RS55670B1 - Peptidi, konjugati i metod za povećanje imunogenosti vakcine - Google Patents

Description

Oblastpronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na oblast vakcina, kao što su vakcine protiv karcinoma ili neke zarazne bolesti. Konkretno, predmetni pronalazak definiše imunogen koji sadrži peptid izveden iz tetanus toksina za indukciju snažnih humoralnih i celularnih imunoloških odgovora kada se primeni subjektima koji poseduju antitela protiv tetanus toksina.

Stanje tehnike

Skoro sve nove vakcine su manje efikasne nego što je potrebno, posebno kada je infekcija već uspostavljena. Najbolje vakcine se temelje na empirijskim zapažanjima. To su npr. ubijeni ili oslabljeni mikroorganizami. Generalno, takve vakcine obuhvataju sve komponente potrebne za indukciju efikasnih i zaštitnih imunoloških odgovora. Međutim, ove vakcine su obično slabo definisane. Osim toga, one sadrže mnoge nepoznate komponente, mehanizam delovanja je najčešće uglavnom nepoznat, one ne mogu da se proizvedu reproduktivno i zbog toga ne ispunjavaju kriterijume za savremene lekove. One se primenjuju samo zato što ništa bolje nije dostupno u ovom trenutku. U slučaju vakcina protiv karcinoma stvari su još komplikovanije, jer je korišćenje prirodnih materijala, tj. ćelija karcinoma, neprihvatljivo.

Da bi vakcine mogle da izazovu zaštitni imunološki odgovor protiv patogenih mikroba, zahteva se dovoljna efikasnost vezanja vakcine za antigen prezentujuće ćelije (APC), kao što su dendritske ćelije i makrofagi. APC treba da internalizuju antigene i da ih prebace u regionalne drenažne limfne čvorove, gde oni obrađuju i prezentuju antigene peptide klasa I i klasa TT MHC molekula za aktivaciju CD8+, odnosno CD4+ T ćelija (Zinkernagel et al.

(1999) Immunol Rev 156: 199-209; Banchereau i Steinman (1998) Nature 392:245-252).

Međutim, zbog slabe akumulacije (uptake) APC ćelija, neke vakcine imaju ograničenu imunogenost, iako se sastoje od proteina koji deluju antigenski kod ljudi. Slabo vezanje je verovatno zbog toga što mnogim vakcinirajućim proteinima u rastvoru, kao i izvesnim vakcinama, nedostaju markeri koji ih identifikuju za internalizaciju i obradu pomoću APC i stoga je akumulacija takve vakcine upravljana samo slučajnom endocitozom u APC ćelijama, dakle minimalna (Abdel-Motal et al. (2009) Vaccine 27:3072-3082).

Imunogenost mikrobnih vakcina, kao što je tetanus toksoid, pokazano je da se može poboljšati kada se vakcine primenjuju kao imunosni kompleks s njihovim odgovarajućim IgG antitelom (Raveth i Clines (1998) Annu Rev Immunol 16:421-432; Schuurhuis et al. (2002) J Immunol 168:2240-2246; Gosselin et al. (1992) J. Immunol 149: 3477-3481). Međutim, nedostatak je u tome što imunosni kompleks mora da bude formiran sa antitelom koje ima Fc domen koji se efikasno vezuje za Fc-gama receptor na APC, pri čemu Fc domen mnogih monoklonalnih antitela ima slabu interakciju sa Fc-gama receptorom na APC. Dalji nedostatak je u tome što se složeni imunodominantni peptidni epitopi mogu maskirati, pa time rezultirati lošom imunogenošću.

Druga strategija za poboljšanje imunogenosti vakcina je predstavljena u patentu VO 2008/118487, gde je opisan virus influence koji nosi a-gal epitope (Galal-3Gaipi-4 (3) GlcNAc-R), što je rezultiralo poboljšanim ciljanjem viriona na APC te određenim povišenim humoralnim i celularnim imunološkim odgovorom na influencu. Međutim, sintetizovanje a-gal epitopa je teže u odnosu na sintezu standardnih peptida i kao posledica toga - mnogo skuplje.

Volk et al. (1984, Infect Immun 45:604-609) opisuju fragment tetanus toksina koji sadrži N-terminalnu polovinu teškog lanca toksina što uključuje sekvencu GITELKKL koja obuhvata rezidue 383 do 390 iz teškog lanca toksina kao što je opisano u SEKV ID NO:3, te njihova antitela.

Raju et al. (1996, J. Autoimmun 9:79-88) opisuju preklapajuće sintetičke peptide, svaki dužine 20 rezidua, koji su korišćeni za određivanje epitopnog repertoara humanih CD4+ T ćelija. Jedan od peptida kojega su prepoznale navedene ćelije obuhvata rezidue 371-390 teškog lanca tetanusa toksina, što u potpunosti obuhvata sekvencu GITELKKL.

Demotz et al. (1989, J. Immunol 142:394-402) opisuju monoklonalna antitela koja vezuju B fragment tetanus toksina i rekombinantne fragmente 744-1315 i 604-1315 uključujući sekvencu GITELKKL.

Engstrom et al. (J. Immunoassays 16:231-245) opisuju "peptid 20", koji sadrži sekvencu GITEL, koja je prepoznata od strane humanih IgG i IgA antitela.

Patent WO 2004/000873 opisuje određeni konjugat koji sadrži tetanus epitop izveden iz tetanus teškog lanca sekvence 830-843 uključujući sekvencu GITE.

Fischer et al. (1994, Mol. Immunol. 31:1141-1148) opisuju epitopsko mapiranje antitela koja su porasla kod miševa i zečeva kao odgovor na tetanus toksoid i da heksapeptidi iz regiona koji obuhvata rezidue 350-400 teškog lanca tetanus toksoida pokazuju visoku reaktivnost u odnosu prema antitelima.

Međutim, nijedna od prethodnih tehnika ne definiše ili sugeriše peptide koji sadrže linearni epitop iz tetanus toksina, a cirkulirajuća antitela protiv njih su često prisutna u ljudskoj populaciji. Stanje prethodne tehnike ne definiše ili sugeriše upotrebu ovih peptida za konjugaciju nekoga antigena protiv kojega je poželjan imunološki odgovor, u cilju povećanja efikasnosti kojom ovaj željeni imunološki odgovor može biti indukovan.

Stoga, još uvek postoji potreba u tehnici za metode i sredstva da se poveća imunogenost vakcina.

Rezime pronalaska

Prva realizacija ovog pronalaska se odnosi na konjugat, koji sadrži neki peptid konjugovan za neki antigen, imunogen ili neki nosač koji sadrži neki antigen ili imunogen, pri čemu se peptid sastoji od aminokiselinske sekvence bilo koje od SEKV ID NO: 8, 9 , 12, 13, 16, 17, 19-24, 151-158, 163-166, 168, 172-176, 179-182 i 185-197, 198-208 i 210-216, pri čemu su antigen, imunogen ili nosač koji sadrži antigen ili imunogen konjugovani za C-terminal peptida.

Druga realizacija se odnosi na konjugat u skladu sa prvom realizacijom, pri čemu se peptid sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je definisano u bilo kojoj od SEKV ID NO: 12, 13, 16, 17 i 19-24.

Treća realizacija se odnosi na konjugat u skladu sa prethodnim realizacijama, pri čemu je od 2 do 20 peptida vezano za antigen, imunogen ili nosač koji sadrži antigen ili imunogen.

Četvrta realizacija se odnosi na konjugat u skladu sa prethodnim realizacijama, za primenu kao neki lek. Poželjno, konjugat je za upotrebu kao lek u subjekta koji poseduje antitela protiv tetanus toksina ili tetanus toksoida. Poželjnije, lek je neka profilaktička ili terapeutska vakcina.

Peta realizacija se odnosi na konjugat prema bilo kojoj od prve do četvrte realizacije, za upotrebu u prevenciji ili tretiranju karcinoma ili neke zarazne bolesti kod subjekta.

Šesta realizacija se odnosi na primenu konjugata prema bilo kojoj od prve do četvrte realizacije, za proizvodnju leka za prevenciju ili tretiranje karcinoma ili zarazne bolesti kod subjekta. Poželjno, konjugat je namenjen za upotrebu kao lek kod subjekta koji poseduje antitela protiv tetanus toksina ili tetanus toksoida.

U sedmoj realizaciji, konjugat je namenjen za upotrebu kao lek kod subjekta kome se vakcina za generisanje cirkulirajućih antitela protiv tetanus toksina primenjuje najmanje 2 nedelje pre primene konjugata.

U osmoj realizaciji, konjugat ili njegova upotreba kao lek namenjeni su za antitelima upravljano antigen-ciljanje.

U devetoj realizaciji, konjugat ili njegova upotreba kao lek namenjeni su za lečenje karcinoma pri čemu tretman dalje obuhvata hirurški zahvat, hemoterapiju i/ili terapiju zračenjem.

U desetoj realizaciji, konjugat ili njegova upotreba kao lek namenjeni su za lečenje subjekta koji poseduje antitela protiv tetanus toksina ili je tetanus toksoid imunizovan sa tetanus toksoidom, koji je imao post-ekspozicijsku profilaksu za tetanus i/ili je oboleo od tetanusa.

U jedanaestoj realizaciji, u konjugatu prema ovom pronalasku, antigen ili imunogen sadrži epitop T ćelija. Poželjnije, antigen ili imunogen sadrži epitop citotoksične T ćelije i/ili T pomoćne (helper) ćelije.

U dvanaestoj realizaciji, u konjugatima prema ovom pronalasku, peptid i antigen, imunogen ili nosač koji sadrži neki antigen ili imunogen su konjugovani preko nekog linkera. Poželjno, linker je aminoheksanska kiselina - biotinilovani lizin. U još jednoj realizaciji, u konjugatima prema ovom pronalasku, peptid i antigen, imunogen ili nosač koji sadrži neki antigen ili imunogen su konjugovani bez linkera. U poželjnoj realizaciji, u konjugatima prema ovom pronalasku, peptid i antigen, imunogen ili nosač koji sadrži neki antigen ili imunogen su konjugovani preko neke kovalentne veze.

U trinaestoj realizaciji, pronalazak se odnosi na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEKV ID NO: 8, 9, 12, 13, 16, 17, 19-24,151-158, 163-166, 168, 172-176, 179-182 i 185-197, 198-208 i 210-216.

U četrnaestoj realizaciji, pronalazak se odnosi na peptid trinaeste realizacije koji se sastoji od: aminokiselinska sekvenca kao što je definisano u bilo kojem od SEKV ID NO: 12, 13, 16, 17 i 19-24.

U petnaestoj realizaciji, pronalazak se odnosi na peptid prema petnaestoj realizaciji, pri čemu se peptid sastoji od: aminokiselinska sekvenca kako je definisano u SEKV ID NO: 24.

Opis pronalaska

Definicije

Termin "imunološki (imunosni) odgovor" kako se ovde koristi odnosi se na proizvodnju antitela i/ili ćelija (kao što su T limfociti) koje su usmerene protiv, ili pomažu pri raspadanju ili inhibiciji nekog konkretnog antigenog epitopa ili konkretnih antigenih epitopa. Fraza "efikasni imunoprotektivni odgovor", "imunološka zaštita" i slični izrazi, za potrebe ovog pronalaska, označavaju imunološki odgovor koji je usmeren protiv jednog ili više antigenih epitopa patogena ili protiv jednog ili više antigenih epitopa ćelije karcinoma kako bi se izvršila zaštita od infekcije patogenima ili protiv karcinoma u vakcinisanog subjekta. Za svrhe ovog pronalaska, zaštita od infekcije nekim patogenim ili zaštita protiv karcinoma ne uključuje samo apsolutnu prevenciju infekcije ili karcinoma, nego i svako detektirajuće smanjenje stepena ili stope infekcije nekim patogenim ili karcinoma, ili bilo koje detektirajuće smanjenje ozbiljnosti bolesti ili bilo kojeg simptoma ili stanja koji rezultiraju usled infekcije patogenima ili karcinoma u vakcinisanog subjekta, na primer u poređenju sa nevakcinisanim inficiranim subjektom. Efikasna imunoprotektivna reakcija u slučaju karcinoma uključuje uklanjanje ćelija karcinoma, čime se smanjuje obim karcinoma ili čak njegovo iskorenjivanje. Vakcinacija koja se primenjuje da bi se to postiglo se naziva terapeutska vakcinacija.

Efikasni imunoprotektivni odgovor može biti indukovan kod subjekata koji nisu bili prethodno inficirani patogenim i/ili nisu trenutačno inficirani patogenim ili još ne boluju od karcinoma u vreme vakcinacije. Efikasni imunoprotektivni odgovor može takođe biti indukovan kod subjekta koji je već inficiran patogenima ili već boluje od karcinoma u vreme vakcinacije.

Prema ovom pronalasku, generalna upotreba termina "antigen" ovde se odnosi na bilo koji molekul koji se specifično veže za antitelo. Termin se takođe odnosi na bilo koji molekul ili molekularni fragment koji može da se vezuje za neki MHC molekul i bude prezentovan.

Termin "antigen" ovde može da se koristi naizmenično sa terminom "imunogen", te se ovde koristi da se opiše protein, peptid, celularni sastav, organizam ili druga molekula koji izaziva humoralni i/ili celularni imunološki odgovor (tj. daje antigenski), tako da davanje imunogena subjektu (npr. preko vakcine iz ovog pronalaska) pokreće neki imunogen-specifičan imunološki odgovor protiv istih ili sličnih imunogenih/antigena koji mogu da se nađu u tkivima subjekta. Stoga, vakcinisanje subjekta protiv konkretnog antigena označuje, u jednoj realizaciji, daje izazvan imunološki odgovor u odnosu na antigen ili njegov imunološki deo, kao posledica primene antigena. Vakcinacija poželjno rezultira protektivnim ili terapeutskim efektom, pri čemu kasnije izlaganje antigenu (ili izvoru antigena) izaziva imunološki odgovor protiv antigena (ili izvora) čime se smanjuje ili sprečava bolest ili stanje kod subjekta. Koncept vakcinacije je dobro poznat u tehnici. Imunološki odgovor koji je izazvan davanjem profilaktičke ili terapeutske kompozicije iz ovog pronalaska može biti bilo koja detektirajuća promena u bilo kojem aspektu imunološkog statusa (npr. celularni odgovor, humoralni odgovor, proizvodnja citokina), u poređenju sa promenom u odsustvu primene vakcine.

Termin "epitop" je ovde definisan kao jedinstvena imunogena lokacija unutar datog antigena/imunogena koja je dovoljna da izazove imunološki odgovor kod subjekta. Stručnjaci u ovoj oblasti tehnike će znati da su epitopi T ćelija različiti po veličini i sastavu od epitopa B ćelija i da se epitopi T ćelija predstavljeni kroz put MHC klasa I razlikuju od epitopa predstavljenih kroz put MHC klasa II. Epitopi mogu biti linearni sekvencijski ili konformacioni epitopi (sačuvani vezujući regioni) u zavisnosti od tipa imunološkog odgovora. Antigen može biti malen kao jedan epitop ili veći, te može da obuhvati više epitopa. Kao takva, veličina antigena može biti malena, veličine oko 5-12 aminokiselina (na primer, peptid) i velika: kao protein pune dužine, uključujući multimerne i fuzione proteine, himerne proteine, cele ćelije, čitave mikroorganizme ili njihove delove (npr. lizati celih ćelija ili ekstrakti mikroorganizama).

Kako se ovde koristi, termin "antitelo" označava molekul imunoglobulina ili fragment imunoglobulinskog molekula koji ima sposobnost da se specifično veže za određeni antigen. Antitela su dobro poznata stručnjacima u imunološkoj nauci.

Termin "imunogenost" vakcine se ovde definiše kao sposobnost da se indukuju i aktiviraju T-ćelije (i citotoksične T ćelije i T pomoćne (helper) ćelije) i izazove proizvodnja antitela kod subjekta.

Termin "antitelom upravljano antigen-ciljanje" se ovde koristi da se označi neki sistem unošenja antigena koji koristi antitelom (kao što je npr IgG) posredovano antigen ciljanje preko Fc receptora koji su eksprimirani na površini ćelije u APC, kao što su na primer DC i makrofagi. Koristeći antigen-specifična antitela, kompleksi ovih antitela sa antigen proteinom mogu se formiratiin vitro,ali iin vivo.Ovi kompleksi (tzv. imunosni kompleksi (IC)) mogu biti vezani za APC preko ovih Fc receptora, nakon toga preuzeti, pa će antigen onda biti obrađen i peptid izveden iz njega biće prezentiran za specifične T ćelije. Važno je da u antitelom upravljanom antigen ciljanju IC će aktivirati APC i to dovodi do optimalne stimulacije specifičnih T ćelija (Schuurhuis et al., J. Immunol. 168, 2240-2246, 2002). Na taj način, u antitelima upravljanom antigen ciljanju, koriste se specifična antitela koja cirkulišu u čoveku za selektivno ciljanje antigena da se stimuliše celularni imunološki sistem.

Termin "peptid" kako se ovde koristi definiše neki lanac aminokiselinskih rezidua, obično s nekom definisanom sekvencom. Kako se ovde koristi, termin peptid je sinonim sa terminima "polipeptid" i "protein". U kontekstu ovog pronalaska, termin "peptid" se definiše kao bilo koji peptid ili protein koji sadrži najmanje dve aminokiseline koje su povezane modifikovanom ili nemodifikovanom peptidnom vezom. Termin "peptid" se odnosi na molekule kratkog lanca poput oligopeptida ili oligomera ili molekule dugog lanca kao što su proteini. Peptid prema prikazanom pronalasku može sadržavati modifikovane aminokiseline. Stoga, peptid iz ovog pronalaska se takođe može modifikovati prirodnim procesima kao što su post-transkripcijske modifikacije ili hemijskim postupkom. Neki primeri ovih modifikacija su: acetilacija, acilovanje, ADP-ribozilacija, amidacija, kovalentno vezivanje sa flavinom, kovalentno vezivanje sa hemom, kovalentno vezivanje sa nukleotidom ili derivatom nukleotida, kovalentno vezivanje sa modifikovanom ili nemodifikovanom ugljenhidratnom grupe, vezivanje sa lipidom ili derivatom lipida, kovalentno vezivanje sa fosfotidilinositolom, unakrsno vezivanje, ciklizacija, formiranje disulfidne veze, demetilacija, formiranje cistein molekule, piroglutamat formiranje, formilacija, gama-karboksilacija, hidroksilacija, jodinacija, metilacija, oksidacija, fosforilacija, racemizacija, hidroksilacija itd. Stoga, svaka modifikacija peptida koji nema za posledicu efekat eliminisanja imunogenosti peptida, unutar je obima predstavljenog pronalaska.

Termin "identičnost sekvence" ovde je definisan kao odnos između dve ili više aminokiselinskih (peptidi ili proteini) sekvenci ili dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina (polinukleotid), što se određuje poređenjem sekvenci. Obično, sekvencijske identičnosti ili sličnosti se porede preko cele dužine poređenih sekvenci. U tehnici, "identičnost" takođe označava stepen sekvencijske srodnosti između sekvenci aminokiselina ili sekvenci nukleinskih kiselina, kao što može da bude slučaj, što se određuje sparivanjem između stringova takvih sekvenci. "Sličnost" između dve aminokiselinske sekvence se određuje poređenjem aminokiselinske sekvence i njenih sačuvanih aminokiselinskih zamena na jednom peptidu sa sekvencom na nekom drugom peptidu. "Identičnost" i "sličnost" mogu lako da se izračunaju raznim postupcima, koji su poznati stručnjaku u ovoj tehnici. U poželjnoj realizaciji, identičnost sekvenci je određena poređenjem sekvenci ćelom dužinom, kako je ovde definisano. Poželjne metode za određivanje identičnosti su dizajnirane tako da daju podatke o najvećem podudaranju između ispitivanih sekvenci. Metode za određivanje identiteta i sličnosti su kodirane u javno dostupnim kompjuterskim programima. Poželjne kompjuterske programske metode za utvrđivanje identiteta i sličnosti između dve sekvence obuhvataju npr BestFit, BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul, SF et al, J. Mol Biol 215:403-410 (1990), javno dostupni iz NCBI i drugih izvora (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Najpoželjniji algoritam koji se koristi je EMBOSS (http://vvv.ebi.ac.uk/emboss/align). Poželjni parametri za poređenje aminokiselinskih sekvenci koristeći EMBOSS je matricagap open 10. 0., gap extend 0. 5, BLOSUM 62.Poželjni parametri za poređenje sekvenci nukleinskih kiselina korištenjem EMBOSSsu gap open 10. 0, gap extend 0. 5, DNA full matrix(DNK jedinična matrica). Proizvoljno, u određivanju stepena sličnosti aminokiselina, stručnjak u ovoj oblasti može takođe uzeti u obzir tzv. "konzervativne" supstitucije aminokiselina, što će biti jasno stručnjaku u ovoj oblasti. Konzervativne supstitucije aminokiselina odnose se na zamenjivost rezidua koje imaju slične bočne lance. Na primer, grupa aminokiselina koja ima alifatske bočne lance je: alanin, valin, leucin i izoleucin; grupa aminokiselina koja ima alifatsko-hidroksilne bočne lance je: serin i treonin; grupa aminokiselina koja ima amidne bočne lance je: asparagin i glutamin; grupa aminokiselina koje imaju kisele bočne lance je: asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; grupa aminokiselina koja ima aromatične bočne lance je: fenilalanin, tirozin i triptofan; grupa aminokiselina koja ima bazne bočne lance je: lizin, arginin i histidin; te grupa aminokiselina koja ima bočne lance koji sadrže sumpor je: cistein i metionin. Poželjne aminokiselinske supstitucije su supstitucije aminokiseline sa aminokiselinom iz iste konzervativne grupe aminokiselina. Ove konzervativne aminokiselinske grupe su: alanin-valin-leucin-izoleucin-metionin; fenilalanin-tirozin-triptofana; lizin-arginin-histidin; asparagin-glutamin; asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; serin-treonin; glicin-prolin. U ovom konkretnom slučaju, druga konzervativna aminokiselinska supstitucijska grupa je: lizin-formillizin.

Termini "tumor" ili "karcinom" za neki subjekt odnose se na prisustvo ćelija koje poseduju karakteristike kao što su atipični rast ili morfologija, uključujući nekontrolisanu proliferaciju, besmrtnost, metastatski potencijal, ubrzani rast i brzinu proliferacije, te određene karakteristične morfološke osobine. Cesto, ćelije karcinoma će biti u obliku tumora, ali takve ćelije mogu takođe da psotoje u međusobnoj izolaciji jedna od druge unutar subjekta. "Tumor" uključuje benigne i maligne neoplazme.

U kontekstu ovog pronalaska, "pacijent" ili "subjekt" može biti životinja (uključujući ljude). Poželjno, pacijent ili subjekt je ljudsko biće.

Termin "Tettox elisa" se ovde koristi da označi specifičnu elisa-u za tetanus toksoid antitela, što je ovde dodatno definisano na drugom mestu.

Detaljan opis pronalaska

Ovi pronalazači su ranije pokazali da su preformirani imunosni kompleksi (IC) vrlo snažne formulacije vakcine za efikasni prajming odgovora T ćelija kod miševa (Schuurhuis et al., J. Immunol. 168, 2240-2246, 2002). Kompleksiranjem protein antigen ovalbumina (OVA) sa antitelima protiv OVA, pronalazači su mogli da efikasno naciljaju antigen prema dendritskoj ćeliji (DC), što istovremeno dovodi do jakog DC sazrevanja. Ovi sazreli DC unakrsno prezentovani OVA-izvedeni peptidi prema CD8 T ćelijamain vitrosu visoko efikasni u prajmingu CD8+ T ćelija nakon imunizacije kod miševa. Ono što je bitno, ovi odgovori T ćelija su u stanju da kontrolišu tumorin vivo,a naročito su efikasni kada su IC prethodno naneseni na DC (Schuurhuis et al., J Immunol 176, 4573-4580, 2006). Imunizacija sa DC koji je napunjen s preformiranim IC rezultira protektivnim tumorskim imunitetom ali također i terapeutskim tretmanom miševa koji nose tumor. Kontrola tumorain vivobila je zavisna od prisustva aktivirajućih Fc receptora na DC te indukciji specifičnih CD8+ citotoksičnih T ćelija. Ovi nalazi pokazuju da specifično antitelo-posredovano antigen ciljanje DC je visoko efikasan način indukcije imuniteta T ćelija protiv raka.

Pronalazači predmetnog pronalaska su sada neočekivano pronašli da preegzistirajuća, cirkulirajuća antitela mogu da se koriste da se efikasno pokrene specifična proliferacija T ćelija kod miševa. Antitela protiv hapten TNP (neka trinitrofenilna grupa vezana za peptid ili protein) su indukovana imunizacijom sa specifičnim hapten-nosačem (TNP-BSA). Posle toga, imunizovani miševi su izazvani sa nesrodnim proteinskim antigenom koji je vezan za isti hapten (TNP-OVA). Nađeno je daje odgovor T ćelija prema nesrodnom proteinskom antigenu OVA indukovan na mnogo višem nivou kod ovih miševa u poređenju sa kontrolnim miševima koji su vakcinisani sa BSA bez TNP. Ovi nalazi daju principjelni dokaz da se imunogenost vakcinacije može poboljšati koristeći cirkulirajuća antitela koja su već prisutna u momentu vakcinacije. Zbog interspecijskih razlika između miševa i čoveka drugačija grupa cirkulirajućih antitela mora biti naciljana pa prema tome, pronalazači definišu peptid koji može da se primeni čoveku za poboljšanje efikasnosti i imunogenosti vakcine.

Ovim pristupom se oponaša što je više moguće prirodni imunološki odgovor kojega koristi telesni imunološki sistem da se otarasi invazije mikroorganizama, posebno mikroorganizama koji napadaju i povezani su s ćelijama u organizmu, kao što su virusi te intracelularne bakterije, kao što je na primer bacil tuberkuloze. Pristup vakcinom prema ovom pronalasku optimalno koristi dve glavne poluge specifičnog imuniteta, dakle preegzistirajuća antitela u krvnoj plazmi, te ćelijski upravljani imunitet kojega obezbeđuju T-ćelije. Pronalazak koristi Fc fragment antitela da isporuči antigen vezan na drugom kraju antitela za antigen prezentujuće ćelije. Prethodni rad je pokazao daje ovo jedan od najefikasnijih načina da nacilja na imunosni antigen za antigen prezentirajuće ćelije (APC), tj ćelije koje iniciraju imunološke odgovore u organizmu, kao što su na primer dendritske ćelije (DC) ili makrofagi. Za ovaj pronalazak, DC su najvažniji APC. Bez želje da se vežemo za bilo koju teoriju, čini se da zbog antigena koji izazivanje potrebni ćelijski-posredovani imunitet one su fizički povezane sa definisanim aminokiselinama koje se vezuju za unapred postojeća antimikrobna antitela u plazmi, dešava se izvanredno fokusiranje antigena bez presedana efikasnosti na APC, na primer DC, putem vezivanja antitelo-vezanog kompleksa antitela za tzv. Fc receptore na APC (vidi sliku 1). Ovo omogućava ne samo veoma efikasno uvođenje ciljanih antigena (tj. virusa ili tumorski ciljanih antigena) u TPC, već takođe izaziva žestoku aktivaciju APC. Oba događaja su od suštinskog značaja za indukciju robusnih terapeutskih ćelijski-upravljanih imunoloških odgovora (odgovori T ćelija), što je potrebno za iskorenjivanje abnormalnih ćelija, kao što su ćelije tumora ili ćelije inficirane virusom. Zaista, u eksperimentima na miševima sa antitelo-vezanim jedinjenjima, konjugovanim za peptide koji izazivaju odgovore T-ćelija, ovaj pristup snažno povećava odgovore T-ćelija, u poređenju sa odgovorima viđeni protiv ne-konjugovanih komponenata.

Iz istorijskih razloga, modem farmakodinamičke i farmakodistribucijske nauke jedva daje primenjen u vakcinama. Uzimajući u obzir složenu prirodu tradicionalnih vakcina, to nije nikakvo iznenađenje, jer traganja za sudbinom u ljudskom telu svakog od proizvoda cepanja tradicionalnih vakcina, koje su uglavnom sastavljene od toplotom ubijenih ili oslabljenih organizama, predstavljao bi gotovo nemoguć zadatak . Takvi argumenti ne važe, međutim, za vakcine prema ovde predstavljenom pronalasku. Prvo, priroda vakcine koja više podseća na lek prema predmetnom pronalasku omogućava mnogo boljein vivoodređivanje sudbine vakcine. Drugo, ispitivanje farmakodinamike i farmakodistribucije za novu generaciju vakcina je čista potreba da bi mogle razviju svoj terapeutski potencijal na racionalan način. Izazov u dizajniranju i testiranju novih vakcina je kako da ih učinimo jačim i na taj način ih prevedemo iz čisto preventivnih vakcina, koja se u velikoj meri oslanjaju na neutralizaciju antitela, u terapeutske vakcine koje poseduju potencijal potreban da izazovu jaki odgovor T-ćelija i da se leče uspostavljene perzistentne infekcije i bolesti izazvane infekcijama, kao što je virusni karcinom, kao i da imaju kurativni uticaj na neinfekcijska stanja kao što je nevirusni karcinom.

Peptid

Peptid prema predmetnom pronalasku, poželjno je neki molekul protiv kojeg u subjektu gde je poželjan imunološki odgovor već cirkulišu antitela. Tetanus toksin (TTx), takođe poznat

kao tetanospazmin, spazmogeni toksin, TeTx, TeNT i TTX, jedan je od najvažnijih poznatih toksičnih proteina. TTx je neurotoksin kojega proizvode vegetativne sporeClostridium tetaniu anaerobnim uslovima i izaziva tetanus kod ljudi. On postoji kao teški lanac i laki lanac koji su povezani preko disulfidne veze između cisteina L438 en H10 i nekovalentnih interakcija. Tetanus toksoid (TTd) je priređen detoksifikacijom TTx tretiranjem proteina sa formalinom. Ova terapija dovodi različitim modifikacijama proteina (npr. formilacijom bočnih lanaca

rezidua lizina i formiranjem intermolekulskih i intramolekulskih unakrsnih veza). Mada je TTd modifikovana forma TTx (pa je prema tome drugačiji protein) TTd može da indukuje zaštitni imunitet protiv tetanusa što podrazumeva da antitela prikupljena TTd vakcinacijom prepoznaju TTx. Pronalazači su tražili linearne epitope TTd antitela koristeći nemodifikovane linearne peptide iz TTx aminokiselinske sekvence. Tetanus tokin ima 1314 aminokiseline (SEKV TD NO: 1) i sintetiše gaC. tetanikao jednostruki peptidni lanac koji se proteolizuje dajući dva fragmenta, laki lanac (LC; takođe poznat kao alfa lanac) koji je izveden iz amino terminala (SEKV ID NO: 2), te teški lanac (HC; takođe poznat kao beta lanac) koji je izveden iz karboksi terminala (SEKV ID NO: 3).

Tetanus toksoid (TTd) se koristi u imunizaciji, kao što je na primer dečja DTP kombinacija vakcina protiv tri zarazne bolesti (difterija, veliki kašalj (pertussis), tetanus) ili DTP-poliomijelitis vakcina. Skoro svi ljudi su vakcinisani sa tetanus toksoidom (TTd) rano u životu, jer je uključen u vakcini koja se koristi u dečjem programu vakcinacije u mnogim zemljama. Pored toga, mnogi ljudi su podraženi kasnije u životu sa TTd, jer je anti-tetanusa vakcinacija uobičajena procedura nakon povreda za koju se sumnja da je potencijalni uzrok tetanus infekcije. Kao posledica toga, anti-tetanus toksin/toksoid antitela su prisutna u značajnom delu ljudske populacije industrijskih zemalja. Stoga, ciljanje konjugata koji sadrže TTx/TTd epitop, odnosno peptid prema ovom pronalasku, na APC može se očekivati da bude efikasno u takvim vakciniama, kao rezultat in situ formiranja imunosnih kompleksa između anti-tetanus toksin/toksoid antitela i konjugata koji sadrže neki TTx/TTd epitop.

U prvom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na peptid koji sadrži: (i) najmanje 10 aminokiselinskih rezidua SEKV ID NO: 3 koji sadrže aminokiselinsku sekvencu GITELKKL; ili (ii) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70, 80, 90 ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao što je definisano pod (i), pri čemu je peptid, kada se izloži uzorcima seruma od najmanje 10 humanih subjekata koji su bili vakscinisani sa tetanus toksoidom je u najmanje 50% uzoraka seruma vezano za antitela iz uzoraka seruma, kao stoje određeno u Tettox elisa; te gde APC može da se očekuje da bude efikasan u takvim vakcinama, kao rezultatin situformiranja imunosnih kompleksa između anti-tetanus toksin/toksoid antitela i konjugata koji sadrže TTx/TTd epitop.

U prvom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na peptid kako je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva 9-11 koji su ovde definisani. Opisan je petid koji sadrži: (i) najmanje 10 aminokiselinskih rezidua SEKV ID NO: 3 koji sadrže aminokiselinsku sekvencu GITELKKL; ili (ii) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70, 80, 90 ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao je definisano pod (i) i pri čemu je peptid, kada se izloži uzorcima seruma od najmanje 10 humanih subjekata koji su vakcinisani sa tetanus toksoidom je u najmanje 50% uzoraka seruma vezano pomoću antitela za uzorke seruma, kao što je određeno u Tettox elisa; gde peptid nije beta lanac tetanus toksina. Poželjno, najmanje 10 aminokiselinskih rezidua SEKV ID NO: 3 u (i) su 10 uzastopnih aminokiselina iz SEKV ID NO: 3. Poželjno, aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje 70, 80, 90 ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao što je definisano pod (i) je aminokiselinska sekvenca od 10 aminokiselina od kojih najmanje 7, 8, 9 ili 10 aminokiselina identično s 10 uzastopnih aminokiselinskih rezidua SEKV ID NO: 3 koje sadrže aminokiselinsku sekvencu GITELKKL.

Poželjno, peptid prema (ii) gore, izložen je uzorcima seruma od najmanje 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100,150, 250 ili više humanih subjekata. Poželjnije, uzorci seruma su iz humanih subjekata koji imaju visok titar anti-TTd antitela, npr, najmanje 100 internacionalnih jedinica (TU) po ml kako je utvrđeno pomoću Tettox elisa kao što je opisano u daljem tekstu. U jednoj poželjnoj realizaciji, humani subjekti su nasumično odabrani humani subjekti, poželjno je da su slučajno izabrani humani subjekkti oni koji imaju visoki titar anti-TTd antitela kao što je opisano gore.

Tettox ELISA se poželjno izvodi na sledeći način:

Ploča s 96 bunarića (poželjno od Euro-Diagnostica, Arnhem, Holandija) obložena je streptavidinom. Ploča obložena streptavidinom s 96 bunarića se blokira sa PBS koji sadrži 5% BSA (200 ul/bunarić, lh, sobna temperatura). Potom je ploča isprana tri puta sa PBS koji sadrži 0.05% Tween20. Biotinilovani peptid je obložen za vreme 1 h inkubacije na sobnoj temperaturi sa 100 ul/bunarić po 2 ug/ m\ rastvora biotinilovanog peptida u PBS koji sadrži 1% BSA. Ploča je isprana tri puta sa PBS koji sadrži 0.05% Tween20 posle čega sledi inkubacija tokom 1 h na sobnoj temperaturi sa 100 ul seruma iz humanog subjekta kako je gore definisano (poželjno ima visok titar anti-TTd antitela) koji su razblaženi bar 100, 200, 400, 500 ili 1000 puta i poželjno ne više od 100.000, 10.000, 7.500, 5.000 ili 2.500 puta sa PBS koji sadrži 1% BSA. Zatim je ploča isprana tri puta sa PBS koji sadrži 0.05% Tween20. Svaki bunarić je inkubiran 1 h na sobnoj temperaturi sa HRP-konjugovanim IgG antitelom (mišje anti-humano IgG-HRP monoklonska, klon Gl 8-145, kat. Br. 555788, Becton Dickinson, 100 uV bunarić 1000x razblaženje u PBS koji sadrži 0.05% Tween20) posle čega je ploča isprana tri puta sa PBS koji sadrži 0.05% Tween20. Razvijanje se obavlja sa 2,2'-azino-di- (3-etilbenztiazolin sulfonskom kiselinom), ABTS + H2O21/1000, 100 ?)/ bunarić. Optička gustina se meri na 415 nm sa Bio-Rad, model 680, čitač mikroploča. U svakoj ploči se poželjno dodaje negativna kontrola, poželjnije najmanje bar u triplikatu. Poželjna negativna kontrolna je serum iz humanog subjekta bez detektirajućih anti-TTd antitela. Druga poželjna negativna kontrola je rastvor BSA. Poželjno, peptid prema (ii) vezan za antitela u najmanje 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% najpoželjnije 100% ispitivanih uzoraka humanog seruma. Peptid se smatra daje vezan za antitela u serumu uzorka ako utvrđena optička gustina za taj uzorak seruma je najmanje 2.0, poželjnije 2,5, 3,0, 3,5 ili više puta veća u odnosu na optičku gustinu koja je određena za negativnu kontrolu.

Alternativno, peptid pod (ii) biti vezan za antitela prisutnim u TetaQuin® (Sankuin, Amsterdam, Holandija). U Tettox ELISA-i kao što je opisano gore, umesto seruma iz humanog subjekta, može da se koristi 100 ul TetaQuin® koji su razblaženi 800xsa PBS koji sadrži 1% BSA, pri čemu se smatra daje peptid vezan za antitela u TetaQuin® ako utvrđena optička gustina za uzorak je najmanje 2.0, poželjnije 2.5, 3.0, 3.5 ili više puta veća u odnosu na optičku gustinu koja je određena za negativnu kontrolu.

Poželjno, sva merenja u Tettox ELISA se izvode u duplikatu, poželjnije u triplikatu ili više.

Poželjno, peptid prema ovom pronalasku uključuje aminoksielinsku sekvencu FIGITELKKL

(SEKV ID NO: 4), GITELKKLES (SEKV ID NO: 5) ili IGITELKKLE (SEKV ID NO: 6).

Poželjnije, peptid u skladu sa ovim opisom se sastoji od aminokiselinske sekvence

FIGITELKKL (SEKV ID NO: 4), GITELKKLES (SEKV ID NO: 5) ili IGITELKKLE (SEKV ID NO: 6).

U jednoj realizaciji, ovaj pronalazak se odnosi na peptid koji sadrži: (i) aminokiselinsku sekvencu kao što je definisano u bilo kojem od SEKV ID NO: 4-24; ili (ii) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70, 80, 90 ili 100% identičnosti sekvence i/ili najmanje 70, 80, 90 ili 100% sekvencijske sličnosti sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao što je definisano u SEKV ID NO: 4- 24 pri čemu je peptid, kada se izloži uzorcima seruma od najmanje 10 humanih subjekata koji su vakcinisanih s tetanus toksoidom se u najmanje 50% uzoraka seruma vezuju za antitela iz uzoraka seruma, kao stoje određeno u Tettox ELISA kao što je gore opisano. Poželjno, peptid ne sadrži dodatne aminokiselinske rezidue na svom N-terminalu. Poželjnije, ovaj pronalazak se odnosi na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je definisano u SEKV TD NO: 24.

Peptid u ovom opisu obuhvata ili se sastoji od najmanje 10 aminokiselinskih rezidua, poželjno od najmanje 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25,26,27,28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ili više aminokiselinskih rezidua.

U sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak se odnosi na peptid prema iz ovog pronalaska , pri čemu peptid obuhvata ili se sastoji od manje od 100 aminokiselinskih rezidua, još poželjnije manje od 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 aminokiselinskih rezidua. Poželjnije, peptid u skladu s ovim opisom sastoji se od 18 aminoksielinskih rezidua, a najpoželjnije je da se peptid prema ovom pronalasku sastoji od SEKV ID NO: 24.

U još jednoj realizaciji, u nekom peptidu ovog opisa su aminokiselinske rezidue supstituisane drugim aminokiselinskim reziduama, poželjno konzervativnim aminokiselinskim reziduama kao što je definisano gore. Aminokiselinske rezidue u nekom peptidu iz ovog pronalaska koje su supstituisane, poželjno su aminokiselinske rezidue na pozicijama 381, 382, 386-390, 392-398 iz SEKV ID NO: 3.

Alternativno ili u kombinaciji s bar jednom prethodnom realizacijom, opis se odnosi na neku realizaciju gde peptid uključuje dodatne aminokiselinske rezidue na C-terminalu SEKV ID NO: 4-24.

U drugoj realizaciji, ovaj opis se odnosi na neki peptid u skladu sa opisom, pri čemu daljnje aminokiselinske rezidue nisu izvedeni iz tetanus toksina ili tetanusa toksina beta lanca.

U sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak se odnosi na peptid prema ovom pronalasku gde se peptid sastoji od aminokiselinske sekvence kako je opisano u bilo kojem od patentnih zahteva 1 ili 2.

U daljnjoj realizaciji, peptid ovog opisa je peptid predstavljen u Tabeli 2 koji ima neki OD veći od 0,2, 0,25, 0,35, 0,45, 0,6, 0,75, 0,8, 0,85, 1.0, 1.05, 1.1 ili 1.15; neki peptid prikazan u

Tabeli 3 ima OD veći od 0,3, 0,35, 0,4, 0.75, 1.0, 1.15, 1.45, 1.5, 1.55, 1.65, 1.7, 1.85, 1.9 ili 2.0; neki peptid prikazan u Tabeli 5 ima OD veći od 0.16, 0.18, 0.3, 0.38, 0.62, 0.65, 0.7, 0.71, 0.85, 0.88, 0.9, 0.91 ili 1.0; ili neki peptid prikazan u Tabeli 6 ima OD sa bar jednim od Tetaquin® ili serumom 034960 većim od 0,37, 0,41, 0,7, 0,72, 0,8, 0,83, 0,88, 0,9, 0,95, 0,97, 1,01, 1,02, 1,04 ili 1.1. Ove vrednosti ODS su određene prema Tettox Elisa koristeći TetaQuin® kao što je opisano ovde na drugom mestu.

Otkriće dodatno definiše neki metod priređivanja peptida prema ovom pronalasku. Peptid prema ovom pronalasku se poželjno proizvodi hemijskom sintezom i prečišćavanjem (npr. vidi Primere).

Pojedine rezidue peptida ovog opisa mogu biti ugrađene u peptid nekom peptidnom vezom ili mimetičkom peptidnom vezom. Neka mimetička peptidna veza obuhvata modifikacije peptidnog kostura koje su dobro poznate prosečnom stručnjaku. Takve modifikacije uključuju modifikacije amidnog azota, a-ugljenika, amid karbonil, kompletnu zamenu amidne veze, dodatke, brisanja ili unakrsno vezani kostur. Vidi, generalno, Spatola, Chemistrv and Biochemistrv of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. VII (Weinstein ed., 1983). Poznato je nekoliko modifikacija peptidnog kostura, one uključuju,\\ i[CEhS],\|/

[CH2NH], y [CSNH2], y [NHCO],\\ >[COCH2]i y [(E) ili (Z) CH=CH]. Nomenklatura koja je gore korištena, sledi onu koju sugeriše Spatola, iznad. U tom kontekstu,\|/ukazuje na odsustvo amidne veze. Struktura koja zamenjuje amidnu grupu je navedena u zagradama.

Mimetici aminokiselina mogu takođe da se ugrade u peptide. Neki "mimetik aminokiseline" kako se ovde koristi je neka vrsta koja nije prirodna aminokiselina koja konformacijski i funkcionalno služi kao zamena za neku aminokiselinu u peptida ovog pronalaska. Takva vrsta služi kao zamena za neku aminokiselinsku reziduu ako ne narušava sposobnost peptida da se veže za TTd antitela na način definisan u tekstu gore. Mimetici aminokiselina mogu sadržavati neproteinske aminokiseline, kao što su |3-, y-, 8-aminokiseline, P-, y-, 8-imino kiseline (kao što je piperidin-4-karboksilna kiselina), kao i mnoge derivati L-a aminokiselina. Izvesni broj podesnih mimetika aminokiselina je poznat prosečnom stručnjaku, oni uključuju cikloheksilalanin, 3-ciklohekilpropionsku kiselinu, L-adamantil alanin, adamantilsirćetnu kiselinu i slično. Pored toga, D-aminokiseline mogu se smatrati mimeticima. Peptidni mimetici podesni za peptide ovog pronalaska prodiskutirani su u Morgan i Gainor, (1989) Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252.

Konjugat

U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na konjugat kao što je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva 1-3 ovde. Otkriće se odnosi na konjugat, koji sadrži peptid kako je definisano gore te neki imunogena ili neki nosač koji sadrži imunogen. Poželjno, peptid kako je gore definisano je konjugovan na svom C-terminalu za neki imunogen ili neki nosač koji sadrži imunogen.

Neki konjugat prema ovom pronalasku može da služi poboljšanju širokog spektra vakcina, uključujući vakcine za prevenciju i/ili lečenje zaraznih bolesti (kao što su npr. virusne ili bakterijske vakcine) i (ne-virusnih) karcinoma (poput npr. neke tumorske vakcine). Na primer, ovaj pronalazak može korisno da se upotrebi u vakcinama protiv virusa poput HIV, ebola i SARS-a, za sprečavanje parazitskih bolesti poput malarije i protiv bakterija kao što su multirezistentneS. aureus(MRSA) i multirezistentna tuberkuloza. Važno, namera ovog pronalaska nije da se koristi peptid prema ovom pronalasku da se indukuje zaštitni imunitet protiv tetanusa. Umesto toga, peptidi prema ovom pronalasku se koriste kod pacijenata sa već postojećim imunitetom protiv tetanusa u obliku cirkulirajućih anti-TTd ili anti-TTx antitela koja vezuju, poželjno snažno vezuju, peptide ovog pronalaska. Peptidi prema ovom pronalasku se koriste kod subjekata sa pre-egzistirajućim imunitetom protiv tetanusa za unošenje imunogena i/ili nosača koji sadrži imunogen za antigen prezentujuće ćelije (APC) da bi se indukovao i/ili ojačao imunitet protiv imunogena kod subjekta.

Imunogen u konjugatu prema ovom pronalasku može da bude peptid, proteinski fragment, protein, karbohidrat i/ili njihova kombinacija. U jednoj realizaciji epitop i neki HLA klasa II epitop zajedno se ordiniraju na najmanje dva različita imunogena peptida. Nekoliko publikacija je pokazalo da CD4<+>T-ćelije posle interakcije sa klasa II epitopom koji prezentuje dendritske ćelije (DC) doregulišu CD40 ligand. Interakcija CD4<+>Th ćelije pomoću njenog CD40 Uganda sa CD40 molekulom na DC dovodi do aktivacije DC. Aktivirani DC-ovi pokazuju doregulisane kostimulirajuće molekule i luče CTL-promovisane citokine. Ovo ne samo da omogućava jači CD8<+>CTL odgovor koji je indukovan nekim takvim aktivisanim DC koja predstavlja MHC klasa I ograničene epitope, već i mnogo više robustan CTL memorijski odgovor (Ridge et al 1998, Nature 393:474.; Schoenberger i al. 1998, Nature 393:480; Sun et al. 2004, Nat. Immunol. 5:927). Potreba za CD40 ekspresijom na DC za snažne anti-tumorske CD8<+>CTL odgovore posle vakcinacije sa dugačkim peptidima (35 aa.) je objavljena u Zwaveling et al. (2002, J. Immunol. 169:350). Nedavno je utvrđeno da bez indukcije CD4<+>Th odgovora pomoću MHC klasa II epitopa koji su sadržani u dugim peptidima, indukovane CD8<+>CTL odgovori su manje energični i kraće traju, pri čemu potpuno izostaje CD8<+>CTL memorija.

U jednoj realizaciji, imunogeni peptid prema ovom pronalasku obuhvata da se više nego jedan HLA klasa I epitop i/ili više nego jedan HLA klasa II epitop i/ili više nego jedan HLA klasa I epitop i/ili više nego jedan HLA klasa II epitop primenjuju zajedno na najmanje dva različita imunogena peptida. U slučaju kada je više od jednog HLA klasa I epitopa i/ili više od jednog HLA klasa II epitopa prisutno u imunogenom peptidu prema ovom pronalasku (ili je primenjeno na najmanje dva različita imunogena peptida), od više različitih epitopa mogu biti iz jednog i istog izvora antigena, ili mogu biti iz više od jednog različitog izvora antigena. U slučaju da su više od jednog različitog izvora antigena, različiti antigeni mogu biti jedni od jednog te istog patogena ili istog tumora/tumorske ćelije, ili mogu biti iz više od jednog različitog patogena ili iz više od jednog tumora/tumorske ćelije. Antigeni iz infektivnih agenasa (patogena) ili tumorskih ćelija iz kojih HLA klasa I epitopi i/ili HLA klasa II epitopi mogu biti izvedeni za korišćenje u nekom imunogenom peptidu prema ovom pronalasku su opisani u nastavku.

HLA klasa I prezentovan citotoksični T limfocit (CTL) epitopi kao HLA klasa II T pomoćni (helper) epitopi proizvode se intracelularno, sekvencom definisanih intracelularnih mehanizama. Prvo, dominantan događaj koji definiše neki epitop T ćelija je otpuštanje epitopa (ili epitop-prekursora) sa svojih bočnih proteinskih regiona u imunogenim peptidima prema ovom pronalasku putem enzimske digestije od strane citosolnih peptidaza. Razne peptidaze, citosolne i/ili ne-citosolne peptidaze (npr. ER peptidaze) mogu biti uključene u proteolitičko otpuštanje epitopa iz svojih bočnih regiona u imunogenom peptidu. Jedan primer takvih citosolnih peptidaza uključuje npr. multikatalitički proteosom (Rock et al., 2004, Nat. Immunol. 5:670), koji može biti uključen u proizvodnju N- kao i C-terminalnog CTL epitopa. Konkretno, proteosom je često uključen u obrazovanju tačnog C-terminala CTL epitopa. Obrazovanje amino-terminala epitopa T ćelija je donekle fleksibilno jer nekoliko amino-terminalnih ekso-peptidaza (poput ERAP1, piromicin osetljiva aminopeptidaza, bleomicin hidrolaza i druge) borave u citosolu i endoplazmatičnom retikulumu (ER) i ovi triming enzimi imaju sposobnost da skrate neki N-terminalni izduženi epitop-prekursor na svoju preciznu dužinu. Druge peptidaze koje su uključene u obradu epitopa imunogenih peptida uključuju npr. nardilisin. Obrazovanje C-terminala epitopa T ćelija može da bude donekle fleksibilno jer citosolna timetna oligopeptidaza (TOP) (EC 3.4.24.15) ima kapacitet da skrati neki C-terminal izduženi epitop-prekursor do nejgove precizne dužine otpuštanjem 3-5 aminokiselina.

U jednoj realizaciji, neki imunogeni peptid prema ovom pronalasku sadrži dva ili više epitopa kao što je opisano gore koji su poredani kao kuglice na niski, pri čemu su epitopi (perlice) povezani direktno zajedno i/ili su povezani preko linker sekvence. Sekvence aminokiselina koje okružuju ili povezuju peptide/epitope poželjno uključuju mesta proteolitičkog cepanja kako je ovde opisano. Separator (razmaknica) aminokiselinske sekvence koje su bočne ili povezuju epitope u imunogenim peptidima prema ovom pronalasku ne mora da bude prisutan u slučajevima kada je mesto proteolitičkog cepanja deo epitopa. Međutim, u drugim slučajevima separator aminokiselinskih sekvenci, koje sadrže ili ne sadrže jedno ili više mesta proteolitičkog cepanja, mogu da budu dužine od 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15 ili više aminokiselina. Sekvenca aminokiselinskog separatora može ili ne mora da bude sused do aminokiselinske sekvence koja prirodno okružuje epitop u svom izvornom antigenu.

U sledećoj realizaciji imunogenog peptida prema ovom pronalasku, imunogeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja prirodno ne postoji, tj. ne postoji u prirodi, ali to je rezultat ljudske intervencije i/ili dizajna. U ovoj realizaciji, imunogeni peptid će sadržavati jednu ili više HLA klasa I epitop i/ili HLA klasa II epitop kako je prethodno definisano, pri čemu se takav epitop poželjno sastoji od prirodne aminokiselinske sekvence antigena iz infektivnih agenasa i/ili tumora. Međutim, najmanje jedna aminokiselinska sekvenca u imunogenom peptidu koji zaposeda najmanje jedan epitop u imunogenom peptidu i/ili koji povezuje dve epitopa u imunogenom peptidu nije iz (prirodnog ili divljeg tipa) antigena iz kojeg je izveden epitop/epitopi i/ili vezujuća/okružujuća aminokiselinska sekvenca je iz drugih lokacija unutar antigena koje nisu susedne sa epitopom koji ih okružuje. U poželjnoj realizaciji vezujuća/okružujuća aminokiselinska sekvenca u nekom imunogenom peptidu prema ovom pronalasku sadrži jedan ili više motiva za cepanje proteazom kao što je opisano gore. Tako, u skladu sa ovim pronalaskom (vakcina) imunogeni peptidi za izazivanje odgovora T ćelija mogu biti sastavljen da sadrže jedan ili više HLA klasa I epitopa i/ili HLA klasa II epitope, a ti epitopi epitopi mogu biti okruženi ili i zajedno povezani aminokiselinskim sekvencama koje sadrže motive za cepanje proteazom kao što je opisano da se usmeri efikasno proteolitičko otpuštanje epitopa sa imunogenih peptida za prezentaciju epitopa na površini ćelije odgovarajućih klasa I ili II MHC molekula.

U sledećoj realizaciji imunogeni peptid prema ovom pronalasku je sintetički peptid. Upotreba relativno kratkih peptida je veoma poželjna za medicinske svrhe pošto one mogu biti efikasno sintetizovaniin vitro,što nije moguće ili je neracionalno za nativne proteine koji su veći od oko 100 aminokiselina. Hemijska sinteza peptida je rutinska praksa i različiti pogodni postupci su poznati stručnjaku u ovoj oblasti. U jednom aspektu, ovaj pronalazak se takođe odnosi na neki metod za proizvodnju imunogenog peptida prema ovom pronalasku hemijskom sintezom ili proizvodnjom u rekombinantnoj ćeliji domaćina. Hemijskom sintezom peptida se takođe preovlađuju problemi vezani za rekombinantnu produkciji intaktnih proteina, što je teško da se standardizuje i zahteva obimno prečišćavanje i mere za kontrolu kvaliteta. Imunogeni peptidi sa nekom dužinom koja prelazi dužinu HLA klasa I i/ili klasa II epitope (npr. ima dužinu kao što je prikazano niže) su posebno podesni za upotrebu kao sastojak u vakcini jer su dovoljno veliki da ih preuzmu profesionalne antigen prezentujuće ćelije, posebno DC, kako je objašnjeno u patentu WO02/070006 i dođe do obrade u DC pre prezentacije na površini ćelija sadržanih HLA klase i i klase II epitopa. Prema tome, nepovoljna indukcija tolerancije T ćelija sistemskom prezentacijom minimalnog HLA klasa I epitopa na ne-antigen prezentujućim ćelijama (kao što je prikazano u Toes et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7855 i Toes et al., 1996, J. Immunol. 156:3911), sprečava se primenom imunogenog peptida prema ovom pronalasku koji ima dužinu kao što je ovde navedeno (kao što je prikazano na Zwaveling et al., 2002, J. Immunol. 169:350). Radi jasnoće, neki imunogeni peptid prema ovom pronalasku poželjno sadrži najmanje jedan jedne klasa HLA prezentovani epitop i HLA klasa TT prezentovani epitop. Svaki od ovih epitopa je reprezentativan i može da se veže za odgovarajući specifični HLA molekul koji se nalazi na ćeliji nakon prerade kako je ovde opisano. Svaki HLA epitop može stoga biti imenovan kao neki HLA vezujući i/ ili prezentirajući epitop. Dužina jednog imunogenog peptida i/ili sintetičkog imunogenog peptida prema ovom pronalasku poželjno je bar 19, 20, 21, 22, 25, 27, 30, 33, 35, 40 ili 45 aminokiselina i poželjno ne više od 100, 80, 60, 50 aminokiselina.

Vezanje peptida za TTd-antitelo prema ovom pronalasku u konjugatima ovog pronalaska može biti konjugovano direktno za imunogene, ili alternativno, vezanje peptida za TTd-antitelo može biti konjugovano za farmaceutski prihvatljive nanokontejnere (nosače) koji sadrži imunogeni. U takvim konjugatima su imunogeni koji mogu npr. biti inkapsulirani unutar nanokontejnera, poput nanočestica, virosoma, liposoma ili nanogelova, pri čemu vezanje peptida za TTd-antitelo je poželjno konjugovano vezano za takav nanokonktejner. Takva konjugacija za nanokontejner može biti direktna ili preko bilo kojega od poznatih polimernih konjugirajućih agensa poput sfingomijelina, polietilen glikola (PEG) ili drugih organskih polimera. Detalji proizvodnje takvih farmaceutskih kompozicija koje sadrže ciljane (PEG) lipozome su opisani u US patentu bo. 6,372,250. Prema tome, u poželjnoj realizaciji konjugat prema ovom pronalasku je neki konjugat gde farmaceutski prihvatljiv nosač ili nosač sadrži najmanje jedan od: neki nosač proteina, neki nanokontejner, neki liposom, neki polipleksni sistem, neki lipopleksni sistem, te polietilenglikol.

U tehnici je poznat ceo niz metoda za konjugaciju TTd-antitelo vezujućih peptida ovog pronalaska s nekim imunogenom ili nekim nosačem koji sadrži imunogen. Takve metode su npr. opisali Hermanson (1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press), u patentima U.S. 6,180,084 i U.S. 6,264,914 i uključuju npr. metode koje se koriste da se poveže hapteni za noseće proteine što se rutinski koristi u primenjenoj imunologiji (vidi Harlov i Lane, 1988, "Antibodies: A laboratorv manual", Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY). Poznato je da, u nekim slučajevima, neki TTd-antitelo vezujući peptid ili imunogen može izgubiti efikasnost ili funkcionalnost nakon konjugacije zavisno, na primer, o postupku konjugacije ili hemijske grupe koja je korišćena u njemu. Međutim, imajući u vidu veliki niz metoda za konjugaciju stručnjak je u stanju da pronađe način konjugacije koji ne utiče ili najmanje utiče na efikasnost ili funkcionalnost entiteta koji treba da bude konjugovan. Pogodni postupci za konjugaciju peptida sa nekim imunogenim ili nosačem uključuju npr. karbodiimidnu konjugaciju (Bauminger i Vilchek, 1980, Meth. Enzimol. 70:151-159). Alternativno, neki imunogen ili nosač mogu biti vezani za TTd-antitelo vezujući peptid kao što su opisali Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7269-7273

(1996); i Nagy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1794-1799 (1998), od kojih je svaki ovde uključen kao referenca. Druge metode za konjugaciju koji mogu podesne mogu koristiti npr. natrijum perjodat oksidaciju, zatim reduktivnu alkilaciju odgovarajućih reaktanata i glutaraldehid unakrsno vezanje. Drugi pogodan način za unakrsno vezanje je hemijsko spajanje preko neke Staudinger ligacije, preko Staudinger-Bertozzi ligacije, preko hemijske ligacije koristeći tioester, preko [2+3] -Huisgen cikloadicije (klik hernija), preko disulfidnog premošćivanje, i slično. Posebno podesan postupak konjugacije može može da se primeni kada nisu samo TTd-antitelo vezujući peptid već i imunogen ili nosač neki (poli)peptid. U takvim slučajevima dva entiteta mogu biti sintetizovana kao jedan (poli)peptidni lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence i TTd-antitelo vezujuća peptida i imunogen peptida ili nosača. Pored kovalentnog vezivanja, u nekom konjugatu prema ovom pronalasku imunogen ili nosač mogu takođe biti direktno konjugovani za molekul TTd-antitelo vezujućeg peptida vpomoću nespecifične ili specifične interakcije protein-protein, neko valentnim vezivanjem i/ili koordinacijskim hemijskim vezanjem, pri čemu na konjugaciju može proizvoljno da se deluje putem nekog separatora ili linkera koji je vezan za imunogen ili nosač i TTD-antitelo vezujući peptid.

U poželjnoj realizaciji, neki konjugat prema ovom pronalasku sadrži 1-20, poželjnije najmanje2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10 imanje od20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13,12,11,10peptida koji su vezani za antigen, imunogen ili nosač koji sadrži antigen ili imunogen. Poželjnije, konjugat sadrži 2-20, poželjnije 2-15, 2-10, 2-5, najpoželjnije 3 ili 4 peptida koji su vezani za antigen, imunogen ili nosač koji sadrži antigen ili imunogen. U slučaju da konjugat sadrži neki nosač koji sadrži neki antigen ili imunogen i neki peptid, broj peptida može biti mnogo veći od 20, na primer više od 100, 200, 300, 400, 500, poželjno manje od 800, 700, 600.

Neki konjugat ovog pronalaska koji se sastoji prvenstveno od peptida je poželjno rastvorljiv u fiziološki prihvatljivim vodenim rastvorima (npr. PBS) koji sadrže ne više od 60, 50, 40, 35, 20, 10, 5 ili 0% DMSO. U takvom rastvoru, konjugat je poželjno rastvorljiv u koncentraciji od najmanje 0.5, 1,2, 4 ili 8 mg konjugata po ml. Alternativno, smeša od više od jednog različitog konjugata prema ovom pronalasku je rastvorljiva u nekoj koncentraciji od najmanje 0.5, 1, 2, 4 ili 8 mg peptida po ml u takvim rastvorima.

Profilaktička i terapeutska upotreba

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na neki konjugat prema ovom pronalasku koji se koristi kao neki lek. Još poželjnije, pronalazak se odnosi na neki konjugat kao što je definisano gore, koji se koristi kao neki lek kod subjekta koji poseduje antitela protiv tetanus toksina ili tetanus toksoida.

U poželjnoj realizaciji, neki lek prema ovom pronalasku je neka profilaktička ili terapeutska vakcina, poželjnije neka profilaktička ili terapeutska vakcina protiv neke zarazne bolesti ili karcinoma.

U još poželjnijoj realizaciji, lek je namenjen za antitelom upravljano antigen-ciljanje kao što je dalje gore definisano.

U još jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na neki konjugat prema ovom pronalasku, za upotrebu u prevenciji ili tretiranju karcinoma ili zarazne bolesti kod subjekta. Prema ovom aspektu, ovaj pronalazak se takođe odnosi na primenu konjugata prema pronalasku za proizvodnju nekog leka za prevenciju ili tretiranje karcinoma ili neke zarazne bolesti kod subjekta.

Prema tome, neki imunogen u nekom konjugatu prema ovom pronalasku može da sadrži HLA klasa 1 i/ili klasa II epitope iz širokog spektra antigena tumora i patogena (infektivni agensi). Na primer, tumorski antigeni kao što su MAGE, BAGE, RAGE, GAGE, SSX-2, NY-ESO-1, CT-antigen, CEA, PSA, p53, XAGE i PRAME ali i virusno indukovani maligniteti, što obuhvata humani papiloma virus (HPV), Kaposijev sarkoma herpes virus (KSHV), Epstein Barr virus indukovane limfome (EBV). Drugi primeri tumorskih antigena iz kojih mogu biti izvedeni epitopi za upotrebu u ovom pronalasku su različiti sveprisutno izraženi sopstveni-antigeni za koje se zna da su povezani sa karcinomom, koji obuhvataju npr. p53, MDM-2, HDM2 i druge proteine koji igraju ulogu u p53 putu, molekule kao što su survivin, telomeraza, citohrom P450 izoforma 1B1, Her-2/neu, te CD 19 i svim takozvanim kućnim proteinima. Karcinomi koji mogu da se tretiraju u skladu sa ovim pronalaskom se biraju iz redova sledeće liste: pluća, debelo crevo, jednjak, jajnik, pankreas, koža, želudac, glava i vrat, bešika, sarkom, prostata, hepatocelularni karcinom, mozak, nadbubrežna žlezda, dojke, endometrijum, mezoteliom, bubreg, tiroideja, hematološki karcinom, karcinoid, melanom, paratiroideja, cerviks, neuroblastom, Wilms karcinom, testisi, hipofiza i feohromocitomni karcinomi.

Nadalje, neki imunogen u konjugatu ovog pronalaska može da sadrži HLA klasa I i/ili klasa II epitope iz antigena koji pripadaju patogenima i zaraznim agensima kao što su virusi, bakterije, gljivice i protozoa. Neki primeri patogenih virusa koji uzrokuju infekcije ili tumore za koje mogu da se izvedu epitopi antigena uključuju: hepatitis (A, B ili C), herpes virus (npr. VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-I1 i CMV, Epstein Barr virus), adenovirus, SV40 virus (koji izaziva mezoteliom), virus influence, flavivirusi, ehovirus, rinovirus, humani enterovirus, koronavirus, respiratorni sincicijski virus (RSV), mums virus, rotavirus, virus malih boginja, rubeola virus, parvovirus, vakcinia virus, HTLV virus, denga virus, virus moluske, poliovirus, virus besnoće, JC virus, arboviralni encefalitis virus, te virus humane imunodeficijencije (HIV virus; npr. tip I i II), infekcije human papiloma virusom (HPV), konkretnije visoko rizični tumorski tipovi HPV, što obuhvata tipove HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 i 68. Neki primeri patogenih bakterija koje izazivaju infekcije za koje mogu da se izvedu epitopi antigena uključuju:Listeria, Escherichia, Chlamydia,

Rickettsialbacteria,Mycobacteria, Staphylococci, Streptocci, Pneumonococci,

Meningococci, Gonococci, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella,

Diphtheria, Salmonella, Bacilli,bakterije koje izazivaju koleru, tetanus, botulizam, antraks, kugu, leptspiroze i Lymes bolest. Neki primeri patogenih gljivica koje izazivaju infekcije za koje mogu da se izvedu epitopi antigena uključuju:Candida ( npr. albicans, krusei, glabrata, tropicalis), Cryptococcus neoformans, Aspergillus ( npr. fumigatus, niger),gljivice roda

Mucorales ( Mucor, Absidia, Rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis,

Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitisiHistoplasma capsulatum.Neki primeri patogenih parazita koji izazivaju infekcije za koje mogu da se izvedu epitopi antigena uključuju:Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria, Fowleri, Acanthamoeba sp.,

Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinu, Plasmodium vivax, Babesia

microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii

iPlasmodium falciparis.

U jednoj poželjnoj realizaciji, subjekt poseduje antitela protiv tetanus toksina ili tetanus toksoida.

Alternativno ili u kombinaciji s drugim realizacijama, u poželjnoj realizaciji pronalaska, lek je profilaktička ili terapeutska vakcina.

Alternativno ili u kombinaciji s drugim realizacijama, u poželjnoj realizaciji ovog pronalaska postupak dalje obuhvata davanje vakcine da se izazove imunološki odgovor na tetanus toksoid. Poželjno, vakcina za izazivanje imunološkog odgovora na tetanus toksoid se daje najmanje 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 ili više nedelja pre primene konjugata. Poželjno, vakcina je TTd.

U drugoj realizaciji konjugat se prethodno pomeša sa Tetaquin-om da se formira imunosni kompleks i naknadno primeni.

U slučaju pokusne vakcinacije, predtretman subjekata pomoću TTd imunizacije da se povećaju nivoi antitela protiv TTx je takođe moguć.

U poželjnoj realizaciji lek je namenjen za antitelom upravljano antigen-ciljanje kao što je gore definisano.

U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje ili prevenciju karcinoma ili zarazne bolesti, što uključuje davanja subjektu kome je to potrebno efikasne količine konjugata prema ovom pronalasku.

U poželjnoj realizaciji subjekt koji se tretira poseduje antitela protiv tetanus toksina ili tetanus toksoida.

U jednoj poželjnijoj realizaciji, konjugat se primenjuje zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Farmaceutski prihvatljivi agensi za stabilizaciju, osmotski agensi, sredstva za puferovanje, dispergovanje i slično mogu takođe da se ugrade u farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugate prema ovom pronalasku. Poželjna forma zavisi od nameravanog načina davanja i terapijske primene, poželjno parenteralno. Farmaceutski nosač može da bude bilo koja kompatibilna, netoksična supstanca pogodna da se konjugat unese subjektu. Farmaceutski prihvatljivi nosači za parenteralni unos su na primer sterilna puferovana 0,9% NaCl ili 5% glukoza kojima je proizvoljno dodan 20% albumin.

U daljem aspektu, ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje ili prevenciju karcinoma ili infektivne bolesti, što uključuje davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine konjugata prema ovom pronalasku.

U željenoj realizaciji, subjekt koji treba da bude tretiran poseduje antitela protiv tetanus toksina ili tetanus toksoida.

U još poželjnijoj realizaciji, konjugat se primenjuje zajedno s farmaceutski prihvatljivim nosačem. Farmaceutski prihvatljivi stabilizirajući agensi, osmotski agensi, puferski agensi, agensi za disperziju i slično takođe mogu biti ugrađeni u farmaceutske kompozicije koje čine konjugate ovog pronalaska. Poželjna forma zavisi o željenom načinu primene i terapeutskoj aplikaciji, poželjno je parenteralna. Farmaceutski prihvatljivi nosač može da bude bilo koja kompatibilna, netoksična supstanca pogodna za unošenje konjugata u subjekt. Farmaceutski prihvatljivi nosači za parenteralno unošenje su ogledno sterilna puferovana 0.9% NaCl ili 5% glukoza kojoj je proizvoljno dodan 20% albumin. Preparati za parenteralnu primenu moraju da budu sterilni. Parenteralni put za primenu konjugata je u skladu sa poznatim metodama, npr. injekcija ili infuzija intravenoznim, intraperitonealnim, intramuskularnim, intraarterijskim ili intralezijskim putevima. Konjugat prema ovom pronalasku se poželjno primenjuje bolus injekcijom. Tipični farmaceutski sastav za intramuskularnu injekciju može biti takav da sadrži, na primer, 1-10 ml rastvora puferovanog fosfata i 1 do 100ug,poželjno 10 do 300 ug (antigen protein) konjugata ovog pronalaska. Metode za pripremanje parenteralno primenjivih kompozicija su dobro poznate u tehnici i detaljno su opisane u različitim izvorima, npr. Remington's Pharmaceutical Science (15<th>ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980).

U sledećoj realizaciji, farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku dodatno sadrži bar jedno jedinjenje ili adjuvant koji stimulišu imunološki odgovor. Prevashodno , farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku može dodatno da sadrži jedan ili više sintetičkih adjuvanata. Ovi adjuvanti mogu biti pomešani s farmaceutskom kompozicijom prema ovom pronalasku ili mogu biti primenjeni odvojeno sisani ili čoveku koji treba da bude tretiran. Posebno podesni su oni adjuvanti za koje se zna da deluju putem Toll-sličnih receptora. Imunološki modifikovana jedinjenja koja su sposobna za aktivaciju urođenog imunološkog sistema, mogu biti aktivirani od strane nemetilovane CpG DNK ili hromatin - IgG kompleksa. Konkretno, TLR3, TLR7 i TLR9 igraju važnu ulogu u upravljanju nekim urođenim imunološkim odgovorom protiv virusne infekcije, te ona jedinjenja koja su u stanju da aktiviraju ove receptore su posebno podesna za upotrebu u nekoj metodi lečenja, kao i u nekoj smeši ili nekom leku prema ovom pronalasku. Posebno podesni adjuvanti čine, ali nisu ograničeni na sintetički proizvedena jedinjenja koje čine dsRNA, poly(I:C), ne metilovana CpG DNK koja pokreće TLR3 i TLR9 receptore, IC31, IMSAVAC, Montanid ISA-51 (jedan adjuvant kojeg proizvodi Seppic 7, Francuska). Drugo podesno imunološki modifikovano jedinjenje je neki adhezioni inhibitor T ćelija, poželjnije to je neki inhibitor nekog endotelin receptora kao što je BQ-788 (Buckanovich RJ et al, Ishikavva K, PNAS (1994) 91:4892). BQ-788 je N-cis-2,6-dimetil-piperidinokarbonil-L-gama-metilleucil-D -1-metoksikarboniltriptofanil-D-norleucin. Međutim, neki derivat BQ-788 ili modifikovano BQ-788 jedinjenje takođe je obuhvaćeno obimom ovog pronalaska. U drugoj poželjnoj realizaciji, neko sintetičko adjuvant jedinjenje je fizički vezano za neki peptid ili imunogeni peptid ovog pronalaska. Fizičko vezivanje adjuvanata ili kostimulirajućih jedinjenja ili funkcionalnih grupa za HLA klasa I i HLA klasa II epitop obuhvata peptide koji obezbeđuju neki pojačani imunološki odgovor istovremenim stimuliranjem antigen prezentujućih ćelija, konkretno dendritskih ćelija, koje internalizuju, metabolizuju i prikazuju antigen.

Poželjno, konjugat je profilaktička ili terapeutska vakcina.

Alternativno, ili u kombinaciji s jednom ili više drugih realizacija, u nekoj realizaciji ovog pronalaska metod lečenja takođe uključuje primenu neke vakcine da se izazove imunološki odgovor protiv tetanus toksoida bar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,20, 30 ili više nedelja pre primene konjugata. Po mogućstvu, vakcina je TTd.

Poželjno, neki subjekat koji poseduje antitela protiv tetanus toksina ili tetanus toksoida bio je imunizovan s tetanus toksoidom, imao je post-ekspozicijsku profilaksu za tetanus i/ili je bolovao od tetanusa.

Alternativno ili u kombinaciji s drugim realizacijama ovog pronalaska, metod za lečenje karcinoma prema ovom pronalasku može dodatno da uključuje druge metode tretiranja. Primeri drugih metoda tretiranja koje mogu da se kombinuju s metodom lečenja prema ovom pronalasku su npr. hemoprezentujuće ćelije, konkretno dendritske ćelije, koje internalizuju, metabolizuju i prikazuju antigen.

Poželjno, konjugat je preventivna ili terapeutska vakcina.

Alternativno, ili u kombinaciji s jednom ili više drugih realizacija, u jednoj realizaciji ovog pronalaska metod lečenja dodatno obuhvata primenu vakcine da se izazove imunološki odgovora protiv tetanus toksoida najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 ili više nedelja pre primene konjugata. Poželjno, vakcina je TTd.

Poželjno, subjekt koji poseduje antitela protiv tetanus toksina ili tetanus toksoida je imunizovan s tetanus toksiodom, imao je post-ekspozicijsku profilaksu za tetanus i/ili je bolovao od tetanusa.

Alternativno , ili u kombinaciji s drugim realizacijama ovog pronalaska, metod za tretiranje karcinoma prema ovom pronalasku može dodatno da uključuje druge metode tretmana. Primeri drugih metoda tretmana, koji mogu da s ekombinuju s metodom lečenja prema ovom pronalasku su na primer hemoterapija, radioterapija (takođe poznato kao radioterapija, rendgenska terapija, ozračivanje) i/ili hirurški zahvat. Kvalifikovane osobe u ovoj tehnici, što je obično lekar, znaju koje su metode tretiranja podesne u specifičnim situacijama.

U ovom dokumentu i njegovim zahtevima, glagol "obuhvata" i njegove konjugacije koriste se u neograničavajućem smislu da se označi da su stavke koje slede glagol uključene, ali stavke koje nisu specifično pomenute nisu isključene. Pored toga, referenca na neki element neodređenim članom "a" ili "an" (u srpskom prevodu »neki«, op. prev.) ne isključuje mogućnost daje prisutno više elemenata, osim ako kontekst jasno zahteva da to može biti jedan i samo jedan element. Neodređeni član "a" ili "an" zato obično znači "barem jedan".

Primeri koji slede su dani samo kao ilustracija, te ni na koji način nisu namenjeni za ograničavanje obima pronalaska.

Opis slika

Slika 6. Sintetička šema za sintezu ključnog jedinjenja 26.

Slika 7. Sintetička šema za sintezu konstrukta 33.

Slika 8. Dekonvoluisani maseni spektar konstrukta 33, MWcaic = 13 153.1, MW0bs = 13 154.0.

Slika 9. Protočna (flow) citometrija drenažnih limfnih čvorova za SIINFEKL-specifične CD8<+>T-stanice, koristeći i SIINFEKL-tetramere (levi panel) i analizu SIINFEKL- specifične citokinske sekrecije (desni panel). Limfni čvorovi su bili iz miševa koji su vakcinisani sa konstruktom 33 sa (+AB) ili bez njega (-AB) intravenozno sa TTE specifičnim antitelima ili iz netretiranih miševa (naivni).

Primeri

1. Materijali i metode

1. 1. Opšti postupak sinteze peptida

Sinteza peptida izvršena je na višestrukom sintisajzeru (Syro II, MultiSyntech). Prethodno unesene Tentagel S Ac smola (Rapp Polvmere) koje nosi odgovarajuću zaštićenu Fmoc aminokiselinu (10 umol) je isprana sa NMP (3 x 0,8 ml) i tretirana s 20% piridinom u NMP (3x3 min, 0,8 ml). Smola je isprana sa NMP (6 x 0,8 ml). Smoli je dodana Fmoc-aminokiselina (6 ekv., 0,6 M u NMP), PyBOP (6 ekv., 0.67 M u NMP) i NMM (12 ekv., 33% rastvor u NMP). Reakcija vezanja trajala je 90 min uz povremeno potresivanje, a na kraju vezivanja smola je isprana sa NMP (6x0,8 ml). Smola je tretirana 2.5 časova sa 1 ml TFA koji sadrži 5% vode. U slučaju kad je W prisutna u peptidu, takođe je u smešu za cepanje dodan 5% merkaptoetan. U slučaju kad je C prisutna u peptidu, koktel za cepanje tretiranje sa dve kapi trietilsilana pre taloženja. Peptid je staložen sa 9 ml eter/pentan 1/1 (v/v) i izolovan centrifugiranjem. Precipitat je izolovan, rastvoren u vodi ili smeši voda/sirćetna kiselina i liofilizovan da se dobije bela čvrsta supstanca. Čistoća peptida proverena je sa LC-MS (Acquity, Waters) i molekulska masa je određena na Vovager DE-Pro (Perseptive Biosvstems).

1. 2. Tettox ELISA protokol

Streptavidin presvučene ploče sa 96 bunarića (Euro-Diagnostica) su blokirane sa PBS koji sadrži 5% BSA (200 ul/bunarić, 1 h, sobna temperatura). Ploče su su isprane tri puta sa PBS koja sadrži 0,05% Tween20. Prevlaka od biotinilovanih peptida je dobijena 1 h inkubacijom na sobnoj temperaturi sa 100 ul/bunarić 2 ng/ml rastvora biotinilovanog peptida u PBS koji sadrži 1% BSA. Ploče su bile isprane tri puta sa PBS koja sadrži 0,05% Tween20. Bunarići su bili inkubirani 1 h na sobnoj temperaturi sa svakom 100 ul Tetaquin koji je bio razblažen 800 x PBS koji sadrži 1% BSA ili sa 100 ul humanog seruma koji je bio razblažen 100xPBS koji sadrži 1% BSA. Ploče su bile isprane tri puta sa PBS koja sadrži 0,05% Tween20. Svaki bunarić je inkubiran 1 h na sobnoj temperaturi HRP-konjugovanim IgG antitelom (mišji anti-humani IgG-HRP monoklonalni, klon Gl 8-145, kat. br. 555788, Becton Dickinson, 100 ul/bunarić 1000 x razblaživanje u PBS koja sadrži 0,05% Tween20). Ploče su bile isprane tri puta sa PBS koja sadrži 0,05% Tween20. Razvijanje je izvedeno sa 2,2'-azino-di-(3-etilbenztiazolin sulfonskom kiselinom), ABTS + H2O21/1000, 100 ul/bunarić. Optička gustina je merena na 415 nm sa uređajem BIO-RAD, model 680, čitač mikroploča.

1. 3. Sinteza oglednog konjugata

U ovom primeru opisana je sinteza konstrukta koji sadrži tri kopije TT-epitopa ijednu kopiju ovalbuminskog epitopa. Sistem je razvijen na takav način da vezivanje TT- i OVA-epitopa može da se izvrši na sobnoj temperaturi i bez jona bakra. Prvo, tri kopije TT-epitopa koji su proširene sa separatorom za odvajanje i cisteinske rezidue su vezane na jezgro jedinjenja 26. U drugom stepenu neki OVA epitop koji je proširen sa separatorom za odvajanje i neka azidna grupa su povezani da se dobije konstrukt 33.

Sasvim je jasno onome s iskustvom u ovoj tehnici daje ovo samo jedan primer sinteze konstrukta prema ovom pronalasku, pa ovaj primer nije ograničavajući za ovaj pronalazak.

1. 3. 1. Sinteza jedinjenja 26

Vidi sliku 6 za sintetičku šemu za sintezu ključnog jedinjenja 26.

2,2-bis-bromometan-3-(tritiloksi)propan-l-ol (16): Komercijalno dostupan dibromid 15 (131 g, 500 mmol) rastvoren je u piridinu (1000 ml) i dodan je tritilhlorid (69.7 g, 250

mmol), pa je smeša mešana preko noći. Posle koncentrovanjain vacuorezidue su sakupljene u EtOAc i isprane s H2O, organski sloj je je osušen iznad MgSCMi koncentrovanin vacuo.Hromatografija na koloni (PE-Tol-EA 50-50-0 —► 0-99-1) dala je naslovno jedinjenje kao slabo žućkasto ulje (116 g, 93%).(RrPE-EA 70-30 = 0.78)

2,2-bis-bromometan-l-ftalimido-3-(tritiloksi)propan(17): Jedinjenje 16 (116 g, 32 mmol) je ispareno, rastvoreno u THF (1160 ml) i degazirano argonom u trajanju 30 min. PPI13(76 g, 290 mmol) i ftalimid (42.6 g, 290 mmol) su dodani u atmosferi argona . Kada je rastvorena sva čvrsta supstanca dodan je dokapavanjem DEAD (133 ml, 290 mmol). Smeša je mešana preko noći i koncentriranain vacuo.Preostale rezidue su sakupljene u toluenu i nusproizvod je kristalizovao stajanjem na -20 °C preko noći. Matična tečnost je koncentriranain vacuoi sakupljena u Et20 pa je drugi nusproizvod kristalizovao na -20 °C preko noći. Matična tečnost je koncentriranain vacuo.Hromatografija na koloni (Tol-EA 100-0 —> 98-2) dala je naslovno jedinjenje kao slabo žućkasto ulje (76.6 g, 52% i 80 g nečistog proizvoda).( Rr.PE-EA 80-20 = 0.53), 'H NMR (400 MHz, CDCb): 8 = 3.35 (s, 2H, CH2CH2OTr), 3.57 (d, 2H,J=10.8 Hz, CH2CH2Br), 3.66 (d, 2H,J=10.8 Hz, CH2CH2Br), 3.95 (s, 2H, CH2CH2NPhth), 7.22-7.31 (m, 9H, H arom), 7.24-7.44 (m, 6H, H arom), 7.71-7.73 (m, 2H, H arom), 7.83-7.86 (m, 2H, H arom).<13>C NMR (100 MHz, CDCb): 8 = 37.2 (CH2CH2Br), 41.3 (CH2CH2NPhth), 43.8 (Cq CC4H8), 64.9 (CH2CH2OTr), 87.3 (Cq OTr), 123.4 (CH arom), 127.2 (CH arom), 127.9 (CH arom), 128.2 (CH arom), 128.8 (CH arom), 131.9 (Cq arom), 134.1 (CH arom), 143.2 (Cq arom), 168.7 (C=0 Phth).

2,2-bis-azidometan-l-ftalimido-3-(tritiloksi)-propan(18): Jedinjenje 17 (76.6 g, 121 mmol) rastvoreno je u DMF (1000 ml). Ovom rastvoru dodani su NaN3(39 g, 600 mmol) i LiCl (kat). Smeša je grejana pod refluksom 6 časova i koncentriranain vacuo.Rezidue su sakupljene u EtOAc i isprane s H20, organski sloj je osušen iznad MgS04i koncentrovanin vacuo(66.1 g, 98%).( Rr.PE-EA 80-20 = 0.57), 'H NMR (400 MHz, CDCb): 8 = 3.13 (s, 2H, CH2CH2OTr), 3.46 (d, 2H,J =12.4 Hz, CH2CH2N3), 3.51 (d, 2H,J=12.4 Hz, CH2CH2N3), 3.76 (s, 2H, CH2CH2NPhfh), 7.22-7.79 (m, 19H, H arom).<13>C NMR (100 MHz, CDCb): 8 = 40.2 (CH2CH2NPhth), 44.4 (Cq CC4H>0, 52.9 (CH2CH2N3), 63.4 (CH2CH2OTr), 86.9 (Cq OTr), 123.2 (CH arom), 127.2 (CH arom), 127.9 (CH arom), 128.2 (CH arom), 128.8 (CH arom), 131.9 (Cq arom), 134.1 (CH arom), 143.3 (Cq arom), 168.5 (C=0 Phth).

l-amino-2,2-bis-azidometan-3-(tritiloksi)-propan (19): Jedinjenje 18 (50.1 g, 90 mmol) je sakupljeno u suvom EtOH (450 ml) pa je dodan hidrazin (6.55 ml, 135 mmol) u atmosferi argona. Reakcijska smeša mešana je tokom 3 dana (pri čemu se obrazovala čvrsta supstanca) sve dok TLC analize nisu pokazale potpunu konverziju polaznog materijala u nižu razvijenu mrlju. Čvrsta supstanca je filtrirana i isprana dva puta s hladnim EtOH, pa su kombinovani organski slojevi koncentrovaniin vacuo.Hromatografija na koloni (PE-EA 75-25 —> 25-75) dala je naslovno jedinjenje kao bezbojno ulje (24.8 g, 64%).(RrDCM-MeOH 95-5 = 0.44), 'H NMR (400 MHz, CDCb): 5 = 2.62 (s, 2H, CH2CH2NH2), 2.99 (s, 2H, CH2CH2OTr), 3.38 (s, 4H, CH2CH2N3), 7.13-7.43 (m, 15H, H arom).<13>C NMR (100 MHz, CDCb): 5 = 42.1 (CH2CH2NH2), 44.6 (Cq CC4H8), 52.1 (CH2CH2N3), 61.4 (CH2CH2OTr), 86.5 (Cq OTr), 126.9(CH arom), 127.2(CH arom), 128.2(CH arom), 143.4(Cq arom).l-^r/-butoksikarbonilamino>-2,2-di-(if^-butoksikarbonilamino)metil-propan-3-ol (20): Jedinjenje 19 (24.8, 58 mmol) rastvoreno je u THF (580 ml), pa su zatim dodani H2O (29 ml) i PPh3(33.3 g, 127.6 mmol). Smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi pa grejana na 50 °C daljnjih 6 časova( Rr.EtOHMSuOHH20 AcOH: 4-2-2-1 = 0.42). Reakcijska smeša je koncentriranain vacuoi sakupljena u H20 (580 ml) pa filtrirana. Vodenom rastvoru dodana je 37% HC1 (29 ml, 348 mmol) i mešano je 3 dana( Rr.EtOHM3uOHH20 AcOH: 4-2-2-1 = 0.05). Reakcijska smeša je koncentriranain vacuoi isparena 3 puta s H2O da se ukloni većina HC1. Rezidue su sakupljene u H2O i isprane s DCM. Vodeni sloj je koncentrovanin vacuo.Rezidue su sakupljene u H2O (220 ml) i ACN (220 ml) pa je ovom rastvoru dodan NaOH (3 molarni rastvor u H2O) sve do pH 7. Zatim su dodani NaOH (60 ml, 176 mmol, 3 molarni rastvor u H2O) i B0C2O (38.4 g, 176 mmol) i smeša je mešana preko noći. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ispran 2 puta sa EtOAc. Organski slojevi su kombinovani, osušeni iznad MgS04i koncentriraniin vacuo.Kristalizacija iz PE/EtOAc dala je naslovno jedinjenje kao belu čvrstu supstancu (12.9 g, 51%).( Rr.PE-EA 80-20 = 0.53), 'H NMR (400 MHz, CDCb): 8 = 1.45 (s, 27H, CH3Boe), 2.82 (d, 6H,J=6.8 Hz, CH2CH2NH), 3.13 (d, 2H,J =4.4 Hz, CH2CH2OH), 4.32 (t, IH,J= 4.4 Hz, OH), 5.78 (t, 3H,J= 6.4 Hz, NH).<13>C NMR (100 MHz, CDCb): 8 = 28.3 (CH3Boe), 39.0 (CH2CH2NH), 46.1 (Cq CC4H8), 60.3 (CH2CH2OH), 79.7 (Cq Boe), 157.8 (C=0 Boe). l-^r/-butoksikarbonilamino)-2,2-di-(if^-butoksikarbonilamino)metil-3-propanska kiselina (21): Jedinjenje 20 (12.2 g, 28 mmol) suspendovano je u EtOAc (280 ml), MeCN (280 ml) i H2O (280 ml). Ovoj suspenziji dodan je NaI04(24.1 g, 113 mmol) i katalitička količina RuCb koji je promenio boju iz crne u naranđastu. Kada je suspenzija postala providna TLC analiza pokazala je kompletnu konverziju u donju razvijenu mrlju, organski sloj je odvojen i vodeni sloj je ispran s EtOAc. Kombinovanim organskim slojevima dodan je EDTA (104 g, 280 mmol) i mešano je preko noći. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je ispran s Na2S203. Organski sloj je osušen iznad MgS04i tokom koncentriranja došlo je do kristalizacije što je dalo naslovno jedinjenje kao belu čvrstu supstancu (8.77 g, 70%).( Rr.PE-EA-AcOH 50-50-3kapi = 0.77), 'H NMR (400 MHz, CDCb): 5 = 1.43 (s, 27H, CH3Boe), 3.25 (d, 6H,J=6.0 Hz, CH2CH2NH), 5.78 (bs, 3H, NH), 9.59 (vbs, IH, COOH).13CNMR (100 MHz, CDCb): 8 = 28.3 (CH3Boe), 40.31 (CH2CH2NH), 53.0 (Cq CC4H8), 79.8 (CqBoc), 157.0 (C=0 Boe), 176.5 (C=0 COOH).

Boe zaštićena tri-amino-2,2-dimetil propanska kiselina s amino PEG-separatorom (22): Rastvoru jedinjenja 21 (0.447g, 1.0 mmol) u DCM (20 ml) i Et3N (0.21 ml, 1.5 mmol) pod atmosferom argona dodan je HATU (0.380 g, 1.5 mmol), reakcijska smeša je mešana tokom 15 min pa je dodan 2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]etan-l-amin (1.46 ml, 10 mmol). Posle mešanja preko noći smeša je isprana s H2O i organski sloj je osušen iznad MgS04pa koncentriranin vacuo.Hromatografija na koloni (DCM /MeOH 100-0 —» 90-10) dala je naslovno jedinjenje kao bezbojno ulje (0.293g, 51%).( Rr.DCM-MeOH 90-10 = 0.15), 'H NMR (400 MHz, CDCb): 8 = 1.44 (s, 27H, CH3Boe), 2.91 (t, 2H,J=4.8 Hz, CH2peg), 3.23 (d, 6H,J=6.4 Hz, CH2scaffold), 3.40 (m, 2H, CH2peg), 3.46 (bs, 2H, NH2), 3.56 (t, 4H,J =5.2 Hz, peg), 3.63 (bs, 4H, peg), 5.88 (bs, 3H, NH Boe), 7.33 (bs, IH, NH peg amid);<13>C NMR (100 MHz, CDCb): 8 = 28.2 (CH3Boe), 39.1 (CH2peg), 41.1 (CH2scaffold), 52.2 (Cq CC4H8), 69.3 (2xCH2peg), 70.0 (CH2peg), 70.1(CH2peg), 72.1 (CH2peg), 79.6 (Cq Boe), 157.0 (C=0 Boe), 172.6 (C=0 peg amid).

Boe zaštićena tri-amino-2,2-dimetil propanska kiselina s difenilciklooktin PEG separatorom (24): Rastvoru jedinjenja 22 (0.383 g, 0.662 mmol) u DMF (13 ml) i Et3N (0.27 ml, 1.98 mmol) pod atmosferom argona dodano je jedinjenje 23 (0.267 g, 0.695 mmol). Posle mešanja preko noći smeša je koncentriranain vacuo.Veličinska ekskluziona hromatografija (LH20 MeOH/-DCM 1-1) i naknadna hromatografija na koloni (DCM / MeOH 100-0 -»■ 99-1) dali su naslovno jedinjenje kao bezbojno ulje (0.125 g, 33%).( Rr.DCM-MeOH 90-10 = 0.9); 'H NMR (400 MHz, CDCb): 8 = 1.44 (s, 27H, CH3Boe), 2.89 (m, IH, CH2oktin), 3.17 (d, IH,J=13.6 Hz, CH2oktin), 3.23-3.25 (d, 6H,J=6.8 Hz, CH2skela), 3.40-3.45 (m, 4H, CH2peg), 3.58-3.60 (m, 4H, CH2peg), 3.65 (bs, 4H, CH2peg), 5.50 (bs, IH, CH oktin), 5.50 (bs, 3H, NH Boe), 5.81 (bs, IH, NH karbamat), 7.27-7.37 (m, 8H, Harom), 7.52 (d, IH,J=7.6 Hz, NH peg amid);<13>C NMR (100 MHz, CDCb): 8 = 28.3 (CH3Boe), 39.1 (CH2peg), 40.9 (CH2peg), 41.1 (CH2CC4H8), 46.0 (CH2oktin), 52.2 (Cq CC4H8), 69.21 (CH2peg), 69.9 (2xCH2peg), 70.0 (CH2peg), 70.3(CH2peg), 76.6 (CH oktin), 79.8 (Cq Boe), 109.9 (Cq arom), 112.8 (Cq Arom), 121.2 (Cq arom), 123.7-129.8 (CH arom), 151.1, 152.2, 155.5, 157.0 (C=0 Boe), 172.6 (C=0 peg amid).

Linker maleimid propionil funkcionalizovane tri-amino-2,2-dimetil propanske kiseline s difenilciklooktin PEG separatorom (26): Jedinjenje 24 (38 mg, 0.047 mmol) rastvoreno je na 0 °C pod argonom u 4M HC1 u dioksanu (0.47 ml, 1.88 mmol). Smeša je postavljena da se zagreje do sobne temperature. Posle LCMS analize (LCMS: 1090: 13.5 min,Rr6.52 min) pokazala se kompletna konverzija u tri-amin (6 h) pa je smeša ubačena u Et20 na 0 °C i posle toga centrifugirana. Et20 je dekantiran i rezidue su sakupljene u DCM (0.1M). Ovoj suspenziji dodan je OSu ester maleimid propanske kiseline 25 (0.05 g, 0.188 mmol) i Et3N (19 ul, 0.188 mmol). LCMS analiza je posle toga (LCMS: 1090: 13.5 min,Rr.7.56 min) pokazala završetak reakcije i smeša je direktno prečišćena hromatografijom na koloni (DCM / MeOH 100-0 -»■ 96-3) što je dalo naslovno jedinjenje kao žuto ulje (0.0124 g, 27%).(RrDCM-MeOH 90-10 = 0.4); 'H NMR (400 MHz, CDCb): 8 = 1.26 (bs, 6H), 2.54 (bs, 6H), 3.19-3.45 (m, 6H), 3.58-3.82 (m, 14H), 5.47 (s, IH), 6.71 (s, 6H), 7.29 (s, 8H);<n>C NMR (100 MHz, CDCb): 8 = 29.6, 34.2, 34.8, 39.2, 39.7, 40.9, 46.1, 50.9, 53.4, 69.0, 69.9, 70.17, 76.6, 109.8, 112.8, 121.2, 123.7, 125.8, 126.1, 126.9, 127.6, 127.8, 128.0, 129.9, 134.2, 150.9, 155.5, 170.4, 171.7, 172.2.

1. 3. 2. Sinteza konstrukta 33

Vidi sliku 7 za sintetičku šemu sinteze konstrukta 33.

F-I-G-I-T-E-L-K-K-L-E-S-K-I-N-K-V-F-A-A-K-Y-A-R-V-R-A-K-C (TTE-SH) (30)

(SEKV ID NO: 217)

Peptid 30 sintetizovan je pomoću peptidne sinteze na čvrstoj fazi na Tentagel S Ac smoli (Rapp, Tubingen). Normalno vezanje (1,5 h) izvršeno je koristeći Fmoc aminokiseline koje nose kisele nestabilne bočne zaštićene lance (kada je potrebno). Aktivacija je izvedena sa PyBop i NMM. Fmoc uklanjanje zaštite je izvedeno sa 20 vol % piperidinom u NMP. Ispiranja su izvršena sa NMP. Odvajanje od smole i uklanjanje zaštite bočnih lanaca izvršeno je sa TFA koja sadrži 5% vode i 2% trietilsilan. Prečišćavanje je izveden sa rpHPLC. Analiza pročišćenog peptida izvedena je sa UPLC-MS (Acquity, Waters).

Azidoheksanoil-L-E-Q-L-E-S-I-I-N-F-E-K-L-A-A-A-A-A-K (OVAE) (31) (SEKV ID NO: 217)

Peptid 31 sintetizovan je slično kao peptid 30. Azidoheksanoil grupa je uvedena koristeći vezivanje sa azidoheksanskomkiselinom/PyBop/NMM. Odvajanje od smole i uklanjanje zaštite bočnih lanaca izvršeno je sa TFA koja sadrži 5% vode.

Konstrukt 33

TTE peptid 30 (4.8 mg, 1.44 umol) rastvoren je u degaziranoj EbO (800 ul, milipor) u argon atmosferi, pa je pH postavljen na 6 dodavanjem NaHC03(0.5 M, 20 ul, degazirano). Tome je dodan rastvor 26 (0.234 mg, 0.24 umol) u MeCN (23 ul). Ova smeša je mešana 3 časa posle čega je masena spektrometrija (QTof) pokazala kompletnu konverziju jedinjenja 26 u 32. Uz to, opaženi su TTE-SH i srodni disulfid TTE-S-S-ETT, što je posledica viška TTE-SH koji je korišćen. Ovoj smeši dodan je peptid OVAE (31, 0.63 mg, 0.289 umol) u DMSO (400 ul, milipor). U toku 1 časa jedinjenje 32 je prevedeno ujedinjenje 33 što je pokazala masena spektrometrija (Qtof). Smeša je prečišćena pomoću HPLC što je dalo 2.7 mg, 0.20 umol, 83 %. Proizvod je analizovan pomoću masene spektrometrije i opažena je očekivana masa (vidi sliku 8 za dekonvoluisani maseni spektar, MWcaic = 13,153.1, MW0bs = 13,154.0).

2. Rezultati

2. 1. Sistemski antigen- specifičniprajming T ćelija kod miševa

Miševi su bili više puta imunizovani sa TNP-BSA što je rezultiralo visokim titrom cirkulirajućih antitela protiv hapten TNP (TNP imunizovani) ili ostalih neimunizovanih (naivna). Nakon 1-2 meseca svim miševima su injicirane naivne OVA-specifične CD8 T ćelije koje su bile obeležene fluorescentnom bojom CFSE. Nakon 24 časova miševi su injicirani sa jednom dozom TNP-OVA. Tri dana kasnije miševi su žrtvovani i analizovana je OVA-specifična proliferacija obeleženih T ćelija u slezini i limfnim čvorovima pomoću protočne (fiow) citometrije (slika 2). Simboli predstavljaju pojedinačne miševe. Statistička analiza pokazuje da se anti-TNP antitelima upravljana OVA-specifična proliferacija T ćelija znatno razlikuje od ostalih grupa: P < 0.001. Znači, sistemski prajming antigen-specifičnih T ćelija može da se pojača preegzistirajućim cirkulirajućim antitelima protiv hapten-epitopa.

2. 2. Sintetizovanje TTx preklapajućih peptida

S obzirom da ljudi nemaju cirkulirajuća antitela protiv TNP i budući da nije poželjno da se ljudi imunizuju da bi se dobila cirkulirajuća anti-TNP antitela, ovi pronalazači su izabrali patogene protiv koje većina ljudi imaju cirkulirajuća antitela. Ovi pronalazači sintetizovali su TTx alfa i beta lanac preklapanjem peptida (22 aminokiseline dužine, preklapanje 10 aminokiselina). Za ovu studiju 109 peptida je dobijeno pomoću sinteze u čvrstoj fazi. Peptidi su sintetizovani sa C-terminalnim Lvs(biotinom) koje jevezan s peptid pomoću Ahx separatora (regulatora razmaka) (aminohehsanska kiselina). Ovi biotin peptidi mogu biti vezani na streptavidin ELISA ploče za analizu. Peptidi su skenirani u ELISA-i za vezujuća antitela u Tetaquin-u. Tetaquin je smeša antitela na velikom panelu davalaca krvi koji imaju visoke titre anti-TTd antitela. TetaQuin postoji za 90% humanih IgG (100-180 mg/ml) i može da se nabavi od Sanquin (Amsterdam, Holandija). Elisa-e su izvršene u kojima su biotinilovani peptidi pojedinačno dodani na streptavidin-presvučene Elisa ploče. Za svaki peptid ispitan je niz koncentracija TetaQuin-a obzirom na vezanje. Na ovaj način određeni su peptidi s najboljim vezanjem. Rezultati su izraženi kao OD za ELISA-u. To nije apsolutni broj, već je namenjeno samo za diskriminaciju između različitih peptida u jednom testu. Iskusna osoba je svesna da vrednosti OD mogu da variraju između različitih testova.

2. 3. Skrining rezultati za alfa- lanac i beta- lanac peptida

22-merni peptidi iz TTx a-lanca testirani su za Tettox ELISA (slika 3). p31 (= a31) je identifikovan da ima dobro vezanje za TetaQuin ®. 22-merni peptidi iz TTx |3-lanca testirani su u analizi Tettox ELISA (slika 4). pl8, p32, p41, p48, p54 i p55 (= pl8 , |332, (341, p48, p54 i P55) su identifikovani da imaju dobro vezanje za TetaQuin®.

Zaključak : u Tetaquin-u su prisutna antitela <x31, (318,P32, |341, (348,P54,P55.

2. 4. Skrining rezultata za a31, fil8, fi32, 041, fi48, fi54, j} 55 na pojedinačnim serumima

Posle toga, pronalazači su testirali ovih 7 peptida na pojedinačne serume, jer je potreban neki apitop za kojega će svaka osoba da stvara antitela. Rezultati su prikazani na slici 5. Svi donori poseduju antitela protiv isključivo peptida 32 beta lanca.

2. 5. Optimizacija minimalnog peptida koji je potreban za vezanje

Ovaj peptid je optimizovan za vezanje da bi se identifikovali najkraći peptidi s dobrim vezanjem sa TetaQuin® (vidi Tabelu 2). Dužinske varijante peptida p32 su testirane da se utvrdi koji deo peptida je od suštinskog značaja za Ab-vezivanje i koji deo može biti izostavljen. Stoje veći OD to je bolje vezanje peptida od strane TetaQuin®. Zaključak: najkraći peptid koji vezuje za TetaQuin® sastoji se od 10 aminokiselinskih rezidua. Nadalje, peptid može da se skrati na N-terminalnoj strani. Najbolji rezultati se dobijaju sa 22-merom.

2. 6. Dodatno deflnisanje optimalnog peptida

Testirano je više dužinskih varijanti (prikazano u tabeli 3).

Zaključak: Peptid treba da započne sa FIGIT i 18-merom dok drugi F nije najbolji. Ovde su pronalazači takođe testirali da li formilacija jednog ili više lizina u peptidu poboljšava vezivanje. Ovo ne izgleda daje tako. To bi moglo da bude od značaja jer je TTx formilirana forma tetanus toksina.

Prema tome, pronalazači su testirali neke druge dužinske varijante te ispitali da li C-terminalne aminokiselinske rezidue mogu da se zamene nekim duljim separatorom. Sem toga, testirano je dolazi li do neke razlike ako je biotinilovan N-terminal ili C-terminal ili je najbolje da je jedan od njih slobodan. Vidi tabelu 4.

Zaključak: C-terminalne aminokiselinske rezidue su po mogućstvu ne zamjenjuju samo sa duljim separatorom. Peptidi najbolje funkcionišu kada je C-terminal vezan, a N-terminal je slobodan. Ovo je važno za dizajn vakcine.

2.7. Ala- sken i sken konzervativnih supstitucija

Peptidi (FIGITELKKLESKINKVF) su testirani sa jednom Ala-supstitucijom (Tabela 5) ili sa jednim konzervativnom supstitucijom (Tabela 6). Ovo je urađeno da se dobije neki osećaj o relativnoj važnosti svake aminokiseline. Pozicije 3-5 i 11 čini se da su malo važnije od nekih drugih pozicija. Nijedan poboljšani peptid nije pronađen.

Poznato je da akumulacija (uptake) antitela od strane imunosnih ćelija preko Fc receptora može da se unapredi unakrsnim povezivanjem antitela. Dakle, generišu se multimeri gore definisanih peptida i poredi se efikasnost multimera prema monomerima. Ovo poređenje vrši se pomoću CTL- i pomoćnih (helper) epitopa HPV16E7 i ovalbumina (OVA) zain vitroiin vivotestiranje (vidi niže). Pored toga, neki od gore navedenih konstrukta su sintetizovani u fluorescentnoj formi da bi mogla da se istraži akumulacija konstrukata za različite tipove ćelija, uključujući dendritske ćelije (DC).

2. 8. Validacija rezultata s konstruktima kod miševa ( in vivo)

Miševi su u više navrata, više puta vakcinisani sa TTd da se indukuju visoki titri antitela protiv TTd (određeno pomoću ELISA). Posle toga, ovi miševi su podraženi sa jednom dozom jednog od gore navedenih peptida koji su vezani za OVA.

Životinje su praćene obzirom na:

• Efikasni prajming T ćelija pomoću CFSE obeleženih TCR transgenih T ćelija i kvantifikaciju broja specifičnih CD8 T ćelija kod miševa divljeg tipa korišćenjem specifičnih MHC klasa I tetramera. • Zaštitu i terapeutsku snagu konstrukata u odnosu na tumore (OVA-ekspresirajuće tumorske ćelije B16-OVA)

Budući daje repertoar B ćelija kod miševa protiv stranih antigena vrlo velik, može se očekivati daje odgovor antitela protiv linearnih TTd epitopa kod miševa vrlo sličan onome kod čoveka. U slučaju da su odgovori kod miševa znatno drugačiji od onog kod čoveka, što će biti jasno iz studija vakcinacijom miševa, Medarex miševi će se koristiti za ekspresiju nekog humanizovanog Ig lokus sistema B-ćelija. Alternativno , ovi miševi (koji su tolerantni za humana antitela) mogu da se koriste za testiranje konstrukata prethodnim unošenjem ovih dobro definisanih antitela koja su kliničkog razreda (TetaQuin). Ovi prethodno formirani kompleksi će se ubrizgati posle čega sledi prajming analiza T ćelija. U ovom sistemu mišji Fc receptori smatraju se kompatibilnim s humanim antitelo-antigen kompleksima.

2. 9. Validacija rezultata s konstruktima na humanom DC in vitro

Gore definisani peptidi su testirali na njihovu funkcionalnost u humanom sistemu na humane monocit-izvedene dendritske ćelije (MoDC)in vitro.Peptid-konstrukti se inkubiraju sa titrovanim količinama anti-TTd antitela (Tetaquin) i formirani kompleksi gajeni su zajedno sa MoDC te su provedene studije antigen prezentacije i DC sazrevanja.

Peptid-peptid konstrukti se sastoje od HPV izvedenih peptidnih sekvenci koje nose dobro definisane HLA-A2 ili neke HLA-DR3 ograničene epitope za testiranje prepoznavanja od strane HPV specifičnih CD8 T ćelija, odnosno CD-4 T ćelija.

DC sazrevanje je testirano bojenjem sa specifičnim antitelima protiv DC maturacijskih markera CD80, CD86, CD40, MHC klasa II i MHC klasa I pomoću FACScan analize.

2.10. Vakcinacija miševa s konstruktom 33 sa primenom ili bez prethodne primene specifičnih antitela

Da bi se odredili poboljšani prajming kapaciteti konstrukta 33 u prisustvu TTE specifičnih antitelain vivo,vakcinisali smo miševe sa suboptimalnom dozom konstrukta 33 supkutano u fiziološkom rastvoru. Jedna grupa miševa injicirana je intravenozno sa TTE specifičnim antitelima (ProtG pročišćena zečja anti TTE antitela) 4 sata pre vakcinacije sa konstruktom 33. Sedam dana nakon vakcinacije, miševi su žrtvovani i drenažni limfni čvor analiziran protočnom (flow) citometrijom na SIINFEKL-specifične CD8<+>T-stanice, koristeći SUNFEKL-tetramere (slika 9, levi panel), te analizom SIINFEKL specifične citokinske sekrecije (slika 9, desni panel). Kao što je prikazano na slici 9, veći procenat SIINFEKL specifičnih CD8<+>T-ćelija je prisutan kod miševa koji su primili TTE-specifična antitela i konstrukt 33, za razliku od miševa koji su primili samo konstrukt 33, što označava superiorni prajming kapacitet konstrukta 33 u prisustvu TTE-specifičnih antitela.

Claims (15)

1. Konjugat,naznačen timešto sadrži peptid koji je konjugovan za neki antigen, imunogen ili neki nosač koji sadrži neki antigen ili imunogen, pri čemu se peptid sastoji od aminokiselinske sekvence bilo kojeg od sledećih SEKV ID NO: 8, 9, 12, 13, 16, 17, 19-24, 151-158,163-166, 168, 172-176, 179-182, 185-197, 198-208 i 210-216, gde antigen, imunogen ili nosač sadrži antigen ili imunogen koji je konjugovan za C-terminal peptida.

2. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačentimešto se peptid sastoji od aminokiselinske sekvence koja je definisana u bilo kojem od SEKV ID NO: 12, 13, 16, 17 i 19-24.

3. Konjugat prema zahtevu 2, naznačentimešto se peptid sastoji od aminokiselinske sekvence koja je definisana u SEKV ID NO: 24.

4. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1-3,naznačen timešto su od 2 do 20 peptida vezani za antigen, imunogen ili nosač koji sadrži antigen ili imunogen.

5. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1-4,naznačen timešto su antigen ili imunogen neki tumorski antigen ili tumorski imunogen, ili neki patogeni antigen ili patogeni imunogen.

6. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1-5,naznačen timešto se koristi kao lek.

7. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1-5, naznačen time što se koristi za prevenciju ili tretman karcinoma ili neke zarazne bolesti subjekta.

8. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1-5,naznačentime što se koristi za proizvodnju leka za prevenciju ili tretman karcinoma ili neke zarazne bolesti subjekta.

9. Konjugat prema zahtevu 7 ili primena prema zahtevu 8,naznačeni timešto subjekt poseduje antitela protiv tetanus toksina ili tetanus toksoida.

10. Konjugat prema zahtevu 7 ili njegova upotreba prema zahtevu 8,naznačeni timešto je subjektu neka vakcina za generisanje cirkulirajućih antitela za tetanus toksin primenjena bar 2 nedelje pre nego što je primenjen konjugat.

11. Konjugat prema zahtevu 7 ili njegova upotreba prema zahtevu 8, naznačeni time što je navedena zarazna bolest virusna, bakterisjka, gljivična ili parazitska bolest.

12. Konjugat prema zahtevu 7 ili njegova upotreba prema zahtevu 8, naznačeni time što navedeni karcinom pripada grupi sledećih karcinoma: pluća, debelo crevo, jednjak, jajnik, pankreas, koža, želudac, glava i vrat, bešika, sarkom, prostata, hepatocelularni karcinom, mozak, nadbubrežna žlezda, dojke, endometrium, mezoteliom, bubreg, tiroideja, hematološki karcinom, karcinoid, melanom, paratoroideja, cerviks, neuroblastom, Wilms karcinom, testisi, hipofiza ili feohromocitom.

13. Peptid, naznačen time što se sastoji od aminokiselinske sekvence bilo kojeg od SEKV TD NO: 8, 9, 12, 13, 16, 17, 19-24, 151-158, 163-166, 168, 172-176, 179-182, 185-197, 198-208 i 210-216.

14. Peptid prema zahtevu 13, naznačen time što se sastoji od aminokiselinske sekvence kakva je definisana u u bilo kojem od SEKV ID NO: 12, 13, 16,17 i 19-24.

15. Peptid prema zahtevu 14, naznačen time što se sastoji od aminokiselinske sekvence kakva je definisana u SEKV ID NO: 24.