RS55413B1 - Bmp-6 antitela - Google Patents

Description

[0001]Ovaj pronalazak odnosi se na oblast medicine. Specifičnije, ovaj pronalazak se odnosi na antitela, ili njihove antigen vezujuće fragmente, koji se vezuju sa humanim BMP-6 i mogu biti korisni za tretiranje anemije ili hronične bolesti (ACD), kao što je anemija kod kancera, ili anemija kod hronične bolesti bubrega (CKD).

[0002]BMP-6 je član familije kostnog morfogenetskog proteina (BMP); postoji više od dvadeset članova u BMP familiji. Članovi BMP familije su ligandi koji iniciraju signalizaciju SMAD puta koji vodi do transkripcione modulacije u ćeliji. Objavljeno je da su BMP-6 ,,knock-out" miševi vijabilni i fertilni, i pokazuju noramlan razvoj kosti i hrskavice, dok ,,knock-out" miševi za blisko srodni BMP-7 uginu nakon rođenja sa oštećenjima bubrega, oka i kosti. Pokazano je da pojedinačni ,,knock-out" bilo BMP-6 ili BMP-7 nemaju izmenjenu kardiogenezu, ali su dvostruki ,,knock-out" BMP-6 i BMP-7 pokazali nekoliko srčanih defekata i zastoja, i embrioni su uginuli usled srčane insuficijencije. Takođe je pokazano daje prisustvo BMP-7 u mišjim modelima važno za prevenciju napredovanja hronične srčane bolesti povezane sa fibrozom. Stoga, pri inhibiciji humanog BMP-6 sa BMP-6 antitelom, unakrsna reaktivnost protiv BMP-7 verovatno nije poželjna.

[0003]Određene hronične bolesti, kao što je rak, bolest burega, i autoimune bolesti, mogu dovesti do ACD kada prekomerno aktivni citokini izazovu disregulaciju homeostaze gvožđa, smanjenje eritropeze i smanjenje životnog veka crvenih krvnih ćelija. Hepcidin je identifikovan kao ključni hormon uključen u homeostazu gvožđa; visoki nivoi hepcidina su povezani sa eritropezom bez gvožđa uočenoj u ACD. Pokazano je da BMP-6 povećava ekspresiju hepcidina.

[0004]WO 2010/056981 opisuje primenu mišjeg antitela stvorenog na humani BMP-6 na miša; smanjenje hepcidina i povećanje gvožđa registrovano je u jednom trenutku nakon trodnevnog režima sa ovim mišjim antitelom, MAB507, koje je bilo komercijalno dostupno od R&D Svstems. Selektivnost prema BPM je takođe opisana, i pokazano je da je primena BMP-6 antitela MAB507 inhibirala BMP-7 na određenim dozama. Međutim, do danas, nijedno antitelo koje cilja BMP-6 nije odobreno za terapeutsku upotrebu.

[0005]Ostaje potreba da se obezbede alternativna BMP-6 antitela. Naročito, ostaje potreba da se obezbede potentna BMP-6 antitela koja su selektivna za BMP-6 u odnosu na druge članove familije, uključujući BMP-7. Takođe ostaje potreba da se obezbede potentna BMP-6 antitela koja su selektivna za BMP-6 u odnosu na druge članove BMP familije, uključujući BMP-7, i proizvode produženi farmakodinamski odgovor. Takođe ostaje potreba da se obezbede potentna BMP-6 antitela koja su selektivna za BMP-6 u odnosu na druge članove BMP familije, uključujući BMP-7, za tretman ACD.

[0006]Shodno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDRs) LCDR1, LCDR2, i LCDR3, i HCVR sadrži CDRs HCDR1, HCDR2, i HCDR3, gde LCDR1 je polipeptid od RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2), LCDR2 je polipeptid od AATNLAD (SEQ ID NO: 3), LCDR3 je polipeptid od QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4), HCDR1 je polipeptid od GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5), HCDR2 je polipeptd od YINPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 6) ili YINPYNRGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7), i HCDR3 je polipetid od RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8).

[0007]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDRs) LCDR1, LCDR2, i LCDR3, i HCVR sadrži CDRs HCDR1, HCDR2, i HCDR3, gde LCDR1 je polipeptid od RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2), LCDR2 je polipeptid od AATNLAD (SEQ ID NO: 3), LCDR3 je polipeptid od QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4), HCDR1 je polipeptid od GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5), HCDR2 je polipeptid od YINPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 6), i HCDR3 je polipeptid od RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8).

[0008]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDRs) LCDR1, LCDR2, i LCDR3, i HCVR sadrži CDRs HCDR1, HCDR2, i HCDR3, gde LCDR1 je polipeptid od RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2), LCDR2 je polipeptid od AATNLAD (SEQ ID NO: 3), LCDR3 je polipeptid od QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4), HCDR1 je polipeptid od GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5),

HCDR2 je polipeptid YINPYNRGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7), i HCDR3 je polipeptid od

RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8).

[0009] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži LCVR i HCVR, gde LCVR je polipeptid od SEQ ID NO: 9, i HCVR je polipeptid SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 11. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži LCVR i HCVR, gde LCVR je polipeptid od SEQ ID NO: 9, i HCVR je polipeptid od SEQ ID NO: 10. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži LCVR i HCVR, gde LCVR je polipeptid od SEQ ID NO: 9, i HCVR je polipeptid SEQ IDNO: 11.

[0010] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži LCVR i HCVR, gde LCVR je polipeptid od SEQ ID NO: 9, i HCVR je polipeptid od SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 11. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži LCVR i HCVR, gde LCVR je polipeptid od SEQ ID NO: 9, i HCVR je polipeptid SEQ ID NO: 10. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži LCVR i HCVR, gde LCVR je polipeptid od SEQ ID NO: 9, i HCVR je polipeptid SEQ ID NO: 11.

[0011] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži laki lanac (LC) i teški lanac (HC), gde LC je polipeptid od SEQ ID NO: 12, i HC je polipeptid od SEQ ID NO: 13 ili SEQ ID NO: 14. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži LC i HC, gde LC je polipeptid od SEQ ID NO: 12, i HC je polipeptid SEQ ID NO: 13. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži LC i HC, gde LC je polipeptid od SEQ ID NO: 12, i HC je polipeptid SEQ ID NO: 14.

[0012] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koje sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, gde svaki laki lanac je polipeptid od SEQ ID NO: 12, i svaki težak lanac je polipeptid od SEQ ID NO: 13. U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, gde svaki laki lanac je polipeptid od SEQ ID NO: 12, i svaki težak lanac je polipeptid od SEQ ID NO: 14.

[0013]Ovaj pronalazak se takođe odnosi na polinukleotide koji kodiraju prethodno opisana antitela, ili njihove antigen vezujuće fragmente, ovog pronalaska koji mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK, gde DNK uključuje cDNK, i sintetičku DNK. DNK može biti dvolančana ili jednolančana. Kodirajuća sekvenca koja kodira antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska može varirati kao rezultat redundantnosti ili degenerisanosti genetičkog koda.

[0014]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje DNK molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 13 ili aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14. U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje DNK molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 12.

[00015]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje DNK molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 13 i sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 12. U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje DNK molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 14 i sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 12.

[0016]Polinukkleotid ovog pronalaska biće eksprimiran u ćeliji domaćinu nakon što su sekvence operabilno povezane sa kontrolnom sekvencom ekspresije. Ekspresioni vektori se tipično mogu replicirati u organizmima domaćinima bilo kao epizomi ili kao integralni deo hromozomske DNK domaćina. Uobičajeno, ekspresioni vektori će sadržati selekcione markere, npr., tetraciklin, neomicin, i dihidrofolat reduktazu, da bi omogućile detekciju onih ćelija transformisanih sa željenim DNK sekvencama.

[0017]Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska može se lako proizvesti u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NS0, HEK293 ili COS ćelije; u bakterijskim ćelijama kao što suE. coli, Bacillus sarbtilis,ihPseudomonas fluorescence;ili u ćelijama gljiva ili kvasaca. Ćelije domaćini su kultivisane korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici.

[0018]Vektori koji sadrže polinukleotidne sekvence od interesa (npr., polipeptide antitela, ili njihove antigen vezujuće fragmente, i kontrolne sekvence ekspresije) mogu se preneti u ćeliju domaćina dobro poznatim postupcima, koji variraju u zavisnosti od ćelije domaćina. Na primer, transformacija sa kalcijum hloridom se obično koristi za prokariotke ćelije, dok se tretman sa kalcijum fosfatom ili elektroporacija mogu koristiti za druge ćelije domaćine.

[0019]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje sisarsku ćeliju koja sadrži molekul DNK ili molekule ovog pronalaska, gde je ćelija sposobna da eksprimira antitelo koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 12. U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje sisarsku ćeliju koja sadrži DNK molekule ovog pronalaska, gde je ćelija sposobna da eksprimira antitelo koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 14, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 12.

[0020]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju antitela ovog pronalaska koja sadrže teški lanac čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 13 i laki lanac čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO 12, koja sadrži kultivaciju sisarske ćelije ovog pronalaska pod takvim uslovima da je antitelo eksprimirano, i rekuperaciju eksprimiranog antitela. U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju antitela ovog pronalaska koje sadrži teški lanac čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 14 i laki lanac čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 12, koja sadrži kultivaciju sisarske ćelije ovog pronalaska pod takvim uslovima daje antitelo eksprimirano, i rekuperaciju eksprimiranog antitela. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo proizvedeno procesom ovog pronalaska.

[0021]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska, i prihvatljivi nosač, razblaživač ili ekscipijent. Specifičnije, kompozicije ovog pronalaska dalje sadrže jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa.

[0022]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje anemije, koji obuhvata primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje anemije, koji obuhvata primenu efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska, gde je anemija anemija hronične bolesti. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje anemije, koji obuhvata primenu efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska, gde je anemija hronične bolesti izabrana iz grupe koja se sastoji od anemije kancera, i anemije hronične bolesti bubrega.

[0023]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje anemije sa nedostatkom gvožđa povezane sa hepcidinom, koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje anemije sa nedostatkom gvožđa povezane sa hepcidinom, koji obuhvata primenu efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska, gde je anemija sa nedostatkom gvožđa povezana sa hepcidinom, izabrana iz grupe koja se sastoji od anemije kod kancera, ili anemije kod hronične bolesti bubrega.

[0024] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje anemije sa nedostatkom gvožđa refraktornom na gvožđe (IRIDA). koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje (IRIDA). koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska, gde je IRIDA izazvana defektom u TMPRSS6 genu.

[0025] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje Sjogrenovog sindroma, koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska.

[0026] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za povećanje nivoa gvožđa u serumu, broja retikulocita, broja crvenih krvnih ćelija, hemoglobina, i/ili hematokrita, koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za povećanje nivoa gvožđa u serumu, koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska. U sledećem primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za povećanje broja retikulocita, koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za povećanje broja crvenih krvnih ćelija, koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za povećanje hemoglobina koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za povećanje hematokrita koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska.

[0027]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska za upotrebu u terapiji. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska za upotrebu u tretmanu anemije. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska za upotrebu u tretmanu anemije hronične bolesti. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska za upotrebu u tretmanu anemije kod kancera ili anemije kod hronične bolesti bubrega.

[0028]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska za upotrebu u tretmanu anemije bez gvožđa povezane sa hepcidinom. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska za upotrebu u tretmanu anemije bez gvožđa povezane sa hepcidinom kod kancera. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment ovog pronalaska za upotrebu u tretmanu anemije bez gvožđa povezane sa hepcidinom kod hronične bolesti bubrega.

[0029]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska, za upotrebu u tretmanu IRIDA. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska za upotrebu u tretmanu IRIDA, gde je IRIDA izazvana defektom u TMPRSS6 genu.

[0030]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska, za upotrebu u tretmanu Sjogrenovog sindroma.

[00311U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela, ili njegovog antigen vezujućeg dela, ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta za tretman anemije. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta za tretman anemije kod hronične bolesti. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta za tretman anemije kod hronične bolesti bubrega. U sledećem primeru

izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta za tretman anemije kod kancera.

[0032]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta za tretman IRIDA. U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela, ili njegovog antigen vezujućeg dela, ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta za IRIDA, gde je IRIDA izazvana defektom u TMPRSS6 genu.

[0033]U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta za tretman Sjorgenovog sindroma. Opšta struktura „antitela" je veoma dobro poznata u tehnici. Za antitelo IgG tipa, postoji četiri aminokiselinska lanca (dva „teška" i dva „laka" lanca) koji su međusobno povezani preko intra- i inter-lančanih disulfidnih veza. Za antitelo, jedan od teških lanaca obrazuje inter-lančanu disulfidnu vezu sa jednim od lakih lanaca, i drugi težak lanaca obrazuje inter-lančanu disulfidnu vezu sa drugim lakim lancem, i jedan od teških lanaca obrazuje dve inter-lančane disulfidne veze sa drugim teškim lancem. Antigen vezujući fragment je fragment antitela, kao što je Fab, Fab', F(ab')2, jednolančani varijabilni fragment (scFv), ili di-scFv.

[0035]Kada su eksprimirana u određenim biološkim sistemima, antitela imaju humane Fc sekvence koje su glikozilovane u Fc regionu. Antitela mogu takođe biti glikozilovana na drugim pozicijama. Stručnjak će proceniti da antitela ovog pronalaska mogu sadržati takvu glikozilaciju. U tipičnom slučaju, glikozilacija se dešava u Fc regionu antitela na visoko konzervisanom mestu N-glikozilacije. N-glikani se tipično vezuju za asparagine. Predviđeno je da Asparagin 295, po sekvencijalnoj numeraciji, bude glikozilaciono mesto za antitela ovog pronalaska. [00361Antitelo ovog pronalaska je inženjeringom dobijeno antitelo koje je dizajnirano da ima okvirne, zglobne regione, i konstantne regione humanog porekla koji su identični sa ili suštinski identični sa okvirnim i konstantnim regionima izvedenim iz sekvenci humanog genoma. Potpuno humani okvirni, zglobni regioni, i konstantni regioni su one sekvence humane klicine linije kao i sekvence gde se prirodno javljaju somatske mutacije i/ili one sa mutacijma dobijenim inženjeringom. Antitela ovog pronalaska mogu sadržati okvirne, zglobne, ili konstantne regione izvedene iz potpuno humanog okvirnog, zglobnog ili konstantnog regiona koji u sebi sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, ili adicija. Dodatno, antitelo ovog pronalaska je suštinski neimunogeno kod ljudi.

[0037]Antitelo I sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, gde se svaki od lakih lanca sastoji od polipeptida od SEQ ID NO: 12, i svaki težak lanac se sastoji od polipeptida od SEQ ID NO: 13. Antitelo TT sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, gde se svaki od lakih lanca sastoji od polipeptida od SEQ ID NO: 12, i svaki težak lanac se sastoji od polipeptida od SEQ ID NO: 14. Naročiti DNK molekul koji kodira svaki od teških lanca Antitela I je SEQ ID NO: 16, i naročiti DNK molekul koji kodira svaki od lakih lanaca Antitela I je SEQ ID NO: 15. Naročiti DNK molekul koji kodira svaki od teških lanaca Antitela II je SEQ ID NO: 17, i naročiti DNK molekul koji kodira svaki od lakih lanaca Antitela II je SEQ ID NO: 15.

[0038]Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska može se proizvesti korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici, npr, rekombinantnim tehnologijama, tehnologijama fagnog prikaza, ili kombinacijom takvih tehnologija ili drugih tehnologija dobro poznatih u tehnici. Postupci za proizvodnju i prečišćavanje antitela su dobro poznati u tehnici i mogu se naći npr. u Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2.

[0039]Anemija CKD je anemija koja je rana i uobičajena komplikacija kod pacijenata koji pate od CKD. Anemija kod kancera je anemija izazvana hematološkim malignitetima i nekim solidnim tumorima; dok, hemoterapijski-indukovana anemija je anemija izazvana tretmanom pacijenata sa kancerom sa hemoterapijskim agensima. Anemija kod CKD pogoršava dijabetičku neuropatiju, kardiovaskularnu bolest, i retinopatiju, između ostalih stanja. Anemija povezana sa kancerom je povezana povećanim relativnim rizikom od smrti. Trenutne opcije tretmana za anemiju povezanu sa kancerom ograničeni su na transfuzije krvi, jer su agensi koji stimulišu eritropoezu indikovani samo za anemiju izazvanu hemoterapijom.

[0040]„Vezuje" kao što je ovde korišćeno u odnosu na afinitet BMP-6 antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, za humani BMP-6, označava, ukoliko nije drugačije naznačeno, KD manju od oko 1 x IO"<8>M, poželjno, manju od oko 1 x 10"<9>M kao što je određeno uobičajenim postupcima poznatim u tehnici, uključujući upotrebom površinske plazmon rezonanace (SPR) biosenzora na 37°C suštinski kao što je ovde opisano. Temin „selektivno" kao što je ovde korišćeno u odnosu na antitelo ovog pronalaska odnosi se na antitelo koje vezuje humani BMP-6 sa KD oko 1000-, 500-, 200-, 100-, 50-, 10-, ili oko 5 puta manje nego što antitelo vezuje najmanje jednog člana BMP familije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, humani BMP-5 ili humani BMP-7, kao što je mereno površinskom plazmon rezonancom na 37°C. Dodatno, ili alternativno, BMP-6 selektivno antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska vezuje humani BMP-6 ali se ne vezuje ili se samo minimalno vezuje za najmanje jedan član humane BMP familije, uključujući, ali se ne ograničavajući na humani BMP-5 ili humani BMP-7, kada je testirano postupcima opisanim u Primerima 2-3 ovde u nastavku.

[0041]„Efikasna količina" označava količinu antitela ovog pronalaska ili farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo ovog pronalaska koja će izazvati biološki ili medicinski odgovor ili željeni terapeutski efekat na tkivo, sistem, životinju, sisara ili čoveka koji traži istraživač, doktor medicine, ili drugo kliničko lice. Kako efikasna količina antitela može varirati u odnosu na faktore kao što je stanje bolesti, starost, pol, i težina individue, i sposobnosti antitela da izazove željeni odgovor kod individue. Efikasna količina je takođe ona u kojoj je bilo koji toksični ili štetni efekat antitela nadjačan terapeutski korisnim efektima.

[0042]Namera je da termini „tretman", „tretirati", „tretiranje", i slično, uključuju usporavanje ili preokretanje napretka poremećaja. Ovi termini takođe uključuju olakšavanje, ublažavanje, eliminisanje ili smanjenje jednog ili više simptoma poremećaja ili stanja, čak iako poremećaj ili stanje nije zaista eliminisano i čak iako sam napredak poremećaja ili stanja nije usporen ili preokrenut. Pacijent se odnosi na sisara, poželjno čoveka sa bolešću, poremećajem ili stanjem koje bi imalo koristi od BMP-6 aktivnosti.

[0043]Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži isto, može se primeniti parenteralnim putem (npr., potkožno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, ili transdermalno). Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ovog pronalaska može se primeniti na pacijenta zasebno ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i/ili razblaživačem u pojedinačnoj ili višestrukim dozama. Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu se pripremiti postupcima dobro poznatim u tehnici (npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacv, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) i sadrže antitelo, kao što je ovde opisano, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača, ili ekscipijenata.

Primer 1: Ekspresija i prečišćavanje antitela

[0044]Polipeptidi varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca, kompletne aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca Antitela I i II, i nukleotidne sekvence koje kodiraju iste, navedene su u nastavku u odeljku pod naslovom „Aminokiselinske i nukleotidne sekvence". Dodatno, CDR polipeptidi lakog lanca i teškog lanca prikazani su u Tabeli 1.

[0045]Antitela, ili njihovi antigen vezujući fragmenti, ovog pronalaska, uključujući, ali se ne ograničavajući na, Antitela I i II, mogu se napraviti i prečistiti kao što sledi. Odgovarajuća ćelija domaćin, kao što je HEK 293 EBNA ili CHO, može se ili prolazno ili stabilno transficirati sa ekspresionim sistemom za sekreciju antitela korišćenjem optimalnog predeterminisanog HC:LC odnosa vektora ili jednog vektorskog sistema koji kodira i HC i LC. Razbistreni medijum, u koji je antitelo izlučeno, može se prečistiti korišćenjem bilo koje od mnogih uobičajeno korišćenih tehnika. Na primer, medijum može biti pogodno primenjen na MabSelect kolonu (GE Healthcare), ili KappaSelect kolonu (GE Healthcare) za Fab fragment, koji je uravnotežen sa kompatibilnim puferom, kao što je fosfatno puferisani fiziološki rastvor (pH 7.4). Kolona se može isprati da bi se uklonile komponente koje se nespecifično vezuju. Vezano antitelo može se eluirati, na primer, sa pH gradijentom (kao što je 20 mM Tris pufer pH 7 do 10 mM natrijum citratni pufer pH 3.0, ili fosfatno puferisani fiziološki rastvor pH 7.4 do 100 mM glicin pufer pH 3.0). Frakcije antitela se mogu detektovati, kao što je sa SDS-PAGE, i zatim mogu biti pulovane. Dalje prečišćavanje je izborno, zavisno od nameravane upotrebe. Antitelo se može koncentrovati i/ili sterilno filtrirati korišćenjem uobičajenih tehnika. Rastvorljivi agregati i multimeri mogu se efikasno ukloniti sa uobičajenim tehnikama, uključujući ekskluzionu, sa hidrofobnom interakcijom, jono-izmenjivačkom, multimodalnom ili hidroksiapatitnom hromatografijom. Čistoća antitela nakon ovih koraka hromatografije je veći od 95%. Proizvod se može neposredno zamrznuti na

-70°C ili može biti liofilizovan.

Primer 2 Kinetikavezivanja,afinitet i specifičnost anti-BMP6 antitela

[0046]Kinetika vezivanja, afinitet, i selektivnost za humani BMP-6, kao i humani BMP-5 i humani BMP-7, za antitela, ili njegove antigen vezujuće fragmente, ovog pronalaska može se odrediti korišćenjem površinske plazmon rezonance (SPR) biosenzora kao što je BIAcore® 2000, BIAcore® 3000, ili BIAcore® TI00 (GE HealthCare) prema postupcima poznatim u tehnici.

[0047]Humani BMP-5, humani BMP-6, humani BMP-7, i MAB507 mogu se kupiti od R&D Svstems (Minneapolis, MN). MAB507 je komercijalno antitelo za koje se tvrdi da je specifično za BMP-6. BMP-6 makaki majmuna i BMP-6 pacova mogu se napraviti korišćenjem standardnih procedura. Imobilizacija liganda na CM4 čipu (BIAcore # BR-1005-34) može se pripremiti korišćenjem EDC/NHS amin kuplujućeg postupka (BIAcore # BR-1000-50). Ukratko, površine sve četiri protočne ćelije mogu se aktivirati injektiranjem 1:1 smeše EDC/NHS 7 minuta na 10 |uL/minuta. Humani BMP-5, BMP -6, i BMP -7 mogu se razblažiti do 1-2 ug/mL u 10 mM acetatnom puferu, pH 4.5, i imobilisati približno 200 rezonantnih jedinica (RU) na protočnoj ćeliji (Fc) 2, 3 ili 4 na stopi protoka od 10 uL/minutu. Fcl može biti prazna. Mesta koja nisu reagovala mogu se blokirati sa 7 minutnom injekcijom etanolamina na 10 |xL/minutu. Injekcije od 3 x 30 sek glicna pH 1.5 na 30 uU/minutu mogu se koristiti da bi se uklonio bilo koji nekovalentno povezani protein. Sva merenja mogu se izvesti na 25 i 37°C. Tekući pufer može biti HBS-EP+ (BIAcore # BR-1006-69). BIAcore T100 Evaluation Software verzija 2.0.3 može se koristiti za analizu.

[0048]Da bi se odredila specifičnost Antitela I i MAB 507 između različitih članova BMP familije, antitela se mogu pripremiti na finalnoj koncentraciji od 1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, i 0 (blank) nM u tekućem puferu HBS-EP+. Svaki ciklus se može sastojati od injekcije razblaženog antitela na 50 uL/minutu sa 300 sekundi preko svih protočnih ćelija, praćeno sa disocijacijom na 50 uL/minutu 1200 sekundi. Površina čipa može se regenerisati injektiranjem 10 Mm glicina pH 1.5 60 sekundi na 50 uU/minutu i HBS-EP pufera 30 sekundi na 30^L/minutu. Podaci sa oduzetom referentnom vrednošću mogu se prikupiti, i stopa asocijacije( kon)i stopa disocijacije( kqff)za svaki ligand se može proceniti korišćenjem 1:1 vezujućeg modela u BIAevaluation analvsis programu. Afinitet (KD) se može izračunati iz kinetike vezivanja prema odnosu KD =k0fjikon.

[0049]U eksperimentima suštinski izvedenim kao što je opisano u Primeru 2, Antitelo I vezuje se za humani BMP-6 sa 0.020 nM afinitetom. Bez detektabilnog vezivanja za humani BMP-5 i humani BMP-7 na 31°C, Antitelo I pokazuje selektivnost za dva člana BMP familije koji su najbliži po homologiji sekvence sa BMP-6.

[0050]R&D antitelo MAB507 vezuje humani BMP-6 sa 1 nM afiniteom, i za razliku od Antitela I, MAB507 ima afinitet od 23 nM prema humanom BMP-7 (Tabela 2). MAB507 nema detektabilnog vezivanja sa humanim BMP-5 na 37°C (Tabela 2).

[0051]Fabs Antitela I i Antitela II vezuju se za humani BMP-6 sa sličnim afinitetima u opsegu od 0.08 - 0.09 nM na 37 °C (Tabela 3). Fab od MAB507, Fab507, vezuje se za humani BMP-6 sa afinitetom od 12.2 nM na 37°C (Tabela 3).

[0052]Fabs Antitela I i II pokazuju 135-150-puta veći afinitet prema humanom BMP-od Fab od MAB507. Antitelo I pokazuje 50-puta veći afinitet prema humanom BMP-6 u poređenju sa MAB507.

[0053]Fab Antitelo I se vezuje za humani, makaki i BMP-6 pacova sa sličnim afinitetima u opsegu od 79.6 do 88.0 pM na 37°C (Tabela 4). Visoki afinitet Antitela I prema BMP-6 makaki majmuna i BMP-6 pacova omogućava da se Antitelo I koristi direktno kod životinjskih modela makaki majmuna i pacova bez potrebe za surogat antitelom.

Primer3: Anti-BMP6 antitela inhibiraju BMP-6 indukciju hepcidin ekspresije

[0054]In vitroćelijski zasnovana inhibicija humanog BMP-6 sa antitelom, ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, ovog pronalaska može se meriti u testu zasnovanom na ćelijama gde BMP-6 indukuje hepcidin ekspresiju.In vitrotest zasnovan na ćelijama može se takođe koristiti za procenu selektivnosti BMP-6 antitela protiv indukcije hepcidina sa drugim BMPs, kao što su BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7, BMP-9, i BMP-10. U prethodno pomenutomin vitrotestu zasnovanom na ćelijama, vezivanje BMP liganada sa BMP responsivnim elementima na hepcidin promotoru indukuje aktivnost luciferaza reportera kod HepPromLuc ćelija. Test je ekstremno osetljiv, i kao takav nije odgovarajuć za pokazivanje koji su članovi BMP familije uključeni u homeostazu gvožđa. Test je efikasan, međutim, za pokazivanje selektivnosti inhibitora protiv različitih članova BMP familije u ćelijskoj sredini.

[0055] HepProm Luc ćelijska linija se može stvoriti stabilnom transfekcijom Hep3B2.1-7 ćelija (ATCC, Manassas, VA, #HB-8064) sa luciferaza reporter vektorom, koji sadrži kloniranu hepcidin promotor DNK sekvencu (HepProm 0.3 + l.Okb). HepProm Luc ćelije se mogu održavati u kompletnom medijumu DMEM/high glucose (Hvclone, Logan, UT, #SH30243.01) plus 5% toplotno inaktivirani FBS (Invitrogen, Grand Island, NY, #10082-147) sa IX MEM NE A A (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 200 ug/ml G418 Sulfate (Invitrogen, Grand Island, NY, #30-234-CI).

[0056] Za test, HepProm Luc ćelije se mogu resuspendovati do 150,000 ćelija/mL u kompletnom medijumu koji ne sadrži antibiotik. 0.1 mL resuspendovanih HepProm Luc ćelija se može dodati u 96-komorne mikrotitarske ploče (Corning, Lowell, MA, #3917) sa 15,000 ćelija/komorici, i ćelije se zatim mogu inkubirati 24 časa na 37°C pod 5% (v/v) CO2. Medijum kulture se zatim može ukloniti i ćelije izgladnjivati u 80 uL OptiMEM I (Invitrogen, Grand Island,NY, #31985) sa 0.1% (w/v) BSA (Invitrogen, Grand Island, NY, #15260) 5 časova na 37°C pod 5% (v/v) C02.

[0057] Ćelijama se može dodati 10 uL BMP6 antitela (10X finalne koncentracije ) u OptiMEM I sa 0.1% (w/v) BSA za finalni dozni opseg od 0.2 nM do 20 nM za BMP-6 indukciju; finalni dozni opseg od 7.8 nM do 1000 nM za BMP-5 i BMP-7 indukciju, i do 1000 nM, pojedinačne doze za BMP-2, BMP-4, BMP-9 i BMP-10 indukciju. Zatim se može dodati 10 |uL BMP liganda (10X finalne koncentracije) za finalnu koncentraciju BMP-2 (3.8nM), BMP-4 (3.8nM), BMP-5 (12.8nM), BMP-6 (3,4 nM), BMP-7 (3,2 nM), BMP-9 (0,8 nM) ili BMP-10 (4.1nM) u svakoj komorici; ćelije se mogu inkubirati 22-24 časa na 37°C pod 5% (v/v) CO2. Medijum kulture se može ukloniti od ćelija, i ćelijama se može dodati 50 uL Glo Lysis Buffer (Promega, Madison, WI, #E2661) i inkubirati na sobnoj temperaturi 5 minuta nakon 2 minuta šejkiranja. Ćelijama se zatim može dodati 50 uL Bright Glo™ Luciferase Reagent (Promega, Madison,WI, #E2620) i inkubirati na sobnoj temperaturi 5 minuta nakon 30 sekundi šejkiranja. Luminescencija se može meriti 1 sek/komorici na Wallac Victor instrumentu.

[0058]Za izračunavanje procenta inhibicije sa BMP-6 antitelom, 0% inhibicija se može postaviti na prosečnoj luminescenciji za BMP ligand tretman bez dodavanja BMP-6 antitela, i 100% inhibicija se može postaviti na prosečnoj luminescenciji za tretman bez BMP liganda bez dodavanja BMP-6 antitela. Može se izvesti analiza fitovanja krive sa tri ili četiri parametra korišćenjem GraphPad Prism programa (San Diego, CA).

[0059]U eksperimentima suštinski izvedenim kao što je opisano u ovom Primeru 3, Antitela I i II potentno inhibiraju BMP-6-indukovanu aktivnost luciferaze hepcidin promotora HepProm Luc ćelija (Tabela 5); ova inhibicija je približno 22-puta potentnija odMAB507.

[0060]Podaci u Tabeli 6 pokazuju da Antitela I i II značajno ne inhibiraju BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7, BMP-9 i BMP-10 indukovanu aktivnost luciferaze hepcidin promotora kad se testiraju na jednoj koncentraciji od 1000 nM u poređenju sa humanom IgGPAA4 kontrolom. Antitela I i II u ovom testu pokazuju selektivnost preko panela testiranih BMPs. MAB507, međutim, ne pokazuje selektivnost za BMP-6, i ima srednju vrednost 54.2% inhibicije na 1000 nM (N=2) protiv BMP-7 u poređenju sa humanom IgGPAA4 kontrolom koja ima srednju vrednost od -1.7% inhibicije na 1000 nM (N=6).

Primer 4: Farma kokinetičke/farmakodi na niske studije BMP-6 antitela nakon jedne

intravenske doze kod mužjaka makaki majmuna

[00611Serumska farmakokinetika/farmakodinamija (PK/PD) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska može se testirati nakon jedne intravenske doze na normalnog mužjaka makaki majmuna. Mužjaci makaki majmuna se mogu injektirati sa jednom intravenskom (IV) bolus dozom antitela u doznoj zapremini od 1 mL/kg. Za uzorke

seruma uzete u različitim vremenskim tačkama, koncentracija gvožđa u serumu, nivo BMP-6 antitela, i nivo hepcidina se može meriti.

[0062]Za farmakokinetiku, serumski hepcidin, i BMP-6 kvantifikaciju, može se sakupiti oko 1.5 mL krvi od svake životinje u epruvetama bez antikoagulanta. Može se dozvoliti da se uzorci zgrušaju pod ambijentalnim uslovima pre centrifugiranja da bi se dobio serum; uzorci se mogu održavati na vlažnom ledu pre skladištenja na oko -70°C. Za analizu kliničke patologije, može se sakupiti oko 0.5 mL krvi u vremenskim tačkama od svake životinje preko femoralne vene u epruvete koje ne sadrže antikoagulant. Krv se može koristiti da bi se merilo gvožđe u serumu, kapacitet vezivanja nezasićenog gvožđa, ukupni kapacitet vezivanja gvožđa, procenat zasićenja gvožđa, i standardna hematološka merenja korišćenjem standardnih postupaka. Koncentracija hepcidina se može meriti kao što je opisano u Murphv et al., Blood, 110(3): 1048 (2007).

[0063]Uzorci seruma se mogu analizirati za koncentracije BMP-6 antitela korišćenjem ELISA ukupnog humanog IgG. BMP-6 antitelo u serumu se mogu vezati za anti-humano kapa laki lanac antitelo obložene komorice 96 komorne mikrotitarske ploče (Nunc Immobilizer Amino Cat. #436006) i detektovano sa anti-humanim IgG4-HRP konjugat antitelom (Southern Biotech, #9200-05). Gornje i donje granice detekcije u testu mogu biti 200 i 10 ng/mL, respektivno. Koncentracija imunoreaktivnog BMP-6 antitela se može odrediti iz standardnih krivih pripremljenih od poznatih količina jedinjenja u serumu pacova korišćenjem 4/5-parameterskog algoritma (StatLIA, version 3.2). Farmakokinetički parametri mogu se izračunati korišćenjem Watson (Version 7.4 Bioanalvtical LIMS) programskog paketa (Thermo Scientific). Izračunati parametri mogu uključiti površinu ispod krive (AUC0-co), očigledni klirens (Cl), i polu-život eliminacije.

[0064]U eksperimentima suštinski izvedenim kao što je opisano u ovom Primeru 4, Studija I ima doze od 0,3, 1,0, 3,0, i 10 mg/kg Antitela I primenjenog kao jedan intravenski bolus. Kontrolni humani IgG4 je doziran na 10 mg/kg. Nosač u Studiji I je fosfatno puferisani fiziološki rastvor (pH 7.4). Podaci za farmakokinetiku, odgovore serumskog gvožđa i serumskog hepcidina nakon primene Antitela I mereni su od svake životinje pre doze (dan-1) i na 1, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 432, 528, i 672 časa nakon doze i na dane studije 36, 43, 50, i 57 za farmakokinetiku, serumski hepcidin, i BMP-6 kvantifikaciju.

[0065]U eksperimentima suštinski izvedenim kao što je opisano u ovom Primeru 4, Studija II ima doze od 0,05, 0,3, i 3.0 mg/kg Antitela I primenjenom kao jedan intravenski bolus. Kontrolni humani IgG4 je doziran na 3 mg/kg. Nosač u Studiji II je fosfatno puferisani fiziološki rastvor (pH 7.4) plus 0.02% Tween80. Podaci za farmakokinetiku, odgovore serumskog gvožđa i serumskog hepcidina nakon primene Antitela I mereni su od svake životinje pre doze (dan-1) i na 1, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 432, 528, 672, 840, 1008, 1176, 1344, 1512, 1680, i 1848 časova nakon doze. [00661U Studijama I i II, maksimalne serum koncentracije (Cmax) Antitela I povećavaju se približno proporcijalno dozi tokom ispitivanih 0.05- do 10-mg/kg. Kod ispitivanih opsega doza, Antitelo I pokazuje nelinearnu farmakokinetiku sa klirensom koji se smanjuje i polu-životom eliminacije koji se povećava sa povećanom dozom. Klirens se smanjuje od~0.57 do~0.17 mL/č/kg u ispitivanom doznom opsegu. Tokom ispitivanog vremena i doznog opsega, polu-život je u opsegu od~58 do~295 časova.

[0067]Farmakodinamski podaci uTabelama 8 i 9 pokazuju daje primena Antitela I povezana sa inicijalnim neposrednim povećanjem serumskog gvožđa sa pikom 24 časa pre vraćanja blizu nivoa bazalne vrednosti (pre doze) na 120-240 časova nakon doziranja. U 3 i 10 mg/kg doznim grupama, serumsko gvožđe se ponovo povećava nakon 240 časova na više dozno zavisan način; uočeno je produženo povećanje serumskog gvožđa do kraja studije.

[0068]Primena Antitela I je takođe povezana sa akutnim smanjenjem serumskog hepcidina koje se dešava već 6 do 12 časova nakon doze. Serum hepcidin se vraća na bazalni nivo na dozno zavisni način u Studiji II, ali ova dozna zavisnost vraćanja hepcidina na bazalni nivo nije tako očigledna u Studiji I. Humano kontrolno IgG4 antitelo u Studiji I pokazuje smanjenje serumskog hepcidina koje nije ponovljeno u Studiji II. Obe studije takođe pokazuju značajne promene u nivoima serumskog gvožđa u prisustvu Antitela T koje nije u korelaciji sa uočenim niskim nivoima serumskog hepcidina.

Farmakokinetičke/farmakodinamske studije HuA507 nakon jedne intravenskedozena

mužjaka makaki majmuna

[0069]U eksperimentu suštinski izvedenom kao što je opisano u ovom Primeru 4, serumska PK/PD HuA507 je testirana nakon jedne intravenske doze na normalnog mužjaka makaki majmuna. HuA507 je himerno antitelo napravljeno zamenom mišjih konstantnih regiona MAB507 antitela od R&D Svstems sa humanom IgG4PAA osnovom. Jedna intravenska bolus 10 mg/kg doza HuA507 antitela ili kontrolni humani IgG4 je dat u zapremini od 1 mL/kg. Nosač u studiji je fosfatno puferisani fiziološki rastvor (pH 7.4). Krv je sakupljena od svake životinje pre doze (Dan 1) i na 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 264, 336, 432, 528, i 624 časova nakon doze za analizu. Sa 10 mg/kg dozom HuA507 antitela, srednja vrednost koncentracije serumskog gvožđa povećava se od oko 150 |wg/ml na pre doze do oko 210 |ug/ml na 12 časova posle doze, ali se zatim spušta nazad do bazalne vrednosti nakon 48 časova. Za razliku od produženog farmakodinamskog efekta za Antitelo I prikazano u ovom Primeru 4, tretman sa HuA507 pokazuje samo kratko, inicijalno povećanje u koncentraciji serumskog gvožđa do 48 časova, ali ne produženi odgovor uočen sa Antitelom I.

Primer5:Efikasnost uACDmodelupacova

[0070]Efikasnost antitela, ili njihovih antigen vezujućih fragmenata, ovog pronalaska može se meriti u ACD modelu pacova. Kod ženki Lewis pacova starih 8 do 10 nedelja inflamacija se može indukovati jednom intraperitonealnom dozom 5 mg/kg ekstrakta ćelijskog zida bakterijske ćelije(Lee Labs, #PG-PS 10S) na dan 0. Bez daljeg tretmana, mogu se uočiti smanjene koncentracije hemoglobina u ovom modelu unutar 10 dana tretmana sa ekstraktom ćelijskog zida. Tretman sa 10 mg/kg antitela ovog pronalaska može se započeti sa IV dozom na dan 8 i kontinuiranim nedeljnim IV dozama antitela. Koncentracije hemoglobina, serumskog gvožđa i hepcidina mogu se meriti i porediti sa vrednostima uočenim sa tretmanom sa HuIgG4 kontrolom.

[0071]Za analizu kliničke patologije, može se sakupiti oko 0.2 mL krvi u vremenskim tačkama od svake životinje preko zasecanja repa u epruvete koje sadrže EDTA. Krv se može koristiti da bi se merilo gvožđe u serumu, kapacitet vezivanja nezasićenog gvožđa, ukupni kapacitet vezivanja gvožđa, procenat zasićenja gvožđa, i standardna hematološka merenja korišćenjem standardnih postupaka. Za sve druge analize, oko 0.75 mL krvi se može sakupiti u vremenskim tačkama od svake životinje preko zasecanja repa u epruvete koje ne sadrže antikoagulant.

[72] U eksperimentu suštinski izvedenom kao što je opisano u ovom Primeru 5, Antitelo I pokazuje produženi farmakodinamski odgovor sa statistički značajno višim hemoglobinom i gvožđem od kontrole sa hIgG4 izotipom na većinu dana do kraja studije na dan 60. U poređenju sa kontrolom, povećanje koncentracije hemoglobina je oko 0.82-1.5 g/dL. Eritrociti u tretiranoj grupi postaju manje mikrocitni i manje hipohromni kada se započene tretman sa Antitelom I. Na osnovu promene u karakteristikama eritrocita, može se zaključiti da se povećanje hemoglobina uočeno u studiji može izvesti iz normalizacije veličine eritrocita i nivoa ćelijskog hemoglobina pre nego povećane proizvodnje crvenih krvnih ćelija.

Claims (16)

1. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se vezuje za humani BMP-6 (SEQ ID NO: 1), koji sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR sadrži regione koji određuju kompelmentarnosti (CDRs) LCDR1, LCDR2, i LCDR3, i HCVR sadrži CDRs HCDR1, HCDR2, i HCDR3, gde LCDR1 je polipeptid od RSSENLYRNLA (SEQ ID NO: 2), LCDR2 je polipeptid od AATNLAD (SEQ ID NO: 3), LCDR3 je polipeptid od QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4), HCDR1 je polipeptid od GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5), HCDR2 je polipeptid od YTNPYNDGTKYNENFKG (SEQ TD NO: 6) ili YINPYNRGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7), i HCDR3 je polipeptid od RPFGNAMDI SEQ ID NO: 8).

2. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, iz Patentnog zahteva 1, gde je LCDR1 polipeptid od RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2), LCDR2 je polipeptid od AATNLAD (SEQ ID NO: 3), LCDR3 je polipeptid od QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4), HCDR1 je polipeptid od GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5), HCDR2 je polipeptid od YINPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 6), i HCDR3 je polipeptid od RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8).

3. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, iz Patentnog zahteva 1, gde je LCDR1 polipeptid od RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2), LCDR2 je polipeptid od AATNLAD (SEQ ID NO: 3), LCDR3 je polipeptid od QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4), HCDR1 je polipeptid od GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5), HCDR2 je polipeptid od YINPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7), i HCDR3 je polipeptid od RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8).

4. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, iz Patentnog zahteva 1, koji sadrži LCVR i HCVR, gde LCVR je polipeptid od SEQ ID NO: 9, i HCVR je polipeptid SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 11.

5. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, iz Patentnog zahteva 4, gde je LCVR polipeptid od SEQ ID NO: 9, i HCVRje polipeptid SEQ ID NO: 10.

6. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, iz Patentnog zahteva 4, gde je LCVR polipeptid od SEQ ID NO: 9, i HCVRje polipeptid SEQ ID NO: 11.

7. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 4, koje sadrži laki lanac (LC) i teški lanac (HC), gde LC je polipeptid od SEQ ID NO: 12, i HC je polipeptid SEQ ID NO: 13 ili SEQ ID NO: 14.

8. Antitelo prema patentnom zahtevu 7, gde je LCVR polipeptid od SEQ ID NO: 12, i HC je polipeptid SEQ ID NO: 13.

9. Antitelo prema patentnom zahtevu 7, gde je LC polipeptid od SEQ ID NO: 12, i HC je polipeptid SEQ ID NO: 14.

10. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1,4, ili 7, koje sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, gde svaki laki lanac je polipeptid od SEQ ID NO: 12, i svaki težak lanac je polipeptid od SEQ ID NO: 13.

11. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1,4, ili 7, koje sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, gde svaki laki lanac je polipeptid od SEQ ID NO: 12, i svaki težak lanac je polipeptid od SEQ ID NO: 14.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, i prihvatljivi nosač, razblaživač ili ekscipijent.

13. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, za upotrebu u terapiji.

14. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, za upotrebu u tretmanu anemije.

15. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde je anemija hronična bolest.

16. Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, gde je anemija hronična bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od anemije kod kancera, i anemija hronične bolesti bubrega.