RS55561B1 - Derivati tetrahidropirolotiazina kao inhibitori bace - Google Patents

Description

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na nova jedinjenja tetrahidropirolotiazina, na farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenja, ova jedinjenja za upotrebu u postupcima za lečenje fizioloških poremećaja. Takođe su opisani intermedijeri i postupci korisni u sintezi jedinjenja.

[0002]Predmetni pronalazak je u oblasti lečenja Alchajmerove bolesti i drugih bolesti i poremećaja koji uključuju amiloidni p (Ap) peptid, neurotoksičan i visoko agregatorni peptidni segment amiloidnog prekursorskog proteina (APP). Alchajmerova bolest je razarajući neurodegenerativni poremećaj koji pogađa milione pacijenata širom sveta. U pogledu trenutno odobrenih sredstava na tržištu koji daju samo prolazne, simptomatske koristi pacijentu, postoji značajna neispunjena potreba u lečenju Alchajmerove bolesti.

[0003]Alchajmerova bolest je okarakterisana stvaranjem, agregacijom i taloženjem Ap u mozgu. Pokazano je da potpuna ili delimična inhibicija P-sekretaze (enzim koji čepa amiloidni prekursorski protein na P-mestu; BACE) ima značajan efekat na patologije povezane sa plakovima i patologije zavisne od plakova u mišjim modelima, što sugeriše da bi čak mala smanjenja u nivoima A beta peptida mogla da rezultiraju u dugotrajnom značajnom smanjenju u opterećenju plakovima i sinaptičkim deficitima, na taj način obezbeđujući značajne terapeutske koristi, naročito u lečenju Alchajmerove bolesti.

[0004]US 2009/0209755 opisuje fuzionisane derivate aminodihidrotiazinakoji su dalje opisani kao korisna terapeutska sredstva za neurodegenerativnu bolest uzrokovanu Abeta peptidom, kao stoje demencija Alchajmerovog tipa. Pored toga, J. Neuroscience, 31(46), pages 16507-16516 (2011) opisuje (S)-4-(2,4-difluoro-5-pirimidin-5-il-fenil)-4-metil-5,6-dihidro-47f-[l,3]tiazin-2-ilamin, oralno primenjivani CNS-aktivni inhibitor BACE.

[0005]Inhibitori BACE koji su potentni sa dovoljnim prodiranjem u CNS su poželjni za obezbeđivanje tretmana za poremećaje posredovane preko Ap peptida, kao što je Alchajmerova bolest. Predmetni pronalazak daje određena nova jedinjenja koja su potentni inhibitori BACE. Pored toga, predmetni pronalazak daje određena nova jedinjenja sa prodiranjem u CNS.

[0006]Prema tome, predmetni pronalazak daje jedinjenja formule I:

gde je A izabran iz grupe koja se sastoji od; R<1>je H ili F; R2je H, -OCH3,Ci-C3 alkil,

R3je H, -CH3, ili -OCH3; i

R4jeHili F;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0007]Predmetni pronalazak takođe daje ova jedinjenja za upotrebu u postupku za lečenje Alchajmerove bolesti kod pacijenta koja sadrži primenu na pacijenta kod koga postoji potreba za takvim tretmanom efikasne količine jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0008]Predmetni pronalazak dalje daje ova jedinjenja za upotrebu u postupku za prevenciju napredovanja blagog kognitivnog oštećenja Alchajmerove bolesti kod pacijenta koja sadrži primenu na pacijenta kod koga postoji potreba za takvim tretmanom efikasne količine jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0009]Predmetni pronalazak takođe daje ova jedinjenja za upotrebu u postupku inhibicije BACE kod pacijenta koji sadrži primenu na pacijenta kod koga postoji potreba za takvim tretmanom efikasne količine jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0010]Predmetni pronalazak takođe daje ova jedinjenja za upotrebu u postupku za inhibiciju BACE-posredovanog cepanja amiloidnog prekursorskog proteina koji sadrži primenu na pacijenta kod koga postoji potreba za takvim tretmanom efikasne količine jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0011]Pronalazak dalje daje ova jedinjenja za upotrebu u postupku za inhibiciju Ap peptida koji sadrži primenu na pacijenta kod koga postoji potreba za takvim tretmanom efikasne količine jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0012]Pored toga, ovaj pronalazak daje jedinjenje formule 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za upotrebu u terapiji, naročito za lečenje Alchajmerove bolesti ili za prevenciju napredovanja blagog kognitivnog oštećenja do Alchajmerove bolesti. Pored toga, ovaj pronalazak daje upotebu jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za lečenje Alchajmerove bolesti. Ovaj pronalazak takođe daje upotrebu jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za prevenciju napredovanja blagog kognitivnog oštećenja do Alchajmerove bolesti. Pronalazak takođe daje upotrebu jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za inhibiciju BACE. Pronalazak dalje daje upotrebu jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za inhibiciju proizvodnje Ap peptida.

[0013]Pronalazak dalje daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata. U posebnom primeru izvođenja, kompozicija dalje sadrži jedno ili više drugih terapeutskih sredstava. Takođe su opisani novi intennedijeri i postupci za sintezu jedinjenja formule I.

[0014]Blago kognitivno oštećenje je definisano kao potencijalna prodromalna faza demencije povezana sa Alchajmerovom bolešću na bazi kliničke prezentacije i napredovanja pacijenata koji ispoljavaju blago kognitivno oštećenje do Alchajmerove bolesti tokom vremena. (Morris, et al., Arch. Neurol., 58, 397-405 (2001); Petersen, et al., Arch. Neurol, 56, 303-308 (1999)). Termin "prevencija napredovanja blagog kognitivnog oštećenja do Alchajmerove bolesti" obuhvata usporavanje, zaustavljanje ili reverziju napredovanja blagog kognitivnog oštećenja do Alchajmerove bolesti kod pacijenta.

[0015]Kao što je ovde korišćen, termin "C1-C3 alkil" označava metil, etil, propil i izopropil alkil grupe.

[0016]Kao što su ovde korišćeni, termini "lečenje", "tretman", ili "lečiti" obuhvata zabranu, prevenciju, obuzdavanje, usporavanje, zaustavljanje ili reverziju napredovanja ili težine postojećeg simptoma ili poremećaja.

[00171Kao što je ovde korišćen, termin "pacijent" označava sisara, poželjnije čoveka.

[0018]Termin "inhibicija proizvodnje Ap peptida" označava smanjenjein vivonivoa Ap peptida kod sisara.

[0019]Kao što je ovde korišćen, termin "efikasna količina" označava količinu ili dozu jedinjenja prema pronalasku, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli koja, posle primene jedne ili višestrukih doza na pacijenta, obezbeđuje željeni efekat kod pacijenta pod dijagnozom ili tretmanom.

[0020]Efikasna količina može biti lako određena od strane nadležnog dijagnostičara, kao stručnjaka iz date oblasti tehnike, upotrebom poznatih tehnika i beleženjem rezultata dobijenih pod analognim uslovima. U određenjivanju efikasne količine za pacijenta, određeni broj faktora razmatra nadležni dijagnostičar, uključujući, ali bez ograničenja na: vrstu sisara; njegovu veličinu, starost i opšte zdravstveno stanje; specifičnu bolest ili poremećaj; stepen ili učešće ili težinu bolesti ili poremećaja; odgovor pojedinačnog pacijenta; određeno jedinjenje koje se primenjuje; način primene; karakteristike biodostupnosti primenjenog preparata; izabrani režim doziranja; upotrebu istovremenog leka; i druge relevantne uslove.

[0021]Jedinjenja formule I su generalno efikasna u širokom opsegu doza. Naprimer, doze na dan normalno padaju unutar opsega od oko 0.01 do oko 20 mg/kg telsne težine. U nekim slučajevima nivoi doze ispod donje granice gorenavedenog opsega mogu biti više nego adekvatni, dok u drugim slučajevima mogu biti korišćene veće doze sa prihvatljivim sporednim efektima, i prema tome gore navedeni opseg doza nije određen tako da ograniči obim pronalaska ni na koji način. Jedinjenja prema pronalasku su poželjno formulisana kao farmaceutske kompozicije primenjene bilo kojim putem koji čini jedinjenje biodostupnim, uključujući oralne i parenteralne puteve. Najpoželjnije, takve kompozicije su za oralnu primenu. Takve farmaceutske kompozicije i postupci za pripremu istih su dobro poznati u tehnici, (videti, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacv (D.B. Troy, Editor, 21 st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

[0022]Jedinjenja formule I su naročito korisna u postupcima lečenja prema pronalasku, ali određene grupe, supstituenti i konfiguracije su poželjni za jedinjenja formule I. Sledeći pasusi opisuju takve poželjne grupe, supstituente i konfiguracije. Biće jasno da su ove preference primenljive kako na postupke lečenja tako i na nova jedinjenja prema pronalasku.

[0023]Poželjno je daje A izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0024]Najpoželjnije je daje A izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0025]Naročito je poželjno daje Ajednak:

[0026]Poželjno je daR<1>je F.

[0027] Poželjno je da R2 je H ili

[0028]Najpoželjnije R2 je

[0029]Poželjno je daR3je H.

[0030] Naročito je poželjno da kada je R<1>jednako F i R<3>je H, da je R<2>jednako H.

[0031] Dalje je naročito poželjno da kada je R<1>jednako F i R<3>je H, da je R<2>jednako

[0032]Poželjan primer izvođenja obuhvata jedinjenja formule I koja imaju poboljšano prodiranje u CNS.

[0033]Poželjna jedinjenja su: 2-[2-[(4aR,7aR)-2-amino-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol;

2-[2-[(4aR,7aR)-2-amino-7a-(5-fluoro-2-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol;

2-[2-[(4aR,7aS)-2-amino-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol;

(4aR,7aR)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-amin, izomer 1; i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0034]Naročito poželjna jedinjenja su: 2-[2-[(4aR,7aR)-2-amino-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol;

2-[2-[(4aR,7aR)-2-amino-7a-(5-fluoro-2-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol;

2-[2-[(4aR,7aS)-2-amino-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol; i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0035]Najpoželjnije jedinjenje je: 2-[2-[(4aR,7aR)-2-amino-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol, i njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0036]Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da jedinjenja prema pronalasku mogu da postoje u tautomernim oblicima, kao što je prikazano u Šemi A. Kada je data bilo koja referenca u ovoj prijavi na bilo koji od specifičnih tautomera jedinjenja prema pronalasku, razume se da obuhvata oba tautomerna oblika i sve njihove smeše.

[0037]Jedinjenja prema predmetnom pronalasku, ili njihove soli, mogu biti pripremljeni pomoću različitih postupaka poznatih u tehnici, od kojih se neki ilustrovani u šemama, pripremama i primerima u daljem tekstu. Specifični koraci sinteze za svaki od opisanih puteva mogu biti kombinovani na različite načine, ili zajedno sa koracima iz različitih šema, za pripremu jedinjenja formule I, ili njihovih soli. Proizvodi svakog koraka u šemama u daljem tekstu mogu biti izolovani pomoću uobičajenih postupaka, uključujući ekstrakciju, isparavanje, taloženje, hromatografiju, filtraciju, trituraciju i kristalizaciju. [00381Određeni stereohemijski centri su ostavljeni nenaznačeni i određeni supstituenti su eliminisani u sledećim šemama zbog jasnoće i nije bila namera da ograniče navode šema ni na koji način. Pored toga, pojedinačni izomeri, enantiomeri ili diastereomeri mogu biti razdvojeni ili razloženi od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike na bilo kojoj pogodnoj tački u sintezi jedinjenja formule 1 pomoću postupaka kao što su tehnike selektivne kristalizacije ili hiralne hromatografije (videti na primer, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, i E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistrv of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Oznake "izomer 1" i "izomer 2" označavaju jedinjenja koja se eluiraju iz hiralne hromatografije prvo i drugo, respektivno, i ako je hiralna hromatografija započeta rano u sintezi, ista oznaka je primenjena na kasnije intermedijere i primere. Pored toga, intermedijeri opisani u sledećim šemama sadrže određeni broj azotnih zaštitnih grupa. Varijabilna zaštitna grupa može biti ista ili različita u svakom slučaju u zavisnosti od određenih reakcionih uslova i određenih transformacija koje se izvode. Uslovi zaštite i deprotekcije su dobro poznati iskusnom stručnjaku i opisani su u literaturi (vidti na primer "Greene's Protective Groups in Organic Svnfhesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).

[0039]Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da se jedinjenja prema pronalasku sastoje od jezgra koje sadrži najmanje dva hiralna centra: Iako predmetni pronalazak razmatra sve pojedinačne enantiomere, kao i smeše enantiomera navedenih jedinjenja, uključujući racemate, jedinjenja sa apsolutnom konfiguracijom na atomima obeleženim 1 i 2 kao što je ilustrovano u Šemi B su poželjna jedinjenja prema pronalasku.

[0040]Skraćenice koje su ovde korišćene su definisane prema Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984. Druge skraćenice su definisane na sledeći način: "APP" označava amiloidni prekursorski protein; "BOC" označava terc-butiloksikarbonil; "CSF" označava cerebrospinalnu tečnost; "DCC" označava 1,3-dicikloheksilkarbodiimid; "DIC" označava diizopropilarbodiimid; "DMEM" označava Dulbecco-ovu modifikovanu Eagle-ovu podlogu; "DMSO" označava dimetilsulfoksid; "EDCI" označava l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid; "Ex" označava primer; "F12" označava Ham-ovu F12 podlogu; "FBS" označava fetusni teleći serum; "FRET" označava fluorescentni rezonantni prenos energije; "HEK" označava humani embrionalni bubreg; "HOAc" označava sirćetnu kiselinu; "HOAt" označava l-hidroksi-7-azobenzotriazol; "HOBt" označava 1-hidroksilbenzotriazol hidrat; "HPLC označava tečnu hromatografiju visokog učinka; "hr" označava čas ili časove; "IC50" označava koncentraciju sredstva koja proizvodi 50% maksimalnog inhibitornog odgovora mogućeg za to sredstvo; "min" označava minutu ili minute; "PDAPP" označava amiloidni prekursorski protein poreklom od trombocita; "Prep" označava pripremu/preparat; "RFU" označava jedinice relativne fluorescencije "Rt" označava vreme zadržavanja; i "THF" označava tetrahidrofuran.

[0041]U šemama u daljem tekstu, svi supstituenti osim ukoliko nije drugačije naznačeno, su kao što su prethodno definisani. Reagensi i početni materijali su generalno lako dostupni stručnjaku iz date oblasti tehnike. Drugi mogu biti pripremljeni pomoću standardnih tehnika organske i heterociklične hernije koje su analogne sintezi poznatih strukturno sličnih jedinjenja postupaka opisanih u Pripremama i Primerima koji slede uključujući bilo koje nove postupke.

[0042]Šema 1 prikazuje formiranje Weinreb amida (2) korišćenog za formiranje ketona (3) koji može zatim biti transformisan do oksima. Oksim može biti korišćen za formiranje bicikličnog izoksazola (9). (A) grupa može biti inserirana na različitim tačkama sinteze kao što je prikazano u Šemi 1. "PG" je zaštitna grupa razvijena za amino grupu, kao što su karbamati i alil. Takve grupe su dobro poznate i shvaćene u tehnici.

[0043] Jedinjenje formule (1) je prevedeno u Weinreb amid (Korak 1, jedinjenje 2) sa N,0-dimetilhidroksilamid hidrohloridom upotrebom organske baze kao što je diizopropiletilamin ili trietilamin i kuplujućih reagenasa kao što su karbodiimidi i HOBt ili HOAt da bi se poboljšala efikasnost kuplovanja amida. Stručnjaku iz date oblasti biće jasno da postoji određeni broj postupaka i reagenasa za formiranje amida koji su rezultat reakcije karboksilnih kiselina i amina. Na primer, korisni karbodiimidi su DCC, DIC, EDCI.

[0044] Alternativno, karboksilna kiselina može biti prevedena u kiseli hlorid i Weinreb amid može biti formiran upotrebom organske baze i N,0-dimetilhidroksilamin hidrohlorida.

[0045] Kasniji tretman Weinreb amida sa organometalnim reagensom kao što je Grignard-ov reagens ili organolitijumski reagens daje jedinjenje 3, Korak 2. Na primer, heterociklični halogenid i alkil Grignard ili organolitijumski reagens može biti korišćen za formiranje ketona sa vezanom željenom (A) grupom, (3, Korak 2). Keton, (3) može zatim biti korišćen za formiranje oksima sa hidroksilamin hidrohloridom i neorganskom bazom kao što je natrijum acetat trihidrat ili natrijum acetat ili organskom bazom kao što je piridin ili upotrebom 50 tež.% vodenog rastvora hidroksilamina u polarnom protonskom rastvaraču kao što je etanol da bi se dobilo jedinjenje 6, Korak 3. Alternativno, u reakciji od 2 koraka, keton sa beta halogenom može biti alkilovan sa zaštićenim alil aminom ili pomoću reakcije sa alil aminom, nakon čega sledi in situ zaštitatercbutoksikarbamilom i zatim tretman sa hidroksilamin hidrohloridom da bi se dobio oksim, (6, Korak 4). Oksim, (6) može zatim biti preveden u biciklični izoksazol (9) u 3+2 ciklizaciji pomoću nekoliko postupaka kao što je zagrevanje oksima (6) u nepolarnom rastvaraču kao što je toluen ili ksilen da bi se formiramo jedinjenje 9, korak 5 ili upotrebom vodenog rastvora natrijum hipohlorita ili titanijum (IV) etoksida i u nepolarnom rastvaraču kao stoje toluen ili ksilen uz zagrevanje da bi se dobilo jedinjenje 9, Korak 5.

[0046]Šema 2 ilustruje in situ formiranje oksima i kasniju konverziju da bi se formirao bicikličan izoksazol da bi se dobilo jedinjenje (10), Korak 8. N-[(4-metoksifenilmetil]hidroksilamin hidrohlorid je tretiran jedinjenjem (3) u organskoj bazi kao što je trietilamin kome je dodat titanijum (IV) etoksid i uz zagrevanje daje jedinjenje 10. BOC zaštićeni pirolidin bicikličnog izoksazola je deprotektovan pod kiselim uslovima koji su dobro poznati u tehnici. Alilom zaštićeni pirolidin može biti deprotektovan upotrebom kiseline kao što je N,N-dimetilbarbiturna kiselina sa katalizatorom kao što je tetrakis(trifenilfosfin)paladijum. Deprotektovani pirolidin može zatim da reaguje u reakciji nukleofilne aromatične supstitucije (SNAr) sa supstituisanim ili nesupstituisanim aromatičnim pirimidinom upotrebom organske baze kao stoje diizopropiletilamin, trietilamin ili N,N,N',N'-tetrametilguanidin da bi se dobio željeni supstituisani zaštićeni biciklični izoksazol (Koraci 1 i 2 Koraka 9). 4-metoksil benzilom (PMB) zaštićeni biciklični izoksazol je kasnije deprotektovan pod kiselim uslovima da bi se dobilo jedinjenje 11, (Korak 3 Koraka 9). Jedinjenje 11 je tretirano benzoil izotiocijanatom u polarnom aprotonskom rastvaraču kao što je THF da bi se dobila tiourea (12, Korak 10). Izoksazol prsten može biti otvoren sa cinkom u prahu u sirćetnoj kiselini, (13, Korak 11). Hidroksi jedinjenje (13) je zatim tretirano 1-hloro-N,N,2-trimetilpropenilaminom da bi se formirao fuzionisani pirolidinom zaštićeni tiazin (14, Korak 12). Tiazin amid može biti deprotektovan sa organskom bazom kao što je piridin i metilhidroksilamin hidrohlorid u polarnom aprotonskom rastvaraču kao što je etanol ili neorganska baza kao što je kao što je litijum hidroksid u metanolu da bi se dobila jedinjenja formule I u Koraku 13.

[0047]Šema 3 prikazuje zaštićeni biciklični izoksazol (9) koji prvo može biti tretiran sa Zn u prahu u sirćetnoj kiselini ili sa Raney niklom u polarnom rastvaraču kao što je etanol pod uslovima hidrogenizacije pod pritiskom (16, Korak 16) nakon čega je sledila reakcija sa benzotioizocijanatom da bi se dobilo jedinjenje 17, Korak 17. Tiazin prsten može biti fomiran kao što je opisano u Šemi 2, Korak 12 da bi se dobilo jedinjenje 18, Korak 18. U Koraku 19, pirolidin (18) može biti deprotektovan i heteroarilovan kao što je opisano u Šemi 2 (Koraci 1 i 2 Koraka 9) da bi se dobio fuzionisani pirolidin zaštićeni tiazin (jedinjenje 14, Šema 2). Tiazin amid može zatim biti deprotektovan kao što je opisano u Šemi 2 (Korak 13) da bi se dobila jedinjenja formule I.

[0048]Šema 4 prikazuje alternativni put od Šeme 3 i Šeme 2 u kojima jedinjenje 9 može biti deprotektovano i heteroarilovano u SNAr reakciji na azotu pirolidina i izoksazol prsten može biti otvoren pre tretmana bicikiličnog izoksazola sa benzoil izocijanatom.

[0049]Na primer, pirolidin azot može biti deprotektovan i heteroarilovan kao što je opisano u Šemi 2, Korak 9. Izoksazol prsten jedinjenja 11 može biti otvoren kao što je opisano u Šemi 3, Korak 16 da bi se dobilo jedinjenje 19, Korak 21. Konverzija iz dva koraka da bi se fomirao zaštićeni tiazin, (14) može se postići kao što je prikazano u Koracima 22 i 24 i opisano u Koracima 17 i 18, Šema 3 ili zaštićeni tiazin može biti formiran direktno kao što je prikazano u Koraku 23 upotrebom benzotioizocijanata u prvom koraku i trifenilfosfina i diizopropil azodikarboksilata u drugom koraku. Tiazin amid može biti deprotektovan kao što je opisano u Šemi 2, Korak 13 da bi se dobila jedinjenja formule I.

[0050]U izbornom koraku, farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule I, kao što je hidrohloridna so, može biti formirana reakcijom odgovarajuće slobodne baze formule I sa odgovarajućom farmaceutski prihvatljivom kiselinom u pogodnom rastvaraču pod standardnim uslovima. Pored toga, formiranje takvih soli može da se javi istovremeno sa detekcijom azotne zaštitne grupe. Formiranje takvih soli je dobro poznato i shvaćeno u tehnici. Videti, na primer, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); i Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19,

(1977).

Pripreme i primeri

[0051]Sledeće pripreme i primeri dalje ilustruju pronalazak. Osimj ukoliko nije naznačeno suprotno, jedinjenja koja su ovde ilustrovana su imenovana i numerisana upotrebom Symyx® Draw verzije 3.2 (Symyx Solutions, Inc.) ili IUPACNAME ACDLABS.

Priprema 1

2-hloro-5-fluoro-4-izopropil-pirimidin

[0052]

[0053]Mešani rastvor 5-fluoro-2-hloropirimidina (5.00 g, 37.7 mmol) u 1,2-dimetoksietanu (25 mL) reagovao je sa rastvorom 2 M izopropil magnezij um hlorida u tetrahidrofuranu (28.3 mL, 56.6 mmol) uz održavanje temperature ispod 15°C. Dobijeni rastvor je mešan jedan čas pod azotom i zatim hlađen do 0°C. Dodat je trietilamin (5.76 mL, 37.7 mmol) u tetrahidrofuranu (5 mL), a zatim rastvor joda (9.58 g, 37.7 mmol) u tetrahidrofuranu (20 mL). Pošto je dodavanje završeno, tamna reakciona smeša je ugašena vodom, a zatim zasićenim natrijum bikarbonatom i zasićenim natrijum bisulfatom. Smeša je ekstrahovana sa etil acetatom (3 x). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko natrijum sulfata i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 5-100% gradijenta dihlorometana u heksanima da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.55 g, 39%). GC/MS (m/e): 174.

[0054]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 1.

Priprema 4

2-Hloro-5-fluoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin

[0055]

[0056]Natrijum metoksid (446.53 mg, 8.27 mmol) je dodavan u porcijama u mešani rastvor 2,4-dihloro-5-fluoro-6-metil-pirimidina (1.7 g, 7.51 mmol) u metanolu (8 mL, 197.66 mmol) na 0°C. Smeša je zatim mešana na temperaturi sredine u trajanju od 1 časa. Voda (20 mL) je dodata u reakcionu smešu, a zatim i dihlorometan. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa dihlorometanom. Kombinovani organski ekstrakti su sušeni preko magnezijum sulfata i rastvarači su isparavani pod sniženim pritiskom da bi se dobila 8:1 smeša proizvoda prema početnom materijalu. Sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-99% gradijenta dihlorometana u izo-heksanima da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.16 g, 87%). 'H NMR (CDCb) 8 4.09 (s, 3H), 2.45 (d, 3H).

Priprema 5

l-(2-Hloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)etanon

[00571

[0058]Rastvor 5-fluoro-2,4-dihloro-pirimidina (20 g, 119.8 mmol) i (1-etoksietenil)trimetilstanana (43.26 g, 119. 8 mmol) u dimetilformamidu (200 mL) na sobnoj temperaturi prečišćen je azotom. Dodat je bis(trifenilfosfin)paladijum(II) hlorid (1.70 g, 2.40 mmol) i dobijena smeša je zagrevana do 70°C u trajanju od 2 časa pod azotom. Reakcija je hlađena do 50°C i dodat je 5 N vodeni rastvor hlorovodonika (100 mL) i mešan 2 časa. Reakcija je hlađena i razblažena vodom (200 mL) i fiziološkim rastvorom i ekstrahovana pet puta sa dietil etrom. Kombinovani organski slojevi su sušeni preko natrijum sulfata i koncentrovani pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen upotrebom hromatografije nakoloni silika gela upotrebom 5-50% gradijenta etil acetata u heksanima da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (19.2 g, 92%). GC/MS (m/e): 174 i 176.

Priprema 6

2-(2-Hloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)propan-2-ol

[0059]

[0060]U mešani, -78°C rastvor l-(2-hloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)etanona (10.06 g, 57.6 mmol) u tetrahidrofuranu (100 mL) pod azotom dodat je metil magnezijum bromid u dietil etru (3 M, 124 mL, 72.04 mmol) i dobijena smeša je mešana na -78°C u trajanju od 20 minuta. Reakcija je ugašena vodenim zasićenim rastvorom amonijum hlorida i smeša je zagrevana do sobne temperature. Reakciona smeša je ekstrahovana tri puta sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi su sušeni preko natrijum sulfata i koncentrovani pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen upotrebom hromatografije na koloni silika gela upotrebom 5-100% gradijenta etil acetata u heksanima da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (7.06 g, 64%). ES/MS (m/e): 191 i 193 (M+l).

Priprema 7

2-Hloro-5-fluoro-4-( 1 -fluoro-1 -metil-etil)pirimidin

[0061]

[0062]Dietilaminosumpor trifluorid (6.53 g, 40.5 mmol) je dodavan ukapavanjem u -78°C rastvor 2-(2-hloro-5-fluoropirimidin-4-il)propan-2-ola (4.825 g, 25.31 mmol) u dihlorometanu (70 mL) pod azotom. Reakcija je mešana na -78°C u trajanju od 30 minuta pod azotom, ugašena zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, i zagrevana do sobne temperature. Reakciona smeša je ekstrahovana tri puta sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi su sušeni preko natrijum sulfata i koncentrovani pod vakuumom. Dobijeni sirovi proizvod je prečišćen upotrebom hromatografije na koloni silika gela upotrebom 5-100% gradijenta etil acetata u heksanima da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (4.23 g, 87%). ES/MS (m/e): 193 i 195 (M+l).

Priprema 8

(ferc-Butoksikarbonilamino)fere-butilkarbonat

[0063]

[0064]Smeša hidroksilamin hidrohlorida (550.0 g, 7.9 mol), vode (5.5 L) i rastvora heptana/MTBE (5:1, 5.5 L) je hlađena do -5°C. Prethodno ohlađeni (-5°C) rastvor di-t-butildikarbonata (3.55 Kg, 16.3 mol), trietilamina (1.67 Kg, 16.5 mol) kao rastvor u heptanu/MTBE (5:1, 1.1 L) lagano je dodavan tokom 2 časa. Reakcija je mešana na -5°C 1 čas i zatim zagrevana do sobne temperature i mešana preko noći. Slojevi su odvojeni i organski sloj je ispran dva puta zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida (2 L) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (1 L), sušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan da bi se dobilo ulje koje kristališe do bele čvrste supstance. Čvrsta supstanca je mešana sa heptanom (1 L) u ledeno-vodenom kupatilu i filtrirana da bi se dobio proizvod iz naslova (1360.2 g, 73%).

'H NMR (de-DMSO) 8 10.7 (bs, IH), 1.44 (s, 9H), 1.40 (s, 9H).

Priprema 9

[terc-Butoksikarbonil- [(4-metoksifenil)metil] amino]ferc-butil karbonat

[0065]

[0066120 L reaktor, pod azotom je napunjen (terc-butoksikarbonilamino) terc-butil karbonatom (812.9 g, 3.48 mol), dimetilformamidom (4.4 L), kalijum karbonatom (626.5 g, 4.52 mol) i l-(hlorometil)-4-metoksi-benzenom (462 mL, 2.56 mol). Smeša je mešana na 40°C preko noći. 'H NMR analiza prikazuje nekompletnu reakciju. Dodata je nova količina kalijum karbonata (626.5 g, 4.52 mol) i smeša je mešana na 40°C. 'H NMR analiza posle 48 časova pokazuje daje reakcija još uvek nezavršena. Dodata je nova količina kalijum karbonata (482 g, 3.49 mol) i smeša je mešana na 40°C. 'H NMR analiza posle prekonoćne reakcije pokazala je završenu reakciju bez preostalog početnog materijala. Dodati su voda (5 L) i MTBE (5 L) i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je ispran vodom (3x3 L), sušen preko natrijum sulfata i koncentrovan da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.21 Kg, 98%). 'H NMR (de-DMSO) 5 7.20 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 6.91 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 3.73 (s, 2H), 3.35 (s, 3H), 1.41 (s, 18H).

Priprema 10

N-[(4-Metoksifenil)metil]hidroksilamin hidrohlorid

[0067]

[0068][ferc-Butoksikarbonil-[(4-metoksifenil)rnetil]amino] terc-butil karbonat (1.125 Kg, 3.1 mol) je rastvoren u 1,4-dioksanu (2.8 L) i ukapavanjem je dodavan rastvor hlorovodonika (4 M u dioksanu, 3.15 L, 12.4 mol) tokom 1 časa i 30 minuta. Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Proizvod iz naslova je sakupljen filtracijom kao bela čvrsta supstaca (488.0 g, 81%).

'H NMR (de-DMSO) 5 11.71 (s, 2H), 10.94 (s, IH), 7.44 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 6.95 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 4.22 (s, 2H), 3.75 (s, 3H).

Priprema 11

2-(Alil(ferc-butoksikarbonil)amino)sirćetna kiselina

[0069]

[0070]U posudu sa okruglim dnom koja sadrži kalijum karbonat (100 g, 724 mmol), natrijum jodid (110 g, 727 mmol), dimetilformamid (300 mL), trietilamin (200 mL, 1.44 mol) i 2-propen-1-amin (24 g, 426 mmol) na 0°C ukapavanjem je dodat rastvor etil 2-bromoacetata (60.2 g, 360 mmol) u dimetilformamidu (40 mL). Reakcija je zagrevana do temperature sredine i mešana 14 časova. Čvrste supstance su uklonjene filtracijom i isprane dietil etrom. Zasićeni vodeni rastvor natrijum hlorida (1 L) je dodat u filtrat i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa dietil etrom. Organske faze su kombinovane, sušene preko magnezijum sulfata, filtrirane i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. U rastvor na 0°C sirovog ostatka u etanolu (500 ml) i trietilaminu (40 g, 395 mmol) dodat je di-t-butildikarbonat (105 g, 467 mmol) u jednoj porciji. Reakcija je zagrevana do sobne temperature i mešana 14 časova. Reakcija je koncentrovana pod sniženim pritiskom i razblažena vodom (200 mL) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (200 mL) i ekstrahovana sa dietil etrom. Organske faze su kombinovane, sušene preko magenzijum sulfata, filtrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je apsorbovan u metanolu (200 mL) i dodat je 2 N natrijum hidroksid (500 mL). Dobijeni rastvor je mešan 3 časa na sobnoj temperaturi. Zapremina je smanjena za približno 200 ml pod sniženim pritiskom i dobijeni rastvor je zakišeljen do pH 4 upotrebom hlorovodonične kiseline (12 N). Dobijena svetio narandžasta čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana vodom i sušena da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (50 g, 65%). 'H NMR (CDCb) smeša dva rotamera (50:50) 8 1.43, 1.45 (s, 9H), 3.86-3.99 (m, 4H), 5.10-5.20 (m, 2H), 5.71-5.83 (m, IH).

Priprema 12

ferc-Butil N-alil-N-[2-(metoksi(metil)amino)-2-okso-etil]karbamat

[0071]

[0072]2-(Alil(ferc-butoksikarbonil)amino)sirćetna kiselina (49.6 g, 156 mmol) je dodata u tetrahidrofuran (600 mL) na 0°C, a zatim je sledilo dodavanje trietilamina (36.3 g, 359 mmol) i pivaloil hlorida (31 g, 353 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 3 časa i zatim je hlađena do 0°C. Zatim su dodati N,0-dimetilhidroksilamin hidrohlorid (28 g, 283 mmol), trietilamin (33 mL, 237 mmol) i tetrahidrofuran (400 mL). Ledeno kupatilo je uklonjeno i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 3 časa i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Dobijena čvrsta supstanca je rastvorena u vodi i ekstrahovana etil acetatom. Organske faze su kombinovane, sušene preko natrijum sulfata, filtrirane i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela, eluiranjem sa 0-50% gradijentom acetona u heksanima da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (32 g, 54%). 'H NMR (CDCb) smeša dva rotamera (60:40) 8 1.42,1.44 (s, 9H), 3.16, 3.17 (s, 3H), 3.66, 3.69 (s, 3H), 3.88-3.98 (m, 2H), 4.01, 4.11 (s, 2H), 5.10-5.18 (m, 2H), 5.73-5.85 (m, IH).

Priprema 13

2-Bromo-(3-piridil)etanon bromovodonik

[0073]

[0074]U snažno mešani rastvor l-(3-piridinil)-etanona (7.2 mL, 65.44 mmol) u sirćetnoj kiselini (65 mL) i 48% vodenom rastvoru bromovodonika (11 mL, 97.88 mmol) na 0°C ukapavanjem je dodat brom (3.5 mL, 68.11 mmol). Reakcija je zagrevana do 40°C uz snažno mešanje i mešana 2 časa. Reakcija je zatim zagrevana do 75°C imešana 2 časa. Reakciona smeša je hlađena do sobne temperature i razblažena sa dietil etrom. Dobijeni talog je sakupljen, ispran dietil etrom i sušen pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela kristalna čvrsta supstanca (18.27 g, 99%). 'H NMR (de-DMSO) 8 14.53-14.47 (m, IH), 9.35 (d, J= 1.5 Hz, IH), 9.01 (d, J= 4.9 Hz, IH), 8.72 (d, J= 7.8 Hz, IH), 7.97-7.91 (m, IH), 5.09 (s, 2H).

[0075]Sledeće jedijenje je pripremljeno uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 13 upotrebom 2-acetil piridina. Brom je dodat ukapavanjem u 4 jednake porcije.

Priprema 15

2-Bromo-1 -(4-piridil)etanon bromovodonik

[0076]

[0077]U mešani rastvor 4-acetil piridina (3.62 g, 29.88 mmol) u sirćetnoj kiselini (30 mL) dodatje 48% vodeni rastvor bromovodonika (5.3 mL, 47.16 mmol). Ukapavanjem je dodat brom (1.6 mL, 31.14 mmol) u 4 iste porcije. Reakcije je mešana oko 2 časa i čvrsta supstanca se istaložila. Dodatje brom (1.6 mL, 31.14 mmol) i reakcija je mešana preko noći. Dobijeni talog je sakupljen, ispran dietil etrom, i sušen pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (8.6 g, 102%). 'H NMR (de-DMSO) 8 9.02 (d, 2H), 8.17 (d, 2H), 5.08 (2H)

Priprema 16

2-Bromo-1 -pirazin-2-il-etanon bromovodonik

[0078]

[0079]U mešani rastvor acetilpirazina (10 g, 81.88 mmol) u sirćetnoj kiselini (70 mL) dodatje bromovodonik (38% rastvor u sirćetnoj kiselini, 16 mL), a zatim piridinijum bromid perbromid (28 g, 83.17 mmol) koji je dodat u jednoj porciji. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi približno 1.5 čas. Suspenzija je formirana u toku ovog vremena. Dodatje dietil etar (500 mL) i dobijeni talog je sakupljen filtracijom. Izolovani proizvod je ispran acetonitrilom i dietil etrom i sušen pod vakuumom da bi se dobila svetio braon čvrsta supstanca (23.2 g, kvantitativan prinos). 'H NMR (d6-DMSO) 5 9.19 (IH, m), 8.95 (1H, m), 8.84 (IH, m), 5.02 (2H, s).

Priprema 17

terc-Butil N-alil-N-[2-okso-2-(3-piridil)etil]karbamat

[0080]

[0081]2-Bromo-l-(3-piridil)etanon bromovodonik (9.35 g, 21.96 mmol) je dodavan u porcijama tokom 5 minuta u mešani rastvor 2-propen-l-amina (1.82 mL, 24.16 mmol) i diizopropiletilamina (7.66 mL, 43.93 mmol) u tetrahidrofuranu (270 mL) na 0°C. Reakciona smeša je mešana 1 čas i 40 minuta na 0°C. Dodatje di-f-butildikarbonat (9.40 mL, 41.73 mmol) u tetrahidrofuranu (10 mL) i reakcija je nastavljena na 0°C u trajanju od 1 časa i 40 minuta. Reakcija je ugašena zasićenim natrijum hidrogen karbonatom (120 mL). Dodatje dihlorometan (300 mL) i faze su razdvojene. Vodena faza je ponovo ekstrahovana sa dihlorometanom (300 mL). Kombinovane organske faze su sušene preko magnezijum sulfata, filtrirane i koncentrovane pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-5% gradijenta acetona u dihlorometanu, a zatim 5-10% gradijenta acetona u dihlorometanu, zatim sa 100% acetonom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.15 g, 19%>). ES/MS (m/e): 277 (M+l).

[0082]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 17 upotrebom odgovarajućeg piridina ili pirazina.

Priprema 21

ferc-Butil N-alil-N-[2-(5-fluoro-2-piridil)-2-okso-etil]karbamat

[0083]

[0084]2-Bromo-5-fluoro-piridin (2.46 g, 13.98 mmol) u tetrahidrofuranu (20 mL) dodavanje ukapavanjem u izopropilmagnezijum hlorid (15 mL, 30.00 mmol 2M rastvora u tetrahidrofuranu) uz mešanje pod azotom na sobnoj temperaturi. Dobijena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 časa.terc- ButilN-alil-N-[2-[metoksi(metil)amino]-2-okso-etil]karbamat (3.4 g, 13.16 mmol) u tetrahidrofuranu (15 mL) je zatim dodat ukapavanjem na sobnoj temperaturi i dobijena smeša je mešana preko noći. Dodatje razblaženi vodeni rastvor hlorovodonične kiseline, a zatim etil acetat. Slojevi su razdvojeni i vodena faza je ponovo ekstrahovana sa etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su sušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do sušenja pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 0-40% gradijenta acetona u izo-heksanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.27 g, 33%). ES/MS (m/e): 317 (M+23).

Priprema 22

2-(Dialilamino)-1 -(3 -piridil)etanon

[0085]

[0086]2-Bromo-l-(3-piridil)etanon bromovodonik (10 g, 23.49 mmol) je dodavan u porcijama tokom 5 minuta u mešani rastvor dialilamina (5.2 mL, 42.29 mmol) i diizopropiletilamina (10.24 mL, 58.73 mmol) u tetrahidrofuranu (150 mL) na 0°C. Dobijena smeša je mešana na 0°C u trajanju od 1 časa. Reakcija je ugašena dodavanjem zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (100 mL) i dihlorometana (300 mL). Slojevi su razdvojeni i vodena faza je ponovo ekstrahovana sa dihlorometanom (300 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko magnezijum sulfata i rastvarači su uklonjeni pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (4.75 g, 93%). ES/MS (m/e): 217 (M+l).

Priprema 23

terc-Butil N-alil-N-(2-hidroksiimino-2-pirazin-2-il-etil)karbamat

[0087]

[0088]terc-Butil N-alil-N-(2-okso-2-pirazin-2-il-etil)karbamat (6.53 g, 23.55 mmol) je rastvoren u etanolu (22 mL) uz mešanje pod azotom. Dodati su hidroksilamine hidrohlorid (3.80 g, 54.16 mmol) i piridin (2.67 mL, 32.97 mmol) i dobijeni rastvor je zagrevan na 80°C pod azotom 80 minuta. Reakcija je zatim hlađena do sobne temperature i koncentrovana do male zapremine pod sniženim pritiskom. Dodati su dihlorometan (200 ml) i 1 M vodeni rastvor natrijum hidroksida (60 ml) i faze su razdvojene. Vodena faza je ponovo ekstrahovana sa dihlorometanom (2 x 200 mL). Kombinovani organski ekstrakti su sušeni preko magnezijum sulfata i rastvarač je ispravan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao smeša E/Z izomera (6.61 g, 96%). ES/MS (m/e): 293 (M+l).

[0089]Sledeće jedinjenje je pripremljeno uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 23.

Reakcija je zagrevana preko noći.

Priprema 25

terc-Butil N-alil-N-[2-(5-fiuoro-2-piridil)-2-hidroksiimino-etil]karbamat

[0090]

[0091]2-Bromo-5-fiuoro-piridin (6.475 g, 36.79 mmol) u tetrahidrofuranu (20 mL) je dodat ukapavanjem u izopropilmagnezijum hlorid (20 mL, 40.00 mmol 2 M rastvora u tetrahidrofuranu) uz mešanje pod azotom na sobnoj temperaturi. Dobijena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 časa.terc-ButilN-alil-N-[2-[metoksi(metil)amino]-2-okso-etil]karbamat (4.43 g, 17.15 mmol) u tetrahidrofuranu (15 mL) je zatim dodavan ukpavanjem na sobnoj temperaturi i dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 4 časa i 30 minuta. Reakcija je ugašena dodavanjem vodenog rastvora amonijum hlorida, a zatim etil acetata. Slojevi su razdvojeni

[0092]i vodena faza je ponovo ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su sušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do sušenja pod sniženim pritiskom. Dobijeno tamno ulje je apsorbovano u etanolu (60 mL) uz mešanje. Dodatje 50 tež. % vodeni rastvor hidroksilamina (3 mL, 55.09 mmol) i dobijeni rastvor je zagrevan na 60°C tokom vikenda. Reakcija je zatim hlađena do sobne temperature i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-35% gradijenta izoheksana u etil acetatu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao smeša E/Z izomera (4.9 g, 92%). ES/MS (m/e): 310 (M+l).

Priprema 26

ferc-Butil 6a-pirazin-2-il-3,3a,4,6-tetrahidro-lH-pirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilat

[0093]

[0094]Rastvor terc-butil N-alil-N-(2-hidroksiimino-2-pirazin-2-il-etil)karbamata (6.6 g, 22.58 mmol) u toluenu (80 mL) je mešan na 120°C u trajanju od 22 časa. Reakcija je hlađena i rastvarač je isparavan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (5.13 g, 74%). ES/MS (m/e): 293 (M+l).

[0095]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 26.

Priprema 29

terc-Butill-[(4-metoksifenil)metil]-6a-(3-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidro pirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilat

[0096]

[0097]U mešani rastvor terc-butil N-alil-N-[2-okso-2-(3-piridil)etil]karbamata (2.3 g, 8.32 mmol) u anhidrovanom toluenu (38 mL) dodat je N-[(4-metoksifenil) metil]hidroksilamin hidrohlorid (2.05 g, 10.82 mmol) i trietilamin (1.74 mL, 12.48 mmol). Dodatje titanijum (IV) etoksid (6.09 mL, 29.13 mmol) i smeša je zagrevana na 75°C u trajanju od 5 časova. Reakcija je hlađena do sobne temperature, dodati su voda (60 mL) i etil acetat (50 mL) i smeša je mešana 10 minuta i filtrirana kroz dijatomejsku zemlju. Faze su odvojene i organska faza je sušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i koncentrovana pod vakuumom. Sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-40% gradijenta acetona u izo-heksanima da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.9 g, 76%). ES/MS (m/e): 412 (M+l).

[0098]Sledeća jedinjenja su pripremljena pomoću postupka iz Pripreme 29 uz zagrevanje koje varira od 2.5 časa do 6 časova.

Priprema 33

2-(Dialilamino)-1 -(3 -piridil)etanon oksim

[0099]

[0100]2-(Dialilamino)-l-(3-piridil)etanon (4.75 g, 21.96 mmol) je rastvoren u etanolu (47 mL) pod atmosferom azota. Zatim su dodati hidroksilamin hidrohlorid (3.55 g, 50.51 mmol) i piridin (2.5 mL, 30.75 mmol). Dobijeni rastvor je zagrevan na 70°C pod azotom u trajanju od 140 minuta. Reakcija je zatim hlađena do sobne temperature i rastvarač je delimično isparavan pod sniženim pritiskom. Dobijen ostatak je podeljen između 1 M vodenog rastvora natrijum hidroksida (50 ml) i dihlorometana (250 mL). Faze su razdvojene i vodena faza je ekstrahovana sa etil acetatom (250 mL). Organski slojevi su kombinovani i rastvarači su isparavani. Sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom

[0101]0-10% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (3.95 g, 78%) kao smeša E/Z izomera. ES/MS (m/e): 232 (M+l).

Priprema 34

terc-Butil N-alil-N-[2-hidroksiimino-2-(3-piridil)etil]karbamat

[0102]

[0103]terc-Butil N-alil-N-[2-okso-2-(3-piridil)etil]karbamat (31.34 g 113.41 mmol) je rastvoren u etanolu (110 mL) uz mešanje pod azotom. Dodati su hidroksilamin hidrohlorid (18.31 g, 260.85 mmol) i piridin (12.84 mL, 158.78 mmol). Dobijeni rastvor je zagrevan na 80°C pod azotom 2 časa i zatim je hlađen do sobne temperature. Rastvarači su delimično isparavani i dobijeni ostatak je zatim podeljen između 2 M natrijum hidroksida (150 ml) i dihlorometana (500 mL). Faze su razdvojene i vodena faza je ponovo ekstrahovana sa dihlorometanom (2 x 250 mL). Organski ekstrakti su spojeni i isparavani pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom gradijenta 0-10% 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (30.34 g, 91.82%) kao smeša E/Z izomera. ES/MS (m/e) M+l=292.

Priprema 35

5-Alil-6a-(3-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidro-lH-pirolo[3,4-c]izoksazol

[0104]

[0105]Rastvor 2-(dialilamino)-l-(3-piridil)etanon oksima (3.95 g, 17.08 mmol) u toluenu (56 mL) je zagrevan na 120°C u trajanju od 18 časova. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.14 g, 43%). ES/MS (m/e): 232 (M+l).

Priprema 36

6a-(4-Piridil)-l,3,3a,4,5,6-heksahidropirolo[3,4-c]izoksazol

[0106]

[0107]U rastvor tere-butil l-[(4-metoksifenil)metil]-6a-(4-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilata (1.3 g, 3.16 mmol) u dihlorometanu (30 mL) dodata je trifluorosirćetna kiselina (7 mL, 94.77 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 1 čas. Reakcija je koncentrovana i dobijeni ostatak je održavan na sobnoj temperaturi preko noći. Ovaj ostatak je zatim sipan na jono-izmenjivačku kolonu i kolona je prvo eluirana sa metanolom, a zatim sa 2 M rastvorom amonijaka/metanola. Željena bazna frakcija je sakupljena i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (592 mg, 98 %). ES/MS (m/e): 192 (M+l).

Priprema 37

6a-Pirazin-2-il-1,3,3a,4,5,6-heksahidropirolo[3,4-c]izoksazol

[0108]

[0109]Trifluorosirćetna kiselina (40 mL) je dodata u mešani rastvor terc-butil 6a-pirazin-2-il-3,3a,4,6-tetrahidro-lH-pirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilata (5.14 g, 17.58 mmol) u dihlorometanu (200 mL) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana 1 čas i rastvarači su isparavani pod sniženim pritisikom. Dobijeni ostatak je rastvoren u metanolu (100 mL) i sipan na jono-izmenjivačku kolonu (50 g) i kolona je prvo eluirana metanolom (110 mL), a zatim sa 7 M rastvorom amonijaka/metanola (150 mL). Ova bazna frakcija je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod koji je dalje prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 0-10% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.4 g, 71%). ES/MS (m/e): 193 (M+l).

[0110]Sledeće jedinjenje je prpremljeno uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 37.

Priprema 39

6a-(3-Piridil)-l ,3,3a,4,5,6-heksahidropirolo[3,4-c]izoksazol

[0111]

[0112]5-Alil-6a-(3-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidro-lH-pirolo[3,4-c]izoksazol (2.14 g, 7.40 mmol) i N,N-dimetilbarbiturna kiselina (6.93 g, 44.41 mmol) su rastvoreni u hloroformu (80 mL) i dobijeni rastvor je degaziran dva puta upotrebom tečnog azota. Dodat je tetrakis(trifenilfosfin)paladijum (1.28 g, 1.11 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 časa. Reakcija je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je rastvoren u 1:1 smeši dimetilsulfoksida/metanola (40 ml) i rastvor je sipan na jono-izmenjivačku kolonu. Materijal je eluiran metanolom (70 mL), zatim sa 7 M rastvorom amonijaka/metanola (70 mL). Bazna frakcija je sakupljena i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Proizvodje dalje prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 0-15% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.28 g, 86%). ES/MS (m/e): 192 (M+l).

Priprema 40

5-(5-Fluoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin-2-il)-6a-pirazin-2-il-3,3a,4,6-tetrahidro-lH-pirolo [3,4-c] izoksazol

[0113]

[0114]U mešani rastvor 6a-pirazin-2-il-l,3,3a,4,5,6-heksahidropirolo[3,4-c]izoksazola (1.4 g, 7.28 mmol) u 1,4-dioksanu (30 mL) dodat je 2-hloro-5-fluoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin (5.14 g, 29.13 mmol) i diizopropiletilamin (5.7 mL, 32.77 mmol). Dobijeni rastvor je zagrevan na 110°C u trajanju od 4 časa. Reakcija je hlađena i koncentovana pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0.93 g, 38%). ES/MS (m/e): 333 (M+l).

[0115]Sledeća jedinjenja su pripremlčjena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 40 upotrebom odgovarajućeg pirimidina sa vremenima zagrevanja koja variraju od 4 časa do 4.5 časa i temperaturom u opsegu od 100-110°C.

Priprema 45

l-[(4-Metoksifenil)metil]-6a-(3-piridil)-3a,4,5,6-tetrahidro-3H-pirolo[3,4-c]izoksazol

[0116]

[0117]U mešani rastvorterc-butill-[(4-metoksifenil)metil]-6a-(3-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilata (2.9 g, 7.05 mmol) u dihlorometanu (80 mL) dodata je trifluorosirćetna kiselina (16 mL). Reakciona smeša je mešana 1 čas i 30 minuta na sobnoj temperaturi. Rastvarač je koncentrovan i ostatak je podeljen između zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (30 mL) i dihlorometana (100 mL). Dobijeni rastvor je mešan 30 minuta, zatim su faze razdvojene. Vodena faza je ponovo ekstrahovana sa dihlorometanom. Kombinovani dihlorometanski ekstrakti su sušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-10% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.33g, 43%). ES/MS (m/e): 312 (M+l).

[0118]Sledeće jedinjenje je pripremljeno uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 45.

Priprema 48

5-(5-Fluoropirimidin-2-il)-l-[(4-metoksifenil)metil]-6a-(3-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol

[0119]

[0120]U mešani rastvor l-[(4-metoksifenil)metil]-6a-(3-piridil)-3a,4,5,6-tetrahidro-3H-pirolo[3,4-c]izoksazola (1.33 g, 4.27 mmol) u 1,4-dioksanu (30 mL) dodatje 2-hloro-5-fluoro-pirimidin (2.55 g, 19.22 mmol) i diizopropiletilamin (3.72 mL, 21.36 mmol). Dobijeni rastvor je zagrevan na 110°C u trajanju od 3 časa. Reakcija je hlađena i rastvarač je isparavan pod vakuumom da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.11 g, 54%). ES/MS (m/e): 408 (M+l).

[0121]Sledeće jedinjenje je pripremljeno uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 48.

Priprema 51

5-(5-Fluoropirimidin-2-il)-6a-(3-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidro-lH-pirolo[3,4-c]izoksazol,

[0122]

[0123]Rastvor 5-(5-fluoropirimidin-2-il)-l-[(4-metoksifenil)metil]-6a-(3-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazola (1.11 g, 2.32 mmol) u trifluorosirćetnoj kiselini (9.3 mL) je mešan na 60°C u trajanju od 1 časa. Rastvarač je isparavan i dobijeni ostatakje podeljen između dihlorometana (100 mL) i zasićenog vodenog rastvora natrijum karbonata (25 mL). Organska faza je razdvojena i vodena fazaje ponovo ekstrahovana dva puta sa dihlorometanom (100 mL). Kombinovani organski ekstrakti su sušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i rastvarač je isparavn pod vakuumom da bi se dobio ostatak koji je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-10% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0.64 g, 96%). ES/MS (m/e): 288 (M+l).

[0124]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 51.

Priprema 54

N-[5-(5-Fluoropirimidin-2-il)-6a-(3-pir^ karbotioil]benzamid

[0125]

[0126]Benzoil izotiocijanat (511 mL 3.79 mmol) je dodat ukapavanjem u mešani rastvor 5-(5-fluoropirimidin-2-il)-6a-(3-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidro-lH-pirolo[3,4-c]izoksazola (640 mg, 2.23 mmol) u tetrahidrofuranu (20 mL) na 0°C. Dobijena smeša je mešana na 0°C u trajanju od 1 časa i zagrevana do sobne temperature tokom 1 časa. Rastvarač je isparavanpod vakuumom i dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.1 g, kvantitativan). ES/MS (m/e): 451 (M+l).

Priprema 55

N-[6-(5-Fluoropirimidin-2-il)-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-iljbenzamid

[0127]

[0128]Smeša N-[5-(5-fluoropirimidin-2-il)-6a-(3-piridil)-3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol-l-karbotioil]benzamida (550 mg, 1.22 mmol) i cinka u prahu (798.33 mg, 12.21 mmol) u sirćetnoj kiselini (5 mL) je ultrazvučno obrađivana 2 časa na sobnoj temperaturi. Smeša je ekstrahovana etil acetatom (100 mL) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (30 mL). Vodena faza je ponovo ekstrahovana tri puta sa dihlorometanom (100 mL). Kombinovani organski ekstrakti su sušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i koncentrovani da bi se dobio ostatak. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-10% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobio intermedijer N-[[ 1 -(5-fluoropirimidin-2-il)-4-(hidroksimetil)-3-(3-piridil)pirolidin-3-il]karbamotioil]benzamida (145 mg). Ovo je rastvoreno u dihlorometanu (6 mL) i hlađeno do 0°C. Zatim je dodat l-hloro-N,N,2-trimetilpropenilamin (0.05 g, 374.19 mmol) i smeša je mešana na 0°C u trajanju od 1 časa. Dodati su zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (10 mL) i dihlorometan (100 mL). Faze su razdvojene i organska faza je sušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i koncentrovana. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobio proizvod iz naslova (110 mg, 17%). ES/MS (m/e): 435 (M+l).

Priprema 56

[4-Amino-l-(5-fluoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin-2-il)-4-pirazin-2-il-pirolidin-3-il]metanol

[0129]

[0130]Rastvor 5-(5-fluoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin-2-il)-6a-pirazin-2-il-3,3a,4,6-tetrahidro-lH-pirolo[3,4-c]izoksazola (0.92 g, 2.77 mmol) u etanolu (40 mL) je hidrogenizovan na 50 psi u prisustvu Raney nikla (kao suspenzija u vodi) (2.7 g, 45.54 mmol) u trajanju od 5 časova upotrebom PARR hidrogenatora. Dodatje metanol i katalizator je uklonjen filtracijom kroz čep od dijatomejske zemlje. Čep od dijatomejske zemlje je ispran metanolom. Kombinovani filtrati su koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0.92 g, 99%). ES/MS (m/e): 335 (M+l).

[0131]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 56 sa reakcionim vremenom koje varira od 5 časova do 3 dana upotrebom PARR hidrogenatora ili protočnog hidrogenatora.

Priprema 65

N-[[l-(5-Fluoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin-2-il)-4-(hidroksimetil)-3-pirazin-2-il-pirolidin-3-il]karbamoitioil]benzamid

[0132]

[0133]U mešani rastvor [4-amino-l-(5-fiuoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin-2-il)-4-pirazin-2-il-pirolidin-3-il]metanola (930 mg, 2.78 mmol) u tetrahidrofuranu (29 mL) pod atmosferom azota dodatje benzoil izotiocijanat (613 mL, 4.45 mmol). Posle mešanja reakcije na sobnoj temperaturi 1 čas rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.32 g, 95%>). ES/MS (m/e): 498 (M+l).

[0134]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 65.

Priprema 74

Racemski N-[6-(5-Fluoropirimidin-2-il)-7a-(2-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [ 1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0135]

[0136]4-Amino-l-(5-fluoropirimidin-2-il)-4-(2-piridil)pirolidin-3-il]metanol (240 mg, 0.83 mmol) je rastvoren u tetrahidrofuranu (25 mL). Smeša je hlađena do 0°C pod azotom i dodatje benzoil izotiocijanat (120 mg, 0.74 mmol). Dobijna smeša je mešana 30 minuta. Dodati su trifenilfosfin (260 mg, 0.981 mmol), a zatim diizopropil azodikarboksilat (340 mg, 1.68 mmol) i reakcija je ostavljena da se zagreva do sobne temperature. Posle jednog časa reakcija je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 0-50% gradijenta tetrahidrofurana u cikloheksanu. Ovo je dalje prečišćeno pomoću ahiralne SFC (superkritična fluidna hromatografija) (Kolona: Princeton DNP (dinitrofenil) (5li), 21.2 x 250mm; eluent: gradijent 15-30% metanola (0.2% dietilmetilamin) u CO2; protok: 65 mL/min na UV 240 nm) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (160 mg, 44%). ES/MS (m/e): 435 (M+l).

Priprema 75

Racemski N-[6-(5-Fluoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin-2-il)-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [ 1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0137]

[0138]l-Hloro-N,N,2-trimetilpropenilamin (492 uL, 3.71 mmol) je dodat u mešani rastvor N-[[l-(5-fluoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin-2-il)-4-(hidroksimetil)-3-pirazin-2-il-pirolidin-3-il]karbamoitioil]benzamida (1.32 g, 2.65 mmol) u dihlorometanu (30 mL) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana 1 čas i 30 minuta. Zatim je dodat zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (20 mL), a zatim dihlorometan (70 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa dihlorometanom (70 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko magnezijum sulfata i rastvarač je isparavan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je rastvoren u metanom (40 mL) i sipan na jono-izmenjivačku kolonu. Kolona je eluirana metanolom (60 mL), zatim sa 7 M rastvorom amonijaka/metanola (100 mL). Bazna frakcija rastvarača je sakupljena i isparavana pod sniženim pritiskom. Tzolovani ostatak je dalje prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (820 mg, 64%). ES/MS (m/e): 480 (M+l).

[0139] Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 75.

Priprema 81

Racemski terc-Butil 2-benzamido-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [1,3]tiazin-6-karboksilat

[0140]

[0141]l-Hloro-N,N,2-trimetilpropenilamin (409.71liL, 3.10 mmol) je dodat u mešani rastvor terc-butil 3-(benzoilkarbamoitioilamino)-4-(hidroksimetil)-3-pirazin-2-il-pirolidin-l-karboksilata (1.09 g, 2.38 mmol) u dihlorometanu (30 mL) na sobnoj temperaturi. Posle mešanja reakcije na sobnoj temperaturi 3 časa dodat je zasićeni vodeni rastvor natrijum karbonata (15 mL) i smeša je mešana 5 minuta. Dodatje dihlorometan (80 mL) i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa dihlorometanom (70 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko magnezijum sulfata i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Izolovani proizvodje rastvoren u metanolu (60 mL) i prečišćen pomoću hromatografije na jono-izmenjivačkoj koloni eluiranjem sa metanolom (60 mL), zatim sa 7 M rastvorom amonijaka/metanola (120 mL). Bazna frakcija je sakupljena i dobijeni proizvod je dalje prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobio proizvod iz naslova (747 mg, 71%). ES/MS (m/e) 440 (M+l).

[0142]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 81.

Priprema 84

ferc-Butil (4aR,7aR)-2-benzaimdo-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-karboksilat

[0143]

[0144]Racemski/erobutil 2-benzamido-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-karboksilat je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (superkritične fluidne hromatografije) (kolona: Chiralpak AD-H (5li), 30 X 250mm; eluent: 50% izopropanol (0.2% dietilmetilamin) u CO2; protok: 120 mL/min na UV 260 nm). Prvi eluirajući izomer je jedinjenje iz naslova.

Priprema 85

terc-Butil (4aR,7aR)-2-benzamido-7a-(5-fluoro-2-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [ 1,3]tiazin-6-karboksilat

[0145]

[0146]Racemski terc-butil 2-benzarnido-7a-(5-fluoro-2-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-karboksilat je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (kolona: Chiralpak AD-H (5li),30 X 250mm; eluent: 40% metanol (0. % dietilmetilamin) u CO2; protok: 120 mL/min na UV 260 nm). Drugi eluirajući izomer je jedinjenje iz naslova.

Priprema 86

terc-Butil (4aR,7aS)-2-benzamido-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-karboksilat

[0147]

[0148]Racemski terc-butil 2-benzamido-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-karboksilat je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (kolona: Chiralpak AD-H (5 u), 30 X 250 mm; eluent: 35 % izopropanol (0.2 % dietilmetilamin) u CO2; protok: 130 mL/min na UV 260 nm). Prvi eluirajući izomer je jedinjenje iz naslova.

Priprema 87

N-[(4aR,7aR)-7a-Pirazin-2-il-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-il]benzamid

[0149]

[0150]Trifluorosirćetna kiselina (1.5 mL) je dodata u mešani rastvorferc-butil(4aR,7aR)-2-benzamido-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-karboksilata (299 mg, 0.680 mmol) u dihlorometanu (6 mL) na sobnoj temperaturi. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 80 minuta i rastvarač je isparavan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je rastvoren u metanolu (20 mL) i ovaj rastvor je sipan na jono-izmenjivačku kolonu i eluiran sa metanolom, zatim sa 7 M rastvorom amonijaka/metanola. Bazna frakcija je sakupljena i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (231 mg, kvantitativan). ES/MS (m/e): 340 (M+l).

[0151]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 87.

Priprema 90

N-[(4aR,7aR)-6-[5-Fluoro-4-(l-hidroksi-l-metil-etil)pirimidin-2-il]-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [ 1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0152]

[0153]N4(4aRJaR)-7a-pirazin-2-il-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-iljbenzamid (231 mg, 0.680 mmol) je rastvoren u 1,4-dioksanu (4 mL). Dodati su 2-(2-hloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)propan-2-ol (648.60 mg, 3.40 mmol) i diizopropiletilamin (653 iiL, 3.74 mmol). Reakcija je zagrevana na 110°C u trajanju od 6 časova, zatim hlađena do sobne temperature i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen pomoću hromnatografije na koloni silika gela upotrebom 0-5% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (330 mg, 98%). ES/MS (m/e): 494 (M+l).

[0154]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Pripreme 90

Primer A

2-[2-[(4aR,7aR)-2-Amino-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-te1xahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol

[0155]

[0156]N-[(4aR,7aR)-6-[5-fluoro-4-(l-hidroksi-l-metil-etil)pirimidin-2-il]-7a-pirazin-2-ib 4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-il]benzamid (330 mg, 0.668 mmol) je rastvoren u metanom (8 mL) uz mešanje. Dodatje litijum hidroksid (42.51 mg, 1 mmol) i reakcija je zagrevana na 60°C u trajanju od 5 časova i 30 minuta. Reakcija je hlađena do sobne temperature i sipana na kolonu silika gela. Kolona je eluirana sa 0-5% gradijentom 0.14 M amonijaka/metanola u dihlorometanu. Dobijeni proizvod je dalje prečišćen pomoću preparativne HPLC upotrebom 10% B do 100% B gradijenta tokom 9 minuta u 60 mL/minuti (kolona= Phenomenex Gemini NX Cl8, 30 x lOOmm, 5Lim. Pokretna faza A: voda sa 10 mM amonijum bikarbonatom, pH podešen do pH 10 sa amonijakom. Pokretna faza B: acetonitril) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (146 mg, 56%). ES/MS (m/e): 390 (M+l).

[0157]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Primera A.

Primer J

Racemski 6-(5-Fluoropirimidin-2-il)-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin

[0158]

[0159]U mešani rastvor N-[6-(5-fluoropirimidin-2-il)-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-il]benzamida (110 mg, 0.210 mmol) u etanolu (10 mL) dodati supiridin(187 uL2.31 mmol) i O-metilhidroksilamin hidrohlorid (143 mg, 1.68 mmol). Smeša je zagrevana na 70°C uz mešanje u trajanju od 17 časova. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu upotrebom 0-10% gradijenta 0.14 M rastvora amonijaka/metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (62 mg, 89%). ES/MS (m/e): 331 (M+1).

[0160]Sledeći Primeri su pripremljeni uglavnom pomoću postupka iz Primera J sa reakcionim vremenima koja variraju od 2-18 časova i temperaturom koja varira od 65-80°C.

Primer R

(4aR,7aR)-6-(5-Fluoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin-2-il)-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin

[0161]

[0162]Racemski 6-(5-fiuoro-4-metoksi-6-metil-pirimidin-2-il)-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin (490 mg, 1.3 mmol) je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (kolona: Chiralcel OD-H (5 u), 21.2 x 250 mm; eluent: 50% metanol (0.2% dietilmetilamin) u CO2; protok: 70 mL/min na UV 260 nm). Prvi eluirajući izomer je jedinjenje iz naslova (206 mg, 32%). ES/MS (m/e): 376 (M+l).

Primer 1

(4aR,7aS)-6-(5-Fluoropirimidin-2-il)-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin

[0163]

[0164]Racemski 6-(5-fluoropirimidin-2-il)-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin (137 mg, 0.415 mmol) je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (kolona: Chiralpak AD-H (5 u), 21.2 x 250 mm; eluent: 35% izopropanol (0.2% dietilmetilamin) u CO2; protok: 70 mL/min na UV 260 nm). Drugi eluirajući izomer je jedinjenje iz naslova (19 mg). ES/MS (m/e): 331 (M+l).

Primer 2

(4aR,7aS)-6-(5-Fluoro-4-izopropil-pirimidin-2-il)-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [ 1,3]tiazin-2-amin

[0165]

[0166]Racemski 6-(5-fiuoro-4-izopropil-pirimidin-2-il)-7a-(3-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin (210 mg, 0.564 mmol) je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (kolona: Chiralcel OD-H (5 u), 21.2 x 250 mm; eluent: 25% metanol (0.2%> dietilmetilamin) u CO2; protok: 70 mL/min na UV 260 nm). Prvi eluirajući izomer je dalje prečišćen ponovo pomoću hiralne SFC (kolona: Chiralcel OD-H (5u), 21.2x 250 mm; eluent: 15% metanol (0.2% dietilmetilamin) u CO2; protok: 70 mL/min na UV 260 nm) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (71 mg). ES/MS (m/e): 373 (M+l).

Primer 3

(4aR,7aR)-6-(5-Fluoro-4-izopropil-pirimidin-2-il)-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin, izomer 1

[0167]

[0168]Racemski 6-(5-fluoro-4-izopropil-pirimidin-2-il)-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin (127 mg, 0.340 mmol) je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (Kolona: Chiralcel OD-H (5 u), 21.2 x 250 mm; eluent: 50% etanol (0.2% dietilmetilamin) u CO2; protok: 70 mL/min na UV 260 nm). Prvi eluirajući izomer je jedinjenje iz naslova (54 mg). ES/MS (m/e): 374 (M+l).

Primer 4

(4aR,7aR)-6-(5-Fluoropirimidin-2-il)-7a-(2-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [ 1,3]tiazin-2-amin

[0169]

[0170]Racemski 6-(5-fiuoropirimidin-2-il)-7a-(2-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin (82 mg) je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (Kolona: Chiralpak IC (5 u), 30 x 250 mm; eluent: 55% izopropanol (0.4% dietilmetilamin) u CCh; protok: 70 mL/min na UV 240 nm). Prvi eluirajući izomer je jedinjenje iz naslova (37.7 mg). ES/MS (m/e): 331 (M+l).

Primer 5

(4aR,7aR)-7a-(5-Fluoro-2-piridil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin, izomer-2

[0171]

[0172]Racemski 7a-(5-fluoro-2-piridil)-6-(5-fluoropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [ 1,3]tiazin-2-amin (60 mg, 0.172 mmol) je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (Kolona: Chiralpak AD-H (5 u), 21.2x250 mm; eluent: 40% etanol (0.2% dietilmetilamin) u CO2; protok: 70 mL/min na UV 260 nm). Drugi eluirajući izomer je jedinjenje iz nslova (23.8 mg). ES/MS (m/e): 349 (M+l).

Primer 6

(4aR,7aS)-6-(5-Fluoropirimidin-2-il)-7a-(4-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin, izomer-2

[0173]

[0174]Racemski 6-(5-fluoropirimidin-2-il)-7a-(4-piridil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin (185 mg, 0.56 mmol) je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (Kolona: Chiralcel OJ-H (5 u), 21.2 x 250 mm; eluent: 25% etanol (0.2% dietilmetilamin) u CO2; protok: 70 mL/min na UV 260 nm). Drugi eluirajući izomer je jedinjenje iz naslova (40 mg). ES/MS (m/e): 331 (M+l).

Primer 7

(4aR,7aR)-6-(5-Fluoropirimidin-2-il)-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin, izomer 1

[0175]

[0176]Racemski 6-(5-fluoropirimidin-2-il)-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-2-amin (520 mg, 1.57 mmol) je razdvojen u njegove gradivne enantiomere pomoću hiralne SFC (Kolona: Chiralcel OD-H (5 u), 21.2 x 250 mm; eluent: 45% metanol (0.2% dietilmetilamin) u CO2; protok: 70 mL/min na UV 260 nm). Prvi eluirajući izomer je jedinjenje iz naslova (230 mg). ES/MS (m/e): 332 (M+l).

Primer 8

2-[2-[(4aR,7aR)-2-Amino-7a-pirazin-2-il-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol hidrohlorid

[0177]

[0178]2-[2-[(4aRJaR)-2-amino-7a-piraz^ il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol (120 mg, 0.308 mmol) je rastvoren u 0.1 M HC1 (3.1 mL) i acetonitrilu (1 mL). Dobijeni rastvor je sušen zamrzavanjem da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/e): 390 (M+l).

[0179]Sledeća jedinjenja su pripremljena uglavnom pomoću postupka iz Primera 8.

Postupciin vitroanalize:

[01801 Zain vitroenzimatske i ćelijske analize, test jedinjenja su pripremljena u DMSO tako da formiraju 10 mM stok rastvor. Stok rastvor je serijski razblažen u DMSO da bi se dobila kriva razblaženja sa deset tačaka sa finalnim koncentracijama jedinjenja u opsegu od 10 mM do 1 nM u 96-komornoj ploči sa okruglim dnom pre izvođenjain vitroenzimatskih analiza i analiza sa celim ćelijama.

Priprema rekombinantnog humanog BACE1

[01811Humani BACE1 (pristupni broj: AF190725) je kloniran iz ukupne cDNK mozga pomoću PCR-a na sobnoj temperaturi. Nukleotidne sekvence koje odgovaraju aminokiselinskim sekvencama #1 do 460 su inserirane u cDNK koja kodira humani IgGi (Fc) polipeptid (Vassar et al. 1999). Ovaj fuzioni protein BACEl(l-460) i humani Fc, pod nazivom /*«BACEl:Fc, je konstruisan u pJB02 vektor. Humani BACEl(l-460):Fc (/?wBACEl:Fc) je prolazno eksprimiran u HEK293 ćelijama. 250 ug cDNK svakog konstrukta je mešano sa Fugene 6 i dodato u 1 litar HEK293 ćelija. Četiri dana posle transfekcije, kondicionirane podloge su sakupljene za prečišćavanje./zwBACEl:Fc jeprečišćen pomoću hromatografije sa proteinom A. Enzim je čuvan na -80°C u malim alikvotama.

In vitroanalize inhibicije proteaze:

BACE1 FRET analiza

[0182]Serijska razblaženja test jedinjenja su pripremljena kao što je opisano u prethodnom tekstu. Jedinjenja su dalje razblažena 20 x u KH2PO4puferu. Deset uE svakog razblaženja je dodato u svaku komoricu u redu A do H odgovarajuće crne ploče sa niskim vezivanjem proteina koja sadrži reakcionu smešu (25 uE 50 mM KH2PO4, pH 4.6,1 mM TRITON® X-100,1 mg/mL goveđi serum albumin, i 15 uM FRET supstrata)( videtiYang,et. al,J. Neurochemistrv, 91(6) 1249-59 (2004)). Sadržaj je dobro mešan na mućkalici za ploču 10 minuta. Petnaest uE dve stotine pM humanog BACEl(l-460):Fc( videti Vasser,et al, Science, 286, 735-741 (1999)) u KH2PO4puferu je dodato u ploču koja sadrži supstrat i test jedinjenja za započinjanje reakcije. RFU smeše u vremenu 0 je zabeležena na talasnoj dužini ekscitacije 355 nm i talasnoj dužini emisije 460 nm, posle kratkog mešanja na mućkalici za ploču. Reakciona ploča je prekirvena aluminijumskom folijom i održavana u tamnoj humidifikovanoj peći na sobnoj temperaturi u trajanju od 16 do 24 časa. RFU na kraju inkubacije je zabeležena sa istom ekscitacijom i emisijom korišćenom na vremenu 0. Razlika RFU u vremenu 0 i kraj inkubacije je reprezentativan za aktivnost BACE1 pod tretmanom jedinjenjem. Razlike RFU su postavljene na grafikon naspram koncentracije inhibitora i kriva je fitovana sa četvoro-parametarskom logističkom jednačinom da bi se dobile vrednosti IC50.{ videtiSinha, et al., Nature, 402, 537-540 (2000)).

[0183]Jedinjenja iz Primera 1-17 ovde su testirana uglavnom kao što je opisano u prethodnom tekstu i izraženo kao vrednost IC50za BACE1 koja je manja od oko 1 uM. Sledeća ilustrovana jedinjenja su testirana uglavnom kao što je opisano u prethodnom tekstu i ispoljila su sledeću aktivnost za BACE1:

[0184]Ovi reprezentativni podaci pokazuju da jedinjenja iz Tabele 21 potencijalno inhibiraju aktivnost prečišćenog rekombinantnog BACE1in vitro.

Analize cele ćelije za merenje inhibicije aktivnosti beta- sekretaze HEK293Swe Analiza celih

ćelija

[0185]Rutinska analiza celih ćelija za merenje inhibicije aktivnosti beta-sekretaze koristi humanu embrionalnu ćelijsku liniju bubrega HEK293p (ATCC pristupni br. CRL-1573) koja stabilno eksprimira humanu APP751 cDNK koja sadrži prirodnu dvostruku mutaciju Lys651Met652 u Asn651Leu652, uobičajeno označena kao švedska mutacija (naznačena HEK293/APP751sw) i za koju je pokazano da prekomerno proizvodi Abeta (Citron, et al., Nature, 360, 672-674 (1992)).In vitroanalize redukcije opisane su u literaturi( videtiDovey, et al, Journal of Neurochemistry, 76, 173-181 (2001); Seubert, et al., Nature, 361, 260 (1993); i Johnson-Wood, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1550-1555 (1997)).

[0186]Ćelije (HEK293/APP751sw u 3.5xl0<4>ćelija/komorici, koje sadrže 200 uE ćelijske podloge, DMEM koji sadrži 10% FBS) inkubirane su na 37°C u trajanju od 4 do 24 časa u prisustvu/odsustvu inhibitora (razblažen u DMSO) u željenoj koncentraciji. Na kraju inkubacije, kondicionirane podloge su analizirane za dokaz aktivnosti beta-sekretaze, na primer, pomoću analize Abeta peptida. Ukupni Abeta peptidi (Abeta l-x) su mereni pomoću sendvič ELISA, upotrebom monoklonskog 266 kao "capture" antitela i biotinilovanog 3D6 kao "reporting" antitela. Alternativno, Abeta 1-40 i Abeta 1-42 peptidi su mereni pomoću sendvič ELISA, upotrebom monoklonskog 2G3 kao "capture" antitela za Abeta 1-40, i monoklonskog 21F12 kao "capture" antitela za Abeta 1-42. Oba Abeta 1-40 i Abeta 1-42 ELISA-e koriste biotinilovani 3D6 kao "reporting" antitelo. Koncentracija Abeta oslobođenog u kondicioniranim podlogama posle tretmana jedinjenjem odgovara aktivnosti BACE1 pod takvim uslovima. Kriva inhibicije sa 10 tačaka je prikazana na grafikonu i fitovana sa četvoro-parametarskom logističkom jedinačnom da bi se dobile vrednosti IC50za efekat snižavanja Abeta. Sledeća ilustrovana jedinjenja su testirana uglavnom kao što je opisano u prethodnom tekstu i ispoljila su sledeću aktivnost za efekat snižavanja Abeta:

[01871Ovi podaci pokazuju da jedinjenje iz Tabele 22 inhibira naivni endogeni humani BACE1 u ćelijamain vitro.

PDAPP primarna neuronska analiza

[0188]Potvrdna analiza sa celim ćelijama je takođe izvedena u primarnim neuronskim kulturama generisanim iz PDAPP transgenih embrionalnih miševa. Primarni kortikalni neuroni su pripremljeni od embrionalnih dan 16 PDAPP embriona i kultivisani u 96-komornim pločama (15 x IO<4>ćelija/komorici u DMEM/F 12 (1:1) plus 10% FBS). Posle 2 danain vitro,podloga za kulturu je zamenjena sa DMEM/F12 (1:1) bez seruma koja sadrži B27 suplement i 2 uM (krajnja) Ara-C (Sigma, Cl768). Na dan 5 in vitro, neuroni su inkubirani na 37°C u trajanju od 24 časa u prisustvu/odsustvu inhibitora (razblažen u DMSO) u željenoj koncentraciji. Na kraju inkubacije, kondicionirane podloge su analizirane za dokaz aktivnosti beta-sekretaze, na primer, pomoću analize Abeta peptida. Ukupni Abeta peptidi (Abeta l-x) su mereni pomoću sendvič ELISA, upotrebom monoklonskog 266 kao "capture" antitela i biotinilovanog 3D6 kao "reporting" antitela. Alternativno, Abeta 1-40 i Abeta 1-42 peptidi su mereni pomoću sendvič ELISA, upotrebom monoklonskog 2G3 kao "capture" antitela za Abeta 1-40, i monoklonskog 21F12 kao "capture" antitela za Abeta 1-42. Obe Abeta 1-40 i Abeta 1-42 ELISA-e koriste biotinilovani 3D6 kao "reporting" antitelo. Koncentracija Abeta oslobođenog u kondicioniranim podlogama posle tretmana jedinjenjem odgovara aktivnosti BACE1 pod takvim uslovima. Kriva inhibicije sa 10 tačaka je prikazana na grafikonu i fitovana sa četvoro-parametarskom logističkom jednačinom da bi se dobile vrednosti IC50za efekat snižavanja Abeta. Sledeća ilustrovana jedinjenja su testirana uglavnom kao što je opisano u prethodnom tekstu i pokazala su sledeću aktivnost za efekat snižavanja Abeta:

Tabela 23

[0189]Ovi podaci pokazuju da jedinjeja iz Tabele 23 inhibiraju naivni, endogeni mišji BACE1 u ćelijamain vitro.

In vivoinhibicija Beta- sekretaze

[0190]Nekoliko životinjskih modelia, uključujući miša, pacova, zamorče, psa i majmuna, može biti korišćeno za ispitivanje inhibicije aktivnosti&eta-sekretaze in vivoposle tretmana jedinjenjem. Životinje korišćene u ovom pronalasku bili su transgeni PDAPP miševi kao što su opisani u Games et al., Nature 373, 523-527 (1995), koji su bili korisni za analizuin vivoinhibicije proizvodnje Abeta u prisustvu inhibitornih jedinjenja. Dva meseca stari PDAPP miševi su primali jedinjenje formulisano u N-metilpirolidonu (Pharmasolve®) u vodi. Tri časa posle primene jedinjenja, životinje su žrtvovane, i mozgovi su uklonjeni za analizu fragmenata Abeta.( videtiDovey, et al, Journal of Neurochemistrv, 76, 173-181 (2001); i Johnson-Wood, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1550-1555 (1997)).

[0191]Za standardnein vivofarmakološke studije, životinje su dozirane sa različitim koncentracijama jedinjenja i upoređivane sa kontrolnom grupom tretiranom nosačem koja je dozirana istovremeno. Na kraju test perioda, životinje su žrtvovane i moždana tkiva su analizirana za prisustvu Abeta peptida pomoću specifičnih sendvič ELISA analiza. "Abeta l-x peptid" kao što je ovde korišćen označava zbir Abeta vrsta koje počinju sa ostatkom 1 i završavaju se sa C-terminusom koji je na višem mestu od ostatka 28. Ovim se detektuje većina Abeta vrsta i često je označena ko "ukupni Abeta".

[0192]Životinje (PDAPP ili drugi APP transgeni ili netransgeni miševi) koje su primale su inhibitorno jedinjenje mogu da pokažu smanjenje Abeta u moždanim tkivima u poređenju sa kontrolama tretiranim nosačem ili kontrolama u vremenu nula. Na primer, 3 časa posle primene 10 mg/kg ili 30 mg/kg oralne doze jedinjenja iz Primera 8 na mlade ženke PDAPP miševa, nivoi Abeta l-x peptida su značajno smanjeni približno 19% i 46%> respektivno u hipokampusu mozga, i približno 23% i 53% respektivno u moždanom korteksu, u poređenju sa miševima tretiranim nosačem. Značajno smanjenje i smanjenje koje odgovara na dozu ukupnog Abeta posle oralne primene jedinjenja iz Primera 8 je u skladu sa mehanizmom inhibicije BACE

(enzim freta-sekretaza)in vivo.Ove studije pokazaju da jedinjenja prema predmetnom pronalasku inhibiraju BACE i prema tome su korisna u smanjenju nivoa Abeta. Kao takva, jedinjenja prema predmetnom pronalasku su efikasni inhibitori BACE.

Claims (11)

1. gde A je izabran iz grupe koja se sastoji od; R3je H, -CH3, ili -OCH3; i R4jeHili F; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje ili so prema patentnom zahtevu 1 naznačeno time što A je izabran iz grupe koja se sastoji od:
3. 3. Jedinjenje ili so prema patentnom zahtevu 1 ili 2 naznačeno time što A je izabran iz grupe koja se sastoji od:
4. 4. Jedinjenje ili so prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 naznačeno time što A je:
5. 5.Jedinjenje ili so prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 naznačeno time što R2 je
6. 6. Jedinjenje ili so prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 naznačeno time što R<1>je F.
7. 7. Jedinjenje ili so prema patentnom zahtevu 1 koje je 2-[2-[(4aR,7aR)-2-amino-7a-pirazin-2-il-4,4a,5J-te1xahidropirolo[3,4-d][l,3]tiazin-6-il]-5-fluoro-pirimidin-4-il]propan-2-ol.
8. 8. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 za upotrebu u lečenju.
9. 9. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 za upotrebu u lečenju Alchajmerove bolesti.
10. 10. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata.
11. 11. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10, koja dalje sadrži jedno ili više drugih terapeutskih sredstava.