RS55526B1 - Antigenski gm-csf peptidi i antitela gm-csf - Google Patents

Description

TEHNIČKI PROBLEM

[0001]Ovaj pronalazak se, u načelu, odnosi na polje imunoterapeutika. Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na monoklonalna antitela koja mogu da neutrališu autoimune kancerozne ćelije i inflamatorni odgovor.

STANJE TEHNIKE

[0002]U ovom opisu se navode razne publikacije, uključujući patente, objavljene prijave, tehničke članke i stručne članke.

[0003]Na nekoliko antigena udruženih sa bolesti cilja se primenom terapijskih monoklonalnih antitela (MABs) zbog njihovih jedinstvenih farmakoloških profila. Među tim, sa bolešću povezanim ciljnim antigenima, su CD20, faktor tumorske nekroze alfa (TNF-a), receptori epidermalnog faktora rasta (EGFR), kao i faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga.

[0004]Faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF) prvo je bio otkriven kao protein sposoban da stvara kako granulocitne, tako i kolonije makrofaga iz prekursor ćelija kostne srži miša i, prema tome, i nazvan (Burgess i sar. (1980) Blood 56:947-58). Potonje studije su dokazale ulogu GM-CSF u potenciranju funkcije zrelih makrofaga i granulocita (Handman i Burgess (1979) J. Immunol 122:1134-1137); Hamilton i sar. (1980) J.Cell Phvsiol. 103:435-445; Gamble i sar. Gamble i sar. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8667-8671), ukazujući na ulogu GM-CSF u inflamatornim odgovorima (Hamilton i sar.

(1980) J. Cell Phvsiol. 103:435-445). Tokom proučavanja ovog molekula, postalo je jasno da GM-CSF ima i druge funkcije koje proističu iz sposobnosti da se utiče na svojstva zrelijih mijeloidnih ćelija kao što su granulociti, makrofage i eozinofili. Funkcije GM-CSF su posredovane vezivanjem za CD116, receptor faktora stimulacije kolonije granulocita-makrofaga, poznat još i kao receptor alfa faktora 2 stimulacije kolonija koji vezuje GM-CSF slabim afinitetom. Subjedinica beta, pod nazivom CD131, koju takođe imaju i IL3 i IL5 receptori, nema, sama po sebi, nikakav detektabilan afinitet prema samom GM-CSF, ali je neophodna za vezivanje visokog afiniteta kada je udružena sa subjedinicom alfa i igra fundamentalnu ulogu u transdukciji signala. GM-CSF receptori se nalaze na mijeloidnim progenitorima i zrelim mijeloidnim ćelijama uključujući neutrofile, eozinofile, mononukleusne fagocite i monocite. Osim toga, pokazalo se da su GM-CSF receptorske, a subjedinice prisutne u normalnim, nehematopoetičkim tkivima kao što je ljudska placenta, endotel i oligodendriti centralnog nervnog sistema.

[0005]GM-CSF igra glavnu biološku ulogu u stvaranju granulocita-makrofaga iz ranih progenitora kostne srži koji se nalaze u kostnoj srži. Ono što u početku nije shvaćeno, a otkriveno je kasnije, bila je dodatna fiziološka funkcija GM-CSF u odgovorima domaćina na spoljašnje stimuluse i u zapaljenskim i automunim uslovima. U prvim studijama GM-CSF je prečišćavan iz podloge za kondicioniranje tkiva pluća nakon injekcije lipopolisaharida (LPS) koja je data miševima (Burgess et al. (1977) J. Biol. Chem. 252:1998-2003). Mnogi istraživači smatraju da je GM-CSF jedan od glavnih regulatora broja ćelija u linijama i stanja aktivacije granulocita, makrofaga i eozinofila pod normalnim fiziološkim uslovima. Međutim, pretpostavljalo se i da nenormalna ekspresija GM-CSF može dovesti do izmenjenog imunološkog i zapaljenskog odgovora udružena sa patološkim posledicama. Pre nekoliko godina se smatralo da GM-CSF treba posmatrati kao proinflamatorni citokin (Hamilton et al., 1980, J. Cell Phvsiol. 103:435-445). Osim toga, GM-CSF može igrati izvesnu ulogu u dijatezi brojnih inflamatornih patologija kod ljudi, kao što su reumatoidni artritis, autoimune patologije, zapaljensko oboljenje bubrega i zapaljenski poremećaji pluća kao što su astma i hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP). Zanimljivo je da mišljenje da postoji veza između multiple skleroze i GM-CSF (McOualter et al. (2001) J. Exp. Med., 194:873-881). Najednom eksperimentalnom modelu autoimunog encefalomijelitisa, koji je model multiple skleroze, nađeno je daje GM-CSF uključen u demijelizaciji posredovanoj autoimunim mehanizmima.

[0006]Studije in vivo nakon tretiranja monocita, makrofaga i neutrofila primenom GM-CSF dokazale su da GM-CSF može da aktivira ove tipove ćelija i produži njihovo preživljavanje. Štaviše, izlaganje GM-CSF-u ima za posledicu oslobađanje inflamatornih medijatora iz ovih tipova ćelija, a kasnije studije su pokazale sposobnost tih ćelija da ubijaju određene organizme, pa čak i tumorske ćelije (Hamilton (1993) Immunol. Today 14:18-24; Hamilton,

(1993) Lancet 342:536-539; Takahashi, (1993) Blood 81:357-364). Da bi se videlo da li su studije in vivo ukazivale na ovu ulogu GM-CSF in vivo, on je sistemski primenjen kod glodara. Pokazano je da veštačko povećanje koncentracije GM-CSF u krvi putem intraperitonealne primene ovog proteina stvarno ima za posledicu povećanje broja neutrofila u krvi, kao i peritonealnih makrofaga i da dolazi do povećanog stvaranja i diferencijacije CD5+ makrofaga u peritonealnoj duplji glodara (Metcalf et al., (1987) Exp. Hematol. 15:1-9).

[0007]Takođe je pokazano da GM-CSF može da "pripremi" ćelije za izdržljiv sinergični odgovor na drugi stimulans, kao što je LPS ili interferon gama (Hart et al., 1988, J. Immunol. 141:1516-1521). Miševi se mogu pripremiti kako in vitro, tako i in vivo primenom GM-CSF, tako da proizvode više cirkulatornih proinflamatornih citokina nakon potonje stimulacije primenom LPS ili TNF-alfa.

[0008]U kliničkom okruženju, primena GM-CSF kod pacijenata na peritonealnoj dijalizi dovela je do značajnog angažovanja makrofaga (Selgas et al., 1996, Kidnev Int. 50:2070-2078). Zanimljivo je, kao što je predviđeno na osnovu studija na glodarima, primena GM-CSF u kliničkom okruženju može da dovede do naglašene produkcije inflamatornih citokina i eventualnih nepoželjnih neželjenih efekata. Na primer, kada su pacijenti sa reumatoidnim artritisom lečeni primenom GM-CSF u cilju korekcije nautropenije koja prati Feltijev sindrom, došlo je do pogoršanja artritisa (Hazenberg et al., 1991, Blood 74:2769-2770). U nekom drugom kliničkom okruženju, GM-CSF je, posle hemoterapije karcinoma, pogoršao reumatoidni artritis (de Vries et al., (1991) J. Immunol. 163: 4985-4993). Sistemska primena GM-CSF kod ljudi povećavala je sposobnost izolovanih granulocita da proizvode superoksid i oba su naglašavala citotoksičnost monocita u krvotoku, ali i dovodila do povećanja broja monocita (Perkins et al., 1993, Am J. Hematol. 43:279-285). Nenormalna ekspresija GM-CSF udružena je kod ljudi sa oboljenjem pluća. Na primer, čini se da regulacija naviše GM-CSF u plućima pomoću manjih iritanata, endotoksina ili infekcije predstavlja predispoziciju za TH2 imunološku devijaciju i astmu (Eisenbarth et al. (2002) J. Exp. Med. 196:1645-1651). Gore pomenute studije ukazuju na to da GMCSF ima ulogu u aktivaciji zapaljenskog procesa angažovanjem ćelija, produženim preživljavanjem ćelija, odnosno, pripremom za aktivaciju.

[0009]Neki eksperimentalni podaci ukazuju na ulogu GM-CSF kod astme. Primena neutrališućih antitela na modelu astme kod miša pokazala je njihovu sposobnost u potiskivanju fenotipova astme (Yamashita (2002) Cell Immunol. 219:92), dok su neke studije merenja citokina u BAL astmatičnih pacijenata otkrile povećanje GM-CSF (Gajevvska (2003) Curr Drug Targets Inflamm Allergv 2:279).

[0010]Reumatoidni artritis (RA) je hronično inflamatorno autoimuno oboljenje za koje postoje brojni dokazi da u njega može biti uključen GM-CSF. GM-CSF je pronađen u povišenim koncentracijama u RA promenama (Xu et al. (1989) J. Clin. Invest. 83:876), a in vitro ga proizvode rezidentne ćelije zglobova (hondrociti i sinovijalni fibroblasti) nakon njihove stimulacije inflamatornim citokinima kao što su IL-1 i TNF-alfa (Leizer et al. (1990) Blood 76:1989). Kolagenom indukovani artritis (CIA) kod miša je autoimuni model RA koji zavisi i od humoralnog i ćelijskog imunološkog odgovora na kolagen tipa II (ClI) (Seki et al.

(1988) J. Immunol. 140,1477). Istorijski, ovaj fenotip RA ograničen je na sojeve miševa koji nose H-2q ili H-2r haplotip, a genetski se manifestuje kod miševa DBA/1 (Wooley (1988) Methods Enzvmol. 162:361). Jedna serija studija je sprovedena na transgeničnim miševima koji su bili homozigotni nula u pogledu mišjeg GM-CSF lokusa (Stanlev et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5592). Zanimljivo je da su miševi, kojima nedostaje CSF, rezistentni na indukciju kolagen-indukovanog artritisa za razliku od njihove kontrole divljeg tipa (miševi suprotnog pola sa kojima imaju potomstvo) (Campbell et al. (1998) J. Immunol. 161:3639-3644).

[0011]Dalje, značajno je i to što miševi sa GM-CSF nula imaju poremećaj izbacivanja surfaktanta, što dovodi do mišje plućne alveolarne proteinoze (PAP), što veoma liči na to stanje kod ljudi, kao što je opisano u ovom tekstu. Štaviše, taj PAP fenotip se može korigovati nadoknadom GM-CSF gena specifičnog za pluća (Zsengaller et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:2101-2109), aerosolizacijom GM-CSF ili transplantacijom kostne srži radi ponovnog hematopoetičkog uspostavljanja (Reed et al. (1999) Am. J. Phvsiol. 276:L556-L563; Nishinakamura et al. (1996) J. Exp. Med. 183:2657-2662).

[0012]Plućna anveolarna proteinoza kod odraslih ljudi (PAP) je retko oboljenje koje se odlikuje akumulacijom fosfolipida i surfaktant proteina u alveolama. Pretpostavlja se da PAP nastaje zbog nesposobnosti alveolarnih makrofaga i epitelnih ćelija tipa II da izbace višak surfaktanta (Mazzone et. al. (2001) Clev. Clin. J. Med.68:977-992). Za dijagnostikovanje PAP obično je potrebna otvorena biopsija pluća, a standardna terapija ove bolesti je fizičko uklanjanje nagomilanog surfaktanta lavažom celih pluća (Shah et al. (2000) Thorax 55:67-77). Osim toga, pacijenti koji imaju PAP imaju u krvotoku neutrališuća antitela za GM-CSF, što ukazuje na citokine kao uzrok bolesti. Ne zna se da li je ovaj autoimuni odgovor specifičan za GM-CSF. Međutim, pokazano je na jednoj grupi PAP pacijenata da dolazi do poboljšanja nakon GM-CSF terapije, što ide u prilog pretpostavci da odsustvo GM-CSF, bilo usled poremećaja gena ili neutralizacije posredovane antitelima, dovodi do nastanka PAP.

[0013]Postoje i dokazi u prilog uloge GM-CSF kod karcinoma. Na primer, GM-CSF ima izvesnu ulogu u genezi i progresiji leukemije, na primer juvenilne mijelomonocitne leukemije (JMML); Emanuel PD (2004) Curr. Hematol. Rep. 3:203-209). Ovu leukemiju (JMML) odlikuje poremećaj normalne hematopoeze, dovodeći do prekomerne, neodgovarajuće proliferacije nezrelih mijeloidnih ćelija u kostnoj srži. Ove proliferativne hematopoetičke kancerozne ćelije mogu da metastaziraju u slezinu i jetru. Pacijenti sa JMML su preosetljivi na GM-CSF i kod njih se javljaju patogene osobine slične onima kod transgeničnih miševa kod kojih postoji prekomerna ekspresija GM-CSF (Lang et al. (1987) 51:675-86). Osim toga, pokazano je da GM-CSF stimuliše rast JMML ćelija i preživljavanje (Emanuel et al. (1991) Blood 77:925-9). Kod transgeničnih miševa sa JMML, pokazano je da se blokadom GM-CSF smanjuje JMML ćelijsko opterećenje u kostnoj srži, krvi i slezini (Iversen et al. (1997) Blood, 90:4910-7).

[0014]Na osnovu mišjih modela bolesti, koji nemaju GM-CSF, kao i ljudskih bolesti kao što je PAP, gde se antitela stvaraju u sistemskom krvotoku u GM-CSF, jasno je da je ovaj citokin važan medijator patologije. Prema tome, pristup ka razvijanju leka koji se može suprotstaviti aktivnosti GM-CSF, bilo stvaranjem antitela na ovaj citokin ili blokadom receptora GM-CSF receptor, može biti važan za lečenje ljudi. Generisana su neka poliklonalna i monoklonalna antitela na rekombinantni molekul GM-CSF. Na primer, Beffy i sar. ((1994), Hvbridoma 13:457-468), su stvorili poliklonalna antitela na rekombinantni humani GM-CSF kod belih novozelandskih kunića, a monoklonalna antitela kod Balb/c miševa. Ova antitela kod kunića i neka mišja monoklonalna antitela bila su sposobna da neutrališu aktivnost GM-CSF u jednoj in vitro probi ćelijske proliferacije primenom M07e ćelija. U kasnijim studijama, Nice i sar. (1990, Growth Factors 3,159-169) epitopom su mapirali mesto vezivanja jednog neutrališućeg mišjeg antitela protiv GM-CS, LMM102. Dobro definisani epitop je omeđen stvaranjem jedne serije produkata digestije iz rekombinantnog humanog GM-CSF primenom reverzno-faznog HPLC frakcionisanja u cilju odvajanja fragmenata, nakon čega je urađena digestija S. aureus V8 tipičnih fragmenata radi definisanja proizvoda koji sadrži dva peptida vezana disulfidnom vezom. Dempsey et al.

(1990, Hybridoma 9,545-558) su stvorili tri mišja antitela protiv humanog GM-CSF u in vitro eksperimentalnom sistemu primenom EC50 u opsegu od 0,1 do 1,7 nanomola. Ova antitela nisu reagovala sa mišjim GM-CSF ili drugim srodnim citokinima. Sva gore opisana antitela su korisni reagensi za detekciju GM-CSF u ljudskom serumu, kao i za in vitro probe inhibicije GM-CSF signalizacije. Međutim, sva ova antitela imaju malu terapijsku vrednost zbog činjenice da potiču iz sistema miša ili kunića. Bilo je pokušaja stvaranja himeričnih antitela od mišjih delova supkloniranjem varijabilnog domena iz mišjeg anti-GM-CSF antitela u kičmu čoveka. Ova strategija je dovela do nastanka himeričnog antitela koje može da neutrališe GM-CSF in vitro i može biti korisno kao terapijsko sredstvo (WO 03/068924 A2).

[0015]Jedan važan aspekt terapijskog antitela je njegova sposobnost da ispoljava imunološko dejstvo kao što je ćelijska toksičnost koja zavisi od antitela (ADCC). MAbs kunića, na primer, su pokazali da slabo posreduju u funkcijama efektora kod ljudi zbog sekvencijalnih razlika u Fc regiji i, prema tome, himerizacija ili humanizacija su potrebne da bi se dobila optimalna farmakološka svojstva. Osim toga, MAbs sa potpuno humanom sekvencom ne moraju da podrže ADCC ako su nastali u ne-humanim ćelijama koje mogu da promene nativan model glikozilacije MAb-a (Shinkavva et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466-73).

[0016]U svetlu ovih činjenica, preferira se proizvodnja terapijskih antitela od strane humanih B-ćelija. O metodama stvaranja hibridoma koji luče humana MAb već je prethodno pisano (VVO2004/046330). Terapijska MAb koja stvaraju ljudske B ćelije mogu da vrše funkcije humanog efektora i imaju veoma ograničenu imunogenost zbog svoje nativne humane strukture. Stvaranje hibridoma ili limfoblastoidnih linija transformisanih od strane Epštajn-Bar virusa (EBV), koje potiču od ljudskih B ćelija, već je ranije prijavljeno (Kirman et al. (2002) Hybrid Hybridomics 21:405-14; Boerner et al. (1991) J. Immunol. 147:86-95; Zafiropoulos et al. (1997) J. Immunol. Methods 200:181-90); međutim, informacije o karakterizaciji ovih antitela i linija u pogledu njihove dugoročne stabilnosti, pogodnosti za proizvodnju, kao i farmakoloških svojstava tih antitela, veoma su ograničene (van Dijk et al. (2001) Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-74).

[0017]Zato postoji potreba za terapijskim humanim antitelima za lečenje upala usled infekcija, inflamatornim bolestima, autoimunim poremećajima i drugim oboljenjima kao što je karcinom. Dalje, želi se da takva antitela ispoljavaju funkcije imunološkog efektora, kao i da se dobro podnose kod ljudi. Sadašnji pronalazak usmerava se na te i druge potrebe.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

[0018]U prvom aspektu, sadašnji pronalazak obezbeđuje rekombinantno eksprimovano humano monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za GMCSF, pri čemu rečeno antitelo sadrži težak lanac koji se sastoji od CDR1 SEQ ID NO:40, CDR2 SEQ ID NO:41, i CDR3 SEQ ID NO:42 i laki lanac koji se sastoji od CDR1 SEQ ID NO:43, CDR2 SEQ ID NO:44, kao i CDR3 SEQ ID NO:45, pri čemu afinitet vezivanja rečenog antitela za humani GM-CSF ima konstantu disocijacije (KD) nižu od 1x10-10 M. U drugom aspektu, sadašnji pronalazak obezbeđuje formulaciju koja se sastoji od antitela ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljivog kurira.

[0019]U trećem aspektu, sadašnji pronalazak obezbeđuje antitelo ili formulaciju pronalaska za primenu u lečenju GM-CSF posredovanog inflamatornog oboljenja, karcinoma ili neke infektivne bolesti.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0020]Sledeći crteži se odnose na različita antitela. Da ne bi bilo sumnje, antitelo iz pronalaska je antitelo obuhvaćeno zahtevima, a druga antitela koja se pominju na crtežima su za potrebe poređenja i nisu deo pronalaska.

Slika 1 ilustruje antigen panel ELISA za selekciju antigen-specifinih humanih MAb. Tri GM-CSF-specifična humana MAB (E5,G7,E10), reagovala su sa humanim GM-CSF i ni sa jednim drugim antigenom sa panela. Antitelo 215 je mišje MAb koje se vezuje za humani GM-CSF (hGM-CSF) i mišji GM-CSF (mGM-CSF).

Slike 2A i 2B ilustruju visoku specifičnost humanih MAbs prema nativnom humanom GM-CSF. Kao što je prikazano na slici 2A, rastvorljivi humani GM-CSF se vezivao za ćelije mišjeg hibridoma i prezentujući imunoglobulin na površini ćelije (Ig) humanom GM-CSF. MAb E5 je kasnije dodat u reakciju, a njegovo vezivanje za humani GM-CSF mereno je primenom FITC-konjugovanog kozjeg anti-humanog Ig. E5 nije vezivao nijedan površinski protein eksprimovan ćelijama mišjeg hibridoma (srednji panel), već je vezivao samo rastvorljivi GM-CSF uhvaćen od strane Ig na površini ćelije (donji panel). Kao što je prikazano na slici 2B, fikoeritrinon (PE)-obojeni humani GM-CSF (PE-GM) može da izreaguje do Ig eksprimovanom na površini ćelije E10. Višak neobeleženog GM-CSF (donji panel) takmičio se za vezivanje za PE-G. Slika 3 pokazuje sekreciju antigen-vezujućeg IgG od strane ćelija hibridoma promenjene klase. Ćelije hibridoma E5 (roditelja) bile su tretirane kao što je opisano u „Materijali i metode". Klonovi hibridoma koji su promenili klasu (zamenjeni) identifikovani su pomoću skrining ELISPOT. ELISA je primenjena za merenje specifičnog vezivanja za humani GMCSF koji je nanesen na ploče radi procene vezivanja bilo IgM ili IgG. Zamenjeno IgG MAb je ispoljilo komparativno vezivanje za antigen kao roditeljski IgM. Slika 4 pokazuje GM-CSF-zavisnu inhibiciju rasta TF-1 ćelijske linije sa potpuno humanim MAb. Humani GM-CSF-zavisna humana ćelijska linija eritroleukemije TF-1 (ATCC, VA) gajena je u kompletnoj RPMI 1640 podlozi koja sadrži 10 ng/mL rekombinantnog humanog GM-CSF (PeproTech, NJ). Dan pre eksperimenta, TF-1 ćelije su gajene u 0,1% FBS u odsustvu GM-CSF. Izgladnele TF-1 ćelije su skinute i dva puta oprane eksperimentalnom podlogom (čista RPMI podloga sa 0,5% BSA). Ćelije su resuspendovane u eksperimentalnoj podlozi i zasejane na mikroploče sa 96 otvora u koncentraciji 10,000 ćelija/otvoru. U otvorima se nalazila ili eksperimentalna podloga, 100 pg/mL GM-CSF, ili GM-CSF prethodno inkubiran 1 sat sa ispitivanim ili izotop kontrolnim Ig u koncentracijama navedenim na slici. Posle 3 dana, 40 pL Cell Titer reagensa (Promega, Wl) je dodato u svaki otvor i ploče dalje inkubirane na 37°C tokom 1 sata. Optička gustina (O.D.) je merena spektrofotometrijski na 490 nm i pozadina podloge je oduzeta od uzoraka. Procenat neutralizacije GM-CSF izračunat je na sledeći način: 100 - [O.D. sa Ig / O.D. bez lg)x 100]. Slika 5A ilustruje rezultate ELISA testa koji pokazuju da svi ispitani E5-3D2 supklonovi luče visoke koncentracije Ig. Hibridomska E5-3D2 linija je gajena tokom 60 generacija, posle čega je procenjivana stabilnost produkcije analizom učestalosti proizvodnje ćelija. Supklonovi (X1-X10) nastali iz 3D2 ćelija kroz ograničena razblaženja bili su nasumično izabrani i njihova produkcija Ig merena ELISA testom. Apsorbancija na 405 nm je bila normalizovana za veličinu kolonije koja je određivana vizuelnim pregledom otvora sa ćelijama. Slika 5B pokazuje da je specifična produktivnost izmerena tokom log faze bila 24 pg/ćeliji/dan posle zasejavanja 3D2 ćelija u bioreaktor sa mešalicom u kome se nalazio 1 litar podloge bez seruma, a produkcija Ig i broj živih ćelija praćeni su svakodnevno od 1. do 5. dana. Slika 6A prikazuje rezultate primera jedne nukleotidne delecije u BAT markeru koji se nalazi u ćelijama hibridomu E5 tretiranim inhibitorima popravke koji se nisu poklapali. Tačkaste linije koje presecaju centralni pik na histogramu predstavljaju veličinu fragment divljeg tipa (wt) ili kontrahovan fragment (-1 nt). Na slici 6B, roditeljske i smaknute ćelije koje inhibišu popravku bile su zasejane na mikro ploče tako da daju prinos od 3,763, odnosno, 2,437 Ig-sekretornih klonova (O.D. >0.2). Koncentracija Ig je određivana ELISA testom, a frekvencija klonova sa O.D. vrednostima višim od 1 bila je beležena i izražena u procentima ukupnog broja klonova koji su prošli skrining. Slika 7 daje šemu toka u vidu dijagrama koja opisuje svaki korak stvaranja potpuno humane ćelijske linije hibridoma. Slika 8 ilustruje ELISA antigen panel za selekciju antigen-specifičnih humanih MAb. Tri GM-CSF specifičnih huMAb, E10, G9, kao i E5 (nije opisan), reagovala su sa humanim GM-CSF i ni sa jednim drugim antigenom na panelu. Efikasna antigenska obloga optimizovana je primenom specifičnih MAb na različite antigene radi veće osetljivosti probe. 615 i 215 su dva anti-humana GM-CSF mišja MAb. Slika 9 pokazuje određivanje izotopa MAb E10. Da bi se odredio izotop E10, vršena je standardna analiza primenom anti-humanih IgG, lgG1, lgG2, lgG3, IgM, Lk, i LA Fc specifičnih antitela u cilju dobijanja izotopa. Slika 10 prikazuje VVestern analizu sa E10 i G9 MAb. VVestern blot analize su vršene sa E10 i G9 da bi se videlo da li će antitela unakrsno reagovati sa humanim rekombinantnim GM-CSF. mAb215 je mišji anti-humani GM-CSF koji neutrališe monoklonalno antitelo kao pozitivna kontrola, traka 1: opterećenje lizatom tumorskih ćelija kao negativna proteinska kontrola, traka 2: opterećenje sa 500ng rh GM-CSF (PeProTech, NJ USA). Kao što je prikazano na slici 5, E10 i G9 su reagovali sa humanim GM-CSF. Slika 11 pokazuje analizu E10 metodom BIACORE. E10.20 je imalo konstantu stepena asocijacije (ka) = 2,47 x 104, konstantu stepena disocijacije (kd) = 2.,6 x 10-5 i ukupan afinitet (KD) od 0,87 nM. Slika 12 prikazuje određivanje izotopa MAb G9. Da bi se odredio izotop G9, urađena je standardna analiza primenom anti-humanih IgG, lgG1, lgG2, lgG3, IgM, Lk, i LA specifičnih antitela u cilju dobijanja izotopa (u dvostrukim uzorcima, slika 3). Slika 13 prikazuje analizu G9 primenom BIACORE. 10G9.1 je imalo konstantu stepena asocijacije (ka) = 8,47 x 106, konstantu stepena disocijacije (kd) = 9,27 x 10-5 i ukupan afinitet (KD) od 0,87 nM. Slika 14 ilustruje strategiju mapiranja epitopa G9. Preklapajući peptidi korišćeni za mapiranje G9 epitop-vezujuće lokacije odgovaraju sekvenci amino kiselina SEQ ID br.: 35-38, kao i 64-85.

Slika 15 prikazuje analizu mapiranja epitopa G9 primenom VVestern blot analize sa preklapajućim peptidima koji obuhvataju humanu GM-CSF proteinsku sekvencu koja odgovara sekvencama amino kiselina SEQ ID br.: 35-38 i 65-86. Peptidi pozitivni na antitelo uključuju SEQ ID br.: 35-38.

DETALJNI OPIS ILUSTRATIVNIH OSTVARENJA

[0021]Termini kojima se opisuju aspekti sadašnjeg pronalaska su različiti i koriste se u opisu i zahtevima. Tim terminima treba dati obično značenje u struci, osim ako je drugačije navedeno. Druge, konkretno definisane termine treba tumačiti na način dosledan ovde datoj definiciji.

[0022]Treba shvatiti da ovaj pronalazak nije ograničen na konkretne reagense, jedinjenja, formulacije ili biološke sisteme, koji, naravno, mogu varirati. Takođe treba shvatiti da je terminologija ovde upotrebljena samo sa namerom da se opišu konkretni predmeti patenta i nije ograničavajuća. U ovom opisu, kao i u priloženim zahtevima, oblici jednine „neki", „jedan" i „ovaj", podrazumevaju i množinu, osim ako se iz sadržaja jasno ne vidi drugačije. Tako, na primer, „ćelija" uključuje kombinaciju dve ili više ćelije i slično.

[0023]Svaki ovde navedeni opseg uključuje sve kombinacije i podkombinacije opsega, kao i konkretne brojeve koji su ovde navedeni.

[0024]Termin "oko", kada se odnosi na neku merljivu vrednost kao što je količina, vremensko trajanje i slično, obuhvata varijacije ±20% ili ±10%, poželjnije ±5%, čak poželjnije ±1%,a još poželjnije ±0,1% definisane vrednosti, jer su te varijacije odgovarajuće za sprovođenje metoda koje se ovde otkrivaju.

[0025]"Infektivna bolest" uključuje, između ostalog, infekciju patogenom, virusom, bakterijom, gljivicom ili parazitom. Na primer, virusi uključuju, između ostalog, težak akutni respiratorni sindrom (SARS koga izaziva SARS-udruženi korona virus), hepatitis tip B ili tip C, upalu pluća, varičelu, adenovirus, herpes simpleks virus tip I ili tip II, goveđu kugu, rinovirus, ehovirus, rotavirus, sincicijalni virus pluća, papiloma virus, papova virus, citomegalovirus, ehinovirus, arbovirus, hantavirus, koksaki virus, virus zaušaka, virus ovčjih boginja, rubeola virus, polio virus, kao i virus nedostatka imuniteta kod čoveka (HIV) tip I ili tip II. Primeri bakterija su, između ostalog, Ebola, Staphvlococcus A-E, Plasmodium (malarija), M. tuberculosis, mvcobacterium, mvcoplasma, neisseria i legionella. Primeri parazita su, između ostalog, rickettsia i chlamvdia.

[0026]"Inflamatorne bolesti" uključuju, između ostalog, akutne i hronične imunološke patologije, kao što su, između ostalog, reumatoidni artritis, autoimuno oboljenje, inflamatorno oboljenje bubrega i inflamatorne poremećaje pluća kao što su astma i hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP), multiplu sklerozu i autoimuni encefalomijelitis.

[0027]"Autoimuno oboljenje" je oboljenje ili poremećaj koji proističe iz sopstvenog tkiva osobe ili je usmereno na njega, predstavlja njegovu kosegregaciju ili manifestaciju ili njihovo posledično stanje. Primeri autoimunih bolesti su, između ostalog, artritis (reumatoidni artritis kao što su akutni artritis, hronični reumatoidni artritis, giht ili gihtom izazvan artritis, akutni giht artritis, akutni imunološki artritis, hronični inflamatorni artritis, degenerativni artritis, kolagenom izazvan artritis tip II, infektivni artritis, Lajmov artritis, proliterativni artritis, psorijatički artritis, Stillova bolest, vertebralni artritis, kao i juvenilni reumatoidni artritis, osteoartritis, progresivni hronični artritis, deformišući artritis, primarni hronični poliartritis, reaktivni artritis i ankilozirajući spondilitis), inflamatorno hiperproliferativno oboljenje kože, psorijaza kao što je plak psorijaza, gutanta psorijaza, pustularna psorijaza i psorijaza noktiju, atopija koja uključuje atopične bolesti kao što je polenska groznica i Jobov sindrom, dermatitis uključujući kontaktni dermatitis, hronični kontaktni dermatitis, eksfolijativni dermatitis, alergijski dermatitis, alergijski kontaktni dermatitis, dermatitis herpetiformis, numularni dermatitis, seboreični dermatitis, nespecifični dermatitis, primarni iritantni kontaktni dermatitis, kao i atopični dermatitis, x-link hiper IgM sindrom, alergijska intraokularna inflamatorna oboljenja, urtikarija kao što je hronična alergijska urtikarija i hronična idiopatska urtikarija, uključujući hroničnu autoimunu urtikariju, miozitis, polimiozitis/dermatomiozitis, juvenilni dermatomiozitis, toksičnu epidermalnu nekrolizu, sklerodermu (uključujući sistemsku sklerodermu), sklerozu kao što je sistemska skleroza, multipla skleroza (MS) kao što je spino-optička MS, primarna progresivna MS (PPMS) i recidivalna remitujuća MS (RRMS), progresivna sistemska skleroza, ateroskleroza, arterioskleroza, skleroza diseminata, ataksična skleroza, optički neuromijelitis (NMO), inflamatorno oboljenje creva (IBD) (na primer, Kronova bolest, autoimuno-posredovane gastrointestinalne bolesti, kolitis, kao što je ulcerativni kolitis, ulcerozni kolitis, mikroskopski kolitis, kolagenozni kolitis, polipozni kolitis, nekrotizirajući enterokolitis, kao i transmuralni kolitis, i autoimuna inflamatorna bolest crevae), upala creva, pioderma gangrenozum, nodozni eritem, primarni sklerotišući holangitis, respiratorni distres sindrom, uključujući adultni ili akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), meningitis, upalu cele ili dela uvee, iritis, horoiditis, autoimuni hematološki poremećaj, reumatoidni spondilitis, reumatoidni sinovitis, nasledni angioedem, oštećenje kranijalnog nerva kao kod meningitisa, herpes gestationis, pemphigoid gestationis, svrab mošnica, autoimunu prevremenu insuficijenciju jajnika, iznenadni gubitak sluha usled nekog autoimunog stanja, IgE-posredovane bolesti kao što je anafilaksa i alergijski i atopični rinitis, encephalitis kao što je Rasmussenov encefalitis i limbički, odnosno encefalitis moždanog stabla, uveitis kao što je anteriorni uveitis, akutni anteriorni uveitis, granulomatozni uveitis, negranulomatozni uveitis, fakoantigeni uveitis, posteriorni uveitis, ili autoimuni uveitis, glomerulonefritis (GN) sa nefrotičkim sindromom ili bez njega, kao što je hronični ili akutni glomerulonefritis kao što je primarni GN, imunološki-posredovan GN, membranozni GN (membranozna nefropatija), idiopatski membranozni GN ili idiopatska membranozna nefropatija, membrano- ili membranozni proliferativni GN (MPGN), uključujući tip I i tip II, kao i brzonapredujući GN, prol iterativni nefritis, autoimuna poliglandularna endokrina insuficijencija, balanitis uključujući balanitis circumscripta plasmacellularis, balanopostitis, ervthema annulare centrifugum, ervthema dvschromicum perstans, evthema multiform, granuloma annulare, lichen nitidus, lichen sclerosus et atrophicus, lichen simplex chronicus, lichen spinulosus, lichen planus, lamellar ichthvosis, epidermolvtic hvperkeratosis, premalignu keratozu, pioderma gangrenozum, alergijska stanja i odgovore, alergijske reakcije, ekcem uključujući alergijski ili atopični ekcem, asteatotski ekcem, dihidrotički ekcem, kao i vezikularni palmoplantarni ekcem, astmu kao što je bronhijalna astma, autoimuna astma, stanja sa infiltracijom T ćelija i hronične inflamatorne odgovore, imunološke reakcije na strane antigene kao što su fetalne krvne grupe A-B--0 tokom trudnoće, hronična upala pluća, autoimuni miokarditis, nedostatak adhezije leukocita, lupus uključujući lupus nefritis, lupus cerebritis, lupus kod dece, nebubrežni lupus, ekstrabubrežni lupus, diskoidni lupus i diskoidni lupus ervthematosus, alopecia lupus, sistemski lupus ervthematosus (SLE) kao što je kožni SLE ili subakutni kožni SLE, neonatalni lupus sindrom (NLE), kao i lupus ervthematosus disseminatus, juvenilni (Tip I) diabetes mellitus uključujući insulin-zavisni diabetes mellitus kod dece (IDDM), diabetes mellitus kod odraslih (Tip II dijabetes), autoimuni dijabetes, idiopatski diabetes insipidus, dijabetička retinopatija, dijabetička nefropatija, dijabetički poremećaj velikih arterija, imunološke odgovore udružene sa akutnom o odloženom preosetljivošću posredovanom citokinima i T-limfocitima, tuberkulozu, sarkoidozu, granulomatozu uključujući limfomatoidnu granulomatozu, VVegenerovu granulomatzu, agranulocitozu, vaskulitides uključujući vaskulitis, vaskulitis velikih krvnih sudova (uključujući polimijalgiju rheumatica i arteritis velikih ćelija (Takavasujev)), vaskulitis krvnih sudova srednje veličine (uključujući Kavvasakijevu bolest i polvarteritis nodosa/periarteritis nodosa), mikroskopski poliarteritis, imunovaskulitis, CNS vaskulitis, kožni vaskulitis, vaskulitis usled preosetljivosti, nekrotizujući vaskulitis kao što je sistemski nekrotizujući vaskulitis, kao i ANCA-udružen vaskulitis, kao što je Churg-Straussov vaskulitis ili sindrom (CSS) i ANCA-udružen vaskulitis malih krvnih sudova, temporalni arteritis, aplastična anemija, autoimuna aplastična anemija, Coombsova pozitivna anemija, Diamond Blackfanova anemija, hemolitička anemija ili imunološka hemolitiučka anemija uključujući autoimunu hemolitičku anemilu (AIHA), perniciozna anemija (anemia pemiciosa), Addisonovu bolest, čistu eritrocitnu anemiju ili aplaziju (PRCA), nedostatak Faktora VIII, hemofiliju A, autoimunu neutropeniju, pancitopeniju, leukopeniju, oboljenja koja kao što je leukocitna dijapedeza, inflamatorne poremećaje CNSa, sindrom povrede više organa, na primer, sekundarna oboljenja posle septikemije, traume ili krvarenja, antigen-antitelo posredovane bolesti, oboljenja anti-glomerularne bazne membrane, sindrom anti-fosfolipidnih antitela, alergijski neuritis, Behcetova bolest/sindrom, Castlemanov sindrom, Goodpastureov sindrom, Reynaudov sindrom, Sjogrenov sindrom, Stevens-Johnsonov sindrom, pemfigoid kao što je bulozni pemfigoid i kožni pemfigoid, pemphigus (uključujući pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus, pemphigus kao pemfigoid sluzokože i pemphigus ervthematosus), autoimune poliendokrinopatije, Reiterova bolest ili sindrom, termalna povreda, preeklampsija, imunološki kompleksni poremećaj kao što je imunološki kompleksni nefritis, nefritis posredovan antitelima, polineuropatije, hronična neuropatija kao što su IgM polineuropatije ili IgM-posredovana neuropatija, trombocitopenija (kod pacijenata sa infarktom miokarda, na primer), uključujući trombotičku trombocitopeniju purpuru (TTP), post-transfuzionu purpuru (PTP), heparin-indukovanu trombocitopeniju, kao i autoimunu ili imunološki-posredovanu trombocitopeniju kao što je idiopatska trombocitopenija purpura (ITP) uključujući hronićnu ili akutnu ITP, skleritis kao što su idiopatski kerato-skleritis, episkleritis, autoimuno oboljenje testisa i jajnika uključujući autoimuni orhitis i ooforitis, primarni hipotiroidizam, hipoparatiroidizam, autoimune endokrine bolesti uključujući tiroiditis kao što je autoimuni tiroiditis, Hashimotova bolest, hronični tiroiditis (Hashimotov tiroiditis), ili subakutni tiroiditis, autoimuno oboljenje štitnjače, idiopatski hipotiroidizam, Gravezovu bolest, poliglandularne sindrome kao što su autoimuni poliglandularni sindromi (ili poliglandularna endokrinopatija), paraneoplastični sindromi, uključujući neurološke paraneoplastične sindrome kao što su Lambert-Eatonov mijastenični sindrom ili Eaton-Lambertov sindrom, sindrom ukočene osobe, encefalomielitis kao što je alergijski encefalomielitis ili encephalomvelitis allergica i eksperimentalni alergijski encefalomielitis (EAE), mvasthenia gravis kao što je miastenija gravis udružena sa timomom, cerebelarna degeneracija, neuromiotonija, opsoklonus ili opsoklonus mioklonus sindrom (OMS), kao i senzorna neuropatija, multifokalna motorna neuropatija, Sheehanov sindrom, autoimuni hepatitis, hronični hepatitis, lupoidni hepatitis, hepatitis gigantskih ćelija, hronični aktivni hepatitis ili autoimuni hronični aktivni hepatitis, limfoidni intersticijalni pneumonitis (LIP), bronchiolitis obliterans (ne-transplantni) vs NSIP, Guillain-Barreov sindrom, Bergerova bolest (IgA nefropatija), idiopatska IgA nefropatija, linearna IgA dermatoza, akutna febrilna neutrofilna dermatoza, subkornealna pustularna dermatoza, prolazna akantolitička dermatoza, ciroza kao što je primarna bilijarna ciroza i pneumonociroza, autoimuni enteropatski sindrom, celijakija ili celijačna bolest, celijačna malapsorpcija (glutenska enteropatija), refraktorna malapsorpcija, idiopatska malapsorpcija, crioglobulinemija, amilotropska lateralna skleroza (ALS; Lou Gehrigova bolest), koronarna arterijska bolest, autoimuno oboljenje uha kao što je autoimuno oboljenje unutrašnjeg uha (AIED), autoimuni gubitak sluha, polihondritis kao što je refraktorni ili relapsni ili vraćajući polihondritis, pulmonarna alveolarna proteinoza, Koganov sindrom/nesifilistički intersticijalni keratitis, Bellova paraliza, Svveetova bolest/sindrom, rozacea autoimuna, bol usled zostera, amiloidoza, nekancerogena limfocitoza, primarna limfocitoza koja uključuje monoklonalnu limfocitozu B ćelija (npr. benignu monoklonalnu gamopatiju i monoklonalnu gamopatiju neodređenog značaja, MGUS), periferna neuropatija, paraneoplastički sindrom, kanalopatije kao što je epilepsija, migrena, aritmija, mišićni poremećaji, gluvoća, slepilo, periodična paraliza, kao i kanalopatije CNS-a, autizam, inflamatorna miopatija, fokalna ili segmentalna ili fokalno-segmentalna glomeruloskleroza (FSGS), endokrinološka oftalmopatija, uveoretinitis, horioretinitis, autoimuni hepatološki poremećaj, fibromijalgija, multipla endokrina insuficijencija, Schmidtov sindrom, adrenalitis, gastrična atrofija, presenilna demencija, demijelinizacione bolesti kao što su autoimune demijelinizacione bolesti i hronična inflamatorna demijelinizaciona polineuropatija, Dresslerov sindrom, alopecia areata, alopecia totalis, CRESTov sindrom (kalcinoza, Ravnaudov fenomen, ezofagealni dismotilitet, sklerodaktilija i telangiektazija), muška i ženska autoimuna besplodnost, npr. zbog anti-spermatozoidnih antitela, mešovito oboljenje vezivnog tkiva, Chagasova bolest, reumatična groznica, ponovljeni abortus, farmerska pluća, ervthema multiforme, post-kardiotomni sindrom, Cushingov sindrom, pluća ljubitelja ptica, alergijski granulomatozni angiitis, benigni limfocitni angiitis, Alportov sindrom, alveolitis kao što je alergijski alveolitis i fibrozirajući alveolitis, intersticijalna bolest pluća, reakcija na transfuziju, lepra, malarija, parazitska oboljenja kao što je lajšmanijaza, kipanosomijaza, shistosomijaza, askarijaza, aspergiloza, Sampterov sindrom, Caplanov sindrom, denga, endokarditis, endomiokardijalna fibroza, difuzna intersticijalna plućna fibroza, intersticijalna fibroza pluća, plućna fibroza, idiopatska plućna fibroza, cistična fibroza, endoftalmitis, ervthema elevatum et diutinum, ervthroblastosis fetalis, eosinophilic faciitis, Shulmanov sindrom, Feltvjev sindrom, flarijaza, ciklitis kao što je hronični ciklitis, heterohronični ciklitis, iridociklitis (akutni ili hronični), ili Fuchov ciklitis, Henoch-Schonlein purpura, virusna infekcija usled nedostatka imuniteta kod čoveka (HIV), SCID, sindrom stečenog nedostatka imuniteta (AIDS), infekcija ehovirusom, sepsa, endotoksemija, pankreatitis, tiroksikoza, infekcija parvovirusom, infekcija virusom rubeole, post-vakcinacioni sindromi, kongenitalna infekcija rubeolom, infekcija Epstein-Barr virusom, zauške, Evanov sindrom, autoimuna gonadalna insuficijencija, Svdenhamova horeja, post-streptokokni nefritis, tromboangitis ubiterans, tirotoksikoza, tabes dorsalis, horioiditis, polimialgija gigantskih ćelija, hronični pneumonitis, keratoconjunctivitis sicca, epidemijski keratokonjunktivitis, idiopatski nefritički sindrom, nefropatija minimalnih pramena, benigna familijarna i ishemijska reperfuziona povreda, reperfuzija transplantacionog organa, retinalni autoimunitet, upala zglobova, bronhitis, hronična opstruktivna bolest vazdušnih puteva/pluća, silikoza, afte, aftozni stomatitis, arteriosklerotični poremećaji, aspermiogeneza, autoimuna hemoliza, Boeckova bolest, krioglobulinemija, Dupuvtrenova kontraktura, endophthalmia phacoanaphvlactica, enteritis allergica, ervthema nodosum leprosum, idiopatska paraliza lica, sindrom hroničnog zamora, febris rheumatica, Hamman-Richova bolest, senzoneuralni gubitak sluha, haemoglobinuria paroxysmatica, hipogonadizam, ileitis regionalis, leukopenija, infektivna mononukleoza, traverzni mijelitis, primarni idiopatski miksedem, nefroza, ophthalmia svmphatica, orchitis granulomatosa, pankreatitis, polvradiculitis acuta, pioderma gangrenozum, Ouervainov tireoiditis, stečena spenična atrofija, nemaligni timom, vitiligo, sindrom toksičnog šoka, trovanje hranom, stanja u koja je uključena infiltracija T ćelija, nedostatak adhezije leukocita, imunološki odgovori udruženi sa akutnom i odloženom preosetljivošću posredovanom citokinima i T-limfocitima, oboljenja koja uključuju leukocitnu dijapedezu, sindrom povrede više organa, antigen-antitelo posredovane bolesti, antiglomerularno oboljenje bazne membrane, alergijski neuritis, autoimune poliendokrinopatije, ooforitis, primarni miksedem, autoimuni atrofijski gastritis, simpatetička oftalmija, reumatske bolesti, mešovito oboljenje vezivnog tkiva, nefrotički sindrom, insulitis, poliendokrina insuficijencija, autoimuni poliglandularni sindrom tip I, adultni idiopatski hipoparatiroidizam (AOIH), kardiomiopatija kao što je dilatirana kardiomiopatija, epidermolisis bullosa acquisita (EBA), hemohromatoza, miokarditis, nefrotički simdrom, primarni sklerotizirajući holangitis, purulentni ili nepurulentni sinuzitis, akutni ili hronični sinuzitis, etmoidni, frontalni, maksilarni, ili sfenoidni sinuzitis, eosinofil-srodni poremećaj kao što je eozinofilija, plućna infiltraciona eozinofilija, eozinofilija-mialgija sindrom, Lofflerov sindrom, hronična eozinofilna pneumonija, tropska plućna eozinofilija, bronhopneumonijska aspergiloza, aspergilom, ili eozinofili koji sadrže granulome, anafilaksa, seronegativni spondiloartritide, poliendokrine autoimune bolesti, sklerozni holangitis, sklera, episklera, hronična mukokutana kandidijaza, Brutonov sindrom, prolazna hipogamaglobulinemija odojčadi, VViskott-Aldrichov sindrom, ataksija telangiektazija sindrom, angiektazija, autoimuni poremećaji udruženi sa kolagenskom bolesti, reumatizam, neurološko oboljenje, limfadenitis, smanjeni odgovor na krvni pritisak, vaskularna disfunkcija, povreda tkiva, kardiovaskularna ishemija, hiperalgezija, renalna ishemija, cerebralna ishemija, kao i oboljenja koja prate vaskularizaciju, poremećaji alergijske preosetljivosti, glomerulonefritis, reperfuziona povreda, ishemijski reperfuzioni poremećaj, reperfuziona povreda miokarda ili drugih tkiva, limfomatozni traheobronhitis, inflamatorne dermatoze, dermatoze sa akutnim inflamatornim komponentama, slabost više organa, bulozne bolesti, renalna kortikalna nekroza, akutni purulentni meningitis ili drugi inflamatorni poremećaji CNS-a, okularni i orbitalni inflamatorni poremećaji, sindromi udruženi sa transfuzijom granulocita, citokin-indukovana toksičnost, narkolepsija, akutna seriozna upala, hronična intraktabilna upala, pielitis, endarterialna hiperplazija, peptički ulkus, valvulitis, kao i endometrioza.

[0028]"Konzervativno izmenjene varijante" se odnose na sekvence kako amino kiselina, tako i nukleinskih kiselina. Što se tiče konkretnih sekvenci nukleinskih kiselina, konzervativno izmenjene varijante se odnosi na one nukleinske kiseline koje nekodiraju identične ili suštinski identične sekvence amino kiselina, odnosno, kada nukleinska kiselina ne enkodira sekvencu amino kiseline, na suštinski identične sekvence. Zbog degeneracije genetskog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina enkodira bilo koji dati protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU svi enkodiraju amino kiselinu alanin. Prema tome, na svakoj poziciji gde je alanin specifikovan od strane kodona, taj kodon se može promeniti u bilo koje korespondirajuće opisane kodone bez promene enkodiranog polipeptida. Ovakve varijacije nukleinske kiseline su "tihe varijacije," koje su jedna vrsta konzervativno izmenjenih varijacija. Svaka sekvenca nukleinske kiseline iz ovog teksta koja enkodira neki polipeptid takođe opisuje i svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline. Stručno lice će prepoznati da se svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je obično jedini kodon za metionin, kao i TGG, koji je obično jedini kodon za triptofan) može modifikovati tako da da funkcionalno identičan molekul. Prema tome, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja enkodira polipeptid nalazi se u svakoj opisanoj sekvenci u pogledu ekspresije proizvoda, ali ne i u pogledu konkretnih probnih sekvenci.

[0029]"Rekombinantan/rekombinantna", kada se upotrebljava sa pozivom na, npr. ćeliju ili nukleinsku kiselinu, protein ili vektor, ukazuje na to da su ta ćelija, nukleinska kiselina, protein ili vektor modifikovani uvođenjem heterologne nukleinske kiseline ili proteina ili alteracijom nativne nukleinske kiseline ili proteina, ili da se ta ćelija dobija od tako modifikovane ćelije. Prema tome, na primer, rekombinantne ćelije eksprimuju gene koji se ne nalaze u nativnom (ne-rekombinantnom) obliku ćelije ili eksprimuju nativne gene koji se inače nenormalno eksprimuju, ne eksprimuju se dovoljno ili se uopšte ne eksprimuju.

[0030]Izraz "nukleinska kiselina" ili "polinukleotidna sekvenca" odnosi se na jedno ili dvolančani polimer deoksiribonukleotidnih ili ribonukleotidnih baza pročitanih od 5' ka 3'. Nukleinske kiseline mogu još da sadrže modifikovane nukleotide koji omogućavaju pravilno i potpuno čitanje od strane polimeraze i ne menjaju ekspresiju polipeptida koji je enkodiran tom nukleinskom kiselinom, uključujući, na primer, kozervativno modifikovane varijante.

[0031]"Polipeptid," "peptid" i "protein" se ovde upotrebljavaju naizmenično da označe polimer rezidua amino kiseline. Ovi termini se odnose na polimere amino kiselina u kojima je jedna ili više rezidua amino kiseline veštačka hemijska imitacija odgovarajuće amino kiseline koja se nalazi u prirodi, kao i na polimere amino kiselina iz prirode i polimera amino kiselina koje se ne nalaze u prirodi. Polipeptidi iz ovog pronalaska uključuju konzervativno modifikovane varijante. Stručno lice će prepoznati da su supstitucije, delecije ili dodaci nukleinskoj kiselini, peptidu, polipeptidu ili proteinskoj sekvenci koji menjaju, dodaju ili brišu jednu amino kisleinu ili mali procenat amino kisleina i enkodiranoj sekvenci "konzervativno modifikovana varijanta" gde ta izmena dovodi do supstitucije amino kiseline hemijski sličnom amino kiselinom. Tabele konzervativne supstitucije na kojima se nalaze funkcionalno slične amino kiseline dobro su poznate u struci. Te konzervativno modifikovane varijante su dodatak polimorfnim varijantama, homolozima među vrstama, kao i alelima u ovom pronalasku i ne isključuju ih. Svaka od sledećih osam grupa sadrži amino kiseline koje su konzervativna supstitucija jedna drugoj: 1) Alanin (A), Glicin (G); 2) Asparginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W); 7) Serin (S), Treonin (T); i 8) Cistein (C), Metionin (M) (33). Izraz "konzervativna supstitucija" uključuje još i upotrebu supstituisane amino kiseline umesto nesupstituisane roditeljske amino kiseline, pod uslovom da taj polipeptid ispoljava i potrebnu aktivnost vezivanja.

[0032]"Amino kiselina" se odnosi na prirodne i sintetske amino kiseline, kao i na analoge amino kiselina i imitacije amino kiselina koje funkcionišu na način sličan amino kisleinama iz prirode. Amino kiseline iz prirode su one enkodirane genetskim kodom, kao i one amino kiseline koje se kasnije modifikuju, npr. hidroksiprolin, vkarboksiglutamat, kao i O-fosfoserin. "Analog amino kiseline" su jedinjenja koja imaju isti baznu hemijsku strukturu kao amino kisleine iz prirode, tj., a ugljenik koji se vezuje za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu, R grupu, npr., homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonium. Ovi analozi imaju izmenjenu R groupu (npr., norleucin) ili izmenjeni peptidni kostur, ali zadržavaju istu odnosnu hemijsku strukturu kao kod prirodnih amino kisleina. "Imitacija amino kiseline" se odnosi na hemijsko jedinjenje čija se struktura razlikuje od opšte hemijske strukture amino kiseline, ali funkcioniše na način koji je sličan prirodnoj amino kiselini.

[0033]Amino kiseline se ovde mogu označavati ili opštepoznatim simbolima od tri slova ili simbolima od jednog slova prema preporuci IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (videti dole tabelu 1). Nukleotidi se, takođe, mogu označavati svojim opšteprihvaćenim kodovima od tri slova.

[0034]Treba napomenuti da su ovde sve sekvence amino kiselina predstavljene formulama čiji je pravac sa leva na desno konvencionalan pravac od amino terminusa do karboksi-terminusa.

[0035]Ovde upotrebljen izraz "in vitro" ili "ex vivo" odnosi se na veštačko okruženje i na procese ili reakcije koji se odvijaju u veštačkoj sredini, na primer, između ostalog, epruvete i ćelijske kulture. Izraz "in vivo" odnosi se na prirodnu sredinu (npr. životinju ili ćeliju) i na procese i reakcije koji se odvijaju u prirodnoj sredini.

[0036]"Farmaceutski prihvatljivo," "fiziološki podnošljivo" i njihovi gramatički oblici, kada se odnose na formulacije, nosače, rastvarače i reagense, koriste se naizmenično i znače da se ti materijali mogu primenjivati kod ljudi bez neželjenih fizioloških efekata takve jačine koja bi mogla da zabrani primenu te formulacije.

[0037]Izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač" odnosi se na reagense, ekscipijense, ćelije, jedinjenja, materijale, formulacije, odnosno oblike doziranja koji su, u okviru prhvaćenog medicinskog prosuđivanja, pogodni za primenu u kontaktu sa tkivima ljudi i životinja bez ispoljavanja prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih komplikacija udruženih sa razumnim odnosom korist/rizik. Kao što je ovde detaljno opisano, farmaceutski prihvatljivi nosači pogodni za upotrebu u sadašnjem pronalasku uključuju gasove, tečnosti i polučvrste materijale.

[0038]Osim ako se ne odredi drugačije, "ispitanik" ili "pacijent" se koriste naizmenično i odnose se na sisare kao što su ljudi i ne-humani primati, kao i eksperimentalne životinje kao što su kunići, psi, mačke, pacovi, miševi i druge životinje. Prema tome, "ispitanik" ili "pacijent" se ovde koriste u značenju pacijenta sisara ili ispitanika na kome mogu primeniti formulacije iz ovog pronalaska. U nekim predmetima sadašnjeg pronalaska, pacijent će imati infektivno ili inflamatorno oboljenje ili neku autoimunu bolest. U nekim predmetima sadašnjeg pronalaska, pacijentu će biti dijagnostikovan karcinom. U cilju identifikacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom ili formulacijom iz ovog pronalaska, primenjuju se prihvaćene metode skrininga da bi se odredio status postojeće bolesti ili stanja kod ispitanika ili faktori rizika udruženi sa ciljnim ili suspektnim oboljenjem ili stanjem. Te skrining metode uključuju, na primer, pregleda da se odredi da li ispitanik ima neku infektivnu bolest, upalu, karcinom ili neko autoimuno oboljenje. Ove i druge rutinske metode omogućavaju kliničaru da odabere ispitanike kojima je potrebna terapija.

[0039]"Lečenje" iznačava bilo kakav pokazatelj uspeha u lečenju ili ublažavanju, na primer, neke zarazne bolesti, upale kao što je GM-CSF-posredovano upalno oboljenje, karcinom ili neke autoimune bolesti uključujući bilo koji objektivan ili subjektivan parametar kao što je smanjenje; remisija; ublažavanje simptoma ili dovođenje stanja bolesti na stepen podnošljiv za pacijenta; usporavanje degenaracije ili smanjenje; ili učiniti da završni stepen degenracije predstavlja manje iznurivanje pacijenta. Lečenje ili ublažavanje simptoma može se zasnivati na objektivnim ili subjektivnim parametrima; uključujući rezultate pregleda. Prema tome, izraz „lečiti" uključuje primenu jedinjenja ili sredstava iz sadašnjeg pronalaska radi odlaganja, ublažavanja, odnosno, zaustavljanja ili sprečavanja razvoja simptoma ili stanja udruženih sa karcinomom, zaraznim oboljenjem, upalnim oboljenjem kao što je GM-CSF-posredovano inflamatorno oboljenje, odnosno autoimuna bolest. Lečenje uključuje, na primer, sprečavanje rasta displatičnih ćelija, sprečavanje progresije karcinoma ili neoplastične bolesti, održavanje sprečenog tumorskog rasta, uvod u remisiju.

[0040]"Terapijsko jedinjenje" ovde upotrebljeno označava jedinjenje korisno za sprečavanje ili lečenje bolesti ili stanja kao što je karcinom, zarazna bolest, upalna bolesti ili autoimuna bolest.

[0041]"Terapijski efekat" se odnosi na slabljenje, eliminaciju ili sprečavanje nastanka bolesti, simptoma bolesti ili neželjenih efekata bolesti kod ispitanika. "Delotvorna količina" je količina neophodna da proizvede željeni efekat. "Terapijski delotvorna količina" označava količinu koja je, kada se primeni kod ispitanika u cilju lečenja bolesti, stanja ili poremećaja, dovoljna da dovede do lečenje te bolesti.

[0042]"Prateća primena," "istovremena primena," ili "uporedna primena" kada se upotrebe u ovom tekstu uključuju primenu aktivnih agenasa (npr., MAb, hemoterapijskih sredstava, biomolekula), istovremeno, u kombinaciji, zajedno ili pre ili posle jedno drugog. Ta višestruka sredstva mogu se dati na isti način ili različito, istovemeno ili jedan za drugim, ali na način da se obezbedi da svi ti agensi postignu delotvornu koncentraciju na mestu primene. Uobičajeno obrazovanom licu u struci ne bi bio problem da odredi odgovarajuće vreme, redosled, kao i doziranje datih lekova i formulacija iz sadašnjeg pronalaska.

[0043]"Donor ćelije" je termin koji se upotrebljava za označavanje ćelija spojenih sa humanim B-ćelijama radi dobijanje hibridoma. Te ćelije uključuju, između ostalog, mijelom glodara onako kako to razume stručno lice; ćelijske linije glodara, ćelijske linije čoveka; ćelijske linije ptica. Ćelijske linije se mogu dobiti na bilo koji način poznat stručnim licima.

[0044]"Imunoglobulin" ili "antitelo" ima široku upotrebu u označavanju molekula antitela, ali i različitih molekula dobijenih iz antitela i uključuje bilo kog člana grupe glikoproteina koji se javljaju kod viših sisara koji su glavna komponenta imunološkog sistema. Izraz "antitelo" se upotrebljava u najširem smislu, a konkretno, obuhvata monoklonalna antitela, formulacije antitela sa poliepitopskom specifičnošću, bispecifična antitela, diatela, kao i jednolančane molekule i fragmente antitela (npr., Fab, F(ab')2 i Fv), sve dok ona ispoljavaju željeno biološko dejstvo. Molekul imunoglobulina sadrži antigen vezujuće domene koji sadrže lake lance i krajnji terminalni deo teškog lanca, kao i Fc region koji je neophodan za različite funkcije kao što je fiksacija komplementa. Ima pet klasa imunoglobulina pri čemu primarna struktura teškog lanca, Fc region, određuje klasu imunoglobulina. Konkretno, alfa, delta, ipsilon, gama, kao i mu lanci korespondiraju sa IgA, IgD, IgE, IgG, odnosno IgM. Kako je ovde upotrebljen, termin "imunoglobulin" ili "antitelo" uključuje sve potklase alfa, delta, ipsilon, gama i mu, a odnosi se i na bilo koje prirodne (npr., IgA i IgM) ili sintetske multimere četvorolančane imunoglobulinske strukture. Antitela vezuju antigen ne-kovalentno, specifično i reverzibilno.

[0045]Termin "monoklonalno antitelo", kako je ovde upotrebljen, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična, osim mogućih prirodno nastalih mutacija koje mogu biti prisutne u manjem obimu. Na primer, monoklonalna antitela može da proizvodi jedan jedini klon ćelija proizvođača antitela. Za razliku od poliklonalnih antitela, monoklonalna antitela su monospecifična (npr. specifična za samo jedan epitop jednog antigena). Modifikator "monoklonalni" ukazuje na karakter antitela koje se dobija iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba smatrati da je potrebna proizvodnja antitela bilo kojom konkretnom metodom. Na primer, monoklonalna antitela koja će se koristiti u skladu sa sadašnjim pronalaskom mogu se dobiti metodom hibridoma koji je prvi opisao Kohler i sar., Nature, 256: 495, 1975, ili DNK rekombinantnim metodama. "Monoklonalna antitela" se takođe mogu izolovati iz biblioteka fag antitela korišćenjem tehnike opisane, na primer, kod Marks i sar., J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991.

[0046]Kako je upotrebljen ovde, termin "himerizovan" odnosi se na imunoglobulin, pri čemu promenljivi regioni teškog i lakog lanca nisu humanog porekla, ali su konstantni regioni teškog i lakog lanca humanog porekla.

[0047]"Humanizovan" se odnosi na imunoglobulin kao što je antitelo, pri čemu amino kiseline koje su direktno uključene u vezivanje antitela, regioni koji određuju komplementarnost (CDR), teškog i lakog lanca nisu humanog porekla, dok je ostatak tog imunoglobulinskog molekula, okvirni regioni promenljivih teških i lakih lanaca i konstantni regioni teških i lakih lanaca, humanog porekla.

[0048]"Potpuno ljudski (humani)" odnosi se na imunoglobulin, kao što je antitelo, gde je ceo molekul ljudskog porekla ili se sastoji of sekvence amino kiseline identične humanom obliku antitela.

[0049]"Epitop" označava imunologičku determinantu antigena koja služi kao mesto vezivanja antitela. Onako kako je upotrebljen ovde, termin "konformacioni epitop" odnosi se na diskontinualni epitop obrazovan prostornom vezom između amino kiselina nekog antigena, a ne neprekinute serije amino kiselina.

[0050]"Hibridom" označava proizvod fuzije ćelija gajenog neoplastičnog limfocita i pripremljenog Bor T-limfocita koji eksprimuje specifični imunološki potencijal roditeljske ćelije.

[0051]"GM-CSF" se odnosi na familiju glikoproteinskih faktora rasta koji kontrolišu produkciju, diferencijaciju i funkciju granulocita i monocita-makrofaga. Primer, ali ni u kom slučaju jedini oblik takvog molekula, nalazi se u patentu SAD br. 5,602,007 (34).

[0052]Upotrebljen u ovom tekstu, termin "biomolekul" odnosi se na bilo koji molekul koji se može konjugovati, davati zajedno, pre ili posle primene antitela ili se koristiti na neki drugi način udružen sa antitelom iz ovog pronalaska. Biomolekuli uključuju, između ostalog, enzime, proteine, peptide, amino kiseline, nukleinske kiseline, lipide, ugljene hidrate, fragmente, homologe, analoge, odnosno derivate, kao i njihove kombinacije. Primeri biomolekula uključuju, između ostalog, interleukin-2, interferon alfa, interferon beta, interferon gama, rituksan, zevalin, herceptin, erbituks i avastin. Ti biomolekuli mogu biti nativni, rekombinantni ili sintetizovani, a mogu se i modifikovati od svoje nativne forme, na primer, glikozilacijama, acetilacijama, fosforilacijama, miristilacijama i slično. Termin biomolekul, onako kako je ovde upotrebljen, nije ograničen na prirodne molekule i uključuje i sintetske molekule bez bilo kakvog biološkog porekla.

[0053]Polipeptidi prema sadašnjem pronalasku mogu se sintetizovati iz amino kiselina tehnikama poznatim licima stručnim za polipeptide. U načelu, ove metode se sastoje od sekvencijalnog dodavanja jedne ili više rezidue amino kiselina ili odgovarajuće zaštićenih rezidua amino kiselina u rastući peptidni lanac. Obično je ili amino ili karbokslna grupa prve amino kiselinske rezidue zaštićena odgovarajućom zaštitnom grupom koja se može selektivno ukloniti. Za amino kiseline koje sadrže reaktivnu pomoćnu grupu (npr., lizin), koristi se različita, selektivno uklonjiva zaštitna grupa.

[0054]U struci su poznate različite metode dobijanja polipeptida iz sadašnjeg pronalaska (WO 89/06657; WO 92/22315; WO 98/49191; patenti SAD br. 5,260,273; 5,164,369; 5,407,914; 5,789,381; 5,952,303; 6,013,619; 6,013,764; 6,120,795; 6,613,734.).

[0055]Dodatne rezidue se mogu dodati bilo na terminus ili polipeptid iz sadašnjeg pronalaska, na primer, za formiranje „veznika" kojim se taj polipeptid može pogodno zalepiti na obeležje ili čvrsti matriks, odnosno na nosač. Obeležja, čvrsti matriksi i nosači koji se mogu upotrebljavati sa polipeptidima iz ovog pronalaska poznati su u struci; ovde su opisani i neki primeri.

[0056]Reziduani veznici amino kiseline obično je najmanje jedna rezidua, a može ih biti 40 i više, češće 1 do 10 rezidua. Tipične rezidue amino kiseline koje se koriste za povezivanje su tirozin, cistein, lizin, glutaminska i asparaginska kiselina i slično. Osim toga, sekvenca polipeptida u ovom pronalasku može se razlikovati od prirodne sekvence tako što se ta sekvenca modifikuje acilacijom terminalnog NH2, npr. acetilacijom ili amidacijom tioglikolne kiseline, terminalnom karboksiamidacijom, npr., amonijak, metvlamin i slično.

[0057]Mada je jasno da su mnogi ovde obelodanjeni polipeptidi, npr., SEQ ID NOs:1-5 korisni, takođe je tačno da se mnoštvo drugih molekula uključujući retke, ali prirodne amino kiseline, metabolite i karbolite prirodnih amino kiselina, supstituisane amino kiseline i analoge amino kiselina, kao i amino kiseline u „D" konfiguraciji, mogu korisno upotrebiti u molekulima i formulacijama sadašnjeg pronalaska. Osim toga, "dizajnirani" derivati amino kiselina, analozi i imitacije takođe su korisni u raznim jedinjenjima i formulacijama sadašnjeg pronalaska, kao i polimeri uključujući koštanu strukturu sastavljenu od neamidnih spojeva.

[0058]Ovde upotrebljen termin "analozi" i "derivati" polipeptida i rezidua amino kiselina predviđen je da obuhvati metabolite i katabolite amino kiselina, kao i molekula koji sadrže spojeve, kosture, bočne lance ili bočne grupe koje se razlikuju od uobičajeno postojećih u onome što se naziva "prirodno postojeće" amino kiseline L-oblika. (Termini "analog" i "derivat" ovde se mogu koristiti na zamenljiv način.). Prema tome, D-amino kiseline, molekuli koji imitiraju amino kiseline i amino kiseline sa dizajniranim bočnim lancima (npr., koji mogu da zamene jednu ili više amino kiselina u molekulu koji ima aktivnost surfaktanta) ovde su takođe obuhvaćeni izrazima "analozi" i "derivati".

[0059]Na primer, osim L-amino kiselina navedenih na tabeli 1, metaboliti amino kiselina kao što su homoarginin, citrulin, ornitin i a-aminobutanoična kiselina takođe su korisni u molekulima i formulacijama sadašnjeg pronalaska.

[0060]U drugoj varijaciji, može postojati želja da se konstruiše molekul koji ima "rigidnije" ustrojstvo; jedno sredstvo za postizanja ovoga bilo bi dodavanje metil ili drugih grupa atomu a ugljenika u amino kiselinama.

[0061]Dalje, supstituisane amino kiseline koje se obično ne dobijaju od proteina, ali koje su poznate u prirodi i korisne kao što je ovde obelodanjeno, uključuju sledeće primere: L-kanavanin; 1-metil-L-histidin; 3-metil-L-histidin; 2-metil L-histidin; a,e-diaminopimelinska kiselina (L oblik, mezo oblik ili oba); sarkozin; L-ornitin betain; betain histidina (herzinin); L-citrulin; L-fosfoarginin; D-oktopin; o-karbamil-D-serin;Y-anriinobutanoična kiselina; i (3-lizin. D-amino kiseline i analozi D-amino kiselina, uključujući sledeće, takođe su korisni u proteinima, peptidima i formulacijama sadašnjeg pronalaska: D-alanin, D-serin, D-valin, D-leucin, D-izoleucin, D-aloizoleucin, D-fenilalanin, D-glutaminska kiselina, D-prolin, i D-alohidroksiprolin i slični. Gore pomenuti se može koristiti i u GMCSF polipeptidima.

[0062]Amino kiseline mogu da uključe analoge, metabolite, karbolite, kao i derivate, bez obzira na vreme ili mesto modifikacije. U suštini, modifikovane amino kiseline se mogu svrstati u tri kategorije: (1) katabolite i metabolite amino kiselina; (2) modifikovane amino kiseline dobijene posttranslacionom modifikacijom (npr. modifikacija bočnih lanaca); i (3) modifikacije amino kiselina sprovedene nemataboličkim i nekataboličkim procesima (npr. sinteza modifikovanih amino kiselina ili derivata u laboratoriji).

[0063]Lako se mogu dizajnirati bočni lanci rezidualnih jedinica amino kiselina koje sadrže duže ili skraćene bočne lance dodavanjem ili oduzimanjem metilen grupa u linearnom, razgranatom lancu ili aranžmanima ugljovodoničnih ili heterocikličnoh prstenova. Ove linearne ili razgranate lančane strukture mogu da sadrže i neugljenikove atome kao što su S, O ili N. Masne kiseline mogu takođe biti korisni konstituenti molekula surfaktanta iz ovog pronalaska. Ti dizajnirani bočni lanci mogu se završavati sa (R') ili bez (R) naelektrisanim dodatkom ili dodatkom polarne grupe.

[0064]Analozi, uključujući molekule nastale kao rezultat upotrebe različitih veznika, takođe su korisni. Molekuli kod kojih su bočni lanci spojeni zajedno veznicima osim amidne veze, npr. molekuli koji sadrže aminokiselinske bočne lance ili druge bočne lance (R- ili R'-) pri čemu su komponente spojene pomoću karboksiestara ili fosfoestara, etilena, metilena, ketona ili drugim veznicima, da navedemo samo neke primere, takođe su korisni kako je ovde obelodanjeno. U suštini, bilo koji aminokiselinski bočni lanac, molekul koji sadrži R ili R' grupu može biti koristan u smislu ovde obelodanjenom.

[0065]Antitelo iz sadašnjeg pronalaska može biti u obliku dimera spojenog odgovarajućim veznikom, npr. peptidni dimeri spojeni molekulima cisteina. (Kao što stručna lica znaju, dva molekula cisteina mogu se spojiti disulfidnim mostom koji se formira oksidacijom njihovih tiolnih grupa.). Ovi veznici ili mostovi mogu da unakrsno povežu različite polipeptidne lance, dimere, trimere i slično. Drugi korisni veznici koji se mogu upotrebiti za spajanje peptidnih dimera, odnosno, peptidnih multimera uključuju one koji su već navedeni u prethodnom tekstu, npr., karboksiestar, fosfoestar, etilen, metilen, ketone ili drugi veznici i slično.

[0066]Stručno lice će shvatiti da se mogu napraviti različite izmene pojedinih amino kiselina, veznika, odnosno, samih lanaca, kojima će molekuli upasti u okvir sadašnjeg pronalaska i to sve dok rezultujući molekul poseduje biološku (npr., antigensku) aktivnost koja je ovde opisana.

[0067]Prethodno navedene metode stvaranja hibridoma koji luče humana MAb (VVO2004/046330) primenom primarnih humanih B-ćelija primenjene su i ovde. Periferne jednojedrene ćelije krvi, po mogućnosti humane PBMC, imunizuju se ex vivo u prisustvu ciljnog antigena, a zatim imortalizuju fuzijom sa ćelijama donora. Alternativno, selektovane PBMC se identifikuju tako da njihovi serumi ispoljavaju visoku imunološku reaktivnost na antigen od interesa.

[0068]Hibridne ćelije dobijene od donor ćelija se pregledaju da se vidi da li luče ciljna antigen-specifična MAb. U nekim predmetima patenta date su metode za proizvodnju hibridom ćelija koje produkuju monoklonalna antitela za ciljni antigen iz ex vivo imunozanih imunoglobulin-produkujućih ćelija, koje se sastoje od: (a) kombinacije jednojedrenih ćelija iz periferne krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće ćelije, i ciljnog antigena ex vivo; (b) fuzije imunoglobulin-produkujućih ćelija sa donor ćelijama i tako obrazuju hibridom ćelije; (c) određivanja vezivanja antigena antitelima dobijenim iz ćelija hibridoma; i (d) selekcije ćelija hibridoma koje proizvode antitela za ciljni antigen; i na taj način daju ćelije hibridoma koje antitela za ciljni antigen. PBMC mogu biti od zdravih donora. Ciljni antigen je poželjno da bude GM-CSF, a još poželjnije da sadrži sekvencu amino kiseline kao SEQ ID NOs:35-38.

[0069]Alternativno, metode za dobijanje hibridoma koji proizvode monoklonalna antitela za ciljni antigen ciljne bolesti sadrže korake: (a) fuziju ex vivo mononuklearnih ćelija iz periferne krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće B-ćelije dobijene od pacijenta koji ima neko oboljenje ili od donora izloženog antigenu sa donor ćelijama koje stvaraju ćelije hibridoma; (b) određivanje vezivanja antitelima dobijenim iz ćelija hibridoma za ciljni antigen; i (c) selekciju ćelija hibridoma koje proizvode antitela koja se vezuju za ciljni antigen i na taj način produkuju ćelije hiobridoma koje eksprimuju antitela za ciljnu bolest. Poželjno je da ciljni antigen bude sa bolešću povezani antigen, a poželjno udružen sa karcinomom, infektivnim oboljenjem ili autoimunom bolešću. Još poželjnije je da je taj sa bolešću povezani antigen GM-CSF. Ciljni antigen je poželjno GM-CSF, a još poželjnije sekvenca amino kiseline jedna od SEQ ID NOs:35-38. U poželjnom predmetu patenta, antigenu izloženi donor je izložen dejstvu GM-CSF ili može imati alveolarnu proteinozu (PAP).

[0070]Ovaj pronalazak daje metodu za dobijanje ćelija hibridoma koje proizvode antitela za ciljni antigen (MCSF ili njegovi antigenski peptidi) od ex vivo-imunizovanih imunoglobulin-produkujućih ćelija, koja se sastoji iz: (a) ex vivo kombinovanja mononuklearnih ćelija iz periferne krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće ćelije sa ciljnim antigenom; (b) fuzije imunoglobulin-produkujućih ćelija i ćelija donora u cilju stvaranja ćelija hibridoma; (c) obavljanja funkcije sita za vezivanje imunoglobulina koje su proizvele ćelije hibridoma za ciljni antigen i dobijanja ćelija hibridoma koje proizvode antitela za ciljni antigen. PBMC mogu biti od zdravih donora. Ciljni antigen može da sadrži antigenski polipeptid.

[0071]Taj cilji antigen poželjno sadrži jednu sekvencu amino kiseline od SEQ ID NOs:1-5, poželjno bilo koju od SEQ ID NOs:3-5.

[0072]Alternativno, ovaj pronalazak daje metode za dobijanje ćelija hibridoma koje proizvode antitela za ciljni antigen (npr., GM-CSF ili njegovi antigenski peptidi), koje se sastoje od: (a) selekcije jednojedarnih ćelija periferne krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće ćelije dobijene od antigenu izloženog donora; (b) fuzije imunoglobulin-produkujućih ćelija i ćelija mijeloma da se dobiju ćelije hibridoma; (c) obavljanja funkcije sita za vezivanje imunoglobulina koje su proizvele ćelije hibridoma za ciljni antigen i dobijanja ćelija hibridoma koje proizvode antitela za ciljni antigen. Taj ciljni antigen može da sadrži antigenski polipetid iz ovog pronalaska. Taj ciljni antigen poželjno sadrži jednu sekvencu amino kiseline od SEQ ID NOs:1-5, a poželjnije SEQ ID NOs:3-5. Donor je možda bio izložen dejstvu GMCSF ili njegovim antigenskim peptidima ili je možda imao plućnu alveolarnu proteinozu (PAP).

[0073]Ćelije donora (npr. mijelom) mogu da eksprimuju proteinski inhibitor popravke grešaka. Ćelije hibridoma mogu da eksprimuju proteinski inhibitor popravke grešaka. Proteinski inhibitor popravke grešaka može se uneti u ćeliju hibridoma posle fuzije mijeloma sa imunoglobulin-produkujućim ćelijama. Proteinski inhibitor popravke grešaka može se uneti u ćeliju donora ili mijeloma pre fuzije sa imunoglobulin-produkujućim ćelijama. Ćelije donora ili mijeloma ili antitelo-produkujuće ćelije mogu prirodno nedostajati u sistemu popravke grešaka.

[0074]Proteinski inhibitori sistema za popravku grešaka uključuju dominantno negativne alele gena na kojima je izvršena popravka. Dominantno negativni aleli popravljenih gena uključuju, između ostalog dominantno negativne alele PMS2, PMS1, PMSR3, PMSR2, PMSR6, MLH1, GTBP, MSH3, MSH2, MLH3, ili MSH1, kao i homologe mutL i mutS gena. Osim toga, mogu se upotrebiti i polipeptidi sposobni da ometaju popravku grešaka. Na primer, dominantno negativni alel mutL PMS2 sadrži prvih 133 aminokiselinskih PMS2. Dalji opis amino kiselina u mutL homolozima prikazuje amino kiseline

LSTAVKELVENSLDAGATNIDLKLKDYGVDLIEVSDNGCGVEEENFE (SEQ ID NO:6) i LRQVLSNLLDNAIKYTPEGGEITVSLERDGDHLEITVEDNGPGIPEEDLE (SEQ ID NO:7) ili

njihove fragmente. Proteinski inhibitori sistema za popravku tako uključuju polipeptide SEQ ID NOs: 6 i 7 i njihove fragmente. Proteinski inhibitori sistema za popravku se mogu inaktivirati. Na primer, proteinski inhibitor sistema za popravku može se inaktivirati pre ili posle identifikacije ćelije hibridoma koja generiše monoklonalna antitela za ciljni antigen. Inaktivacija proteinskog inhibitora sistema za popravku možda je svakako poznata u struci, na primer, uklanjanje stimulatora ili uklanjanje proteinskog inhibitora sistema za popravku iz ćelije (tj., izlečenje ćelije od proteinskog inhibitora sistema za popravku). Inaktivacija inhibitora sistema za popravku stabilizuje genom hipermutiranog hibridoma.

[0075]U nekim metodama za stvaranje ćelija hibridoma, ćelije hibridoma su izložene dejstvu hemijskog inhibitora sistema za popravku. Hemijski inhibitori sistema za popravku upotrebljeni u nekim predmetima metode uključuju, između ostalog, najmanje jedan od antracena, inhibitor ATPaze, inhibitor nukleaze, molekul za ometanje RNK, inhibitor polimeraze i antisens oligonukleid koji se specifično hibridizuje do nukleotida koji enkodira protein za popravku grešaka (VVO2004/046330). Taj hemijski inhibitor može biti antracensko jedinjenje čija je formula sledeća:

Gde su R1-R10 nezavisne vodonik, hidroksil, amino, alkil, supstituisane alkil, alkenil, supstituisane alkenil, alkinil, supstituisane alkinil, O-alkil, S-alkil, N-alkil, O-alkenil, S-alkenil, N-alkenil, O-alkinil, S-alkinil, N-alkinil, aril, supstituisane aril, ariloxi, supstituisane ariloxi, heteroaril, supstituisane heteroaril, aralkiloksi, arilalkil, alkilaril, alkilariloksi, arilsulfonil, alkilsulfonil, alkoksikarbonil, ariloksikarbonil, guanidino, karboksi, alkohol, amino kiselina, sulfonat, alkil sulfonat, CN, N02, aldehidna grupa, estar, etar, krunski etar, keton, organosumporno jedinjenje, organometalno jedinjenje, karboksilna kiselina, organosilikon ili ugljeni hidrat koji opciono sadrži jednu ili više alkilizovanih hidroksilnih grupa; pri čemu, rečeni heteroalkil, heteroaril, kao i supstituisani heteroaril sadrže najmanje jedan heteroatom koji je kiselonik, sumpor, atom metala, fosfor, silicijum ili azot; i pri čemu su rečeni supstituenti rečenog supstiuisanog alkil, substituisanog alkenil, substituisanog alkinil, substituisanog aril, i substituisanog heteroari halogen, CN, N02, niži alkil, aril, heteroaril, aralkil, aralkoksi, guanidino, alkoksikarbonil, alkoksi, hidroksi, karboksi i amino; i pri čemu su rečene amino grupe opsiono supstituisane alkil grupom ili 1 do 3 aril ili nižim alkil grupama. U nekim predmetima patenta, R5 i R6 su vodonik. U drugim predmetima patenta, R1-R10 su nezavisno vodonik, hidroksil, metil, etil, propil, izopropil, butil, izobutil, fenil, tolil, hidroksimetil, hidroksipropil, ili hidroksibutil. Neograničavajući primeri antracena uključuju 1,2-dimetilantracen, 9,10-dimetilantracen, 7,8- dimetilantracen, 9,10-dufenilantracen, 9,10-dihidroksimetilantracen, 9-hidroksimetil-10-metilantracen, dimetilantracen-1,2-diol, 9-hidroksimetil-10- metilantracen -1,2-diol, 9- hidroksimetil -10- metilantracen -3,4-diol, kao i 9,10-di-m-tolilantracen.

[0076]Taj hemijski inhibitor može se uneti u hranljivu podlogu na kojoj se gaje ćelije.

[0077]Taj hemijski inhibitor može se izvući iz hipermutiranih ćelija hibridoma da bi se restabilizovao genom ćelija. Alternativno, ova metoda može da uključi inaktivaciju hemijskog inhibitora sistema za popravku i na taj način stabilizuje genom tog hipermutiranog hibridoma.

[0078]Ove metode mogu još da uključe kloniranje imunoglobulin-produkujućih gena iz antitelo-produkujućih ćelija i prenos imunoglobulinskih gena u neku ćeliju sa ekspresijom sisara, pri čemu se ti imunoglobulinski geni operativno linkuju sa sekvencama za kontrolu ekspresije.

[0079]Ovaj pronalazak još obezbeđuje metode za dobijanje ćelija sa ekspresijom sisara koje proizvode antitela sa visokim afinitetom za ciljni antigen ex vivo iz imunizovanih imunoglobulin-produkujućih ćelija, koje uključuju: (a) ex vivo kombinovanje jednojedarnih ćelija krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće ćelije za ciljni antigen; (b) fuziju imunoglobulin-produkujućih ćelija i donor ćelija radi dobijanja ćelija hibridoma; (c) određivanje vezivanja antigena antitelima dobijenim iz ćelija hibridoma; (d) optimizacije proizvodnje antitela u hibridomu inhibicijom sistema za popravku; ili kloniranje imunoglobulinskih gena od hibridoma u ćeliju sa ekspresijom sisara, pri čemu se inhibiše sistem za popravku u ćeliji sa ekspresijom sisara; i (e) selekciju ćelija hibridoma koje proizvode antitela koja vezuju ciljni antigen; čime se dobijaju ćelije hibridoma koje proizvode antitela za ciljni antigen. Alternativa koracima (a) i (b), može se primeniti fuzija ex vivo jednojedrenih ćelija periferne krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće B-ćelije dobijene od pacijenta koji ima neko oboljenje ili od antigenu-izloženog donora i donorskih ćelija i tako dobiju ćelije hibridoma.

[0080]Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metode za ćelija sa ekspresijom sisara koje proizvode antitela sa visokim afinitetom za ciljni antigen iz ex vivo imunizovanih imunoglobulin-produkujućih ćelija, koje uključuju: (a) ex vivo kombinovanje jednojedarnih ćelija krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće ćelije za ciljni antigen; (b) fuziju imunoglobulin-produkujućih ćelija i ćelija mijeloma radi dobijanja ćelija hibridoma; (c) obavljanje funkcije sita za vezivanje antitela dobijenih od rečenih ćelija hibridoma za ciljni antigen; (d) optimizovanje dobijanja hibridoma inhibicijom sistema za popravke; ili kloniranje imunoglobulinskih gena iz hibridoma u ćeliju sa ekspresijom sisara, pri čemu se inhibiše sistem za popravke u ćeliji sa sisarskom ekspresijom; i (e) obavljanje funkcije sita za ćelije sa sisarskom ekspresijom koje luče antitela visokog afiniteta za ciljni antigen za razliku od antitela dobijenih iz hibridoma ili rekombinantnih ćelija.

[0081]Ovde se takođe obelodanjuje metoda za dobijanje ćelija sa sisarskom ekspresijom koje proizvode veliki broj antitela visokog afiniteta iz ex vivo imunizovanih imunoglobulin-produkujućih ćelija, koje uključuju: (a) ex vivo kombinovanje jednojedarnih ćelija periferne krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće ćelije i ciljni antigen; (b) fuziju imunoglobulin-produkujućih ćelija i ćelija donora radi dobijanja ćelija hibridoma; (c) određivanje vezivanja antigena antitelima dobijenim iz ćelija hibridoma; (d) kloniranja imunoglobulin gena iz hibridoma u roditeljsku ćeliju sa sisarskom ekspresijom, pri čemu se inhibiše sistem za popravke u ćeliji sa sisarskom ekspresijom; (e) inkubiranja roditeljske ćelije sa sisarskom ekspresijom ili ćelije sa ekspresijom hibridoma kako bi se omogućila mutageneza, čime se dobijaju hipermutirane ćelije sa sisarskom ekspresijom; (f) selekcije hipermutirajućih ćelija sa sisarskom ekspresijom koje luče antitela povećanog afiniteta za ciljni antigen u poređenju sa antitelima dobijenom iz roditeljskih ćelija hibridoma ili selekciju hipermutirajućih ćelija sa sisarskom ekspresijom koje luče veći broj antitela nego roditeljske ćelije sa sisarskom ekspresijom; čime se dobijaju ćelije sa sisarskom ekspresijom koje proizvode antitela za ciljni antigen iz ex vivo imunizovanih imunoglobulin-produkujućih ćelija. Alternativa koracima (a) i (b), može se primeniti fuzija ex vivo jednojedrenih ćelija periferne krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće B-ćelije dobijene od roditelja koji ima neko oboljenje ili od antigenu-izloženog donora i donorskih ćelija i tako dobiju ćelije hibridoma koje se mogu upotrebiti.

[0082]Ovde se takođe obelodanjuje metoda za dobijanje ćelija sa sisarskom ekspresijom koje proizvode veliki broj antitela visokog afiniteta iz ex vivo imunizovanih imunoglobulin-produkujućih ćelija, koje uključuju: (a) ex vivo kombinovanje jednojedarnih ćelija periferne krvi koje sadrže imunoglobulin-produkujuće ćelije i ciljni antigen; (b) fuziju imunoglobulin-produkujućih ćelija i ćelija mijeloma radi dobijanja ćelija hibridoma; (c) određivanje vezivanja antigena antitelima dobijenim iz ćelija hibridoma; (c) obavljanje funkcije sita za vezivanje antitela dobijenih od rečenih ćelija hibridoma za ciljni antigen; (d) kloniranja imunoglobulin gena iz hibridoma u roditeljsku ćeliju sa sisarskom ekspresijom, pri čemu se inhibiše sistem za popravke u ćeliji sa sisarskom ekspresijom ili se optimizuje proizvodnja hibridoma inhibicijom sistema za popravku; (e) inkubiranja roditeljske ćelije sa sisarskom ekspresijom ili ćelije sa ekspresijom hibridoma kako bi se omogućila mutageneza, čime se dobijaju hipermutirane ćelije sa sisarskom ekspresijom; (f) obavljanja funkcije sita za hiermutirajuće ćelije sa sisarskom ekspresijom koje luče antitela višeg afiniteta za ciljni antigen od antitela dobijenih iz ćelija hibridoma; i (g) obavljanja funkcije sita za hipermutirajuće ćelije sa sisarskom ekspresijom koje luče veći broj antitela nego roditeljske ćelije sa sisarskom ekspresijom; čime se dobijaju ćelije sa sisarskom ekspresijom koje proizvode veliki broj antitela visokog afiniteta iz ex vivo imunizovanih imunoglobulin-produkujućih ćelija.

[0083]U nekim predmetima metoda, antitela se analiziraju primenom ELISA testa ili drugih testova kojima se meri vezivanje antitelo-antigen poznato u struci. Crovvther, J. R. (2001) The ELISA guidebook, 1st ed. Humana Press, Totowa, NJ.

[0084]Ovim skrining testovima se mogu analizirati hipermutirajući hibridomi koji proizvode antitela većeg afiniteta od onih koje proizvode roditeljski hibridomi.

[0085]Metoda metode može dalje da sadrži selektovanje hipermutirajućih ćelija koje proizvode antitela koje imaju veći titar antitela odo onog koji proizvode prvobitno selektovane ćelije.

[0086]Metode fuzije imunoglobulin-produkujućih ćelija i ćelija mijeloma korisnih u ovakvim metodama, takođe su poznate u struci. Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 1976. 6:511-9. Derivation of specific antibodv-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion.

[0087]Humane B-ćelije koje se koriste za dobijanje MAb projektovanih za primenu kod ljudi, mogu da budu potencijalni nosač viralne transmisije. Fuzione partner ćelije i jednojedrene ćelije periferne krvi (PBMC) donora mogu proći prethodni skrining da se potvrdi odsustvo viralne DNK, na primer, primenom PCR, uključujući imunodeficijenciju-1 i 2, hepatitis

B i C, citomegalovirus, herpes-6, i Epstein Barr virus.

[0088]Ovaj pronalazak još sadrži antitela za ciljne antigene koje proizvode ćelije hibridoma dobijene prema metodama koje su ovde obelodanjene. Antitela iz ovog pronalaska još uključuju antitela dobijena rekombinantnom tehnikom uz primenu polinukleotida iz ovog pronalaska. Antitela iz ovog pronalaska su u potpunosti humana monoklonalna antitela.

[0089]Poželjna antitela iz ovog pronalaska specifično vezuju epitop, na primer pravilni epitop, ciljnog antigena. Antitela iz pronalaska su poželjno usmerena protiv bolešću-povezanog antigena, na primer, ali se ne ograničavaju na GM-CSF.

[0090]Ćelije koje proizvode antitela stavljene su u Amer. Type Cult. Coll. (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 18. 01. 2007. (10G9), i 02. 02. 2007. (E10) i dati su im brojevi PTA-8173, odnosno PTA-8193. Primeri anti-GM-CSF antitela iz ovog pronalaska su antitela koja proizvode te ćelije.

[0091]Stručna lica će prepoznati da se specifičnost antitela prvenstveno određuje pomoću šest CDR regiona, posebno CDR3 H lanca (Kala M et al. (2002) J. Biochem. 132:535-41; Morea V et al. (1998) J. Mol. Biol. 275:269-94; i Chothia C et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-17). Okvirni regioni antitela, međutim, mogu da imaju izvesnu ulogu u interakcijama antigen-antitelo (Panka DJ et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3080-4), posebno imajući u vidu njihovu ulogu u potvrđivanju CDR petlji (Foote J et al. (1992) J. Mol. Biol. 224:487-99). Prema tome, antitela iz ovog pronalaska mogu da sadrže kombinaciju regione CDR ili FWR K ili L lanca koji doprinose specifičnosti antitela za GM-CSF. Eksperimenti mešanja domena, koji se rutinski vrše u struci (Jirholt P et al. (1998) Gene 215:471-6; Soderlind E et al. (2000) Nature Biotechnology 18:852-6), mogu se izvesti radi stvaranja antitela koja se specifično vezuju za GM-CSF prema ovde opisanim i pokazanim specifikacijama. Antitela dobijena takvim mešanjem domena spadaju u područje sadašnjeg pronalaska.

[0092]Potrebno je shvatiti da, zbog prirodne varijacije sekvence koja verovatno postoji u teškim i lakim lancima i genima koji ih enkodiraju, stručno lice bi očekivalo da pronađe varijacije izvesnog nivoa u okviru sekvenci amino kiselina ili gena koji ih enkodiraju, a da se zadrže jedinstvene osobine vezivanja (npr. specifičnost i afinitet) antitela iz sadašnjeg pronalaska. Ovakvo očekivanje postoji delimično zbog degeneracije genetskog koda, kao zbog poznatog evolutivnog uspeha konzervativnih varijacija u sekvencama amino kiselina, što ne menja primetno prirodu kodiranog proteina. U skladu sa tim, ovakve varijacije i homolozi smatraju se suštinski istim i spadaju u područje sadašnjeg pronalaska.

[0093]Antitela iz ovog pronalaska, prema tome, uključuju varijante sa jednom ili više supstitucija, brisanja, dodavanja ili zamena amino kiselina kojima se održavaju biološka svojstva (npr., afinitet vezivanja ili aktivnost imunološkog efektora) antitela iz ovog pronalaska. Stručno lice može da proizvede varijante sa jednom ili više supstitucija, brisanja, dodavanja ili zamena amino kiselina. Te varijante mogu da uključe, inter alia: (a) varijante kod kojih su jedna ili više rezidua amino kiselina supstituisane konzervativnim ili nekonzervativnim amino kiselinama, (b) varijante kod kojih su jedna ili više amino kiselina dodate polipeptidu ili izbrisane iz njega, (c) varijante kod kojih jedna ili više amino kiselina uključuju supstituentnu grupu i (d) varijante kod kojih je polipeptid stopljen sa drugim peptidom ili polipeptidom kao što je partner u fuziji, oznaka proteina ili neko drugo hemijsko mesto, i tako obezbede korisne osobine tog polipeptida kao što su, na primer, epitop za antitelo, polihistidinska sekvenca, biotinsko mesto i slično. Antitela iz sadašnjeg pronalaska mogu da uključe varijante u kojima su rezidue amino kiselina iz jedne vrste supstituisane odgovarajućom reziduom druge vrste, bilo na zaštićenom ili nezaštićenom mestu. U drugim predmetima patenta, rezidue amino kiselina na nezaštićenim mestima zamenjene su konzervativnim i nekonzervativnim reziduama. Tehnike za dobijanje tih varijanti, uključujući genetske (supresija, delecija, mutacija itd.), hemijske i enzimatske tehnike, poznate su licu osnovne stručnosti.

[0094]Stručna lica će, međutim, prepoznati da će se, u nekim slučajevima, uparivanjem datih teških lanaca sa različitim lakim lancima, ili uparivanjem datih lakih lanaca sa različitim teškim lancima dobiti antitela iste ili bolje specifičnosti, odnosno afiniteta od nativne kombinacije. U skladu sa tim, ovaj pronalazak se ne ograničava na poželjne kombinacije parova H i L lanaca, a antitela iz pronalaska tako obuhvataju različite kombinacije parova H i L lanaca, uključujući, između ostalog, ovde opisane H i L lance, ili neke druge H ili L lance koji bi bili poznati stručnom licu ili na drugi način eksperimentalno određeni u smislu kompatibilnosti sa ovde opisanim H i L lancima da bi se dobilo specifično vezivanje visokog afiniteta za GM-CSF.

[0095]Poželjna antitela ovog pronalaska sadrže dva teška lanca. Poželjna antitela ovog pronalaska sadrže dva laka lanca. Poželjnija su antitela koja sadrže dva teška i dva laka lanca iz pronalaska.

[0096]Antitela iz ovog pronalaska uključuju varijante sa jednom ili više supstitucija, delecija dodavanja ili zamena amino kiselina kojima se zadržavaju biološke osobine (npr., afinitet vezivanja ili imunološka aktivnost efektora) antitela ovog pronalaska. Stručno lice može da proizvede varijante sa jednom ili više supstitucija, delecija dodavanja ili zamena amino kiselina. Te varijante mogu da uključe, inter alia: (a) varijante u kojima su jedna ili više rezidua amino kiselina supstituisane konzervativnim ili nekonzervativnim amino kiselinama, (b) varijante u kojima su jedna ili više amino kiselina dodate ili izbrisane iz polipeptida, (c) varijante u kojima jedna ili više amino kiselina sadrže supstituentnu grupu i (d) varijante u kojima je polipeptid u fuziji sa drugim peptidom ili polipeptidom kao što je partner u fuziji, oznaka proteina ili neko drugo hemijsko mesto, čime se mogu dodati korisne osobine polipeptidu, na primer, epitop za antitelo, polihistidinska sekvenca, biotinsko mesto i slično. Antitela ovog pronalaska mogu da sadrže varijante u kojima su rezidue amino kiselina jedne vrste supstituisane odgovarajućom reziduom druge vrste kako na zaštićenom, tako i na nezaštićenom mestu. U drugom predmetu patenta, rezidue amino kiselina na nezaštićenim mestima se supstituišu konzervativnim ili nekonzervativnim reziduama. Tehnike za dobijanje tih varijanti, uključujući genetske (supresija, delecija, mutacija itd.), hemijske i enzimatske tehnike, poznate su licu osnovne stručnosti. Antitela ovog pronalaska sadrže i fragmente antitela. "Fragment" se odnosi na sekvence polipeptida koje imaju poželjno najmanje oko 40, poželjnije najmanje oko 50, poželjnije najmanje oko 60, poželjnije najmanje oko 70, poželjnije najmanje oko 80, poželjnije najmanje oko 90, a još poželjnije najmanje oko 100 amino kiselina u dužini, koji zadržavaju neku biološku ili imunološku aktivnost sekvence pune dužine, na primer, afinitet ili žudnja za vezivanjem i imunološku aktivnost efektora.

[0097]Antitela ovog pronalaska imaju afinitet vezivanja za ciljni antigen takav koji uključuju konstantu disocijacije (KD) nižu od 10<10>. U jednom predmetu patenta, KD je niža od 1 x 10"11. U nekim predmetima patenata, KD je niža od 1 x 10<12.>U drugim predmetima patenata, KD je niža od 1 x 10~<13>. U drugim predmetima patenata, KD je niža od 1 x 10<14>. U nekim drugim predmetima patenata, KD je niža od 1 x 10~<15>.

[0098]Antitela ovog pronalaska sadrže derivate koji su izmenjeni, npr., kovalentnim priključkom bilo kog tipa molekula za antitelo tako da taj kovalentni priključak ne sprečava antitelo da se veže za svoj epitop. Primeri pogodnih derivata uključuju, između ostalog, glikozilizovana antitela i fragmente, acetilizovana antitela i fragmente, pegilizovana antitela i fragmente, fosporilizovana antitela i fragmente, kao i amidizovana antitela i fragmente. Antitela ovog pronalaska mogu i sama da se derivatizuju poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, vezom sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinima i slično. Dalje, antitela ovog pronalaska mogu da sadrže jednu ili više neklasičnih amino kiselina kao što je opisano u prethodnom tekstu. U nekim predmetima ovog patenta, GM-CSF ili njegovi epitopi konjuguju se u imunogeni protein kako bi pojačali imunogenost antigena. Taj imunogeni protein može biti bilo koji protein koji pojačava imunološki odgovor ćelija, na primer, između ostalih, tetanus toksoid C (TT), hemocijanin iz morskih puževa (KLH), albumin, ovalbumin, albumin iz belanceta (CAB), albumin iz goveđeg seruma, tiroglobulin, toksoid difterije, BCG, toksin kolere i slično. U nekim predmetima patenta, antigen se dobija denaturisanjem zrelog proteina.

[0099]Antitela ovog pronalaska mogu imati post-translaciona mesta koja se poboljšavaju usled aktivnosti ili stabilnosti antitela. Ta mesta uključuju sumpor, metil, ugljeni hidrat, fosfor, kao i druge hemijske grupe koje se često sreću na molekulima imunoglobulina.

[0100]Antitela ovog pronalaska mogu da budu bilo koji izotop. Pri čemu se taj izotop antitela može izmeniti in vivo zamenom klase ili genetskim projektovanjem.

[0101]Ovde se obelodanjuju nukleotidne sekvence koje enkodiraju polipeptide iz ovog pronalaska. Nukleinske kiseline ovog pronalaska uključuju, između ostalog, genomsku DNK, DNK, cDNK, RNK, nukleinske kiseline duplog i jednostrukog lanca, kao i njihove komplementarne sekvence.

[0102]U nekim predmetima patenta, polinukleotidi ovog pronalaska (i peptidi koje oni enkodiraju) uključuju vodeću sekvencu. Može se upotrebiti bilo koja vodeća sekvenca poznata u struci. Ta vodeća sekvenca može da uključi, između ostalog, restriktivno mesto, odnosno startno translaciono mesto.

[0103]Takođe se obelodanjuju ekspresioni vektori koji sadrže polinukleotide koji enkodiraju antitela ovog pronalaska i ćelije domaćina kao što su, između ostalog, rekombinantne ćelije domaćina, eksprimujući polinukleotide.

[0104]Obezbeđuju se rekombinantni ekspresioni vektori koji sadrže sekvencu koja enkodira polipeptid od interesa. Taj ekspresioni vektor može da sadrži jednu ili više dodatnih sekvenci kao što su, između ostalog, regulatorne sekvence (npr., promoter, pojačivač), selekcioni marker, kao i signal poliadenilacije.

[0105]Rekombinantni ekspresioni vektori uključuju sintetske, genomske ili iz cDNA-izvučene nukleinske fragmente koji enkodiraju najmanje jedan rekombinantni protein koji se može operativno povezati sa odgovarajućim regulatornim elementima. Ovi regulatorni elementi mogu da uključe transkripcioni promoter, sekvence koje enkodiraju mRNK ribozomalna mesta vezivanja, kao i sekvence koje kontrolišu završetak transkripcije i translacije. Ekspresioni vektori, posebno ekspresioni vektori sisara, mogu da uključe i jedan ili više nestranskribovanih elemenata kao što je poreklo replikacije, odgovarajući promoter i pojačivač povezan sa genom koji treba eksprimovati, druge netranskribovane sekvence bočno uz 5' ili 3', netranslantirane sekvence 5' ili 3' (kao su neophodna ribozomalna mesta vezivanja), mesto poliadenilacije, upletena mesta donora i primaoca ili transkripcione sekvence za završetak. Može se uključiti i poreklo replikacije koja nosi sposobnost replikacije u domaćinu.

[0106]Transkripcione i translacione kontrolne sekvence u ekspresionim vektorima koji se upotrebljavaju u transformaciji ćelija kičmenjaka mogu se dobiti iz virusnih izvora. Primer i vektora mogu se konstruisati prema opisu u Okavama and Berg (1983) Mol. Cell. Biol. 3:280.

[0107]Selekcioni markeri koji se mogu upotrebiti u sistemu uključuju one poznate u struci, kao što su pozitivni i negativni selekcioni markeri, kao što su, između ostalog, geni rezistentni na antibiotike (npr., gen rezistentan na neomicin, gen rezistentan na higromvcin, gen rezistentan na kanamicin, gen rezistentan na tetraciklin, gen rezistentan na penicilin), HSV-TK, HSV-TK derivati za selekciju ganciklovira, ili gen bakterijske purinske nukleozidne fosforilaze za selekciju 6-metilpurina (Gadi et al. (2000) Gene Ther. 7:1738-1743). [0034] Sekvenca nukleinske kiseline koja enkodira selekcioni marker ili mesto kloniranja može biti pre ili posle sekvence nukleinske kiseline koja enkodira polipeptid od interesa ili mesto kloniranja.

[0108]Vektor može da sadrži jedan ili više promotora kao što su, između ostalog, konstitutivni, induktivni, domaćin-specifičan, odnosno tkivo-specifičan promotor. Na primer, često korišćeni promotori i pojačivači dobijaju se iz humanog citomegalovirusa (CMV), adenovirusa 2, virusa majmuna 40 (SV40), kao i polioma. Virusni genomski promotori, kontrolne i signalne sekvence mogu se koristiti za pokretanje ekspresije, a zavise od kompatibilnih ćelija domaćina. Promotori dobijeni od domaćinskih gena takođe se mogu upotrebiti (npr., (3-globin, timidin kinaza, kao i EF-1a promotori), u zavisnosti od identiteta tipa ćelije u kojoj vektor treba eksprimovati. Promotor može da se nalazi pre sekvence nukleinske kiseline koja enkodira jedan ili više polipeptida od interesa.

[0109]Vektori mogu da sadrže jedno ili više internih mesta za ulazak ribozoma (IRES). Uključivanje IRES sekvence u fuzioni vektor može biti od koristi za pojačanje ekspresije nekih proteina.

[0110]Ovaj vektorski sistem može da sadrži jedno ili više mesta poliadenilacije (npr. SV40), koje može da se nalazi pre ili posle bilo koje gore pomenute sekvence nukleinske kiseline.

[0111]VeKtorske komponente mogu biti blisko povezane ili poredane tako da omoguće optimalni razmak za ekspresiju produkata gena (tj. uvođenjem "spejser" nukleotida između ORF), ili postavljene na neki drugi način. Regulatorni elementi, kao što je IRES motiv, takođe se mogu poredati tako da omoguće optimalni razmak za ekspresiju.

[0112]Ćelije transfektovane ekspresionim vektorima mogu se selektovati pod uslovima pozitivne selekcije i ispitati u pogedu ekspresije rekombinantnog proteina. Rekombinantno-pozitivne ćelije se ekspandiraju i ispitaju u pogledu subklona koji ispoljavaju željeni fenotip.

[0113]Ćelije, uključujući i eukariotske ćelije, mogu se transformisati ekspresionim vektorima. U skladu sa tim, obelodanjuje se ćelija domaćina transformisana ekspresionim vektorom. Pogodne ćelije domaćina su, poželjno, eukariotske ćelije, poželjnije biljnog, glodarskog ili humanog porekla, na primer, između ostalog, NSO, CHO, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293 ćelije, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L ćelije, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 ćelije mijeloma, kao i BHK ćelijske linije, između ostalih.

[0114]U načelu, transfekcija će se sprovesti primenom suspenzije ćelija, ili jedne ćelije, mada se mogu primeniti i druge metode u stepenu u kome se dovoljna frakcija tretiranih ćelija ili tkiva ugrađuje u polinukleotid, čime se omogućava gajenje i upotreba transfektovanih ćelija. Tehnike za transfekciju su dobro poznate. U struci su poznati i neki protokoli transformacije. Videti, npr., Kaufman (1988) Meth. Enzymology 185:537. Stručna lica mogu lako shvatiti da se transformacioni protokol određuje po tipu ćelije domaćina i prirodi gena od interesa. Osnovne komponente bilo kojeg takvog protokola uključuju uvođenje sekvence nukleinske kiseline koja enkodira protein od interesa u odgovarajuću ćeliju domaćina, a zatim identifikaciju i izolovanje ćelija domaćina u koje je ugrađen DNK vektor na stabilan i ekspresivan način. Tehnike uvođenja polinukleotida uključuju, između ostalog, elektroporaciju, transdukciju, ćelijsku fuziju, upotrebu kalcijum hlorida, kao i pakovanje polinukleotida zajedno sa lipidom u cilju fuzije sa ćelijom od interesa. Ako je transfekcije stabilna, tako da se selektabilni marker gen eksprimuje na doslednom nivou kroz brojne generacije ćelije, onda se dobija ćelijska linija.

[0115]Jedan čest način transfekcije u ćelije sisara je taloženje kalcijum fosfata. Drugi način je polietilen glikolom (PEG) pokrenuta fuzija bakterijskih protoplasta i ćelija sisara. Schaffner et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163. Još jedan način je elektroporacija koja se takođe može upotrebiti za uvođenje DNK direktno u citoplazmu ćelije domaćina, kao što je opisano, na primer, kod Potteretal. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161.

[0116]Transfekcija DNK se može još vršiti primenom polilipozomskih reagenasa kao što su Lipofektin i Lipofektamin (dostupni kod Gibco BRL, Gaithersburg, MD) koji obrazuju komplekse lipida i nukleinske kiseline (ili lipozome), koji, kada se primene na ćelijskoj kulturi, olakšavaju preuzimanje nukleinske kiseline u ćelijama.

[0117]Kada se identifikuje ćelija koja eksprimuje željeni protein, ona se može ekspandirati i selektovati. Transfektovane ćelije se mogu selektovati na brojne načine. Na primer, ćelije se mogu selektovati radi ekspresije polipeptida od interesa. Kod ćelija kod kojih vektor sadrži i gen rezistentan na antibiotik, ćelije se mogu selektovati za rezistenciju na antibiotik, što je pozitivna selekcija ćelija koje sadrže vektor. Te ćelije se mogu pustiti da rastu pod odabranim uslovima.

[0118]Kada se identifikuje klon koji proizvodi protein, ta linija se može dalje ispitati radi identifikacije subklona koji imaju jedan ili više željenih fenotipova, kao što su, između ostalog, ćelije koje ispoljavaju ekspresiju u visokom titru, svojstva ubrzanog rasta, kao i sposobnost da daju proteine sa željenim biohemijskim karakteristikama, na primer, zbog modifikacije proteina i izmenjenih post-translacionih modifikacija. Ovi fenotipovi mogu nastati zbog postojećih svojstava datog subklona ili zbog mutageneze. Mutageneza se može uraditi primenom hemikalija, UV svetlosti, zračenja, virusa, ubačenih mutagena, oštećenog sistema za popravku DNK ili kombinacije ovih metoda.

[0119]U profilaktičkim primenama, farmaceutske formulacije se daju pacijentu osetljivom na neku bolest ili stanje ili pacijentu kod kojeg postoji rizik od neke bolesti ili stanja (npr. karcinoma, zarazne bolesti ili zapaljenske bolesti) u profilaktički delotvornoj količini. Osobe koja su u riziku su, između ostalog, osobe sa porodičnom istorijom karcinoma, zarazne bolesti ili zapaljenske bolesti, osobe koje su prethodno lečene od karcinoma, zarazne ili zapaljenske bolesti, kao i osobe koje imaju kliničke indikacije za povišenu verovatnoću od dobijanja karcinoma, zarazne ili zapaljenske bolesti. Drugim rečima rečeno, osoba u riziku je bilo koja osoba za koju se smatra da ima povišen rizik u odnosu na opštu populaciju da dobije karcinom, zaraznu ili zapaljensku bolest. Termin "profilaktički delotvorna količina" se odnosi na količinu neke formulacije koja proizvodi dejstvo koje se smatra prevencijom pojave ili recidiva karcinoma, zarazne ili zapaljenske bolest. Profilaktički delotvorne količine neke formulacije se obično određuju prema dejstvu koje ispoljavaju u odnosu na dejstvo koje ispoljava neka druga formulacija kojoj nedostaje aktivni agens, primenjena kod osobe koja je u sličnoj situaciji.

[0120]U terapijskim primenama, formulacije se daju pacijentu koji već boluje ili za koga se sumnja da boluje od neke ovakve bolesti u terapijski delotvornoj količini dovoljnoj da izleći, ili bar delimično zaustavi, simptome bolesti (biohemijski ili histološki), uključujuću njene komplikacije i fenotipove tokom razvoja bolesti.

[0121]U terapijskim i profilaktičkim režimima, agensi se obično daju u različitim dozama sve dok se ne postigne zadovoljavajući odgovor. Odgovor se obično prati, a ako on počne da jenjava, doze se ponavljaju.

[0122]Delotvorne doze monoklonalnih antitela za lečenje karcinoma, zarazne bolesti ili zapaljenske bolesti, kao što je ovde opisano, variraju u zavisnosti od mnogih različitih faktora uključujući sredstvo primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, drugih primenjenih lekova, kao i da li je lečenje profilaktičko ili terapijsko. Obično je pacijent čovek, ali se i ne-humani sisah takođe mogu lečiti.

[0123]Doziranje zavisi od težine i reakcije bolesti ili stanja koje treba lečiti, pri čemu lečenje traje od nekoliko dana do nekoliko meseci ili dok ne nastupi izlečenje ili se ne postigne smanjenje težine bolesti ili stanja. Optimalni plan doziranja može se izračunati na osnovu merenja akumulacije leka u telu pacijenta ili ispitanika. Lica osnovne stručnosti mogu lako odrediti optimalne doze, način primene i potrebu za eventualnim ponavljanjem. Optimalne doze mogu varirati u zavisnosti od relativne aktivnosti pojedinih antitela i, u slučaju istovremene primene, relativne aktivnosti poznatih primenjenih lekova za lečenje bolesti. Optimalne doze se obično mogu odrediti na osnovu EC50 (polovine maksimalne delotvorne koncentracije) čija je delotvornost potvrđena na in in vitro i in vivo životinjskim modelima.

[0124]U načelu, doza se kreće u opsegu od 0,01 mg do 100 g po kilogramu telesne mase i može se dati jednom ili više puta dnevno, mesečno ili godišnje ili čak na svakih 2 do 20 godina. Doza i učestalost primene mogu varirati u zavisnosti od toga da li je lečenje profilaktičko ili terapijsko. Kod profilaktičke primene, daje se relativno niska doza u relativno retkim intervalima tokom dugog vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju terapiju celog života. Kod terapijske primene, nekad je potrebna primena relativno visoke doze u relativno kratkim intervalima dok se ne smanji ili zaustavi progresija, a poželjno je dok se simptomi pacijenta delimično ili potpuno ne izgube. Posle toga, pacijent se može prebaciti na profilaktički režim.

[0125]Mada neke potrebe mogu varirati, određivanje optimalnih režima delotvornih količina formulacija spada u domen struke. Doze za primenu kod čoveka se mogu ekstrapolirati iz studija na životinjama (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20TH ED., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2000). U načelu, doza koja sadrži delotvornu količinu formulacije, koju može prilagođavati stručno lice, variraće u zavisnosti od starosti, zdravstvenog stanja, fizičke kondicije, telesne mase, vrste i stepena bolesti ili poremećaja primaoca, učestalosti primene, prirode istovremeno primenjene terapije (ako je ima) i od prirode i obima željenih efekata.

[0126]Farmaceutske formulacije iz ovog pronalaska mogu se formulisati sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju vodu, PBS, rastvor soli (kao što je Ringerov rastvor), alkohole, ulja, želatin, kao i ugljene hidrate kao što su laktoza, amiloza ili škrob, estre masnih kiselina, hidroksimetilcelulozu, kao i polivinil pirolidon. Ovi preparati se mogu stabilizovati i, po potrebi, mešati sa dodatnim materijama kao što su lubrikanti, konzervansi, stabilizatori, sredstva za vlaženje, emulzifikatori, soli za pokretanje osmotskog pritiska, puferi i boje. Farmaceutski nosači pogodni za upotrebu u sadašnjem pronalasku, poznati su u struci (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20TH ED., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2000).

[0127]Farmaceutske formulacije, koje se mogu pogodno napraviti u jediničnom obliku doziranja, mogu se pripremiti korišćenjem konvencionalne tehnike dobro poznate u farmaceutskoj industriji. Ove tehnike uključuju fazu dovođenja u vezu aktivnih sastojaka sa farmaceutskim nosačem (nosačima). U načelu, ove formulacije se dobijaju uniformnim dovođenjem u bliski kontakt aktivnih sastojaka sa tečnim nosačima ili fino podeljenim čvrstim nosačima ili oba. Ove formulacije se mogu upakovati u jednodozne ili višedozne kontejnere, na primer, u hermetički zatvorene ampule i bočice, a mogu se čuvati u zamrznutom ili liofilizovanom stanju u kom slučaju je potrebno samo dodati sterilni tečni nosač neposredno pre upotrebe.

[0128]Ove farmaceutske formulacije se obično formulišu kao sterilne, suštinski izotonične i u potpunoj saglasnosti sa svim propisima dobre proizvođačke prakse (DPP) Uprave za hranu i lekove SAD.

[0129]Dopunska uputstva u pogledu formulacija, doze i režima primene dostupna su u struci (Berkovv et al., 1997, THE MERCK MANUAL OF MEDICAL INFORMATION, Home, ed., Merck Research Laboratories, VVhitehouseStation, N.J.; Goodman et al., 1996,

GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 9th ed.

McGraw-Hill Health Professions Division, New York; Ebadi, 1998, CRC DESK REFERENCE OF CLINICAL PHARMACOLOGY, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Katzung, 2001, BASIC & CLINICAL PHARMACOLOGY, 8TH ED. Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub. Division, New York; Speight et al., 1997, AVERV'S DRUG TREATMENT: A GUIDE TO THE

PROPERTIES, CHOICE, THERAPEUTIC USE AND ECONOMIC VALUE OF DRUGS IN

DISEASE MANAGEMENT, 4TH ED. Adis International, Auckland/Philadelphia, PA).

[0130]Kada se koriste kao farmaceutska terapija, formulacije iz sadašnjeg pronalaska mogu se primeniti same ili zajedno sa drugim jedinjenjima ili formulacijama koje se koriste za lečenje bolesti, karcinoma, zarazne ili upalne bolesti. Primeri tih jedinjenja, koji se ovde nazivaju "pomoćna jedinjenja" ili "pomoćne formulacije," uključuju, između ostalog, antibiotike, anticitokine, antiastmatike, antifosfolipaze (npr., inhibitore fosfolipaze), vazodilatatore (npr., adenozin, beta-adrenergičke agoniste ili antagoniste, (3-adrenergičke blokatore, a-adrenergičke blokatore, diuretike, vazodilatatore hgaltkih mišića, nitrate i inhibitore angiotenzin konvertujućih enzima), biomolekule, citostatike, kao i hemoterapijske agense. Farmaceutske formulacije iz ovog pronalaska mogu da sadrže, na primer, jedno ili više pomoćnih jedinjenja. U nekim predmetima patenta, antitelo se konjuguje u pomoćno jedinjenje.

[0131]Ovde se još obelodanjuju kompleti, na primer, za lečenje karcinoma, zarazne ili upalne bolesti.

[0132]Ti kompleti sadrže antitelo ili formulaciju antitela iz ovog pronalaska i uputstvo za upotrebu kompleta u metodi za lečenje karcinoma, zarazne ili upalne bolesti kod pacijenta ili za sprečavanje biološke aktivnosti ciljnog antigena (npr. GM-CSF). Komplet može da sadrži uputstva, kao i sredstvo za primenu antitela ili formulacije antitela, na primer, putem injekcije.

[0133]Antitela iz ovog pronalaska mogu se upotrebiti za detektovanje antigena u biološkom uzorku kao što je, između ostalog, serum. Može se primeniti bilo koja metoda poznata u struci, na primer, između ostalog, protočna citometrija. Na primer, biološki uzorak se može inkubirati sa antitelom iz ovog pronalaska, a zatim se inkubacija opere obeleženim sekundarnim antitelom. Na primer, to sekundarno antitelo može se usmeriti ka lakom lancu i konjugovati u FITC ili fikoeritrin za potrebe detekcije.

[0134]Aktivnost antitela iz ovog pronalaska da neutrališu antigene može se ispitati testom neutralizacije antigena primenom bilo koje metode poznate u struci. Na primer, aktivnost antitela da neutrališu antigene može se proceniti primenom antigen-zavisnih ćelijskih linija. Primeri GM-CSF-zavisnih ćelijskih linija uključuju, između ostalog TF-1 i AML-193.

[0135]U prvoj analizi neutralizacije antigena, antigen-zavisne ćelije se suspenduju u test podlozi, test podloga sa antigenom se inkubira tokom jednog sata sa ispitivanim ili izotop kontrolnim antitelima. Posle perioda inkubacije, inhibicija rasta se ocenjuje bilo kojom metodom poznatom u struci. Na primer, reagens ćelijskog titra (Promega, Wl) se može dodati nakon čega sledi dalja inkubacija i spektrofotometrijsko merenje optičke gustine (O.D.) na 490 nm, posle čega se pozadina podloge oduzme od uzoraka. Procenat neutralizacije antigena izračunava se na sledeći način: 100 - [O.D. sa Ig / O.D. bez lg)x 100].

[0136]U drugoj analizi neutralizacije, antigen se pomeša sa anti-antigen antitelima iz ovog pronalaska. Antigen-zavisne ćelije se dodaju u mešavinu i ona se inkubira. Posle perioda inkubacije, meri se inhibicija rasta. Na primer, može se dodati marker DNK proliferacije MTS i meri se ugradnja boje. Smanjena ugradnja boje u prisustvu antitela u odnosu na ugradnju boje u odsustvu anti-antigen antitela ukazuje na neutralizaciju antigena.

[0137]Alternativno, antigen-zavisne ćelije se gaje u prisustvu antigena. Dodaju se sve veće količine antitela u tu hranljivu podlogu i aktivnost neutralizacije se procenjuje kao prethodno. Antitela iz ovog pronalaska i njihove farmaceutske formulacije mogu se upotrebiti u metodama inhibicije billoške aktivnosti ciljnog antigena, na primer, GM-CFS i u metodama za lečenje bolesti kao što su, između ostalog, karcinom, zarazna ili upalna bolest tako što se farmaceutske formulacije antitela iz ovog pronalaska daju pacijentu ili ispitaniku kojima su potrebne. Biološka aktivnost GM-CSF uključuje, između ostalog, GM-CSF receptor. Antitela iz ovog pronalaska i njihove farmaceutske formulacije mogu se upotrebljavati u primenjenim metodama, na primer, u cilju profilaktičkog ili terapijskog lečenja bolesti kao što su, između ostalog, karcinom, zarazne ili upalne bolesti. Antitela iz ovog pronalaska i njihove farmaceutske formulacije mogu se upotrebljavati u terapijskim metodama pogodnim za primenu kod ljudi i ne-humanih životinja. Ne-humane životinje koje imaju koristi od pronalaska uključuju kućne ljubimce, egzotične životinje (npr. u zoo vrtu) i domaće životinje. Poželjno je da te ne-humane životinje budu sisari.

[0138]Antitela iz ovog pronalaska mogu se davati kroz usta u bilo kom prihvatljivom obliku kao što su kapsule, tablete, vodene suspenzije, rastvori i silično. Ta antitela se mogu davati i parenteralno. To jest, na sledeće načine: supkutanom, intravenskom, intramuskularnom, intra-artikularnom, intra-sinovijalnom, intrasternalnom, intranazalnom, lokalno, intratekalno, intrahepatičkom, intralezionalnom, kao i intrakranijalnom injekcijom i infuzionim tehnikama. U načelu, antitela će se davati intramuskularnom ili intravenskom injekcijom.

[0139]Antitela iz ovog pronalaska mogu se davati sama ili sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, uključujući prihvatljive adjuvante, vehikulume i ekscipijense.

[0140]Antitela iz ovog pronalaska mogu se davati pre, posle ili istovremeno sa nekim drugim terapijskim agensom. Na primer, antitela iz ovog pronalaska mogu se davati sama ili sa nekim pomoćnim jedinjenjem.

[0141]Antitela iz ovog pronalaska mogu se davati kao homogene mešavine nekonjugovanih ili konjugovanih antitela ili kao heterogene mešavine nekonjugovanih ili konjugovanih antitela.

[0142]Delotvornost lečenja može se proceniti na različite načine. U jednom predmetu patenta, delotvornost lečenja karcinoma, zarazne ili upalne bolesti određuje se usporenom progresijom bolesti. U nekom drugom predmetu patenta, delotvornost terapije meri se pojačanim osećanjem boljitka pacijenta uključujući znake kao što su dobitak telesne mase, vraćena snaga, smanjenje bola, pacijent se fizički boljitak, kao i subjektivni znaci pacijenta o svom biljem zdravlju.

[0143]Da bi se pronalazak mogao lako shvatiti i praktično primeniti, navešćemo jedan ili više primera u kojima je bar jedan deo obelodanjenog materijala opisan na osnovu eksperimentalnog rada na razvoju pronalaska. Bilo koji primer opisan u nastavku teksta koji ne potpada pod okrilje zahteva, naveden je samo u informativne svrhe.

Primer 1

Pobijanje antigen specifičnih humanih MAbs za GM- CSF

Materijali i metode

[0144] Ex vivo imunizacija i kultura humanih B-ćelija.U svim potonjim procedurama, ćelije su gajene u 5% C02 na 37°C. Leukopakovi su dobijeni od zdravih osoba vakcinisanih protiv tetanus toksoida (TT). PBMC su prečišćene pomoću Ficoll-Plaque (Amersham BioSciences) i CD 19 pozitivnih B-ćelija, odnosno CD4 pozitivne T-ćelije su izolovane iz PBMC pomoću EasvSep® kompleta za selekciju humanih CD4, osnosno CD19 (StemCell Technologies) i pomešane da se dobije mešavina B-ćelija/T-ćelija (BT4 ćelije). BT4 ćelije su gajene u kompletnoj RPMI1640 (Invitrogen, CA) koja je sadržala 10% toplotom inaktivisanog humanog seruma AB (Nabi, FL), 2mM L-glutamina, 0.1 mM ne-esencijalnih amino kiselina, 1 mM natrijum piruvata, 55 mM 2-merkaptoetanola (Invitrogen, CA).

[0145]Radi ex-vivo imunizacije, BT4 ćelije su bile zajedno gajene u prisustvu T i B ćelijskih epitopa. BT4 ćelije su bile brzo zasejane u gustini od 106/ml_ u kompletnu RPMI koja sadrži 1 Lf/mL toksoida tetanusa (TT) (Cylex, MD) u prisustvu ozračenih autolognih PBMC u odnosu 1:1 radi dobijanja aktivisanih T ćelija (T-fond). U cilju dobijanja antigen-aktivisanih B-ćelija (B-fond), BT4 ćelije su bile zasejane u gustini od 3 x 10<6>ćelija/mL u kompletnu RPMI koja sadrži 10% humanog seruma AB, 5% podloge za kondicioniranje iz aktivisanih T-ćelija, 20 J/mL IL-2, 0,5 ng/mL IL-6, 100 J/mL IL-10 (PrepoTech, NJ) i 250 ng/mL koktela peptida (bio-World, OH) koji su predstavljali različite regije ciljnog antigena, sintetizovanih da sadrže i T i B ćelijske apitope kao što je prethodno opisano (Zafiropoulos et al. (1997) J. Immunol. Methods 200:181-90).

[0146]Ti selektovani epitopi B-ćelija za GM-CSF bili su: EHVNAIQEARRLLNL (SEQ ID

NO:3), STQPWEHVNAIQEAR (SEQ ID NO:4), MASHYKQHCPPTPET (SEQ ID NO:5).

[0147]T i B fondovi bili su zasebno gajeni 7 dana, a zatim zajedno gajeni (106 cell/mL) u odnosu 1:10 na monosloju ozračenih CHO ćelija za ishranu u kompletnoj RPMI koja sadrži 10% toplotom inaktivisanog humanog AB seruma i 400 U/ml IL-4 (PeproTech, NJ). T i B fondovi su posle pet dana spojeni i tako su dobijeni hibridomi, kao što je već opisano.

[0148]U cilju imortalizacije B ćelija pulmonarne alveolarne proteinoze (PAP) pacijenata, obrađeno je 100 ml_ cele krvi da se prečiste PBMCs. Limfociti su gajeni tokom for 7-10 dana u kompletnoj RPMI koja sadrži 10% toplotom inaktivisanog seruma goveđeg fetusa (FBS), (JRH Biosciences, KS), 2 ng/mL IL-4 (PeproTech, NJ), 2 mM L-glutamina, 0,1 mM ne-esencijalnih amino kiselina, 1 mM natrijum piruvata, 55 mM 2-merkaptoetanola (Invitrogen, CA), 50 mg/mL transferina, 5 ng/mL forbol miristat acetata (PMA) i 0,5 mg/mL ciklosporina A (Sigma, MO), u prisustvu ozračenih CHO ćelija za ishranu. Limfociti su zatim elektro-spojeni kao što je već opisano.

[0149] Fuzija ćelija i Enzvme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) test antigen-

reagujućih hibridoma.Humane B-ćelije upotrebljene za dobijanje MAb dizajniranih za primenu kod ljudi mogu da predstavljaju potencijalni vehikulum za viralnu transmisiju. Ćelije partneri u fuziji i PBMC od zdravih donora bile su prethodno pregledane primenom PCR-a radi potvrđivanja odsustva viralne DNK, uključujući imunodeficijenciju-1 i 2, hepatitis B i C, citomegalovirus, herpes-6, kao i Epstein Barr viruse. Limfociti su bili spojeni K6H6/B5 ćelijama (ATCC, VA) upotrebom CYTOPULSE CEEF-50 aparata (Cyto Pulse Sciences, Inc., MD) u odnosu limfociti i K6H6/B5 1:1.

[0150]Posle fuzije, ćelije su bile zasejane na mikroploče sa ravnim dnom od po 96 otvora pri -5,000 ćelija/otvoru u kompletnu RPMI koja sadrži 10% toplotom inaktivisanog FBS, 2mM L-glutamina, 0,1 mM ne-esencijalnih amino kiselina, 1 mM natrijum piruvata, 55 mM 2-merkaptoetanola (Invitrogen, CA), 100 mM hipoksantina, 0,4 mM aminopterina i 16 mM timidina (HAT, Sigma, MO). Podloga je menjana jednom nedeljno i HAT selekcija je održavana sve do završetka skrininga reaktivnosti antigena (3-5 nedelja).

[0151]U cilju identifikacije antigen-reagujućih MAb, robotski je sproveden ELISA skrining primenom BIOMEK FX sistema za rukovanje tečnostima integrisanom u perač ploča i spektrofotometar. Mikrotitar ploče su obložene na sobnoj temperaturi tokom 6 sati sa 50 mL/otvoru lokalno proizvedenog rekombinantnog antigena (1 mg/mL GM-CSF) rastvorenog u puferu za oblaganje (50 mM karbonat-bikarbonat, pH 9,4). Ploče su zatim blokirane puferom za vezivanje (PBS koji sadrži 1% BSA (Sigma, MO) i 0,05% Tweena 20 (BioRad, CA)) na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Ploče su oprene jednom puferom za pranje (PBS koji sadrži 0,05% Tweena 20) i 50 mL/otvoru hibridom supernatanta je prebačeno na ELISA ploče. Reakcija vezivanja je izvršena na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Ploče su, zatim, oprane 4 puta i dodato je 100 mL kozjeg anti-humanog IgG+M konjugovanog ren peroksidazom (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA) u razblaženju 1:10,000 u puferu za vezivanje i reakcija je izvršena na sobnoj temperaturi tokom 1,5 sata. Na kraju, ploče su oprane 4 puta i 100 mL/otvoru SureBlue supstrata (KPL, MD) je dodato tokom 10 min. Reakciju su zaustavljene dodavanjem 50 mL/otvoru 1 N sumporne kiseline i apsorbancija izmerena na 450 nm.

[0152] Analize fluorescentno-aktivisanog sortiranja ćelija (FACS).Koraci vezivanja Ig i pranja ćelija bili su sprovedeni primenom ledenog pufera za vezivanje (DPBS) bez kalcijuma ili magnezijuma, 0,5% BSA), reakcije su postavljene na mikro ploče sa V-dnom i uzorci analizirani primenom FACSAria aparata (BD Biosciences, NJ). Za FACS eksperiment prikazan na slici 3A, 106 ćelija mišjeg anti-GM-CSF hibridoma (Mul19/2) su bile opterećene sa 100 ng/reakciji GM-CSF i zatim inkubirane sa anti-GM-CSF humanim MAb E5. Vezivanje GM-CSF specifičnih MAb detektovano je pomoću 10 mg/mL FITC obeleženog kozjeg anti-humanog Ig (SouthernBiotech, AL). Za FACS eksperiment prikazan na slici 3B, E10 ćelije hibridoma su bile oprane i zasejano je 500,000 ćelija po otvoru u količini od 90 mL. Deset mL fikoeritrina (PE)-obeleženog GM-CSF (R&D Svstem, MN) je onda dodatu u svaki otvor i ćelije su inkubirane na ledu tokom jednog sata. Za takmičenje neobeleženih GM-CSF, ćelije hibridoma bile su prethodno inkubirane sa 5 mg/mL rekombinantnog humanog GM-CSF (PeproTech, NJ) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi, oprane tri puta, a zatim inkubirane sa PE-GM-CSF, kao prethodno pre analize. Kod FACS eksperimenta prikazanog na slici 4, A431 i A431-K5 ćelije (poklon Dr. Ira Pastan, National Cancer Institute) bile su obojene sa 10 mg/mL C12 MAb ili normalnog humanog IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA) razblaženog u puferu za vezivanje posle čega su reakcije izvršene kao prethodno.

[0153] Biološka analiza neutralizacije GM-CSF.GM-CSF-zavisna ćelijska linija humane eritroleukemije TF-1 (ATCC, VA) gajena je u kompletnoj RPMI 1640 (videti gore) koja sadrži 10 ng/mL rekombinantnog humanog GM-CSF (PeproTech, NJ). Dan pre eksperimenta, TF-1 ćelije su gajene u 0,1% FBS u odsustvu GM-CSF. Izgladnele ćelije su oprane dva puta, resuspendovane u test podlozi i zasejane na mikroploče sa po 96 otvora u koncentraciji od 10,000 ćelija/otvoru. Otvori su sadržali ili test podlogu, 100 pg/mL GM-CSF, ili GM-CSF prethodno inkubiran jedan sat sa ispitivanim ili izotop kontrolnim Ig u koncentraciji prikazanoj na slici. Posle 3 dana u svaki otvor je dodato 40 mL Cell Titer reagensa (Promega, Wl) i ploče dalje inkubirane na 37°C tokom 1 sata. Optička gustina (O.D.) je merena spektrofotometrijski na 490 nm i osnovna podloga oduzeta svim uzorcima. Procenat neutralizacije GM-CSF izračunat je na sledeći način: 100 - (O.D. sa Ig / O.D. bez Ig x 100).

[0154] Promena klase antitela.Ćelije hibridoma su oprane jednom sa 10 mL PBS, resuspendovane u kompletnoj RPMI, zasejane na mikroploče sa ravnim dnom sa po 96 otvora i inkubirane na 37°C u 5% C02. Posle četiri dana, ćelije su bile resuspendovane pipetiranjem i 100 mL je preneto na 20 ELISPOT ploča (Millipore, MA) obloženih sa 2,3 mg/mL kozjim anti-humanim IgG (H+L) (Jackson Immunoresearch, PA). Preostale ćelije na tkivnim pločama su hranjene dodavanjem 100 mL kompletne RPMI. Posle inkubacije tokom noći, ELISPOT ploče su isprane tri puta PBS-om koji sadrži 0,05% Tvveena (PBST), a potom je dodato 100 mL 2 mg/mL kozjeg anti-humanog IgG (H+L)-HRP i ploče opet inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploče su oprane tri puta sa PBST, zatim je 100 mL AEC supstrat rastvora (Sigma, St. Louis, MO) dodato u otvore i inkubirano tokom 90 minuta na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Supstrat je usisan, a ploče oprane sa dH20 i ostavljene na vazduhu da se osuše. Klonovi iz otvora koji su imali pozitivne tačke (ukazujući na proizvodnju IgG) bili su ekspandovani. Ovaj korak je uzastopno ponavljan presejavanjem pozitivnih klonova u koncentraciji od 1000, 100, 10 i 0,25 ćelija/otvoru uz praćenje pozitivnih otvora sve dok nije identifikovana jednoćelijska kolonija koja je lučila IgG.

[0155] Fermentacija šupljim vlaknima u bioreaktoru sa mešalicom.Ćelije su zasejane u koncentraciji 2,5 x 105/mL u biorektoru od 2 L (B Braun Stat B-DU) u kome se nalazio 1 L HyQCDM4NS0 podloge bez seruma (HvCIone, UT) održavajući koncentraciju glukoze, odnosno glutamina od 6 g/L, odnosno 4 mM. Kontrolisani parametri bili su: pH 7,1, d02 40% zasićenje vazduhom, temperatura 37°C i brzina mešanja 80 o/min. Dnevno je skidan rast od po 2 mL uzorka, 1 mL za prebrojavanje ćelija primenom aparata Cedex i 1 mL za merenje koncentracije Ig primenom ELISA. Za fermentaciju šupljeg vlakna, 108 živih ćelija je preneto i sistem FiberCell (Bellco, NJ) u kome se nalazilo 15 mL kompletne RPMI, koje su ponovo hranjene pomoću linijskog rezervoara u kome se nalazio jedan litar sveže podloge kada je potrošeno 50% glukoze.

[0156] Inhibicija sistema za popravku radi povećanja genetske raznolikosti linija

hibridoma.Ćelije hibridoma su gajene u kompletnoj RPMI (negativna kontrola) ili kompletnoj RPMI sa sadržajem od 250 mM ili 500 mM MMR-inhibišućeg antracenskog jedinjenja. Ćelije su svaka tri do četiri dana propuštane pri razblaženju 1:5 u svežu podlogu sa morfocenom ili bez njega i posle tri nedelje su skinute i resuspendovane u koncentraciji 2 x 106 ćelija/mL u FACS puferu (PBS sa 1% BSA). Ćelije su obojene sa 10 mg/mL FITC-conjugovanog kozjeg anti-humanog Ig (Jackson Immunoresearch) tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su oprane sa 10 mL ledenog FACS pufera i resuspendpvane u 3 mL FACS pufera. 10

mL Viaprobe (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) dodavano je tokom 5 minuta na ledu, a žive ćelije sortirane u pogledu visokog Ig površinskog obojenja primenom FACSAria uređaja za sortiranje ćelija (Becton Dickinson). Prolaz je podešen da sortira ćelije koje predstavljaju 5% subpopulacije sa najvećim Ig površinskim obojenjem. Radi selekcije klonova sa povišenim titrom, FACS sortirane ćelije su zasejane na ploče sa U dnom i po 96 otvora i inkubirane jednu nedelju na 37°C u 5% C02. Iz otvora je skinuto 50 mL gornjih tečnosti i analizirano ELISA testom na produkciju IgM uz upotrebu ploča obloženih kozjim anti-humanim IgM+G. Kao interna kontrola, 3 otvora na svakoj ELISA ploči zasejani su sa 50 mL 10 ng/mL humanog IgM (Jackson Immunoresearch). O.D. vrednosti dobijene na 450 nm normalizovane su na srednje vrednosti internih kontrolnih otvora. Otvori koji su davali jake IgM signale bili su ekspandirani radi dalje analize. Za analizu nestabilnosti mikrosatelita (MSI), ekstrahovana je DNK iz roditeljskih ili morfocen-tretiranih ćelija pomoću Qiagen DNeasv Tissue kompleta (Qiagen). BAT poli A ponovljeni marker (7) je pojačan primenom D4 fluorescentno obeleženog BAT-26-F (5'-tcaccatccattgcacagtt-3') (SEQ ID NO:20) i BAT-26-R (5'-ctgcgagaaggtactcaccc-3') (SEQ ID NO:21) prajmera, pfuUltra™ high-fidelity polimeraze (Stratagene, CA) i reakcija je inkubirana na sledeći način: 5 min. na 95°C; 9 ciklusa od 1 min. na 94°C, 1 min. na 60°C i 2 min. na 72°C, pri čemu se temperatura smanjivala za 1°C u svakom ciklusu; 30 ciklusa od 1 min. na 94°C, 1 min. na 52°C i 2 min. na 72°C; završna ekstenzija od 10 min. na 72°C. Po jedna kopija marker alela je dobijena razblaženjem DNK koje je dalo amplikon u samo 50% PCR reakcija. PCR produkti su razblaženi 1:10 sa CEQ rastvorom uzorka, a zatim stavljeni u Beckman CEQ 8000 Genetic Analvsis Svstem radi analize fragmenata.

[0157] Dobijanje antigen-specifičnih humanih MAb.Ex- vivoimunizacija je izvršena korišćenjem krio-sačuvane B-ćelije dobijene od dobrovoljaca (zdravih donora) kao što je gore opisano. Alternativno, B-ćelije su dobijene od ljudi ispitanika čiji je serum imao visok titar MAb specifičnih za antigen od interesa. Obrazloženje za ova poslednji pristup proizilazi iz mogućnosti da bi neka antigen-specifična MAb mogla poticati od abnormalnog imunološkog odgovora (kao u slučaju autoimunih pacijenata), ili odin vivoimunološkog odgovora na tumor, mikroorganizme ili antigene iz vakcina.

[0158]Nekoliko antigen-reagujućih MAb je identifikovano posle fuzijeex- vivoimunizovanih ćelija i iz biblioteka hibridoma dobijenih of B ćelija PAP pacijenata. Za buduće studije je selektovano 4 linije hibridoma, E5 (IgM), G7 (IgM), E10 (IgG) i G9 (IgG), a humana MAb koja oni proizvode ispitana su u pogledu specifičnosti ELISA testom. Slika 1 prikazuje da E5, G7 i E10 humana MAb reaguju samo sa humanim GM-CSF i ni sa jednim od deset nesrodnih ispitanih antigena, uključujući mišji GM-CSFkoji je u 53% identičan ljudskom homologu. Slični rezultati su dobijeni za G9 hibridom. FACS analize su sprovedene radi potvrde specifičnosti tih humanih MAb. Humanom GM-CSF je bilo dozvoljeno da se veže za površinu ćelija mišjeg hibridoma, čime se eksprimuju za membranu vezana MAb koja su specifična za humani GM-CSF na različitom epitopu. E5 MAb su vezala površinu ovih ćelija pod ovim uslovima, na šta ukazuje promena intenziteta fluorescencije (slika 2A, donji panel). Ovaj rezultat dokazuje sposobnost E5 MAb da se veže za nativni humani GM-CSF. U odsustvu za ćeliju vezanog GM-CSF, E5 MAb nisu unakrsno reagovala ni sa jednim za membranu vezanim proteinom eksprimovanim ovim ćelijama hibridoma (slika 2A, srednji panel). Slično tome, E10 MAb su pokazala visoku specifičnost u FACS analizi. Osim toga, od kada je otkriveno da je E10 MAb bilo udruženo sa ćelijskom membranom hibridoma, pokazana je, primenom FACS, njegova sposobnost da veže rastvorljivi, fikoeritrin (PE)-obeležen GM-CSF (slika 2B, srednji panel). Specifičnost vezivanja bila je dokazana prethodnom inkubacijom E10 ćelija hibridoma sa neobeleženim GM-CSF u višku (slika 2B, donji panel).

[0159]De novopromena klase humanih MAb.Koristeći gore opisane dve strategije, dobijena su IgG i IgM humana MAb za različite humane i ne-humane antigene. Mada je većina terapijskih antitela u markeru IgG izotipa, ispitivanja karcinoma kojima su ispitivana potencijalno terapijska IgM MAb pokazala su regresiju tumorain vivo(16, 17). Ovi klinički odgovori mogu se pripisati sposobnosti IgM da snažno fiksira i aktivira putanju komplementa i da uspešno ubije tumorske ćelije. IgG se vezuje za Fc receptore na makrofagama i NK ćelijama i tako posreduje u ADCC aktivnosti protic tumorskih ćelija. IgG, kao i IgM identične specifičnosti (isti antigen i epitop) mogu se ispitatiin vivou pogledu farmakološke aktivnosti. U slučaju kada je neki IgG izotop poželjan, primenjuje se brza izdržljiva procedura (videti pod „Materijali i metode") zade novopromenu klase IgM. Koristeći E5 liniju kao primer, identifikovana je podgrupa ćelija koje su promenile klasu na IgG izotop u uslovima rasta. To E5 IgG ispoljilo je istu sekvencu nukleotida u svom varijabilnom regionu i sličnu reaktivnost na GM-CSF (slika 3) kao roditeljsko E5 IgM.

[0160] Biološka aktivnost humanih MAb.Farmakološke osobine potrebne terapijskim MAb koja ciljaju rastvorljive medijatore bolesti uključuju sposobnost neutralizacije faktora rasta. Kao što je prethodno pomenuto, jedan takav primer je GM-CSF kao medijator RA (9-11). Procenjivana je sposobnost humanih MAb da blokiraju funkciju GM-CSF pomoću ćelijske probe gde rast humanih eritroblastoidnih ćelija (TF1) zavisi od prisustva ovog citokina. Kao što je pokazano na slici 4, E10, kao i G9 su u znatnoj meri inhibisali rast GM-CSF-zavisnih ćelija, dok kontrola koja je bila humani IgG izotip nije pokazivala nikakav efekat. Razlika u aktivnosti između E10 i G9 dobro se uklapa u njihove očigledne afiniteta od 870, odnosno 14 pikomolara. E5 MAb je pokazivao samo minimalnu aktivnost neutralizacije koja je bila u skladu sa njegovim sniženim afinitetom (5 nM).

[0161] Određivanje titra i stabilnosti hibridoma koju luče humana MAb.Značajna osobina MAb proizvodne linije je stabilnost sekrecije Ig tokom celokupnog proizvodnog ciklusa serije. Po jednom scenariju, gde ciklus traje oko dva meseca, linija koja se udvostručava svaka 24 sata prođe kroz oko 60 generacija od odmrzavanja do skupljanja porasta. Jedna E5 linija je upotrebljena kao model za ispitivanje titra MAb i proizvodne stabilnosti hibridoma koji je dobijen našom metodom. Klon dobijen od ove linije, 3D2, imao je vreme dupliranja od 24 časa i bio je rekloniran ograničavanjem razblaženja nakon više od dva meseca neprekidnog gajenja. Učestalost proizvodnih klonova određena je ELISA testom, mereći koncentracije Ig u njihovim prilagođenim podlogama normalizovanim prema gustini ćelija. Slika 5A pokazuje da svi E5-3D2 ispitani subklonovi luče veliki broj Ig, što dokazuje homogeno zadržavanje proizvodnje Ig u toj ćelijskoj populaciji posle 60 generacija. Proizvodnja Ig je zatim određena primenom malog (15 mL) sistema šupljeg vlakna. Ćelije su zasejane u uložak šupljeg vlakna i stalno hranjene pomoću linijskog rezervoara u kome se nalazi jedan litar sveže podloge. Počev od 5. dana, celokupna prilagođena podloga iz uloška (15 mL) bila je svakodnevno uzimana i zamenjivana svežom podlogom. Fermentacija je vršena tokom sledeća 4 dana, a Ig titar određivan ELISA sistemom primenom Ig standarda poznate koncentracije. Zabeležen je kumulativan titar od 1.2 g/L 4-dnevne probe. Potrošnja glukoze je bila na vrhuncu (2 grama/L na dan) između 8. i 9. dana, što ukazuje na to da su ćelije dobro podnosile ekstremno veliku ćelijsku gustinu. Učinak proizvodnje je takođe ocenjivan na seriji od 1 litra u sistemu sa mešalicom. Ćelije su iz zamrznute ampule prvo odmrznute i zasejane u normalni su na mešalici, a kasnije zasejane u bioreaktor sa mešalicom (Bauer) u kome se nalazio 1 litar podloge bez seruma. Fermentacija je trajala sve dok viabilnost ćelija nije pala na ispod 60% (dan 6). Proizvodnja Ig i gustina ćelija evidentirani su između dana 1 i dana 5 i prikazani na slici 5B. Tokom log faze (dan 1-4), izmerena je specifična produktivnost od 24 pg/ćeliji/dan sa prosečnim vremenom dupliranja od 23,4 časa, što ukazuje na dobru prenosivost ovih ćelija iz normalnog suda u biorektor održavajući, pri tome, visoki titar.

[0162] Genetska optimizacija hibridoma koji luče humana MAb regulacijom sistema

popravki.Već je prethodno dokazana korist od unapređenja kvaliteta MAb-produkujućih ćelijskih linija pomoću procesa, koji se naziva morfogenetika, koji podrazumeva prolaznu regulaciju MMR (Nicolaides et al. (1995) Genomics 30:195-206; and, Nicolaides et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:1635-41.). Posle povećanja genetske raznolikosti fonda ćelija primenom ove metode, sproveden je skrining velikog protoka radi identifikacije subklonova koji daju visok titar, afiniteta (Grasso et al. (2004) Bioprocess Int. 2:58-64; and, Nicolaides et al.

(2005) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1059:1-11), ili ubrzane stope rasta (Grasso, L. Lično zapažanje). Ćelije E5 su bile podvrgnute morfogenetici radi dokazivanja sposobnosti za povećanu fenotipsku raznolikost u linijama koje luče MAb i koje su dobijene našom hibridomskom strategijom. Inhibicija MMR je praćena otkrivanjem nestabilnosti mikrosatelita (MSI) u BAT poli-A ponovljenom markeru. Od 24 analizirana BAT alela u ćelijama podvrgnutim morfonenetičkom procesu, 3 alela su pokazala alteracije kao što su brisanje jednog nukleotida, prikazano na slici 6A, i ubacivanje. Nije detektovana nikakva MSI ni u jednom od 24 BAT alela u paralelnim ćelijama. Kasnije, roditeljske ili morfogenetski tretirane ćelije su zasejane ograničavajućim razblaženjima na mikro ploče. Ćelijski klonovi su ostavljeni da luče MAb tokom jedne nedelje kada je njihova prilagođena podloga analizirana ELISA sistemom u pogledu koncentracije Ig. Učestalost klonova sa O.D. većim od 1 (visoka sekrecija Ig) određena je na osnovu ukupnog broja ispitanih klonova (3,763 za roditeljski i 2,437 za morfocenski fond); nađeno je da se povećala za 260% (p = 0,0014) u morfogenski tretiranoj populaciji (slika 6B).

Zaključak

[0163]Ova studija predstavlja održivu strategiju razvoja humanih MAb za imunoterapiju koristeći optimizovanuex- vivoimunizaciju i proces imortalizacije humanih B-ćelija u kombinaciji sa inhibicijom sistema za popravku. Ovim pristupom se mogu dobiti visoko specifična i biološki aktivna MAb koja luče stabilne linije hibridoma.

[0164]Prema metodama iz ovog pronalaska, ostvarena je stabilna proizvodnja MAb kod preko 60 dupliranja i proizvodnja preko 1 grama MAb po litru tokom 4-dnevne fermentacije u šupljem vlaknu, što ukazuje na to da su ćelije hibridoma dobijene sadašnjim metodama pogodne za sisteme za perfuziju, kao i za potencijalno obimnu proizvodnju. Štaviše, hibridomi dobijeni ovim procesom su dobro funkcionisali tokom proizvodnog ciklusa u bioreaktoru, što ukazuje na moguću upotrebu ovih linija u komercijalne svrhe. U zaključku, ovde predstavljen proces nudi alternativni pristup brzom i jevtinom razvoju potpuno humanih antitela dobrog kvaliteta za primenu u imunoterapiji.

Primer 2

Pobijanje potpuno humanog anti- GM- CSF antitela; izolacija PAP ćelija

[0165]Pacijenti sa adultnom plućnom alveolarnom proteinozom (PAP) nagomilavaju fosfolipide i proteine surfaktanta u alveolama. Pretpostavlja se da PAP nastaje zbog nemogućnosti alveolarnih makrofaga i epitelijalnih ćelija tipa II da izbace višak surfaktanta. Kao što je prethodno opisano, uloga GM-CSF u kontroli homeostaze plućnog surfaktanta utvrđena je na modelu miša, a ekstenzijom je utvrđeno da izaziva ovu patologiju kod ljudi. Osim toga, pokazano je da pacijenti sa PAP imaju u krvotoku antitela koja neutrališu GM-CSF, što ukazuje na to da ovaj citokin izaziva oboljenje. Da li je ovaj autoimuni odgovor specifičan za GM-CSF ostaje nejasno. Međutim, pokazano je da podgrupa PAP pacijenata ima poboljšanje sa terapijom GM-CSF, što podržava hipotezu da odsustvo GM-CSF, bilo da se radi o prekidu gena ili antitelima posredovanoj neutralizaciji, ima za posledicu razvoj

PAP.

[0166] Izolacija GM-CSF-specifičnih antitela. Iz periferne krvi PAP pacijenata su izolovane jednojedarne ćelije (PBMC). B ćelije PAP pacijenata su dobijene iz cele krvi. Cela krv je razblažena jednakom količinom PBS-/- i sadržaj blago mešan okretanjem kontejnera. 25 ml razblažene krvi dodato je u epruvetu od 50 ml u kojoj se nalazilo 25 ml Ficoll-Paque (Amersham Biosciences AB, Uppsala Sweden). Epruvete su centrifugirane pri 2000o/min tokom 30 minuta sa sobnoj temperaturi. PBMC su sakupljene sa međusloja pipetom od 10 ml, prenete u druge epruvete od 50 i dva puta oprane sa PBS-/-. Peleta od PBMC je resuspendovana u 10 ml ACK pufera za liziranje (Lvsing Buffer) (150 mM NH4CI, 10 mM KHC03, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2), inkubirane tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi radi lize eritrocita i dva puta oprane sa PBS-/-.

[0167] Fuzija PAP B ćelija sa ćelijskom linijom mijeloma radi dobijanja hibridoma. - obogaćene B ćelije dobijene od PAP pacijenata spojene su sa mnoštvom ćerlija mijeloma (humani-mišji heterohibridom, ATCC, VA, USA); CBF-7 ćelijama (humani-mišji heterohibridom); HEK293; ćelijama humanom mijeloma sledećom metodom. Te B ćelije i ćelije fuzionog partnera treba da imaju dobru viabilnost (>90% održivih i u log fazi). Oba ćelijska tipa su prebrajana u svojoj prvobitnoj podlozi i pomešana u odnosu 1:1 u epruvetama od 15 ml, a zatim centrifugirana pri 1000 o/min 6 minuta na 4°C. Ćelije su oprane 3 puta sa po 10-15 ml hladne CPFM (CYTOPULSE fuziona podloga, Cyto Pulse Sciences, MD USA). Dobijena peleta je resuspendovana u koncentraciji od 10x10<6>ćelija/ml u CPFM. Elektrofuzija je izvršena primenom CYTOPULSE CEEF-50 (Cyto Pulse Sciences, MD USA). Fuzioni parametri su bili optimizovani prema uputstvima proizvođača i na osnovu iskustva, a efikasnost fuzije je u prošeku bila jedan hibrid na 5000 ćelija. Posle fuzije, ćelije su zasejane na mikroploče sa ravnim dnom sa po 96 otvora u koncentraciji od -5000 ćelija/otvoru u kompletnoj RPMI u kojoj se nalazilo 10% toplotom inaktivisanog FBS, 100 mM hipoksantina, 0,4 mM aminopterina i 16 mM timidina (HAT, Sigma, MO USA). Podloga je menjana jednom nedeljno, a HAT selekcija je održavana sve do završetka reaktivnosti antigena.

[0168] ELISA test. Za identifikaciju antigen-reagujućeg MAb, korišćena je automatska ELISA metoda primenom sistema za tečnost BIOMEK FX integrisanog sa peračem ploča i spektrofotometrom. Ukratko, mikrotitar ploče su obložene tokom 6 sati na sobnoj temperaturi sa 50 ml/otvoru interno proizvedenih rekombinantnih antigena (1 mg/mL GM-CSF) razblaženim u puferu za oblaganje (50 mM karbonat bikarbonata, pH 9.4). Ploče su zatim blokirane puferom za vezivanje (PBS koji sadrži 3% BSA (Sigma, MO) i 0.05% Tvveena 20 (BioRad, CA)) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su opraje jednom puferom za pranje (PBS koji sadrži 0,05% Tvveena 20) i 50 mL/otvoru gornje tečnosti hibridoma je preneto na ELISA ploče. Reakcija vezivanja je izvršena na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Posle toga ploče su oprane 4 puta i 100 mL HRP-conjugovanog kozjeg anti-humanog IgG+M (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA) razblaženo je u odnosu 1:10,000 u puferu za vezivanje i reakcija izvršena na sobnoj temperaturi tokom 1,5 sata. Na kraju, ploče su oprane 4 puta i 100 mL/otvoru SUREBLUE supstrata (KPL, MD) je dodavano tokom 10 min. Reakcije su zaustavljene dodavanjem 50 mL/otvoru 1 N sumporne kiseline i apsorbancija izmerena na talasnoj dužini od 450 nm.

[0169] FACS analiza i sortiranje.U svakoj studiji, vezivanje Ig i pranje ćelija sprovođeni su u ledeno hladnom puferu za vezivanje (DPBS bez kalcijuma ili magnezijuma, 0,5% BSA). PBMC ili ćelije hibridoma oprane su i zasejane u koncentraciji od 500,000 ćelija/otvoru. Dodate su FITC i fikooeritrin(PE)-obeležene anti-humane CD3, CD19, CD20 (SouthernBiotech, AL), kao i PE-obeleženi GM-CSF (R&D Svstem, MN) (10 - 100 razblaženja) i inkubirani na ledu tokom jednog sata. Ćelije su zatim oprane tri puta puferom za vezivanje i analizirane i sortirane pomoću aparata FACSARIA (BD Biosciences, NJ). Rezultati analize izotipa Mab E10 prikazani su na slici 9. Da bi se odredio izotop E10, urađena je standardna analiza primenom anti-humanih IgG, lgG1, lgG2, lgG3, IgM, Lk, kao i LA Fc specifičnih antitela radi dobijanja izotipa.

[0170] Bioproba neutralizacije GM-CSF.Humana GM-CSF-zavisna ćelijska linija humane eritroleukemije TF-1 (ATCC, VA) gajena je u kompletnoj RPMI 1640 (videti u prethodnom tekstu) koja je sadržavala 10 ng/mL rekombinantnog humanog GM-CSF (Pepro-Tech, NJ). Dan pre eksperimenta, TF-1 ćelije sz gajene u 0,5% FBS u odsustvu GM-CSF. Izgladnele TF-1 ćelije su skinute i oprane dva puta ispitivanom podlogom (obična RPMI sa 0,5% BSA). Ćelije su resuspendovane u ispitivanoj podlozi i zasejane na mikroploče sa 96 otvora u koncentraciji od 10,000 ćelija/otvoru. Otvori su sadržali ili ispitivanu podlogu, 100 pg/mL GM-CSF ili GM-CSF prethodno inkuboranog tokom jednog sata sa ispitivanim ili izotop kontrolisanim Ig u koncentraciji kao na slici. Posle 3 dana, 40 mL reagensa ćelijskog titra (Promega, Wl) dodato je u svaki otvor i ploče dalje inkubirane na 37°C tokom 1 sata. Optička gustina (O.D.) merena je na 490 nm spektrofotometrijski, a vrednost podloge je odbijena od svih uzoraka. Procenat neutralizacije GM-CSF je izračunat na sledeći način: 100 - [(O.D. sa Ig / O.D. bez Ig) x 100)]. Na slici 4 je prikazana GM-CSF-zavisna inhibicija Tf-1 ćelijske linije sa potpuno humanim MAb.

[0171] Inhibicija sistema za popravku radi povećanja raznolikosti hibridomskih

ćelijskih linija.Inhibicija sistema za popravku može dovesti do genetički raznolikih sestrinskih ćelija uz povećanu produkciju, ćelijski rast ili aktivnost antitela. U cilju poboljšanja aktivnosti MAb i ćelijskog rasta, ćelije hibridoma su gajene u kompletnoj RPMI (negativna kontrola) ili kompletnoj RPMI sa sadržajem 250 mM ili 500 uM inhibitorskog morfocena

sistema za popravku (9,10-dimetil antracen, MP Biomedicals, CA). Ćelije su prolazile kroz razblaženje od 1:5 svaka tri do četiri dana u svežoj podlozi sa ili bez mikrocena i posle tri nedelje je porast skinut i ćelije resuspendovane u koncentraciji 2 x 106 ćelija/mL u FACS puferu (PBS sa 1% BSA). Ćelije su obojene primenom 10 mg/mL FITC-konjugovanog kozjeg anti-humanog Ig (Jackson Immunoresearch) na ledu tokom 30 minuta. Ćelije su oprane sa 10 mL ledeno hladnog FACS pufera i resuspendovane u 3 mL FACS pufera. 10 mL VIAPROBE (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) je dodavano tokom 5 minuta na ledu i žive ćelije sortirane prema u pogledu jačine Ig površinskog obojenja primenom FACSARIA uređaja za sortiranje ćelija (Becton Dickinson). Vrata su podešena da sortiraju ćelije koje predstavljaju 5% subpopulacije sa najjačin Ig površinskim obojenjem. Ta populacija je ekspandovana tokom jedne nedelje u prisustvu ili odsustvu hemijskog inhibitora sistema za popravku (MMR) i postupak ponovljen još dva puta. U cilju selekcije klonova sa povećanim titrom, FACS sortirane ćelije su zasejane na ploče sa U dnom i po 96 otvora u koncentraciji od 0,8 ćelija/otvoru u 200 mL kompletne RPMI. Ploče su inkubirane jednu nedelju na 37°C u 5% C02. Iz otvora je uzeto 50 mL gornjeg sloja i analizirano u pogledu produkcije IgM primenom ELISA koristeći ploče obložene kozjim anti-humanim IgM+G. Interna kontrola su bila 3 otvora na svakoj ELISA ploči koja su zasejana sa 50 mL 10 ng/mL humanog IgM (Jackson Immunoresearch). Vrednosti O.D. dobijene na 450 nm normalizovane su na srednju vrednost internih kontrolnih otvora. Otvori sa visokim IgM signalima su ekspandovani radi dalje analize. Za MSI analizu, DNK je ekstrahovana iz roditeljskih ili MMR inhibitor-tretiranih ćelija primenom Oiagen DNeasv Tissue kompleta (Oiagen). The BAT poli A ponovljeni marker je pojačan pomoću D4 fluorescentno obeleženim mBAT-26-F (5-tcaccatccattgcacagtt-3') (SEQ ID NO:20) i mBAT-26-R (5'- ctgcgagaaggtactcaccc-3') (SEQ ID NO:21) prajmerima, pfu-Ultra™ polimerazom visoke gustine (Stratagene, CA), i reakcije su inkubirane na sledeći način: 5 min. na 95°C; 9 ciklusa od 1 min. na 94°C, 1 min. na 60°C i 2 min. na 72°C, pri čemu se temperatura smanjivala za po 1°C u svakom ciklusu; 30 ciklusa od 1 min. na 94°C, 1 min. na 52°C, i 2 min. na 72°C; finalna ekstenzija od 10 min. na 72°C. Jedina kopija alela markera dobijena je pomoću razblaženja DNK koje je dalo amplikon u samo 50% PCR reakcija. Produkti PCR su razblaženi u odnosu 1:10 sa CEQ rastvorom uzorak, a zatim stavljeni u Beckman CEQ 8000 sistem za genetske analize radi analize fragmenata. (Blake et al. Stepvvise deletions of polyA sequences in mismatch repair-deficient colorectal cancers. (2001) Am. J. Pathol. 158:1867-70.)

Primer 3

Dobijanje monoklonalnog antitela E10 visoke specifičnosti prema GM- CSF

[0172]Nekoliko antitela je dobijeno iz B ćelija pacijenata sa PAP. Ova antitela su bila IgM, IgG izotipa. Testovima specifičnosti koji su ovde opisani, nađeno je da se svaki od ovih antitela specifično vezuje za GM-CSF. Jedno anti-GM-CSF humano lgG1 monoklonalno antitelo E10 je dobijeno iz B ćelija pacijenata sa plućnom alveolarnom proteinozom (PAP) koje su spojene sa ćelijama mijeloma, a potom, primenom ELISA, analizirane u pogledu anti-humani GM-CSF monoklonalna antitela.

[0173]Krv uzeta od PAP pacijenta (91 ml cele krvi) upotrebljena je za izolaciju ukupno 49,5 miliona PBMC. Održivost tih ćelija bila je 99,0%. Rezultati FACS analize su prikazani na tabeli 2. B ćelije su ekspandovane gajenjem približno 25 miliona PBMCs uCRPMI1640 (10 ml) sa IL-4 2 ng/ml (PeproTech), transferinom 50 ug/ml (Sigma), PMA 5 ng/ml(Sigma), kao i ciklosporinom A 0,5 ug/ml (Sigma) uz ćelije za hranu. Posle 11 dana gajenja, ostalo je 12 miliona ćelija koje su spojene elektrofuzijom sa ćelijama mijeloma (CvtoPulse CEEF-50). Rezultati FACS analize prikazani su na tabeli 2.

[0174]Te spojene ćelije su gajene u RPMI 1640 (Invitrogen, CA, USA) sa 10% FBS, toplotom-inaktivisanim (JRH Biosciences, KS USA ); L-glutaminom, 200 mM (Invitrogen, CA, USA); ne-esencijalnim amino kiselinama, 10 mM (Invitrogen, CA, USA); natrijum piruvat rastvorom, 100 mM (Invitrogen, CA, USA); Pen-Strep (Invitrogen, CA, USA); 2-merkaptoetanolom, 55 mM (Invitrogen, CA, USA); and 1x HAT (Sigma, MO USA).

[0175]Posle 12 dana uzgoja, oko 48% kulture hibridoma je pokazalo rast. Zatim, ti hibridomi su analizirani pomoću GM-CSF specifičnog ELISA testa sa rekombinantnim GM-CSF (PeproTech, NJ, USA). Izolovano je nekoliko klonova, uključujući one koji su bili pozitivni na GM-CSF. Ti klonovi su ELISA testirani radi potvrde da su specifični za rekombinantni GM-CSF, a ne za toksin tetanusa (TT). Klon 4E10 je specifično reagovao sa GM-CSF, ali ne sa TT. Klon 4E10 je bio kasnije subkloniran. Posle 3 nedelje, subklonovi iz kulture su ELISA analizirani radi potvrde da se specifičnost za GM-CSF održava, a zatim su dalje karakterisani kao što će biti opisano kasnije.

[0176] Karakterizacija E10.Za određivanje specifičnosti anti-GM-CSF antitela E10, urađena je antigen-specifična ELISA sa izvesnim asortimanom antigena (slika 8). Slika 8 je poređenje vezivanja za sledeće antigene: hlL-1 a, h IL-2, h IL-3, h IL-4, h IL-5, IL-6, hlL-13, hGM-CSF, mGM-CSF, BSA, i TT. U kasnijim studijama, vezivanje anti-GM-CSF antitela je upoređeno sa humanim GM-CSF, humanim mezotelinom, SEB, BGG, CAB, HEL, TT, BSA, kozjim IgG, humanim mucinom, kao i mišjim IgG (podaci nisu prikazani). U obe studije, samoje4E10 reagovao na humani GM-CSF.

[0177]Radi određivanja izotipa E10, urađena je standardna analiza primenom anti-humanog IgG, lgG1, lgG2, lgG3, IgM, Lk, i LA da se dobije izotip. Ovom analizom je dokazano da je 4E10 lgG1 i kapa antitelo (videli sliku 9).

[0178]Sposobnost E10 da neutralizuje biološku aktivnost GM-CSFin vitro,ispitana je koristeći ćelijski liniju TF-1 koja je zavisna od ovog citokina za preživljavanje i rast (videti sliku 8). Ta od humanog GM-CSF-zavisna ćelijska linija humane eritroleukemije TF-1 (ATCC, VA) gajena je u kompletnoj RPMI 1640 sa sadržajem 10 ng/mL rekombinantnog humanog GM-CSF (PeproTech, NJ). Dan pre eksperimenta, TF-1 ćelije su gajene u 0,1% FBS u odsustvu GM-CSF. Izgladnele TF-1 ćelije su skinute i oprane dva puta ispitivanom podlogom (obična RPMI sa 0,5% BSA). Ćelije su resuspendovane u ispitivanoj podlozi i zasejane u mikroploče sa po 96 otvora u koncentraciji od 10,000 ćelija/otvoru. Otvori su sadržali ili ispitivanu podlogu, 100 pg/mL GM-CSF, ili GM-CSF prethodno inkubiran jedan sat sa ispitivanim ili izotip kontrolnik Ig u koncentraciji od 20 mg/mL do 0,315 mg/mL. Posle 3 dana, 40 uL CELL TITER reagensa (Promega, Wl) je dodato u svaki otvor i ploče dalje inkubirane na 37°C tokom 1 sata. Optička gustina (O.D.) je merena spektrofotometrom na 490 nm pri čemu je vrednost podloge oduzeta od svih uzoraka. Procenat neutralizacije GM-CSF izračunat je na sledeći način: 100 - [(O.D. sa Ig / O.D. bez Ig) x 100]. Antitelo 4E10 bilo je u stanju da neutralizuje aktivnost GM-CSFin vitrou koncentraciji od 100pg/ml.

[0179]VVestern blot analiza E10 je vršena da se odredi da li ovo antitelo može unakrsno da reaguje sa humanim rekombinantnim GM-CSF. Kao što je pokazano na slici 10, E10 unakrsno reaguje sa humanim GM-CSF u redukovanim uslovima.

[0180]Za određivanje afiniteta vezivanja E10, rađena je BIACORE analiza na sledeći način. Konstanta vezivanja E10 je oko 870 pM (slika 11).

Primer 4

Pobijanje monoklonalnog antitela G9 visoke specifičnosti za GM- CSF

[0181]Anti-GM-CSF monoklonalno antitelo G9 humanog lgG1 dobijeno je iz B ćelija pacijenata sa plućnom alveolarnom proteinozom (PAP) koje su spojene sa K6 ili sa CBF-7, a zatim analizirane u pogledu anti-humanih GM-CSF monoklonalnih antitela pomoću ELISA kao što je prethodno opisano.

[0182]Krv uzeta od PAP pacijenta (91 ml cele krvi) upotrebljena je za izolaciju ukupno 49,5 miliona PBMC. Održivost tih ćelija bila je 99,0% (podaci nisu prikazani). B ćelije su ekspandovane gajenjem približno 25 miliona PBMCs uCRPMI1640 (10 ml) sa IL-4 2 ng/ml (PeproTech), transferinom 50 ug/ml (Sigma), PMA 5 ng/ml(Sigma), kao i ciklosporinom A 0,5 ug/ml (Sigma) uz ćelije za hranu. Posle 11 dana gajenja, ostalo je 12 miliona ćelija koje su spojene elektrofuzijom sa ćelijama mijeloma (CvtoPulse CEEF-50).

[0183]Te spojene ćelije su gajene u RPMI 1640 (Invitrogen, CA, USA) sa 10% FBS, toplotom-inaktivisanim (JRH Biosciences, KS USA ); L-glutaminom, 200 mM (Invitrogen, CA, USA); ne-esencijalnim amino kiselinama, 10 mM (Invitrogen, CA, USA); natrijum piruvat rastvorom, 100 mM (Invitrogen, CA, USA); Pen-Strep (Invitrogen, CA, USA); 2-merkaptoetanolom, 55 mM (Invitrogen, CA, USA); and 1x HAT (Sigma, MO USA).

[0184]Posle 12 dana uzgoja, oko 48% kulture hibridoma je pokazalo rast. Zatim, ti hibridomi su analizirani pomoću GM-CSF specifičnog ELISA testa sa rekombinantnim GM-CSF (PeproTech, NJ, USA). Izolovano je nekoliko klonova, uključujući one koji su bili pozitivni na GM-CSF. Ti klonovi su ELISA testirani radi potvrde da su specifični za rekombinantni GM-CSF, a ne za toksin tetanusa (TT). Populacija G9 je pokazala visoko specifičnu reaktivnost sa GM-CSF, ali ne sa TT. Zatim, populacija G9 je bila subklonirana da se dobije čista kultura. Posle 3 nedelje, subklonovi iz kulture su ELISA analizirani radi potvrde da se specifičnost za GM-CSF održava, a zatim su dalje karakterisani kao što će biti opisano kasnije.

[0185] Karakterizacija G9.Za određivanje specifičnosti anti-GM-CSF antitela G9, urađena je antigen-specifična ELISA sa izvesnim asortimanom antigena (slika 8). Slika 8 je poređenje vezivanja za sledeće antigene: hlL-1 a, h IL-2, h IL-3, h IL-4, h IL-5, IL-6, hlL-13, hGM-CSF, mGM-CSF, BSA, i TT. U kasnijim studijama, vezivanje anti-GM-CSF antitela je upoređeno sa humanim GM-CSF, humanim mezotelinom, SEB, BGG, CAB, HEL, TT, BSA, kozjim IgG, humanim mucinom, kao i mišjim IgG (podaci nisu prikazani). U obe studije, samo je 4E10 reagovao na humani GM-CSF.

[0186]Radi određivanja izotipa G9, urađena je standradna analiza primenom anti-humanog IgG, lgG1, lgG2, lgG3, IgM, Lk, i LA da se dobije izotip. Ovom analizom je dokazano da je G9 lgG1 i kapa antitelo (videli sliku 12).

[0187] Biološka analiza sposobnosti neutralizacije G9.Sposobnost G9 da neutralizuje biološku aktivnost GM-CSF in vitro, ispitana je koristeći ćelijski liniju TF-1 koja je zavisna od ovog citokina za preživljavanje i rast (slika 4). Ta od humanog GM-CSF-zavisna ćelijska linija humane eritroleukemije TF-1 (ATCC, VA) gajena je u kompletnoj RPMI 1640 sa sadržajem 10 ng/mL rekombinantnog humanog GM-CSF (PeproTech, NJ). Dan pre eksperimenta, TF-1 ćelije su gajene u 0,1% FBS u odsustvu GM-CSF. Izgladnele TF-1 ćelije su skinute i oprane dva puta ispitivanom podlogom (obična RPMI sa 0.5% BSA). Ćelije su resuspendovane u ispitivanoj podlozi i zasejane u mikroploče sa po 96 otvora u koncentraciji od 10,000 ćelija/otvoru. Otvori su sadržali ili ispitivanu podlogu, 100 pg/mL GM-CSF, ili GM-CSF prethodno inkubiran jedan sat sa ispitivanim ili izotip kontrolnih Ig u koncentraciji od 20 mg/mL do 0,315 mg/mL. Posle 3 dana, 40 uL CELL TITER reagensa (Promega, Wl) je dodato u svaki otvor i ploče dalje inkubirane na 37°C tokom 1 sata. Optička gustina (O.D.) je merena spektrofotometrom na 490 nm pri čemu je vrednost podloge oduzeta od svih uzoraka. Procenat neutralizacije GM-CSF izračunat je na sledeći način: 100 - [(O.D. sa Ig / O.D. bez Ig) x 100]. Antitelo 4E10 bilo je u stanju da neutralizuje aktivnost GM-CSF in vitro u koncentraciji od 100pg/ml.

[0188]VVestern blot analiza E10 je vršena da se odredi da li ovo antitelo može unakrsno da reaguje sa humanim rekombinantnim GM-CSF. Kao što je pokazano na slici 10, G9 unakrsno reaguje sa humanim GM-CSF u redukovanim uslovima.

[0189]Za određivanje afiniteta vezivanja G9, rađena je BIACORE analiza na način prikazan prethodno. Konstanta vezivanja G9 je oko 11-17 pM (slika 13).

Primer 5

Nukleotidne sekvence koje enkodiraju antitela G9iE10 potpuno humanog anti- GM-

CSF

[0190] Antitelo G9.Nukleotidne i sekvence amino kiselina za antitelo G9 za potpuno humani anti-GM-CSF dobijene su standardnim metodama. Ukratko, celokupna RNK je izolovana iz hibridoma G9 primenom Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Ta poruka je sitentizovana u cDNK koristeći Superscript II reverznu transferazu (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Radi pojačanja svetlosti i raznih regiona teškog lanca, izvršene su PCR reakcije primenom Herculase DNK polimeraze (Stratagene) koristeći prajmere SEQ ID NO:22 i SEQ ID NO:23 za laki lanac i SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25 za teški lanac. Produkti PCR su klonirani u pCR4-TOPO vektor (Invitrogen), transformisani u E. coli Machl ćelije i ti produkti transformacije selektovani na LB kanamicin pločama. Kolonije su pregledane da se vidi da li ima inserata istih prajmer parova kao prethodno i svaka od četiri pozitivne kolonije je upotrebljena za dobijanje templejt DNK za određivanje sekvence DNK, primenom TempliPhi reagensa (GE Healthcare). DNK inserti su sekvencionisani prajmerima SEQ ID NO:26 i SEQ ID NO:27 koristeći Beckman Coulter DTCS reagens za sekvencionisanje, nakon čega su prikupljeni podaci i analizirani na aparatu Beckman Coulter CEO2000. Da bi se dodala vodeća peptidne sekvenca u lako lanac, pozitivan klon je još pojačan prajmerima SEQ ID NO:28 i SEQ ID NO:23 pomoću Herculase DNK polimeraze. Da bi se dobio teški lanac pune dužine (SEQ ID NO:11), uključujući sekvencu vodećeg peptida izvršena je PCR pomoću prajmera SEQ ID NO:29 i SEQ ID NO:30 koristeći originalni cDNK kao templejt. Dobijeni produkt PCR bio je TA kloniran, transformisan u Machl ćelije i pozitivni kloni su identifikovani kao što je prethodno opisano. cDNK teškog lanca G9 potpune dužine sekvencionisana je prajmerima SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:27 i SEQ ID NO:30 koristeći templejt DNK dobijent pomoću TempliPhi reagensa. Dobijene DNK sekvence za teški lanac pune dužine za G9 (SEQ ID NO:11) i laki lanac pune dužine za G9 (SEQ ID NO: 15) prikazane su nastavku. Predviđeni produkti translacije dobijeni od SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:15 prikazani su u SEQ ID NO:9, odnosno SEQ ID NO: 13. Predviđeni produkti translacije dobijeni od SEQ ID NO:10 i SEQ ID NO:14 prikazani su u SEQ ID NO:8 , odnosno SEQ ID NO:12. Podvučene sekvence SEQ ID NOs: 11i 15 predstavljaju vodeću sekvencu dodatu od PCR. Sekvence polinukleotida SEQ ID NO: 10 i 14 enkodiraju težak, odnosno lak lanac G9 antitela bez dodatih vodećih sekvenci. Sekvence malim slovima sekcenci SEQ ID NOs:9 i 13 predstavljaju humane vodeće peptide dodate PCR reakcijom.. Podvučene sekvence SEQ ID NOs: 8, 9, 12, i 13 predstavljaju CDR regione. Preostale sekvence SEQ ID NOs:8, 9, 12 i 13 su okviri varijabilnih i konstantnih regiona. Konstantni region teškog lanca počinje sekvencom amino kisleine WGQG (amino kisleina 111 SEQ ID NO:8 ili 130 SEQ ID NO:9), a konstantni region lakog lanca počinje sekvencom amino kisleine FGQG (amino kiselina 98 SEQ ID NO:12 ili 117 of SEQ ID NO:13).

[0191] Antitelo E10.Nukleotidne i sekvence amino kiselina za potpuno humano anti-GMCSF antitelo E10 dobijene su standardnim metodama. Ukratko, celokupna RNK je izolovana iz hibridoma E10 primenom Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Ta poruka je sintentizovana u cDNK koristeći Superscript II reverznu transkriptazu (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Radi pojačanja svetlih varijabilnih regiona teškog lanca, izvršene su PCR reakcije primenom Herculase DNK polimeraze (Stratagene) koristeći prajmere SEQ ID NO:22 i SEQ ID NO:23 za laki lanac i SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25 za teški lanac. Produkti PCR su klonirani u pCR4-TOPO vektor (Invitrogen), transformisani u E. coli Machl ćelije i ti produkti transformacije selektovani na LB kanamicin pločama. Kolonije su pregledane da se vidi da li ima inserata istih prajmer parova kao prethodno i svaka od četiri pozitivne kolonije je upotrebljena za dobijanje templejt DNK za određivanje sekvence DNK, primenom TempliPhi reagensa (GE Healthcare). DNK inserti su sekvencionisani prajmerima SEQ ID NO:26 i SEQ ID NO:27 koristeći Beckman Coulter DTCS reagens za sekvencionisanje, nakon čega su prikupljeni podaci i analizirani na aparatu Beckman Coulter CEO2000. Dobijene DNK sekvence koje enkodiraju varijabilni region teškog lanca za E10 (SEQ ID NO:17) i laki lanac pune dužine za E10 (SEQ ID NO:19) prikazane su nastavku. Predviđeni produkti translacije dobijeni od SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO:19 prikazani su u SEQ ID NO:16, odnosno SEQ ID NO:18. Podvučene sekvence SEQ ID NOs: 16 i 18 predstavljaju CDR regione. Preostale sekvence SEQ ID NO:16 i 18 su okvir varijabilnog regiona i konstantih regiona. Konstantni region teškog lanca počinje sekvencom amino kisleine WGQG (amino kisleina 115 SEQ ID NO: 16), a konstantni region lakog lanca počinje sekvencom amino kisleine FGQG (amino kiselina 98 SEQ ID NO:18).

Primer 6

Mapiranje epitopa anti- GM- CSF antitela

[0192]Za mapiranje epitopa GM-CSF za koji se vezuje G9, generisana je serija preklapajućih peptida koji pokrivaju dužinu humanog GM-CSF (slika 14). Ukratko, dizajnirano je 25 preklapajućih 12-mer peptida koji obuhvataju sekvencu humanog GM-CSF (GenBank Accession # AAA52578, rezidue 14 do144) tako da sadrže 7 preklapanja amino kiselina. Peptidi su generisani kao pojedinačne mrlje dimenzija 3,7 mm X 3,7 mm sintezom čvrste faze priključivanjem C-terminusa svakog peptida za površinu derivatizovane celulozne membrane (SPOTs tehnologija, Sigma Genosvs). Standardna VVestern blot analiza je primenjena za određivanje peptida koji unakrsno reaguje sa G9 (slika 15). Ta celulozna membrana je navlažena u metanolu i blokirana u rastvoru za blokiranje (5% BSA, 1X TBS, 0,1% Tween-20, 0.1% NaN3) na 4°C preko noći. Dodat je svež rastvor za blokiranje koji sadrži 1 mg/ml prečišćenog antitela 10G9 i inkubirano preko noći na 4°C. Mrlja je oprana tri puta, svaki put po 5 minuta, u TBS-T (1X TBS, 0,1% Tween-20) i inkubirana jedan sat u 1:10,000 razblaženju HRP-konjugovanog kozjed anti-humanog IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearchcat. 109-035-088) u rastvaraču (5% BSA, 1X TBS, 0.1% Tween-20). TMrlja je razvijena pomoću SuperSignal VVest Femto ECL supstratnog kompleta (Pierce cat. 34095), posle čega slikana sa ekspozicijom od jedne sekunde na BioMAX film (Kodak). Ovom metodom, antitelo G9 je specifično prepoznavalo peptide br. 6, 13, 14, 15, i verovatno peptid br. 23, što odgovara SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, odnosno, SEQ ID NO:47.

[0193]Sadašnji pronalazak nije ograničen na ostvarenja, goreopisana i praćena primerima, već su moguće varijacije i modifikacije u okviru opsega priloženih zahteva.

[0194]

Listing sekvenci:

Claims (12)

1. Rekombinantno eksprimovano humano monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF) naznačeno time što navedeno antitelo sadrži teški lanac koji se sastoji iz CDR1 sekvence SEQ ID NO:40, CDR2 sekvence SEQ ID NO:41, kao i CDR3 sekvence SEQ ID NO:42 i laki lanac koji se sastoji iz CDR1 sekvence SEQ ID NO:43, CDR2 sekvence SEQ ID NO:44, kao i CDR3 sekvence SEQ ID NO:45, pri čemu afinitet vezivanja navedenog antitela za humani GM-CSF ima konstantu disocijacije (KD) nižu od 1x1010 M.

2. Antitelo, iz zahteva 1, koje sadrži dva teška lanca i/ili dva laka lanca.

3. Formulacija koja sadrži antitelo iz bilo kojeg prethodnog zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač.

4. Antitelo iz zahteva 1 ili 2 za upotrebu u lečenju GM-CSF posredovanog inflamatornog oboljenja.

5. Antitelo iz zahteva 1 ili 2 za upotrebu u lečenju karcinoma.

6. Antitelo iz zahteva 1 ili 2 za upotrebu u lečenju zaraznog oboljenja.

7. Antitelo za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 4 do 6, naznačeno time što je ispitanik čovek.

8. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 4, naznačeno time što je GM-CSF posredovano inflamatorno oboljenje reumatoidni artritis, mulpla skleroza i astma.

9. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 5, naznačeno time što karcinom je karcinom debelog creva, pluća, dojke, pankreasa, leukemija ili juvenilna mijelomonocitna leukemija.

10. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, naznačeno time što je zarazno oboljenje septički šok.

11. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 5, naznačeno time što se navedena upotreba još sastoji iz primene sa nekim hemoterapijskim agensom.

12. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 11, naznačeno time što se navedeno antitelo konjuguje u navedeni hemoterapijski agens.