RS55772B1 - Stabilizacija fsh - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001]Ovaj pronalazak se odnosi uopšteno na oblast stabilizacije FSH formulacija, određenije tećnih FSH-formulacija. Stabilizacija se postiže dodavanjem Na2S04ili kombinacije NaCI i Na2S04.

POZADINA

[0002]Gonadotropini su familija hormona, koji su u suštini pre svega uključeni u ciklus plodnosti kod žena i muškaraca. Gonadotropini mogu da budu izvedeni iz urina, i radi istraživanja i u svrhe tretiranja, međutim nekoliko gonadotropina može se proizvesti rekombinantno.

[0003]Određenije, gonadotropini mogu da se koriste u tretiranju neplodnosti.

[0004]Četiri glavna gonadotropina koja su ovde uključena i od kojih svi pripadaju istoj familiji glikoproteina su folikulostimulišući hormon (FSH), tireostimulišući hormon (TSH), luteinizirajući hormon (LH) i horionski gonadotropin (hCG). Svi ovi gonadotropini sastoje se od alfa i beta subjedinica; pri čemu je alfa subjedinica zajednička za sve, tj. ista za sva četiri gore pomenuta gonadotropina, dok se beta subjedinica razlikuje, respektivno.

[0005]Kao što je prethodno navedeno, gonadotropini su grupa heterodimernih glikoproteinskih hormona koji regulišu funkciju gonada kod muškaraca i žena. Oni uključuju folikulostimulišući hormon (FSH), luteinizirajući hormon (LH), tireostimulišući hormon (TSH) i (humani) horionski gonadotropin (hCG).

[0006]FSH se prirodno izlučuje u prednjem režnju hipofize i funkcioniše tako što podržava folikularni razvoj i ovulaciju. FSH obuhvata alfa subjedinicu od 92 aminokiseline, što je uobičajeno i za druge glikoproteinske hormone, npr. LH i hCG, i beta subjedinicu od 111 aminokiselina jedinstvenu za FSH koja daje biološku specifičnost tog hormona (Pierce i Parsons, 1981, Glvcoprotein hormones: structure and function, Ann Rev Biochem., 50:465-495). Svaka subjedinica se posttranslaciono modifikuje dodavanjem otataka kompleksnih ugljenih hidrata. Obe subjedinice nose dva mesta za vezivanje N-vezanog glikana, i to alfa subjedinica na aminokiselinama 52 i 78 i beta subjedinica na aminokiselinskim ostacima 7 i 24 (Rathnam and Saxena, (1975) Primarv amino acid sequence of follicle stimulating hormone from human pituitarv glands. I. alpha subunit, J Biol Chem. 250 (17):6735-6746; Saxena and Rathnam, (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitarv glands, J Biol Chem. 251(4): 993-1005)). FSH je tako glikozilovan do oko 30mas.% (Dias and Van Roev, (2001) Structural biologv of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6): 510-519; Fox et al. (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 379-89).

[0007]FSH prečišćen iz postmenstrualnog humanog urina koristi se tokom mnogo godina u tretiranju neplodnosti; i za promovisanje ovulacije u prirodnoj reprodukciji i radi obezbeđivanja oocita za medicinski potpomognute oplodnje. Dve rekombinantne verzije FSH, Gonal-f (Merck Serono) i Puregon (Schering-Plough) postale su dostupne sredinom 1990-ih. Obe se eksprimiraju u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) (Hovvles, CM. (1996), genetic engineering of human FSH (Gonal-f), Hum Reprod. Update, 2:172-191). CG se često koristi u tretmanima neplodnosti zato što je ovo jedinjenje koje ima LH aktivnost.

[0008]I humani FSH i hCG su heterodimeri koji se sastoje od alfa i beta subjedinice. Alfa subjedinica u oba hormona je identična. Razlike između ta dva hormona dodeljene su beta subjedinicom. Matična beta subjedinica od FSH sastoji se od 111 aminokiselina, dok se ona od hCG sastoji od 145 aminokiselina, dodatno primarna aminokiselinska sekvenca od FSH i hCG beta subjedinice razlikuje se kroz ceo beta lanac. Beta lanac i FSH i hCG sadrži šest disulfidnih mostova, pri čemu se zbog njihove različite aminokiselinske sekvence oni, međutim, razlikuju u njihovoj strukturi višeg reda, što rezultuje različitim savijanjem i raspodelom naelektrisanih, polarnih i hidrofobnih regija (Fox et al. (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3),379-89).

[0009]lako su obe beta subjedinice od FSH i hCG glikozilovane, beta subjedinica od FSH sadrži samo N-glikolizaciju (N-7 i N-24) dok beta subjedinica od hCG sadrži i N- i O-glikozilaciju (N-13, N-30, 0-121, O-127, 0-132 i 0-138). Ekstra glikolizacija u beta subjedinici od hCG čini ga više hidrofilnim nego ona od FSH. Iš-subjedinice obezbeđuju specifičnost za interakciju receptora.

[0010]CHO ćelije obično se koriste za proizvodnju farmaceutskih rekombinantnih proteina. Strukturnom analizom identifikovano je daje sijalinska kiselina isključivo vezana a2,3-vezom. Mnogi humani glikoproteini sadrže mešavinu i a2,3- i a2,6-veza za ostatke sijalinske kiseline. Prema tome, rekombinantni proteini eksprimovani korišćenjem CHO sistema razlikovaće se od svojih prirodnih duplikata u njihovom tipu terminalnih veza sijalinske kiseline.

NEPLODNOST

[0011]U ovom kontekstu, "neplodnost" će biti definisana kao smanjena sposobnost ili nesposobnost da se začne dete i da se imaju potomci. Žene koje mogu da ostanu trudne ali kod kojih se javljaju ponovljeni pobačaji takođe se smatraju neplodnima. Neplodnost se takođe definiše u specifičnim uslovima kao neuspeh da se začne dete nakon godinu dana redovnog snošaja bez kontracepcije.

[0012]Do neplodnosti može doći iz raznih razloga. Ispitivanja su pokazala da je malo više od polovine slučajeva neplodnosti rezultat stanja žena.

[0013]Ostatak je uzrokovan poremećajima sperme i neobjašnjivim faktorima.

[0014]Trenutno postoji nekoliko mogućnosti za tretiranje neplodnosti.

[0015]To su snošaji u određeno vreme, upotreba medicinski potpomognute oplodnje (MPO), medicinsko upravljanje endometriozom, fibroidima i ženskom seksualnom disfunkcijom (FSD), i operacija radi ispravljanja abnormalnosti.

[0016]Kod medicinski potpomognute oplodnje, koriste se lekovi za stimulisanje ovulacije. Pored LH i hCG, FSH je jedno od onih jedinjenja koje se koristi u ovom kontekstu.

[0017]Za davanje pogodne su tečne formulacije ovih jedinjenja.

[0018]Na nesreću, u prošlosti se pokazalo da konzervansi dodati tečnim formulacijama, naročito benzil alkohol (BA), fenol i m-krezol, ispoljavju destabilizirajuće dejstvo na protein (Maa, Y.F. and Chung, C.H. 1996, Aggregation of recombinant human growth hormone induced by phenolic compounds. Int. J. Pharm. 140:155-168; Lam, X.M., Patapoff, T.W., and Nguven, T.H. 1997, The effect of benzvl alcohol on recombinant human interferon-gamma. Pharm. Res. 14:725-729; Hoffmann, J.A. and Lu, J. 2002, FSH and FSH variant formulations comprising benzvl alcohol as a preservative. EP0974359B1,1-50).

[0019]Prema tome, važno je da se obezbedi stabilizovana formulacija, naročito u pogledu činjenice da doza FSH koja će se dati treba da smanji rizik od neželjenih efekata disociranih ili udruženih oblika poput imunogenih odgovora, ako je prisutan ne-nativni FSH.

[0020]Destabilizirajući događaji koji rezultuju od konzervanasa, međutim, smanjuju stvarni nivo aktivnog gonadotropina, tj. FSH, u tečnoj formulaciji.

[0021]Prema tome, cilj ovog pronalaska je da obezbedi formulacije, određenije tečne FSH formulacije, koje su stabilne, kao i postupak za njihovu stabilizaciju.

SAŽETAK PRONALASKA

[0022]Ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu Na2S04ili kombinacije NaCI i Na2S04za stabilizaciju tečne FSH formulacije tako da se stabilizuje tečna FSH formulacija. Tečna formulacija koja će biti stabilizovana može biti formulacija sa ili bez konzervansa.

[0023]Formulacija koja se dostavlja sa stabilizirajućom solju se tako u nekom alternativnom ostvarenju čuva u liofilizovanom stanju. Liofilizacija se izvodi kako je opšte poznato stručnjaku u ovoj oblasti. Liofilizovana formulacija može potom da se čuva do konačne upotrebe kod pacijenta. Pre davanja, liofilizovana formulacija se onda rekonstituiše sa bilo kojom od poznatih podloga za rekonstituciju, npr. sterilisana voda. Soje sadržana ili u liofilizovanoj formulaciji ili u tečnosti za rekonstituciju.

[0024]20. Upotreba ili postupak bilo koje od gore navedenih stavki pri čemu je tečna formulacija formulacija za jednokratnu upotrebu ili višedozna formulacija, poželjno za injekciju.

[0025]U poželjnom ostvarenju, soje sadržana u tečnoj formulacijipersekoja nije liofilizovana već se čuva kao tečnost u skladištu.

[0026]Ovaj pronalazak odnosi se na stabilizaciju tečne FSH formulacije, pri čemu je so Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04.

[0027]Kao što je gore opisano, tečne FSH formulacije pogodne su za tretiranje neplodnosti. S tim u vezi, postalo je jasno da tečne FSH formulacije mogu biti nestabilne; ovo je tačno za sve tečne FSH formulacije uključujući one namenjene za jednokratnu upotrebu. Nestabilnost može biti izraženija ako tečne FSH formulacije obuhvataju konzervans, koji je npr. neophodan za sve višedozne formulacije. Ovaj konzervans može biti bilo koji konzervans korstan za očuvanje neke FSH formulacije; prema tome, konzervans može biti konzervans koji je odobren od strane FDA za FSH formulacije, određenije npr. neki FDA odobren konzervans, odobren za parenteralne FSH formulacije, kao, na primer, benzil alkohol, fenol i/ili m-krezol; konzervans, međutim, ni na koji način nije ograničen na ove primere. Stabilnost FSH se smanjuje npr. benzil alkoholom, fenolom i/ili m-krezolom.

[0028]Prema tome, ovde naznačene i opisane soli Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04, koriste se za stabilizaciju FSH formulacija za jednokratnu upotrebu.

[0029]Štaviše, ovde naznačene i opisane soli Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04, koriste se za stabilizaciju višedoznih FSH formulacija; pri čemu takve formulacije ne moraju da obuhvataju konzervans, ali takođe mogu da obuhvataju konzervans.

[0030]Dodavanje ovde naznačenih soli koje obuhvataju Na2S04ili kombinaciju NaCI i Na2S04, stabilizuje tečnu FSH formulaciju. Stabilizacija se postiže u formulacijama za jednokratnu upotrebu ili višedoznim formulacijama, određenije tokom dužeg vremena skladištenja i može u daljem mogućem ostvarenju da bude korisna kao kontramera destabilizirajućem dejstvu konzervanasa, kao što su benzil alkohol, fenol i/ili m-krezol.

[0031]Soli, koje se koriste prema ovom pronalasku, su Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04.

[0032]So je poželjno sadržana u količini od 20 do 500 mM, čak poželjnije sadržana je u količini od 30-300 mM; u naročito poželjnom ostvarenju sadržana je u količini od 50-200 mM.

[0033]Maksimalna količina dodate soli ograničena je osmolalnošću rastvora. Da bi se minimizirao bol prilikom injekcije, rastvor bi trebalo da bude izotoničan ili najmanje da ne bude hipertoničan. Budući da svi ekscipijensi u rastvoru doprinose osmolalnosti, maksimalna količina soli koja se može dodati rastvoru zavisi od količine drugih prisutnih komponenata.

[0034]Soje poželjno sadržana u količini koja rezultuje u maksimalnoj osmolalnosti od 350 mosmol/kg, čak poželjnije u količini koja rezultuje u maksimalnoj osmolalnosti od 320 mosmol/kg; u naročito poželjnom ostvarenju sadržana je u količini koja rezultuje u maksimalnoj osmolalnosti od 300 mosmol/kg.

Teorija osmolalnosti

[0035]Osmolalnost je praktičan način davanja ukupne mere doprinosa različitih rastvorenih supstanci prisutnih u rastvoru osmotskom pritisku rastvora. Osmolalnost se može izmeriti u skladu sa Ph. Eur. 2.2.35, 7th edition, supplement 2011 (7.2), Osmolalitv, 01/2008:20235.

[0036]"So" u kontekstu ovog pronalaska je Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04.

[0037]Pronalazači su neočekivano otkrili da su Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04naročito pogodni za stabilizaciju neke FSH formulacije.

[0038]Gonadotropin koji može da bude stabilizovan prema ovom pronalasku je FSH, tj. folikulostimulišući hormon, opciono u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojcima.

[0039]FSH je urinarni ili plazma-izvedeni ili rekombinantni FSH (rFSH). U poželjnom ostvarenju, FSH je urinarni ili rFSH; naročito poželjan je rFSH.

[0040]Kao što je prethodno navedeno, sada je moguće da se rekombinantno proizvede FSH. Prema tome, odnoseći se ovde na FSH uopšteno uvek uključuje i urinarno izvedeni kao i rekombinantni (r) gonadotropin. Prema tome, odnoseći se na FSH takođe obuhvata rFSH.

[0041]Formulacija prema ovom pronalasku je tečna rFSH formulacija, najpoželjnije injektibilna, koja je stabilizovana sa Na2S04ili kombinacijom NaCI i Na2S04.

[0042]U alternativnom ostvarenju, rFSH svih ostvarenja je dugodelujući FSH. Dugodelujuće FSH formulacije mogu se dobiti kao što je opšte poznato stručnjaku u ovoj oblasti, npr. modifikovanjem FSH molekula ili modifikovanjem formulacije.

[0043]FSH ovde tako obuhvata sve moguće urinarno izvedene ili rekombinantne oblike gore pomenutog FSH kao i sve moguće kombinacije FSH oblika. Takođe je obuhvaćena formulacija za jednokratnu upotrebu ijedna ili više daljih formulacija (istog ili različitog gonadotropina) za višedoznu upotrebu.

[0044]Jedan mogući proizvod može biti formulacija koja uključuje FSH (opciono sa CG, LH, LH aktivnošću itd.), svi u različitim fiolicama. LH aktivnost, ako je prisutna, može da potiče od LH ili CG. LH može biti zamenjen ekvivalentnom dozom CG ivice versa;"ekvivalentna doza" u tom kontekstu može se izračunati na osnovu toga da 1IU CG je ekvivalentna 5 - 7 IU LH u Farmakopeji Van Hell Bioassav (Van Hell, H et al, Acta Endocrin. 47,409-418, 1964).

[0045]Poželjna kombinacija je ta od (r)FSH, (r)LH i (r)hCG, pri čemu su svi u različitim fiolicama.

[0046]Moguće kombinacije u različitim fiolicama takođe uključuju: urinarni (u) FSH i uhCG ili uFSH i uLH; dalje (rhCG ili rLH ili rFSH) i (uhCG ili uLH ili rvCG ili rLH), i sve moguće njihove permutacije.

[0047]Druga poželjna kombinacija je ta od (r)FSH i (r)hCG, u različitim fiolicama, respektivno.

[0048]Druga poželjna kombinacija je ta od (r)FSH i (r)LH, u različitim fiolicama, respektivno.

[0049]FSH formulacija ovog pronalaska je tečna formulacija.

[0050]Poželjno, formulacija je injektibilna. Formulacije mogu biti isporučene kao proizvod koji ima jednu, dve ili više farmaceutsku(e) kompoziciju(a) uključujući FSH ili FSH/hCG, za davanje odvojeno ili zajedno. Ako se daju odvojeno, davanje može biti sekvencijalno. Proizvod se može isporučiti u bilo kojoj pogodnoj ambalaži. Na primer, proizvod može da sadrži brojne prethodno napunjenje špriceve od kojih svaki uključuje FSH (FSH kompoziciju), ili dodatno hCG (hCG kompoziciju) npr. gde špricevi mogu biti upakovani u blister ambalažu ili druga sredstva koja održavaju sterilnost. Proizvod može opciono da sadrži instrukcije za upotrebu FSH formulacija.

[0051]Prema daljem aspektu, inventivna FSH formulacija obezbeđena je kao višedozni preparat. Ovaj pronalazak, međutim, eksplicitno je takođe usmeren na formulacije namenjene za jednokratnu upotrebu. Ovaj pronalazak takođe se odnosi na stabilizaciju formulacija kao deo kita. Takav kit obuhvataće najmanje jedan kontejner koji obuhvata jednu ili više dnevnih doza FSH, ili npr. dva kontejnera (npr. fiolica), gde svaki obuhvata različiti gonadotropin, i npr. dalje instrukcije (npr. za davanje) i npr. dalje sredstvo za injekciju. U poželjnom ostvarenju, koristi se injekciona olovka za višestruke injekcije, pri čemu je FSH rastvor napunjen u respektivne kertridže.

[0052]U poželjnom ostvarenju, FSH je sadržan sa 35 - 850 lll/ml, poželjno 50 -800 lU/ml, čak poželjnije 100-600IU/ml.

[0053]Naročito poželjna formulacija za npr. 600 lU/ml rFSH ima sledeći sastav:

600 lU/ml rFSH

0,001-0,05, poželjno 0,005 mg/ml Polisorbata 20

0,1 do 10, poželjno 1,0 mg/ml L-metionina

0,5 do 50, poželjno 5,0 mg/ml fenola

1 do 100, poželjno 14 mg/ml dinatrijum sulfata (tj. 0,1 M)

0,1 do 10, poželjno 1 mM natrijum fosfatni pufer, (pH 6 do 8, poželjno pH 6,5).

[0054]Osmolalnost rastvora je poželjno 300 mosmol/kg

(pH odnosi se na pH celog rastvora.)

[0055]Injektibilni depo oblici mogu se izraditi formiranjem mikroinkapsuliranih matrica od FSH (i drugih agenasa, ako su prisutni) u biorazgradivim polimerima. Polimer bazirani depo oblici/produženo oslobađanje sistemi mogu, u zavisnosti od njihove hemijske prirode, da budu na primer mikro- ili nano čestice, hidrogelovi, micele, emulzije ili implanti. U zavisnosti od odnosa FSH prema polimeru i prirode određenog korišćenog polimera, može se kontrolisati brzina FSH oslobađanja. Primeri biorazgradivih polimera uključuju polilaktid/poliglikolid kopolimer sisteme, polivinilpirolidon, poli(ortoestre), poli(anhidride), poli(etilen glikol), poli aminokiseline, polisaharide npr. natrijum hijaluronat (NaHA) ili druge soli, želatin, hitozan itd. Svi navedeni polimeri mogu biti izvedeni ili modifikovani radi optimizovanja isporuke proteinskog leka ili njegove stabilnosti. Depo injektibilne formulacije takođe se pripremaju zatvaranjem FSH u lipidne sisteme, ili polimerne lipidne mešavine kao micele, lipozomi ili mikroemulzije koje su kompatabilne sa tkivima u telu.

[0056]Injektibilne formulacije mogu biti sterilisane, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, ili inkorporacijom agenasa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje mogu biti rastvorene ili dispergovane u sterilnoj vodi ili nekoj drugoj sterilnoj injektibilnoj podlozi neposredno pre upotrebe. Injektibilne formulacije mogu se isporučiti u bilo kom pogodnom kontejneru, npr. fiolici, prethodno napunjenom špricu, injekcionim kertridžima, i slično, kako je opisano gore.

[0057]pH i tačna koncentracija raznih komponenata farmaceutske kompozicije podešavaju se u skladu sa rutinskom praksom u ovoj oblasti. Videti GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7th edition. U poželjnom ostvarenju, kompozicije ovog pronalaska isporučuju se kao kompozicije za parenteralno davanje. Opšti postupci za pripremanje parenteralnih formulacija poznati su u ovoj oblasti i opisani su u REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, na stranama 780-820. Parenteralne kompozicije mogu biti isporučene u tečnoj formulaciji ili kao čvrsta supstanca koja će biti umešana sa sterilnom injektibilnom podlogom neposredno pre davanja. U naročito poželjnom ostvarenju, parenteralne kompozicije isporučuju se u doznom jediničnom obliku radi lakog davanja i uniformnosti doze.

[0058]FSH ovog pronalaska može se izvesti konvencionalnim sredstvom iz urina ili može se proizvesti rekombinantno. Za moguće proizvodne postupke dalje se upućuje na npr. WO 2009/127826.

[0059]hCG može se dobiti na bilo koji način poznat u ovoj oblasti. hCG, kako se ovde koristi, uključuje humano-izveden i rekombinantni hCG. Humano-izveden hCG može se prečistiti iz bilo kog pogodnog izvora (npr. urina i placente) bilo kojim postupkom koji je poznat u ovoj oblasti. Postupci ekspresije i prečišćavanja rekombinantnog hCG dobro su poznati u ovoj oblasti.

[0060]LH može se dobiti na bilo koji način poznat u ovoj oblasti. LH, kao što se ovde koristi, uključuje humano-izveden i rekombinantni LH. Humano-izveden LH može se prečistiti iz bilo kog pogodnog izvora (npr. urina) bilo kojim postupkom koji je poznat u ovoj oblasti. Postupci ekspresije i prečišćavanja rekombinantnog LH poznati su u ovoj oblasti.

[0061]Farmaceutska kompozicija može biti za tretiranje neplodnosti, npr. za upotrebu u npr. medicinski potpomognutim oplodnjama (MPO), indukciji ovulacije (01) ili intrauterinoj inseminaciji (IUI). Farmaceutska kompozicija može da se koristi, na primer, u medicinskim indikacijama gde se koriste poznati FSH preparati. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu stabilizovanog FSH preparata opisanog ovde (prema aspektima ovog pronalaska) za, ili u proizvodnji medikamenta za, tretiranje neplodnosti. Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u dobro poznate kompozicije za bilo koji put davanja leka, npr. oralni, rektalni, parenteralni, transdermalni (npr. flaster tehnologija), intravenozni, intramuskularni, subkutani, intracisternalni, intravaginalni, intraperitonealni, lokalni (praškovi, masti ili kapi) ili kao bukalni ili nazalni sprej. Tipična kompozicija obuhvata farmaceutski prihvatljivi nosač, kao što je vodeni rastvor, netoksične ekscipijense, uključujući soli i konzervanse, pufere i slično, kako je opisano u Remington's Pharmaceutical Sciences petnaesto izdanje (Matt Publishing Companv, 1975), na stranama 1405 do 1412 i 1461 do 87, i nacionalnom formularu XIV četrnaesto izdanje (American Pharmaceutical Association, 1975), između ostalog.

[0062]Primeri pogodnih vodenih i nevodenih farmaceutskih nosača, razblaživača, rastvarača ili vozila uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), karboksimetilcelulozu i njihove pogodne mešavine, biljna ulja (kao što je maslinovo ulje), i injektibilne organske estre kao što je etil oleat.

[0063]Kompozicije takođe mogu da sadrže aditive kao što su, ali bez ograničenja na, konzervansi, agensi za vlaženje, emulgatori, agensi za puferovanje, i dispergujući agensi. Mogu biti uključeni antibakterijski i antifungalni agensi radi sprečavanja rasta mikroba i uključuju, na primer, parabene, hlorbutanol, fenole, sorbinsku kiselinu, i slično. Štaviše, poželjno je da uključuju agense toniciteta.

[0064]U nekim slučajevima, radi efekta produženog dejstva poželjno je da se uspori apsorpcija FSH (i drugih aktivnih sastojaka, ako su prisutni) iz subkutane ili intramuskularne injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom rastvorljivošću u vodi. Brzina apsorpcije od npr. FSH onda zavisi od njegove brzine rastvaranja koja, za uzvrat, može da zavisi od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno datog oblika FSH kombinacije postiže se rastvaranjem ili suspendovanjem FSH kombinacije u uljanom vozilu.

[0065]Prema ovom pronalasku, pronalazači su uložili napor da bi ispitali dejstvo određenih jedinjenja na stabilnost tečne gonadotropinske formulacije; pri čemu su, ovde, ispitivana stabilizirajuća kao i destabilizirajuća dejstva određenih jedinjenja.

[0066]Izraz "stabilnost" može da se odnosi na hemijsku stabilnost, uključujući kovalentnu modifikaciju u aminokiselinskoj sekvenci, ali u kontekstu proteinske stabilnosti može takođe da se odnosi na fizičku stabilnost, koja uključuje promene proteinskog savijenog stanja (tj. nativnog stanja) ne uključujući cepanje kovalentnih veza.

[0067]U ovom pronalasku izraz "stabilnost" odnosi se na fizičku stabilnost formulacija gonadotropina, određenije FSH ovog pronalaska. Fizička nestabilnost proteinske formulacije može biti izazvana agregacijom proteinskih molekula radi formiranja agregata višeg reda, disocijacijom heterodimera u monomere, ili bilo kojom drugom konformacionom promenom koja smanjuje najmanje jednu biološku aktivnost FSH proteina uključenih u ovom pronalasku.

[0068]"Stabilan" rastvor ili formulacija je ona kod koje je stepen agregacije, disocijacije, konformacione modifikacije, gubitka biološke aktivnosti i slično, proteina u njemu prihvatljivo kontrolisan, i ne raste neprihvatljivo tokom vremena. Stabilnost može biti ocenjena postupcima koji su dobro poznati u ovoj oblasti, uključujući merenje rasipanja svetlosti uzorka, vizuelni pregled jasnoće i/ili obojenja, apsorbanciju, ili optičku gustinu, određivanja molekularne veličine (npr. ekskluzionom hromatografijom ili "field flow" frakcionisanje),in vitroiliin vivobiološke aktivnosti i/ili diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC). Drugi postupci za ocenjivanje stabilnosti dobro su poznati u ovoj oblasti i takođe se mogu koristiti prema ovom pronalasku.

[0069]Poznato je da nekoliko konzervanasa ima izraženo destabilizirajuće dejstvo na gonadotropinske formulacije i iznenađujuće je ovde otkriveno da su Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04, za koje se pokazalo ovde sa su pogodni za stabilizaciju tečne FSH formulacije, dodatno korisni da se suprostave destabilizirajućim dejstvima konzervansa, kao što je benzil alkohol, fenol i m-krezol, koji treba da bude sadržan u tečnoj višedoznoj FSH formulaciji za medicinsku upotrebu.

[0070]Ovde naznačene soli imaju stabilizirajuće dejstvo na tečnu FSH formulaciju koje je na povoljan i iznenađujući način čak izraženije od stabilizirajućih dejstava poznatih stabilizatora, kao što je npr. saharoza. Poboljšan efekat stabilizacije u poređenju sa poznatim stabilizatorima kao što je saharoza je naročito iznenađujući. Dalje, sasvim neočekivano, stabilizirajuća dejstva inventivnih soli mogla su se pokazati za FSH formulacije, iako nikakvo stabilizirajuće dejstvo nije moglo da se pokaže za veoma sličan hCG. Dalje je iznenađujuće to što efekti stabilnosti, kao što je primećeno, nisu ispoštovali takozvane Hofmajsterove serije (videti takođe dole), već su tome bile protivne.

[0071]Iz stanja tehnike poznato je da se javlja razgradnja FSH u farmaceutskim FSH formulacijama, a što je potvrđeno prvim setom prisutnih primera.

[0072]FSH će se razgraditi i u funkciji vremena i u funkciji temperature. Određenije, na temperaturama iznad sobne temperature, sekundarne, tercijarne i kvaternarne strukture biće izmenjenje.

[0073]Čini se da je konformaciono odvijanje tercijarnih i sekundarnih FSH struktura koje se javlja usled zagrevanja je prelaz između dva stanja (kada je agregacija proteina ograničena). Ovo odvijanje može biti nezavisno od disocijacije subjedinica (promene u kvaternarnoj strukturi).

[0074]Dalje, postaje jasno sa ovim pronalaskom da FSH, koji sadrži konzervans poput benzil alkohola ili fenola, gde su takvi konzervansi neophodni, na primer kao antimikrobni agensi u tečnim FSH formulacijama, jasno utiču na stabilnost višedoznih FSH formulacija na negativan način. Ovde, dugoročna stabilnost FSH se smanjuje, temperatura denaturacije FSH je niža, a već denaturisani oblici imaju niži nivo sekundarnih struktura FSH formulacija koje ne sadrže konzervanse.

[0075]Ovaj pronalazak takođe po prvi put pokazuje da Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04, ima značajan dejstvo na stabilnost tečnih FSH formulacija. Može se pokazati da se sekundarna struktura FSH u tečnim FSH formulacijama koje obuhvataju ove soli neće značajno promeniti usled zagrevanja do 76,5°C. Denaturisan oblik je relativno izgrađen u prisustvu Na2S04, što čini denaturaciju više reverzibilnom, i prema tome, značajno se povećava kinetička stabilnost proteina. Ovo je podržano ovde prikazanim podacima za stabilnost u realnom vremenu koji pokazuju izraženo stabilizirajuće dejstvo na heterodimernu strukturu FSH.

[0076]Rezultati ovde jasno ukazuju da ovde naznačene soli, tj. Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04mogu da ograniče tendenciju FSH molekula da disociraju i tako značajno povećavaju stabilnost tokom skladištenja.

[0077]Ovaj pronalazak takođe se odnosi na postupak za stabilizaciju tečne FSH formulacije, pri čemu taj postupak obuhvata fazu dodavanja gore pomenutih soli pomenutoj formulaciji.

[0078]Sva ispitivanja su potvrđena dodatnim sprovođenjem podataka u realnom vremenu.

Kratak opis slika

[0079]

Fig. 1:

CD (cirkularni dihroizam, videti dole) signal (mstepen) kao funkcija talasne dužine (nm) prikazan je za rFSH na različitim temperaturama. Nije primećena nikakva značajna razlika između 24,0°C -> 45,9°C spektara, ali primećeno je temperaturno zavisno smanjenje CD-signala iznad 50°C. rFSH protein (0,93 mg/ml) rastvoren je u 3,57 mM fosfatnom puferu pH 6,3 koji sadrži 0,0036 mg/ml Polisorbata 20. Skeniranje na 24,0°C (boldovan pun trag), 50,3°C (isprekidan trag), 54,7°C (tačkasti trag), 59,0°C (isprekidan-tačkasti trag), 63,4°C (zvezdice), 67,8°C (dijamanti) i 76,5°C (pun trag).

Fig. 2:

CD signal (mstepen) kao funkcija talasne dužine (nm) prikazan je za rFSH koji sadrži Na2S04na različitim temperaturama. Nije primećena nikakva značajna razlika između 24,0°C -> 45,9°C spektara. rFSH protein rastvoren je u 3,57 mM fosfatnom puferu pH 6,3 koji sadrži 0,0036 mg/ml Polisorbata 20 i 8,5 mg/ml natrijum sulfata (Na2S04). Skeniranje na 24,0°C (boldovan pun trag), 50,3°C (isprekidan trag), 54,7°C (tačkasti trag), 59,0°C (isprekidan-tačkasti trag) i 76,5°C (pun trag).

Fig. 3:

CD signal (mstepen) kao funkcija talasne dužine (nm) prikazan je za rFSH koji sadrži benzil alkohol na različitim temperaturama. Nije primećena nikakva značajna razlika između 24,0°C -> 45,9°C spektara. rFSH protein (0,93 mg/ml) rastvoren je u 3,57 mM fosfatnom puferu pH 6,3 koji sadrži 0,0036 mg/ml Polisorbata 20 i 0,17 mg/ml benzil alkohola. Skeniranje na 24,0°C (boldovan pun trag), 45,9°C (kružići), 50,3°C (isprekidan trag), 54,7°C (tačkasti trag), 59,0°C (isprekidan-tačkasti trag), 63,4°C (zvezdice), 67,8°C (dijamanti) i 76,5°C (pun trag).

Fig. 4:

Naknadna DSC skeniranja hCG i rFSH. DSC podaci za 5 mg/ml hCG u 0,005 mg/ml Polisorbata 20, 0,5 mg/ml L-metionina, 1 mM fosfatnom puferu, pH 6,5 i 2,4 mg/ml rFSH u 0,005 mg/ml Polisorbata 20, 0,5 mg/ml L-metionina, 0,24 M NaCI, 1 mM fosfatnom puferu, pH 6,5. Brzina skeniranja 2,0°C/min. Prvo rFSH skeniranje (pun trag), drugo rFSH skeniranje (isprekidan-tačkasti trag), prvo hCG skeniranje (isprekidan trag) i drugo hCG skeniranje (tačkasti trag). Nakon prvog skeniranja uzorak je ohlađen do 20°C pre drugog skeniranja.

Fig. 5:

DSC skeniranja hCG sa različitim šećerom ili solima. DSC podaci za 5 mg/ml hCG u 0,005 mg/ml Polisorbata 20, 0,5 mg/ml L-metionina i 1 mM fosfatnom puferu, pH 6,5. Bez dodatog šećera ili soli (boldovan pun trag), 0,1 M Na2S04(pun trag), 0,1 M NaCI (tačkasti trag), 0,1 M NaCI04(isprekidan trag) i 0,1 M saharoza (isprekidan-tačkasti trag). Brzina skeniranja 2,0°C/min.

Fig. 6:

DSC skeniranja rFSH sa različitim šećerom i solima. DSC podaci za 2,4 mg/ml rFSH u 0,005 mg/ml Polisorbata 20, 0,5 mg/ml L-metionina i 1 mM fosfatnom puferu, pH 6,5. Bez dodatog šećera ili soli (boldovan pun trag), 0,1 M Na2S04(pun trag), 0,1 M NaCI (tačkasti trag), 0,1 M NaCI04(isprekidan trag) i 0,1 M saharoza (isprekidan-tačkasti trag). Brzina skeniranja l,0°C/min.

Ovaj pronalazak je dalje objašnjen putem sledećih primera, koji neće, međutim, nikako da ograniče njegov obim.

PRIMERI

Primer 1- Spektroskopija cirkularnog dihroizam sa sinhrotronskim zračenjem ( SRCD)

POSTUPAK

[0080]Spektroskopija cirkularnog dihroizma izvedena je korišćenjem sinhotronske instalacije na Aarhus univerzitetu, Danska. Svi CD spektri su snimljenji korišćenjem 0,1 mm duge staze kvare suprasil ćelije (Hellma GmbH, Germanv) preko opsega talasne dužine od 180-270 nm u 1 nm koracima, i sa vremenom zadržavanja od 3 sekunde po talasnoj dužini. Tri identična CD skeniranja snimljena su za svaku eksperimentalnu probu i za rFSH i referentne (placebo) probe. CD spektar od rFSH predstavljen u ovom izveštaju dobijen je oduzimanjem prosečnog odgovarajućeg placebo skeniranja od prosečnog proteinskog skeniranja. Za svaki set CD skeniranja korišćen je rastvor od približno 120 u.1 (što odgovara rFSH od približno 112 ug).

[0081]Tokom ispitivanja temperaturnih efekata na rFSH CD spektar, temperatura u komori za zagrevanje varirala je od 25°C do 85°C sa 5°C-intervalima, i vreme uravnotežavanja od 5 minuta. Iz kalibracione datoteke određena je stvarna eksperimentalna temperatura (temperatura u kvare suprasil ćeliji).

[0082]CD meri razliku u apsorpciji levo i desno kružno polarizovane svetlosti koja se javlja zbog strukturne asimetrije.

[0083]Sekundarne strukture proteina mogu se ispitati pomoću CD spektroskopije u dalekoj UV regiji (približno 180- 250 nm). Uopšteno, uređenija struktura prati intenzivnije CD signale (pozitivne ili negativne). Međutim, različite sekundarne strukture imaju različite CD spektre, i kao a-heliksi imaju intenzivnije CD signale od (3-struktura, ne mogu se izvesti direktna poređenja između različitih proteina za koje se izvodi zaključak o stepenu uređenosti struktura.

[0084]Zbog visoke osetljivosti ka strukturnim promenama, CD spektroskopija je moćan alat kada se ispituje fizička stabilnost proteina. Takva ispitivanja obično se izvode detekcijom CD spektra kao funkcije promena u spoljašnjim faktorima npr. temperature, pH, koncentracije denaturanata, surfaktanata ili stabilizatora. U ovom ispitivanju, CD spektar od rFSH ispitivan je kao funkcija temperature. Dodatno su ispitivani efekti benzil alkohola i natrijum sulfata (Na2S04) na rFSH sekundarnu strukturu.

[0085]Gonadotropin korišćen u ovom primeru kao i u primerima 2 i 3 je rekombinantni folikulostimulišući hormon (rFSH), humani hormon koji se eksprimira iz humane PER.C6<*>ćelijske linije korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK. rFSH je heterodimerni protein koji se sastoji od dva glikozilovana monomera: alfa-subjedinice od 92 aminokiseline koja je zajednička za FSH, luteinizirajući hormon (LH), humani horionski gonadotropin (hCG) i tireostimulišući hormon (TSH), i beta-subjedinice od 111 aminokiselina koja je specifična za FSH. Svi glikoproteinski hormoni, koji obuhvataju FSH, gube svoju bioaktivnost usled disocijacije nekovalentno vezanih monomera. ;[0086]Prethodni rezultati ukazuju da se nestabilnost rFSH pre svega zasniva na disocijaciji dimera (razgradnja kvaternarne strukture, i prateće smanjenje u imunovezujućem odgovoru). ;[0087]U zavisnosti od namenjene upotrebe, trenutno dostupne na tržištu rFSH formulacije obezbeđene su u različitim koncentracijama, u opsegu od 37,5 lU/ml (što odgovara približno 2,8 ug/ml za Gonal-f) do najmanje 833 lU/ml (što odgovara približno 83,3 u.g/ml za Puregon). ;[0088]rFSH korišćen u ispitivanjima namenjen je za tečnu formulaciju leka, 600 IU rFSH/ml za subkutanu injekciju. Budući da je proizvod namenjen za višedoznu injekciju, dodavanje konzervansa je neophodno. ;[0089]Ispitivane formulacije proizvedene su mešanjem štok rastvora različitih sastojaka. Ispitivani interval koncentracije i proteina i ekscipijenasa ograničen je zbog korišćenog postupka, tj. koncentracija proteina trebalo je da se održava relativno visokom u poređenju sa koncentracijama ekscipijensa. Zbog UV apsorpcije aromatičnih jedinjenja u ispitivanoj regiji talasne dužine, koncentracija benzil alkohola trebalo je da se održava niskom. Tabela ispod daje tri različite formulacije koje su ispitivane u prvom eksperimentalnom projektu od strane ovih pronalazača. ;Uzorak 1;[0090]CD spektar snimljen je za rFSH, uzorak 1 (videti Tabelu 1) na trinaest različitih temperatura između 24°C i 77°C. Zbog jasnoće prikazano je samo sedam od ovih spektara na Fig. 1. Uzorak 1, kao izvodiv iz Tabele 1, ne obuhvata ni so, ni konzervans. Spektri su prikazani na Fig. 1. Rezultati jasno pokazuju da intenzitet CD signla opada kao funkcija temperature, što ukazuje na razgradnju sekundarnih struktura na visokoj temperaturi (> 50°C). Nisu detektovane nikakve značajne razlike između 24,0°C -> 45,9°C spektara, što pokazuje da se tokom vremenskog perioda merenja (oko 20 minuta) sekundarna struktura proteina očuvala usled zagrevanja do približno 46°C. SRCD spektri od FSH usled zagrevanja pokazuju izodihroidnu tačku na približno 193 nm, što je takođe otkriveno za spektre uzorka 2, videti Fig. 2. ;Uzorak 2;[0091]CD spektar snimljen je za rFSH, uzorak 2 (tabela 1) koji sadrži Na2S04. Spektri su dobijeni na trinaest različitih temperatura između 24°C i 77°C, i prikazani su na Fig. 2. Zbog jasnoće, na Fig. 2 prikazano je samo pet od ovih spektara. Rezultati pokazuju razgradnju sekundarnih struktura kao funkciju temperature. Podaci pokazuju da se sekundarna struktura rFSH u uzorku 2 očuvala usled zagrevanja do približno 46°C (tokom trajanja eksperimenta). Važno je to da podaci takođe pokazuju da je denaturisani oblik relativno stuktuiran u prisustvu Na2S04. ;Uzorak 3;[0092]CD spektar snimljen je za rFSH, uzorak 3 (tabela 1) koji sadrži benzil alkohol (BA). Benzil alkohol je antimikrobni konzervans koji se vrlo često bira za tečnu FSH formulaciju. Zbog relativno malog kapaciteta očuvanja u poređenju sa, na primer, m-krezolom, BA treba da se koristi u visokim koncentracijama (oko 10-15 mg/ml). Konzervans je neophodan budući da je nameravana upotreba rFSH za nekoliko injekcija tokom vremenskog perioda do 1 meseca, i jer se rFSH obično čuva na sobnoj temperaturi. ;[0093]Spektri od rFSH u prisustvu 0,17 mg/ml BA dobijaju se na trinaest različitih temperatura između 24°C i 77°C, i predstavljeni su na Fig. 3. Zbog jasnoće, na Fig. 3 prikazano je samo osam od ovih spektara. ;[0094]Zbog veoma visoke UV apsorbancije benzil alkohola (i pratećeg niskog CD signala), ispitivana BA koncentracija ne može da se poveća, i prema tome ne može da dođe čak ni blizu koncentracije koja će se koristiti za očuvanje rFSH formulacija. Ipak, primećeno je jasno destabilizirajuće dejstvo BA. CD rezultati ukazuju da sekundarna struktura rFSH u uzorku 3 ostaje očuvana usled zagrevanje do42°C, što je neznatno niže od početne temperature denaturacije rFSH u uzorcima 1 i 2. ;[0095]Dodatno, i najvažnije, podaci pokazuju da denaturisani oblici nemaju uređenu strukturu do značajno višeg stepena nego FSH u odsustvu konzervansa. ;Dejstva ekscipijenasa na temperaturno indukovane strukturne promene;[0096]So Na2S04koja je ovde korišćenja kao reprezentativni primer za ovde naznačene soli pokazala je značajno dejstvo na strukturu temperaturom denaturisanih proteina. Ovo je očigledno važno otkriće. Kao denaturisani (nesavijeni ili delimično nesavijeni) proteini su skloniji povezivanju radi formiranja agregata nego nativni proteini (Fink, A.L, 1998, Fold Des. 3(1):R9-R23), pri čemu rezultati ukazuju da natrijum sulfat može da ograniči tendenciju rFSH molekula da se denaturišu i prema tome rizik za agregaciju, a time se značajno povećava stabilnost tokom skladištenja. Benzil alkohol (BA) s druge strane izaziva značajnu strukturnu razgradnju na visokim temperaturama. Nisu detektovane uređene sekundarne strukture pomoću SRCD. Primećena dejstva BA (više nesavijene strukture) mogu biti deo objašnjenja za povećanu agregaciju koja je pronađena u drugim sistemima proteina usled dodavanja benzil alkohola (Maa, Y. i Hsu, C.C., 1996, Int. J. Pharm. 140:155-168; Zhang, Y. et al., 2004, J. Pharm. Sci. 93(12):3076-3089). ;[0097]Međutim, dodavanje konzervanasa je od presudnog značaja za razvoj višedoznih formulacija, i iz postojanja rFSH proizvoda na tržištu zna se da treba razviti stabilanije formulacije čak i sa relativno visokim sadržajem benzil alkohola (Puregon<*>sadrži 10 mg/ml benzil alkohola).

[0098]Otkriveno je da benzil alkohol smanjuje stabilnost rFSH i da favorizuje gubitak uređene sekundarnih struktura usled zagrevanja. Međutim, važno je dodavanje konzervanasa. Ovo ispitivanje pokazalo je da ovde naznačene soli povećavaju nivo uređenih struktura u zagrejanim rFSH formulacijama.

[0099]Tako, ove soli veoma su pogodne kao stabilizator(i) u tečnoj rFSH formulaciji, na primer da bi nadoknadile dejstva benzil alkohola ili drugih fenolnih konzervanasa.

Primer 2-Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija ( DSC)

[0100]FSH korišćen representativno u ovom primeru je isti kao u Primeru 1. Uopšteno nativna (bioaktivna) struktura proteina veoma je osetljiva prema svom okruženju npr. sastavu formulacije, sistemima kontejnera, pH i temperaturi. U ovom primeru rFSH temperatura denaturacije, 7~m, ispitivana je pomoću tečne diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC). rFSH temperatura denaturacije je pokazatelj stabilnosti proteina u rastvoru, gde viša Tmukazuje da je stabilaniji protein.

[0101]Tercijarna i kvaternarna struktura proteina je stabilizovana pre svega nekovalentnim interakcijama. Budući da su mnoge od ovih intramolekularnih interakcija zamenjene nekovalentnim interakcijama sa molekulima vode tokom odvijanja, termodinamički balans između različitih strukturnih oblika (tj. nativnog i denaturisanog) je redak. Uopšteno ovo znači daje ograničena stabilnost nativnih proteina. Mnogi proteini termički se odvijaju na oko 70°C. Savijanje ili denaturisanje proteina može se opisati termodinamičkim parametrima koji mogu da se direktno ispituju i kvantifikuju korišćenjem DSC. Stoga, DSC je značajan alat za ispitivanje dejstava ekscipijenasa na stabilnost proteina, a time za identifikaciju optimalnih formulacija za proteinske terapeutike.

TEČNA DIFERENCIJALNA SKENIRAJUĆA KALORIMETRIJA (DSC)

Teorija

[0102]Kada se zagreva uzorak proteina (tj. povećanje temperature uzorka) u tečnoj DSC, samo se dobija blagi porast osnovne linije, ali kada se zagrevanje nastavi (tj. nastavlja se porast temperature), protein apsorbuje toplotu što izaziva da se termički odvijaju preko karakteristike temperaturnog opsega ispitivanog proteina. Ovo dovodi do endotermnog pika. Tokom odvijanja proteina, molekuli vode koji okružuju protein reorganizuju se budući da su izloženi hidrofobni lanci. Kada se odvijanje završi, apsorpcija toplote se smanjuje i formira se nova osnovna linija.

[0103]Integracija toplotnog kapaciteta, CP, uzorka dovodi do promene entalpije, AH, povezane sa procesom odvijanja prema jednačini (1). Primećena promena entalpije potiče od endotermnih procesa kao što je raskidanje vodoničnih veza i egzotermnih procesa kao što je formiranje vodoničnih veza između proteina i okolne sredine. Središnja tačka termalnog prelaza ili središnja tačka prelaza,Tm(često se naziva temperatura denaturacije proteina), je temperatura na kojoj je polovina proteinskih molekula savijena, a polovina proteinskih molekula je nesavijena.

[0104]Sirovi podaci iz DSC merenja, to jest, toplotni fluks (u W) kao funkcija temperature može se lako preračunati u parcijalni molarni toplotni kapacitet (u J/mol K), ako su poznati molarna masa i koncentracija korišćenog proteina.

Postupak ispitivanja

[0105]Temperatura denaturacije proteina, Tm, izmerena je korišćenjem tečne DSC, Nano DSC od TA Instruments, opremljene sa 300 u.1 ćelija u dve kapilare i korišćenjem sledećih parametara: Brzina skeniranja: 0,5-2,0°C/min, ako ništa drugo nije navedeno, koristi se brzina skeniranja od l,0°C/min (2,0°C/min za pr. 4)

Početna temperatura: 20°C

Krajnja temperatura: 100°C

Ravnoteža: 900 s (ili 900 s (prvo skeniranje) 600 s (drugo skeniranje) za pr.4)Konstantan pritisak: 3 atm

[0106]Svi uzorci su degasirani 15 min pre merenja. Ćelije uzorka očišćene su sa 50% mravljom kiselinom nakon svakog proteinskog uzorka. Dodatno ćelije su isprane sa 1000 ml prečišćene vode nakon svakog uzorkovanja.

[0107]Svi uzorci izmereni su sa odgovarajućim placebo u referentnoj ćeliji. Rezultati iz odvojenog skeniranja sa placebo rastvorom napunjenim i u referentnoj i u uzorku ćelije oduzeti su od podataka pre ocenjivanja, tj. prazno oduzimanje.

MALDI-TOF MS

[0108]Uzorci rFSH, pre i posle tretiranja enzimom sijalidazom, analizirani su pomoću masene spektrometrije matricom potpomognutom laserskom desorpcijom/jonizacijom sa vremenom preleta (MALDI-ToF MS) radi ocene obima reakcije desijalilacije. Spektri su dobijeni na Autoflex II MALDI ToF masenom spektrometru (Bruker Daltonics). Sinapinska kiselina korišćena je kao matrica.

[0109]Analiza je izvedena u pozitivnom linearanom jonskom režimu, sa odloženom ekstrakcijom. Opseg skeniranja od 4000-20893 Da korišćen je sa spoljašnjom kalibracijom.

PREDMET OVOG PRIMERA

[0110]Cilj ovog primera je da istraži termičku stabilnost rFSH pomoću tečne diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC), i da ispita stabilizirajuće dejstvo različitih soli na rFSH sa i bez dodavanja konzervansa (fenol ili benzil alkohol).

[0111]Ovo ispitivanje zajedno sa prethodnim ispitivanjem sa cirkularni dihroizam (CD) spektroskopijom (Primer 1 gore) i ispitivanjem stabilnosti u realnom vremenu (Primer 3 dole) imaju za cilj da ispitaju dejstvo soli i konzervanasa na rFSH stabilnost u rastvorima.

PROIZVODI KOJI SE ISPITUJU

INFORMACIJE O ŠARŽI rFSH

[0112]rFSH, lekovita supstanca, šarža br. 08800020 i šarža br. 09PD80010 proizvedene su pomoću Bio-Technologv General (BTG), Izrael.

[0113]Određivanje biološke aktivnosti rFSH izvedeno je prema Ph. Eur. Koncentracija je određena da bude 13.223 lU/mg (što rezultuje u 9.256 lU/ml) za šaržu 08800020 i 15.109 lU/mg (što rezultuje u 10.576 lU/ml) za šaržu 09PD80010, respektivno za dve korišćene rFSH šarže.

MATERIJALI

Ekscipijensi

[0114]Lista ekscipijenasa korišćenih u rFSH rastvorima u ovom ispitivanju navedena je u Tabeli 2.

Tabela 2: Lista ekscipijenasa

SASTAV ISPITIVANIH RASTVORA

[0115]Sastav ispitivanih rFSH i placebo rastvora dat je u Tabeli 3, Tabeli 4 i Tabeli 5. Ispitivana koncentracija konzervanasa odabrana je na osnovu koncentracije potrebne da ispuni Ph. Eur. A kriterijume koji se tiču očuvanja efikasnosti formulacije namenjene za parenteralnu upotrebu.

[0116]Ispitivane koncentracije soli baziraju se na koncentraciji natrijum sulfata da bi se dobila izotoničnost u ispitivanim rastvorima, to jest, 0,1 M natrijum sulfatu. Sve druge soli ispitivane su pri istoj molarnoj koncentraciji kao natrijum sulfat. Dodatno je ispitivana viša i niža koncentracija natrijum hlorida, da bi se ocenio efekat koncentracije soli na rFSH temperaturu denaturacije,Tm.

[0117]Koncentracija natrijum fosfatnog pufera u ispitivanim rastvorima održavana je niskom da bi se minimizirao rizik od stabilizirajućih/destabilizirajućih dejstava pufernih soli kao takvih.

PROIZVODNI POSTUPAK

[0118]Svi rastvori (Tabela 3, Tabela 4 i Tabela 5) proizvedeni su u laboratorijskoj razmeri kod Ferring Pharmaceuticals A/S, Kopenhagen, Danska. Proizvodni postupak rezimiran je dole:

Priprema rFSH štok rastvora

[0119]rFSH štok rastvori u fosfatnom puferu pripremljeni su dodavanjem faze koncentrovanja korišćenjem rFSH šarže 08800020 ili šarže 09PD80010 rastvora lekovite supstance kao početnog materijala. Gornje koncentrovanje izvedeno je korišćenjem Vivaspin 20 uređaja sa membranom za uklanjanje molekula granične molekulske mase (MVVCO) od 10 kDa od Vivascience. Membrana je prethodno oprana centrifugiranjem 15 ml odgovarajućeg placebo rastvora, koji sadrži 0,5 mg/ml L-metionina, 0,005 mg/ml Polisorbata 20 u 1 mM fosfatnom puferu pH 5,5, 6,5 ili 7,5 kroz filter. Centrifugiranje je izvedeno pri 3000 x g za 20 minuta korišćenjem swing-out rotora.

[0120]Za izvođenje faze koncentrovanja, ukupno 80 ml rFSH uzorka je korišćeno da se popune četiri Vivaspin 20 uređaja (20 ml po uređaju) i centrifugirano pri 3000 x g za 15 min. Svaki retenat prenet je u volumetrijsku bočicu od 20 ml. Filteri su isprani sa malim alikvotima željenog placebo rastvora. Rastvor za ispiranje prenet je u volumetrijsku bočicu, koja je konačno razblažena do željene zapremine korišćenjem istog placebo rastvora. Ovako se dobija 2,8 mg/ml rFSH štok rastvor koji sadrži 0,5 mg/ml L-metionina, 0,005 mg/ml Polisorbata 20 u 1 mM fosfatnom puferu pH 5,5, 6,5 ili 7,5, respektivno.

Priprema rFSH i placebo rastvora

[0121]Štok rastvori svih ekscipijenasa, osim konzervanasa, pripremljeni su u Milli-Q vodi.

[0122]Za pripremanje rFSH i placebo rastvora, štok rastvori svakog ekscipijensa pomešani su radi dobijanja željenih koncentracija datih u Tabeli 3, Tabeli 4 i Tabeli 5. Konzervans je dodat direktno u rastvore.

De-sijalilacija rFSH

[0123]Koncentrovani rFSH rastvor koji ima rFSH koncentraciju od 2,8 mg/ml koji sadrži 0,5 mg/ml L metionina, 0,005 mg/ml Polisorbata 20 u 1 mM fosfatno puferu pH 6,5 korišćen je za uklanjanje sijalinske kiseline iz šećernih ostataka vezanih za rFSH. Uklanjanje se vrši enzimski, korišćenjem a(2->3, 6, 8, 9) neuraminidaze (sijalidaze) od Sigma. rFSH je tretiran neuraminidazom tokom prekonoćnog mućkanja na 37°C. Reagensi su uklonjeni korišćenjem Vivaspin uređaja kao što je opisano gore za koncentrovanje rFSH. rFSH rastvor koji sadrži enzime prenet je u prethodno ispran Vivaspin uređaj. Uređaj je centrifugiran, filtrat je ispušten i retenat je resuspendovan u placebo rastvoru koji sadrži 0,5 mg/ml L metionina, 0,005 mg/ml Polisorbata 20 u 1 mM fosfatnom puferu pH 6,5. Rastvor je centrifugiran ponovo. Ovaj postupak je ponovljen tri puta pre nego što je krajnji retenat prenet u volumetrijsku bočicu i razblažen do željene zapremine sa placebo rastvorom. Ovako se dobija 2,8 mg/ml desijaliliranog rFSH štok rastvora koji sadrži 0,5 mg/ml L metionina, 0,005 mg/ml Polisorbata 20 u 1 mM fosfatnom puferu pH 6,5.

REZULTATI i DISKUSIJA

EFEKAT DSC BRZINE SKENIRANJA NA rFSHTm

[0124]Radi ispitivanja efekta brzine DSC skeniranja na rFSH temperaturu denaturacije,Tmmerenja su izvedena sa tri različite brzine skeniranja. Kao što se može videti u Tabeli 6, rFSH 7~mvarira sa brzinom DSC skeniranja korišćenom tokom merenja.

[0125]Sve dok se temperature denaturacije doijene iz merenja izvedenih sa identičnim brzinama skeniranja porede, činjenica da Tmvarira sa brzinom skeniranja ne utiče na interpretaciju podataka, videti na primer Tabelu 7.

[0126]Ponavljanje DSC skeniranja do 100°C pokazuje da je denaturacija rFSH delimično ireverzibilna pod eksperimentalnim uslovima (videti Fig. 4). Ovo znači da je ponovno savijanje sporije od vremena uravnotežavanja između dva DSC skeniranja, ili da je odvijanje povezano sa ireverzibilnom fazom kao što je naznačeno u jednačini 2.

EFEKAT DODAVANJA KONZERVANSA NA rFSHTm

[0127]Kao što se može videti u Tabeli 7, dodavanje konzervansa u rFSH rastvor, snižava temperaturu denaturacije, 7~m, za 2-6°C, u zavisnosti korišćenog konzervansa. Ovo dobro odgovara prethodno saopštenim podacima i za druge rekombinantne proteine i za urinarno izveden FSH.

[0128]Veće smanjenjeTmdobijeno za rFSH rastvore sa benzil alkoholom u poređenju sa rFSH rastvorima sa fenolom (videti Tabelu 7) može se objasniti zbog više koncentracije benzil alkohola (15 mg/ml) nego fenola (5 mg/ml) korišćenih u eksperimentima.

EFEKAT DODAVANJA RAZLIČITIH SOLI NA rFSHTm

[0129]Rangiranje soli prema njihovim opštim efektima na rastvorljivost i stabilnost proteina poznata je kao Hofmajsterove serije ili liotropne serije, jednačina (3) dole. Agensi isoljavanja na levoj strani, takozvani kosmotropni joni poznati su da daju stabilizirajuće dejstvo na proteine. Gde je za haotropne ili jone usoljavanja na desnoj strani, poznato da destabilizuju proteine.

Efekat dodavanja različitih soli rastvoru bez konzervansa na rFSHTm

[0130]Kada se meri efekat različitih natrijumovih soli na rFSH7~m,prilično iznenađujuće, nije primećeno stabilizirajuće/destabilizirajuće dejstvo očekivano prema Hofmajsterovim serijama kao što je opisano gore, kada su varirani katjoni videti Tabelu 8 i Tabela 9. Bez obzira da li su najviše korišćeni kosmotropni jon, sulfat, ili haotropni jon, perhlorat, porast temperature denaturacije bio je približno isti. U stvari, najveći porast rFSH 7~mdobijen je za soli perhloratnih jona, gde je očekivano destabilizirajuće dejstvo na rFSH. Povećanje 7~mbilo je u istom opsegu i za različite neorganske anjone kao što su sulfat, hlorid i perhlorat, ali takođe i za organske anjone poput citrata, acetata i tartarata.

[0131]Bez dodatka soli:Tm=72,9°C, drugi ekscipijensi prema zaglavlju tabele 0,1 M saharoza: 7~m=73,3°C, drugi ekscipijensi prema zaglavlju tabele

0,1 M saharoza: 0,4°C, drugi ekscipijensi prema zaglavlju tabele

Posmatrani trend da položaj anjona u Hofmajsterovim serijama ne utiče na porast rFSHTmusled dodavanja različitih natrijumovih soli takođe je otkriven za kalijum (videti Tabelu 8 i Tabela 9). Imajući iste katjone, anjon uopšteno samo utiče na promenu rFSH 7~m do manjeg stepena i nikad prema Hofmajsterovim serijama.

[0132]Prilično iznenađujuće, katjoni, s druge strane, utiču na rFSH Tm. Određenije, soli sa monovalentnim katjon pokazuju uopšteno višu rFSH Tmnego dvovalentni joni (videti Tabelu 8). Određenije, monovalentni alkalni metalni joni izazivaju visoku rFSH Tm. Drugim rečima, primećena stabilizirajuća dejstva (tj. porast rFSH Tm) usled dodavanja soli prilično su nezavisna od ispitivanih anjona (videti Tabele 8 i 9), pri čemu katjoni imaju veliki uticaj na stepen stabilizacije. Soli kalijuma i natrijuma pokazuju posebno veliko stabilizirajuće dejstvo.

[0133]Svi gore ispitivani rastvori imaju koncentraciju soli od 0,1 M. Radi ispitivanja efekta koncentracije soli na rFSH Tm, ispitivana su DSC merenja rFSH rastvora koji sadrže tri različite koncentracije natrijum hlorida. Stabilizirajuće dejstvo usled dodavanja soli rFSH rastvoru primećeno je u ćelom opsegu ispitivanih koncentracija soli (videti Tabelu 10).

[0134]Postojeći patenti koji se odnose na upotrebu FSH formulacija npr. saharoza kao stabilizator za FSH. Dodavanje 0,1 M saharoze rFSH rastvoru daje minutnu promenu rFSHTm(videti Tabelu 8 i Tabela 9), ukazujući da je stabilizirajuće dejstvo rFSH usled dodavanja kalijumovih ili natrijumovih soli izrazito veće od efekta dobijenog usled dodavanja saharoze.

Efekti dodavanja različitih soli rastvoru sa dodatim konzervansom na rFSH7~m

[0135]Dobro je poznato da dodavanje konzervanasa proteinskim rastvorima smanjuje stabilnost proteina u rastvoru. Međutim, za vodenu višedoznu formulaciju namenjenu za parenteralnu upotrebu, konzervans je preduslov. Prema tome, od ogromne je važnosti da se nadoknadi smanjenje stabilnosti proteina zbog dodavanja konzervansa dodavanjem stabilizatora, poput soli, rFSH rastvorima.

[0136]Kao što se može videti u Tabeli 11, dodavanje konzervansa rFSH rastvoru rezultuje smanjenjem rFSH temperature denaturacije za 2-3°C.

[0137]Dodavanje soli radi očuvanja rFSH rastvora povećava rFSH temperaturu denaturacije za oko 5°C. Drugim rečima, destabilizirajuće dejstvo primećeno usled dodavanja konzervansa rFSH rastvoru dobro se nadoknađuje dodavanjem soli kao što je definisano ovim pronalaskom. Zapravo, dodavanje soli rFSH rastvorima koji sadrže fenol ne samo da neutrališe dejstvo konzervansa na rFSHTm,ono zapravo povećavaTmu poređenju sa rFSH u vodenom rastvoru bez dodavanja konzervansa ili soli (videti Tabelu 11).

EFEKAT PROMENE pH NA rFSHTm

[0138]Radi ispitivanja efekta pH na rFSHTmsa i bez dodavanja stabilizirajućih soli, rFSH temperatura denaturacije određena je pri pH od 5,5, 6,5 i 7,5 sa i bez dodavanja tri različite natrijumove soli (videti Tabelu 12).

[0139]Kao što se može videti u Tabeli 12, opšta kretanja u rFSH Tmusled dodavanja različitih natrijumovih soli ista su u ćelom pH opsegu od 5,5 do 7,5, to jest, odstupanje od stabilizirajućeg/destabilizirajućeg dejstva soli prema Hofmajsterovim serijama primećeno je na svim ispitivanim pH.

[0140]U ispitivanom pH opsegu, primećene rFSH temperature denaturacije povećavaju se sa povećanjem pH u rastvorima, i sa i bez dodavanja soli (videti Tabelu 12). Stvarni porast rFSH temperature denaturacije usled dodavanja soli, Arm(so), je malo niži pri višem pH (videti Tabelu 12).

EFEKAT rFSH SIJALILACIJE NA rFSHTm

[0141]Kao što je pokazano gore, uticaj dodavanja soli rFSH rastvoru uopšte ne prati, gore opisane, Hofmajsterove serije, gde se očekuje da soli perhloratnih jona destabilizuju proteine (doprinose nižoj 7~mproteina), a za sulfatne jone se očekuje da stabilizuju proteine (doprinose višojTmproteina).

[0142]Budući da je rFSH glikozilovan protein, koji ima brojne ostatke sijalinske kiseline vezane za šećerne ostatke, i stoga prilično visoko negativno naelektrisanje mreže, ispitivan je efekat sijalinske kiseline na neočekivano stabilizirajuće ponašanje soli.

[0143]Za ispitivanje efekta sijalinske kiseline na rFSHTmusled dodavanja različitih soli, pri čemu je sijalinska kiselina enzimski uklonjenja. De-sijalilirani rFSH je potom analiziran pomoću DSC, sa i bez dodavanja soli.

[0144]Da bi se potvrdilo da su uspešno uklonjeni ostaci sijalinske kiseline, rFSH uzorak pre i posle enzimskog uklanjanja sijalinske kiseline analiziran je pomoću MALDI-ToF MS.

[0145]Pod MALDI-ToF MS kiselim uslovima uzorka, alfa- i beta-subjedinice su disocirane i stoga merene odvojeno. Prosečna molekulska masa alfa-subjedinice pre tretiranja sijalidazom je 15000 Da.

[0146]Nakon tretiranja sijalidazom prosečna molekulska masa je 14000 Da.

[0147]Prosečna molekulska masa beta-subjedinice pre tretiranja sijalidazom je 18000 Da, i 17000 Da nakon tretiranja sijalidazom. Pomak u masi za obe subjedinice je rezultat uklanjanja sijalinskih kiselina što rezultuje smanjenjem mase. Praktično, svi ostaci sijalinske kiseline uklonjeni su iz rFSH tokom desijalilacije.

[0148]Porast rFSH Tmusled dodavanja natrijum sulfata ili natrijum perhlorata prati isti trend za nemodifikovan rFSH i de-sijalilirani rFSH, to jest, primećeno stabilizirajuće dejstvo (porast rFSH 7~m) ne prati gore opisane Hofmajsterove serije. Uopšteno primećena 7"m je 2-6°C niža za de-sijalilirani rFSH nego za nemodifikovani rFSH (videti Tabelu 13). Stabilizirajuće dejstvo primećeno usled dodavanja soli je takođe niže za de-sijalilirani rFSH nego za nemodifikovani rFSH (videti Tabelu 13).

[0149]Očekivana je niža Tmdobijena za de-sijalilirani rFSH nego za nemodifikovan rFSH, budući da se veruje da prisustvo sijalinske kiseline na šećernim ostacima na rFSH povećava rFSH stabilnost.

[0150]Činjenica da i nemodifikovan rFSH i de-sijalilirani rFSH prate isti trend (odstupajući od stabilizirajućeg/destabilizirajućeg dejstva prema Hofmajsterovim serijama) usled dodavanja različitih soli, dokazuje da nije samo po sebi prisustvo sijalinskih kiselina na rFSH to što dovodi do ovog efekta.

ZAKUUČCI

[0151]Destabilizirajuće dejstvo (sniženje rFSH 7"m) primećeno za rFSH usled dodavanja konzervansa dobro odgovara znanju iz stanju tehnike u ovoj oblasti.

[0152]Primećeno odstupanje iz Hofmajsterovih serija u rFSH temperaturi denaturacije usled dodavanja soli sa različitim anjonima je, međutim, neočekivano. Prema Hofmajsterovim serijama, (koje rangiraju soli prema njihovim opštim efektima na rastvorljivost i stabilnost proteina), kosmotropni anjoni poput sulfata normalno stabilizuju proteine (dajući višu Tm), pri čemu haotropni anjoni poput perhlorata destabilizuju proteine (dajući nižu Tm). U ovom ispitivanju svi ispitivani anjoni koji imaju isti katjon, pokazuju slični porast rFSH temperature denaturacije. Sasvim suprotno predviđanju iz Hofmajsterovih serija, soli perhloratnih jona pokazuju najveći porast rFSH temperature denaturacije.

[0153]Drugim rečima, primećeno stabilizirajuće dejstvo (tj. porast rFSH 7~m) usled dodavanja soli je sasvim nezavisno od ispitivanih anjona.

[0154]Soli natrijuma i kalijuma pokazuju posebno veliko stabilizirajuće dejstvo. Naročito dodavanje natrijum perhlorata rFSH rastvoru dovodi do velikog povećanja rFSH temperature denaturacije. Međutim, perhlorati su uopšteno visoko reaktivni i oksidirajući su agensi, pa perhlorati stoga nisu odobreni kao neaktivni sastojci u farmaceutskim formulacijama.

[0155]Neočekivano stabilizirajuće dejstvo dobijeno za rFSH usled dodavanja soli ne može se objasniti prisustvom sijalinske kiseline na šećernim ostacima rFSH. Određivanja rFSH temperature denaturacije na de-sijaliliranom rFSH pokazuju da je isti trend u stabilizirajućem dejstvu na rFSH usled dodavanja soli kao na nemodifikovanom rFSH.

Primer 3-Stabilnost u realnom vremenu na rFSH rastvore

CIU ISPITIVANJA

[0156]Predmet ovog ispitivanja bio je da se utvrdi da li stabilnost rFSH u realnom vremenu u različitim formulacijama prati isti trend kao što se vidi u merenjima rFSH temperature denaturacije pomoću tečne DSC kao što je opisano u Primeru 2 i takođe promenama u rFSH sekundarnoj strukturi usled zagrevanja kako je izmereno CD spektroskopijom, kao što je opisano u Primeru 1.

[0157]U ovom ispitivanju određena je strukturna stabilnost rFSH tokom skladištenja, izmerena na osnovu toga kako je rFSH sklon da disocira u svoje monomere.

[0158]Stabilnost rFSH 600 lU/ml formulacija nakon skladištenja na dve različite temperature skladištenja ispitivana je na dugoročnim 5 ± 3°C/ambjentalna RV i ubrzanim 30 ± 2°C/65 ± 5% RV uslovima tokom 6-12 meseci. Sve fiolice skladištene su u obrnutom položaju. Placebo kontrole koje sadrže odgovarajuće formulacije, ali bez dodatog rFSH, čuvane su pod istim uslovima kao što je opisano za aktivan rFSH.

PROIZVOD KOJI SE ISPITUJE

INFORMACIJE 0 ŠARŽI

[0159]rFSH, lekovita supstanca, šarža br 08800060 i šarža br 09800020 proizvedena je od strane Bio-Technologv General (BTG), Izrael. Određivanje biološke aktivnosti gore pomenutih rFSH šarži izvedeno je prema Ph.Eur.

MATERIJALI

Ekscipijensi

[0160]Lista ekscipijenasa korišćenih u ovom ispitivanju opisana je u Tabeli 14.

Sistem kontejner i zatvarač

[0161]Korišćeni materijali primarne ambalaže navedeni su u Tabeli 15.

[0162]Sastav rFSH štok rastvora i različitih formulacija (rFSH i placebo) navedeni su u Tabeli 16, Tabeli 17 i Tabeli 18. Osim za formulaciju koja ne sadrži bilo koji stabilizator/agens toniciteta, koncentracija stabilizator/agens toniciteta podešena je tako da se dobiju izotonični rastvori.

PROIZVODNI POSTUPAK

[0163]Svi rastvori (Tabela 17 i Tabela 18) proizvode se u laboratorijskoj razmeri u Ferring Pharmaceuticals A/S, Kopenhagen, Danska. Proizvodni postupak je rezimiran dole.

Priprema rFSH i placebo formulacija

[0164]Štok rastvori svih ekscipijenasa pripremaju se u Milli-Cl vodi.

[0165]Za pripremanje placebo formulacija, štok rastvori svakog ekscipijensa mešaju se da bi se dobile koncentracije date u Tabeli 18. Pre razblaživanja do željene zapremine, podešava se pH svake formulacije, kada je potrebno.

[0166]Za pripremanje rFSH formulacija, rastvor za razblaživanje priprema se od štok rastvora svakog ekscipijensa. Podešava se pH rastvora za razblaživanje. Rastvori za razblaživanje mešaju se sa rFSH štok rastvorom (videti Tabelu 16) dajući krajnje koncentracije navedene u Tabeli 17.

Sterilna filtracija i aseptičko punjenje

[0167]Krajnje formulacije se sterilno filtriraju korišćenjem 0,22 um PVDF filtera (Millipore). Placebo formulacije se sterilno filtriraju u autoklaviranim staklenim bocama korišćenjem Stericup filtera. rFSH formulacije se sterilno filtriraju u autoklaviranim staklenim bikerima korišćenjem Sterivex-GV filtera i sterilnih Luer Lock špriceva od 20 ml (Braun). Sterilna filtracija, punjenje i čvrsto zatvaranje fiolica izvodi se u LAF komori korišćenjem autoklaviranih fiolica i gumenih čepova. Pre i nakon punjenja, fiolice se produvaju sa gasom azota, prolazeći kroz 0,20 um Millex-FG PFTE filter (Millipore) za najmanje 6 sekundi. Fiolice se napune sa 1,5 ml uzorka po fiolici. Sve fiolice se aseptički pune i odmah zatvaraju gumenim čepovima i alumino flip-off poklopcima.

USLOVI SKLADIŠTENJA

[0168]Uzorci koji sadrže rFSH 600 lU/ml i placebo skladište se tokom 6-18 meseci na 5 ± 3°C/ ambjentalna RV. Dodatno, uzorci se skladište tokom 6-18 meseci na ubrzanim uslovima, 30 ± 2°C/65 ± 5% RV. Na svakoj temperaturi skladištenja, fiolice se skladište u obrnutim položajima. Sve fiolice zaštićene su od svetla.

PROGRAMI STABILNOSTI

[0169]Programi stabilnost za rFSH 600 lU/ml i placebo prikazani su u Tabeli 19 dole.

ANALITIČKI POSTUPCI

[0170]Analitički postupak korišćen u ovom ispitivanju opisan je dole. Prilikom svakog ispitivanja, 2 fiolice rFSH i 1 fiolica odgovarajućeg placeba biće analizirane za svaku formulaciju.

OBLICI NISKE MOLEKULSKE MASE (LMW)

[0171]LMW oblici rFSH određeni su pomoću LC-UV korišćenjem izokratske eluacije na ekskluzionoj (SEC) koloni. Analiza se izvodi korišćenjem kolone na bazi silike sa TRIS puferom kao pokretnom fazom i UV detekcijom. LMW oblici rFSH su pikovi koji eluiraju sa molekulskom masom nižom (nakon) od one od rFSH glavnog pika. LMW oblici određuju se kao procenat oblasti pika od ukupne oblasti pika.

[0172]Za uzorke koji sadrže konzervans, konzervans se uklanja iz uzorka rastvora pre ulaska u ekskluzionu kolonu.

REZULTATI I DISKUSIJA

DISOCIJACIJA rFSH TOKOM SKLADIŠTENJA

[0173]Budući da rFSH gubi svoju bioaktivnost usled disocijacije nekovalentno vezanih monomera, direktan način da se isprati gubitak rFSH aktivnosti zbog disocijacije monomera je da se izmeri količina rFSH LMW oblika u rastvoru. Ova informacija može se preuzeti iz SEC hromatografije, gde je poznato da pik LMW oblika koji eluira nakon rFSH glavnog pika potiče od disociranog rFSH.

[0174]Kao što se može videti u Tabeli 20, sveže pripremljen rFSH rastvor koji sadrži različiti stabilizator, sa i bez dodatog konzervansa otkriva sličnu relativnu količinu disociranog rFSH (LMW oblici). Budući da ograničenje kvantifikovanja SEC postupka je 3% nikakva nedvosmislena diferencijacija između formulacija ne može se izvesti ispod ove granice, što znači da su primećene razlike u LMW oblicima u početnom vremenskom trenutku unutar granica varijacije postupka.

[0175]Već nakon jednomesečnog skladištenja na 30 ± 2°C/65 ± 5% RV, relativna količina disociranog rFSH porasla je za uzorke koji sadrže fenol zajedno sa saharozom ili bez stabilizatora, pri čemu uzorci koji sadrže natrijum sulfat ili natrijum hlorid nisu pokazali bilo kakav značajan porast u disociranom rFSH (videti Tabelu 20).

[0176]Nakon šest meseci skladištenja na 30 ± 2°C/65 ± 5% RV, rFSH uzorak koji sadrži fenol bez dodatog stabilizatora sadrži više od 20% disociranog rFSH (LMW oblici). rFSH uzorci koji sadrže fenol koji imaju saharozu kao stabilizator takođe pokazuju značajan porast disociranog rFSH (više od 10% disociranog rFSH), pri čemu uzorci koji sadrže fenol stabilizovan sa ili natrijum hloridom ili natrijum sulfatom samo pokazuje minutno povećanje u disociranom rFSH (videti Tabelu 20). Uzorci koji ne sadrže nikakav konzervans su najstabilniji prema disocijaciji tokom skladištenja; međutim, za vodenu višedoznu formulaciju namenjenu za parenteralnu upotrebu, potrebno je dodavanje konzervansa, stoga se ova formulacija isključivo dodaje kao poređenje.

[0177]Nakon šest meseci skladištenja na 5 ± 3°C/ ambjentalnoj RV, nijedna od ispitivanih rFSH formulacija nije pokazala porast u relativnoj količini disociranog rFSH (videti Tabelu 21). lako, najmanje 24 mesečno skladištenje na 5°C i prateći jedan mesec, poželjno 3-4 meseci skladištenja na sobnoj temperaturi, je potrebno za komercijalan proizvod rFSH da bi on bio uspešan.

rFSH TEMPERATURA DENATURACIJE, PROMENE U SEKUNDARNOJ STRUKTURI I STEPEN DISOCIJACIJE

[0178]Budući daje cilj ovog primera bio da odredi korelaciju između podataka ispitivanja stabilnosti u realnom vremenu, određivanja rFSH temperature denaturacije pomoću DSC i podaci rFSH sekundarne strukture određeni pomoću CD spektroskopije, deo DSC podataka (videti Primer 2) i deo CD podataka (videti Primer 1) dati su dole. Svi detalji predstavljenih DSC rezultata dati su u Primeru 2, a detalji CD podataka dati su u Primeru 1.

[0179]Kao što se može videti u Tabeli 22, rFSH temperatura denaturacije dobijena pomoću DSC dobro koreliše sa podacima za stabilnost u realnom vremenu nakon šest meseci skladištenja na 30 ± 2°C/65 ± 5% RV, gde je slična korelacija između DSC i stabilnosti u realnom vremenu kako je analizirana pomoću SEC prethodno predstavljena za rekombinantna antitela i rekombinantne glikoproteine (videti npr. Burton et al (2007), Pharm. Dev. Technol. 12:265-273 i Remmele et al (1998), Pharm. Res. 15:200-208). rFSH rastvor bez dodatog konzervansa stabilizovan sa natrijum sulfatom pokazuje samo nizak stepen disociranog rFSH nakon skladištenja za šest meseci, pri čemu takođe pokazuje značajno višu temperaturu denaturacije od rastvora koji sadrži konzervans. Dalje se može videti da za rastvore koji sadrže konzervans (fenol) dodavanje soli, ili natrijum hlorida ili natrijum sulfata, doprinosi značajno nižem stepenu disociranog rFSH nakon šest meseci skladištenja, nego što je kod rastvora koji sadrže saharozu ili nemaju stabilizator. Temperatura denaturacije za rFSH bez dodatog stabilizatora je takođe značajno niža od rFSH 7~mza rastvore koji sadrže so. rFSH temperatura denaturacije za rastvore koji sadrže saharozu sa dodatkom fenola nije određivana, međutim, kao što se može videti u Tabeli 23, merenja rFSH 7~m za rastvore bez dodatog konzervansa, pokazuju isti trend kao podaci za stabilnost u realnom vremenu nakon šest meseci skladištenja na 30 ± 2°C/65 ± 5% RV (videti Tabelu 22). Kao zaključak, NaCI i Na2S04su značajno bolji stabilizatori od saharoze prema strukturnoj razgradnji. Ovo je prikazano i Tmmerenjima (videti Tabelu 23) i podacima za stabilnost u realnom vremenu (videti Tabelu 22).

[0180]Nikakvi podaci stabilnosti u realnom vremenu za rastvore koji sadrže benzil alkohol kao konzervans nisu određivani, međutim, kada se uporede rFSH temperatura denaturacije kako je određena pomoću DSC i promene u rFSH sekundarnoj strukturi usled zagrevanja kako je određeno CD spektroskopijom, primećuje se isti trend (videti Tabelu 24). Određivana je sekundarna struktura rFSH za različite uzorke proteina; sekundarna struktura određena na 24°C može se smatrati kao nativna struktura, a ovde nikakve razlike u rFSH sekundarnoj strukturi nisu primećene za rFSH rastvore usled dodavanja ili benzil alkohola (0,17 mg/ml) ili natrijum sulfata.

[0181]lako, kada se zagrevaju rastvori do 76,5°C, primećen gubitak u rFSH sekundarnoj strukturi varira sa dodatim ekscipijensima. Dodavanje konzervansa (benzil alkohol) dovodi do većeg gubitka rFSH sekundarne strukture nego za rFSH rastvore koji ne sadrže nikakav konzervans, dok dodavanje soli (natrijum sulfat) doprinosi manjem gubitku rFSH sekundarne strukture nego za rFSH rastvore bez dodate soli. Gubitak uređene rFSH sekundarne strukture može se tumačiti kao delimična ili potpuna denaturacija proteina.

Primer 4-Podaci iz diferencijalne skenirajuće kalorimetrije ( DSC) za hCG

[0182]Humani horionski gonadotropin (hCG) je heterodimerni protein koji se sastoji od dva glikozilovana monomera: ct-subjedinice od 92 aminokiseline koja je zajednička za hCG, folikulostimulišući hormon (FSH), luteinizirajući hormon (LH) i tireostimulišući hormon (TSH), i Is-subjedinice od 145 aminokiseline koja je specifična za hCG. Glikoproteinski hormoni, koji obuhvataju FSH i hCG, svi gube svoju bioaktivnost usled disocijacije nekovalentno vezanih monomera. Rezultati iz analiza stabilnosti ukazuju da se nestabilnost rekombinantnog FSH (rFSH) pre svega bazira na dimernoj disocijaciji (razgradnja kvaternarne strukture, i prateće smanjenje u imunovezujućem odgovoru).

[0183]Cilj ovog primera je da utvrdi da li se ranije primećena zavisnost raznih šećera i soli od rFSH temperature denaturacije, kako je određeno pomoću DSC, a kao što je opisano u primerima 1 - 3 gore, takođe primećuje za veoma slične proteine hCG. Dodatno, DSC temperatura denaturacije za hCG određena u ovom ispitivanju poređena je sa prethodno objavljenim podacima za stabilnost u realnom vremenu (Samaritani, F. 1995, hCG liquid formulations. EP 0 814, 841).

[0184]Temperatura denaturacije od hCG ispitivana je u prisustvu i odsustvu 0,1 M raznih natrijumovih soli ili saharoze u 1 mM fosfatnom puferu koji sadrži 0,5 mg/ml L-metionina i 0,005 mg/ml Polisorbata 20. Ispitivana su četiri različita šećera i soli; saharoza, natrijum sulfat, natrijum hlorid i natrijum perhlorat.

Urinarno izveden humani horionski gonadotropin (hCG)

[0185]Korišćena je hCG, lekovita supstanca, šarža br. 2823287510 (7059 lU/mg) prečišćena iz humanog urina od Massone S.A., Argentina. Materijal je čuvan u frižideru na 2-8°C.

[0186]Određivanje biološke aktivnosti prethodno navedene hCG šarže izvedeno je prema Ph.Eur.

[0187]rFSH i drugi materijali korišćeni su kao što je opisano u primerima 2-3.

[0188]Sastav različitih hCG formulacija naveden je u Tabeli 26.

PROIZVODNI POSTUPAK

[0189]Svi rastvori (Tabela 26) proizvedeni su u laboratorijskoj razmeri u Ferring Pharmaceuticals A/S, Kopenhagen, Danska.

Priprema hCG formulacija

[0190]Štok rastvori svih ekscipijenasa pripremljeni su u Milli-Q. vodi. Placebo rastvori sa raznim ekscipijensima pripremljeni su od štok rastvora.

[0191]hCG lekovita supstanca rastvorena je u placebo rastvorima da bi se dobile koncentracije date u Tabeli 26. Budući da podaci stabilnosti za ove formulacije nisu bili dostupni, DSC analize uvek su izvođene na sveže pripremljenim uzorcima; u okviru jednog sata od pripreme uzorka.

[0192]Kao što se može videti na Fig. 4 i Tabeli 27, temperatura denaturacije, Tm, za hCG je niža od Tm za rFSH. Dodatno, entalpija procesa denaturacije (tj. veličina pika denaturacije) je značajno manja za hCG nego za rFSH. Za razliku od rFSH gde je proces denaturacije skoro u potpunosti ireverzibilan nakon zagrevanja rFSH uzoraka do 100°C, proces denaturacije nakon zagrevanja hCG do 100°C je, u većoj meri, reverzibilan (2).

EFEKAT DODAVANJA ŠEĆERA ILI SOLI NA hCG I rFSH TM

[0194]Očekuje se da će dodavanje soli vodenim rastvorima proteina da utiče na stabilnost proteina u rastvoru i stoga da utiče na temperaturu denaturacije proteina.

[0195]Kada se meri efekat raznih natrijumovih soli na hCG i rFSH Tm prilično je iznenađujuće da stabilizirajuće/destabilizirajuće dejstvo očekivano prema Hofmajsterovim serijama nije primećeno kada se variraju anjoni, videti Fig. 5, Fig. 6 i Tabelu 27. Za hCG i natrijum sulfat i natrijum hlorid zapravo destabilizuju protein, dok za rFSH ove soli stabilizuju protein. Za i hCG i rFSH natrijum perhlorat, za koji se očekuje da ima destabilizirajuće dejstvo na proteine, ustvari povećava Tm najviše od svih ispitivanih šećera i soli.

Tabela 27: Temperatura denaturacije, Tm, i promena temperature denaturacije, ATm (šećer/so), za hCG uzorke koji sadrže 5 mg/ml hCG, 0,5 mg/ml L-metionina, 0,005 mg/ml Polisorbata 20,1 mM natrijum fosfatni pufer pH 6,5 usled dodavanja 0,1 M šećera ili soli i rFSH uzorke koji sadrže 2,4 mg/ml rFSH, 0,5 mg/ml L-metionina, 0,005 mg/ml Polisorbata 20,1 mM natrijum fosfatni pufer pH 6,5 usled dodavanja 0,1 M šećera ili soli. ATm (šećer/so)=Tm(šećer/so) -Tm(bezše(;era/soii)-

EFEKAT DODAVANJA ŠEĆERA ILI SOLI NA HCG I RFSH ČISTOĆU

Disocijacija rFSH subjedinica, rFSH čistoća tokom skladištenja

[0196]Budući da rFSH gubi svoju bioaktivnost usled disocijacije nekovalentno vezanih monomera, a direktan način za praćenje gubitka rFSH aktivnosti zbog monomerne disocijacije je da se meri količina rFSH LMW oblika u rastvoru. Ova informacija može se preuzeti od SEC hromatografije, gde se zna da LMW oblici koji eluiraju nakon rFSH glavnog pika potiču od disociranog rFSH.

[0197]U ispitivanoj formulaciji, ni jedno drugo jedinjenje srodno proteinu, kao što su rFSH agregati nije primećeno. Stoga, rFSH proteinska čistoća može se izračunati kao

[0198]Kao što se može videti u Tabeli 28, sveže pripremljeni rFSH rastvori koji sadrže različiti šećer ili soli, sa i bez dodatog konzervansa pokazuju sličnu čistoću, to jest, sličnu relativnim količinama disociranog rFSH (LMW oblici).

[0199]Već nakon mesec dana skladištenja na 30°C, rFSH čistoća se smanjuje za uzorke koji sadrže fenol zajedno sa saharozom ili nemaju šećer ili so, pri čemu uzorci koji sadrže fenol i natrijum sulfat ili natrijum hlorid zajedno sa uzorcima bez dodatog fenola nisu pokazali nikakvo značajno smanjenje u rFSH čistoći (videti Tabelu 28). Nakon šest meseci skladištenja na 30°C, rFSH uzorci koji sadrže fenol bez dodatog šećera ili soli daju rFSH čistoću manju od 80%. rFSH uzorci koji sadrže fenol imajući saharozu kao stabilizator takođe pokazuju značajno smanjenje u rFSH čistoći, pri čemu uzorci koji sadrže fenol stabilizovani sa ili natrijum hloridom ili natrijum sulfatom samo pokazuju minutno smanjenje u rFSH čistoći (videti Tabelu 28). Uzorci koji ne sadrže nikakav konzervans su najstabilniji prema disocijaciji tokom skladištenja, tj. pokazuju najveću čistoću, međutim, za vodenu višedoznu formulaciju namenjenu za parenteralnu upotrebu, potrebno je dodavanje konzervansa.

Čistoća hCG tokom skladištenja

[0200]Ranije objavljeni podaci za promene u hCG čistoći usled skladištenja korišćeni su za poređenje sa gore predstavljenim podacima za rFSH stabilnost (Samaritani,supra).

[0201]Već nakon jednog meseca skladištenje na 50°C, hCG čistoća značajno se smanjuje.

[0202]Smanjenje je značajno veće za uzorke koji sadrže natrijum hlorid nego za uzorke koji sadrže saharozu (videti Tabelu 29). Nakon šest nedelja skladištenja na 50°C, hCG čistoća uzoraka koji sadrže natrijum hlorid je više od 10% niža nego za uzorke koji sadrže saharozu.

POREĐENJE hCG I rFSH TMI ČISTOĆE

[0203]Kao što se može videti u Tabeli 30, i rFSH i hCG temperatura denaturacije dobijena pomoću DSC dobro koreliše sa rFSH i hCG čistoćom kako je dobijena iz podataka za stabilnost u realnom vremenu. Slična korelacija između DSC i stabilnosti u realnom vremenu kako je analizirano pomoću SEC prethodno je predstavljena za rekombinantna antitela i rekombinantne glikoproteine.

[0204]Podaci stabilnosti u realnom vremenu za rFSH određeni su na 30°C. Budući daje rFSH proizvod namenjen za dugoročno skladištenje u frižideru, 25-30°C je pogodan opseg za ubrzano ispitivanje stabilnosti. Podaci za stabilnost u realnom vremenu za hCG samo su dostupni za do 12 nedelja skladištenja na 50°C, 11 nedelja skladištenja na 25°C i 40°C i 6 nedelja skladištenja na 50°C5 Za temperature od 40°C ili niže, smanjenje hCG čistoće je manje od 6% tokom skladištenja i za formulacije sa saharozom i natrijum hloridom i stoga teško je napraviti razliku između efekta raznih šećera i soli već nakon 11-12 nedelja skladištenja. Samo na 50°C, razne formulacije mogu se jasno razlikovati, iako je trend primećen na nižim temperaturama isti kao na 50°C.

ZAKUUČCI

[0205]Ispitivanja hCG i rFSH stabilnosti u raznim rastvorima pomoću hCG i rFSH temperatura denaturacije kao i hCG i rFSH čistoća nakon skladištenja na povišenim temperaturama daju nedvosmislen dokaz za uticaj različitih šećera i soli na hCG i rFSH stabilnost u rastvoru. Dva korišćena postupka, tečna DSC i SEC hromatografija, pokazuju saglasne rezultate. Ovi rezultati jasno su potvrđeni prisutnim podacima za stabilnost u realnom vremenu.

[0206]Ispitivanja rFSH stabilnosti u raznim rastvorima pomoću promena u rFSH sekundarnoj strukturi (CD spektroskopijom - Primer 1), rFSH temperature denaturacije (promene u tercijarnoj i kvaternarnoj strukturi pomoću DSC - Primer 2) ili relativne količine disociranog rFSH formiranog nakon skladištenja na 30 ± 2°C/65 ± 5% RV (promene u kvaternarnoj strukturi pomoću SEC - Primer 3) daju nedvosmislen dokaz za uticaj konzervanasa i stabilizatora na rFSH stabilnost u rastvoru. Sva tri korišćena postupka, CD, DSC i SEC hromatografija pokazuju saglasne rezultate.

[0207]Zaključivanjem rezultata iz svih primera 1-3, jasno se može videti da dodavanje konzervansa, fenola ili benzil alkohola, smanjuje rFSH stabilnost u rastvoru. Očekuje se da će drugi fenolni konzervansi, poput m-krezola i hlorokrezola dovesti do sličnih destabilizirajućih dejstava.

[0208]Destabilizirajuće dejstvo primećeno za rFSH usled dodavanja konzervansa dobro odgovara znanju stanja tehnike u ovoj oblasti.

[0209]Dodavanje farmaceutski prihvatljive soli alkalnog metala Na<+>ili K<+>u rFSH rastvore neutrališe destabilizirajuće dejstvo konzervanasa na rFSH i - najpogodnije - povećava stabilnost rFSH u rastvoru u poređenju sa rFSH rastvorima koji ne sadrže ni konzervans ni so. Sve ispitivane natrijumove i kalijumove soli dovode do povećane rFSH stabilnosti nezavisno od korišćenih anjona; npr. neorganski anjoni poput sulfata, hlorida i perhlorata i takođe koričćenja organskih anjona poput citrata, acetata i tartarata. Variranje katjona soli daje veliki uticaj na stepen rFSH stabilizacije; monovalentni katjoni, specifičnih soli sa katjonima natrijum ili kalijum dovodi do izraženog stabilizirajućeg dejstva na rFSH. Dodavanje natrijum perhlorata u rFSH rastvor dovodi do najstabilnijih rFSH rastvora, međutim, perhlorati su uopšteno veoma reaktivni i oksidirajući agensi i prema tome perhlorati nisu odobreni kao neaktivni sastojci u farmaceutskim formulacijama. Stoga, natrijumove soli ili kalijumove soli sulfata i hlorida, su najpovoljniji stabilizirajući agensi.

[0210]Dodavanje saharoze u hCG ili rFSH rastvore daje blagi porast u stabilnosti proteina, i za hCG i rFSH, dok dodavanje natrijum hlorida ima destabilizirajuće dejstvo na hCG i stabilizirajuće dejstvo na rFSH (videti primer 4). Dodavanje natrijum perhlorata u hCG i rFSH rastvore ima stabilizirajuće dejstvo na oba hCG i rFSH (primer 4). Stabilizirajuće dejstvo ovih soli na rFSH rastvore je iznenađujuće veoma bolje od stabilizirajućeg dejstva primećenog za saharozu.

[0211]Zaključci na osnovu ovih rezultata su sledeći:

1) pod ispitivanim uslovima, dejstva soli na hCG i rFSH stabilnost ne prate Hofmajsterove serije

2) uprkos činjenici da su hCG i FSH strukturno veoma slični (tj. pripadaju istoj klasi proteina, oba su

glikozilovani i oba se sastoje od dve subjedinice u kojima je a-subjedinica identična u dva proteina), dejstvo raznih šećera i soli poput saharoze i natrijum hlorida na stabilnost proteina se razlikuje za hCG i rFSH. Veoma iznenađujuće je, za veoma slične proteine poput hCG i rFSH, da soli ne pokazuju isto stabilizirajuće dejstvo.

3) Na<+->i K<+->soli pokazuju svoje stabilizirajuće dejstvo na FSH rastvore, nezavisno od korišćenih

anjona.

4) stabilizirajuće dejstvo Na<+->i K<+->soli na FSH rastvore može se suprostaviti destabilizirajućem dejstvu konzervanasa.

SKRAĆENICE I DEFINICIJE

[0212]Sledeće skraćenice i definicije korišćene su u tekstu i primerima:

A7"mPromena temperature denaturacije usled dodavanja konzervansa ili soli, videti dalje Tm

MPO Medicinski potpomognute oplodnje

BA benzil alkohol

BTG Bio-Technology General

CD Cirkularni dihroizam

CHO Ćelije jajnika kineskog hrčka

CoA Sertifikat analize

DNK Dezoksiribonukleinska kiselina

DSC Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija

FSD Ženska seksualna disfunkcija

FSH Folikulostimulišući hormon

hCG Humani horionski gonadotropin

IU Internacionalne jedinice A mera rFSH bioaktivnosti kako je određeno Steelman-Pohlev biološkim

ogledom prema Ph.Eur. i USP.

IUI Intrauterina inseminacija

LC-UV Tečna hromatografija sa ultravioletnom detekcijom

LH Luteinizirajući hormon

LMW Oblik niske molekulske mase, sastoji se uglavnom ili isključivo od disociranog monomernog

proteina.

01 Indukcija ovulacije

p.a. Pred analiza

Ph. Eur. Evropska Farmakopeja

RH Relativna vlažnost

rFSH Rekombinantni humani folikulostimulišući hormon

SEC Ekskluziona hromatografija

SRCD Cirkularni dihroizam sa sinhrotronskim zračenjem

7~m Središnja tačka termalnog prelaza ili središnja tačka prelaza ili temperatura denaturacije Temperatura kada je polovina proteinskih molekula savijena, a polovina proteinski molekuli je

nesavijena.

TRIS 2-Amino-2-hidroksimetil-propan-l,3-diol

TSH Tireostimulišući hormon

USP Farmakopeja Sjedinjenih Američkih Država

UV Ultraljubičasto zračenje

Claims (10)

1.Upotreba soli koje obuhvataju farmaceutski prihvatljive katjone alkalnih metala radi ograničavanja tendencije FSH da disocira u tečnoj FSH formulaciji, u kojoj je so Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04.

2.Upotreba prema zahtevu 1, u kojoj je so sadržana u količini od 20 do 500 mM, ili u količini od 30-300 mM ili u količini od 50-200 mM.

3.Upotreba prema zahtevu 1 i/ili 2, u kojoj FSH formulacija predstavlja rFSH formulaciju.

4.Upotreba prema bilo kom od zahteva 1 do 3, u kojoj formulacija dodatno obuhvata konzervans.

5.Upotreba prema zahtevu 4, u kojoj formulacija obuhvata benzil alkohol, fenol i/ili m-krezol.

6.Upotreba prema bilo kom od zahteva 1 -5, u kojoj je formulacija neka injektibilna formulacija.

7.Postupak za ograničavanje tendencije FSH da disocira u tečnoj FSH formulaciji, pri čemu taj postupak obuhvata fazu dodavanja pomenutoj formulaciji soli koje obuhvataju farmaceutski prihvatljive katjone alkalnih metala, gde je pomenuta so Na2S04ili kombinacija NaCI i Na2S04.

8.Postupak prema zahtevu 7, u kom FSH predstavlja rFSH.

9.Postupak prema bilo kom od zahteva 7 i/ili 8, u kom formulacija dodatno obuhvata konzervans.

10.Postupak prema zahtevu 9, u kom je konzervans izabran iz grupe koja se sastoji od benzil alkohola, fenola i m-krezola.