RS56178B1 - Upotreba vegfr-3 inhibitora za lečenje hepatocelularnog karcinoma - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na inhibitore receptora 3 vaskularnog endotelnog faktora rasta za upotrebu u lečenju hepatocelularnog karcinoma (HCC). Hepatocelularni karcinom (HCC) je peti najčešći čvrsti tumor širom sveta i njegova učestalost se stalno povećavala tokom 25 godina (Thomas et al. Hepatocellular carcinoma: consensus recommendations of the National Cancer Institute Clinical Trials Planning Meeting. J Clin Oncol.

2010;28(25):3994-4005). HCC je smrtna bolest sa više od 600,000 smrtnih ishoda godišnje u svetu.

[0002] Neispunjena potreba je ekstremno visoka, pogotovo u Azijsko-pacifičnom regionu (Kudo et al. Asian consensus workshop report: expert consensus guideline for the management of intermediate and advanced hepatocellular carcinoma in Asia. Oncology 2011.

81:158-64). U Kini je, oko 400,000 novih slučajeva dijagnozirano svake godine. Većina slučajeva je dijagnozirano pri naprednim stadijumima sa ograničenim mogućnostima za lečenjem. Samo 20% je pogodno za operaciju pri veoma velikoj stopi vraćanja. Do sada, samo Sorafenib, inhibitor multi-kinaze, je odobren za HCC terapiju. Daje povećanje do 2-3 meseca OS (ukupno preživljavanje) > placebo i manje od 5% pacijenata je pogodno zbog visoko povezane toksičnosti (Song et al. A single center experience of sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma patients: evaluation of prognostic factors. Eur. J. Gastroenterol Hepatol. 2011 (12):1233-8).

[0003] Receptor 3 vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGFR-3) je receptor tirozin kinaze koji prepoznaje dva liganda VEGFC i VEGFD. Limfangiogeneza povezana sa tumorom kod HCC povezana je sa lošom prognozom i preživljavanjem pacijenata. (Thelen et al. Tumor-Associated Lymphangiogenes rognosis after Resection of Human Hepatocellular Carcinoma. Ann. Surg. Oncol. (2009) 16:1222-1230; Thelen et al. Tumor-associated angiogenesis and lymphangiogenesis correlate with progression of intrahepatic cholangiocarcinoma. Am. J. Gastroenterol. 105(5): 1123-32, 2010). U poređenju sa normalnim uzorcima jetre, većina uzoraka tkiva HCC je pokazala jaku imunoreaktivnost na VEGF-D (Thelen et al. VEGF-D promotes tumor growth and lymphatic spread in a mouse model of hepatocellular carcinoma Int. J. Cancer.122, 2471-24812008). Dodatno, klinički probni uzorci predlažu visoke nivoe VEGFC kako su osnovni pravci značajno povezani sa prolongiranim OS kod lečenja sa sunitinibom (pan-VEGFR inhibitor) (Harmon et al.

Mechanism-related circulating proteins as biomarkers for clinical outcome in patients with unresectable hepatocellular carcinoma receiving sunitinib J. Transl. Med.2011 Jul 25;9:120). Štaviše, ekspresija VEGFR-3 je opisana da je upregulisana kod >75% Hepatitis B X antigen (HBxAg) pozitivnih HCC izraslina i da je inverzno povezana sa preživljavanjem HCC pacijenta (Lian et al. Hepatitis B x Antigen Up-regulates Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3 in Hepatocarcinogenesis. HEPATOLOGY, Vol.45, No.6, 2007). Dalje, infiltracija makrofaga koja može da dovede do ekspresije VEGFR-3, povezana je sa intrahepatičnom metastazom, vraćanjem tumora, i niskim preživljavanjem pacijenata. (Lin et al. Macrophage activation increases the invasive properties of hepatoma cells by destabilization of the adherens junction FEBS Letters 580 (2006) 3042-3050; Zhu et al. High expression of macrophage colony-stimulating factor in peritumoral liver tissue is associated with poor survival after curative resection of hepatocellular carcinoma. J. Clin. Oncol.2008 Jun 1;26(16):2707-16; Ju et al. Peritumoral activated hepatic stellate cells predict poor clinical outcome in hepatocellular carcinoma after curative resection. Am. J. Clin Pathol. 2009 Apr;131(4):498-510). Štaviše, do sada, ne postoji određeni VEGFR-3 inhibitor koji je zabeležen u kliničkim fazama za lečenje HCC.

[0004] Međunarodna patentna prijava br. PCT/EP2012/059145 ('145 prijava), podnesena 16. Maja, 2012, obelodanjuje jedinjenje formule (I), gde je R metoksi ili hidroksil grupa, kao VEGFR-3 inhibitor. Sada je otkriveno da su jedinjenja formule (I) takođe od koristi pri lečenju HCC.

[0005] Dati pronalazak povezan je sa jedinjenjima formule (I) za upotrebu u metodi pri lečenju hepatocelularnog karcinoma koja obuhvata davanje pacijentu koji ima potrebu za farmaceutski efektivnom količinom jedinjenja formule (I),

gde je R metoksi ili hidroksil grupa, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0006] Dati pronalazak takođe se odnosi na jedinjenje formule (I) iznad, ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu pri lečenju hepatocelularnog karcinoma.

[0007] Gore navedeni i drugi aspekti, svojstva, i prednosti datog pronalaska biće bolje shvaćeni iz sledećeg detaljnog opisa koji je u vezi sa pratećim crtežima.

● Slika 1 prikazuje rezultate in vivo evaluaciju jedinjenja iz Primera 1 u hepatokaricinom ksenograft modelu miševa.

● Slika 2 prikazuje rezultate in vivo evaluacije jedinjenja iz Primera 1 na hemijskiuzrokovanom hepatokarcinomu.

[0008] Kao što je korišćeno iznad, i kroz opis pronalaska, sledeći termini, ukoliko nisu drugačije naznačeni, će biti uzeti da imaju sledeće značenje:

"Jedinjenje prema pronalasku" odnosi se na jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0009] "Hepatocelularni karcinom" je jedan tip kancera jetre koji se javlja u ćelijama jetre. Oštećenje jetre, koje se manifestuje cirozom (ožiljci), je glavni faktor rizika kod kancera jetre. HCC, međutim, takođe uključuje čvrsti karcinom jetre u odsustvu ciroze jetre.

[0010] "Pacijent" uključuje oba, ljude i druge sisare.

[0011] "Farmaceutski prihvatljive soli" odnosi se na relativno ne-toksične, neorganske i organske kisele adicione soli, i bazne adicione soli jedinjenja formule I. Ove soli se mogu pripremiti in situ tokom finalne izolacije i prečišćavanja jedinjenja formule I. Videti, na primer S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977).

[0012] "Farmaceutski efektivna količina" odnosi se količinu jedinjenja ili sastava prema datom pronalasku efektivnu za uzrokovanje željenog terapeutskog efekta.

[0013] "Lečiti" ili "Lečenje" odnosi se na umanjenje simptoma, uklanjanje uzroka simptoma na trenutnom ili na trajnom nivou, ili na usporavanje ispoljavanje simptoma navedenog poremećaja ili stanja.

[0014] Jedno posebno otelotvorenje prema pronalasku odnosi se na jedinjenje formule (I) za upotrebu u metodi pri lečenju hepatocelularnog karcinoma koja obuhvata davanje pacijentu koji ima potrebu za farmaceutski efektivnom količinom 2-amino-1-etil-7-((3R)-3-hidroksi-4-metoksi-3-metil-but-1-inil)-3-(1 H-imidazol-2-il)-1 H-[1,8]-naftiridin-4-ona, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0015] Još jedno otelotvorenje prema pronalasku odnosi se na jedinjenje 2-amino-1-etil-7-((3R)-3-hidroksi-4-metoksi-3-metil-but-1-inil)-3-(1H-imidazol-2-il)-1H-[1,8]-naftiridin-4-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu pri lečenju hepatocelularnog karcinoma.

[0016] Jedno posebno otelotvorenje prema pronalasku odnosi se na jedinjenje formule (I) za upotrebu u metodi pri lečenju hepatocelularnog karcinoma koja obuhvata davanje pacijentu koji ima potrebu za farmaceutski efektivnom količinom 2-amino-1-etil-7-((3R)-3-hidroksi-4-metoksi-3-metil-but-1-inil)-3-(1H-imidazol-2-il)-1H-[1,8]-naftiridin-4-ona. Drugo otelotvorenje prema pronalasku odnosi se na jedinjenje 2-amino-1-etil-7-((3R)-3-hidroksi-4-metoksi-3-metil-but-1-inil)-3-(1H-imidazol-2-il)-1H-[1,8]-naftiridin-4-on za upotrebu pri lečenju hepatocelularnog karcinoma.

[0017] Jedno posebno otelotvorenje prema pronalasku odnosi se na jedinjenje generalne formule (I), gde je R metoksi ili hidroksil grupa, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u pripremanje medikamenata za lečenje hepatocelularnog karcinoma..

[0018] Poseban aspekt prema pronalasku pruža jedinjenje prema datom pronalasku koje se daje u formi farmaceutskog sastava. Farmaceutski sastav, prema datom pronalasku, sadrži jedinjenje prema datom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0019] U praksi, jedinjenje prema pronalasku može se davati ljudima i drugim životinjama oralnim ili intravenoznim putem, u formi jedinice za davanje, kao smeša sa konvencionalnim farmaceutskim ekscipijentima.

[0020] Farmaceutski sastavi prema datom pronalasku, pogodni za oralnu upotrebu, mogu biti predstavljeni kao izolovane jedinice kao što su čvrste forme doze, poput kapsula, pastila ili tableta gde svaka sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sastojka, ili kao prah ili granule; kao tečne forme doze poput rastvora ili suspenzija u vodenoj tečnosti ili ne-vodenoj tečnosti, ili kao ulje-u-vodi tečnoj emulziji ili voda-u-ulju tečnoj emulziji.

[0021] Farmaceutski sastavi prema datom pronalasku pogodni za intravenozno davanje mogu biti formulisani kao tečni rastvori, posebno u fiziološki pogodnim puferima kao što su Henkov rastvor ili Ringerov rastvor. Dodatno, sastavi mogu biti formulisani kao čvrste forme i da budu ponovo rastvoreni ili suspendovani neposredno pre upotrebe. Liofilizirane forme su takođe obuhvaćene. Formulacije su sterilne i uključuju emulzije, suspenzije, vodene i nevodene injekcione rastvore, koji mogu sadržati suspendujuće agense i zgušnjivače i antioksidanse, pufere, bakteriostate i solute koji čine formulaciju izotoničnom, i imaju pogodno podešenu pH vrednost, sa krvi namenjenog recipijenta.

[0022] Stvarne količine doza aktivnih sastojaka u sastavima prema pronalasku mogu varirati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efektivna da ostvari željeni terapeutski odgovor za određeni sastav i metodu davanja pacijentu. Odabrani nivo doze za bilo kojeg pacijenta stoga zavisi od više faktora uključujući željeni terapeutski efekat, vid davanja, željeno trajanje davanja, etiologiju i ozbiljnost bolesti, stanje pacijenta, težinu, pol, ishranu i starost, tip i potencijal svakog od aktivnih sastojaka, stopu apsorpcije, metabolizam i/ili izlučivanje i druge faktore.

[0023] Ukupna dnevna doza jedinjenja prema pronalasku koja se daje pacijentu u jednoj ili odvojenim dozama može biti u količinama, na primer, od oko 0.001 do oko 100 mg/kg telesne težine dnevno i posebno 0.01 do 10 mg/kg/dan. Procenat aktivnog sastojka u sastavu može biti promenljiv, ali treba da predstavlja takvu proporciju da se dobije pogodna doza. Sastavi jedinica za dozu mogu sadržati takve količine takvih podgrupa kao što se može koristiti za određivanje dnevnih doza. Očigledno, više jedinica doze se može davati otprilike u isto vreme. Doza može biti davana učestalo onoliko koliko je potrebno u cilju dobijanja željenih terapeutskih efekata. Neki pacijenti mogu reagovati brzo na veću ili manju dozu i može im mnogo manja održavajuća doza biti adekvatnija. Kod drugih pacijenata, može biti neophodno da imaju dugoročna lečenja sa stopom od 1 do 4 doza na dan, u skladu sa fiziološkim potrebama svakog pacijenta posebno. Nepotrebno je napomenuti da, za svakog pacijenta, će biti potrebno prepisati ne više od jedne do dve doze na dan.

Primer 1:

2-Amino-1-etil-7-((3R)-3-hidroksi-4-metoksi-3-metil-but-1-inil)-3-(1H-imidazol-2-il)-1H-[1,8]-naftiridin-4-on

Korak 2: 6-Hloro-2-etilamino-nikotinoil fluorid

[0024] Rastvor od 18.0 g (84.4 mmol) 2,6-dihloronikotinske kiseline u 180 ml rastvora etilamina (70% u vodi) je mešan na temperaturi okoline tokom 72 sata. Višak amina je evaporisan pod sniženim pritiskom, i vodeni rastvor sirćetne kiseline pri 10% je dodat dok se proizvod nije istaložio. Bež čvrsta supstanca je okretanjem filtrirana i osušena, isprana sa hladnom vodom i osušena u pećnici.10.5 g očekivanog proizvoda je dobijeno.

Tačka topljenja = 158-160°C

Prinos = 62%.

Step 2: 6-Hloro-2-etilamino-nikotinoil fluorid

[0025] 2 ml (24.8 mmol) piridina i 4.2 ml (49.8 mmol) 2,4,6-trifluorotriazina je dodato suspenziji od 5.0 g (24.8 mmol) 6-hloro-2-etilamino-nikotinske kiseline u 125 ml dihlorometana. Smeša je mešana tokom 3 sata na temperaturi okoline i potom je filtrirana. Čvrsta supstanca je isprana sa 50 ml dihlorometana i filtrat je ispran dva puta sa 60 ml ledene vode. Organska faza je osušena preko Na2SO4 i rastvarač je evaporiran pod sniženim pritiskom. 5.01 g proizvoda je dobijeno u formi narandžastog ulja koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja.

Prinos = 99%.

Korak 3: 1-(2-Trimetilsilanil-etoksimetil)-1H-imidazol-2-karbaldehid

[0026] Uljana suspenzija 20.8 g natrijum hidrida u mineralnom ulju (50%, 0.52 mol) je isprana od mineralnog ulja mešanjem sa heksanom 3 puta i suspendovana je u 400 ml DMF. Tokom mešanja na temperaturi okoline 50.0 g (0.520 mol) imidazol-2-karbaldehida je dodato suspenziji. Nakon 1.5 h, 101 ml (0.572 mol) 2-(trimetilsilanil)etoksimetil hlorida je dodato i reakcija je mešana još sat. Potom preostala voda je dodata suspenziji i reakciona smeša je ekstrahovana tri puta sa etil acetatom. Organska faza je osušena preko Na2SO4i rastvarač je evaporiran pod sniženim pritiskom. Sirovi materijal je potom prečišćen na koloni hromatografijom (DCM) kako bi se dobio prinos 85.0 g (0.376 mol) SEM-zaštićenog imidazol-2-karbaldehida.

Prinos = 72%

MH+ = 227.1 (C10H18N2O2Si, Mr=226.35)

1 H NMR (DMSO-d6, 500MHz): δ 9.83 (s, 1 H); 7.86 (s, 1 H); 7.39 (s, 1 H); 5.75 (s, 2H); 3.58 (t, 2H); 0.95 (t, 2H); 0.02 (s, 9H)

Korak 4: [1-(2-Trimetilsilanil-etoksimetil)-1H-imidazol-2-il]-acetonitril

[0027] 1.73 g (8.84 mmol) tozilmetilizocijanida je rastvoreno u 10 ml DME i ohlađeno do -60°C. Pri ovoj temperaturi prvo je 1.98 g kalijum tert-butoksida dodato i zatim polako rastvor 2.00 g (8.84 mmol) 1-(2-trimetilsilanil-etoksimetil)-1H-imidazol-2-karbaldehida u 5 ml DME. Nakon 2 sata mešanja pri -60°C reakciji je dopušteno da dostigne 0°C i 5 ml metanola (123.60 mmol) je dodato rastvoru. Reakcija je mašana još 24 sata na temperaturi okoline i 2 sata na 40°C. Preostala voda je dodata i rastvor je ekstrahovan 3 puta sa dihlorometanom. organska faza je osušena preko Na2SO4, nakon evaporisanja rastvarača pod sniženim pritiskom sirovi materijal je prečišćen na koloni hromatografijom reverzne faze (voda 0.1%TFA/acetonitril = 80/20 kako bi se dobio prinos od 0.87 g (0.367 mol) SEM-zaštićenog imidazol-acetonitrila.

Prinos = 41%

MH+ = 238.1 (C11H19N3OSi, Mr =237,38)

1 H NMR (DMSO-d6, 500MHz): δ 7.66 (s, 1 H); 7.39 (s, 1 H); 5.53 (s, 2H); 4.52 (s, 2H); 3.55 (t, 2H); 0.92 (t, 2H); 0.02 (s, 9H)

Korak 5: 3-(6-Hloro-2-etilamino-piridin-3-il)-3-hidroksi-2-[1-(2-(trimetilsilaniletoksimetil)-1H-imidazol-2-il]-acrilonitril

[0028] 0.283 g (2.53 mmol) kalijum tert-butilata je dodato, u malim količinama, rastvoru na 0°C od 0.600 g (2.53 mmol) [1-(2-trime -1H-imidazol-2-il]-acetonitrila u 10 ml anhidrovanog THF. Smeša je mešana tokom 45 minuta na temperaturi okoline, i zatim je ohlađena opet do 0°C. Rastvor od 0.512 g (2.53 mmol) 6-hloro-2-etilamino-nikotinoil fluorida u 10 ml THF je zatim dodan i medijum je mešan na temperaturi okoline preko noći, ponovo ohlađen do 0°C i drugi ekvivalent kalijum tert-butilata (0.283 g, 2.53 mmol) je dodat. Nakon 2 h mešanja na temperaturi okoline 50 ml zasićenog amonijum hlorid vodenog rastvora je dodato, pH vrednost je podešena na 7 sa 2N HCl i potom je ekstrahovan tri puta sa etil acetatom. Kombinovane organske faze su osušene preko MgSO4i rastvarači su evaporisani pod sniženim pritiskom. Sirovi materijal je dalje prečišćen na koloni hromatografijom (DCM/Metanol=90:10) što daje prinos od 418mg (prinos=38%) jedinjenja iz naslova.

MH+ = 421 (C19H26ClN5O2Si, Mr = 419,99)

1 H NMR (DMSO-d6, 500MHz): δ 13.35 (s, 1H); 7.70 (d, 1H); 7.46 (s, 1H); 7.23 (s, 1H); 7.08 (t, 1H); 6.58 (d, 1H); 5.59 (s, 2H); 3.58 (t, 2H); 3.34 (dq, 2H); 1.13 (t, 3H); -0.03 (3s, 9H).

Korak 6: 2-Amino-7-hloro-1-etil-3-[1-(2-trimetilsilanil-etoksimetil)-1H-imidazol-2-il]-1H-[1,8]naftiridin-4-on

[0029] 0.112 g (1 mmol) kalijum tert-butilata je dodato, u malim količinama, hladnom rastvoru na 0°C od 418 mg (1 mmol) međuproizvoda pripremljenog pod 1.53-(6-hloro-2-etilamino-iyridin-3-il)-3-hidroksi-2-[1-(2-(trimetilsilanil-etoksimetil)-1H-imidazol-2-il]-akrilonitrila u 5 ml anhidrovanog THF. Smeša je mešana tokom 48h na temperaturi okoline nakon čega je 50 ml zasićenog amonijum hlorid vodenog rastvora dodato, pH vrednost je podešena na 7 sa 2N HCl i reakciona smeša je ekstrahovana tri puta sa etil acetatom.

Kombinovane organske faze su osušene preko MgSO4 i rastvarači su evaporisani pod sniženim pritiskom kako bi se dobio prinos od 400 mg jedinjenja iz naslova.

Prinos = 38%

MH+ = 421 (C19H26ClN5O2Si, Mr = 419,99)

1 H NMR (DMSO-d6, 500MHz): δ 8.50 (d, 1 H); 8.03 (s, 1 H); 7.98 (s, 1 H); 7.78 (s, 2H); 7.60 (s, 1 H); 5.49 (s, 2H); 4.58 (q, 2H); 3.57 (t, 2H); 1.42 (t, 3H); 0.85 (t, 2H); -0.03 (3s, 9H).

Korak 7: (±)-2-Metil-but-3-ine-1,2-diol

[0030] Komercijalno dostupan 0.5 M rastvor etinilmagnezijum hlorid u tetrahidrofuranu je razređen sa 200 ml tetrahidrofurana i ohlađen do 0°C. Zatim je rastvor hidroksiacetona u 200 ml tetrahidrofurana dodat i smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 3 sata. Reakciona smeša je ohlađena i vodeni rastvor NH4C j j ekstrahovana 3 puta sa etil acetatom i organske faze su kombinovane, osušene preko natrijum sulfata, filtrirane, i koncentrovane pod vakuumom (približno 200 mbar). Konačno, 20 g očekivanog proizvoda je dobijeno u formi braon ulja, koje se koristi bez daljeg prečišćavanja (kvantitativni sirovi prinos) u racemskoj formi ili se može razdvojiti u čiste enantiomere preparativnom HPLC na hiralnoj HPLC koloni. U cilju dobijanja optički čistih enantiomera, odgovarajuća racemska smeša je izložena preparativnoj hromatografiji na hiralnoj stacionarnoj fazi (Chiralpak AD-H kolona, 250 x 21 mm, 5 mm) upotrebom, kao mobilne faze: ili CO2/2-propanol (70%/30%) sa protokom od 60 ml/min pri pritisku od 100 bar ili izoheksan/etanol (70/30) smeše sa 0.3% TFA i protokom 120 ml/min.

[0031] Nakon elucije i evaporacije, svaki enantiomer je izolovan, i hemijska čistoća i enantiomerska čistoća svakog je određena analitičkim metodama poznatim onima koji su stručni u ovoj oblasti.

Korak 8: 2-Amino-1-etil-7-((3R)-3-hidroksi-4-metoksi-3-metil-but-1-inil)-3-[1-(2-trimetilsilanil-etoksimetil)-1H-imidazol-2-il]-1H-[1,8]naftiridin-4-on

[0032] U reakcionoj boci ispunjenoj argonom 500 mg (1.2 mmol) 2-amino-7-hloro-1-etil-3-[1-(2-trimetilsilanil-etoksmetil)-1H-imidazol-2-il]-1H-[1,8]naftiridin-4-ona, 204 mg (1.8 mmol) (3R)-1-metoksi-2-metil-but-3-in-2-ola, 84 mg (0.120 mmol) bis(trifenilfosfin)paladijum (II) dihlorida, 30 mg (0.16 mmol) bakar (I) jodida, 2 ml DMF (degaziranog), 2ml trietilamina (degaziranog) je dodato i izloženo radijaciji u mikrotalasnoj pećnici na takav način da je reakciona smeša odražavana na 120°C tokom 24h. Rastvarači su evaporisani i čvrsta supstanca je ponovo suspendovana u 3 ml DMF i filtrirana. Filtrat je zatim prečišćen pomoću HPLC kako bi se dobio prinos od 430 mg (0.702 mmol) TFA soli jedinjenja iz naslova.

Prinos = 59%.

MH+ = 498.2 (C25H35N5O4Si, Mr =497,67).1 H NMR (DMSO-d6, 500MHz): δ 8.39 (d, 1 H); 7.95 (s, 1 H); 7.88 (s, 1 H); 7.60 (s, 2H); 7.48 (d, 1H); 5.25 (s, 2H); 4.50 (široki signal, 2H); 3.52 - 3.40 (široki signal, voden vrh 4H); 1.48 (s, 3H); 1.25 (t, 3H); -0.12 (3s, 9H).

Korak 9: 2-Amino-1-etil-7-((3R)-3-hidroksi-4-metoksi-3-metil-but-1-inil)-3-(1H-imidazol-2-il)-1H-[1,8]naftiridin-4-on

[0033] 240 mg (0.4 mmol) SEM zaštićenog naftiridinona 1.8 je rastvoreno na 0°C u 1.2 ml TFA i 1.2 ml DCM. Rastvor je ostavljen na 3-5°C preko noći dok analitički HPLC nije pokazao potpunu deprotekciju naftiridinona. Rastvor je ugašen dodavanjem ostatka vodenog NaHCO3rastvora. Smeša je zatim ekstra il acetatom. Kombinovane organske faze su osušene preko MgSO4i rastvarači su evaporisani pod sniženim pritiskom. Tako dobijeni sirovi materijal je prečišćen na silicijum dioksid gelu (DCM:MeOH = 4:1) kako bi se dobio prinos 143 mg (kvantitativni prinos) nezaštićenog jedinjenja.

MH+ = 368.2 (C19H21N5O3, Mr =367,41)

1H NMR (DMSO-d6, 500MHz): δ 13.15 (s, 1 H); 11.55 (b s, 1H); 8.59

(d, 1 H); 8.10 (b s, 1 H); 7.47 (d, 1 H); 7.25 (s, 1 H); 7.02 (s, 1 H); 5.85 (s, 1 H); 4.58 (široki signal, 2H); 3.51 - 3.370 (široki signal, vodeni vrh 4H); 1.48 (s, 3H); 1.25 (t, 3H)

Rt (analitički HPLC): 4.806 min

Primer 2:

2-Amino-7-((3R)3,4-dihidroksi-3-metil-but-1-inil)-1-etil-3-(1H-imidazol-2-il)-1,8-naftiridin-4(1H)-on

Korak 1: 2-Amino-1-etil-7-(3,4-dihidroksi-3-metil-but-1-inil)-1-etil-3-[1-(2-trimetilsilanil-etoksimetil)-1 H-imidazol-2-il]-1,8-naftiridin-4(1H)-on

[0034] Sledeća procedura prema koraku 8 Primera 1, upotrebom međuproizvoda dobijenog korakom 6 Primera 1 (2-amino-7-hloro-1-etil-3-[1-(2-trimetilsilanil-etoksmetil)-1H-imidazol-2-il-1,8-naftiridin-4(1H)-on) i korakom 7 Primera 1 ((±)-2-metil-but-3-ine-1,2-diol), jedinjenje iz naslova je dobijeno.

MH+ = 354.16 (C18H19N5O3, Mr = 353,38)

Rt (analitički HPLC): 4.48min

Korak 2: 2-Amino-1-etil-7-((3R)3,4-dihidroksi-3-metil-but-1-inil)-1-etil3-[1-(2-trimetilsilanil-etoksimetil)-1H-imidazol-2-il]-1,8-naftiridin-4(1H)-on

[0035] Racemsko jedinjenje dobijeno u koraku 1 izloženo je preparativnom Hiralnom SFC prečišćavanju, upotrebom metoda, Berger prep SFC, UV detekcija pri 230nm, stacionarna faza Chiralpak IC 20x 250nm 5µm, mobilna faza 65%/ 35% CO2/ (MeOH à.5% izopropilamin), 50 ml/min, 100 rešetki) dovedeno je do razdvajanja R i S enantiomera.

[0036] Hiralna čistoća je kontrolisana upotrebom Hiralnih SFC metoda, Berger SFC, UV detekcija pri 210nm, stacionarna faza Chiralpak AD-H (250mmx4.6) 5µm, mobilna faza 65/ 35% CO2/ (izopropanol 0.5% izopropilamin), 2.4 ml/min, 100 rešetki. R enantiomer (Rt= 6.9 min, enantiomerska čistoća = 97.9 %)

Korak 3: 2-Amino-7-((3R)3,4-dihidroksi-3-metil-but-1-inil)-1-etil-3-(1H-imidazol-2-il)-1,8-naftiridin-4(1H)-on

[0037] Sledeći postupak prema koraku 9 Primera 1, jedinjenje iz Primera 2 je izolovano kao žuti prah.

MH+ = 354.16 (C18H19N5O3, Mr = 353,38)

Rt= 0.77 min

1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ 13.15 (s, 1H); 11.55 (bs, 1H); 8.55 (d, 1H, J= 6.4Hz); 8.10 (bs, 1H); 7.47 (d, 1H, J= 6.4Hz); 7.15 (s, 1H); 7.02 (s, 1H); 5.6 (s, 1H); 5.1 (t, 1H, J= 6.4Hz) 4.53 (bd, 2H); 3.49 (dd, 1H, J= 6.4; 10.4 Hz); 3.41 (dd, 1 H, J= 6.4; 10.4 Hz)1.48 (s, 3H); 1.27 (t, 3H, J= 7.2Hz).

Hiralna čistoća je kontrolisana upotrebom Hiralnih SFC metoda, Berger SFC, UV detekcija pri 230 nm, stacionarna faza Chiralpak AD-H (250mmx4.6) 5µm, mobilna faza 60/ 40% CO2/ (izopropanol 0.5% izopropilamin), 2.4 ml/min, 100 rešetki.

R enantiomer (Rt= 8.37 min, enantiomerska čistoća = 99.2%)

Analitička metoda LC/UV/MS detekcije vremena zadržavanja (Rt)

[0038]

Kolona: Merk Chromolith performance RP18e, 100 x 4.6 mm, 3.5 µm

Rastvarač A: H2O/TFA (99.9/0.1)

Rastvarač B: ACN/TFA (99.9/0.1)

Protok: 2 ml/min

Gradijent (A/B): 98/2 (0 min) do 0/100 (8 min) do 98/2 (10 min)

Detekcija: 254.16 nM

NMR

[0039] 1 H NMR spektra dobijeno je upotrebom NMR spektometara Bruker 250, 300, 400 ili 600 MHz u DMSO-d6, upotrebom vrha DMSO-d5 kao unutrašnje reference. Hemijske promene δ su izražene u delovima po milionu (ppm).

Posmatrani signali su izraženi kao što sledi: s = singlet; d = dublet; t = triplet; q = kvadriplet; m = multiplet ili veliki singlet; br = širok; H = proton.

Tačke topljenja

[0040] Tačka topljenja je izmerena sa Kofler bench.

Farmakološko testiranje

I. In vitro evaluacija jedinjenja iz Primera 1

[0041] '145 prijava obelodanjuje da jedinjenja iz Primera 1 i 2 inhibiraju rekombinantnu VEGFR-3 TK aktivnost i autofosforilacij j a IC50 oko 25nM i 47 nM, respektivno. U istim testovima, jedinjenje iz Primera 1 je izrazilo manju aktivnost na VEGFR-2 (90nM-140nM) i na VEGFR-1 (>1µM). Upotrebom primarnih limfnih ćelija smo potvrdili visoku aktivnost prema VEGFR-3, kako inhibira VEGFC- i VEGFD-uzrokovanu proliferaciju sa IC50 i oko 10-15nM. Štaviše, demonstrirali smo da je jedinjenje iz Primera 1 visoko selektivno za VEGFR-3 u poređenju sa svim ostalim kinazama (85 različitih kinaza) i sa 107 receptora, enzima i jonskih kanala.

II. In vivo evaluacija jedinjenja iz Primera 1 u hepatokarcinom lsenograft modelu miševa.

[0042] In vivo anti-tumor efikasnost jedinjenja iz Primera 1 u HepG2 ćelijskoj liniji ortotopskog ksenograft modela je procenjena. HepG2 ćelije su injektirane u jetru SCID miševa (dobijenih iz ATCC) i miševi su nasumično podeljeni u 2 grupe 14 dana nakon injektiranja ćelijama: kontrolna grupa tretirana sa nosiocem i jedinjenjem iz Primera 1-tretirana grupa. Tretiranje je izvršeno jednom dnevno sa 100mg/kg u metil celulozi tvin kao nosiocu.

[0043] Veličina tumora je merena dodavanjem mase na levi režanj sa tumorom 28. dana. Tretiranje sa jedinjenjem iz Primera 1 je značajno smanjilo srednju masu režanja jetre koji nosi tumor 28. dana nakon injektiranja sa ćelijama 34% (p=0.001, Studentski t-test).

Normalni režanj jetre je takođe meren i izveden iz režnja miševa koji imaju tumor. U tim slučajevima jedinjenja iz Primera 1 su smanjila masu tumora za 62%. (Videti Sliku 1).

III. In vivo evaluacija jedinjenja iz Primera 1 kod hemijski-uzrokovanih hepatokarcinoma kod miševa

[0044] DEN (N-dietinitrosamin)-uzrokovani model kod miševa je potvrđen kao reprezentativni model za ljudski HCC Wu et al. J. Cancer Res. Clin. Oncol. (2009) 135.969-981; Chuang et al. Carcinogenesis (2000) 21 ;331-335).

[0045] Inicijacija tumora je postignuta jednom intraperitonealnom injekcijom od 10mg/kg N-dietilnitrosamina (DEN) kod mužjaka C3H miševa (Charles river laboratories France) pri starosti od 5 nedelja.

[0046] Miševi su razvili tumor u jetri od 7. meseca nakon DEN davanja ali je učestalost dostigla 100% u 12. mesecu. Jedinjenje iz Primera 1 je dnevno davano P.O. (oralno) nakon suspenzije u metil celulozi tvinu, između 10. i 12. meseca nakon davanja DEN.

[0047] Masa je procenjena svake nedelje tokom tretiranja i 12. meseca. Miševi su ubijeni prekomernom dozom natrijum pentobarbitala, i jetre su uklonjene i izmerene. Broj tumora po jetri je izbrojan i zapremina tumora je izmerena sa kaliperom. Zapremina tumora V je izračunata upotrebom formule V=0.52 x a<2>x b, gde "a" predstavlja najmanje prečnik tumora i "b" najveći prečnik tumora.

[0048] Kasno tretiranje sa jedinjenjem iz Primera 1 je sprečilo formiranje novih lokusa i potpuno blokiralo razvoj tumora u poređenju sa istim parametrima u 10. mesecu. U poređenju sa grupom nosioca, jedinjenje iz Primera 1 je smanjilo za 50% broj tumora/jetri i za 85% ukupnu zapreminu tumora. Takođe je smanjilo i skoro normalizovalo ukupnu masu jetre (videti Sliku 2).

Claims (5)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje prema formuli (I),

   gde je R metoksi ili hidroksil grupa, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu pri lečenju hepatocelularnog karcinoma.
2. 2. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je R metoksi grupa.
3. 3. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je R hidroksil grupa.
4. 4. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1 ili 2, koje je 2-amino-1-etil-7-((3R)-3-hidroksi-4-metoksi-3-metil-but-1-inil)-3-(1H-imidazol-2-il)-1H-[1,8]-naftiridin-4-on.
5. 5. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1 ili 3, koje je 2-amino-7-((3R)3,4-dihidroksi-3-metil-but-1-inil)-1-etil-3-(1H-imidazol-2-il)-1,8-naftiridin-4(1H)-on.