RS55843B1 - Humanizovana antitela za liv-1 i upotreba istih u lečenju kancera - Google Patents

Humanizovana antitela za liv-1 i upotreba istih u lečenju kancera

Info

Publication number
RS55843B1
RS55843B1 RS20170310A RSP20170310A RS55843B1 RS 55843 B1 RS55843 B1 RS 55843B1 RS 20170310 A RS20170310 A RS 20170310A RS P20170310 A RSP20170310 A RS P20170310A RS 55843 B1 RS55843 B1 RS 55843B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
liv
antibodies
humanized
binding
Prior art date
Application number
RS20170310A
Other languages
English (en)
Inventor
Maria Leia Smith
Django Sussman
William Arthur
Albina Nesterova
Original Assignee
Seattle Genetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seattle Genetics Inc filed Critical Seattle Genetics Inc
Publication of RS55843B1 publication Critical patent/RS55843B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

POZADINA
[0001]LIV-1 je član LZT (LIV-1-ZIP Cink transportera) podfamilije cink transportnih proteina. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 1611: 16-30 (2003). Kompjuterska analiza proteina LIV-1 otkriva potencijalni metaloproteazni motiv, ugradnju konsenzus sekvence za katalitičko cink-vezujuće mesto motiva cink metaloproteaze. LIV-1 mRNK se prvenstveno eksprimira u dojci, prostati, hipofizi i moždanom tkivu.
[0002]LIV-1 protein je takođe impliciran pri određenim kancerogenim uslovima, npr. rak dojke i rak prostate. Otkrivanje LIV-1 je povezano sa estrogenim receptorno-pozitivnim kancerom dojke, McClelland et al., Br. J. Cancer 77: 1653-1656 (1998) i metastatsko širenje ovih kancera do regionalnih limfnih čvorova. Manning et al., Eur. J. Cancer 30A: 675-678 (1994). Mišja anti-LIV-1 antitela proizvedena pomoću hibridoma (ATCC-5705, ATCC-5706 i ATCC-5707 su opisana u WO 2004/067564.
REZIME PATENTNOG PRONALASKA
[0003]Pronalazak obczbcđujc humanizovano antitclo, pri čemu zreli varijabilni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR: 52 ili 53 i zreli varijabilni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR: 59 ili 60.
[0004]Pronalazak takođe obezbeđuje humanizovano antitelo koje sadrži zreli varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa SEK ID BR: 53 pod uslovom da je položaj H27 zauzet od strane L, položaj H29 zauzet od strane I, H30 od strane E i H94 od strane V i zreli varijabilni region lakog lanca je najmanje 90% identičan sa SEK ID BR: 60 pod uslovom da je položaj L36 zauzet od strane Y i položaj L46 od strane P. Opciono, humanizovano antitelo sadrži tri CDR-a iz SEK ID BR: 53 i tri CDR-a iz SEK ID BR: 60. Ovi CDR segmenti su prikazani na Slici. 16. Opciono, položaj H76 zauzima N. Opciono, humanizovano antitelo sadrži zreli varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu sa SEK ID BR: 53 i zreli varijabilni region lakog lanca najmanje 95% identičan sa SEK ID BR: 60. Opciono, zreli varijabilni region teškog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca i zreli konstantni region lakog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca. Opciono, konstantni region teškog lanca je mutant oblik prirodnog humanog konstantnog regiona koji ima smanjeno vezivanje za receptor Fc gama u odnosu na prirodni humani konstantni region. Opciono, konstantni region teškog lanca je IgGl izotipa. Opciono, konstantni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 44 i konstantni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 42. Opciono, konstantni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 46 (S239C) i konstantni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja uključuje SEK ID BR: 42. U nekim takvim humanizovanim antitelima, bilo koje razlike u CDR segmentima zrelog varijabilnog regiona teškog lanca i zrelog varijabilnog regiona lakog lanca iz SEK ID BR-a 52 i 60, se respektivno nalaze u položajima H60-H65. U nekim ovakvim humanizovanim antitelima, zreli varijabilni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR: 52 ili 53 i zreli varijabilni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR: 59 ili 60. U nekim takvim humanizovanim antitelima, zreli varijabilni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR: 53 i zreli varijabilni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR: 60. Neka takva humanizovana antitela su konjugovana sa citotoksičnim ili citostatičkim agensom. Neka takva humanizovana antitela imaju konstantu asocijacije za humani ili makaki majmuna LIV-1 od 0,5 do 2 x IO9 M"1.
[0005]Pronalazak takođe obezbeđuje humanizovano antitelo koje sadrži zreli varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri Kabat CDR regiona od SEK ID BR: 52, pri čemu položaj H27 zauzima L, položaj H29 zauzima I, H30 od E, H76 od N, i H94 od V i zreli varijabilni region lakog lanca sadrži tri Kabat CDR regiona od SEK ID BR: 60 pod uslovom da položaj L36 zauzima Y i položaj L46 od P. Pronalazak takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu ili nukleinske kiseline koje kodiraju zreli varijabilni region teškog lanca i zreli varijabilni region lakog lanca bilo kojeg od gore definisanih humanizovanih antitela.
[0006]Pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano antitelo prema pronalasku za upotrebu u lečenju pacijenta koji ima ili je pod rizikom od nastanka kancera. Kancer može biti na primer kancer dojke, kancer grlića materice, melanom ili kancer prostate.
[0007]Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži humanizovano antitelo kao što je gore definisano.
[0008]Takođe su opisani postupci za lečenje subjekta koji pati od melanoma koji eksprimira LIV-1 protein davanjem subjektu LIV-1 specifičnog antitela ili LIV-1 antitelo lek konjugata, u količini dovoljnoj da inhibira rast ćelija kancera melanoma.
[0009]Takođe su opisani postupci za lečenje subjekta koji pati od raka grlića materice koji eksprimira LIV-1 protein davanjem subjektu LIV-1 specifičnog antitela ili LIV-1 antitelo lek konjugata, u količini dovoljnoj da inhibira rast ćelija kancera grlića materice.
[0010]Takođe je ovde opisano humanizovano antitelo koje sadrži zreli varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa HB (SEK ID BR: 10) i zreli varijabilni region lakog lanca najmanje 90% identičan sa LB (SEK ID BR: 15). Opciono, antitelo sadrži zreli varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičanu sa HB i zreli varijabilni region lakog lanca najmanje 95% identičan sa LB. Opciono, u svakom takvom antitelu, položaje H29, H30 i H76 zauzimaju I, E i N i L36 zauzima Y. Opciono, svaka razlika u varijabilnom regionu okvira iz zrelog varijabilnog regiona teškog lanca i SEK ID BR: 10 je/su izabrana(i) iz grupe koju čine H27 koji zauzima F, H28 koji zauzima N, H48 koj zauzima I, H66 koji zauzima K, H67 koji zauzima A, H71 koji zauzima A, H76 koji zauzima N, H93 koji zauzima N, H94 koji zauzima V, L37 koji zauzima L, L39 koji zauzima K, L45 koji zauzima K, i L46 koji zauzima L. Opciono, 3 CDR-a zrelog varijabilnog regiona teškog lanca su oni iz SEK ID BR: 10 i 3 CDR-a zrelog varijabilnog regiona lakog lanca su oni iz SEK ID BR: 15. CDR-ovi su prikazani na Slici. 1. Opciono, zreli varijabilni region teškog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca i zreli konstantni region lakog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca. Opciono, konstantni region teškog lanca je mutant oblik prirodnog humanog konstantnog regiona koji ima smanjeno vezivanje za receptor Fcgamma u odnosu na prirodni humani konstantni region. Opciono, konstantni region teškog lanca je IgGl izotipa. Opciono, konstantni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 6 i konstantni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 4. Opciono, konstantni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 8 (S239C) i konstantni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 4. Opciono, bilo koje razlike u CDR regionima zrelog varijabilnog regiona teškog lanca i zrelog varijabilnog regiona lakog lanca iz SEK ID Br-a. 10 i 15, odnosno nalaze se u položajima H60-H65. Opciono, zreli varijabilni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja uključuje SEK ID BR: 10 i zreli varijabilni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja uključuje SEK ID BR: 15. Opciono, antitelo je konjugovano sa citotoksičnim ili citostatičkim agensom. Poželjna humanizovana antitela imaju veći afinitet za LIV-1 od BR2-14a antitela. U drugom izvođenju, humanizovano antitelo ima konstantu asocijacije za humani ili makaki majmuna LIV-1 od 0,5 do 2x10<9>M<_1>.
[0011]Takođe je opisano humanizovano antitelo koje sadrži zreli varijabilni region teškog lanca koji sadrži 3 CDR-a iz SEK ID BR: 10 i gde položaje H29, H30 i H76 zauzimaju I, E i N respektivno i zreo varijabilni region lakog lanca koji sadrži 3 CDR-a iz SEK ID BR: 15, a pri čemu položaj L36 zauzima
Y.
[0012]Takođe je opisana nukleinska kiselina koja kodira zreli varijabilni region teškog lanca i / ili zreo varijabilni region lakog lanca bilo kog od humanizovanih antitela gore opisanih.
[0013]Takođe je opisan postupak lečenja pacijenta koji ima ili je pod rizikom od kancera, koji se sastoji od davanja pacijentu efikasnog režima humanizovanog antitela kao što je gore opisano. Opciono, karcinom je kancer dojke, kancer grlića materice, melanom ili kancer prostate.
[0014]Takođe je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži humanizovano antitelo kao što je gore opisano.
[0015]Takođe je opisan postupak lečenja pacijenta koji ima ili je pod rizikom od trostruko negativnog kancera dojke, koji se sastoji od davanja pacijentu efikasnog režima antitela koje se specifično vezuje za LIV-1. Opciono, u takvim postupcima, antitelo je konjugovano sa citotoksičnim ili citostatičkim agensom.
KRATAK OPIS SLIKA
[0016]SI. 1 prikazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci roditeljskog mišjeg mAt (koje se naziva BR2-14a) sa humanizovanim LIV-1 varijabilnim regionima teškog (gornja dva panela) i lakog lanca (gornja dva panela).
SI. 2 prikazuje krive vezivanja za humanizovana LIV-1 mAt-a i roditeljsko mišje antitelo (koje se naziva BR2-14a).
SI. 3 prikazuje rezultate studije kompetitivnog vezivanja humanizovanih LIV-1 mAt-a i roditeljskog mišjeg antitela (koje se naziva BR2-14a). Brojevi u zagradama nakon svake varijante ukazuju na broj povratnih mutacija.
SI. 4 prikazuje rezultate studija saturacionog vezivanja na MCF7 ćelijama. BR2-14a-AF se odnosi na AF-obeleženo roditeljsko mišje antitelo. hLIV-14 se odnosi na AF-obeleženo HBLB antitelo, humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za LIV-1.
SI. 5 prikazuje rezultate studija kompetitivnog vezivanja na CHO ćelijama koje eksprimiraju rekombinantni LIV-1 protein. BR2-14a se odnosi na roditeljsko mišje antitelo. hLIV-14 HBLB WT se odnosi na HBLB antitelo. hLIV-14 HBLB S239C se odnosi na HBLB antitelo koje ima supstitucije serina do cisteina na svakom položaju u teškom lancu.
SI. 6 prikazuje analizu ekspresije LIV-1 proteina IHC-om na post-hormonski tretiranim uzorcima pacijenata sa karcinomom dojke.
SI. 7 prikazuje analizu ekspresije LIV-1 proteina IHC-om na uzorcima pacijenata kod hormonski-refraktornog metastatskog karcinoma prostate.
SI. 8 prikazuje analizu ekspresije LIV-1 proteina IHC-om na trostruko negativnim uzorcima pacijenata sa karcinomom dojke.
SI. 9 prikazuje rezultate eseja citotoksičnosti na hLIV-14 antitelo lek konjugate, tj HBLB mAt konjugovano sa vcMMAE (1006) ili mcMMAF (1269), kao i konjugate kontrolnih mišjih (mlgG) i humanih (hlgG) antitela. hLIV-14-SEA-1006 se odnosi na ne-fukozilovani oblik HBLB mAt-a konjugovanog sa vcMMAE (1006).
SI.10prikazuje rezultate in vitro ADCC ispitivanja na MCF7 ćelijama korišćenjem humanih NK ćelija (davalac 1; V/V). hLIV-14 WT se odnosi na HBLB mAt. hLIV-14 SLA se odnosi na ne-fukozilovani oblik HBLB mAt. hLIV-14 mcMMAF se odnosi na konjugat antitelo lek od HBLB mAt konjugovanog sa mcMMAF. hLIV-14 vcMMAE se odnosi na konjugat antitelo lek od HBLB mAt konjugovanog sa vcMMAE. hLIV-14 SEA vcMMAE se odnosi na ne-fukozilovani oblik HBLB mAt-vcMMAE konjugata antitelo lek.
SI. 11 prikazuje rezultate in vitro ADCC ispitivanja na MCF7 ćelijama korišćenjem humanih NK ćelija (davalac 2). hLIV-14 WT se odnosi na HBLB mAt. hLIV-14 SEA se odnosi na ne-fukozilovani oblik HBLB mAt. cLIV-14 SEA se odnosi na ne-fukozilovani oblik himernog roditeljskog mišjeg antitela. hLIV-14 mcF (4) se odnosi na konjugat antitelo lek od HBLB mAt-a sa prošekom od 4 mcMMAF linker molekula leka po antitelu. hLIV-14 vcE (4) SEA se odnosi na ne-fukozilovani oblik HBLB mAt-vcMMAE konjugata antitelo lek koji ima prošek od četiri vcMMAE linker molekula leka po antitelu. hlgG se odnosi na kontrolni humani IgG. HOO-mcF (4) se odnosi na kontrolni konjugat antitelo lek od nevezujućeg antitela sa prošekom od 4 mcMMAF linker molekula leka po antitelu. HOO-vcE (4) se odnosi na kontrolni konjugat antitelo lek od nevezujućeg antitela sa prošekom od 4 vcMMAE linker molekula leka po antitelu.
SI. 12prikazuje rezultate studije ksenografta iz MCF7 linije kancera dojke kod golih miševa. cLIV-14-mcMMAF (4) se odnosi na konjugat antitelo lek od himernog oblika roditeljskog mišjeg antitela koje ima u prošeku 4 mcMMAF linker molekula leka po antitelu. cLIV-14-vcMMAE (4) označava konjugat antitelo lek himernog oblika od roditeljskog mišjeg antitela koje ima u prošeku 4 vcMMAE linker molekula leka po antitelu. HOO-mcMMAF (4) se odnosi na konjugat antitela leka od nevezujućeg kontrolnog antitela koje ima u prošeku 4 mcMMAF linker molekula leka po antitelu. HOO-vcMMAE (4) se odnosi se na konjugat antitelo lek od nevezujućeg kontrolnog antitela koje ima u prošeku 4 vcMMAE linker molekula leka po antitelu. Doza i vreme primene su naznačeni na slici.
SI.13 pokazuje rezultate ksenograft studije na PC3 liniji karcinoma prostate kod mužjaka golih miševa. cLIV-14-vcMMAE (4) označava antitelo-lek konjugat himernog oblika roditeljskog mišjeg antitela koje ima u prošeku 4 vcMMAE linker molekula leka po antitelu. hBU12-vcMMAE (4) označava antitelo-lek konjugat anti-CD19 antitela koje ima u prošeku 4 vcMMAE linker molekula leka po antitelu. Doza i vreme primene su naznačeni na slici.
SI. 14pokazuje rezultate ksenograft studije linije MCF7 kancera dojke kod golih miševa. hLIV-14-vcMMAE (4) se odnosi na konjugat antitelo lek od HBLB antitela koje ima u prošeku 4 vcMMAE linker molekula leka po antitelu. hLIV-14d-vcMMAE (2) se odnosi se na konjugat antitelo lek od HBLB antitela koje ima u prošeku 2 vcMMAE linker molekula leka po antitelu, svaki konjugovan na S239C položaju iz svakog teškog lanca. HOO-vcMMAE (4) se odnosi na antitelo-lek konjugat od nevezujućeg kontrolnog antitela koje ima u prošeku 4 vcMMAE linker molekula leka po antitelu. Doza i vreme primene je naznačeno na slici.
SI. 15pokazuje rezultate ksenograft studije na PC3 liniji karcinoma prostate kod mužjaka golih miševa. hLlV-14-vcMMAE (4) se odnosi na konjugat antitelo lek od HBLB antitela koje ima u prošeku 4 vcMMAE linker molekula leka po antitelu. hLIV-14-mcMMAF (4) se odnosi na antitelo-lek konjugat od HBLB antitela koje ima u prošeku 4 mcMMAF linker molekula leka po antitelu. hLIV-14d-vcMMAE (2) se odnosi na konjugat antitelo lek od HBLB antitela koje ima u prošeku 2 vcMMAE linker molekula leka po antitelu, svaki konjugovan na položaju S239C iz svakog teškog lanca. hLIV-14d-mcMMAF (2) se odnosi na konjugat antitelo lek od HBLB antitela koje ima u prošeku 2 mcMMAF linker molekula leka po antitelu, svaki konjugovan na S239C položaju od svakog teškog lanca. HOO-vcMMAE (4) se odnosi na konjugat antitelo lek od nevezujućeg kontrolnog antitela koje ima u prošeku 4 vcMMAE linker molekula leka po antitelu. HOO-mcMMAF (4) se odnosi na konjugat antitelo lek od nevezujućeg kontrolnog antitela koje ima u prošeku 4 mcMMAF linker molekula leka po antitelu. Doza i vreme primene su naznačeni na slici.
SI. 16A i 16Bprikazuju poravnanja humanizovanog teškog lanca(Slika 16A)i lakog lanca(Slika 16B)zrelih varijabilnih regiona sa onima od miša BR2-22a.
SI. 17prikazuje ispitivanja kompetitivnih vezivanja različitih permutacija humanizovanih teških lanaca HA-HF i humanizovanih lakih lanaca LA-LF izvedenih iz mišjeg monoklonskog anti LIV-1 antitela BR2-22a. Ukupan broj mišjih povratnih mutacija u svakom lakom ili teškom lancu je prikazan u zagradama. Samo HELF je pokazao dovoljnu retenciju vezivanja.
SI. 18pokazuje sistematske varijacije HE i LF lanaca za testiranje doprinosa pojedinačnih povratnih mutacija za vezivanje antigena. Mesta potencijalne somatske hipermutacije su u zagradama. Mišji ostaci su podvučeni. Preostali ostaci su humani ostaci matične linije.
SI. 19pokazuje kompetitivno vezivanje LF varijanti na vrhu slike. Ispitivane povratne mutacije su prikazane na dnu slike. Mišji ostaci su podvučeni. Preostali ostaci su humani ostaci matične linije.
SI. 20pokazuje kompetitivno vezivanje HE varijanti na vrhu slike. Ispitivane povratne mutacije su prikazane na dnu slike. Mišji ostaci su podvučeni. Preostali ostaci su humani ostaci matične linije.
SI. 21pokazuje kompetitivna vezivanja različitih permutacija HE, HF, HG i LF i LG.
SI. 22pokazuje saturaciona vezivanja humanizovanog LIV 14 antitela i humanizovanog LIV22 antitela na humani i cinomolgus LIV-1 eksprimiran iz CHO ćelija.
SI. 23pokazuje citotoksičnu aktivnost humanizovanog LIV22-vcMMAE na MCF-7 ćelijama nakon 144 h tretmana. hOO-1006 je lek-konjugovano kontrolno antitelo.
SI. 24pokazuje citotoksičnu aktivnost hLIV22-mcMMAF na MCF-7 ćelijama nakon 144 h tretmana. hOO-1269 je konjugovano lekom kontrolno antitelo.
SI. 25pokazuje aktivnost hLIV22 antitela na PC3 (DSMZ) modelu karcinoma prostate kod golih ženki miševa. Dnevne doze su označene trouglovima na X-osi.
SI. 26pokazuje aktivnost hLIV22 antitela na MCF7 (NCI) tumore karcinoma dojke kod golih miševa.
SI.27 upoređuje aktivnost hLIV22 i hLIV14 u istom modelu kaoSlika26.
SI. 28prikazuje analizu ekspresije LIV-1 proteina pomoću IHC-a na uzorcima pacijenata sa melanoma kancerom.
DEFINICIJE
[0017]Monoklonska antitela su tipično obezbeđena u izolovanom obliku. To znači daje antitelo tipično najmanje 50% m/m čisto od interferirajućih proteina i drugih kontaminanata koji proizilaze iz njegove proizvodnje ili prečišćavanja, ali ne isključuje mogućnost da se monoklonsko antitelo kombinuje sa viškom farmaceutski prihvatljivog(im) nosača(ima) ili drugim nosačem namenjenim da olakša njegovo korišćenje. Ponekad su monoklonska antitela najmanje 60%, 70%, 80%), 90%, 95 ili 99% m/m čista od interferirajućih proteina i nečistoća iz proizvodnje ili prečišćavanja.
[0018]Specifično vezivanje monoklonskog antitela za njegov ciljni antigen označava afinitet od najmanje 106, IO<7>, IO<8>, IO<9>, ili 10<10>M"<1>. Specifično vezivanje je primetno većeg intenziteta i razlikuje se od nespecifičnog vezivanja koje se javlja na najmanje jednom nepovezanom cilju. Specifično vezivanje može biti rezultat formiranja veza između određenih funkcionalnih grupa ili pojedinih prostornih podešavanja (npr, tip brave i ključa) dok nespecifično vezivanje je obično rezultat Van der Valsovih sila. Specifično vezivanje, međutim, ne znači nužno da se monoklonsko antitelo vezuje za jedan jedini cilj.
[0019]Osnovna strukturna jedinica antitela je tetramer od subjedinica. Svaki tetramer uključuje dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) ijedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca obuhvata varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Ovaj promenljivi region je početno eksprimiran povezano sa odvajanjem signalnog peptida. Varijabilni region bez signalnog peptida se ponekad naziva zreo varijabilni region. Tako, na primer, zreli varijabilni region lakog lanca, označava varijabilni region lakog lanca bez signalnog peptida lakog lanca. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju.
[0020]Laki lanci su klasifikovani bilo kao kapa ili lambda. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgM, IgG, IgA, IgD i IgE, respektivno. Unutar lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni su pridruženi pomoću "J" regiona od oko 12 ili više aminokiselina, sa teškim lancem koji takođe uključuje "D" region od oko 10 ili više aminokiselina.
(Videti generalno, Fundamental Immunologv (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7)).
[0021]Zreli varijabilni regioni svakog para lakog/teškog lanca formiraju mesto vezivanja antitela. Tako, čitavo antitelo ima dva mesta vezivanja. Osim kod bifunkcionalnih ili bispeciflčnih antitela dva mesta vezivanja su ista. Lanci svi pokazuju istu opštu strukturu relativno očuvanih okvirnih regiona (FR) spojenih sa tri hipervarijabilna regiona, takođe nazvani regionima koji određuju komplementarnost ili CDR. CDR-ovi iz dva lanca svakog para su poravnani od strane okvirnih regiona, omogućavajući vezivanje za specifičan epitop. Od N-terminala do C-terminala, i laki i teški lanci sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodela aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama Kabat, sekvence proteina od imunološkog interesa (Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, MD., 1987. i 1991), ili Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabat takođe obezbeđuje široko korišćenu konvenciju o numeraciji (Kabat numeracija) u kojoj odgovarajući ostaci između različitih teških lanaca ili između različitih lakih lanaca imaju dodeljeni isti broj.
[0022]Izraz "antitelo" obuhvata intaktna antitela i njihove vezujuće fragmente. Tipično, fragmenti antitela se takmiče sa netaknutim antitelom iz koga su ona izvedena za specifično vezivanje za cilj, uključujući odvojenih teških lanaca, lakih lanaca Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, dijatela, Dabs, nanotela i Fv. Fragmenti mogu biti proizvedeni pomoću tehnika rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim odvajanjem intaktnih imunoglobulina. Izraz "antitelo" takođe uključuje dvojno antitelo (homodimerni Fv fragment) ili minitelo (VL-VH-CH3), bispecifično antitelo ili slično. Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teških/lakih lanaca i dva različita mesta vezivanja (videti, npr, Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelnv et al, J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). Izraz "antitelo" obuhvata antitelo samo po sebi (ogoljeno antitelo) ili antitelo konjugovano sa citotoksičnim ili citostatičkim lekom.
[0023]Izraz "epitop" se odnosi na mesto na antigenu za koje se vezuje antitelo. Epitop može biti formiran iz susednih aminokiselina ili nesusednih aminokiselina stavljenih pored tercijarnim savijanjem jednog ili više proteina. Epitopi obrazovani od susednih aminokiselina su tipično zadržani pri izlaganju rastvaračima denaturisanja dok epitopi formirani tercijarnim savijanjima se obično gube tretmanom sa rastvaračima denaturisanja. Epitop tipično uključuje najmanje 3, obično, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Metode određivanja prostorne konformacije epitopa uključuju, na primer, rendgensku kristalografiju i 2-dimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu. Videti, npr., Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biologv, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).
[0024]Antitela koja prepoznaju iste ili preklapajuće epitope mogu biti identifikovana u jednostavnom imunotestu koji pokazuje sposobnost jednog antitela da konkuriše sa vezivanjem drugog antitela za ciljni antigen. Epitop izvesnog antitela takođe može biti definisan rendgenskom kristalografijom antitela vezanog za njegov antigen da identifikuje kontaktne ostatke. Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ako sve aminokiselinske mutacije u antigenu koji smanjuje ili eliminiše vezivanje jednog antitela smanje ili eliminišu vezivanje drugog. Dva antitela imaju preklapajuće epitope ako neke aminokiselinske mutacije koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanje ili eliminišu vezivanje drugog.
[0025]Konkurencija između antitela se određuje ispitivanjem u kome antitelo podvrgnuto testu inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen (videti, npr, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Ispitivano antitelo se takmiči sa referentnim antitelom ako višak ispitivanog antitela (npr najmanje 2x, 5x, 10x, 20x ili 100x) inhibira vezivanje referentnog antitela od najmanje 50%, ali poželjnije 75%, 90% ili 99% kao što je izmereno u ispitivanju kompetitivnog vezivanja. Antitela identifikovana testom konkurencije (konkurentska antitela) uključuju antitela koji se vezuju za isti epitop kao i referentno antitelo i antitela koja se vezuju za susedni epitop dovoljno blizak epitopu koji je vezan od strane referentnog antitela za nastanak sternog ometanja.
[0026]Izraz "pacijent" obuhvata humane i druge subjekte sisara koji dobijaju ili profilaktičko ili terapeutsko lečenje.
[0027]Za potrebe klasifikacije aminokiselinskih supstitucija kao konzervativnih ili nekonzervativnih, aminokiseline su grupisane na sledeći način: grupa I (hidrofobnim bočnim lancima): met, ala, val, leu, ile; Grupa II (neutralnim hidrofilnim bočnim lancima): cis, ser, tre; Grupa III (kiselinskim bočnim lancima): Asp, Glu; Grupa IV (baznim bočnim lancima): asn, gln, his, liz, arg; Grupa V (ostaci utiču na orijentaciju lanca): gli, pro; i Grupa VI (aromatičnim bočnim lancima): trp, tir, fen. Konzervativne supstitucije obuhvataju supstitucije između aminokiselina u istoj klasi. Nekonzervativne supstitucije predstavljaju razmenu člana jedne od ovih klasa za člana drugog.
[0028]Procenat identičnosti sekvenci je određen sekvencama antitela maksimalno usklađenih pomoću Kabat numeričke konvencije. Nakon usklađivanja, ukoliko se predmetni region antitela (npr, ceo zreli varijabilni region teškog ili lakog lanca) poredi sa istim regionom referentnog antitela, procenat identičnosti sekvence između predmetnih i referentnih regiona antitela je broj zauzetih položaja od strane iste aminokiseline u oba predmetnom i referentnom regionu antitela podeljen sa ukupnim brojem usaglašenih položaja dva regiona, sa prazninama nebrojanim, pomnožen sa 100 da se pretvori u procenat.
[0029]Kompozicije ili metode " koje sadrže" jedan ili više navedenih elemenata mogu uključiti druge elemente koji nisu specifično navedeni. Na primer, kompozicija koja sadrži antitelo može sadržati antitelo samostalno ili u kombinaciji sa drugim sastojcima.
[0030]Oznaka niza vrednosti obuhvata sve cele brojeve unutar ili definisanje niza.
[0031]Efektorska funkcija antitela se odnosi na funkciju doprinetu od strane Fc domen(a) jednog imunoglobulina. Takve funkcije mogu biti, na primer, ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela, ćelijska fagocitoza zavisna od antitela ili komplement-zavisna citotoksičnost. Takva funkcija se može postići, na primer, vezivanjem Fc efektorskog domena(a) za receptor Fc na imunoj ćeliji sa fagocitnom ili litičkom aktivnošću ili vezivanjem Fc efektorskog domena za komponente sistema komplementa. Tipično, efekat (i) posredovani ćelijama koje vezuju Fc ili komponente komplementa dovode do inhibicije i / ili pražnjenja LIV-1 ciljne ćelije. Fc regioni antitela mogu regrutovati Fc receptor ćelija koje eksprimiraju (FcR) i stavljaju ih naporedo sa obloženim antitelima ciljnih ćelija. Ćelije koje eksprimiraju površinske FcR za IgG, uključujući FcyRIII (CD16), FcyRII (CD32) i FcyRIII (CD64) mogu delovati kao efektorske ćelije za uništavanje IgG-obloženih ćelija. Takve efektorske ćelije uključuju monocite, makrofage, prirodne ćelije ubice (NK) ćelije, neutrofile i eozinofile. Angažovanje FcyR od IgG aktivira ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) ili ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP). ADCC je posredovan pomoću CD16<+>efektorskih ćelija preko sekrecije membranskih proteina sa formiranjem pora i proteaza, dok je fagocitoza posredovana od strane CD32<+>i CD64<+>efektorskih ćelija (videti Fundamentalna imunologija, 4th ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, poglavlja 3, 17 i 30; Uchida et al., 2004, J. Exp. Med. 199: 1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61: 4061-65; VVatanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53: 199-207). Pored ADCC i ADCP, Fc regioni ćelijski vezanih antitela takođe mogu aktivirati klasičan put komplementa da izazovu komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC). Clq sistema komplementa se vezuje za Fc regione antitela kada su ona kompleksirana sa antigenima. Vezivanje Clq za ćelijski vezana antitela može da inicira kaskadu događaja koji uključuju proteolitičku aktivaciju C4 i C2 za generisanje C3 konvertaze. Cepanje C3 do C3b od strane C3 konvertaze omogućava aktiviranje terminalnih komponenti komplementa uključujući C5b, C6, C7, C8 i C9. Kolektivno, ovi proteini formiraju složene pore koje napadaju membranu na ćelijama obloženim antitelom. Ove pore remete integritet ćelijske membrane, ubijajući ciljnu ćeliju (videti Imunobiologiju, 6th ed., Janeway et al., Garland Science, N.Y., 2005, poglavlje 2).
[0032]Izraz "ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela" ili ADCC, je mehanizam za indukciju ćelijske smrti koja zavisi od interakcije ciljnih ćelija obloženih antitelom sa imunim ćelijama koje poseduju litičku aktivnost (takođe označene kao efektorske ćelije). Takve efektorske ćelije uključuju ćelije prirodne ubice, monocite/makrofage i neutrofile. Efektorske ćelije privezuju se za Fc efektorski domen (e) imunoglobulina vezanog za ciljne ćelije preko njihovih antigen-kombinovanovih položaja. Smrt ciljne ćelije obložene antitelom nastaje kao rezultat aktivnosti efektorskih ćelija.
[0033]Izraz "ćelijska fagocitoza zavisna od antitela " ili ADCP, odnosi se na proces kojim su ćelije obložene antitelom internalizovane, u celosti ili delimično, pomoću fagocitnih imunih ćelija (npr makrofaga, neutrofila i dendritskih ćelija) koje se vezuju za Fc efektorski domen (e) Ig-a.
[0034]Izraz "komplement-zavisna citotoksičnost" ili CDC, se odnosi na mehanizam za indukovanje ćelijske smrti u kome Fc efektorski domen (i) ciljno-vezanog antitela aktiviraju serije enzimskih reakcija koje kulminiraju formiranjem otvora u membrani ciljne ćelije. Tipično, kompleksi antigen-antitelo kao što su oni na ciljnim ćelijama obloženim antitelom vezuju i aktiviraju komponentu komplementa Clq koja zauzvrat aktivira kaskadu komplementa koja dovodi do smrti ciljne ćelije. Aktivacija komplementa može rezultirati u izbacivanju komponenti komplementa na površinu ciljnih ćelija koje olakšavaju ADCC vezivanjem receptora komplementa (npr, CR3) na leukocitima.
[0035]Izvestan "citotoksični efekat" se odnosi na pražnjenje, eliminaciju i/ili ubijanje ciljne ćelije. Jedan "citotoksični agens" se odnosi na agens koji ima citotoksični efekat na ćeliju. Citotoksični agensi mogu biti konjugovani sa antitelom ili primenjivani u kombinaciji sa antitelom.
[0036]Izvestan "citostatički efekat" se odnosi na inhibiciju ćelijske proliferacije. Jedan "citostatički agens" se odnosi na agens koji ima izvestan citostatički efekat na ćeliju, na taj način inhibirajući rast i/ili širenje specifičnog podskupa ćelija. Citostatički agensi mogu biti konjugovani sa antitelom ili primenjivani u kombinaciji sa antitelom.
[0037]Izraz "farmaceutski prihvatljiv" označava odobren ili važeći od strane regulatorne agencije federalne ili državne vlade ili naveden u Američkoj farmakopeji ili drugim opšte priznatim farmakopejama za upotrebu kod životinja, a posebno kod ljudi. Izraz "farmaceutski kompatibilni sastojak" se odnosi na farmaceutski prihvatljiv razblaživač, adjuvans, ekscipijens ili nosač sa kojim je anti-LIV-1 antitelo.
[0038]Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na farmaceutski prihvatljive organske ili neorganske soli anti-LIV-1 antitela ili njegovih konjugata ili agens primenjen sa anti-LIV-1 antitelima. Primeri soli uključuju sulfat, citrat, acetat, oksalat, hlorid, bromid, jodid, nitrat, bisulfat, fosfat, kiseli fosfat, izonikotinat, laktat, salicilat, kiseli citrat, tartarat, oleat, tanat, pantotenat, bitartrat, askorbat, sukcinat, maleat, gentizinat, fumarat, glukonat, glukuronat, saharat, formijat, benzoat, glutamat, metansulfonat, etansulfonat, benzensulfonat, p toluensulfonat, i pamoat (tj, 1,1' metilen bis- (2 hidroksi 3 naftoat)) soli. Farmaceutski prihvatljiva so može sadržati uključenje drugog molekula kao što je acetatni jon, sukcinatni jon ili drugi suprotni jon. Kontrajon može biti bilo koji organski ili neorganski ostatak koji stabilizuje naelektrisanje na matičnom jedinjenju. Dalje, farmaceutski prihvatljiva so može imati više od jednog naelektrisanog atoma u svojoj strukturi. Primeri gde su višestruko naelektrisani atomi deo farmaceutski prihvatljive soli mogu imati više kontrajona. Stoga, farmaceutski prihvatljiva so može imati jedan ili više naelektrisanih atoma i/ili jedan ili više kontrajona.
[0039]Ukoliko nije drugačije jasno iz konteksta, izraz "oko" obuhvata vrednosti unutar standardne devijacije navedene vrednosti.
DETALJAN OPIS
I. O<p>šte
[0040]Predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonska antitela koja se specifično vezuju za LIV-1. Antitela su korisna u lečenju i dijagnozama različitih kancera, kao i otkrivanju LIV-1.
II. Ciljni molekuli
[0041]Ukoliko nije drugačije naznačeno, LIV-1 označava humani LIV-1. Primernoj humanoj sekvenci je dodeljen švajcarski Prot pristupni broj Q13433. Q13433 je ovde uključen kao SEK ID BR: 83. Poznate su tri izoformne varijante i jedan polimorfizam. Druga verzija humanog LIV-1 proteina, pristupni broj AAA96258.2, je ovde uključen kao SEK ID BR: 84. Četiri ekstracelularna domena su ograničena sa ostacima 29-325, 377-423, 679-686 i 746-755 iz Q13433 respektivno.
[0042]Ukoliko nije drugačije očigledno iz kontekstne reference LIV-1 označava najmanje izvesni ekstracelularni domen proteina i obično kompletni protein izuzev jednog otcepljenog signalnog peptida (aminokiseline 1-28 odQ13433).
III. Antitela
A. Specifičnost vezivanja i funkcionalne karakteristike
[0043]Ovde opisana su humanizovana antitela izvedena iz dva mišja antitela, BR2-14a i BR2-22a. Ukoliko nije specifično drugačije naznačeno, sadašnja otkrića se odnose na oba antitela. Ova dva mišja antitela pokazuju 94% i 91% identičnosti sekvence jedno prema drugom u zrelim varijabilnim regionima teškog i lakog lanca. Dva antitela se vezuju za iste ili preklapajuće epitope na humanom LIV-1. Međutim, BR2-22a antitelo ima oko deset puta veći afinitet za humani LIV-1 i oko 3 puta veći afinitet za makaki majmuna LIV-1 nego BR2-14a kao što je prikazano na SI. 22.
[0044]Afinitet humanizovanih oblika mišjeg BR2-14a antitela (tj, Ka) je poželjno unutar faktora pet ili faktora dva od onog mišjeg antitela BR2-14a za humani LIV-1. Humanizovana BR2-14a antitela se specifično vezuju za humani LIV-1 u prirodnom obliku i/ili rekombinantno eksprimiran iz CHO ćelija kao što to radi mišje antitelo iz koga su ona izvedena. Poželjna humanizovana BR2-14a antitela imaju afinitet isti ili veći (tj, veći od izvan granice greške u merenju) od onog afiniteta BR2-14a za humani LIV-1 (npr, 1,1-5 puta, 1,1 do 3 puta, 1,5 do 3 puta, 1,7 do 2,3-puta ili 1,7-2,1 puta afinitet ili dvostruki afinitet od BR2-14a). Poželjna humanizovana BR2-14a antitela se vezuju za isti epitop i/ili takmiče sa BR2-14a za vezivanje za humani LIV-1. Poželjna humanizovana BR2-14a antitela se takođe vezuju za cino-homolog LIV-1 tako omogućavajući pretkliničko ispitivanje kod nehumanih primata.
[0045]Afinitet humanizovanih oblika mišjih BR2-22a antitela (tj, Ka) za humani LIV-1, prirodno eksprimiran ili eksprimiran iz CHO ćelija, je poželjno unutar faktora pet ili faktora dva u odnosu na mišje antitelo BR2-22. Neka humanizovana BR2-22a antitela imaju konstantu asocijacije koja je u suštini ista kao od BR2-22a (tj, u okviru eksperimentalne greške). Neka humanizovana BR2-22a antitela imaju konstantu asocijacije u rasponu od 0,5 do 1 ili 0,5-1,5 od one konstante asocijacije BR2-22a antitela. Poželjna humanizovana BR2-22a antitela imaju konstantu asocijacije veću od 5 x IO<8>M"<1>, ili u opsegu od 0,5 do 2 x IO<9>M"<1>ili oko 0,8 x IO<9>M"<1>(+/- greška u merenju) za humani LIV-1 eksprimiran iz CHO ćelija. Ovde kao 1 drugde u ovoj prijavi, mogu se meriti afiniteti u skladu sa metodama iz primera. Poželjna humanizovana BR2-22a antitela se vezuju za isti epitop i/ili takmiče sa BR2-22a za vezivanje za humani LIV-1. Humanizovana BR2-22a antitela se vezuju za cino-homolog LIV-1, kao i humani LIV-1. Poželjna humanizovana BR2-22a antitela se vezuju sa suštinski istom konstantom asocijacije za humani i makaki majmuna LIV-1 eksprimiran kod oboje iz CHO ćelija (unutar eksperimentalne greške) čime dozvoljavaju i povećavaju prediktivnu tačnost pretkliničkog ispitivanja kod nehumanih primata.
[0046]Poželjna antitela (i humanizovana BR2-14a i humanizovana BR2-22a) inhibiraju kancer (npr, rast ćelija, metastaze i/ili smrtnosti organizama) kao što je prikazano na kancerogenim ćelijama koje propagiraju u kulturi, na životinjskom modelu ili kliničkom ispitivanju. Životinjski modeli mogu da se formiraju implantacijom humanih tumorskih ćelijskih linija koje eksprimiraju LIV-1 u odgovarajuće imunodeficijentne sojeve glodara, npr, goli miševi bez timusa ili SCID miševi. Ove ćelijske linije tumora se mogu uneti kod imunodeficijentnih glodara domaćina bilo kao čvrsti tumor subkutanim injekcijama ili kao rasejani tumori intravenskim injekcijama. Jednom uspostavljeni unutar domaćina, ovi modeli tumora mogu biti primenjeni za evaluaciju terapeutskih efikasnosti anti-LIV-1 antitela ili njihovih konjugovanih oblika kao što je opisano u Primerima.
B. Humanizovana Antitela
[0047]Jedno humanizovano antitelo je genetskim inženjeringom proizvedeno antitelo u kome su CDR regioni iz nehumanog antitela "davalac" nakalemljeni u humane "primalac" sekvence antitela (videti, npr, Queen, US 5,530,101 i 5,585,089; Winter, US 5,225,539; Čarter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; i Foote, US 6,881,557). Primalac sekvence antitela mogu biti, na primer, zrela humana sekvenca antitela, smeše takvih sekvenci, konsenzus sekvenca od humanih sekvenci antitela ili embrionski region sekvence. Poželjna sekvenca primalac za teški lanac je embrionska VHeksona VH1-2 (takođe poznata u literaturi kao HV1-2) (Shin et al., 1991, EMBO J. 10: 3641-3645) i za zglobni region (JH), eksona JH-6 (Mattila et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25: 2578-2582). Za laki lanac, poželjni akceptor (primalac) sekvenca je eksona VK2-30 (takođe označen u literaturi kao KV2-30) i za zglobni region eksona Jk-4 (Hieter et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 1516-1522). Stoga, jedno humanizovano antitelo je antitelo koje ima neke ili sve CDR regione u potpunosti ili suštinski od donorskog antitela i varijabilni region okvirnih sekvenci i konstantne regione, ako je prisutan, u potpunosti ili uglavnom od sekvenci humanih antitela. Slično jedan humanizovani teški lanac ima najmanje jedan, dva i obično sva tri CDR-a potpuno ili uglavnom od teškog lanca donorskog antitela i varijabilni region teškog lanca okvirne sekvence i konstantni region teškog lanca, ako je prisutan, uglavnom od varijabilnog regiona humanog teškog lanca okvirnih i sekvenci konstantnog regiona. Slično humanizovani laki lanac ima najmanje jedan, dva i obično sva tri CDR-a potpuno ili uglavnom od lakog lanca donorskog antitela, i okvirnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca i konstantni region lakog lanca, ako je prisutan, suštinski od humanog varijabilnog regiona lakog lanca okvirnih i sekvenci konstantnog regiona. Osim nanotela i dAt-a, jedno humanizovano antitelo sadrži jedan humanizovani teški lanac i jedan humanizovani laki lanac. Jedan CDR u humanizovanom antitelu je suštinski iz odgovarajućeg CDR-a nehumanog antitela kada je najmanje 60%, 85%, 90%, 95% ili 100% odgovarajućih ostataka (kao što je definisano prema Kabat-u) identično između respektivnih CDR-a. Varijabilni region okvirnih sekvenci jednog lanca antitela ili konstantni region lanca antitela su suštinski od jednog humanog varijabilnog regiona okvirne sekvence ili humanog konstantnog regiona odnosno kada je najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% od odgovarajućih ostataka definisanih prema Kabat-u identično.
[0048]Iako humanizovana antitela često uključuju svih šest CDR-a (poželjno kao utvrđenih prema Kabat-u) iz antitela miša, ona takođe mogu biti napravljena sa manje od svih CDR-a (npr, najmanje 3, 4 ili 5) CDR-a iz antitela miša (npr, Pascalis et al., J. Immunol. 169: 3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biologv, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36: 1079-1091, 1999; Tamura et al., Journal of Immunologv, 164: 1432-1441, 2000).
[0049]Određene aminokiseline iz humanog varijabilnog regiona ostataka okvira mogu biti odabrane za supstituciju na osnovu njihovog mogućeg uticaja na CDR konformaciju i/ili vezivanje za antigen. Ispitivanje takvih mogućih uticaja je modeliranjem, ispitivanje karakteristika aminokiselina na određenim lokacijama, ili empirijsko posmatranje efekata supstitucije ili mutageneze određenih aminokiselina.
[0050]Na primer, kada se izvesna aminokiselina razlikuje između okvirnog ostatka mišjeg varijabilnog regiona i izabranog okvirnog ostatka humanog varijabilnog regiona, humana okvirna aminokiselina može biti supstituisana sa ekvivalentnom okvirne aminokiseline iz mišjeg antitela kada se to opravdano očekuje da amino kiselina:
(1) nekovalentno vezuje antigen direktno,
(2) susedna je CDR regionu,
(3) drugačije stupa u međusobnu interakciju sa CDR regionom (npr, u okviru je 6 A CDR
regiona); ili
(4) posreduje interakciju između teških i lakih lanaca.
[0051]Pronalazak obezbeđuje humanizovane oblike mišjeg BR2-14a antitela, uključujući pet objašnjenih primerima zrelih varijabilnih regiona humanizovanog teškog lanca (HA-HE) i šest objašnjenih primerima zrelih varijabilnih regiona humanizovanog lakog lanca (LA-LF). Permutacije ovih lanaca koji imaju najjača vezivanja (najniži EC50) su HBLB, HBLF, HCLB, HCLF, HDLB, HDLF, HELE i HELF. Od ovih permutacija, HBLB (takođe poznat kao hLIV14) je poželjna jer ima najjače vezivanje, oko 2 puta jače od mišjeg donorskog antitela, a ima najmanje povratnih mutacija (četiri).
[0052]Takođe su opisane varijante humanizovanog antitela HBLB u kojem zreli varijabilni region humanizovanog teškog lanca pokazuje najmanje 90%, 95% ili 99% identičnosti sa SEK ID BR: 10 i zreli varijabilni region humanizovanog lakog lanca pokazuje najmanje 90%, 95% ili 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 15. Poželjno, u takvim antitelima neke ili sve povratne mutacije u HBLB su zadržane. Drugim rečima, najmanje 1, 2 ili poželjno sva 3 položaja teškog lanca H29, H30 i H76 zauzimaju I i E i N, respektivno. Slično položaj L36 je poželjno zauzet od Y. CDR regioni takvih humanizovanih antitela su poželjno suštinski identični CDR regionima HBLB, koji su isti kao oni iz mišjeg donorskog antitela. CDR regioni mogu biti definisani bilo kojom konvencionalnom definicijom (npr, Chothia), ali su prvenstveno kao što je definisano od strane Kabat. U jednoj realizaciji, humanizovano antitelo sadrži jedan težak lanac koji sadrži 3 CDR-a iz SEK ID BR: 10 i okvire varijabilnog regiona sa najmanje 95% identičnosti prema okvirima varijabilnog regiona iz SEK ID BR: 10. U drugoj realizaciji, humanizovano antitelo sadrži laki lanac koji sadrži 3 CDR-a iz SEK ID BR: 15 i okvire varijabilnog regiona sa najmanje 95% identičnosti prema okvirima varijabilnog regiona iz SEK ID BR: 15. U daljoj realizaciji, humanizovano antitelo sadrži teški lanac koji sadrži 3 CDR-a iz SEK ID BR: 10 i okvire varijabilnog regiona sa najmanje 95% identičnosti prema okvirima varijabilnog regiona iz SEK ID BR: 10, i laki lanac koji obuhvata 3 CDR-a iz SEK ID BR: 15, i okvire varijabilnog regiona sa najmanje 95% identičnosti prema okvirima varijabilnog regiona iz SEK ID BR: 15.
[0053]Ukoliko humanizovana antitela pokazuju bilo koju varijaciju iz ilustrovanog HBLB humanizovanog antitela, jedna mogućnost za takvu dodatnu varijaciju su dodatne povratne mutacije u okvirima varijabilnog regiona. Bilo koji ili svi položaji povratno mutirani u drugim objašnjenim primerima zrelih varijabilnih regiona humanizovanog teškog ili lakog lanca mogu takođe biti načinjeni (tj, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili svih 9 H27 zauzeti od strane F, H28 zauzet od strane N, H48 zauzet od strane I, H66 zauzet od strane K, H67 zauzet od strane A, H71 zauzet od strane A, H76 zauzet od strane N, H93 zauzet od strane N i H94 zauzet od strane V u teškom lancu i 1, 2, 3, 4 ili svih 5 od L37 su zauzeti od strane L, L39 zauzet od strane K, L45 zauzet od strane K, i L46 zauzet od strane L u lakom lancu. Međutim, takve dodatne povratne mutacije nisu poželjne jer generalno one ne poboljšavaju afinitet i uvođenje više mišjih ostataka može proizvesti povećani rizik od imunogenosti.
[0054]Ovde opisani su humanizovani oblici mišjeg BR2-22a antitela uključujući tri objašnjena primerima zrela varijabilna regiona humanizovanog teškog lanca (HE, HF i HG) i dva objašnjena primerima humanizovana laka lanca (LF i LG) koji mogu biti kombinovani u različitim permutacijama sa adekvatnim vezivanjem (videti Sliku 21). Od ovih permutacija, HGLG (takođe poznat kao hLIV22) je poželjan jer ima najbolju kombinaciju vezujućih svojstava (suštinski ista kao mišje BR2-22a antitelo unutar eksperimentalne greške), a najmanje povratnih mutacija (sedam).
[0055]Takođe su opisane varijante HGLG humanizovanog antitela u kome zreli varijabilni region humanizovanog teškog lanca pokazuje najmanje 90%, 95%, 98% ili 99% identičnosti sa SEK ID BR: 53 i zreli varijabilni region humanizovanog lakog lanca pokazuje najmanje 90%, 95%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 60. Poželjno, u takvim antitelima neke ili sve povratne mutacije u HGLG se zadržavaju. Drugim rečima, najmanje 1, 2, 3, 4 ili poželjno svih 5 položaja teškog lanca H27, H29, H30, H76, i H94 je zauzeto od strane L, I, E, N i V (ovde, kao i drugde u ovoj prijavi Kabat numeracija se koristi da opiše položaje u zrelim varijabilnim regionima varijabilnog teškog i lakog lanca). Od ovih povratnih mutacija, najviše H94 doprinosi zadržavanju afiniteta vezivanja i H76 najmanje. Isto tako položaji L36 i L46 su poželjno zauzeti od strane Y i P respektivno. CDR regioni takvih humanizovanih antitela su poželjno suštinski identični sa CDR regionima HGLG, koji su isti kao oni od mišjeg donorskog antitela. CDR regioni mogu biti definisani bilo kojom konvencionalnom definicijom (npr, Chothia) ali su prvenstveno kao što je definisano prema Kabat-u. U jednoj realizaciji, humanizovano antitelo sadrži jedan teški lanac koji sadrži 3 CDR-a iz SEK ID BR: 53 i okvire varijabilnog regiona sa najmanje 95% identičnosti prema okvirima varijabilnog regiona iz SEK ID BR: 53. U drugoj realizaciji, humanizovano antitelo sadrži jedan laki lanac koji sadrži 3 CDR regiona iz SEK ID BR: 60 i okvire varijabilnog regiona sa najmanje 95% identičnosti prema okvirima varijabilnog regiona iz SEK ID BR: 60. U daljoj realizaciji, humanizovano antitelo sadrži jedan teški lanac koji sadrži 3 CDR regiona iz SEK ID BR: 53 i okvire varijabilnog regiona sa najmanje 95% identičnosti sa okvirima varijabilnog regiona iz SEK ID BR: 53, i laki lanac koji obuhvata 3 CDR regiona iz SEK ID BR: 60, i okvire varijabilnog regiona sa najmanje 95% identičnosti prema okvirima varijabilnog regiona iz SEK ID BR: 60.
[0056]Ukoliko humanizovana BR2-22a antitela pokazuju bilo koju varijaciju iz objašnjenog primerom HGLG humanizovanog antitela, jedna mogućnost za takvu dodatnu varijaciju su dodatne povratne mutacije u varijabilnom regionu okvira. Bilo koji ili svi položaji povratno mutirani u drugim objašnjenim primerima zrelim varijabilnim regionima humanizovanog teškog ili lakog lanca mogu biti načinjeni (tj, 1, 2, 3, 4, 5, ili svih 6, od H28 zauzeti od strane N, H48 zauzet od strane I, H66 zauzet od strane K, H67 zauzet od strane A, H71 zauzet od strane A, H93 zauzet od strane T u teškom lancu i 1 ili 2, od L37 zauzeti od strane L, i L45 zauzet od strane K. Međutim, takve dodatne povratne mutacije nisu poželjne jer one uopšte ne poboljšavaju afinitet i uvođenje više mišjih ostataka može dati povećan rizik od imunogenosti.
[0057]Druga moguća varijacija je da se zamene određeni ostaci u CDR regionima mišjeg antitela sa odgovarajućim ostacima humanih CDR sekvenci, tipično od CDR regiona humanih akceptorskih sekvenci korišćenih u dizajniranju objašnjenih primerima humanizovanih antitela. U nekim antitelima samo deo CDR regiona, naime podskup CDR ostataka potrebnih za vezivanje, nazvani SDR regionima, potrebni su da zadrže vezivanje u humanizovanom antitelu. CDR ostaci ne kontaktiraju antigen i ne mogu da se identifikuju u SDR regionima na osnovu prethodnih studija (na primer ostaci H60-H65 u CDR H2 često nisu obavezni), iz regiona Kabat CDR regiona koji leže van Chothia hipervarijabilnih petlji (Chothia, J. Mol. Biol. 196: 901, 1987), molekulskim modelovanjem i/ili empirijski, ili kako je opisano u Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863 (2004). U takvim humanizovanim antitelima na položajima u kojima je jedan ili više donatora CDR ostataka odsutno ili u kojima je celi donator CDR izostavljen, aminokiselina koja zauzima položaj može biti aminokiselina koja zauzima odgovarajući položaj (po Kabat numeraciji) u akceptorskoj sekvenci antitela. Broj takvih supstitucija akceptora za donatorske aminokiseline u CDR regionima za uključivanje odražava ravnotežu konkurentskih razmatranja. Takve supstitucije su potencijalno korisne u smanjenju broja mišjih aminokiselina u humanizovanom antitelu i posledično smanjuju potencijal imunogenosti. Međutim, supstitucije mogu takođe izazvati promene afiniteta, i značajna smanjenja afiniteta se poželjno izbegavaju. U sledećoj varijaciji, jedan ili više ostataka u jednom CDR-u humanizovanog BR2-22a antitela (koji bi inače bili isti kao CDR BR2-22a mišjeg antitela) može biti zamenjen odgovarajućim ostacima CDR-a iz mišjeg BR2 -14a antitela (ili obrnuto). Položaji za supstituciju u CDR regionima i aminokiseline za supstituciju mogu takođe biti odabrane empirijski.
[0058]Iako nije poželjno, druge aminokiselinske supstitucije mogu biti, na primer, u ostatacima okvira koji nisu u kontaktu sa CDR regionima, ili čak neki potencijalni CDR-kontaktni aminokiselinski ostaci unutar CDR regiona. Često su zamene napravljene u varijanti humanizovanih sekvenci konzervativne u odnosu na zamenjene HBLB aminokiseline (u slučaju humanizovanog BR2-14a) ili HGLG aminokiseline (u slučaju humanizovanog BR2-22). Poželjno, zamene u odnosu na HBLB ili HGLG (da li ili nekonzervativne) nemaju značajan efekat na afinitet vezivanja ili sposobnost humanizovanog mAt, to je, njegova sposobnost da vezuje humani LIV-1 i inhibira rast ćelija kancera.
[0059]Varijante se tipično razlikuju od sekvenci zrelog varijabilnog regiona teškog i lakog lanca HBLB (hLIV14) ili HGLG (hLIV22) pomoću malog broja (npr obično ne više od 1, 2, 3, 5 ili 10 bilo u zrelom varijabilnom regionu lakog lanca ili teškog lanca, ili oba) zamena, brisanja ili umetanja.
C. Izbor konstantnog regiona
[0060]Varijabilni regioni teškog i lakog lanca humanizovanih antitela mogu biti vezani sa najmanje jednim delom humanog konstantnog regiona. Izbor konstantnog regiona zavisi, delom, bilo da su poželjne antitelo-zavisna ćelijski-posredovana citotoksičnost, antitelo-zavisna ćelijska fagocitoza i/ili komplement-zavisna citotoksičnost. Na primer, humani izotipovi IgGl i IgG3 imaju snažnu komplement-zavisnu citotoksičnost, humani izotip IgG2 slabu komplement-zavisnu citotoksičnost i humanom IgG4 nedostaje komplement-zavisna citotoksičnost. Humani IgGl i IgG3 takođe indukuju snažnije ćelijski posredovane efektorske funkcije od humanog IgG2 i IgG4. Konstantni regioni lakog lanca mogu biti lambda ili kapa. Antitela mogu eksprimirana kao tetrameri koji sadrže dva laka i dva teška lanca, kao zasebni teški lanci, laki lanci kao Fab, Fab', F(ab')2, i Fv, ili kao jednolančana antitela u kojima su varijabilni domeni teškog i lakog lanca vezani preko odstojnika.
[0061]Humani konstantni regioni pokazuju alotipske varijacije i izoalotipske varijacije između različitih pojedinaca, to jest, konstantni regioni se mogu razlikovati kod različitih pojedinaca na jednom ili više polimorfnih položaja. Izoalotipovi se razlikuju od alotipova u tom serumu prepoznajući izoalotip koji se vezuje za ne-polimorfni region jednog ili više drugih izotipova.
[0062]Jedna ili nekoliko aminokiselina na amino ili karboksi terminusu lakog i/ili teškog lanca, kao što su C-terminalni lizin teškog lanca, mogu da nedostaju ili su derivatizovane u proporciji ili sve molekule. Zamene mogu biti u konstantnim regionima da se smanji ili poveća efektorska funkcija kao što su komplementom-posredovana citotoksičnost ili ADCC (videti, npr, VVinter et al., US patent br. 5,624,821; Tso et al., US patent br. 5,834,597; i Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 4005, 2006), ili da produži poluživot kod ljudi (videti, npr, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279: 6213, 2004).
[0063]Primeri supstitucija obuhvataju aminokiselinsku supstituciju prirodne aminokiseline do cisteinskog ostatka uvedenog na položaj aminokiseline 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330, ili 332, poželjno S239C mutaciju kod humanog IgGl izotipa (US 2010/0158909). Prisustvo dodatnog cisteinskog ostatka omogućava formiranje interlančane disulfidne veze. Takvo formiranje interlančane disulfidne veze može izazvati prostorne smetnje, na taj način smanjujući afinitet vezujuće interakcije Fc region-FcyR. Cisteinski ostatak(ci) uveden(i) ili u blizini sa Fc regionom IgG konstantnog regiona mogu poslužiti kao mesta za konjugaciju do terapeutskih agenasa (tj, kuplovanje citotoksičnih lekova korišćenjem tiol specifičnih reagenasa kao što su maleimid derivati lekova. Prisustvo terapeutskog agensa izaziva prostorne smetnje, na taj način smanjujući afinitet vezujuće interakcije Fc region-FcyR. Druge supstitucije u bilo kom od položaja 234, 235, 236 i/ili 237 smanjuju afinitet za Fcy receptore, naročito FcyRI receptor (videti, npr., US 6, 624,821, US 5,624,821).
[0064]In vivo poluživot antitela može takođe uticati na njegove efektorske funkcije. Polu-život antitela može biti povećan ili smanjen radi promene njegovih terapeutskih aktivnosti. FcRn je receptor koji je strukturno sličan MHC klasi I antigena koji se nekovalentno udružuje sa p2-mikroglobulinom. FcRn reguliše katabolizam IgG-a i njihove transcitoze preko tkiva (Ghetie and Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25: 97-113). IgG-FcRn interakcija se odvija pri pH 6,0 (pH intracelularnih vezikula) ali ne na pH 7,4 (pH krvi); ova interakcija omogućava IgG-u da se reciklira nazad u cirkulaciju (Ghetie and Ward, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18: 739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25: 97-113). Region na humanom IgGl uključen u FcRn vezivanju je mapiran (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591-604). Supstitucije alanina na položajima Pro238, Tre256, Tre307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382 ili Asn434 humanog IgGl poboljšavaju FcRn vezivanje (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591-604). IgGl molekuli koji skrivaju ove supstitucije imaju duže serumske polu-živote. Otuda, ovi modifikovani IgGl molekuli mogu biti sposobni da obavljaju njihove efektorske funkcije, a time ispoljavaju njihove terapeutske efikasnosti, tokom dužeg vremenskog perioda u poređenju sa nemodifikovanim IgGl. Drugi primeri supstitucija za povećanje vezivanja za FcRn uključuju Gln na položaju 250 i/ili Leu na položaju 428. EU numeracija se koristi za sve položaje u konstantnom regionu.
[0065]Oligosaharidi kovalentno vezani za očuvanu Asn297 su uključeni u sposobnost Fc regiona IgG-a za vezivanje FcyR (Lund et al., 1996, J. Immunol. 157: 4963-69; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol. 15: 26-31). Inženjering ove glikoforme na IgG-u može značajno poboljšati IgG-om posredovan ADCC. Dodavanje ukrštajućih N-acetilglukozaminskih modifikacija (Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotech. Bioeng. 74: 288-94) na ovoj glikoformi ili uklanjanje fukoze (Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 26733-40; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278: 6591-604; Niwa et al., 2004, Cancer Res. 64: 2127-33) iz ove glikoforme su dva primera IgG Fc inženjeringa koji poboljšavaju vezivanje između IgG Fc i FcyR, čime se povećava Ig-posredovana ADCC aktivnost.
[0066]Sistemska supstitucija aminokiselina izloženih rastvaraču iz humanog IgGl Fc regiona generiše IgG varijante sa izmenjenim FcyR afinitetima vezivanja (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591-604). Kada se porede sa roditeljskim IgGl, podskup ovih varijanti uključuje supstitucije na Tre256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/ Liz334, ili Ser298/Glu333/ Liz334 do Ala pokazuje povećanje i u afinitetu vezivanja prema FcyR i ADCC aktivnosti (Shields et al, 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591-604; Okazaki et al., 2004, J. Mol. Biol. 336: 1239-49).
[0067]Aktivnost fiksacije komplementa antitelima (obe Clq vezivanja i CDC aktivnost) mogu biti poboljšane supstitucijama na Liz326 i Glu333 (Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166: 2571-2575). Iste supstitucije na osnovi humanog IgG2 mogu pretvoriti izotip antitela koji vezuje slabo u Clq i koji je ozbiljno deficitaran u aktivnosti aktiviranja komplementa do onog koji može i da vezuje Clq i posreduje CDC (Idusogie et al, 2001, J. Immunol. 166: 2571-75). Nekoliko drugih metoda je takođe primenjeno za poboljšanje aktivnosti fiksacije komplementa antitelima. Na primer, presađivanje 18-amino kiselina karboksil-terminalnog dela repa IgM na karboksilnim-krajevima IgG značajno povećava njihovu CDC aktivnost. Ovo je primećeno čak i sa IgG4, koji obično nema detektovanu CDC aktivnost (Smith et al., 1995, J. Immunol. 154: 2226-36). Takođe, supstitucija Ser444 koji se nalazi u blizini karboksi-terminala IgGl teškog lanca sa Cis indukuje rep-prema-repu dimerizacije IgGl sa 200-strukim porastom CDC aktivnosti više od monomernih IgGl (Shopes et al., 1992, J. Immunol.148: 2918-22). Pored toga, bispecifično dvojno antitelo napravljeno sa specifičnošću za Clq takođe daje CDC aktivnost (Kontermann et al., 1997, Nat. Biotech. 15: 629-31).
[0068]Aktivnost komplementa može biti smanjena mutacijom najmanje jednog od aminokiselinskih ostataka 318, 320, i 322 teškog lanca do ostatka koji ima drugačiji bočni lanac, kao što je Ala. Drugi alkil-supstituisani nejonski ostaci, kao što su Gli, Ile, Leu, ili Val, ili takvi aromatični nepolarni ostaci kao Fen, Tir, Trp i Pro na mestu svakog od tri ostataka takođe smanjuje ili ukidaju Clq vezivanja. Ser, Thr, Cis i Met mogu biti korišćeni na ostacima 320 i 322, ali ne 318, da smanje ili ukinu Clq aktivnost vezivanja. Zamena 318 (Glu) ostatka sa polarnim ostatkom može modifikovati ali ne ukida Clq aktivnost vezivanja. Zamena ostatka 297 (Asn) sa Ala rezultira u uklanjanju litičke aktivnosti, ali samo malo smanjuje (oko tri puta slabiji) afinitet za Clq. Ova izmena uništava mesto glikozilacije i prisustvo ugljenih hidrata koje je potrebno za aktivaciju komplementa. Svaka druga zamena na ovom mestu takođe uništava mesto glikozilacije. Sledeće mutacije i njihove kombinacije takođe smanjuju Clq vezivanje: D270A, K322A, P329A, i P311S (videti WO 06/036291).
[0069]Referenca sa humanim konstantnim regionom sadrži konstantni region sa bilo kojim prirodnim alotipom ili bilo kojom permutacijom ostataka koji zauzimaju polimorfne položaje u prirodnim alotipovima. Takođe, do 1, 2, 5 ili 10 mutacija može biti prisutno u odnosu na prirodni humani konstantni region, poput onih gore navedenih za smanjenje Fcgama receptornog vezivanja ili povećanje vezivanja za FcRn.
D. Ekspresija rekombinantnih antitela
[0070]Humanizovana antitela su tipično proizvodena rekombinantnom ekspresijom. Rekombinantni polinukleotidni konstrukti tipično uključuju sekvencu za kontrolu ekspresije operativno vezanu za kodirajuće sekvence lanaca antitela, uključujući prirodno-povezane ili heterologne regione pokretača. Poželjno, ekspresione kontrolne sekvence su eukariotski sistemi promotera u vektorima sposobnim za transformaciju ili transfekciju eukariotske ćelije domaćina. Kada je jednom vektor inkorporiran u odgovarajućeg domaćina, domaćin se održava pod uslovima pogodnim za ekspresiju visokog nivoa nukleotidnih sekvenci, i prikupljanje i prečišćavanje unakrsno-reagujućih antitela.
[0071]Ćelije sisara su poželjan domaćin za ekspresiju nukleotidnih segmenata koji kodiraju njihove imunoglobuline ili fragmente. Videti Winnacker, od gena do klonova, (VCH Publishers, NY, 1987). Jedan broj pogodnih ćelijskih linija domaćina sposobnih za sekreciju intaktnih heterolognih proteina je razvijen u tehnici, i obuhvataju CHO ćelijske linije (npr, DG44), razne COS ćelijske linije, HeLa ćelije, IIEK293 ćelije, L ćelije i ne-antitelo-produkujuće mijelome uključujući SP2/0 i NS0. Poželjno, ćelije su nehumane. Ekspresioni vektori ovih ćelija mogu da uključuju sekvence za kontrolu ekspresije, kao što su poreklo replikacije, promoter, pojačivač (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), i neophodna obrada informacionih mesta, kao što su mesta vezivanja ribozoma, RNK mesta spoja, mesta poliadenilacije, i transkripcione završne sekvence. Poželjne ekspresione kontrolne sekvence su promoteri izvedeni iz endogenih gena, citomegalovirusa, SV40, adenovirusa, goveđeg papiloma virusa, i slično. Videti Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992).
[0072]Jednom izražena, antitela mogu biti prečišćena prema standardnim procedurama u tehnici, uključujući HPLC prečišćavanje, hromatografiju na koloni, gel elektroforezu i slično (videti generalno, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
IV. Nukleinske kiseline
[0073]Ovde su opisane nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od humanizovanih teških i lakih lanaca gore opisanih. Tipično, nukleinske kiseline takođe kodiraju signalni peptid fuzionisan sa zrelim teškim i lakim lancima. Kodirajuće sekvence na nukleinskim kiselinama mogu biti u operativnoj vezi sa regulatornim sekvencama kako bi se osigurala ekspresija kodirajućih sekvenci, kao što je promoter, pojačivač, mesto vezivanja ribozoma, transkripcioni završni signal i slično. Nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance se mogu javiti u izolovanom obliku ili se mogu klonirati u jedan ili više vektora. Nukleinske kiseline se mogu sintetisati na primer, sintezom čvrstog stanja ili PCR preklapajućih oligonukleotida. Nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance mogu biti spojene kao jedna susedna nukleinska kiselina, npr, u okviru ekspresionog vektora, ili mogu biti odvojene, npr svaka klonirana u svoj ekspresioni vektor.
V. Konjugati antitelo- lek
[0074]Anti-LIV-1 antitela mogu biti konjugovana sa citotoksičnim ili citostatičkim grupama (uključujući njihove farmaceutski kompatibilne soli) za formiranje konjugata antitelo-lek (ADC). Naročito pogodne grupe za konjugaciju sa antitelima su citotoksični agensi (npr hemioterapeutski agensi), konvertujući enzimi proleka, radioaktivni izotopi ili jedinjenja, ili toksini (ovi ostaci se kolektivno nazivaju terapeutsko sredstvo). Na primer, anti-LIV-1 antitelo može biti konjugovano sa citotoksičnim agensom kao što je hemioterapeutski agens, ili toksin (npr citostatik ili citocidalni agent kao što su, npr, abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin ili difterični toksin).
[0075]Anti-LIV-1 antitelo može biti konjugovano sa konvertujućim enzimima proleka. Konvertujući enzim proleka može biti rekombinantno fuzionisan sa antitelom ili hemijski konjugovan na ovom korišćenjem poznatih postupaka. Primeri konvertujućih enzima proleka su karboksipeptidaza G2, beta-glukuronidaza, penicilin-V-amidaza, penicilin-G-amidaza, P-laktamaza, P-glukozidaza, nitroreduktaza i karboksipeptidaza A.
[0076]Tehnike za konjugaciju terapeutskih sredstava za proteine, a posebno antitela, su dobro poznate.
(Videti, na primer, Amon et al., "Monoklonska antitela za Imunociljanje leka u terapiji kancera," U monoklonskim antitelima i lečenje kancerogenih oboljenja (Reisfeld et al. eds, Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antitela za isporuku leka," U kontrolisanoj isporuci leka (Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, "Antitela nosači citotoksičnih agenasa u terapiji kancera: Pregled," U monoklonskim antitelima '84: Biološke i kliničke primene (Pinchera et al.eds., 1985); "Analize, rezultati, i budućnost perspektive terapijske upotrebe radioobeleženih antitela u terapiji kancera," u monoklonskim antitelima za otkrivanje kancera i terapiju (Baldwin et al.eds., Academic Press, 1985); i Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev 62: 119-58. Videti takođe, npr, PCT publikaciju WO 89/12624).
[0077]Terapeutski agens može biti konjugovan na način koji smanjuje njegovu aktivnost osim ako je rascepljeno antitelo (na primer, hidrolizom, degradacijom antitela ili pomoću agensa cepanja). Takav terapeutski agens je vezan za antitelo sa odvojivim linkerom koji je osetljiv na cepanje u intracelularnom okruženju kanceroznih ćelija koje eksprimiraju LIV-1, ali nije suštinski osetljiv u ekstracelularnom okruženju, tako da se konjugat čepa od antitela kada je internalizovan od strane ćelija kancera koje eksprimiraju LIV-1 (npr u endozomnom ili, na primer na osnovu pH osetljivosti ili osetljivosti proteaze, u lizozomnom okruženju ili u kaveolarnom okruženju).
[0078]Tipično ADC sadrži region linkera između terapeutskog agensa i anti-LIV-1 antitela. Kao što je gore navedeno, obično, linker se odvaja pod intracelularnim uslovima, tako da cepanje linkera oslobađa terapeutsko sredstvo iz antitela u intracelularno okruženje (npr, unutar lizozoma ili endozoma ili kaveola). Linker može biti, npr, peptidil linker koji se čepa od strane intracelularne peptidaze ili proteaze enzima, uključujući lizozomne ili endozomne proteaze. Tipično, peptidil linker je dugačak najmanje dve aminokiseline ili dugačak najmanje tri aminokiseline. Cepajući agensi mogu uključiti katepsine B i D i plazmin (videti, npr., Dubowchik and VValker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123). Najtipičniji su peptidil linkeri koji se cepaju pomoću enzima koji su prisutni u LIV-1-eksprimirajućim ćelijama. Na primer, peptidil linker koji je otcepljen pomoću tiol zavisne proteaze katepsin-B, koji je veoma izražen u kancerogenom tkivu, može biti korišćen (npr, linker koji sadrži Fen-Leu ili Gli-Fen-Leu-Gli peptid). Drugi takvi linkeri su opisani, na primer, u U.S. Pat. Br. 6,214,345. U specifičnim realizacijama, peptidil linker otcepljen pomoću intracelularne proteaze sadrži Val-Cit linker ili Fen-Liz dipeptid (videti, npr., U.S. Patent 6,214,345, koji opisuje sintezu doksorubicina sa Val-Cit linkerom). Jedna prednost korišćenja intracelularnog proteolitičkog oslobađanja terapeutskog agensa je daje agens obično razblažen kada je konjugovan i serumske stabilnosti konjugata su tipično visoke.
[0079]Cepivi linker može biti pH-senzitivan, tj osetljiv na hidrolizu pri određenim pH vrednostima. Tipično, pH-senzitivni linker će hidrolizovati pod kiselim uslovima. Na primer, kiselinski labilan linker koji je hidrolizovao u lizozom (npr., hidrazon, semikarbazon, tiosemikarbazon, cis-aconitic amid, ortoestar, acetal, ketal, ili slično) može biti korišćen. (Videti, npr., U.S. Pat. Br. 5,122.368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and VValker, 1999, Pharm. Therapeutics, 83: 67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661). Takvi linkeri su relativno stabilni pod neutralnim uslovima pH, poput onih u krvi, ali su nestabilni ispod pll 5,5 ili 5,0, približnom pll lizozoma. U izvesnim realizacijama, hidrolizabilni linker je linker tioetar (kao što su, na primer, tioetar vezan za terapeutsko sredstvo preko acilhidrazonske veze (videti, npr., U.S. Patent broj 5,622,929)).
[0080]Ostali linkeri su otcepljeni pod redukcionim uslovima (npr., disulfidni linker). Disulfidni linkeri obuhvataju one koji se mogu formirati korišćenjem SATA (N-sukcinimidil-S-acetiltioacetata), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionata), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirata) i SMPT (N-sukcinimidil-oksikarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridil-ditio)toluena), SPDB i SMPT. (Videti, na primer, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., In immunoconjugates: Antibodv Conjugates in Radioimagerv and Therapv of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Videti takođe U.S. Patent broj 4,880,935).
[0081]Linker takođe može biti jedan malonatni linker (Johnson et al., 1995, Anticancer Res 15:1387-93), jedan maleimidobenzoil linker (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1299- 1304), ili 3'-N-amidni analog (Lau et al., 1995, Bioorg Med-Chem. 3(10): 1305-12).
[0082]Linker može biti linker koji se ne otcepljuje, kao što je maleimido-alkilen- ili maleimid-aril linker koji je direktno vezan za terapeutski agens (npr., jedan lek). Aktivni lek-linker se oslobađa degradacijom antitela.
[0083]Tipično, linker nije suštinski osetljiv u ekstracelularnom okruženju znači da se ne više od oko 20%, obično ne više od oko 15%, još tipičnije ne više od oko 10%, i čak tipičnije ne više od oko 5%, ne više od oko 3%, ili ne više od oko 1% linkera u uzorku ADC čepa kada je ADC prisutan u ekstracelularnom okruženju (npr u plazmi). Bilo da jedan linker nije suštinski osetljiv u ekstracelularnom okruženju može biti određen, na primer, inkubacijom samostalno sa plazmom oba (a) konjugatom antitelo-lek ("ADC uzorkom") i (b) jednakim molarnim količinama nekonjugovanog antitela ili terapeutskog agensa ("kontrolnim uzorkom") za predodređeni vremenski period (npr., 2, 4, 8, 16 ili 24 sati), a zatim poređenjem količine nekonjugovanog antitela ili terapeutskog agensa prisutnog u ADC uzorku sa onim prisutnim u kontrolnom uzorku, kao što je mereno, na primer, pomoću tečne hromatografije visoke performanse.
[0084]Linker može promovisati ćelijsku internalizaciju. Linker može promovisati ćelijsku internalizaciju kada je konjugovan sa terapeutskim agensom (tj., u miljeu linker-terapeutskog agensa grupe ADC ili ADC derivata kako je ovde opisano). Alternativno, linker može promovisati ćelijska internalizaciju kada je konjugovan sa oboje terapeutskim agensom i anti-LIV-1 antitelom (tj, u miljeu ADC-a kako je ovde opisano).
[0085]Različiti linkera koji mogu biti korišćeni sa sadašnjim kompozicijama su opisani u WO 2004/010957 i imaju oblik
pri čemu:
-A- je noseća jedinica;
a je 0 ili 1;
svaki -W-je nezavisno jedinica aminokiseline;
wje nezavisno ceo broj u rasponu od 0 do 12;
-Y-je razdvajajuća jedinica; i
yje0, 1 ili 2.
[0086]Reprezentativne noseće jedinice su prikazane u okviru uglastih zagrada u formulama (la) i (lb; vidi pod), gde A-, -W-, -Y-, -D, w i y su kao što je gore definisano i R<1>je odabran od -CrCi0alkilen-, - C3-C8 karbociklo-, -0-(Ci-C8alkil)-, -arilen-, -CrCioalkilen-arilen-, -arilen-Ci-Cioalkilen-, -CpCioalkilen-(C3-C8karbociklo)-, -(C3-C8karbociklo)-CrCio alkilen-, -C3-Cg heterociklo-, -CrCi0alkilen-(C3-C8heterociklo)-, -(C3-C8heterociklo)-CrC10alkilen-, -(CH2CH20)r-, i -(CH2CH20)r-CH2- i r je ceo broj u opsegu od 1-10. Ab je antitelo.
[0087]Punjenje leka je predstavljeno pomoću p, brojem lek-linker molekula po antitelu. U zavisnosti od konteksta, p može da predstavlja prosečan broj lek-linker molekula po antitelu, takođe se odnosi na prosečno punjenje leka. P u opsegu od 1 do 20 i poželjno je od 1 do 8. U nekim poželjnim realizacijama, kada p predstavlja prosečno punjenje leka, p je u opsegu od oko 2 do oko 5. U nekim realizacijama, p je oko 2, oko 3, oko 4, ili oko 5. Prosečan broj lekova po antitelu u preparatu može biti okarakterisan konvencionalnim sredstvima kao što su masena spektroskopija, ELISA test, i HPLC. Aminokiselinska jedinica (-VV-), ukoliko je prisutna, povezuje noseću jedinicu (-A-) sa jedinicom razdvajanja (-Y-) ukoliko je jedinica odvajanja prisutna i povezuje noseću jedinicu sa citotoksičnim ili citostatičkim agensom (jedinica leka; D) ako je razdvajajuća jedinica odsutna.
[0088]Ako je prisutan, -Ww- je poželjno dipeptid, tripeptid, tetrapeptid, pentapeptid, heksapeptid, heptapeptid, oktapeptid, nonapeptid, dekapeptid, undekapeptid ili dodekapeptid jedinica.
[0089]Spacer jedinica (-Y-), kada je prisutna, povezuje aminokiselinsku jedinicu sa jedinicom leka. Spacer jedinice su dva opšta tipa: samo-žrtvujuće i ne samo-žrtvujuće. Ne samo-žrtvujuća spacer jedinica u kojoj deo ili celokupna spacer jedinica ostaje vezana za jedinicu leka nakon enzimskog cepanja jedne jedinice aminokiseline iz anti-LIV-1 konjugata antitelo-linker-lek ili lek-linker jedinjenja. Primeri ne samožrtvujuće Spacer jedinice koje sadrže (glicin-glicin) spacer jedinicu i glicin spacer jedinicu. Kada anti-LIV-1 antitelo-linker-lek konjugat koji sadrži glicin-glicin spacer jedinicu ili glicin spacer jedinicu podleže enzimskom cepanju preko tumorskih-ćelija povezane-proteaze, kanceroznim ćelijama asocirane proteaze ili limfocitima-asocirane proteaze, a ostatak glicin-glicin-lek ili ostatak glicin-lek se odvaja od Ab-Aa-Ww-. Da se oslobodi lek, nezavisna reakcija hidrolize treba da se odvija unutar ciljne ćelije za cepanje glicin-lek veze jedinice.
[0090]Alternativno, izvesni konjugat anti-LIV-1 antitelo-lek koji sadrži razdvajajuću jedinicu samožrtvujuću može osloboditi lek (D) bez potrebe za odvojenim korakom hidrolize. U nekim od ovih realizacija, -Y-je ^-aminobenzil alkoholna (PAB) jedinica koja je povezana sa -Ww- preko atoma azota PAB grupe i direktno povezana sa -D preko karbonatne, karbamatne ili etarske grupe. Drugi primeri samožrtvujućih spejsera uključuju aromatična jedinjenja koja su elektronski ekvivalentna sa PAB grupom kao što su 2-aminoimidazol-5-metanol derivati (videti Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237 za primere) i orto ili para-aminobenzilacetali. Odstojnici mogu biti korišćeni da podležu lakoj ciklizaciji nakon hidrolize amidne veze, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4-aminobuterne kiseline (Rodrigues et al., 1995, Chemistrv Biology 2:223), odgovarajući supstituisani biciklo [2.2.1] i biciklo [2.2.2] sistemi prstena (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) i amidi 2-aminofenilpropionske kiseline (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Eliminacija lekova koji sadrže amin supstituisan na a-položaju glicina (Kingsburv, et al., 1984, J. Med. Chem. 27: 1447) su takođe primeri samo-žrtvujućih strategija odstojnika koje se mogu primeniti na anti-LIV-1 antitelo-linker-lek konjugate. Alternativno, odstojnik jedinica je razgranata bis (hidroksimetil) stirenska (BHMS) jedinica, koja se može koristiti za inkorporiranje dodatnih lekova.
[0091]Korisne klase citotoksičnih agenasa za konjugate u anti-LIV-1 antitelima uključuju, na primer, antitubulin agense, vezujuće agense DNK manjih žljebova, inhibitore DNK replikacije, hemioterapijske senzibilizatore, ili slično. Drugi primeri klase citotoksičnih agenasa uključuju antracikline, auristatine, kamptotecine, duokarmicine, etopozide, maitansinoide i vinka alkaloide. Neki primeri citotoksičnih agenasa uključuju auristatine (npr auristatin E, AFP, MMAF, MMAE), vezujuće agense DNK manjih žljebova (na primer, enedini i leksitropsini), duokarmicine, taksane (npr, paklitaksel i docetaksel), vinka alkaloide, doksorubicin, morfolino-doksorubicin i cijanomorfolin-doksorubicin.
[0092]Citotoksični agens može biti hemioterapeutski kao što je, na primer, doksorubicin, paklitaksel, melfalan, vinka alkaloidi, metotreksat, mitomicin C ili etopozid. Agens može takođe biti CC-1065 analog, kaliheamicin, maitanzin, analog dolastatina 10, rizoksin ili palitoksin.
[0093]Citotoksični agens takođe može biti auristatin. Auristatin može biti auristatin E derivat, npr., estar formiran između auristatina E i keto kiseline. Na primer, auristatin E može da reaguje sa para acetil benzoevom kiselinom ili benzoilvalerijanskom kiselinom da proizvede AEB i AEVB, respektivno. Drugi tipični auristatini uključuju AFP, MMAF i MMAE. Sinteza i struktura različitih auristatina je opisana u, na primer, US 2005-0238649 i US 2006-0074008.
[0094]Citotoksični agens može biti DNK vezujući agens manjeg žljeba. (Videti, npr., U.S. Patent br. 6,130,237). Na primer, vezujući agens manjeg žljeba može biti jedno CBI jedinjenje ili enedivne (npr kaliheamicin).
[0095]Citotoksični ili citostatički agens može biti anti-tubulin agens. Primeri anti-tubulin agenasa uključuju taksane (npr., Taxol® (paklitaksel), Taxotere® (docetaksel)), T67 (Tularik), vinka alkaloide (na primer, vinkristin, vinblastin, vindesin, i vinorelbin) i auristatine (npr., auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). (Primeri auristatina su prikazani ispod u formulama III-XIII. Drugi pogodni antitubulin agensi uključuju, na primer, baccatin derivate, analoge taksana (npr., epotilon A i B), nokodazol, kolhicin i kolcimid, estramustin, kriptofizine, cemadotin, maitansinoidi, kombretastatini, diskodermolid i eleuterobin.
[0094]Citotoksični agens može biti maitansinoid, druga grupa anti-tubulin agenasa. Na primer, maitansinoid može biti maitansin ili maitansin linker koji sadrži lek kao što su DM-1 ili DM-4 (ImmunoGen, Inc.; videti takođe Chari et al., 1992, Cancer Res. 52: 127-131).
[0095]Primeri antitelo lek konjugata uključuju vcMMAE i mcMMAF antitelo lek konjugate kao što sledi gde su p i At kao što je prethodno ovde opisano:
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
VI. Druga antitela za LIV- 1
[0098]Kao i humanizovani oblici BR2-14a i BR2-22a antitela gore opisana, druga antitela koja se vezuju za ekstracelularni domen LIV-1 mogu biti korišćena u nekim postupcima ovde opisanim, posebno u lečenju trostruko negativnih karcinoma dojke. Kolekcija mišjih antitela za LIV-1 je opisana u US20080175839. Ova antitela uključuju 1.1F10, 1.7A4, BR2-10b, BR2-lla, BR2-13a, BR2-14a, BR2-15a, BR2-16a, BR2-17a, BR2-18a, BR2-19a, BR2-20a, BR2 -21a, BR2-22a, BR2-23a, BR2-24a i BR2-25a, od kojih su BR2-19a koje proizvodi hibridom ATCC Pristupni br. PTA-5706 ili BR2-23a koja proizvodi hibridom ATCC Pristupni br. PTA- 5707 pored BR2-14a i BR2-22a poželjna. Humanizovana, himerna ili obloženi oblici ovih antitela mogu biti dobijeni prema konvencionalnim postupcima sumiranim ispod.
[0099]Druga antitela za LIV-1 mogu biti dobijena de novo imunizacijom sa LIV-1 ili jednim ili više ekstracelularnih domena istog. Proizvodnja ostalih monoklonskih nehumanih antitela, npr, mišja, morskog praseta, primata, zeca ili pacova, protiv imunogena može biti izvedena pomoću kao što je opisano od strane Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratorv Manual (CSHP NY, 1988). Takav imunogen se može dobiti iz prirodnog izvora, sintezom peptida ili rekombinantnom ekspresijom.
[0100]Mogu biti proizvedeni humanizovani, himerni ili obloženi oblici nehumanih antitela. Opšta metodologija za proizvodnju humanizovanih antitela je opisana od strane Queen, U.S. 5,530,101 i 5,585,089; Winter, US 5,225,539; Čarter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; i Foote, US 6,881,557). Himerno antitelo je antitelo u kome su zreli varijabilni regioni lakih i teških lanaca nehumanog antitela (npr, miša) kombinovani sa humanim konstantnim regionima lakog i teškog lanca. Takva antitela suštinski ili u potpunosti zadržavaju specifičnost vezivanja mišjeg antitela i ona su oko dve trećine humane sekvence. Obloženo antitelo je vrsta humanizovanog antitela koje zadržava neke i obično sve CDR regione i neke od okvirnih ostataka nehumanog varijabilnog regiona nehumanog antitela ali zamenjuje druge okvirne ostatke varijabilnog regiona koji mogu doprineti B- ili T ćelijskim epitopima, na primer izloženi ostaci (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) sa ostacima sa odgovarajućih položaja sekvence humanog antitela. Rezultat je antitelo u kome su CDR regioni u potpunosti ili u značajnoj meri iz nehumanog antitela i promenljivi regioni okvira nehumanog antitela su napravljeni više nalik humanim pomoću supstitucija.
[0101]Humana antitela protiv LIV-1 mogu biti obezbeđena različitim tehnikama niže opisanim. Postupci za proizvodnju humanih antitela uključuju metode trioma od Oestberg et al., Ilibridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S. Patent br. 4,634,664; i Engleman et al., US Patent 4,634,666; upotrebu transgenih miševa, uključujući humane imunoglobulinske gene (videti, npr, Lonberg et al., V/093/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) i metode displeja faga (videti, npr Dower et al., WO 91/17271 i McCafferty et al, WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 i US 5,565,332.
[0102]Bilo koje od antitela može biti odabrano da ima iste ili preklapajuće specifičnosti epitopa kao antitelo objašnjeno primerom, kao što je BR2-14a antitelo, testom kompetitivnog vezivanja ili na drugi način.
VII. Terapeutske primene
[0103]Humanizovana antitela prema pronalasku, sama ili kao konjugati LIV-1 antitelo lek, mogu biti korišćena u lečenju kancera. Neki takvi kanceri pokazuju detektabilne nivoe LIV-1 izmerene bilo na osnovu proteina (npr, imunotest koristeći jedno iz objašnjenih primera antitela) ili nivoa mRNK. Neki takvi kanceri pokazuju povišene nivoe LIV-1 u odnosu na ne-kancerozna tkiva istog tipa, poželjno od istog pacijenta. Primer nivoa LIV-1 na ćelijama kancera podložnih tretmanu je 5000-150000 LIV-1 molekula po ćeliji, iako viši ili niži nivoi mogu biti tretirani. Opciono, nivo LIV-1 kod kancera je izmeren pre izvođenja tretmana.
[0104]Primeri kancera povezanih sa LIV-1 ekspresijom i podložni tretmanu obuhvataju kancer dojke, kancer prostate, kancer jajnika, kancer endometrijuma, cerviksa, jetre, želuca, bubrega i karcinome skvamoznih ćelija (npr bešike, glave, vrata i pluća), kancere kože, npr, melanom, karcinom malih plućnih ćelija ili karcinoid pluća. Lečenje se može primeniti kod pacijenata koji imaju primarne ili metastatske tumore ovih vrsta. Lečenje se može primeniti kod pacijenata koji su otporni na konvencionalna lečenja (npr hormone, tamoksifen, herceptin), ili koji imaju povratak nakon odgovora na takve tretmane. Postupci se takođe mogu koristiti na trostruko negativnim kancerima dojke. Trostruko negativni kancer dojke je izraz iz tehnike za kancer kome nedostaje detektovani estrogen i progesteronski receptori i kome nedostaje prekomerna ekspresija HER2/neu kada se boji sa antitelom za bilo koji od ovih receptora, kao što je opisano u primerima. Bojenje se može izvesti u odnosu na irelevantno kontrolno antitelo i nedostatak ekspresije prikazan sa podloga nivoa bojenja je isti ili sličan sa onim iz kontrole unutar eksperimentalne greške. Isto tako nedostatak prekomerne ekspresije je prikazan bojenjem na istom ili sličnom nivou unutar eksperimentalne greške nekanceroznih tkiva dojke, poželjno dobijenih od istog pacijenta. Alternativno ili dodatno, trostruko nativni kanceri dojke su karakterisani nedostatkom reakcije na hormone u interakciji sa ovim receptorima, agresivno ponašanje i poseban obrazac metastaza. hLIV14 antitela se mogu koristiti za lečenje kancera koji eksprimiraju LIV-1. U jednoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi za lečenje subjekta sa kancerom dojke koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom prostate koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa melanomom koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenje subjekta sa kancerom jajnika koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom endometrijuma koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa cervikalnim kancerom koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom jetre koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom želuca koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom bubrega koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa karcinomom skvamoznih ćelija koji eksprimira LIV-1 (npr, bešike, glave, vrata i kancer pluća). U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom dojke koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom kože koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV14 se koristi u lečenju subjekta sa sitnoćelijskim karcinomom pluća ili karcinoidom pluća koji eksprimira LIV-1. hLIV22 antitela se mogu koristiti za lečenje kancera koji eksprimiraju LIV-1. U jednoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom dojke koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom prostate koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa melanomom koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom jajnika koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom endometrijuma koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa cervikalnim kancerom koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom jetre koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom želuca koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom bubrega koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa karcinomom skvamoznih ćelija koji eksprimira LIV-1 (npr, bešike, glave, vrata i kancer pluća). U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom dojke koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa kancerom kože koji eksprimira LIV-1. U drugoj realizaciji, antitelo hLIV22 se koristi u lečenju subjekta sa sitnoćelijskim karcinomom pluća ili karcinoidom pluća koji eksprimira LIV-1. Ova prijava daje prvo obelodanjivanje da je LIV-1 protein eksprimiran na površini melanoma ćelija. Stoga, antitela koja se vezuju za LIV-1 mogu da se koriste za lečenje pacijenata koji boluju od melanoma koje eksprimiraju LIV-1. Takva antitela uključuju antitela otkrivena ovde, npr hLIV14 i hLIV22, ali nisu ograničena na antitela ovde opisana.
[0105]Humanizovana antitela, sama ili kao konjugati, se primenjuju u efikasnom režimu koji podrazumeva dozu, put primene i učestalost primene koji odlaže početak, smanjuje jačinu, inhibira dalje pogoršanje, i/ili ublažava najmanje jedan znak ili simptom kancera. Ako pacijent već boluje od kancera, režim se može nazvati terapeutski efikasnim režimom. Ukoliko je pacijent pri povišenom riziku od pojave kancera u odnosu na opštu populaciju, ali još uvek ne doživljava simptome, režim se može nazvati kao profilaktički efikasan režim. U nekim slučajevima, terapeutska ili profilaktička efikasnost može se posmatrati kod individualnog pacijenta u odnosu na istorijat kontrola ili prethodna iskustva kod istog pacijenta. U drugim slučajevima, terapeutska ili profilaktička efikasnost se može demonstrirati pretkliničkim ili kliničkim ispitivanjem u populaciji lečenih pacijenata u odnosu na kontrolnu populaciju netretiranih pacijenata.
[0106]Primeri doza za monoklonska antitela su 0,1 mg/kg do 50 mg/kg pacijentove telesne težine, još tipičnije 1 mg/kg do 30 mg/kg, 1 mg/kg do 20 mg/kg, 1 mg/kg do 15 mg/kg, 1 mg/ kg do 12 mg/kg, ili 1 mg/kg do 10 mg/kg, 1 ili 2 mg/kg do 30 mg/kg, 2 mg/kg do 20 mg/kg, 2 mg/kg do 15 mg/kg, 2 mg/kg do 12 mg/kg ili 2 mg/kg do 10 mg/kg, ili 3 mg/kg do 30 mg/kg, 3 mg/kg do 20 mg/kg, 3 mg/kg do 15 mg/kg, 3 mg/kg do 12 mg/kg, ili 3 mg/kg do 10 mg/kg. Primeri doza za monoklonsko antitelo ili antitelo lek konjugata su 1 mg/kg do 7,5 mg/kg, ili 2 mg/kg do 7,5 mg/kg ili 3 mg/kg do 7,5 mg/kg subjektove telesne težine, ili 0,1-20 ili 0,5-5 mg /kg telesne težine (npr 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mg/kg) ili 10-1500 ili 200-1500 mg kao fiksna doza. U nekim postupcima, pacijentu je primenjivana doza od najmanje 1,5 mg/ kg, najmanje 2 mg/kg ili najmanje 3 mg/kg, primenjenih jednom svake tri nedelje ili veće. Doziranje zavisi od učestalosti primene, stanja pacijenta i odgovora na prethodni tretman, ako ih ima, da li je tretman profilaktički ili terapeutski i da li je taj poremećaj akutni ili hronični, između ostalih faktora.
[0107]Primena može biti parenteralna, intravenozna, oralna, subkutana, intraarterijska, intrakranijalna, intratekalna, intraperitonealna, topikalna, intranazalna ili intramuskularna. Primena se takođe može lokalizovati direktno u tumor. Primena u sistemsku cirkulaciju intravenskom ili subkutanom primenom je poželjna. Intravenska primena može biti, na primer, infuzijom tokom perioda kao što je 30-90 min ili pojedinačnom bolus injekcijom.
[0108]Učestalost primene zavisi od poluživota antitela ili konjugata u cirkulaciji, stanja pacijenta i načina primene između ostalih faktora. Učestalost primene može biti dnevna, nedeljna, mesečna, tromesečna, ili u nepravilnim intervalima kao odgovor na promene pacijentovog stanja ili progresije kancera koji se leči. Primer učestalosti za intravenoznu primenu je između dva puta nedeljno i kvartalno preko kontinuiranog toka lečenja, iako je više ili rede učestalo doziranje takođe moguće. Drugi primeri učestalosti doziranja kod intravenske primene su između nedeljnog ili tri od svake četiri nedelje kod kontinuiranog toka lečenja, iako je viša ili reda učestalost doziranja takođe moguća. Za subkutanu primenu, primer učestalosti doziranja je dnevno do mesečno, iako je viša ili manja učestalost doziranja takođe moguća.
[0109]Broj primenjenih doza zavisi od prirode kancera (na primer, da li predstavlja akutne ili hronične simptome) i odgovor poremećaja na lečenje. Za akutne poremećaje ili akutna pogoršanja kroničnog poremećaja između 1 i 10 doza su često dovoljne. Ponekad je jedna bolus doza, opciono u podeljenom obliku, dovoljna kod akutnog poremećaja ili akutnog pogoršanja kroničnog poremećaja. Tretman se može ponoviti za recidiv akutnog poremećaja ili akutnog pogoršanja. Za hronične poremećaje, antitelo se može primenjivati u redovnim intervalima, na primer, jednom nedeljno, svake dve nedelje, mesečno, kvartalno, na svakih šest meseci tokom najmanje 1,5 ili 10 godina, ili pacijentovog života.
[0110]Farmaceutske kompozicije za parenteralnu primenu su poželjno sterilne i suštinski izotonične i proizvedene pod GMP uslovima. Farmaceutske kompozicije mogu biti obezbeđene u obliku jedinične doze (tj doze za pojedinačnu primenu). Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivik nosača, razblaživača, ekscipijenasa ili pomoćnih sredstava. Formulacija zavisi od izabranog puta primene. Za injekcije, antitela mogu biti formulisana u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima kao što su Hankov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki rastvor ili acetatni pufer (kako bi se smanjila nelagodnost na mestu primene injekcije). Rastvor može sadržati sredstva za formulisanje kao što agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno antitela mogu biti u liofilizovanom obliku za konstituciju sa pogodnim vehikulumom, na primer, sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe. Koncentracija antitela u tečnoj formulaciji može biti npr 1-100 mg/ml, kao što je 10 mg/ml.
[0111]Lečenje sa antitelima iz predmetnog pronalaska se može kombinovati sa hemioterapijom, zračenjem, lečenjem matičnim ćelijama, hirurgijom i drugim lečenjima efikasnim protiv poremećaja koji se leče. Korisne klase drugih agenasa koji se mogu primenjivati sa humanizovanim antitelima LIV-1 uključuju, na primer, antitela za druge receptore eksprimirane na kanceroznim ćelijama, antitubulin agense (npr auristatine), DNK vezujuća sredstva manjeg žljeba, inhibitore DNK replikacije, alkilujuće agensi (npr kompleksi platine kao što su c/s-platin, mono (platinum), bis (platinum) i tri-nuklearni kompleksi platine i karboplatin), antracikline, antibiotike, antifolate, antimetabolite, hemioterapijske senzibilizatore, duokarmicine, etopozide, fluorovani pirimidin, jonofore, leksitropsine, nitrozouree, platinole, preformirajuća jedinjenja, purinske antimetabolite, puromicine, radijacione senzibilizatore, steroide, taksane, inhibitore topoizomeraze, vinka alkaloide, i slično.
[0112]Tretman sa humanizovanim anti-LIV-1 antitelom, opciono u kombinaciji sa bilo kojim od drugih sredstava ili režima gore opisanih pojedinačno ili kao konjugat antitelo lek, može da poveća medijanu preživljavanja bez napredovanja bolesti ili ukupno vreme preživljavanja pacijenata sa tumorima (npr, dojke, prostate, melanom), naročito kada je recidiv ili refraktorni tumor, najmanje 30% ili 40%), ali poželjno 50%, 60% do 70% ili čak 100% ili duže, u odnosu na isti tretman (npr hemioterapija) ali bez anti-LIV-1 antitela samostalnog ili kao konjugata. Dodatno ili alternativno, tretmanom (npr standardnom hemioterapijom) uključujući anti-LIV-1 antitela samostalno ili u obliku konjugata može se povećati kompletna stopa odgovora, delimična stopa odgovora ili objektivna stopa odgovora (kompletna + delimična) pacijenata sa tumorom najmanje 30% ili 40% ali poželjno 50%, 60%) do 70%) ili čak 100% u poređenju sa istim tretmanom (npr hemoterapija) ali bez anti-LIV-1 antitela.
[0113]Tipično, u kliničkom ispitivanju (na primer, faza II/ III ili faza III ispitivanja), navedeno povećanje srednjeg preživljavanja bez napredovanja bolesti i/ili stope odgovora pacijenata tretiranih standardnom terapijom plus humanizovana anti-LIV-1 antitela, u odnosu na kontrolnu grupu pacijenata koji su primali samo standardnu terapiju (ili plus placebo), su statistički značajne, na primer pri p _ 0,05 ili 0,01 ili čak 0,001 nivou. Kompletne i delimične stope odgovora se određuju prema objektivnim kriterijumima koji se obično koriste u kliničkim ispitivanjima za kancer, na primer, kao što je navedeno ili prihvaćeno od strane Nacionalnog instituta za kancer i / ili Administracija za hranu i lekove (FDA).
VIII. Druge primene
[0114]Anti-LIV-1 humanizovana antitela mogu biti korišćena za detekciju LIV-1 u kontekstu kliničke dijagnoze ili lečenja ili u istraživanju. Ekspresija LIV-1 usled kancera daje indikaciju da je kancer podložan tretmanu sa antitelima iz ovog pronalaska. Antitela takođe mogu biti prodata kao istraživačke reagensi za laboratorijsku istraživanja u otkrivanju ćelija koje nose LIV-1 i njihov odgovor na različite stimulanse. U takvim upotrebama, monoklonska antitela mogu biti obeležena fluorescentnim molekulima, spin-obeleženim molekulima, enzimima ili radioizotopima, i mogu se obezbediti u obliku kompleta sa svim potrebnim reagensima za obavljanje testa za LIV-1. Antitela ovde opisana, BR2-14a, BR2-22a i njihove humanizovane verzije, na primer, hLIV14 i hLIV22, mogu biti korišćena za detekciju ekspresije LIV-1 proteina i određuju da lije kancer podložan tretmanu sa LIV-1 antitelo-lek konjugatom (ADC-om). Kao primer, BR2-14a, BR2-22a i njihove humanizovane verzije, na primer, hLIV14 i hLIV22 mogu biti korišćene za detekciju LIV-1 ekspresije na ćelijama kancera dojke, melanoma ćelija, cervikalnim ćelijama kancera, ili ćelijama kancera prostate. Antitela takođe mogu biti korišćena za prečišćavanje LIV-1, npr, pomoću afinitetne hromatografije.
IX. LIV- 1 Makaki majmuna
[0115]Ovde opisana je aminokiselinska sekvenca za LIV-1 (CY LIV-1) od makaki majmuna u SEK ID BR: 85, sa ili bez signalnog peptida, koji zauzima približno ostatke 1-28 iz SEK ID BR: 85, kao i nukleinske kiseline koje kodiraju tc aminokiselinske sekvence. Varijante koje se razlikuju i do 1, 2, 3, 4, ili 5 supstitucija, brisanja ili umetanja su takođe uključene obezbeđujući da CY varijante ne uključuju prirodnu humanu LIV-1 sekvencu. Analogno humanom LIV-1, referenca sa CY-LIV-1 označava najmanje jedan ekstracelulami domen proteina i obično kompletan protein osim jednog raskinutog signalnog peptida (aminokiseline 1-28). Pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za SEK ID BR: 85 sa ili bez specifičnog vezivanja za humani LIV-1 (tj, vezivanje za humani LIV-1 na nivou negativne kontrole irelevantnog antitela). Pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja poželjno vezuju CY-LIV-1 preko humanog LIV-1 i obrnuto. Preferencijalno vezivanje označava višu asocijaciju izvan eksperimentalne greške i poželjno najmanje 2, 3 ili 4 puta višu. Pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja pokazuju isti vezujući profil za humani i CY LIV-1 u okviru eksperimentalne greške kao bilo koja primerima objašnjena antitela opisana u nastavku. Pronalazak dalje obezbeđuje postupke za analiziranje vezivanja antitela za CY LIV-1. Takvi postupci uključuju kontaktiranje antitela sa CY LIV-1, određivanje da li se antitelo specifično vezuje za CY LIV-1 i izborno određivanje mere jačine vezivanja, kao što je konstanta asocijacije.
PRIMERI
I. Humanizacija BR2-14a
Materijali
[0116]Ćelijske linije opisane u sledećim primerima su održavane u kulturi u skladu sa uslovima utvrđenim od strane American Type Culture Collection (ATCC), Nacionalnog instituta za kancer (NCI) ili Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulruren GmbH, Braunschweig, Nemačka (DMSZ). Reagensi ćelijske kulture su dobijeni od kompanije Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA.) ili drugih dobavljača.
Metodologije:
Ispitivanja saturacionog vezivanja
[0117]1* 10<5>ćelija koje eksprimiraju antigen (bilo MCF7 ćelije (ATCC) koje eksprimiraju humani LIV-1, jedna transfektovana CHO ćelijska linija koja eksprimira humani LIV-1 ili jedna transfektovana CHO ćelijska linija koja eksprimira cyno LIV-1) su alikvotirane po bazenčiću od 96-bazenčića ploča sa V-dnom. AlexaFluor-647 označeno mišje LIV-1 mAt, npr BR2-14a, dodaje se u koncentracijama u opsegu od 0,66 pM do 690 nM i inkubira na ledu tokom 30 minuta. Ćelije su peletirane i isprane 3 x sa PBS/BSA. Ćelije su zatim peletirane i resuspendovane u 125 uL PBS/BSA. Fluorescencija je analizirana protočnom citometrijom, koristeći procenat zasićenog fluorescentnog signala za određivanje procenta vezivanja i da se zatim izračuna prividna Kd.
Ispitivanja kompetitivnogvezivanja
[0118]1 x IO<5>CHO ćelija koje eksprimiraju rekombinantni humani LIV-1 u PBS/BSA su alikvotirane u svaki od 96 bazenčića sa v-dnom na ledu. Ćelije su inkubirane tokom 1 sata sa 5 nM AlexaFluor-647 (AF) obeleženog roditeljskog mišjeg LIV-1 mAt i rastućim koncentracijama (od 0,038 nM do 600 nM) neobeleženog humanizovanog LIV-1 mAt, kombinacijama humanizovanih lakih lanaca LA-LF i humanizovanih teških lanaca HA-HE. Ćelije su peletirane i isprane 3 puta sa PBS/BSA. Ćelije su peletirane i resuspendovane u 125 uL PBS/ BSA. Fluorescencija je analizirana protočnom citometrijom, koristeći procenat zasićenog fluorescentnog signala za određivanje procenta vezanog obeleženog mišjeg LIV-1 mAt i naknadno ekstrapolacija EC50 uklapanjem podataka sa sigmoidalnom krivom doze-odgovora sa varijabilnom nagibom.
[0119]1*10<5>MCF7 ćelija koje eksprimiraju LIV-1 u PBS/BSA su alikvotirane u svakom od 96 bazenčića ploča sa v-dnom na ledu. Ćelije su inkubirane tokom 1 sata sa 5 nM AlexaFluor-647 obeleženim mišjim LIV-1 mAt i rastućim koncentracijama (od 0,038 nM do 600 nM) neobeleženog humanizovanog LIV-1 mAt, kombinacijama humanizovanih lakih lanaca LA-LF i humanizovanih teških lanaca HA-HE. Ćelije su peletirane i isprane 3 puta sa PBS. Ćelije su peletirane i resuspendovane u 125 uL PBS/BSA. Fluorescencija je analizirana protočnom citometrijom, korišćenjem procenta zasićenog fluorescentnog signala za određivanje procenta obeleženog vezanog mišjeg LIV-1 mAt i naknadno ekstrapolacija EC50 uklapanjem podataka do sigmoidalne krive doze-odgovora sa varijabilnom nagibom.
[0120]lxl0<5>CHO ćelija koje eksprimiraju rekombinantne cino LIV-1 u PBS-u su alikvotirane u svakom od 96 bazenčića ploča sa v-dnom na ledu. Ćelije su inkubirane tokom 1 sata sa 5 nM AlexaFluor-647 obeleženim mišjim LIV-1 mAt i rastućim koncentracijama (od 0,038 nM do 600 nM) neobeleženog humanizovanog LIV-1 mAt, kombinacijama humanizovanih lakih lanaca LA-LF i humanizovanih teških lanaca HA-HE. Ćelije su peletirane i isprane 3 puta sa PBS-om. Ćelije su peletirane i resuspendovane u 125 uL PBS/BSA. Fluorescencija je analizirana protočnom citometrijom, korišćenjem procenta zasićenog fluorescentnog signala za određivanje procenta vezanog obeleženog mišjeg LIV-1 mAt i naknadno ekstrapolacije EC50 uklapanjem podataka do sigmoidalne krive doze-odgovora sa varijabilnom nagibom.
Kvantitativna protočna citometrijska analiza
[0121]Kvantifikacija LIV-1 broja kopija na površini ćelija je određivana korišćenjem mišjeg LIV-1 mAt kao primarnog antitela i DAKO QiFiKit protočno citometrijski indirektnog ispitivanja kao što je opisano od strane proizvođača (DAKO A/S, Glostrup, Danska) i ocenjeno sa Becton Dikinson FACS®can protočnim citometrom.
Ispitivanje citotoksičnosti
[0122]Tumorske ćelije su inkubirane sa LIV-1 antitelo lek konjugatima tokom 96-144 sata na 37°C. Nevezujući (H00) ADC je korišćen kao negativna kontrola. Vijabilnost ćelija je merena resazurinom (Sigma) pri finalnoj koncentraciji od 50 uM. Ćelije su inkubirane tokom četiri do šest sati na 37°. Fluorescentni signal je meren na čitaču Fusion HT fluorescentna ploča (Perkin Elmer, VValtham, MA.). Rezultati su prikazani kao IC50, koncentracija jedinjenja koja je potrebna da se dobije smanjenje 50% u vijabilnosti u odnosu na vijabilnost ćelija tretiranih vehikulumom (kontrola = 100%).
Proizvodnja konjugata antitelo-lek
[0123]Konjugati antitelo-lek od LIV-1 antitela su pripremljeni kao što je opisano u US20050238649. Linkeri leka vcMMAE (takođe označen i kao 1006) i mcMMAF (označen kao 1269) su oboje opisani u US20050238649. Priprema cisteinskih mutanta IgGl antitela je generalno opisana u US20100158919, US20050238649 i US20100158919.
Proizvodnja ne-fukozilovanog anti-LIV-1 mAt
[0124]Ćelijska linija CHO DG44 koja proizvodi humanizovano IgGl anti-LIV-1 monoklonsko antitelo, HBLB mAt (hLIV-14), je kultivisana na 3,0 x IO<5>ćelija po mL u 30 mL CHO kulture medija na 37°, sa 5% C02i trešena na 100 RPM u 125 ml boci za trešenje. Medijum je dopunjen sa insulinski sličnim faktorom rasta (IGF), penicilinom, streptomicinom i 65 uM 2-fluorofukoze peracetata (SGD-2084) (videti US20090317869). Kulture su hranjene na dan 3. sa 2% zapremine hrane medijuma. Četvrtog dana, kultura je podeljena u odnosu 1: 4 u svežem medijumu kulture. Kulture su hranjene sa zapreminom 6% proizvodnog hranjenog medijuma u danima 5, 7, 9 i 10. Kondicionirani medijum se sakuplja 13-og dana propuštanjem kulture kroz filter sa veličinom pora od 0,2 um. Prečišćavanje antitela je izvedeno primenom kondicioniranog medijuma za proteinsku A kolonu unapred ekvilibrisanu lx sa fosfatnim slanim puferom (PBS), pH 7,4.
[0125]Nakon ispiranja kolone sa 20 zapremina kolone od 1 * PBS-a, antitela su eluirana sa 5 zapremina kolone Immunopure IgG eluacionog pufera (Pierce Biotechnologv, Rockford, IL). Zapremina od 10 % IM Tris pH 8,0 je dodata eluiranoj frakciji. Uzorak je dijalizovan tokom noći 1 x u PBS-u.
Ćelijska citotoksičnostzavisnaod antitela (ADCC)
[0126]ADCC aktivnost je merena korišćenjem standardnog ispitivanja oslobađanja<31>Cr. Ukratko, ciljne ćelije tumora MCF-7 su obeležene sa 100 uCi Na<51>Cr04, isprane i pre-inkubirane sa testiranim antitelima pre dodavanja efektorskih ćelija (prirodnih ubica, NK ćelija). NK ćelije (CD16<+>CD56<+>) su pripremljene iz neadherentnih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC-a) dobijenih od normalnih FcyRIIIA 158V/V donatora (Lifeblood, Memphis, TN) sa imunomagnetnim zrncima (EasvSep, StemCell Technologies, Vankuver, BC, Kanada). Vijabilne NK ćelije su dodate ciljnim ćelijama pri odnosu efektora prema ciljnoj ćeliji od 10:1. Humani IgGlK(Ancell, Bavport, MN) je korišćen kao negativna kontrola u ovom ispitivanju. Nakon 4 sata inkubacije, supernatanti su sakupljeni i osušeni preko noći na Luma pločama. Gama zračenje emitovano iz liziranih MCF-7 ćelija je zatim detektovano korišćenjem TopCount Microplate Scintillation and Luminescence Counter (Perkin Elmer, VValtham, Massachusetts). ADCC aktivnost je zabeležana kao% specifične lize.
In Vivostudija aktivnosti
[0127]Golim (nu/nu) miševima (7-8 životinja/grupi) implantirane su tumorske ćelije uzgajane u kulturi: MCF-7 od NCI (5 x IO<6>ćelija u 25% matrigela), PC3 od ATCC (2,5 x IO<6>ćelije u 25% matrigela), i PC3 od DSMZ (5 x IO<5>u 25% matrigela). Zain vivorast MCF-7 ćelija, ženke miševa su takođe primile dodatak estrogena implantacijom peleta sa sporim oslobađanjem estrogena (90 dana oslobađanja). Doziranja sa himernim ili humanizovanim LIV-1 ADC-om ili nevezujućim kontrolnim ADC-om (3 mg/kg) je započeto kada su tumori dostigli 100 mm<3>(q4d * 4 intraperitonealne injekcije). Zapremine tumora su praćene korišćenjem kalibarskih šestara i životinje su podvrgnute eutanaziji kada je zapremina tumora dostigla~800 mm<3>. Dijagrami srednje zapremine tumora su nastavljeni za svaku grupu dok su jedna ili više životinja bile podvrgnute eutanaziji. Sve procedure na životinjama su izvedene pod protokolom odobrenom od strane Institucional Animal Care and Use Committee veštinom akreditovanom od strane Udruženja za procenu i akreditaciju laboratorija za životinjsku negu.
LIV-1 Imunohistohemijsko (IHC) bojenje
Postupak
[0128]Tumorske mikromatrice (TMAS) i individualni uzorci tumora su dobijeni iz komercijalnih izvora. Tkiva mikromatrica od normalnog ili tumorskih tkiva fiksiranih formalinom i zatopljenih parafinom (FFPE) su nabavljena ili iz SAD Biomax Inc. ili Cvbrdi. Zamrznuta matrica je nabavljena od BioChain. Pojedinačne sekcije su nabavljene od NDRI, Asterand, Tissue Solution ili CHTN. Komplet od 25 uzoraka zatopljenih parafinom metastatskog hormonski refraktornog kancera prostate (odgovara metastatskim mestima kostiju i mekih tkiva) obezbedio je dr R. Vessella, Univerziteta u Vašingtonu, Urogenitalnog Odeljenja za kancer. Svi uzorci su obrađeni na Bond Max ™ auto-stainer (Leica).
IHC bojenje FFPE tkiva:
[0129]FFPE diapozitivi ili TMAs preseci na staklenim pločicama su deparafinisani korišćenjem Bond™ Dewax rastvora (Leica, kat # AR9222) na 72°C i ponovo hidrirani. Oporavak antigena je obavljen korišćenjem EDTA baziranog Bond™ Epitope Retrieval Solution 2 (Leica, kat # AR9640) tokom 20 minuta na 95-100° C pre inkubacije sa primarnim mišjim LIV-1 mAt-om (1-2 ug/ml tokom 30-45 minuta na 25°C). Izotipski uparen mišji IgGl (Sigma; kat # M5284) je korišćen kao negativna kontrola za pozadinska obojenja. Za automatsko IHC bojenje koristili smo ili Refine DAB komplet ili komplet za detekciju na bazi alkalne fosfataze: Bond™ Polvmer AP Red Detection kit (Leica, kat # DS9305). Pločice su inkubirane sa mišjim monoklonskim primarnim antitelima protiv mišjeg LIV-1 mAt tokom 45 min pri 1 ug/ml sa preliminarnim 30 min blokom proteina (DAKO kat # X0909). Nakon razvoja hromogena, preseci su kontra bojeni sa hematoksilinom i pokriveni. Pločice su ocenjene i bodovane od strane patologa i slike su snimljene korišćenjem Zeiss Axiovert 200M mikroskopa (Carl Zeiss, Inc., Thormvood, NY).
IHC zamrznutih tkiva:
[0130]5 uM sekcije smrznutih/OCT uzoraka su fiksirane acetonom za 10 min., osušene na vazduhu 30 min, i prethodno tretirane 20 min sa 1 * Morphosave na sobnoj temperaturi. Pločice su napunjene u Bond-Mak™ auto-Stainer (Leica) i bojene tokom 45 min sa primarnim antitelom sa preliminarnim 30 min blokom proteina (DAKO kat # X0909). Mišji IgGl (BD Pharmingen kat # 550878) je korišćen kao negativna kontrola. Za detekciju koristili smo DAB-bazirani Bond Polvmer Refine komplet (Leica, kat # DS9800). Nakon razvoja hromogena, preseci su kontra bojeni sa hematoksilinom i pokriveni. Pločice su ocenjene i bodovane od strane patologa.
Rezultati
1. Vezivanje mišjeg antitela
[0131]Konstanta disocijacije (Kd) mišjeg LIV-1 monoklonskog antitela BR2-14a antitela (US2004141983) je određena za humani LIV-1 izražen kao endogeni protein u ćelijskoj liniji humanog kancera dojke ili kao rekombinantni protein u CHO ćelijskoj liniji. Kd za mišje LIV-1 antitelo BR2-14a je takođe određena za makaki LIV-1 izražen kao rekombinantni protein u CHO ćelijskoj liniji. MCF7 je ćelijska linija humanog karcinoma dojke. 293F je humana embrionska ćelijska linija bubrega. Tabela 1 pokazuje da antitelo ima oko 5-puta nižu konstantu disocijacije za ne-rekombinantni LIV-1 izražen iz humane ćelijske linije nego rekombinantni LIV-1, bilo da je humani (hLIV-1) ili iz makaki majmuna (cyLIV-l).
2. Dizajn i testiranje humanizovanih antitela
[0132]Polazna tačka ili donorsko antitelo za humanizaciju u ovom primeru je mišje antitelo BR2-14a proizvedeno pomoću hibridoma koji ima ATCC pristupni broj PTA-5705A i opisan je u US2004141983. Pogodne humane akceptorske sekvence su genomske sekvence obezbeđene pomoću VH1-02 i JH5 za teški lanac i pomoću VK2-30 i Jk4 za laki lanac. Humane primalac sekvence pokazuju 68 i 85 procenata identičnosti sa davalac sekvencama u varijabilnom regionu okvira. CDR regioni lakog lanca od humanih primalac sekvenci su istog kanonskog tipa kao CDR regioni davalac sekvenci. Nasuprot tome, CDR regioni teškog lanca humanih primalac sekvenci se razlikuju u svom kanonskom tipu (embrionalna je 1-3 nasuprot 1-2 za mišji davalac).
[0133]Poravnjanjem donatorskih sekvenci identifikovano je jedanaest položaja u teškom lancu (H27, H28, H29, H30, H48, H66, H67, H71, H76, H93 i H94) i pet položaja u lakom lancu (L36, L37, L45, L46 i L39) pri kojoj se humana sekvenca primalac razlikovala od donorske sekvence kao i da može da utiče na vezivanje antitela kao rezultat direktnog kontaktiranja antigena, utičući na konformaciju CDR segmenata ili utičući na pakovanje između teških i lakih lanaca. Pet humanizovanih teških lanaca i šest humanizovanih lakih lanaca su napravljeni uključujući povratne mutacije pri različitim permutacijama ovih položaja (SI. 1 (poravnanje sekvence) i Tabela 2).
[0134]Humanizovana antitela su zatim eksprimirana predstavljaći svaku permutaciju ovih lanaca (30 mogućnosti) humanizovanih teških i lakih lanaca. Krive vezivanja za rekombinantni humani LIV-1 eksprimiran iz CHO ćelija su prikazane na Slici. 2. EC50vrednosti su sumirane u Tabeli 3 u nastavku.
[0135]Ovi podaci ukazuju na značajne varijacije EC50 između 30 testiranih humanizovanih antitela sa HBLB i HELE koja pokazuju najmanje dva puta bolje vezivanje od sledećeg humanizovanog antitela HBLF i većih granica više od većine humanizovanih antitela. Vezujuće krive na Slici 2 pokazuju da su oba HBLB i HELE imala jače vezivanje od originalnog mišjeg antitela.
[0136]HBLB antitelo je izabrano kao najbolje od humanizovanih antitela zato što ima (zajedno sa HELE) najjače vezivanje, ali ima manje povratnih mutacija naspram HELE, budući da su četiri povratne mutacije u HBLB-u i dvanaest u HELE-u.
[0137]EC50 vrednosti za humanizovano LIV-1 mAb koje vezuje humani LIV-1 eksprimiran na CHO ćelijama su određene za humani LIV-1 eksprimiran kao nativni protein u jednoj MCF7 ćelijskoj liniji (Slika 3). Ponovo, za LIV-1 monoklonska antitela HBLB i HELE bilo je odlučno da su najčvršća veziva.
[0138]Kd za HBLB prema humanom LIV-1 na ćelijskoj liniji MCF7 je određena iz prošeka nekoliko saturacionih krivi vezivanja kao 1,5 nm dok je za mišje antitelo 2,9 nM. Drugim rečima, HBLB antitelo ima oko dva puta od afiniteta za nativni humani LIV-1 kao mišje antitelo. Saturaciona kriva vezivanja prikazana na Slici 4 je reprezentativni primer.
[0139]Dva oblika HBLB antitela su upoređena za vezivanje za humani LIV-1 rekombinantno eksprimiran iz CHO ćelija. Jedan oblik je eksprimiran sa divljim tipom humanog IgGl i kapa konstantnim regionima. Drugi oblik je isti, osim za S239C mutaciju (EU numeracija) u teškom lancu IgGl (označen kao LIV-14d ili HBLB S239C), koji smanjuje vezivanje antitela za Fc gama receptore. Krive vezivanja i EC50 ovih antitela u poređenju sa mišjim antitelom donora su prikazani na Slici. 5. EC50 efikasne koncentracije oba oblika HBLB su slične jedna drugoj (u okviru greške studije), i obe su bile jače od mišjeg antitela.
[0140]EC50 efikasne koncentracije za humanizovano LIV-1 mAt HBLB i HBLB S239C su određene za cyno LIV-1 eksprimiran kao rekombinantni protein u CHO ćelijskoj liniji. Oba antitela vezuju sa jednakim afinitetom (bolje nego mišje LIV-1 mAt).
Podaci ekspresije za LIV-1
[0141]Mišja LIV-1 monoklonska antitela (najmanje 2 za slaganje) su korišćena za imunohistohemijske analize različitih tipova tumora korišćenjem formalinski-fiksiranih parafinski zatopljenih tkiva.
[0142]Primetili smo nižu LIV-1 IHC pozitivnost u izvedenim studijama koristeći mikromatrična tkiva u odnosu na velike sekcije tkiva. Razlika u ekspresiji je visoko značajna ukazujući daje analiza LIV-1 ekspresije u većim sekcijama tkiva poželjna. Bila je dobra saglasnost u ekspresiji korišćenjem najmanje 2 različita anti-LIV-1 monoklonska antitela. Slike 6 i 7 pokazuju visoki nivo u ekspresiji LIV-1 kod post-hormonski (tamoksifenom ili inhibitorima aromataze) tretiranih tumora dojke i prostate obezbeđujući jako obrazloženje za ciljanje ovih tumora pomoću LIV-1 ADC. Slika 8 prikazuje detektabilnu LIV-1 ekspresiju u trostruko negativnim (ER-, PgR-, Her2-) tkivima kancera dojke. Nivo ekspresije LIV-1 u trostruko negativnom kanceru dojke pomoću imunohistohemijskog bojenja je uporediv sa nivoom u PC3 životinjskom modelu, gdje smo pokazali anti-tumorsku aktivnost LIV-1 konjugata antitelo-lek (ADC). Trostruko negativni kanceri dojke su stoga potencijalna ciljna populacija, posebno trostruko negativni kanceri dojke za koje je utvrđeno da eksprimiraju LIV-1.
In vitroanti-tumorska aktivnost hLIV-14 mAt kao ADC-a i poboljšana efektorska funkcija mAt
(SEA)
[0143]Anti-tumorska aktivnost LIV-1 ADCs in vitro je merena korišćenjem oba ispitivanja citotoksičnosti (Slika 9) i ćelijske citotoksičnosti posredovane antitelima (ADCC) (Slike 10 i 11). Prvo, izvršili smo pregled LIV-1 ekspresije u različitim ćelijskim linijama kvantitativnom FACS analizom. Ćelijska linija kancera dojke MCF-7 od ATCC je imala najviši nivo LIV-1 mesta vezivanja po ćeliji, u poređenju sa MCF-7 ćelijskom linijom iz drugih izvora (podaci nisu prikazani). Iskoristili smo ovu ćelijsku liniju za oba ispitivanja in vitro. Pozivajući se na Sliku 9, različiti hLIV-14 ADC-i (HBLB antitelo konjugovano sa vcMMAE (koje se naziva 1006) ili mcMMAF (koje se naziva 1269) (oba mali molekuli i/ili linkeri opisani u US20050238649)) su visoko efikasni u ubijanju MCF-7 ćelija , u poređenju sa nevezujućim i mišjim kontrolnim konjugatima (mIgG-1006, mIgG-1269, hlgG-1006 i hlgG-1269). Pored toga, cisteinski mutant LIV-14d konjugat antitelo-lek (ADC), koji ima u prošeku dva linkera leka po antitelu su takođe veoma efikasni u ubijanju MCF-7 ćelija mereno citotoksičnim ispitivanjem. Pozivajući se na Slike 10 i 11, u ADCC ispitivanjima aktivnost fukozilovanog/divljeg tipa (WT) monoklonskog antitela i konjugati antitelo-lek su poređeni sa poboljšanim verzijama efektorskih funkcija (ne-fukozilovana mAt-a i ADCs, koja se nazivaju SEA). Rezultati su pokazali da poboljšana efektorska funkcija LIV-1 mAt-a i konjugati antitelo-lek imaju dobru ADCC aktivnost protiv MCF-7 ćelija, u poređenju sa ne-efektorskom funkcijom poboljšanog mAt-a ili ADC-a (uporediti, na primer, Sliku 10 hLIV-1 SEA vcMMAE sa hLIV-1 vcMMAE). Ponovo pozivajući se na Sliku 9, efektorska funkcija poboljšanog LIV-1 ADC (označenog kao SEA) takođe je imao sličan nivo citotoksične aktivnosti kao divlji tip (ne-fukozilovani) ADC-i (uporediti hLIV-1 SEA 1006 (vcMMAE) sa hLIV-1 1006 (vcMMAE)). Tako se na citotoksičnost može uticati pomoću obe efektorske funkcije i konjugovane akcije.
In vivoanti-tumorska aktivnost hLIV-14 ADC
[0144]Korišćenjem modela karcinoma dojke (MCF-7) i karcinoma prostate (PC-3), utvrdili smo anti-tumorsku aktivnost LIV-1 konjugata antitelo-lek (ADCs) (himernih i humanizovanih (HBLB) monoklonskih antitela sa prošekom od 4 leka po antitelu)in vivo( Slike 12-15). LIV-1 konjugati antitelo-lek konjugovani sa vcMMAE su pokazali značajno odlaganje tumora u poređenju sa netretiranim i kontrolnim konjugatima antitelo-lek. Zapažena je najmanje jedna kompletna regresija (CR) u svim studijama korišćenjem LIV-l-vcMMAE pri 3 mg/kg sa brojem životinja koje imaju tumore koji su statički ili su rasli sporo u poređenju sa kontrolama. Pozivajući se na Sliku 12, himerni oblik roditeljskog mišjeg antitela konjugovan sa vcMMAE je rezultirao u potpunoj regresiji kod 3 od 7 miševa. Pozivajući se na Sliku 13, isti himerni ADC je proizveo kompletnu regresiju kod 1 od 8 miševa. Pozivajući se na Sliku 14, humanizovan ADC (HBLB) konjugovan sa vcMMAE (hLIV-14-vcMMAE (4)) proizvodi kompletnu regresiju kod 1 od 8 miševa. Pored toga, cisteinski mutant oblik HBLB antitela, jedan vcMMAE linker leka konjugovan sa svakim teškim lancem na položaju 239, koji proizvodi konjugat sa prosečnom količina leka od 2 linkera leka po antitelu; označen hLIV-14d-vcMMAE(2)) ispoljava sličnu aktivnost kao oblik sa 4 punjenja. Pozivajući se na Sliku 15, humanizovan konjugat antitelo-lek (HBLB) konjugovano sa vcMMAE (hLIV-14-vcMMAE(4)) proizvodi kompletnu regresiju kod 1 od 8 miševa u modelu karcinoma prostate. Nasuprot tome, aktivnost dva napunjena cisteinska mutanta nije toliko izražena u ovom modelu (uporediti hLIV-14-vcMMAE(4) sa hLIV-14d-vcMMAE(2), i hLIV-14-mcMMAF(4) sa hLIV-14d-mcMMAF(2). Ukratko, ove studije pokazuju da LIV-1 ADC može zaustaviti ili odložiti rast kancera koji eksprimiraju LIV-1 uključujući dojke i prostate.
II. Humanizacija BR2-22a
[0145]BR2-22a, ponekad se takođe naziva mAt2 je mišje monoklonsko antitelo izotipa IgGl kapa.
Metodologije:
[0146]Ukoliko nije drugačije naznačeno ispod, postupci opisani za humanizaciju i ispitivanje BR2-14a takođe važe za BR2-22.
Ispitivanja saturacionog vezivanja
[0147]1*IO<5>ćelija koje eksprimiraju antigen (ili MCF7 ćelije koje eksprimiraju humani LIV-1, 293F ćelije, jedna transfektovana ćelijska linija CHO eksprimira humani LIV-1 ili jedna transfektovana CHO ćelijska linija eksprimira cyno LIV-1) su bile alikvotirane po bazenčiću ploče od 96 bazenčića sa v-dnom. AlexaFluor-647 obeleženo mišje BR2-22a je dodato u koncentracijama u opsegu od 0,66 pM do 690 nM i inkubirano na ledu tokom 30 minuta. Ćelije su peletirane i isprane 3X sa PBS/BSA. Ćelije su zatim peletirane i resuspendovane u 125 uL PBS/BSA. Fluorescencija je analizirana protočnom citometrijom, korišćenjem procenta zasićenog fluorescentnog signala za određivanje vezanog procenta i da se zatim izračuna prividna Kd.
Ispitivanja kompetitivnog vezivanja
[0148]1* 10<5>CHO ćelija koje eksprimiraju rekombinantni LIV-1 u PBS-u su alikvotirane u svaki od 96 bazenčića ploča sa v-dnom na ledu. Ćelije su inkubirane tokom 1 sata sa 5 nM AlexaFluor-647 (AF) obeleženim roditeljskim BR2-22a i sa rastućim koncentracijama (od 0,038 nM do 600 nM) neobeleženog humanizovanog BR2-22a antitela u svim kombinacijama humanizovanih lakih lanaca LA-LG i humanizovanih teških lanaca HA-HG. Ćelije su peletirane i isprane 3 puta sa PBS-om. Ćelije su zatim peletirane i resuspendovane u 125 uL PBS/BSA. Fluorescencija je analizirana protočnom citometrijom, korišćenjem procenta zasićenog fluorescentnog signala za određivanje procenta vezanog obeleženog humanizovanog BR2-22a antitela i za naknadnu ekstrapolaciju EC50 uklapanjem podataka u sigmoidalnoj krivi doze-odgovora sa varijabilnom nagibom.
In vivostudija aktivnosti
[0149]Golim (nu/nu) miševima (7-8 životinja po grupi) su implantirane tumorske ćelije uzgajane u kulturi: MCF-7 (NCI) pri 5x 106 u 25% Matrigela, PC3 od ATCC (2,5xIO<6>ćelija u 25% Matrigela), i PC3 od DSMZ (5 x IO<5>u 25% Matrigela). Zain vivorast MCF-7 ćelija, ženke miševa su takođe primile suplementacije estrogena implantacijom peleta sa sporim oslobađanjem estrogenaa (90 dana oslobađanja). Doziranja bilo sa himemim ili humanizovanim LIV-1 ADC ili nevezujućim kontrolnim ADC (3 mg/kg) je započeto kada su tumori dostigli 100 mm<3>(q4d x 4 intraperitonealne injekcije). Zapremine tumora su praćene korišćenjem kalibarskih šestara i životinje su podvrgnute eutanaziji kada je zapremina tumora dostigla -800 mm<3>. Dijagrami srednje zapremine tumora su nastavljeni za svaku grupu dok su jedna ili više životinje bile podvrgnute eutanaziji. Sve procedure na životinjama su izvedene pod protokolom odobrenim od strane Institucional Animal Care and Use Committee u objektu akreditovanom od strane Udruženja za procenu i akreditaciju laboratorija životinjske nege.
Rezime rezultata i diskusija
Saturaciono vezivanje
[0150]BR2-22a pokazuje 94% identičnosti sa BR2-14a u zrelom varijabilnom regionu teškog lanca i 91%) identičnosti u zrelom varijabilnom regionu lakog lanca. KD za mišji Livl od BR2-22a (Tabela 5) je određena za humani LIV-1 izražen kao endogeni protein u ćelijskoj liniji humanog karcinoma dojke, u 293F ćelijama ili kao rekombinantni protein u CHO ćelijskoj liniji. Kd za BR2-22a je takođe određen za Cyno LIV-1 eksprimiran kao rekombinantni protein u CHO ćelijskoj liniji.
Strategija humanizacija
[0151]BR2-22a antitelo je humanizovano korišćenjem VH1-02 JH5 matične linije primalac sekvence za teški lanac i VK2-30 JK4 primalac sekvence za laki lanac. Ove sekvence primaoci su odabrane na osnovu toga da imaju najvišu identičnost sekvence sa zrelim varijabilnim regionom okvira BR2-22A teških i lakih lanaca. U početku je konstruisano pet varijacija teških lanaca. Svaki uključuju tri Kabat CDR regiona iz teškog lanca BR2-22a, lanci se razlikuju da imaju od nula (VA) do 11 (VE) povratnih mutacija. U početku je konstruisano šest varijacija lakih lanaca. Svaki uključuje tri Kabat CDR regiona iz lakog lanca BR2-22a i od nula (LA) do četiri povratnih mutacija (LF). Ove povratne mutacije su izabrane kao rezultat modeliranja BR2-22A antitela da se identifikuju položaji sa potencijalom za direktnu interakciju sa antigenom, utiču na CDR konformaciju ili utiču na međupovršinu između teških i lakih lanaca i na osnovu prethodnog iskustva u humanizovanju BR2-14a zbog visoke identičnosti sekvence između BR2-14a i BR2-22a. U stvari, jedanaest istih položaja u teškom lancu i četiri ista položaja u lakom lancu su razmatrani na povratne mutacije u oba BR2-14a i BR2-22a (L39 nije razmatran u BR2-22a jer je mišji ostatak isti kao humani ostatak). Povratne mutacije prisutne u svakoj varijanti humanizovanog antitela BR2-22a su prikazane ispod u Tabelama 6 i 7.
[0152]Puna sekvenca zrelog varijabilnog regiona svake od varijanti je prikazana na Slikama 16A i 16B.
[0153]Sve permutacije ovih pet teških lanaca i šest lakih lanaca su onda testirane u eseju kompeticije poređenjem sa BR2-22a (videti Sliku 17). Iznenađujuće, s obzirom na iskustva sa BR2-14a antitelom u kojem je poboljšano vezivanje u odnosu na mišje antitelo dobijeno sa samo četiri povratne mutacije i dalje povratne mutacije nisu nužno poboljšale afinitet vezivanja, jedina kombinacija humanizovanih lanaca koja pokazuju približno onaj afinitet vezivanja približno od BR2-22a je bila HELF sa 15 povratnih mutacija. Ostale permutacije su pokazale slabo ili nikakvo značajno vezivanje za LIV-1. The EC50s različitih permutacija su prikazane u Tabeli 8 niže.
[0154]Iako HELF pokazuje zadovoljavajuće vezivanje, antitelo sadrži ukupno 15 povratnih mutacija, broj veći od idealnog u vezi sa potencijalnom imunogenošću. Prema tome, HE i LF lanci su sistematski menjani kako bi se ispitao efekat uklanjanja pojedinačnih povratnih mutacija. Slika 18 prikazuje testirane varijante. LF-1 preko LF-4 se razlikuje od LF svakom nedostaje različita povratna mutacija prisutna u LF. Slično tome, HE-1 preko HE-11 nedostaje jedna od povratnih mutacija prisutna u HE. Slika 19 poredi LF-1 preko LF-4 (svaki uparen sa HE). Slika 19 pokazuje da LF-2 i LF-3 gube značajan afinitet vezivanja u odnosu na LF (označen kao HELF istorijska kontrola na grafikonu), dok LF-1 i LF-4 ne. Zaključuje se da povratne mutacije L36 i L46 značajno doprinose zadržavanju afinitete vezivanja, dok se povratne mutacije na položajima L37 i L45 mogu podeliti bez značajnog efekta na vezivanje. Slika 20 pokazuje slične krive vezivanja za varijante HE. Slika 20 pokazuje daje HE-11 izgubio većinu njegovog vezivanja ukazujući da povratna mutacija na položaju H94 ima najveći uticaj na afinitet vezivanja od testiranih povratnih mutacija. Gubitak povratnih mutacija na položajima H27, H29 i H30 je takođe uzrokovao značajni gubitak afiniteta. Uloga H30 može da se racionalizuje pomoću mišjeg ostatka koji je rezultat somatske mutacije. Gubitak povratne mutacije na položaju H76 je uzrokovao donekle gubitak afiniteta. Druge povratne mutacije na položajima H28, H48, H66, H67, H71 i H93 se mogu podeliti sa malo ili nimalo uticaja na afinitet za vezivanje.
[0155]U svetlu ovih eksperimenata, konstruisani su teški lanci HF i HG kao što je bio laki lanac LG. HF uključene povratne mutacije na H27, H29, H30 i H94 i HG uključene ove mutacije ijedna povratna mutacija na H76. LG sadrži povratne mutacije na L36 i L46. Nekoliko permutacija HF, HG, LE i LF su testirane na kompetitivno vezivanje kao što je prikazano na Slici 21 i svi su pokazali vezivanje unutar faktora tri od onog mišjeg BR2-22a.
[0156]U svetlu ovog eksperimenta, HGLG je izabran za dalje eksperimente kao onaj koji predstavlja najbolju kombinaciju afiniteta vezivanja i najmanjim brojem povratnih mutacija. Ovo antitelo se u daljem tekstu označava kao hLIV22. Afinitet saturacionog vezivanja hLIV22 za humani i cyno LIV-1 eksprimiran iz CHO ćelija je prikazan na Slici 22 u poređenju sa onim od hLIV14. Slika 22 pokazuje da hLIV22 ima oko četiri puta veći afinitet (suprotno od konstante disocijacije) za humani LIV-1 u odnosu na hLIV14. Nadalje, afinitet hLIV22 za humani LIV-1 je isti u okviru eksperimentalne greške kao njegov afinitet za cvnomolgus LIV-1, dok hLIV14 pokazuje dvostruki afinitet za humani LIV-1 kao i za cvnomolgus LIV-1. Afinitet hLIV22 za humani LIV-1 je isti unutar eksperimentalne greške kao onaj od matičnog mišjeg antitela, BR2-22a.
In vitroanti-tumorska aktivnost hLIV22 konjugata antitelo-lek
[0157]Anti-tumorska aktivnost hLIV22 konjugata antitelo-lek (ADC) in vitro je merena korišćenjem testova citotoksičnosti. Prvo, izvršili smo pregled LIV-1 ekspresije u različitim ćelijskim linijama kvantitativnom FACS analizom. Ćelijska linija kancera dojke MCF-7 od ATCC je imala najviši nivo LIV-1 mesta vezivanja/ćeliji, u poređenju sa MCF-7 ćelijskom linijom iz drugih izvora (podaci nisu prikazani). Koristili smo ovu ćelijsku liniju za in vitro ispitivanja. Uočili smo da su različiti hLIV22 konjugati antitelo lek (konjugovano sa vcMMAE (označen kao 1006) ili mcMMAF (označen kao 1269)
(oba mala molekula su opisana u US 2005-0238649)) bili visoko efikasni u ubijanju MCF-7 ćelija mereno pomoćuin vitrocitotoksičnog eseja. Slike 23 i 24 porede hLIV22-konjugovan sa 1006 ili 1269 sa nevezujućm kontrolnim antitelom konjugovanim sa 1006 ili 1269.
In vivoanti-tumorska aktivnost LIV-1 konjugata antitelo-lek (ADC)
[0158]Korišćenjem modela kancera prostate (PC-3) i kancera dojke (MCF-7) kao što je prikazano na Slikama 25 i 26, utvrdili smo anti-tumorsku aktivnost hLIV22 ADCs (sa prošekom od 4 leka po antitelu)in vivo.hLIV22 ADCs konjugovana sa vcMMAE su pokazala značajno odlaganje tumora u poređenju sa netretiranim i kontrolnim ADCs. Bilo je više kompletnih regresija uočenih u studiji MCF-7 korišćenjem hLIV22-vcMMAE od 3 mg/kg. Dodatno, u svim studijama bio je broj životinja koji su imali tumore koji su bili statični ili su rasli sporo u poređenju sa kontrolama. Ove studije pokazuju da hLIV22 ADC može zaustaviti ili odložiti rast kancera koji eksprimiraju LIV-1, uključujući dojke i prostate. Slika 27 upoređuje aktivnosti hLIV22 i hLIV14 ADCs u MCF-7 modelu. Iako su oba antitela bila efikasna, hLIV22 je bio malo efikasniji. hLIV22 ADCs su takođe bila testirana na modelu raka grlića materice. HeLA model ćelijskog ksenografta je korišćen za analizu. Nakon što tumori izrastu do odgovarajuće veličine, hLIV22 konjugovano sa vcMMAE je primenjivano na životinjama pri 3 mg/kg i 1 mg/kg. Kontrolni konjugat antitela je primenjivan pri dozi od 3 mg/kg. Potpuna i delimična regresija zabeležena kod životinja koje su primile 3 mg/kg konjugata hLIV22 vc MMAE. (Podaci nisu prikazani). Stoga, LIV-1 antitela i konjugati antitelo-lek mogu biti korišćeni za lečenje kancera grlića materice koji eksprimiraju LIV-1.
III. Lečenje rakakožekorišćenjem anti-LIV-1 antitela
Ekspresija LIV-1 proteina na uzorcima melanoma tumora
[0159]Uzorci melanoma od pacijenata su procenjeni na LIV-1 ekspresiju, korišćenjem IHC bojenja. FFPE pločice su deparafinisane korišćenjem Bond™ Dewax rastvora (Leica, kat # AR9222) na 72°C. Istraživanje antigena je izvedeno korišćenjem EDTA baziranog Bond™ Epitope Retrieval Solution 2 (Leica, kat # AR9640) tokom 20 min na 100°C . Za IHC bojenje koristili smo komplet za detekciju na bazi alkalne fosfataze Bond™ Polvmer Refine Red Detection Kit (Leica, kat # DS9390). Pločice su inkubirane sa mišjim monoklonskim primarnim antitelima protiv LIV-1 (BR2-14a) tokom 45 min pri 1 ug/ml sa preliminarnim 30 min blokom proteina (DAKO cat # X0909). Mišji IgG (Sigma, kat # M5284) je korišćen kao negativna kontrola. Nakon razvoja hromogena, preseci su kontra bojeni sa hematoksilinom i pokriveni. Pločice su ocenjene i bodovane od strane patologa.
[0160]Rezultati su prikazani na Slici 28. Sedamdeset dva procenta od testiranih melanomskih uzoraka pacijenata (21/29) je bilo pozitivno na LIV-1 ekspresiju. Ovo ukazuje da LIV-1 inhibitori, na primer, anti-LIV-1 antitela, mogu biti korišćena za lečenje kancera melanoma.
In vivoanti-melanoma aktivnost LIV-1 konjugata antitelo-lek (ADC)
[0161]Golim (nu/nu) miševima (7-8 životinja/grupi) je implantirano 10 x IO<6>SK-MEL-5 ćelija (melanoma tumora izvedena ćelijska linija) uzgajanih u kulturi. Tumori su ostavljeni da rastuin vivodok ne budu 100 mm<3>, mereno pomoću kalibarskog šestara. Humanizovana LIV-1 ADCs, npr., hLIV14 ili hLIV22, se primenjuju od 3 mg/kg. Konjugati leka su, npr. vcMMAE ili mcMMAF. Kontrolni ADCs su takođe primenjivani na kontrolne životinje pri 3 mg/kg. ADC su dati kao q4d * 4 intraperitonealne injekcije. Zapremine tumora se prate pomoću kalibarskog šestara i životinje su podvrgnute eutanaziji kada zapremina tumora dostigne~800 mm<3>. Primena hLIV14 antitelo-lek konjugata (ADC) ili hLIV22 antitelo-lek konjugata (ADC) u velikoj meri smanjuje rast tumora kod životinja u odnosu na one životinje koje su primile kontrolne konjugate antitelo-lek.

Claims (12)

1. Humanizovano antitelo za Liv-1, naznačeno timo što zreli varijabilni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR:52 ili 53 i zreli varijabilni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR:59 ili 60.
2. Humanizovano antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde zreli varijabilni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR:53 i zreli varijabilni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu SEK ID BR:60.
3. Humanizovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, gde je zreli varijabilni region teškog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca, opciono pri čemu je konstantni region teškog lanca mutant oblik prirodnog humanog konstantnog regiona koji ima smanjeno vezivanje za Fc gama receptor u odnosu na prirodni humani konstantni region.
4. Humanizovano antitelo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je konstantni region teškog lanca IgGl izotipa.
5. Humanizovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 3 ili 4, pri čemu konstantni region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja uključuje SEK ID BR:44 ili SEK ID BR:46 i konstantni region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja uključuje SEK ID BR: 42.
6. Humanizovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, gde je antitelo konjugovano sa citotoksičnim ili citostatičkim agensom.
7. Humanizovano antitelo prema patentnom zahtevu 6, gde je agens auristatin.
8. Humanizovano antitelo prema patentnom zahtevu 6, gde je agens MMAE.
9. Humanizovano antitelo prema patentnom zahtevu 6, gde je agens MMAF.
10. Nukleinska kiselina ili nukleinske kiseline koje kodiraju zreli varijabilni region teškog lanca i zreli varijabilni region lakog lanca kao što je definisano bilo kojim od patentnih zahteva 1-6.
11. Humanizovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za upotrebu u lečenju pacijenta koji ima ili je pod rizikom od raka, opciono gde je kancer rak dojke, rak prostate, rak grlića materice ili melanom.
12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži humanizovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9.
RS20170310A 2010-12-06 2011-12-06 Humanizovana antitela za liv-1 i upotreba istih u lečenju kancera RS55843B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42029110P 2010-12-06 2010-12-06
US201161446990P 2011-02-25 2011-02-25
EP11847198.6A EP2648752B1 (en) 2010-12-06 2011-12-06 Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer
PCT/US2011/063612 WO2012078688A2 (en) 2010-12-06 2011-12-06 Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55843B1 true RS55843B1 (sr) 2017-08-31

Family

ID=46207694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170310A RS55843B1 (sr) 2010-12-06 2011-12-06 Humanizovana antitela za liv-1 i upotreba istih u lečenju kancera

Country Status (25)

Country Link
US (6) USRE48959E1 (sr)
EP (4) EP2648752B1 (sr)
JP (6) JP6105481B2 (sr)
KR (5) KR20220011811A (sr)
CN (1) CN103533957B (sr)
AU (4) AU2011338480B8 (sr)
BR (2) BR112013013781A2 (sr)
CA (2) CA2819038C (sr)
CY (3) CY1118874T1 (sr)
DK (3) DK3461847T3 (sr)
ES (3) ES2719548T3 (sr)
HR (1) HRP20170567T1 (sr)
HU (3) HUE052806T2 (sr)
IL (4) IL299837A (sr)
LT (1) LT2648752T (sr)
MX (3) MX351027B (sr)
NZ (1) NZ611468A (sr)
PL (3) PL3156420T3 (sr)
PT (3) PT3156420T (sr)
RS (1) RS55843B1 (sr)
RU (1) RU2608646C2 (sr)
SG (3) SG10201510041QA (sr)
SI (3) SI2648752T1 (sr)
WO (1) WO2012078688A2 (sr)
ZA (1) ZA201303803B (sr)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2648752B1 (en) 2010-12-06 2017-02-15 Seattle Genetics, Inc. Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer
EP3722320A3 (en) 2012-10-25 2020-12-30 Bioverativ USA Inc. Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
DK2914291T3 (da) 2012-11-02 2022-05-16 Bioverativ Usa Inc Anti-komplement-c1s-antistoffer og anvendelser deraf
WO2014089177A2 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines
HK1210713A1 (en) 2012-12-27 2016-05-06 Sanofi Anti-lamp1 antibodies and antibody drug conjugates, and uses thereof
CA2919076C (en) * 2013-07-31 2024-01-30 Amgen Inc. Stabilization of fc-containing polypeptides
NZ758049A (en) 2013-10-15 2024-03-22 Seagen Inc Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
CA2937753A1 (en) 2014-02-17 2015-08-20 Seattle Genetics, Inc. Hydrophilic antibody-drug conjugates
CA2981321A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 True North Therapeutics, Inc. Humanized anti-c1s antibodies and methods of use thereof
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
KR20180090290A (ko) 2015-12-04 2018-08-10 시애틀 지네틱스, 인크. 사차화 튜불리신 화합물들의 컨쥬게이트들
CN108778329B (zh) 2016-02-17 2022-09-16 西雅图基因公司 Bcma抗体和其用以治疗癌症和免疫病症的用途
MX2018010847A (es) * 2016-03-15 2019-07-04 Seattle Genetics Inc Terapia combinada mediante el uso de un conjugado de anticuerpo-farmaco de liv1 (liv1-adc) y agente quimioterapeutico.
CN109843919A (zh) 2016-03-25 2019-06-04 西雅图基因公司 用于制备聚乙二醇化的药物-接头及其中间体的方法
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
TWI851531B (zh) 2016-08-09 2024-08-11 美商思進公司 具有改善之生理化學性質之具自我穩定連接子之藥物結合物
EA201891851A1 (ru) * 2016-09-16 2019-04-30 Сиэтл Дженетикс, Инк. Антитела против bcma и их применение для лечения злокачественных новообразований и иммунологических нарушений
CN110300520B (zh) 2016-10-12 2022-10-04 美国比奥维拉迪维股份有限公司 抗C1s抗体及其使用方法
CA3039589A1 (en) 2016-10-18 2018-04-26 Seattle Genetics, Inc. Targeted delivery of nicotinamide adenine dinucleotide salvage pathway inhibitors
SG10202110182PA (en) 2017-03-15 2021-10-28 Silverback Therapeutics Inc Benzazepine compounds, conjugates, and uses thereof
KR102648564B1 (ko) 2017-03-24 2024-03-19 씨젠 인크. 글루쿠로니드 약물-링커의 제조 공정 및 그 중간물
WO2018191865A1 (en) 2017-04-18 2018-10-25 3M Innovative Properties Company Air filter media with post-pleat-deposited sorbent particles
CA3060206A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Seattle Genetics, Inc. Quaternized nicotinamide adenine dinucleotide salvage pathway inhibitor conjugates
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
WO2019046859A1 (en) * 2017-09-02 2019-03-07 Abbvie Inc. ANTI-EGFR-DRUG ANTIBODY (ADC) CONJUGATES AND USES THEREOF
WO2019046858A1 (en) * 2017-09-02 2019-03-07 Abbvie Inc. ANTI-EGFR-DRUG ANTIBODY (ADC) CONJUGATES AND USES THEREOF
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
SG11202004751TA (en) * 2017-12-01 2020-06-29 Seattle Genetics Inc Humanized anti-liv1 antibodies for the treatment of breast cancer
SG11202007540SA (en) 2018-02-20 2020-09-29 Seattle Genetics Inc Hydrophobic auristatin f compounds and conjugates thereof
AU2019337654A1 (en) 2018-09-12 2021-04-08 Silverback Therapeutics, Inc. Substituted benzazepine compounds, conjugates, and uses thereof
WO2020056192A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody conjugates of toll-like receptor agonists
MX2021002764A (es) 2018-09-12 2021-05-12 Silverback Therapeutics Inc Composiciones para el tratamiento de enfermedades con conjugados inmunoestimuladores.
WO2020056194A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Silverback Therapeutics, Inc. Benzazepine compounds, conjugates, and uses thereof
WO2020095249A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Crispr Therapeutics Ag Anti-liv1 immune cell cancer therapy
TW202112801A (zh) 2019-06-05 2021-04-01 美商西雅圖遺傳學公司 純化遮蔽抗體之方法
TW202112354A (zh) 2019-06-05 2021-04-01 美商西雅圖遺傳學公司 遮蔽抗體調配物
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
GB201908208D0 (en) * 2019-06-10 2019-07-24 Univ College Cardiff Consultants Ltd An anti-mitotic agent
AU2020318975A1 (en) * 2019-07-22 2022-03-17 Seagen Inc. Humanized anti-LIV1 antibodies for the treatment of cancer
CN114667134A (zh) 2019-08-15 2022-06-24 希沃尔拜克治疗公司 苯并氮杂䓬缀合物的制剂及其用途
CA3151322A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Silverback Therapeutics, Inc. Combination therapy with immune stimulatory conjugates
KR20220114002A (ko) 2019-12-09 2022-08-17 씨젠 인크. Liv1-adc 및 pd-1 길항제를 사용하는 병용 요법
TWI877278B (zh) 2019-12-30 2025-03-21 美商思進公司 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法
JP7735291B2 (ja) 2020-02-21 2025-09-08 エーアールエス ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッド ネクチン－４抗体コンジュゲートおよびその使用
JP2023532304A (ja) 2020-07-01 2023-07-27 エーアールエス ファーマシューティカルズ オペレーションズ，インク． 抗ａｓｇｒ１抗体コンジュゲートおよびその使用
TW202229346A (zh) * 2020-09-28 2022-08-01 美商西根公司 用於治療癌症之人化抗ｌｉｖ１抗體
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
WO2022182415A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof
BR112023018676A2 (pt) 2021-03-18 2023-10-10 Seagen Inc Conjugado anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, métodos de tratamento de uma doença ou condição e de um câncer, e, composição de conjugado ligante-fármaco
WO2022236134A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Surface Oncology, Inc. Anti-il-27 antibodies and uses thereof
US20240352080A1 (en) 2021-07-14 2024-10-24 Seagen Inc. Antibody Masking Domains
EP4405387A1 (en) 2021-09-24 2024-07-31 Seagen Inc. Improved antibody masking domains
WO2023111913A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Crispr Therapeutics Ag Engineered anti-liv1 cell with regnase-1 and/or tgfbrii disruption
EP4523704A1 (en) 2022-05-12 2025-03-19 Hainan Simcere Zaiming Pharmaceutical Co., Ltd. Camptothecin derivative and ligand-drug conjugate
WO2024109944A1 (zh) * 2022-11-25 2024-05-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗liv-1抗体、其药物偶联物及其医药用途
IL322565A (en) 2023-02-07 2025-10-01 Lanova Medicines Ltd Antibodies targeting liv-1 and their uses
AU2024235054A1 (en) * 2023-03-15 2025-10-02 BioRay Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-liv-1 antibody and anti-liv-1 antibody-drug conjugate, and pharmaceutical use thereof
WO2025021118A1 (zh) * 2023-07-25 2025-01-30 海南先声再明医药股份有限公司 配体-药物偶联物及其偶联连接子
WO2025146128A1 (zh) * 2024-01-05 2025-07-10 海南先声再明医药股份有限公司 抗liv-1的抗体及其用途
WO2025146137A1 (zh) * 2024-01-05 2025-07-10 海南先声再明医药股份有限公司 抗liv-1抗体药物偶联物及其用途
CN120040587B (zh) * 2025-04-27 2025-08-08 上海宏成药业有限公司 抗liv-1抗体或其抗原结合片段及其用途

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Acylhydrazone derivatives of anthracycline and methods for their preparation
AU631802B2 (en) 1988-06-14 1992-12-10 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69230142T2 (de) 1991-05-15 2000-03-09 Cambridge Antibody Technology Ltd. Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
DE69228300T2 (de) 1991-08-22 1999-09-23 Becton Dickinson And Co., Franklin Lakes Methoden und zusammensetzungen zur krebstherapie und zur vorhersagbarkeit der reaktionen auf diese behandlung
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2156149T3 (es) 1992-12-04 2001-06-16 Medical Res Council Proteinas de union multivalente y multiespecificas, su fabricacion y su uso.
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5914349A (en) 1994-01-10 1999-06-22 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives
CA2132500A1 (en) 1994-09-20 1996-03-21 David Lockwood Manning Methods for predicting the behaviour of breast tumours
DK0871490T3 (da) 1995-12-22 2003-07-07 Bristol Myers Squibb Co Forgrenede hydrazonlinkere
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US6130237A (en) 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
JP4614472B2 (ja) 1996-10-31 2011-01-19 アボット・ラボラトリーズ 乳房の疾患の検出に有用な試薬および方法
US6066778A (en) 1996-11-06 2000-05-23 The Regents Of The University Of Michigan Transgenic mice expressing APC resistant factor V
WO1998034118A1 (en) 1997-01-30 1998-08-06 Yale University Diagnostic methods and compositions based on the distribution of rad51
EP1027444A1 (en) 1997-10-31 2000-08-16 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
JP2001523472A (ja) 1997-11-18 2001-11-27 アボット・ラボラトリーズ 乳房の疾患の検出に有用な試薬および方法
WO1999033869A2 (en) 1997-12-24 1999-07-08 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of breast cancer and methods for their use
CA2347906A1 (en) 1998-08-04 2000-02-17 Diadexus, Inc. A novel method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating breast cancer
ATE386804T1 (de) 1998-10-15 2008-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Gene mit veränderter expression in metastatischen brust- oder dickdarm- krebszellen
NZ513144A (en) 1999-02-05 2003-05-30 Samsung Electronics Co Ltd Image texture retrieving method and apparatus thereof
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
US6762020B1 (en) 1999-03-15 2004-07-13 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosing breast cancer
US20040141983A1 (en) 1999-03-15 2004-07-22 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen LIV-1 and uses thereof
MXPA02007190A (es) * 2000-01-25 2003-02-12 Genentech Inc Proteina relacionada a liv-1, polinucleotidos que codifican para la misma y uso de la misma para el tratamiento de cancer.
WO2001096372A2 (en) 2000-06-13 2001-12-20 University College Cardiff Consultants Ltd Zinc transporters proteins and their use in medicinal preparations
US6964849B2 (en) 2001-01-11 2005-11-15 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030068636A1 (en) 2001-06-21 2003-04-10 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast and ovarian cancer
WO2003004989A2 (en) 2001-06-21 2003-01-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
CA2478683C (en) 2002-03-08 2016-01-26 Protein Design Labs, Inc. Antibodies against cancer antigen tmeff2 and uses thereof
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
KR20050102627A (ko) * 2003-01-27 2005-10-26 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｓｆ9 및 ｌｉｖ-1을 사용한 암 치료용 조성물 및치료방법
WO2004067564A2 (en) 2003-01-29 2004-08-12 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen liv-1 and uses thereof
KR20050010267A (ko) 2003-07-18 2005-01-27 삼성전자주식회사 식각장치
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
US7371381B2 (en) 2003-12-12 2008-05-13 Amgen Inc. Anti-galanin antibodies and uses thereof
US7501121B2 (en) 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
MX2007000998A (es) 2004-07-30 2007-07-11 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos peptido beta-amiloide y procedimientos que usan los mismos.
US20060222653A1 (en) * 2004-11-12 2006-10-05 Xencor, Inc. Antibodies operably linked to selected chemoattractants
WO2006124269A2 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
EP1928912A4 (en) 2005-09-07 2010-02-24 Medimmune Inc EPH ANTI-RECEPTOR ANTIBODIES CONJUGATED TO TOXINS
TW200813231A (en) * 2006-04-13 2008-03-16 Novartis Vaccines & Diagnostic Methods of treating, diagnosing or detecting cancer
PT2099823E (pt) * 2006-12-01 2014-12-22 Seattle Genetics Inc Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações
AR066240A1 (es) * 2007-04-23 2009-08-05 Wyeth Corp Metodos y composiciones para tratar y monitorear el tratamiento de trastornos asociados con il-13
US20090148905A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 Claire Ashman Antigen-binding constructs
WO2009135181A2 (en) 2008-05-02 2009-11-05 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
WO2010003773A1 (en) 2008-06-16 2010-01-14 Siemens Medical Solutions Diagnostics Gmbh Algorithms for outcome prediction in patients with node-positive chemotherapy-treated breast cancer
WO2010045234A1 (en) 2008-10-14 2010-04-22 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods of optimizing treatment of estrogen-receptor positive breast cancers
WO2010069858A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical composition
US8642270B2 (en) 2009-02-09 2014-02-04 Vm Institute Of Research Prognostic biomarkers to predict overall survival and metastatic disease in patients with triple negative breast cancer
US20110165566A1 (en) 2009-07-09 2011-07-07 Wittliff James L Methods of optimizing treatment of breast cancer
JP5996429B2 (ja) 2009-09-03 2016-09-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 関節リウマチの治療、診断及びモニターするための方法
EP2648752B1 (en) * 2010-12-06 2017-02-15 Seattle Genetics, Inc. Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer
WO2012125712A2 (en) 2011-03-14 2012-09-20 Respira Health, Llc Lung tumor classifier for current and former smokers
MX338711B (es) 2012-10-12 2016-04-28 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas.
MX2018010847A (es) 2016-03-15 2019-07-04 Seattle Genetics Inc Terapia combinada mediante el uso de un conjugado de anticuerpo-farmaco de liv1 (liv1-adc) y agente quimioterapeutico.
SG11202004751TA (en) 2017-12-01 2020-06-29 Seattle Genetics Inc Humanized anti-liv1 antibodies for the treatment of breast cancer
WO2020095249A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Crispr Therapeutics Ag Anti-liv1 immune cell cancer therapy
GB201908208D0 (en) 2019-06-10 2019-07-24 Univ College Cardiff Consultants Ltd An anti-mitotic agent

Also Published As

Publication number Publication date
JP7166384B2 (ja) 2022-11-07
CA2819038C (en) 2023-10-17
AU2011338480A1 (en) 2013-06-13
KR20130135884A (ko) 2013-12-11
AU2019202530B2 (en) 2021-04-01
CY1123883T1 (el) 2022-03-24
AU2011338480B8 (en) 2017-03-23
PT3461847T (pt) 2020-12-24
AU2019202530A1 (en) 2019-05-02
US20200165335A1 (en) 2020-05-28
JP2014506120A (ja) 2014-03-13
US20240247059A1 (en) 2024-07-25
AU2021204473A1 (en) 2021-07-29
ES2719548T3 (es) 2019-07-11
MX2020010639A (es) 2020-10-28
ZA201303803B (en) 2014-07-30
EP2648752A2 (en) 2013-10-16
KR20220011811A (ko) 2022-01-28
JP6105481B2 (ja) 2017-03-29
EP2648752B1 (en) 2017-02-15
CA3211246A1 (en) 2012-06-14
PT3156420T (pt) 2019-05-27
ES2842895T3 (es) 2021-07-15
IL299837A (en) 2023-03-01
JP2017149717A (ja) 2017-08-31
HUE052806T2 (hu) 2021-05-28
DK3461847T3 (da) 2020-12-14
IL226754B (en) 2018-10-31
EP3156420A1 (en) 2017-04-19
AU2011338480A8 (en) 2017-03-23
KR102198189B1 (ko) 2021-01-05
KR20190076068A (ko) 2019-07-01
EP3461847B1 (en) 2020-09-23
WO2012078688A3 (en) 2012-08-23
DK2648752T3 (en) 2017-03-27
BR122021020513B1 (pt) 2022-10-25
AU2011338480B2 (en) 2017-03-16
JP2019073515A (ja) 2019-05-16
AU2017203851A1 (en) 2017-06-22
MX379481B (es) 2025-03-11
CY1118874T1 (el) 2018-01-10
SI3156420T1 (sl) 2019-05-31
US20130259860A1 (en) 2013-10-03
PT2648752T (pt) 2017-03-28
USRE48959E1 (en) 2022-03-08
HRP20170567T1 (hr) 2017-06-16
US9228026B2 (en) 2016-01-05
HUE043355T2 (hu) 2019-08-28
NZ611468A (en) 2015-06-26
JP2021106599A (ja) 2021-07-29
JP2023011709A (ja) 2023-01-24
IL273607A (en) 2020-05-31
HUE031726T2 (en) 2017-07-28
EP3786185A1 (en) 2021-03-03
US20160185858A1 (en) 2016-06-30
CY1121546T1 (el) 2020-05-29
WO2012078688A2 (en) 2012-06-14
SG190938A1 (en) 2013-07-31
KR101993921B1 (ko) 2019-06-28
KR20230057485A (ko) 2023-04-28
PL3461847T3 (pl) 2021-07-05
JP2024178209A (ja) 2024-12-24
EP3461847A1 (en) 2019-04-03
AU2021204473B2 (en) 2024-07-18
IL273607B2 (en) 2023-06-01
AU2017203851B2 (en) 2019-01-31
PL2648752T3 (pl) 2017-07-31
SG10201510041QA (en) 2016-01-28
KR20200145867A (ko) 2020-12-30
RU2608646C2 (ru) 2017-01-23
BR112013013781A2 (pt) 2016-09-13
LT2648752T (lt) 2017-04-10
CN103533957A (zh) 2014-01-22
DK3156420T3 (en) 2019-04-29
PL3156420T3 (pl) 2019-08-30
MX351027B (es) 2017-09-28
US9783608B2 (en) 2017-10-10
US20180079810A1 (en) 2018-03-22
SI2648752T1 (sl) 2017-06-30
EP3156420B1 (en) 2019-02-20
JP6453924B2 (ja) 2019-01-16
MX2013006365A (es) 2013-08-15
ES2620264T3 (es) 2017-06-28
JP6869218B2 (ja) 2021-05-12
EP2648752A4 (en) 2015-05-20
CA2819038A1 (en) 2012-06-14
EP3461847A8 (en) 2021-04-14
SI3461847T1 (sl) 2021-03-31
IL261900A (en) 2018-10-31
CN103533957B (zh) 2016-06-22
SG10201912646UA (en) 2020-02-27
RU2013130609A (ru) 2015-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240247059A1 (en) Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer
TWI591176B (zh) 抗ｌｉｖ－１之人化抗體類及彼等於治療癌症上之用途
HK40049211A (en) Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer
HK40006603B (en) Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer
HK40006603A (en) Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer
HK1190326B (en) Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer
HK1190326A (en) Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer