RS56298B1 - Antitelo koje vezuje il-17a i il-17f - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na molekule antitela koji imaju specifičnost za antigenske determinante oba IL-17A i IL-17F. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na terapijske upotrebe molekula antitela i metode za njihovu produkciju.

[0002] IL-17A (originalno nazvan CTLA-8 i takođe poznat kao IL-17) je proinflamatorni citokin i osnivački član IL-17 familije (Rouvier et al, 1993, J. Immunol., 150:, 5445-5456). Naknadno je identifikovano pet dodatnih članova familije (IL-17B - IL-17F) uključujući najuže povezani IL-17F (ML-1), koji deli približno 55% homologne sekvence aminokiseline sa IL-17A (Moseley et al., 2003, Cytokine Growth Factor Rev.14: 155-174). IL-17A i IL-17F su izraženi od strane nedavno definisanog autoimuno povezanog podskupa T pomoćnih ćelija, Th17, koje takođe izražavaju IL-21 i IL-22 potpis citokina (Korn et al., 2009, Annu. Rev. Immunol.27:485-517.: 485-517). IL-17A i IL-17F su izraženi kao homodimeri, ali mogu biti izraženi kao IL-17A/F heterodimer (Wright et al. 2008, J. Immunol.181: 2799-2805). IL-17A i F signal preko receptora IL-17R, IL-17RC ili IL-17RA/RC kompleksa receptora (Gaffen 2008, Cytokine. 43: 402-407). Oba IL-17A i IL-17F su povezani sa brojnim autoimunim bolestima.

[0003] Prema dvojnim antagonistima IL-17A i IL-17F mogu biti efikasniji od samog antagonista u lečenju IL-17 posredovanih bolesti. Antitela koja vežu IL-17A i IL-17F su opisana u WO2007/106769, WO2008/047134, WO2009/136286 i WO2010/025400.

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje poboljšano neutralizirajuće antitelo koje je sposobno vezivanju na oba IL-17A i IL-17F sa visokim afinitetom, imajući laki lanac i teški lanac pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 7 i varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 9. Konkretno, antitelo predmetnog pronalaska je sposobno da se specifično vezuje za oba i IL-17A i IL-17F tj. antitelo se ne veže za druge izoforme IL-17. Poželjno, antitelo predmetnog pronalaska takođe veže IL-17A/IL-17F heterodimer. Poželjno, antitelo predmetnog pronalaska neutrališe aktivnost oba IL-17A i IL-17F. U jednom izvođenju antitelo predmetnog pronalaska takođe neutraliziše aktivnost heterodimera IL-17A/IL-17F. Antitela predmetnog pronalaska zbog toga imaju povoljno svojstvo da mogu inhibirati biološku aktivnost oba IL-17A i IL-17F. Prema tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu takvih antitela u lečenju i/ili profilaksi bolesti posredovanih bilo kojim ili oba IL-17A ili IL-17F, kao što je autoimuna ili inflamatorna bolest ili kancer.

[0005] Kao što se ovde koristi, termin "neutralizirajuće antitelo" opisuje antitelo koje je sposobno neutralisanju biološke signalizirajuće aktivnosti oba IL-17A i IL17F, na primer blokiranjem vezivanja IL-17A i IL17F za jedan ili više njihovih receptora i blokiranjem vezivanja IL-17A/IL-17F heterodimera za jedan ili više njihovih receptora. Treba imati na umu da se izraz "neutralizirajući" kao što se ovde koristi odnosi na smanjenje biološke signalne aktivnosti koja može biti delimična ili potpuna. Dalje, biće razumljivo da obim neutralizacije IL-17A i IL-17F aktivnosti od strane antitela može biti isti ili različit. U jednom izvođenju, stepen neutralizacije aktivnosti heterodimera IL-17A/IL-17F može biti isti ili različit od obima neutralizacije aktivnosti IL-17A ili IL-17F.

[0006] U jednom izvođenju antitela predmetnog pronalaska se specifično vezuju za IL-17A i IL-17F. Specifično vezivanje znači da antitela imaju veći afinitet za IL-17A i IL-17F polipeptide (uključujući IL-17A/IL-17F heterodimer) nego za ostale polipeptide. Poželjno su polipeptidi IL-17A i IL-17F humani. U jednom izvođenju antitelo takođe veže tzv. "cynomolgus " majmuna IL-17A i IL-17F.

[0007] IL-17A ili IL-17F polipeptidi ili smeša dva ili ćelije koje izražavaju jedan ili oba od navedenih polipeptida mogu biti korišćeni da se dobiju antitela koja specifično prepoznaju oba polipeptida. IL-17 polipeptidi (IL-17A i IL-17F) mogu biti "zreli" polipeptidi ili biološki aktivni fragmenti ili derivati od njih koji poželjno uključuju mesto vezivanja receptora. Poželjno su IL-17 polipeptidi zreli polipeptidi. IL-17 polipeptidi mogu biti pripremljeni procesima dobro poznatim u tehnici iz genetski modifikovanih ćelija domaćina obuhvatajući ekspresione sisteme ili mogu biti obnovljeni iz prirodnih bioloških izvora. U ovoj prijavi, termin "polipeptidi" uključuje peptide, polipeptide i proteine. Oni se koriste naizmenično, osim ako nije drugačije određeno. IL-17 polipeptid može u nekim slučajevima biti deo većeg proteina kao što je fuzioni protein na primer fuzionisan za afinitetnu oznaku. Mogu se dobiti antitela generisana protiv tih polipeptida, gde je imunizacija životinje neophodna, primenom polipeptida na životinji, poželjno ne-humanoj životinji, korišćenjem dobro poznatih i rutinskih protokola, videti na primer Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Mogu se imunizovati mnoge toplokrvne životinje, kao što su zečevi, miševi, pacovi, ovce, krave ili svinje. Međutim, generalno su poželjni miševi, zečevi, svinje i pacovi.

[0008] Antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju cela antitela i funkcionalno aktivne fragmente ili derivate od njih i mogu biti, ali nisu ograničeni na, monoklonalna, više-valentna, multi-specifična, bispecifična, humanizovana ili himerna antitela, domena antitela, npr. VH, VL, VHH, antitela sa jednostrukim lancem, Fv, Fab fragmente, Fab' i F(ab')2 fragmente i fragmente koji vezuju epitop bilo kojeg od iznad navedenih. Drugi fragmenti antitela uključuju one opisane u Međunarodnim patentnim prijavama WO2005003169, WO2005003170 i WO2005003171. Drugi fragmenti antitela uključuju Fab-Fv i Fab-dsFv fragmente opisane u WO2009040562 i WO2010035012 respektivno. Fragmenti antitela i metode njihove produkcije su dobro poznati u tehnici, videti na primer Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181; Adair and Lawson, 2005. Therapeutic antibodies. Drug Design Reviews – Online 2(3):209-217.

[0009] Antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove imunoglobulinskih molekula, tj. molekule koji sadrže mesto vezivanja antigena koji specifično veže antigen. Molekuli imunoglobulina iz pronalaska mogu biti bilo koje klase (npr., IgG, IgE, IgM, IgD i IgA) ili podklase molekula imunoglobulina.

[0010] Monoklonalna antitela mogu biti pripremljena bilo kojom metodom poznatom u tehnici, kao što je tehnika hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), tehnika trioma, tehnika hibridoma ljudske B-ćelije (Kozbor et al. 1983, Immunology Today, 4:72) i tehnika EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0011] Antitela za upotrebu u pronalasku mogu takođe biti generisana upotrebom metoda pojedinačnog antitela limfocita kloniranjem i ekspresijom imunoglobulina cDNA varijabilne regije generisanih iz pojedinačnih limfocita izabranih za produkciju specifičnih antitela, putem na primer metoda opisanih od strane Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 i međunarodne patentne prijave broj WO2004/106377.

[0012] Humanizovana antitela su molekuli antitela iz ne-humanih vrsta koje imaju jednu ili više regija određujući komplementarnost (CDR-ovi) iz ne-humanih vrsta i okvirne regije iz humanog imunoglobulinskog molekula (videti, npr. US 5585089; WO91/09967).

[0013] Himerna antitela su ona antitela kodirana od strane gena imunoglobulina koji su genetički konstruisani tako da su geni lakog i teškog lanca sastavljeni od segmenata imunoglobulinskih gena koji pripadaju različitim vrstama. Ova himerna antitela su verovatno manje antigena.

[0014] Dvovalentna antitela mogu biti dobijena metodama poznatim u tehnici (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539; WO 93/08829, Traunecker et al., 1991, EMBO J.10:3655-3659). Multi-valentna antitela mogu sadržavati višestruke specifičnosti ili mogu biti monospecifična (videti na primer WO 92/22853 i WO05/113605).

[0015] Antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu takođe biti generisana korišćenjem različitih metoda poznatih u tehnici i uključuju one koje su otkrivene od strane Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 19971879-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) and WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; and US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 and 5,969,108. Tehnike za produkciju jednolančanih antitela, kao što su one opisana u US 4946778, se mogu takođe prilagoditi za produkciju jednolančanih antitela koja se vežu na IL-17A i IL-17F. Takođe, transgeni miševi ili drugi organizmi, uključujući i druge sisare, mogu biti upotrebljeni za ekspresiju humanizovanih antitela.

[0016] Skrining antitela može biti izveden korišćenjem testova da izmere vezivanje na humanom IL-17A i humanom IL-17F, na primer BIAcore™ testova opisanih u Primerima navedenim ovde. Pogodni testovi neutralizacije su poznati u tehnici, videti na primer WO2008/047134 i ovde navedene Primere.

[0017] Ostaci u varijabilnim domenama antitela su konvencionalno numerisani prema sistemu osmišljenom od strane Kabat et al. Ovaj sistem je napred naveden u Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (U daljem tekstu "Kabat et al. (supra)"). Ovaj sistem numerisanja je korišćen u predmetnoj specifikaciji osim ako nije drugačije navedeno.

[0018] Oznake Kabatovih ostataka ne odgovaraju uvek direktno sa linearnim numerisanjem aminokiselinskih ostataka. Aktuelna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržavati manje ili više aminokiselina nego u striktnom Kabatovom numerisanju, što odgovara skraćenju ili umetanju strukturne komponente, bilo da se radi o okvirnoj regiji ili komplementarnosti koja određuje regiju (CDR) osnovne strukture varijabilne domene. Pravilno Kabat numerisanje ostataka se može odrediti za dato antitelo poravnavanjem ostataka homologije u sekvenci antitela sa "standardnom" Kabatovom numerisanom sekvencom.

[0019] CDR-ovi varijabilne domene teškog lanca se nalaze na ostacima 31-35 (CDR-H1), ostacima 50-65 (CDRH2) i ostacima 95-102 (CDR-H3) prema Kabatovom sistemu numerisanja. Međutim, prema Chothia (Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), petlja ekvivalentna sa CDR-H1 se proteže od ostatka 26 do ostatka 32. Tako "CDR-H1", kao što se ovde koristi, sadrži ostatke 26 do 35, kao što je opisano kombinacijom Kabatovog numeričkog sistema i definicije Chothiaove topološke petlje.

[0020] CDRs varijabilne domene lakog lanca se nalaze na ostacima 24-34 (CDR-L1), ostacima 50-56 (CDRL2) i ostacima 89-97 (CDR-L3) prema Kabatovom sistemu numerisanja.

[0021] Neutralizirajuće antitelo koje ima specifičnost za humani IL-17A i humani IL-17F, može sadržavati laki lanac, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR:4 za CDR-L1, sekvencu datu u SEK ID BR:5 za CDR-L2 i sekvencu datu u SEK ID BE:6 za CDR-L3 (videti Sliku 1c).

[0022] Molekuli antitela predmetnog pronalaska sadrže komplementarni teški lanac.

[0023] Prema tome, neutralizirajuće antitelo koje ima specifičnost za humani IL-17A i humani IL-17F, može sadržavati teški lanac, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži CDR imajući sekvencu datu u SEK ID BR:1 za CDR-H1, CDR imajući sekvencu datu u SEK ID BR:2 za CDR-H2 i CDR imajući sekvencu datu u SEK ID BR:3 za CDR-H3 (videti Sliku 1c).

[0024] U jednom izvođenju antitelo obezbeđeno predmetnim pronalaskom je monoklonalno antitelo.

[0025] U jednom izvođenju, antitelo obezbeđeno predmetnim pronalaskom je CDR-graftovani molekul antitela obuhvatajući svaki od CDR-ova dobezbeđenih u SEK ID BRS: od 1 do 6. Kao što se ovde koristi, termin "CDR-graftovani molekul antitela" se odnosi na molekul antitela pri čemu, teški i/ili laki lanac sadrži jedan ili više CDR-ova (jedan ili više modifikovanih CDR-ova) iz donorskog antitela (npr. mišje monoklonalno antitelo) graftovanih u okviru varijabilne regije teškog i/ili lakog lanca (npr. humano antitelo). Za pregled, videti Vaughanet al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. U jednom izvođenju samo ostaci za određivanje specifičnosti iz svakog gore opisanog CDR-a preneseni su u okvirnu ljudskog protutijela. Za pregled, videti Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. U jednom izvođenju samo specifičnost određivanja ostataka iz svake od CDR-ove opisane iznad ovde se prenosi na okvir humanog antitela.

[0026] Kada su CDR-ovi ili ostatci za određivanje specifičnosti graftovani, bilo koja odgovarajuća sekvenca akceptorske varijabilne regije može biti korišćena uzimajući u obzir klasu/tip donorskog antitela iz kojeg su dobijeni CDR-ovi, uključujući miša, primate i humana okvirna područja. Poželjno, CDR-graftovano antitelo prema predmetnom pronalasku ima varijabilni domen koji sadrži humane akceptorske okvirne regije, kao i jedan ili više CDR-ove ili specifičnost određivanja ostataka opisanih iznad. Tako, obezbeđeno u jednom izvođenju, je neutralizirajuće CDR-graftovano antitelo, pri čemu varijabilni domen sadrži humane akceptorske okvirne regije i CDR-ove koji nisu humani donori.

[0027] Primeri humanih okvira koji se mogu koristiti u predmetnom pronalasku su KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat et al., supra). Na primer, KOL i NEWM se mogu koristiti za teški lanac, REI se može koristiti za laki lanac, i EU, LAY i POM se mogu koristiti za teški i laki lanac. Alternativno mogu biti upotrebljene humane tzv. "germline"-klicine linije sekvence; One su dostupne na: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/

[0028] U CDR-graftovanom antitelu predmetnog pronalaska teški i laki lanci akceptora ne moraju nužno biti izvedeni iz istog antitela i mogu, ako se želi, sasdržati kompozitne lance imajući okvirne regije izvedene iz različitih lanaca.

[0029] Poželjna okvirna regija za teški lanac CDR-graftovanog antitela predmetnog pronalaska je izvedena iz humane pod-grupe VH3 sekvence 1-3 3-07 zajedno sa JH4, kao što je prethodno opisano u WO2008/047134. Prema tome, obezbeđeno je neutralizirajuće CDR-graftovano antitelo koje sadrži najmanje jedan CDR- koji nije humani donor, pri čemu je okvirna regija teškog lanca izvedena iz humane podgrupe sekvence 1-3 3-07 zajedno sa JH4. Sekvenca humanog JH4 je kao što sledi: (YFDY)WGQGTLVTVSS. Motiv YFDY je deo CDR-H3 i nije deo okvira 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591).

[0030] Poželjna okvirna regija za laki lanac CDR-graftovanog antitela predmetnog pronalaska je izvedena iz humane klicine linije pod-grupe VK1 sekvence 2-1-(1) L4 zajedno sa JK1, kao što je prethodno opisano u WO2008/047134. Prema tome, obezbeđeno je neutralizirajuće CDR-graftovano antitelo koje sadrži najmanje jedan CDR koji nije humani donor, pri čemu je okvirna regija lakog lanca izvedena iz humane podgrupe sekvence VK12-1-(1) L4 zajedno sa JK1. The JK1 sekvenca je kao što sledi: (WT)FGQGTKVEIK. Motiv WT je deo CDR-L3 i nije deo okvira 4 (Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522).

[0031] Takođe, u CDR-graftovanom antitelu predmetnog pronalaska, okvirne regije ne moraju imati tačno istu sekvencu kao one akceptorskog antitela. Na primer, neobični ostaci mogu biti menjani u češće nastale ostatke za klasu ili tip akceptorskog lanca. Alternativno, izabrani ostaci u okvirima akceptorskih regija mogu biti menjani tako da odgovaraju ostatku koji se nalazi na istoj poziciji u donorskom antitelu (videti Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Takve promene treba držati na minimumu potrebnom da se oporavi afinitet donorskog antitela. Protokol za biranje ostataka u okviru akceptorskih regija koje mogu biti menjane je naveden u WO 91/09967.

[0032] Poželjno, u CDR-graftovanom molekulu antitela predmetnog pronalaska, ako akceptorski teški lanac ima humanu VH3 sekvencu 1-3 3-07 zajedno sa JH4, onda akceptorske okvirne regije teškog lanca sadrže, pored jednog ili više donorskih CDR-ova, donorski ostatak na najmanje poziciji 94 (prema Kabat et al.,(supra)). Prema tome, obezbeđeno je CDR-graftovano antitelo, pri čemu najmanje ostatak na poziciji 94 varijabilne domene teškog lanca je donorski ostatak.

[0033] Poželjno, u CDR-graftovanom molekulu antitela prema predmetnom pronalasku, ako akceptorski laki lanac ima humanu pod-grupu VK1 sekvence 2-1-(1) L4 zajedno sa JK1 tada se ostaci donora ne prenose, tj. samo su CDR-ovi preneseni. Prema tome, obezbeđeno je CDR-graftovano antitelo, pri čemu su samo CDR-ovi preneseni u donorski okvir.

[0034] Ostaci donora su ostaci od donorskog antitela, tj. antitela od kojih su CDR-ovi originalno izvedeni.

[0035] U predmetnom pronalasku antitelo poznato kao CA028_0496 (prethodno opisano u WO2008/047134) je poboljšano menjanjem pet ostataka u lakom lancu. Tri ostataka su bila u CDR-ovima i dva u okviru. Prema tome, u jednom izvođenju varijabilni domen lakog lanca sadrži argininski ostatak na poziciji 30, serinski ostatak na poziciji 54, izoleucinski ostatak na poziciji 56, ostatak asparaginske kiseline na poziciji 60 i argininski ostatak na poziciji 72.

[0036] Prema tome, u jednom izvođenju, antitelo predmetnog pronalaska sadrži laki lanac, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 7 (gL7).

[0037] U jednom izvođenju, antitelo predmetnog pronalaska sadrži teški lanac, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR:9 (gH9).

[0038] U jednom izvođenju, antitelo predmetnog pronalaska sadrži teški lanac, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR:9 i laki lanac, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR:7.

[0039] "Identitet", kao što se ovde koristi, ukazuje da je aminokiselinski ostatak identičan između sekvenci u bilo kojoj određenoj poziciji u poravnatim sekvencama." Sličnost ", kao što se ovde koristi, označava da u bilo kojoj određenoj poziciji u poravnatim sekvencama, amino kiselinski ostatak je sličnog tipa između sekvenci. Na primer, leucin može biti supstituisan sa izoleucinom ili valinom. Druge aminokiseline koje mogu biti često supstituisane jedna sa drugom, uključuju, ali nisu ograničene na:

- fenilalanin, tirozin i triptofan (aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance);

- lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju bazne bočne lance);

- aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance);

- asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju amidne bočne lance); i

- cistein i metionin (aminokiseline koje imaju boče lance sadržavajući sumpor). Stepeni identiteta i sličnosti mogu biti lako izračunati (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).

[0040] Molekul antitela predmetnog pronalaska može sadržavati kompletni molekul antitela imajući teške i lake lance pune dužine ili fragmente od njih, kao što je domen antitela, na pr. VH, VL, VHH, Fab, modifikovani Fab, Fab', F(ab')2, Fv ili scFv fragment. Drugi fragmenti antitela uključuju Fab-Fv i Fab-dsFv fragmente opisane u WO2009040562 i WO2010035012 respektivno. U jednom izvođenju, fragment antitela predmetnog pronalaska je izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', F(ab')2, scFv i Fv fragment.

[0041] Biće procenjeno da antitela predmetnog pronalaska, naročito fragmenti antitela opisani iznad, mogu biti inkorporisani u druge oblike antitela, naročito u multi-specifična antitela, kao što su bi ili tri specifična antitela, gde je jedna specifičnost obezbeđena antitelom predmetnog pronalaska, tj. specifičnost za IL-17A i IL-17F (uključujući IL-17A/F heterodimer). Prema tome, u jednom izvođenju predmetni pronalazak obezbeđuje multi-specifično antitelo koje sadrži jedan ili više fragmenata antitela, opisanih ovde iznad.

[0042] Primeri multi-specifičnih antitela uključuju bi, tri ili tetra-valentna antitela, Bis-scFv, diabodije, triabodije, tetrabodije, bibodije i tribodije (videti na primer Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech 23(9): 1126-1136; Schoonjans et al., 2001, Biomolecular Engineering,, 17 (6), 193-202). Druga multi-specifična antitela uključuju Fab-Fv, FabdsFv, Fab-Fv-Fv. Fab-Fv-Fc i Fab-dsFv-PEG fragmente opisane u WO2009040562, WO2010035012, WO2011/08609, WO2011/030107 i WO2011/061492 respektivno.

[0043] Domene konstantne regije molekula antitela predmetnog pronalaska, ako postoje, mogu biti izabrane imajući u vidu predloženu funkciju molekula antitela, i naročito efektorne funkcije koje mogu biti potrebne. Na primer, domene konstantne regije mogu biti humane IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM domene. Naočito, mogu biti korišćene domene konstantne regije humanog IgG, posebno izotipa IgGl i IgG3, kada je molekul antitela namenjen za terapijsku upotrebu i potrebne su funkcije efektora antitela. Alternativno, izotipovi IgG2 i IgG4 mogu biti upotrebljeni kada je molekul antitela namenjen za terapijske svrhe, i funkcije efektora antitela nisu potrebne, npr. za jednostavno blokiranje IL-17 aktivnosti. Biće jasno da se varijante sekvenci ovih domena konstantne regije takođe mogu koristiti. Na primer, molekuli IgG4 u kojima je serin na poziciji 241 promenjen u prolin kao što je opisano u Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108 mogu biti upotrebljeni. Naročito je poželjna konstantna domena IgGl. Stručnjak sa ovog područja tehnike će takođe razumeti da antitela mogu prolaziti kroz različite posttranslacionee modifikacije. Tip i obim ovih modifikacija često zavisi od ćelije domaćina korišćene za ekspresiju antitela, kao i za uslove kulture. Takve modifikacije mogu uključivati varijacije u glikozilaciji, oksidaciji metioninom, formiranju diketopiperazina, aspartatnoj izomerizaciji i asparagin deamidaciji. Česta modifikacija je gubitak karboksi-terminalnog bazičnog ostatka (kao što je lizin ili arginin) zbog delovanja karboksipeptidaza (kao što je opisano u Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Prema tome, C-terminalni lizin teškog lanca antitela, na primer kao što je prikazan na Slici 2 (a), SEK ID BR: 15, može biti odsutan.

[0044] U jednom izvođenju, teški lanac antitela sadrži CH1 domen, i laki lanac antitela sadrži CL domen, bilo kapa ili lambda.

[0045] U poželjnom izvođenju antitelo obezbeđeno predmetnim pronalaskom je neutralizirajuće antitelo koje ima specifičnost za humani IL-17A i humani IL-17F u kojem konstantna regija teškog lanca sadrži konstantnu regiju humanog IgG1. Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo u kojem teški lanac sadrži ili se sastoji od sekvence date u SEK ID BR: 15 (Videti Sliku 2a).

[0046] U jednom izvođenju, molekul antitela prema predmetnom pronalasku sadrži laki lanac koji sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 11 (Videti Sliku 1d).

[0047] U poželjnom izvođenju predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo u kojem teški lanac sadrži ili se sastoj od sekvence date u SEK ID BR: 15, i laki lanac sadrži ili se sastoji od sekvence date u SEK ID BR: 11.

[0048] Molekul antitela bilo kojeg aspekta predmetnog pronalaska poželjno ima visoki afinitet vezivanja, poželjno pikomolarni. Biće jasno da afinitet vezivanja antitela prema predmetnom pronalasku za humani IL-17A može biti različit od afiniteta vezivanja istog antitela za humani IL-17F i/ili IL-17A/F heterodimer. U jednom primeru molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet za IL-17A koji je veći od njegovog afiniteta za IL-17F. U jednom primeru molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet za IL-17A koji je najmanje pet puta veći od njegovog afiniteta vezivanja za IL-17F. U jednom primeru molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet za IL-17A koji je isti kao i njegov afinitet za IL-17F. U jednom primeru molekul antitela predmetnog pronalaska ima pikomolarni afinitet za IL-17A i IL-17F.

[0049] Afinitet može biti izmerien primenom bilo koje pogodne metode poznate u tehnici, uključujući BIAcore™, kao što je opisano u Primerima ovde, korišćenjem izolovanog prirodnog ili rekombinantnog IL-17A i IL-17F, koji oba postoje kao homodimeri.

[0050] Poželjno, molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet vezivanja za IL-17A od 50 pM ili manje. U jednom izvođenju, molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet vezivanja za IL-17A od 20 pM ili manje. U jednom izvođenju, molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet vezivanja za IL-17A od 10 pM ili manje. U jednom izvođenju, molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet vezivanja za IL-17A od 5 pM ili manje. U jednom izvođenju antitelo predmetnog pronalaska ima afinitet za IL-17A od 3.2 pM.

[0051] Poželjno, molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet vezivanja za IL-17F od 100 pM ili manje. U jednom izvođenju antitelo predmetnog pronalaska ima afinitet za IL-17F od 50 pM ili manje. U jednom izvođenju antitelo predmetnog pronalaska ima afinitet za IL-17F od 23 pM.

[0052] Biće procenjeno da afinitet antitela obezbeđenih predmetnim pronalaskom može biti menjan upotrebom bilo koje pogodne metode poznate u tehnici. Predmetni pronalazak se usled toga takođe odnosi na varijante molekula antitela predmetnog pronalaska, koji imaju poboljšani afinitet za IL-17A i/ili IL-17F. Takve varijante se mogu dobiti nizom protokola sa afinitetom sazrevanja, uključujući mutiranje CDR-ova (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), chain shuffling (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), use of mutator strains of E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA shuffling (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), phage display (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) and sexual PCR (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) diskutuje o ovim metodama sazrevanja afiniteta.

[0053] Ako se želi, antitelo za upotrebu u predmetnom pronalasku može biti konjugovano na jednom ili više efektora molekula (više molekula). Treba imati na umu da efektorski molekul može sadržavati pojedinačni efektorski molekul ili dva ili više takvih molekula tako povezanih da formiraju pojedinačni ostatak koji se može vezati za antitela predmetnog pronalaska. Tamo gde se želi dobiti fragment antitela povezan sa efektorskim molekulom, ovo može biti pripremljeno standardnim hemijskim ili procedurama rekombinantne DNK u kojima je fragment antitela povezan ili direktno ili putem agensa za spajanje za efektorski molekul. Tehnike za konjugaciju takvih efektorskih molekula za antitela su dobro poznate u tehnici (videti, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp.

623-53; Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Posebne hemijske procedure uključuju, na primer, one opisane u WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 i WO03031581. Alternativno, gde je efektorski molekul protein ili polipeptid, povezivanje može biti postignuto korišćenjem procedura rekombinantne DNK, na primer kao što je opisano u WO 86/01533 i EP0392745.

[0054] Termin efektorski molekul, kao što se ovde koristi, uključuje, na primer, antineoplastične agense, lekove, toksine, biološki aktivne proteine, na primer enzime, druga antitela ili fragmente antitela, sintetske ili prirodne polimere, nukleinske kiseline i fragmente od njih, npr. DNK, RNK i fragmente od njih, radionukleotide, naročito radiojodid, radioizotope, helirane metale, nanočestice i reporterske grupe kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja mogu biti detektovana putem NMR ili ESR spektroskopije.

[0055] Primeri efektorskih molekula mogu uključiti citotoksine ili citotoksične agense, uključujući bilo koji agens, koje je štetan za (npr. ubija) ćelije. Primeri uključuju kombrestatine, dolastatine, epotilone, staurosporin, majtanzinoide, spongistatine, rizoksin, halihondrine, roridine, hemiasterline, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i analoge ili homologe od njih.

[0056] Efektorski molekuli takođe uključuju, ali nisu ograničene na, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), agense za alkilovanje (npr. mehloretamin, tiopa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platinum (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, antramicin (AMC), kaliheamicin ili duokarmicin), i anti-mitotičke agense (npr. vinkristin i vinblastin).

[0057] Drugi efektorski molekuli mogu uključiti helirane radionuklide kao što je<111>In i<90>Y, Lu<177>, Bizmut<213>, Kalifornijum<252>, Iridijum<192>i Tangsten<188>/ Renijum<188>; lekovi kao što su, ali bez ograničenja na, alkilfosfoholine, inhibitore topoizomeraze I, taksoide i suramin.

[0058] Drugi efektorski molekuli uključuju proteine, peptide i enzime. Enzimi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, proteolitičke enzime, hidrolaze, lijaze, izomeraze, transferaze. Proteini, polipeptidi i peptidi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, imunoglobuline, toksine kao što je abrin, ricin A, pseudomonasni egzotoksin ili difterijski toksin, protein kao što je insulin, faktor nekroze tumora, α-interferon, β-interferon, faktor rasta nerva, faktor rasta krvnih pločica ili tkivni plazminogenski aktivator, trombotski agens ili anti-angiogeni agens, npr. angiostatin ili endostatin, ili modifikator biološkog odgovora kao što je limfokin, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), granulocitno-makrofagni faktor stimulacije kolonija (GM- CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), faktor rasta nerva (NGF), ili drugi faktor rasta i imunoglobulini.

[0059] Drugi efektorski molekuli mogu uključiti supstance za detekciju korisne na primer u dijagnozi. Primeri supstanci za detekciju uključuju razne enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale, radioaktivne nuklide, metale koji emituju pozitrone (za upotrebu u pozitronskoj emisionoj tomografiji), i neradioaktivne paramagnetske metalne jone. Videti, generalno, U.S. Patent No. 4 741 900 za metalne jone koji mogu biti konjugovani za antitela za upotrebu kao u dijagnostci. Pogodni enzimi uključuju peroksidazu iz rena, alkalnu fosfatazu, ili betagalaktozidazu, ili acetilholinesterazu; pogodne prostetičke grupe uključuju streptavidin, avidin i biotin; pogodni fluorescentni materijali uključuju ubeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil-hlorid i fikoeritrin; pogodni luminiscentni materijali obuhvataju luminol; pogodni bioluminiscentni materijali uključuju luciferazu, luciferin, ekvorin; i pogodni radioaktivni nuklidi uključuju<125>I,<131>I,<111>In i<99>Tc.

[0060] U drugom primeru efektorski molekul može povećati vreme poluraspada antitela in vivo, i/ili smanjiti imunogenost antitela i/ili poboljšati isporuku antitela kroz epitelijalnu barijeru do imunog sistema. Primeri pogodnih efektorskih molekula ovog tipa uključuju polimere, albumin, albumin vezujuće proteine ili albumin vezujuća jedinjenja kao što su ona opisana u WO05/117984.

[0061] Gde je efektorski molekul polimer može, generalno, biti sintetski ili prirodni polimer, na primer, opciono-supstituisani pravi ili razgranati lanac, polialkilena, polialkenilena ili polioksialkilen polimera ili razgranati ili nerazgranati polisaharid, npr. i homo- ili hetero-polisaharid.

[0062] Određeni opcioni supstituenti koji mogu biti prisutni u iznad spomenutim sintetskim polimerima uključuju jednu ili više hidroksi, metil ili metoksi grupa.

[0063] Određeni primeri sintetskih polimera uključuju opciono supstituisani pravi ili razgranati lanac poli(etilenglikol), poli(propilenglikol), poli(vinilalkohol), ili derivate od njih, posebno opciono supstituisani poli (etilenglikol) kao što je metoksipoli(etilenglikol) ili derivate od njih.

[0064] Određeni polimeri koji se pojavljuju prirodno uključuju laktozu, amilozu, dekstran, glikogen ili derivate od njih.

[0065] „Derivati”, kao što se ovde koristi je namenjen da uključuje reaktivne derivate, na primer tiol -selektivne reaktivne grupe kao što su maleimidi i slično. Reaktivna grupa može biti povezana direktno ili preko linkera segmenta polimera. Biće jasno da će ostatak takve grupe u nekim slučajevima formirati deo produkta kao vezujuću grupu između fragmenta antitela i polimera.

[0066] Veličina malog polimera može varirati po želji, ali će generalno biti u prosečnoj molekularnoj težini od 500Da do 50000Da, poželjno od 5000 do 40000Da i poželjnije od 20000 do 40000Da. Veličina polimera može naročito biti izabrana na osnovu namene produkta, na primer sposobnosti da lokalizuje određena tkiva kao što su tumori ili produženo cirkulišuće vreme poluraspada (za pregled videti Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Tako, na primer, gde je produkt namenjen da napusti cirkulaciju i prodre u tkivo, na primer, za upotrebu u lečenju tumora, može biti korisno koristiti male molekularne težine polimera, na primer, sa molekularnom težinom od oko 5000Da. Za aplikacije gde produkt ostaje ucirkulaciji, može biti korisno koristiti polimer veće molekularne težine, na primer, koji ima molekularnu težinu u rasponu od 20000Da do 40000Da.

[0067] Naročito poželjni polimeri uključuju polialkilen polimer, kao što je poli(etilenglikol) ili, posebno, metoksipoli(etilen-glikol) ili njegov derivat, i posebno sa molekularnom težinom u rasponu od oko 15000Da do oko 40000Da.

[0068] U jednom primeru antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku su spojena za poli (etilenglikol)(PEG) ostatke. U jednom određenom primeru antitielo je fragment antitela, i PEG molekuli mogu biti spojeni preko bilo kojeg raspoloživog aminokiselinskog bočnog lanca ili terminalne funkcionalne grupe aminokiseline smeštene u fragment antitela, na primjer, bilo koje slobodne amino, imino, tiol, hidroksil ili karboksil grupe. Takve aminokiseline se mogu prirodno pojaviti u fragmentu antitela ili se mogu ubaciti u fragment primenom metoda rekombinantne DNK (videti na primer US 5219996; US 5667425; WO98/25971). U jednom primeru, molekul antitela predmetnog pronalaska je modifikovani Fab fragment, pri čemu je modifikacija dodatak na C-terminalnom kraju njegovog teškog lanca jedne ili više aminokiselina da dopusti spajanje efektorskog molekula. Poželjno, dodatne aminokiseline formiraju modifikovanu zglobnu regiju sadržavajući jedan ili više cisteinskih ostataka na kojima se efektorski molekuli može spojiti. Višestruka mesta se mogu koristiti za spajanje dva ili više PEG molekula.

[0069] Poželjno PEG molekuli su kovalentno povezani preko tiol grupe najmanje jednog cisteinskog ostatka smeštenog u fragmentu antitela. Svaki molekul polimera vezan na modifikovani fragment antitela može biti kovalentno vezan na atom sumpora cisteinskog ostatka smešenog u fragmentu. Kovalentna veza će generalno biti disulfidna veza ili naročito, sumpor-ugljenik veza. Gde je tiol-grupa korišćena kao tačka spajanja odgovarajuće aktiviranih efektorskih molekula, na primer, selektivni derivati tiola kao maleimidi i derivati cisteina mogu biti korišćeni. Aktivirani polimer može biti korišćen kao početni materijal u pripremi polimer-modifikovanih fragmenata antitela kao što je opisano iznad. Aktivirani polimer može biti bilo koji polimer koji sadrži tiol reaktivnu grupu kao što je α halokarboksilna kiselina ili estar, npr. jodocetamid, imid, npr. maleimid, vinil sulfon ili disulfid. Takvi polazni materijali se mogu dobiti komercijalno (na primer od Nektar, formerly Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) i mogu biti pripremljeni iz komercijalno dostupnih početnih materijala primenom uobičajenih hemijskih procedura. Naročito PEG molekuli uključuju 20K metoksi-PEG-amin (mogu se dobiti od Nektar, ranije Shearwater; Rapp Polymere; i SunBio) i M-PEG-SPA (mogu se dobiti od Nektar, ranije Shearwater).

[0070] U jednom izvođenju, antitelo je modifkovani Fab fragment koji je PEGilirani, tj. ima PEG (poli(etilenglikol)) kovalentno vezan za njega, npr. prema metodi objavljenoj u EP 0948544 [videti takođe "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. U jednom primeru PEG je spojen za cistein u zglobnoj regiji. U jednom primeru, PEG modifikovani Fab fragment ima maleimid grupu kovalentno vezanu za pojedinačnu tiol grupu u modifikovanoj zglobnoj regiji. Ostatak lizina može biti kovalentno vezan na maleimidnu grupu i na svaku od amino grupa lizinskog ostatka može biti spojen metoksipropil(etilenglikol) polimer koji ima molekularnu težinu od približno 20.000 Da. Ukupna molekularna težina PEG-a spojena za Fab fragment može zbog toga biti približno 40.000 Da.

[0071] U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje neutralizirajući molekul antitela koji ima specifičnost za humani IL-17A i humani IL-17F, koji je modifikovan Fab fragment imajući teški lanac koji sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 9 i laki lanac koji sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 7, i imajući na C-terminalnom kraju njegovog teškog lanca modifikovanu zglobnu regiju sadržavajući najmanje jedan cisteinski ostatak za koji je spojen efektor molekula. Poželjno, efektor molekula je PEG i spojen je, korišćenjem metoda opisanih u (WO98/25971 i WO2004072116) pri čemu je lizil--maleimidna grupa spojena za ostatak cisteina na C-terminalnom kraju teškog lanca, i svaka amino grupa lizil ostatka je kovalentno vezana na njemu metoksipoli(etilenglikol) ostatakom imajući molekularnu težinu od oko 20.000 Da. Ukupna molekularna težina PEG-a spojena za antitelo je usled toga približno 40.000Da.

[0072] U drugom primeru efektorski molekuli mogu biti spojeni za fragmente antitela upotrebom metoda opisanih u Međunarodnim patentnim prijavama WO2005/003169, WO2005/003170 i WO2005/003171.

[0073] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu DNK sekvencu koja kodira teški i/ili laki lanac (lance) molekula antitela iz predmetnog pronalaska. Poželjno, DNK sekvenca kodira teški ili laki lanac molekula antitela iz predmetnog pronalaska. DNK sekvenca predmetnog pronalaska može sadržavati sintetsku DNK, na primer proizvedenu hemijskom obradom, cDNK, genomskom DNK ili bilo kojom kombinacijom od njih.

[0074] DNK sekvence koje kodiraju molekul antitela predmetnog pronalaska mogu biti dobijene metodama dobro poznatim stručnjacima sa ovog područja tehnike. Na primer, DNK sekvence koje kodiraju deo ili sve teške i lake lance antitela mogu biti sintetisane po želji iz određenih sekvenci DNK ili na osnovu odgovarajućih sekvenci aminokiselina.

[0075] DNK koja kodira sekvence akceptorskog okvira je široko dostupna stručnjacima u tehnici i može lako biti sintetisana na osnovu njihovih poznatih aminokiselinskih sekvenci.

[0076] Standardne tehnike molekularne biologije mogu biti korišćene za pripremu DNK sekvenci koje kodiraju molekul antitela predmetnog pronalaska. Željene sekvence DNK mogu biti sintetisane u potpunosti ili delimično primenom tehnika sinteze oligonukleotida. Po potrebi se može koristiti mesto- usmerene mutageneze i tehnike lančane reakcije polimeraze (PCR).

[0077] Primeri pogodnih sekvenci su obezbeđeni u SEK ID BR:8; SEK ID BR:10; SEK ID BR:13; SEK ID BR:14; SEK ID BR:17, SEK ID BR:18 I SEK ID BR:19.

[0078] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na kloniranje ili ekspresioni vektor koji sadrži jednu ili više DNK sekvenci predmetnog pronalaska. Prema tome, obezbeđen je klonirajući ili ekspresioni vektor sadržavajući jednu ili više sekvenci DNK kodirajući antitelo predmetnog pronalaska. Poželjno, klonirajući ili ekspresioni vektor sadrži dve DNK sekvence, koje kodiraju laki lanac i teški lanac molekula antitela predmetnog pronalaska, respektivno uz pogodne signalne sekvence. Poželjno, vektor prema predmetnom pronalasku sadrži sekvence date u SEK ID BR: 14 i SEK ID BR: 18. U jednom izvođenju, vektor prema pedmetnom pronalasku sadrži sekvence date u SEK ID BR: 13 i SEK ID BR: 17.

[0079] Generalne metode pomoću kojih vektori mogu biti konstruisani, metode transfekcije i metode kulture dobro su poznate stručnjacima sa ovog područja tehnike. U tom pogledu se pozivamo na "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.

[0080] Takođe je obezbeđena ćelija domaćina koja sadrži jedan ili više kloniranih ili ekspresionih vektora sadržavajući jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju antitelo predmetnog pronalaska. Bilo koja odgovarajuća ćelija domaćina/sistem vektora može biti upotrebljena za ekspresiju DNK sekvenci koje kodiraju molekul antitela predmetnog ronalaska. Mogu se koristiti takođe bakterijski, na primer E. koli, i drugi mikrobiološki sistemi, ili eukariotski, na primer sisara, ekspresioni sistemi ćelije domaćina. Pogodne ćelije domaćina sisara uključuju CHO, mijelom ili ćelije hibridoma.

[0081] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje proces za produkciju molekula antitela prema predmetnom pronalasku sadržavajući kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži vektor predmetnog pronalaska pod uslovima pogodnim za dovođenje do ekspresije proteina iz DNK koja kodira molekul antitela predmetnog pronalaska, i izolovanje molekula antitela.

[0082] Molekul antitela može sadržavati samo polipeptid teškog ili lakog lanca, u kojem slučaju treba koristiti samo teški ili laki lanac polipeptida kodirajuće sekvence da transfektuje ćelije domaćina. Za produkciju produkata koji sadrže oba teške i lake lance, ćelijska linija može biti transfektovana sa dva vektora, prvi vektor koji kodira polipeptid lakog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid teškog lanca. Alternativno, može biti upotrebljen pojedinačni vektor, vektor uključujući sekvence koji kodiraju polipeptide lakog lanca i teškog lanca.

[0083] Kao što su antitela predmetnog pronalaska korisna u lečenju i/ili profilaksi patološkog stanja, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku ili dijagnostičku kompoziciju koja sadrži molekul antitela predmetnog pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, razblaživača ili nosača. Prema tome, obezbeđena je upotreba antitela prema predmetnom pronalasku za proizvodnju leka. Kompozicija će obično biti isporučena kao deo sterilne farmaceutske kompozicije koja će normalno biti uključena kao farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija predmrtnog pronalaska može dodatno sadržavati farmaceutski-prihvatljiv adjuvans.

[0084] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje proces za pripremu farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije sadržavajući dodavanje i mešanje molekula antitela predmetnog pronalaska zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa, razblaživača ili nosača.

[0085] Molekul antitela može biti jedini aktivni sastojak u farmaceutskoj ili dijagnostičkoj kompoziciji ili može biti praćen drugim aktivnim sastojcima uključujući druge sastojke antitela, na primer anti-TNF, anti-IL-1, anti-Tćeliju, anti-IFNy ili anti-LPS antitela ili sastojke bez antitela kao što su ksantini ili inhibitor malog molekula.

[0086] Farmaceutska kompozicija poželjno sadrži terapijski efikasnu količinu antitela predmetnog pronalaska. Termin "terapijski efikasna količina" kao što se ovde koristi se odnosi na količinu terapijskog agensa potrebnog da se leči, ublaži ili spreči ciljana bolest ili stanje ili pokaže detektibilni terapijski ili preventivni efekat. Za bilo koje antitelo, terapijski efikasna količina može biti procenjena u početku ili u testovima ćelijske kulture ili na modelima životinja, obično na glodarima, zečevima, psima, svinjama ili primatima. Životinjski model može takođe biti korišćen za određivanje odgovarajuće koncentracije raspona i načina primene. Takve informacije mogu zatim biti korišćene da odrede korisne doze i načine primene kod ljudi.

[0087] Tačna terapijski efikasna količina za humani subjekat će zavisiti od težine bolesnog stanja, opšteg zdravlja subjekta, starosti, težine i pola subjekta, ishrane, vremena i učestalosti primene, kombinacije leka (lekova), reakcijskih osetljivosti i tolerancije/odgovora na terapiju. Ova količina može biti određena rutinskim eksperimentisanjem i nalazi se u proceni kliničara. Generalno, terapijski efikasna količina će biti od 0.01 mg/kg do 50 mg/kg, poželjno 0.1 mg/kg do 20 mg/kg. Farmaceutske kompozicije mogu biti pogodno predstavljene u oblicima jedinične doze koji sadrže prethodno određenu količinu aktivnog agensa predmetnog pronalaska po dozi.

[0088] Kompozicije mogu biti primenjivane pojedinačno na pacijentu ili mogu biti primenjivane u kombinaciji (npr. istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno) sa drugim agensima, lekovima ili hormonima.

[0089] Doza pri kojoj je primenjivan molekul antitela predmetnog pronalaska, zavisi od prirode stanja koje se leči, obima prisutne inflamacije i od toga da li se koristi molekul antitela profilaktički ili se leči postojeće stanje.

[0090] Učestalost doze će zavisiti od vremena poluraspada molekula antitela i trajanja njezinog efekta. Ako molekul antitela ima kratko vreme poluraspada (npr.2 do 10 sati), može biti potrebno da se daje jedna ili više doza dnevno. Alternativno, ako molekul antiela ima dugo vreme poluraspada (npr. 2 do 15 dana), može biti potrebno dati samo jedu dozu dnevno, jednom nedeljno ili čak jednom svakog 1 ili 2 meseca.

[0091] Farmaceutski prihvatljivi nosač ne bi trebao sam indukovati produkciju antitela štetnih za pojedinca koji prima kompoziciju i ne bi trebalo biti toksični. Pogodni nosači mogu biti veliki, sporo metabolisani makromolekuli kao što su proteini, polipeptidi, lipozomi, polisaharidi, polimlečne kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne aminokiseline, kopolimeri aminokiselina i neaktivne čestice virusa.

[0092] Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti korišćene, na primer, soli mineralnih kiselina, kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati i sulfati, ili soli organskih kiselina, kao što su acetati, propionati, malonati i benzoati.

[0093] Farmaceutski prihvatljivi nosači u terapijskim kompozicijama mogu dodatno sadržavati tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Dodatno, u takvim kompozicijama mogu biti prisutne pomoćne supstance, kao što su agensi za vlaženje ili emulgatori ili pH supstance za puferovanje. Takvi nosači omogućuju da farmaceutske kompozicije budu formulisane kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, guste suspenzije i suspenzije, za gutanje kod pacijenta.

[0094] Poželjni oblici za primenu uključuju oblike pogodne za parenteralnu primenu, na pr. injekcijom ili infuzijom, na primer bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Gde je produkt za injekciju ili infuziju, može biti u obliku suspenzije, rastvora ili emulzije u uljanom ili vodenom nosaču i može sadržavati formulacijske agense, kao sredstva za suspendovanje, konzervisanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, molekul antitela može biti u suvom obliku, za rekonstituciju pre upotrebe sa odgovarajućom sterilnom tečnošću.

[0095] Jednom formulisane, kompozicije predmetnog pronalasku mogu biti primenjivane direktno na subjektu. Subjekti koji se leče mogu biti životinje. Međutim, poželjno kompozicije su prilagođene za primenu na humanim subjektima.

[0096] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjivane bilo kojim brojem puteva uključujući, ali bez ograničenja, oralni, intravenski, intramuskularni, intra-arterijski, intramedularni, intratekalni, intraventrikularni, transdermalni, transkutani (na primer, videti WO 98/20734), subkutani, intraperitonealni, intranazalni, enteralni, topikalni, sublingvalni, intravaginalni ili rektalni put. Hiposprejevi takođe mogu biti korišćeni za primenu farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska. Tipično, terapijske kompozicije mogu biti pripremljene kao injekcije, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije. Takođe mogu biti pripremljeni čvrsti oblici pogodni za rastvor ili suspenziju u tečnim nosačima pre injektiranja.

[0097] Direktna isporuka kompozicija će se generalno postići injekcijom, subkutano, intraperitonealno, intravenozno ili intramuskularno, ili se isporučuju u intersticijalni prostor tkiva. Kompozicije se mogu takođe dati u leziju. Lečenje doziranjem može biti predviđeno u vidu pojedinačne doze ili u vidu višestrukih doza.

[0098] Biće jasno da će aktivni sastojak u kompoziciji biti molekul antitela. Kao takav, biće podložan degradaciji u gastrointestinalnom traktu.Tako, ako se kompozicija treba primeniti putem koji koristi gastrointestinalni trakt, kompozicija će morati sadržavatiagense koji štite antitelo od razgradnje, ali koji oslobađaju antitelo kada se apsorbuje iz gastrointestinalnog trakta.

[0099] Temeljna rasprava o farmaceutski prihvatljivim nosačima je dostupna u Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J.1991).

[0100] U jednom izvođenju formulacija je obezbeđena kao formulacija za topikalne primene, uključujući inhalaciju.

[0101] Pogodni inhalacioni pripravci uključuju praškove za inhalaciju, aerosole za doziranje koji sadrže potisne gasove ili rastvore za inhalaciju bez potisnih gasova. Inhalacioni prah prema otkriću koji sadrži aktivnu supstancu može se sastojati isključivo od gore pomenutih aktivnih supstanci ili smeše gore pomenutih aktivnih supstanci sa fiziološki prihvatljivim ekscipijensom.

[0102] Ovi inhalacioni praškovi mogu uključivati monosaharide (npr. glukozu ili arabinozu), disaharide (npr. laktozu, saharozu, maltozu), oligo- i polisaharide (npr. dekstrane), polialkohole (npr. sorbitol, manitol, ksilitol), soli (na primer natrijum hlorid, kalcijum karbonat) ili njihove međusobne smeše. Pogodni su mono- ili disaharidi, upotreba laktoze ili glukoze, naročito ali ne isključivo u obliku njihovih hidrata.

[0103] Čestice za taloženje u plućima zahtevaju veličinu čestica manju od 10 mikrona, kao što je 1-9 mikrona, na primer od 0.1 do 5 mm, naročito od 1 do 5 mm. Veličina čestica aktivnog sastojka (kao što je antitelo ili fragment) je od primarne važnosti.

[0104] Potisni gasovi koji mogu biti korišćeni za pripremu inhalacionih aerosola su poznati u tehnici. Pogodni potisni gasovi su izabrani između ugljovodonika kao što je n-propan, n-butan ili izobutan i halo-ugljovodonici kao što su hlorisani i/ili fluorisani derivati metana, etana, propana, butana, ciklopropana ili ciklobutana. Iznad pomenuti potisni gasovi mogu biti korišćeni sami ili u njihovim smešama.

[0105] Naročito pogodni potisni gasovi su halogenirani derivati alkana izabrani između TG 11, TG 12, TG 134a i TG227.

Od iznad navedenih halogeniranih ugljovodonika, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetan) i TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan) i smeše od njih su naročito pogodni.

[0106] Aerosoli koji se mogu inhalirati sa potisnim gasom mogu takođe sadržavati druge sastojke kao što su su rastvarači, stabilizatori, površinski aktivni agrensi (surfaktanti), antioksidanti, sredstva za podmazivanje i sredstva za podešavanje pH. Svi ovi sastojci su poznati u tehnici.

[0107] Inhalacioni aerosoli koji sadrže potisni gas prema predmetnom pronalasku mogu sadržavati do 5.% po težini aktivne supstance. Aerosoli prema pronalasku sadrže, na primjer, 0.002 do 5% po težini, 0.01 do 3 % po težini, 0.015 do 2% po težini, 0.1 do 2% po težini, 0.5 do 2% po težini, ili 0.5 do 1% po težini aktivnog sastojka.

[0108] Alternativne topikalne primene u pluća mogu takođe biti davanjem tečnog rastvora ili formulacije suspenzije, na primer primenom uređaja kao što je nebulizator, na primer, raspršivač spojen na kompresor (npr. Pari LC-Jet Plus(R) nebulizator spojen na Pari Master (R) kompresor proizveden od strane Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

[0109] Antitelo predmetnog pronalaska se može unositi dispergovano u rastvaraču, npr. u obliku rastvora ili suspenzije. Može biti suspendovano u pogodnom fiziološkom rastvoru, npr. fiziološki prihvatljivom rastvaraču ili puferisanom rastvoru. Puferisani rastvori poznati u tehnici mogu sadržavati 0.05 mg do 0.15 mg dinatrijum edetata, 8.0 mg do 9.0 mg NaCl, 0.15 mg do 0.25 mg polisorbata, 0.25 mg do 0.30 mg anhidrovane limunske kiseline i 0.45 mg do 0.55 mg natrijum citrata po 1 ml vode tako da se postigne pH od oko 4.0 do 5.0. Suspenzija može primeniti, na primer, liofilizovano antitelo.

[0110] Terapijske suspenzije ili formulacije rastvora mogu takođe sadržavati jedan ili više ekscipijenasa. Ekscipijensi su dobro poznati u tehnici i uključuju pufere (npr. citratni pufer, fosfatni pufer, acetatni pufer i bikarbonatni pufer), aminokiseline, ureu, alkohole, askorbinsku kiselinu, fosfolipide, proteine (npr. serumski albumin), EDTA, lipozome, manitol, sorbitol i glicerol. Rastvori ili suspenzije mogu biti inkapsulirani u lipozome ili biorazgradive mikrosfere. Formulacija će generalno biti obezbeđena u suštinski sterilnom obliku, uz primenu sterilnih procesa proizvodnje.

[0111] Ovo može uključiti produkciju i sterilizaciju filtracijom puferisanog rastvarača/rastvor korišćen za formulaciju, aseptičnom suspenzijom antitela u sterilnom puferisanom rastvoru rastvarača i točenjem formulacije u sterilne posude metodama koje su poznate prosečnom stručnjaku u tehnici.

[0112] Nebulizirana formulacija prema predmetnom pronalasku može biti obezbeđena, na primer, kao pojedinačne dozne jedinice (npr. hermetički zatvorene plastične posude ili bočice) pakovane u folijske omotnice. Svaka bočica sadrži jediničnu dozu u zapremini npr.2 mL rastvarača/rastvor pufera.

[0113] Ovde opisana antitela mogu biti pogodna za isporuku nebulizacijom.

[0114] Takođe je predviđeno da antitelo predmetnog pronalaska može biti primenjeno pomoću genske terapije. Da bi se ovo postiglo, DNK sekvence koje kodiraju teške i lake lance molekula antitela pod kontrolom odgovarajućih komponenti DNK se unose kod pacijenta tako da su lanci antitela izraženi iz DNK sekvenci i sastavljeni in situ.

[0115] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje molekul antitela za upotrebu u kontroli inflamatornih bolesti. Poželjno, molekul antitela može biti korišćen za smanjenje inflamatornog procesa ili da se spreči inflamatorni proces.

[0116] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje molekul antitela predmetnog pronalaska za upotrebu u lečenju ili profilaksi patološkog poremećaja koji je posredovan od strane IL-17A i/ili IL-17F ili je povezan sa povećanim nivoom IL-17A i/ili IL-17F. Poželjno, patološko stanje je izabrano iz grupe koja se sastoji od infekcija (virusne, bakterijske, gljivične i parazitske), endotoksičnog šoka koji je povezan sa infekcijom, artritisa, reumatoidnog artritia, psorijatičnog artritisa, početnog sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa (JIA), sistemskog eritemskog lupusa (SLE), astme, hronične opstruktivne bolesti disajnih puteva (COAD), hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), akutne povrede pluća, inflamatorne bolesti karlice, Alchajmerove bolesti, Kronove bolesti, inflamatorne bolesti creva, sindroma iritabilnog creva, ulceroznog kolitisa, Kastlemanove bolesti, ankilozirajućeg spondilitisa i drugih spondiloartropatija, dermatomiozitisa, miokarditisa, uveitisa, egzoftalmusa, autoimunog tiroiditisa, Pejronijeve bolesti, celijačne bolesti, bolesti žučne kese, Pilonidne bolesti, peritonitisa, psorijaze, atopijskog dermatitisa, vaskulitisa, hirurških adhezija, moždanog udara, autoimunog dijabetesa, Dijabetesa tipa I, lajmskog artritisa, meningoencefalitisa, imunološki posredovanih inflamatornih poremećaja centralnog i perifernog nervnog istema kao što je multipla skleroza i Gijen-Bareov sindrom, drugih autoimunih poremećaja, pankreatitisa, traume (hirurgija), bolesti grafta protiv domaćina, odbacivanja transplantata, poremećaja fibroze uključujući fibrozu pluća, fibrozu jetre, fibrozu bubrega, skleroderme ili sistemske skleroze, kancera (oba čvrsta tumora kao što su melanomi, hepatoblastomi, sarkomi, karcinomi skvamoznih ćelija, karcinoma tranzicione ćelije, karcinoma jajnika i maligne hematološke bolesti, a naročito akutne mijelogene leukemije, hronične mijelogene leukemije, hronične limfatične leukemije, karcinom želuca i kancera debelog creva), bolesti srca uključujući ishemijske bolesti kao što je infarkt miokarda kao i ateroskleroza, intravaskularne koagulacije, resorpcije kostiju, osteoporoze, periodontitisa i hipohlorhidrije.

[0117] U jednom izvođenju antitelo predmetnog pronalaska se koristi u lečenju ili profilaksi patoloških poremećaja izabranih iz grupe koja se sastoji od artritisa, reumatoidnog artritisa, psorijaze, psorijatičnog artritisa, početnog sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa (JIA), sistemskog eritemskog lupusa (SLE ), astme, hronične opstruktivne bolesti disajnih puteva, hronične opstruktivne bolesti pluća, atopijskog dermatitisa, skleroderme, sistemske skleroze, fibroze pluća, inflamatornih bolesti creva, ankilozirajućeg spondilitisa i drugih spondiloartropatija i kancera.

[0118] U jednom izvođenju antitelo predmetnog pronalaska se koristi u lečenju ili profilaksi patoloških poremećaja izabranih iz grupe koja se sastoji od artritisa, reumatoidnog artritisa, psorijaze, psorijatičnog artritisa, početnog sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa (JIA), sistemskog eritemskog lupusa (SLE), astme, hronične opstruktivne bolesti disajnih puteva, hronične opstruktivne bolesti pluća, atopičnog dermatitisa, skleroderme, sistemske skleroze, fibroze pluća, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, ankilozirajućeg spondilitisa i drugih spondiloartropatija i kancera.

[0119] U jednom izvođenju antitelo predmetnog pronalaska se koristi u lečenju ili profilaksi patoloških poremećaja izabranih iz grupe koja se sastoji od artritisa, reumatoidnog artritisa, psorijaze, psorijatičnog artritisa, sistemskog početka idiopatskog artritisa maloletnika (JIA), sistemskog eritemskog lupusa (SLE), astme, hronične opstruktivne bolesti disajnih puteva, hronične opstruktivne bolesti pluća, atopijskog dermatitisa, skleroderme, sistemske skleroze, fibroze pluća, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, ankilozirajućeg spondilitisa i drugih spondiloartropatija.

[0120] U jednom izvođenju patološki poremećaj je reumatoidni artritis.

[0121] U jednom izvođenju patološki poremećaj je Kronova bolest.

[0122] U jednom izvođenju patološki poremećaj je ulcerozni kolitis.

[0123] U jednom primeru antitelo predmetnog pronalaska se koristi u lečenju inflamatorne ili imunološki povezane bolesti. U jednom primeru inflamatorna ili imunološki povezana bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa, Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa.

[0124] Premetni pronalazak takođe obezbeđuje molekul antitela prema predmetnom pronalasku za upotrebu u lečenju ili profilaksi bola, naročito bola povezanog sa inflamacijom.

[0125] Premetni pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu molekula antitela prema predmetnom pronalasku u proizvodnji leka za lečenje ili profilaksu patološkog poremećaja koji je posredovan putem IL-17A i/ili IL-17F ili je povezan sa povećanjem nivoa IL-17A i/ili IL-17F. Poželjno, patološki poremećaj je jedan od iznad opisanih medicinskih indikacija. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu molekula antitela prema predmetnom pronalasku u proizvodnji leka za lečenje ili profilaksu bola, naročito bola povezanog sa inflamacijom.

[0126] Molekul antitela predmetnog pronalaska može biti iskorišćen u bilo kojoj terapiji gde je poželjno smanjiti efekte IL-17A i/ili IL-17F u humanom ili životinjskom telu. IL-17A i/ili IL-17F mogu cirkulisati u telu ili mogu biti prisutni na neželjenom visokom nivou lokalizovanom na određenom mestu u telu, na primer mestu inflamacije.

[0127] Molekul antitela prema predmetnom pronalasku se poželjno koristi za kontrolu inflamatorne bolesti, autoimune bolesti ili kancera.

[0128] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod lečenja humanih ili životinjskih subjekata koji pate od ili su u opasnosti od poremećaja posredovanih sa IL-17A i/ili IL-17F, metod koji sadrži primenjivanje na subjektu efikasne količine molekula antitela predmetnog pronalaska.

[0129] Molekul antitela prema predmetnom pronalasku može takođe biti upotrebljen u dijagnozi, na primer u dijagnozi in vivo i snimanju bolesnih stanja uključujući IL-17A i/ili IL-17F.

[0130] Predmetni pronalazak je dalje opisan putem ilustracije samo u sledećim primerima, koji se odnose na prateće Slike, u kojima:

Slika 1

a) Laki lanac V regije antitela CA028_0496g3 (SEK ID BR:7)

b) Tešli lanac V regije antitela CA028_0496g3 (SEK ID BR:9)

c) CDRH1 (SEK ID BR:1), CDRH2 (SEK ID BR:2), CDRH3 (SEK ID BR:3), CDRL1 (SEK ID BR:4), CDRL2 (SEK ID BR:5), CDRL3 (SEK ID BR:6) antitela CA028_496g3.

d) Laki lanac antitela CA028_496g3 (SEK ID BR:11).

e) Laki lanac antitela CA028_496g3 uključujući signalnu sekvencu (SEK ID BR:12).

Slika 2

a) Teški lanac antitela CA028_496g3 (SEK ID BR:15).

b) Teški lanac antitela CA028_496g3 uključujući signalnu sekvencu (SEK ID BR:16).

c) DNA kodirajući laki lanac antitela CA028_496g3 (bez signalne sekvence) (SEK ID BR:13).

Slika 3

a) DNK kodirajući laki lanac antitela CA028_496g3 uključujući signalnu sekvencu (SEK ID BR:14)

b) DNK kodirajući varijabilnu regiju lakog lanca antitela CA028_496g3 (SEK ID BR:8)

c) DNK kodirajući varijabilnu regiju teškog lanca antitela CA028_496g3 bez signalne sekvence (SEK ID BR:10) Slika 4: DNK (uključujući eksone) kodirajući teški lanac antitela CA028_496g3 bez signalne sekvence (SEK ID BR:17) Slika 5: DNK (uključujući eksone i signalnu sekvencu) kodirajući teški lanac antitela CA028_496g3 (SEK ID BR:18) Slika 6: c DNK kodirajući teški lanac antitela CA028_496g3 uključujući signalnu sekvencu (SEK ID BR:19).

Slika 7: Efekat antitela CA028_0496 (označen 496g1 u legendi) i CA028_00496.g3 (označen

496.g3 u legendi) na ljudskom IL-17F indukovanu IL-6 produkciju iz Hela ćelija.

Prim er 1: Produkcija poboljšanog neutralizirajućeg antitela koje veže IL-17A i IL-17F

[0131] Izolacija i humanizacija antitela CA028_0496 je prethodno opisana u WO2008/047134. CA028_0496 je humanizirano neutralizirajuće antitelo koje veže i IL-17A i IL-17F i sadrži graftovane varijabilne regije gL7 i gH9, čije sekvence su date u WO2008/047134. Akceptor teškog lanca je humana klicine linije sekvenca VH31-33-07 sa okvirom 4 koji dolazi iz ovog dela humane JH regije klicine linije JH4. Okvir akceptora lakog lanca je humana klicine linije sekvenca VK12-1-(1) L4, sa okvirom 4 koji dolazi iz ovog dela humane JK-regije klicine linije JK1.

[0132] Antitelo CA028_00496 je afinitetno sazrelo da bi se poboljšao afinitet antitela za IL-17F uz zadržavanje afiniteta za IL-17A. Za razliku od antitela CA028_00496, afinitetno sazrelo antitelo, poznato kao CA028_00496.g3, je izraženo kao IgG1 umesto IgG4. Geni su bili modifikovani da generišu afinitetne maturirane verzije putem oligonukleotidne usmerene mutageneze. Afinitetni zreli laki lanac varijabilne regije (gL57) genske sekvence je subkloniran u UCB Celltech humani laki lanac ekspresioni vektor pKH10.1, koji sadrži DNK kodirajući humanu C-Kapa konstantnu regiju (Km3 alotip). Nepromenjena sekvenca varijabilne regije teškog lanca (gH9) je sub-klonirana u UCB Celltech ekspresioni vektor pVhgl FL, koji sadrži DNK kodirajući humani teški lanac gama-1 konstantnih regija. Plazmidi su kotransfektovani u CHO ćelije korišćenjem Lipofectamine™ 2000 procedure prema uputstvima proizvođača (InVitrogen, catalogue No. 11668). Konačna sekvenca afinitetnih zrelih varijabilnih regija antitela CA028_00496.g3 je prikazana na Slikama 1a i 1b. U antitelu CA028_00496.g3 sekvenca varijabilne regije teškog lanca je ista kao ona kod roditeljskog antitela CA028_00496. Nasuprot tome, varijabilna regija lakog lanca se razlikuje sa 5 aminokiselina. Pet ostataka koji se razlikuju između lakog lanca antitela CA028_00496 i antitela CA028_00496.g3 su istaknuti na Slici 1a.

Primer 2: BIACORE

[0133] Kao što je niže opisano, format testa je bio hvatanje antitela CA028_00496.g3 pomoću imobilizovanog anti-humanog IgG Fc- specifičnog antitela, praćeno titracijom humanog IL-17A i humanog IL-17F preko zahvaćene površine.

[0134] Analiza biomolekularne interakcije je izvedena korišćenjem Biacore 3000 (Biacore AB). Testovi su izvedeni na 25°C. Afinipur F(ab')2fragment specifičan za kozji anti-humani IgG Fc (Jackson ImmunoResearch) je imobilisan na CM5 Sensor Chip (Biacore AB) putem hemije spajanja amina do nivoa od približno 6000 jedinica odgovora (RU). HBS-EP pufer (10mM HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Surfaktant P20, Biacore AB) je korišćen kao tekući pufer koji se izvodi sa brzinom protoka od 10 µL/minuti (min). Upotreba 10µL injekcije CA028_00496.g3 pri 0.5µg/mL je korišćena je za hvatanje imobilisaog anti-humanog IgG Fc. Humani IL-17A (generisan u kući sa UCB) je titrirana nad zarobljenim CA028_00496.g3 iz 5nM pri brzini protoka od 30µL/min tokom 3min praćen sa 20min disocijacijom. Humani IL- 17F (R&D sistemi) je titriran preko zarobljenog CA028_00496.g3 iz 10nM pri brzini protoka pri 30µL/min tokom 3min praćen 5min disocijacijom. Površina je regenerisana pri brzini protoka od 10µL/min sa 10µL injekcijom od 40mM HCl praćena 5µL injekcijom od 5mM NaOH.

Tabela 1 Afinitet CA028-.g3 prema humanom IL-17F i IL-17A

[0135] Analizirane su oduzete krive vezivanja sa dvostrukom referentnom pozadinom korišćenjrem softvera BIAevaluation (verzija 4.1) pateći standardne procedure. Kinetički parametri su određeni iz podesnosti algoritma. Podaci su detaljno prikazani u Tabeli 1, prosečne vrednosti su označene sivom bojom.

[0136] Vrednost afiniteta određena za originalno antitelo CA028_0496 vezujući IL-17A bila je 16 pM i 1750 pM za IL-17F. Nasuprot tome, poboljšano antitelo CA028_0496 g3 ima afinitet prema IL-17A od 3-2 pM i za IL-17F od 23 pM. Afinitet antitela CA028_0496 za IL-17F je poboljšan preko 70 puta bez smanjenja afiniteta antitela za IL-17A. U stvari, afinitet za IL-17A je povećan pet puta. Afinitet CA028_0496 g3 je takođe poboljšan za IL-17A/F heterodimer (napravljen kao što je opisano u WO2008/047134) gde je utvrđen afinitet 26pM (podaci nisu prikazani).

Primer 3

[0137] Snaga CA028_00496.g1 (prethodno opisana u WO2008/047134) i CA028_00496.g3 za neutralizaciju humanog IL-17F je određena korišćenjem biološkog ispitivanja HeLa ćelije. Hela ćelije su dobijene iz ćelijske banke na ATCC (ATCC CCL-2). Ćelije su uzgajane u tzv. "Dulbecco" modifikovanom Eagleovom medijumu (DMEM) dopunjenom sa 10% fetalnim goveđim serumom, penicilinom, gentamicinom i glutaminom. Ćelije 1x10<4>su stavljene u 96 jažica tkivne kulture sa ravnim dnom. Ćelije su inkubirane preko noći i isprane jednom u puferu za ispitivanje. HeLa ćelije su stimulisane sa kombinacijom rekombinantnog humanog IL-17F (125ng/ml) i faktora tumorske nekroze alfa (TNF-α) (1 ng/ml) tokom 48 sati u prisustvu različitih koncentracija antitela. U HeLa ćelijskoj liniji, IL-17F sinergiše sa TNF-alfa da indukuje produkciju IL-6 koja može biti kvantifikovana korišćenjem specifičnog seta za testiranje MSD. Dobijena količina izlučenog IL-6 je merena korišćenjem tehnologije ispitivanja Meso Scale Discovery (MSD) i izračunate vrednosti IC50. CA028_00496.g1 i CA028_00496.g3 je pokazala inhibiciju bioaktivnosti IL-17F zavisno od doze, kao što je izmereno u biološkom testu HeLa ćelija (Slika 7). Aktivnost CA028_00496.g1 i CA028_00496.g3 u HeLa testu je izražena kao doza potrebna da inhibiše 50% od aktivnosti IL-17F (IC50). IC50 za CA028_00496.g1 je 92mg/mL i za CA0496.g3 je 4mg/mL.

[0138] Sposobnost CA028_00496.g3 da neutrališe IL-17A, kao što je prethodno opisano za CA028_00496.g1 u WO2008/047134, je potvrđena korišćenjem istog testa u kojem je IL-17F zamenjen sa IL-17A (podaci nisu prikazani).

LISTA SEKVENCI

[0139]

<110> UCB Pharma S.A. Adams, Ralph Baker, Terence Lawson, Alastair <120> Molekuli antitela vezujući IL-17 i IL-17F

<130> G0141

<160> 19

<170> PatentIn verzija 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> CDRH1

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> CDRH2

<400> 2

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> CDRH3

<400> 3

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> CDRL1

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> CDRL2

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> CDRL3

<400> 6

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> Laki lanac varijabilno regiona

<400> 7

<210> 8

<211> 321

<212> DNK

<213> DNK kodirajući laki lanac varijabilnog regiona <220>

<223> CDR

<400> 8

<210> 9

<211> 125

<212> PRT

<213> Veštački

<220>

<223> Teški lanac varijabilnog regiona

<400> 9

<210> 10

<211> 375

<212> DNK

<213> Veštačka

<220>

<223> DNK kodirajući teški lanac varijabilnog regiona <400> 10

<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> Laki lanac antitela CA028_496g3

<400> 11

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> Laki lanac antitela uključujući signalnu sekvencu <400> 12

<212> DNK

<213> Veštačka

<220>

<223> DNK kodirajući laki lanac antitela CA028_496g3

<400> 13

<210> 14

<211> 705

<212> DNK

<213> Veštačka

<220>

<223> DNK kodirajući laki lanac antitela CA028_496g3 uključujući signalnu sekvencu

<210> 15

<211> 455

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> Teški lanac antitela CA028_496g3 <400> 15

<210> 16

<211> 474

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> Teški lanac antitela CA028_496g3 uključujući signalnu sekvencu <400> 16

<210> 17

<211> 1365

<212> DNK

<213> Veštačka

<223> DNK (uključujući ekzone) kodirajući teški lanac antitela CA028_496g3

<400> 17

<210> 18

<211> 1422

<212> DNK

<213> Veštačka

<220>

<223> DNK (uključujući ekzone) kodirajući teški lanac antitela CA028_496g3 sa signalnom sekvenom <400> 18

<210> 19

<211> 1422

<212> DNK

<213> Veštačka

<220>

<223> CDNA kodirajući teški lanac antitela CA028_496g3 uključujući signalnu sekvencu

<400> 19

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Neutralizirajuće antitelo koje veže humani IL-17A i humani IL-17F imajući laki lanac i teški lanac, pri čemu varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvencu datu u SEK ID BR:7 i varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR:9.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje takođe veže IL-17A/IL-17F heterodimer.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu je antitelo celo antitelo ili njegov funkcionalno aktivni fragment.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od Fab, Fab', F(ab')2, scFv i Fv fragmenta.

5. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu je antitelo multi-specifično antitelo.

6. Neutralizirajuće antitelo koje veže humani IL-17A i humani IL-17F prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 3, imajući teški lanac koji obuhvata sekvencu datu u SEK ID BR:15 i laki lanac koji obuhvata sekvencu datu u SEK ID BR:11.

7. Izolovana DNK sekvenca koja kodira teški i laki lanac antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6.

8. Vektor za kloniranje ili ekspresiju koji obuhvata DNK sekvencu prema patentnom zahtevu 7.

9. Vektor prema patentnom zahtevu 8, pri čemu vektor obuhvata sekvence date u SEK ID BR:13 i SEK ID BR:17.

10. Ćelija domaćina za ekspresiju antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, obuhvatajući:

(i) DNK sekvencu koja kodira teški lanac navedenog antitela, i

(ii) DNK sekvencu koja kodira laki lanac navedenog antitela,

pri čemu su DNK sekvence obezbeđene u jednom ili više klonirajućih ili ekspresionih vektora.

11. Ćelija domaćina koja obuhvata jedan ili više klonirajućih ili ekspresionih vektora prema patentnom zahtevu 8 ili patentnom zahtevu 9.

12. Proces za produkciju antitela iz bilo kojeg od patentnih zahteva od 1 do 6, obuhvatajući kultivisanje ćelije domaćina iz patentnog zahteva 10 ili 11 i izolovanje antitela.

13. Farmaceutska kompozicija, koja obuhvata antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa, razblaživača ili nosača.

14. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13, dodatno obuhvatajući druge aktivne sastojke.

15. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 ili 14, za upotrebu u terapiji.

16. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 ili patentnom zahtevu 14, za upotrebu u lečenju ili profilaksi patološkog stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od infekcija (virusne, bakterijske, gljivične i parazitske), endotoksičnog šoka povezanog sa infekcijom, artritisa, reumatoidnog artritisa, psorijatičnog artritisa, početnog sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa (JIA), sistemskog eritemskog lupusa (SLE), astme, hronične opstruktivne bolesti disajnih puteva (COAD), hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), akutne povrede pluća, inflamatorne bolesti karlice, Alchajmerove bolesti, Kronove bolesti, inflamatorne bolesti creva, sindroma iritabilnog creva, ulceroznog kolitisa, Kastlemanove bolesti, ankilozirajućeg spondilitisa i drugih spondiloartropatija, dermatomiozitisa, miokarditisa, uveitisa, egzoftalmusa, autoimunog tiroiditisa, Pejronijeve bolesti, celijačne bolesti, bolesti žučne kese, Pilonidne bolesti, peritonitisa, psorijaze, atopijskog dermatitisa, vaskulitisa, hirurških adhezija, moždanog udara, autoimunog dijabetesa, Dijabetesa tipa I, lajmskog artritisa, meningoencefalitisa, imunološki posredovanih inflamatornih poremećaja centralnog i perifernog nervnog istema kao što je multipla skleroza i Gijen-Bareov sindrom, drugih autoimunih poremećaja, pankreatitisa, traume (hiruške), bolesti grafta protiv domaćina, odbacivanja transplantata, poremećaja fibroze uključujući fibrozu pluća, fibrozu jetre, fibrozu bubrega, skleroderme ili sistemske skleroze, kancera (oba čvrsta tumora kao što su melanomi, hepatoblastomi, sarkomi, karcinomi skvamoznih ćelija, karcinoma tranzicione ćelije, karcinoma jajnika i maligne hematološke bolesti, a naročito akutne mijelogene leukemije, hronične mijelogene leukemije, hronične limfatične leukemije, karcinom želuca i kancera debelog creva), bolesti srca uključujući ishemijske bolesti kao što je infarkt miokarda kao i ateroskleroza, intravaskularne koagulacije, resorpcije kostiju, osteoporoze, periodontitisa i hipohlorhidrije.