RS56040B1 - Antigenski polipeptidi trihinele i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu novih antigena indetifikovanih u Trichinella parazitu, u kontekstu dijagnostikovanja i prevencije trihinoze.

[0002] Trihinoza je zoonoza povezana sa konzumiranjem mesa inficiranog sa Trichinella parazitom (MURRELL et al., Vet Parasitol, 93, 293-307, 2000).

[0003] Ova nematoda, klase Adenophorea, pripada porodici Trichinellidae koja obuhvata 8 vrsta i 3 genotipa koji su povezani u 2 filogenetski distinktivne grupe: sa jedne strane, enkapsulirane trihinele (T. spiralis; T. nativa; T. britovi; T. murrelli; T. nelsoni) koje napadajau sisare, i sa druge strane neenkapsulirane trihinele (T. pseudospiralis; T. papuae; T. zimbabwensis) koje napadaju sisare, ptice i reptile (GASSER et al., Electrophoresis, 25, 3357-64, 2004). Sve ove vrste mogu za napadnu čoveka.

[0004] Biološki ciklus parazita je auto-heteroksen: u potpunosti se odvija u istom domaćinu, koji je jednovremeno i domaćin posrednik i krajnji domaćin (BOIREAU et al., Revue française des laboratoires, 71-89, 2002). Prelazak zaraznih larvi iz jednog domaćina u druge neophodno je kako bi se izveo novi ciklus. Taj prelazak odvija putem varenja sirovog mesa ili blago skuvanog mesa koje je kontaminirano larvama parazita. Tokom varenja, pomenute larve se oslobađaju, i ulaze u crevni epitelijum, gde će se tranformisati u seksualno odrasle jedinke (Ad) crva. Oplođene ženke naknadno izbacuju novorođene L1 (NRL1) larve koje stižu do prugastih mišića putem limfne cirkulacije i krvotoka. Ove NRL1 larve prodiru u mišićne ćelije (faza razvijanja zaraze L1M: mišićna L1 larva) od kojih obrazuju ćelije za odgoj i razvoj okružene zaštitnom kolagenskom kapsulom koja je debela u slučaju enkapsulirane trihinele, a veoma tanka u slučaju neenkapsulirane trihinele.

[0005] Iako je trihinoza ne pokazuje simptome kod životinja, ljudska zaraza ogleda se, tokom intestinalne faze, dijarejom povezanom sa mučninom, povraćanjem i jakim abdominalnim bolom, dok su simptomi povezani sa fazom invazije mišića okarakterisani kombinacijom groznice, facijalnog edema i mijalgije (CAPO & DESPOMMIER, Clin Microbiol Rev, 9, 47-54, 1996). Očne, plućne, gastrointenstinalne, srčane i neurološke zaraze takođe se mogu dodati kliničkoj slici trihinoze, čija progresija može biti smrtonosna. Hronična priroda zaraze, koja je obeležena upornim bolom u mišićima pacijenata, povezana je sa preživljavanjem parazita u ćelijama za odgoj i razvoj.

[0006] Specifično tretiranje humane trihinoze antelminticima je znatno efektivnije ukoliko se dijagnoza zaraze uradi rano čime se omogućava aktivnost protiv svih parazitskih faza, a naročito pre obrazovanja zaštitne kolagenske kapsule oko L1M larvi (FOURESTIE et al., Parasitol Res, 75, 36-41, 1988).

[0007] Epidemiološki podaci pokazuju geografsku distribuciju parazita u svim delovima sveta, povezana sa metodom prenošenja koja uključuje mnoge vrste u divljoj fauni koja takođe održava ciklus domaće zaraze koja je uglavnom prisutna kod svinja (DUPOUY-CAMET, Vet Parasitol, 93, 191-200, 2000).

[0008] Epidemija humane trihinoze, koja se pojavljuje ili vraća iz zoonoze, predstavlja stvaran zdravstveni problem širom sveta zahvaljujući dijetetskim navikama i kontroli higijene koje nisu uvek efektivne (MURRELL & POZIO, Int J Parasitol, 30, 1339-49, 2000). Ove epidemije uglavnom uključuju meso svinje i divlje svinje, ali i konjsko meso (BOIREAU et al., Vet Parasitol, 93, 309-20, 2000).

[0009] Prema tome, sprečavanje ljudske zaraze uključuje potpuno kuvanje mesa i poboljšanje uslova uzgoja i nege i/ili uslova za kontrolisanje životinjske trihinoze (svinja, konj, divlja svinja i druge vrste divljih životinja osetljive na Trichinella) (BOIREAU et al., Revue française des laboratoires, 71-89, 2002).

[0010] Skrining tehnike za trihinozu mogu se podeliti u dve kategorije: 1) direktna detekcija L1M larvi, nakon veštačkog varenja mišićnih uzoraka, i 2) indirektna detekcija raznim imunološkim postupcima, radi detektovanja antitela usmerenih protiv Trichinella antigena.

[0011] Svaka od faza razvoja parazita: Ad, NRL1, i L1M, odgovara specifičnom antigenskom profilu.

[0012] Antigenski preparati izvedeni iz faze L1M larvi, trenutno se primenjuju za imunodijagnozu. Razlog tome je što su antigenske frakcije dve rane faze Ad i NRL1 teške za prečišćavanje, i što nije bilo moguće identifikovati imunodominantne antigene povezane sa jednom i/ili drugom od ove dve faze sve do nedavno (LIU et al., 1-13,2007).

[0013] Principijelno, koriste se ili preparati ukupnog rastvorljivog antigena dobijenog lizijom larvi, ili, uobičajenije, antigeni izlučivanja/lučenja (E/S antigeni).

[0014] E/S antigeni se proizvode smeštanjem L1M larvi u uslovima za preživljavanje u medijum kulture; oni potiču iz određenog organa, koji se naziva stihosoma, koji se sastoji od oko pedeset diskoidnih ćelija, stihocita. Stihociti sadrže granule, čiji se sadržaj izbacuje kanalikulusom u lumen parazitskog egzofagusa.

Ovaj sadržaj, koji je veoma visoko antigeničan, čini deo E/S antigena. Ovi antigeni obrazuju mešavinu kompleksa proteina, koji su sadržani u određenoj grupi glikoproteina (koji se zovu TSL-1 antigeni) koji nose specifičan ugljeno hidratni molekul, poznat samo u Trichinella i prisutan u svim vrstama ovog parazita, beta-tiveloza.

[0015] Preparati E/S antigena koji su trenutno u upotrebi kao referenca u smislu imunodijagnostikovanja trihinoze, dobijaju se iz medijuma kulture L1M larvi iz T. spiralis. Nakon uzgajanja od 18 do 20 sati, medijum se izoluje filtracijom, a zatim koncetrovanjem (GAMBLE et al., Vet Parasitol, 13, 349-61, 1983; GAMBLE et al., Vet Parasitol, 30, 131-7, 1988).

[0016] Glavni nedostatak preparata ukupnog rastvorljivog antigena leži u manjku njihove specifičnosti. Unakrsne reakcije antigena sa drugim parazitima često su uočene. E/S antigeni omogućavaju dobijanje bolje specifičnosti. Međutim, u oba slučaja, teško je proizvesti standardizovane serije antigena u velikim količinama.

[0017] Još jedan problem koji se javlja u kontekstu serološke dijagnoze Trichinella je postojanje «slepog prozora» detekcije koji odgovara ranim fazama zaraze, a koja se ogleda lažno-negativnim serološkim rezultatima. Ovaj slepi prozor može trajati od 3 do 8 nedelja, u zavisnosti od inicijalne infektivne doze. Pored toga, kod konja, primećeno je postepeno nestajanje antitela 25 nedelja nakon zaraze.

[0018] Tokom prethodnih ispitivanja, tim pronalazača identifikovao je dva imunodominantna antigena očuvana unutar Trichinella genusa, a koja su specifična za pomenuti genus. Ovi antigeni opisani su u PCT prijavi WO/2007/090960. Jedan od ovih antigena, koji se zove NBL1 antigen, eksprimiran je specifično u NRL1 fazi, dok je za drugi, koji se zove 411 antigen, primećeno da je zajednički za nekoliko faza razvoja Trichinella.

[0019] Serološki dijagnosatički testovi tipa ELISA, razvijeni su na bazi ovih antigena proizvedeni u obliku prečišćenih rekombinantnih proteina. Ovi testovi omogućavaju veoma ranu serološku detekciju specifičnih anti-Trichinella antitela. Poređenje sa referentnim ELISA testom, primenom E/S antigena (ELISA E/S test) pokazalo se da ELISA testovi koji koriste NBL1 i 411 antigene mogu detektovati prisustvo specifičnih anti-Trichinella antitela respektivno 5 do 45 dana ranije i 5 do 20 dana ranije u odnosu na ELISA E/S test. Međutim, humoralni odgovor koji cilja NBL1 antigen zatim ima tedenciju da je umanji (na oko 8 nedelja nakon zaraze), a 411 antigen ima nedostatak koji se ogleda u tome što je manje osetljiiv na zarazu u odnosu na ELISA E/S test za detekciju zaraze sa Trichinella vrstama koje se razlikuju od T. nativa.

[0020] Pronalazači su identifikovali dva nova imunodominantna antigena Trichinella, koja se mogu primeniti za razvoj novih seroloških dijagnostičkih testova, ili za poboljšanje nivoa perfomansi postojećih testova.

[0021] Prvi od ovih antigena u nastavku biće označen sa « L20h-Ts3 ». Sekvenca cDNK klona koji kodira ovaj antigen i izdvojena polipeptidna sekvenca prikazani su na FIG.1A, a takođe su respektivno reprodukovane u priloženoj listi sekvenci pod brojem SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. Polipeptid SEQ ID NO: 2 ima veliku identičnost (91%) sa SML-3 proteinom (GenBank ACJ06741) nedavno identifikovan među proteinima verovatno izlučen od strane T. spiralis larvi u mišićnoj fazi, i koji može imati ulogu u obrazovanju ćelije za odgoj i razvoj (GUILIANO et al., Int J Parasitol, 39, 515-24, 2009); međutim, antigenske karakteristike SML-3 proteina do sada nisu ispitane.

[0022] Drugi antigen u nastavku biće označen sa « L20h-Ts1 ». Sekvenca cDNK klona koji kodira ovaj antigen i izdvojena polipeptidna sekvenca prikazani su na FIG.1B, a takođe su respektivno reprodukovane u priloženoj listi sekvenci pod brojem SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4. Polipeptid SEQ ID NO: 4 nema bilo kakvu identičnost sa bilo kojim poznatim proteinom Trichinella ili drugih organizama.

[0023] L20h-Ts3 i L20h-Ts1 polipeptidi, proizvedeni u rekombinantnom obliku, omogućavaju detektovanje, u ranoj fazi, humoralnog odgovora usmerenog protiv Trichinella. Pored toga, humoralni odgovor koji cilja ove antigene opstaje i duže nakon zaraze u odnosu kada se radi o rekombinantnom NBL1 antigenu, gde počinje da slabi približno 8 nedelja nakon zaraze. Upotreba L20h-Ts3 i L20h-Ts1 polipeptida tako omogućava širi vremenski prozor za detektovanje humoralnog odgovora.

[0024] Prema tome, cilj ovog pronalaska je upotreba nekog antigenskog polipeptida prepoznatog od strane anti-Trichinella antitela, kao reagensa za detekciju anti-Trichinella antitela u biološkim vrstama, okarakterisana u tome što je pomenuti polipeptid odabran od polipeptida a) koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 2, ili koji obuhvata neku sekvencu koja pokazuje najmanje 95% identiteta sa sekvencom SEQ ID NO: 2.

[0025] Poželjno, u kontekstu primene ovog pronalaska, moguća je upotreba mešavine, koja obuhvata polipeptid a) kakav je prethodno definisan i polipeptid b) koji obuhvata aminokiseline 21-67 sekvence SEQ ID NO: 4 (koji predstavlja zreli oblik L20h-Tsl proteina), ili koji obuhvata neku sekvencu koja pokazuje najmanje 95% identiteta sa sekvencom aminokiselina 21-67 sekvence SEQ ID NO: 4, ili neke mešavine koja obuhvata polipeptid a) i polipeptid b) kakav je prethodno definisan, kombinovana sa jednim ili više antigenskih polipeptida prepoznatih od strane anti-Trichinella antitela, na primer jedan ili više polipeptida izvedenih od NBL1 i 411 antigena, što je opisano u PCT prijavi WO/2007/090960.

[0026] Određenije, cilj ovog pronalaska je postupak za detekciju prisustva anti-Trichinella antitela u biološkom uzorku, pri čemu je pomenuti postupak okarakterisan u tome što obuhvata:

- dovođenje pomenutog biološkog uzorka u kontakt sa polipeptidom a) ili polipeptidom a) i polipeptidom b), kakav je prethodno definisan, pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa antigen/antitelo između pomenutog polipeptida(a) i anti-Trichinella antitela moguće prisutnim u pomenutom uzorku;

<�>detekciju, bilo kojim pogodnim sredstvom, kompleksa antigen/antitelo koji je moguće obrazovan.

[0027] Generalno, pomenuti biološki uzorak je uzorak seruma. Može se dobiti od bilo koje jedinke (sisar, ptica ili repril) koja pripada vrsti koja može biti zaražena sa Trichinella, i kod koje je poželjno detektovanje prisustva parazita. Poželjno, uzorak se dobija od sisara, na primer životinje koja se uzgaja na farmi, ili od humanog pacijenta.

[0028] Ova kombinacija naročito omogućava proširenje spektra reaktivnosti, a takođe i vremenskog okvira za detekciju humoralnog odgovora, u poređenju sa svakim od pojedinačno upotrebljenih polipeptida.

[0029] Ovaj pronalazak određenije obuhvata himerne polipeptide koji obuhvataju jednu ili više kopija polipeptida a) i jednu ili više kopija polipeptida b) ili više kopija polipeptida a) kakav je prethodno definisan, opciono fuzionisan sa jednim ili više heterolognih polipeptida, na primer jednim ili više polipeptida izvedenih od NBL1 i 411 antigena, što je opisano u PCT prijavi WO/2007/090960.

[0030] Cilj ovog pronalaska su takođe i polinukleotidi koji kodiraju himerni polipeptid prema ovom pronalasku, kao i rekombinantni vektori koji obuhvataju pomenute polinukleotide, i ćelije domaćina transformisane pomenutim vektorima.

[0031] Prethodno definisani polipeptidi a) i b) mogu se primeniti u kontekstu raznih postupaka za detekciju antitela, koji su same po sebi poznati. Primera radi, posebno se mogu navesti postupci ELISA tipa (direktan, indirektan ili sendvič), postupci mikroaglutinacije na perlicama, a takođe i postupci elektroforetičkog transfera kombinovanog sa imunoobeležavanjem.

[0032] Cilj ovog pronalaska je takođe i komplet za detekciju prisustva anti-Trichinella antitela u biološkom uzorku, okarakterisan u tome što obuhvata polipeptid a) ili polipeptid a) i polipeptid b) kakav je prethodno definisan, i, kada je pogodno, pufere i reagense pogodne za pripremanje reakcionog medijuma koji omogućava obrazovanje kompleksa antigen/antitelo, i, opciono, sredstvo za detekciju pomenutog kompleksa antigen/antitelo. Opciono, može obuhvatati jedan ili više drugih antigenskih polipeptida prepoznatih pomoću anti-Trichinella antitela, na primer jedan ili više polipeptida izvedenih od NBL1 i 411 antigeni, što je opisano u PCT prijavi WO/2007/090960.

[0033] Poželjno, pomenuti polipeptid(i) je (su), imobilisan(i) u čvrstoj podlozi. Kao neograničavajući primeri čvrstih podloga koje se mogu primeniti, mogu se navesti mikrotitarske ploče, perlice, mikroperlice ili mikročestice, trake, itd....

[0034] Pomenuti komplet takođe obuhvata referentne uzorke, kao što je jedan ili više negativnih seruma i jedan ili više pozitivnih seruma.

[0035] Ovaj pronalazak postaće jasnije u opisu koji sledi, koji se odnosi na primere koji pokazuju upotrebu L20h-Ts3 i L20h-Ts1 antigena, za imunodijagnozu trihinoze.

PRIMER 1 : IDENTIFIKACIJA L20H-TS3 i L20H-TS1 ANTIGENA, i PROIZVODNJA OVIH ANTIGENA U OBLIKU REKOMBINANTNIH PROTEINA U PROKARIOTSKOM EKSPRESIONOM SISTEMU.

[0036] Imunoskrining cDNK ekspresdionih biblioteka ranih faza Trichinella (14h, 20h, 48h nakon infekcije miševa) izveden je sa supernatantima seruma i crevne mukozne kulture svinja koje su eksperimentalno zaražene sa T. spiralis.

[0037] L20h-Ts3 gen identifikovan je u 41 od klonova cDNK biblioteka dobijenih 14h i 20h nakon infekcije miševa. Nukleotidna sekvenca i izdvojena polipeptidna sekvenca jednog od ovih klonova prikazane su na FIG.1A.

[0038] Njegova dužina je 398 bp, uključujući 33 bp za 3'UTR, pretpostavljeni poliadenilacioni signal (podvučen na FIG.1A), i okvir otvorenog čitanja koji kodira protein od 106 ak, sa molekulskom masom od 11906,0 Da i izoelektričnom tačkom od 4,21. Ni jedan peptidni signal nije primećen na osnovu algoritma od BENDTSEN et al. (BENDTSEN et al., J Mol Biol, 340, 783-95, 2004). Potraga za homolozima u bazi podataka otkrila je jak identitet (91%) između izdvojene polipeptidne sekvence L20h-Ts3 i proteina T. spiralis, koji se zove SML-3 (GUILIANO et al., Int J Parasitol, 39, 515-24, 2009).

[0039] Ovaj klon je svaren sa BamHI-NotI (New England BioLabs, Beverly, Massachusetts), i restrikcionim fragmentom koji sadrži kompletnu kodirajuću sekvencu za L20h-Ts3 koji je subkloniran u pGEX-6P-1 vektor (GenBank U78872). Ovaj vektor ima N-terminalnu Schistosoma japonicum glutinacionu S-tranferaza oznaku (GSTsj) (GSTsj ne eksprimira nikakve imunološke unakrsne reakcije sa Trichinella). Rezultujući ekspresioni vektor, koji se zove pGEX-6P-1-(L20h-Ts3), kodira rekombinantni protein koji sadrži celu L20h-Ts3 sekvencu i koji nosi GSTsj oznaku u N-terminalnom položaju i polihistidinsku oznaku u C-terminalnom položaju.

[0040] L20h-Ts1 gen identifikovan je u 121 od klonova cDNK biblioteka dobijene 20h i 48h nakon infekcije miševa. Sekvenca jednog od ovih klonova prikazana je na FIG.1B. Njegova dužina je 339 bp, uključujući 139 bp za 3'UTR, pretpostavljeni poliadenilacioni signal (podvučen na FIG.1B), i okvir otvorenog čitanja koji kodira protein od 67 ak, sa molekulskom masom od 7834,9 Da i izoelektričnom tačkom 4,42. Signalni peptid od 20 ak (podebljano na FIG.1B) identifikovan je na osnovu algoritma od BENDTSEN et al. (2004). Potraga za homolozima u bazi podataka nije otkrila nikakvu homologiju sa poznatim Trichinella proteinima.

[0041] Ovaj klon svaren je sa BamHI-NotI (New England BioLabs, Beverly, Massachusetts), a restrikcioni fragment koji kodira Tyr21-Ala67 fragment za L20h-Ts1 (koji odgovara zrelom obliku, bez signalnog proteina) subkloniran je u pGEX-6P-1 vektoru. Rezultujući ekspresioni vektor koji se zove pGEX-6P-1-(L20h-Ts1) kodira rekombinantni protein koji sadrži sekvencu zrelog oblika L20h-Ts1 i koji nosi GSTsj oznaku na N-terminalnom položaju i polihistidinsku oznaku na C-terminalnom položaju.

[0042] pGEX-6P-1-(L20h-Ts3) ili pGEX-6P-1-(L20h-Ts1) vektor primenjen je za tranformisanje E. coli bakterije (soj BL21), a ekspresija svakog rekombinantnog proteina (koji sadrže oznaku GSTsj na N-Ter ili histidinsku oznaku na C-Ter) indukovana je dodavanjem 0,5 mM (finalne koncetracije) izopropil-β-D-tiogalaktopiranozida (IPTG) i inkubisanjem tokom 3h, na 37°C i 225 o/min. Indukovane bakterije su centrifugirane (4000 x g, 20 min na 4°C), resuspendovane u lizionom buferu (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150mM NaCl) dopunjen sa 0,5 mg/mL lizozoma, i lizirane pomoću tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja u tečnom azotu.

[0043] Dalje, 5 µg/mL de DNaza I dodata je u lizat inkubisan tokom 15 min na 37°C. Zatim, a lizat je inkubisan tokom 1h30 na 4°C u rotacionom mešaču u 50 ml Falcon® epruveti zaobljenog dna (Becton Dickinson, Le Pont-De-Claix, France) u prisustvu Ni-NTA matrice (GE Healthcare Europe, Orsay, France) prethodno ekvilibrisane u lizionom puferu. Mešavina lizat-matrica uvedena je u PD-10 kolonu (GE Healthcare Europe, Orsay, France) kako bi se uklonili nepovezani proteini ili kontaminacije, a zatim je transferovana u novu 50 ml Falcon® epruvetu i oprana sa 50 mL bufera za pranje I (20 mM Tris-HCl, pH 8.0; 300 mM NaCl) tokom 30 min na 4°C na rotacionom mešaču. Nakon centrifugiranja tokom 5 min (1500 x g, 4°C), mešavina je oprana 4 puta sa 50 mL pufera za pranje II (20 mM Tris-HCl, pH 8.0; 300 mM NaCl; 30 mM imidazol) tokom 30 min na 4°C; ova pranja su praćena finalnim centrifugiranjem tokom 5 min (1500 x g, 4°C). Konačno, svaki rekombinantni protein eluiran je sa elucionim puferom (20 mM Tris-HCl, pH 8.0; 300 mM NaCl; 500 mM imidazol), a koncentracija je određena primenom spektrofotometra na 280 nm. Rekombinantni protein podeljen je na alikvotne frakcije i odložen na -20°C u 10 % glicerolu.

[0044] Gelovi elektroforeze pod denaturisanim uslovima (SDS-PAGE) GSTsj-L20h-Ts3 i GSTsj-L20h-Ts1 fuzionih proteina respektivno su prikazani na FIG.2A i 2B (traka 1: markeri molekulske mase). Na ovim gelovima, GSTsj-L20h-Ts3 i GSTsj-L20h-Ts1 proteini pojavljuju se i u obliku jedne trake pri očekivanoj veličini za fuzioni protein.

PRIMER 2 : IMUNOREAKTIVNOST L20H-TS3 i L20H-TS1 PROTEINA U VESTERN BLOTU.

Anti-Trichinella Serumi

[0045] Svinje bez specifičnog patogena (svinje BSP) ili svinje sa konvencionalnih farmi inficirane su sa 200, 1000, 20000 inficirajućih larvi T. spiralis (ISS004, International Trichinella Reference Centre, Rome, Italie) ili T. britovi (ISS100). Krvni uzorci uzimani su 48h pre zaraze (negativna kontrola), i 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 dana nakon zaraze (pi).

[0046] Serumi koji su dobijeni od svinja BSP inficirani sa 20000 L1M larvi T. spiralis (ISS003) ili T. britovi (ISS002) takođe su korišćeni. Krvni uzorci uzimani su 24h pre zaraze (negativna kontrola), i 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20, 25 nedelja pi.

[0047] Serumi svinja dobijeni iz industrijskih farmi za proizvodnju iz Ille-et-Vilaine (France), a koji su se pokazali negativnim na trihinozu veštačkim varenjem, sakupljeni su 2004 i koriste se kao negativni referentni serumi.

VESTERN BLOT

[0048] Imunoreaktivnost rekombinantnih L20h-Ts3 i L20h-Ts1 antigena (u obliku GSTsj-L20h-Ts3 i GSTsj-L20h-Ts1 fuzionih proteina) analizirana je primenom Vestern blota.

[0049] Rekombinantni proteini podvrgnuti su elektroforezi pod uslovima denaturisanja (15 % SDS-PAGE, 700 ng proteina po bazenčiću), i transferovani na nitrocelulozne membrane. Nakon blokiranja membrana inkubacijom tokom 1 noći na 4°C u PBS puferu koji sadrži 0,1% Tween®-20(PBS-T) i 5 % obranog mleka, one su oprane 3 puta u PBS-T tokom 5 min. Dalje, membrane su zatim inkubisane tokom 1 h na sobnoj temperaturi sa:

- u slučaju L20h-Ts3, serumi svinja BSP eksperimentalno su inficirani sa 20000 L1M larvi T. spiralis, sakupljeni -2, 5, 12, 15, 20, 28, i 60 dana nakon zaraze i razblaženi do 1/300 u PBS-T koji sadrži 5 % obranog mleka,

- u slučaju L20h-Ts1, serum svinje BSP eksperimentalno je inficiran sa 20000 L1M larvi T. spiralis, sakupljen -1, 7, 14, 21, 28, 49, 84 dana nakon zaraze i razblažen do 1/300 u PBS-T koji sadrži 5 % obranog mleka.

[0050] Nakon 3 pranja tokom 5 min u PBS-T, membrane su inkubisane tokom 1h na sobnoj temperaturi sa zečijim anti-svinjskim IgG antitelom obeleženim peroksidazom razblaženom do 1/10000. Nakon 3 nova pranja, vizualizacija je izvedena pomoću kompleta « ECL PLUS WESTERN BLOTTING i AMERSHAM HYPERFILM ECL » (GE Healthcare Europe, Orsay, France).

L20h-Ts3 :

[0051] Rezultati dobijeni sa serumima svinja BSP eksperimentalno inficirane sa sa 20000 L1M larvi T. spiralis i sakupljeni -2, 5, 12, 15, 20, 28, i 60 dana pi, prikazani su na FIG.3. Ovi rezultati pokazuju da je rekombinantni L20h-Ts3 antigen (GSTsj-L20h-Ts3) jasno prepoznat 20 dana pi (traka koja se odnosi na nedelju vidljiva je 15 dana pi), i trajala je čak do 60 dana pi.

L20h-Ts1 :

[0052] Rezultati su prikazani na FIG.4. Ovi rezultati pokazuju rekombinantni L20h-Ts1 antigen (GSTsj-L20h-Ts1) jasno prepoznat 28 dana pi (traka koja se odnosi na nedelju vidljiva je 21 dan pi), i trajala je čak do 84 dana pi u slučaju seruma svinja BSP eksperimentalno inficirane sah sa 20000 L1M larvi T. spiralis (FIG.4A i 4B) (treba napomenuti da je detekcija 112 dana pi takođe moguća sa još jednim serumom svinje BSP eksperimentalno inficirane sa 20000 L1M larvi T. spiralis, podaci nisu prikazani). Rekombinantni L20h-Ts1 antigen (GSTsj-L20h-Ts1) takođe je prepoznat (traka koja se odnosi na nedelju je vidljiva) 60 dana pi u slučaju svinje inficirane sa 200 L1M larvi T. spiralis (podaci nisu prikazani).

PRIMER 3: IMUNOREAKTIVNOST REKOMBINANTNOG L20H-TS3 ANTIGENA U INDIREKTNOM ELISA [0053] Imunoreaktivnost rekombinantnog L20h-Ts3 antigena procenjenja je indirektnim ELISA, u poređenju sa E/S antigenom T. spiralis, i sa NBL1 antigenom opisanom u PCT prijavi WO/2007/090960.

[0054] Serumi svinja inficirani sa Trichinella koji su korišćeni su oni opisani u Primeru 2 gore. Za određivanje dijagnostičkog praga, korišćeno je ukupno 220 referentna seruma svinja.

[0055] E/S antigen koji je korišćen kao referenca pripadao je ELISA testu koji je kupljen od l'Institut Zaquier (Montpellier, France).

[0056] Korišćeni protokol za ELISA testove bio je kako sledi: 100 µL/bunarčić antigena razblaženog u puferu za sintetizovanje (12 mM natrijum karbonat; 35 mM natrijum bikarbonat, pH 9,6) odmereno je i inkubisano tokom 2h na 37°C u mikrotitarskoj ploči (Immuno 96 MicroWell Plates F96 MaxiSorp, Nunc, Roskil, Danemark). Dalje, svaki bunarčić je opran 5 puta sa 250 µL pufera za pranje (destilovana voda, Tween®-200,05 %) i inkubisan tokom 30 min na 37°C sa 200 µL zasićenog pufera (PBS, 1 % želatin; Tween®-200,05 %). Nakon 5 pranja rastvorom za pranje, 200 µL/bunarčić primarnih antitela (seruma) razblaženih u zasićenom puferu odmereno je i inkubisano 1h na 37°C. Nakon 5 pranja rastvorom za pranje, 100 µL/bunarčić sekundarnih antitela zečijeg anti-svinjskog IgG konjugovanog u peroksidazi (razblažena do 1/50000 u zasićenom puferu) odmereno je i inkubisano tokom 1h na 37°C. Konačno, bunarčići su oprani 5 puta rastvorom za pranje, a 100 µL/bunarčić 3, 3', 5, 5' tetrametilbenzidina (TMB, Zymed, California, USA) upotrebljeno je za vizualizaciju u mračnoj komori. Reakcija je zaustavljena sa 50 µL/bunarčić 12,5 % sumporne kiseline i čitanje je izvedeno na 450 nm primenom Labsystems iEMS Reader MF čitača ploča koji je primenjen sa Ascent 2.6 (Thermo LabSystems, Cergy Pontoise, France).

[0057] Optimalni uslovi za ELISA definisani su uzorcima seruma koji se testira u razblaženju od 1/10, 1/100 i 1/300, i količinama L20h-Ts3 proteina od 50 ng, 250 ng, 500 ng i 1 µg po bunarčiću. Dobijeni rezultati zatim su analizirani primenom Wilcoxon-Mann-Whitney testa. Na taj način, najveća razlika između vrednosti pozitivnih uzoraka i vrednosti negativnih uzoraka primećena je za razblaženje od 1/10 seruma i 250 ng L20h-Ts3 proteina. Ovi uslovi stoga su primenjeni tokom naknadnih ELISA.

[0058] Ovi uslovi su na taj način korišćeni za ponavljanje testova. Dijagnostički prag određen je primenom negativnih referentnih seruma. Izračunavanja su bazirana na upotrebi formule definisane od strane Međunarodne kancelarije epizoota (Manuel des testovi de diagnostic i des vaccins za les animaux terrestres, 6e éd., 2008, Chapitre 2.01.6), koji odgovaraju srednjoj vrednosti OG izmerenih na 450 nm kojoj je 3 puta dodata standardna devijacija.

[0059] Rezultati su prikazani na FIG.5 do 13.

FIG.5 prikazuje vrednosti optičke gustine izmerene na 220 negativnih referentnih seruma. Dijagnostički prag utvrđen na bazi ovih merenja je 0,33 OG jedinica.

FIG.6 prikazuje vrednosti optičke gustine izmerene u serumima svinja BSP (▲) ili svinja sa konvencionalnih farmi (■), inficiranih sa 20000 L1M larvi T. spiralis, za sakupljanje seruma 5 (svinje 1-3), 12 (svinje 4-6), 15 (svinje 7-9), 20 (svinje 10-12) i 60 (svinje 13-15) dana pi. Slepi prozor, tokom kog nije moguća detekcija sa ELISA E/S, označen je zasenčenjem.

FIG.7 prikazuje promenu optičke gustine (na ordinati) tokom nedelja nakon zaraze (na apscisi) za serume 3 svinje BSP eksperimentalno inficirane sa sa 20000 L1M larvi T. spiralis i testirane sa L20h-Ts3 antigenom.

FIG.8 prikazuje promenu optičke gustine (na ordinati) tokom nedelja nakon zaraze (na apscisi) za serume 3 svinje BSP eksperimentalno inficirane sa sa 20000 L1M larvi T. spiralis i testirane sa E/S antigenom. % E/P definisan je sledećom formulom: (OG test uzorka)/(srednja vrednost OG uzorka pozitivne kontrole)x100.

FIG.9 prikazuje promenu optičke gustine (na ordinati) tokom nedelja nakon zaraze (na apscisi) za serume 3 svinje BSP eksperimentalno inficirane sa sa 20000 L1M larvi T. spiralis i testirane sa NBL1 antigenom.

FIG.10 prikazuje promenu optičke gustine (na ordinati) tokom nedelja nakon zaraze (na apscisi) za serume 3 svinje BSP eksperimentalno inficirane sa sa 20000 L1M larvi T. britovi i testirane sa L20h-Ts3 antigenom.

FIG.11 prikazuje promenu optičke gustine (na ordinati) tokom nedelja nakon zaraze (na apscisi) za serume 3 svinje BSP eksperimentalno inficirane sa sa 20000 L1M larvi T. britovi i testirane sa E/S antigenom.

FIG.12 prikazuje promenu optičke gustine (na ordinati) tokom nedelja nakon zaraze (na apscisi) za serume 3 svinje BSP eksperimentalno inficirane sa sa 20000 L1M larvi T. britovi i testirane sa NBL1 antigenom.

FIG.13 prikazuje vrednosti optičke gustine izmerene sa serumima svinja BSP (▲) ili svinja iz konvencionalnih farmi (■), inficirane sa 200 (svinje 1-3) ili 1000 (svinje 4-6) L1M larvi T. spiralis i testirane sa L20h-Ts3 antigenom.

[0060] U slučaju svinja eksperimentalno inficiranih sa 20000 L1M T. spiralis, detekcija sa L20h-Ts3 antigenom bila je moguća 15 dana pi za 1/6 svinja (svinja 8) i 20 dana pi za 4/6 svinja (FIG.6). Za ELISA E/S nije omogućena detekcija infekcije pre 25 dana. Dobijeni rezultati razlikovali su se u zavisnosti od zdravstvenog statusa svinja. Određenije, kod svinja BSP odetektovane su ranije u poređenju sa konvencionalnim svinjama.

[0061] Serokonverzija je dopunjena profilom humoralnog odgovora sa visokim titrima i održavana čak do 25 nedelja pi za 2/3 svinje i čak do 12 nedelja pi za 1/3 svinje inficirane sa T. spiralis (FIG.7). Jedna od tri svinje detektovana je ranije (1 nedelju ranije), a zatim sa ELISA E/S (FIG.8). Kod 3 iste životinje, NBL1 antigen (FIG.9) omogućio je detekciju anti-Trichinella antitela 3 nedelje pi. Sa druge strane, pad u odgovoru primećen je 7 nedelja pi za 2 od ove 3 svinje. Za treću svinju, prisustvo anti-Trichinella antitela nije bilo moguće detektovati nakon 12 nedelja.

[0062] U slučaju svinja eksperimentalno inficiranih sa 20000 L1M T. britovi, serokonverzija je detektovana jednu do dve nedelje pre sa L20h-Ts3 antigenom u poređenju sa ELISA E/S (FIG.10 i 11), sa izmerenim OG koje su bile više od 3 nedelje pi i održavana je čak do 25 nedelja pi za tri testirane svinje. Na iste 3 životinje, NBL1 antigen (FIG.12) omogućio je detekciju anti-Trichinella antitela u serumu jedne od tri svinje 2 nedelje pi i čak do 16 nedelja pi. Prisustvo anti Trichinella antitela detektovano je u serumu kod druge svinje samo tri i četiri nedelje pi. Konačno, ni jedno anti-Trichinella antitelo nije detektovano u serumu treće svinje.

[0063] Dodatno, 3/6 svinja sa umerenom dozom infekcije (1000 L1M, T. spiralis) detektovano je 60 dana pi sa L20h-Ts3 antigenom (FIG.13). Ponovo, dobijeni rezultati zavisili su od zdravstvenog statusa svinja. Određenije, detektovano je 2/3 svinje BSP i 1/3 konvencionalne svinje. Svinje inficirane sa niskom dozom infekcije (200 L1M, T. spiralis) nisu detektovane 60 dana pi.

LISTA SEKVENCI

[0064]

<110> AGENCE NATIONALE CHARGEE DE LA SECURITE SANITAIRE DE

L'ALIMENTATION, DE L'ENVIRONNEMENT i DU TRAVAIL

ZOCEVIC, Aleksandar

BALDISSERA, Giovani

LACOUR, Sandrine A.

MACE, Pauline

VALLEE, Isabelle

BOIREAU, Pascal

<120> Antigenski polipeptidi trihinele i njihove upotrebe

<130> MJP/11-F1159-7 WO

<150> FR 1000660

<151> 2010-12-17

<170> PatentIn version 3.5 <210> 1

<211> 398

<212> DNK

<213> Trichinella spiralis <220>

<221> CDS

<222> (34)..(351) <400> 1

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> Trichinella spiralis <400> 2

<211> 339

<212> DNK

<213> Trichinella spiralis <220>

<221> CDS

<222> (1)..(201) <400> 3

<210> 4

<211> 67

<212> PRT

<213> Trichinella spiralis <400> 4

Claims (9)

Patentni zahtevi

1. Upotreba antigenskog polipeptida kao reaktanta za detektovanje anti-Trichinella antitela indukovanih zarazom sa Trichinella u biološkom uzorku, n a z n a č e n a t i m e, što pomenuti polipeptid obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 2 ili sekvencu sa najmanje 95% identiteta sa sekvencom SEQ ID NO: 2 i što je pomenuti polipeptid prepoznat pomoću anti-Trichinella antitela.

2. Upotreba prema zahtevu 1, n a z n a č e n a t i m e, što se koristi mešavina koja obuhvata prvi polipeptid kakav je definisan u zahtevu 1 i drugi polipeptid koji obuhvata aminokiseline 21-67 sekvence SEQ ID NO: 4 ili sekvencu sa najmanje 95% identiteta sa sekvencom aminokiselina 21-67 sekvence SEQ ID NO: 4, i što je pomenuti drugi polipeptid prepoznat pomoću anti-Trichinella antitela.

3. Antigenski polipeptid prepoznat pomoću anti-Trichinella antitela, n a z n a č e n t i m e, što je pomenuti polipeptid odabran od:

- himernog polipeptida koji obuhvata:

(i) jednu ili više kopija prvog polipeptida koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 2 ili sekvencu sa najmanje 95% identiteta sa sekvencom SEQ ID NO: 2, pri čemu je pomenuti polipeptid prepoznat pomoću anti-Trichinella antitela, i

(ii) jednu ili više kopija drugog polipeptida koji obuhvata aminokiseline 21-67 sekvence SEQ ID NO: 4 ili sekvencu sa najmanje 95% identiteta sa sekvencom aminokiselina 21-67 sekvence SEQ ID NO: 4, pri čemu je pomenuti polipeptid prepoznat pomoću anti-Trichinella antitela, opciono fuzionisan sa jednim ili više heterolognih polipeptida;

- himernog polipeptida koji obuhvata više kopija polipeptida koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 2 ili sekvencu sa najmanje 95% identiteta sa sekvencom SEQ ID NO: 2, pri čemu je pomenuti polipeptid prepoznat pomoću anti-Trichinella antitela, opciono fuzionisan sa jednim ili više heterolognih polipeptida.

4. Polinukleotidno kodiranje za antigenski polipeptid prema zahtevu 3.

5. Rekombinantni vektor koji sadrži jedan ili više polinukleotida prema zahtevu 4.

6. Ćelija domaćin transformisana rekombinantnim vektorom prema zahtevu 5.

7. Postupak za detektovanje prisustva anti-Trichinella antitela indukovanih zarazom sa Trichinella, u biološkom uzorku, koji postupak je n a z n a č e n t i m e, što pomenuti postupak uključuje: - dovođenje pomenutog biološkog uzorka u kontakt sa polipeptidom kakav je definisan u zahtevu 1, mešavinom peptida kakav je definisan u zahtevu 2, ili himernim peptidom kakav je definisan u zahtevu 3, u uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa antigen/antitelo sa anti-Trichinella antitelima moguće prisutnim u pomenutom uzorku;

- detekciju, bilo kojim pogodnim sredstvom, kompleksa antigen/antitelo koji je moguće obrazovan.

8. Komplet za detektovanje prisustva anti-Trichinella antitela indukovanih zarazom sa Trichinella, u biološkom uzorku, n a z n a č e n t i m e, što pomenuti komplet obuhvata:

- polipeptid, koji polipeptid obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 2 ili sekvencu sa najmanje 95% identiteta sa sekvencom SEQ ID NO: 2, pri čemu je pomenuti polipeptid prepoznat pomoću anti-Trichinella antitela, - mešavinu polipeptida koja obuhvata prvi polipeptid kakav je prethodno definisan i drugi polipeptid koji obuhvata aminokiseline 21-67 sekvence SEQ ID NO: 4 ili sekvencu sa najmanje 95% identiteta sa sekvencom aminokiselina 21-67 sekvence SEQ ID NO: 4, pri čemu je pomenuti drugi polipeptid prepoznat pomoću anti-Trichinella antitela, ili

- himerni polipeptid kakav je definisan u zahtevu 3, i

- pufere i reaktante pogodne za obrazovanje reakcionog medijuma koji omogućava obrazovanje kompleksa antigen/antitelo.

9. Komplet prema zahtevu 8, n a z n a č e n t i m e, što se pomenuti polipeptid(i) imobiliše(u) na čvrstom supstratu.