RS56419B1 - Postupak za ćelijsku ekspresiju rnk - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj opis se odnosi na pospešivanje RNK ekspresije u ćeliji kao što je ćelija transfektovana sa RNK smanjenjem aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR). Prema tome, ovaj opis se odnosi na in vitro postupke za ekspresiju RNK u ćeliji koja obuhvata korak smanjenja aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u ćeliji. Smanjenje aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u toj ćeliji povećava stabilnost RNK i/ili povećava ispoljavanje RNK u toj ćeliji.

STANJE TEHNIKE

[0002] Prednosti korišćnja RNK kao vrste reverzibilne terapije gena obuhvataju tranzijentnu ekspresiju i netransformišući karakter. RNK ne iziskuje ulazak u nukleus da bi bila ispoljena i pored toga ne može da se integriše u genom domaćina, čime se eliminiše rizik od onkogeneze. Brzine transfekcije koje je moguće dostići sa RNK su relativno visoke, za veliki broj tipova ćelije čak >90%, i samim tim, nema potrebe da se selektuju transfektovane ćelije. Zapravo, mRNK transfekcija različitih linija ćelije i primarnih ćelija se smatra kao visoko efikasno sredstvo za tranzijentno prekomerno ispoljavanje (Ryser et al., Molecular Therapy 2006: 13, Suppl. 1, S198). Pored toga, dostignute količine proteina odgovaraju količinama u fiziološkoj ekspresiji.

[0003] RNK je opisana kao korisna za reverznu diferencijaciju somatskih ćelija u ćelije slične matičnim ćelijama bez generisanja embriona ili fetusa. Reverzna diferencijacija somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije, posebno pluripotentnost, može biti delotvorna uvođenjem RNK kodirajućih faktora koji indukuju reverznu diferencijaciju somatskih ćelija u somatske ćelije i kultivaciju somatskih ćelija što omogućava reverznu diferencijaciju ćelija. Pošto se reverzno izdiferenciraju, ove ćelije bi mogle biti indukovane da se reverzno diferenciraju u isti ili različiti tip somatske ćelije kao što je neuronska, hematopoietička, mišićni, epitelni, i drugi tipovi ćelije. Zato, takve matičnim ćelijama slične ćelije imaju medicinske primene za lečenje degenerativnih bolesti pomoću "ćelijske terapije" i moguće ih je koristiti u novim terapijskim strategijama za lečenje srčanih, neuroloških, endokrinih, vaskularnih, bolesti mrežnjače, dermatoloških, mišićno skeletnih poremećaja, i drugih bolesti.

[0004] Pored toga, upotreba RNK obezbeđuje privlačnu alternativu da se zaobiđu potencijalni rizici koje nose vakcine na bazi RNK. Kao i kod DNK, transfer RNK, u ćelije može takođe da indukuje i ćelijske i humoralne odgovore imunog sistema in vivo.

[0005] Preciznije, dve različite strategije se prate za imunoterapiju sa in vitro transkribovanom DNK (IVT- RNK), koje su obe uspešno testirane na različitim modelima životinja. Bilo da je RNK direktno ubrizgana u pacijenta različitim rutama imunizacije ili su ćelije transfektovane sa IVT-RNK korišćenjem uobičajenih postupaka transfekije in vitro i zatim su transfektovane ćelije primenjene kao lek pacijentu. RNK može, na primer da bude prevedena i izraženi protein predstavljen na MHC molekulima na površini ćelija da se podstakne odgovor imunog sistema.

[0006] Pokušano je da se stabilizuje IVT-RNK različitim modifikacijama da bi se postigla viša i produžena ekspresija prenetih IVT-RNK. Međutim, uprkos uspehu na RNK transfekciji zasnovanih strategija da se ispolje peptidi i proteini u ćelijama, ostaju problemi koji se odnose na RNK stabilnost, zadržano ispoljavanje kodiranog peptida ili proteina i citotoksičnost RNK. Na primer, poznato je da eksogena jedno-lančana RNK aktivira mehanizme odbrane u ćelijama sisara. Henry et al.1994 (JBRHA, 8: 15-25) opisuje identifikaciju RNK elementa u reovirusu S1 iRNK koji ativira od RNK zavisnu kinazu proteina (PKR) da se selektivno suzbije translacija S1 iRNK. Mehanizmi ćelijske odbrane mogu da obuhvate proizvodnju interferona kao posrednika urođenog odgovora imunog sistema na virusne infekcije. Marcus et al. 1988 (Journal of General Virology 69: 1637-1645) and Chen et al. 2006 (Am J Respir Cell Mol Biol.34: 192-203) opisuje da inhibicija PKR korišćenjem 2-aminopurina može da blokira proizvodnju interferona posle infekcije ćelija sa RNK virusima.

KRATAK OPIS OVOG PRONALASKA

[0007] Ovaj opis se odnosi na postupak za ekspresiju RNK u ćeliji koji obuhvata korak smanjenja aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u ćeliji.

[0008] U jednom drugom izvođenju, ova RNK je ili se uvodi u ćeliju postupkom kao što je

elektroporacijom.

[0009] U jednom izvođenju, ova RNK je in vitro transkribovana RNK.

[0010] U jednom izvođenju, korak smanjenja aktivnosti PKR u toj ćeliji daje kao rezultat pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ekspresije RNK u ćeliji, pri čemu pospešivanje ispoljavanja RNK u toj ćeliji preporučljivo obuhvata povećanje u nivou ekspresije i/ili povećanje u pogledu trajanja ekspresije RNK u toj ćeliji.

[0011] U jednom izvođenju, korak smanjenja aktivnosti PKR u toj ćeliji obuhvata tretiranje te ćelije sa barem jednim PKR inhibitorom. U jednom izvođenju, tretiranje ćelije sa barem jednim PKR inhibitorom je tokom izvesnog vremenskog perioda dovoljno da kao rezultat da pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ekspresije RNK u toj ćeliji. U jednom izvođenju, PKR inhibitor suzbija RNK indukovanu PKR autofosforilaciju. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je mestom vezivanja na ATP usmeren inhibitior PKR. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je jedinjenje imidazolo-oksindola. U jednom izvođenju, taj PKR inhibitor je 6,8-dihidro-8-(1H-imidazol-5-ilmetilen)-7H-pirolo[2,3-g]benzotiazol-7-on ili 2- aminopurin. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je virusno izveden inhibitor PKR, pri čemu je virusno izveden inhibitor PKR preporučljivo izabran iz grupe koja obuhvata virus vakcine E3 i/ili K3, ili njihovu RNK.

[0012] U jednom izvođenju, korak smanjenja aktivnosti PKR u toj ćeliji obuhvata prigušivanje ekspresije PKR gena.

[0013] U jednom izvođenju, ćelija je ćelija koja ima funkciju prepreke. U jednom izvođenju, ta ćelija je fibroblast, keratinocit, ćelija epitela, ili ćelija endotela, pri čemu je ćelija endotela preporučljivo ćelija endotela srca, ćelija endotela pluća, ili nedotelna ćelija vene pupčane vrpce. Preporučljivo ta ćelija ljudska ćelija.

[0014] Ovaj opis se stakođe odnosi na upotrebu sredstava koja su pogodna za smanjenje aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u ćeliji tako da to znači kako je ovde opisano, posebno barem jedan PKR inhibitor, kao što je barem jedan od PKR inhibitora onako kako to neće izvuči, za lečenje ćelije u kojoj RNK treba da bude ispoljena..

[0015] U jednom drugom izvođenju, ova RNK je ili se uvodi u ćeliju postupkom kao što je elektroporacija.

[0016] U jednom izvođenju, ova RNK je in vitro transkribovana RNK.

[0017] U jednom izvođenju, korak smanjenja aktivnsoti PKR u toj ćeliji daje kao rezultat pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ekspresije RNK u ćeliji, pri čemu pospešivanje ispoljavanja RNK u toj ćeliji preporučljivo obuhvata povećanje u nivou ekspresije i/ili povećanje u pogledu trajanja ekspresije RNK u toj ćeliji.

[0018] U jednom izvođenju, terapija ćelije sa barem jednim PKR inhibitorom je dovoljna u nekom vremenskom periodu da kao rezultat da pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ispoljavanja RNK u ćeliji. U jednom izvođenju, PKR inhibitor suzbija RNK-om indukovanu PKR autofosforilaciju. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je mestom vezivanja na ATP usmeren inhibitior PKR. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je jedinjenje imidazolo-oksindola. U jednom izvođenju, taj PKR inhibitor je 6,8-dihidro-8-(1H-imidazol-5-ilmetilen)-7H-pirolo[2,3-g]benzotiazol-7-on ili 2- aminopurin. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je virusno izveden inhibitor PKR, pri čemu virusno izveden inhibitor PKR je preporučljivo izabran iz grupe koja obuhvata virus vakcine E3 i/ili K3, ili njihovu RNK.

[0019] U jednom izvođenju, sredstva za smanjenje aktivnosti PKR u toj ćeliji obuhvataju sredstva za prigušivanje ekspresije PKR gena.

[0020] U jednom izvođenju, ćelija je ćelija koja ima funkciju prepreke. U jednom izvođenju, ta ćelija je fibroblast, keratinocit, ćelija epitela, ili ćelija endotela, pri čemu je ćelija endotela preporučljivo ćelija endotela srca, ćelija endotela pluća, ili nedotelna ćelija vene pupčane vrpce. Preporučljivo ta ćelija ljudska ćelija.

[0021] Ovaj opis se takođe odnosi na postupak za dobijanje ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije koja obuhvata korake (i) obezbeđivanja populacije ćelija koja obuhvata somatske ćelije, (ii) smanjenje aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u somatskim ćelijama, (iii) uvođenje RNK koja može da ispoljava jedan ili više činilaca koji dozvoljavaju reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije u barem jedan deo somatskih ćelija, i (iv) omogućavanje razvoja ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije.

[0022] U jednom izvođenju, RNK se uvodi u barem jedan deo somatskih ćelija putem elektroporacije.

[0023] U jednom izvođenju, ova RNK je in vitro transkribovana RNK.

[0024] U jednom izvođenju, jedan ili više činilaca obuhvata OCT4 i SOX2. Jedan ili više činilaca može da obuhvata i KLF4 i/ili c-MYC i/ili NANOG i/ili LIN28. [0024] U jednom izvođenju, jedan ili više činilaca obuhvata OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC i može još da obuhvata LIN28. U jednom izvođenju, jedan ili više činilaca obuhvata OCT4, SOX2, NNOG i LIN28.

[0025] U jednom izvođenju, korak smanjenja aktivnsoti PKR u tim ćelijama daje kao rezultat pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ekspresije RNK u ćelijama, pri čemu pospešivanje ispoljavanja RNK u tim ćelijama preporučljivo obuhvata povećanje nivoa ekspresije i/ili povećanje u pogledu trajanja ekspresije RNK u tim ćelijama.

[0026] U jednom izvođenju, korak smanjenja aktivnosti PKR u tim ćelijama obuhvata tretiranje tih ćelija sa barem jednim PKR inhibitorom. U jednom izvođenju, tretiranje ćelija sa barem jednim PKR inhibitorom je tokom izvesnog vremenskog perioda dovoljno da kao rezultat da pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ekspresije RNK u tim ćelijama. U jednom izvođenju, PKR inhibitor suzbija RNK-om indukovanu PKR autofosforilaciju. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je mestom vezivanja na ATP usmeren inhibitor PKR. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je jedinjenje imidazolo-oksindola. U jednom izvođenju, taj PKR inhibitor je 6,8-dihidro-8-(1H-imidazol-5-ilmetilen)-7H-pirolo[2,3-g]benzotiazol-7-on ili 2- aminopurin. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je virusno izveden inhibitor PKR, pri čemu se virusno izveden inhibitor PKR preporučljivo bira iz grupe koja obuhvata virus vakcine E3 i/ili K3, ili njihovu RNK.

[0027] U jednom izvođenju, korak smanjenja aktivnosti PKR u toj ćeliji obuhvata prigušivanje ekspresije PKR gena.

[0028] U jednom izvođenju, postupak još obuhvata korak kultivisanja somatskih ćelija u prisustvu barem jednog inhibitora deacetilaze histona, pri čemu barem jedan inhibitor deacetilaze histona preporučljivo obuhvata valproinsku kiselinu, natrijum butirat, trihostatin A i/ili scriptaid.

[0029] U jednom izvođenju, korak (iv) obuhvata kultivisanje somatskih ćelija u uslovima kulture embrionskih matičnih ćelija.

[0030] U jednom izvođenju, karakteristike matične ćelije obuhvataju morfologiju embrionske matične ćelije.

[0031] U jednom izvođenju, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije imaju normalne kariotipe, ispoljavaju aktivnost telomeraze, ispoljavaju markere na površini ćelije koji su karakteritični za embrionske matične ćelije i/ili ispoljavaju gene koji su karakteristični za embrionske matične ćelije.

[0032] U jednom izvođenju, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije ispoljavaju pluripotentno stanje.

[0033] U jednom izvođenju, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije imaju razvojni potencijal da se izdiferenciraju u unapređene derivate sva tri primarna sloja klice.

[0034] U jednom izvođenju, somatske ćelije su fibroblasti kao što su fibroblasti pluća, fibroblasti prepucijuma ili dermalni fibroblasti. Preporučljivo, somatske ćelije su ljudske ćelije.

[0035] Ovaj se opis takođe odnosi na postupak za dobijanje diferenciranih tipova ćelije koji obuhvata korake (i) dobijanja ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije korišćenjem postupka za dobijanje ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije prema ovom pronalasku, i (ii) kultivisanje ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije pri uslovima koji indukuju ili usmeravaju delimičnu ili potpunu diferencijaciju na izdiferenciran tip ćelije.

[0036] Kao što je vode opisano, inhibicija PKR u ćelijama indukuje proizvodnju interferona. Ovaj opis se dakle odnosi na postupak povećanja proizvodnje interferona pomoću ćelije koji obuhvata korak smanjenja aktivnosti PKR u toj ćeljii. U skladu sa ovim opisom, proizvodnja interferona pomoću ćelije može da bude povećana bilo in vitro ili in vivo. Ako se poveća in vitro proizvodnja interferona pomoću ćelije, ta ćelija može naknadno da se primeni subjektu.

[0037] Interferoni su poznati po svojim antiproliferativnim i apoptotskim dejstvima, njihovim antiangiogenskim dejstvima i njihovoj sposobnosti da moduliraju odgovor imunog sistema. Zato, se opis takođe odnosi na postupak tretiranja subjekta, preporučljivo pacijenta kao što je pacijent bolestan od kancera, koji obuhvata korak smanjenja aktivnosti PKR u ćeliji pomenutog subjekta kao što je putem primene inhibitora ekspresije i/ili aktivnosti PKR. Tretiranje pomenutog subjekta može imati za cilj modulaciju preporučljivo aktivaciju, imunog sistema pomenutog subjekta. Tretiranje pomenutog subjekta može imati za cilj, posebno, da se postigne ili pospeši antikancerno dejstvo, posebno antikancerni odgovor imunog sistema, kod pomenutog subjekta. Takve terapije mogu takođe biti dostignute povećanjem proizvodnje interferona pomoću ćelije in vitro i naknadnom primenom te ćeilje subjektu u vidu leka. U jednom izvođenju, ćelija je autologna ćelija.

[0038] Ćelija u gore pomenutim varijantnim rešenjima ovog pronalaska može biti ćelija kako je ovde opisano. Interferon je preporučljivo interferon α i/ili interferonβ, još preporučljivije interferon α. Aktivnost PKR može biti smanjena u ćeliji kako je ovde opisano. Pored toga, kada se smanjuje aktivnost PKR u gore pomenutim varijantnim rešenjima ovog pronalaska RNK može biti uvedena u ćeliju, npr. kako je ovde opisano, ili RNK ne mora biti uvedena u ćeliju. Ako se RNK uvede u ćeliju, RNK može da bude RNK kako je ovde opisano.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0039]

Slika 1: Indukovanje interferona pomoću IVT RNK

Primarni fibroblasti ljudskog prepucijuma (CCD1079SK) su elektroporisani sa 1 µg IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca i 5 µg IVT RNK kodiranjem za destabilizovan GFP (luc+GFP). Ćelije su bile ili ostavljene netretiranim ili su inkubirane sa 2 µM C13H8N4OS (PKR inhibitor). Uzvodna regulacija interferona alfa i interferona bettranskripata, primećena u fibroblastima čoveka, je indukovana pomoću RNK elektroporacije (Sl.1A i 1C). Inhibicijca PKR korišćenjem C13H8N4OS je dala kao rezultat ogromno povećanje transkripata interferona (Sl 1B i 1D).

Slika 2: Od doze zavisno povećanje ekspresije luciferaze inhibicijom PKR

(A-C) Primarni fibroblasti ljudskog prepucijuma od različitih donora i snabdevača (panel A: BJ fibroblasti; panel B CCD1079Sk; panel C: HFF) i (D) mišji embrionski fibroblasti (MEF) su elektroporisani sa 0,5 µg IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca i 1,25 µg IVT RNK kodiranjem za destabilizovan GFP (eGFP). Ćelije su raspoređene u duplikatima na ploče sa 96 pregrada u gustini od 30000 ćelija/pregradi. Ove ćelije su ili ostavljene netretirane ili inkubirane sa povećanjem količina C13H8N4OS (PKR inhibitor) u opsegu od 0,5 µM do 2 µM kako je navedeno na legendama panela. Aktivnost luciferaze je izmerena pri navedenim vremenskim tačkama. Date su srednje vrednosti duplikata. Od doze zavisno povećanje je primećeno kod luciferaze gena reportera.

Slika 3: Od doze zavisno povećanje ekspresije GFP inhibicijom PKR

(AB) Primarni fibroblasti ljudskog prepucijuma od različitih donora i snabdevača (panel A: BJ fibroblasti; panel B (CCD1079SK) i (C) MEF su elektroporisani sa 0,5 µg IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca i 1,25 µg IVT RNK kodiranjem za pospešeni GFP (eGFP). Ćelije su raspoređene na ploče sa 96 pregrada u gustini od 250000 ćelija/pregradi. Ove ćelije su ili ostavljene netretirane ili inkubirane sa povećanjem količina C13H8N4OS (PKR inhibitor) u opsegu od 0,5 µM do 2 µM kako je navedeno na legendama panela. GFP ekspresija je izmerena protočnom citometrijom kako je navedeno u vremenskim tačkama. Prikazan je srednji intenzitet fluorescencije (MFI) trasnfektovane GFP-pozitivnih frakcija ćelije. Od doze zavisno povećanje je primećeno kod GFP gena reportera.

Slika 4: Dejstvo PKR inhibicije na IVT RNK baziranoj ekspresiji gena reportera za primarne ljudske ćelije endotela vene pupčane vrpce

Primarne ljudske ćelije endotela vene pupčane vrpce (HUVECs) su elektroporisane sa 1 µg IVT RNK kodiranjem luciferaze svitaca i 5 µg IVT RNK kdiranjem za destabilizovani GFP. Ćelije su raspoređene u duplikatima na ploče sa 96 pregrada u gustini od 10000 ćelija/pregradi. Ove ćelije su ili ostavljene netretirane ili inkubirane sa povećanjem količina C13H8N4OS (PKR inhibitor) u opsegu od 0,5 µM do 2 µM kako je navedeno na legendi panela. Aktivnost luciferaze je bila izmereno u navedenim vremenskim tačkama. Date su srednje vrednosti duplikata. Ekspresija luciferaze je pospešena u HUVEC na način koji je zavisio od doze.

Slika 5: Dejstvo PKR inhibicije na IVT RNA-zasnovanu ekspresiju gena reportera u transfektovanim primarnim CD4+ i CD8+ T ćelijama i nezrelim dendritskim ćelijama

Ljudske primarne CD4 i CD8 pozitivne T ćelije, kao i nezrele dendritske ćelije (iDCs) su izolovane i elektroporisane sa 5 µg IVT RNK kodiranjem za destabilizovane GFP. iDC su bile elektroporisane sa 1 µg IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca. Ćelije su ostavljene bilo netretirane ili inkubirane sa povećanjem količina C13H8N4OS (PKR inhibitor) u opsegu od 0,5 µM do 2 µM kako je navedeno na legendama panela. (A) T ćelije i (B) iDC su prikupljeni u navedenim vremenskim trenucima i GFP ekspresija je procenjena protočnom citometrijom. Prikazan je srednji intenzitet fluorescencije (MFI) transfektovanih, GFP pozitivnih frakcija ćelija. (C) Za oglede luciferaze, iDCs su raspoređene u duplikatima na ploče sa 96 pregrada u gustini od 10000 ćelija/pregradi. Aktivnost luciferaze je izmerena pri navedenim vremenskim tačkama. Date su srednje vrednosti duplikata. Ni inhibicija T ćellija ni za iDC inhibicija PKR nisu odvele do povećane GFP ekspresije (Sl. 5A, B). Kod iDC, inhibicija PKR je kao rezultat dala gubitak ekspresije luciferaze (Sl.5C)

Slika 6: Tranzijentna inhibicija PKR posle elektroporacije

BJ i CCD1079SK fibroblasti su elektroporisani sa 0,5 µg IVT RNK kodiranje za luciferazu svitaca i 2,5 µg IVT RNK kodiranje za eGFP. Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za svaki tip ćelije. 10000 ćelija/pregradi su raspoređene u duplikatima na ploče od 96 pregrada. Ćelije su ili ostavljene netretirane ili inkubirane sa (A) 2 µM C13H8N4OS ili (B) 2 µM 2-aminopurina (2-AP) tokom 8 časova, 24 časova, 48 časova ili trajno kako je navedeno na legendama panela. Aktivnost luciferaze je izmerena kolektivno 72 časa posle elektroporacije. Date su srednje vrednosti duplikata. Ovi podaci pokazuju da je PKR inhibitor reverzibilan. Trajna inhibicija daje kao rezultat visoke nivoe ekspresije luciferaze tokom 5 dana.

Slika 7: Inhibicija PKR korišćenjem E3 i K3 proteina virusa vaccinia kotransfektovanih u fibroblaste i HUVEC

CCD1079SK fibroblasti i HUVEC su elektroporisani sa IVT RNK kodiranjem luciferaze svitaca (1 µg), destabilizovanog GFP (5 µg) i 3 µg E3 ili K3 ili oba kako je navedeno. Elektroporacije su izvedene korišćenjem optimizovanih parametara za svaki tip ćelije. 10000 ćelija/pregradi su raspoređen u duplikatima na ploče od 96 pregrada. CCD1079Sk su ili ostavljene netretirane (zatvoreni simboli) ili (B) su inkubirane sa 2 µM C13H8N4OS (otvoreni simboli). (C) HUVEC ćelije su ostavljene bilo netretirane ili inkubirane sa povećanjem koncentracija C13H8N4OS kao što je navedeno. Aktivnost luciferaze je bila izmerena u navedenim vremenskim tačkama posle elektroporacije. Date su srednje vrednosti duplikata. I virusni proteini su odveli do 2-strukog povećanja u ekspresiji luciferaze 24 časa posle elektroporacije. (Sl. 7A). Dodatna primena C13H8N4OS je dala kao rezultat dodatno povećanje ekspresije luciferaze i stabilizaciju (Sl 7B). Slični eksperimenti sa HUVEC ćelijama je otkrila da je kombinacija E3 i K3 povećala ekspresiju luciferaze, koja je aditivno pospešena pomoću C13H8N4OS na od doze zavisan način (Sl 7C).

Slika 8: Inhibicija PKR korišćenjem E3 i K3 proteina virusa vaccinia kotransfektovanih u ljudske T ćelije i iDC

(A) Ljudske primarne CD4 i (B) CD8 pozitivne T ćelije su izolovane i elektroporisane sa IVT RNK kodiranjem destabilizovanih GFP (10 µg) i 5 µg oba, E3 i K3. Elektroporacije su izvedene korišćenjem kiveta sa 4-mm otvorom i optimizovanih parametara za svaki tip ćelije. Ćelije su bile ili ostavljene netretiranim ili inkubirane sa povećanjem koncentracija C13H8N4OS. Ćelje su prikupljeni u navedenim vremenskim trenucima i GFP ekspresija je procenjena protočnom citometrijom. Prikazan je srednji intenzitet fluorescencije (MFI) trasnfektovanihm GFP-pozitivnih frakcija ćelije. (C) Ljudske iDC su izolovane i elektroporisane sa IVT RNK kodiranjem destabilizovanih GFP (10 µg) i 1 µg luciferaze i 5 µg oba, E3 i K3. Elektroporacije su izvedene korišćenjem kiveta sa 4-mm otvorom i optimizovanim parametrima za svaki tip ćelije. Ove ćelije su postavljene u duplikatima na ploče sa 96 pregrada pri gustini od 10000 ćelija/pregradi i ili su ostavljene netretirane (levi panel) ili inkubirane sa povećanjem koncentracija C13H8N4OS (desni panel). Aktivnost luciferaze je izmerena pri navedenim vremenskim tačkama. Date su srednje vrednosti duplikata. Kako je priakzano na Sl. 8A i 8B, virusni proteini koji inhibiraju PKR nisu povećali ekspresiju gena reportera u T ćelijama, niti u prisustvu niti u odsustvu C13H8N4OS. Za iDC, virusni proteini - kako je primećeno pre za inhibitor - su smanjili ekspresiju luciferaze. Takođe, E3 i K3 nije okrenuti negativno dejstvo C13H8N4OS na ekspresiji luciferaze (Sl.

8C).

Slika 9: Dejstvo PKR inhibicije na ekspresiju gena reportera u fibroblastima transfektovanim sa RNK sastavljenom od modifikovanih nukleotida

(A) CCD1079Sk fibroblasti su koelektroporisani sa 1 µg IVT-RNK kodiranjem luciferaze i 5 µg IVT RNK kodiranjem destabilizovanog GFP, bilo nemodifikovanog (unmod) ili modifikovanog sa 5-metilcitidinom (5mC) i pseudouridinom (PU) kako je naznačeno. Odmah posle elektroporacije, ćelije su raspoređene u duplikatima na ploče sa 96 pregrada u gustini od 10000 ćelija/pregradi. Ćelije su ostale bilo netretirane ili su kultivisane u prisustvu 2 µM PKR inhibitora. Posle 7 časova, 24 časa, 48 časova, i 72 časa je procenjena aktivnost luciferaze. Inkorporiranje 5mC i PU u transkripte povećava ekspresiju luciferaze za oko 2-struko u poređenju sa nemodifikovanom kontrolom. Upotreba 2 µM C13H8N4OS još povećava i stabilizuje ekspresiju luciferaze kodirane modifikovanom IVT RNK.

Slika 10: Povećana i stabilizovana ekspresija faktora reprogramirajuće transkripcije pomoću PKR inhibicije

(AB) Primarni fibroblasti ljudskog prepucijuma od različitih donatora i snabdevača (panel A: BJ fibroblasti; panel B: CCD1079Sk) i (C) MEFs su elektroporisani sa 0,5 µg IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca i 1,25 µg IVT RNK kodiranjem za eGFP i 2,5 µg IVT RNK kodiranjem za svaki od individualnih reprogramirajućih faktora OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC. Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za svaki tip ćelije. Ćelije su raspoređene na ploče sa 6 pregrada u gustini od 250000 ćelija/pregradi. Ove ćelije su ili ostavljene netretirane ili inkubirane sa povećanjem količina C13H8N4OS (PKR inhibitor) u opsegu od 0,5 µM do 2 µM kako je navedeno na legendi panela. OCT4 ekspresiija je detektovana unutarćelijskim bojenjem sa fluorescentno označenim antitelom i izmerene protočnom citometrijom na navedenim vremenskim tačkama. Prikazan je srednji intenzitet fluorescencije (MFI) trasnfektovane OCT4-pozitivnih frakcija ćelije. (D) CCD1079Sk fibroblasti su elektroporisani sa IVT RNK kao u B i tretirani tokom 24 časa ili 48 časova sa 2 µM C13H8N4OS. 72 časa posle elektroporacije ove ćelije su prikupljene i izvedeno je unutarćellijsko bojenje sa fluorescentno označenim antitelima reaktivnim protiv naznačenih faktora transkripcije. Prikazane su MFI frakcije na faktor pozitivne ćelije transkripcije. Ekspresija OCT4 faktora transkripcije, Nanog i SOX2 je jako povećana i stabilizovana u tretiranim ćelijama na način koji je zavisio do doze i vremena.

Slika 11: Pospešena indukcija pluripotentnih marker gena posle tretiranja sa C13H8N4OS CCD1079SK fibroblasti su ili mock elektroporirane (elektroporacija bez DNK) ili elektroporirrane sa IVT RNK kodiranjem za luciferazu svica (1 µg), eGFP (1,25 µg), SV40 Large T (1,25 µg), HPV16-E6 (1,25 µg), OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG i LIN28 (2,5 µg OCT4 i jednakim molarnim količinama za druge). Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za CCD. Ćelije su raspoređene na ploče sa 6 pregrada u gustini od 250000 ćelija/pregradi i ostavljene bilo netretirane ili inkubirane sa 2 µM C13H8N4OS kao što je navedeno. 72 časa posle elektroporacije ćelije su prikupljene da se ekstrahuje ukupna RNK i izvede qRT-PCR analiza za markere pluripotencije (A) GDF3 i (B) hTERT. GDF3 i hTERT indukcija je povećana terapijom 72 časa posle elektroporacije.

Slika 12: Stabilizacija IVT-RNK konstrukata pod inhibicijom PKR

(A) CCD1079SK fibroblasti su bili ili mock elektroporisani ili elektroporisani sa IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca (1 µg), eGFP (1,25 µg), SV40 velika T (1,25 µg), HPV16-E6 (1,25 µg), OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG i LIN28 (2,5 µg OCT4 i jednakim molarnim količinama za druge). Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za CCD. Posle elektroporacije ćelije su ili ostavljene netretirane ili inkubirane sa 2 µM C13H8N4OS tokom 24 časa ili 48 časova. Posle 72 časa ćelije su prikupljene da se ekstrahuje ukupna RNK i izvede qRT-PCR analiza za kodon optimizovane IVT-RNK konstrukte OCT4 i SOX2. (B) Da se odredi da li C13H8N4OS ima dejstvo na in vivo poluživot IVT-RNK, CCD1079SK fibroblasti su mock elektroporisani ili elektroporisani sa IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca (1 µg), SV40 velika T (1,25 µg), pospešen GFP (1,25 µg), E3 (3 µg) i K3 (3 µg) uz dodavanje IVT-RNK kodiranje za OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (svaka 2,5 µg) ili dodavanje eGFP (10 µg) kao kontrola. Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za CCD. 250.000 ćelija/pregradi su postavljene u ploče sa 6 pregrada i ili ostavljene netretirane ili inkubirane sa 2 µM C13H8N4OS tokom 80 časova. Posle 8 časova, 32 časa, 56 časova, 80 časova ćelije su prikupljene da se ekstrahuje ukupna RNK i izvede qRT-PCR analiza za kodon optimizovane IVT-RNK konstrukte OCT4, SOX2, KLF4 i cMYC. Truljenje transkripta je šematski prikazano u vremenu i razlika između poluživota (t1/2) konstrukta u odsustvu ili prisustvu C13H8N4OS je izračunata (∆t1/2= t1/2<(+C>13<H>8<N>4<OS) - t>1/2<(-C>13<H>8<N>4<OS)). Prelazno tretiranje ćelija sa 2 µM C>13<H>8<N>4<OS je povećalo>obilje IVT RNK tokom 72 časa (A). Poluživot IVT RNK konstrukata je produžen tokom 1-2,5 časa pod PKR-inhibicijom (B). Stabilizacija ekspresije reportera pod PKR-inhibicijom je samim tim u nekoj mei zasnovana na stabilizaciji IVT- RNK konstrukata.

Slika 13: Izlučivanje interferona posle elektroporacije IVT-RNK i pod dejstvom C13H8N4OS Primarni ljudski fibroblasti prepucijuma (HFF) su elektroporisani sa IVT RNK kodiranjem eGFP (10 µg) bilo nemodifikovanog ili modifikovanog (mod.) sa 5-metilcitidinom (5 mC) u pseudouridinom (PU) ili nemodifikovanom eGFP (10 µg) i sa 3 µg modifikovanog (5 mC i PU) E3 i K3 kako je navedeno. IVT-RNK indukuje izlučivanje IFNβ posle elektroporacije. Ovo izlučivanje je značajno pospešeno kada su ćelije inkubirane sa C13H8N4OS. Indukcija IFNβ je smanjena kada je IVT-RNK modifikovan sa 5mC i PU.

Slika 14: PKR obaranje vodi stabilizaciji ekspresije transkripta slično PKR inhibiciji

(A) Primarni fibroblasti ljudskog prepucijuma (CCD1079Sk) su elektroporisani sa povaćanjem količine siRNK- mešavine ciljanjem PKR (Santa Cruz; sc-36263) u opsegu od 20 nM do 80 nM. Nivo ekspresije PKR je procenjen pomoću qRT-PCR. Prikazane su relativni nivoi ekspresije u poređenju sa ćelijama divljeg tipa. PKR je oboren na 5-10% uz sve koncentracije siRNK-mešavine 24 časa posle elektroporacije. Samo 80 nM su dovoljno da se smanji PKR tokom 48 časa.

(B) Primarni ljudski fibroblasti prepucijuma (CCD1079Sk) su elektroporisani sa IVT RNK kodiranjem nemodifikovanog eGFP (1,5 µg) bilo sami ili uz povećanje količine siRNK-mešavine ciljanjem PKR u opsegu od 20 nM do 80 nM. Nivo ekspresije IFN-odgovora gena OAS1 i OAS2 je procenjen pomoću qRT-PCR. Prikazani su relativni nivoi ekspresije u poređenju sa ćelijama divljeg tipa. Nivoi ekspresije OAS1 i OAS2 nisu značajno promenjeni dodavanjem siRNK-mešavine koja označava da siRNK ne indukuje IFN posle elektroporacije.

(C) Primarni ljudski fibroblasti prepucijuma (CCD1079Sk) su elektroporisani sa ili bez 80 nM siRNK mešavine ciljanjem PKR i 48 časova kasnije sa 1 µg IVT RNK koja kodira luciferazu svica i eGFP (2,5 µg). Ćelije su ostavljene bilo netretirane ili inkubirane sa 2 µM C13H8N4OS Aktivnost luciferaze je izmerena u navedenim vremenskim tačkama. Elektroporacija ćelija prethodno inkubiranih sa siRNK ciljajućim PKR i samim tim je u stanju nedovoljne PKR vodi potpuno sličnom kinetičkom i povećanju ekspresije gena reportera kao inkubacije a 2 µM PKR-inhibitora C13H8N4OS sa blago nižim stabilizujućim efektom. Kombinacija preinkubacije sa siRNK- mešavinom ciljanjem PKR i upotreba inhibitora vodi čak višem nivou ekspresije transkripta reportera.

Slika 15: Dejstvo C13H8N4OS na translaciju IVT RNK korišćenjem lipofekcije

1,2 µg 5’-trifosforilisane i nemodifikovane IVT RNK (0,8 µg kodirajuće luciferaze, 0,4 µg GFP) je spakovana sa 6 µl RNAiMAX reagensom transfekcije (Invitrogen) i transfektovane su u ljudske fibroblaste prepucijuma i srednje suplementirani sa povećanjem koncentracija C13H8N4OS. U naznačenim vremenskim tačkama te ćelije su lizovane i izmerena je aktivnost luciferaze lizata. C13H8N4OS je imao stabilizuće dejstvo na translaciju luciferaze. Ovaj efekat je bio zavisan od doze.

Slika 16: Dejstvo 2-aminopurina na ekspresiju luciferaze

Ljudski fibroblasti prepucijuma su elektroporisani sa 2 µg IVT RNK kodiranjem za luciferazu prepucijuma i 5 µg IVT RNK kodiranjem za GFP i inkubirani sa koncentracijama 2-AP navedenim na legendi panela.10 mM do 20 mM 2- AP vodi sličnom povećanju translacije kao 2 µM C13H8N4OS.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0040] Iako je ovaj pronalazak detaljno opisan dole u tekstu, treba razumeti da se ovaj opis kao takav ne ograničava na određene metodologije, protokole i reagense opisane ovde jer oni mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisa određenih izvođenja, i nije predviđeno da ograniči obim ovog pronalaska koji će biti ograničen samo pomoću priloženih patentnih zahteva. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju ista značenja kako ih najčešće razume prosečan stručnjak u ovoj oblasti.

[0041] U nastavku će biti opisani elementi ovog opisa. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim izvođenjima, međutim, treba razumeti da mogu biti kombinovani na bilo koji način i u bilo kom broju da se kreiraju dodatna izvođenja. Različito opisane primere i preporučena izvođenja ne treba tumačiti da ograničavaju ovaj pronalazak na samo ekspilicitno opisana izvođenja. Ovaj opis treba razumeti da podržava i obuhvata izvođenja koja kombinuju ekscplicitno opisana izvođenja sa bilo kojim brojem opisanih i/ili preporučenih izvođenja. Pored toga, bilo kakve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati opisanim u opisu ovog objašnjenja osim ako kontekst ne ukazuje da je drugačije. Na primer, ako u preporučenom izvođenju RNK obuhvata poli(A)-rep koji obuhvata 120 nukleotide i u drugom preporučenom izvođenju RNK molekul obuhvata 5’-cap analog, zatim u nekom preporučenom izvođenju, RNK obuhvata poli(A)-rep koji se sastoji od 120 nukleotida i 5’-cap analoga.

[0042] Preporučljivo, ovde korišćeni pojmovi se definišu kako je opisano u "A višejezičkom glosaru biotehnoloških pojmova: (IUPAC preporuke)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).

[0043] Prime ovog pronalaska koristi, osim ako nije drugačije navedeno, uobičajene postupke iz hemije, biohemije, i rekombinantnih DNK tehnika koje su objašnjene u literaturi u ovoj oblasti (cf.,npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0044] U celom ovom spisu i patentnim zahtevima u nastavku, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč "obuhvatiti", i varijacije kao što je "obuhvata" i "obuhvatanje", treba razumeti da ukazuje na inkluziju navedenog člana, celog broja ili korak ili grupe članova, celih brojeva ili koraka ali ne isključuje ni jedan drugi član, celi broj ili korak ili grupe članova, celih brojeva ili koraka iako neka izvođenja kao što je drugi član, celi broj ili korak ili grupa članova, celih brojeva ili koraka može biti isključena, t.j. predmet se sastoji u uključivanju navedenog broja, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Pojmove neodređenog ili određenog člana ("a" i "an" i "the") i slične reference korišćeni u kontekstu opisa ovog pronalaska (posebno u kontekstu patentnih zahteva) treba tumačiti da obuhvataju i jedninu i množinu, osim ako nije drugačije navedeno ovde ili jasno kontradiktovano kontekstom. Navođenje opsega vrednosti ovde je prosto predviđeno da služi kao stenogramski metod upućivanja pojedinačno na svaku posebnu vrednost koja spada u taj opseg. Osim ako nije drugačije navedeno, svaka pojedinačna vrednost je obuhvaćena u specifikaciju kao da je bila pojedinačno navedena ovde. Svi ovde opisani postupci mogu biti izvedeni bilo kojim pogodnim redosledom osim ako nije drugačije navedeno ovde ili drugračije jasno kontraindikovano kontekstom. Upotreba bilo kog ili svih primera, ili jezika primera (npr., ''kao što je''), ovde dato je predviđena samo da bolje ilustruje ovaj pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima ovog pronalaska kada se drugačije traži zaštita. Nijedan jezički pojam u ovom spisu ne treba tumačiti tako da označava na bilo koji element za koji se zaštita traži patentom ključan za praktikovanje ovog pronalaska.

[0045] Pojmovi kao što je "redukovanje" ili "inhibiranje" se odnose na sposobnost da se prouzrokuje ukupno smanjenje, preporučljivo od 5% ili veće, 10% ili veće, 20% ili veće, još preporučljivije od 50% ili veće, i još preporučljivije od 75% ili veće, u tom niovu. Pojam "inhibirati" ili slične fraze obuhvataju potpunu ili u suštini potpunu inhibiciju, t.j. smanjenje na nulu ili u suštini na nulu.

[0046] Pojmovi kao što je "povećanje", "pospešivanje", ili "produžavanje" se preporučljivo odnose na povećanje, pospešivanje ili produženje za oko barem 10%, preporučljivo barem 20%, preporučljivo barem 30%, preporučljivo barem 40%, preporučljivo barem 50%, preporučljivo barem 80%, preporučljivo barem 100%, preporučljivo barem 200% i posebno barem 300%. Ovi pojmovi mogu takođe da se odnose na povećanje, pospešivanje, ili produženje od nule do nemerljivog ili nedetektibilnog nivoa do nivoa od više od nule ili nivoa koji je merljiv ili detektibilan.

[0047] Pojam "rekombinantni" u kontekstu ovog pronalaska znači "napravljen kroz genetski inženjering". Preporučljivo, "rekombinantni entitet" kao što je rekombinantni protein u kontekstu ovog pronalaska se ne javlja prirodno i preporučljivo kao rezultat kombinacije entiteta kao što su sekvence amino kiseline ili sekvence nukleinske kiseline koje se ne kombinuju u prirodi. Na primer, rekombinannti protein u kontekstu ovog pronalaska može da obuhvata više sekvenci amino kiselina izvedenih iz različitih proteina spojenih zajedno, npr., peptidnim vezama.

[0048] Pojam "prirodno se javlja" kako se ovde koristi se odnosi na činjenicu da predmet može biti pronađen u prirodi. Na primer, protein ili nukleinska kiselina koji je prisutan u organizmu (uključujući viruse) i može da bude izolovan iz izvora u prirodi i koji nije namerno modifikovan od strane čoveka u laboratoriji se prirodno javlja.

[0049] Nukleinska kiselina je prema objašnjenju preporučljivo deoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (mRNK), još preporučljivije RNK) najpreporučljivije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK). Nukleinske kiseline obuhvataju prema ovom pronalasku genomsku DNK, kDNK, iRNK, rekombinantno proizvedene i hemijski sintetisane molekule. Prema ovom objašnjenju, nukleinska kiselina može da bude prisutna kao jednolančani ili dvolančani i linearni ili kovalentno cirkularno zatvoren molekul . Nukleinska kiselina može, prema objašnjenju, da bude izolovana. Pojam "izolovana nukleinska kiselina" znači, prema ovom pronalasku, da je nukleinska kiselina (i) pojačana in vitro, na primer preko polimerazne lančane reakcije (PCR), (ii) je proizvedena rekombinantno kloniranjem, (iii) prečišćena je, na primer, cepanjem i odvajanjem gel elektroforezom, ili (iv) je sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Nukleinska može biti korišćena za uvođenje u, t.j. transfekciju, ćelija, posebno, u obliku RNK koja može biti pripremljena putem in vitro transkripcije iz DNK uzorka. RNK može još da bude modifikovana pre primene stabilizovanjem sekvenci, capping, i poliadenilacije.

[0050] Kao nukleinska kiselina, u specifičnoj DNK, za ekspresiju više od jednog peptida ili proteina, bilo tipa nukleinske kiseline u kom su prisutni različiti peptidi ili proteini u različitim molekulima nukleinske kiseline ili može da se koristi tip nukleinske kiseline u kom su prisutni peptidi ili proteini u istom molekulu nukleinske kiseline.

[0051] U kontekstu ovog pronalaska objašnjenje, pojma "RNK" se odnosi na molekul koji obuhvata barem jedan ostatak ribonukleotida i preporučljivo je potpuno ili pretežno sastavljen od ostataka ribonukleotida. ''Ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksil grupom na 2’-pozociji β-D-ribofuranozil grupe. Pojam "RNK" obuhvata dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, u suštini čista RNK, sintetička RNK, i rekombinantno generisana RNK kao što je modifikovana RNK koja se razlikuje od RNK koja se javlja u prirodi dodavanjem, brisanjem i/ili promenom jednog ili više nukleotida. Takve promene mogu da obuhvate dodavanje nenukleotidnog materijala, kao što je na krajeve RNK ili interno, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u RNK molekulima mogu takođe da obuhvate nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili deoksinukleotidi. Ovi promenjeni RNK mogu da se pominju kao analozi ili analozi RNK koja se prirodno pojavljuje.

[0052] Prema ovom objašnjenju, pojam "RNK" obuhvata i preporučljivo se odnosi na "iRNK". Pojam "iRNK" se odnosi na "informacionu-RNK" i odnosi se na "transkript" koji se generiše korišćenjem DNK uzorka i kodira peptid i protein. Najčešće, iRNK. obuhvata 5’-UTR, protein kodirajući region, i 3’-UTR. iRNK samo poseduje ograničeni poluživot u ćelijama i poseduje tako ograničen poluživot u ćelijama i in vitro. U kontekstu ovog pronalaska, iRNK moguće je generisati putem in vitro transkripcije iz DNK uzorka. Metodologija in vitro transkripcije je poznata stručnjaku. Na primer, postoji veliki broj in vitro transkripcionih kompleta koji su komercijalno dostupni.

[0053] Prema ovom objašnjenju, stabilnost i efikasnost translacije RNK moguće je modifikovati kako je neophodno. Na primer, RNK moguće je stabilizovati i njenu translaciju povećati za jednu ili više modifikacija koje imaju stabilizujuća dejstva i/ili povećanje efikasnosti translacije RNK. Takve modifikacije su opisane, na primer, u PCT/EP2006/009448 (WO2007/036366). Da bi se povećala ekspresija RNK korišćene prema ovom objašnjenju, moguće ju je modifikovati u okviru regiona kodiranja, t.j. kodiranje sekvencom izraženog peptida ili proteina, preporučljivo bez promene sekvence izraženog peptida il proteina, tako da se poveća GC sadržaj da se poveća iRNK stabilnost i da se izvede optimizacija kodona i, tako, da se pospeši translacija ćelija.

[0054] Pojam "modifikacija" u kontekstu RNK korišćen za ovaj opis obuhvata modifikaciju RNK koja nije prirodno prisutna u pomenutoj RNK.

[0055] U jednom izvođenju, RNK koja se koristi prema ovom pronalasku nema uncapped 5’-trifosfate. Uklanjanje takvih uncapped 5’-trifosfata moguće je postići tretiranjem RNK sa fosfatazom.

[0056] RNK mogu da modifikuju ribonukleotide kako bi se povećala njena stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost. Na primer, u jednom izvođenju, u RNK korišćenoj prema ovom pronalasku 5-metilcitidin se supstituiše delimično ili potpuno, preporučljivo potpuno, za citidin. Alternativno ili dodatno, u jednom izvođenju, za RNK korišćenu prema ovom pronalasku pseudouridin je supstituisan delimično ili potpuno, preporučljivo potpuno za uridin.

[0057] U jednom izvođenju, pojam "modifikacija" se odnosi na obezbeđivanje RNK sa 5’-cap ili 5’-cap analogom. Pojam "5’-cap" se odnosi na cap strukturu koja se nalazi na 5’-kraju iRNK molekula i generalno se sastoji od nukleotida guanozina spojenog na iRNK preko neuobičajene 5’ do 5’ trifosfatne veze. U jednom izvođenju, ovaj guanozin je metilisan na 7-poziciji. Pojam "uobičajeni 5’-kamp" se odnosi na prirodno postojeću RNK 5’-camp, preporučljivo na 7-metilguanozin cap (m<7>G). U kontekstu ovog pronalaska, pojam "5’-cap" obuhvata 5’-cap analog koji je sličan RNK cap strukturi i modifikovan je da poseduje sposobnost da stabilizuje RNK i/ili pospeši translaciju RNK ako je spojen na nju, preporučljivo in vivo i/ili u nekoj ćeliji.

[0058] Preporučljivo, 5’ kraj RNK obuhvata Cap strukturu koja ima sledeću opštu formulu:

pri čemu su R1 iR2nezavisno hidroksi ili metoksi i W-, X<->i Y<->su nezavisno kiseonik, sumpor, selen, ili BH3. U preporučenom izvođenju, R1i R2su hidroksi i W-, X<->i Y<->su kiseonik. U još jednom preporučenom izvođenju, jedan od R1i R2, preporučljivo R1je hidroksi i drugi je metoksi i W-, X<->i Y<->su kiseonik. U još jednom preporučenom izvođenju, R1i R2su hidroksi i jedan od W-, X<->i Y-, preporučljivo X<->je sumpor, selen, ili BH3, preporučljivo sumpor, dok je drugi kiseonik. U još jednom preporučenom izvođenju R1 iR2, preporučljivo R2je hidroksi i drugi je metoksi i jedan od W-, X<->i Y-, preporučljivo X<->je sumpor, selen, ili BH3, preporučljivo sumpor dok je drugi kiseonik.

[0059] U gornjoj formuli, nukleotid na desnoj strani je spojen na RNK lanac kroz svoju 3’ grupu.

[0060] Te Cap strukture pri čemu je barem jedna od njih W-, X<->i Y<->je sumpor, t.j. koji ima fosforotioatni deo, postoje u različitim diastereoizomernim oblicima od kojih su svi ovde obuhvaćeni. Pored toga, ovaj pronalazak obuhvata sve tautomere i stereoizomere iz gornje formule.

[0061] Na primer, Cap struktu 2ra koja ima gornju strukturu pri čemu R1jeste metoksi, R2je hidroksi, X-je sumpor i W<->i Y<->su kiseonik postoje u dva diastereoizomerna oblika (Rp i Sp). Oni mogu biti rešeni reverznom fazom HPLC i nazivaju se D1 i D2 prema njihovom redosledu eluacije iz reverzne faze HPLC kolone. U skladu sa ovim pronalaskom, D1 izomer m<7,2’-0>GnpspG je posebno preporučen.

[0062] Obezbeđivanje RNK sa 5’-cap ili 5’-cap analogom moguće je postići in vitro transkripcijom DNK uzorka u prisustvu pomenutog 5’-cap ili 5’-cap analoga, pri čemu je pomenuti 5’-cap kontranskripciono inkorporiran u generisani RNK lanac, ili RNK može biti generisana, na primer, pomoću in vitro transkripcije, i 5’-cap može biti spojen na RNK posttranskripciono korišćenjem capping enzima, na primer, capping enzima virusa vaccinia.

[0063] RNK može da obuhvati još modifikacija. Na primer, dodatna RNK modifikacija može biti produžetak ili zarubljenost prirodno postojećeg poli(A) repa ili promena 5’- ili 3’-netranslatiranih regiona (UTR) kao što je uvođenje UTR koje nije povezano na regione kodiranja pomenute RNK, na primer, zamena postojećeg 3’-UTR sa ili ubacivanje jedne ili više preporučljivo dve kopije 3’-UTR izvedenog iz globin gena, kao što je alfa2-globin, alfa1-globin, beta-globin, preporučljivo beta-globin, još preporučljivije ljudski beta-globin.

[0064] RNK ima nemaskiranu poli-A sekvencu se prevodi efikasnije od RNK koja ima maskiranu poli-A sekvencu. Pojam "poli(A) rep " ili "poli-A sekvenca" se odnosi na sekvencu ostataka adenila (A) koji se obično nalaze na 3’-kraju RNK molekula i "nemaskiranu poli-A sekvencu" znači da se poli-A sekvenca na 3’ kraju RNK molekula završava sa A sekvence poli-A i da iza nje ne slede nukleotidi koji nisu A smešteni na 3’ kraju, t.j. nizvodno, od sekvence poli-A . Pored toga, duga poli-A sekvenca od oko 120 baznih parova daje kao rezultat optimalnu stabilnost transkripta i efikasnost translacije RNK.

[0065] Samim tim, da bi se povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK korišćene prema ovom objašnjenju, može biti modifikovana tako da je prisutna u vezi sa poli-A sekvencom, preporučljivo dužine od 10 do 500, još preporučljivije 30 do 300, još preporučljivije 65 do 200 i posebno 100 do 150 ostataka adenozina. U posebno preporučenom izvođenju poli-A sekvenca ima dužinu od približno 120 ostataka adenozina. Da bi se još povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK korišćene prema ovom objašnjenju, poli-A sekvenca može da se demaskira.

[0066] Pored toga, inkorporiranje 3’-netranslatiranog regiona (UTR) u 3’-netranslatiran region RNK molekul može kao rezultat dati pospešivanje efikasnosti translacije. Sinergijski efekat može biti ostvaren inkorporiranjem dva ili više takvih 3’-netranslatiranih regiona. 3’-netranslatirana regiona mogu biti autologna ili heterologna za RNK u koji se uvode. U jednom određenom izvođenju 3’-netranslatirani region se izvodi iz ljudskog β-globin gena.

[0067] Kombinacija gore opisanih modifikacija, t.j. inkorporacija poli-A sekvence, demaskiranje poli-A sekvence i inkorporacija jednog ili više 3’-netranslatiranih regiona, ima singerijski uticaj na stabilnost RNK i povećanje efikasnosti translacije.

[0068] Pojam "stabilnost" RNK se odnosi na "poluživot" RNK. "Poluživot" se odnosi na period vremena koji je potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količina, i broj molekula. U kontekstu ovog pronalaska, poluživot RNK je indikativan za stabilnost RNK. Poluživot RNK može uticati na "trajanje ekspresije" RNK. Može se očekivati da će RNK koja ima dug poluživot biti izražena u dužem vremenskom periodu.

[0069] Naravno, ako u skladu sa ovim pronalaskom želi da se smanji stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK, moguće je modifikovati RNK tako da se meša sa funkcijom elemenata kako je opisano gore povećanjem stabilnosti i/ili efikasnosti translacije RNK.

[0070] Pojam "ekspresija" se koristi u svom najopštijem značenju i obuhvata proizvodnju RNK i/ili peptida ili proteina, npr. transkripcijom i/ili translacijom. U vezi sa RNK, pojam "ekspresija" ili "translacija" se odnosi posebno na proizvodnju peptida ili proteina. On takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija može biti tranzijentna ili stabilna.

[0071] Prema ovom objašnjenju, pojmovi kao što je "RNK ekspresija", "izražavanje RNK", ili "ekspresija RNK" se odnose na proizvodnju peptida ili proteina kodiranog pomoću RNK. Preporučljivo, takvi pojmovi se odnose na translaciju RNK kao što je da izrazi, t.j. proizvede peptid ili protein kodiran pomoću RNK.

[0072] U kontekstu ovog objašnjenja, pojam "transkripcija" se odnosi na proces, pri čemu se genetski kod u DNK sekvenci transkribuje u RNK. Naknadno, RNK može da se translatira u protein. U skladu sa ovim pronalaskom, pojam "transkripcija" obuhvata "in vitro transkripciju", pri čemu se taj pojam "in vitro transkripcija" odnosi na proces pri čemu RNK, posebno iRNK, jeste in vitro sintetisana u sistemu bez ćelije, preporučljivo korišćenjem odgovarajućih ekstrakata ćelije. Preporučljivo, klonirajući vektori se primenjuju za generisanje transkripata. Ovi klonirajući vektori su generalno naznačeni kao vektori transkripcije i u skladu sa ovim pronalaskom su obuhvaćeni pojmom ''vektor''. U skladu sa ovim objašnjenjem, RNK korišćena u ovom objašnjenju je preporučljivo in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) i može se dobiti in vitro transkripcijom odgovarajućeg DNK šablona. Promoter za regulisanje transkripcije može biti bilo koji promoter za bilo koju RNK polimerazu. Određeni primeri RNK polimeraza su T7, T3, i SP6 RNK polimeraze. Preporučljivo, in vitro transkripcija u skladu sa ovim pronalaskom se reguliše pomoću T7 ili SP6 promotera. DNK uzorak za in vitro transkripciju moguće je dobiti kloniranjem nukleinske kiseline, posebno kDNK, i njeno uvođenje u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. DNK je moguće dobiti reverznom transkripcijom RNK.

[0073] kDNK koja obuhvata šablon vektora može obuhvatiti vektore koji nose različite kDNK umetke koji posle rezultata transkripcije u populaciji različitih RNK molekula opciono mogu da ispolje različite peptide ili proteine ili mogu obuhvatiti vektore koji nos esamo jednu vrstu kDNK umetka koji posle transkripcije daje kao rezultat samo populaciju jedne RNK vrste koja može da ispoljava samo jedan peptid ili protein. Dakle, moguće je proizvesti RNK sposobnu da ispoljava samo jedan peptid ili protein ili da proizvodi supstance različitih RNK kao što su RNK biblioteke i RNK cele ćelije koja može da ispoljava više od jednog peptida ili proteina, npr. mešavina peptida ili proteina. Ovaj opis predviđa uvođenje cele takve RNK u ćelije.

[0074] Pojam "translacija" kako se ovde koristi se odnosi na proces u ribozomima ćelije po kojoj lanac informacione RNK usmerava sklop sekvence amino kiseline da napravi peptid ili protein.

[0075] Ekspresija kontrolnih sekvenci ili regulatornih sekvenci, što prema objašnjenju može da bude povezano funkcionalno sa nukleinskom kiselinom, može biti homologno ili heterologno u vezi sa nukleinskom kiselinom. Kodirajuća sekvenca i regulatorna sekvenca su povezane zajedno ''funkcionalno'' ako su vezane zajedno kovalentno, tako da je transkripcija ili translacija kodirajuće sekvence pod kontrolom ili pod uticajem regulatorne sekvence. Ako kodirajuća sekvenca treba da se prevede u funkcionalni protein, sa funkcionalnom vezom regulatorne sekvence sa kodirajućom sekvencom, uvođenje regulatorne sekvence vodi transkripciji kodirajuće sekvence, a da ne prouzrokuje promeranje okvira učitavanja u kodirajućoj sekvenci ili nemogućnosti prevođenja kodirajuće sekvence u željeni protein ili peptid.

[0076] Pojam "sekvenca kontrole ekspresije" ili "regulatorna sekvenca" obuhvata, prema ovom objašnjenju, promotere, sekvenci koje vezuju ribozom i drugih kontrolnih elemenata, koji kontrolišu transkripciju nukleinske kiseline ili translacije iz izvedene RNK. U izvesnim izvođenjima ovog pronalaska, regulatorne sekvence je moguće kontrolisati. Precizna struktura regulatornih sekvenci može varirati zavisno od vrsta ili zavisno od tipa ćelije, ali generalno obuhvata 5’-netranskribovane i 5’-netranslatirane sekvence i 3’-netranslatirane sekvence, koje su obuhvaćene u pokretanje transkripcije ili translacije, kao što je TATA-kutijama, capping-sekvenca, CAAT-sekvenca i slične. Preciznije, 5’-netranskribovane regulatorne sekvence obuhvataju region promotera koji obuhvata sekvencu promotera za transkripcionu kontrolu funkcionalnosti vezanog gena. Regulatorne sekvence mogu takođe da obuhvataju sekvence pospešivača ili sekvence uzvodnog aktivatora.

[0077] Pojmovi kao što je "pospešivanje ekspresije", "pospešena ekspresija" ili "povećana ekspresija" znače u kontekstu ovog objašnjenja da količina peptida ili proteina ispoljenog datim brojem RNK molekula jeste veća od količine peptida ili proteina ispoljenog pomoću istog broja RNK molekula, pri čemu se ekspresija RNK molekula izvodi pod istim uslovima osim za uslov koji daje kao rezultate pospešenu ili povećanu ekspresiju RNK, kao što je smanjenje aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u ćeliji naspram nesmanjenja aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u ćeliji. U ovom kontekstu, ''isti uslovi'' se odnose na situaciju gde iste RNK sekvence kodiraju isti peptid ili protein se uvode istim sredstvima u iste ćelije, te ćelije se kultivišu pod istim uslovima (izuzev pod uslovom koji daje kao rezutlat pospešenu ili povećanu ekspresiju) i količine peptida ili proteina se mere istim sredstvima. Količina peptida ili proteina može biti data u molima, ili težinom, t.j. u gramima, ili masom ili aktivnošću polipeptida, npr. ako je peptid ili protein enzim može mu biti data katalitička aktivnost ili ako je peptid ili protein antitelo ili antigen ili receptor može mu biti dat afinitet vezivanja. U jednom izvođenju, pojmovi kao što je ''pospešivanje ekspresije'', ''pospešena ekspresija'' ili povećana ekspresija'' znače u kontekstu ovog pronalaska da količina peptida ili proteina izraženog datim brojem RNK molekula i unutar datog perioda vremena jeste veća od količine peptida ili proteina izraženog istim brojem RNK molekula i unutar istog vremenskog perioda. Na primer, maksimalna vrednost peptida ili proteina izraženog datim brojem RNK molekula u određenoj vremenskoj tački može biti veća od maksimalne vrednosti peptida ili proteina izraženog istim brojem RNK molekula. U drugim izvođenjima, maksimalna vrednost peptida ili proteina izraženog datim brojem RNK molekula ne mora da bude veća od maksimalne vrednosti peptida ili proteina izraženog istim brojem RNK molekula. Međutim, prosečna količina peptida ili proteina izraženog datim brojem RNK molekula u datom vremenskom periodu može da bude veća od prosečne količine peptida ili proteina izraženog istim brojem RNK molekula. Ovi poslednji se pominju ovde kao ''visok nivo ekspresije'' ili ''povećani nivo ekspresije'' i odnose se na više maksimalne vrednosti ekspresije i/ili više prosečne vrednosti ekspresije. Alternativno ili dodatno, pojmovi kao što je "pospešivanje ekspresije", "pospešena ekspresija" ili "povećana ekspresija" znače u kontekstu ovog objašnjenja takođe da vreme u kom je peptid ili protein izražen pomoću RNK molekula može biti duže od vremena u kom je peptid ili protein izražen istim RNK molekulima. Zato, u jednom izvođenju, pojmovi kao što je "pospešivanje ekspresije", "pospešena ekspresija" ili "povećana ekspresija" znače u kontekstu ovog objašnjenja takođe da je količina peptida ili proteina izraženog datim brojem RNK molekula veća od broja peptida ili proteina izraženih istim brojem RNK molekula od vremenskog perioda u kom je RNK stabilno prisutna i zražena je duže od vremenskog perioda u kom je isti broj RNK molekula stabilno prisutan i izražen. Ovi slučajevi se pominju i kao "povećano trajanje ekspresije".

[0078] Preporučljivo, takvi duži vremenski periodi se odnose na ekspresiju tokom barem 48 časova, preporučljivo barem 72 časa, još preporučljivije tokom barem 96 časova, preciznije tokom barem 120 časova ili čak duže posle uvođenja RNK ili posle prvog uvođenja (npr. u slučaju ponovljenih transfekcija) RNK u ćeliji.

[0079] Nivo ekspresije i/ili trajanja ekspresije RNK može da se odredi merenjem količine, kao što je ukupna količina izražena i/ili količina izražena u datom vremenskom periodu, i/ili vreme ekspresije peptida ili proteina kodirano RNK, na primer, korišćenjem ELISA postupka, imunohistohemijskog postupka, kvantitativnog postupka analize slike, Vestern blot metode, masene spektrometrije, kvantitativnog imunohistohemijskog postupka, ili enzimskog testa.

[0080] U određenim izvođenjima, RNK u skladu sa ovim objašnjenjem obuhvata populaciju različitih RNK molekula, npr. mešavinu različitih RNK molekula opciono kodiranje različitih peptida i/ili proteina, RNK cele ćelije, RNK biblioteku, ili deo biblioteke, npr. biblioteku RNK molekula izraženih u određenom tipu ćelije, kao što su neizdiferencirane ćelije, posebno matične ćelije kao što su embrionske matične ćelije, ili frakcije biblioteke RNK molekula kao što je RNK sa obogaćenom ekspresijom u nediferenciranim ćelijama, posebno matičnim ćelijama kao što su embrionske matične ćelije u odnosu na diferencirane ćelije. Tako, prema ovom objašnjenju, pojam "RNK" može da obuhvata i mešavinu RNK molekula, RNK cele ćelije ili njene frakcije, koju je moguće dobiti postupkom koji obuhvata izolaciju RNK iz ćelija i/ili rekombinantnim sredstvima, posebno putem in vitro transkripcije.

[0081] Preporučljivo, u skladu sa ovim objašnjenjem, RNK koju treba izraziti u ćeliji se uvodi u pomenutu ćeliju, bilo in vitro ili in vivo, preporučljivo in vitro. RNK može da bude uvedena u ćeliju bilo pre, ili i/ili istovremeno sa smanjenjem aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u toj ćeliji. Preporučljivo, aktivnost od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u toj ćeliji je smanjena dokle god je ekspresija RNK u ćeliji poželjna. U jednom izvođenju postupaka u skladu sa ovim pronalaskom, RNK koju treba uvesti u ćeliju se dobija putem in vitro transkripcije odgovarajućeg DNK šablona.

[0082] RNK korišćena u skladu sa ovim objašnjenjem može imati poznati sastav (u ovom izvođenju to je preporučljivo poznato koji se peptidi ili proteini izražavaju putem RNK) ili sastav RNK može da bude delimično ili potpuno nepoznat. Alternativno, RNK može imati poznatu funkciju ili ta funkcija RNK može biti delimično ili potpuno nepoznata.

[0083] U skladu sa ovim objašnjenjem, pojmovi "RNK sposobna za ekspresiju" i "RNK kodiranje" se koriste ravnopravno ovde i u vezi sa određenim peptidom ili proteinom znače da RNK, ako postoji u odgovarajućem okruženju, preporučljivo unutar ćelije, može da bude izražena da proizvede pomenuti peptid ili protein. Preporučljivo, RNK u skladu sa ovim objašnjenjem može da bude u interakciji sa mašinerijom ćelijske translacije da se obezbedi peptid ili protein koji je sposoban za ekspresiju.

[0084] Preporučljivo, u skladu sa ovim objašnjenjem, RNK je moguće uvesti u ćelije bilo in vitro ili in vivo, preporučljivo in vitro. Te ćelije u koje se uvodi RNK in vitro mogu, preporučljivo posle ekspresije RNK in vitro postupcima iz ovog objašnjenja, da se primene kao lek pacijentu.

[0085] Pojmovi kao što je "transfer", "uvođenje" ili "transfektovanje se koristi" ovde ravnopravno i odnosi se na uvođenje nukleinskih kiselina, posebno eksogenih ili heterolognih nukleinskih kiselina, posebno RNK u ćeliji. U skladu sa ovim opisom, ćelija može biti izolovana ćelija ili može formirati deo organa, tkiva i/ili organizma. Moguće je koristiti bilo koju tehniku koja je pogodna za uvođenje RNK u ćelije. Preporučljivo, RNK se uvodi u ćelije standardnim tehnikama. Takve tehnike obuhvataju transfekciju taloga kalcijum fosfata nukleinske kiseline, transfekciju nukleinskih kiselina koje se povezuju sa DEAE, transfekcija ili infekcija virusima koji nose nukleinske kiseline od interesa, elektroporaciju, lipofekcija, i mikroinjekcija. U skladu sa ovim objašnjenjem, primena nukleinske kiseline je bilo dostignuta kao gola nukleinska kiselina ili u kombinaciji sa reagensom primene leka. Preporučljivo, primena nukleinskih kiselina je u obliku golih nukleinskih kiselina. Preporučljivo, ta RNK se primenjuje kao lek u kombinaciji sa stabilišućim supstancama kao što su inhibitori RNaze. Ovo objašnjenje takođe predviđa ponovoljeno uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije da se dozvoli zadržana ekspresija tokom produženih vremenskih perioda.

[0086] Ćelije je moguće transfektovati, na primer, korišćenjem komercijalno dostupnih kompleta za transfekciju na bazi lipozoma kao što je Lipofektamin™ (Invitrogen) i moguće ih je transfektovati sa bilo kojim nosiocima sa kojima je RNK moguće povezati, npr. formiranjem kompleksa sa RNK ili formiranjem vezikula u kojima je RNK obuhvaćena ili stavljena u kapsule, što kao rezultat daje povećanu stabilnost RNK u poređenju sa golom RNK. Nosači korisni u skladu sa ovim objašnjenjem obuhvataju, na primer, nosače koji sadrže lipid kakvi su katjonski lipidi, lipozomi, posebno katjonske lipozome, i površinski aktivne materije (micele). Katjonski lipidi mogu da formiraju komplekse sa negativno naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Bilo koji katjonski lipid moguće je koristiti u skladu sa ovim objašnjenjem.

[0087] Preporučljivo, uvođenje RNK koja kodira peptid ili protein u ćeliju daje kao rezultat ekspresiju pomenutog peptida ili proteina u toj ćeliji. Kod određenih izvođenja, preporučuje se ciljanje nukleinskih kiselina u određenim ćelijama. U takvim izvođenjima, nosač koji se primenjuje za primenu nukleinske kiselien u neku ćeliju (na primer, retrovirus ili lipozom), ispoljava ciljajući molekul. Na primer, molekul kao što je antitelo koje je specifično za protein površinske membrane na ciljnoj ćeliji ili ligandu za receptor na ciljnoj ćeliji može biti inkorporiran u nosač nukleinske kiselien ili može biti vezan na njega. U slučaju da se nukleinska kiselina primenjuje pomoću lipozoma, proteini koji se vezuju na protein površinske membrane koji se povezuje sa endocitozom može biti inkorporiran u formulaciju lipozoma kako bi se omogućilo ciljanje i/ili apsorpcija. Takvi proteini obuhvataju proteini kapsida njegovih fragmenata koje su specifične za određeni tip ćelije, antitela protiv proteina koja se internalizuju, proteini kojima su cilj unutarćelijske lokacije itd.

[0088] Elektroporacija ili elektropermeabilizacija se odnosi na značajno povećanje u električnoj provodljivosti i propusnosti (prožimanju) plazma membrane ćelije prouzrokovane spolja nanetim električnim poljem. Obično se koristi u molekularnoj biologiji kao način uvođenja neke supstance u ćeliju. Elektroporacija se obično radi sa elektroporatorima, urađejima koji stvaraju elektromagnetno polje u rastvoru ćelije. Suspenzija ćelije se pipetom ukaplje u staklenu ili plastičnu kivetu koja ima dve aluminijumske elektrode na svojim stranama. Za elektroporaciju, obično s ekoristi suspenzija ćelije od oko 50 mikrolitara. Pre elektroporacije se meša sa nukleinskom kiselinom koju treba transfektovati. Mešavina se pipetom ukaplje u kivetu, napon i električni kapacitet se podese i kiveta se ubaci u elektroporator. Preporučljivo, tečni medijum se dodaje odmah posle elektroporacije (u kiveti ili u Ependorf cevi), i ta cev se inkubira na optimalnoj temperaturi za ćelije tokom jedan sat ili više da se dozvoli oporavak ćelija i opciono ekspresija antibiotske otpornosti.

[0089] U skladu sa ovim objašnjenjem preporučuje se da nukleinska kiselina kao što je RNK kodira peptid ili protein jednom kada se apsorbuje ili uvede u ćeliju čija ćelija može biti prisutna in vitro ili u pacijentu što kao rezultat daje ekspresiju pomenutog peptida ili proteina. Ova ćelija može izraziti kodirani peptid ili protein unutarćelijski, može izlučiti kodirani peptid ili protein, ili ga može izraziti na površini.

[0090] Ako se u skladu sa objašnjenjem RNK sposobnim da izrazi izvesne činioce za reprogramiranje somatskih ćelija uvodi u somatske ćelije, preproučuje se da ovo uvođenje RNK daje kao rezultat ekspresiju pomenutih faktora za izvestan vremenski period da se završi proces reprogramiranja i za razvoj ćelija koje imaju karakteristike matičnih ćelija. Preporučljivo, uvođenje RNK sposobne za ekspresiju izvesnih činilaca kako su ovde opisani u somatske ćelije daje kao rezutlat ekspresiju pomenutih faktora za produženi period vremena, preporučljivo za barem 10 dana, preporučljivo za barem 11 dana i još preporučljivije za barem 12 dana. Da bi se postigla takva dugoročna ekspresija, RNK se preporučljivo periodično uvodi u ćelije više nego jednom, preporučljivo korišćenjem elektroporacije. Preporučljivo, RNK se uvodi u ćelije barem dvaput, još preporučljivije barem 3 puta, još preporučljivije barem 4 puta, i još preporučljivije barem 5 puta do preporučljivije 6 puta, još preporučljivije i do 7 puta ili čak još preporučljivije 8,9 ili 10 puta, još preporučljvije tokom vremenskog perioda od barem 10 dana, preporučljivije tokom barem 11 dana i još preporučljivije tokom barem 12 dana da se osigura ekspresija jednog ili više činilaca tokom produženog vremenskog perioda. Preporučljivo, vremenski periodi koji ističu između ponovljenih uvođenja RNK su od 24 časa do 120 časova, preporučljivo 48 časova do 96 časova. U jednom izvođenju, vremenski periodi koji prolaze između ponovljenih uvođenja RNK nisu duži od 72 časa, preporučljivo nisu duži od 48 časova ili 36 časova. U jednom izvođenju, pre sledeće elektroporacije, ćelije su ostavljene da se oporave od prethodne elektroporacije. U ovom izvođenju, vremenski periodi koji ističu između ponovljenih uvođenja RNK su barem 72 časa, preporučljivo barem 96 časova, još preporučljivije barem 120 časova. U svakom slučaju, uslove treba izabrati tako da se frakcije izražene u ćelijama u količinama i tokom perioda vremena koji podržavaju proces reprogramiranja.

[0091] Preporučljivo barem 1 µg, preporučljivo barem 1,25 µg, još preporučljivije barem 1,5 µg i preporučljivo do 20 µg, još preporučljivije i do 15 µg, još preporučljivije i do 10 µg, još preporučljivije i do 5 µg, preporučljivo 1 do 10 µg, čak preporučljivije 1 do 5 µg, ili 1 do 2,5 µg RNK za svaki peptid, protein ili faktor se koristi po elektroporaciji.

[0092] Preporučljivo, ako dođe do gubitka održivosti ćelija ponovljenim elektroporacijama, prethodno neelektroporisane ćelije su dodate kao ćelije nosači. Preporučljivo, prethodno neelektroporisane ćelije se dodaju pre, tokom ili posle jedne ili više 4. i naknadne, preporučljivo, 5. i naknadnih elektroporacija kao što je pre, tokom ili posle 4. i 6. elektroporacije. Preporučljivo, prethodno neelektroporisane ćelije se dodaju pre, tokom ili posle 4. ili 5. i svake naknadne elektroporacije Preporučljivo, prethodno neelektroporisane ćelije su iste ćelije kao one u koje se uvodi RNK.

[0093] RNK vezujući protein RNK zavisne kinaze proteina (Kinaza proteina aktivirana sa RNK, PKR) vezuje RNK na način koji zavisi od dužine. PKR je interferonom indukovan serin/treonin kinaza proteina početno identifikovana u viralnom odgovoru pomoću svog vezivanja i aktivacije ekstenzivnom sekundarnom strukturom formiranom viralnim RNK sekvencama. Ljudski PKR je 68 kDa sa oko 20 kDa N-terminalnim domenom dsRNK vezivanja i domenom C terminalne kinaze proteina. In vitro PKR se aktivira vezvanjem na RNK molekule sa produženom dupleks sekundarnom strukturom. Veruje se da se In vivo enzim aktivira pomoću viralne dvolančane RNK (dsRNK) ili viralne replikativne intermedijare koji obuhvataju dsRNK. Vezivanje na dvolančanu RNK na PKR prouzrokuje konformacionu promenu u enzimu koji menja mesto vezivanja na ATP u domen kinaze i vodi autofosforilaciji na višestrukim ostacima serina i treonina u celoj PKR sekvenci. RNK stimulisana autofosforilacija povećava osetljivost ćelije na apoptotske i proinflamatorne stimulanse kroz izvestan broj navodnih putanja, uključujući fosforilaciju svog poznatog faktora 2 eukariotske inicijacije supstrata (elF2a).

[0094] Pojam "PKR" se preporučljivo odnosi na ljudsku PKR, i, posebno, na protein koji obuhvata sekvencu amino kiseline u skladu sa SEK ID BR: 13 sa spiska sekvene ili varijantu pomenute sekvence amino kiseline. U jednom izvođenju, pojam "PKR" se odnosi na protein koji obuhvata sekvencu amino kiselien kodiranu sekvencom nukleinske kiseline u skladu sa SEK ID BR: 32. Pojam "PKR" obuhvata bilo koje varijante, posebno mutante, varijante spajanja (splajs), konformacije, izoforme, alelene varijante , varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koji su prirodno prisutni. Alelna varijanta se odnosi na promenu u normalnu sekvencu gena, čiji je značaj često nejasan. Potpuno sekvenciranje gena često prepoznaje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrsta je nukleinska kiselina ili sekvenca amino kiseline čija su porekla različite vrste od date sekvence nukleinske kiseline ili amino kiseline. Stručnjak u ovoj oblasti razume da bi kDNK sekvenca PKR kako je gore opisano bila ekvivalentna PKR iRNK, i može se koristiti za generisanje inhibitornih nukleinskih kiselina protiv PKR.

[0095] Aktivnost kinaze proteina uključujući autofosforilaciju kinaze proteina moguće je izmeriti različitim tehnikama poznatim stručnjaku u ovoj oblasti. Jedan postupak obuhvata separaciju nedostignute ATP iz fosforilisanog supstrata kinaze putem npr. taloženjem fosfoproteina na celulozne trake putem trihlorosirćetne kiseline posle čega sledi pranje, ili adsorpcija fosfoproteina na trake fosfoceluloze. Na primer, defosfoPKR moguće je aktivirati inkubacijom sa poli[I:C] i autofosforilaciju je moguće ostaviti da se odvija u prisustvuo [γ-32P]ATP. Sposobnost jedinjenja da blokira ovu RNK indukovanu PKR autofosforilaciju može da se terstira. Još jedan postupak obuhvata detekciju i kvantifikaciju fosfo-PKR u odnosu na ukupnu količinu PKR u istom lizatu ćelija Vestern blotingom sa antitelima specifičnim za fosfo PKR ili PKR pune dužine. Još jedan postupak obuhvata detekciju i kvantifikaciju fosforilisanog supstrata PKR, npr. fosfo-eIF2α u odnosu na ukupnu količinu eIF2α u istom lizatu ćelija putem Vestern blotinga sa antitelima specifičnim za fosfo-eIF2α ili punu dužinu eIF2α.

[0096] Mehanizmi virusne odbrane protiv PKR funkcije npr. putem navodne dsRNK (adenovirus VAI RNK; Epštajn-Barov (Epstein- Barr) virus EBER; HIV TAR), PKR degradacija (poliovirus 2A<pro>), skrivanje virusne dsRNK (E3L virus vaccinia; sigma3 reovirus; virus NS1 influence), blokirajuća dimerizacija (p58<IPK>virus influence; NS5A virus hepatitisa C), pseudosupstrati (K3L virus vaccinia; HIV Tat) ili defosforilacija supstrata ( ICP34.5 virus herpes simpleksa).

[0097] Navodna RNK je pseudosupstrat RNK koji ima sličnu strukturu RNK supstratu enzima, da bi se naterao taj enzim da se veže na pseudosupstrat a ne na stvarni supstrat, tako se blokira aktivnost tog enzima.

[0098] Prema ovom objašnjenju, pojam "smanjenje aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR)" se odnosi na mere koje daju kao rezultat niži stepen homodimerizacije PKR, u nižoj meri od autofosforilacije PKR i/ili u manjem stepenu fosforilacije ciljeva koji su supstrati kinaze PKR kao što je eIF2a u poređenju sa normalnom situacijom, specifično normalnom situacijom u ćeliji, pri čemu aktivnost PKR nije smanjena/se ne smanjuje intervencijom čoveka. Preporučljivo, pomenuti pojam obuhvata sve mere koje daju kao rezultat niže stepene autofosforilacije PKR i/ili u nižem stepenu fosforilaciju ciljeva koji su supstrati kinaze PKR.

[0099] U skladu sa ovim objašnjenjem, predviđa se da se smanji aktivnost PKR u ćeliji in vitro ili in vivo, preporučljivo in vitro. Dakle, u skladu sa ovim pronalaskom, ćelija može da bude izolovana ćelija ili može da formira deo organa, tkiva i/ili organizma.

[0100] U skladu sa ovim objašnjenjem, sve mere i sredstva koje daju kao rezultat smanjenje aktivnosti PKR su pogodne za smanjenje aktivnosti PKR. Smanjenje aktivnosti PKR u ćeliji preporučljivo daje kao rezultat pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ekspresije RNK u ćeliji u poređenju sa normalnom situacijom, posebno normalnom situacijom u ćeliji, pri čemu se aktivnost PKR nije smanjena/se ne smanjuje intervencijom čoveka. Pospešivanje ekspresije RNK u ćeliji preporučljivo obuhvata povećanje nivoa ekspresije i/ili povećanje trajanja ekspresije RNK u ćeliji u poređenju sa normalnom situacijom, posebno normalnom situacijom u ćeliji, pri čemu aktivnost PKR nije smanjena/se ne smanjuje intervencijom čoveka.

[0101] U jednom izvođenju, smanjenje aktivnosti od RNK zavisne kinaze proiteina (PKR) u nekoj ćeliji obuhvata tretiranje te ćelije inhibitorom ekspresije bilo koje aktivnosti PKR. U skladu sa ovim opisom, fraza "inhibira ekspresiju i/ili aktivnost" obuhvata potpuno ili u suštini potpunu inhibiciju ekspresije i/ili aktivnosti i smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti. Preporučljivo, tretiranje ćelije inhibitorom PKR-a je za izvesno vreme dovoljno da kao rezultat da pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ekspresije RNK u ćeliji.

[0102] Preporučljivo, pomenuta inhibicija ekspresije PKR može da se odigra inhibiranjem proizvodnje ili smanjenjem nivoa transkripta, t.j. iRNK, kodiranjem za PKR, npr. inhibiranjem transkripcije ili smanjenjem degradacije transkripta, i/ili inhibiranjem transkripcije, i/ili inhibiranjem proizvodnje PKR, npr. inhibiranjem translacije kodiranja transkripta za PKR. U jednom izvođenju, pomenuti PKR inhibitor je specifičan za kodiranje PKR nukleinskom kiselinom.. U specifičnom izvođenju, inhibitor ekspresije PKR je inhibitorna nukleinska kiselina (npr., antisens molekul, ribozime, iRNK, siRNK ili DNK koja kodira isti) selektivno hibridizovanje i specifičan je za PKR, čime se inhibira (npr., smanjenje) transkripcije i/ili njena translacija.

[0103] Inhibitorne nukleinske kiseline iz ovog pronalaska obuhvataju oligonukleotide koji imaju sekvence u antisens smeru u odnosu na ciljne nukleinske kiseline. Pogodni inhibitorni oligonukleotidi obično variraju u dužini od pet do nekoliko stotina nukleotida, češće dužine od oko 20-70 nukleotida ili kraće, i još češće dužine od oko 10-30 nukleotida. Ovi inhibitorni oligonukleotidi mogu biti primenjenim, bilo in vitro ili in vivo, kao slobodne (gole) nukleinske kiseline ili u zaštićenim oblicima, npr. enkapslirane u lipozome. Upotreba lipozomnih ili drugih zaštićenih oblika može da bude prednost jer može da pospeši in vivo stabilnost i time olakša isporuku ciljnim mestima.

[0104] Takođe, ciljna nukleinska kiselina može da se koristi da projektuje ribozime koji ciljaju cepljenje odgovarajućih iRNK u ćelijama. Slično, ovi ribozomi mogu biti primenjeni kao lek u slobodnom (golom) obliku ili upotrebom sistema isporuke koji pospešuju stabilnost i/ili ciljanjem, npr., lipozoma.

[0105] Takođe, ciljna nukleinska kiselina može da se koristi da projektuje siRNK koje mogu inhibirati (npr. smanjiti) ekspresiju nukleinske kiseline. Ove siRNK moguće je primeniti kao lek u slobodnom (golom) obliku ili upotrebom sistema isporuke koji pospešuju stabilnost i/ili ciljanjem, npr., lipozoma. Njih je moguće primeniti u obliku njihovih prekursora ili kodiranjem DNK.

[0106] siRNK preporučljivo obuhvata smisaoni lanac RNK i antisens lanac RNK, pri čemu taj smisaoni lanac i antisens RNK lanac formiraju RNK dupleks, i pri čemu smisaoni lanac RNK obuhvata sekvencu nukleotida u suštini identičnu ciljnoj sekvenci od oko 19 do oko 25 dodirnih nukleotida u ciljnoj nukleinskoj kiselini, preporučljivo iRNK kodiranje za PKR.

[0107] U jednom izvođenju, pomenuti PKR inhibitor se usmerava na PKR protein i preporučljivo je specifičan za PKR. PKR može biti inhibiran na različite načine, npr. putem inhibiranja autofosforilacije PKR i/ili dimerizacije, obezbeđivanjem PKR pseudo-aktivatora, ili obezbeđivanjem PKR pseudosupstrata. PKR inhibitor može da bude agens koji je uključen u virusni mehanizam odbrane kako se gore razmatra. Na primer, E3L virus vaccinia kodira dsRNK vezujući protein koji inhibira PKR u ćelijama inficiranim virusom, po svoj prilici razdvajanjem dsRNK aktivatora. K3, je takođe kodirana virusom vaccinia, funkcioniše kao inhibitor pseudosupstrata vezivanjem na PKR. Dakle, obezbeđuje E3L virus vaccinia može da kao rezultat da inhibiciju PKR. Dobijanje adenovirusa VAI RNK, HIV Tat ili Epstajn-Barovog (Epstein-Barr) virusa EBER1 RNK može kao rezutlat da da PKR pseudo-aktivaciju. Dakle, na primer, svi virusni faktori, t.j. virusno izvedeni inhibitori, blokiranje PKR aktivnosti kao što su one koje su ovde opisane moguće je koristiti za smanjenje aktivnosti PKR. Takvi faktori mogu biti obezbeđeni u ćeliji bilo u obliku nukleinske kiseline kao što je RNK ili peptida/proteina, kako je odgovarajuće.

[0108] U jednom izvođenju, PKR inhibitor je hemijski inhibitor. Preporučljivo, PKR inhibitor je inhibitor RNK indukovanom PKR autofosforilacijom. U jednom izvođenju, PKR inhibitor je mestom vezivanja na ATP usmeren inhibitior PKR.

[0109] U jednom izvođenju, PKR inhibitor je 6,8-dihidro-8-(1H-imidazol-5-ilmetilen)-7H-pirolo[2,3-g]benzo- tiazol-7-on. U jednom izvođenju, PKR inhibitor ima sledeću formulu:

[0110] U jednom izvođenju, PKR inhibitor je 2-aminopurin. U jednom izvođenju, PKR inhibitor ima sledeću formulu:

[0111] Preporučljivo, inhibitor kako je opisano gore u tekstu se koristi u koncentraciji od barem 0,5 µM ili viši, barem 1 µM ili više ili barem 2 µM ili više i preporučljivo u koncentraciji od do 5 µM, od do 4 µM, od do 3 µM ili od do 2 µM.

[0112] U još jednom izvođenju, inhibitor aktivnosti PKR je antitelo koje se specifično veže na PKR. Vezivanje antitela na PKR može da se meša sa funkcijom PKR, npr. inhibiranjem aktivnosti vezivanja ili katalitičke aktivnosti.

[0113] U jednom izvođenju, predviđa se da se smanji aktivnost PKR u nekoj ćeliji tretiranjem te ćelije sa jednim ili više viralno izvedenih inhibitora kao što je E3 virus vaccinia i/ili K3 virus vaccinia kao tretiranje ćelije sa jednim ili više hemijskih PKR inhibitora kao što je 6,8-dihidro-8-(1H-imidazol-5-ilmetilen)-7H-pirolo[2,3-g]benzotiazol-7-on i/ili 2-aminopurin.

[0114] U jednom izvođenju, ćelije se tretiraju da se smanji aktivnost PKR pre, istovremeno sa i/ili posle uvođenja RNK ili prvog uvođenja (npr. u slučaju ponovljenih transfekcija) RNK. U jednom izvođenju, ćelije se tretiraju da se smanji aktivnost PKR posle, preporučljivo odmah posle uvođenja RNK ili prvog uvođenja (npr. u slučaju ponovljenih transfekcija) RNK.

[0115] U jednom izvođenju, ćelije se tretiraju da se smanji aktivnost PKR tokom barem 24 časa, barem 48 časova, barem 72 časa, barem 96 časova, barem 120 časova ili čak duže. Još preporučljivije, ćelije se tretiraju da se smanji aktivnost PKR za ceo vremenski period u kom je ekspresija RNK poželjna, kao što je trajno, opciono sa ponovljenom transfekcijom RNK.

[0116] "Antisens molekuli" ili "antisens nukleinske kiseline" mogu da se koriste za regulisanje, posebno smanjenje, ekspresije nukleinske kiseline. Pojam "antisens molekul" ili "antisens nukleinska kiselina" se odnosi u skladu sa ovim pronalaskom na oligonukleotid koji je oligoribonukleotid, oligodeoksiribonukleotid, modifikovan oligoribonukleotid ili modifikovan oligodeoksiribonukleotid i koji hibridizuje pod psihološkim uslovima na DNK koja obuhvata određeni gen ili na iRNK pomenutog gena, čime se inhibira transkripcija pomenutog gena i/ili translacija pomenute iRNK. Prema ovom pronalasku, ''antisens molekul'' takođe obuhvata konstrukt koji obuhvata nukleinsku kiselinu ili njen deo u reverznoj orijentaciji u odnosu na prirodni promoter. Antisens transkript nukleinske kiseline ili njen deo mogu formirati dupleks sa iRNK koja se prirodno javlja i tako sprečiti akumulaciju ili translaciju iRNK. Još jedna mogućnost je upotreba ribozoma za neaktiviranje nukleinske kiseline.

[0117] U preporučenim izvođenjima, antisens oligonukleotid hibridizuje sa N-terminalom ili 5’ uzvodnim mestom kao što je mesto pokretanja translacije ili mesto promotera. U daljim izvođenjima, antisens oligonukleotid hibridizuje sa 3’-netranslatiranim regionom ili iRNK mestom splajsovanja.

[0118] Pod "mala interferirajuća RNK" ili "siRNK" kako s ovde koristi znači RNK molekul, preporučljivo veći od 10 nukleotida u dužini, još preporučljivije veće od 15 nukleotida u dužini, i još preporučljivije 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 nukleotida u dužini koja se koristi da se označi ciljni gen ili iRNK koju treba degradirati. Opseg 19-25 nukleotida je najpreporučljivija veličina siRNK.

[0119] Jedan ili oba lanca siRNK može takođe da obuhvata 3’-neupareni ostatak. Kako se ovde koristi, "3’-neupareni ostatak" se odnosi na barem jedan neupareni neukleotid koji se nastavlja od 3’-kraja RNK lanca. Zato, u jednom izvođenju, siRNK obuhvata barem jedan 3’-neupareni ostatak sa od 1 do oko 6 nukleotida (koji obuhvata ribonukleotide ili deoksinukleotide) u dužini, preporučljivo od 1 do oko 5 nukleotida u dužini, još preporučljivije od 1 do oko 4 nukleotida u dužini, i preporučljivo od oko 2 do oko 4 nukleotida u dužini. U jednom izvođenju u kom oba lanca siRNK molekula obuhvataju 3’-neupareni ostatak, dužina neuparenog nukleotida može biti ista ili različita za svaki lanac. Kod većine preporučenih izvođenja, 3’-neupareni ostatak na kraju je prisutan na oba lanca siRNK, i ima dužinu od 2 nukleotida. Na primer, svaki lanac siRNK iz ovog pronalaska može obuhvatiti 3’-neuparene ostatke dideoksitimidilne kiseline ("TT") ili diuridilne kiseline ("uu").

[0120] Da bi se pospešila stabilnost siRNK, 3’-neupareni ostaci mogu biti i stabilizovani protiv degradacije. U jednom izvođenju, neupareni ostaci se stabilizuju uključivanjem nukleotida purina, kao što su nukleotidi adenozina ili guanozina. Alternativno, supstitucija nukleotida pirimidina modifikovanim analozima, t.j., supstitucija nukleotida uridina u 3’-neuparenim ostacima sa 2’-deoksitimidinom, se toleriše i ne utiče na efikasnost RNKi degradacije. Specifično, u odsustvu 2-hidroksil u 2'-deoksitimidina značajno pospešuje otpornost nukleaze 3'-neuparenog nukleotida u medijumu kulture tkiva.

[0121] U smisaonim i antisens lancima siRNK mogu da obuhvataju dva komplementarna, jednolančana RNK molekula ili mogu da obuhvate jedan molekul u kom su dva komplementarna dela bazno uparena i kovalentno su povezana područjem jednolančane ''ukosnice''. To znači da smisleni region i antisens region mogu biti kovalentno povezani preko linker molekula. Linker molekul može biti polinukleotidni ili nenukleotidni linker. Bez želje da se vežemo za bilo koju teoriju, veruje se da je zona ukosnice ovog poslednjeg tipa siRNK molekula podeljena unutarćelijski putem proteina "Rezača" (ili njegovog ekvivalenta) da se formira siRNK od dva individualna bazna para RNK molekula.

[0122] Kako se ovde koristi, "ciljna iRNK" se odnosi na RNK molekul koji je cilj za nizvodnu regulaciju.

[0123] siRNK može biti izražen iz pol III vektora ekspresije bez promene u ciljanju mesta, jer se veruje da je ekspresija RNK iz pol III promotera efikasna samo kada je prvi transkribovani nukleotid purin.

[0124] siRNK u skladu sa ovim pronalaskom može biti ciljan na bilo koji od približno 19-25 dodirnih nukleotida u bilo kojim ciljnim RNK sekvencama ("ciljna sekvenca"). Tehnike za odabir ciljnih sekvenci za siRNK su date, na primer, kod (Tuschl T. i saradnika., "The siRNA User Guide" (siRNK vodič za korisnike), revised Oct. 11, 2002, ) čiji je ceo opis ovde ugrađen u vidu reference. "The siRNA User Guide" je dostupan na internetu na vebsajtu koji drži ( Dr. Thomas Tuschl, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, New York, USA,) i može se naći pristupom vebsajtu Univerziteta Rokfeler i pretragom ključne reči "siRNK". Dakle, smisleni lanac iz ove siRNK obuhvata sekvencu nukleotida u suštini identičnu bilo kojoj dodirnoj površini od oko 19 do oko 25 nukleotida u ciljnoj iRNK.

[0125] Generalno, ciljna sekvena na ciljnoj MRNK može biti izabrana iz date DNK sekvence koja odgovara ciljnoj iRNK, preporučljivo počevši od 50 do 100 nt nizvodno (t.j., u 3’-smeru) od početnog kodona. Ciljna sekvenca može, međutim, da se smesti u 5’- ili 3’-netranslatirane regione, ili u region blizu početnog kodona.

[0126] siRNK može da se dobije korišćenjem izvesnog broja tehnika poznatih stučnjaku u ovoj oblasti. Na primer, siRNK moguće je hemijski sintetisati ili rekombinantno proizvoditi korišćenjem postupaka poznatih u ovoj oblasti, kao što je Drosophila in vitro sistem opisan u U.S. objavljenoj prijavi 2002/0086356 od Tuschl i saradnika, čiji je ceo opis ovde uključen u vidu reference.

[0127] Preporučljivo, siRNK je hemijski sintetisana korišćenjem prikladno zaštićenih ribonukleozidnih fosforamidita i konvencionalnog DNK/RNK sintetizatora. siRNK moguće je sintetisati kao dva odvojena, komplementarna RNK molekula, ili kao pojedinačni RNK molekul sa dva komplementarna regiona.

[0128] Alternativno, siRNK može takođe biti izražen iz rekombinantnih cirkularnih ili linearnih DNK plazmida korišćenjem pogodnog promotera. Pogodni promoteri za izražavanje siRNK iz ovog pronalaska iz plazimda obuhvataju, na primer, U6 ili H1 RNK pol III sekvence promotera i promoter citomegalovirusa.

[0129] Izbor drugih pogodnih promotera je u okviru stručnosti u ovoj oblasti. Rekombinantni plazmidi mogu takođe da obuhvate induktibilne ili regulatibilne promotere za ekspresiju siRNK u određenom tkivu ili u određenom unutarćelijskom okruženju

[0130] Ta siRNK izražena iz rekombinanntih plazmida može bilo da bude izolovana iz kultivisanih sistema ekspresije ćelije sistema ekspresije kultivisane ćelije standardnim tehnikama, ili može biti izražena unutarćelijski. Upotreba rekombinantnih plazmida da se isporuči siRNK u ćelije in vivo je u okviru stručnosti u ovoj oblasti. siRNK može biti izražena iz rekombinantnog plazmida bilo kao dve odvojena, komplementarna RNK molekula, ili kao samo jedan RNK molekul sa dva komplementarna regiona.

[0131] Selekcija plazmida pogodnih za ekspresiju siRNK, postupaka za ubacivanje sekvenci nukleinske kiseline za ekspresiju siRNK u plazmid, i postupci isporuke rekombinantnog plazmida u ćelijama od interesa su deo stučnosti u ovoj oblasti.

[0132] Pojam "ćelija" ili "ćelija domaćin" se preporučljivo odnosi na nedirnutu ćeliju, t.j. ćeliju sa nedirnutom membranom koja nije otpustila svoje normalne untarćelijske komponente kao što su enzimi, organele, ili genetski materijal. Nedirnuta ćelija je preporučljivo održiva ćelija, t.j. živa ćelija koja je sposobna da izvodi svoje normalne metaboličke funkcije. Preporučjivo pomenuti pojam obuhvata bilo koju ćeliju koju je moguće transformisati sa eksogenom nukleinskom kiselinom. Pojam "ćelija" obuhvata u skladu sa ovim pronalaskom prokariotske ćelije (npr., E. coli) ili eukariotske ćelije. Ćelije sisara su posebno preporučene, kao što su ćelije iz ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza, i primata. Ćelija je preporučljivo ćelija u kojoj smanjenje aktivnosti PKR daje kao rezultat pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ekspresije RNK u toj ćeliji. U jednom izvođenju, ta ćelija je somatska ćelija kako je ovde opisano. U jednom izvođenju, ćelija je ćelija koja ima funkciju prepreke. Preporučljivo, ta ćelija je fibroblast kao što je ovde opisan fibroblast, keratinocit, ćelija epitela, ili ćelija endotela kao što je ćelija endotela srca, ćelija endotela pluća, ili ćelija endotela vene pupčane vrpce. Preporučljivo, ta ćelija je ljudska ćelija.

[0133] Fibroblast je tip ćelije koji sintetizuje vanćelijski matriks i kolagen i igra ključnu ulogu u izlečenju rane. Glavna funkcija fibroblasta je da održi strukturni integritet vezivnih tkvia neprekidnim izlučivanjem prekursora vanćelijskog matriksa. Fibroblasti su najuobičajenije ćelije vezivnog tkiva kod životinja. Fibroblasti su morfološki heterogeni sa različitim izgledima zavisno od njihove lokacije i aktivnosti.

[0134] Keratinociti su preovladavajući tip ćelije u epidermu, najspoljnijem sloju ljudske kože. Primarna funkcija keratinocita je formiranje sloja keratina koji štiti kožu i osnovnog tkiva kod oštećenja okoline kao što je toplota, UV zračenje i gubitak vode.

[0135] Epitel je tkivo koje čine ćelije koje izravnavaju šupljine i površine struktura u celom telu. Brojne žlezde se takođe formiraju iz tkiva eppitela. Ono leži na vrhu vezivnog tkiva, i dva sloja su odvojena bazalnom membranom. Kod ljudi, epitel se klasifikuje kao primarno telesno tkivo, druga su vezivna tkiva, mišićno tkivo i nervno tkivo. Funkcije ćelija epitela obuhvataju izlučivanje, selektivnu apsorpciju, zaštitu, transćelijski transport i detekciju senzitizacije.

[0136] Endotel je tanki sloj ćelija koji oblaže unutrašnju površinu krvnih sudova, formirajući vezni sklop između cirkulišuće krvi u lumenu i ostatka zida krvnog suda. Ove ćelije se zovu ćelije endotela. Ćelije endotela su ceo sistem krvotoka, od srca do najmanjih kapilara. Tkivo endotela je specijalizovan tip tkiva epitela.

[0137] U skladu sa ovim pronalaskom, RNK kodira ili je sposobna za ekspresiju peptida ili proteina, kao što je faktor reprogramiranja takođe se pominje kao ''faktor'' i ovde, čija je ekspresija u ćeliji poželjna.

[0138] U skladu sa ovim objašnjenjem, pojam "peptid" obuhvata oligo i polipeptide i odnosi se na supstance koje obuhvataju dva ili više, preporučljivo 3 ili više, preporučljivo 4 ili više, preporučljivo 6 ili više, preporučljivo 8 ili više, preporučljivo 10 ili više, preporučljivo 13 ili više, preporučljivo 16 ili više, preporučljivo 21 ili više i do preporučljivo 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, specifično 100 amino kiselina spojenih kovalentno peptidnim vezama. Pojam "protein" se odnosi na velike peptide, preporučljivo na peptide sa više od 100 ostataka amino kiseline, ali generalno pojmovi "peptidi" i "proteini" su sinonimi i koriste se ravnopravno ovde u tekstu.

[0139] Ovaj opis takođe obuhvata "varijante" peptida, proteina, ili sekvenci amino kiseline opisane ovde.

[0140] Za potrebe ovog objašnjenja, "varijante" sekvence amino kiseline obuhvataju varijante umetka amino kiseline, varijante dodatka amino kiseline, varijante brisanja amino kiseline i/ili varijante supstitucije amino kiseline. Varijante brisanja amino kiseline koje obuhvataju brisanje na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju tog proteina se takođe zovu varijanta N-terminala i/ili varianta zarubljenja Nterminala.

[0141] Varijante umetka amino kiseline obuhvataju umetke jedne ili dve ili više umetaka amino kiseline posebno sekvence amino kiseline. U slučaju da varijante sekvenca amino kiseline ima umetak, jedan ili više ostataka amino kiseline se ubacuje određeno mesto u sekvenci amino kiseline, iako je takođe moguće nasumično ubacivanje sa odgovarajućim skriningom proizvoda dobijenog kao rezultat.

[0142] Varijante dodavanja amino kiseline obuhvataju fuzije amino i/ili karboksi terminala jedne ili više amino kiselina, kao što je 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više amino kiselina.

[0143] Varijante brisanja amino kiseline karakteriše uklanjanje jedne ili više amino kiselina iz te sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5,10, 20, 30, 50, ili više amino kiselina. Brisanja mogu da budu u bilo kom položaju proteina.

[0144] Varijante supstitucije amino kiseline karakteriše barem jedan ostatak u sekvenci koja se uklanja i još jedan ostatak koji se umeće na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama koje su na mestima u sekvenci amino kiseline koje nisu očuvane između homolognih proteina ili peptida i/ili da se zamene amino kiseline sa drugim koje imaju slična svojstva. Preporučljivo, promene amino kiseline u varijantama proteina su konzervativne promene amino kiseline, t.j. supstitucije slično promenjenih ili nepromenjenih amino kiselina. Konzervativna promena amino kiseline obuhvata supstituciju jedne od familije amino kiselina koje se odnose na njihove bočne lance. Amino kiseline koje postoje prirodno se generalno dele u četiri famlije: sirćetna (aspartat, glutamat), osnovne (lizin, arginin, histidin), nepolarni (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) amino kiseline. Fenilalanin, triptofan, i tirozin se ponekad klasifikuju zajedno kao aromatične amino kiseline

[0145] Preporučljivo stepen sličnosti, preporučljivo identitet između date sekvence amino kiseline i sekvence amino kiseline koja je varijanta pomentue date sekvence amino kiseline će biti barem oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%. Stepen sličnosti ili identitet se daje preporučljivo za region amino kiseline koji je barem oko 10%, barem oko 20%, barem oko 30%, barem oko 40%, barem oko 50%, barem oko 60%, barem oko 70%, barem oko 80%, barem oko 90% ili oko 100% potpuna dužina referentne sekvence amino kiseline. Na primer, ako se referentna sekvenca amino kiseline sastoji od 200 amino kiselina, stepen sličnosti ili identičnosti je dat preporučljivo barem oko 20, barem oko 40, barem oko 60, barem oko 80, barem oko 100, barem oko 120, barem oko 140, barem oko 160, barem oko 180, ili oko 200 amino kiselina, preporučljivo kontinualnih amino kiselina. U preporučenim izvođenjima, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celu dužinu referentne sekvence amino kiseline. Poravnavanje za određivanje sličnosti sekvence, preporučljivo identičnost sekvence može biti urađena sa alatima poznatim u ovoj oblasti, preporučljivo korišćenjem najboljeg poravnanja sekvence, na primer, korišćenjem Align, korišćenjem standardnih podešavanja, preporučljivo EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

[0146] "Sličnost sekvence" označava procenat amino kiselina koje su bilo identične ili koje predstavljaju konzervativne supstitucije amino kiseline. "Identičnost sekvence" između dve sekvence amino kiseline označava procenat amino kiselina ili nukleotida koje su identične između sekvenci.

[0147] Pojam "procenat identičnosti" je predviđen da označi procenat ostataka amino kiseline koji su identični između dve sekvence koje treba uporediti, dobijen posle najboljeg poravnanja, ovaj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence su poremećene nasumično i celom njihovom dužinom.

Poređenja sekvenci između dve sekvence amino kiseline se konvencionalno izvode poređenjem ovih sekvenci posle njihovog optimalnog poravnavanja, pomenuto poređenje se izvodi pomoću segmenta ili putem "poređenja prozora" da bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti sekvence. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može biti proizvedeno, pored ručnog, pomoću lokalnog algoritma homologije koji su dali Smith i Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, bomoću lokalnog algoritma homologije koji su dali Neddleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, pomoću postupka pretrage sličnosti koje su dali Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wiskonsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0148] Procenat identičnosti je izračunat određivanjem broja identičnih pozicija između dve sekvence koje se porede, podelom ovog broja upoređenih pozicija i množenjem dobijenog rezultata sa 100 tako da se dobije procenat identičnosti između ove dve sekvece.

[0149] Homologne sekvence amino kiseline ispoljavaju u skladu sa ovim pronalaskom barem 40%, specifično barem 50%, barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90% i preporučljivo 95%, barem 98 ili barem 99% identičnosti ostataka amino kiseline.

[0150] Varijante sekvence amino kiseline opisane ovde može lako da pripremi stučnjak u ovoj oblasti, na primer, manipulacijom rekombinantne DNK. Manipulacija sekvence DNK za pripremu peptida ili proteina sa supstituentima, aditivima, umecima ili brisanim delovima, je detaljno opisana u radu Sambrook i saradnika (1989), na primer. Pored toga, varijante peptida i amino kiselina opisane ovde moguće je lako pripremiti uz pomoć poznatih tehnika sinteze peptida kao što su, na primer, sinteza solidne faze i slični postupci.

[0151] Ovaj pronalazak obuhvata derivate peptida ili proteina opisanih ovde koji su obuhvaćeni pojmovima "peptid" i "protein". U skladu sa ovim pronalaskom, "derivati" proteina i peptida su modifikovani oblici proteina i peptida. Takve modifikacije obuhvataju hemijsku modifikaciju i obuhvataju jednu ili više supstitucija, brisanja i/ili dodavanja bilo kog molekula povezanog sa tim proteinom ili peptidom, kao što su karbohidrati, lipidi i/ili proteini ili peptidi. U jednom izvođenju, "derivati" proteina ili peptida obuhvataju one modifikovane analoge koji nastaju kao rezultat iz glikozilacije, acetilacije, fosforilacije, amidacije, palmitoilacije, miristoilacije, izoprenilacije, lipidacije, alkilacije, derivatizacije, uvođenje zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitsko cepanje ili vezivanje na antitelo ili na drugi ćelijski ligand. Pojam "derivat" se takođe proširuje na sve funkcionalne hemijske ekvivalente pomenutih proteina i peptida. Preporučljivo, modifikovani peptid ima povećanu stabilnost i/ili povećanu imunogenost.

[0152] Prema ovom objašnjenju, varijanta peptida ili proteina preporučljivo ima funkcionalno svojstvo peptida ili proteina iz kog je izvedena. Takva funkcionalna svojstva su ovde opisana za OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 i c-MYC, prema opisanom redosledu. Preporučljivo, varijanta peptida ili proteina ima isto svojstvo za reprogramiranje životinjske diferencirane ćelije kao peptid li protein iz kog je izvedena. Preporučljivo, ta varijanta indukuje ili pospešuje reprogramiranje životinjske diferencirane ćelije.

[0153] U jednom izvođenju, peptid ili protein kodiran pomoću RNK je faktor koji omogućava reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije. U jednom izvođenju, peptid ili protein obuhvata jedan ili više antigena i/ili jedan ili više peptida antigena. Preporučljivo, pomenuta RNK je sposobna da izražava peptid ili protein, posebno ako se uvede u ćeliju.

[0154] "Matična ćelija" je ćelija koja ima sposobnost da se samoobnavlja, da ostane nediferencirana, i da postane diferencirana. Matična ćelija može da se deli bez ograničenja, najmanje tokom životnog veka životinje u kojoj prirodno boravi. Matična ćelija nije terminalno diferencirana, i nije u krajnjem stadijumu putanje diferencijacije. Kada se matična ćelija deli, svaka ćerka ćelija može bilo da ostane matična ćelija ili da se otisne na put koji vodi prema terminalnoj diferencijaciji.

[0155] Totipotentne matične ćelije su ćelije koje imaju totipotencijalna svojstva diferencijacije i mogu da se razvijaju u potpuni organizam. Ovo svojstvo poseduju ćelije sve do 8-ćelijskog stadijuma posle oplodnje oocita spermom. Kada se ove ćelije izoluju i transplantiraju u uterus, one mogu da se razviju u potpuni organizam.

[0156] Pluripotentne matične ćeljie su ćeljie koje su sposobne da se razviju u različite ćelije i tkiva izvedene iz ektodermalnih, mezodermalnih i endodermalnih slojeva. Pluripotentne matične ćelije koje se izvode iz unutrašnje ćelijske mase koja se nalazi unutar blastocita, generisane 4-5 dana posle oplodnje se zovu "embrionske matične ćelije" i mogu da se diferenciraju u različite ćelije drugih tkiva ali ne mogu da formiraju nove žive organizme.

[0157] Višestrukopotentne matične ćelije su matične ćelije koje se diferenciraju normalno u samo tipove ćelije specifične za njihovo tkivo i organ porekla. Višestrukopotentne matične ćelije su uključene ne samo u rast i razvoj različitih tkiva i organa tokom fetusnih, neonatalnih i odraslih perioda ali takođe i za održavanje homeostaze tkiva odrasle osobe i funkciju indukovanja regeneracije posle oštećenja tkiva.. Višestrukopotentne ćelije specifične za tkivo se kolektivno zovu "matične ćelije odrasle osobe". "Embrionska matična ćelija" je matična ćelija koja je prisutna u ili izolovana iz embriona. Može biti Pluripotentna, sa kapacitetom da se diferencira u svaku i sve ćelije prisutne u organizmu, ili višestrukopotentna, koja ima sposobnost da se diferencira u više od jednog tipa ćelije.

[0158] Kako se ovde koristi, "embrion" se odnosi na životinju u ranim stadijumima njenog razvoja. Ove stadijume karakteriše implantacija i gastrulacija, gde se ovi slojevi klice definišu i uspostavljaju i putem diferencijacije slojeva klica u odgovarajuće organe i sisteme organa. Tri sloja klice su endoderm, ektoderm i mezoderm.

[0159] "Blastocist" je embrion u ranom stadijumu razvoja u kom je oplođeno jajašce prošlo cepanje, i formira se, ili se formirao sferni sloj ćelija koji okružuju šupljinu ispunjenu tečnošću. Ovaj sferni sloj ćelija je trofektoderm. Unutar trofektoderma je skup ćelija pod nazivom unutrašnja ćelijska masa (ICM). Trofektoderm je prekursor placente, i ICM je prekursor tog embriona.

[0160] Odrasla matična ćelija, se takođe zove somatska matična ćelija, je matična ćelija koja se nalazi u odrasloj osobi. Odrasla matična ćelija se nalazi u diferenciranom tkivu, može da se obnovi, i može da se diferencira, uz neka ograničenja, da se da prinos specijalizovanih tipova ćelije od njenog tkiva od kog potiče. Primeri obuhvataju mezenhimalne matične ćelije, hematopoietične matične ćelije, i neuronske matične ćelije.

[0161] "Diferencirana ćelija" je zrela ćelija koja je podvrgnuta progresivnim razvojnim promenama u specijalizovanijem obliku ili funkciji. Diferencijacija je proces koji ćelija prolazi dok stari u otvoreno specijalizovanom tipu ćelije. Diferencirane ćelije imaju osobene karakteristike, izvode specifične funkcije, i manje je verovatno da će podeliti svoje manje diferencirane duplikate.

[0162] "Nediferencirana" ćelija, na primer, nezrela, embrionska, ili primitivna ćelija, obično ima nespecifičan izgled, može da dati višestruk učinak, nespecifične aktivnosti, i može imati slab učinak, ako uopšte ima ikakav učinak, u funkcijama koje se obično izvode putem diferenciranih ćelija.

[0163] "Somatska ćelija" se odnosi na bilo koju i na sve diferencirane ćelije i ne obuhvata matične ćelije, klicine ćelije, ili gamete. Preporučljivo, ''somatska ćelija'' kako se ovde koristi se odnosi na terminalno diferenciranu ćeliju.

[0164] Kako se ovde koristi, "posvećen" se odnosi na ćelije koje se smatraju trajno posvećenim specifičnoj funkciji. Posvećene ćelije se takođe pominju i kao "terminalno diferencirane ćelije".

[0165] Kako se ovde korisit, "diferencijacija" se odnosi na prilagođavanje ćelije za određeni oblik ili funkciju. U ćelijama, diferencijacija vodi što posvećenijoj ćeliji.

[0166] Kako se ovde koristi, "reverzna diferencijacija" se odnosi na gubitak specijalizacije u obliku ili funkciji . U ćelijama, reverzna diferencijacija vodi manje posvećenoj ćeliji.

[0167] Kako se ovde koristi "reprogramiranje" se odnosi na resetovanje genetičkog programa ćelije. Reprogramirana ćelija preporučljivo ispoljava pluripotentnost.

[0168] Ovi pojmovi "reverzno diferencirane" i "reprogramirane" ili slični pojmovi se koriste naizmenično ovde da označe somatske ćelije izvedene iz ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije. Međutim, pomenuti pojmovi nisu namenjeni da ograniče predmet koji se ovde opisuje putem mehaničkih ili funkcionalnih razmatranja.

[0169] Pojam "RNK indukovanje razvoja karakteristika matične ćelije" ili "RNK sposobna za ekspresiju jednog ili više faktora koji omogućavaju reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije" se odnsoe na RNK koja kada se uvede u somatsku ćeliju indukuje da se ćelija diferencira.

[0170] Kako se ovde koristi, "klicina ćelija" se odnosi na reproduktivnu ćeliju kao što je spermatocit ili oocit, ili koja će se razviti u reproduktivnu ćeliju.

[0171] Kako se ovde koristi, "pluripotentno" se odnosi na ćelije koje mogu dati podsticaj bilo kom tipu ćelije iz ove placente ili drugih potpornih ćelija materice.

[0172] Pojmovi kao što je "ćelija ima karakteristike matične ćelije", "ćelija koja ima svojstva matične ćelije" ili "ćelija slična matičnoj ćeliji" se koriste ovde da označe ćelije koje, iako se izvode iz diferenciranih somatskih nemtatičnih ćelija, ispoljavaju jedno ili više svojstava tipičnih za matične ćelije, specifično embrionske matične ćelije. Takve karakteristike obuhvataju morfologiju embrionske matične ćelije kao što su kompaktne kolonije, visok odnos nukleusa prema citoplazmi i izraženi nukleoli, normalni kariotipi, ekspresija aktivnosti telomeraze, ekspresija markera na površini ćelije koji su karakteristični za embrionske matične ćelije, i/ili ekspresija gena koji su karakteristični za embrionske matične ćelije.Markeri na površini ćelije koji su karakteristični za embrionske matične ćelije su, na primer, izabrani iz grupe koja se sastoji od za stadijum specifičnog embrionskog antigena 3 (SSEA-3), SSEA-4, sa tumorom povezanog antigena -1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81, i TRA-2-49/6E. Biraju se geni koji su karakteristični za embrionske matične ćelije, na primer, iz grupe koja obuhvata endogeni OCT4, endogeni NANOG, rast i diferencijaciju faktora 3 (GDF3), smanjenu ekspresiju 1 (REX1), faktor rasta fibroblasta 4 (FGF4), za embrionsku ćeliju specifičan gen 1 (ESG1), sa razvojem povezanu pluripotentnu 2 (DPPA2), DPPA4, i reverznu transkriptazu telomeraze (TERT). U jednom izvođenju, jedna ili više karakteristika uobičajenih za matične ćelije obuhvata pluripotentnost.

[0173] U jednom izvođenju postupka iz ovog objašnjenja, karaktenstike matične ćelije obuhvataju morfologiju embrionske matične ćelije, pri čemu pomenuta morfologija embrionske matične ćelije preporučljivo obuhvata morfološke kriterijume izabrane iz grupe koja se sastoji od kompaktnih kolonija, visokog odnosa nukleusa prema citoplazmi i promenentnih nukleola. U izvesnim izvođenjima, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije imaju normalne kariotipe, ispoljavaju aktivnost telomeraze, ispoljavaju markere na površini ćelije koji su karakteritični za embrionske matične ćelije i/ili ispoljavaju gene koji su karakteristični za embrionske matične ćelije. Markeri na površini ćelije koji su karakteristični za embrionske matične ćelije mogu biti izabrani iz grupe koja obuhvata za stadijum sepcifičan embrionski antigen-3 (SSEA-3), SSEA-4, sa tumorom povezan antigen-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81, i TRA-2-49/6E i gene koji su karakteristični za embrionske matične ćelije moguće je izabrati iz grupe koja se sastoji od endogenih OCT4, endogenih NANOG, faktora 3 za rast i diferencijaciju 3 (GDF3), smanjene ekspresije 1 (REX1), faktora 4 rasta fibroblasta (FGF4), gena 1 specifičnog za embrionsku ćeliju 1 (ESG1), sa razvojem povezanu pluripotentnu 2 (DPPA2), DPPA4, i reverznu transkriptazu telomeraze (TERT).

[0174] Preporučljivo, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije su reverzno diferencirane i/ili reprogramirane somatske ćelije. Preporučljivo, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije ispoljavaju osnovne karakteristike embrionskih matičnih ćelija kao što je pluripotentno stanje. Preporučljivo, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije imaju razvojni potencijal da se diferenciraju u napredne derivate iz sva tri primarna sloja klice. U jednom izvođenju, primarni sloj klice je endoterm i napredni derviat je tkivo epitela slično crevu. U daljem izvođenju, primarni sloj klice je mezoderm i napredni derivat je izbrazdani mišić i/ili hrskavica. U još jednom izvođenju, primarni sloj klice je endoterm i napredni derviat je neutralno tkivo i/ili tkivo epiderma. U jednom preporučenom izvođenju, ćelije sa karakteristikama matične ćelije imaju razvojni potencijal da se diferenciraju u neuronske ćelije i/ili srčane ćelije.

[0175] U jednom izvođenju, somatske ćelijeiz embrionske matične ćelije su izvedene somatske ćelije sa mezenhimalnim fenotipom. U preporučenom izvođenju, somatske ćelije su fibroblasti kao što su fibroblasti fetusa ili postnatalni fibroblasti ili keratinociti, preporučljivo keratinociti izvedeni iz folikule dlake. U daljim izvođenjima, fibroblasti su fibroblasti pluća, fibroblasti prepucijuma ili dermalni fibroblasti. U određenim izvođenjima, tibroblasti su fibroblasti kako su deponovani u Američkog zbirci tipa kultura (American Type Culture Collection) (ATCC) pod kataloškim br. CCL-186, kako su deponovani u Američkog zbirci tipa kultura (ATCC) pod kataloškim brojem CRL-2097 ili kao su deponovani u Američkog zbirci tipa kultura (ATCC) pod kataloškim brojem CRL-2522, ili kako su distribuirani od strane System Biosciences pod kataloškim brojem PC501A-HFF. U jednom izvođenju, fibroblasti su odrasli ljudski dermalni fibroblasti. Preporučljivo, somatske ćelije su ljudske ćelije. U skladu sa ovim objašnjenjem, somatske ćelije mogu biti genetski modifikovane.

[0176] Pojam "faktor" u skladu sa ovim pronalaskom kada se koristi u vezi sa njegovom ekspresijom putem RNK obuhvata proteine i peptide kao i njihove derivate i varijante. Na primer, pojam "faktor" obuhvata OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 i c-MYC.

[0177] Ovi faktori mogu biti bilo koja od životinjskih vrsta, npr., sisari i glodari. Primeri sisara obuhvataju ali se ne ograničavaju na ljudske i neljudske primate. Primati obuhvataju ali se ne ogrnaičavaju na ljude, šimpanze, babune, makaki rakojede, i bilo koje druge majmune novog ili starog sveta. Glodari obuhvataju ali se ne ograničavaju na miša, pacova, gvinejsko prase, hrčka i skočimiša.

[0178] U skladu sa ovim objašnjenjem, jedan ili više činilaca koji su sposobni da reprogramiraju somatske ćelije u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije obuhvataju skup faktora izabranih iz grupe koja obuhvata (i) OCT4 i SOX2, (ii) OCT4, SOX2, i jedan ili oba NANOG i LIN28, (iii) OCT4, SOX2 i jedan ili oba KLF4 i c- MYC. U jednom izvođenju, pomenuti jedan ili više faktora sposobnih da budu izraženi pomoću RNK obuhvata OCT4, SOX2, NANOG i LIN28 ili OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC. Preporučljivo, RNK se uvodi u pomenutu životinjsku diferenciranu somatsku ćeliju elektroporacijom ili mikroinjekcijom. Preporučljivo, postupak iz opisa obuhvata i omogućavanje razvoja ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije, npr. kultivisanjem somatskih ćelija pod uslovima kulture embrionske matične ćelije, preporučljivo uslova pogodnih za održavanje pluripotentnih matičnih ćelija u nediferenciranom stanju.

[0179] OCT4 je faktor transkripcije eukariotskih POU faktora transkripcije i indikator pluripotentnosti embrionskih matičnih ćelija. To je roditeljski (majčinski) izražen protein vezivanja oktomera. Primećeno je da je prisutan u oocitima, unutrašnjoj masi ćelije blastocita i takođe u primordijalnoj klicinoj ćeliji. Gen POU5F1 kodira OCT4 protein. Sinonimi za naziv gena obuhvataju OCT3, OCT4, OTF3 i MGC22487. Prisustvo OCT4 u specifičnim koncentracijama je neophodno da embrionske matične ćelije ostanu nediferencirane.

[0180] Preporučljivo, "OCT4 protein" ili jednostavno "OCT4" se odnosi na ljudski OCT4 i preporučljivo obuhvata sekvencu amino kiseline koja je kodirana nukleinskom kiselinom u skladu sa SEK ID BR: 1, preporučljivo sekvenca amino kiseline u skladu sa SEK ID BR: 2. Stručnjaku u ovoj oblasti razume da je kDNK sekvenca OCT4 kako je opisano iznad jednaka za OCT4 iRNK, i moguće ju je koristiti za generisanje RNK koja može da ispoljava OCT4.

[0181] Sox2 je član Sox (sa SRY-povezanom HMG kutijom) familije gena koji kodiraju faktore transkripcije sa jednim HMG DNK domenom vezivanja. Utvrđeno je da SOX2 kontroliše neuronske progenitor ćelije inhibiranjem njihove sposobnosti da se diferenciraju. Potiskivanje ovog faktora daje kao rezultat raslojavanje iz zone komore posle koje sledi izlaz iz ciklusa ćelije. Ove ćelije takođe počinju da gube svoj progenitorski karakteri kroz gubitak progenitora i ranih markera neuronske diferencijacije.

[0182] Preporučljivo, "SOX2 protein" ili jednostavno "SOX2" se odnosi na ljudski SOX2 i preporučljivo obuhvata sekvencu amino kiseline koja je kodirana nukleinskom kiselinom u skladu sa SEK ID BR: 3, preporučljivo sekvenca amino kiseline u skladu sa SEK ID BR: 4. Stručnjak u ovoj oblasti razume da je kDNK sekvenca SOX2 kako je opisano iznad jednaka za SOX2 iRNK, i moguće ju je koristiti za generisanje RNK koja može da ispoljava SOX2.

[0183] NANOG je NK-2 tip homeodomena gena i predloženo je da igra ključnu ulogu u održavanju pretpostavljene pluripotentnosti matične ćelije regulisanjem ekspresije gena ključnih za obnavljanje matične ćelije i diferencijacije. NANOG se ponaša kao aktivator transkripcije sa dva neuobičajeno jaka domena aktivacije umetnuta u njegov C terminus. Smanjenje NANOG ekspresije indukuje diferencijaciju embrionskih matičnih ćelija.

[0184] Preporučljivo, "NANOG protein" ili jednostvano "NANOG" se odnosi na ljudski NANOG i preporučljivo obuhvata sekvencu amino kiseline kodiranu nukleinskom kiselinom u skladu sa SEK ID BR: 5, preporučljivo sekvenca amino kiseline u skladu sa SEK ID BR: 6. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da kDNK sekvenca NANOG kako je opisano gore bude ekvivalentna sa NANOG iRNK, i može se koristiti za generisanje RNK koja može da ispoljava NANOG.

[0185] LIN28 je konzervisan citoplazmični protein sa neuobičajenim uparivanjem RNK-vezujućih motiva: domen hladnog šoka i par cinkovih prstiju (fingera) retrovirusnog tipa CCHC. Kod sisara, javlja se obilno u različitim tipovima nediferenciranih ćelja. Kod pluripotentnih ćelija sisara, LIN28 se primeti u RNazasenzitivnim kompleksima sa poli(A)-vezujućim proteinom, i polizomalnim frakcijama gradijanata saharoze, nagoveštavajući da se povezuju sa translacijom iRNK.

[0186] Preporučljivo, "LIN28 protein" ili jednostavno "LIN28" se odnosi na ljudski LIN28 i preporučljivo obuhvata sekvencu amino kiseline koja je kodirana nukleinskom kiselinom u skladu sa SEK ID BR: 7, preporučljivo sekvenca amino kiseline u skladu sa SEK ID BR: 8. Stručnjak u ovoj oblasti razume da je cDNK sekvenca LIN28 kako je opisano iznad jednaka za LIN28 iRNK, i moguće je koristiti za generisanje RNK koja može da ispoljava LIN28.

[0187] Krueppel-sličan faktor (KLF4) je faktor transkripcije cinkogvog prsta, koji je jako izražen u posmitotskim ćelijama epitela različitih tkiva, npr. debelog creva, želuca i kože. KLF4 je ključan za terminalnu diferencijaciju ovih ćelija i uključen u regulaciju ciklusa ćelije.

[0188] Preporučljivo, "KLF4 protein" ili jednostavno "KLF4" se odnosi na ljudski KLF4 i preporučljivo obuhvata sekvencu amino kiseline koja je kodirana nukleinskom kiselinom u skladu sa SEK ID BR: 9, preporučljivo sekvenca amino kiseline u skladu sa SEK ID BR: 10. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da će kDNK sekvenca KLF4 kako je opisana gore da bude ekvivalentna sa KLF4 iRNK, i može se koristiti za generisanje RNK koja može da ispoljava KLF4.

[0189] MYC (kMYC) je fotoonkogen, koji je prekomerno izražen u velikom broju ljudskih kancera. Kada je specifično mutiran, ili prekomerno izražen, on povećava proliferaciju ćelije i funkcioniše kao onkogen. MYC gen kodira za faktor transkripcije koji reguliše ekspresiju 15% svih gena kroz vezivanje na sekvence kutije pospešivača (E-kutije) i regrutuje histonske acetiltransferaze (HAT). MYC pripada MYC familiji faktora transkripcije, koja takođe obuhvata gene N-MYC i L-MYC. Faktori transkripcije MYC-familije obuhvataju domen bHLH/LZ (bazni zavojnica-petlja-zavojnica leucinski zatvarač)

[0190] Preporučljivo, "kMYC protein" ili jednostavno "kMYC" se odnosi na ljudski kMYC i preporučljivo obuhvata sekvencu amino kiseline koja je kodirana nukleinskom kiselinom u skladu sa SEK ID BR: 11, preporučljivo sekvenca amino kiseline u skladu sa SEK ID BR: 12. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da će kDNK sekvenca kMYC kako je opisana gore da bude ekvivalentna sa kMYC iRNK, i može se koristiti za generisanje RNK koja može da ispoljava kMYC.

[0191] Ovde se upućuje na specifične faktore kao što su OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 ili k-MYC ili njihove specifične sekvence koje treba razumeti tako da takođe obuhvataju sve varijante ovih specifičnih faktora ili sve njihove sekvence kako je ovde opisano. Preciznije treba razumeti tako da obuhvata i sve varijante splajsovanja, translaciono modifikovane varijante, konformacije, izoforme i homologe vrsta ovih specifičnih faktora/sekvenci koje se prirodno izražavaju putem ćelija.

[0192] Preporučljivo, korak dozvoljavanja razvoja ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije korišćen u postupcima za obezbeđivanje ovde opisanih ćeija koje imaju karakteristike matične obuhvata kultivaciju somatskih ćelija u uslovima kulture embrionske matične ćelije, preporučljivo uslovima pogodnim za održavanje pluripotentnih matičnih ćelija u nediferenciranom stanju.

[0193] Preporučljivo, da bi se dozvolio razvoj ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije, ćelije se kultivišu u prisustvu jednog ili više inhibitora metiltransferaze i/ili jednog ili više inhibitora histonske deacetilaze. Preporučena jedinjenja se biraju iz grupe koja obuhvata 5’-azacitidin (5’-azaC), suberoilanilid hidroksaminsku kiselinu (SAHA), deksametazon, trihostatin A (TSA), natrijum butirat (NaBu), skriptaid i valproinsku kiselinu (VPA). Preporučljivo, te ćelije se kultivišu u prisustvu valproinske kiseline (VPA), preporučljivo u koncentraciji od između 0,5 i 10 mM, još preporučljivije između 1 i 5 mM, još preporučljivije u koncentraciji od oko 2 mM.

[0194] Postupke iz ovog pronalaska moguće je koristiti da se proizvede reverzna diferencijacija bilo kog tipa somatske ćelije. Ćelije koje je moguće koristiti obuhvataju ćelije koje je moguće reverzno diferencirati ili reprogramirati postupcima iz ovog objašnjenja, posebno ćelijama koje su potpuno ili delimično diferencirane, još preporučljivije terminalno diferencirane. Preporučljivo, somatska ćelija je diploidna ćelija izvedena iz preembrionskih, embrionskih, fetusnih, i postnatalnih višećelijskih organizama. Primeri ćelija koje je moguće koristiti ali bez ograničenja na fibroblaste, kao što su fetusni i neonatalni fibroblasti ili fibroblasti odraslih,, keratinociti, posebno primarni keratinociti, još poželjnije keratinociti izvedeni iz kose, adipoznih ćelija, ćelija epitela, ćelija epiderma, hondrocita, kumulusnih ćelija neuronskih ćelija, glijalnih ćelija, astrocita, ćelija srčanog mišića i ćelija jednjaka, ćelija mišića, melanocita, hematopoietičkih ćelija, osteocitia, makrofaga, monocita, i mononuklearnih ćelija.

[0195] Ove ćelije za koje je moguće koristitii postupke iz ovog objašnjenja mogu biti bilo koje životinjske vrste; npr., sisari i glodari. Primeri ćelija sisara koje je moguće reverzno diferencirati i reverzno diferencirati putem ovog pronalaska obuhvataju ali se ne ograničavaju na ćelije humanih i nehumanih primata. Ćelije primata sa kojima je ovaj pronalazak moguće izvesti obuhvataju ali se ne ograničavaju na ćelije ljudi, šimpanzi, babuna, makaki rakojeda, i bilo kojih drugih majmuna novog i strarog sveta. Ćelije glodara sa kojima je ovaj pronazak moguće izvesti obuhvataju ali se ne ograničavaju na ćelije miša, pacova, gvinejskog praseta, hrčka i skočimiša.

[0196] Očekuje se da reverzno diferencirane ćelije pripremljene prema objašnjenju datom ovde prikažu veliki broj istih zahteva kao pluripotentne matične ćelije i moguće ih je proširiti i održavati u uslovima korišćenim za embrionske matične ćelije, npr. podloga (medijum) ES ćelije ili bilo koja podloga koja podržava rast embrionskih ćelija. Embriionske matične ćelije zadržavaju svoju pluripotentnost in vitro kada su zadržane na neaktiviranim fetusnim fibroblastima kao što su ozračeni mišji embrionski fibroblasti ili ljudski fibroblasti (npr., ljudski fibroblasti prepucijuma, ljudski fibroblasti kože, ljudski fibroblasti endometrijuma, ljudski fibroblasti jajovoda) u kulturi. U jednom izvođenju, ljudske gradivne ćelije (fibroblasti) mogu biti autologne gradivne ćelije izvedene iz iste kulture reprogramiranih ćelija direktnom diferencijacijom.

[0197] Pored toga, matične ćelije ljudskog embriona mogu uspešno da se umnožavaju na Matrigelu u podlozi uslovljenoj uslovima koje daju mišji fibroblasti fetusa. Ljudske matične ćelije mogu rasti u kulturi u dužem periodu vremena i ostati nediferencirane pod specifičnim uslovima kulture.

[0198] U izvesnim izvođenjima, uslovi kulture ćelije mogu obuhvatiti dovođenje u kontakt ćelija sa faktorima koji mogu da inhibiraju diferencijaciju ili na drugi način da omoguće reverznu diferencijaciju ćelija, npr. spreče diferencijaciju ćelija u ne-ES ćelije, trofektoderm ili druge tipove ćelija.

[0199] Reverzno diferencirane ćelije pripremljene u skladu sa ovim pronalaskom mogu da budu procenjene postupcima koji obuhvataju nadzdiranje promena u fenotipu ćelije i karakterisanje njihovog gena i ekspresije proteina. Ekspresija gena može biti određena pomoću RT-PCR, i proizvodi translacije mogu biti određeni imunocitohemijom i tehnikom Vestern blota. Preciznije, reverzno diferencirane ćelije mogu da budu karakterisane da odrede šablon ekspresije gena i da li reprogramirane ćelije prikazuju šablon ekspresije gena sličan šablonu ekspresije koji se očekuje od nediferenciranih, pluripotentnih kontrolnih ćelija kao što su embrionske matične ćelije korišćenjem tehnika dobro poznatih u ovoj oblasti uključujući transkriptomiku.

[0200] Ekspresija sledećih gena reverzno diferenciranih ćelija može biti procenjena u vezi sa ovim: OCT4, NANOG, faktora 3 za rast i diferencijaciju (GDF3), smanjena ekspresija 1 (REX1), faktor 4 rasta fibroblasta (FGF4), gen 1 specifičan za embrionsku ćeliju (ESG1), sa razvojem povezanu pluripotentnu 2 (DPPA2), DPPA4, reverznu transkriptazu telomeraze (TERT), embrionski antigen-3 (SSEA-3), SSEA-4, sa tumorom povezan antigen-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81, i TRA-2-49/6E.

[0201] Nediferencirane ili embrionske matične ćelije sa kojima je moguće uporediti reprogramirane ćelije mogu biti iz istih vrsta kao diferencirane matične ćelije. Alternativno, nediferencirane ili embrionske matične ćelije sa kojima je moguće uporediti reprogramirane ćelije mogu biti iz istih vrsta kao diferencirane matične ćelije.

[0202] Kod nekih izvođenja, sličnost šablona ekspresije gena postoji između reprogramirane ćelije i nediferencirane ćelije, npr., embrionske matične ćelije, ako su izvesni geni specifično izraženi u nediferenciranoj ćeliji se takođe izrađene u reprogramiranoj ćeliji. Na primer, izvesni geni, npr., telomeraze, koji su obično nedetiktibilni u diferenciranim somatskim ćelijama moraju biti korišćeni da nadgledaju nivo reprogramiranja. Slično tome, za izvesne gene, odsustvo ekspresije može biti korišćeno da se proceni nivo reprogramiranja.

[0203] Kapacitet samoobnavljanja, označen indukcijom aktivnosti telomeraze, je još jedna karakteristika matičnih ćelija koje je moguće nadgledati u reverzno diferenciranim ćelijama.

[0204] Kariotipska analiza može biti izvedena pomoću hromozoma koji se prostiru iz mitotskih ćelija, spektralnog kariotipovanja, ogleda dužine telomera, ukupne genomske hibridizacije, ili drugih tehnika dobro poznatih u ovoj oblasti.

[0205] Korišćenjem ovog opisa, RNK kodiranje odgovarajućih faktora je ugrađeno u jednu ili više somatskih ćelija, npr. elektroporacijom. Posle ugradnje, ćelije se preporučljivo kultivišu korišćenjem uslova koji podržavaju održavanje reverzno diferenciranih ćelija (t.j. uslove kulture matične ćelije). Reverzno diferencirane ćelije mogu zatim da budu nastavljene i indukovane da se reverzno diferenciraju u drugi tip somatskih ćelija koje su potrebne za terapiju ćelije. Reverzno diferencirane ćelije dobijene u skladu sa ovim objašnjenjem mogu da budu indukovane da se diferenciraju u jednu ili više željenih tipova somatske ćelije in vitro ili in vivo.

[0206] Preporučljivo, reverzno diferencirane ćelije dobijene prema ovom pronalasku mogu da daju podsticaj izlasku ćelije iz bilo kog od tri embrionska sloja klice, t.j. endoterm, mezoterm, i ektoderm. Na primer, reverzno diferencirane ćelije mogu da se diferenciraju u mišić skeleta, skelet, dermis kože, vezivno tkivo, urogenitalni sistem, srce, krv (limfne ćelije), i jetru (mezoderm); želudac, debelo crevo, jetru, pankreas, mokraćnu bešiku, oblogu uretre, epitelne delove trahee, pluća, ždrela, tiroidee, paratiiroidee, creva (endoderma); ili centralnog nervnog sistema, mrežnjače i sočiva, mozda i senzornih nerava, ganglija i nerava,, ćelija pigmenta, vezivnog tkiva glave, epidermisa, dlake, mlečnih žlezda (ektoderma). Reverzno diferencirane ćelije dobijene prema ovom objašnjenju mogu biti reverzno diferencirane in vitro ili in vivo korišćenjem tehnika poznatih u ovoj oblasti.

[0207] U jednom izvođenju, reprogramirane ćelije, koje nastaju iz ovde opisanih postupaka se koriste da proizvedu diferencirano potomstvo. Dakle, u jednom varijantnom rešenju, ovo objašnjenje daje postupak za proizvodnju diferenciranih ćelija, koji obuhvata: (i) dobijanje reprogramiranih ćelija korišćenjem postupaka iz ovog objašnjenja; i (ii) indukovanje diferencijacije reprogramiranih ćelija da se proizvedu diferencirane ćelije. Korak (ii) moguće je izvesti in vivo ili in vitro. Pored toga, diferencijaciju je moguće indukovati kroz prisustvo odgovarajućih faktora diferencijacije koji mogu bilo da budu dodati ili su prisutni in situ, npr. u telu, organu ili tkivu u koji su uvedene reprogramirane ćelije. Diferencirane ćelije moguće je koristiti da se izvedu ćelije, tkvia i/ili organi koji se pogodno koriste u ovoj oblasti transplantacije ćelije, tkiva, i/ili organa. Ako se želi da se dobiju, genetske modifikacije moguće je izvesti, na primer, u somatske ćelije pre reprogramiranja. Diferencirane ćelije iz ovog objašnjenja preporučljivo ne poseduju pluripotentnost embrionske matične ćelije, ili embrionske klicine ćelije, i jesu, u suštini, za tkivo specifične delimično ili potpuno diferencirane ćelije.

[0208] Jedna prednost postupaka iz ovog pronalaska je da reprogramirane ćelije dobijene pomoću ovde datog objašnjenja mogu biti diferencirane pre selekcije ili prečišćavanja ili uspostavljanja linije ćelije. U skladu sa izvesnim izvođenjima, heterogena populacija ćelija obuhvata reprogramirane ćelije koje su diferencirane u željeni tip ćelije. U jednom izvođenju, mešavina ćelija dobijenih iz postupaka iz ovog pronalaska se izlaže jednom ili više faktora diferencijacije i kultivisana je in vitro.

[0209] Postupci diferencijacije reprogramranih ćelija dobijenih ovde opisanim postupcima mogu obuhvatiti korak prožimanja reprogramirane ćelije. Na primer, ćelije generisane pomoću ovde opisanih tehnika reprogramiranja, ili alternativno heterogena mešavina ćelija koja obuhvata reprogramirane ćelije, mogu biti permeabilizovane pre izlaganja jednom ili više faktora diferencijacije ili ekstrakta ćelije ili druge pripreme koja obuhvata faktore diferencijacije.

[0210] Na primer, diferencirane ćelije moguće je dobiti kultivisanjem nediferenciranih reprogramiranih ćelija u prisustvu barem jednog faktora diferencijacije i izborom diferenciranih ćelija iz kulture. Selekcija diferenciranih ćelija može biti zasnovana na fenotipu, kao što je ekspresija izvesnih markera ćelije na diferenciranim ćeljiama, ili funkcionalnim ogledima (npr., sposobnosti da se izvede jedna ili više funkcija određenog diferenciranog tipa ćelije).

[0211] U još jednom izvođenju, ove ćelije reprogramirane u skladu sa ovim pronalaskom se genetski modifikuju kroz dodavanje, brisanje, ili modifikaciju njihove DNK sekvence ili sekvenci.

[0212] Reprogramirane ili reverzno diferencirane ćelije su dobijene u skladu sa ovde datim objašnjenjem ili ćelija izvedenih iz reprogramiranih ili reverzno diferenciranih ćelija su korisne da se dostigne i u terapiji. Reprogramirane pluripotentne ćelije moguće je diferencirati u bilo koje ćelije u telu uključujući, bez ograničenja, kožu, hrskavicu, kosti skeletnog mišića, mišić srca, bubrega, jetre, krvi i formiranja krvi, ćelije vaskularnog prekursora i vaskularnog endotela, pankreasne beta ćelije, neurona, glija, mrežnjače, neurona, creva, pluća, i ćelija jetre.

[0213] Reprogramirane ćelije su korisne za regenerativnu/repetitivnu terapiju mogu biti transplantirane u pacijenta kom su potrebne. U jednom izvođenju, ove ćelije su autologne sa pacijentom.

[0214] Reprogramirane ćelije omogućene u skladu sa ovim pronalskom mogu biti korišćene, na primer, u terapijskim strategijama za lečenje bolesti srca, neuroloških bolesti, endokrinih bolesti, vaskularnih bolesti, bolesti mrežnjače, dermatoloških bolesti, poremećaja skeeletnog mišića, i drugih bolesti.

[0215] Na primer, i nije predviđen kao ograničenje, reprogramirane ćelije iz ovog objašnjenja moguće je koristiti da se obnove ćelije u životinjama čije su prirodne ćelije ispražnjene usled starosti ili terapije ablacije kao što je radioterapija i hemoterapija kancera. U drugom neograničavajućem primeru, reprogramirane ćelije iz ovog pronalaska su korisne u regeneraciji organa i obnove tkiva. U jednom izvođenju iz ovog objašnjenja, reprogramirane ćelije moguće je koristiti da se osnaži oštećeno tkivo mišića uključujući distrofičnih mišića i mišića oštećenih ishemijskim događajima kao što su infarkti miokarda. U još jednom izvođenju, ovde opisane reprogramirane ćelije moguće je koristiti da se poboljša zaceljivanje ožiljaka u životinjama, uključujući ljude, sledeći traumatsku povredu ili hirurški zahvat. U ovom izvođenju, reprogramirane ćelije iz ovog pronalaska se primenjuju sistemski, kao što je intravenski, i presele na mesto sveže traumatizovanog tkiva regrutovanog cirkulisanjem citokina izlučenih iz oštećenih ćelija. U još jednom izvođenju, reprogramirane ćelije moguće je primeniti lokalno na mesto gde je potrebno lečenje ili oporavak ili regeneracija.

[0216] U daljim izvođenjima, RNK korišćena u skladu sa ovim objašnjenjem kodira peptid ili protein, koji ima terapijsku vrednost. Ćelije koje sadrže RNK mogu, na primer, da budu manipulisane in vitro da izraze RNK i tako, peptid ili protein, korišćenjem ovde opisanih postupaka. Ćelije koje izražavaju peptid ili protein mogu naknadno da budu uvedene u pacijenta.

[0217] U posebno preporučenom izvođenju, RNK korišćena u ovom opisu kodira peptid ili protein koji obuhvata imunogen, antigen ili antigen peptida. U jednom izvođenju, peptid ili protein se procesira posle ekspresije da se dobije pomenuti imunogen, antigen ili antigen peptida. U jednom drugom izvođenju, peptid ili protein sam jeste imunogen, antigen ili antigen peptid. Moguće je koristiti ćelije koje izražavaju takav peptid ili protein i sadrže imunogen, antigen ili antigen peptid, na primer, u imunoterapiji da se podstakne odgovor imunog sistema protiv imunogena, antigena ili antigen peptida kod pacijenta.

[0218] "Antigen" u skladu sa ovim pronalaskom obuhvata bilo koju supstancu koja će podstaći odgovor imunog sistema. Specifičnije, "antigen" se odnosi na bilo koju supstancu koja reaguje specifično sa antitelima ili T limfocitima (T ćelije). Prema ovom objašnjenju, pojam "antigen" obuhvata bilo koji molekul koji obuhvata barem jedan epitop. Preporučljivo, antigen u kontekstu ovog objašnjenja jeste molekul koji, opciono posle procesiranja, indukuje reakciju imunog sistema , koja je preporučljivo specifična za antigen. Prema ovom objašnjenju, bilo koji pogodan antigen moguće je koristiti, koji je kandidat za reakciju imunog sistema, pri čemu reakcija imunog sistema može da bude i reakcija humoralnog imunog sistema i reakcija ćelijskog imunog sistema. U kontekstu izvođenja ovog objašnjenja, antigen je preporučljivo prisutan u ćeliji, preporučljivo putem ćelije u kojoj je prisutan antigen, u kontekstu MHC molekula, što kao rezultat daje reakciju imunog sistema protiv antigena. Antigen je preporučljivo proizvod koji odgovara ili je izveden iz antigena koji se prirodno javlja. Takvi antigeni koji se prirodno javljaju mogu da obuhvate ili mogu da budu izvedeni iz alergena, virusa, bakterija, gljivica, parazita i drugih infektivnih agenasa i patogena ili antigen može takođe da bude antigen tumora. Prema ovom objašnjenju, antigen može da odgovara proizvodu koji se javlja u prirodi, na primer, virusnom proteinu, ili njegovom delu.

[0219] U preporučenom izvođenju, antigen je antigen tumora, t.j. deo ćelije tumora, koji može biti izveden iz citoplazme, površine ćelije ili nukleusa ćelije, specifično one koje se primarno javljaju unutarćelijski ili kao površinski antigeni ćelija tumora. Na primer, antigeni tumora obuhvataju karcinoembrioni antigen, α1-fetoprotein, izoferitin, i fetusni sulfoglikoprotein, α2-H-feroprotein i γfetoprotein, kao i različite virusnog antigene tumora. Prema ovom objašnjenju, antigen tumora preporučljivo obuhvata bilo koji antigen koji je karakterističan za tumore ili kancere kao i za ćelije tumora ili kancera u pogledu tipa i/ili nivoa ekspresije. U još jednom izvođenju, antigen je antigen virusa kao što je virusni ribonukleoprotein ili protein obloge. Preciznije, antigen treba da bude predstavljen pomoću MHC molekula što daje kao rezultat modulaciju, posebno aktivaciju ćelija u imunom sistemu organizma, preporučljivo CD4+ i CD8<+>limfocita, preciznije preko modulacije aktivnosti receptora T ćelije.

[0220] U preporučenim izvođenjima, taj antigen je antigen tumora i ovo objašnjenje obuhvata stimulaciju anti-tumorskog CTL odgovora protiv ćelija tumora koje izražavaju takav antigen tumora i preporučljivo pretstavljaju takav antigen tumora sa klasom I MHC.

[0221] Pojam "imunogenost" se odnosi na relativnu učinkovitost antigena da indukuje reakciju imunog sistema.

[0222] Pojam "patogen" se odnosi na patogene mikroorganizme i obuhvata viruse, bakterije, gljivice, jednoćelijske organizme i parazite. Primeri za patogene viruse su virus imunodeficijencije kod čoveka (HIV), citomegalovirus (CMV), virus herpesa (HSV), virus hepatitisa A (HAV), HBV, HCV, papiloma virus, i virus T limfocita kod čoveka (HTLV). Jednoćelijski organizmi obuhvataju plazmodija tripanozome, amebu, itd.

[0223] Primeri antigena koje je moguće koristiti u skladu sa postupcima iz ovog objašnjenja su p53, ART- 4, BAGE, ss-katenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp- B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (or hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preporučljivo MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MY MAGE-A10, MAGE-A11, ili MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miozin/m, MUC1, MUM-1,-2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 manji BCR-abL, Plac-1, Pm1/RARa, PRAME, proteinaza 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ili RU2, SAGE, SART-1 ili SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE i WT, preporučljivo WT-1.

[0224] "Deo ili fragment antigena" ili "antigen peptid" prema ovom objašnjenju je preporučljivo nepotpuno predstavljanje antigena i sposobno je da podstakne odgovor imunog sistema protiv antigena.

[0225] U ovom kontekstu, objašnjenje takođe daje upotrebu peptida koji obuhvataju sekvence amino kiseline izvedene iz antigena, takođe se ovde pominju pod pojmom "antigen peptidi". Pod "antigen peptide", ili "antigen peptid izveden iz antigena" se misli na oligopeptid ili polipeptid koji obuhvata sekvencu amino kiseline koja uglavnom odgovara sekvenci amino kiseline fragmenta ili peptida antigena. Antigen peptida može da bude bilo koje dužine.

[0226] Preporučljivo, antigen peptidi su sposobni da stimulišu odgovor imunog sistema, preporučljivo ćelijski odgovor protiv antigena ili ćelija koje karakteriše ekspresija antigena i preporučljivo prisustvom antigena. Preporučljivo, antigen peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv neke ćelije koju karakteriše prisustvo antigena klase I MHC i preporučljivo sposoban da stimuliše CTL koji daje odgovor na antigen. Preporučljivo, antigen peptidi prema ovom pronalasku su MHC klasa I i/ili klasa II prisutnih peptida ili mogu biti prerađeni da proizvedu MHC klase I i/ili klase II prisutnih peptida. Preporučljivo, antigen peptidi obuhvataju sekvencu amino kiseline koja značajno odgovara sekvenci amino kiseline fragmenta antigena. Preporučljivo, pomenuti fragment antigena je MHC klasa I i/ili klasa II prisutnog peptida. Preporučljivo, antigen peptid prema ovom pronalasku obuhvata sekvencu amino kiseline koja značajno odgovara sekvenci amino kiseline takvog fragmenta i prerađena je da proizvede takav fragment, t.j., i MHC klase I i/ili klase II prisutnog peptida izvedenog iz antigena.

[0227] Ako antigen peptid treba da bude prisutan direktno, t.j., bez prerade, posebno bez cepanja, on ima dužinu koja je pogodna za vezivanje na MHC molekul, preciznije klasu I MHC molecula, i preporučljivo je dužine 7-20 amino kiselina, još preporučljivije dužine 7-12 amino kiselina, još preporučljivije dužine 8-11 amino kiselina, još preporučljivije dužine 9 ili 10 amino kiselina. Preporučljivo sekvenca peptida antigena koja treba da bude direktno prisutna se izvodi iz sekvence amino kiseline iz antigena, t.j., njegova sekvenca pretežno odgovara i preporučljivo je potpuno identična fragmentu antigena.

[0228] Ako antigen peptid treba da bude prisutan posle prerade, posebno posle cepanja, taj peptid proizveden preradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje na MHC molekul, precizniju klasu I MHC molecula, i preporučljivo je dužine 7-20 amino kiselina, još preporučljivije dužine 7-12 amino kiselina, još preporučljivije dužine 8-11 amino kiselina, još preporučljivije dužine 9 ili 10 amino kiselina. Preporučljivo, sekvenca peptida koja treba da bude prisutna posle prerade se izvodi iz sekvence amino kiseline iz antigena, t.j., njegova sekvenca pretežno odgovara i preporučljivo je potpuno identična fragmentu antigena. Otuda, antigen peptid prema ovom pronalasku u jednom izvođenju obuhvata sekvencu dužine 7-20 amino kiselina, poželjnije dužine 7-12 amino kiselina, još poželjnije dužine 8-11 amino kiselina, specifično dužine 9 ili 10 amino kiselina koja pretežno odgovara i preporučljivo je potpuno identična fragmentu antigena i posle prerade antigen peptida dopunjava prisutan peptid. Međutim, antigen peptid može takođe da obuhvata sekvencu koja pretežno odgovara i preporučljvo je potpuno identična fragmentu antigena koji je čak duži od gore navedene sekvence. U jednom izvođenju, antigen peptid može obuhvatiti celu sekvencu antigena.

[0229] Peptidi koji imaju sekvence amino kiseline pretežno odgovarajuće sekvenci peptida koji je prisutan putem klase I MHC može da se razlikuje na jednom ili više ostataka koji nisu ključni za prepoznavanje TCR tog peptida kako je predstavljeno klasom I MHC, ili za vezivanje peptida na MHC. Takvi pretežno odgovarajući peptidi su takođe sposobni da stimulišu CTL. koji daje odgovor na antigen. Peptidi koji imaju sekvence amino kiseline različite od predstavljenog peptida na ostacima koji ne utiču na TCR prepoznavanje već poboljšavaju stabilnost vezivanja na MHC mogu poboljšati imunogenost antigen peptida, i mogu da se pominju ovde ''kao optimizovani peptid''. Korišćenje postojećeg znanja o tome za koji od ovih ostataka može biti verovatnije da utiče na vezivanje bilo na MHC ili na TCR, može da se koristi racionalni pristup projektovanju pretežno odgovarajućih peptida. Peptidi koji nastaju kao rezultat ovoga a koji su funkcionalni se posmatraju kao antigen peptidi.

[0230] "Prerada antigena" se odnosi na raspadanje antigena u fragmente (npr., raspadanje proteina u peptide) i povezivanje jednog ili više ovih fragmenata (npr., preko vezivanja) sa MHC molekulima za prisustvo ''ćelija u kojima je prisutan antigen'' na specifične T ćelije.

[0231] "Ćelije u kojima je prisutan" (APC) su ćelije u kojima su prisutni fragmenti peptida antigena proteina u vezi sa MHC molekulima na površini njihove ćelije. Neki APC mogu aktivirati T ćelije specifične za antigen.

[0232] Pojam "imunoterapija" se odnosi na lečenje koje obuhvata aktivaciju specifične reakcije imunog sistema.

[0233] Pojam "in vivo" se odnosi na situcaciju kod subjekta.

[0234] Pojmovi "subjekat" i "pojedinac" se koriste naizmenično da se odnose na sisare. Na primer, sisari u kontekstu ovog pronalaska su ljudi, nehumani primati, pripitomljene životinje kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, gvinejska prasad, itd. kao i životinje u zatočeništvu kao što su životinje u zološkim vrtovima. Pojam "životinja" kako se ovde koristi takođe obuhvata ljude. Pojam "subjekat" može takođe da obuhvati pacijenta, t.j. životinju, preporučljivo čoveka koji ima bolest.

[0235] Ako u skladu sa ovim objašnjenjem želi primeniti lek subjektu, supstanca za primenu se generalno primenjuje u farmaceutski kompatibilnim količinama i u farmaceutski kompatibilnim preparatima. Pojam "farmaceutski kompatibilan" se odnosi na netoksični materijal, koji ne reaguje sa aktivnošću aktivne komponente farmaceutske supstance. Preparati ove vrste mogu obično da sadrže soli, puferske supstance, konzervanse, ekscipijente i nosače i primenjuju se kao lek na način poznat stručnjaku u ovoj oblasti.

[0236] Ovaj opis je opisan detaljno putem slika i primera datih dole u tekstu a koji se koriste samo u svrhu ilustracije.

PRIMERI

Primer 1:

Kultura ćelije

[0237] Primarni ljudski fibroblasti prepucijuma novorođenčeta (CCD-1079Sk, CCDs), BJ ljudski fibroblasti prepucijuma za neonatalnu odojčad su dobijeni iz ATCC (Manassas, VA, USA) i kultivisani u MEM (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) dopunjeni sa 10% toplotom inaktiviranog zlatnog seruma goveđeg fetusa (PAA Labratories, Pasching, Austria), 1x neesencijalne amino kiseline (Invitrogen), 1 mM natrijum piruvat (Invitrogen), 2 mM glutamin (Invitrogen), 50 U/ml penicilin (Invitrogen) and 50mg/ml streptomicin (Invitrogen). Još jedno punjenje ljudskih fbroblasta prepucijuma za neonatalnu odojčad, (HFF) su dobijeni iz SBI (Mountain View, CA, USA) i kultivisani slično CCD i BJ. Mišji embrionski fibroblasti (MEFs) su izolovani sa 14 dana starosti C57BL/6 mišji embrioni i kultivisani u DMEM (Invitrogen) dopunjeni sa 15% toplotom neaktiviranog seruma goveđeg fetusa, 1x neesencijalnih amino kiselina, 1 mM natrijum piruvat, 2 mM glutamin, 50 U/ml penicilin i 50 µg/ml streptomicina. Ljudski epidermalni kerratinociti su dobijeni iz PromoCell (Heidelberg, Germany) i kultivisani u keratinocitnom bazalnom medijumu 2 sa aditivima koje je dodao dobavljač (PromoCell, Heidelberg, Germany). Ljudske ćelije endotela vene pupčane vrpce (HUVEC) iz Lonza (Walkersville, MD, USA) su kultivisane korišćenjem Clonetics ® Endothelial Cell System (Lonza).

[0238] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) su izolovane putem Ficoll Hypaque (Amersham Biosciences, Glat tbrugg, Switzerland) centrifugiranja u gradijentu gustine iz tzv. ''buffy coats'' frakcija krvi dobijenih iz banke krvi od zdravih donatora. Monociti su obogaćeni iz PBMCs sa anti-CD 14 mikroperlicama (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Da bi se dobile nezrele dendritske ćelije (iDCs), monociti su diferencirani tokom 5 dana u RPMI 1640 podlozi (Invitrogen) sa 2mM glutamin, 100 U/ml penicilin, 100 µg/ml streptomicin, 1 mM natrijum piruvat, 1x neesencijalne amino kiseline, 10% toplotom inaktiviran ljudski AB-serum dopunjen sa 1000 U/ml GM-CSF (Essex, Luzern, Switzerland) i 1000 U/ml IL-4 (Strathmann Biotech, Hamburg, Germany).

Generisanje in vitro transkribovanih RNK

[0239] Konstrukti plazmida korišćeni kao uzorci za in vitro transkripciju RNK kodiranjem luciferaze, eGFP, destabilizovan eGFP (d2eGFP), OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, LIN28, NANOG, SV40 veliki T antigen, E6, p53-DD, E3 i K3 su bazirani na pST1-2hBgUTR-A120 (Holtkamp 2006). Sekvenca nukleotida gena je bila kodon optimizovan da poveća GC sadržaj i da poveća translaciju u ciljnim ćelijama. Za generisanje in vitro transkribovanih RNK, plazmidi su linearizovani nizvodno od poli(A) repa korišćenjem restriktivne endonukleaze klase II. Linearizovani plazmidi su prečišćeni putem ekstrakcije fenol hloroforma i taloženjem etanola, kvantifikovani spektrofotometrički, i podvrgnuti in vitro transkripciji sa T7 RNK, polimerazom korišćenjem MEGAscript T7 kompleta (Ambion, Austin, TX, USA). Za inkorporiranje cap analoga β-S-ARCA (D1), 6 mM tog analoga je dodato u reakciju pritom je GTP koncentracija snižena do 1,5 mM. Reakcije su inkubirane 3-6 časova na 37°C, DNase (Ambion) tretirane i prečišćene korišćenjem MEGAclear kompleta (Ambion) prema ovom proizvođaču.

Transfer IVT-RNK u ćelije

[0240] Transfer IVT-RNK u ćelije je izvedeno elektroporacijom (EP). U ovom cilju, 1-10x10<7>ćelija po EP je prikupljeno, prane su u sledu sa PBS dopunjenim sa 2 mM EDTA i X-VIVO 15 podlogom (Lonza), vraćene su u suspenziju u 125 µl X-VIVO 15 podlozi i prenete su na 2-mm otvor sterilne kivete za elektroporaciju (Bio-RAD, Hercules, CA, USA). Odgovarajuća količina in vitro transkribovane RNK je dodata i ćelije su elektropermeabilizovane korišćenjem BTX ECM® 830 Electroporation System (BTX, Holliston, MA, USA) i prethodno optimizovanih parametra elektroporacije za CCDs (110 V, 3x12 ms impuls, 400 ms interval), BJs (110V, 3x12 ms impuls, 400 ms interval), MEFs (125V, 5x6 ms impuls, 400 ms interval), HFFs (125V, 1x24ms pulse), keratinociti (125 V, 4x6 ms impuls, 200 ms interval) i HUVECs (125 V, 1x20 ms impuls). Ljudski PBMCs i iDC su elektroporisani u 4-mm otvoru sterilne kivete za elektroporaciju (Bio-RAD) korišćenjem Gene-Pulser-II aparata (Bio-Rad, Munich, Germany) sa postavkama za napon i električni kapacitet 450V/250 µF (PBMC) 300V/150 µF (iDC). Ćelije su razblažene u podlozi kulture neposredno posle elektroporacije.

Ogledi sa genom reporterom

[0241] Za oglede luciferaze, ćelije su elektroporisane sa in vitro transkribovanom RNK kodiranjem za luciferazu su raspoređene u 96 pregrada mikroploče sa belim ravnim dnom (Nunc, Langenselbold, Germany) i inkubirane na 37°C. Liza ćelija je izvedena korišćenjem ’Bright-Glo Luciferase Assay System’ (Promega, Madison, WI, USA). Fluks bioluminiscencije je izmeren sa čitačem luminiscencije Infinite M200 mikroploče (Tecan, Crailsheim, Germany) sa vremenom integracije od 1 s. Podaci o aktivnosti luciferaze predstavljeni ovde se računaju po sekundi.

[0242] Za kvantifikaciju d2eGFP i eGFP proteina, ćelije su oprane u PBS, fiksirane korišćenjem PBS dopunjenog sa 2% formaldehida i analiziranog protočnom citometrijom na FACS Canto II protočnom citometru (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Raspoređivanje na ulazu je izvedeno na živim ćelijama i srednji intenzitet fluorescencije (MFI) GFP ekspresije populacija ćelije je kvantifikovan korišćenjem FlowJo softvera (Tree Star, Ashland, OR, USA). Subpopulacije ljudske T ćelije elektroporisanih PBMC su bojene sa CD4 ili CD8 reaktivnim fluorescentnim antitelima pre protočne citometrije. Propuštanje na ulazu je izvedeno na živim CD4+ i CD8+ T ćelijama i GFP ekspresija i MFI obe subpopulacije T ćelije je određena protočnom citometrijom.

Kvantifikacija nivoa transkripta reverznom transkriptazom PCR u realnom vremenu

[0243] Ukupna ćelijska RNK je ekstrahovana iz ćelija sa RNeasy mini kompletom ili RNeasy mikro kompletom (Qiagen, Hilden, Germany), reverzno transkribovana sa oligo-dT18 korišćenjem Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), i podvrgnuta kvantitativnoj analizi u realnom vremenu na instrumentu i softveru za sistem za detekciju sekvence: ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) korišćenjem QuantiTect SYBR Green PCR kompleta (Qiagen). Reakcije su izvedene trostruko sa početnicom koja pojačava specifični region kodonom optimizovane OCT4

(OCT4-s: 5’-ACCTGGAAAACCTGTTCCTGC-3’ (SEK ID BR: 14); OCT4-as: 5’-AGCTCGGATCCTCATCAGTTG- 3’ (SEK ID BR: 15)),

SOX2 (SOX2-s: 5’-AACCAGCGGATGGACAGCTAC-3’ (SEK ID BR: 16); SOX2-as: 5’-GCTTTTCACCACGCT- GCCCAT-3’ (SEK ID BR: 17)),

KLF4 (KLF4-s: 5’-AAGACCTACACCAAGAGCAGC-3’ (SEK ID BR: 18); KLF4-as: 5’-AGGTGGTCAGATCTGCT-GAAG-3’ (SEK ID BR: 19)) i

cMYC (cMYC-s: 5’-CCCCTGAACGACAGCTCTAGC-3’ (SEK ID BR: 20); cMYC-as: 5’-TTCTCCACGGACAC-CACGTCG-3’ (SEK ID BR: 21)) ili

endogene transkripte od

IFNα (IFNα-s: 5’-AAATACAGCCCTTGTGCCTGG-3’ (SEK ID BR: 22); IFNα-as: 5’-GGTGAGCTGGCATACGAAT-CA-3’ (SEK ID BR: 23)),

IFNβ (IFNβ-s: 5’-AAGGCCAAGGAGTACAGTC-3’ (SEK ID BR: 24); IFNβ-as: 5’-ATCTTCAGTTTCGGAGGTAA-3’ (SEK ID BR: 25)),

GDF3 (GDF3-s: 5’-TCCCAGACCAAGGTTTCTTTC-3’ (SEK ID BR: 26); GDF3-as: 5’-TTACCTGGCTTAGGGGT- GGTC-3’ (SEK ID BR: 27)) i

TERT (TERT-s: 5’-CCTGCTCAAGCTGACTCGACACCGTG-3’ (SEK ID BR: 28); TERT-as: 5’-GGAAAAGCT- GGCCCTGGGGTGGAGC-3’ (SEK ID BR: 29)) (svaki 333nM)

sa početnom denaturacijom/aktivacijom za 15 min na 95°C, i 40 ciklusima od 30 s na 95°C, 30 s na temperaturi specifičnoj za temperiranje početnice (OCT4, cMYC, IFNα, IFNβ, GDF3, TERT: 60°C; SOX2: 64°C; KLF4: 58°C) i 30 s na 72°C. Ekspresija transkripata je kvantifikovana korišćenjem ∆∆Ct kalkulacije u odnosu na HPRT kodiranje RNK kao unutrašnjim standard (HPRT-s, 5’-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3’ (SEK ID BR: 30); HPRT-as: 5’-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3’ (SEK ID BR: 31); PCR uslovi kako je gore navedeno sa 62°C kao temperaturom temperiranja) da se normalizuje za varijante u kvalitetu RNK i količini ulazne komplementarne DNK.

Unutarćelijsko FACS bojenje za OCT4, SOX2 i NANOG

[0244] Unutarćelijsko FACS bojenje OCT4, SOX2 i NANOG je urađeno korišćenjem kompleta za analizu faktora transkripcije ljudske pluripotentne matične ćelije prema uputstvima proizvođača (BD Bioscience). Ukratko, 3-5x10<5>ćelije su prikupljene, oprane dva puta sa PBS i fiksirane tokom 20 min u 250 µl puferskog sredstva BD Cytofix Buffer (BD Biosciences) na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije ćelije su oprane dva puta sa PBS i permeabilizovane pranjem dva puta sa puferskim sredstvom za pranje 1xPerm/Wash Buffer (BD Bioscience) posle čega je usledila inkubacija u trajanju od 10 minuta u 50 µl 1x Perm/Wash na sobnoj temperaturi. Bojenje sa izotipom kao kontrolom i specifična antitela su izvedena tokom 30 min na sobnoj temperaturi u mraku posle čega je usledilo pranje dva puta sa 1xPerm/Wash. Ćelije su vraćene u suspenziju u PBS suplementirane sa 2% formaldehidom i analizirane protočnom citometrijom kako je gore opisano.

Primer 2:

[0245] Primarni ljudski fibroblasti prepucijuma (CCD1079SK) su elektroporisani sa 1 µg IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca i 5 µg IVT RNK kodiranje za destabilizovan GFP (luc+GFP). Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara. Ćelije su raspoređene na ploče sa 6 pregrada u gustini od 300000 ćelija/pregradi, i, ili su ostavljene netretirane, ili su inkubirane sa 2 µM C13H8N4OS (PKR inhibitor). Posle 24 časa ćelije su prikupljene za ukupnu RNK ekstrakciju i reverznu transkriptazu. Indukcija interferona tipa I je procenjena putem qRT-PCR korišćenjem specifične početnice za IFNα ili IFNβ u prisustvu ili odsustvu PKR inhibitora kako je navedeno na Sl.1. Paneli A i C pokazuju iste uzorke kao B i D sa smanjenim vrednostima y-ose.

[0246] Primećena je uzvodna regulacija transkripata interferona u ljudskim fibroblastima indukovanim pomoću RNK elektroporacije (Sl 1A i 1C). Neočekivano, inhibicija PKR korišćenjem C13H8N4OS je dala kao rezultat ogromno povećanje transkriapta interfereona (Sl 1B i 1D): IFN-α je indukovan čak i u odsustvu RNK, IFN-β je indukovan putem C13H8N4OS samo u prisustvu RNK. Ovi podaci pokazuju da inhibicija PKR korišćenjem inhibitora malog molekula ne ukida putanju odgovora interferona.

Primer 3:

[0247] Ljudski i mišji primarni fibroblasti su elektroporisani sa IVT RNK kodiranjem gena reportera za luciferazu svitaca i GFP. Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za svaki tip ćelije. Odmah posle elektroporacije ćelije su raspoređene u odsustvu ili prisustvu povećanja koncentracija C13H8N4OS PKR inhibitora.

[0248] Kao što je prikazano na Sl. 2 i 3 od doze zavisno povećanje gena reportera luciferaze i GFP je primećeno kod ljudskih i mišjih fibroblasta. U prisustvu najviše koncentracije korišćene (2 µM), primećeni su visok nivo stabilizacije luciferaze i GFP ekspresije.

Primer 4:

[0249] Primarne ljudske ćelije endotela vene pupčane vrpce (HUVECs) su elektroporisane sa IVT RNK i dejstvo PKR inhibicije na ekspresiju gena reportera je analizirano u sličnim eksperimentalnim podešavanjima kako je gore opisano. Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za HUVEC. Ekspresija luciferaze je pospešena u HUVECs na od doze zavisan način. Međutim, ekspresija nije jednako dugotrajna kako je primećeno u fibroblastima (Sl 4).

[0250] Sledeći slični eksperimenti su izvedeni sa ljudskim CD4 i CD8 pozitivnim T ćelijama kao i nezrelim dendritskim ćelijama (iDCs). Elektroporacije su izvedene korišćenjem optimizovanih parametara za svaki tip ćelije. Nasuprot našim prethodnim zapažanjima u ćelijama fibroblasta i ćelijama endotela, niti su T ćelije niti su iDCs PKR inhibicija dovele do povećane GFP ekspresije (Sl.5A, B). Kod iDC, inhibicija PKR je kao rezultat dala gubitak ekspresije luciferaze (Sl.5C).

Primer 5:

[0251] Da bi se istražilo da li primećena stabilizacija ekspresije gena reportera postoji zahvaljujući ireverzibilnoj inhibiciji PKR putem većih koncentracija C13H8N4OS odlučili smo da izvedemo prelazna tretiranja elektroporisanih ćelija. Pored toga drugi PKR inhibitor, 2-aminopurin (2-AP) je obuhvaćen u ovaj eksperiment. Oba inhibitora su korišćena pri finalnim koncentracijama 2 µM. Kao što je prikazano na Sl. 6, povećana translacija proteina iz IVT RNK je zavisna od vremena inkubacije sa oba inhibitora. Period inkubacije od 7 časova sa bilo PKR inhibitorom nije dao kao rezultate značajno povećanje ekspresije luciferaze i 24 satnu terapija je brzo reverzovana posle uklanjanja inhibitora. Čak i 48 satna terapija je bila manje efikasna od trajne terapije. Ovi podaci pokazuju da je PKR inhibitor reverzibilan. Trajna inhibicija daje kao rezultat visoke nivoe ekspresije tokom 5 dana.

Primer 6:

[0252] Virusni protein koji su poznati da inhibiraju PKR, naime proteine E3 i K3 virusa vaccinia, su istraživani. Oba proteina su kodirana pomoću IVT RNK i kontransferovana putem elektropermeabilnosti u fibroblaste, zajedno sa genima reporterima IVT RNK kodiranja. Pored toga, inkubirali smo deo ćelija sa 2 µM C13H8N4OS da se istraže dejstva aditiva I virusni proteini su odveli do 2-strukog povećanja u ekspresiji luciferaze 24 časa posle elektroporacije. Nije bilo nikakvog aditivnog dejstva ova dva proteina. Takođe, ekspresija je stabilizovana kako je primećeno kod inhibitora malih molekula, ali je brzo opala do istih nivoa kao i kontrole bez virusnih proteina (Sl. 7A). Dodatna primena C13H8N4OS je dala kao rezultat povećanje aditiva ekspresije luciferaze i stabilizaciju u poređenju sa netretiranm kontrolama kako je viđeno ranije sa inhibicijom malog molekula PKR (Sl. 7B). Slični eksperimenti sa HUVEC ćelijama su otkrili da je kombinacija E3 i K3 povećala eksprresiju luciferaze, koja je dodatno pospešena pomoću C13H8N4OS na način zavisan od doze (Sl 7C).

[0253] U sličnom nizu eksperimenata smo istraživali da li bi virusni proteini mogli da spasu nepostojeća dejstva C13H8N4OS u T ćelijama ili da vrate inhibitorna dejstva u dendritske ćelije. Kako je priakzano na Sl. 8A i 8B, virusni proteini koji inhibiraju PKR nisu povećali ekspresiju gena reportera u T ćelijama, niti u prisustvu niti u odsustvu C13H8N4OS . Za iDC, virusni proteini - kako je primećeno pre za inhibitor - su smanjili ekspresiju luciferaze. Takođe, E3 i K3 nije okrenuti negativno dejstvo C13H8N4OS na ekspresiju luciferaze (Sl.8C).

Primer 7:

[0254] Slični eksperimenti kako je gore opisano su izvedeni korišćenjem IVT RNK sastavljene od nemodifikovanih nukleotida kao ranije, i IVT RNK koja je sastavljena od 5 mC i PU umesto citidina i uridina. Kako je prikazano na Sl. 9, ekspresija luciferaze u ćelijama elektroporisanim sa nemodifikovanom IVT-RNK je u velikom meri pospešena i stabilizovana pomoću 2 µM C13H8N4OS i rekapitulira naša prethodna otkrića. Inkorporiranje 5mC i PU u transkripte povećava ekspresiju luciferaze za oko 2-struko u poređenju sa nemodifikovanom kontrolom. Upotreba 2 µM C13H8N4OS dodatno povećava i stabilizuje ekspresiju luciferaze kodirane modifikovanim IVT RNK.

Primer 8:

[0255] Istražili smo stabilnost reprogramiranja ekspresije faktora transkripcije posle transfera IVT RNK.

U sličnim eksperimentima opisanim gore, tretirali smo elektroporisane ćelije bilo trajno sa povećanjem koncentracija C13H8N4OS, ili tranzijentno sa 2 µM C13H8N4OS. Kako je prikazano na Sl. 10, ekspresija faktora transkripcije OCT4, Nanog i SOX2 je jako povećana i stabilizovana u tretiranim ćelijama na način koji je zavisio od doze i vremena.

[0256] Direktna posledica reprogramiranja ekspresije faktora transkripcije je uvođenje pluripotentnih marker gena na transkripcionom nivou. Da bi se istražilo da li stabilizovana i povećana ekspresija faktora transkripcije pomoću PKR inhibicije olakšava indukciju markera, elektroporisali smo CCD1079Sk fibroblaste sa IVT RNK kodiranjem velike T, HPV16-E6, p53DD, OCT4, SOX2, KLF4, CMYC, Nanog i LIN28 (TEP-OSKMLN). Kako je prikazano na Sl. 11, GDF3 i hTERT indukcija je povećana terapijom tokom 72 časa posle elektroporacije.

Primer 9:

[0257] Da bi se istražilo da li je primećena stabilizovana ekspresija proteina povezana sa povećanim poluživotom transfektovane IVT RNK, mi smo pristupili koraku unutarćelijske IVT RNK degradacije. U ovu svrhu, istražili smo unutarćelijski nivo prenete IVT RNK 72 časa posle elektroporacije u tranzijentno tretiranim i netretiranim ćelijama. Kako je prikazano na Sl. 12A, tranzijentno tretiranje ćelija sa 2 µM C13H8N4OS je povećalo obilje IVT RNK tokom 72 časa. U skladu sa ovim podacima, poluživot IVT RNK konstrukata OCT4, SOX2, KLF4 i cMYC je produžen tokom 1-2,5 časa pod PKR-Inhibicijom kao što se vidi na Sl.12B. Stabilizacija ekspresije reportera pod PKR-inhibicijom je samim tim u nekoj meri bazirana na stabilizaciji IVT-RNK konstrukata.

Primer 10:

[0258] Primarni ljudski fibroblasti prepucijuma (HFF) su elektroporisani sa IVT RNK kodiranjem eGFP (10 µg) bilo nemodifikovanih ili modifikovanih (mod.) sa 5-metilcitidinom (5mC) i pseudouridinom (PU) ili nemodifikovanim eGFP (10 µg) i sa 3 µg modifiikovanog (5mC i PU) E3 i K3 kako je naznačeno na Sl.

13. Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za HFF. 300.000 ćelija/pregradi je postavljeno u ploče sa 6 pregrada i ili su ostavljene netretirane ili inkubirane sa 2 µM C13H8N4OS. Posle 24 časa supernatanti su prikupljeni i izmereno im je izlučivanje IFN korišćenjem ljudskog IFNα i β Kit od PBL Interferon Source.

[0259] IVT-RNK indukuje izlučivanje IFNβ posle elektroporacije. Izlučivanje je značajno pospešeno kada se ćelije inkubiraju sa C13H8N4OS. Ovi rezultati su u skladu sa rezultatima iz qRT-PCR. Kako je očekivano, indukcija IFNβ je smanjena kada je IVT-RNK modifikovana sa 5mC i PU. Dodavanje E3 i K3-IVT-RNK nema nikakvo dejstvo. Izlučivanje IFNα nije primećeno u ovim eksperimentima (podaci nisu prikazani).

Primer 11:

[0260] Primarni fibroblasti ljudskog prepucijuma (CCD1079Sk) su elektroporisani sa povećanjem količine siRNK- mešavine ciljanjem PKR (Santa Cruz; sc-36263) u opsegu od 20 nM do 80 nM. Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za CCD. Ćelije su raspoređene u 6 pregrada i 24 časa ili 48 časova kasnije su prikupljene za ukupnu RNK ekstrakciju i reverznu transkriptazu. Nivo ekspresije PKR je procenjen pomoću qRT-PCR korišćenjem specifične početnice. Prikazani su relitivni nivoi ekspresije u poređenju sa ćelijama divljeg tipa. Utvrđeno je da je PKR oboren do 5-10% sa svim koncentracijama od siRNK-mešavine 24 časa posle elektroporacije. Samo 80 nM su dovoljni da se obori PKR tokom 48 časova; cf. Sl.14(A).

[0261] Primarni ljudski fibroblasti prepucijuma (CCD1079Sk) su elektroporisani sa IVT RNK kodiranjem nemodifikovanog eGFP (1,5 µg) bilo sami ili uz povećanje količine siRNK-mešavine ciljanjem PKR u opsegu od 20 nM do 80 nM. Elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za CCD. Ćelije su raspoređene u 6 pregrada i 24 časa kasnije prikupljene za ukupnu RNK ekstrakciju i reverznu transkripciju . Nivoi ekspresije gena za IFN-odgovor OAS1 i OAS2 su procenjeni pomoću qRT-PCR korišćenjem specifične početnice. Prikazani na Sl. 14(B) su relitivni nivoi ekspresije u poređenju sa ćelijama divljeg tipa. Utvrđeno je da nivoi ekspresije OAS1 i OAS2 nisu značajno promenjeni dodavanjem siRNK-mešavine koja označava da siRNK ne indukuje IFN posle elektroporacije. (Nasuprot tome izgleda da postoji tendencija da se smanji IFN odgovor primenom visokih doza PKR siRNK-mešavine)

[0262] Primarni ljudski fibroblasti prepucijuma (CCD1079Sk) su elektroporisani sa ili bez 80 nM siRNK-mešavinom ciljane PKR. Posle 48 časova ćelije su prikupljene i elektroporisane drugi put sa 1 µg IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca i za eGFP (2,5 µg). Sve elektroporacije su izvedene u kivetama sa 2-mm otvorom korišćenjem optimizovanih parametara za CCD. Ove ćelije su postavljene u duplikatima na ploče sa 96 pregrada pri gustini od 10000 ćelija/pregradi i onda su ili su ostavljene netretirane ili inkubirane sa 2 µM C13H8N4OS. Aktivnost luciferaze je izmerena u vremenskim tačkama indukovanim na Sl. 14(C). Date su srednje vrednosti duplikata. Utvrđeno je da je elektroporacija ćelije prethodno inkubiranih sa siRNK ciljanjem PKR i samim tim je u stanju nedostatka PKR što vodi do sasvim sličnog kinetičkog i povećanja ekspresije gena reportera kao inkubacija sa 2 µM PKR inhibitora C13H8N4OS sa nešto nižim stabilizujućim dejstvom. Kombinacija preinkubacije sa siRNK- mešavinom ciljanjem PKR i upotreba inhibitora vodi čak višem nivou ekspresije transkripta reportera ali nije mnogo stabilizovana kao u prisustvu samog inhibitora.

Primer 12:

[0263] Da bi se proučilo da li bi C13H8N4OS mogla da pospeši i translaciju posle lipozomnog IVT RNK transfera, 1,2 µg 5’- trifosforilisan i nemodifikovana IVT RNK (0,8 µg kodiranjem luciferaze, 0,4 µg GFP) je spakovan sa 6 µl RNKiMAKS reagensom transfekcije (Invitrogen) i transfektovana u ljudske fibroblaste prepucijuma. Posle inkubacije od 3 časa sa mešavinom za transfekciju, podloga je obnovljena i dopunjena sa povećanjem koncentracija C13H8N4OS. U vremenskim tačkama navedenim na Sl. 15 ćelije su lizovane korišćenjem puferskog sredstva pasivne lize stabilizujuće luciferaze (Promega) u skladu sa proizvođačevim uputstvima. Do kraja ovog vremenskog toka, izmerena je aktivnost luciferaze svih lizata. C13H8N4OS je imao stabilizuće dejstvo na translaciju luciferaze. Ovaj efekat je bio zavisan od doze. Prikazan je jedan od tri nezavisno izvedena eksperimenta. Dakle, dejstvo C13H8N4OS na translaciju IVT RNK nije ograničeno na isporuku preko elektroporacije. C13H8N4OS takođe pospešuje translaciju luciferaze kada je IVT RNK dovedena u ćelije pomoću lipozoma. Dejstvo C13H8N4OS je samim tim nezavisno iz rute isporuke.

Primer 13:

[0264] Ljudski fibroblasti prepucijuma su elektroporisani sa 2 µg IVT RNK kodiranjem za luciferazu svitaca i 5 µg IVT RNK kodiranje za GFP. Posle elektroporacije ćelije su raspoređene na ploče u prisustvu povećanja koncentracija 2-AP kako je navedeno na legendi ploče na Sl. 16. 2 µM C13H8N4OS je služio kao pozitivna kontrola. Ekspresija luciferaze je usledila tokom 72 časa je usledila tokom 72 časa. GFP ekspresija je potvrdila da su sve elektroporacije bile uspešne (podaci nisu prikazani).10 mM do 20 mM 2- AP vodi sličnom povećanju translacije kao 2 µM C13H8N4OS.

SPISAK SEKVENCI

[0265]

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Postupak za dobijanje ćelija koje imaju karakteristike matičnih ćelija in vitro koji oobuhvata korake (i) smanjenja aktivnosti od RNK zavisne kinaze proteina (PKR) u populaciji ćelija koja obuhvata somatske ćelije, (ii) uvođenje RNK koja može da ispoljava jedan ili više faktora koji omogućavaju reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matičnih ćelija u barem deo somatskih ćelija, i (iii) omogućavanje razvoja ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije.

2. Postupak iz patentnog zahteva 1, pri čemu jedan ili više činilaca obuhvata OCT4 i SOX2.

3. Postupak iz patentnog zahteva 2, pri čemu jedan ili više činilaca obuhvata ELF4 i/ili c-MYC i/ili NANOG i/ili LIN28.

4. Postupak iz jednog ili više patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu korak smanjenja aktivnosti PKR u ćelijama daje kao rezultat pospešivanje stabilnosti i/ili pospešivanje ekspresije RNK u tim ćelijama.

5. Postupak iz patentnog zahteva 4, pri čemu pospešivanje ekspresije RNK u tim ćelijama obuhvata povećanje nivoa ekspresije i/ili povećanje trajanja ekspresije RNK u tim ćelijama.

6. Postupak iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu korak smanjenja aktivnosti PKR u ćelijama obuhvata tretiranje ćelija barem jednim PKR inhibitorom ili prigušivanje ekspresije PKR gena.

7. Postupak iz patentnog zahteva 6, pri čemu PKR inhibitor suzbija sa RNK indukovanu PKR autofosforilaciju.

8. Postupak iz patentnog zahteva 6 ili 7, pri čemu PKR inhibitor jeste jedinjenje imidazolo-oksindola, 2-aminopurin ili virusno izveden inhibitor PKR.

9. Postupak iz patentnog zahteva 8, pri čemu pomenuti imidazolo-oksindol jeste 6,8-dihidro-8-(1H-imidazol-5-ilmetilen)-7H-pirolo[2,3-g]benzotiazol-7-on i pri čemu se virusno izveden inhibitor PKR bira iz grupe koja obuhvata virus za vakcinu E3 i/ili K3, ili njihov RNK.

10. Postupak iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu somatske ćelije jesu fibroblasti.

11. Postupak iz patentnog zahteva 10, pri čemu pomenuti fibroblasti jesu fibroblasti pluća, fibroblasti prepucijuma ili fibroblasti kože.

12. Postupak za dobijanje diferenciranih tipova ćelije obuhvata korake (i) dobijanja ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije korišćenjem postupka iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 11, i (ii) kultivacije ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije pod uslovima koji indukuju ili usmeravaju delimičnu ili potpunu diferencijaciju u diferencirani tip ćelije.