RS56229B1 - Postupak za kristalizaciju (s)-izopropil 2-(((s)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata - Google Patents

Description

Prioritet

Ova patentna prijava zahteva prioritet od američke patentne prijave pod brojem 63/319,513, koja je podneta 31. marta 2010, američke patentne prijave pod brojem 61/319,548, koja je podneta 31. marta 2010, i američke patentne prijave pod brojem 12/783,680, koja je podneta 20. maja 2010.

Oblast pronalaska

Pronalazak se odnosi na nukleozid fosforamidate i njihovu primenu u smislu agenasa za lečenje virusnih oboljenja. Ova jedinjenja su inhibitori RNK-zavisne RNK virusne replikacije i korisna su kao inhibitori HCV NS5B polimeraze, kao inhibitori HCV replikacije i za lečenje infekcije virusom hepatitisa C kod sisara.

Stanje tehnike

Hepatitis C virusna (HCV) infekcija je težak zdravstveni problem koji dovodi do hroničnih oboljenja jetre kao što su ciroza i hepatocelularni karcinom, kod većine obolelih, što je procenjeno na 2-15% svetske populacije. Samo u Sjedinjenim Državama procenjuje se da ima 4.5 milliona zaraženih jedinki, prema SAD Centru za kontrolu bolesti. Prema Svetskoj Zdravstvenoj Organizaciji, ima preko 200 milliona zaraženih osoba širom sveta, a najmanje 3 do 4 miliona oboli godišnje. Nakon infekcije ko 20% zaraženih se izleči od od virusa dok ostatak može da nosi HCV celog života. Deset do dvadeset procenata hronično zaraženih osoba na kraju ipak razvije cirozu koja uništava jetru ili dobiju kancer. Virusno oboljenje se prenosi parentalno zaraženom krvlju i krvnim produktima, putem zaraženih igala ili putem polnih odnosa i vertikalno, sa zaraženih majki ili majke nosioca na potomstvo. Trenutno lečenje HCV infekcije, je ograničeno na imunoterapiju samo sa rekombinantnim interferonom -α ili u kombinaciji sa nukleozidnim analogom ribavirinom, ima ograničenu kliničku korist. Štaviše, ne postoji uspostavljena vakcina za HCV. Prema tome, postoji hitna potreba za boljim terapijskim sredstvima koji će biti uspešni u borbi protiv hronične HCV infekcije.

HCV virus je RNK virus pozitivnog lanca sa omotačem sa jednom oligoribonukleotidnom genskom sekvencom od oko 9600 baza koje kodiraju poliprotein od oko 3,010 amino kiselina. Proteinski produkti HCV gena se sastoji iz strukturalnih proteina C, E1, i E2, i nestrukturalnih proteina NS2, NS3, NS4A i NS4B, i NS5A i NS5B. Veruje se da nestrukturalni (NS) proteini obezbeđuju katalitičku mašineriju za virusnu replikaciju. NS3 proteaza oslobađa NS5B, RNK-zavisne RNK polimeraze poliproteinskog lanca. HCV NS5B polimeraza je potrebna radi sintetisanja dvolančane RNK od jednolančane viralne RNK koja služi kao šablon u cilklusu replikacije HCV. Stoga, NS5B polimeraza se smatra esencijalnom komponentom u HCV replikacijskom kompleksu (K. Ishi, et al, Heptology, 1999, 29: 1227-1235; V. Lohmann, et al., Virology, 1998,249: 108-118). Inhibicija HCV NS5B polimeraze sprečava formiranje dvolančane HCV RNK i stoga predstavlja primamljiv pristup za razvijanje specifičnih HCV antivirusnih terapija.

HCV pripada mnogo većoj porodici virusa koje imaju mnoštvo zajedničkih osobina.

Flaviviridae Virusi

Familija Flaviviridae virusa sadrži najmanje tri različita roda: pestivirusi, koji uzrokuju oboljenja kod goveda i svinja; flavivrusi, koji su glavni uzrok oboljenja kao što je Denga groznica i Žuta groznica; i hepacivirusi, čiji jedini član je HCV. Rod flavivirusa uključuje preko 68 članova podeljenih na grupe na osnovu serološke povezanosti (Calisher et al., J. Gen. Virol, 1993,70,37-43). Klinički simptomi se razlikuju i uključuju groznicu, encefalitis i hemoragičnu groznicu (Fields Virology, Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M., i Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, 1996, Poglavlje 31, 931-959). Flavi virusi od globalnog interesa koji su povezani sa oboljenjem kod ljudi uključuju Denga virus hemoragične groznice (DHF), virus Žute groznice, šok sindrom i šok sindrom japanskog encefalitisa kao i virus japanskog encefalitisa (Halstead, S. B., Rev. Infect. Dis., 1984,6, 251-264; Halstead, S. B., Science, 239:476-481, 1988; Monath, T. P., New Eng. J. Med, 1988, 319, 641-643).

Rod pestivirus podrazumeva virus viralne diareje kod goveda (BVDV), klasični svinjski groznični virus (CSFV, takođe poznat pod nazivom virus svinjske kolere) i virus granične bolesti (BDV) kod ovaca (Moennig, V. et al. Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). Pestivirus infekcija kod domaćih životinja (stoka, svinje i ovce) uzrokuje značajan ekonomski gubitak širom sveta. BVDV izaziva oboljenja sluzokože kod goveda i od velikog je ekomnomskog značaja u stočarstvu. (Meyers, G. i Thiel, H.J., Advances in Virus Research, 1996, 47, 53-118; Moennig V., et al, Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). Humani pestivirusi nisu u tolikoj meri okarakterisani kao što su životinjski. Međutim, serološka ispitivanja ukazuju na znatnu izloženost ljudi pestivirusima.

Pestivirusi i hepacivirusi su usko povezane grupe virusna u okviru familije Flaviviridae. Ostali virusi koji su usko povezani sa ovom familijom podrazumevaju GB virus A, GB virus A-slične agente, GB virus-B i GB virus -C (takođe nazivan virus hepatitisa G, HGV). Grupa hepacivirusa (virus hepatitisa C; HCV) se sastoji od određenog broja usko povezanih ali genotipski različitih virusa koji inficiraju ljude. Postoji najmanje 6 HCV genotipa i više od 50 podtipova. Zbog sličnosti između pestivirusa i hepacivirusa, u kombinaciji sa slabom mogućnosti da hepacivirusi efikasno rastu u ćelijskoj kulturi, kao surogat u izučavanju HCV virusa se često koristi virus viralne diareje kod goveda (BVDV).

Genetska organizacija pestivirusa i hepacivirusa je veoma slična. Pozitivni RNK virusi poseduju otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira sve viralne proteine potrebne za replikaciju virusa. Ovi proteini su ekspresovani kao poliprotein odnosno koji je tokom i posle translacije modifikovan kako ćelijskim tako virusom kodiranim proteinazama kako bi se dobili zrenli viralni proteini. Viralni proteini koji su odgovorni za replikaciju viralnog genoma RNK su locirani u blizini karboksi-kraja. Dve trećine ORF se nazivaju nestrukturalni (NS) proteini. Genetska organizacija i obrada poliproteina nestrukturalne porcije proteina ORFa za pestiviruse i hepaciviruse je veoma slična. U oba slučaja, i za pestiviruse i za hepaciviruse, zreli nestrukturalni (NS) proteini, u sekvencijalnom redu od amino kraja kodirajućeg dela nestrukturnog proteina do karboksi-kraja ORF-a, sastoje se iz p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, i NS5B.

NS proteini pestivirusa i hepacivirusa dele sekvencione domene koji su karakteristični za pojedine funkcije proteina. Na primer, NS3 proteini virusa u obe grupe poseduju motive sekvenci amino kiselina koji su karakterištični za proteinaze i helikaze (Gorbalenya et al., Nature, 1988, 333, 22; Bazan i Fletterick Virology, 1989, 171, 637-639; Gorbalenya et al., Nucleic Acid Res., 1989, 17, 3889-3897). Slično, NS5B proteini pestivirusa i hepacivirusa imaju motive karakteristične za RNK-usmerenu RNK polimerazu (Koonin, E.V. i Dolja, V.V., Crir. Rev. Biochem. Molec. Biol.1993, 28, 375-430).

Stvarne uloge i funkcije NS proteina pestivirusa i hepacivirusa u životnom ciklusu virusa su direktno analogne. U oba slučaja, NS3 serin proteinaza je odgovorna za protoelitičke procese poliproteinskog perkursora nizvodno od njegove pozicije u ORF (Wiskerchen i Collett, Virology, 1991, 184, 341-350; Bartenschlager et al., J. Virol.1993, 67, 3835-3844; Eckart et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993,192, 399-406; Grakoui et al., J. Virol. 1993, 67, 2832-2843; Grakoui et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 1993, 90, 10583-10587; Hijikata et al., J. Virol. 1993, 67, 4665-4675; Tome et al., J. Virol., 1993, 67, 4017-4026). NS4A protein, u oba slučaja, deluje kao kofaktor sa NS3 serin proteazom (Bartenschlager et al., J. Virol. 1994, 68, 5045-5055; Failla et al., J. Virol. 1994, 68, 3753-3760; Xu et al., J. Virol., 1997, 71:5312-5322). NS3 protein oba virusa takođe funkcioniše kao helikaza (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995, 215, 160-166; Jin i Peterson, Arch. Biochem. Biophys 1995, 323, 47-53; Warrener i Collett, J. Virol.1995, 69,1720-1726). Konačno, NS5B proteini pestivirusa i hepacivirusa imaju predviđenu RNK-zavisnu RNK polimeraznu aktivnost (Behrens et al., EMBO, 1996, 15, 12-22; Lechmann et al., J. Virol., 1997, 71, 8416-8428; Yuan et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997, 232, 231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong et al, J. Virol., 1998, 72, 9365-9369).

Trenutno, postoje ograničene mogućnosti lečenja za jedinke zaražene virusom hepatitisa C. Trenutno dozvoljena terapeutska opcija je korišćenje imunoterapije samo sa rekombinatnim interferonom-α ili u kombinaciji sa nukleozidnim analogom ribavirinom. Ova terapija je ograničena u svojoj kliničkoj efikasnosti i samo 50% lečenih pacjenata reaguje na terapiju. Stoga, postoji značajna potreba za efikasnijim i novim terapijama kako bi se pristupilo neispunjenim medicinskim potrebama koje uzrokuje infekcija virusom hepatitisa C.

Broj potencijalnih molekularnih ciljeva za razvoj leka direktnog antivirusnog delovanja kao anti -HCV terapije je sada identifikovano uključujući, ali ne ograničavajući na, NS2-NS3 autoproteazu, N3 proteazu, N3 helikazu i NS5B polimerazu. RNK-zavisna RNK polimeraza je apsolutno neophodna za replikaciju jednolančanog, pozitivnog, RNK genoma i ovaj enzim je izazvao značajno interesovanje među medicinskim hemičarima.

Inhibitori HCV NS5B kao potencijalne terapije za HCV infekciju su pregledani: Tan, S.-L., et al., Nature Rev. Drug Discov., 2002, 1, 867-881; Walker, M.P. et al., Exp. Opin. Investigational Drugs, 2003, 12, 1269-1280; Ni, Z-J., et al., Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2004, 7, 446-459; Beaulieu, P. L., et al., Current Opinion in Investigational Drugs, 2004, 5, 838-850; Wu, J., et al., Current Drug Targets-Infectious Disorders, 2003, 3, 207-219; Griffith, R.C., et al, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 2004, 39, 223-237; Carrol, S., et al., Infectious Disorders-Drug Targets, 2006, 6, 17-29.

Potencijal za pojavu rezistentnih HCV lanaca i potreba da se identifikuju agensi sa širokom pokrivenošću podržavanja genotipa i podržava potrebu za nastavljanje napora da se identifikuje novi i efikasniji nukleozidi kao HCV NS5B inhibitori.

Nukleozidni inhibitori NS5B polimeraze mogu delovati bilo kao neprirodni supstrat koji rezultira terminacijom lanca ili kao kompetitivni inhibitor koji se takmiči sa nukleotidnim vezivanjem za polimerazu. Da bi funkcionisao kao terminator lanca analogni nukleozid mora biti preuzet od ćelije i konvertovan in vivo u trifosfat kako bi se takmičio za polimerazno nukleotidno mesto vezivanja. Ova konverzija u trifosfat je obično posredovana ćelijskim kinazama koje daju dodatne strukturalne zahteve potencijalnom inhibitoru nukleozidne polimeraze. Nažalost, ovo ograničava direktnu evaluaciju nukleozida kao inhibitora HCV replikacije na ćelijski bazirane testove sposobne za in situ fosforilaciju.

U nekim slučajevima, biološka aktivnost nukleozida je otežana lošim osobinama supstrata za jednu ili više kinaza koje su potrebne za konverziju do aktivnog trifosfatnog oblika. Formiranje monofosfata nukleozidnom kinazom se obično posmatra kao ograničavajući korak brzine dešavanja tri fosforilacije. Da bi se zaobišla potreba za korakom inicijalne fosforilacije u metabolizmu od nukleozida do aktivnog analoga trifosfata, saopštena je priprema stabilnog fosfatnog proleka. Nukleozidni fosforamidatni prolekovi se prikazani kao prekursori aktivnog nukleozid trifosfata i da inhibiraju replikaciju virusa kada se primene na ćelijama koje su inficirane virusom (McGuigan, C., et al., J. Med. Chem., 1996, 39, 1748-1753; Valette, G., et al., J. Med. Chem., 1996, 39, 1981-1990; Balzarini, J., et al., Proc. National Acad Sci USA, 1996, 93, 7295-7299; Siddiqui, A. Q., et al., J. Med. Chem., 1999,42,4122-4128; Eisenberg, E. J., et al., Nucleosides, Nucleotides i Nucleic Acids, 2001, 20, 1091-1098; Lee, W.A., et al., Antimicrobial Agents i Chemotherapy, 2005, 49, 1898); US 2006/0241064; i WO 2007/095269.

Takođe ograničavajuće za primenu nukleozida kao živih terapijskih sredstava su njihove, ponekada, slabe fizičkohemijske i farmakokinetičke osobiname. Ove slabe osobine mogu da ograniče intestinalnu apsorpciju angenasa i da ograniče pre uzimanje u ciljno tkivo ili ćeliju. Kako bi se poboljšale njihove osobine koriste se prolekovi nukleozida. Pokazalo se da primena nukleozid fosforamidata poboljšava sistemsku apsorpciju nukleozida i dalje, fosforamidat grupa ovih "pronukleotida" je maskirana neutralnim lipofilnim grupama kako bi se dobio odgovarajući udeoni koeficijent particije kako bi se optimizovalo uzimanje i prenos u ćeliju dramatično poboljšavajući intraćelijsku koncentraciju analoga nukleozid monofosfata u odnosu na osnovni nukleozid. Hidroliza ostatka estra posredovanjem enzima fosforne kiseline proizvodi nukleozid monofosfat gde je inicijalna fosforilacija koja je ograničavajuća u smislu brzine, nepotrebna. U tom cilju, Prijava Patenta u SAD-u sa brojem 12/053,015, koja odgovara svetskoj prijavi patenta sa brojem WO 2008/121634 i US 2010/0016251, stavlja na uvid javnosti određen broj nukleozidnih prolekova fosforamidata, od kojih mnogi pokazuju aktivnost u HCV. Nekoliko jedinjenja stavljenih na uvid javnosti u Patentnoj prijavi u SAD-u US 2010/0016251 je testirano kao potencijalni klinički kandidati za odobrenje od strane FDA.

PCT prijava PCT/LTS2010/035641 stavlja na uvid javnosti nukleozidne fosforamidate, i postupke za njihovo pripremanje, koji su inhibitori RNK-zavisne 5 RNK virusne replikacije i korisni su kao inhibitori HCV NS5B polimeraze, kao inhibitori HCV replikacije i za lečenje infekcije hepatitisa C kod sisara.

PCT prijava PCT/LTS2011/030767 stavlja na uvid javnosti purin fosforamidat kao i njegove hidrate u kristalnom ili nalik kristalnom obliku.

Rezime pronalaska

U skladu sa predmetnim pronalaskom, obezbeđen je postupak za pripremanje kristalnog (S)-izopropil 2-(((S) perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata predstavljen formulom

koja sadrži:

kristalizaciju (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi) (fenoksi)fosforil)amino)propanoata od druge kompozicije

a) prva kompozicija;

b) pentafluorofenol;

c) ne-nukleofilnu baza; i

d) tečna kompozicija;

gde prva kompozicija sadrži (S)-izopropil 2-(((S) (perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat i (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat i gde tečna kompozicija sadrži makar jedan rastvarač i anti-rastvarač, navedeni (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat, što je korisno u pripremi jedinjenja formule 4 i odgovarajućih diastereomera na bazi fosfora, predstavljenih formulama Sp-4 i Rp-4.

Poželjni prikazi predmetnog pronalaska su navedeni u zavisnim patentnim zahtevima od priloženog seta patentnih zahteva.

Kratak opis nacrrta

Slika 1. Visoke rezolucije XRD difraktograma 4.

Slika 2. Visoke rezolucije XRD difraktograma RP-4.

Slika 3. Visoke rezolucije XRD difraktograma SP-4 (Oblik 1).

Slika 4. Visoke rezolucije XRD difraktograma SP-4 (Oblik 1).

Slika 5. Visoke rezolucije XRD difraktograma SP-4·CH2Cl2 (Oblik 2).

Slika 6. Visoke rezolucije XRD difraktograma SP-4·CHCl3(Oblik 3).

Slika 7. Visoke rezolucije XRD difraktograma SP-4 (Oblik 4).

Slika 8. Visoke rezolucije XRD difraktograma SP-4 (Oblik 5).

Slika 9. Visoke rezolucije XRD difraktograma SP-4 (amorfni).

Slika 10. Rendgenski zraci kristalne strukture za SP-4 (Oblik 1)

Slika 11. Rendgenski zraci kristalne (izotropske) strukture za SP-4·CH2Cl2 (Oblik 2) Slika 12. Rendgenski zraci kristalne (neizotropske) strukture za SP-4·CH2Cl2 (Oblik 2)

Slika 13. Rendgenski zraci kristalne strukture za SP-4·CHCl3(Oblik 3)

Slika 14. FT-IR spektar od 4.

Slika 15. FT-IR spektar od RP-4.

Slika 16. FT-IR spektar od SP-4.

Slika 17. TGA i DSC analiza za 4.

Slika 18. TGA i DSC analiza za RP-4.

Slika 19. TGA i DSC analiza za SP-4.

Slika 20A. Rendgenski zraci kristalne strukture za 8 (SP-izomer) (molekul br. 1 asimetrične jedinice).

Slika 20B. Rendgenski zraci kristalne strukture za 8 (SP-izomer) (molekul br. 2 asimetrične jedinice).

Slika 21. XRD difraktogram visoke rezolucije SP-4 (Oblik 6).

Slika 22A. Rendgenski zraci kristalne strukture za (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat (molekul br. 1 asimetrične jedinice).

Slika 22B. Rendgenski zraci kristalne strukture za (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat (molekul br. 2 asimetrične jedinice).

Detaljan opis pronalaska

Definicije

Reč “neki” kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više subjekata; na primer, neko jedinjenje se odnosi na jedno ili više jedinjenja ili bar na jedno jedinjenje. Kao takvi, termini ”neki”, “jedan ili više” i “bar jedan” će dalje biti naizmenično korišćeni.

Termin “po izboru” kako se ovde koristi, znači da nadalje opisan događaj ili okolnost može ali i ne mora da se desi, i da opis sadrži instance gde će se događaj ili okolnost odigrati i instance u kojima neće. Na primer, “veza po izboru” znači da ta veza može i ne mora da bude prisutna, i da opis uključuje jednogubu, dvogubu ili trogubu vezu.

Termin "P*" znači da je je atom fosfora hiralni i da ima odgovarajuću Kan-Ingold-Prelog dezignaciju "R" ili "S" koji imaju svoja jednostavna prihvaćena značenja. ;Termin "prečišćeni," kako je ovde opisan, odnosi se na čistoću datog jedinjenja. Na primer, neko jedinjene je "prečišćeno" kada je dato jedinjenje veliki sastavni deo kompozicije, tj. bar 50% w/w čistoće. Tako, "prečišćeno" obuhvata najmanje 50% w/w čistoće, najmanje 60% w/w čistoće, najmanje 70% čistoće, najmanje 80% čistoće, najmanje 85% čistoće, najmanje 90% čistoće, najmanje 92% čistoće, najmanje 94% čistoće, najmanje 96% čistoće, najmanje 97% čistoće, najmanje 98% čistoće, najmanje 99% čistoće, najmanje 99.5% čistoće, i najmanje 99.9% čistoće, gde "suštinski čist" obuhvata najmanje 97% čistoće, najmanje 98% čistoće, najmanje 99% čistoće, najmanje 99.5% čistoće, i najmanje 99.9% čistoće. ;Termin "metabolit," kako je ovde opisano, odnosi se na jedinjenje proizvedeno in vivo nakon administracije subjektu kome je to potrebno. ;Termin "približno" (takođe predstavljen znakom ~) znači da je navedena numerička vrednost deo opsega koji varira u okviru standardne eksperimntalne greške. ;Izraz "suštinski kako je prikazano u…..." određeni XRPD obrazac znači da maksimalne vrednosti prikazane u XRPD obrascu su suštinski iste, u okviru vizualnog pregleda (± 0.2 °2θ). Prosečan stručnjak u oblasti tehnike razume da intenziteti mogu da variraju u zavisnosti od uzorka. ;Termin "suštinski anhidrovan" znači da supstanca ne sadrži više od 10% mase vode, poželjno ne više od 1% mase vode, poželjnije ne više od 0.5% mase vode, i najpoželjnije 0.1% mase vode. ;Rastvarač i anti rastvarač (kao što je korišćeno u reakcijama, kristalizaciji, itd. ili rešetke i/ili apsorbovani rastvarači) uključuje bar jedan od C1 do C8 alkohol, C2 do C8 etar, C3 do C7 ketona, C3 do C7 estra, C1 do C2 hlorovani ugljenik C2 do C7 nitrila, raznovrsni rastvarači, C5do C12zasićenog ugljovodonika, i C6do C12aromatični ugljovodonik. ;C1 do C8 alkohol se odnosi na ravan/razgranat i/ili cikličan/acikličan alkohol koji ima takav broj ugljenika. C1do C8alkohol sadrži, ali nije ograničeno na, metanol, etanol, npropanol, izopropanol, izobutanol, heksanol, i cikloheksanol. ;C2 do C8 etar se odnosi na ravan/razgranat i/ili cikličan/acikličan etar koji ima takav broj ugljenika. C2do C8etar sadrži, ali nije ograničen na, dimetil ethar, dietil etar, diizopropil etar, di-n-butil etar, metil-t-butil etar (MTBE), tetrahidrofuran, i dioksan. ;C3 do C7 ketoni se odnose na ravne/razgrante i/ili ciklične/aciklične ketone koji imaju takav broj ugljenika. C3do C7ketona sadrže, ali nisu ograničeni na, aceton, metil etil keton, propanon, butanon, metil izobutil keton, metil butil keton, i cikloheksanon. ;C3 do C7 estri se odnose ravne/razgranate i/ili ciklične/aciklične estre koji imaju takav broj ugljenika. C3do C7estri sadrže, ali nisu ograničeni na, etil acetat, propil acetat, n-butil acetat, itd. ;C1 do C2 hlorovani ugljenik se odnosi na hlorovani ugljenik koji ima takav broj ugljenika. C1 do C2 hlorovanog ugljenika sadrži, ali nije ograničen na, hloroform, metilen hlorid (DCM), ugljenik tetrahlorid, 1,2-dihloroetan, i tetrahloroetan. ;C2 do C7 nitril se odnosi na nitril koji ima toliki broj ugljenika. C2 do C7 nitril sadrži, ali nije i ograničen na, acetonitril, propionitril, itd. ;Raznovrsni rasvarač se odnosi na rastvarač koji je obično korišćenn u organskoj hemiji, što uključuje, ali nije ograničen na, dietilen glikol, diglim (dietilen glikol dimetil etar), 1,2-dimetoksi-etan, dimetilformamid, dimetilsulfoksid, etilen glikol, glicerin, heksametilfsforamid, heksametilfosfor triam, N-metil-2-pirolidinon, nitrometan, piridin, trietil amin, i sirćetnu kiselinu. ;Termin C5 do C12 zaisićeni ugljovodonik se odnosi na ravan/razgranat i/ili ciklični/aciklični ugljovodonik. C5 do C12 zasićeni ugljovodonik sadrži, ali nije i ograničen na, n-pentan, petroleum etar (ligroin), n-heksan, n-heptan, cikloheksan, i cikloheptan. ;Termin C6do C12aromatični se odnosi na supstituisane i nesupstituisane ugljovodonike koji imaju fenil grupu za svoj osnov. Preferirani ugljovodonici sadrže benzen, ksilen, toluen, hlorobenzen, o-ksilen, m-ksilen, p-ksilen, ksilene, sa tim da je toluen najpoželjniji. ;Termin “halo" ili "halogen" kako se ovde koristi, sadrži hloro, bromo, jodo i fluoro. ;Termin "zaštitna grupa" se odnosi na hemijsku grupu koja ispoljava sledeće osobine. "Grupa" proističe iz "zaštitnog jedinjenja." Grupe koje su selektivne za primarne hidroksile u odnosu na sekundarne hidroksile koji mogu da budu stavljeni pod konzistentne uslove sa stabilnošću fosforamidata (pH 2-8) i da pruže na dobijeni proizvod bitno drugačija fizička svojstva dozvoljavajući lakše odvajanje 3'-fosforamidat-5'-nova grupa proizvoda od neizreagovanog željenog jedinjenja. Grupa mora da reaguje selektivno sa dobrim prinosom kako bi dala zaštićeni substrat koji je stabilan prema projektovanim reakcijama (v. Protective Groups in Organic Synthesis, 3nd ed. T. W. Greene i P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1999). Prvi u grupi sadrže, ali nisu i ograničeni na: benzoil, acetil, fenilsubstituent benzoil, tetrahidropiranil, tritil, DMT (4,4'-dimetoksitritil), MMT (4-monometoksitritil), trimetoksitritil, piksil (9-fenilksanten-9-il) grupa, tiopiksil (9-feniltioksanten-9-il) ili 9-(p-metoksifenil)ksantin-9-il (MOX), itd.; C(O)-alkil, C(O)Ph, C(O)aril, CH2O-alkil, CH2O-aril SO2-alkil, SO2-aril, tert-butildimetilsilil, tert-butildifenilsilil. Acetali, kao što su MOM ili THP i slični se uzimaju u obzir kao moguće grupe. Fluorisana jedinjenja su takođe razmatrana utoliko da mogu da se vežu za jedinjenje i da mogu selektivno da se uklone tako što će prolaziti kroz fluorisan medijum za ekstrakciju čvrste faze (FluoroFlash<®>). Poseban primer sadrži fluorisani tritil analog, tritil analog 1-[4-(1H,1H,2H,2H-perfluorodecil)fenil)-1,1-difenilmetanol. Drugi fluorisani analozi tritil-a, BOC, FMOC, CBz, itd. su takođe u razmatranju. Sulfonil hloridi isto kao p-toluensulfonil hlorid mogu selektivno da reaguju na 5' poziciji. Estri mogu da se formiraju selektivno kao što su acetati i benzoati. Dikarboksilni anhidridi kao što je anhidrid ćilibarne kiseline i njeni derivati mogu da se koriste za stvaranje estarske veze sa slobodnom karboksilnom kiselinom, takvi primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, oksalil, malonil, sukcinil, glutaril, adipil, pimelil, superil, azelail, sebacil, ftalil, izoftalil, tereftalil, itd. Slobodna karboksilna kiselina dramatično povećava polarnost i isto tako može da se koristi za izdvajanje reakcionog proizvoda u blago bazne vodene faze kao što su rastvori natrijum bikarbonata. Fosforamidatna groupa je relativno stabilna u kiseloj sredini, tako da grupe koje zahtevaju kisele reakcione uslove, kao što su, tetrahidropiranil, takođe mogu da se koriste. ;Termin "zaštitna grupa" koji je izveden iz "zaštitno jedinjenje," ima svoje prosto i jednostavno značenje, t.j., najmanje jedna zaštitna ili blokirajuća grupa je povezana sa najmanje jednom funkcionalnom grupom (n.p.r, -OH, -NH2, itd.) što omogućuje hemijsku modifikaciju najmanje jedne druge funkcionalne grupe. Primeri zaštitne grupe, sadrže, ali nisu i ograničeni na, benzoil, acetil, fenil-supstituisani benzoil, tetrahidropiranil, tritil, DMT (4,4'-dimetoksitritil), MMT (4-monometoksitritil), trimetoksitritil, piksil (9-fenilksanten-9-il) grupa, tiopiksil (9-feniltioksanten-9-il) ili 9-(p-metoksifenil)ksantin-9-il (MOX), itd.; C(O)-alkil, C(O)Ph, C(O)aril, C(O)O(niži alkil), C(O)O(niži alkilen)aril (npr.,-C(O)OCH2Ph), C(O)Oaril, CH2O-alkil, CH2O-aril, SO2-alkil, SO2-aril, zaštitna grupa koja sadrži baj jedan atom silicijuma, kao što je, terc-butildimetilsilil, terc-butildifenilsilil, Si(niži alkil)2OSi(niži alkil)2OH (kao što je, -Si(<i>Pr)2OSi(<i>Pr)2OH. ;Termin "zaštitno jedinjene," koje se ovde koristi i ukoliko nije definisano drugačije, se odnosi na jedinjenje koje sadrži "zaštitinu grupu" i koje je sposobno da reaguje sa jedinjenjem koje sadrži funkcionalne grupe koje su sposobne da budu zaštićene. ;Termin "odlazeća grupa", kako se ovde koristi, ima isto značenje prosečnom stručnjaku u oblasti tehnike (Advanced Organic Chemistry: reactions, mechanisms i structure-Četvrto izdanje, autora Džeri Mrč, Džon Vili i sinovi ed.; 1992 strane 351-357) i predstavlja grupu čiji je deo i koja je pričvršćena za molekul supstrat; u reakciji gde molekul supstrat podlaže reakciji premeštanja (sa na primer nukleofilom), odlazeća grupa je tada premeštena. Primeri grupe koja odvlači elektrone, ali nisu i ograničeni na: halogen (F, Cl, Br, i I), poželjno Cl, Br, ili I; tosilat, mesilat, triflat, acetat, kamforsulfonat, ariloksid, i ariloksid zamenjen sa najmanje jednom grupom koja odvlači elektrone (npr., p-nitrofenoksid, 2-hlorofenoksid, 4-hlorofenoksid, 2,4-dinitrofenoksid, pentafluorofenoksid, itd.), itd. Termin "grupa koja odvlači elektrone" ovde ima svoje prosto značenje. Primeri elektrona iz povlačeće grupe sadrže, ali nisu i ograničeni na, halogen, -NO2, -C(O)(niži alkil), -C(O)(aril), -C(O)O(niži alkil),-C(O)O(aril), itd. ;Termin "bazni reagens", kako se ovde koristi, označava jedinjenje koje može da deprotonizuje hidroksilnu grupu. Primeri baznih reagenasa sadrže, ali nisu i ograničeni na, (niži alk)oksid ((niži alkil)OM) u kombinaciji sa alkoholnim rastvaračem, gde (niži alk)oksidi sadrže, ali nisu i ograničeni na, MeO-, EtO-,<n>PrO-,<i>PrO-,<t>BuO-,<i>AmO- (izo-amiloksid), itd., i gde je M alkalni metal katjon, kao što su Li<+>, Na<+>, K<+>, itd. Alkoholni rastvarači šadrže (niži alkil)OH,, kao što je, na primer, MeOH, EtOH,<n>PrOH,<i>PrOH,<t>BuOH,<i>AmOH, itd. Nealkoksi baze mogu isto tako da se koriste kao što je sodijum hibrid, natrijum heksametildisilazan, litijum heksametildisilazan, litijum diizopropilamid, kalcijum hidrid, natrijum karbonat, kalijum karbonat, cezijum karbonat, DBU, DBN, Grinjarevi reagensi, kao što (niži alkil)Mg(halogen), koji uključuju ali nisu i ograničeni na MeMgCl, MeMgBr,<t>BuMgCl,<t>BuMgBr, itd. ;Termin "baza" obuhvata termin "bazni reagens" i namenjeno je da bude jedinjenje koje je u mogućnosti da deprotonizuje jedinjenje koje sadrži proton, t.j., Bronsted bazu. Pored gore navedenih primera, dalje bazni primeri obuhvataju, ali nisu i ograničeni na piridin, kolidin, 2,6-(niži alkil)-piridin, dimetil-anilin, imidazol, N-metil-imidazol, pirazol, N-metilpirazol, trietilamin, di-izopropiletilamin, itd. ;Termin "nenukleofilna baza" označava jedinjenje koje je u mogućnosti da deluje kao Brønstedova baza, ali ima nisku nukleofilnost. Primeri nenukleofilnih baza sadrže, ali se ne ograničavaju na, kalijum karbonat, cezijum karbonat, di-izopropilamin, di-izopropiletilamin, trietilamini, kvinuklidin, naftalen-1,8-diamin, 2,2,6,6-tetrametilpiperidin, 1,8-diazabiciklundec-7-en, 4-dimetilamino-piridin, piridin, 2,6-di-Cl-6-alkil-pridin, 2,4,6-tri-Cl-6-alkil-piridin, 1,5-diazabiciklo[4.3.0]non-5-en, i 1,4-diazabiciklo[2.2.2]oktan. ;Termin "grupa koja odvlači elektrone" zadržava svoje prosto značenje. Primeri grupe koje odvlače elektrone uključuju, ali nisu i ograničeni na halogen (F, Cl, Br, ili I), -NO2, -C(O)(niži alkil), -C(O)(aril), -C(O)O(niži alkil),-C(O)O(aril), itd. ;Termin "ko-kristalati" sadrže kokristalate 4, RP-4, ili SP-4 u kombinaciji sa solima, što obuhvata farmaceutski prihvatljive soli. ;Termin "soli," kako je opisano ovde, se odnosi na jedinjenja koja sadrže katjon i anjon, koji može da se dobije protonizacijom proton akceptorske grupe i/ili deprotonizacijom proton donorske grupe. Treba da bude naznačeno da protonizacija proton akceptorske grupe rezultira u formiranju katjonskih grupa u kojoj je naelektrisanje balansirano prisustvom fiziološkog anjona, dok deprotonizacija proton donorske grupe rezultira u formiranju anjonske vrste u kojoj je naelekrtisanje balansirano prisutnošću fiziološkog katjona. ;Fraza "farmaceutski prihvatljiva so" označava so koja je farmaceutski prihvatljiva. Primeri farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu i ograničeni na: (1) kisele adicione soli, koje su napravljene sa neorganskim kiselinama kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kisellina, i slične; ili napravljene sa organskim kiselinama kao što su glikolna kiselina, pirogrožđana kiselina, mlečna kiselina, malonska kiselina, jabučna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, 3-(4-hidroksibenzoil)benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, 1,2-etan-disulfonska kiselina, 2-hidroksietansulfonska kiselina, benzensulfonska kiselina, 4-hlorobenzensulfonska kiselina, 2-naftalensulfonska kiselina, 4-toluensulfonska kiselina, kamforsulfonska kiselina, lavril sumporna kiselina, glukonska kiselina, glutaminska kiselina, salicilna kiselina, mukonska kiselina, i slične ili (2) dodatne bazne soli koje su napravljene sa konjugovanom bazom bilo koje od navedenih neorganskih kiselina, gde konjugovane baze sadrže katjonsku komponentu izabranu od Na<+>, K<+>, Mg<2+>, Ca<2+>, NHgR"'4-g<+>, u kojima je R"' C1-3alkil i g je broj izabran od 0, 1, 2, 3, ili 4. Treba da je jasno da sve reference farmaceutski prihvatljive soli sadrže oblike sa dodatkom rastvarača (solvate) ili kristalne oblike (polimorfne) kako je ovde objašnjeno, iste kisele adicione soli. ;Termin "alkil" se odnosi na nerazgranati ili razgranati lanac, zasićen, monovalentan ugljovodonični ostatak koji sadrži od 1 do 30 atoma ugljenika. Termin "C1-M alkil" se odnosi na alkil koji sadrži od 1 do M atoma ugljenika, gde je M ceo broj koji ima sledeće vrednosti: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30. Termin "C1-4alkil" se odnosi na alkil koji sadrži od 1 do 4 atoma ugljenika. Termin "niži alkil" označava ugljovodonični ostatak ravnog ili razgranatog lanca koji sadrži od 1 do 6 atoma ugljenika. "C1-20 alkil" kako se ovde koristi odnosi se na alkil koji sadrži od 1 do 20 atoma ugljenika. "C1-20alkil" kako se ovde koristi odnosi se na alkil koji sadrži od 1 do 10 atoma ugljenika. Primeri alkilne grupe sadrže, ali nisu i ograničeni na, niže alkil grupe koje sadrže metil, etil, propil, i-propil, n-butil, i-butil, t-butil ili pentil, izopentil, neopentil, heksil, heptil, i oktil. Termin (ar)alkil ili (heteroaril)alkil ukazuje na to da je alkil grupa po izboru zamenjena sa aril ili heteroaril grupom. ;Termin "alkenil" se odnosi na nesupstituisani ugljovodonični lanac radikala koji ima od 2 do 10 atoma ugljenika koji imaju jednu ili dve olefinske dvogube veze, poželjno jednu olefinsku dvogubu vezu. Termin "C2-Nalkenil" se odnosi na alkenil koji sadrži od 2 do N atoma ugljenika, gde je N ceo broj koji ima sledeće vrednosti: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10. Termin "C2-10alkenil" se odnosi na alkenil koji sadrži od 2 do 10 atoma ugljenika. Termin "C2-4alkenil" se odnosi na alkenil koji sadrži od 2 do 4 atoma ugljenika. Primeri sadrže, ali nisu i ograničeni na, vinil, 1-propenil, 2-propenil (alil) ili 2-butenil (krotil). ;Termin "aril," kako se ovde koristi, i ukoliko nije naznačeno drugačije, se odnosi na supstituisani ili nesupstituisani fenil (Ph), bifenil, ili naftil, poželjno termin aril se odnosi na supstituisani ili nesupstituisani fenil. Aril grupa može biti supstituisana sa jednom ili više grupa izabranih od hidroksil, F, Cl, Br, I, amino, alkilamino, arilamino, alkoksi, ariloksi, nitro, cijano, sulfonska kiselina, sulfat, fosfonska kiselina, fosfat, i fosfonat, bilo nezaštićena, ili zaštićena ukoliko je neophodno, kako je poznato prosečnom stručnjaku u oblasti tehnike, na primer, kako što je opisano u T.W. Greene i P.G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3rd ed., John Wiley & Sons, 1999. ;Termin "ariloksid," kako se ovde koristi, i ukoliko nije naznačeno drugačije, se odnosi na supstituisani ili nesupstituisani fenoksid (PhO-), p-fenil-fenoksksid (p-Ph-PhO-), ili naftoksid, poželjno se termin ariloksid odnosi na supstituisani ili nesupstituisani fenoksid. Ariloksid grupa može biti supstituisana sa jednom ili više grupa izabranih iz hidroksil, F, Cl, Br, I, -C(O)(niži alkil), -C(O)O(niži alkil), amino, alkilamino, arilamino, alkoksi, ariloksi, nitro, cijano, sulfonska kiselina, sulfat, fosfonska kiselina, fosfat, i fosfonat, bilo nezaštićena, ili zaštićena ukoliko je neophodno, kako je poznato prosečnom stručnjaku u oblasti tehnike, na primer, kako što je opisano u T.W. Greene i P.G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3rd ed., John Wiley & Sons, 1999. ;Termin "priprema" ili "oblik doziranja" treba da obuhvati i čvrste i tečne formulacije aktivnog jedinjenja a prosečan stručnjak iz oblasti tehnike će razumeti da aktivni sastojak može da bude u različitim preparatima u zavisnosti od željene doze i farmakokinetičkih parametara. ;Termin "ekscipijens" kako se ovde koristi se odnosi na jedinjenje koje se koristi za pripremanje farmaceutskih jedinjenja, i generalno je siguran, netoksičan i niti biološki niti drugačije nepoželjan, i sadrži ekscipijense koji su prihvatljivi za veterinarsku upotrebu kao i za farmaceutsku primenu kod ljudi. ;Termin "kristalni" se odnosi na situaciju gde čvrst uzorak od bilo SP-4 ili RP-4 poseduje kristalne karakteristike kada se ustanovi na osnovu difrakcije X-zraka na praškastim materijalima ili rentgenskom strukturnom analizom. ;Termin "kao kristalni" se odnosi na situaciju gde čvrst uzorak bilo SP-4 ili RP-4 poseduje kristalne karakteristike kada su ustanovljene jednim sredstvom, npr., vizuelno ili optičkim ili polarizirajućim mikroskopom, ali ne poseduje kristalne karakteristike kada se ustanovljava drugim sredstvima, npr.,difrakcijom X-zraka na praškastim materijalima. Postupci vizuelnog određivanja kristalnosti čvrstog uzorka vizuelno ili optičkim ili polarizirajućim mikroskopom su prikazane u USP <695> i <776>. Čvrst uzorak bilo od SP-4 ili RP-4 koji je "kao kristalni" može da bude kristalni pod određenim uslovima ali može da postane ne kristalni kada je podvrgnut drugačijim uslovima. ;Termin "amorfni" se odnosi na situaciju gde čvrst uzorak bilo SP-4 ili RP-4 niti je kristalni niti kao kristalni. ;Prikazi ;Ovde je stavljeno na uvid javnosti jedinjenje koje je predstavljeno formulom 4: ;;; ;; gde P* predstavlja hiralni atom fosfora. Zahvaljujući hiralnom atomu fosfora, jedinjenje koje je predstavljeno formulom 4 sadrži dva diastereomera određenih RP-4 i SP-4. Jedinjenje predstavljeno formulom 4 isto tako može da bude deo rastvarača, hidrata ili mešavine rastvarač/hidrat. Rastvarač je označen kao 4·nS, dok je hidrat označen sa 4·mH2O, gde je S rešetkasti rastvarač, a n varira između integrisane i integrisane količine od oko 0 do oko 3, a m varira za ceo broj ili količinu koja nije jednaka celom broju od oko 0 do oko 5. Konačno, jedinjenje predstavljeno formulom 4 može da ne postoji kao rastvarač ili kao hidrat ili kao mešavina rastvarač/hidrat, već da ima određenu korisnu količinu apsorbovanog rastvarača (S) ili vode. U kojem slučaju, količina S ili vode može da varira od oko 0 wt. % do oko 10 wt.% na osnovu mase jedinjenja koje je predstavljeno formulom 4. Jedinjenje koje je predstavljeno formulom 4 i njegovi rastvarači i hidrati su kristalni, semi kristalni ili amorfni.

Isto tako ovde opisano jedinjenje je prikazano formulom RP-4:

Jedinjenje koje je predstavljeno formulom RP-4 isto tako može biti deo rastvarača, hidrata ili mešavine rastvarač/hidrat. Rastvarač je označen sa RP-4·nS, dok je hidrat označen sa SP-4·mH2O, gde je S rešetkasti rastvarač, a n varira za ceo broj ili količinu koja nije jednaka celom broju od oko 0 do oko 3, a m varira za ceo broj ili količinu koja nije jednaka celom broju od oko 0 do oko 5. Konačno, jedinjenje predstavljeno formulom RP-4 može da ne postoji kao rastvarač ili kao hidrat ili kao mešavina rastvarač/hidrat, već da ima određenu količinu apsorbovanog rastvarača (S) ili vode. U kojem slučaju bi, količina S ili voda zavisili od oko 0 wt. % do oko 10 wt.% na osnovu mase jedinjenja koje je predstavljeno formulom RP-4. Jedinjenje koje je predstavljeno formulom RP-4 i njegovi rastvarači i hidrati su kristalni, semi kristalni ili amorfni.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni RP-4.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni RP-4 koji ima XRPD 2θ-refleksije (°) od oko: 6.6, 7.1, 9.0, 11.6, 17.9, 20.7, 24.1, 24.4, i 26.2.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni RP-4 koji ima XRPD 2θ-refleksije (°) od oko: 6.6, 7.1, 9.0, 11.0, 11.6, 12.0, 16.0, 17.9, 19.6, 20.7, 21.0, 21.7, 21.9, 22.2, 23.1, 24.1, 24.4, 26.1, 27.3, 27.7, i 28.2.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni RP-4 koji ima XRPD shemu difrakcije suštinski kao što je prikazano na Slici 2.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti RP-4 koji ima sledeće FT-IR najviše tačke (cm<-1>): 1742, 1713, 1679, 1460, 1377, 1259, 1157, i 1079.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti RP-4 koji ima FT-IR spektar suštinski kao što je prikazano na Slici 15.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti suštinski čist RP-4.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti suštinski čist kristalni RP-4.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti suštinski čist amorfni RP-4.

Isto tako ovde je stavljeno na uvid javnosti jedinjenje predstavljeno sa formulom SP-4:

Jedinjenje predstavljeno sa formulom SP-4 isto tako može da bude deo rastvarača, hidrata, ili mešavine rastvarač/hidrat. Rastvarač je označen sa SP-4·nS, dok je hidrat označen sa SP-4·mH2O, gde je S rešetkasti rastvarač, a n varira između za ceo broj ili količinu koja nije jednaka celom broju od oko 0 do oko 3, a m varira za ceo broj ili količinu koja nije jednaka celom broju od oko 0 do oko 5. Konačno, jedinjenje predstavljeno formulom SP-4 može da ne postoji kao rastvarač ili kao hidrat, ali može da varira da ima određenu korisnu količinu apsorbovanog rastvarača (S) ili vode. U kojem slučaju bi, količina S ili voda zavisili od oko 0 wt. % do oko 10 wt.% zasnovana na masijedinjenja koje je predstavljeno formulom SP-4. Jedinjenje koje je predstavljeno formulom SP-4 i njegovi rastvarači i hidrati su kristalni, semi kristalni ili amorfni.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni SP-4.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti monociklični kristalni SP-4, koji poželjno poseduje sledeće jedinice ćelijskih parametara a ~ 12.88 Å, b ~ 6.17 Å, c ~ 17.73 Å, i β ~ 92.05°.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti monociklični kristalni SP-4, koji poželjno poseduje sledeće jedinice ćelijskih parametara a ~ 20.09 Å, b ~ 6.10 Å, c ~ 23.01 Å, i β ~ 112.29°.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti monociklični kristalni SP-4, koji poželjno poseduje sledeće jedinice ćelijskih parametara a ~ 12.83 Å, b ~ 6.15 Å, c ~ 17.63 Å, i β ~ 91.75°.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti monociklični kristalni SP-4, koji poželjno poseduje sledeće jedinice ćelijskih parametara a ~ 12.93 Å, b ~ 6.18 Å, c ~ 18.01 Å, i β ~ 96.40°.

Isto tako prikazan ovde je kristalni SP-4 koji ima XRPD 20-refleksije (°) od oko: 5.2, 7.5, 9.6, 16.7, 18.3, 22.2.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni SP-4 koji ima XRPD 2θ-refleksije (°) od oko: 5.0, 7.3, 9.4, i 18.1.

Isto tako prikazan ovde je kristalni SP-4 koji ima XRPD 2θ-refleksije (°) od oko: 4.9, 6.9, 9.8, 19.8, 20.6, 24.7, i 26.1.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni SP-4 koji ima XRPD 20-refleksije (°) od oko: 6.9, 9.8, 19.7, 20.6, i 24.6.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni SP-4 koji ima g XRPD 20-refleksije (°) od oko: 5.0, 6.8, 19.9, 20.6, 20.9, i 24.9.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni SP-4 koji ima XRPD 20-refleksije (°) od oko: 5.2, 6.6, 7.1, 15.7, 19.1, i 25.0.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni SP-4 koji ima XRPD 2θ-refleksije (°) od oko: 6.1, 8.2, 10.4, 12.7, 17.2, 17.7, 18.0, 18.8, 19.4, 19.8, 20.1, 20.8, 21.8, i 23.3.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni SP-4 koji ima XRPD shemu difrakcije suštinski kao što je prikazano na bilo kojoj od Slika 3, Slika 4, Slika 5, Slika 6, Slika 7, Slika 8, i Slika 21.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti SP-4 koji ima sledeće FT-IR pikove (cm<-1>) od oko: 1743, 1713, 1688, 1454, 1378, 1208, i 1082.

Isto tako ovde je stavljeno na uvid javnosti da SP-4 ima FT-IR spektar suštinski kao što je prikazan na Slici 7.

Isto tako ovde je stavljeno na uvid javnosti suštinski čist SP-4.

Isto tako ovde je stavljeno na uvid javnosti suštinski čist kristalni SP-4.

Isto tako ovde je stavljeno na uvid javnosti suštinski čist amorfni SP-4.

Doziranje, Primena, i Upotreba

Takođe na uvid javnosti je stavljena kompozicija za lečenje i-ili profilaksu bilo kojeg virusnog agensa koristeći bilo koje od jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4. Mogući virusni agensi uključuju, ali nisu i ograničeni na: virus hepatitisa C, virus hepatitisa B, virus hepatitisa A, virus zapadnog Nila, Denga virus, rinovirus, polio virus, virus goveđe virusne diareje, virus japanskog encefalitisa, ili oni virusi koji pripadaju grupama pestivirusa, hepacivirusa, ili flavavirusa.

Takođe je ovde na uvid javnosti stavljena kompozicija za lečenje bilo kojeg virusnog agensa koji je ovde stavljen na uvid javnosti navedena kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv medijum koji je odabran od ekscipijensa, nosača, razređivača i ekvivalentnog medijuma i bilo kog jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4, koji treba da uključi njihove hidrate, rastvarače i bilo koje kristalne forme bilo kog jedinjenja 4, RP-4 i SP-4 ili njihove hidrate i rastvarače.

Jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4, mogu nezavisno da se formulišu u širokoj različitosti doziranih oblika za oralnu primenu nosača. Oralna primena može da bude u obliku tableta, obloženih tableta, tvrdih i mekanih želatinastih kapsula, rastvora, emulzija, sirupa ili suspenzija. Jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4, su efikasna kada se primeni kao supozitorija, pored drugih puteva primene. Najpogodniji način primene je generalno oralni korišćenjem prikladnog dnevnog režima doziranja koji može da se uskladi u zavisnosti od težine oboljenja i odgovora pacijenta na antivirusno lečenje.

Jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4, zajedno sa jednim ili više konvencionalnih ekscipijenasa, nosača ili razređivača, mogu da budu smešteni u oblik farmaceutskih kompozicija i jedinica doziranja. Farmaceutske kompozicije i oblici jediničnog doziranja mogu da sadrže konvencionalne sastojke u konvencionalnim odnosima, sa ili bez dodatnih aktivnih jedinjenja i oblici jediničnog doziranja mogu da sadrže bilo koju odgovarajuću efikasnu količinu aktivnog sastojka koja je srazmerna opsegu nameravane dnevne doze. Farmaceutske kompozicije mogu da se koriste kao čvrste materije, kao što su tablete ili napunjenje kapsule, polu čvrste materije, praškovi, formulacije sa produženim oslobađanjem, ili tečnosti kao što sususpenzije, emulzije, ili napunjene kapsule za oralnu upotrebu; ili u obliku supozitorija za rektalnu ili vaginalnu primenuTipičan preparat će sadržati od oko 5% do oko 95% aktivnog jedinjenja ili aktivnih jedinjenja. (w/w).

Jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4 mogu da se primene samostalno ali će se generalno primenjivati pomešano sa jednim ili više odgovarajućih farmaceutskih ekscipijenasa, rastvarača ili nosača izabranih u odnosu na namenjeni put primene i standardnu farmaceutsku praksu.

Preparat u čvrstom obliku uključuje, na primer, praškove, tablete, pilule, kapsule, supozitorije i disperzivne granule. Čvrst nosač može da bude jedna ili više supstanci koji isto tako mogu da se ponašaju kao rastvarači, sredstva za poboljšavanje ukusa, solubilizatori, lubrikanti, agensi za suspendovanje, sredstva za povezivanje, konzervansi, agensi za raspadanje tableta, ili materijal za kapsuliranje. U prahovima, nosač je generalno fino podeljena čvrsta supstanca što je mešavina sa fino podeljenom aktivnom komponentom. U tabletama, aktivna komponenta je generalno pomešana sa nosačem koji ima neophodan kapacitet vezivanja u odgovarajućim proporcijama i kompaktna u željenoj veličini i obliku. Odgovarajući nosači uključuju ali nisu i ograničeni na magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktozu, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragant, metilcelulozu, natrijum karboksimetil celulozu, vosak sa niskom temperaturom topljenja, kakao buter, i slični. Preparati u čvrstom obliku mogu da sadrže, pored aktivne komponente, boje, ukuse, stabilizatore, bufere, veštačke i prirodne zaslađivače, disperzante, zgusnjivače, agense za solubilizaciju, i slično. Primeri čvrstih formulacija su navedeni kao primeri u patentnim prijavama sa sledećim brojevima: EP 0524579; US 2002/0142050; US 2004/0224917; US 2005/0048116; US 2005/0058710; US 2006/0034937; US 2006/0057196; US 2006/0188570; US 2007/0026073; US 2007/0059360; US 2007/0077295; US 2007/0099902; US 2008/0014228; US 6,267,985; US 6,294,192; US 6,383,471; US 6,395,300; US 6,569,463; US 6,635,278; US 6,645,528; US 6,923,988; US 6,932,983; US 7,060,294; i US 7,462,608.

Tečne formulacije koje su isto tako pogodne za oralnu primenu uključuju tečne formulacije u šta spadaju emulzije, sirupi, eliksiri i vodene suspenzije. Ove uključuju preparate u čvrstom obliku koji su namenjeni da budu konvertovani u tečne preparate kratko pre upotrebe. Primeri tečnih formulacija su navedeni za primere u patentnim prijavama u SAD-u sa brojem 3,994,974; 5,695,784; i 6,977,257. Emulzije mogu da se pripremaju u rastvorima, na primer, u vodenom propilen glikol rastvorima ili mogu da sadrže emulgujući agens kao što su lecitin, sorbitan monooleat, ili akacija. Vodene suspenzije mogu da se pripremaju dispergovanjem fino podeljene aktivne komponente u vodi sa viskoznim materijalom, kao što su prirodne ili sintetičke gume, smole, metilceluloza, natrijum karboksimetilceluloza i drugi dobro poznati agensi za suspenziju.

Jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4 mogu da budu nezavisno formulisana za primenu kao supozitorije. Vosak sa niskom tačkom topljenja, kao što je mešavina glicerida masnih kiselina ili kakao buter se prvi otopi i aktivna komponenta se homogeno disperguje, na primer, mešanjem. Istopljena homogena smeša se zatim sipa u kalupe pogodne veličine, ostave da se ohlade i očvrsnu.

Jedinjenja 4, Rp-4 ili SP-4 mogu da budu nezavisno formulisana za vaginalnu primenu. Vagitorije, tamponi, kreme, gelovi, paste, pene ili sprejevi pored aktivnog sastojka sadrže takve nosače koji su poznati prosečnim stručnjacima iz oblasti tehnike, da su adekvatni. Neke od ovih formulacija mogu isto tako da se koriste u kombinaciji sa kondomom sa ili bez spermicidalnog agensa.

Odgovarajuće formulacije zajedno sa farmaceutskim nosačima, razređivačima i ekscipijensima su opisane u Remingtonovoj knjizi: The Science i Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Pennsylvania. Prosečan stručnjak iz oblasti tehnike može da modifikuje formulacije u okviru učenja specifikacije kako bi proizveo brojne formulacije za određenu putanju primene bez pravljenja kompozicija koje sadrže jedinjenja koja se ovde smatraju nestabilnim ili kompromitujući njihovu terapijsku aktivnost.

Dodatno, prečišćena jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4 mogu nezavisno da se formulišu u konjunkciji sa lipozomima ili micelama. Što se tiče lipozoma, razmatrano je da prečišćena jedinjenja mogu da se formulišu na način kao što je stavljeno na uvid javnosti u prijavama patenata u SAD-u sa brojevima 4,797,285; 5,013,556; 5,077,056; 5,077,057; 5,154,930; 5,192,549; 5,213,804; 5,225,212; 5,277,914; 5,316,771; 5,376,380; 5,549,910; 5,567,434; 5,736,155; 5,827,533; 5,882,679; 5,891,468; 6,060,080; 6,132,763; 6,143,321; 6,180,134; 6,200,598; 6,214,375; 6,224,903; 6,296,870; 6,653,455; 6,680,068; 6,726,925; 7,060,689; i 7,070,801.

Što se tiče micelijuma, razmatrano je da prečišćena jedinjenja mogu da budu formulisana u maniru kako je stavljeno na uvid javnosti u prijavi patenta u SAD-u sa brojem: 5,145,684 i 5,091,188.

Takođe ovde je stavljena na uvid javnosti upotreba bilo kojeg od jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4 u proizvodnji leka za lečenje bilo kojeg stanja koje je rezultat infekcije bilo kojim od sledećih virusnih agenasa: virus hepatitisa C, Virus West Nile, virus žute groznice, deguirani virus, rinovirus, polio virus, virus hepatitisa A, viralni virus dijareje goveda i virus japanskog encefalitisa.

Termin "medikament" označava supstancu korišćenu u postupku lečenja i/ili profilakse subjekta kome je to potrebno, gde supstanca uključuje, ali nije i ograničena na kompoziciju, formulaciju, oblik doziranja, i slično, koji obuhvata jedinjenja 4, Rp-4 ili SP-4.

Razmatrana je upotreba bilo kojeg od jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4 u proizvodnji leka za lečenje bilo kojeg ovde opisanog antivirusnog stanja, bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjem koji je ovde stavljeno na uvid javnosti.

Takođe, ovde je opisan postupak za lečenje i/ili profilaksu subjekta, kojem je to potrebno, pri čemu taj postupak obuhvata administriranje subjektu terapeutski efikasne količine bilo kojeg od jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4.

Namera je da je subjekat, kojem je to potrebno, onaj koji ima bilo kakvo stanje kao rezultat infekcije bilo kojim virusnim agensom koji je ovde opisan, koji uključuje, ali nije ograničen na, virus hepatitisa C, virus West Nile, virus žute groznice, deguirani virus, rinovirus, polio virus, virus hepatitisa A, viralni virus dijareje goveda ili virus japanskog encefalitisa, virus flaviviridae ili pestivirus ili hepacivirus ili virusni agens koji uzrokuje simptome ekvivalentne ili uporedive sa bilo kojim od gore navedenih virusa.

Pojam "subjekat" označava sisara, koji uključuje, ali nije ograničen na, goveda, svinje, ovce, kokoške, ćurke, bivole, lame, nojeve, pse, mačke i ljude, a poželjno je da je subjekat čovek. Smatra se da u postupku lečenja ovde opisanog subjekta može biti bilo koji od ovde razmatranih jedinjenja, bilo sam bilo u kombinaciji s drugim jedinjenjem koje je ovde opisano.

Termin "terapijski efikasna količina" kako se ovde koristi označava količinu koja je potrebna da se smanje simptomi oboljenja kod pojedinca. Doza će biti prilagođena pojedinačnim potrebama za svaki poseban slučaj. Doza može da varira u okviru širokih granica u zavisnosti od brojnih faktora kao što je jačina oboljenja koje treba da se leči, starost i opšte zdravstveno stanje pacijenta, drugi medikamenti sa kojima je pacijent lečen, put i oblik primene i prednosti i iskustvo uključenog lekara. Za oralnu primenu, dnevna doza dostiže između 0.001 i oko 10 g, uključujući sve međuvrednosti, kao što su 0.001, 0.0025, 0.005, 0.0075, 0.01, 0.025, 0.050, 0.075, 0.1, 0.125, 0.150, 0.175, 0.2, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, i 9.5, po danu bi trebalo da su adekvatne u monoterapiji i/ili kombinovanoj terapiji. Određena dnevna doza se kreće od oko 0.01 i od oko 1 g dnevno, uključujući sve postepene vrednosti od 0.01 g (tj. 10 mg) između, poželjna dnevna doza od oko 0.01 i od oko 0.8 g dnevno, poželjnije od oko 0.01 i od oko 0.6 g dnevno, i najpoželjnije od oko 0.01 i od oko 0.25 g dnevno, od kojih svaka uključuje sve postepene vrednosti od 0.01 g između. Uopšteno, lečenje počinje sa velikom početnom "udarnom dozom" kako bi rapidno smanjilo ili eliminisalo virus što prati smanjenje doze do nivoa koji je dovoljan da spreči ponovo javljanje infekcije. Jedna od uobičajenih veština u lečenju oboljenja koja su ovde opisana bi omogućila, bez preteranog eksperimentisanja i u odnosu na znanje, iskustvo i stavljanja na uvid javnosti ove primene, obezbeđivanje terapijski efikasne količine jedinjenja koje je ovde stavljeno na uvid javnosti za predmetno oboljenje i pacijenta.

Terapijska efikasnost se može utvrditi iz testova funkcije jetre uključujući, ali ne i ograničavajući na nivo proteina kao što su proteini seruma (npr. albumin, faktori koagulacije, alkalna fosfataza, aminotransferaze (npr. alanin transaminaza, aspartat transaminaza), 5'-nukleozidaza, γ-glutaminiltranspeptidaza, itd.), sinteza bilirubina, sinteza holesterola i sinteza žučne kiseline; metabolička funkcija jetre, uključujući, ali ne i ograničavajući na, ugljene hidrate, amino kiseline i metabolizam amonijaka. Po izboru, terapijska efikasnost može da bude praćena merenjem HCV-RNK. Rezultati ovih testiranja omogućuju optimizaciju doziranja.

Ovde je takođe opisan postupak lečenja i/ili profilakse kod subjekta kojem je to potrebno, pri čemu navedeni postupak sadrži administriranje terapijski efikasne količine jedinjenja predstavljenog bilo kojim od jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4, i terapijski efikasne količine drugog antivirusnog agensa; gde je primena konkurenta ili alternativna. Razume se da vreme između alternativne primene može da bude u opsegu između 1-24 časa, što dozvoljava svaki među pod opseg uključujući, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, i 23 časa.

Primeri "drugog antivirusnog agensa" uključuju, ali nisu i ograničeni na: inhibitore HCV NS3 proteaze (v. EP 1881001, US 2003187018, US 2005267018, WO 2003006490, WO 200364456, WO 2004094452, WO 2005028502, WO 2005037214, WO 2005095403, WO 2007014920, WO 2007014921, WO 2007014922, WO 2007014925, WO 2007014926, WO 2007015824, WO 2008010921, i WO 2008010921); HCV NS5B Inhibitore (v. US 2004229840, US 2005154056, US 2005-98125, US 20060194749, US 20060241064, US 20060293306, US 2006040890, US 2006040927, US 2006166964, US 2007275947, US 6784166, US20072759300, WO 2002057287, WO 2002057425, WO 2003010141, WO 2003037895, WO 2003105770, WO 2004000858, WO 2004002940, WO 2004002944, WO 2004002977, WO 2004003138, WO 2004041201, WO 2004065367, WO 2004096210, WO 2005021568, WO 2005103045, WO 2005123087, WO 2006012078, WO 2006020082, WO 2006065335, WO 2006065590, WO 2006093801, WO 200702602, WO 2007039142, WO 2007039145, WO 2007076034, WO 2007088148, WO 2007092000, i WO2007095269); HCV NS4 Inhibitore (v. WO 2005067900 i WO 2007070556); HCV NS5a Inhibitore (v. US 2006276511, WO 2006035061, WO 2006100310, WO 2006120251, i WO 2006120252); Toll-like receptore (v. WO 2007093901); i druge inhibitore (v. WO 2000006529, WO 2003101993, WO 2004009020, WO 2004014313, WO 2004014852, i WO 2004035571); i jedinjenja stavljena na uvid javnosti u patentnoj prijavi iz Sjedinjenih Američkih Država broj 12/053,015, podnet u martu 21, 2008 (US 2010/0016251), interferon-α, interferon-β, peginterferon-α, ribavirin, levovirin, viramidin, druge nukleozidne inhibitore HCV polimeraze, inhibitore HCV nenukleozidne polimeraze, inhibitore HCV proteaze, inhibitore HCV helikaze ili inhibitore HCV fuzija.

Kada su jedinjenja 4, RP-4 ili SP-4 administrirana u kombinaciji sa drugim antivirusnim agensom aktivnost može da bude uvećana u odnosu na osnovno jedinjenje. Kada je lečenje kombinovana terapija, takva primena može biti konkurentna ili sekvencijalna u odnosu na derivate nukleozida. "Konkurentska primena" kako se ovde koristi stoga uključuje primenu agensa istovremeno ili u različito vreme. Primena dva ili više agensa u isto vreme može da bude postignuta jedinstvenom formulacijuom koja sadrži dva ili više aktivna sastojka ili suštinski simultanom primenom dva ili više dozna oblika sa jednim aktivnim agensom.

Podrazumeva se da lečenje ovde podrazumeva profilaksu kao i lečenje postojećeg stanja. Osim toga, termin "lečenje" HCV infekcije, kako se ovde koristi, isto tako uključuje lečenje ili profilaksu oboljenja ili stanja koje je povezano sa ili posredovano HCV infekcijom, ili njihovim kliničkim simptomima.

Priprema

Ovde je takođe stavljen na uvid javnosti postupak pripreme bilo kog jedinjenja 4, RP-4, ili SP-4, koje sadrži: a) reakciju izopropil-alanata, A, di-LG-fenilfosfata, B, 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina, 3, i baze kako bi se dobila prva smeša koja sadrži najmanje jedan od SP-4 i RP-4

gde je X konjugovana baza kiseline, n je 0 ili 1, i LG je odlazeća grupa; b) reakciju prve smeše sa zaštitnim jedinjenjem kako bi se dobila druga smeša koja sadrži najmanje jedan zaštićeni SP-4 i zaštićeni RP-4; i c) po izboru podvrgavanje druge smeše kristalizaciji, hromatografiji ili ekstrakciji kako bi se dobilo 4, SP-4, ili RP-4.

Prema predmetnoj objavi izopropil alanat može da bude prisutan u svom obliku soli hlorovodonične kiseline, koja je poželjno, suštinski anhidrovana.

Prema predmetnoj objavi baza može da bude N-metilimidazol.

Prema predmetnoj objavi molski odnos A-prema-B-prema-3 može biti od oko 1.6-prema-1.3-prema-1.

Prema predmetnoj objavi zaštitno jedinjenje: može da bude t-butil-dimetil-silil-hlorid. Isto tako, ovde je stavljen na uvid javnosti postupak za pripremu SP-4 ili RP-4, koji sadrži: a) reakciju izopropil-alanata, A, di-LG-fenilfosfata, B, 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina, 3, i baze kako bi se dobila prva smeša koja sadrži najmanje jedan od SP-4 i RP-4

gde je X konjugovana baza kiseline, n je 0 ili 1, i LG odlazeća grupa; i b) po izboru podvrgavanje druge smeše kristalizaciji, hromatografiji ili ekstrakciji kako bi se dobilo prečišćeno SP-4 ili RP-4.

Prema predmetnoj objavi postupak za pripremu RP-4 može dodatno da uključuje dalje prečišćavanje druge smeše prečišćenog RP-4 rastvaranjem ili suspendovanjem druge smeše ili prečišćene RP-4 smeše u rastvaraču; nakon čega po izboru sledi zasejavanje sa kristalnim RP-4; i dodavanje dovoljne količine anti-rastvarača kako bi se dobio kristalni RP-4.

Prema predmetnoj objavi postupak za pripremu SP-4 može dodatno da uključuje dalje prečišćavanje druge smeše prečišćenog SP-4 d) rastvaranjem ili suspendovanjem druge smeše ili prečišćene SP-4 smeše u rastvaraču nakon čega sledi zasejavanje kristalnog SP-4 na sobnoj temperaturi; sakupljanje prve čvrste supstance od koje se veći deo sadrži SP-4; rastvaranjem prve čvrste supstance u rastvaraču na temperaturi refluksa; i hlađenjem ili dodavanjem anti rastvarača dobija se druga čvrsta supstanca.

Prema predmetnoj objavi postupak za pripremu SP-4 može dodatno da uključuje dalje prečišćavanje SP-4 d) rastvaranjem ili suspendovanjem druge smeše ili prečišćene SP-4 smeše u prvom rastvaraču, nakon čega sledi dodavanje anti rastvarača kako bi se dobila prva kompozicija u kojoj je ostatak rastvarača/anti rastvarača otklonjen dekantovanjem kako bi se dobio ostatak; tretiranjem ostatka sa rastvorom koji sadrži prvi rastvarač i anti rastvarač kako bi se dobila druga kompozicija pri čemu po sniženju pritiska nastaje prva čvrsta supstanca; rastvaranje ili suspendovanje prve čvrste supstance koristeći drugi rastvarač kako bi se dobila treća kompozicija; dodavanje kristalnih semena od SP-4 treće kompozicije; saklupljanje druge čvrste supstance; rastvaranje ili suspendovanje druge čvrste supstance u trećem rastvaraču, po izboru zagrejano do temperature refluksa treći rastvarač kako bi se dobila četvrta kompozicija, i, ukoliko je neophodno, hlađenje četvrte kompozicije kako bi se dobila treća čvrsta supstanca koja sadrži SP-4 koja se sakuplja filtriranjem.

Prema predmetnoj objavi postupak za pripremu SP-4 može dalje da se prečisti drugom smešom ili prečišćenim SP-4 tako što d) se dodaje silika gel drugoj smeši ili prečišćen SP-4 nakon čega sledi evaporacija rastvarača kako bi se dobio suvi ostatak; mešanjem suvog ostatka u prvoj kombinaciji rastvarača/anti rastvarača kako bi se dobio prvi vlažan ostatak; dekantovanjem kombinacije prvog rastvarača/anti rastvarača od prvog vlažnog ostatka kako bi se dobio drugi vlažni ostatak i prva kompozicija; dodavanjem drugom vlažnom ostatku drugu kombinaciju rastvarača/anti rastvarača nakon čega sledi mešanje; dekantovanje druge kombinacije rastvarača/anti rastvarača od drugog vlažnog ostatka kako bi se dobio treći vlažni ostatak i druga kompozicija; po izboru ponavljanjem koraka g)-h) na trećem vlažnom ostatku ili dodatni vlažni ostaci; evaporacijom rastvarača iz druge kompozicije, i po izboru bilo koja dodatna kompozicija dobijena iz koraka po izboru i) kako bi se dobila prva čvrsta supstanca; rastvaranjem ili suspendovanjem prve čvrste supstance u rastvoru koji sadrži treći rastvarač i po izboru četvrti rastvarač kako bi se dobila treća kompozicija; po izboru dodavanje kristalnih semena SP-4 trećoj kompoziciji; dobijanjem iz treće kompozicije druge čvrste supstance koja sadrži SP-4; i po izboru ponovnom kristalizacijom druge čvrste supstance korišćenjem trećeg rastvarača kako bi se dobila treća čvrsta supstanca koja sadrži SP-4.

Prosečan stručnjak u oblasti tehnike će razumeti da jedinjenja mogu da se odvoje uobičajenom ekstrakcijom, uobičajenom kristalizacijom ili uobičajenim hromatografskim tehnikama. Uobičajene hromatografske tehnike uključuju, ali nisu i ograničene na, hromatografiju na silika gelu (koristeći npr. 3-5% metanol u DCM-u ili 4-6% izopropanol u DCM-u) kako bi se napravili poboljšani nivoi jednog izomera (50-100%) i onda ga kristalizovati. Alternativno, može da se koristi hromatografija reverzilnih faza (koristeći npr.

1-30% acetonitril mobilna vodenafaza). Dalje, jedinjenja mogu da se izoluju superkritičnom tečnom hromatografijom SFC sa ugljendioksidom kao glavnim rastvaračem i alkoholima kao što je metanol kao modifikator, poželjno uz korišćenje adekvatnog hiralnog medijuma, kao što je, Daicel Chiralpack IA. Po izboru, SMB hromatografija može da se upotrebi korišćenjem adekvatnog hiralnog medijuma, kao što je, Daicel ChiralPack IA, korišćenjem smeše rastvarača kao što su heksani/izopropanol ili pojedinačni rastvarači kao što je etil acetat.

Isto tako, ovde je stavljen na uvid javnosti postupak pripreme SP-4, koji sadrži: a) reaktivni izopropil-alanil-fosforamidat sa 3'-O-zaštićenom ili nezaštićenom 3, i bazni reagens kako bi se dobila kompozicija koja sadrži zaštićen ili nezaštićen SP-4

gde je izopropil-alanil-fosforamidat sastavljen od smeše diastereomera koja je predstavljena sledećim strukturama:

gde je odnos C:C' od oko 1:1.

Prema predmetnoj objavi bazni reagens može da bude t-butilmagnezijum hlorid i odnos C:C' je veći ili jednak oko 1:1.

Prema predmetnoj objavi bazni reagens može da bude t-butilmagnezijum hlorid i odnos C:C' je veći od oko 1:1.

Prema predmetnoj objavi bazni reagens može da bude t-butilmagnezijum hlorid i odnos C:C' je najmanje oko 1.5:1, oko 2.3:1, oko 4:1, oko 5.7:1, oko 9:1, oko 19:1, oko 32.3:1, oko 49:1, ili oko 99:1.

Prema predmetnoj objavi LG' može biti preuzet iz, 2,4-dinitrofenoksida, 4-nitrofenoksida, 2-nitrofenoksida, 2-hloro-4-nitrofenoksida, 2,4-dihlorofenoksida, i pentafluorofenoksida, bazni reagens može biti t-butilmagnezijum hlorid, i odnos C:C' može biti najmanje od oko 1.5:1, oko 2.3:1, oko 4:1, oko 5.7:1, oko 9:1, oko 19:1, oko 32.3:1, oko 49:1, ili oko 99:1.

Takođe je stavljena na uvid javnosti priprema za SP-4 koja sadrži a) reagovanje izopropil-alanil-fosforamidata (C) sa 3'-O-zaštićenim ili nezaštićenim 3, i bazni reagens kako bi se dobila kompozicija koja sadrži zaštićeni ili nezaštićeni SP-4

gde je Z zaštitna grupa ili hidrogen; LG' je odlazeća grupa; i b) po izboru podvrgavanje dobijenog zaštićenog ili nezaštićenog SP-4 hromatografiji, ekstrakciji ili kristalizaciji kako bi se dobilo prečišćeno zaštićeno ili nezaštićeno SP-4. Prema predmetnoj objavi LG' može da bude tosilat, kamforsulfonat ili ariloksid supstituisan sa najmanje jednom grupom koja odvlači elektrone; poželjnije, LG' je odabran od 2,4-dinitrofenoksid, 4-nitrofenoksid, 2-nitrofenoksid, 2-hloro-4-nitrofenoksid, 2,4-dihlorofenoksid ili pentafluorofenoksid. Prema predmetnoj objavi kada je SP-4 zaštićen, tj. Z nije hidrogen, postupak je dalje usmeren ka uklanjanju zaštite zaštićenom SP-4. Prema predmetnoj objavi reakcija može da se sprovodi u polarno aprotičnom rastvaraču, kao što je, tetrahidrofuran ili drugi etarski rastvarač bilo da je sam ili u kombinaciji sa C2 do C7 nitril, kao što je acetonitril.

Predmetna objava može dalje da sadrži 1) reaktivni (LG')P(O)(LG)2, gde je LG, nezavistan od LG', napuštajuća grupa, sa (i) izopropil-alanatom i prvom bazom da se dobije (LG')P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr) koju prati reakcija (LG')P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr) sa fenolom i druga baza kako bi se dobila smeša koja sadrži C i C', (ii) fenol i prva baza da se dobije (LG')P(O)(LG)(OPh) koju prati reakcija (LG')P(O)(LG)(OPh) sa izopropil-alanatom i druga baza kako bi se dobila smeša koja sadrži C i C', ili (iii) kombinovanjem izopropil-alanata, fenola, i najmanje jedne baze da se dobije smeša koja sadrži C i C'; ili 2) reakcijom (PhO)P(O)(LG)2, gde je LG napuštajuća grupa, sa (i) izopropil-alanatom i prvom bazom kako bi de dobilo (PhO)P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr) koju prati reakcija (PhO)P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr) sa perkusorom napuštajuće grupe (LG'H) i drugom bazom kako bi se dobila smeša koja sadrži C i C',

i podvrgavanjem smeše hromatografiji ili kristalizaciji da se dobije C. Prema predmetnoj objavi izopropil alanat može da bude prisutan u obliku soli hlorovodonične kiseline, koja je poželjno, suštinski anhidrovana.

Isto tako ovde je stavljen na uvid javnosti postupak pripreme RP-4, koji sadrži: a) reakciju izopropil-alanil-fosforamidata sa 3'-O-zaštićenim ili nezaštićenim 3, i baznog reagensa kako bi se dobila kompozicija koja sadrži zaštićeno ili nezaštićeno RP-4

gde izopropil-alanil-fosforamidat sadrži smešu diastereomera koji su predstavljeni sledećim strukturama:

gde je odnos C':C oko 1:1.

Prema predmetnoj objavi bazni reagens može da bude t-butilmagnezijum hlorid i odnos C':C može da bude veći ili jednak od oko 1:1.

Prema predmetnoj objavi bazni reagens može da bude t-butilmagnezijum hlorid i odnos C':C može da bude veći od 1:1.

Prema predmetnoj objavi bazni reagens može da bude t-butilmagnezijum hlorid i odnos C':C može da bude najmanje od oko 1.5:1, oko 2.3:1, oko 4:1, oko 5.7:1, oko 9:1, oko 19:1, oko 32.3:1, oko 49:1, ili oko 99:1.

Prema predmetnoj objavi LG' može da bude p-nitrofenoksid, bazni reagens može da bude t-butilmagnezijum hlorid i odnos C':C može da bude najmanji od oko 1.5:1, oko 2.3:1, oko 4:1, oko 5.7:1, oko 9:1, oko 19:1, oko 32.3:1, oko 49:1, ili oko 99:1.

Takođe stavljena je na uvid javnosti priprema za RP-4 koja sadrži: a) reakciju izopropil-alanil-fosforamidata (C') sa 3'-O-zaštićenim ili nezaštićenim 3, i bazni reagens da se dobije kompozicija koja sadrži zasićeni ili nezasićeni RP-4

Gde je Z zaštitna grupa ili vodonik; LG' je odlazeća grupa; i b) po izboru podvrgavanje dobijenog zaštićenog ili nezaštićenog RP-4 hromatografiji, ekstrakciji ili kristalizaciji kako bi se dobilo prečišćeno zaštićeno ili nezaštićeno RP-4. Prema predmetnoj objavi LG' može da bude tozilat, kamforsulfonat ili ariloksid supstituisan sa najmanje jednom grupom koja odvlači elektrone; poželjnije, LG' je odabran od p-nitrofenoksida, 2,4-dinitrofenoksida, i pentafluorofenoksida. Prema predmetnoj objavi kada je RP-4 zaštićen, tj. Z nije vodonik, postupak može da bude dalje usmeren ka uklanjanju zaštite zaštićenom RP-4. Prema predmetnoj objavi reakcija će se sprovoditi u polarnom aprotičnom rastvaraču, kao što je tetrahidrofuran ili drugom eteričnom rastvaraču bilo pojedinačno ili u kombinaciji jedan sa drugim ili sa C2 do C7 nitrilom, kao što je acetonitril.

Postupak stavljen na uvid javnosti može dalje da sadrži 1) reakciju (LG')P(O)(LG)2, gde je LG, nezavistan od LG', koji je odlazeća grupa, sa (i) izopropil-alanatom i prvom bazom kako bi se dobilo (LG')P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr) što je praćeno reakcijum (LG')P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr) sa fenolom i drugom bazom kako bi se dobila smeša koja sadrži C i C', (ii) fenolom i prvom bazom kako bi se dobilo (LG')P(O)(LG)(OPh) u nastavku sa reakcijom (LG')P(O)(LG)(OPh) sa izopropil-alanata i druge baze kako bi se dobila smeša koja sadrži C i C', ili (iii) kombinovanjem izopropil-alanata, fenola, i najmanje jedne baze kako bi se dobila smeša koja sadrži C i C'; ili 2) reakciju (PhO)P(O)(LG)2, gde je LG', nezavisno od LG, je odlazeća grupa, sa (i) izopropil-alanatom i sa prvom bazom kako bi se dobilo (PhO)P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr) koju dalje prati reakcija (PhO)P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr) sa prekursorom odlazeće grupe i sa drugom bazom kako bi se dobila smeša koja sadrži C i C',

i podvrgavanje smeše hromatografiji ili kristalizacijom smeše kako bi se dobilo C'. Prema predmetnoj objavi izopropil alanat može da bude prisutan u obliku soli hlorovodonične kiseline koja je poželjno suštinski anhidrovana.

Ovde je takođe opisana kompozicija dobijena opisanim postupcima. Ovde je takođe opisana kompozicija dobijena bilo kojim od dole opisanih primera. Tako dobijena kompozicija može biti kristalna, nalik kristalnoj, amorfna ili njihova kombinacija.

Isto tako ovde je stavljeno na uvid javnosti jedinjenje 3

gde je Z zaštitna grupa ili vodonik; što je korisno za pripremu RP-4 ili SP-4.

Takođe stavljeno je na uvid javnosti jedinjenje sa sledećom strukturom

3a: Z = -C(O)CH2CH2C(O)CH3

3b: Z = -C(O)OCH2Ph

3c: Z = -Si(Me)2<t>Bu

3d: Z = -Si(<i>Pr)2OSi(<i>Pr)2OH

Isto tako ovde je stavljeno na uvid javnosti jedinjenje, njegova so, hidrat, solvat ili njihova kombinacija, koja je predstavljena sledećim strukturama

gde je LG' odlazeća grupa, što je korisno za pripremu RP-4 or SP-4.

Prema predmetnoj objavi LG' može da bude tozilat, kamforsulfonat, ariloksid ili ariloksid supstituisan sa najmanje jednom grupom koja odvlači elektrone.

Prema predmetnoj objavi LG' može da bude izabrano od 2,4-dinitrofenoksida, 4-nitrofenoksida, 2-nitrofenoksida, 2-hloro-4-nitrofenoksida, 2,4-dihlorofenoksida ili pentafluorofenoksida.

Prema predmetnoj objavi LG' može da busde pentafluorofenoksid ili 4-nitro-fenoksid. Takođe stavljeno na uvid javnosti je jedinjenje C, gde je LG' 2,4-dinitrofenoksid, 4-nitrofenoksid, 2-nitrofenoksid, 2-hloro-4-nitrofenoksid, 2,4-dihlorofenoksid ili pentafluorofenoksid.

Takođe stavljeno na uvid javnosti je jedinjenje C, gde je LG' 4-nitrofenoksid ili pentafluorofenoksid.

Takođe stavljeno na uvid javnosti je jedinjenje C, gde je LG' 4-nitrofenoksid.

Takođe stavljeno na uvid javnosti je kristalno jedinjenje C, gde je LG' 4-nitrofenoksid.

Takođe stavljeno na uvid javnosti je jedinjenje C, gde je LG' pentafluorofenoksid. Takođe stavljeno na uvid javnosti je kristalno jedinjenje C, gde je LG' pentafluorofenoksid.

Isto tako je ovde stavljen na uvid javnosti postupak za pripremu jedinjenja koje je predstavljeno sledećom strukturalnom formulom

Kristalizacijom jedinjenja iz kompozicije, koja sadrži

a) prvu kompoziciju;

b) perkursor druge odlazeće grupe;

c) nenukleofilnu bazu; i

d) tečnu kompoziciju;

gde prva kompozicija sadrži jedinjenje i njegov odgovarajući P-bazirani diastereomer. Prema predmetnoj objavi količina molova u jedinjenju i količina molova njegovog P-baziranog diastereometra može biti ista ili različita.

Prema predmetnoj objavi količina molova u jedinjenju može biti veća od količine molova njegovog odgovarajućeg P-baziranog diastereomera ili obrnuto.

Prema predmetnoj objavi perkursor druge odlazeće grupe može biti 2,4-dinitrofenol, 4-nitrofenol, 2-nitrofenol, 2-hloro-4-nitrofenol, 2,4-dihlorofenol ili pentafluorofenol.

Prema predmetnoj objavi LG' može da bude pentafluorofenoksid. Prema predmetnoj objavi perkursor druge odlazeće grupe može biti pentafluorofenol. Prema predmetnoj objavi količina pentafluorofenola može da varira od oko 0.01 mol ekvivalenata do oko 10 ekvivalenata u odnosu na količinu molova jedinjenja i njegovog P-baziranog diastereomera i svi molnih ekvivalenata između. Prema predmetnoj objavi količina pentafluorofenola može da varira od oko 0.1 molnih ekvivalenta do oko 1 mol ekvivalenta u odnosu na količinu molova jedinjenja i njegovog P-baziranog diastereomera i svih molnih ekvivalenata između.

Prema predmetnoj objavi kristalizacija može da nastane na temperaturi koja varira od oko -10°C do oko 40°C i svim temperaturnim vrednostima između. Prema predmetnoj objavi kristalizacija može da nastane na sobnoj temeraturi.

Prema predmetnoj objavi nenukleofilne baze mogu da budu izabrane od kalijum karbonata, cezijum karbonata, di-izopropilamina, di-izopropiletillamina, trietilamina, kvinuklidina, naftalen-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8-diazabicikludek -7-ena, 4-dimetilamino-piridina, piridina, 2,6-di-C1-6-alkil-piridina, 2,4,6-tri-C1-6-alkil-piridina i njihove mešavine. Prema predmetnoj objavi u prvom pod stanovištu, nenukleofilna baza može da bude trietilamin ili 1,8-diazabicikludek -7-en. Prema predmetnoj objavi nenukleofilna baza može da bude trietilamin.

Prema predmetnoj objavi nenukleofilne baze mogu da budu prisutne u količini koja je u opsegu od oko 0.01 molnih ekvivalenata do oko 10 molnih ekvivalenata, i svim međuvrednostima molnih ekvivalenata, u odnosu na ukupni molni ekvivalent jedinjenja i njegovog P-baziranogg diastereomera. Prema predmetnoj objavi nenukleofilna baza može da bude prisutna u količini koja ima opseg od oko 0.1 molnih ekvivalenata do oko 1 molnog ekvivalenta i svih međuvrednosti molnih ekvivalenata, u odnosu na ukupni molni ekvivalent jedinjenja i njegovog P-baziranog diastereomera.

Prema predmetnoj objavi rastvorljivost jedinjenja može biti manja od rastvorljivosti njegovog odgovarajućeg P- baziranog diastereomera u tečnoj kompoziciji ili obrnuto.

Prema predmetnoj objavi tečna kompozicija može da sadrži najmanje jedan rastvarač i jedan anti rastvarač. Prema predmetnoj objavi tečna kompozicija može da sadrži najmanje jedan C1 do C8 alkohol, C2 do C8 etar, C3 do C7 keton, C3 do C7 estar, C1 do C2 hlorokarbon, C2 do C7 nitril, C5 do C12 zasićen ugljovodonik i C6 do C12 aromatični ugljovodonik. Prema predmetnoj objavi tečna kompozicija može da sadrži najmanje jedan od C2do C8etra, C3do C7 estra, C5 do C12 zasićenog ugljovodonika i C6 do C12 aromatičnog ugljovodonika. Prema predmetnoj objavi tečna kompozicija može da sadrži najmanje jedan od C2 do C8 etra, C3 do C7estra, C5do C12zasićenog ugljovodonika. Prema predmetnoj objavi tečna kompozicija može da sadrži najmanje jedan etil acetat, t-butil-metiletar i heksan. Prema predmetnoj objavi tečna kompozicija može da sadrži etil acetat i heksan. Prema predmetnoj objavi tečna kompozicija može da sadrži t-butil-metiletar i heksan.

Prema predmetnoj objavi količina tečne kompozicije može da bude u opsegu od oko 1 mL do oko 10 mL za svaki gram prve kompozicije i sve mL/g međuvrednosti.

Predmetna objava može dalje da sadrži dodavanje kristalnog jedinjenja kompoziciji. Pored toga predmetna objava može da sadrži dodavanje od oko 0.1 do oko 1 wt. %, i sve wt. % međuvrednosti, kristalnog jedinjenja prvoj kompoziciji.

Predmetna objava može dalje da sadrži

a) reakciju PhOP(O)(LG)2i<i>Pr-Ala-NH2•HCl u prisustvu prve baze kako bi se dobilo (PhO)P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr);

b) reakciju (PhO)P(O)(LG)(NHAla-<i>Pr) sa perkursorom prve odlazeće grupe (LG'H) u prisustvu druge baze kako bi se dobila kompozicija koja sadrži jedinjenje i P- bazirani diastereomer;

gde LG i LG', koji su nezavisni jedan od drugog, predstavljaju odlazeće grupe; gde je perkusor prve odlazeće grupe i perkursor druge odlazeće grupe isti ili različiti; i gde su prva baza i druga baza iste ili različite.

Predmetni pronalazak se odnosi na prostupak pripreme kristalnog (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata koji ima sledeću strukturu,

koja sadrži:

kristališući (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat od druge kompozicije koja sadrži

a) prvu kompoziciju;

b) pentafluorofenol;

c) nenukleofilnu bazu; i

d) tečnu kompoziciju;

gde prva kompozicija sadrži (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat i (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat i gde tečna kompozicija sadrži najmanje jedan rastvarač i nerastvarač.

Molska količina (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata i molska količina (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata mogu da budu iste ili različite.

Molska količina (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata može biti veća od molske količine (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata.

Količina pentafluorofenola može da bude u opsegu od oko 0.01 molnih ekvivalenata do oko 10 molnih ekvivalenata (i svih međuvrednosti molnih ekvivalenata) u odnosu na molsku količinu (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata i (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata. Količina pentafluorofenola može da bude u opsegu od oko 0.1 molskih ekvivalenata do oko 1 molskih ekvivalenata (i svih međuvrednosti molnih ekvivalenata) u odnosu na molsku količinu (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata i (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata.

U postupku predmetnog pronalaska, kristalizacija se javlja na temperaturi koja je u opsegu od oko -10°C do oko 40°C i svim temperaturnim međuvrednostima. Kristalizacija može da se javi na sobnoj temperaturi.

U postupku predmetnog pronalaska, nenukleofilna baze je izabrana od kalijum karbonata, cezijum karbonata, di-izopropilamina, di-izopropiletilamina, trietilamina, kvinuklidina, naftalen-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8-diazabiciklundek-7-ena, 4-dimetilamino-piridina, piridina, 2,6-di-C1-6-alkil-piridina, 2,4,6-tri-C1-6-alkil-piridina i njihove mešavine. Nenukleofilne baze mogu biti trietilamin ili 1,8-diazabiciklundek-7-en. Nenukleofilna baza može biti trietilamin.

Nenukleofilna baza može biti prisutna u količini koja ima opseg od oko 0.1 do oko 1 molskih ekvivalenata (i svih međuvrednosti molskih ekvivalenata) u odnosu na celokupnu molsku količinu (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata i (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata.

Rastvorljivost (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata može biti manja od rastvorljivosti (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata u tečnoj kompoziciji.

Prema predmetnom pronalasku tečna kompozicija sadrži najmanje jedan rastvarač i antirastvarač. Tečna kompozicija može da sadrži najmanje jedan od C1 do C8 alkohol, C2 do C8etar, C3do C7keton, C3to C7estar, C1do C2hlorokarbon, C2do C7nitrila, C5do C12zasićeni ugljovodonik i C6 do C12 aromatični ugljovodonik.

Tečna kompozicija može da sadrži najmanje jedan od C2 do C8 etar, C3 do C7 estar, C5 do C12zasićen ugljovodonik, i C6do C12aromatični ugljovodonik. Tečna kompozicija može da sadrži najmanje jedan od C2do C8etar, C3do C7estar, i C5do C12zasićeni ugljovodonik. Tečna kompozicija može da sadrži najmanje jedan etil acetat, t-butil-metiletar i heksan. Prema predmetnom pronalasku, tečna kompozicija sadrži etil acetat i heksan. Tečna kompozicija može da sadrži t-butil-metiletar i heksan.

Količina tečne kompozicije može da bude u opsegu od oko 1 do 10mL za svaki gram (i sve mL/g međuvrednosti) prve kompozicije.

Postupak pronalaska može dalje da sadrži dodavanje kristalnog (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata drugoj kompoziciji.

Postupak pronalaska može dalje da sadrži dodavanje oko 0.1 do oko 1 wt. % (i sve wt.% međuvrednosti) kristalnog (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata na osnovu celokupne mase (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata u prvoj kompoziciji.

Isto tako, ovde je stavljen na uvid javnosti kristalni (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat koji je dobijen gore pomenutim postupkom.

Isto tako, ovde je stavljen na uvid javnosti postupak za pripremu (S)-izopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata, koji sadrži:

Kristalni (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat iz druge kompozicije koja sadrži

a) prvu kompoziciju;

b) pentafluorofenol;

c) nenukleofilnu bazu; i

d) tečnu kompoziciju;

gde prva kompozicija sadrži (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat i (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat.

Isto tako na uvid javnosti je stavljen postupak za pripremu (S)-izopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata, koji sadrži:

kontaktiranje (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata sa proizvodom dobijenim u reakciji tbutilmagnezijum halida sa 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-dionom sa t-butilmagnezijum halidom.

Prema predmetnoj objavi do kontakta se može doći posredstvom medijuma koji ima temperaturu koja je u opsegu 0°C do oko 40°C i svih temperatura svih međuvrednosti datog opsega.

Prema predmetnoj objavi do kontakta može doći posredstvom medijuma koji ima temperaturu koja je u opsegu 0°C do oko 30°C i svih temperatura svih međuvrednosti datog opsega.

Prema predmetnoj objavi molski odnos t-butilmagnezijum halida u odnosu na 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-dion može da ima opseg od oko 2 do oko 2.2. Prema predmetnoj objavi molski odnos t-butilmagnezijum halida u odnosu na 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-dion može biti od oko 2.1.

Prema predmetnoj objavi t-butilmagnezijum halid može biti t-butilmagnezijum hlorid. Isto tako, ovde je stavljen na uvid javnosti postupak pripreme značajno čistog (S)-izopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata, koji sadrži:

dobijanje (S)-izopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata prema predmetnoj objavi, i kristalizacijom tako formiranog (S)-izopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata.

Isto tako, ovde je stavljen na uvid javnosti izotopski-obeležen analog RP-4 ili SP-4. Termin "izotopski-obeležen" analog se odnosi na analog RP-4 ili SP-4 koji je "deuterisani analog", "<13>C-obeležen analog," ili "deuterisani/<13>-C-obeleženi analog." Termin "deuterisani analog" označava jedinjenje koje je opisano ovde, gde je<1>H-izotop, tj. vodonik (H), je supstituisan sa<2>H-izotop, tj. deuterijum (D). Deuterjium substitucija može biti delimična ili potpuna. Delimična deuterijum substitucija znači da je najmanje jedan vodonik supstituisan sa najmanje jednim deuterijumom. Na primer, za RP-4 ili SP-4, prosečnom stručnjaku iz oblasti tehnike mogu biti jasni sledeći delimični deuterisani analozi (gde "dn" predstavlja nbroj atoma deuterijuma, kao što je, za izopropil grupu n = 1-7, dok je za fenil grupu, n = 1-5), kao i one koji su opisani ispod.

Iako metil grupe opisane iznad su prikazane tako da su u potpunosti deuterisane, može se prepoznati da su delimično-deuterisane varijacije takođe moguće, kao što su, -CDH2i -CD2H. U razmatranje se takođe uzimaju oni koji su izotopski obeleženi i baze. Isto tako, termini "<13>C-obeleženi analog" i "deuterisani/<13>-C-obeležen analog" se odnosi na jedinjenje koje je opisano ovde, pri čemu je atom ugljenika obogaćen sa<13>C-izotopom što znači da stepen obogaćenja premašuje uobičajeno prirodno prisustvo od oko 1.1%.

Primeri

Kako se ne bi ograničili putem primera, navedeni primeri se koriste kako bi olakšali razumevanje predmeta stavljenog na uvid javnosti.

Sintetička stanovišta

U cilju pripreme uridin nukleozida, može da se primeni koristan tribenzoilni citidin intermedijer za sintetisanje određenim 3',5'-diacilovanim analoga od 3 (vidi dole) koji se već efikasno dobijaju na maloj skali u hemijskoj industriji (vidi WO 2006/031725 ili US 2006/0122146). Sledeći postupak je nađen da je skalabilan i ekonomičan.

3',5'-O-dibenozil-2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metil-N<4>-benzoilcitidin (1) se dobija metodom koja je stavljena na uvid javnosti u WO 2006/031725 i WO 2008/045419.

1 je tretiran sa 70% vodenim rastvorom sirćetne kiseline kako bi se dobio 3',5'-O-dibenozil-2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridin (2). Estri benzoila mogu biti hidrolizovani brojnim metodama kao što su, pr. alkoksidi u alkoholnom rastvoru, kao što je natrijum metoksid u metanolu, kalijum karbonat u metanolu ili etanol analozi, alkilamini kao što je metilamin u metanolu, butilamin, itd. Metanolni amonijak je uzet za rad na većoj skali. Uridin proizvod (3) može biti prečišćen kristalizacijom kako bi se dobio 70% tribenzoisani citidin (1).

Brojni postupci u literaturi opisuju različite puteve i uslove kako da se napravi fosforamidat korišćenjem višestrukih ekvivalenata reagensa. Vidi, na primer, McGuigan et al. J. Med. Chem. 2005, 48, 3504-3515 i McGuigan et al. J. Med. Chem. 2006, 49, 7215. Za rad na proširenoj skali, trenutno postoji samo jedan poznat primer, koji je satvljen na uvid javnosti u Lehsten et al., Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 819-822 ("Lehsten"). U ovoj referenci, autori uvode koncept "postupak jedne posude" u kojem hlorovodonična so amino kiseline i fenil dihlorofosfor reaguju zajedno sa N-metilimidazolom u dihlorometanu. Kasnije se dodaje nukleozid kako bi se napravio željeni 5'-O-fosforamidat proizvod, što bi u ovom slučaju bilo dobijanje jedinjenja predstavljenog sa formulom 4. Nažalost, Lehsten postupak je imao nedostatke. Na primer, Lehsten postupak je koristio daleko veći višak reagenasa nego što je to bilo neophodnošto što je uticalo na cenu i teškoću hromatografskog prečišćavanja. Nadalje, Lehsten je predložio selektivnost reakcije može da se kontroliše 5'-hidroksilu u odnosu na 3'-hidroksil upoređujući sa referencom iz literature korišćenjem nižih temperatura i sporim dodavanjem nukleozida.

Korišćenjem Lehsten postupka za jedinjenja koja su ovde stavljena javnosti na uvid dobijeno je od oko 1-5% mono-substituisanih 3'-O-fosforamidatnih diastereomera (5) i oko 10-30% bi-substituisanih proizvoda (6). Kako je polarnost 3'-diastereomera veoma slična željenim 5'-diastereomerima (4), hromatografsko odvajanje je veoma izazovno. Postupak na većoj skali je bio skoro nemoguć bez odbacivanja znatnog dela manje polarnog 5'-diastereomera (4) ili prihvatanjem većeg nivoa kontaminacije 3'-diastereomera (5). U inicijalnoj skali na 50 g, konačni proizvod je sadržao 3'-diastereomer (5) kontaminaciju od oko 3%, koji je ko-eluiran sa manje polarnim od 5'-diastereromera (4).

Ovde su stavljeni na uvid javnosti reakcioni uslovi koji koriste manje količine reagenasa i postupak kako da se selektivno otklonila nečistoća 3'-O-fosforamidat diastereomera (5) sa lakšim hromatografskim odvajanjem čime se dobijaju željeni 5'-O-fosforamidat diastereomeri sa mnogo većom čistoćom (4).

Za stoihiometriju reagensa, napravljena je studia u kojoj je stoihiometrije reagenasa sistematično promenjena i rezultati su praćeni fosfornim NMR-om sirove reakcije kako je objavio Lehsten. U uspešnijim prikazima, upoređeni su izolovani prinos i čistoća željenog proizvoda. Primećeno je da primarni 5'-hidroksil brže reaguje nego sekundarni 3'-hidroksil. Ovo pravi takmičarsku situaciju između napretka reakcije konzumirajući sve početne nukleozide i konvertujući 5'- i 3'-monosubstituisane proizvode (4 i 5) u 5',3'-bi substituisane proizvode (6). 3'-monosubstituisani proizvod konvertuje se u bis proizvod brže nego 5'-monosubstituisani produkt, tako da je moguće smanjiti 3'-diastereomerni nivo kontaminacije navodeći reakciju više ka bi-substituisanim proizvodima. Međutim, sa efektivnim načinom uklanjanja 3'-diastereomera, reakcija može biti optimalna kako bi se dobilo više traženih 5'diastereomera bez preteranog žrtvovanja 5'-diastereomera konvertovanog u njegov bisubstituent (6). Takođe se uvidelo da amino kiselina hlorovodonika je veoma hidroskopna. Kako bi bilo koja količina vode koja je prisutna konzumirala ekvivalentnu količinu fenil dihlorofosfatnog reagensa, treba obratiti pažnju da se amino kiselina održava suštinski anhidrovanom ili da se značajno anhidruje pre upotrebe. Ukratko, Lehsten je izvestio da je optimalni odnos amino kiselina i fenildihlorofosfata i nukleozida 3.5:2.5:1 redom. Pronađeno je da je optimalni odnos amino kiselina i fenildihlorofosfata i nukleozida od oko 1.6 do oko 1.3 do oko 1 i optimalan u uslovima u kojima 3'-diastereomer može da bude efikasno uklonjen i kada je amino kiselina hlorovodonika značajno anhidrovana. Korišćenjem manje količine reagenasa, postiže se ušteda zajedno sa pojednostavljenjem hromatografskog isparavanja željenog proizvoda od sporednih proizvoda reagensa i od smanjenog nivoa bidiastereomera.

U jednom alternativnom postupku, 3'-hidroksi-blokiran derivat 3 je napravljen korišćenjem t-butildimetilsilil blokirajuće grupe u dva koraka. Ovaj je posle konvertovan u njegov 5'-fosforamidat derivat. Sa namerom da silil grupa može potom da bude uklonjena i da nema 3' izomera (5) ili 3',5'-bi- fosforamidata (6). Sličan pristup je prikazan od strane Borch i Fries-a (SAD Patent 5,233,031) u niskom ukupnom prinosu alkil fosforamidata.

Još jedan alternativni pristup je da se upotrebi direktna sinteza i potom koristi hemija kako bi pomogla diferencijacija 3'-diastereomernih nečistoća 5 od željenih 5'-diastereomera 4 kako bi se pomogla separacija. Tražena je grupa koja bi selektivno reagovala sa slobodnim primarnim hidroksilom 3'-O-fosforamidata nečistoće 5 preko slobodnog sekundarnog hidroksila željenog 5'-O-fosforamidata 4. Isto tako je traženo da blokirajuća grupa značajno izmeni polarnost rezultirajućeg 5'-O-blokiranog 3'-O-fosforamidatnog proizvoda željenog 5'-O-fosforamidata 4. Ne bi bio potreban dodatni korak da se ukloni blokirajuća grupa kako željeni 5'-diastereomer 4 ne bi bio promenjen. Hemijski izmenjen 3'-diastereomer bi tada omogućio lakšu hromatografsku separaciju ili separaciju specijalnim skupljačima ili ekstrakcijom.

Konkretno, blokirajuća grupa terc-butildimetilsilil (tBDMS ispunjava ove kriterijume i bio je prvi koji je demonstriran i naknadno korišćen na multi-kilogram skali. Pod određenim uslovima kao na primer kada se piridin koristi kao rastvarač i baza, tBDMS grupa reaguje sa visokom selektivnošću primarnoj na hidroksil poziciji preko 3' sekundarne hidroksil pozicije.

Fosforamidat reakcija koristi N-metilimidazol (NMI) kao bazu. U prisustvu NMI, sililacija je manje selektivna. Poželjno, količina NMI bi trebalo da bude smanjena. Ovo lako može da se postigne posle reakcije fosforamidata, ispiranjem rastvora reakcije sa 1 N hlorovodoničnom kiselinom. NMI i uklonjen je preostali polazni nukleozid, ostavljajući sirovu smešu mono i bi supstituisanih proizvoda i sporednih proizvoda reakcije. Ovo je potom rastvoreno u piridinu i tretirano sa terc-butildimetilsilil hloridom. 3'-monosubstitisani proizvod 5 je u roku od nekoliko časova ili manje konvertovan u 5'-O-tBDMS-3'-O-fosforamidat 7. Progres reakcije može da se posmatra pomoću HPLC-a. Polarnost ovog sililat proizvoda 7 je manja nego bifosforamidata 6 i lako se uklanja hromatografijom. Koristeći ovaj metod, bilo je moguće smanjiti nivo 3'-monofosforamidata od 5 do ispod 0.1% od 5'-proizvoda 4 u odnosu na 1-3% bez tretiranja sililom. Slično, tretiranje sa dimetoksitrifenilmetil hloridom (DMT-Cl) pod istim uslovima je isto tako funkcionisalo. Isto tako, je bilo lakše identifikovati DMT proizvod reakcije TLC kao DMT koji sadrže molekule koji ostavljaju svetlo narandžaste fleke pri zagrevanju ili izlaganju kiselini. Isto tako, može se zamisliti mnoštvo drugih blokirajućih grupa kako su ranije pomenute.

Uslovi reakcije i izbacivanje gasova 3'-nečistoće su uobičajene metode i mogu da se primene na većinu nukleozid fosforamidata sa slobodnim 3' hidroksilom. Ostatak fosforamidata može biti bilo koja kombinacija estra amino kiselina i aromatičnih alkohola. Ostatak nukleozida može biti bilo koji nukleozid u kojem bi 5' fosforamidat doveo do 5'-monofosfata i mogao dalje da se metaboliše u 5'-trifosfatni oblik.

Sledeća shema je shema osnovne reakcije koja je ilustrovana za pravljenje izopropil L-alanata fenil fosforamidata od 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina sa glavnim proizvodom kao što je traženi 5'-O-fosforamidat (4, dva diastereomera) i sporedni proizvod kao 3'-O-fosforamidat (5, dva diastereomera) i 3',5' -bis-O-fosforamidat (6, četiri diastereomera). Reagensi su dodati u stoihiometrjskom odnosu kako je opisano u delu postupka pripreme. Reakciji je dozvoljeno da nastavi dok oko 5% početnog materijala ostaje što je procenjeno UV vizualizacijom hromatografije na tankom sloju (TLC). Isto tako UPLC/MS prikazan otprilike 10% od 3',5' bi-fosforamidata 6 koji je formiran u poređenju sa traženim 5'-proizvodom. Posle hlađenja i tehnike kiselog razblaživanja, sirovi ostatak organskog sloja je spreman za sililaciju. Pod opisanim uslovima reakcije, silil grupa poželjno reaguje sa slobodnim 5'-hidroksilom 3'-O-fosforamidata kako bi se napravio 7. Reakcija se nastavlja sve dok 3'-O-fosforamidat ne može više da se detektuje od strane UPLC/MS.

Nakon postavljanja reakcije sililacije, željeni proizvod se podvrgava hromatografiji na silika gelu i eluira se gradijentom metanola u dihlorometanu (1-4%). Željeni 5'-monofosforamidat 4 eluira poslednji.

Postupak pripreme

Referenca

Primer 1. Priprema 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridin (3)

U erlenmajer od 10 L je dodato 3', 5'-O-dibenozil-2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metil-N4-benzoilcitidin (500 g, 0.874 mol) i 70% vodeni rastvor sirćetne kiseline (7.5 L). Rastvor se zagreva do refluksa (110°C) tokom 20 h. TLC ukazuje na to da je reakcija završena (Rf 0.6 u 5% metanola u dihlorometanu (DCM)). Smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i razblažena sa vodom (2 L). Posle mešanja tokom 2 h, dobijeni talog je sakupljen filtriranjem i čvrsta supstanca se ispira vodom (5 L) i atmosferski suši na sobnoj temperaturi tokom 12 h da bi se dobilo 360 g (88%). Ovaj dibenzoiluridin intermedijer se koristi direktno u sledećem koraku tako što se dodaje ceo u sveže pripremljeni metanolni amonijak (5.4 L, oko 25%) na 0°C. Ova temperatura se održava tokom 3 h i potom se dozvoljava da se zagreje do 15°C tokom 24 h. TLC ukazuje da je reakcija završena (Rf 0.4 u 10% metanolu u DCM-u). Reakciona smeša se filtrira kroz Celite bed i koncentriše se pod sniženim pritiskom kako bi se dobio sirovi proizvod (216 g). Sirovi proizvod se meša sa etil acetatom (325 mL) tokom 3 h na temperaturi sredine. Dobijena čvrsta supstanca se skuplja filtiranjem i pere etil acetatom (216 mL). Dobijena čvrsta supstanca se suši pod vakumom na sobnoj temperaturi tokom 4h kako bi se dobilo 160 g (78%) traženog proizvoda 98.7% HPLC čistoće.<1>H-NMR (DMSO-d6) δ 11.44 (br s, 1H, NH), 7.95 (d, 1H, C-6H), 5.97 (d, 1H, C-1'H), 5.64 (d, 1H, C-5H), 3.84-3.77 (m, 3H, C-5'-Ha, C-3'H. C-4'H), 3.63-3.60 (m, 1H, C5'-Hb), 1.23 (d, 3H, C-2'-CH3). ES-MS M-1 259.

Referenca

Primer 2. Priprema izopropil estra (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Diokso-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-(R)-fluoro-3-hidroksi-4-metil-tetrahidrofuran-2-ilmetoksi]-fenoksifosforilamino}- propionske kiseline (4)

Sinonim: 5'-O-(Izopropil-L-alanat, fenil fosforamidil)-2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridin diastereomerna smeša.

Erlenmajer sa tri grla od 5 L je opremljen sa mehaničkom mešalicom, ledenom kadicom sa fiziološkim rastvorom internim termometrom, i atmosferom azota. Erlenmajer je napunjena sa L-alanin izopropil estar hidrohloridom (82.0 g, 0.490 mola) i anhidrovanim dihlorometanom (0.80 L). Dok se ovo meša, fenil dihlorofosfat (85.0 g, 0.40 mola) se dodaje u jednom cugu i meša. Dok se unutrašnja temperatura održava između -5 do 5°C, rastvor Nmetilimidazol (NMI, 250 g, 3.07 mola) u dihlorometanu (250 mL) se dodaje u periodu od pola sata. Dozvoljeno je da se rastvor meša tokom 1 h u ovom temperaturnom opsegu. 2'-Deoksi-2'-fluoro-2'-C-metil-uridin (3, 80.0 g, 0.307 mola) se dodaje na 0°C u jednoj porciji i tada je dozvoljeno zagrevanje reakcionog erlenmajera polako u kadici sa fiziološkim rastvorom. Tokom 1 h, unutrašnja temperatura se popela na -2°C. TLC (5% metanola u DCM) tokom 1 h pokazuje da je utrošeno više nego 50% nukleozida. Kada je uklonjena kadica, reakcioni erlenmajer je dostigao temperaturu okoline tokom 1 h i više. TLC posle 3 h i na 5 h potpuno prikazuje da je 95% početnih nukleozida bilo utrošeno. Reakciona smeša je kvenčovana dodavanjem metanola (100 mL) i mešanjem reakcije tokom 5 minuta.

Reakciona smeša se ispira sa 1N HCl (2 X 500 mL) zatim zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (2 X 500 mL). Izdvojeni organski sloj se suši anhidrovanim natrijum sulfatom (50 g) i filtrira. Rastvor isparava pod sniženim pritiskom i nakon toga pod visokim vakumom do isušivanja kako bi se dobio sirovi proizvod u obliku viskoznog ulja (170 g). Uzimaju se NMR očitavanja sirovog proizvoda (<31>P i<1>H).<31>P-NMR je ukazao na oko 1% totalne integracije fosfora zahvaljujući prisustvu 3' izomera 5.

Sirovom proizvodu se dodaje anhidrovani piridin (1700 mL). Rastvarač isparava pod sniženim pritiskom i nakon toga pod visokim naponom kako bi se smanjio sadržaj vode u sirovoj smeši kroz uporednu evaporaciju. Dobijeno ulje se ponovo rastvara u anhidrovanom piridinu (500 ml) i nakon toga se dodaje t-butildimetilsilil hlorid u višku (9.0 g, 60mM). Reakcija se meša na temperaturi okoline. Progres reakcije je posmatran od strane UPLC/MS. Nakon 3 časa, 3' nečistoća 5 nije više mogla da se detektuje i reakcija je kvenčovana dodavanjem metanola (50 mL).

Reakcija je isparila pod sniženim pritiskom do ulja. Ostatak je rastvoren u etil acetatu (1.5 L) i ispran sa 1N HCl (2X 500 mL), nakon toga zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (2 X 500 mL). Organski sloj se suši putem anhidrovanog natrijum sulfata (50 g), filtrira i isparava pod sniženim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod u obliku bledo žutog ulja.

Sirovo ulje se razblaži istom zapreminom dihlorometana i nanese na 2.5 Kg patronu silika gela radialnom kompresijom pri 100 psi vazdušnog pritiska. Koristeći gradijent pumpu na 60 psi i brzinu protoka od 400 mL/min, patrona se pere sa metilen hloridom (4L) a zatim gradijentom od 1-4% metanola u metilen hloridu (48 L). Većina glavnih nečistoća (di(izopropilalanil)fenil fosfat, 3',5'-bifosforamidat (6), 3'-fosforamidat-5'-TBDMS adukta (7)) eluirani sa gradijentom ~3%. Traženi proizvod je eluiran između 3 i 4% metanola. Frakcije koje sadrži proizvod su sortirane u dve partije. Prva sadrži male količine gornjih nečistoća a druga je čist proizvod. Prvi set frakcije je sadržavao male količine manje polarnih nečistoća (gornje nečistoće) kao što je 3',5'-bis fosforamidat i di-alanilfenil fosfat i ponajviše Rp diastereomer i zahtevao je prečišćavanje na drugoj koloni. (Relativna terminologija, gornji vs. donji se odnosi na eluciju na normalnu fazu hromatografije na silika gelu, gde "gornji izomer" znači da je prvi eluirani izomer.) Drugi set frakcija nije imao značajnu količinu nečistoća- samo ostatak RPi uglavnom SPdiasterereomere. Kasnije je kombinovan sa duplo kolumnisanom frakcijom. Rastvor je ispario pod sniženim pritiskom i dobijena bela pena je dalje osušena (0.20 mmHg) tokom 1 h kako bi dala 42 g nečiste količine (4:1 gornji vs donji izomer na bazi od<31>P-NMR) i 38 g čiste količine (1:3 gornji vs donji izomer). Nečista količina je ponovo organizovana na isti način kako bi se dobilo 3.8 g od 97% čistog gornjeg izomera (frakcija se izdvojila) i 36 g čistog proizvoda u odnosu 4:1. Dve glavne količine su rastvorene u DCM-u, spojene, isparene pod ssniženim pritiskom i osušene (50°C, 0.2 mmHg, 24 h) da se dobije 74 g (45.7%) čistog proizvoda 4 sa diastereomernim odnosom od 48: 51, u obliku bele pene, mp oko 75-85°C.

U cilju dobijanja amorfne čvrste supstance diastereomerne smeše, 74 g bele pene se umeša sa t-butil metil etrom (750 mL) rezultira u delimičnom rastvoru i gumenom čvrstom ostatku. Za vreme mešanja, heptan (750 mL) se dodaje polako i suspenzija se mehanički meša tokom 1 h sve dok se većina gumenog ostatka ne pretvori u belu čvrstu supstancu. Čvrsta supstanca se sastruže špatulom i dobijena gusta smeša se filtrira. Čvrsta supstanca se pere heptanima (4 X 50 mL) i suši pod vakumom (50°C, 0.2 mmHg, 24 h) da se dobije beli, amorfnni prašak (64 g) sa visokim opsegom topljenja od oko 70-80°C.<1>H i<31>P NMR prilagođen strukturi i HPLC prikazuje čistoću od 99.8% sa diastereomernim opsegom od 46:54 (isto tako potvrđeno od<31>P NMR).

Alternativni postupak pravljenja čvrste smeše 4. Nakon hromatografije, ostatak je zajedno ispario sa dihlorometanom dva puta (5 mL/g) i sušen tokom 24 h na 35-40°C na 35-45 mTorr. Ostatak pene je prosejan kroz 250 mikronski ekran i dalje sušen pod istim uslovima sve dok ostatak dihlorometana nije pao ispod 400 ppm kao što je izmereno gasnim GC. Dobijeni fino beli do beli amorfni prašak sa temperaturom staklene tranzicije u opsegu od 53.7 do 63.5°C.

Karakterizacija smeše izomera (4):<1>H-NMR (CDCl3) δ 10.05 (br s, 1H, NH, SP), 10.00 (br s, 1H, NH, RP), 7.49 (d, 1H, C6-H, SP), 7.36 (m, 5H, C6-H, RP, aromatični), 7.23-7.14 (m, 6H, RP/SP, aromatični), 6.18 (br d, 2H, C1'-H, RP/SP), 5.63 (d, 1H, C5-H, SP), 5.58 (d, 1H, C5-H, RP), 5.01 (m, 2H, CH-(CH3)2, RP/SP), 4.46-4.33 (m, 8H, C-5'-H2, ala-NH, C3'-OH, RP/SP), 4.12 (m, 2 H, ala-CH-CH3, RP/SP), 4.01-3.85 (m, 4H, C3'-H, C4'-H, RP/SP), 1.39-1.22 (m, 12H, all CH3, RP/SP).

<31>P-NMR (CDCl3) δ 3.60 (RP), 3.20 Sp relativno za trifenilfosfat na-17.80 ppm. ES-MS M+1 530.2. Analiza elemenata: Računato u % (uključujući 0.29% vode kako je postavljeno u Karl Fisher analizi) C, 49.75; H, 5.54; N, 7.90, F, 3.58, P, 5.84. Nađeno %: C, 49.50; H, 5.44; N, 7.85; F, 3.62; P, 6.05.

Diskusija o razdvajanju izomera

Jedinjenje 4 zahvaljujući hilarnosti fosfora je sastavljeno iz dva diastereomera, koji su označeni kao SP-4 i RP-4. Napravljen je stereometrijski zadatak zasnovan na pojedinačnoj kristalnoj analizi SP-4 rentgenskim zracima. Oba i RP-4 i SP-4 su dali kristalni proizvod.

Postupak kristalizacije je naznačen ispod.

Referenca

Primer 3.

Kristalizacija izomera RP-4. Hromatografska frakcija prisutnog prvog eluiranog, manje polarnog RP-4 izomera (3.8 g, 97% čist) je rastvorena u izopropanolu (36 g) i razblažena heptanima do zamućenja (72 g). Rastvor je zasejan i mešan na sobnoj temperaturi tokom 5 h. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena vakum filtracijom, isprana heptanima (2x20 mL) i osušena (50°C, 0.2 mm, 24 h) do 2.3 g veoma malih belih iglica mp 136.2-137.8°C. HPLC čistoća nastalog materijala je 99.02%.

RP-4:<1>H-NMR (CDCl3) δ 9.10 (br s, 1H, NH), 7.36 (m, 2H, o-aromatični), 7.26-7.16 (m, 4 H, C6-H, m,p-aromatični), 6.16 (br d, 1H, C1'-H), 5.58 (d, 1H, C5-H), 5.01 (sept, 1H, CH-(CH3)2), 4.52-4.47 (m, 2H, C-5'-H2), 4.10 (d, 1H, C3'-H), 4.02-3.76 (m, 4H, ala-NH, C3'-OH, C4'-H, ala-CH-CH3), 1.37-1.20 (m, 12H, all CH3).

Referenca. Primer 4. Priprema i kristalizacija SP-4.

Postupak 1: Direktna precipitacija iz sirovog 4: U mešani rastvor L-alanin izopropil estar hidrohlorida (10.5g, 61.5mmol, azeotropično sušen, dva puta, sa 50 mL toluenom svaki put) u dihlorometanu (100 mL) je dodat fenidihlorofosfat (7.5 mL, 50 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je ohlađena do -10°C i onda je dodat rastvor od NMI (30.5 mL, 384.3mmol) u 30 mL dihlorometana tokom perioda od 30 min. Nakon završetka dodavanja, smeša se meša između -10 i -15°C, tokom 1h. Navedenoj smeši se dodaje od jednom 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridin (3) (10g, 38.4mmol) i smeša se meša ispod -10°C tokom 3h i zatim se polako dopušta zagrevanje do 20°C (6h). Smeša se meša na ovoj temperaturi tokom noći (15h) i zatim kvenčuje sa 10 mL metanola. Rastvor je ispario i ostatak je ponovo rastvoren u EtOAc (200 mL). EtOAc sloj se ispira vodom (100mL), 1N HCl (3x75 mL), 2 % razblaženimm rastvorom NaHCO3 (50 mL) i fiziološkim rastvorom (50mL). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje. Ostatak se suši pod visokim vakumom tokom 2h kako bi se dobila bela pena (22 g).

Navedena pena je rastvorena u 33 mL DCM-a i onda je dodato 65 mL IPE-a (izopropil etra) kako bi se dobio zasićen rastvor. Rastvor je filtriran kroz male jastučiće Celita i filtrat je mešan sa SP-4 i zasejan tokom 72h na temperaturi okoline (od oko 22°C – napomenuti da hlađenje suspenzije do 0°C dovodi do podmazivanja sirovog proizvoda. Bela čvrsta supstanca se filtrira, ispira sa IPE-om (20mL) i suši kako bi se dobilo 4.58g (-85:15 smeše od SP-4:RP-4 respektivno kako je utvrđeno<31>P NMR) belog praška. Navedena čvrsta supstanca je suspendovana u 23 mL DCM-a i zatim refluksovana tokom 3h. Smeša je ohlađena do temperature okoline i mešana tokom 15h. Bela čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa 4.5 mL hladnim DCM-om i suššena pod visokim vakumom na 45°C kako bi se dobio čist SP-4, mp 93.9-104.7°C, HPLC čistoće 99.74% (3.11g, 15.2 % od uridin nukleozida).

SP-4<1>H-NMR (CDCl3) δ 8.63 (br s, 1H, NH), 7.47 (d, 1H, C6-H), 7.30 (m, 2H, oaromatični), 7.26-7.18 (m, 3H, m,p-aromatični), 6.18 (br d, 1H, C1'-H), 5.70 (d, 1H, C5-H), 5.02 (sept, CH-(CH3)2), 4.53 (m, 2H, C-5'-H2), 4.11 (d, 1H, C3'-H), 3.97 (m, 3H, C3'-OH, C4'-H, ala-CH-CH3), 3.77 (br s, 1H, ala-NH), 1.39 (d, 3H,C2'-CH3), 1.37 (d, 3H, ala-CH3), 1.24 (d, 6H, CH-(CH3)2).

Postupak 2: Podmazivanje iz sirove supstance 4: Promešanom rastvoru L-alanin izopropil estar hidrohlorida (20.6g, 123mmol, azeotropično suši, dva puta, sa 75 mL toluena svaki put) u dihlorometanu (200 mL) je dodat fenidihlorofosfat (14.9 mL, 100mmol) na temperaturi okoline. Smeša je ohlađena do -10°C i tada je dodat rastvor NMI (61.3 mL, 769mmol) u 60 mL dihlorometana tokom 30 min. Nakon završetka dodavanja, smeša je mešana između -10°C i -15°C tokom 1h. Navedenoj smeši je dodat odjednom 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridin (3) (20g, 76.9mmol) i smeša je mešana ispod-10°C tokom 3h i zatim je polako dozvoljeno da se zagreje do 20°C (6h). Smeša je mešana na ovoj temperaturi tokom noći (15h) i zatim kvenčovana sa 10 mL metanola. Rastvor je ispario i ostatak se ponovo rastvara na EtOAc (400 mL). EtOAc sloj se pere vodom (200mL), 1N HCl (3x100 mL), 2 % vodenim rastvorom NaHCO3 (100 mL) i fiziološkim rastvorom (50mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Ostatak se je osušen pod visokim vakumom tokom 2h kako bi se dobila bela pena (43 g). Navedena pena je dalje razblažena u 86 mL EtOAc u erlenmajeru sa okruglim dnom i sa dva grla koji je opremljena sa mehaničkom mešalicom. Dok se meša, 100 mL heptana se dodaje polako i suspenzija se meša tokom 1 h. Gornji sloj se dekantuje i ostatak se ponovo meša sa 50 mL 2:3 EtOAc/heptan rastvora tokom 10 min i potom dekantuje. Ostatak je osušen pod visokim vakumom kako bi se dobila bela pena (31g).

Navedena pena je rastvorena u 46 mL DCM-a i potom je dodato 95 mL IPE-a kako bi se dobio zasićen rastvor. Rastvor se filtrira kroz mali jastučić Celita i filtrat se meša sa SP-4 i zaseje tokom 72h na sobnoj temperaturi. Bela čvrsta supstanca se filtrira, ispira sa IPE (30mL) i suši kako bi se dobilo 7.33g (-85:15 smeše od SP-4: RP-4 respektivno, kako je utvrđeno<31>P NMR) belog praha. Navedena čvrsta supstanca se suspenduje u 36 mL DCM-a i zatim refluksuje tokom 3h. Smeša se hladi do sobne temperature i meša tokom 15h. Bela čvrsta supstanca se filtrira, ispira sa 7.5 mL hladnom DCM i suši pod visokim vakumom na 45°C kako bi se dobilo >99% čisto SP-4, (4.78g, 11.6 % od uridin nukleozida).

Postupak 3: Nanošenje sirove supstance na silika gel 4: 5.0 g sirove supstance 4 je napravljeno na isti način kao smeša diastereomera neposredno pre koraka hromatografije na koloni počinjući sa otprilike 2.5 g od 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (3). Sirova supstanca je rastvorena u 10 mL DCM-u i 10 g silika gela je dodato rastvoru. Rastvor je ispario kako bi ise dobila suva gusta smeša. Gusta smeša je pomešana sa 40 mL 50% EtOAc/heksana tokom 15 min i potom filtrirana. Silika gel se ispira sa dodatnih 10 mL 50% EtOAc/heksani. Silika gel se potom ispira sa 15% MeOH/DCM (100 mL) i sakuplja odvojeno. Rastvor je ispario i osušen je pod visokim vakumom kako bi se dobilo 4.0 g ostatka (pene). Ostatak je rastvoren u DCM-u (6mL) i zatim dodat ~9mL IPE kako bi se napravio zasićen rastvor. Smeša se potom lagano meša tokom noći sa SP-4, zaseje na sobnoj temperaturi. Bela čvrsta supstanca se filtrira i ispira sa IPE (5 mL) kako bi se dobilo 1.28 g proizvoda.<31>P NMR otkriva da navedeni proizvod sadrži 77:23 smeše od SP-4 : RP-4 respektivno. Ovo se ponovo kristališe sa 20 mL od DCM-a kako bi se dobilo 0.75 g >99% čistog SP-4 (oko 12% od uridin nukleozida). Ovakva priprema SP-4 ne zahteva korak sililacije kako je zahtevano za postupak pripreme smeše, tako da celokupan postupak reakcije je prikazan gore. Stanovišta jedne kristalizacije i polimorfnih oblika SP-4 su predstavljeni ispod.

Postupak 4: 40.0 g 1:1 smeše 4 je rastvoreno u 90 mL dihlorometana. Diizopropiletar (70 mL) je dodat navedenom rastvoru kako bi se dobio zasićeni rastvor. (Kvantitet diizopropila može da varira u zavisnosti od čistoće proizvoda.). Rastvor je zasejan sa čistim SP-4 (> 99%) i smeša je lagano mešana sa mešalicom na sobnoj temperaturi tokom 20h (formiranje čvrste supstance se primećuje nakon 2h). Čvrsta supstanca se filtrira, ispira sa 40 mL mešavine diizopropiletra/dihlorometana (1:1) i suši kako bi se dobila bela čvrsta supstanca (16.6 g, 89.35 % čista SP-4 od strane NMR). Čvrsta supstanca se suspenduje u 83 mL dihlorometana i refluksuje tokom 3h. Suspenzija se hladi do sobne temperature i meša tokom noći. Čvrsta supstanca se filtrira i suši sa 10mL hladnog DCM-a. Čvrsta supstanca se suši pod vakumom kako bi se dobilo SP-4 (13.1 g, 99.48 % čisto od strane HPLC). 11g ove čvrste supstance je ponovo rastvoreno u 330 mL DCM- pod vrelim uslovima. Rastvor se hladi do sobne temperature i ostavlja na ovoj temperaturi da prenoći. Kristalni proizvod se filtrira i suši kako bi se dobilo 10.5 g od SP-4 (99.74 % od strane HPLC).

Jedinjenja SP-4 i RP-4 se mogu alternativno napraviti, u skladu sa predmetnom objavom, reakcijom nukleozida (zaštićenog ili nezaštićenog) 3 sa izopropil-alanilfosforamidatom (smeša od C i C', C ili C'), kako je prikazano u sledećoj jednačini.

P.D. Howes et al. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 2003, Vol.22, Nos.5-8, pp. 687-689 ("Howes") stavlja na uvid javnosti 2'- i 5'-fosforamidate dobijene u reakciji sa tbutilmagnezijum hloridom. Ovde, Howes stavlja na uvid javnosti da kada 3'-deoksi-citidin nukleozid reaguje sa metil estrom (S)-2-[hloro-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline u prisustvu 1.2 ekvivalenata t-butilmagneszijum hlorida, javlja se selektivna fosforilacija na 2'-pložaju, ali ovo sa dodatnim ekvivalentom od t-butilmagnezijum hlorida prikazuje selektivnu fosforilaciju na 5'-položaju. Ovo stavljanje na uvid javnosti bi trebalo da se uporedi sa onim koje je stavljeno na uvid javnosti u Howesovoj shemi 1.

Referenca

Primer 5-1. Priprema izopropil estra (S)-2-[(4-nitro-fenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline

Mešanom rastvoru 4-nitrofenil fosforodihloridata 12.8g, (50 mmol) u dihlorometanu (100 mL) dodavan je rastvor fenola i trietilamina (7.7 mL, 55 mmol) u dihlorometanu (100 mL) na -78°C u toku 20min. Smeša je mešana na ovoj temperaturi tokom 30min i preneta u drugi erlenmajer sa okruglim dnom koji sadži L-alanin izopropil estar hidrohlorid (8.38g, 50mmol) u dihlorometanu (100 mL) na 0°C. Smeši je dodavana druga porcija trietilamina (14.6 mL, 105 mmol) tokom 15min. Smeša je mešana na 0°C tokom 1 h i tada je rastvarač isparen. Ostatak se trituriše sa etil acetatom (150 mL) i filtracijom se dobija bela čvrsta supstanca. Filtrat je koncenrisan pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo bledo žuto ulje. Sirovo jedinjenje je podvrgnuto hromatografiji korišćenjem 0-20% gradijenta etil acetata/heksana kako bi se dobio proizvod (17g, 83 %prinos) kao smeša diastereomera u odnosu od oko 1:1.<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6): δ -0.31, -0.47;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.31-8.27 (m, 2H), 7.51-7.37(m, 4H), 7.27-7.19(m, 3H), 6.70-6.63(m, 1H), 4.85-4.78(m, 1H), 3.97-3.86(m, 1H), 1.21-1.19(m, 3H), 1.11-1.09 (m, 6H); MS (ESI) m/z 407 (M-1)<+>.<31>P NMR (162 MHz, CDCl3): δ -2.05, -2.10;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.22 (d, J = 9.2Hz, 2H), 7.41-7.33(m, 4H), 7.26-7.18(m, 3H), 5.05-4.96(m, 1H), 4.14-4.05(m, 1H), 3.93-3.88(m, 1H), 1.38(d, J=6.8Hz, 3H), 1.22 (dd, J = 6.2 & 3.0Hz, 6H); MS (ESI) mlz 407 (M-1)+.

Referenca

Primer 5-2. Priprema SP-4/RP-4.

Mešanom rastvoru 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-hidroksimetil-3-metiltetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidin-2,4-diona (130mg, 0.5mmol) u suvom THF-u (1.5mL) je dodat 1.0M rastvor terc-butilmagnezijum hlorida (1.05mL, 1.05mmol, 2.1 ekuiv)) na sobnoj temperaturi tokom 5min. Nakon 30min, rastvoru izopropil estra (S)-2-[(4-nitro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline (1:1 smeša izomera, 408mg, 1mmol) u THF-u (1.5mL) se dodaje u kapima tokom 5min. Smeši je dozvoljeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 48h i zatim tretira sa zasićenom razblaženom NH4Cl (20mL). Smeša je razdeljena između etil acetata (50mL) i vode (20mL). Kombinovani organski ekstrakt se suši putem anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom kako bi se dobio bledo žuti ostatak. Kolonskom hromatografijom ostatka koristeći 0-2% MeOH/dihlorometan gradijent daje belu penastu čvrstu supstancu (125mg, 47% prinosa, smeše od SP-4/RP-4 u odnosu od oko 3.05:1.0).

Referenca

Primer 6. Priprema i ne hromatografska izolacija izopropil estra (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline

L-alanin izopropil estar hidrohlorid (330 g, 1.97 mol) je prethodno osušen uporednom evaporacijom sa toluenom (2 x 400 mL) pod sniženim pritiskom i potom osušen u vakum pećnici (50°C, 0.2 mmHg, 17 h). U mešanom rastvoru 4-nitrofenil fosforodihloridata (500.0 g, 1.953 mol) u anhidrovanom dihlorometanu (3.0 L) dodat je rastvor fenola (183.8 g, 1.953 mol) i trietilamina (300 mL, 2.15 mol) i dihlorometana (900 mL) na -60°C unutrašnje temperature tokom 3 časa. Smeša se meša na ovoj temperaturi dodatnih 30 min i i zatim joj se dozvoljava da se zagreje do -5°C tokom 2.5 h. Prethodno osušeni estar amino kiseline se dodaje na -5~0°C pod atmosferom azota preko 10 minuta. Ostatak soli amino estra u dodatnom erlenmajeru je preneto u reakcionu smešu putem ispiranja sa dihlorometanom (2 x 100 mL). Smeša se meša na 0°C tokom 40 minuta i druga porcija trietilamina (571 mL, 4.10 mol) se dodaje tokom 40 minuta na 0°C. Smeša se meša na 0~10°C tokom 3 h i zatim bela čvrsta supstanca (trietilamin hidrohlorid) je filtracijom izvađena i ispirana sa dihlorometanom (3 x 300 mL). Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom i ostatak se triturira sa metil tbutil etrom (MTBE, 4 L). Dodatna čvrsta so ovako formirana se filtrira i ispira sa MTBE-om (3 x 150 mL). Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo bistro ulje svetlo braon boje. Ostatak je uporedno ispario sa heksanima (2 x 140 mL) kako bi se uklonili bilo kakvi ostaci MTBE i dalje suši pod vakumom na 40°C tokom 2 časa. Suvi ostatak se meša sa diizopropil etrom (IPE, 1.1 L) i meša se na temperaturi od 5 °C u kadici sa ledenom vodom. Mala količina kristalnog semena željenog SP-izomera proizvoda je dodata rastvoru i smeša se meša na temperaturi od 5°C tokom 22 h kako bi se formirao talog srednje gustine. Ovome je dozvoljeno da odleži u zamrzivaču (-10°C) tokom 44 h. Precipitirani proizvod je sakupljen putem filtracije i ispran sa prethodno ohlađenom smešom rastvaračaIPE i heksana (1:1, 3 x 190 mL). Čvrsta supstanca se suši u vakumu (0.5 mm Hg) na sobnoj temperaturi dok se ne dobije konstantna težina od 227.23 g (prinos: 28.5%) kao čvrse supstance u obliku beli čvrst prašak. Odnos dva diastereomera SP:RPje bio 9.65/1 na osnovu<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6, δ -0.31 (SP), -0.47). Proizvod se ponovo kristališe rastvaranjem u IPE (840 mL) dok se zagreva u kadici na temperaturi od 60°C. Navedeni rastvor se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h i potom mala količina kristalnog Sp izomera se dodaje. Čvrsta supstanca u obliku belog praška je formirana tokom 2 h i erlenmajer se čuva u zamrzivaču (-10°C) tokom 16 časova. Bela i fina kristalna čvrsta supstanca koja se dobila se filtrira, pere sa prethodno ohlađenim IPE-om (3x 50 mL) i suši pod vakumom (ambijent, 0.5 mm Hg) do dostizanja konstantne težine kako bi se dobila bela pahuljasta čvrsta supstanca (177.7 g, 22% ukupan prinos ili 44% ukupan prinos na osnovu teorijskog prinosa SP izomera) sa diastereomernim odnosom od 48/1 na osnovu P-NMR. Mp 62-66°C.

<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6): δ -0.31;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.30-8.27 (m, 2H), 7.49(d, J=8.8Hz, 2H), 7.41-7.37(m, 2H), 7.23-7.19 (m, 3H), 6.66 (dd, J=13.6, 10.0Hz, 1H), 4.86-4.78 (m, 1H), 3.97-3.86 (m, 1H), 1.19 (d, J=7.2Hz, 3H), 1.10(d, J=6.4Hz, 6H);

<31>P NMR (162 MHz, CDCl3): δ -2.05; (162 MHz, DMSO-d6): δ -0.31;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.22 (d, J=9.2Hz, 2H), 7.41-7.33(m, 4H), 7.26-7.18(m, 3H), 5.05-4.96(m, 1H), 4.14-4.05(m, 1H), 3.93-3.88(m, 1H), 1.38(d, J=6.8Hz, 3H), 1.22 (dd, J=6.2 & 3.0Hz, 6H);<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.30-8.27 (m, 2H), 7.49(d, J=8.8Hz, 2H), 7.41-7.37(m, 2H), 7.23-7.19 (m, 3H), 6.66 (dd, J=13.6, 10.0Hz, 1H), 4.86-4.78 (m, 1H), 3.97-3.86 (m, 1H), 1.19 (d, J=7.2Hz, 3H), 1.10(d, J=6.4Hz, 6H)

MS (ESI) mlz 407 (M-1)<+>.

Stereohemija od 8 (SP-izomera) je potvrđena jednom kristalografijom rentgenskim zracima, videti detalje koji su ispod.

Referenca

Primer 7. Odvajanje diastereomerne smeše izopropil estra (S)-2-[(4-nitrofenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline od strane SFC

Uzorak smeše diastereomera (4.8 g) obogaćen sa RP-izomerom je podvrgnut SFC-u korišćenjem ChiralPak AD-H (2x15 cm) kolone i eluiran sa 35% izopropanolom u ugljen dioksidu na 100 bara. Injekcionim nanošenjem 4 mL uzorka sa koncentracijom od 17 mg/mL metanola. RP-izomer [izopropil estra (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline] je prvi eluiran. Odgovarajuće frakcije ovih višestrukih prikaza su bile spojene i koncentrovane pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo 2.9 g RP-izomera [izopropil estra (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline] u obliku svetlo žutog viskoznog ulja i 1.9 g SP-izomera [izopropil estra (S)-2-[(S)-(4-nitrofenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline] kao bela čvrsta supstanca. Analitički podaci RP-izomera su slični proizvodu koji je izolovan gore navedenim postupkom kristalizacije.

Analitički podaci za izopropil estar

(S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline (8, RP-izomer):<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) : δ - 0.47;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.308.27 (m, 2H), 7.46-7.38 (m, 4H), 7.27-7.20 (m, 3H), 6.68 (dd, J=13.8, 10.2Hz, 1H), 4.86-4.77 (m, 1H), 3.97-3.86 (m, 1H), 1.20 (d, J=7.2Hz, 3H), 1.10(dd, J=6.2,2.2Hz, 6H); MS (ESI) mlz 407 (M-1)<+>.

Referenca

Primer 8-1. Priprema racemskog izopropil estra (±) 2-[(4-hloro-fenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline:

Mešanom rastvoru 4-hloro-fenil fosforodihloridata (2.45g, 10.0 mmol) u dihlorometanu (20 mL) je dodat rastvor fenola (0.94 g, 10 mmol) i trietilamina (1.56 mL, 11 mmol) u dihlorometanu (20mL) na -78°C tokom 20 min. Smeša se meša na ovoj temperaturi tokom 30min i zatim prebacuje u drugi erlenmajer sa okruglim dnom koji sadrži L-alanine izopropil estar hidrohlorid (1.67 g, 10 mmol) u dihlorometanu (50 mL) na 0°C. Smeši se dodaje druga količina trietilamina (2.92 mL, 21 mmol) tokom 15min. Smeša se meša na 0°C tokom 1h i zatim rastvor isparava. Ostatak je triturisan sa etil acetatom (30mL) i bela čvrsta supstanca je izdvojena filtriranjem. Filtrat je koncentrisan pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo bledo žuto ulje. Sirovo jedinjenje je hromatografisano korišćenjem 10-20% gradijenta etil acetata/heksana da se dobije proizvod (2.0 g, 50% prinos) kao smeša diastereomera u odnosu od 1:1.<31>P NMR (162 MHz, CDCl3): δ -1.58, -1.62;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.06-7.51 (m, 8H), 7.15-7.28 (m, 2H), 7.29-7.47(m, 2H), 4.0-4.10(m, 1H), 3.82-3.88 (m, 3H), 1.35-1.36 (dd, 6H); 1.19-1.22 (m, 3H). MS (ESI) m/z 398 (M-1)<+>. Dobijeni proizvod je prečišćen ekstrakcijom, kristalizacijom ili hromatografijom, kao što je gore navedeno.

Referenca

Primer 8-2. Priprema (S)-Izopropil 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2 il)metoksi)(fenoksi)-fosforilamino)propanoata (4).

Mešanom rastvoru od 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-hidroksimetil-3-metiltetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidin-2,4-diona (3, 2.6 g, 10 mmol) u suvom THF (50 mL) dodat je 1.7 M rastvor tert-butilmagnezijum hlorida (12.4 mL, 21 mmol, 2.1 ekviv)) na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Nakon 30 min, rastvor racemskog izopropil estra (2-[(4-hloro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline (4.08g, 10mmol) u THF-u (15mL) se dodaje u kapima tokom 10 min. Smeši je dozvoljeno mešanje na sobnoj temperaturi tokom 72 h. TLC odgovarajuća tačka sa autentičnim proizvodom je pokazala da je oko 5% željenog proizvoda formirano u poređenju sa početnim nukleozidom.

Referenca

Primer 9-1. Priprema racemskog izopropil estra (±) 2-[(2-hloro-fenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline.

Mešanom rastvoru 2-hloro-fenil fosforodihloridata (9.8 g, 40 mmol) u dihlorometanu (80 mL) je dodavan rastvor fenola (3.76 g, 40 mmol) i trietilamina (6.16 mL, 44 mmol) u dihlorometanu (80 mL) na -78°C tokom 20 min. Smeša je mešana na ovoj temperaturi tokom 30 min i zatim prebačena u drugi erlenmajer sa okruglim dnom koji sadrži L-alanin izopropil estar hidrohlorid (6.7 g, 40 mmol) u dihlorometanu (150 mL) na 0°C. Smeši je dodavana druga porcija trietilamina (11.6 mL, 84 mmol) tokom 15 min. Smeša je mešana na 0°C tokom 1h i zatim je rastvor isparen. Ostatak je triturisan etil acetatom (100mL) i bela čvrsta supstanca je izdvojena filtriranjem. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo bledo žuto ulje. Sirovo jedinjenje je podvrgnuto hromatografiji korišćenjem 10-20% gradijenta etil acetata/heksana da se dobije proizvod (11.3g, 72 % prinos) kao smeša diastereomera u odnosu od 1:1.<31>P NMR (162 MHz, CDCl3): δ -1.58, -1.61;<1>H NMR (400 MHz,CDCl3): δ 7.06-7.51 (m, 8H), 5.02-5.94 (m, 1H), 4.10-4.16(m, 1H), 3.31-3.94(m, 1H), 1.18-1.35(m, 3H), 1.38-1.40 (dd, 6H); MS (ESI) m/z 398 (M-1)<+>. Dobijeni proizvod je prečišćen ekstrakcijom, kristalizacijom ili hromatografijom, kao što je gore navedeno.

Referenca

Primer 9-2. Priprema (S)-izopropil 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2 il)metoksi)(fenoksi)-fosforilamino)propanoata.

Mešanom rastvoru 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-hidroksimetil-3-metiltetraidro-furan-2-il)-1H-pirimidin-2,4-diona (3, 2.6 g, 10 mmol) u suvom THF-u (50 mL) je dodavan 1.7 rastvor terc-butilmagnezijum hlorida (12.4 mL, 21 mmol, 2.1 ekviv)) na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Nakon 30 min, rastvor izopropil estra (2-[(2-hloro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline (racemski 4.08 g, 10 mmol) u THF-u (15mL) je dodavan u kapima tokom 10 min. Smeši je dozvoljeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 72h. TLC odgovarajuća tačka sa autentičnim proizvodom je pokazala da je oko 5-10 % željenog proizvoda formirano u poređenju sa početnim nukleozidom.

Referenca

Primer 10-1. Priprema racemskog izopropil estra (±) 2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline.

Mešanom rastvoru pentafluorofenil fosforodihloridata (6.0 g, 20 mmol) u dihlorometanu (40 mL) je dodavan rastvor fenola i trietilamina (3.08 mL, 22 mmol) u dihlorometanu (40 mL) na -78°C tokom 20 min. Smeša je mešana na ovoj temperaturi tokom 30 min i potom prebačena u drugi erlenmajer sa okruglim dnom koji sadrži L-alanin izopropil estar hidrohlorid (3.35 g, 20 mmol) u dihlorometanu (100 mL) na 0 °C. Smeši je dodavana druga količina trietilamina (5.84 mL, 42 mmol) tokom 15 min. Smeša je mešana na 0°C tokom 1h i zatim je rastvor isparen. Ostatak je triturisan sa etil acetatom (60mL) i bela čvrsta supstanca je izdvojena filtriranjem. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo bledo žuto ulje kao smeša diastereomera u odnosu od 1:1.<31>P NMR (162 MHz, CDCl3): δ -0.49,-0.58. Dobijeni proizvod je prečišćen ekstrakcijom, kristalizacijom ili hromatografijom, kao što je gore navedeno.

Primer 10-2. Priprema diastereomerne smeše izopropil estra (S)-2-[(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline i izolovanje jednog diastereomera izopropil estra (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline putem kristalizacijom-indukovane dinamične rezolucije sa mnoštvom prinosa.

Dvolitarskom erlenmajeru sa okruglim dnom i tri grla, koji je opremljen sa mehaničkom mešalicom i termometrom koji može da meri niske temperature je dodato 60 g (284 mmol) fenil dihlorofosfata i 300 mL anhidrovanog dilorometana. Rastvor je ohlađen do 0°C pod atmosferskim azotom i pod izo-propil alanat hidrohloridna so (sušeno u peći in vacuo, 47.7 g, 284 mmol) je dodata brzo kao čvrsta supstanca. Smeša je mešana i ohlađena do -55°C u kadici sa suvim ledom i acetonom. Rastvor 60.32 g trietlamina (596 mmol) u 300 mL dihlorometana je dodavan kroz levak tokom 70 minuta. Bela mutna smeša je mešana na -55°C oko pola sata i zatim je temperatura podignuta do -5°C polako tokom 1.5 h. Prethodno ohlađena (sobna temperatura) smeša pentafluorofenola (52.42 g, 284 mmol) i trietilamina (32.11 g, 317 mmol) u 180 mL o dihlorometanu je dodavana smeši putem levka za dodavanjetokom 1 h na 0°C i dobijena smeša je mešana na 0°C tokom 4 časa. Beli talog (TEA•HCl) je izdvojen filtriranjem i ispran dihlorometanom (3x 50 mL). Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i beli čvrsti ostatak supstance je triturisan u 880 mL tbutil metil etru (TBME) na sobnoj temperaturi tokom jednog časa. Bela suspenzija je filtrirana i čvrsta supstanca je ispirana sa TBME (3x 150 mL). Čvrsta supstanca je raspoređena u smeši etil acetata (600 mL) i vode (150 mL). Organski sloj je izdvojen i ispran vodom (3 x 100 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4i koncentrovan kako bi se dobilo 29.92 g (66 mmol) proizvoda (SP-izomera, što je potvrđeno rentgenskom kristalografijom, infra) u obliku bele paperjaste čvrste supstance.

Gore navedeni filtrat TBME triturat je koncentrovan pod sniženim pritiskom do belog čvrstog ostatka i čvrsta supstanca je triturisana u 450 mL mešavine etil acetata i heksana (20:80, v/v) na sobnoj temperaturi tokom 75 minuta. Čvrsta supstanca (čvrsta supstanca 1) je sakupljena filtriranjem i ispira se sa 20% etil acetatom u heksanima (75 mL, 2x 30 mL). Dobijena tečnost je koncentrovana kako bi se dobila prljavo bela čvrsta supstanca koja je triturisana u 20% etil acetatu u heksanima (185 mL) na sobnoj temperaturi tokom 17 časova. Bela čvrsta supstanca (čvrsta supstanca 2) je sakupljen filtriranjem i isprana sa 20% etil acetatom u heksanima (2 x 10 mL). Čvrsta supstanca 1 i čvrsta supstanca 2 su kombinovane i rastvorene u 1.2 L etil acetata. Rastvor je ispran vodom (3x 150 mL), fiziološkim rastvorom (50 mL) i osušen preko MgSO4. Rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo 72.8 g (161 mmol) čistog proizvoda. Ukupna količina proizvoda je 102.72 g (226 mmol, 80%).<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.38-7.33 (m, 2 H), 7.27-7.24 (m, 2 H), 7.23-7.19 (m, 1 H), 5.04 (hept, 1 H), 4.18-4.09 (m, 1 H), 4.01-3.96 (m, 1 H), 1.45 (d, 3 H), 1.25 (dd, 6 H).<31>P NMR (CDCl3, 162 MHz) δ: -0.50.

Primer 10-3: Priprema diastereomerne smeše izopropil estra (S)-2-[(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline i izolacija jednog diastereomera izopropil estra (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline putem kristalizacijom-indukovane dinamične rezolucije u jednom prinosu.

U 1 L suvog erlenmajera sa tri grla koji je opremljen termometrom koji može da meri niske temperature i mehaničkom mešalicom je dodat fenil fosforodihloridat (25 g, 118.5 mmol). Anhidrovani dihlorometan (125 mL) je dodat i rastvor je ohlađen do 0°C. So estra alanina (sušena u peći) (19.86 g, 1 ekv) je brzo dodata pod N2 uz mešanje. Rastvor je ohlađen na oko -50°C (unutrašnja temperatura (u aceton/suvi led kadici pod N2). Rastvor trietilamina (25.2 g, 2.1 ekv.) u DCM-u (125 mL) je dodat u kapima putem levka za dodavanje tokom 0.5 h na -50°C i dobijena bela suspenzija je mešana na oko -50°C tokom 0.5 h. Smeši je dozvoljeno da se zagreje do 0°C tokom 1.5 h i zatim prethodno pripremljen ohlađeni rastvor pentafluorofenola (21.82 g, 1 ekv) i TEA (13.2 g, 1.1 ekv) (oprez: oslobađa se toplota dok se meša pentafluorofenol i TEA) u 75 mL DCM-a je dodavan vremenski tokom 0.5 h na 0°C putem levka za dodavanje. Smeša je mešana na 0°C dodatnih 4 h.

Smeša je filtrirana u Bihnerovom levku i sakupljen čvrst trietilamin hidrohlorid je ispran DCM-om (3 x 40 mL). Filtrat je proveren sa<31>P-NMR (odnos oko 1.14:1 je favorizovao donji pik SP-diastereomera) i podeljen na dva dela iste mase. Jedan od njih je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Beli ostatak čvrsti ostatak (31 g) je triturisan u smeši EtOAc i heksana (150 mL, 20:80, v/v) na sobnoj temperaturi tokom 17 h ostavljajući vreme za dinamično rastvaranje manje rastvorljivog SP izomer. Bela suspenzija je filtrirana i čvrsta supstanca je ispirana sa 20% EtOAc u heksanima (2x 25 mL). Čvrsta supstanca (22.58 g) je proverena sa<1>H-NMR i<31>P-NMR i sadržavala je proizvod kao jedan izomer kontaminiran sa trietilamin hidrohlornom soli. Čvrsta supstanca je rastvorena i podeljena u 310 mL od EtOAc i 100 mL vode. Nakon odvajanja organskog sloja, vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa EtOAc (50 mL). Kombinovani organski sloj je ispran vodom (3x 80 mL), fiziološkim rastvorom (50 mL) i osušen preko MgSO4. Rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom i potom osušen pod visokim vakumom na sobnoj temperaturi do konstantne mase kako bi se dobilo 17.36 g proizvoda u obliku bele čvrste supstance kao jedne polovine reakcije. Prinos je 64%. Gore navedena početna tečnost je koncentrovana do gumenog ostatka (7.89 g) koji sadrži reagense u odnosu od 1:1.2 (željeni/neželjeni) zasnovano na<31>P-NMR.

Referenca

Primer 10-4. Priprema izopropil estra (S)-2-[(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline

DCM (11.5 L) je sipan u čist i suv stakleni reaktor. Fenildihlorofosfat (2.3 kg, 10.9 mol) je sipan u reaktor pod azotom. Rastvor je zatim ohlađen do 0°C. L-Alanin izopropilestar hlorovodonične kiseline je (1.83 kg, 10.9 mol) zatim dodat od jednom i mešanje je nastavljeno tokom 30 min. Reakciona masa je ohlađena do -50°C unutrašnje temperature korišćenje suvi led/aceton kadice. Smeša TEA (2.1 ekv, 3.17 L) u DCM-u (11.5 L) je polako dodavana navedenom reakcionom rastvoru tokom 8 h kako bi se unutrašnja temperatura održala na -40 do -50°C. Nakon završetka dodavanja, reakcija se održava na istom temperaturnom opsegu tokom 1h. Smeša je polako zagrevana do 0°C tokom 4h.

U međuvremenu, u drugom reaktoru, DCM (6.9 L) je napunjen, i potom je pentaflurofenol (2.0 Kg, 10.9 mol) dodat pod azotom. Rastvor je ohlađen do 0°C, zatim je dodavan TEA (1.1 ekv, 1.65 L) u rastvor pentafluorofenola (egzotermno) tokom 2 h. Dobijeni rastvor je polako dodat prvom rastvoru koji sadrži fenil dihlorofosfat i estar amino kiseline dok je temperatura održavana između 0 do 5°C tokom 7 h. Nakon završetka dodavanja, mešanje je nastavljeno sa istim opsegom temperature tokom 4 h. Progres reakcije je posmatran HPLC-om. Kada je ostalo manje od 5% pentafluorofenola, reakcija je zaustavljena. Napominjemo da je hiralni HPLC pokazao jednaku smešu diastereomera proizvoda u ovom trenutku.

Reakciona suspenzija je filtrirana kroz Nučeov filter kako bi se uklonila većina suspendovane trietilamine hidrohlorne soli. Čvrsta so je isprana DCM-om u višku (9 L) i ovo ispiranje je dodato glavnom filtratu. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom na 35°C kako bi se dobio čvrst ostatak. Čvrst ostatak je uporedno isparen heksanima (4 L) kako bi se dalje smanjili nivoi prwostalog DCM-a. Ovom čvrstom ostatku dodato je 20% MTBE/Heksana 6 L i suspenzija je mešana tokom 17 h na temperaturi okoline i praćena HPLC-om. PH vrednost rastvora je ostala bazna zahvaljujući preostalom TEA. Za ovo vreme, odvijala se dinamična rezolucija u kojoj je istaložena čvrstanca supstanca željeni SP-4 izomer i supernatant je ostao u ekvilibrijumu između SP-4 i RP-4.

Suspenzija je propuštena kroz Nučeov filter i čvrsta supstanca kao željeni proizvod, koja je još uvek kontaminirana sa TEA hidrohlornom kiselinom, je isprana sa 5% MTBE/Heksanima (1 L). Čvrsta supstanca je rastvorena u etil acetatu (35 L) i rastvor je ispiran vodom (3 x 35 L) i fiziološkim rastvorom (10 L) zatim je rastvor osušen preko čvrstog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom održavajući temperaturu reaktora ispod 44°C. Čvrst ostatak je uporedno isparen sa heksanima (4 L). Reaktor je doveden do temperature okoline i dodato je 5% MTBE/Heksana (5 L). Gusta suspenzija je mešana tokom 15 min i zatim je čvrsta supstanca sakupljna filtriranjem. Sakupljena čvrsta supstanca je isprana heksanom (2.5 L) i sušena na visokom vakumu na temperaturi okoline do konstantne mase kako bi se dobio konačni proizvod (SP-4) u obliku bele čvrste supstance, 2.6 kg (53%); 99.5% čist pomoću HPLC-a, 0.4% drugog RP-4.

Referenca

Primer 10-5. Priprema (S)-izopropil 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2 il)metoksi)(fenoksi)-fosforilamino)propanoata.

Mešanom rastvoru 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-hidroksimetil-3-metiltetraidro-furan-2-il)-1H-pirimidin-2,4-diona (3, 2.6g, 10mmol) u suvom THF-u (50mL) je dodat 1.7M rastvor terc-butilmagnezijum hlorida (12.4mL, 21mmol, 2.1 ekviv.)) na sobnoj temeraturi tokom 15min. Nakon 30min, rastvor sirovog racemskog izopropil estra (2-[(2,3,4,5,6-pentafluoro fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline (4.08g, 10mmol) u THF-u (15mL) se dodaje u kapima tokom 10min. Smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 72h. TLC odgovarajuća tačka sa autentičnim proizvodom pokazala da je oko 40-50 % željenog proizvoda formirano u poređenju sa početnim nukleozidom.

Referenca

Primer 10-6. Priprema (S)-Izopropil 2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforilamino)propanoata (SP-4) koristeći izopropil estar (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline i prečišćavanje isključivo kristalizacijom.

Mešanom rastvoru od 3 (10g, 38.46mmol, sušen pod vakumom na 50°C tokom 20h) u suvom THF-u (165mL) je dodavan 1.7M rastvor terc-butilmagnezijum hlorida u THF-u (47.5 mL, 80.77 mmol) tokom 20min dok je erlenmajer čuvan u kadici sa hladnom vodom (5°C) pod atmosferom azota. Nakon završetka ovog dodavanja, kadica sa hladnom vodom je uklonjena i bela suspenzija je mešana na sobnoj temeraturi (20°C) tokom 30 min. Rastvor izopropil estra (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline (20.9 g, 46.11 mmol) u anhidrovanom THF-u (165 mL) je dodat reakcionoj smeši tokom 30 min. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi (20°C) tokom 3.5 h. Mešanje je nastavljeno tokom dodatnih 1.5 h, u ovom stadijumu TLC je pokazala >95% konverzije i neznačajnu razliku u intenzitetu nečistoće 3',5'-bis-fosforamidata od 2h. Reakciona smeša je kvenčovana zasićenom vodenim rastvorom NH4Cl (10 mL) i zatim je rastvarač isparen na 25°C. Ostatak je podeljen između etil acetata (400 mL) i zasićenog smeše amonijum hlorid (60 mL)/voda (20 mL). Organski sloj je izdvojen, ispran sa zasićenim amonijum hloridom (80 mL) i vodom (3 x 60 mL). Vodeni sloj je sve do ovog trenutka bio odvojen. Organski sloj je ispran sa 5% vodenim rastvorom natrijum karbonatom (3 x 50 mL) i vodom (2 x 60 mL). Prvi vodeni sloj je ekstrahovan dodatnim etil acetatom (100 mL), ispran vodom (2 x 20 mL) i zatim vodeni sloj dobijen ispiranjem sa natrijum karbonatom ekstrahovan istim ekstraktom etil acetata. Organski sloj je ispran vodom (2 x 20 mL) i kombinuje sa osnovnom količinom. Kombinovani organski slojevi sue sušeni anhidrovanim natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani kako bi se dobila penasta čvrsta supstanca (19.32 g). Ostatak je rastvoren u 60 mL dihlorometana (bela čvrsta supstanca je izdvojena u obliku taloga i formirao se kolač tokom 5 minuta) i zatim je dodato 25 mL IPE-a. Suspenzija je mešana na sobnoj tmperaturi tokom 2 h. Bela čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa 1:1 smešom hladnog (0°C) IPE/dihlorometana (20 mL) i osušena kako bi se dobilo 11.77 g (58% prinos) u obliku amorfne bele čvrste supstance. Navedena čvrsta supstanca je ponovo rastvorena u dihlorometanu (350 mL), filtrirana i isparena pod atmosferskim pritiskom (45°C temperatura kadice) do zapremine od ~120 mL. Rastvor je ostavljen da stoji na sobnoj temperaturi (21°C) tokom 20 h. Bela kristalna čvrsta supstanca (olvat dihlorometan) je sakupljena filtriranjem, isprana hladnim (0°C) dihlorometanom (10 mL) i osušena pod visokim vakumom tokom 4 h na sobnoj temperaturi kako bi se dobio čist nesolvatni proizvod (10.62 g, 52% prinos) u obliku belih iglica. HPLC čistoća 99.8%. Spektralne osobine odgovaraju onim vrednostima koje su ovde predstavljene.

Referenca

Primer 10-7. Priprema (S)-Izopropil 2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforilamino)propanoata (SP-4) korišćenjem izopropil estra (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline, modifikovani uslovi reakcije i ‘’work-up’’ i prečišćavanje isključivo kristalizacijom.

Mešanoj suspenziji 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (3,5.0 g, 19.1 mmol, ošušenoj pod vakumom na 50°C tokom 20 h) u suvom THF-u (75 mL) dodat je 1.7 M rastvor tercbutilmagnezijum hlorida u THF-u (23.7 mL, 40.35 mmol) korišćenjem levka za dodavanje tokom 30 min na -5°C. Bela suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 min i zatim zagrevana do temperature okoline (20°C) na kojoj temperaturi je mešana dodatnih 30 min. Reakciona smeša je ohlađena do 5°C i zatim je dodavan rastvor izopropil estra (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline (10.45 g, 23.06 mmol) u THF-u (50 mL) tokom 30 min. Smeša je mešana na 5°C tokom 18 h, ohlađena do -5°C i zatim kvenčovana sa 2N HCl (25 mL). Toluen (100 mL) je dodat smeši i zagrevan do sobne temperature. Nakon 20 min slojevi su razdvojeni. Organski sloj je ispran sa 1N HCl (2 x 10mL), vodom (10 mL), 5% vodenim rastvorom Na2CO3(4 x 10mL), vodom (2 x 10mL) i fiziološkim rastvorom (10 mL). Svi razblaženi slojevi su ponovo ekstrahovani sa toluenom (20 mL), isprani sa 5% vodenim rastvorom Na2CO3 (2 x 5 mL), vodom (10 mL) i fiziološkim rastvorom (5 mL). Kombinovani organski sloj je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i isparen do aproksimativne zapremine od 20 mL. Dihlorometan (20 mL) je dodat rastvoru i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 h. Čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa 1:1 MTBE/DCM smešom (2 x 10mL) i sušena pod visokim vakumom kako bi se dobila bela čvrsta supstanca (7.7 g). HPLC čvrste supstance je pokazalo u ovome 98.21% SP-4, 0.18% neizreagovane 3 i 0.67% 3',5'-bis-fosforamidatne nečistoće. Navedena čvrsta supstanca SP-4 je ponovo rastvorena u dihlorometanu (77 mL, zagrevano u posudi pod pritiskom na 55°C) i ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 20 h. Kristalna čvrsta supstanca je filtrirana i isprana sa hladnim dihlorometanom (5 mL, 0°C) i sušena pod visokim vakumom kako bi se dobio čist proizvod u obliku bele čvrste supstance (6.9 g, 68% prinos, 99.79% prečišćen pomoću HPLC-a).

Priprema i prečišćavanje C ili C' obezbeđuje direktan pristup bilo SP-4 ili RP-4, kao što je ilustrovano u sledećim primerima.

Referenca

Primer 11.

Priprema SP-4 (32 mg-skala): Mešanom rastvoru 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-hidroksimetil-3-metil-tetraidro-furan-2-il) -1H-pirimidin-2,4-diona 3 (32 mg, 0.12 mmol) u suvom THF-u (1mL) je dodavan 1M rastvor t-butilmagnezijum hlorida (0.26 mL, 0.26 mmol, 2.1 ekviv.)) na sobnoj temperaturi tokom 3 min. Nakon 30 min, rastvor izopropil estra (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline (8, SP-izomer) u THF-u (0.5mL) se dodaje u kapima tokom 3min. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 42h i zatim kvenčovana sa zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (10mL). Smeša je podeljena između etil acetata i vode. Kombinovani organski ekstrakt je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan. Ostatak je podvrgnut hromatografiji koristeći 0-4% gradijenta metanol/dihlorometn kako bi se dobilo SP-4 u obliku penaste čvrste supstance (29mg, 44.5% prinos).<1>H i<31>P NMR se poklapaju sa ovim što je ovde stavljeno na uvid javnosti.

Referenca

Primer 12.

Priprema SP-4 (2.6 g-skala, bez hromatografije): Mešanom rastvoru 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-hidroksimetil-3-metil-tetraidro-furan-2-il)-1H-pirimidin-2,4-diona (2.6 g, 10 mmol) u suvom THF-u (50 mL) je dodat 1.7 M rastvor tercbutilmagnezijum hlorida (12.4 mL, 21 mmol, 2.1 equiv)) na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Nakon 30 min, rastvor izopropil estra (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline (8, SP-izomer, 4.08g, 10mmol) u THF-u (15 mL) je dodavan u kapima tokom 10min. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 60h i zatim kvenčovana zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (20mL). Smeša je podeljena između etil acetata (150 mL) i sekventivno, 10% vodenog rastvora Na2CO3 (3 x 20 mL) i vode (20 mL). Kombinovani organski ekstrakt je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobio bledo žuti ostatak (3.8 g). Ostatak je rastvoren u dihlorometanu (7.6 mL) i potom mešan tokom 20h na sobnoj temperaturi. Bela čvrst supstanca je filtrirana, isprana sa 1:1 IPE/dihlorometanom (5 mL) i sušena pod vakumom kako bi se dobio proizvod u obliku bele čvrste supstance (1.85 g, 35% prinos).

Referenca

Primer 13. Priprema SP-4 koristeći NaHMDS:

Mešanom rastvoru 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-hidroksimetil-3-metiltetraidro-furan-2-il) -1H-pirimidin-2,4-diona (71 mg, 0.27 mmol) u suvom THF-u (2.0 mL) dodat je 2.0 M rastvor natrijum bi(trimetilsilil)amid (NaHMDS) u THF-u (270 µL, 0.54 mmol) na -78°C tokom 2 min. Nakon 30 min, rastvor izopropil estra (S)-2-[(S)-(4-nitrofenoksi)-fenoksi-fosforilamino]-propionske kiseline (8, SP-izomer, 111 mg, 0.27 mmol) u THF-u (1 mL) je dodat smeši. Reakciona smeša je mešana na ovoj temperaturi tokom 2h i zatim zagrevana do -20°C na kojoj temperaturi je mešana dodatnih 20h. TLC je pokazalo ~30% neizreagovanog početnog materijala nukleozida. Stoga, dodatnih 0.5 ekvivalenata reagensa (55 mg, 0.14 mmol) u THF-u (0.5 mL) je dodato reakcionoj smeši i mešano dodatnih 6h. Reakciona smeša je kvenčovana zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i zatim podeljena između etil acetata i vode. Kombinovani organski ekstrakt je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan kako bi se dobio svetlo braon ostatak. Kolonskom hromatografijom sirovog proizvoda koristeći 0-5% metanol/dihlorometan gradijent, dobijen je SP-4 (22 mg, 15% prinos), 3'-foshoramidat (5, SP-izomer, 11.5 mg, 16% prinos) i bifosforamidat (6, SP, SP-izomer, 12.6mg).

Referenca

Primer 14. Priprema Rp-4 (260 mg-skala):

Mešanom rastvoru 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-hidroksimetil-3-metiltetraidro-furan-2-il)-1H-pirimidin-2,4-diona (260 mg, 1 mmol) u suvom THF-u (6 mL) je dodat 1.7 M rastvor terc-butilmagnezijum hlorida (1.23 mL, 2.1 mmol, 2.1 ekviv.)) na sobnoj temperaturi tokom 5 min. Nakon 30 min, rastvor izopropil estra (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline (8, RP-isomer) u THF-u (3 mL) dodat je u kapima tokom 3 min. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 96 h i zatim kvenčovana sa zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (10 mL). Smeša je podeljena na etil acetat (50 mL) i vodu (2 x 20 mL). Kombinovani organski ekstrakt je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobio bledo žuti ostatak (490 mg). Ostatak je podvrgnut hromatografji koristeći 0-5% metanol/dihlorometan gradijent da se dobije proizvod u obliku bele čvrste supstance (160 mg, 30% prinos).

Pripremanje SP-4 ili RP-4 isto tako može da se postigne reakcijom 3'-zaštićenog 3 sa odgovarajućim reagensom C ili C' ili smešom koja sadrži C i C', kao što je ilustrovano u sledećim primerima.

Referenca

Primer 15. Priprema SP-4 sa 3a kao Sintetičkim intermedijerom

Referenca

Primer 15-1. Sinteza 5'-O-terc-butildimetilsilil-2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (9):

Mešanom rastvoru 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (3, 81.1 g, 312 mmol) u suvom piridinu (750 mL) dodavan je u kapima rastvor TBDMSCl (103.19 g, 685.6 mmol) u suvom piridinu (500 mL) tokom 45 min na temperaturi okoline. Reakcija je mešana na temperaturi okoline tokom 24 h. Metanol (85 mL) je dodat reakcionoj smeši i ostavljen da se meša tokom 10 min i zatim su rastvarači izdvojeni destilovanjem pod sniženim pritiskom. Vruća voda (45°C) (1 L) je dodata reakcionoj masi i smeša je ekstrahovana sa etil acetatom (2 x 500 mL), isprana sa vodom (1 x 500 mL). Organski sloj je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Etil acetat je izdvojen destilovanjem i dobijeni ostatak uporedno isparen sa toluenom (2 x 500 mL) kako bi se dobila sirova supstanca 9 u obliku bele pene. Prinos = 116.9 g (kvantitativno).<1>H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 0.1 (s,6H), 0.91 (s, 9H), 1.22 (d, 3H, J = 21 Hz), 2.50 (s, 2H), 3.75-4.05 (m,4H), 5.54 (d, 1H, J = 9 Hz), 5.73 (s, 1H), 6.0 (d, 1H, J = 18 Hz), 7.81 (d, 1H, J = 9 Hz), 8.57 (br, s, 1H), 11.1 (s, 1H).

Referenca

Primer 15-2. Sinteza 5'-O-(terc-butildimetilsilil)-3'-O-levulinil-2'-deoksi-2'-fluoro 2'-C-metil-uridina (10):

Mešanom rastvoru nukleozida 9 (116.9 g, 312.1 mmol) u DCM-u (1 L) je dodat DMAP (30.5 g, 249.7 mmol) i ovo je ostavljeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 20 min. Rastvor anhidrovane levulinske kiseline (133.6 g, 642.3 mmol) u DCM-u (200 mL) je dodat smeši i mešan tokom 24 h. TLC smeše je pokazao na završetak reakcije. Hladna voda (500 mL) je dodata i smeša je mešana tokom 20 min. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je ipran sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (2 x 250 mL), sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i potom je rastvor destilovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo žuto ulje. Sirov prinos: 197.6 g (135 %). Materijal je kao takav korišćen za sledeći korak.<1>H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 0.11 (s, 6H), 0.94 (s, 9H), 1.34 (d, 3H, J = 21 Hz), 2.22 (s, 3H), 2.6-2.89 (m, 4H), 3.72 (m, 1H), 4.01 (d, 1H, J = 12 Hz), 4.23 (d, 1H, J = 9 Hz), 5.33 (dd, 1H, J = 15 Hz), 5.73 (d, 1H, J = 6 Hz), 6.26 (d, 1H, J = 15 Hz), 8.12 (d, 1H, J = 12 Hz), 8.72 (br, s, 1H).

Referenca

Primer 15-3. Sinteza 3'-O-levulinil-2'-deoksi-2'-fluoro 2'-C-metil-uridina (3a): Sirova supstanca 10 (197.6 g, ~312.1 mmol) je rastvorena u DCM-u (1 L) u koji je dodat TEA.3HF (50.3 g, 312.1 mmol) i mešana preko noći na temperaturi okoline. TLC mešavine je pokazao oko 50 % završene reakcije. Još jedan ekvivalent TEA.3HF (50.3 g, 312.1 mmol) je dodat i reakciona smeša je mešana tokom 6 h. TLC u ovom trenutku je pokazao oko 10 % g neizreagovanog početnog materijala. Još jedan 0.25 ekv od TEA.3HF (12.5 g, 78.0 mmol) je dodat i reakciona smeša je mešana tokom noći. Reakciona smeša je koncentrovana do suve materije kako bi se dobilo žuto ulje. Sirova supstanca iz svih serija je prečišćena hromatografski na silika gel koloni (0-2% MeOH u DCM-u) kako bi se dobilo 124.1 g 3'-levulinat u obliku bele penaste čvrste supstance (90% prečišćeni prinos preko tri koraka od 2'-deoksi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina).<1>H NMR: (CDCl3, 400 MHz) δ 1.55 (d, 3H, CH3, J = 20 Hz), 2.36 (s, 3H, CH3), 2.8-3.03 (m, 5H, CH2CH3), 3.91-3.96 (dd, 1H, CH"), 4.2-4.25 (m, 1H, CH'), 4.34 (dd, 1H, CH, J = 8 Hz), 5.25 (dd, 1H, J =16 Hz), 5.93 (d, 1H, J = 8 Hz), 8.20 (d, 1H, J = 8 Hz), 9.18 (s, 1H).

Referenca

Primer 15-4. Stereoselektivna sinteza (S)-izopropil estra (S)-2-{[((1R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-(R)-fluoro-3-(4-oksopentanoil)-4-metiltetrahidro-furan-2-ilmetoksi]-fenoksi-fosforilamino}-propionske kiseline (11):

Rastvoru nukleozida (3a, 1.00 mmol, 358 mg) u 5 ml anhidrovanog THF-a koji je ohlađen do 0°C dodat je tBuMgCl (1.7 M in THF, 2 ekv) i ostavljen da se zagreje do temperature okoline i meša tokom pola sata. Ovoj smeši je dodat reagens (oko 97% hiralna čistoća) izopropil estar (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline (8, SP-isomer) (408 mg, 1.00 mmol, 1.00 ekv) od jednom i mešan je na sobnoj temperaturi. Nakon 16 h, ostalo je ~30% početnog materijala. Reakciona smeša je kvenčovana zasićenim rastvorom NH4Cl 10 ml, i vodena faza je ekstrahovana sa etil acetatom (3 x25 ml). Kombinovani organski sloj je ispran fiziološkim rastvorom i osušen preko anhidrovanog Na2SO4 i isparen do suve supstance kako bi se dobila bledo žuta pena. (500 mg). Ovo je podvrgnuto hromatografiskom prečišćavanju na silika gel koloni uz korišćenje 2-5% metanol u metilen hloridu kako bi se dobio proizvod u obliku bele pene (275 mg) od oko 97% P hiralne čistoće i početnog materijala koji nije reagovao (162 mg). Na osnovu utrošenog početnog materijala, prinos je bio 76%.<31>P NMR (CDCl3, 162 MHz): 3.7 ppm;<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.22 (dd, 6H, J = 6.4 Hz), 1.37 (s, 3H), 1.58 (s, 3H), 2.18 (s, 3H), 2.63-2.9 (m, 4H), 4.0 (d, 1H, J = 8 Hz), 4.2-4.33 (m, 1H), 4.57 (d, 1H, J = 8Hz), 4.96-5.00 (sept, 1H), 5.2 (dd, 1H, J = 9 Hz), 5.42 (d, 1H, J = 8Hz), 6.19 (d, 1H, J = 18Hz), 7.15-7.35 (m, 5H), 7.5 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 8.2 (br, s, 1H).

Referenca

Primer 15-5. Sinteza (S)-izopropil estra (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-(R)-fluoro-3-hidroksi-4-metil-tetrahidrofuran-2-ilmetoksi]-fenoksi-fosforilamino}-propionske kiseline (SP-4)

Rastvor natrijum sulfata je pripremljen dodavanjem Na2S2O3(1.51 g) i Na2S2O5(0.57 g) vodi (25 mL). Rastvoru levulinat kiseline (11, 250 mg, 0.40 mmol) u anhidrovanom THF-u (2.5 mL) je dodat 1.0 ml rastvora natrijum sulfata. Ovo je mešano na sobnoj temperaturi tokom 4 h. Reakciona smeša je sipana u vodu (15 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (3x25 mL) osušena i isparena kako bi se dobio kvantitativni proizvod u obliku bele čvrste supstance sa oko 97% P hiralne čistoće što poklapa sa fizičkim i spektralnim svojstvima SP-4 koji je proizveden direktno iz nezaštićenog nukleozida.

Referenca

Primer 16. Alternativni postupak za pripremu SP-4 od 3a.

Mešanom rastvoru estra 4-okso-pentanske kiseline (2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-diidro-2H-pirimidin-1-il)-4-fluoro-2-hidroksimetil-4-metil-tetraidro-furan-3-ila (3a, 210 mg, 0.59 mmol) u suvom THF-u (1.5 mL) je dodat 1.7 M rastvor terc-butilmagnezijum hlorida (1.07 mL, 1.82 mmol) na sobnoj temperaturi tokom 2 min. Inicijalno, primećen je beli talog i nakon 10 min reakciona smeša je postala tamno žuti rastvor. Nakon 30min, rastvor izopropil estra (S)-2-[(S)-(4-nitrofenoksi)-fenoksi-fosforilamino]-propionske kiseline (8 (SP-izomer), 382mg, 0.94mmol) u THF-u (1.5mL) je dodavan u kapima tokom 3min. Smeša je zagrevana na 40°C tokom 5h a za to vreme TLC i<1>H NMR su pokazali manje od 2% početnog materijala koji nije reagovao. Reakcija je kvenčovana sa zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i zatim podeljena između etil acetata i vode. Kombinovani organski sloj je ispran sa 10% vodenim rastvorom Na2CO3 (3 x 10 mL), nakon čega sa vodom. Organski sloj je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan kako bi se dobio ostatak braon boje (410 mg). Sirov proizvod je rastvoren u tetrahidrofuranu (1.0 mL) i zatim je dodat vodeni rastvor rastvor smeše natrijum sulfita (37 mg, 0.295 mmol) i natrijum metabisulfita (224 mg, 1.18 mmol) u 1mL vode. Smeša je zagrevana do 45°C tokom 20 h u ovom stadijumu je samo oko 10% konverzije primećeno po TLC-u, stoga sudodatni natrijum sulfit (74 mg) i natrijum metabisulfit (448 mg) dodati i zagrevanje je nastavljeno tokom dodatnih 52 h. U ovom trenutku je, oko 40% konverzije je primećeno po TLC-u. Reakciona smeša je podeljena uzmeđu vode i etil acetata. Kombinovani organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan kako bi se dobio braon ostatak (210 mg). Kolonskom hromatografijom ostatka korišćenjem 0-5% MeOH/DCM gradijenta dobijen je neizreagovani početni materijal (89mg) i SP-4 (57mg, 18% prinos, 24% na osnovu regenerisanog početnog materijala).

Referenca

Primer 17. Priprema SP-4 sa 3c u obliku sintetičkog intermedijera

Referenca

Primer 17-1. Priprema 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsilaniloksi)-3-fluoro-5-hidroksimetil-3-metil-tetrahidrofuran-2-il]-1H-primidin-2,4-diona, 12.

Rastvoru od 3 (10.0g, 38.43 mmol) u piridinu (50 mL) je dodat dihlorometan (50 mL). Rastvor je ohlađen do 0°C. Rastvoru je dodat 4,4'-dimetoksitritil hlorid (14.32 g, 42.27 mmol) i rastvor je mešan na 0°C tokom 5 h. Metanol (5 mL) je dodat kako bi se reakcija zaustavila. Rastvor je koncentrovan do isušivanja pod sniženim pritiskom i ostatak je podeljen između etil acetata (500 mL) i vode (50 mL). Organski rastvor je ispran sa fiziološkim rastvorom (50 mL) i osušen (natrijum sulfatom, 4 g). Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i ostatak je rastvoren u dihlorometanu (100 mL). U rastvor je dodat imidazol (7.83 g, 115 mmol) i t-butildimetilsilil hlorid (8.68 g, 57.6 mmol). Rastvor je mešan na ambijentalnoj temperaturi tokom 16 h. Metanol je dodat kako bi se reakcija zaustavila (5 mL) i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i ostatak je podeljen između etil acetata (500 mL) i vode (50 mL). Organski rastvor je sušen (natrijum sulfat, 4 g) i isparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen kolonskom hromatografijom (10-40% EtOAc u Heksanu) kako bi se dobilo 5'-O-DMT-3'-O-tBDMS intermedijera. Ovo je dalje tretirano 1% trifluoroacetatnom kiselinom u dihlorometanu (200 mL). Rastvor je mešan na temperaturi okoline tokom 1h. Voda (20 mL) je dodata i rastvor je mešan na temperaturi okoline dodatnih sat vremena. Metanol (5 mL) je polako dodavan i rastvor je mešan na temperaturi okoline dodatnih 1h. Amonijum hidroksid je dodatkako bi se pH vrednost rastvora podesila na 7. Organski rastvor je izdvojen, osušen (natrijum sulfat, 4 g) i isparava do isušenja pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gel koloni (1-5% metanol u dihlorometanu) kako bi se dobilo 12 u obliku bele čvrste supstance 7.5g u 50% prinosu u tri koraka.<1>H NMR (DMSO-d6) δ (ppm) 11.48 (br s, 1H, NH), 7.94 (d, 1H, H-6), 6.00 (d, 1H, H-1'), 5.69 (d, 1H, H-5), 4.06 (dd, 1H, 3'-H), 3.85 (m, 2H, H-5'a, H-4'), 3.58 (br d, 1H, H-5'b), 1.27 (d, 3 H, 2-CH3), 0.89 (s, 9H, C(CH3)3), 0.12 (s, 6H, Si(CH3)2).

Referenca

Primer 17-2. Priprema SP-4 korišćenjem 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(tercbutildimetilsilaniloksi)-3-fluoro-5-hidroksimetill-3-metil-tetrahidrofuran-2-il]-1H-pirimidin-2,4-diona (3c).

Mešanom rastvoru 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsilaniloksi)-3-fluoro-5-hidroksimetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il]-1H-pirimidin-2,4-diona (12, 374 mg, 1 mmol) u suvom THF-u (3 mL) je dodat 1.7 M rastvor terc-butilmagnezijum hlorida (1.8 mL, 3.1 mmol)) na sobnoj temperaturi tokom 2 min. Inicijalno, primećen je beli talog i nakon 10 min reakciona smeša je pretvorena u bistar tamno žuti rastvor. Nakon 30 min, rastvor izopropil estra (S)-2-[(S)-(4-nitrofenoksi)-fenoksi-fosforilamino]-propioniske kiseline (8, SP-izomer, 653 mg, 1.6 mmol) u THF-u (2.5 mL) je dodvan u kapima tokom 3 min. Smeša je zagrevana na 40°C tokom 20 h u toku čega su TLC i<1>H NMR pokazali manje od 5% početnog materijala koji nije reagovao. Reakciona smeša je kvenčovana sa zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i potom podeljena između etil acetata i vode. Organski sloj je opran sa 10% vodenog rastvora Na2CO3(3 x 10 mL), zatim vodom (20 mL). Organski sloj je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan kako bi se dobio braon ostatak koji sadrži 3c (850 mg). Sirovi proizvod je rastvoren u tetrahidrofuranu (2 mL) i dodat je 0.8 mL 80% vodenog rastvora mravlje kiseline na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zagrevana do 50°C tokom 96h. Oko 70% konverzije je primećeno pomoću TLC-a. Reakciona smeša je sipana u hladni zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata i zatim podeljena između etil acetata i vode. Kombinovani organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan kako bi se dobio braon ostatak (220 mg). Kolonskom hromatografijom ostatka koristeći 0-5% MeOH/DCM gradijent dobijen je početni materijal koji nije reagovao (21 mg) i SP-4 (77 mg, 35% prinos, 39% prinos na osnovu regenerisanog početnog materijala).

Referenca

Primer 18. Priprema SP-4 sa 3d kao sintetičkim intermedijerom

Referenca

Primer 18-1. Priprema 3d

Mešanom rastvoru 3 u piridinu (20 mL) na 0°C je dodavan TIPDS-Cl u kapima tokom 15 min. Smeša je polako zagrevana na sobnu temperaturu na kojoj je mešana tokom 16 h. Piridin je isparen i ostatak uporedno isparen sa toluenom (50 mL). Ostatak je triturisan sa heksanima i beli talog je izdvojen filtriranjem koristeći ploču Celita. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobila penasta čvrsta supstanca (12.97 g). Sirovi proizvod (13) je ponovo rastvoren u tetrahidrofuranu (75mL) i dodavan je vodeni rastvorr TFA (75mL, 1:1 TFA/voda) na 0°C tokom 20 min. Smeša je mešana na ovoj temperaturi tokom 6 h. TLC ukazuje na ~5% početnog materijala. Reakciona smeša je kvenčovana sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3 sve dok nije dobijena pH vrednost od 8 i potom ekstrahovana sa etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakt je ispran vodom, osušen i koncentrovan kako bi se dobila bela kristalna čvrsta supstanca. Daljim triturisanjem čvrste supstance heksanimom (30 mL) dobijena je bela čvrsta supstanca koja je filtrirana i osušena pod visokim vakumom kako bi se dobilo 3d (10.1 g, 84 % prinos preko 2 koraka).

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.83 (bs, 1H), 7.94 (bd, J=6.0Hz, 1H), 6.10 (bd, J=18.4Hz, 1H), 5.71 (d, J=8.2Hz, 1H), 4.43 (bs, 1H), 4.36 (dd, J=22.6, 9.0Hz, 1H), 4.27 (bs, 1H), 4.10(d, J=13.2Hz, 1H), 4.03 (d, J=9.2Hz, 1H), 3.92 (d, J=13.2Hz, 1H), 1.39 (d, J=22.0Hz, 3H), 1.11-0.92 (m, 28H).

Referenca

Primer 18-2. Priprema SP-4

Mešanom rastvoru od 3d (520 mg, 1 mmol) u suvom THF-u (5 mL) dodat je 1.7M rastvor terc-butilmagnezijum hlorida (1.8 mL, 3.1 mmol, 3.1 ekviv.)) na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Nakon 30 min, rastvor izopropil estra (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline (8, SP-izomer, 653 mg, 1.6 mmol) u THF-u (1 mL) je dodavan u kapima tokom 3 min. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 60 h.<1>H i<31>P NMR sirovog uzorka je ukazao na smešu diastereomera u odnosu oko 1:0.76. Reakciona smeša je kvenčovana zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (20 mL). Smeša je podeljena između etil acetata (150 mL) i redom, 10% vodenog rastvora Na2CO3 (3 x 20mL) i vode (20 mL). Kombinovani organski ekstrakt je sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobio bledo žuti ostatak (14, 878 mg).

Navedeno jedinjenje, 14, je ponovo rastvoreno u tetrahidrofuranu (3 mL) i zatim je dodat 80% vodeni rastvor mravlje kiseline. Smeša je zagrevana na 55°C tokom 20h. Reakciona smeša je ohlađena do 0°C, i zatim kvenčovana zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (pH 7.0). Reakciona smeša je onda podeljena između etil acetata i vode. Kombinovani organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i koncentrovan kako bi se dobilo 560mg ostatka. Ostatak je podvrgnut hromatografiji koristeći 0-5% metanol/dihlorometan gradijent kako bi se dobio početni materijal koji nije reagovao (14, 242mg) i SP-4 (80mg, 15% prinos) u obliku bele čvrste supstance.

Referenca

Primer 19. Priprema Izotopski obeleženog SP-4

Referenca

Primer 19-1. Priprema 1-((6aR,8R,9R,9aS)-9-hidroksi-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona, 16

Uridin (15, 100.0 g, 409.5 mmol) je ponovo uparen do isušivanja sa anhidrovanim piridinom (600 mL) i ponovo suspendovan u anhidrovanom piridinu (700 mL). U ovu mešanu suspenziju je dodavan 1,3-dihloro-1,1,3,3-tetraizopropildisiloksan (135.7 g, 482.5 mmol) tokom 60 min na temperaturi okoline. Nakon mešanja fine suspenzije tokom 17 h na temperaturi okoline, reakcija je dalje kvenčovana dodavanjem metanola (20 mL) i zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je podeljen između etil acetata (1.5 L) i vode (2 L). Organski sloj je dalje ispran sa 5% hlorovodoničnom kiselinom (2 x 1 L), fiziološkim rastvorom (500 mL), sušen preko čvrstog natrijum sulfata (50 g), filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom do sirovog proizvoda, oko 250 g. Ostatak je podvrgnut kolonskom filtriranju koristeći silika gel (1.75 kg) i gradijent etil acetata u heksanima 20-65%. Čiste frakcije prozvoda, što se procenjuje pomoću homogenoe TLC-a (Rf 0.55 u odnosu 1:1 heksani-etil acetat) su kombinovane i koncentrovane pod sniženim pritiskom i osušene (40°C, 0.2 mm Hg, 24 h) kako bi se dobilo 145.5 g (76%) od 16 u obliku bele čvrste pene.

Još jedna frakcija (35 g) blago nečistog 16 je takođe skupljena.<1>H NMR (DMSO-d6) δ (ppm) 11.35 (s, 1H, NH), 7.66 (d, 1H, J = 7.6 Hz, H-6), 5.57 (d, 1H, J = 4.8 Hz, 2'-OH), 5.50-5.49 (m, 2H, 1'-H i H-5), 4.14-4.18 (m, 3H, 2', 3', 4'-H), 3.97-3.87 (m, 2H, 5'-Ha i Hb), 1.02-0.95 (m, 28H, CH(CH3)2).

Referenca

Primer 19-2. Priprema 1-((6aR,8R,9aR)-2,2,4,4-tetraizopropil-9-oksotetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona, 17

U suvi erlenmajer sa okruglim dnom i sa tri grla je dodat anhidrovani DCM (600 mL) i DMSO (30.82 g, 394.5 mmol). Rastvor je ohlađen do-78°C u suvoj led/aceton kadici pod atmosferskim azotom. Trifluoro sirćetni anhidrid (čist, 77.7 g, 369.8 mmol) je dodavan špricem tokom 40 min i dobijena je zamućena smeša. Smeši je dodavan rastvor derivata uridina 16 u DCM (600 mL) u kapima tokom 75 min na -78°C putem levka nza dodavanje. Heterogena smeša je mešana tokom 2 h na -78~-65°C i zatim je dodat anhidrovani trietilamin (92 mL) brzim ubrizgavanjem da se dobije bistro žuti rastvor. Posle I h na niskoj temperaturi, reakcija je završena kako je prikazano u TLC-ijem (30% EtOAc u heksanima). Kadica za hlađenje je uklonjena i reakciona smeša je polako zagrevana do temperature okoline tokom 1 h. Reakcija je kvenčovana dodatkom zasižćenog NH4Cl (180 mL). Voda (200 mL) je dodata i izdvojen je organski sloj. Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa DCM-om (300 mL). Kombinovani organski sloj je ispran vodom (3x 400 mL), fiziološkim rastvorom (150 mL), i sušen preko Na2SO4. Uklanjanjem rastvarača dobijen je lepljivi braon ostatak.

Sirov uljani ostatak (koji sadrži tragove DCM-a) je odložen preko noći u zamrzivaču. Nakon čitave noći, primećeno je stvaranje izvesne kristalne čvrste supstance u ulju. Ulje je ponovo rastvoreno u 500 ml heksana na temperaturi okoline. Rastvor je odložen u friz tokom 24 časa i formirano je više čvrste supstance. Čvrsta supstanca je sakupljena putem filtriranja i ispirana hladnim 10% DCM-om u heksanima (1 L) kako bi se otklonila većina narandžaste boje. Čvrsta supstanca (17) je sušena pod vakumom tokom 2 h i potom je ostavljena da se suši na vazduhu tokom 24 h. Čvrsta supstanca ima masu od 21 g pošto je osušena na 50 °C pod vakumom. Filtrat je koncentrovan i ostatak je prečišćen putem kolonske hromatografije (10-70% etil acetat u heksanima) kako bi se dobilo dodatnih 37 g (kombinovanog prinosa od 97%) od 17 u obliku svetlo narandžastog čvrstog ostatka.

Referenca

Primer 19-3. Priprema 1-((2R,3S,4R,5R)-3,4-dihidroksi-5-(hidroksimetil)-3-<13>C-perdeuteriometiltetrahidrofuran-2-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona, 18

Magnezijum (3.53 g, 147 mmol), je ispran sa 5% vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline i osušen (50°C, 0.2mm Hg, 24 h), stavljen je u erlenmajer sa okruglim dnom koji ima sa dva grla i opremljen je sa magnetskom mešalicom i kondenzatorom. Erlenmajer se puni gasom argona i potom je dodavan anhidrovani etar (80 mL). Magnezijumu koji se nalazi u etru je polako dodavan perdeuterio-<13>C metil jodid (15.06 g, 110.3 mmol), koji generiše egzotermnu reakciju. Pošto je reakciona smeša ohlađena, supernatant je prenesenu rastvor osušenog jedinjenja 17 (50°C, 0.2mm Hg, 15 h) (10.0 g, 20.63 mmol) u anhidrovanom THF-u (1 L) na -50°C tokom 20 min. Temperaturi se dopušta da se podigne do -40°C i smeša je mešana između -40 i -25°C tokom 4h. Po završetku reakcije, smeša je razblaženasa EtOAc (1L) na -50 °C i potom je polako dodavan fiziološki rastvor (300 mL). Organski sloj je odvojen i potom ispran sa zasićenim rastvorom amonijum hlorida (300 mL x 2) i osušen sa natrijum sulfatom. Posle filtriranja i koncentrovanja pod sniženim pritiskom, ostatak je rastvoren u MeOH (250 mL). Amonjum fluorid (12 g) i TBAF (400 mg) su dodati. Dobijena smeša je mešana na 90°C tokom 7h i zatim koncentrovana sa silika gelom (20 g) pod sniženim pritiskom. Nakon temeljnog sušenja pod vakumom, dobijeni ostatak je prečišćen uz pomoć ‚‘‘flash‘‘ hromatografije na slilika gel koloni i (MeOH:CH2Cl2 = 1:20 to 1:10) daje jedinjenje 18 (5 g, 46%) u obliku belog čvrstog ostatka.<1>H NMR (DMSO-d6) δ (ppm) 11.26 (s, 1H, NH), 7.65 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H-6), 5.77 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H-1'), 5.57 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H-5), 5.46 (d, 1H, J= 5.2 Hz, HO-3'), 5.24 (d, 1H, J= 2.4 Hz, HO-2'), 5.14 (t, 1H, J= 5.6 Hz, HO-5'), 3.74-3.56 (m, 4H, H-3', 4', 5', 5").

Referenca

Primer 19-4. Priprema ((2R,3R,4S,5R)-3-acetoksi-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-hidroksi-4-<13>C-perdeuteriometiltetrahidrofuran-2-il)metil acetata, 19

Rastvoru jedinjenja 18 (5.00 g, 19.1 mmol) u anhidrovanom piridinu (100 mL) je dodat anhidrid sirćetne kiseline (3 mL) na temperaturi okoline. Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 15h, razblažena sa EtOAc (250 mL), isprana sa vodom (50 mL x 3), i osušena sa natrijum sulfatom. Nakon filtriranja i koncentrovanja, ostatak je prečišćen kolonskom ‘‘flash‘‘ hromatografijom (MeOH 0 to 5% u CH2Cl2) kako bi se dobilo jedinjenje 19 (4.0 g, 68%) u obliku sive čvrste supstance.

Referenca

Primer 19-5. Priprema ((2R,3R,4R,5R)-3-acetoksi-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-4-<13>C-perdeuteriometiltetrahidrofuran-2-il)metil acetata, 20

U rastvor jedinjenja 19 (2.33 g, 6.73 mmol) u anhidrovanom CH2Cl2 (60 mL) je polako dodavan DAST (1.33 mL, 10.1 mmol) na -78°C. Dobijena smeša je mešana tokom 30 min nakon što je izložena temperaturi okoline. Dodatne dve reakcije na 2.33 g skali i jedna na 1.00 g su izvedene na potpuno isti način. Sve četiri reakcione smeše su spojene, razblažene sa CH2Cl2(300 mL), i ispirane sa ledenom vodom (100 mL x 2) i zatim hladnim razblaženim rastvorom NaHCO3(100 mL x 2). Nakon sušenja, filtriranja i koncentrovanja, ostatak je prečišćen kolonskom ‘‘flash‘‘ hromatografijom na silika gelu (EtOAc 0% do 50% u heksanima, jedinjenje je izašlo oko 48%) kako bi se dobilo jedinjenje 20 (2.0 g, 24% od ukupno 7.99 g jedinjenja 19) u obliku bele čvrste supstance.<1>H NMR (CDCl3) δ (ppm) 8.27 (s, 1H, NH), 7.55 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H-6), 6.17 (d, 1H, J = 18.8 Hz, H-1'), 5.78 (dd, 1H, J = 1.2, 8.4 Hz, H-5), 5.12 (dd, 1H, J = 9.6,21.6 Hz, H-3'), 4.40-4.31 (m, 3H, H-4', 5', 5"), 2.19 (s, 3H, CH3), 2.15 (s, 3H, CH3).

Referenca

Primer 19-6. Priprema 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)-3-<13>C-perdeuteriometiltetrahidrofuran-2-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona, 21

Rastvoru jedinjenja 20 (2 g, 5.74 mmol) u metanolu (20 mL) se dodaje n-butilamin (6 mL). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15h i koncentrovana sa silika gelom in vacuo. Dobijeni ostatak je prečišćen kolonskom ‘’flash’’ hromatografijom na silika gelu (MeOH 0 do 10% u CH2Cl2) da se dobije jedinjenje 21 (1.3 g, 85%) u obliku bele čvrste supstance. H NMR (CD3OD) δ (ppm) 8.08 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H-6), 6.13 (d, 1H, J = 18.4 Hz, H-1'), 5.70 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H-5), 3.99 (d, 1H, J= 13.6 Hz, H-5'), 3.97-3.91 (m, 2H, H-3', 4'), 3.80 (dd, 1H, J = 2.0, 12.8 Hz, H-5"), ESMS (M+1) procenjeno 265, opaženo 265.

Referenca

Primer 19-7. Priprema (S)-Izopropil 2-((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-<13>C-perdeuteriometiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforilamino)propanoata, 22

Rastvoru nezaštićenog nukleozida 21 (207 mg, 0.783 mmol) i N-metilimidazola (0.4 ml, 5 mmol) u THF-u (4 mL) dodat je unapred napravljen fosforohloridat u THF-u (1.0 M, 2.35 ml, 2.35 mmol) na 0°C u kapima. Reakcija je polako zagrevana do temperature okoline tokom 1 h i zatim je dodata voda (1 mL) i EtOAc (5 mL). Organski rastvor je ispran sa zasićenim vodenim rastvorom monobaznog natrijum citrata (2 x 2 ml), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(1 x 2 ml), osušen (MgSO4) i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen kolonskom hromatografijom na silika gelu koristeći 0 do 5%<i>PrOH u CH2Cl2 kao eluente da se dobije fosforamidat, 22 (216 mg, 52%, 1:1 mešavina od P-diastereomera) u obliku bele čvrste supstance: H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.54 (s, 1H), 7.56 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.40-7.35 (m, 2H), 7.23-7.18 (m, 3 H), 6.14-5.96 (m, 2H), 5.89 (dd, J = 5.6, 25.6 Hz, 1H), 5.55 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 4.85 (dq, J = 1.6, 6.0 Hz, 1H), 4.44-4.32 (m, 1H), 4.25 (m, 1H), 4.06-3.98 (m, 1H), 3.86-3.70 (m, 2H), 1.30-1.08 (m, 9H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 4.90, 4.77; LRMS (ESI) [M H]<+>izračunato za C21<13>CH27D3FN3O9P 534.5, nađeno 534.4.

Referenca

Primer 19-8. Priprema (2S)-2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-<13>C-perdeuteriometiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(hidroksi)fosforil)amino)propanske kiseline, 23

Fosforamidat 22 (147 mg, 0.276 mmol) je suspendovan u trietilamin (2 mL) i vodi (0.5 mL), i zagrevan je na 60°C tokom 30 h. Zatim su isparive komponente isparene pod sniženim pritiskom. Sirov proizvod je prečišćen kolonskom hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa 50-70%<i>PrOH u CH2Cl2 i potom, 0 do 20% NH4OH u<i>PrOH da se dobije 23 u obliku bele čvrste supstance (95 mg, 83%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.98 (d, J = 19.2 Hz, 1H), 5.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.02-3.81 (m, 4H), 1.10 (d, J= 6.8 Hz, 3H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 8.12; LRMS (ESI) [M H]<+>izračunato za C12<13>CH17D3FN3O9P 416.3, nađeno 416.4.

Osobine uzoraka RP-44, i SP-4

Uzorci RP-4, 4, i SP-4 su analizirani Rentgenskom praškovnom difrakcijom (XRPD), Nuklearno-magnetno-rezonantna spektroskopija (NMR), Infracrvenom spektroskopijom s Fourierovom transformacijom (FT-IR), Diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC), Toplotna gravimetričnom analizom (TGA), Gravimetričnom sorpcijom pare (GVS), Termodinamičkom rastvorljivosti u vodi i Tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC).

Referenca

Primer 20. Rentgenska praškovna difrakcija

Uzorci od RP-4, 4, i SP-4 se analiziraju Rentgenskom praškovnom difrakcijom (XRPD) pod sledećim režimom.

a. Bruker AXS/Siemens D5000 (difraktormer)

Sheme Rentgenske praškovne difrakcije se skupljaju na Siemens D5000 diffraktometru korišćenjem Cu Kα radiacije (40kV, 40mA), θ-θ goniometra, divergenciju od V20 sa primajućim prorezima, sekundarni grafički monohromator i scintijlacijski brojač. Performanse instrumenta se proveravaju korišćenjem sertifikovanog Korund stiard (NIST 1976). Softver koji se koristi za prikupljanje podataka je Diffrac Plus XRPD Commier v2.3.1 i podaci se analiziraju i prezentuju korišćenjem Diffrac Plus EVA v 11.0.0.2 or v 13.0.0.2.

Uslovi okoline

Uzorci koji su testirani pod uslovima okoline su pripremljeni u obliku ravne ploče koristeći prah kako je dobijen. Otprilike 35 mg uzorka se lagano pakuje u šuplji isečak polirane, neutralne (510) silikonske folije. Uzorak je tokom analize rotiran u sopstvenoj ravni. Detalji prikupljanja podataka su: ugaoni opseg: 2 to 42°2θ; veličina koraka: 0.05°2θ; i vreme prikupljanja: 4 s.step<-1>.

b. Bruker AXS C2 GADDS (difraktormer)

Sheme Rentgenske praškovne difrakcije se skupljaju na Bruker AXS C2 GADDS difraktometru korišćenjem Cu Kα radiacije (40 kV, 40 mA), automatizovana XYZ faza, laserski video mikroskop za pozicioniranje auto-uzoraka i HiStar 2-dimenzionalni detektor površine. Optika X-zraka sastoji se iz jednog Gebel multilslojnog ogledala uparenog sa kolimator koji ima prorez od 0.3 mm.

Divergencija zraka, tj. efektivna veličina snopa X-zraka na uzorku, je aproksimativno 4 mm. A θ-θ kontinuirani mod skeniranja je korišćen sa uzorkom - sa detektor distancom od 20 cm što daje efektivni 2θ okvir od 3.2°-29.7°. Tipično se uzorak izlaže snopu X-zraka tokom 120 sekundi. Softver koji se koristi za prikupljanje podataka je GADDS za WNT 4.1.16 i podaci se analiziraju i prikazuju koristeći Diffrac Plus EVA v 9.0.0.2 ili v 13.0.0.2.

Uslovi okoline

Uzorci koji se testiraju pod uslovima okoline su pripremljeni u obliku ravne ploče koristeći prah u obliku u kakvom je dobijen bez mlevenja. Aproksimativno 1-2 mg uzorka se lagano presuje na staklenoj pločici kako bi se dobila ravna površina.

Rentgenska praškovna difrakcija (XRPD)

Ustanovljeno je pomoću XRPD da je 4 u amorfnom obliku (vidi Sliku 1). XRPD analiza sa visokom rezolucijom RP-4 spremljena na osnovu Primera 3 potvrđuje kristalnu čvrstu supstancu koja pokazuje drugačiju shemu praha od one koju pokazuje SP-4 (spremljeno na osnovu Primera 4, Postupak 4), koji je takođe potvrđen da daje kristalnu čvrstu supstancu. Rezultati XRPD tabele za RP-4 i SP-4 su prikazani u Tabeli 1 sa isključenim svim najvišim vrednostima koje pokazuju intenzitet od ≤5% (RP-4) i ≤3% (SP-4).

Tabela 1. XRPD Podaci za RP-4 i SP-4.

Uzorak SP-4 je usitnjava u avanu sa tučkom, i zatim sukcesivno provlačen kroz 500 i 250 µm sito kako bi se dobio uzorak u obliku finog praška. Uzorak je ponovo analiziran viskom rezolucijom XRPD, potvrđuje da nije nastala nikakva promena.

Referenca. Primer 21. Studije kristalizacije za SP-4.

Kristalni SP-4 pokazuje polimorfizam. Tako, predmetna objava je delimično usmerena ka kristalnom SP-4 i njegovim individualnim polimorfnim oblicima. SP-4 može da postoji u najmanje pet polimorfnih oblika, koji su označeni kao Oblici 1-5. Štaviše, amorfni oblik SP-4 može takođe da se napravi. Tipičnom kristalizacijom se omogućava rastvaranje od oko 100 mg SP-4 u odgovarajućoj zapremini kristalizacionog rastvarača (acetonitril (5 vol), hloroform (5 vol), n-butil acetat (7 vol), dihlorometan (50 vol), anisol (7 vol), i 1:1 MTBE/heptan (50 vol)) i zatim se dozvoljava isparenje rastvora na 5 °C. Dobijaju se razni kristalni oblici, ali svaki oblik, nakon filtriranja i/ili sušenja, daje Oblik 1.

Oblici 1, 2 i 3 su nesolvatni oblik, 1:1 DCM solvat i 1:1 hloroform solvat, respektivno, kako je potvrđuje jednom kristalografijom X-zracima i XRPD analizom. Oblici 4 i 5 se dobijaju kristalizacijom SP-4 iz rastvora acetonitrila i anisola, respektivno. Ne može da se sakupi dovoljno podataka kako bi se utvrdilo da li su Oblici 4 i 5 u ne solvatnom obliku, hidrati ili solvati budući da nisu dobijeni pojedinačni kristali zadovoljavajućeg kvaliteta. Oblici 4 i 5 se transformišu u Oblik 1 filtriranjem. Dobijaju se dva dodatna kristalna oblika nakon kristalizacije SP-4 od n-butil acetata ("BuAc) i rastvora koji sadrži metil-butil etar (MTBE) i heptan; nakon filtriranja oba ova kristalna oblika se konvertuju u Oblik 1. Oblici 2 i 3 se isto tako transformišu u Oblik 1 po izolaciji. Oblik 1 je nesolvantoblik koji pokazuje visok nivo endotermnog topljenja sa početnom temperaturom od 94.3°C i ΔHfus of 24.0 kJ mol<-1>. Dodatna XRPD shema SP-4 Oblika 1 je prikazana na Slici 4.

Referenca. Konverzija SP-4, Oblika 1 u SP-4, Oblik 6

Oblik 1 može da se konvertuje u Oblik 2 na najmanje dva načina.

Prvo, tako što se dozvoli finim kristalima Oblika 1 da budu izloženi atmosferskoj vlažnosti nekoliko dana, stvara se monohidrat Oblika 1 koji izgleda kao okamenjena guma. Nakon usitnjavanja monohidratne čvrste supstance do finog praška, XRPD shema ostaje konzistentna sa Oblikom 1. Pošto je odložena u otvorenom erlenmajeru tokom 6-10 nedelja, osnovni materijal se polako menja u Oblik 6 u obliku anhidrovane čvrste supstance. Oblik 1 je stabilan najmanje 2 godine u zatvorenoj ambalaži.

Po izboru, Oblik 1 može da se suspenduje u vodi 5-50 mg/mL na sobnoj temperaturi i tokom nekoliko sati će se transformisati u Oblik 6. Efikasnost postupka vodene transformacije može da se pospeši zagrevanjem vode do tačke rastvaranja većeg dela Oblika 1 i da se 1 i da se poveća fluidnost ne mešanog dela SP-4 od oblika čvrste gume do suspendovanog ulja od oko i više. Tokom vremena, Oblik 6 može da počne da se kristališe na 50°C. Dalje hlađenje suspenzije na 0-10°C dovodi do većeg oporavka čvrste supstance. Kristalizacijom iz vode isto tako se uklanja više tragova polarne nečistoće, što dovodi do poboljšanja celokupne čistoće.

Ponovno rastvaranje Oblika 6 u organskom rastvaraču kao što je dihlorometan ili acetonitril koje prati kristalizacija stvara se Oblik 1, čak i kada je započet kristalni Oblik 6.

U suv 100 mL erlenmajer sa okruglim dnom i jednim grlom koji je opremljena sa gumenim septumom i magnetskom mešalicom stavlja se 1.04 grama SP-4, Oblika 1. HPLC čistoća je 99.7%. Napunjen sa 40 mL DI vode. Mešanje suspenzije se počinje energično dok se zagreva na 50°C. Jednom kada temperatura dostigne 50°C, uglavnom homogeni rastvor je čuvan tokom 60 minuta, tokom kog vremena su čvrste supstance počele da stvaraju talog iz rastvora, formirajući tanak talog. Talog se hladi do 20°C vremenski preko 90 minuta i drži 16 sati na 20°C, praćeno daljim hlađenjem do 0-5°C vremenski preko 30 minuta i drži na 0-5°C ftokom 2.5 sati. Gusta smeša se filtrira kroz levak sa staklom srednje poroznosti i pere sa 10 mL ledenom vodom. Sukcijom vlažnog kolača se suši 2 sata pre sušenja u vakumskoj peći tokom noći vremenski 23 časa na 50°C. Izolovano 0.88 g (84.6% oporavljeno) SP-4, Oblika 6.

Oblik 6 ima primećenu tačku topljenja od oko 124.5-126°C.

Referenca

Primer 21-1. SP-4 Oblik 1

Spisak najviših vrednosti SP-4 Oblik 1 je predstavljen u Tabeli 2.

Referenca

Primer 21-2. SP-4 Oblik 2

XRPD shema SP-4 Oblik 2 je prikazana na Slici 5.

Spisak najviših vrednosti SP-4 Form 2 je prikazan u Tabeli 3.

Referenca

Primer 21-3. SP-4 Oblik 3

XRPD shema SP-4 Oblika 3 je prikazana na Slici 6.

Spisak najviše vrednosti SP-4 Oblika 3 je predstavljen u Tabeli 4.

Referenca

Primer 21-4. SP-5 Oblik 4

XRPD shema SP-4 Oblika 4 je prikazana na Slici 7.

Spisak najviše vrednosti SP-4 Oblika 4 je predstavljen u Tabeli 5.

Referenca

Primer 21-5. SP-4 Oblik 5

XRPD shema SP-4 Oblika 5 je prikazana na Slici 8.

Spisak najviše vrednosti SP-4 Oblika 5 je predstavljen u Tabeli 6.

Primer 21-5. SP-4 Oblik 6

XRPD shema SP-4 Oblika 6 je opisana na Slici 21.

Spisak najviše vrednosti SP-4 Oblika 6 je prikazan na sledećoj tabeli.

Referenca

Primer 21-7. SP-4 (Amorfni)

XRPD shema za amorfni SP-4 je opisana na Slici 9.

Referenca

Primer 22. Pojedinačna Kristalografija X zraka kristalnog SP-4 i njegovih solvata

Referenca

Primer 22-1. Pojedinačna Kristalografija X zraka kristalnog Sp-4 (Oblik 1) Slika 10 prikazuje Kristalnu strukturu X-zraka za Sp-4 Oblika 1. Ovde, slika pokazuje prikaz molekula Oblika 1 kristalne strukture prikazujući uključenu shemu numeracije. Neizotropske atomske zamene elipsoida nevodoničnih atoma su prikazani sa nivoom verovatnoće od 50%. Atomi vodonika su prikazani sa proizvoljno malim radijusom.

Struktura rastvora se dobija direktnim postupkom, prečišćavanje full-matričnom metodom najmanjih kvadrata na F<2>sa ponderima w<-1>= σ<2>(Fo<2>) (0.0592P)<2>+ (0.6950P), gde je P = (Fo<2>+2Fc<2>)/3, neizotropska zamena parametara, korekcija empirijskom apsorpcijom koristeći sferičnu harmoniku, implementiranu u SCALE3 ABSPACK skalu algoritma.

Finalni wR<2>= {∑[w(Fo<2>-Fc<2>)<2>]/∑[w(Fo<2>)<2>]<1/2>} = 0.0871 za sve vrednosti, konvencionalnih R1 = 0.0329 iz F vrednosti od 7090 refleksije sa Fo> 4σ(Fo), S = 1.016 za sve vrednosti i 870 parametara. Finalni Δ/σ(max) 0.001, Δ/σ(mean), 0.000. Finalna mapa razlike između 0.534 i -0.36 e Å<-3>.

Tabela 7. Pojedinačni kristalni parametri Oblika 1

Referenca

Primer 22-2. Pojedinačna Kristalografija X zraka kristalnog Sp-4 (Oblik 2) Slika 11 prikazuje kristalnu strukturu X-zraka za SP-4 Form 2. Ovde, ova slika pokazuje prikaz molekula Oblika 2 kristalne strukture koji prikazuju uključenu shemu numeracije. Heteroatomi se rastvaraju izotropski veoma slabih vrednosti. Atomi vodonika nisu prikazani.

Struktura rastvora se dobija direktnim metodama, prečišćavanje full-matričnom metodom najmanjih kvadrata na F<2>sa ponderima w<-1>= σ<2>(Fo<2>) (0.0975P)<2>+ (10.6969P), gde je P = (Fo<2>+2Fc<2>)/3, neizotropska zamena parametara, ispravka empirijske apsorpcije korišćenjem sferične harmonike, implementirano u SCALE3 ABSPACK skalni algoritam. Konačni wR<2>= {∑[w(F<2>o -Fc<2>)<2>]/∑[w(Fo<2>)<2>]<1/2>}=0,1883 za sve podatke, konvencionalnih R1 = 0.0741 na F vrednosti od 2525 refleksija sa Fo > 4σ(Fo), S = 1.05 za sve podatke i 158 parametre. Konačno Δ/σ(max) 0.000, Δ/σ(mean), 0.000. Konačna mapa razlike između 1.388 i -0.967 e Å<-3>.

Tabela 8. Pojedinačni kristalni parametri Oblika 2

Referenca

Primer 22-3. Pojedinačna Kristalografija X-zraka kristalnog SP-4 (Oblik2) Slika 12 prikazuje kristalnu strukturu X-zraka (ORTEP - neizotropski) SP-4 (Oblik 2). Kristalna struktura metilen hlorida rastvora SP-4 (Oblik 2), C23H31N3PO9FCl2, prinosi monokliničkoj razmak grupi P2l (sistematično odsustvo 0k0: k=odd) sa a=12.8822(14) Å, b=6.1690(7) Å, c=17.733(2) Å, β=92.045(3)°, V=1408.4(3)Å<3>, Z=2 i dcalc=1.449 g/cm<3>. Intenzitet vrednosti X-zraka je sakupljen na Rigaku živi CCD detektor oblasti koristeći monohromni grafit Mo-Kα radiacije (λ=0.71073 Å) na temperaturi od 143K. Izvedeno je preliminarno indeksiranje iz serija od dvanaest 0.5° rotirajućih slika sa izloženosti od 30 sekundi. Ukupno 648 rotirajućih slika su sakupljene sa kristalom do distance detektora od 35 mm, 2θ ugao ljuljanja od -12°, rotaciona širina od 0.5° i izloženost od 30 sekundi: sken br.1 je φ-sken od 315° do 525° na ω)= 10° i χ = 20°; sken br. 2 je ω-sken od -20° do 5° na χ = -90° i φ = 315°; sken br.3 je ω-sken od -20° do 4° na χ = -90° i φ = 135°; sken br.4 je ω-sken od -20° do 5° na χ= -90° i φ = 225°; sken br.5 je ω-sken od -20° do 20° na χ = -90° i φ = 45°. Rotirajuće slike su procesuirane korišćenjem CrystalClear (CrystalClear: Rigaku Corporation, 1999), proizvodeći listing neprosečnog F<2>i σ(F<2>) vrednosti koje se potom prenose na CrystalStructure (CrystalStructure: Crystal Structure Analysis Package, Rigaku Corp. Rigaku/MSC (2002)) programski paket za dalju obradu i rastvor strukture na Dell Pentium III kompjuteru. Ukupno je izmereno 7707 refleksija u opsegu od 5.48 ≤ 2θ ≤ 50.04°, -14 ≤ h ≤ 15, -7 ≤ k ≤ 6, -19 ≤ 1 ≤ 21 prinoseći 4253 jedinstvene refleksije (Rint = 0.0180). Intenzitet vrednosti je korigovan za Lorenc i efekte polarizacije i za apsorpciju korišćenjem REQAB (minimum i maksimum transmisije 0.824, 1.000).

Struktura se rešava direktnim postupcima (SIR97, SIR97: Altomare, A., M. Burla, M. Camalli, G. Cascarano, C. Giacovazzo, A. Guagliardi, A. Moliterni, G. Polidori & R. Spagna (1999). J. Appl. Cryst., 32, 115-119). Prečišćavanje full-matričnom metodom najmanjih kvadrata na F<2>korišćenjem SHELXL-97 (SHELXL-97: Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst., A64, 112-122). Sve refleksije su korišćene tokom usavršavanja. Korišćena shema pondera je

gde je

Ne vodonični atomi su neizotropski prečišćeni i atomi vodonika su prečišćeni korišćenjem modela "jahača". Prečišćavanje se konvergira do R1=0.0328 i wR2=0.0817 za 4046 refleksije za koje je F > 4σ(F) i R1=0.0348, wR2=0.0838 i GOF = 1.056 za sve 4253 jedinstvene, non-zero refleksije i 358 varijable (R1 =

gde je n = broj refleksija i p = broj prečišćenih parametara). Maksimum Δ/σ u finalnom krugu najmanjih kvadrata je 0.000 i dve najvažnije najviše vrednosti u konačnoj razlici Fourier su bile 0.312 i -0.389 e/Å<3>. Flak apsolutna struktura parametra prečišćena do to -0.06(6) čime se potkrepljuje stereohemija naslovljenog jedinjanja.

Tabela 1 navodi podatke ćelija, parametre za prikupljanje podataka, i podatke prečišćavanja. Završni pozicioni i ekvivalentni izotropski termalni parametri su dati u Tabeli 2. Neizotropski termalni parametri su u Tabeli 3. ("ORTEP-II: A Fortran Thermal Ellipsoid Plot Program for Crystal Structure Illustrations". C.K. Johnson (1976) ORNL-5138.) prikaz molekula sa 30% verovatnoće prikazane termalne elipsoide.

Tabela 9. Pregled strukture određivanja jedinjenja Sp-4·CH2Cl2.

Referenca

Primer 22-4. Pojedinačna Kristalografija X- zraka kristalnog SP-4 (Oblik 3) Slika 13 prikazuje kristalnu strukturu X-zraka za SP-4 Oblik 3. Ovde, slika pokazuje prikaz molekula Oblika 3 kristalne strukture koji pokazuju uključenu shemu numeracije. Neizotropska atomska zamena elipsoida za ne vodonične atome su prikazani na nivou od 50% verovatnoće. Atomi vodonika su prikazani sa proizvoljno malim radijusom.

Struktura rastvora je dobijena direktnim postupkom, full-matričnog pričišćavanja metodom najmanjih kvadrata na F<2>sa ponderima w<-1>= σ<2>(Fo<2>) (0.0512P)<2>+ (0.6810P), gde je P = (Fo<2>+2Fc<2>)/3, neizotropska zamena parametara, ispravka empirijske apsorpcije korišćenjeme sferične harmonike, implementirana u SCALE3 ABSPACK skalnom algoritmu.

Konačni wR<2>= {∑[w(Fo<2>-Fc<2>)<2>]/∑[w(Fo<2>)<2>]<1/2>} = 0.0796 za sve podatke, konvencionalni R1 = 0.0294 na F vrednostima od 2486 refleksije sa Fo> 4σ(Fo), S = 1.068 za sve podatke i 377 parametre. Konačno Δ/σ(max) 0.001, Δ/σ(mean), 0.000. Konačna razlika mapa između 0.211 i -0.334 e Å<-3>.

Tabela 10. Pojedinačni kristalni parametri Oblika 3

Referenca

Primer 23. Stabilnost na povišenim temperaturama i relativnoj vlažnosti Uzorak Rp-4 je čuvan u vlažnoj komori na 40°C i 75% relativne vlažnosti tokom jedne nedelje, i uzorak se ponovo analizira sa XRPD. Dobijena praškasta shema za RP-4 ne pokazuje značajne promene tokom sprovođenja eksperimenta, što znači da nije primećena promena u čvrstoj supstanci. Ovo treba da se suprotstavi uzorku 4, koja se rastvara u okviru 16 sati po skladištenju na 40°C i 75 % relativne vlažnosti. Svakako, ilustracija prirode rastvaranja 4 je dalje prikazana. Uzorak 4 je propušten kroz 250 µm sita i potom su uzorci skladišteni na 40°C / 75 % RH i 25°C / 53 % relativne vlažnosti i posmatralo se na regularnim intervalima. Rezultati su dati u Tabeli 4.

Tabea 11. Stabilnost 4 na povišenoj relativnoj vlažnosti.

Po skladištenju na 40 °C i 75 % relativne vlažnosti uzorak od SP-4 raspada se unutra tokom 16 časova. Na primer, uzorak SP-4 je usitnjen tučkom u avanu, i potom sukcesivno propušten kroz 500 i 250 µm sito da prinese uzorak u obliku finog praška. Uzorci ovog materijala se skladište na 40°C i 75% relativne vlažnosti i 25°C i 53 % RH i posmatralo se na regularnim intervalima. Rezultati su dati u Tabeli 5.

Tabela 12. Stabilnost SP-4 na povišenoj relativnoj vlažnosti.

XRPD analiza uzorka posle skladištenja na 25°C i 53% RH tokom 104 sati ne prikazuje značajne promene u proizvedenom difraktogramu ukazujući time da nije nastala nikakav oblik promene.

Referenca

Primer 24. Fourier Transformacija - Infracrvena (FT-IR) Spektrometrija

Podaci prikupljeni na Perkin-Elmer Spectrum One, koji odgovaraju univerzalnom ATS Infracrvenom Skopijom priboru za uzorke. Podaci su prikupljeni i analizirani korišćenjem Spektrum v5.0.1 softvera.

IR dobijeni spektar za 4, RP-4, i SP-4 je prikazan na slikama. 5-7, respektivno. Odabrane najviše vrednosti, u talasnim brojevima (cm<-1>) je prikazan ispod:

4: ~1680, ~1454, ~1376, ~1205, ~1092, ~1023 (Fig.14);

RP-4: ~1742, ~1713, ~1679, ~1460, ~1377, ~1259, ~1157, ~1079 (Fig.15);

i

SP-4 (Form 1): ~1743, ~1713, ~1688, ~1454, ~1378, ~1208, ~1082 (Fig.16).

Referenca. Primer 25. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrijska (DSC) Termogravimetrijska Analiza (TGA)

DSC podaci su prikupljeni na TA Instrumentu Q2000 opremljenim sa 50 pozicija auto-uzoraka. Kalibracija termalnog kapaciteta se sprovodi korišćenjem safira i kalibracija za energiju i temperaturu se sprovodi korišćenjem sertifikovanog indijuma.

Modulirana temperatura DSC se sprovodi uobičajeno na 0.8-1.2 mg svakog uzorka, aluminijumskoe posude sa iglenim rupicama, koristeći podvučenu stopu zagrevanja od 2°C.min<-1>i parametre temperaturne modulacije od ± 0.2 °C.min<-1>i 40 sekundi. Prečišćavanje suvog azota na 50 ml.min<-1>se održava preko uzorka.

Softver za kontrolu instrumenata je Advantage for Q Series v2.8.0.392 i Thermal Advantage v4.8.3 i podaci se analiziraju korišćenjem Univerzalne analize v4.3A.

DSC podaci su sakupljeni na Mettler DSC 823e opremljenim sa 34 pozicije autouzoraka. Instrument je kalibrisan za energiju i temperaturu korišćenjem sertifikovanog indijuma. Uobičajeno 0.8-1.2 mg od svakog uzorka, u rupičastoj aluminijumskoj posudi, se zagreva na 10°C.min<-1>od 25°C do 250°C. Prečišćavanje azota na 50 ml.min<-1>je održano preko uzorka. Kontrola instrumenata i softverska analiza podataka je STARe v9.20.

DSC podaci za SP-4 (Oblik 6) su sakupljeni korišćenjem DSC instrumenta (TA Q2000), korišćenjem stope zagrevanja od 10 °C/ min pod kontinuiranim protokom suvog gasa azota (100 ml/min). Aproksimativno 2.2 mg uzorka je tačno izmereno i zagrevano u ne hermetički zatvorenoj, 'Tzero' posudi sa labavim poklopcem. Instrument se kalibriše (entalpija i temperatura) sa indium stiardom i (toplotni kapacitet) sa safirnim stiardom. Pretpostavlja se nivo nejasnoća oko ±0.1 °C za temperature i ±5 % za izmerene entalpije. Softver TA Univerzalna analizia je uključen u merenje temperatura na licu mesta.

TGA podaci su sakupljeni na Mettler TGA/SDTA 851e opremljenim sa 34 pozicije auto-uzoraka. Instrument je kalibrisan za temperaturu korišćenjem sertifikovanog indijuma. Uobičajeno 8-12 mg svakog uzorka se nanosi na prethodno izmerenu aluminijumsku retortu i zagreva na 10°C.min<-1>od temperature okoline do 350°C. Prečišćeni azot 50 ml.min<-1>se održava u uzorku. Kontrola instrumenta i softverska analiza podataka je STARe v9.20.

DSC analiza 4 pokazuje pojedinačni široki endoterm sa početkom od 58.7°C (ΔH 14 J.g<-1>) što je potvrđeno da je zbog molekularnog opuštanja tokom staklene tranzicije pomoću dalje modulisane DSC analize (Sl. 17). TGA analiza 4 ne pokazuje gubitak težine pre raspadanja preko 240°C, potvrđujući da materijal nije u solvatnom obliku. Kako XRPD analiza 4 potvrđuje amorfnost materijala, modulirana DSC analiza je preuzeta u pokušaju izračunavanja temperature staklene tranzicije, koja je izmerena 57°C.

DSC analiza prikazuje pojedinačni oštri endoterm sa početkom od 136.2 °C (ΔH 76 J.g<-1>) što je potvrđeno da je rastop vruće faze mikroskopije. Vidi Sliku 18. TGA analiza RP-4 prikazuje da nema gubitka težine pre raspada na 240 °C, potvrđujući da materijal nije rastvoran.

DSC analiza SP-4 pokazuje pojedinačni široki endoterm sa temperaturom od 93.9°C (ΔH 43 J.g<-1>) potvrđeno da je rastop pomoću mikroskopije vruće faze. Vidi Sliku 19. TGA analiza SP-4 prikazuje da nema gubitka težine pre raspada na 240°C, potvrđujući da materijal nije u obliku solvata.

DSC analiza SP-4 (Oblik 6) pokazuje pojedinačni široki endoterm sa temperaturom od 120.7°C (ΔH 79 J.g-1).

Referenca

Primer 26. Sorpcija gravimetrijske pare (GVS)

Intrinzičan SMS DVS

Apsorbovani izotermi su dobijeni koristeći SMS DVS analizator apsorpcije unutrašnje vlage, kontrolisan sa SMS Analysis Suite softverom. Temperaturau zorka se održava na 25 °C pomoću kontrola instrumenta. Vlažnost se kontroliše mešanjem protoka suvog i vlažnog azota, sa ukupnom stopom protoka od 200 ml.min<-1>. Relativna vlažnost se meri kalibrisanim Rotronik sonda (dinamička stopa od 1.0-100 %RH), nađeni u blizini uzorka. Promena težine, (masena relaksacija) uzorka u funkciji %RH se konstantno posmatra mikrobalansom (tačnost ±0.005 mg).

Uobičajeno 5-20 mg uzorka se stavlja u tariranu korpu nerđajućeg čelika pod uslovima okoline. Uzorak se puni i prazni na 40 %RH i 25°C (obično sobni uslovi). Izoterm vlažne apsorpcije se izvoti kako se navodi u daljem tekstu (2 skena daju 1 kompletan krug). Standardni izoterm je izveden na 25°C 10 %RH u opsegu intervala preko 0.5-90 %RH.

Tabela 13. Postupak Parametara za SMS DVS unutrašnje eksperimente

Uzorak je povraćen po završetku izoterma i ponovo analiziran pomoću XRPD.

GVS analiza pokazuje da RP-4 nije higroskopan pokazujući reverzibilni unos od aproksimativno 0.2 wt % vode od 0 do 90 % relativne vlažnosti. Ponovnom analizom uzorka od strane XRPD nakon GVS eksperiment je pokazao da nema promene u obliku.

Uzorak od SP-4 je usitnjen u avanu tučkom, i zatim sukcesivno provučen kroz 500 i 250 µm sito da prinese uzorak u obliku finog praška koji je onda analiziran korišćenjem modifikovanog pojedinačnog cikličnog postupka. Uzorak je uzet od 40 % RH (aproksimativni ambijent) do 60 % RH, umesto 90 % za standardni metod, i onda cikliran do 0 % i nazad do 40 % RH. Ova analiza pokazuje da SP-4 nije higroskopan sve do 60 % RH, sa reverzibilnim uzimanjem od ~0.2 % težinom vode od 0 do 60 % RH.

Referenca

Primer 27. Termodinamička rastvorljivost u vodi

Rastvorljivost u vodi je ustanovljena suspendovanjem dovoljne količine jedinjenja u vodi kako bi se dobila maksimalna konačna koncentracija od ≥10 mg.ml<-1>u obliku jedinjenja koje ne sadrži osnovno jedinjenje. Suspenzija je uravnotežena na 25 °C tokom 24 časa onda je izmerena pH vrednost. Suspenzija se potom filtrira kroz stakleno vlakno C filtera na ploču sa 96 udubljenja. Filtrat se potom razblažuje faktorom od 101. Kvantifikacija je bila pomoću HPLC u odnosu na standardni rastvor od aproksimativno 0.1 mg.ml<-1>in DMSO. Različite zapremine standardnog, razblaženog i nerazblaženog uzorka rastvora se ubrizgavaju. Rastvorljivost se računa koristeći površine ispod pika koje su određene integracijom pika nađenog u isto retenciono vreme kad i glavni pik pri ubrizgavanju standarda.

Tabela 14. Parametri HPLC metode za merenje rastvorljivosti

Analize su sprovedene pod gore navedenim uslovima na sistemu Agilent HP 1100 serija opremljenim sa redom ‘’diode array’’ detektorom i korišćenjem ChemStation softver vB.02.01-SR1.

Tabela 15. Rezultati rastvorljivosti u vodi RP-4, 4, i SP-4.

Referenca

Primer 28. Određivanje hemijske čistoće HPLC-om

Razni HPLC uslovi mogu da se koriste kako bi se odredila hemijska čistoća jedinjenja koje je ovde stavljeno na uvid javnosti. Jedan od takvih primera je stavljen na uvid javnosti ranije u tekstu u odnosu na studije termodinamičke rastvorljivosti u vodi. Još jedan primer se stavlja na uvid javnosti u daljem tekstu.

HPLC uslovi:

Pod ovim uslovima, ustanovljena čistoća 4, RP-4, i SP-4 je ~99.6, ~99%, i ~99.5%, redom. Naznačeno je da može da se ostvari viši stepen čistoće optimizacijom postupaka koji su u ranijem tekstu stavljeni na uvid javnosti.

Inspekcija XRPD difraktograma pokazuje da su dva pojedinačna kristalna diastereomera dali očigledno različite XRPD sheme. Pored toga, bila je jasna razlika u tački topljenja navedena dva kristalna diastereomera, gde RP-44 ima znatno višu početnu tačku od SP-4 (136°C vs. 94°C).

Referenca

Primer 29. Dodatni postupci separacije

Sledeća SFC separacija (uslovi su navedeni u daljem tekstu) prinosi adekvatnu separaciju mešavine diastereomera, RP-4 i SP-4.

Sledeća SFC separacija (uslovi su navedeni u daljem tekstu) prinosi adekvatnu separaciju mešavine diastereomera, RP-4 i SP-4.

Tabela 16. Pregled rezultata iz serije karakterizacija RP-4, 4, i SP-4.

Primer 30. Rentgenska kristalografija 8 (SP-izomer)

Jedinjenje 8 (SP-izomer), C18H21N2PO7, kristališe u monocikličnoj prostornoj grupi P2l(sistematično odsustvo 0k0: k=odd) sa a=5.3312(4)Å, b=15.3388(8)Å, c=23.7807(13)Å, β=92.891(3)°, V=1942.2(2)Å<3>, Z=4, i dcalc=1.397 g/cm<3>. Vrednosti intenziteta X-zraka se uzimaju sa Bruker APEXII CCD detektora oblasti angažujući grafit-monohromirani Mo-Kα radiacije (λ=0.71073 Å) na temperaturi od 100(1)K. Slike 20A i 20B prikazuju molekule označene sa 1 i 2, shodno, asimetrične jedinice.

Preliminarno indeksiranje je izvedeno iz trideset šest serija 0.5° rotacionih okvira sa izloženosti od 30 secundi. Ukupno je sakupljeno 3608 okvira sa kristalom sa razdaljinom detektora od 70.00 mm, rotacione širine od 0.5° i izlaganja (ekspozicija) 20 sekundi:

Rotacioni okviri se integrišu korišćenjem SAINT (Bruker (2009) SAINT. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.) proizvodeći spisak nepresečnih F<2>i σ(F<2>) vrednosti koje se onda prosleđuju na SHELXTL (Bruker (2009) SHELXTL. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.) paket program za dalju preradu i strukturu rastvora na Dell Pentium 4 komjputeru. Ukupno je izmereno 6909 refleksije preko opsega od 1.58 ≤ θ ≤ 25.09°, -6 ≤ h ≤ 6, -18 ≤ k ≤ 18, -28 ≤ 1 ≤ 28 sa prinosom od 6909 jedinstvene refleksije (Rint = 0.0581). Podaci o intenzitetu su prepravljeni za Lorentz i efekat polarizacije i za apsorpciju koristeći SADABS (Sheldrick, G.M. (2007) SADABS. University of Gottingen, Germany.) (minimum i maksimum transmisije 0.6093, 0.7452).

Struktura je rešena direktnim postupcima (SHELXS-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64,112-122.)). Usavršavanje se radi punom matricom postupka najmanjih kvadrata zasnovanom na F<2>korišćenjem SHELXL-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64, 112-122.). Sve refleksije su korišćene tokom ispravke. Korišćena shema pondera je w=1/[σ<2>(Fo<2>)+ (0.0000P)<2>+ 14.0738P] gde je P = (Fo<2>+ 2Fc<2>)/3. Nevodonični atomi su prečišćeni neizotropski i atomi vodonika su prečišćeni koristeći jašući model. Usavršavanje konvergira u R1 = 0.0847 i wR2 = 0.1899 za 6173 posmatrane refleksije za koje je F > 4σ(F) i R1=0.0963 i wR2=0.1963 i GOF =1.119 za sve 6909 jedinstvene, nula refleksije i 512 varijable (R1 = ∑||Fo| - |Fc|| / ∑ |Fo|; wR2 = [∑w(Fo<2>- Fc<2>)<2>/∑w(Fo<2>)<2>]<1⁄2>; GOF = [∑w(Fo<2>-Fc<2>)<2>/(n - p)]<1⁄2>; gde je n = broj refleksija i p = broj usavršenih parametara). Maksimum Δ/σ u konačnom krugu postupka najmanjih kvadrata je bio 0.000 i dve najvažnije najviše vrednosti u oknačnoj razlici Fourier su 0.402 i -0.559 e/Å<3>. Slike 20A i 20B su ORTEP (30% verovatnoća termo elipsoida) molekula 1 i 2 asimetrične jedinice.

Tabela 17. Pregled strukture određivanja jedinjenja 8 (Sp-izomer)

Referenca

Primer 32. Rentgenska kristalografija (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata

(S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)-amino)propanoat, C18H17NPPO5F5, se kristališe u trikliničkoj prostornoj grupi P1 sa a = 5.2641(6) Å, b = 12.0548(13) Å, c = 16.4307(15) Å, α = 74.960(4)°, β = 83.959(4)°, γ = 80.275(4)°, V = 990.40(18) Å<3>, Z = 2, i dcalc=1.520 g/cm<3>. Podaci intenziteta X-zraka su prikupljeni na Bruker APEXII CCD prostornom detektoru koristeći monohromni grafit Mo-Kα radiacije (λ = 0.71073 Å) na temperaturi od 143(1)K. Preliminarno indeksiranje je izvedeno iz niza od trideset šest was 0.5° rotacionih okvira sa ekspozicijom od 20 sekundi. Ukupno je sakupljeno 3593 okvira sa kristaalom sa detektor distancom od 37.600 mm, rotacionom širinom od 0.5° i ekspozicijom od 20 sekundi:

Rotacioni okviri su integrisani korišćenjem SAINT (Bruker (2009) SAINT. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.), stvarajući spisak neprosečnih F<2>i σ(F<2>) vrednosti koje su potom prenete na SHELXTL (Bruker (2009) SHELXTL. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.) paket program za dalju obradu i strukturu rastvora na Dell Pentium 4 compjuteru. Ukupno je izmereno 17880 refleksija u opsegu od 1.77 ≤ θ ≥ 25.12°, -6 ≤ h ≤ 6, -14 ≤ k ≤ 14, -19 ≤ 1 ≤ 19 sa prinosom od 6897 posebnih refleksija (Rint = 0.0212). Podaci o intenzitetu su korigovani za Lorentz i za efekat polarizacije i za apsorpciju korišćen SADABS (Sheldrick, G.M. (2007) SADABS. University of Gottingen, Germany.) (minimum i maksimum transmisije 0.6887, 0.7452).

Struktura se rešava direktnim postupcima (SHELXS-97(Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64,112-122.)). Prečišćavanje se radi punom matricom postupka najmanjih kvadrata zasnovanom na F<2>korišćenjemSHELXL-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64,112-122.). Sve refleksije su korišćene tokom prečišćavanja. Korišćena shema pondera je w=1/[σ<2>(Fo<2>)+ (0.0344P)<2>+ 0.1102P] gde je P = (Fo<2>+ 2Fc<2>)/3. Nevodonični atomi su prečišćenineizotropski i atomi vodonika su prečišćeni koristeći jašući model. Prečišćavanje konvergira u R1=0.0259 i wR2=0.0609 za 6527 opažene refleksije za koje je F > 4σ(F) i R1 = 0.0284 i wR2 = 0.0621 i GOF = 1.040 za sve 6897 jedinstvene, refleksije koje nisu jednake nuli i 548 varijable. (R1 = ∑||Fo| - |Fc|| / ∑|Fo|; wR2 = [∑w(Fo<2>- Fc<2>)<2>/∑w(Fo<2>)<2>]<1⁄2>; GOF = [∑w(Fo<2>- Fc<2>)<2>/(n - p)]<1⁄2>; gde je n = broj refleksija i p = broj usavršenih parametara.) Maksimum Δ/σ u konačnom krugu postupka najmanjih kvadrata je bio 0.001 i dve najvažnije najviše vrednosti u knačnoj razlici Fourier su 0.254 i -0.236 e/Å<3>. Slike 22A i 22B su ORTEP (30% verovatnoća termo elipsoida) molekula 1 i 2 asimetrične jedinice.

Tabela 18. Pregled strukture određivanja (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata

Reference. Primer 33. Biološka aktivnost

Ćelije koje sadrže replikon su zasejane na bilo 3,000 ćelija po udubljenju (50 µL) na ploči sa 96 belih/neprovidnih udubljenja, ili 1,500 ćelija po udubljenju (25 µL) na ploči sa 384 belim/neprovidnim udubljenjima. 50 µL od 2X jedinjenja se dodaje na ploču sa 96 udubljenja ili 25 µL 2X jedinjenja se dodaje na ploču sa 384 udubljenja. Ploče se stavljaju u inkubator na 37°C u vlažnu 5% CO2atmosferu tokom 4 dana. Nakon inkubacije, Bright-Glo reagens (50 µL ploču sa 96 udubljenja, ili 25 µL ploču sa 384 udubljenja) je dodato kako bi se izmerio reportersvetlucave luciferaze za HCV replikaciju. Procenat inhibicije je izračunat u odnosu na kontrolu leka.

RP-4 i SP-4 su pokazali da imaju široku pokrivenost genotipa. Na primer, oba su se pokazala da su aktivna protiv virusa hepatitisa C, genotipa 1-4.

Claims (7)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Postupak za pripremu kristalnog (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoata koji je predstavljen formulom

   koji sadrži: kristalizaciju (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil) amino)propanoata od druge kompozicije koja sadrži a) prvu kompoziciju; b) pentafluorofenol; c) ne-nukleofilnu bazu; i d) tečnu kompoziciju; gde prva kompozicija sadrži (S)-izopropil 2-(((S)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat i (S)-izopropil 2-(((R)-(perfluorofenoksi)(fenoksi)fosforil)amino) propanoat, i gde tečna kompozicija sadrži najmanje jedan od rastvarača i anti-rastvarača.
2. 2. Postupak iz patentnog zahteva 1, u kome se kristalizacija odigrava na temperaturi koja je u opsegu od -10°C do 40°C.
3. 3. Postupak iz patentnog zahteva 2, u kome se kristalizacija odigrava na sobnoj temperaturi.
4. 4. Postupak iz patentnog zahteva 1, u kome je ne-nukleofilna baza odabrana između kalijum karbonata, cezijum karbonata, di-izopropilamina, diizopropiletilamina, trietilamina, hinuklidina, naftalen-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8-diazabicikloundec-7-ena, 4-dimetilamino-piridina, piridina, 2,6-di-C1-6-alkil-piridina, 2,4,6-tri-C1-6-alkil-piridina, 1,5-diazabiciklo[4.3.0]non-5-ena, 1,4- diazabiciklo[2.2.2]oktana, ili njihovih smeša.
5. 5. Postupak iz patentnog zahteva 4, u kome je ne-nukleofilna baza trietilamin.
6. 6. Postupak iz patentnog zahteva 1, u kome tečna kompozicija sadrži najmanje jedan od C2 do C8 etra, C3 do C7 estra, i C5 do C12 zasićenog ugljovodonika.
7. 7. Postupak iz patentnog zahteva 1, u kome tečna kompozicija sadrži najmanje jedan od etil acetata, t-butil-metiletra, i heksana.