost za zearalenon, dok su ekstrakti ćelijskog zida kvasca iz kvasca kultivisanog u odsustvu gline ispoljili samo 69% stopu efikasnosti adsorpcije. Ekstrakti ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom dobijeni iz kvasca gajenog u prisustvu 2.0%> gline ispoljili su 53.7% efikanosti za aflatoksin BI, dok su ekstrakti ćelijskog zida kvasca iz kvasca kultivisanog u odsustvu gline ispoljili samo 2.65% stopu efikasnosti adsorpcije. Dodatno, kvasac isprepletan glinom gajen/kultivisan u prisustvu gline ispoljio je značajnu promenu u komponenti/strukturi ćelijskog zida kvasca. Nivo uključenosti proizvoda vezivanja za AFB1 i ZEA bili su respektivno 0.1 i 0.4% u reakcionom medijumu koji je održavan na konstantnoj pH od 4.0. Analiza je izvedena pod orbitalnim mešanjem u toku 90 min na 37°C i količina vezanog toksina je procenjivana upotrebom HPLC opremljene fluorescentnim deketorom.

[0130]Postupak iz Primera 1 je korišćen sa alternativnim izvorima kvasca da bi se procenio uticaj smektitne gline (American Colloid Companv, Arlighton Height, IL, USA) dodate u 1.0% u medijumu za rast na kompoziciju materijala ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom. Ispitivana su tri tipa kvasca koji pripadajuSaccharomyces cerevisiae,ADY Fermin (08-032/460-89), pekarski kvasac iz Levapan (Batch # 7169281, Levapan S.A., Bogota, Columbia) i aktivni suvi kvasac iz DCL (lot #1390, DCL Yeast Ltd., Alloa, Great Britain).

[0131]Varijacija između ćelijskog zida kvasca isprepletanog kvascem zabeležena je sa nivoima od 19.9, 17.0 i 10.3% glukana; 10.6, 10.4 i 8.4% manana; i 1.5, 1.4, 0.9% hitina (N-acetil-glukozamina) prisutnih u ćelijskom zidu kvasca (i izraženim u odnosu na celu ćeliju) za ADY Fermin, Levapan, DCL CZKIG pre hidrolize.

[0132]Efikasnost vezivanja proizvedenog materijala ispoljila je takođe razlike prema izabranom tipu ćelije kvasca (VIDETI SL. 9). Zabeležene varijacije prema efikasnosti su takođe povezane sa razmatranim tipom mikotoksina.

PRIMER 4

Elektronmikroskopski prikaz ekstrakataćelijskogzidakvasca izćelijakvascagajenih/kultivisanih u odsustvu iprisustvugline

[0133]Eksperimenti su izvedeni u toku razvoja primera izvođenja pronalaska u cilju karakterizacije i beleženja nekoliko uzoraka kvasca (videti, npr., sliku 2). Uzorci su pripremljeni filtracijom rehidratisanog rastvora kvasca u 2.5 % glutaraldehidu (GTA) u 0.85 % rastvoru NaCl. Rastvor je zatim filtriran kroz najlonske nukleopore prečnika 13 mm, veličine pora 0.1 um prethodno ovlaženih sa 0.85 % NaCl. Filter je zatim prebačen u Petri posudu i pokriven kapima GTA/kakodilat (Cac) fiksativa na sobnoj temperaturi u toku 90 min. Filteri su zatim ispirani sa 0.1 M Na Cac pH 7.2. Sekundarna fiksacija je postignuta postavljanjem filtera u epruvetu u toku 60 min sa 100 uL 2 % osmijum tetroksida u 0.1 M Na Cac pH 7.2. Uzorci su zatim ispirani sa 0.1 M Na Cac pH 7.2 i 3 puta sa dejonizovanom vodom. Dehidratacija uzorka je postignuta pomoću etanolske serije (25% do 100%). Zatim, uzorci su sušeni zamrzavanjem, montirani na podlogu pripremljenu sa ugljenom trakom za svrhe provodljivosti, i obloženi sa Au/P legurom. Beleženja su izvedena na 3.0 keV na S-4300 FESEM (Hitachi, Japan). Da bi se uklonila svaka nespecifična interakcija između kvasca i gline, azotna struja gasa pod visokim pritiskom je primenjena na svaki montirani uzorak pre oblaganja sa Au/P.

PRIMER 5

Srazmerno povećanjeproizvodnje do polu-industrijskerazmere ćelijskogzidakvascakultivisanogsaglinom

[0134]Srazmerno uvećanje kulture kvasca.150 L fermentor (ML-4100, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, New Jersev, U.S.A.) je korišćen za uzgajanje kvascaSacchromyces cerevisiae(aktivni suvi kvasac (ADY) iz Fermin, Alltech Inc., serija #609, broj ćelija kvasca: 2.38xl0<10>ćelija/gramu, vijabilnost: 92.6%). Inokulum kvasca je pripremljen prebacivanjem 0.84 kg svežeg ADY Fermina u prethodno autoklavisani (121°C u toku 40 min) balon od 19 L sa cevi, pokriven sa BioShield koji sadrži 7.5 L vode i to je održavano posle autoklavisanja na 30°C u inkubatoru preko noći. Dva balona od 19 L sa hranom, pokrivena sa BioShield pripremljena su dodavanjem 9 L vode, 6 kg dekstroze i šipke za mešanje. Posle mešanja i rastvaranja izvora ugljenika, hranljivi medijum je autoklavisan (121°C u toku 40 min). Azotni rastvor je pripremljen upotrebom 1 L sterilne zatvorene boce koja sadrži 250 ml dejonizovane vode, 120 g diamonijum fosfata podešenog do pH 4.0-4.1 sa koncentrovanom HC1. Dve 1 L sterilne zatvorene boce sa azotnom hranom su pripremljene dodavanjem 700 mL dejonizovane vode, 192 g diamonijum fosfata podešenog do pH 4.0-4.1 sa koncentrovanom HC1. Bazni rastvor je pripremljen u boci od 19 L sa cevi, pokrivenoj sa BioShield i koja sadrži 13.5 L vode, 1.5 L KOH. Cev je zatim povezana sa peristaltičkom pumpom. Rastvor sredstva protiv penušanja (sredstvo protiv penušanja AES, 1:10) je pripremljen u boci od 19 L sa cevi, pokrivenoj sa BioShield i koja sadrži 12 L vode, 3 L sredstva protiv penušanja (sredstvo protiv penušanja AES, 3 kg) i mešan. Cev je zatim povezana sa peristaltičkom pumpom. 150 L medijum fermentora je sastavljen od 1.98 kg ćilibara, 0.3 kg peptona, 0.12 kg dekstroze, 0.12 kg azotne baze kvasca, 0.516 g smektitne gline (American Colloid Companv, Arlighton Height, IL, USA) i 60 L vode koja je dovedena do 121 °C, 15psi za 1 čas uz mešanjem. Medijum je ohlađen do 30°C i ova temperatura je održavana tokom razmnožavanja.

[0135]Umnožavanje je izvedeno na 150 L fermentoru održavanom na 30°C sa blagim mešanjem (70% snage) i injektiranjem vazduha (na 5 psi) pre inokulacije i u toku cele fermentacije. Inokulum koji sadrži 0.84 kg ADY u 7.5 L vode je mešan u trajanju od 20-30 min pre inokulacije u 150L fermentoru. Jedna boca sa azotnom hranom je dodata u svaku bocu sa hranom uz mešanje. Azotni rastvor je pumpan u 150 L fermentor i ostavljen da se meša minimalno 10 min pre inokulacije. Balon sa sredstvom protiv penušanja je vezan i sredstvo protiv penušanja je pumpano kroz cev u 150 L fermentor prema potrebi. Sonda za penu je postavljena unutar fermentora za praćenje penušanja i da bi se omogućilo ispravno dopunjavanje sa sredstvom protiv penušanja. Bazni rastvor je vezan i pumpan kroz cev u 150 L fermentor prema potrebi. Razvijanje pH medijuma u 150 L fermentoru je praćeno i održavano na minimalno pH 5.0 u toku celog rasta. Inokulacija je izvedena vezivanjem balona sa inokulumom u sistemu i pumpanjem sadržaja u 150L fermentor. Mešanje inokuluma u fermentoru je izvedeno za 20-30 min pre prvog uzorkovanja. Pena je praćena tokom umnožavanja, podešavanja vazduha i mešanja jedan čas. pH je praćena interno i eksterno i podešavana kako je neophodno da se održava pH od 5.0 ili više. Nivo glukoze je testiran u toku rasta sa dijabetičkim trakicama (OneTouch, UltraMini, LifeScan, Inc., Milpitas, California, U.S.A.) i dopunska glukoza je dodata kada je nivo glukoze pao ispod 0.8 mg/mL sporim pumpanjem u hranljivi rastvor ili ubrzavanjem postepeno tokom vremena. Ako se nivo šećera popeo iznad 0.8 mg/mL, stopa napajanja je usporena ili isključena ako je neophodno. [0136JKulture kvasca su sakupljene kada je sav šećer iskorišćen. Sadržaj 150 L fermentora je sakupljen u sterilne boce i centrifugiran na 4000 g u trajanju od 20 min. Supernatant je uklonjen i meren je procenat suve materije ispranog kvasca. Materijal je zatim prebačen nazad u 150 L fermentor i dodata je voda da bi se suspenzija dovela od 9-11% do koncentracije od 13-15%o suve materije. Mešanje je održavano sve vreme.

[0137]Ekstrakcija ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom preko enzimske hidrolize.13-15% suspenzije suve materije kvasca je mešano na 60°C. pH je podešena upotrebom 10 % NaOH do 8.0 pre dodavanja enzima u 0.3 mL/L. Temperatura i uslovi mešanja su održavani tokom 8 časova. pH je praćena i podešavana na svakih 15 min (upotrebom 10 % NaOH) tokom prva dva časa, i zatim je pH praćena i podešavana na svaki čas tokom sledećih šest časova. Suspenzija je prebačena u sterilne boce za centrifugu i centrifugirana na 4000 g u trajanju od 20 min. Supernatant je odbačen i talog je ispran sa tri zapremine hladne sterilne vode, i zatim centrifugiran ponovo na 4000 g u trajanju od 20 min. Korak ispiranja je ponavljan dva puta pre nego što je talog zamrznut, osušen zamrzavanjem i mleven. Povećanje temperature u toku faze sušenja rasprskavanjem rezultiralo je u malo višem prinosu i manjoj akumulaciji proizvoda u uređaju za sušenje raspršivanjem.

[0138]Uključenje materijala od gline može biti praćeno promenom u koncentraciji pepela uzorka koji dostiže vrednosti oko 20 % za ćelijski zid kvasca isprepletan glinom u poređenju sa 5% koncentracijom u ekstraktu ćelijskog zida kvasca koji ne sadrži materijal od gline (VIDETI SL. 6). Značajna razlika prema kompoziciji između ADY Fermin ćelijske linije kvasca proizvedene prethodno u Bioflow fermentorima u poređenju sa 150 L fermentorom takođe je nađena sa smanjenjem sadržaja glukana i manana u proizvodnji velikih razmera, ali takođe i povećanje sadržaja hitina ćelijskog zida kvasca (1.5% do 3%) koje objašnjava odgovore ćelijskog zida kvasca na uznemirujući agens i uključen je u put prenosa signala ćelijskog zida.

[0139]ĆZKIG proizvodi polu-industrijskih razmera su procenjivani za efikasnot vezivanja mikotoksina (videti, npr. Sliku 7), i rezultati potvrđuju povećanje sposobnosti adsorpcije mikotoksina od strane ĆZKIG.

PRIMER 6

Proizvodnja ćelijskog zidakvascaisprepletanog glinom koja koristi industrijskiizvor šećera

[0140]Kultura kvasca. Sacchromyces cerevisiae(aktivni suvi kvasac (ADY) iz Fermin, Alltech Inc., Broj ćelija kvasca: 2.38xl0<10>ćelija/gram, vijabilnost: 92.6%) je gajen u Bioflow fermentoru (BioFlow III, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, New Jersey, U.S.A.). Inokulum kvasca je pripremljen prebacivanjem 29 g svežeg ADY Fermina u prethodno zagrejanu bocu od 87 ml sterilne dejonizovane vode. Zatim, rastvor je inkubiran na 30°C (u vodenom kupatilu) u trajanju od 20 min i kovitlan nekoliko puta. BioFlow medijum je sastavljen od 0.048 g kalcijum hipohlorida, 0.24 g magnezijum sulfata, 0.168 g cink sulfata, 0.24 g magnezijum hlorida, 2.4 g (2.5ml pripremljene hrane) soka i pulpe šećerne trske, 7.5 smektitne gline (0.5%> u krajnjem medijumu, (American Colloid Companv, Arlighton Height, IL, USA)) i 1440 mL dejonizovane vode. Sok i pulpa šećerne trske je 30%> ukupnih redukcionih šećera (TRS) rastvor melasa razblažen vodom. Priprema soka i pulpe je izvedena sa 669 g melasa (62.8% TRS) i 731 mL dejonizovane vode. Izvor azota je pripremljen sa 54.5 g uree u 163.5 mL dejonizovane vode.

[0141]Medijum Bioflovv reaktora je zagrevan na 30°C i injektiran je vazduh na lL/min stopi protoka u toku 10 min pre inokulacije. Mešanje je podešeno na 300 rpm i medijum je praćen i održavan na minimumu od pH 5.0 u toku celog rasta upotrebom fosforne kiseline, 85%. Dodato je sredstvo protiv penušanja (sredstvo protiv penušanja AES, 1:10, prema potrebi). Prethodno resuspendovani kvasac je dodat u fermentor. Nivo glukoze je testiran u toku rasta sa dijabetičkim trakicama (OneTouch, UltraMini, LifeScan, Inc., Milpitas, California, U.S.A.) i dopunska hrana (iz soka i pulpe šećerne trske) je dodata kada je nivo glukoze pao ispod 0.8 mg/mL. Mešanje je progresivno povećano do 500 rpm tokom 2 časa inkubacije kao i protok vazduha (do 4 L/min tokom 3 časa). Krajnja koncentracija gline u reaktoru bila je 0.5% u krajnjem medijumu.

[0142]Količina melasa koja se dodaje u fermentor zavisi od efikasnosti kvasca da iskorišćava šećer i sadržana je između 400 i 600 g. Prekomerno napajanje melasama stvara probleme u proizvodnji koji imaju za rezultat nemogućnost da se generiše bilo kakva biomasa kvasca preko fermentacije. Kulture kvasca su sakupljene kada više nije zabeležen rast. Sadržaj BioFlow je sakupljen u sterilne boce i centrifugiran na 4000 g u trajanju od 20 min. Supernatant je uklonjen i talog je ispran sa 0.125 % NaCl u H20. Nikakva posebna frakcija nije nađena kada su melase korišćene za izvođenje umnožavanja kvasca. Kvasci su zatim isprani tri puta sa 0.125% rastvorom NaCl.

[0143]Postupak ekstrakcije ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom.Talog kvasca je resuspendovan sa sterilnom dejonizovanom vodom do koncentracije od 13 do 15 % suve materije. Suspenzija kvasca je mešana na 60°C. pH je podešena upotrebom 10 % NaOH do 8.0 pre dodavanja enzima u 0.3 mL/L. Temperatura i uslovi mešanja su održavani tokom 8 časova. pH je praćena i podešavana na svakih 15 min (upotrebom 10 % NaOH) tokom prva dva časa, i zatim je pH praćena i podešavana na svakih 1 čas sledećih šest časova. Suspenzija je prebačena u sterilne bočice za centrifugu i centrifugirana na 4000 g u trajanju od 20 min. Supernatant je odbačen i talog je ispran sa tri zapremine hladne sterilne vode, i zatim centrifugiran ponovo na 4000 g u trajanju od 20 min. Korak ispiranja je ponovljen dva puta pre nego što je talog zamrznut, osušen zamrzavanjem i mleven.

[0144] Efikasnot vezivanja proizvedenog materijala ispoljila je takođe razlike prema izvoru ugljenika korišćenom za umnožavanje kvasca (VIDETI SL. 8). Zabeležene varijacije prema efikasnosti su takođe povezane sa tipom razmatranog mikotoksina. Sastav materijala je takođe različit od sastava materijala koji je prethodno proizveden sa dekstrozom kao jedinim izvorom ugljenika. Zabeleženi su nivoi od 13.4% glukana; 17.8% manana i 2.7% hitina (N-acetil-glukozamin) prisutni u ćelijskom zidu kvasca (i izraženi u odnosu na celu ćeliju).

PRIMER 7

In vivoefikasnost protivFusariummikotoksikoza

[0145] Jedan dan stari hibridni ćurići (Hvbrid Turkevs, Kitchener, ON, Canada) su pojedinačno mereni, vezana su im krila i podeljeni su po slučajnom izboru u grupe na Arkell Poultrv Research Station of the Universitv of Guelph. Ćurići su po slučajnom izboru doodeljeni svakoj od 5 ishrana. Ćurići su početno održavani na 32°C, i temperatura je postepeno smanjivana za 3°C na nedelju da bi se dostigla temperatura od 21°C do kraja nedelje 4. Ova temperatura je održavana tokom trajanja eksperimenta. Ćurići su hranjeni kukuruzom, pšenicom i starterom na bazi soj inog brašna (0-3 nedelje), i ishranom za rast (4-6 nedelja) formulisanom sa kontrolnim zrnima, kontrola+ 0.2% ćelijski zid kvasca isprepletan glinom, kontaminiranim zrnima i kontaminiranim zrnima + 0.2 % ćelijski zid kvasca isprepletan glinom. Kontrolna ishrana je formulisana da se ispune ili prevaziđu minimalne potrebe za hranljivim materijama ćurića prema NRC (1994). Ishrane kontaminirane mikotoksinom pripremljene su zamenom 25 i 10% i 26 i 5% kontrolnog kukuruza i pšenice sa kontaminiranim kukuruzom i pšenicom prirodno kontaminiranom sa mikotoksinimaFusariumu toku starter faze i faze rasta, respektivno. Nivoi zamene kontrolnih zrna sa kontaminiranim zrnima su izračunati u cilju postizanja mikotoksina od oko 4 mg DON/kg ishrane u toku starter faze i faze rasta. Ishrane dopunjene sa polimernim glukomananom su pripremljene supstitucijom kontrolnog kukuruza u ishranama sa 0.2 % ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom (ĆZKIG). Obezbeđen je slobodan pristup hrani i vodi. Reprezentativni uzorci hrane su uzeti na početku svake faze za neposredne analize i analize mikotoksina. Sadržaj proteina, suve materije i pepela u ishrani određivani su prema Association of Official Analvtical Chemists (1980). Formulacije ishrane i sadržaj hranljivih sastojaka su prikazani u Tabeli 1. Eksperimentalni postupci su odobreni od strane Universitv of Guelph Animal Care Committee praćenjem vodiča Canadian Council on Animal Care.

Izračunate vrednosti

Analizirane vrednosti

Izračunate vrednosti Analizirane vrednosti

[0146]Koncentracije DON, 15-acetil-DON, ZEN, fumonizina i ohratoksina A u ishrani su date u Tabeli 2. Drugi mikotoksini bili su ispod granica detekcije za postupak koje su bile 0.12 mg/kg za nivalenol, 0.05 mg/kg za 3-acetil-DON, 0.07 mg/kg za neosolaniol, 0.06 za diacetoksiscirpenol i T-2 toksin i 0.04 mg/kg za HT-2 toksin, i 0.001 mg/kg za aflatoksine. Granice detekcije za DON, 15-acetil-DON, ZEN, fumonizin i ohratoksin A bile su 0.06, 0.05, 0.025, 0.05 i 0.0003 mg/kg, respektivno.

[0147]Ishrana kontaminiranim zrnima nije značajno uticala na dobitak na telesnoj težini, potrošnju hrane i efikasnost upotrebe hrane na kraju starter faze (Tabela 3). Hranjenje kontaminiranom ishranom značajno je povećalo dobitak na telesnoj težini i poboljšalo je efikasnost ishrane u poređenju sa kontrolom na kraju faze uzgoja. Nije bilo efekta ishrane na na unos hrane u toku faze uzgoja (Tabela 3). Na kraju faze uzgoja, dopunjavanje kontaminirane ishrane ćelijskim zidom kvasca isprepletanog glinom povećalo je dobitak na telesnoj težini, potrošnju hrane i poboljšalo je efikasnost potrošnje hrane u poređenju sa kontrolom. Dobitak na telesnoj težini i efikasnost ishrane tokom eksperimentalnog perioda od 6 nedelja značajno su bili viši kod ptica hranjenih kontaminiranim ishranama i kontaminiranim ishranama dopunjenim ćelijskim zidom kvasca isprepletanim glinom.

[0148]Ishrana kontaminiranim zrnima povećala je (P<0.05) broj eozinofila na nedelji 6 (Tabela 4). Dopuna kontaminiranih ishrana sa ćelijskim zidom kvasca isprepletanim glinom je sprečila ovo. Dopuna kontrolne ishrane ćelijskim zidom kvasca isprepletanim glinom značajno je povećala hematokrit u poređenju sa kontrolom koja nije dopunjena. Postojala je značajna redukcija u koncentraciji glukoze i aktivnosti y-glutamil transferaze kod ptica hranjenih kontaminiranom ishranom tokom nedelje 3 u poređenju sa kontrolom (Tabela 5). Dopuna sa ćelijskim zidom kvasca isprepletanim glinom sprečila je ovo. Dopuna kontaminiranih ishrana ćelijskim zidom kvasca isprepletanim glinom značajno je povećala koncentracije urinske kiseline u poređenju sa kontrolom tokom nedelje 3 i 6. Postojalo je značajno smanjenje u aktivnosti laktat dehidrogenaze tokom nedelje 3 kod ptica hranjenih kontaminiramom ishranom + ćelijskim zidom kvasca isprepletanim glinom u poređenju sa kontrolom.

[0149]Ishrana kontaminiranim zrnima značajno je smanjila aktivnosti laktat dehidrogenaze u toku nedelje 6 u poređenju sa kontrolom (Tabela 5). Dopuna ćelijskim zidom kvasca isprepletanim glinom je sprečila ovo. Postojalo je značajno povećanje u koncentracijama kalcijuma i fosfora kod ptica hranjenih kontaminiranom ishranom i ishranom sa ćelijskim zidom kvasca isprepletanim glinom u poređenju sa kontrolom u toku nedelje 6. Ista ishrana u toku nedelje 6 takođe je značajno smanjila aktivnosti y-glutamil transferaze u poređenju sa kontrolom. Značajno povećanje u koncentracijama ukupnog proteina i globulina, i smanjenje u nivoima holesterola zabeleženi su kod ptica hranjenih kontaminiranom ishranom kada je dopunjena ćelijskim zidom kvasca isprepletanog glinom.

[0150] Hranjenje ćurki zrnima prirodno kontaminiranim saFusariummikotoksinima rezultiralo je u hormetičkom odgovoru u vezi sa dobitkom u telesnoj težini i efikasnosti hranjenja.Fusariummikotoksini iz stočne hrane rezultirali su u nekim efektima na parametre krvi u poređenju sa kontrolama uključujući povećani broj eozionofila i smanjene aktivnosti laktat dehidrogenaze na nedelji 6 i smanjene koncentracije glukoze i aktivnost gama-glutamil transferaze na nedelji 3. Ishrana ćelijskim zidom kvasca isprepletanog glinom sprečila je sve ove efekte. Ishrana ćelijskim zidom kvasca isprepletanim glinom rezultirala je u numeričkim povećanjima (P>0.05) u rastu u poređenju sa ishranom nedopunjenom kontaminiranim zrnima.

Claims

1. Kompozicija koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletan glinom, pri čemu je ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletanog glinom poreklom od ćelije kvasca kultivisane u medijumu za rast koji sadrži glinu, za upotrebu u smanjenju apsorpcije i/ili unosa jednog ili više tipova mikotoksina od strane subjekta preko digestivnog trakta i na taj način sprečavanju bolesti povezanih sa mikotoksinom i patoloških odgovora povezanih sa mikotoksinom kod subjekta.

2. Upotreba kompozicije koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletan glinom, pri čemu ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletan glinom je poreklom od ćelije kvasca kultivisane u medijumu za rast koji sadrži glinu, u organskoj materiji, hrani za životinje ili vodi za uklanjanje ili vezivanje jednog ili više tipova mikotoksina.

3. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili upotrebu prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je glina izabrana od mineralne gline, sintetičke gline koja pripada silikatnoj grupi, zeolita, bentonita, aluminosilikata, montmorilonita, smektita, kaolinita, organske gline ili njihove smeše.

4. Kompozicija za upotrebu prema patentnim zahtevima 1 ili 3 ili upotrebu prema patentnim zahtevima 2 i 3, pri čemu je ekstrakt ćelijskog zida kvasca od kvasca rodaSaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Torulasporaili njihove kombinacije.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3 do 4 ili upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 4, pri čemu su jedan ili više tipova mikotoksina izabrani iz grupe koja se sastoji od aflatoksina, zearalenona, trihotecena, fumonizina, ohratoksina i njihovih kombinacija.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3 do 5 ili upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 5, pri čemu je ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletan glinom pripremljen kultivacijom ćelija kvasca u medijumu ćelijske kulture koji sadrži glinu, pri čemu je količina gline u medijumu ćelijske kulture od 0.125% do 4.0%, inkubacijom kvasca pod uslovima koji omogućavaju rast kvasca i inkorporaciju gline u ćelijske zidove kvasca u toku rasta, liziranje ćelija kvasca isprepretanih glinom i odvajanje ćelijskih zidova kvasca isprepletanih glinom od rastvorljivih intracelularnih komponenti ćelije kvasca.

7. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, ili upotrebu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je količina gline u medijumu ćelijske kulture od 0.5% do 2.0%.

8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3 do 7 ili upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 7 pri čemu je navedena kompozicija za unošenje od strane člana carstva Animalia.

9. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili upotrebu prema patentnom zahtevu 8 koja sadrži 0.0125% do 99.0% prema težini, 0.0125% do 10% prema težini ili 0.0125% do 4.0% prema težini navedene kompozicije koja sadrži ekstrakt ćelijskog zida kvasca isprepletan glinom.

10. Upotreba kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 7 u hrani za životinje koja je formulisana za uklanjanje ili vezivanje jednog ili više tipova mikotoksina.

11. Upotreba kompozicije prema patentnom zahtevu 10, pri čemu je hrana za životinje izabrana iz grupe koja se sastoji od Totalnog mešanog raciona (TMR), krme, peleta, koncentrata, premiksa, koproizvoda, zrna, džibre, melase, vlakna, krmnih biljaka, trave, sena, jezgra, listova, brašna, rastvorljivih materija i suplementa.

12. Ćelija kvasca koja sadrži ćelijski zid kvasca koji sadrži glinu isprepletanu u navedeni ćelijski zid kvasca za upotrebu u smanjenju apsorpcije i/ili unosa jednog ili više tipova mikotoksina od strane subjekta preko digestivnog trakta i na taj način prevenciji bolesti povezanih sa mikotoksinom i patoloških odgovora povezanih sa mikotoksinom kod subjekta.

13. Upotreba ćelije kvasca koja sadrži ćelijski zid kvasca koji sadrži glinu isprepletanu u navedeni ćelijski zid kvasca u hrani za životinje za uklanjanje ili vezivanje jednog ili više tipova mikotoksina.

14. Ćelija kvasca za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 ili upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu ćelija kvasca je kultivisana u medijumu ćelijske kulture koji sadrži glinu.

15. Ćelija kvasca za upotrebu prema patentnim zahtevima 12 ili 14 ili upotrebu prema patentnom zahtevu 13 ili 14, pri čemu, glina je mineralna glina ili sintetička glina koja pripada silikatnoj grupi.

16. Ćelija kvasca za upotrebu prema patentnim zahtevima 12 ili 14 do 15 ili upotrebu prema patentnim zahtevima 13 do 15, pri čemu navedena ćelija kvasca je za unošenje od strane člana carstva Animalia.