RS56357B1 - Vezujući domen bakterijske atp sintaze - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak pruža izolovan mutiran atpE protein i polazi od navedenog mutiranog atpE proteina identifikacijom vezujućeg domena ATPaze. Ovaj pronalazak takođe pruža srodne nukleinske kiseline, vektore, ćelije domaćine, farmaceutske sastave i predmete proizvodnje. Ovaj pronalazak dalje pruža postupke za određivanje da li test jedinjenje interakuje sa atpE proteinom, odnosno sa vezujućim domenom ATPaze prema predmetnom pronalasku, kao i farmaceutski sastavi koje sadrže navedeno test jedinjenje, posebno kao antimikrobni agensi, još određenije kao anti-mikobakterijski agens, još određenije za lečenje tuberkuloze kod pacijenta.

STANJE TEHNIKE

[0002] Nakon AIDS-a, tuberkuloza (TB) je vodeći uzrok smrtnosti odraslih (2-3 miliona smrtnih slučajeva godišnje) u svetu i predstavlja kritičnu prepreku za ublažavanje globalnog siromaštva i patnje (1). Faktori koji doprinose porastu pretnje bolesti uključuju poteškoće u sprovođenju anti-TB programa u mnogim zemljama, dramatično povećanje broja imunosupresovanih pojedinaca - uglavnom zbog HIV infekcija - i kretanje ljudi preko i iz područja u kojima je TB endemska. Epidemije tuberkuloze i HIV-a potpomažu jedna drugu u ko-zaraženim ljudima - trenutno 11 miliona odraslih - povećavajući i morbiditet i mortalitet (2, 3). Pored toga, TB je vodeći uzrok smrti kod osoba s HIV-om (4).

[0003] Iako režimi lekova za prvu liniju anti-TB lekova mogu postići više od 90% stope efikasnosti, njihova složenost može dovesti do lošeg usaglašavanja kada adekvatna medicinska podrška i programi za tretman TB nisu dostupni, i zauzvrat, na pojavu rezistencije (5). Linije TB otporne na više lekova (MDR) značajno komplikuju terapiju (6). The Global Alliance for TB Drug Development su preporučili da bilo koji novi tretman treba da ponudi najmanje jednu od sledećih tri prednosti u odnosu na postojeće terapije: skraćivanje ili pojednostavljivanje efikasnog tretmana TB; povećanje efikasnosti protiv MDR-TB; i poboljšanje lečenja latentnog oblika TB infekcije. Takav novi lek bi u velikoj meri poboljšao usklađenost sa pacijentima, čime bi se smanjili troškovi programa lečenja tuberkuloze, kao što je strategija Direktno posmatranog tretmana kratkog kursa (DOT) od Svetske zdravstvene organizacije (WHO) (7).

[0004] Noviji anti-TB kandidati trenutno u predkliničkio i kliničkom razvoju uglavnom su iz postojećih porodica lekova (kao što je moksifloksacinom) ili su analozi prvoj liniji lekova, kao što mH-98-1-81 (od izoniazida), oksazolidinoni i rifapentin (blizak analog rifampina) (8). Iako ovi novi lekovi mogu biti snažni, analogna jedinjenja pružaju samo privremena rešenja rezistencijai (9), pošto se oslanjaju na isti mehanizam delovanja kao postojeće porodice lekova.

Antibiotici uopšte obično inhibiraju bakterijsku replikaciju inhibiranjem metabolizma bakterija kroz specifičan mehanizam. Na primer, izoniazid ometa enzimsku mašineriju koja sintetiše mikolne kiseline, neophodne komponente ćelijskog zida, dok rifampicin ometa bakterijsku mehanizaciju za transkripciju RNK iz DNK. Shodno tome, u interesu je istražiti nove postupke za identifikaciju anti-TB jedinjenja koja ciljaju različite specifične aspekte rasta i replikacije mikobakterija u odnosu na poznate agense.

SAŽETAK PRONALASKA

[0005] Ovaj pronalazak pruža izolovane mutirane atpE proteine, posebno kodirane aminokiselinskim sekvencama odabranim od (SEQ ID No.1), (SEQ ID No.2), (SEQ ID No.3), (SEQ ID No .4) i (SEQ ID No.5), izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira navedene mutirane atpE proteine, posebno odabrana iz grupe koju čine (SEQ ID No.6), (SEQ ID No.7), (SEQ ID No .8), (SEQ ID No.9) i (SEQ ID No.10) i vektor koji sadrži trenutnu nukleinsku kiselinu. U određenom otelotvorenju mutirani atpE protein je kodiran sa SEQ ID No.2 i izolovana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira navedeni protein sastoji se od SEQ ID No.7.

[0006]Ovaj pronalazak dalje pruža domaćin-vektor sistem koji sadrži ćeliju domaćina koja ima u sebi trenutni vektor eksprimiranja.

Ovaj pronalazak dalje pruža izolovanu ćeliju koja sadrži mutiran atpE protein, pri čemu navedeni protein indukuje anti-mikrobnu otpornost u ćeliji.

[0007] Ovaj pronalazak dalje daje postupak za identifikaciju anti-mikrobnog jedinjenja navedenog postupka koji sadrži korake

(a) dovođenja u dodir ćelije koja eksprimira atpE protein sa test jedinjenjem pod fiziološkim uslovima;

(b) određivanja da li test jedinjenje interakuje sa atpE proteinom.

[0008] Ovaj pronalazak dalje daje postupak za procenu potencijala test jedinjenja za interakciju sa atpE proteinom, gde navedeni postupak obuhvata;

(a) korišćenje tehnike molekularnog modeliranja za generisanje trodimenzionalne strukture atpE proteina;

(b) upotreba računskih sredstava za obavljanje operacije uklapanja između test jedinjenja i trodimenzionalne strukture atpE proteina; i

(c) analiziranje rezultata pomenute operacije uklapanja za kvantifikaciju udruživanja test jedinjenja sa trodimenzionalnom strukturom atpE proteina.

[0009] Takođe je cilj ovog pronalaska da pruži mesto vezivanja F0dela ATPaze koji sadrži barem aminokiseline Ala<24>, Gly<27>, Phe<53>, Val<57>, Gly<58>, Glu<61>, Tyr<64>i Phe<65>jedne C podjedinice; aminokiseline Ser<182>, Leu<183>, Ser<184>, Leu<185>, i Arg<18>jedne A podjedinice i pomenute aminokiseline imaju atomske koordinate bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5.

[0010] U daljem cilju, predmetni pronalazak pruža upotrebu spomenutog vezujućeg domena u postupku za identifikaciju jedinjenja koja su u interakciji sa F0delom ATPaze i njihovog potencijala kao anti-mikrobna jedinjenja, posebno u postupku identifikovanja antimikobakterijskih jedinjenja.

[0011]U skladu s tim, cilj ovog pronalaska je da obezbedi postupak lečenja pacijenta sa mikrobiološkom baziranom infekcijom, koji obuhvata davanje pacijentu jedinjenja koje se meša sa F0 delom ATPaze, posebno sa atpE proteinom na mestima koja omogućavaju rezistenciju ili sa vezujućim mestom prema predmetnom pronalasku. Ovaj pronalazak dalje pruža postupak za lečenje pacijenta pogođenog tuberkulozom, koji obuhvata davanje pacijentu agensa koji interakuje sa atpE proteinom pomoću bilo kog od prethodno pomenutih postupaka skrininga. U postupcima tretmana koji obuhvataju upotrebu jedinjenja koje se meša sa F0delom ATPaze, posebno sa atpE proteinom, jedinjenja koja su prethodno poznata da interakuju sa F0delom ATPaze, a naročito sa atpE proteinom, biće isključena. Posebno je iz bilo kog obelodanjenog postupka tretmana isključena upotreba DARQ J jedinjenja opisana u (11).

[0012] Ovaj pronalazak dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži agens koji interakuje sa atpE proteinom u ćeliji i farmaceutski prihvatljiv nosač. Konačno, ovaj pronalazak pruža predmet proizvodnje koji sadrži ambalažu i farmaceutski agens, gde (a) farmaceutski agens interakuje sa atpE proteinom u ćeliji, i (b) ambalaža sadrži etiketu koja ukazuje na upotrebu agensa za lečenje bakterijske infekcije kod pacijenta. U određenom otelotvorenju predmetni pronalazak pruža upotrebu DARQ J u proizvodnji anti-mikrobnih lekova.

[0013] Ovaj i drugi aspekti ovog pronalaska će biti detaljnije razmotreni u daljem tekstu.

SAŽET OPIS SKICA

[0014]

Tabela. 1 Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) vodećeg DARQ jedinjenja (J), koje inhibiraju 90% rasta različitih mikobakterijskih vrsta. Broj testiranih linija je n=1, ako nije drugačije navedeno.

Tabela. 2 Aminokiseline koje okružuju vezujuće mesto DARQ J jedinjenja.

Tabela. 3 Atomske koordinate za aminokiseline koje okružuju vezujuće mesto DARQ J jedinjenja izvedene i iz divljeg tipa i iz DARQ J mutiranih M. tuberculosis linija.

Tabela 4. Atomske koordinate za vezujuće mesto za DARQ J jedinjenje u divljem tipu M. tuberculosis.

Tabela 5. Atomske koordinate za vezujuće mesto za DARQ J jedinjenje u DARQ J mutiranoj M. tuberculosis liniji.

Tabela 6. Atomske koordinate za mutirani atpE protein (SEQ ID No.2) od M.

tuberculosis.

Tabela 7. Atomske koordinate za divlji tip atpE proteina (SEQ ID No.1) od M.

tuberculosis.

Slika 1 Apsolutna konfiguracija R207910, ovde takođe nazvana kao J ili DARQ J.

Slika 2 Poravnanje sekvenci atpE proteina za M. tuberculosis i M. smegmatis mutante.

Mtb_S: linija osetljiva na lek od M. tuberculosis H37Rv, atpE (1-81).

Pristupni broj: Swiss-Prot Q10598 (SEQ ID No.1). Mtb_R: linija otporna na lek od M. tuberculosis BK12, atpE (1-81) (SEQ ID No.2). Msm_S: linija osetljiva na lek od M. smegmatis, atpE (1-86). Sekvenca dobijena od Institute for Genome Research (SEQ ID No.3). Msm_R09 (SEQ ID No.4) i R10 (SEQ ID No.5): linije otporne na lek od M. smegmatis atpE (1-86). Sekvence dobijene interno. Čovek: Homo sapiens, ATP5G3 (66-142). Pristupni broj: Ensembl ENSP00000284727. Gornja numeracija: M. tuberculosis i M. smegmatis atpE. Donja numeracija: H sapiens ATP5G3 (66-142) Senčenje ukazuje na sličnost aminokiselina koristeći BLOSUM62 matricu (crno = visoko, sivo = srednje). Strelice ukazuju na položaje tačkastih mutacija primećene u otpornim linijama.

Slika 3 Ukupno ćelijsko ATP merenje M. tuberculosis u prisustvu DARQ J, Isoniazid & DCCD. Jedinice relativne luminescencije oksiluciferina izmerene na 526 nm, i u divljem tipu M. tuberculosis i u DARQ J mutantu M. tuberculosis.

Slika 4. Traka predstavlja tri C-podjedinice (A lanac, K lanac and L lanac) i A podjedinicu (M lanac) koji zajednu obrazuju vezujuće mesto za DARQ J jedinjenje.

DETALJAN OPIS

Definicije

[0015]Kad se koristi u ovoj prijavi, osim ako je drugačije nije izričito navedeno, svaki od sledećih izraza ima značenje dato u nastavku.

[0016] „AtpE protein“ označava C-lanac F0 podjedinice ATPaza kompleksa kako je predstavljeno od strane SwissProt unosa Q10598 za M. tuberculosis, ili protein koji ima najmanje 70, 80, 90, 95, 97 ili 99% identičnosti sekvence sa pomenutom sekvencom M.

tuberculosis.

[0017] „F1F0ATPaza“ koja se takođe naziva ATPaza, ATP sintaza ili F0F1ATPaza označava veliki kompleks višestrukih podjedinica koji katalizuje sintezu ili hidrolizu ATP-a. F0F1ATPaze su sastavljene od dva domena: F1 deo, koji je ekstrinzičan u odnosu na membranu i sadrži katalitička mesta i F0deo koji prostire kroz dvosloj i sadrži protonsku poru. Aspekti ATPaza nalazese u plazma membrani bakterija, tilakoidnoj membrani hloroplasta i unutrašnjoj membrani mitohondrija gde koriste energiju protonskog elektrohemijskog gradijenta za pokretanje ATP sinteze.

[0018] „Primena“ podrazumeva isporuku na način koji se izvršava ili obavlja korišćenjem bilo kog od različitih postupaka i sistema isporuke poznatih stručnjacima. Primena se može izvesti, na primer, lokalno, intravenozno, perikardijalno, oralno, putem implantata, transmukosalno, transdermalno, intramuskularno, potkožno, intraperitonealno, intratekalno, intralimetično, intralesivno ili epiduralno. Davanje se takođe može izvesti, na primer, jednom, više puta, i/ili tokom jednog ili više vremenskih perioda.

[0019] „Ćelije domaćini“ uključuju, ali nisu ograničene na, bakterijske ćelije, ćelije kvasca, gljivične ćelije, ćelije insekata i ćelije sisara. Bakterijske ćelije se mogu transfektovati postupcima koji su poznati u struci kao što su precipitacija kalcijum fosfata, elektroporacija i mikroinjektiranje.

[0020] „Izolovan“, u odnosu na atpE protein, označava pripremu fragmenta membrane koji sadrži atpE protein ili druge odgovarajuće pripreme gde atpE zadržava svoju prirodnu funkciju i slobodan je od nekih ili svih drugih proteina u svom prirodnom miljeu.

Podrazumeva se da obuhvata membranske pripreme koje sadrže F0deo F0F1ATPaze, naročito F0deo koji sadrži mutirane atpE proteine iz ovog pronalaska.

[0021]„Bakterijska ćelija“ označava svaku bakterijsku ćeliju. Bakterijske ćelije obuhvataju, bez ograničenja, ćelije koje su normalne, abnormalne i transformisane, i kao na primer su date mikobakterije, posebno Micobacterium tuberculosis i Micobacterium smegmatis, korinbaktarija, nokardija, gram-pozitivne bakterije, kao što su na primer streptokoke, stafilokoke i enterokoke ili gram-negativne bakterije kao što su npr. Escherichia coli, Heamophilus influenzae i Helicobacter pylori.

[0022] Izraz „nukleinska kiselina“ i „polinukleotid“ se ovde koriste međusobno zamenjivo, i svaki se odnosi na polimer deoksiribonukleotida i/ili ribonukleotida. Dezoksiribonukleotidi i ribonukleotidi mogu biti prirodni ili njihovi sintetički analozi.

[0023] Izraz „fiziološki uslovi“ podrazumeva, u odnosu na datu ćeliju, takve uslove, koji bi normalno predstavljali biohemijski milje ćelije. Biohemijski milje ćelije uključuje, bez ograničenja, neke ili sve proteaze kojima je ćelija normalno izložena. Takvi uslovi uključuju, ali nisu ograničeni, na in vivo uslove.

[0024]Izrazi „polipeptid“, „peptid“ i „protein“ se ovde koriste međusobno zamenjivo, i svaki znači polimer aminokiselinskih ostataka. Ostaci aminokiselina mogu biti prirodni ili njihovi hemijski analozi. Polipeptidi, peptidi i proteini takođe mogu uključiti modifikacije kao što su glikozilacija, vezivanje lipida, sulfacija, hidroksilacija i ADP-ribozilacija.

[0025] „Pacijent“ označava svaku životinju, kao što je sisar ili ptica, uključujući, bez ograničenja, kravu, konja, ovcu, svinju, psa, mačku, glodara kao što su miš ili pacov, ćurku, kokošku i primata. U poželjnom otelotvorenju, pacijent je ljudsko biće.

[0026] „Lečenje“ treba da sadrži, bez ograničenja, eliminisanje, promenu kursa, usporavanje progresije, smanjenje simptoma ili na neki drugi način poboljšanje bolesti kod pacijenta.

[0027] „Vektor“ označava bilo koji vektor nukleinske kiseline poznat u struci tehnike. Takvi vektori uključuju, ali se ne ograničavaju na, plazmidne vektore, kosmidne vektore i vektore bakteriofaga.

[0028] Izrazi „supstanca kandidat“ i „test jedinjenje“ se koriste međusobno zamenjivo i odnose se na supstancu za koju se veruje da interakuje sa drugim delom, tj. atpE proteinom, kao modifikatorom biološkog odgovora. Na primer, veruje se da reprezentativna kandidat supstanca stupa u interakciju sa atpE proteinom i veruje se da modifikuje aktivnost ATPaze. Primerne kandidat supstance koje se mogu ispitati primenom postupaka iz ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na peptide, enzime, supstrate enzima, kofaktore, šećere, oligonukleotide, hemijska jedinjenja malih molekule i monoklonska antitela.

[0029] „Modulacija“ označava povećanje, smanjenje ili drugu promenu bilo koje ili svih hemijskih i bioloških aktivnosti ili svojstava proteina divljeg ili mutiranog atpE proteina.

[0030] „Interakcija“ podrazumevaju detektabilne interakcije između molekula, uključujući „vezujuće“ interakcije između molekula. Interakcije mogu, na primer, po svojoj prirodi biti protein-protein ili protein-nukleinska kiselina. Takve interakcije se mogu detektovati pomoću postupaka poznatih u struci, na primer, test kvasca sa dva hibrida, imunoprecipitacija, SPA-test ili analiza filtera vezivanja.

[0031]Kad se ovde koristi, izraz „atomske koordinate“ ili „strukturne koordinate“ odnosi se na matematičke koordinate koje opisuju položaje atoma u formatu Protein Data Bank (PDB), uključujući X, Y, Z i B za svaki atom. Stručnjaci u oblasti shvataju da skup strukturnih koordinata određenih rendgenskom kristalografijom nije bez standardne greške. U svrhu ovog pronalaska, bilo koji skup strukturnih koordinata za ATPsintazu iz bilo kog izvora koji ima srednju kvadratnu devijaciju ne-vodoničnih atoma od manje od 1,5Å kada se nadmaši na položaju ne-vodoničnog atoma odgovarajućih atomskih koordinata Tabela 3, 4, 5, 6 ili 7 se smatra suštinski identičnim ili homolognim. U poželjnijem otelotvorenju, bilo koji skup strukturnih koordinata ATPsintaze iz bilo kog izvora koji ima srednju kvadratnu devijaciju ne-vodoničnih atoma od manje od 0,75Å kada se nadmaši na poziciji ne-vodoničnog atoma odgovarajućih atomskih koordinata Tabela 3, 4,5, 6 ili 7 se smatra suštinski identičnim.

Otelotvorenja pronalaska

Mutirani atpE proteini

[0032]Ovaj pronalazak pruža izolovane mutirane atpE proteine, naročito bakterijske atpE proteine, posebno određene mikobakterijske atpE proteine, još specifičnije M. tuberculosis ili M. smegmatis atpE proteine. Mutacija se bira od mutacija, umetanja ili brisanja jedne tačke. Mutacija se sastoji od najmanje jedne tačke mutacije koja se nalazi u bilo kojoj od aminokiselina od 20 do 40, posebno 30 do 40, poželjno u aminokiselini 34 ili aminokiselinama od 60 do 75, posebno 62 do 73, poželjno u aminokiselini 69 kao što je prikazano u poravnanju sekvence na Slici 2. U jednom aspektu pronalaska izolovani mutirani atpE proteini su definisani u patentnim zahtevima, npr. izabrani od Mtb_R (SEQ ID No.2), Msm_R09 (SEQ ID No.4) i Msm_R10 (SEQ ID No.5) kao što je prikazano na Slici 2 ili sa sekvencom aminokiselina koja ima najmanje 70, 80, 90, 95 , 97 ili 98% identičnosti sekvence sa bilo kojom od prethodno navedenih aminokiselinskih sekvenci.

[0033] Ovaj pronalazak dalje pruža izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira navedene mutirane atpE proteine. U jednom otelotvorenju pomenuta sekvenca nukleinske kiseline sastoji se od svih gena koji kodiraju F0deo, kao što je na primer opisano u J.Biol.Chem, 1994, Vol.269(10),p.7285-7289, gde su navedeni geni transkribovani iz jednog promotera i obuhvataju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mutirani atpE protein iz ovog pronalaska. Nukleinska kiselina može biti DNK ili RNK, i poželjno je DNK i u daljem otelotvorenju se bira iz sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju Mtb_R (SEQ ID No.7) Msm_R09 (SEQ ID No.9), Msm_R10 (SEQ ID No.10) ili sekvence nukleinske kiseline koja ima najmanje 70, 80, 90, 95, 97 ili 98% identičnosti sekvence sa bilo kojom od gore pomenutih sekvenci nukleinskih kiselina.

[0034] Procenat identičnosti nukleinske i polipeptidne sekvence može se izračunati korišćenjem komercijalno dostupnih algoritama koji upoređuju referentnu sekvencu sa sekvencom upita. Sledeći programi (pruženi od strane National Center for Biotechnology Information) mogu se koristiti za određivanje homologije/identičnosti: BLAST, gapped BLAST, BLASTN i PSI-BLAST, koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima.

[0035] Algoritam GAP (Genetics Computer Group, Madison, VI) koristi algoritam Needleman i Wunsch za usklađivanje dve potpune sekvence koje maksimizuju broj poklapanja i minimizuju broj praznina. Uopšteno govoreći, koriste se podrazumevani parametri, sa kaznom za kreiranje praznine = 12 i kaznom proširenja praznina = 4.

[0036]Drugi postupak za određivanje najboljeg ukupnog poklapanja između sekvence nukleinske kiseline ili njenog dela i sekvence upita je korišćenje računarskog programa FASTDB baziranog na algoritmu od Brutlag et al (Comp. App. Biosci., 6; 237-245 (1990)). Program pruža globalno poravnavanje sekvenci. Rezultat navedenog globalnog poravnanja sekvenci je u procentualnoj identičnosti. Odgovarajući parametri koji se koriste u FASTDB pretraživanju DNK sekvence za izračunavanje procenta identičnosti su: Matrix=Unitary, ktuple=4, Mismatch penalty=1, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, i Window Size=500 ili dužina sekvence upita u nukleotidnim bazama, u zavisnosti od toga šta je kraće. Pogodni parametri za izračunavanje procentualne identičnosti i sličnosti poravnanja aminokiselina su:

Matrix=PAM 150, k-tuple=2, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, i Window Size=500 ili dužina sekvence upita u nukleotidnim bazama, u zavisnosti od toga šta je kraće.

[0037] Ovaj pronalazak dalje pruža vektor koji sadrži trenutnu nukleinsku kiselinu. U jednom otelotvorenju vektor je plazmidni vektor.

[0038]Ovaj pronalazak dalje pruža domaćin-vektor sistem koji sadrži ćeliju domaćina koja ima u sebi trenutni plazmidni vektor. Ćelija može biti prokariotska ili eukariotska, u jednom otelotvorenju ćelija domaćina je bakterijska ćelija, posebno ćelija mikobakterije kao što su npr. M. tuberculosis ili M. smegmatis.

[0039] Ovaj pronalazak dalje pruža izolovanu ćeliju koja sadrži mutirani atpE protein, gde protein indukuje anti-mikrobnu rezistenciju u ćeliji. Izolovana ćelija se sastoji od ćelije M. smegmatis transformisane mutantnim mikobakterijskim atpE proteinom, posebno transformisanim mutantnim mikobakterijskim atpE proteina, pri čemu se mutacija sastoji od najmanje jedne tačke mutacije locirane u bilo kojoj od aminokiselina od 20 do 40, posebno 30 do 40, poželjno u aminokiselini 34 ili aminokiselinama od 60 do 75, posebno 62 do 73, poželjno u aminokiselini 69 kao što je prikazano u poravnanju sekvenci na Slici 2.

Postupci skrininga

[0040] Ovaj pronalazak dalje pruža postupak za identifikaciju anti-mikrobnog jedinjenja gde navedeni postupak sadrži korake

(a) dovođenja u dodir ćelije koja eksprimira atpE protein sa test jedinjenjem u fiziološkim uslovima;

(b) određivanje da li test jedinjenje interakuje sa atpE proteinom.

[0041]U jednom otelotvorenju atpE protein koji se koristi u prethodno pomenutom postupku, sastoji se od bakterijskog atpE proteina, naročito mikobakterijskog proteina i podrazumeva se da obuhvata i divlji tip atpE proteina kao i mutirane atpE proteine kao što je prethodno opisano. U daljem otelotvorenju ovog pronalaska, mikobakterijski atpE protein koji se koristi u prethodno navedenom postupku sastoji se od mutiranog mikobakterijskog atpE proteina prema pronalasku. U konkretnom otelotvorenju prethodno pomenutog testa korišćena je ćelija domaćin transformisana mutiranim atpE proteinom pronalaska i interakcija test jedinjenja sa navedenim atpE proteinom se procenjuje određivanjem moguće inhibicije enzimske aktivnosti F1F0-ATPaze koja obuhvata navedeni mutiran atpE protein. Inhibicija aktivnosti F1F0-ATPaze se određuje korišćenjem poznatih postupaka, kao što je npr. dodavanje supstance sistemu koji sadrži F1F0-ATPazu i ATP kao supstrat, uz detekciju enzimske aktivnosti spajanjem proizvodnje ADP sa oksidacijom NADH preko piruvat kinaze i reakcije laktatne hidrogenaze.

[0042]U jednom otelotvorenju testa, atpE protein se može koristiti u testu vezivanja. Testovi vezivanja mogu biti konkurentni ili nekonkurentni. Takav test može da odgovori brzom skriningu velikog broja jedinjenja da bi se utvrdilo koja jedinjenja, ako ih ima, mogu da se vezuju za polipeptide.

U okviru ovog konteksta, predmetni pronalazak pruža postupak za utvrđivanje da li se test jedinjenje vezuje za izolovani atpE protein iz ovog pronalaska, i da li je stoga potencijalno anti-mikrobno jedinjenje, gde navedeni postupak sadrži:

a) dovođenje u dodir ćelija koje eksprimiraju atpE protein, pri čemu takve ćelije normalno ne eksprimiraju navedeni atpE protein, sa test jedinjenjem u prisustvu i odsustvu jedinjenja za koje se zna da vezuje atpE protein,

b) odrediti vezivanja test jedinjenja na atpE protein koristeći jedinjenje za koje se zna da se vezuje za atpE protein kao referencu.

[0043]Vezivanje test jedinjenja ili jedinjenja za koje se zna da se vezuje za atpE protein, u daljem tekstu takođe nazvano referentno jedinjenje, procenjuje se korišćenjem poznatih tehnika za proučavanje interakcija proteinskih liganda. Na primer, takvo vezivanje se može meriti upotrebom označene supstance ili referentnog jedinjenja. Test jedinjenje ili referentno jedinjenje, posebno jedinjenje J (Slika 1) može se označiti na bilo koji pogodan način poznat u struci, npr. radioaktivno, fluorescentno ili enzimski. U konkretnom otelotvorenju pomenutog postupka, za jedinjenje za koje se zna da se vezuje za atpE protein, takođe poznato kao referentno jedinjenje, se detektabilno obeležava, i navedeno obeležje se koristi za određivanje vezivanja test jedinjenja na atpE protein. Navedeno referentno jedinjenje se obeležava korišćenjem radioobeležja, fluorescentnih obeležja ili enzimskih obeležja, najpoželjnije radioobeležja.

[0044] U alternativnom otelotvorenju ovog pronalaska pomenuti testovi vezivanja se izvode na ćelijskom sastavu, tj. ćelijskom ekstraktu, ćelijskoj fragmentu ili organskim ćelijama koje sadrže atpE protein kao što je prethodno definisano. Konkretnije, gore pomenuti testovi vezivanja se izvode na ćelijskom sastavu, tj. membranskom preparatu koji sadrži atpE protein kao što je prethodno definisano, pri čemu se navedeni ćelijski sastav, tj. membranski preparat dobija iz ćelije M. smegmatis transformisane sa mutiranim mikobakterijskim atpE proteinom, posebno transformisane sa mutiranim mikobakterijskim atpE proteinom gde se mutacija sastoji od najmanje jedne tačke mutacije locirane u bilo kojoj od aminokiselina od 20 do 40, posebno od 30 do 40, poželjno u aminokiselini 34 ili aminokiselina od 60 do 75, posebno 62 do 73, poželjno u aminokiselini 69 kao što je prikazano u poravnanju sekvenci na Slici 2. Navedene regije su definisane u zahtevima.

[0045]U jednom otelotvorenju testovi vezivanja se izvode primenom membranskih priprema. Ove membranski pripreme se mogu koristiti u konvencionalnim analizama vezivanja filtera (npr. pomoću Brandel opreme za testiranje filtera) ili u testovima vezivanja visokog protoka Scintillation Proximity tipa (SPA i Cytostar-T tehnologija brzih ploča;

Amersham Pharmacia Biotech) za otkrivanje vezivanja radio-obeleženih AtpE liganda (uključujući<3>H označene DARQ) i pomeranje takvih radio-obeležja od strane konkurenata za vezujuće mesto. Radioaktivnost se može meriti pomoću Packard Topcount, ili sličnih instrumenata, sposobnih za brzo merenje od formata 96-, 384-, 1536- mikrotitarski komorica SPA/Cytostar-T tehnologija je posebno odgovarajuća za skrinig visokog protoka zato je ova tehnologija pogodna za upotrebu za skrining jedinjenja koja mogu zameniti standardne ligande.

[0046] Drugi pristup za proučavanje vezivanja liganda sa atpE proteinom u okruženju približnom prirodnoj situaciji koristi površinski plazmonski rezonantni efekat koji koristi Biacore instrument (Biacore). atpE protein u membranskim preparatima ili celim ćelijama može biti vezan za biosenzorski čip Biacore i vezivanje liganda ispitanih u prisustvu i odsustvu jedinjenja za identifikaciju konkurenata na mestu vezivanja.

Molekularno modeliranje

[0047] Ovaj pronalazak dalje daje postupak za procenu potencijala test jedinjenja za interakciju sa atpE proteinom, gde navedeni postupak obuhvata;

(a) korišćenje tehnike molekularnog modeliranja za generisanje trodimenzionalne strukture atpE proteina;

(b) upotrebu računskih sredstava za obavljanje operacije uklapanja između test jedinjenja i trodimenzionalne strukture atpE proteina; i

(c) analiziranje rezultata pomenute operacije uklapanja za kvantifikaciju udruživanja test jedinjenja sa trodimenzionalnom strukturom atpE proteina.

[0048] Tehnike molekularnog modeliranja su poznate u struci, uključujući i hardver i softver koji su pogodni za stvaranje i korišćenje modela receptora i enzimskih konformacija.

Brojni računarski programi su dostupni i pogodni za procese računarskog modeliranja, izgradnje modela i računsko identifikovanje, izbor i procenu potencijalnih atpE interakcija u postupcima koji su ovde opisani. Ovo uključuje, na primer, GRID (dostupan od Oxford University, UK), MCSS (dostupan od Accelrys, Inc., San Diego, CA), AUTODOCK (dostupan od Oxford Molecular Group), FLEX X (dostupan od Tripos, St. Louis. MO), DOCK (dostupan od University of California, San Francisco, CA), CAVEAT (dostupan od University of California, Berkeley), HOOK (dostupan od Accelrys, Inc., San Diego, CA) i sisteme za 3D baze podataka kao što su MACCS-3D (dostupan od MDL Information Systems, San Leandro, CA), UNITY (dostupan od Tripos, St. Louis.MO) i CATALYST (dostupan od Accelrys, Inc., San Diego, CA). Potencijalne kandidat supstance mogu takođe biti računsko dizajnirane „de novo“ koristeći softverske pakete kao što su LUDI (dostupan od Biosym Technologies, San Diego, CA), LEGEND (dostupan od Accelrys, Inc, San Diego, CA) i LEAPFROG (dostupan od Tripos, St. Louis.MO). Energija deformacije jedinjenja i elektrostatička odbojnost mogu se analizirati pomoću programa kao što su GAUSSIAN 92, AMBER, QUANTA/CHARMM i INSIGHT II/DISCOVER. Ove računarske procene i tehnike modeliranja mogu se izvoditi na bilo kom odgovarajućem hardveru, uključujući na primer, radne stanice dostupne od Silicon Graphics, Sun Microsistems i drugih. Ove tehnike modeliranja, postupci, hardver i softverski paketi su reprezentativni i nisu namijenjeni da budu sveobuhvatna lista. Druge tehnike za modeliranje poznate u ovoj oblasti mogu se koristiti u skladu s ovim pronalaskom. Pogledati, na primer, N.C. Cohen, Molecular Modeling in Drug Design, Academic Press (1996).

[0049] U jednom otelotvorenju ovog pronalaska, trodimenzionalna struktura atpE proteina generiše se korišćenjem atomskih koordinata Ile28, Glu61 i Ile63 E. coli (Protein Database 1Q01) /- koren srednje srednje kvadratne devijacije kičme atoma navedenih aminokiselina od ne više od 10Å, poželjno ne više od 5Å.

[0050] Kao što je navedeno u primerima u nastavku, cilj ovog pronalaska je da obezbedi trodimenzionalnu strukturu atpE proteina. Tabele 6 i 7 pružaju atomske koordinate za mutirani i divlji tip atpE proteina sa SEQ ID No.2 i SEQ ID No.1. Prema tome, u jednom otelotvorenju trodimenzionalna struktura atpE proteina generiše se korišćenjem atomskih koordinata Tabela 6 ili 7. U konkretnom otelotvorenju trodimenzionalna struktura atpE proteina generiše se pomoću atomskih koordinata Tabele 7. DARQ J jedinjenje inhibira interakciju Arg<186>od A podjedinice sa Glu<61>od C podjedinice u svojem deprotonovanom obliku. Shodno tome, cilj ovog pronalaska je da obezbedi upotrebu atomskih koordinata Tabela 6 ili 7 u postupku za procenu potencijala test jedinjenja za interakciju sa atpE proteinom.

Mesto vezivanja

[0051] U još jednom otelotvorenju ovaj pronalazak pruža karakterizaciju mesta vezivanja u F0delu ATPaze. Za ovo mesto vezivanja, identifikovano kao sposobno da veže DARQ J jedinjenje, je otkriveno da se poklapa sa regijama identifikovanim u ovom tekstu, kao mesta mutacije koja omogućavaju rezistenciju u atpE proteinima M.tuberculosis i M. smegmatis (17). Prema tome, predmetni pronalazak pruža mesto vezivanja u F0delu ATPaze koje se karakteriše time što obuhvata mesta mutacije koja omogućavaju rezistenciju atpE proteina. Mesta mutacije koja omogućavaju rezistenciju se koriste ovde kako su definisana u patentnim zahtevima.

[0052]U daljem otelotvorenju mesto vezivanja sadrži barem aminokiseline Ala<24>, Gly<27>, Phe<53>, Val<57>, Gly<58>, Glu<61>, Tyr<64>i Phe<6>jedne C podjedinice i aminokiseline Ser<182>, Leu<183>, Leu<185>, i Arg<186>jedne A podjedinice (ima za A podjedinicu, kodove Ser 206 - Leu 207 - Leu 209 i Arg 210 u Tabelama 3, 4 i 5), gde pomenute aminokiseline imaju atomske koordinate bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5 ili homologne strukturne koordinate koje sadrže koren srednjeg kvadratnog odstupanja ne-vodoničnih atoma od manje od oko 1,5Å, poželjno ne više od 0,75Å, kada se nadmaši na položaju ne-vodoničnog atoma odgovarajućih atomskih koordinata Tabela 3, 4 ili 5. U posebnom otelotvorenju, vezujuće mesto sadrži aminokiseline Ala<21>, Gly<25>prve C podjedinice; aminokiseline Ala<24>, Gly<27>, Phe<53>, Phe<54>, Val<57>, Gly<58>, Glu<61>, Tyr<64>, Phe<65>druge C podjedinice; aminokiseline Met<17>, Gly<19>, Gly<20>, Ala<21>, Ile<22>, Gly<23>, Ala<24>, Gly<25>, Ile<26>, Gly<27>, Asp<28>, Gly<29>, Ala<31>, Phe<53>, Thr<56>, Val<57>, Gly<58>, Leu<59>, Val<60>, Glu<61>, Ala<62>, Ala<63>/Pro<63>, Tyr<64>, Phe<65>treće C podjedinice i aminokiseline Leu<183>, Leu<185>i Arg<186>A podjedinice; gde pomenute aminokiseline imaju atomske koordinate bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5 ili homologne strukturne koordinate koje sadrže koren srednjeg kvadratnog odstupanja ne-vodoničnih atoma od manje od oko 1,5Å, poželjno ne više od 0,75Å, kada se nadmaši na položaju ne-vodoničnog atoma odgovarajućih atomskih koordinata Tabela 3, 4 ili 5. U još određenijem otelotvorenju mesto vezivanja sastoji se od aminokiselina Ala<21>, Gly<25>prve C podjedinice; aminokiselina Ala<24>, Gly<27>, Phe<53>, Phe<54>, Val<57>, Gly<58>, Glu<61>, Tyr<64>, Phe<6>druge C podjedinice; aminokiselina Met<17>, Gly<19>, Gly<20>, Ala<21>, Ile<22>, Gly<23>, Ala<24>, Gly<25>, Ile<26>, Gly<27>, Asp<28>, Gly<29>, Ala<31>, Phe<53>, Thr<56>, Val<57>, Gly<58>, Leu<59>, Val<60>, Glu<61>, Ala<62>, Ala<63>/Pro<63>, Tyr<64>, Phe<65>treće C podjedinice i aminokiselina Leu<183>, Leu<185>i Arg<186>A podjedinice; gde pomenute aminokiseline imaju atomske koordinate bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5. U najodređenijem otelotvorenju mesto vezivanja sastoji se od aminokiselina Ala<21>, Gly<25>prve C podjedinice; aminokiselina Ala<24>, Gly<27>, Phe<53>, Phe<54>, Val<57>, Gly<58>, Glu<61>, Tyr<64>, Phe<65>druge C podjedinice; aminokiselina Met<17>, Gly<19>, Gly<20>, Ala<21>, Ile<22>, Gly<23>, Ala<24>, Gly<25>, Ile<26>, Gl<y27>, Asp<28>, Gly<29>, Ala<31>, Phe<53>, Thr<56>, Val<57>, Gly<58>, Leu<59>, Val<60>, Glu<61>, Ala<62>, Ala<63>/Pro<63>, Tyr<64>, Phe<65>treće C podjedinice i aminokiselina Leu<183>, Leu<185>i Arg<186>A podjedinice; gde pomenute aminokiseline imaju atomske koordinate Tabele 3.

[0053] Shodno tome, predmet ovog pronalaska je procena potencijala test jedinjenja za interakciju sa atpE proteinom pomoću atomskih koordinata kao što je gore opisano, u računarskim programima za skrining. U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža postupak za procenu potencijala test jedinjenja za interakciju sa atpE proteinom, pri čemu navedeni postupak sadrži: - tehnike molekularnog modeliranja za stvaranje trodimenzionalne strukture mesta vezivanja F0dela ATPaze; - upotrebljavajući računska sredstva za obavljanje uklapanja između test jedinjenja i trodimenzionalne strukture vezujućeg mesta; i - analizu rezultata pomenute operacije uklapanja kako bi se kvantitativno odredilo vezivanje test jedinjenja sa trodimenzionalnom strukturom za vezivanje. U jednom daljem otelotvorenju ovog pronalaska, trodimenzionalna struktura vezivanja je generisana korišćenjem atomskih koordinata Tabela 3, 4 ili 5 ili homolognih strukturnih koordinata koje sadrže koren srednjeg kvadratnog odstupanja ne-vodoničnih atoma od manje od oko 1,5Å, poželjno ne više od 0,75Å, kada se nadmaši na položaju ne-vodoničnog atoma odgovarajućih atomskih koordinata Tabela 3, 4 ili 5. U specifičnom otelotvorenju trodimenzionalna struktura se generiše korišćenjem atomskih koordinata aminokiselina Ala<21>, Gly<25>lanca A iz bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5; aminokiselina Ala<24>, Gly<27>, Phe<53>, Phe<54>, Val<57>, Gly<58>, Glu<61>, Tyr<64>, Phe<65>iz K lanca bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5; aminokiselina Met<17>, Gly<19>Gly<20>, Ala<21>, Ile<22>, Gly<23>, Ala<24>, Gly<25>, Ile<26>, Gly<27>, Asp<28>, Gly<29>, Ala<31>, Phe<53>, Thr<56>, Val<57>, Gly<58>, Leu<59>, Val<60>, Glu<61>, Ala<62>, Ala<63>/pro<63>, Tyr<64>, Phe<65>L lanca bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5; i aminokiselina Ser<206>, Leu<207>, Leu<207>, i Arg<210>M lanca bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5.

[0054] U ovom skriningu, kvalitet uklapanja takvih jedinjenja na mesto vezivanja može se proceniti bilo komplementarnosti oblika, ili procenjenog energijom interakcije (Meng, E.C. et al., J. Coma.Chem 13:505-524 (1992)).

Korišćenje mesta vezivanja

[0055]Dizajn jedinjenja koja se vezuju za, promovišu ili inhibiraju funkcionalnu aktivnost atpE prema ovom pronalasku obično podrazumeva razmatranje dva faktora. Prvo, jedinjenje mora biti sposobno za fizičko i strukturno povezivanje sa atpE. Ne-kovalentne molekulske interakcije značajne u povezivanju atpE sa jedinjenjem, uključuju vezivanje vodonika, van der Vals i hidrofobne interakcije. Drugo, jedinjenje mora biti u stanju da preuzme konformaciju koja mu omogućava povezivanje sa atpE. Iako određeni delovi jedinjenja ne mogu direktno da učestvuju u povezivanju sa atpE, ti delovi mogu uticati na ukupnu konformaciju molekula. To, pak, može imati značajan uticaj na afinitet vezivanja, terapeutsku efikasnost, kvalitet i potencijal osobina leka. Takvi konformacioni zahtevi uključuju ukupnu trodimenzionalnu strukturu i orijentaciju hemijskog entiteta ili jedinjenja u odnosu na sve ili deo aktivnog mesta ili druge regije atpE ili razmaka između funkcionalnih grupa jedinjenja koje sadrži nekoliko hemijskih entiteta koji direktno interakuju sa atpE.

[0056]Potencijalni, predviđeni, inhibitorni agonist, antagonist ili vezujući efekat liganda ili nekog drugog jedinjenja na atpE mogu se analizirati pre njegove stvarnog sinteze i testiranja korišćenjem tehnika računarskog modeliranja. Ako teorijska struktura datog jedinjenja ukazuje na nedovoljnu interakciju i povezanost između njega i atpE, može se izbjeći sinteza i testiranje jedinjenja. Međutim, ukoliko računarsko modeliranje ukazuje na snažnu interakciju, molekul se onda može sintetizovati i testirati na sposobnost interakcije sa atpE. Na taj način se može izbeći sinteza neoperativnih jedinjenja. U nekim slučajevima, neaktivna jedinjenja se sintetizuju prema predviđanjima na modeliranju, i zatim se testiraju da bi se razvio SAR (odnos strukture i aktivnosti) za jedinjenja koja interakuju sa određenom regijom atpE.

Stručnjak u oblasti može da koristi jedan od nekoliko postupaka za prikazivanje fragmenata hemikalija, jedinjenja ili agensa za njihovu sposobnost da se udruže sa atpE, a naročito sa pojedinačnim vezivnim džepovima ili aktivnim mestima atpE. Ovaj proces može započeti vizuelnim pregledom, na primer, aktivnog mesta na ekranu računara zasnovanom na atomskim koordinatama atpE ili atpE kompleksiranog sa ligandom. Izabrani hemijski entiteti, jedinjenja ili agensi mogu potom biti pozicionirani u različitim orijentacijama, ili povezani unutar pojedinačnog veznog džepa atpE. Prijanjanje se može postići korišćenjem softvera kao što su Quanta i Sybyl, praćeno minimizacijom energije i molekularnom dinamikom sa standardnim silama polja molekularne mehanike, kao što su CHARMM i AMBER.

[0057] Specijalizovani računarski programi mogu takođe da pomognu u procesu selekcije hemijskih entiteta. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na: GRID (Goodford, P. J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules," J. Med. Chem. 28:849-857 (1985), dostupan od Oxford University, Oxford, UK); MCSS (Miranker, A. i M. Karplus, "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method." Proteins: Structure, Function and Genetics 11: 29-34 (1991), dostupan od Molecular Simulations, Burlington, Mass.); AUTODOCK (Goodsell, D. S. i A. J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing" Proteins: Structure. Function, and Genetics 8:195-202 (1990), dostupan od Scripps Research Institute, La Jolla, Calif.); i DOCK (Kuntz, I. D. et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions," J.-Mol. Biol.161:269-288 (1982), dostupan od University of California, San Francisco, Calif.).

[0058] Korišćenje softvera kao što je GRID, programa koji određuje moguće lokacije interakcije između sondi sa različitim karakteristikama funkcionalne grupe i makromolekularne površine, koristi se za analiziranje površinskih lokacija za određivanje struktura sličnih inhibirajućih proteina ili jedinjenja. GRID kalkulacije, sa odgovarajućim inhibirajućim grupama na molekulima (npr. protonisanim primarnim aminima) kao sondama, koriste se za identifikaciju potencijalnih bitnih tačaka oko dostupnih položaja na odgovarajućim nivoima konture energije. Program DOCK se može koristiti za analiziranje aktivne lokacije ili lokacije za vezivanje liganda i predložiti ligande sa komplementarnim steričkim svojstvima.

[0059] Kada se odaberu odgovarajuća hemijska jedinjenja, entiteti ili agensi, oni se mogu sastaviti u jedinstveni ligand ili jedinjenje ili inhibitor ili aktivator. Sklop može nastaviti vizuelnim pregledom odnosa fragmenata jednih sa drugima na trodimenzionalnoj slici. Ovo može biti praćeno manuelnim modeliranjem pomoću softvera kao što su Quanta ili Sybyl.

[0060] Korisni programi koji pomažu u povezivanju pojedinačnih hemijskih jedinjenja, jedinjenja ili agensa uključuju, ali nisu ograničeni na: CAVEAT (Bartlett, P. A. et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules." In Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp.82-196 (1989)); sisteme 3D baza podataka kao što je MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, Calif. and Martin, Y.C., "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem.35: 2145-2154 (1992); i HOOK (dostupan od Molecular Simulations, Burlington, Mass.).

Dostupno je nekoliko metodologija za pretraživanje trodimenzionalnih baza podataka za ispitivanje hipoteza farmakofora i odabranih jedinjenja za skrining. Ovo uključuje program CAVEAT (Bacon et al., J. Mol. Biol.225:849-858 (1992)). Na primer, CAVEAT koristi baze podataka cikličnih jedinjenja koja mogu delovati kao „odstojnici“ za povezivanje bilo kog hemijskog fragmenta koji su već pozicionirani na aktivnoj lokaciji. Ovo omogućava stručnjaku da brzo generiše stotine mogućih načina povezivanja već poznatih fragmenata za koje se zna ili sumnja da su neophodni za čvrsto vezivanje.

Umesto da se izgradi inhibitorni aktivator, agonist ili antagonist atpE koristeći korak po korak postupak jednog po jednog hemijskog jedinjenja koji je opisan gore, takva jedinjenja mogu biti dizajnirana kao celina ili „de novo“ pomoću praznog aktivnog mesta ili opciono uključujući i deo ili delove poznatih molekula. Ovi postupci uključuju: LUDI (Bohm, H.-J., "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. ComR. Aid. Molec. Design, 6, pp.61-78 (1992), dostupan od Biosym Technologies, San Diego, Calif.); LEGEND (Nishibata, Y. and A. Itai, Tetrahedron 47:8985 (1991), dostupan od Molecular Simulations, Burlington, Mass.); i LeapFrog (dostupan od Tripos Associates, St. Louis, Mo.).

Na primer, program LUDI može da odredi spisak lokacija interakcije u koje treba postaviti i vezivanje vodonika i hidrofobne fragmente. LUDI zatim koristi biblioteku veznika da poveže do četiri različita mesta interakcije u fragmente. Zatim se koriste manje „premošćujuće“ grupe kao što su --CH2- i --COO-- za povezivanje ovih fragmenata. Na primer, za enzim DHFR, plasmani ključnih funkcionalnih grupa u poznatom inhibitoru metotreksata reprodukovane su uz pomoću LUDI. Pogledati takođe Rotstein and Murcko, J. Med. Chem.

36: 1700-1710 (1992).

[0061]Ostale molekularne tehnike modeliranja takođe mogu biti korišćene u skladu sa ovim pronalaskom. Pogledati npr. Cohen, N. C. et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry, J. Med. Chem.33:883-894 (1990). Pogledati takođe`, Navia, M. A.

i M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design," Current Opinions in Structural Biology, 2, pp.202-210 (1992).

[0062] Jednom kada je jedinjenje dizajnirano ili odabrano gore navedenim metodama, afinitet sa kojim se to jedinjenje može vezati ili povezati sa atpE može se testirati i optimizovati pomoću računske procene i/ili testiranjem biološke aktivnosti nakon sintetizacije jedinjenja. Inhibitori ili jedinjenja mogu da komuniciraju sa atpE u više od jedne konformacije koja je slična u ukupnoj energiji vezivanja. U tim slučajevima, energija deformacije vezivanja se uzima kao razlika između energije slobodnog jedinjenja i prosečne energije konformacija posmatranih kada se jedinjenje vezuje za atpE.

[0063] Jedinjenje dizajnirano ili izabrano za vezivanje ili povezivanje sa atpE može biti dodatno računski optimizovano tako da u svom vezanom stanju poželjno nema repulzivne elektrostatičke interakcije sa atpE. Takve nekomplementarne (npr., elektrostatičke) interakcije uključuju repulzivne nalon-napon, dipol-dipol i napon-dipol interakcije.

Konkretno, zbir svih elektrostatičkih interakcija između inhibitora i atpE kada je inhibitor vezan, poželjno daje neutralan ili povoljan doprinos entalpiji vezivanja. Slaba vezujuća jedinjenja takođe će biti dizajnirana ovim postupcima kako bi se odredila SAR. Pogledati, na primer, U. S. Appl. Nos. 60/275,629; 60/331,235; 60/379,617; i, 10/097,249.

[0064] Specifični kompjuterski softver je na raspolaganju za procenu energije deformacije jedinjenja i elektrostatičke interakcije. Primeri programa dizajnirani za takvu upotrebu uključuju: Gaussian 92, revision C (M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa., COPYRGT 1992); AMBER, version 4.0 (P. A. Kollman, University of California at San Francisco, COPYRGT 1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass. COPYRGT 1994); i Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif.

COPYRGT 1994). Ostali hardverski sistemi i softverski paketi biće poznati stručnjacima.

[0065] Jednom kada je jedinjenje koje se povezuje sa atpE optimalno izabrano ili dizajnirano, kako je gore opisano, tada mogu biti napravljene supstitucije u nekim od njegovih atoma ili bočnih grupa kako bi se poboljšala ili modifikovala svojstva vezivanja. Generalno, početne zamene su konzervativne, tj. grupa zamene će imati približno istu veličinu, oblik, hidrofobnost i napon kao izvorna grupa. Treba, naravno, shvatiti da se mogu izbeći komponente poznate u struci da bi se izmijenile konformacije. Takva supstituisana hemijska jedinjenja se zatim mogu analizirati za efikasnost uklapanja u atpE istim kompjuterskim postupcima koji su detaljno opisane gore.

[0066] Ovaj pronalazak dalje pruža sisteme, posebno računarske sisteme koji sadrže koordinate sekvence i/ili strukture opisane ovde. Takvi sistemi su dizajnirani da izvrše strukturno određivanje i racionalni dizajn lekova za atpE ili za vezujuće mesto u F0 delu ATPaze. Sistemi zasnovani na kompjuteru odnose se na hardverska sredstva, softverska sredstva i sredstva za čuvanje podataka korišćenih za analizu sekvence i/ili strukturnih koordinata ovog pronalaska u bilo kom od kompjuterskih postupaka koji su detaljno opisane iznad. Minimalno hardversko sredstvo računarskog sistema prema predmetnom pronalasku obuhvata centralnu procesorsku jedinicu (CPU), sredstva za unos, izlazna sredstva i sredstva za čuvanje podataka. Kvalifikovana osoba može lako razumeti koji od trenutno dostupnih računarskih sistema su pogodni za upotrebu u ovom pronalasku.

[0067] Shodno tome, predmet ovog pronalaska je da obezbedi kompjuterski čitljiv medijum za čuvanje podataka koji sadrži strukturne koordinate opisane ovde. Kad se ovde koristi, „računarski medijum za čuvanje podataka“ se odnosi na bilo koji medijum koji se može čitati ili pristupiti direktno putem računara. Takvi mediji uključuju, ali se ne ograničavaju na: magnetske medije za skladištenje, kao što su diskete, hard diskovi i magnetska traku; optički mediji za skladištenje kao što su optički diskovi ili CD-ROM; električni mediji za skladištenje kao što su RAM i ROM; i hibridi ovih kategorija kao što su magnetski/optički mediji za skladištenje.

Postupci tretmana

[0068] Kao što je već pomenuto ovde, takođe je predmet ovog pronalaska da pruži upotrebu jedinjenja koja su identifikovana korišćenjem bilo kog od prethodno pomenutih postupaka skrininga u postupku lečenja pacijenta sa mikrobiološki-zasnovanom infekcijom. Generalno, bakterijski patogeni mogu biti klasifikovani kao gram-pozitivni ili gram-negativni patogeni. Za anti-mikrobna jedinjenja sa aktivnošću protiv gram-pozitivnih i gram-negativnih patogena se generalno smatra da imaju širok spektar aktivnosti. Jedinjenja iz ovog pronalaska se smatraju aktivna protiv gram-pozitivnih i/ili gram-negativnih bakterijskih patogena.

Konkretno, ova jedinjenja su aktivna protiv najmanje jedne gram-pozitivne bakterije, poželjno protiv nekoliko gram-pozitivnih bakterija, poželjnije protiv jedne ili više grampozitivne bakterije i/ili jedne ili više gram-negativne bakterije.

[0069] Primeri gram-pozitivnih i gram-negativnih aerobnih i anaerobnih bakterija, uključuju stafilokoke, na primer S. aureus; enterokoke, na primer E. faecalis; streptokoke, na primer S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogens; bakcile, na primer Bacillus subtilis; listerike, na primer Listeria monocytogenes; heamofile, na primer H. influenza; moraksele, na primer M. catarrhalis; pseudomone, na primer Pseudomonas aeruginosa; i ešerihije, na primer E. coli. Gram-pozitivni patogeni, na primer stafilokoke, enterokoke i streptokoke su posebno važni zbog razvoja otpornih sojeva koji se teško tretiraju i teško ih je eliminisati, na primer, jednom nakon što je uspostavljeno bolničko okruženje. Primeri takvih sojeva su meticilin rezistentni Staphilococcus aureus (MRSA), meticilin rezistentni koagulaza negativne stafilokoke (MRCNS), penicilin rezistentan Streptococcus pneumoniae i višestruko rezistentni Enterococcus faecium.

[0070] Jedinjenja iz ovog pronalaska takođe pokazuju aktivnost protiv rezistentnih bakterijskih sojeva.

[0071]Jedinjenja iz ovog pronalaska posebno su aktivna protiv onih bakterija kod kojih vitalnost zavisi od pravilnog funkcionisanja F1F0ATP sintaze. Bez vezivanja za bilo koju teoriju, zna se da dejstvo ovih jedinjenja leži u inhibiciji F1F0ATP sintaze, naročito inhibiciji F0kompleksa F1F0ATP sintaze, određenije inhibiciji transfera protona iz Arg186 od A podjedinice do Glu61 od C podjedinice F0kompleksa F1F0ATP sintaze, što dovodi do ubijanja bakterija smanjenjem nivoa ćelijskih ATP nivoa bakterija. Jedinjenja identifikovana upotrebom bilo kog od pomenutih postupaka skrininga su posebno aktivna protiv grampozitivnih bakterija, posebno mikobakterija, a većina naročito protiv infekcija izazvanih od strane M. africanum, M. avium, M. bovis, M. bovis-BCG, M. chelonae, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. microti, M. scrofulaceum, M. paratuberculosis, M. leprea, M. tuberculosis, M. ulcerans i M. ranae.

[0072] Kad god se upotrebljava ovde, ranije ili u nastavku, da jedinjenja mogu da tretiraju bakterijsku infekciju, podrazumeva se da jedinjenja mogu da tretiraju infekciju sa jednim ili više bakterijskih sojeva. Međutim, kada se koristi, u vezi sa upotrebom DARQ J kao antimikrobnog jedinjenja, anti-mikrobno treba da bude jedinjenje koje može da tretira infekciju sa jednim ili više bakterijskih sojeva, pod uslovom da su navedeni bakterijski sojevi različiti od mikobakterija.

[0073] Bakterijske infekcije koje se mogu lečiti ovim jedinjenjima uključuju, na primer, infekcije centralnog nervnog sistema, infekcije spoljnog uva, infekcije srednjeg uva, poput akutnog otitis medija, infekcije kranijalnih sinusa, infekcije oka, infekcije usna šupljina, kao što su infekcije zuba, desni i mukoze, infekcije gornjih disajnih puteva, infekcije donjih disajnih puteva, genitourinarne infekcije, gastrointestinalne infekcije, ginekološke infekcije, sepse, infekcije kostiju i zglobova, kože i kožnih tkiva, bakterijski endokarditis, opekotine, antibakterijska profilaksa od operacija i antibakterijska profilaksa kod imunosupresovanih pacijenata, kao što su pacijenti koji primaju hemoterapiju protiv raka ili pacijenti sa transplantacijom organa.

[0074] Ovaj pronalazak dalje pruža postupak za lečenje pacijenta pogođenog tuberkulozom, koji obuhvata davanje pacijentu agensa koji deluinterakuje sa atpE proteinom.

Farmaceutski sastavi

[0075] Ovaj pronalazak dalje pruža farmaceutski sastav koja sadrži agens koje interakuje sa atpE proteinom u ćeliji i farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0076] Takvi agensi mogu biti formulisani u sastave koje sadrže agens zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem. Agens može u obliku fiziološki funkcionalnog derivata, kao što su estar ili so, kao što je kisela adiciona so ili osnovna metalna so, ili N ili S oksid. Sastavi mogu biti formulisani za bilo koju pogodnu rutu i način primene. Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači obuhvataju one koji koriste u formulacijama koje su pogodne za oralnu, rektalnu, nazalnu inhalaciju, topikalno (uključujući bukalno i sublingvalno), vaginalno ili parenteralno (uključujući potkožno, intramuskularno, intravensko, intradermalno, intratekalno i epiduralno) primenjivanje. Izbor nosioca ili razblaživača će naravno zavisiti od predloženog načina primene, koji može zavisiti od agensa i njegove terapeutske svrhe. Formulacije se mogu pogodno prikazati u jediničnom doznom obliku i mogu se pripremiti bilo kojim od postupaka koji su dobro poznati u farmaciji. Takvi postupci uključuju korak uključivanja aktivnog sastojka sa nosačem kog čine jedan ili više pomoćnih sastojaka. Uopšteno, formulacije su pripremljene uniformno i bliskim dovođenjem u vezu aktivnog sastojka sa tečnim nosačima ili fino podeljenim čvrstim nosačima ili sa oba, i zatim, ako je potrebno, oblikovanjem proizvoda.

[0077] Za čvrste sastave, mogu se koristiti uobičajeni netoksični čvrsti nosači koji uključuju, na primer, farmaceutske gradacije manitola, laktoze, celuloze, derivati celuloze, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, glukozu, saharozu, magnezijum karbonat, i slično. Aktivno jedinjenje kao što je prethodno definisano može biti formulisano kao supozitorijum koji koristi, na primer, polialkilen glikole, acetilirane trigliceride i slično, kao nosač. Tečni farmaceutski primenljivi sastavi mogu, na primer, biti pripremljene rastvaranjem, disperzijom, itd aktivnog jedinjenja kako je definisano u prethodnom tekstu i opcionim farmaceutskim adjuvansima u nosaču, kao što su, na primer, voda, slani vodeni rastvor dekstroze, glicerol, etanol, i slično, kako bi se na taj način formirao rastvor ili suspenzija. Ako je poželjno, farmaceutski sastav koji će se primenjivati može takođe sadržati male količine netoksičnih pomoćnih supstanci kao što agensi za vlaženje ili emulgovanje, pH puferi i slično, na primer, natrijum acetat, sorbitan monolaurat, trietanolamin natrijum acetat, sorbitan monolaurat, trietanolamin oleat itd. Aktuelni postupci pripreme takvih doznih oblika poznate su ili će biti očigledne onima koji su stručni u oblasti; na primer, pogledati Gennaro et al., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18th Edition, 1990.

[0078] Sastav ili formulacija za primenu će u svakom slučaju sadržati količinu aktivnog jedinjenja u količini koja je efikasna za ublažavanje simptoma pacijenta koji se tretira.

[0079] Tačna doza i učestalost primene predmetnih jedinjenja zavise od određenog korišćenog jedinjenja, specifičnog stanja koje se tretira, težine tretiranog stanja, starosti, težine, pola, ishrane, vremena primene i opšteg fizičkog stanje određenog pacijenta, načina primene, kao i drugih lekova koje pojedinac može uzimati, što je dobro poznato stručnjacima. Pored toga, evidentno je da se efektivna dnevna količina može smanjiti ili povećati u zavisnosti od odgovora tretiranog pacijenta i/ili u zavisnosti od procene lekara koji propisuje jedinjenja iz ovog pronalaska.

[0080] Dozni oblici ili sastavi koji sadrže aktivni sastojak u opsegu od 0,25 do 95% sa balansom napravljenim od netoksičnog nosača mogu se pripremiti. U zavisnosti od načina primene, farmaceutski sastav će se poželjno sastojati od 0,05 do 99 % težine, poželjnije od 0,1 do 70 % težine aktivnih sastojaka, i od 1 do 99,95 % težine, poželjnije od 30 do 99,9 % težine farmaceutski prihvatljivog nosača, gde se svi procenti se baziraju na ukupnom sastavu.

[0081] Za oralnu primenu formiran je farmaceutski prihvatljiv netoksični sastav inkorporiranjem bilo kog od normalno korišćenih ekscipijenasa, kao što su, na primer, farmaceutske klase manitola, laktoze, celuloze, derivati celuloze, natrijum kroskarmeloze, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, glukoza, saharoza, magnezijum, karbonat i slično. Takvi preparati imaju oblik rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Takvi preparati mogu sadržati 1%-95% aktivnog sastojka, još poželjnije 2-50%, najpoželjnije 5-8%.

[0082] Parenteralnu primenu generalno karakteriše injekcija, bilo potkožno, intramuskularno ili intravenozno. Injekcije se mogu pripremiti u konvencionalnim oblicima, bilo kao tečni rastvore ili suspenzije, čvrsti oblici pogodne za rastvaranje ili suspenziju u tečnosti pre injektiranja ili kao emulzije. Pogodni ekscipijenti su, na primer, voda, fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol, etanol ili slično. Pored toga, ako je poželjno, farmaceutski sastavi koje treba primenjivati mogu takođe sadržati manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci kao što su agensi vlaženje ili emulgovanje, agensi za puferovanje pH i slično, kao što su npr. natrijum acetat, sorbitan monolaurat, trietanolamin oleat, trietanolamin natrijum acetat itd.

[0083] Procenat aktivnog jedinjenja sadržan u takvim roditeljskim sastavima zavisi od njegove specifične prirode, kao i aktivnosti jedinjenja i potreba pacijenta. Međutim, procenti aktivne supstance od 0,1% do 10% u rastvoru mogu biti upotrebljivi i biće veći ako je sastav čvrsta supstanca koja će se naknadno razređivati prema gore navedenim procentima.

Poželjno, sastav će sadržati 0,2-2% aktivnog agensa u rastvoru.

[0084]Na kraju, ovaj pronalazak pruža predmet proizvodnje koji sadrži ambalažu i farmaceutski agens, gde (a) farmaceutski agens interakuje sa atpE proteinom u ćeliji, i (b) ambalaža sadrži etiketu koja ukazuje na upotrebu agensa za lečenje bakterijske infekcije kod pacijenta. Posebno kao anti-mikobakterijski lek.

Tokom ovog opisa, izrazi „standardni postupci“, „standardni protokoli“ i „standardne procedure“, kada se koriste u kontekstu tehnika molekularne biologije, treba shvatiti kao protokole i procedure koje se nalaze u uobičajenom laboratorijskom priručniku kao što su: Current Protocols in Molecular Biology, editors F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc.

1994, ili Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.

[0085] Ovaj pronalazak će biti bolje shvaćen uzimajući u obzir eksperimentalne detalje koji slede, ali oni koji su stručnjaci u ovoj oblasti će lako razumeti da su to samo ilustracije pronalaska, kao što je opisano u potpunosti u patentnim zahtevima koji slede.

EKSPERIMENTALNI DEO

[0086] Koristeći Mycobacterium smegmatis kao surogat, otkrili smo niz DARQ sa snažnom aktivnošću in vitro protiv nekoliko mikobakterija (11). Do danas, 20 molekuli DARQ serije imaju minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) ispod 0,5 µg/ml protiv Mycobacterium tuberculosis H37RV, i za tri od ovih anti-mikobakterijski aktivnosti su potvrđene u in vivo mišjem modelu.

[0087] Strukturno i mehanički, DARQ se veoma razlikuju od oba fluorohinolona (uključujući metoksihinolone) i druge klase hinolina, uključujući meflohin i njegove analoge, 4-metilhinoline i 4-hinolilhidrazone (12-16). Jedna od glavnih strukturnih razlika između DARQ i drugih klasa hinolona ili hinolina je specifičnost funkcionalizovanog lateralnog (3') lanca koji nosi DARQ klasa. Pored toga, nedostatak mikroobakterijske unakrsne otpornosti sa postojećim hemijskim klasama ukazuje na drugačiji mehanizam delovanja.

Utvrđeno je da olovno jedinjenje DARQ, u daljem tekstu J ili DARQ J (Slika1), ima jedinstveni spektar potentne i selektivne anti-mikobakterijske aktivnosti in vitro (Tabela 1). Srednji MIC, dobijen za laboratorijsku liniju H37Rv i šest potpuno osetljivih izolata, iznosio je 0,060 µg/ml, u poređenju sa 1,00 µg/ml za rifampin. J je pokazao sličnu in vitro efikasnost prema kliničkim izolatima M. tuberculosis otpornih na TB agense prve linije: rifampin, streptomicin, etambutol i pirazinamid; i TB agens druge linije moksifloksacin. Za osam kliničkih izolata otpornih na izoniazid, srednji MIC je bio 0,010 µg/ml. Nedostatak unakrsne rezistencije sa trenutno korišćenim anti-TB agensima sugerišu da J može zadržati aktivnost protiv MDR-TB linija. Zaista, korišćenjem BACTEC™ sistema kulture, jasna inhibicija bakterijskog rasta zavisna od koncentracije je viđen kada su MDR-TB linije izložene fiksnim koncentracijama J. Od 30 izolata MDR-TB, za 13 (43%) je nađeno da su podložni 0,100 µg/ml J i 17 (57%) da su podložni 0,010 µg/ml J. Sličan visok stepen osetljivosti (MIC ispod 0,010 µg/ml) je primećen samo za jedan od 10 dodatnih linija potpuno podložnih, kada se testira korišćenjem BACTEC ™ sistema, dok su sve linije osetljive na 0,100 µg/ml J.

Potentna aktivnost je takođe pokazano protiv drugih vrsta mikobakterija uključujući Mycobacterium bovis i Mycobacterium kansasii, kao i protiv vrsta prirodno otpornih na mnoge druge anti-TB agense i uključenih u oportunističke infekcije, poput Mycobacterium avium kompleksa (MAC), Mycobacterium abcessus, Mycobacterium fortuitum i Mycobacterium marinum (Tabela 1).

[0088] Iznenađujuće, aktivnost J je bila specifična za mikobakterije. J je jedva aktivan protiv vrsta bliskih mikobakterijama poput Corynebacterium (MIC 4.00 µg/ml) i Nocardia (MIC> 4,00 µg/mL), i nije aktivan protiv drugih organizama uključujući gram pozitivne Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus – uključujući linije rezistentne na meticilin (MIC > 32 µg/ml) – i Enterococcus faecalis, ili gram negativne Escherichia coli, Haemophilus influenzae, i Helicobacter pylori. Izlaganje M. tuberculosis u fazi rasta koncentracijama J na 100 x MIC rezultiralo je smanjenjem 10<3>logaritamskim smanjenjem broja bakterija nakon 12 dana, što ukazuje na to da J ima baktericidnu aktivnost in vitro. Uticaj J na stacionarne bakterije bakcila tuberkuloze još nije proučavan.

Izolacija mutanata, unakrsna otpornost i postulirani cilj leka

[0089] Istražujući mikobakterijsku rezistenciju, želeli smo da identifikujemo cilj molekulskog leka i predložimo mehanizam delovanja. Rezistentni mutanti M. tuberculosis i M. smegmatis izvedeni su in vitro selekcijom u inhibitornim koncentracijama J, kako bi:

•kantifikovali udeo rezistentnih mutanata kod mikobakterija (sa rifampinom kao kontrolom)

•procenili model otpornosti rezistentnih mutanata (uključujući unakrsnu/ne-unakrsnu otpornost na hinolone)

•istražili mehanizam delovanja.

[0090] Od eksperimenata selekcije, procenat mutanata sa smanjenom osetljivošću na J bio je 5 x 10<-7>i 2 x 10<-8>na MIC x 4, i 5 x 10<-8>i 1 x 10<-8>kod MIC x 8 za M. tuberculosis i M. smegmatis, respektivno (podržavajući onlajn tekst). U slučaju M. tuberculosis, ove proporcije su upoređivane sa mutantima koji su otporni na rifampin (10<-7>do 10<-8>) i ukazuju da je prirodno prisutna rezistencija na J retka. Osim toga, senzitivnost M. tuberculosis rezistentnih na J ostala je nepromijenjena za anti-TB agense izoniazid, rifampin, streptomicin, amikacin, etambutol i moksifloksacin. Dalja analiza M. tuberculosis i M. smegmatis mutanata sa smanjenom osetljivošću na J pokazala je da nema mutacija u DNK giraznim regijama gyrA i gyrB, sekvencama u kojima se tipično razvija otpornost na hinolon. Ovo potvrđuje da je molekularna mera za J različita od one fluorohinolona.

[0091] Jedan pristup za određivanje molekularnog cilja za J i utvrde mehanizi delovanja je da se identifikuju i uporede mutacije koje pružaju otpornost u osetljivim i rezistentnim linijama M. tuberculosis i M. smegmatis. Genomi rezistentne M. tuberculosis linije BK12 i dea otporne M. smegmatis linije R09 i R10, kao i roditeljsku M. smegmatis, sekvencirani su do kraja. Identifikovali smo mutacije koje omogućavaju rezistenciju komparativnom analizom sekvenci genoma osetljivih i rezistentnih linija M. tuberculosis i M. smegmatis (Slika 2). Pokazali smo da je jedini gen pogođen u sva tri nezavisna mutanta protiv odgovarajućeg roditeljskog divljeg tipa koji kodir za atpE, deo F0podjedinice ATP sintaze. Ovo sugeriše da je atpE odgovoran za otpornost na J u linijama mutanata, što ukazuje na to da J inhibira novi cilj M. tuberculosis, protonsku pumpu ATP sintaze.

[0092] Istraživanja komplementacije su izvedena kako bi se pokazalo da je mutiran atpE gena odgovoran za rezistenciju na J i direktnim utvrđivanjem da je atpE genski proizvod cilj od J u mikobakterijama. S obzirom na to da je poznato da se svi geni operona ATP sintaze moraju eksprimirati na koordiniran način, tj. svi geni koji kodiraju F0deo moraju da se eksprimiraju sa iste lokacije, mi smo pojačali F0 deo operona iz rezistentne M. smegmatis linije (D32V) i odabranih klonova koji nisu stekli dodatne mutacije putem PCR procesa. Divlji tip M. smegmatis je transformisan sa plazmidom koji sadrži tako odabrani mutant F0fragment. Ovo je omogućilo da ćelije budu otporne na J sa MIC-om praktično identičnim onim od rezistentne linije M. smegmatis R09 (D32V). Pored toga, kada je plazmid ponovo izolovan od ovih transformatora i kad je atpE gen sekvenciran, pokazalo se da je ostao mutantni alel (D32V).

[0093]Stvarni efekat DARQ J na ATP proizvodnju u M. tuberculosis je dalje pokazan merenjem efekta J na ukupni ćelijski ATP prisutan u mikobakterijama koristeći ATP Bioluminescence Luciferase Assay Kit HS II od Roche. Ovaj test se zasniva na ATP-vođenoj konverziji D-Luciferina do Oksiluciferina koja se može meriti na 526 nm.

Ukratko, efekat DARQ J na ukupni ATP testiran je i u divljem tipu M. tuberculosis i u mutiranoj liniji. DCCD koji je dobro poznat inhibitor ATP sintaze korišćen je kao pozitivna kontrola i izoniazid koji je inhibitor za biosintezu određenih komponenti ćelijskog zida, ali nema efekta na proizvodnju ATP, korišćen je kao negativna kontrola.

Kao što se može videti na Slici 3, tretman divljeg tipa M. tuberculosis sa DARQ J dovodi do dozno-zavisnog smanjenja ATP proizvodnje u tim bakterijama. Nasuprot tome, izoniazid nema efekta na proizvodnju ATP. Kao što je prethodno opisano, izlaganje ovih bakterija visokoj koncentraciji DARQ J podiže mutante M. tuberculosis rezistentne na diarilhinoline. Kada su ove rezistentne M. tuberculosis tretirane sa DARQ J, ove bakterije nisu pokazale nikakvo smanjenje proizvodnje ATP-a, čak ni sa 100 puta minimalnih inhibitornih koncentracija (MIC) ovog jedinjenja. Nasuprot tome, DCCD je bio u stanju da blokira proizvodnju ATP-a u ovim bakcilima što sugeriše da DARQ J i DCCD imaju različite vezivne džepove u ATP sintazama.

Računarsko modeliranje i identifikacija regiona vezivanja DARQ J

[0094] Za dalje istraživanje različitog načina delovanja DCCD i DARQ J korišćen je računarski generisan 3D model ATP sintaze za divlji tip i DARQ J mutant M. tuberculosis. Atomske koordinate navedene u Tabelama 4 i 5 izračunate su izradom modela 3D strukture objavljenih aminokiselinskih sekvenci P63691 i AJ865377. Zaključeno je da je stvarno mesto vezivanja DARQ J locirano na dodirnoj površini A i C podjedinica, a naročito oko aminokisline „Arg 210“ od A podjedinice i „Glu 61“ od C podjedinice, kako je navedeno u Tabelama 3, 4 ili 5. Ovo se lepo uklapa sa rezultatima koji su prikazani za skrining mutacija koje omogućavaju rezistenciju u osetljivim i rezistentnim linijama M. tuberculosis i M. smegmatis, opisanim gore.

[0095]Model se zasniva na optimizaciji relativnog postavljanja A- i C heliksa strukture ATPaze i orijentacije aminokiselina na kičmenu stranu i bočni lanac prema minimalno izračunatoj unutrašnjoj liniji. Geometrija je dobijena pomoću brojnih simulacionih ciklusa molekularne dinamike i relaksacija molekularne mehanike počevši od prethodno objavljene opšte heliks geometrije različitog organizma [E-Coli PDB kod za unos 1C17 - V.K. Rastogi i M.E. Girvin, Nature, 402, 263-268 (1999)]. Molekularna dinamika i relaksacija geometrije su izvedeni pomoću parametrizacije sile na bazi MMFF94s [Halgren, T.A. (1996), J. Comput. Chem., 17, 490-519], ali se može koristiti bilo koji savremeni softver molekularne dinamike [Berendsen, H.J.C., van der Spoel, D. i van Drunen, R., Comp. Phys. Comm. 91 (1995), 43-56; Lindahl, E., Hess, B. i van der Spoel, D., J. Mol. Mod.7 (2001) 306-317.] praćena odgovarajućom optimizacijom geometrije [J. W. Ponder i F. M. Richards, J. Comput. Chem., 8, 1016-1024 (1987).].

[0096] Izračunate koordinate u Tabelama 3, 4 i 5 sadrže deo (sa zapreminom od 30 Angstromskih radijusa) predviđene strukture regije koja se smatra relevantnom za inhibiciju MTB aktivnosti ATPaze u ovim enzima, na osnovu predloženog načina inhibicija i na pojavu rezistentnih mutacionih tačaka u biološkim testovima.

Diskusija

[0097]DARQ J je član nove hemijske klase anti-TB agensa sa MIC jednakim ili nižim od referentnih jedinjenja. Njegov spektar je jedinstven po svojoj specifičnosti za mikobakterije, uključujući atipične vrste značajne kod ljudi; MAC, M. kansasii i brzo rastuće M. fortuitum i M. abscessus. Ovaj anti-mikobakterijski specifični spektar se razlikuje od onog od izoniazida, koji nema aktivnosti protiv MAC. Klinička upotreba J će biti visoko ciljana na lečenje TB i mikobakterijskih infekcija. Nemogućnost J da inhibira ne-mikobakterije trebalo bi da se prevede na manje selektivni pritisak i manji rizik od rezistencije koja se razvija u drugim vrstama bakterija, u poređenju sa antibiotikom sa širim spektrom (9).

Cilj i mehanizam delovanja J razlikuje se od onih drugih anti-TB agenasa. Poređenje sekvenci ATP sintaza različitih bakterija i eukariotske ATP sintaze, i posebno C lanca F0podjedinice kompleksa ATPaze, zajedno sa 3D modeliranjem ATP sintaza divljeg tipa i mutanta M. Tuberkuloze, daje obrazloženje specifičnosti antibakterijskog spektra i, u manjoj meri, bezbednosnog profila.

[0098]Ispitivanje dinamike koje se izvodi na konstruisanim modelima mikobakterijske ATPaze pokazuje da u ovim strukturama postoji šupljina (mesto vezivanja prema atomskim koordinatama Tabele 3) na dodirnoj površini A i C podjedinica (oko aminokiseline „Arg 210“ od A podjedinice A i „Glu 61“ od C podjedinice). Tabele 4 i 5 pružaju koordinate dve ispitivane varijante atoma oko ove lokacije i njihovu prosečnu poziciju. DARQ J inhibitor je u mogućnosti da ometa normalan korak protonskog prenosa koji uključuje ove dve aminokiseline tako što zabranjuje tim aminokiselinama da interakuju. Stereospecifičnost DARQ J može se razumeti iz asimetrije predviđenog mesta vezivanja; aktivni hiralni enantiomer optimalno prilagođava ovu šupljinu, drugi oblici jedinjenja i varijanti ATPaze su manje usklađeni.

[0099] Vezujuće mesto koje smo ovde izveli nalazi se na sasvim drugom delu sistema ATPaze od DCCD-a (DARK su u membranskom delu enzima, vezivanje DCCD se odvija približno 90 Angstroma dalje unutar ćelije, na osnovu PDB strukture goveđeg ATPaza kristal „1E79“ - objavljeno od strane u C.Gibbons, M.G.Montgomery, A.G.W. Leslie, J.E.Walker, Nat.Struct.Biol.,7,1055 (2000). Stoga atomi koji mogu potencijalno biti uključeni u DCCD tip inhibicije MTB ATPAze nisu u regiji navedenoj u tabeli koordinata na mestu vezivanja (koji samo jedva obuhvata membranski deo enzima) i, recipročno, ovaj deo enzima koji je uključen u DARQ J način inhibicije nije prisutan u objavljenoj „1E79“ srukturi (koja samo pokazuje intracelularni deo). Ova razlika u mestu vezivanja može da objasni različiti odgovor M. tuberculosis koji je primećen u in vitro testu ATP proizvodnje.

[0100] Bez obzira na gore navedeno, starije studije sa DCCD na mitohondrijalnim ATPazama ukazuju na još jedno vezujuće mesto koje se nalazi oko kisele aminokiseline u lipofilnom okruženju F0regije enzima, npr. od Sebald W, Machleidt W, Wachter E., Proc Natl Acad Sci U S A.1980 Feb;77(2):785-789. Ova pozicija vezivanja na mitohondrijalne ATPaze može se smatrati analognom onoj koja je ovde opisana za Micobacterium vrste.

[0101] Istovremeno, ciljanje novog mehanizma osigurava da trenutno cirkulišuće TB linije sa rezistentnim mutacijama na dostupne tretmane nisu unakrsno otporne na J. Očigledno je iz naših in vitro ispitivanja da J ima bar tako visoko anti-bakterijsko dejstvo protiv izolata MDR-TB, čak i protiv onih sa širokom rezistencijom na četiri leka, kao protiv normalnih tipova divljih podložnih linija M. tuberculosis. Ova opservacija je važna jer jasno pokazuje da nema unakrsnog otpora sa postojećim anti-TB lekovima. S obzirom na dalju identifikaciju vezujućeg džepa u membranskom delu ATPaze, rezultati ovog ispitivanja će omogućiti dalji razvoj novih anti-bakterijskih jedinjenja, posebno anti-mikobakterijskih jedinjenja koja se bave sintezom ATP-a u ovim organizmima.

Reference

[0102]

1. Global Alliance for TB Drug Development, Developing a faster TB cure (2004; http://www.tballiance.org).

2. E. L. Corbett et al., Arch. Intern. Med. 163, 1009 (2003).

3. UNAIDS, AIDS epidemic update 2003 (2003;

www.unaids.org/Unaids/EN/Resources).

4. World Health Organization, Tuberculosis (2004; http://www.who.int/health topics/tuberculosis/en/).

5. R. J. O'Brien, P. P. Nunn, Am. J. Respir. Crit. Care Med.163, 1055 (2001). 6. World Health Organization, Tuberculosis Fact Sheet No 104 (2004; http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/).

7. A. J. Claxton, J. Cramer, C. Pierce, Clin. Ther.23, 1296 (2001).

8. N. Lounis et al., Antimicrob. Agents Chemother.45, 3482 (2001).

9. A. S. Ginsburg, J. H. Grosset, W. R. Bishai, Lancet Infect. Dis.3, 432 (2003).

10. C. K. Stover et al., Nature 405, 962 (2000).

11. Guillemont J, Emile G, Patent (International Publication Number. WO 2004/011436. International Publication Date 5 February, 2004).

12. Barbachyn MR, Brickner SJ, Patent (International Publication Number: WO 93/09103, International Publication Date: 13 May 1993, International Application Number: PCT/US92/08267, International Filing Date: 1992).

13. R. Jain, B. Vaitilingam, A. Nayyar, P. B. Palde, Bioorg. Med. Chem. Lett.13, 1051 (2003).

14. C. M. Kunin, W. Y. Ellis, Antimicrob. Agents Chemother. 44, 848 (2000). 15. L. Savini, L. Chiasserini, A. Gaeta, C. Pellerano, Bioorg. Med Chem 10, 2193 (2002).

16. S. Vangapandu, M. Jain, R. Jain, S. Kaur, P. P. Singh, Bioorg. Med. Chem.12, 2501 (2004).

17. K. Andries et al., Science 307, 223 (2005).

Tabela 1

Tabela 2

Tabela 3

Tabela 4

Tabela 5

Tabela 6

Tabela 7

SPISAK SEKVENCI

[0103]

<110> Janssen Pharmaceutica N.V. <120> mutirani atpE proteini <130> PRD2323p

<150> EP 04104720.0

< 151> 2004-09-28

<150> US 60/620500

< 151> 2004-10-20

<160> 12

<170> PatentIn verzija 3.1 <210> 1

< 211> 81

< 212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Izolovan mutiran atpE protein koji obuhvata polipeptidnu sekvencu izabranu od SEQ ID NO 01 koja obuhvata barem jednu tačkastu mutaciju koja se nalazi na bilo kom vezujućem mestu ATPaze koje se nalazi između aminokiselina 14 do 34 ili između aminokiselina 54 do 69, i SEQ ID NO 03 koja obuhvata barem jednu tačkastu mutaciju koja se nalazi na bilo kojoj aminokiselini 20 do 40, ili ili aminokiselinama 60 do 75, gde navedeni protein indukuje rezistenciju na anti-mikrobsko jedinjenje DARQ J sa Slike 1.

2. Izolovan mutiran atpE protein prema patentnom zahtevu 1 koji obuhvata polipeptidnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO 01 koji obuhvata barem jednu tačkastu mutaciju koja se nalazi na aminokiselini 28 ili aminokiselini 63.

3. Izolovan mutiran atpE protein prema patentnom zahtevu 1 ili 2, izabran od Mtb_R kako je prikazano u SEQ ID No.2, Msm_R09 kako je prikazano u SEQ ID No.4, Msm_R10 kako je prikazano u SEQ ID No.5.

4. Primena polipeptida prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3 u postupku za identifikovanje jedinjenja koja interakuju sa F0delom ATPaze i za njihov potencijal kao antimikrobna jedinjenja.

5. Postupak procene potencijalnog test jedinjenja da interakuje sa atpE proteinom, gde navedeni postupak obuhvata;

- tehnike molekularnog modeliranja za generisanje trodimenzionalne strukture mesta vezivanja prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3;

- upotreba računskih sredstava za obavljanje operacije uklapanja između test jedinjenja i trodimenzionalne strukture mesta vezivanja; i

- analiziranje rezultata pomenute operacije uklapanja za kvantifikaciju udruživanja test jedinjenja sa trodimenzionalnom strukturom mesta vezivanja.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 5 gde je trodimenzionalna struktura generisana barem sa aminokiselinama Ala<24>, Gly<27>, Phe<53>, Val<57>, Gly<58>, Glu<61>, Tyr<64>i Phe<65>jedne C podjedinice i aminokiselinama Ser<182>, Leu<183>, Leu<185>, i Arg<186>jedne A podjedinice, koristeći atomske koordinate bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5 ili homologne strukturne koordinate koje sadrže koren srednjeg kvadratnog odstupanja ne-vodoničnih atoma od manje od oko 1,5Å

7. Postupak prema patentnom zahtevu 5 gde je trodimenzionalna struktura generisana koristeći atomske koordinate ili aminokiseline Ala<21>, Gly<25>od A Lanca bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5; aminokiseline Ala<24>, Gly<27>, Phe<53>, Phe<54>, Val<57>, Gly<58>, Glu<61>, Tyr<64>, Phe<65>od K Lanca bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5; aminokiseline Met<17>, Gly<19>Gl<20>, Ala<21>, Ile<22>, Gly<23>, Ala<24>, Gly<25>, Ile<26>, Gly<27>, Asp<28>, Gly<29>, Ala<31>, Phe<53>, Thr<56>, Val<17>, Gly<58>, Leu<59>Val<60>, Glu<61>, Ala<62>, Ala<63>/Pro<63>, Tyr<64>, Phe<65>od L Lanca bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5; i ili aminokiseline Ser<182>, Leu<183>, Leu<185>, i Arg<186>od M Lanca bilo koje od Tabela 3, 4 ili 5.

8. Izolovanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira izolovan mutiran atpE protein prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3.

9. Vektor koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8.

10. Ćelija domaćin koja nosi vektor prema patentnom zahtevu 9

11. Postupak za identifikovanje anti-mikrobnog jedinjenja, gde navedeni postupak obuhvata a) dovođenje u dodir ćelije koja eksprimira atpE protein sa test jedinjenjem pod fiziološkim uslovima, i

b) određivanje da li test jedinjenje interakuje sa atpE proteinom

gde je atpE protein mutiran atpE protein prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3.

12. Postupak za procenu potencijalnog test jedinjenja da interakuje sa mutiranim atpE proteinom prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3, gde navedeni postupak obuhvata; a) tehnike molekularnog modeliranja za generisanje trodimenzionalne strukture mutiranog atpE proteina prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3,

b) upotreba računskih sredstava za obavljanje operacije uklapanja između test jedinjenja i trodimenzionalne strukture mutiranog atpE proteina prema patentnim zahtevima 1 do 3, i

c) analiziranje rezultata pomenute operacije uklapanja za kvantifikaciju udruživanja test jedinjenja sa trodimenzionalnom strukturom mutiranog atpE protein prema patentnim zahtevima 1 do 3.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 12 gde je trodimenzionalna struktura atpE proteina generisana koristeći atomske koordinate Ile28, Glu61 i Ile63 od E. coli (Protein Database 1Q01) /- koren srednje srednje kvadratne devijacije kičme atoma navedenih aminokiselina od ne više od 10Å.

14. Postupak prema patentnom zahtevu 12 gde je trodimenzionalna struktura atpE proteina generisana koristeći atomske koordinate prema Tabelama 6 ili 7 /- koren srednje srednje kvadratne devijacije kičme atoma navedenih aminokiselina od ne više od 1,5Å.