RS56431B1 - Antitela protiv adp-ribozil ciklaze 2 - Google Patents

Description

Opis

UVOD

[0001] Predmetni opis se generalno odnosi na oblasti imunologije i molekularne biologije. Specifičnije, ovde su obezbeđena antitela i drugi terapeutski proteini protiv ADP-ribozil ciklaze 2, nukleinske kiseline koje kodiraju takva antitela i terapeutski proteini, postupci za pripremu monoklonskih antitela i drugih terapeutskih proteina, i postupci za tretman bolesti, kao što su kanceri posredovani sa ekspresijom/aktivnošću ADP-ribozil ciklaze 2 i/ili stoga povezani sa abnormalnom ekspresijom/aktivnošću liganada.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] ADP-ribozil ciklaza 2 (takođe poznata kao stromalni antigen 1 kostne srži (BST1) ili CD157) je lipidnousidreni, bi-funkcionalni ektoenzim koji katalizuje ciklizaciju i hidrolizu ribonukleotida. Stvara nukleotidne sekundarne glasnike cikličnu ADP-ribozu i ADP-ribozu koji su sposobne da aktiviraju oslobađanje kalcijuma i fosforilaciju proteina (FEBS Lett.1994, 356(2-3):244-8). Sposobna je da potpomogne rast pre-B ćelija na parakrini način, verovatno preko stvaranja NAD+ metabolita (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91:5325-5329; J Biol Chem.

2005, 280:5343-5349).

[0003] Izgleda da ADP-ribozil ciklaza 2 i njen homolog, CD38, deluju kao receptori, koji stvaraju meatbolite sekundarne glasnike koji indukuju intracelularno oslobađanje Ca<2+>preko rianodin receptora (Biochem Biophys Res Commun. 1996, 228(3):838-45). Takođe može delovati preko CD11b integrina da postigne oslobađanje Ca<2+>preko puta PI-3 kinaze (J Biol Regul Homeost Agents. 2007;21(1-2):5-11). Ranije nije objavljeno da je BST1 poreklom od memebrane ćelija akutne mijeloidne leukemije (AML), kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera pluća ili kancera pankreasa i predstavlja protein nove terapeutske i dijagnostičke vrednosti. Takođe je pokazano da je BST1 eksprimiran na monocitima i granulocitima, pri čemu oba mogu biti povezana sa i aktivirana kod bolesti kao što su astma, giht, Kron, lupus i dijabetes. Monociti su takođe uključeni u razvoj aterosklerotičnih plakova.

REZIME PRONALASKA

[0004] Predmetni opis obezbeđuje antitela usmerena protiv BST1, nukleinskih kiselina koje kodiraju takva antitela i terapeutske proteine, postupke za pripremu anti-BST1 antitela, i upotrebu antitela za tretman bolesti, kao što su bolesti posredovane sa BST1, npr. humani kanceri, uključujući akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), B-ćelijsku hroničnu limfocitnu leukemiju, kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer bubrega, kancer glave i vrata, kancer pluća, kancer jajnika, kancer pankreasa, ovde nadalje označeno kao ’bolest pronalaska’. Takođe su opisani postupci za tretiranje humanih inflamatornih bolesti, uključujući astmu, giht, Kron, lupus, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, psorijazu, dijabetes i aterosklerozu.

[0005] Stoga, predmetni opis obezbeđuje izolovana antitela, naročito mišja, himerna, humanizovana i u potpunosti humana monoklonska antitela koja se vezuju za BST1 i pokazuju jednu ili više poželjnih funkcionalnih osobina. Takve osobine uključuju, na primer, specifično vezivanje za BST1 sa visokim afinitetom. Takođe je obezbeđena upotreba antitela prema pronalasku za tretiranje mnogih BST1-posredovanih bolesti.

[0006] U jednom primeru izvođenja, izolovano anti-BST1 antitelo poseduje:

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

i) prvi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 10;

ii) drugi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 12 ili SEQ ID NO: 51; iii) treći CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 14; i

b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

i) prvi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 16;

ii) drugi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 18;

iii) treći CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 20.

[0007] U sledećem primeru, izolovano anti-BST1 antitelo poseduje:

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

i) prvi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 9;

ii) drugi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 11;

iii) treći CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 13; i

b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

i) prvi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 15;

ii) drugi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 17;

iii) treći CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 19.

[0008] U sledećem primeru, izolovano anti-BST1 antitelo poseduje:

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

i) prvi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 56;

ii) drugi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 57;

iii) treći CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 58; i

b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

i) prvi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 59;

ii) drugi CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 60;

iii) treći CDR koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 61.

[0009] Epitop(i) prepoznat od strane antitela pronalaska nalazi se unutar polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 44.

[0010] U sledećem primeru, antitela sadrže varijabile CDR u poređenju sa roditeljskim antitelima opisanim ovde. Stoga, opis obezbeđuje varijante antitela koji sadrže varijante varijabilnih regiona roditeljskog antitela, pri čemu roditeljsko antitelo sadrži prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10, drugi vhCDR koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:12 i SEQ ID NO:51, treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO:14, prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO:16, drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO:18; i treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO:20, i gde varijanta antitela ima 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih supstitucija kolektivno u setu prvog vhCDR, drugog vhCDR, trećeg vhCDR, prvog vlCDR, drugog vlCDR i trećeg vlCDR, sa od 1 do 4 supstitucija za naročitu upotrebu, i gde antitelo zadržava specifično vezivanje za BST1. Slično tome, roditeljska antitela mogu sadržati prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO:9, drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO:11, treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 13; prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 15, drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO:17 i treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO:19. Dodatno, roditeljsko antitelo može sadržati prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO:56, drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 57, treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO:58, prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO:59, drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO:60 i treći vlCDR koji sadrži a SEQ ID NO:61.

[0011] U sledećem primeru izvođenja, izolovano anti-BST1 antitelo poseduje sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca kao što je predstavljeno sa SEQ ID NO: 2 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca kao što je predstavljeno sa SED ID NO: 4.

[0012] U sledećem primeru, izolovano anti-BST1 antitelo poseduje sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca kao što je predstavljeno sa SEQ ID NO: 45 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca kao što je predstavljeno sa SEQ ID NO: 49.

[0013] U sledećem primeru, izolovano anti-BST1 antitelo poseduje sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca kao što je predstavljeno sa SEQ ID NO: 1 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca kao što je predstavljeno sa SED ID NO: 3.

[0014] U sledećem primeru, izolovano anti-BST1 antitelo poseduje sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca kao što je predstavljeno sa SEQ ID NO: 52 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca kao što je predstavljeno sa SED ID NO: 53.

[0015] U jednom primeru izvođenja, bilo koje od prethodnih antitela poseduje Fc domen. U nekim primerima izvođenja Fc domen je humani. U drugim primerima izvođenja, Fc domen je varijanta humanog Fc domena.

[0016] U sledećem primeru izvođenja, bilo koja od prethodno opisanih antitela su monoklonska antitela.

[0017] U jednom primeru izvođenja, bilo koje od prethodno opisanih antitela dodatno poseduje konjugovani agens. U nekim primerima izvođenja konjugovani agens je citotoksični agens. U drugim primerima izvođenja konjugovani agens je polimer. U sledećem primeru izvođenja, polimer je polietilen glikol (PEG). U sledećem primeru izvođenja, PEG je derivat PEG.

[0018] U jednom primeru, izolovano antitelo je antitelo koje je u kompeticiji sa bilo kojim od prethodnih antitela za vezivanje za BST1.

[0019] U sledećem primeru izvođenja, opisan je postupak za pripremu bilo kog od prethodnih antitela, pri čemu je postupak dobijanje ćelije domaćina koja sadrži jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju prethodna antitela, uzgajanje ćelije domaćina u kulturi ćelije domaćina, obezbeđivanje uslova u kulturi ćelija domaćina gde je jedan ili više molekula nukleinske kiseline eksprimirano, i rekuperacija antitela iz ćelije domaćina ili kulture ćelije domaćina.

[0020] U jednom primeru, bilo koje od opisanih anti-BST1 antitela je obezbeđeno u farmaceutskoj kompoziciji.

[0021] U sledećem primeru, postupak za tretiranje ili sprečavanje bolesti povezane sa BST1, pri čemu je postupak primena na subjekta kome je to potrebno bilo kojeg od prethodnih antitela u efikasnoj količini.

[0022] Predmetni opis obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, fragment antitela, ili mimetik antitela koji se vezuje za epitop na humanom BST1 prepoznatom od strane antitela koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: izabranu iz grupe koja se sastoji od 2, 1 i 52 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: izabranu iz grupe koja se sastoji od 4, 3 i 53. U nekim primerima izolovano antitelo je antitelo pune dužine od IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 izotipa.

[0023] U nekim primerima izvođenja, antitelo predmetnog pronalaska je izabrano iz grupe koja se sastoji od: celog antitela, antigen vezujućeg dela, humanizovanog antitela, jednolančanog antitela, imunokonjugata, defukozilovanog antitela, i bispecifičnog antitela. Takođe su opisani fragmenti antitela, koji mogu biti izabrani iz grupe koja se sastoji od: unitela, domen antitela i nanotela. U nekim primerima izvođenja, imunokonjugati pronlaska sadrže terapeutski agens. U sledećem aspektu pronalaska, terapeutski agens je citotoksin ili radioaktivni izotop.

[0024] U nekim primerima, antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od: afitela, DARPin, antikalina, avimera, versatela i duokalina.

[0025] U alternativnim primerima izvođenja, kompozicije predmetnog pronalaska sadrže izolovano antitelo ili antigen vezujući deo i farmaceutski prihvatljv nosač.

[0026] Ovde opisano antitelo može biti kompozicija koji sadrži izolovano antitelo ili antigen-vezujući deo i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0027] U nekim primerima izvođenja, pronalazak sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira teški i laki lanac izolovanog antitela ili antigen-vezujućeg dela. Drugi aspekti pronalaska sadrže ekspresione vektore koji sadrže takve molekule nukleinske kiseline, i ćelije domaćine koje sadrže takve ekspresione vektore.

[0028] U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu anti-BST1 antitela, gde pomenuti postupak sadrži korake: dobijanja ćelije domaćina koja sadrži jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo pronalaska; uzgajanje ćelije domaćina u kulturi ćelije domaćina; obezbeđivanje uslova za kulturu ćelija domaćina gde su jedan ili više molekula nukleinske kiseline eksprimirani; i rekuperovanje antitela iz ćelije domaćina ili iz kulture ćelije domaćina.

[0029] Ovde su opisani postupci za tretiranje ili sprečavanje bolesti povezane sa ciljnim ćelijama koje eksprimiraju BST1, gde pomenuti postupak sadrži korak primene na subjekta anti-BST1 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, u količini efikasnoj da tretira ili spreči bolest. U nekim primerima, bolest tretirana ili sprečena antitelima ili njihovim antigen-vezujućim delom, je humani kancer.

[0030] Takođe su opisani postupci za tretiranje ili sprečavanje bolesti povezane sa ciljnim ćelijama koje eksprimiraju BST1, pomenuti postupak sadrži korak primene na subjekta anti-BST1 antitela, ili njegovog antigenvezujućeg dela, u količini efikasnoj da tretira ili spreči bolest. U nekim primerima, bolest tretirana ili sprečena antitelima ili antigen-vezujućim delom je humani kancer.

[0031] U drugim primerima izvođenja, pronalazak je usmeren na anti-BST1 antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, za upotrebu u tretiranju bolesti povezane sa ciljnom ćelijom koja eksprimira BST1. U nekim aspektima, bolest tretirana ili sprečena sa antitelima pronalaska ili njihovim antigen-vezujućim delom je humani kancer. U nekim primerima izvođenja, bolesti tretirane ili sprečene sa antitelima predmetnog pronalaska su bolest pronalaska.

[0032] Takođe je opisana upotreba anti-BST1 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, za proizvodnju medikamenta za upotrebu u tretmanu ili prevenciji bolesti povezane sa ciljnim ćelijama koje eksprimiraju BST1. U nekim primerima, bolest tretirana ili sprečena sa medikamentom prema pronalasku je humani kancer. U nekim primerima, bolesti tretirane ili sprečene medikamentom prema pronalasku su bolest pronalaska.

[0033] Takođe je opisano izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujući deo, fragment antitela, ili mimetik antitela koji se vezuje za epitop na humanom BST1 prepoznatom od strane antitela koje sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca date u SEQ ID NO: 2 i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca date u SEQ ID NO: 4; aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca date u SEQ ID NO: 1 i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca date u SEQ ID NO: 3; aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca date u SEQ ID NO: 52 i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca date u SEQ ID NO: 53. U nekim primerima, antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od: celog antitela, fragmenta antitela, humanizovanog antitela, jednolančanog antitela, imunokonjugata, defukozilovanog antitela, i bispecifičnog antitela. U dodatnim primerima, fragment antitela je izabran iz grupe koja se sastoji od: unitela, domen antitela, i nanotela. U nekim primerima, mimetik antitela je izabran iz grupe koja se sastoji od: afitela, DARPin, antikalina, avimera, versatela, i duokalina. U sledećim primerima izvođenja, kompozicija sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući deo i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0034] U nekim primerima izvođenja, Predmetni pronalazak je izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira teški i laki lanac izolovanog antitela ili njegov antigen vezujući deo prema pronalasku, i u dodatnim aspektima može uključivati ekspresioni vektor koji sadrži takve nukleinske kiseline, i ćelije domaćine koje sadrže takve ekspresione vektore.

[0035] Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska je hibridom koji eksprimira antitelo ili njegov antigen vezujući deo bilo kog antitela pronalaska.

[0036] Takođe su opisani postupci stvaranja antitela prema opisu, koji sadrže korake:

imunizacije životinje sa BST1 peptidom;

rekuperovanja iRNK iz B ćelija pomenute životinje;

konvertovanja pomenute iRNK u cDNK;

ekspresije cDNK u fagima tako da su anti-BST1 antitela kodirana pomenutom cDNK prikazana na površini pomenutih fagova;

selekcije fagova koji prikazuju anti-BST1 antitela;

rekuperovanja molekula nukleinske kiseline iz pomenutih selektovanih fagova koji kodiraju anti-BST1 imunoglobuline;

ekspresije pomenutih rekuperovanih molekula nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu; i rekuperovanja antitela iz pomenute ćelije domaćina koja se vezuju za BST1.

[0037] U nekim primerima, izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, vezuje epitop na BST1 polipeptidu koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 44 prepoznatu od strane antitela koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: izabranu iz grupe koja se sastoji od 2, 1 ili 52, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: izabranu iz grupe koja se sastoji od 4, 3 ili 53.

[0038] Druge karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i primera koj ne treba shvatiti kao ograničavajuće.

KRATAK OPIS SLIKA

[0039]

Slika 1a prikazuje poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR1 regiona teškog lanca A1 (SEQ ID NO:21) sa nukelotidima 138392-138424 VH1-80 nukleotidne sekvence mišje klicine linije (SEQ ID NO:33); poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR1 regiona teškog lanca A2 (SEQ ID NO:22) sa nukelotidima 153362-153394 VH1-39 nukleotidne sekvence mišje klicine linije (SEQ ID NO:35).

Slika 1b prikazuje poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR2 regiona teškog lanca A1 (SEQ ID NO:23) sa nukelotidima 138461-138511 VH1-80 nukleotidne sekvence mišje klicine linije (SEQ ID NO:34); poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR2 regiona teškog lanca A2 (SEQ ID NO:24) sa nukelotidima 153431-153481 VH1-39 nukleotidne sekvence mišje klicine linije (SEQ ID NO:36).

Slika 2a prikazuje poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR1 regiona lakog lanca A1 (SEQ ID NO:27) sa nukelotidima 496-531 VK4-74 nukleotidne sekvence mišje klicine linije (SEQ ID NO:37); poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR1 regiona lakog lanca A2 (SEQ ID NO:28) sa nukelotidima 523-552 VK4-55 mišje klicine linije (SEQ ID NO:40).

Slika 2b prikazuje poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR2 regiona lakog lanca A1 (SEQ ID NO:29) sa nukelotidima 577-597 VK4-74 nukleotidne sekvence mišje klicine linije (SEQ ID NO:38); poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR2 regiona lakog lanca A2 (SEQ ID NO:30) sa nukelotidima 598-618 VK4-55 nukleotidne sekvence mišje klicine linije (SEQ ID NO:41).

Slika 2c prikazuje poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR3 regiona lakog lanca A1 (SEQ ID NO:31) sa nukelotidima 691-718 VK4-74 nukleotidne sekvence mišje klicine linije (SEQ ID NO:39); poravnanje nukleotidnih sekvenci CDR3 regiona lakog lanca A2 (SEQ ID NO:32) sa nukelotidima 715-739 VK4-55 nukleotidne sekvence mišje klicine linije (SEQ ID NO:42).

Slika 3a i 3b prikazuje rezultate protočno citometrijske analize BST1 na A549 i H226 ćelijama.

Slika 4a i 4b prikazuje internalizaciju anti-BST1 monoklonskih antitela sa A549 i H226 ćelijama, upotrebom MabZAP analize.

Slika 5 prikazuje poravnanje ostataka 21-137 iz SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 45), humanizovanog VHlanca sa CDR regionima (naglašeni boldom) iz SEQ ID NO: 2 prenetim na odgovarajuće položaje humane klicine linije BF238102 VH(SEQ ID NO: 46), sa humanom klicinom linijom BF238102 VH(SEQ ID NO: 47). Ostaci koji pokazuju značajan kontakt sa CDR regionima supstituisani sa odgovarajućim humanim ostacima. Ove supstitucije (podvučeno) izvedene su na položajima 30, 48, 67, 71 i 100.

Slika 6 prikazuje poravnanje ostataka 22-128 iz SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 48), humanizovanog VLlanca sa CDR regionima (naglašeni boldom) iz SEQ ID NO: 4 preneti na odgovarajuće položaje humane klicine linije X72441 VL(SEQ ID NO: 49) sa humanom klicinom linijom X72441 VL(SEQ ID NO: 50). Ostaci koji pokazuju značajan kontakt sa CDR regionima supstituisani sa odgovarajućim humanim ostacima. Jedna supstitucija (podvučeno) izvedena je na položaju 71.

Slika 7 prikazuje poravnanje CDR2 regiona A2 teškog lanca (SEQ ID NO: 12) sa mogućim aminokiselinskim supstitucijama (SEQ ID NO: 51) bez gubljenja afiniteta za vezivanje antigena.

Slika 8 prikazuje BST1_A2 i BST1_A2_NF koji izaziva antitelo zavisni ćelijski toksični (ADCC) odgovor u prisustvu efektorskih ćelija.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0040] Predmetni opis se odnosi na izolovana antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, na primer, koja se specifično vezuju za BST1 sa visokim afinitetom kao što je ovde izloženo. U određenim primerima, obezbeđena antitela poseduju naročite strukturne osobine kao što su CDR regioni sa određenim aminokiselinskim sekvencama. Ovaj opis obezbeđuje izolovana antitela (koja, kao što je izloženo u nastavku, uključuju veoma raznovrsne dobro poznate strukture, derivate, mimetike i konjugate), postupke za stvaranje pomenutih molekula, i farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenute molekule i farmaceutski nosač. Ovaj opis se takođe odnosi na postupke za korišćenje molekula, kao što je da se detektuje BST1, kao i da se tretiraju bolesti povezane sa ekspresijom BST1, kao što je BST1 eksprimiran kod tumora i inflamatornih bolesti, uključujući bolest pronalaska.

[0041] Da bi se predmetni opis lakše razumeo, određeni termini su prvo definisani. Dodatne definicije su date u okviru detaljnog opisa.

[0042] Humanizovana i mišja antitela ovog opisa mogu, u određenim slučajevima, biti unakrsno reaktivna sa BST1 iz vrsta različitih od čoveka. U određenim primerima, antitela mogu biti potpuno specifična za jedan ili više humanih BST1 i ne moraju pokazivati unakrsnu reaktivnost u odnosu na vrstu ili druge tipove ne-humane unakrsne reaktivnosti.

[0043] Termin "imuni odgovor" odnosi se na dejstvo, na primer, limfocita, antigen prikazujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita, i rastvorljivih makromolekula proizvedenih od strane prethodno pomenutih ćelija ili jetre (uključujući antitela, citokine, i komplement) koji rezultuje u selektivnom oštećenju, uništenju, ili eliminaciji iz humanog tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih sa patogenima, ćelijama kancera, ili, u slučajevima autoimuniteta ili patološke inflamacije, normalnih humanih ćelija ili tkiva.

[0044] "Put prenosa signala" odnosi se na biohemijsku vezu između različitih molekula koji prenose signal i koji imaju ulogu u prenosu signala iz jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Kao što je ovde korišćeno, izraz "receptor na ćelijskoj površini" uključuje, na primer, molekule i komplekse molekula sposobne da primaju signal i prenose takav signal preko plazma membrane ćelije. Primer "receptora na ćelijskoj površini" je BST1.

[0045] Termin "antitelo" kao što je ovde označeno uključuje, minimalno, antigen vezujući fragment (tj. "antigen vezujući deo") imunoglobulina.

[0046] Definicija "antitela" obuhvata, ali bez ograničenja na, antitela pune dužine, fragmente antitela, jednolančana antitela, bispecifična antitela, minitela, domen antitela, sintetička antitela (nekada označena ovde kao "mimetici antitela"), himerna antitela, humanizovana antitela, fuzije antitela (nekada označena kao "konjugati antitela") i fragmente i/ili derivate svakog od navedenih, respektivno. Uopšteno, antitelo pune dužine (nekada ovde označeno kao "cela antitela") označava glikoprotein koji može sadržati najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana sa disuflidnim vezama. Svaki težak lanac je sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VLili VK) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VHi VL/ VKregioni se mogu dalje podeliti u regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), pomešani sa regionima koji su konzervativniji, označeni okvirni regioni (FR). Svaki VHi VL/ VKse sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati vezivanje imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0047] U jednom primeru, antitelo je fragment antitela. Specifični fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1 domena, (ii) Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1 domena, (iii) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jednog antitela, (iv) dAb fragment, koji se sastoji od jednog varijabilnog regiona, (v) izolovani CDR region, (vi) F(ab’)2 fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva povezana Fab fragmenta (vii) jednolančane Fv molekule (scFv), gde su VHdomen i VLdomen vezani sa peptidnim linkerom koji omogućava da se dva domena povežu da bi formirali antigen vezujuće mesto, (viii) bispecifične jednolančane Fv dimere, i (ix) "diatela" ili "triatela", multivalente ili multispecifične fragmente konstruisane fuzijom gena. Fragmenti antitela mogu biti modifikovani. Na primer, molekuli mogu biti stabilizovani inkorporacijom disulfidnih mostova koji povezuju VHi VLdomene. Primeri formata i arhitektura antitela opisani su u Holliger & Hudson (2006) Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136, i Carter (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357, i referencama u njima citiranim.

[0048] Predmetni opis obezbeđuje analoge antitela. Takvi analozi mogu sadržati mnoštvo struktura, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitela pune dužine, fragmente antitela, bispecifična antitela, minitela, domen antitela, sintetička antitela (nekada ovde označena kao "mimetici antitela"), fuzije antitela, konjugate antitela, i fragmente svakog, respektivno.

[0049] U jednom primeru, imunogloublin sadrži fragment antitela. Specifični fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1 domena, (ii) Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1 domena, (iii) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jednog antitela; (iv) dAb fragment, koji se sastoji od jednog varijabilnog, (v) izolovane CDR regione, (vi) F(ab’)2 fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva povezana Fab fragmenta (vii) jednolančane Fv molekule (scFv), gde su VHdomen i VLdomen vezani sa peptidnim linkerom koji omogućava da se dva domena vežu da bi formiralo antigen vezujuće mesto, (viii) bispecifične jednolančane Fv dimere, i (ix) "diatela" ili "triatela", multivalentne ili multispecifične fragmente konstruisane fuzijom gena. Fragmenti antitela mogu biti modifikovani. Na primer, molekuli mogu biti stabilizovani inkorporacijom disulfidnih mostova koji povezuju VHi VLdomene. Primeri formata i arhitektura antitela opisani su u Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, i Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357 i u njima navedenim referencama.

[0050] Prepoznati geni imunoglobulina, na primer kod ljudi, uključuju kapa (κ), lambda (λ), i genske lokuse teškog lanca, koji zajedno čine bezbroj gena varijabilnih gena, i gene konstantnog regiona mu (υ), delta (δ), gama (γ), sigma (σ), i alfa (α) koji kodiraju IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4), IgE, i IgA (IgA1 i IgA2) izotipove respektivno. Namera je da antitelo ovde uključuje antitela pune dužine i fragmente antitela, i može se odnositi na prirodno antitelo iz bilo kog organizma, konstruisano antitelo, ili antitelo stvoreno rekombinantno za eksperimentalne, terapeutske, ili druge svrhe.

[0051] U jednom primeru izvođenja, ovde opisano antitelo može biti multispecifično antitelo, i naročito bispecifično antitelo, koje se takođe nekada označavaju kao "diatela". Ovo su antitela koja se vezuju za dva (ili više) različitih antigena. Diatela se mogu proizvesti na različite načine poznate u tehnici, npr. pripremljena hemijski ili iz hibridnih hibridoma. U jednom primeru, antitelo je minitelo. Minitela su minimizovani proteini slični antitelu koji sadrži scFv vezan sa CH3 domenom. U nekim slučajevima, scFv može biti vezan za Fc region, i može uključivati neke ili sve zglobne regione. Za opis multispecifičnih antitela, videti Holliger i Hudson (2006) Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136 i tu citirane reference.

[0052] Pod "CDR" kao što je ovde korišćeno podrazumeva se "region koji određuje komplementarnost" varijabilnog domena antitela. Sistemska identifikacija ostataka uključenih u CDR razvijena je od strane Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda) i alternativno od strane Chothia [Chothia i Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883; Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-948]. Za svrhe predmetnog pronalaska, CDR su definisani kao nešto manji set ostataka od CDR definisanih od strane Chothia. VLCDR su ovde definisani da uključuju ostatke na položajima 27-32 (CDR1), 50-56 (CDR2), i 91-97 (CDR3), gde je numerisanje prema Chothia. Kako su VLCDRs kao što su definisanii od strane Chothia i Kabat identični, numerisanje ovih VLCDR položaja je takođe prema Kabat. VHCDR su ovde definisani da uključe ostatke na položajima 27-33 (CDR1), 52-56 (CDR2), i 95-102 (CDR3), gde je numerisanje prema Chothia. Ovi VHCDR položaji odgovaraju Kabat položajima 27-35 (CDR1), 52-56 (CDR2), i 95-102 (CDR3).

[0053] Kao što će stručnjaci shvatiti, ovde opisani CDR mogu takođe uključiti varijante, na primer, kada se povratno mutiraju ovde opisani CDR u različite okvirne regione. Generalno, identičnost nukleinskih kiselina između pojedinačnih varijanti CDR je najmanje 80% sa ovde prikazanim sekvencama, i tipičnije sa poželjno rastućom identičnošću od najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i skoro 100%. Na sličan način, "procenat (%) identičnosti sekvence nukleinske kiseline" u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline vezujućih proteina identifikovanih ovde definisan je kao procenat nukleotidnih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa nukleotidnim ostacima u kodirajućoj sekvenci antigen vezujućeg proteina. Specifični postupak koristi BLASTN modul WU-BLAST-2 seta sa podrazumevanim parametrima, sa širinom preklapanja i frakcijom preklapanja podešenim na 1 i 0.125, respektivno i bez izabranih filtera.

[0054] Generalno, identičnost sekvence nukleinske kiseline između nukleotidnih sekvenci koje kodiraju pojedinačnu varijantu CDRs i nukleotidnih sekvenci prikazanih ovde je najmanje 80%, i tipičnije sa poželjno ratsućom identičnošću od najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% i skoro 100%.

[0055] Stoga, "varijanta CDR" je ona sa specifikovanom homologijom, sličnošću, ili identičnošću sa roditeljskim CDR pronalaska, i deli biološku funkciju, uključujući, ali se ne ograničavajući na, najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% specifičnosti i/ili aktivnosti roditeljskog CDR.

[0056] Dok je mesto ili region za introdukciju varijacije aminokiselinske sekvence predodređen, mutacija sama po sebi ne mora biti predodređena. Na primer, da bi se optimizovala performansa mutacije na datom mestu, može se izvesti mutageneza po principu slučajnosti na ciljnom kodonu ili regionu i može se izvršiti skrining eksprimiranih antigen vezujućih proteinskih CDR varijanti u odnosu na optimalnu kombinaciju željene aktivnosti. Tehnike za stvaranje mutacija supstitucija na predodređenim mestima u DNK koja ima poznatu strukturu su dobro poznate, na primer, M13 prajmer mutageneza i PCR mutageneza. Skrining mutanata je urađen korišćenjem analiza aktivnosti antigen vezujućeg proteina kao što je ovde opisano.

[0057] Aminokiselinske supstitucije su tipično u pojedinačnom ostatku; insercije će obično biti reda veličine od oko jednog (1) do oko dvadeset (20) aminokiselinskih ostataka, iako se mogu tolerisati znatno duže insercije. Delecije su u opsegu od oko jednog (1) do oko (20) aminokiselinskih ostataka, iako u nekim slučajevima delecije mogu biti mnogo veće.

[0058] Supstitucije, delecije, insercije ili bilo koja njihova kombinacija mogu se koristiti da bi se došlo do konačnog derivata ili varijante. Generalno ove promene su urađene na nekoliko aminokiselina da bi se minimizovala promena molekula, naročito imunogenost i specifičnost antigen vezujućeg proteina. Međutim, mogu se tolerisati veće promene u određenim okolnostima.

[0059] Pod "Fab" ili "Fab regionom" kao što je ovde korišćeno podrazumeva se polipeptid koji sadrži VH, CH1, VL, i CLdomene imunoglobulina. Fab se može odnositi na ovaj region u izolaciji, ili ovaj region u kontekstu antitela pune dužine, fragmenta antitela ili Fab fuzionog proteina, ili bilo kog drugog primera izvođenja antitela kao što je ovde izloženo.

[0060] Pod "Fv" ili "Fv fragmentom" ili "Fv regionom" kao što je ovde korišćeno podrazumeva se polipeptid koji sadrži VLi VHdomene pojedinačnog antitela.

[0061] Pod "okvirnim regionom" kao što je ovde korišćeno podrazumeva se region varijabilnog domena antitela bez onih regiona definisanih kao CDR. Svaki varijabilni domen okvirnog regiona antitela se može dalje podeliti na susedne regione razdvojene sa CDR (FR1, FR2, FR3 i FR4).

[0062] Termin "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "deo antitela"), kao što je ovde korišćeno, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen (npr. BST1). Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija može izvesti sa fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih terminom "antigen-vezujući deo" antitela uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL/ VK, VH, CLi CH1 domena; (ii) F(ab’)2 fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana sa disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fab’ fragment, koji je suštinski Fab sa delom regiona zgloba (videti, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1 domena; (v) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jedne ruke antitela; (vi) dAb fragment [Ward et al. (1989) Nature 341:544-546], koji se sastoji od VHdomena; (vii) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR); i (viii) Nanobody, varijabilni region teškog lanca koji sasdrži pojedinačni varijabilni domen i dva konstantna domena. Dodatno, iako su dva domena Fv fragmenta, VL/ VKi VH, kodirani zasebnim genima, mogu se spojiti, korišćenjem rekombinatnih postupaka, sintetičkim linkerom koij im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kom su VL/ VKi VHregioni upareni da bi se formirali monovalentni molekuli (poznati kao jednolančani Fv (scFv); videti npr. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Namera je da takva jednolančana antitela budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući deo" antitela. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima, i izvršen je skrining fragmenata za upotrebu na isti način kao što su intaktna antitela.

[0063] Namera je da "izolovano antitelo" kao što je ovde korišćeno, označava antitelo koje je u značajnom stepenu bez antitela koja imaju drugačije antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za BST1 je u značajnom stepenu bez antitela koja specifično vezuju antigene različite od BST1). Izlovano antitelo koje se specifično vezuje za BST1 može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima, kao što su BST1 molekuli iz drugih vrsta. Dodatno, i/ili alternativno izolovano antitelo može biti u značajnom stepenu bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija, koje je u obliku koji se normalno ne nalazi u prirodi.

[0064] U nekim primerima izvođenja, antitela pronalaska su rekombinantni proteini, izolovani proteini ili u značajnom stepenu čisti proteini. "Izolovani" protein nije praćen najmanje sa nekim materijalom sa kojim je normalno povezan u svom prirodnom stanju, na primer sadrži najmanje oko 5%, ili najmanje oko 50% po težini ukupnog proteina u datom uzorku. Podrazumeva se da izolovani protein može činiti od 5 do 99.9% po težini ukupnog sadržaja proteina u zavisnosti od okolnosti. Na primer, protein može biti napravljen u značajno većoj koncentraciji upotrebom inducibilnog promotora ili promotora sa visokom ekspresijom, tako da je protein napravljen u povećanim nivoima koncentarcije. U slučaju rekombinantnih proteina, definicija uključuje proizvodnju antitela u veoma raznovrsnim organizmima i/ili ćelijama domaćinima koje su poznate u tehnici u kojima nije normalno proizveden.

[0065] Termini "monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskog antitela" kao što je ovde korišćeno odnosi se na pripremu molekula antitela pojedinačne molekularne kompozicije. Kompozicija monoklonskog antitela prikazuje pojedinačnu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Kao što je ovde korišćeno, "poliklonsko antitelo" se odnosi na antitela proizvedena od strane nekoliko klonova B-limfocita kao što bi bio slučaj u celoj životinji.

[0066] Kao što je ovde korišćeno, "izotip" se odnosi na klasu antitela (npr. IgM ili IgG1) koja je kodriana genima konstantnog regiona teškog lanca.

[0067] Izrazi "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" su ovde korišćeni naizmenično sa terminom "antitelo koje se vezuje specifično za antigen".

[0068] Termin "derivati antitela" odnosi se na bilo koji modifikovani oblik antitela, npr. konjugat (generalno hemijska veza) antitela i drugog agensa ili antitela. Na primer, antitela predmetnog pronalaska mogu biti konjugovana sa agensima, uključujući, ali se ne ograničavajući na, polimere (npr. PEG) toksine, obeleživače, itd. Kao što je potpunije opisano u nastavku. Antitela predmetnog pronalaska mogu biti ne-humana, himerna, humanizovana, ili potpuno humana. Za opis koncepata himernih i humanizovanih antitela, videti Clark et al. (2000) i u njima citirane reference (Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402). Himerna antitela sadrže varijabilni region ne-humanog antitela, na primer VHi VLdomene poreklom od miša ili pacova, operativno povezane sa konstantnim regionom humanog antitela (videti na primer SAD patent br. 4,816,567). U poželjnom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska su humanizovana. Pod "humanizovanim" antitelom kao što je ovde korišćeno podrazumeva se antitelo koje sadrži humani okvirni region (FR) i jedan ili više regiona koji određuju komeplementarnost (CDR’s) iz ne-humanog (obično miša ili pacova) antitela. Ne-humano antitelo koje obezbeđuje CDR se naziva "donor" i humani imunoglobulin koji obezbeđuje okvirni region naziva se "akceptor". Humanizacija se u principu oslanja na graftovanje donor CDR na akceptorske (humane) VLi VHokvirne regione (SAD patent br, 5,225,539). Ova strategija se označava kao "CDR grafting". "Povratna mutacija" izabranih ostataka akceptorskog okvirnog regiona u odgovarajuće donorske ostatke je često neophodna da bi se ponovo dobio afinitet izgubljen u inicijalno graftovanom konstruktu (SAD 5,530,101; SAD 5,585,089; SAD 5,693,761; SAD 5,693,762; SAD 6,180,370; SAD 5,859,205; SAD 5,821,337; SAD 6,054,297; SAD 6,407,213). Humanizovano antitelo će optimalno takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina, tipično onog iz humanog imunoglobulina, i stoga će tipično sadržati humani Fc region. Postupci za humanizaciju nehumanih antitela su dobro poznati u tehnici, i mogu se suštinski izvesti praćenjem postupaka od Winter i saradnika [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; Verhoeyen et al. (1988) Science, 239:1534-1536]. Dodatni primeri humanizovanih mišjih monoklonskih antitela su takođe poznati u tehnici, na primer antitela koja vezuju humani protein C (O’Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8), interleukin 2 receptor [Queen et al. (1989) Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33], i receptor 2 humanog epidermalnog faktora rasta [Carter et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9]. U alternativnom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti potpuno humana, odnosno sekvence antitela su potpuno ili u značajnom stepenu humane. Određen broj postupaka je poznat u tehnici za stvaranje potpuno humanih antitela, uključujući upotrebu transgenih miševa [Bruggemann et al. (1997) Curr Opin Biotechnol 8:455-458] ili humanih biblioteka antitela kuplovanih sa postupcima selekcije [Griffiths et al. (1998) Curr Opin Biotechnol 9:102-108].

[0069] Namera je da termin "humanizovano antitelo" uključuje antitela kod kojih su CDR sekvence izvedene iz klicine linije drugih vrsta sisara, kao što je miš, graftovane na humane sekvence okvirnog regiona. Dodatne modifikacije okvirnog regiona mogu se napraviti unutar humanih sekvenci okvirnog regiona, kao što su modifikacije aminokiselina Fc domena, kao što je ovde opisano.

[0070] Namera je da termin "himerno antitelo" označava antitela kod kojih su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz jedne vrste i sekvence konstantnog regiona su izvedene iz druge vrste, kao što je antitelo kod koga su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz antitela miša i sekvence konstantnog regiona su izvedene iz humanog antitela.

[0071] Nije namera da termin "specifično se vezuje" (ili "imunospecifično se vezuje") ukazuje da se antitelo vezuje isključivo za njegovu nameravanu ciljnu strukturu, iako će u mnogim primerima izvođenja ovo biti tačno; odnosno, antitelo se "specifično vezuje" za svoju ciljnu strukturu i ne vezuje se detektabilno ili u značajnom stepenu za druge komponente u uzorku, ćelije ili pacijenta. Međutim, u nekim primerima izvođenja, antitelo se "specifično vezuje" ukoliko je njegov afinitet za njegovu nameravanu ciljnu strukturu oko 5-puta veća u poređenju sa njegovim afinitetom za molekul koji nije njegova ciljna struktura. Pogodno ne postoji nikakva značajna unakrsna reakcija ili unakrsno vezivanje sa neželjenim supstancama, naročito proteinima koji se prirodno javljaju ili tkivima zdrave osobe ili životinje. Afinitet antitela će, na primer, biti najmanje 5-puta, kao što je 10-puta, kao što je 25-puta, naročito 50-puta, i naročito 100-puta ili više, veći za ciljni molekul nego njegov afinitet za molekul koji nije ciljni. U nekim primerima izvođenja, specifično vezivanje između antitela ili drugog vezujućeg agensa i antigena označava afinitet vezivanja od najmanje 10<6>M<-1>. Antitela se mogu, na primer, vezivati sa afinitetom od najmanje oko 10<7>M<-1>, kao što je između oko 10<8>M<-1>do oko 10<9>M<-1>, oko 10<9>M<-1>do oko 10<10>M<-1>, ili oko 10<10>M<-1>do oko 10<11>M<-1>. Antitela se mogu, na primer, vezivati sa EC50od 50 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 100 pM ili manje, ili poželjnije 10 pM ili manje.

[0072] Termin "ne vezuje se u značajnom stepenu" za protein ili ćelije, kao što je ovde korišćeno, označava da se ne vezuje ili se ne vezuje sa visokim afinitetom za protein ili ćelije, tj. vezuje se za protein ili ćelije sa KDod 1 x 10<-6>M ili više, poželjnije 1 x 10<-5>M ili više, poželjnije 1 x 10<-4>M ili više, poželjnije 1 x 10<-3>M ili više, još poželjnije 1 x 10<-2>M ili više.

[0073] Namera je da se termin "EC50" kao što je ovde korišćen, odnosi na potenciju jedinjenja kvantifikovanjem koncentracije koja dovodi do 50% maksimalnog odgovora/efekta. EC50se može odrediti sa Scratchard ili FACS.

[0074] Namera je da termin "Kassoc" ili "Ka," kao što je ovde korišćen, označava stopu asocijacije određene interakcije antitelo-antigen, dok je namera da termin "Kdis" ili "Kd," kao što je ovde korišćeno, označava stopu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Namera je da termin "KD," kao što je ovde korišćeno, označava konstantu afiniteta, koja je dobijena iz odnosa Kdprema Ka(tj. Kd/Ka) i eksprimiran je kao molarna koncentracija (M). Vrednosti KDza antitela se mogu odrediti korišćenjem doboro ustanovljenih postupaka u tehnici. Poželjan postupak za određivanje KDantitela je korišćenje površinske plazmon rezonance, poželjno korišćenjem biosenzornog sistema kao što je Biacore® sistem.

[0075] Kao što je ovde korišćeno, termin "visok afinitet" za IgG antitelo odnosi se na antitelo koje ima KDod 1 x 10<-7>M ili manje, poželjnije 5 x 10<-8>M ili manje, još poželjnije 1x10<-8>M ili manje, još poželjnije 5 x 10<-9>M ili manje i još poželjnije 1 x 10<-9>M ili manje za ciljni antigen. Međutim, "visok afinitet" vezivanja može varirati za druge izotipove antitela. Na primer, "visok afinitet" vezivanja za IgM izotip odnosi se na antitelo koje ima KDod 10<-6>M ili manje, poželjnije 10<-7>M ili manje, još poželjnije 10<-8>M ili manje.

[0076] Termin "epitop" ili "antigena determinanta" odnosi se na mesto na antigenu za koje se imunoglobulin ili antitelo specifično vezuje. Epitopi se mogu formirati i iz susednih aminokiselina ili nesusednih aminokiselina dovedenih u međusobnu blizinu tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi formirani iz susednih aminokiselina su tipično zadržani pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok epitopi formirani tercijarnim savijanjem su tipično izgubljeni po tretmanu sa denaturišućim rastvaračima. Epitop tipično uključuje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci određivanja prostorne konformacije epitopa uključuju tehnike u tehnici i one opisane ovde, na primer, rentgensku kristalografiju i 2-dimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu [videti, npr. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996)].

[0077] Shodno tome, ovde su takođe opisana antitela koja se vezuju za (tj. prepoznaju) isti epitop kao antitela opisana ovde (tj. BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3). Antitela koja se vezuju za isti epitop mogu se identifikovati po njihovoj sposobnosti da ulaze u unakrsnu kompeticiju sa (tj. kompetitivno inhibiraju vezivanje) referentnog antitela za ciljni antigen na statistički značajan način. Kompetitivna inhibicija se može desiti, na primer, ukoliko se antitela vezuju za identične ili strukturno slične epitope (npr. preklapajući epitopi), ili prostorno proksimalne epitope koji, kada se vežu, izazivaju steričko ometanje između antitela.

[0078] Kompetitivna inhibicija se može odrediti korišćenjem rutinskih analiza u kojima imunoglobulin koji se testira inhibira specifično vezivanje referentnog antitela sa zajedničkim antigenom. Brojni tipovi analiza kompetitivnog vezivanja su poznati, na primer: direktna ili indirektna radioimunoanaliza čvrste faze (RIA), direktna ili indirektna enzimska imunoanaliza čvrste faze (EIA), sendvič analiza kompeticije [videti Stahl et al. (1983) Methods in Enzymology 9:242]; direktna biotinavidin EIA čvrste faze [videti Kirkland et al. (1986) J. Immunol. 137:3614]; direktna analiza sa obeležavanjem čvrste faze, direktna sendvič analiza sa obeležavanjem čvrste faze [videti Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press]; direktna RIA sa obeležavanjem čvrste faze korišćenjem I-125 obeleživača [videti Morel et al. (1988) Mol. Immunol.

25(1):7)]; direktna biotin-avidin EIA čvrste faze [Cheung et al. (1990) Virology 176:546]; i direktna RIA sa obeležavanjem. [Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77]. Tipično, takva analiza uključuje upotrebu prečišćenog antigena vezanog za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo koji od sledećeg, neobeleženi test imunoglobulin i obeleženi referentni imunoglobulin. Kompetitivna inhibicija je merena određivanjem količine obeleživala vezanog za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu test imunoglobulina. Obično je test imunoglobulin prisutan u višku. Obično, kada je kompetitivno antitelo prisutno u višku, inhibiraće specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen sa najmanje 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% ili više.

[0079] Druge tehnike uključuju, na primer, postupke mapiranja epitopa, kao što su rentgenske analize kristala kompleksa antigen:antitelo što omogućava atomsko razdvajanje epitopa. Drugi postupci prate vezivanje antitela sa fragmentima antigena ili mutiranim varijacijama antigena gde je gubitak vezivanja usled modifikacije aminokiselinskog ostatka unutar sekvence antigena često smatrano indikacijom komponente epitopa. Dodatno, kompjuterski kombinatorni postupci za mapiranje epitopa se takođe mogu koristiti. Ovi postupci se zasnivaju na sposobnosti antitela od interesa da prema afinitetu izoluju specifične kratke peptide iz kombinatornih peptidnih biblioteka fagnog prikaza. Peptidi su onda smatrani kao vodilje za definiciju epitopa koji odgovara antitelu korišćenom za skrining peptidne biblioteke. Za mapiranje epitopa, takođe su razvijeni kompjuterski algoritmi za koje je pokazano da mapiraju konformacione diskontinuirane epitope.

[0080] Kao što je ovde korišćeno, termin "subjekat" uključuje bilo koju humanu ili ne-humanu životinju. Termin "ne-humana životinja" uključuje sve kičmenjake, npr. sisare i ne-sisare, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci, gmizavci, itd.

[0081] Opis je opisan detaljnije u sledećim potpoglavljima.

Anti-BST1 antitela

[0082] Antitela pronalaska se karakterišu određenim funkcionalnim karakteristikama ili osobinama antitela. Na primer, antitela se specifično vezuju za humani BST1. Poželjno, antitelo pronalaska se vezuje za BST1 sa visokim afinitetom, na primer, sa KDod 8 x 10<-7>M ili manje, još tipičnije 1 x 10<-8>M ili manje. Anti-BST1 antitela pronalaska poželjno pokazuju jednu ili više sledećih karakteristika, sa tim da antitela koja pokazuju obe nalaze naročitu primenu:

Vezuju se za humani BST1 sa EC50od 50 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 100 pM ili manje, ili još poželjnije 10 pM ili manje;

Vezuju se za humane ćelije koje eksprimiraju BST1.

[0083] U jednom primeru izvođenja, antitela se poželjno vezuju za antigeni epitop prisutan u BST1, epitop koji nije prisutan u drugim proteinima. Poželjno, antitela se ne vezuju za srodne proteine, na primer, antitela se ne vezuju u značajnom stepenu za druge ćelijske adhezione molekule. U jednom primeru izvođenja, antitelo može biti internalizovano u ćeliju koja eksprimira BST1. Standardni testovi da bi se procenila internalizacija antitela su poznati u tehnici, uključujući, na primer, MabZap ili HumZap testove internalizacije.

[0084] Standardni testovi za procenu sposobnosti vezivanja antitela prema BST1 može se uraditi na nivou proteina ili ćelije i poznati su u tehnici, uključujući na primer, ELISA, Western blot, RIA, BIAcore® analize i protočno citometrijska analiza. Pogodni testovi su detaljno opisani u Primerima. Kinetika vezivanja (npr. afinitet vezivanja) antitela se takođe može proceniti standardnim testovima pozantim u tehnici, kao što je Biacore® sistemska analiza. Da bi se procenilo vezivanje za Raji ili Daudi B ćelije tumorske ćelije, Raji (ATCC Deposit No. CCL-86) ili Daudi (ATCC Deposit No. CCL-213) ćelije se mogu dobiti iz javno dostupnih izvora, kao što je American Type Culture Collection, i korišćenjem u standardnim testovima, kao što je protočno citometrijska analiza.

Monoklonska antitela pronalaska

[0085] Antitelo pronalaska je monoklonsko antitelo BST1_A2. Takođe je opisano antitelo BST1_A1 izolovano i strukturno karakterizovano kao što je opisano u Primerima 1-4. VHaminokiselinske sekvence BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3 su prikazane u SEQ ID NOs: 2, 1 i 52, respektivno. VKaminokiselinske sekvence BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3 su prikazane u SEQ ID NOs: 4, 3 i 53, respektivno.

[0086] S obzirom da se svako od ovih antitela može vezati za BST1, VHi VKsekvence se mogu "mešati i uparivati" da bi se stvorili drugi anti-BST1 vezujući molekuli. BST1 vezivanje takvih "pomešanih i uparenih" antitela može biti testirano korišćenjem testova vezivanja opisanih prethodno i u Primerima (npr. ELISA). Poželjno, kada su VHi VKlanci pomešani i upareni, VHsekvenca iz određenog VH/VKuparivanja je zamenjena sa strukturno sličnom VHsekvencom. Slično tome, poželjno VKsekvenca iz određenog VH/VKuparivanja je zamenjena sa strukturno sličnom VKsekvencom.

[0087] Shodno tome, u jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo, koji sadrži:

Varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 2, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 4; gde se antitelo specifično vezuje za BST1, poželjno humani BST1.

[0088] Druge kombinacije teškog i lakog lanca opisane ovde uključuju:

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; ili

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53.

[0089] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitela koja sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i lakog lanca BST1_A2. Takođe su opisana antitela koja sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i lakog lanca BST1_A1 i BST1_A3, ili njihove kombinacije. Aminokiselinske sekvence VHCDR1 BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3 prikazane su u SEQ ID NOs: 10, 9 i 56, respektivno. Aminokiselinske sekvence VHCDR2s BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3 su prikazane u SEQ ID NOs: 12 ili 51, 11 i 57, respektivno. Aminokiselinske sekvence VHCDR3 BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3 su prikazane u SEQ ID NOs: 14, 13 i 58, respektivno. Aminokiselinske sekvence VKCDR1 BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3 su prikazane u SEQ ID NOs: 16, 15 i 59, respektivno. Aminokiselinske sekvence VKCDR2s BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3 su prikazane u SEQ ID NOs: 18, 17 i 60, respektivno. Aminokiselinske sekvence VKCDR3s BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3 su prikazane u SEQ ID NOs: 20, 19 i 61, respektivno. CDR regioni su opisani korišćenjem Kabat sistema [Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health i Human Services, NIH Publication No.91-3242].

[0090] S obzirom da se svako od ovih antitela može vezati za BST1 i da je antigen-vezujuća specifičnost primarno obezbeđena sa CDR1, CDR2, i CDR3 regionima, VHCDR1, CDR2, i CDR3 sekvence i VKCDR1, CDR2, i CDR3 sekvence mogu biti "mešane i uparivane" (tj. CDR iz različitih antitela se mogu mešati i uparivati, iako svako antitelo generalno sadrži VHCDR1, CDR2, i CDR3 i VKCDR1, CDR2, i CDR3) da bi se stvorili drugi anti-BST1 vezujući molekuli.

[0091] BST1 vezivanje takvih "mešanih i uparenih" antitela može biti testirano korišćenjem testova vezivanja opisanih prethodno i u Primerima (npr. ELISA, Biacore® analiza). Poželjno, kada su VHCDR sekvence mešane i uparene, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene VHsekvence je zamenjena sa strukturno sličnom CDR sekvencom (sekvencama). Slično tome, kada su VKCDR sekvence mešane i uparene, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene VKsekvence poželjno je zamenjena sa strukturno sličnom CDR sekvencom (sekvencama). Stručnjaku će biti jasno da se nove VHi VKsekvence mogu stvoriti supstitucijom jedne ili više sekvenci CDR regiona VHi/ili VL/ VKsa strukturno sličnim sekvencama iz CDR sekvenci opisanih ovde za monoklonska antitela BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3.

[0092] Shodno tome, ovde je opisano izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo koji sadrži:

CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 9 i 56;

CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 12 ili 51, 11 i 57;

CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 14, 13 i 58;

CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 16, 15 i 59;

CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18, 17 i 60; i

CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 20, 19 i 61;

pri čemu su moguće sve moguće kombinacije, gde se antitelo specifično vezuje za BST1, poželjno humani BST1.

[0093] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo poseduje:

CDR1 varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10;

CDR2 varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 12 ili SEQ ID NO: 51;

CDR3 varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 14; i

CDR1 varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 16;

CDR2 varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 18;

CDR3 varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 20.

[0094] U sledećem primeru, antitelo poseduje:

CDR1 varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 9;

CDR2 varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 11;

CDR3 varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 13; i

CDR1 varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 15;

CDR2 varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 17;

CDR3 varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 19.

[0095] U sledećem primeru, antitelo poseduje:

CDR1 varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 56;

CDR2 varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 57;

CDR3 varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 58; and

CDR1 varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 59;

CDR2 varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 60;

CDR3 varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 61.

[0096] U tehnici je dobro poznato da CDR3 domen, nezavisno od CDR1 i/ili CDR2 domena (ili više njih), sam može odrediti specifičnost vezivanja antitela za srodni antigen i da se više antitela može stvoriti predvidljivo sa istom specifičnošću vezivanja na zajedničkoj CDR3 sekvenci. Videti, na primer, Klimka et al. (2000) British J. of Kancer 83(2):252-260 (koji opisuje proizvodnju humanizovanog anti-CD30 antitela korišćenjem samo CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg anti-CD30 antitela Ki-4); Beiboer et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:833-849 (koji opisuje rekombinantna antitela na epitelni glikoprotein-2 (EGP-2) korišćenjem samo CDR3 sekvence teškog lanca roditeljskog mišjeg MOC-31 anti-EGP-2 antitela); Rader et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:8910-8915 (koji opisuje panel humanizovanih anti-integrin αvβ3 antitela korišćenjem varijabilnog CDR3 domena teškog i lakog lanca mišjeg anti-integrin αvβ3 antitela LM609 gde svaki član antitelo sadrži distinktnu sekvencu van CDR3 domena i sposobno je da vezuje isti epitop kao roditeljsko mišje antitelo sa afinitetima visokim ili višim od roditeljskog mišjeg antitela); Barbas et al. (1994) J. Am. Chem. Soc.116:2161-2162 (koji opisuje da CDR3 domen obezbeđuje najznačajniji doprinos vezivanju antigena); Barbas et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:2529-2533 (koji opisuje grafting CDR3 sekvenci teškog lanca tri Fabs (SI-1, SI-40, i SI-32) protiv humane placentalne DNK na teški lanac anti-tetanus toksoid Fab čime se zamenjuje postojeći CDR3 teškog lanca i pokazujući da je sam CDR3 domen omogućio specifičnost vezivanja); i Ditzel et al. (1996) J. Immunol. 157:739-749 (koji opisuje studije graftovanja gde je transfer samo CDR3 teškog lanca roditeljskog polispecifičnog Fab LNA3 na teški lanac monospecifičnog IgG tetanus toksoid-vezujućeg Fab p313 antitela bio dovoljan da se zadrži specifičnost vezivanja za roditeljski Fab).

[0097] Shodno tome, predmetni opis obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz antitela izvedenog iz humane ili ne-humane životinje, gde je monoklonsko antitelo sposobno da se specifično vezuje za BST1. Unutar određenih primera, predmetni opis obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz ne-humanog antitela, kao što je antitelo miša ili pacova, gde je monoklonsko antitelo sposobno da se specifično vezuje za BST1. Unutar nekih primera, takva inventivna antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz ne-humanog antitela (a) su sposobna da se kompetitivno vezuju sa; (b) zadrže funkcionalne osobine; (c) vezuju se za isti epitop; i/ili (d) imaju sličan afinitet vezivanja kao odgovarajuće roditeljsko ne-humano antitelo.

[0098] Unutar drugih primera, predmetni opis obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz humanog antitela, kao što je, na primer, humano antitelo dobijeno od ne-humane životinje, gde je humano antitelo sposobno da se specifično vezuje za BST1. Unutar drugih primera, predmetni opis obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz prvog humanog antitela, kao što je, na primer, humano antitelo dobijeno iz ne-humane životinje, gde je prvo humano antitelo sposobno da se specifično vezuje za BST1 i gde CDR3 domen iz prvog humanog antitela zamenjuje CDR3 domen u humanom antitelu kome nedostaje specifičnost vezivanja za BST1 da bi se stvorilo drugo humano antitelo koje je sposobno da se specifično vezuje za BST1. unutar nekih primera, takva inventivna antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz prvog humanog antitela (a) su sposobna da se kompetitivno vezuju sa; (b) zadrže funkcionalne osobine; (c) vezuju se za isti epitop; i/ili (d) imaju sličan afinitet vezivanja kao odgovarajuće roditeljsko prvo humano antitelo.

Antitela koja imaju određene sekvence klicine linije

[0099] U određenim primerima izvođenja, antitelo pronalaska sadrži varijabilni region teškog lanca iz određenog gena imunoglobulina teškog lanca klicine linije i/ili varijabilni region lakog lanca iz određenog gena imunoglobulina lakog lanca klicine linije

[0100] Na primer, u poželjnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji je proizvod ili je izveden iz mišjeg VH1-39 gena, mišjeg VH1-80 gena ili mišjeg VH69-1 gena, gde se antitelo specifično vezuje za BST1. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz mišjeg VK4-55 gena, mišji VK4-74 gen ili mišji VK44-1 gen, gde se antitelo specifično vezuje za BST1.

[0101] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, gde antitelo:

sadrži varijabilni region teškog lanca koji je proizvod ili je izveden iz mišjeg VH1-39 gena (gena koji uključuje nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NOs: 35 i 36); sadrži varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz mišjeg VK4-55 gena (gena koji uključuje nukleotidne sekvence date u SEQ ID NOs: 40, 41 i 42); i specifično se vezuje za BST1, poželjno humani BST1. Primeri antitela koja imaju VH1-39 i VK4-55 gene, sa prethodno opisanim sekvencama, su BST1_A2.

[0102] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, gde antitelo:

sadrži varijabilni region teškog lanca koji je proizvod ili je izveden iz mišjeg VH1-80 gena (gena koji uključuje nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NOs: 33 i 34); sadrži varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz mišjeg VK4-74 gena (gena koji uključuje nukleotidne sekvence date u SEQ ID NOs 37, 38 i 39); i specifično se vezuje za BST1, poželjno humani BST1. Primer antitela koje ima VH1-80 i VK4-74 gene, sa prethodno opisanim sekvencama, je BST1_A1.

[0103] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, gde antitelo:

sadrži varijabilni region teškog lanca koji je proizvod ili je izveden iz mišjeg VH69-1 gena (gena koji uključuje nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID NOs: 68 i 69); sadrži varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz mišjeg VK44-1 gena (gena koji uključuje nukleotidne sekvence date u SEQ ID NOs: 70, 71 i 72); i specifično se vezuje za BST1, poželjno humani BST1. Primer antitela koje ima VHi VKgene, sa prethodno opisanim sekvencama, je BST1_A3.

[0104] Kao što je ovde korišćeno, antitelo sadrži varijabilne regione teškog ili lakog lanca koji su "proizvod" ili "izvedeni iz" određene sekvence klicine linije ukoliko su varijabilni regioni antitela dobijeni iz sistema koji koristi imunoglobulinske gene mišje klicine linije. Takvi sistemi uključuju skrining biblioteke imunoglobulinskog gena prikazanog na fagu sa antigenom od interesa. Antitelo koje je " proizvod " ili "je izvedeno iz "imunoglobulinske sekvence mišje klicine linije može se identifikovati kao takvo poređenjem nukleotidne ili aminokiselinske sekvence antitela sa nukleotidnim ili aminokiselinskim sekvencama imunoglobulina mišje klicine linije i selekcijom imunoglobulinske sekvence mišje klicine linije koja je po sekvenci najbliža (tj. najveći % identičnosti) sa sekvencom antitela. Antitelo koje je "proizvod" ili "izvedeno iz "određene imunoglobulinske sekvence mišje klicine linije može sadržati aminokiselinske razlike u poređenju sa sekvencom klicine linije, usled, na primer, somatskih mutacija koje se javljaju u prirodi ili namerne introdukcije mutacije usmerene ka mestu. Međutim, izabrano antitelo je tipično najmanje 90% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom imunoglobulinskim genom mišje klicine linije i sadrži aminokiselinske ostatke koji identifikuju antitelo kao mišje u poređenju sa imunoglobulinskim aminokiselinskim sekvencama klicine linije drugih vrsta (npr. humane sekvence klicine linije). U određenim slučajevima, antitelo može biti najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom sa imunoglobulinskim genom klicine linije. Tipično, antitelo izvedeno iz određene sekvence mišje klicine linije prikazivaće ne više od 10 razlika u aminokiselinama od aminokiselinske sekvence kodirane sa imunoglobulinskim genom mišje klicine linije. U određenim slučajevima, antitelo može prikazati ne više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2, ili 1 razliku u aminokiselinama od aminokiselinske sekvence kodirane sa imunoglobulinskim genom klicine linije.

Homologa antitela

[0105] U sledećm primeru, antitelo opisa sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su homologe sa aminokiselinskim sekvencama poželjnih antitela opisanih ovde, i gde antitela zadržavaju željene funkcionalne osobine anti-BST1 antitela pronalaska.

[0106] Na primer, opis obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koje sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, gde: varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 2, 1 i 52; varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, 3 i 53; i antitela koje se vezuje za humani BST1. Takva antitela se mogu vezivati za humani BST1 sa EC50od 50 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 100 pM ili manje, ili poželjnije 10 pM ili manje.

[0107] Antitelo se takođe može vezati za CHO ćelije transfektovane sa humanim BST1.

[0108] U različitim primerima izvođenja, antitelo može biti, na primer, humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo.

[0109] U drugim primerima izvođenja, VHi/ili VKaminoksielinske sekvence mogu biti 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% homologe sa sekvencama datim prethodno. Antitelo koje ima VHi VKregione koji su visoko (tj.80% ili više) identični sa VHi VKregionima sekvenci datim prethodno, mogu se dobiti mutagenezom (npr. usemerenom na mesto ili PCR posredovanom mutagenezom) molekula nukleinske kiseline koji kodiraju SEQ ID NOs: 6, 5, 8, 7, 54 i 55 nakon čega sledi testiranje kodiranog izmenjenog antitela u odnosu na zadržanu funkciju korišćenjem ovde opisanih funkcionalanih analiza.

[0110] Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaja koje dele sekvence (tj. % homologije = # identičnih položaja/ukupan # položaja x 100), uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koja se mora uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je opisano u neograničavajućim primerima u nastavku.

[0111] Procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti korišćenjem algoritma od E. Meyers i W. Miller [Comput. Appl. Biosci. (1988) 4:11-17] koji je inkorporisan u ALIGN program (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tabele težine ostataka, penala za dužinu praznine od 12 i penala za prazninu 4. Dodatno, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti korišćenjem Needleman i Wunsch [J. Mol. Biol. (1970) 48:444-453] algoritma koji je inkorporisan u GAP program u GCG softverskom paketu (dostupan na http://www.gcg.com), korišćenjem ili Blossum 62 matrice ili PAM250 matrice, i težine za prazninu 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i težine za dužinu od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.

[0112] Dodatno ili alterantivno, sekvence proteina predmetnog pronalaska mogu se dalje koristiti kao "upitna sekvenca" da bi se izvršila pretraga u odnosu na javne baze podataka da bi se, na primer, identifikovale srodne sekvence. Takve pretrage se mogu izvesti korišćenjem XBLAST programa (verzija 2.0) od Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST pretrage proteina mogu se izvesti sa XBLAST programom, rezultat = 50, dužina reči = 3 da bi se dobile sekvence aminokiselina homologe molekulima antitela pronalaska. Da bi se dobila poravnanja sa prazninama za svrhe poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Kada se koriste BLAST i Gapped BLAST programi, mogu se korisiti podrazumevani parametri respektivnih programa (npr. XBLAST i NBLAST). Videti www.ncbi.nlm.nih.gov.

Antitela sa konzervativnim modifikacijama

[0113] U određenim primerima, antitelo opisa sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, gde jedan ili više ovih CDR sekvenci sadrži naznačene aminokiselinske sekvence na osnovu poželjnih antitela opisanih ovde (npr. BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3), ili njihovih konzervativnih modifikacija, i gde antitela zadržavaju željene funkcionalne osobine anti-BST1 antitela pronalaska. Shodno tome, opis obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence, gde: CDR3 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 14, 13 i 58, i njihovih konzervativnih modifikacija; CDR3 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NOs: 20, 19 i 61, i njenih konzervativnih modifikacija; i antitelo se vezuje za humani BST1 sa EC50od 50 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 100 pM ili manje, ili poželjnije 10 pM ili manje.

[0114] Antitelo se takođe može vezati za CHO ćelije transfektovane sa humanim BST1.

[0115] U poželjnom primeru izvođenja, CDR2 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 12 ili 51, i njihovih konzervativnih modifikacija; i CDR2 sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NOs: 18, i njenih konzervativnih modifikacija. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, CDR1 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 10, i njene konzervativne modifikacije; i CDR1 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 16, i njene konzervativne modifikacije. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, CDR3 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 14, i njene konzervativne modifikacije; i CDR3 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 20, i njene konzervativne modifikacije.

[0116] U poželjnom primeru izvođenja, CDR2 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 12 ili 51, i njene konzervativne modifikacije; i CDR2 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 18, i i njene konzervativne modifikacije. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, CDR1 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 10, i njene konzervativne modifikacije; i CDR1 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 16, i njene konzervativne modifikacije.

[0117] U različitim primerima izvođenja, antitelo može biti, na primer, humana antitela, humanizovana antitela ili himerna antitela.

[0118] Kao što je ovde korišćeno, namera je da se termin "modifikacije konzervativne sekvence" odnosi na modifikacije aminokiseline koje značajno ne utiču ili menjaju karakteristike vezivanja antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu. Takve konzervativne modifikacije uključuju aminokiselinske supstitucije, adicije i delecije. Modifikacije mogu biti introdukovane u antitelo pronalaska standardnim tehnikama poznatim u tehnici, kao što je mutageneza usmerena na mesto i PCR-posredovana mutageneza. Konzervativne supstitucije aminokiselina su one u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen sa aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselina koje imaju slične bočne lance definisane su u tehnici. Ove porodice uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta granate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr.

tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Stoga, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar CDR regione antitela pronalaska može se zameniti sa drugim aminokiselinskim ostacima iz porodice sa istim bočnim lancem i izmenjeno antitelo se može testirati u odnosu na zadržanu funkciju korišćenjem ovde opisanih funkcionalnih analiza.

[0119] CDR1 sekvence teškog lanca SEQ ID NOs: 10, 9 i 56 mogu sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, kao što je jedna, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; CDR1 sekvence lakog lanca SEQ ID NOs: 16, 15 i 59 mogu sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, kao što je jedna, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija;

CDR2 sekvence teškog lanca prikazanog na SEQ ID NO: 12 ili 51, 11 i 57 mogu sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, kao što je jedna, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; CDR2 sekvence lakog lanca prikazane na SEQ ID NOs: 18, 17 i 60 mogu sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, kao što je jedna, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; CDR3 sekvence teškog lanca prikazane na SEQ ID NOs: 14, 13 i 58 mogu sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, kao što je jedna, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; i/ili CDR3 sekvence lakog lanca prikazane na SEQ ID NOs: 20, 19 i 61 mogu sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, kao što je jedna, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija.

Antitela koja se vezuju za isti epitop kao anti-BST1 antitela pronalaska

[0120] U sledećem primeru, opis obezbeđuje antitela koja se vezuju za isti epitop na humanom BST1 kao bilo koje od BST1 monoklonskih antitela pronalaska (tj. antitela koja imaju sposobnost unakrsne-kompeticije za vezivanje za BST1 sa bilo kojim od monoklonskih antitela pronalaska). U jednom primeru, referentno antitelo za studije unakrsne kompetitivnosti može biti monoklonsko antitelo BST1_A2 (koje ima VHi VKsekvence kao što su prikazane u SEQ ID NOs: 2 i 4, respektivno), monoklonsklo antitelo BST1_A1 (koje ima VHi VKsekvence kao što su prikazane u SEQ ID NOs: 1 i 3, respektivno), monoklonsko antitelo BST1_A3 (koje ima VHi VKsekvence kao što su prikazane u SEQ ID NOs: 52 i 53, respektivno).

[0121] Takva unakrsno-kompetitivna antitela mogu se identifikovati na osnovu njihove sposobnosti unakrsne kompeticije sa BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3 u standardnom testu vezivanja BST1. Na primer, BIAcore analiza, ELISA analiza ili protočna citometrija se mogu koristiti za pokazivanje unakrsne kompetitivnosti sa antitelima predmetnog pronalaska. Sposobnost test antitela da inhibira vezivanje, na primer, BST1_A2, BST1_A1 i BST1_A3, sa humanim BST1 pokazuje da test antitelo može biti kompetitivno sa BST1_A2, BST1_A1 ili BST1_A3 za vezivanje za humani BST1 i stoga vezivati isti epitop na humanom BST1_A2, BST1_A1 ili BST1_A3.

Inženjeringom dobijena i modifikovana antitela

[0122] Antitelo pronalaska se može pripremiti korišćenjem antitela koje ima jednu ili više VHi/ili VLsekvenci opisanih ovde koje se mogu koristiti kao početni materijal za konstruisanje modifikovanog antitela, pri čemu modifikovano antitelo može imati izmenjene osobine u poređenju sa početnim antitelom. Antitelo se može konstruisasti modifikovanjem jedne ili više aminokiselina unutar jednog ili oba varijabilna regiona (tj. VHi/ili VL), na primer, unutar jednog ili više CDR regiona i/ili unutar jednog ili više okvirnih regiona. Dodatno ili alternativno, antitelo može biti konstruisano modifikovanjem ostataka unutar konstantnog regiona (ili više njih), na primer da bi se izmenila efektorska funkcija (funkcije) antitela.

[0123] U određenim primerima izvođenja, CDR grafting se možđe koristiti da se konstruišu varijabilni regioni antitela. Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno preko aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u šest regiona koji određuju kompelmentarnost teškog i lakog lanca (CDR). Iz tog razloga, aminokiselinske sekvence unutar CDR su raznovrsnije između pojedinačnih antitela nego sekvence van CDR. Kako su CDR sekvence odgovorne za većinu antitelo-antigen interakcija, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja oponašaju osobine specifičnih antitela koja se javljaju u prirodi konstruisanjem ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnih antitela koja se prirodno javljaju graftovanjem na okvirne sekvence drugog antitela sa različitim osobinama (videti , npr. Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. USA. 86:10029-10033; SAD patent br. 5,225,539 to Winter, i US Patent br.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 od Queen et al.).

[0124] Shodno tome, sledeći primer izvođenja pronalaska odnosi se na izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence koje sadrže aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NOs 10; 12 ili 51; i 14, respektivno, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence koje sadrže aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NOs: 16; 18; i 20, respektivno. Stoga, takva antitela sadrže VHi VKCDR sekvence monoklonskog antitela BST1_A2, s druge strane mogu sadržati različite okvrine sekvence od ovih antitela.

[0125] Takve okvirne sekvence se mogu dobiti iz javnih DNK baza ili objavljenih referenci koje uključuju sekvence gena antitela klicine linije. Na primer, DNK sekvence klicine linije za mišje gene varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mogu se naći u IMGT (international ImMunoGeneTics) baze sekvenci mišje klicine linije (dostupne preko http://www.imgt.cines.fr/?), kao i u Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health i Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Kao sledeći primer, DNK sekvence za gene varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mogu se naći u Genbank bazi.

[0126] Sekvence proteina antitela su poređene u odnosu na bazu podataka kompiliranih sekvenci proteina korišćenjem jednog od postupaka za pretraživanje sličnosti sekvence nazvan Gapped BLAST [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402], koji je dobro poznat stručnjacima. BLAST je heuristički algoritam po tome što statistički značajno poravnanje između sekvence antitela i sekvence iz baze verovatno sadrži parove segmenata sa visokim-skorom (HSP) poravnatih reči. Parovi segmenata čiji se skorovi ne mogu popraviti ekstenzijom ili skraćivanjem nazvani su hit. Ukratko, nukelotidne sekvence u bazi su prevedene i region između i uključujući FR1 do FR3 okvirni region je zadržan. Sekvence iz baze podataka imaju prosečnu dužinu od 98 ostataka. Duplikati sekvenci koji se tačno poklapaju celom dužinom proteina su uklonjeni. BLAST pretraga za proteine korišćenjem programa blastp sa podrazumevanim, standardnim parameterima izuzev nisko kompleksnog filtera, koji je isključen, i supstitucijom matrice iz BLOSUM62, filtrira prvih 5 hitova koji daju poklapanje sekvence. Nukleotidne sekvence su prevedene u svih šest okvira i okvir bez stop kodona u poklapajućem segmentu sekvence iz baze se smatra potencijalnim hitom. Ovo je zauzvrat potvrđeno korišćenjem BLAST programa tblastx, koji prevodi sekvencu antitela u svih šest okvira i upoređuje ove prevode u nukleotidne sekvence u bazi dinamički prevedenih u svih šest okvira.

[0127] Identičnosti su tačna poklapanja aminokiselina između sekvence antitela i baze proteina celom dužinom sekvence. Pozitivni (identičnosti poklapanja supstitucije) nisu identični, već aminokiselinske supstitucije vođene BLOSUM62 supstitucionom matricom. Ukoliko se sekvenca antitela poklapa sa dve od sekvenci iz baze sa istim identitetom, hit sa najviše pozitivnih će biti određen kao hit poklapajuće sekvence.

[0128] Poželjne okvirne sekvence za upotrebu u antitelima pronalaska su one koje su strukturno slične okvirnim sekvencama korišćenim od strane izabranih antitela pronalaska, npr., slične VH1-80 okvirnoj sekvenci, VH1-39 okvirnoj sekvenci, VK4-74 okvirnoj sekvenci i/ili VK4-55 okvirnim sekvencama korišćenim od strane poželjnih antitela pronalaska. VHCDR1, CDR2, i CDR3 sekvence, i VKCDR1, CDR2, i CDR3 sekvence, mogu se graftovati na okvirne regione koji imaju identičnu sekvencu kao ona koja se nalazi u imunoglobulinskom genu klicine linije iz koje se izvodi okvirna sekvenca, ili CDR sekvence se mogu graftovati na okvirne regione koji sadrže jednu ili više mutacija u poređenju sa sekvencama klicine linije. Na primer, nađeno je da je u određenim slučajevima korisno mutirati ostatke unutar okvirnog regiona da bi se održala i poboljšala sposobnost vezivanja antigena od strane antitela (videti, npr., SAD patenti br.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 od Queen et al.).

[0129] Drugi tip modifikacije varijabilnog regiona je mutacija aminokiselinskih ostataka unutar VHi/ili VKCDR1, CDR2 i/ili CDR3 regiona čime se poboljšava jedna ili više osobina vezivanja (npr. afinitet) antitela od interesa. Mutageneza usmerena na mesto ili PCR-posredovana mutageneza može se izvesti da bi se introdukovala mutacija (mutacije) i efekat vezivanja antitela, ili druga funkcionalana karakteristika od interesa, može se proceniti in vitro ili in vivo analizama kao što je ovde opisano i obezbeđeno u Primerima. U nekim primerima, uvedene su konzervativne modifikacije (kao što je prethodno razmatrano). Alternativno, mogu se napraviti ne-konzervativne modifikacije. Mutacije takođe mogu biti aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije, ali su poželjno supstitucije. Dodatno, tipično ne više od jednog, dva, tri, četiri ili pet ostataka unutar CDR regiona je izmenjeno, iako, kao što će shvatiti stručnjaci, varijante u drugim oblastima (na primer okvirnim regionima) mogu biti veće.

[0130] Shodno tome, u sledećem primeru, predmetni opis obezbeđuje izolovana anti-BST1 monoklonska antitela, ili njihove antigen vezujuće delove, koja sadrže varijabilni region teškog lanca koji sadrži: (a) VHCDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 9 i 56 ili aminokiselinske sekvence koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 10, 9 i 56; (b) VHCDR2 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 12 ili 51, 11 i 57, ili aminokiselinske sekvence koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 12 ili 51, 11 i 57; (c) VHCDR3 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 14, 13 i 58, ili aminokiselinske sekvence koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 14, 13 i 58; (d) VKCDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 16, 15 i 59, ili aminokiselinske sekvence koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 16, 15 i 59; (e) a VKCDR2 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18, 17 i 60, ili aminokiselinske sekvence koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 18, 17 i 60; i (f) a VKCDR3 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 20, 19 i 61, ili aminokiselinske sekvence koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 20, 19 i 61.

[0131] Inženjeringom dobijena antitela prema opisu uključuju ona u kojima su modifikacije napravljene u okvirnim ostacima unutar VHi/ili VK, npr. da bi se poboljšale karakteristike antitela. Tipično takve modifikacije okvirnih regiona napravljene su da bi se smanjila imunogenost antitela. Na primer, jedan pristup je da se "povratno mutira" jedan ili više okvirnih ostataka odgovarajućoj sekvenci klicine linije. Specifičnije, antitelo koje podleglo somatskoj mutaciji može sadržati okvirne ostatke koji se razlikuju od sekvence klicine linije od koje je antitelo izvedeno. Takvi ostaci se mogu identifikovati poređenjem okvirnih sekvenci antitela sa sekvencama klicine linije iz koje je izvedeno antitelo.

[0132] Drugi tip modifikacije okvirnog regiona uključuje mutiranje jednog ili više ostataka unutar okvirnog regiona, ili čak unutar jednog ili više CDR regiona, da bi se uklonili T ćelijski epitopi čime se smanjuje potencijalna imunogenost antitela. Ovaj pristup je takođe označen kao "deimunizacija" i opisan je detaljnije u SAD patentnoj objavi br.2003/0153043.

[0133] Dodatno ili alterenativno modifikacijama načinjenim unutar okvirnog ili CDR regiona, antitela pronalaska mogu biti konstruisana da uključuju modifikacije unutar Fc regiona, tipično da izmene jednu ili više funkcionalanih osobina antitela, kao što je polu-život u serumu, fiksiranje komplementa, vezivanje Fc receptora, i/ili antigen-zavisna ćelijska citotoksičnost. Dodatno, antitelo pronalaska može biti hemijski modifikovano (npr. jedna ili više hemijskih grupa može se vezati za antitelo) ili biti modifikovana da izmeni njegovu glikozilaciju, ponovo da se izmeni jedna ili više funkcionalnih osobina antitela. Svaki od ovih primera izivođenja je detaljnije opisan u nastavku. Numerisanje ostataka u Fc regionu je onaj od Kabat EU ideksa.

[0134] U jednom primeru izvođenja, zglobni region CH1 je tako modifikovan da je broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu izmenjen, npr. povećan ili smanjen. Ovaj pristup je dalje opisan u SAD patentu br. 5,677,425. Broj cisteinskih ostataka u zglobno regionu CH1 je izmenjen da bi se, na primer, olakšalo sastavljanje lakih i teških lanaca ili da bi se povećala ili smanjila stabilnost antitela.

[0135] U sledećem primeru izvođenja, Fc zglobni region antitela je mutiran da bi se smanjio biološki polu-život antitela. Specifičnije, jedna ili više aminokiselinskih mutacija je uvedeno u region interfejsa CH2-CH3 domena Fczglobnog fragmenta tako da antitelo ima oslabljeno vezivanje stafilokoknog proteina A (SpA) u odnosu na vezivanje SpA nativnog Fc-zglobnog domena. Ovaj pristup je detaljnije opisan u SAD patent br.6,165,745.

[0136] U sledećem primeru izvođenja, antitelo je modifikovano da bi se povećao njegov biološki polu-život. Mogući su različiti pristupi. Na primer, jedna ili više od sledećeih mutacija se može izvesti: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u SAD patent br.6,277,375. Alternativno, da bi se povećao biološki polu-život, antitelo se može izmeniti unutar CH1 ili CLregiona da sadrži vezujući epitop receptora za spasavanje uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kao što je opisano u SAD patentima br.5,869,046 i 6,121,022.

[0137] U sledećem primeru izvođenja, antitelo je proizvedeno kao unitelo kao što je opisano u WO2007/059782.

[0138] U sledećim primerima izvođenja, Fc region je izmenjen zamenom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka sa različitim aminokiselinskim ostatkom da bi se izmenila efektorska funkcija (funkcije) antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina izabrana od aminokiselinskih ostataka 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 može se zameniti sa različitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeni afinitet za efektorni ligand, ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost roditeljskog antitela. Efektorni ligand kome je promenjen afinitet može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je opisan detaljnije u SAD patentima br.5,624,821 i 5,648,260.

[0139] U sledećem primeru, jedna ili više aminokiselina izabranih od aminokiselinskih ostataka 329, 331 i 322 može se zameniti sa raličitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeno C1q vezivanje i/ili smanjenu ili ukinutu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Ovaj pristup je opisan detaljnije u SAD patent br.6,194,551.

[0140] U sledećem primeru, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar aminokiselinskih položaja 231 i 239 su izmenjeni čime se menja sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup je opisan detaljnije u PCT Publication WO 94/29351.

[0141] U sledećem primeru, Fc region je modifikovan da bi se povećala sposobnost antitela da posreduje antitelo zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) i/ili da poveća afinitet antitela za Fcγ receptor modifikacijom jedne ili više aminokiselina na sledećim položajima: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ili 439. Ovaj pristup je detaljnije opisan u PCT objavi WO 00/42072 od Presta. Dodatno, vezujuća mesta na humanom IgG1 za FcγR1, FcγRII, FcγRIII i FcRn su mapirana i opisane su varijante sa poboljšanim vezivanjem (videti Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Pokazano je da specifične mutacije na položajima 256, 290, 298, 333, 334 i 339 poboljšavaju vezivanje sa FcγRIII. Dodatno, pokazano je da sledeći kombinovani mutanti poboljšavaju vezivanje FcγRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A i S298A/E333A/K334A. Dodatne ADCC varijante su napisane, na primer, u WO2006/019447.

[0142] U sledećem primeru, Fc region je modifikovan da bi se povećao polu-život antitela, generalno povećanjem vezivanja sa FcRn receptorom, kao što je opisano, na primer, u PCT/US2008/088053, SAD 7,371,826, US 7,670,600 i WO 97/34631. U sledećem primeru izvođenja, antitelo je modifikovano da bi se povećao njegov biološki polu-život. Mogući su različiti pristupi. Na primer, jedna ili više sledećih mutacija se može uvesti: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u SAD patent br. 6,277,375 od Ward. Alternativno, da bi se povećao biološki polu-život, antitelo se može izmeniti unutar CH1 ili CLregiona da bi sadržao vezujući epitop receptora za spasavanje uzetog iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kao što je opisano u SAD patentima br. 5,869,046 i 6,121,022.

[0143] U sledećem primeru izvođenja, modifikovana je glikozilacija antitela. Na primer, može se stvoriti aglikozilovano antitelo (tj. antitelo kome nedostaje glikozilacija). Glikozilacija može biti izmenjena da bi se, na primer, povećao afinitet antitela za antigen. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu se postići sa, na primer, izmenom jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela. Na primer, može se napraviti jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje rezultuju u eliminaciji jednog ili više glikozilacionih mesta okvirnog regiona varijabilnog regiona da bi se time eliminisala glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet antitela za antigen. Takav pristup je opisan detaljnije u SAD patentima br. 5,714,350 i 6,350,861 od strane Co et al., i može se postići uklanjanjem asparagina na položaju 297.

[0144] Dodatno ili alternativno, može se napraviti antitelo koje ima izmenjeni tip glikozilacije, kao što je hipofukozilovano antitelo koje ima smanjene količine fukozil ostataka ili antitelo koje ima povećane bisekcione GlcNac strukture. Ovo se nekada u tehnici označava kao "inženjeringom dobijena glikoforma". Pokazano je da takvi izmenjeni obrasci glikozilacije povećavaju ADCC sposobnost antitela. Takve modifikacije ugljenih hidrata se generalno mogu postići na dva načina; na primer, u nekim primerima izvođenja, antitelo je eksprimirano u ćeliji domaćinu sa izmenjenom mašinerijom za glikozilaciju. Ćelije sa izmenjenom mašinerijom za glikozilaciju opisane u tehnici mogu se koristiti kao ćelije domaćini u kojima se eksprimiraju rekombinantna antitela pronalaska čime se proizvodi antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Referenca je napravljena u odnosu na POTELLIGENT® tehnologiju. Na primer, ćelijskim linijama Ms704, Ms705, i Ms709 nedostaje gen za fukoziltransferazu, FUT8 (alfa (1,6) fukoziltransferaza), tako da antitelima eksprimiranim u Ms704, Ms705, i Ms709 ćelijskim linijama nedostaje fukoza na njihovim ugljenim hidratima. Ms704, Ms705, i Ms709 FUT8-/- ćelijske linije su stvorene ciljanom disrupcijom FUT8 gena u CHO/DG44 ćelijama korišćenjem dva zamenska vektora [videti SAD patentnu objavu br. 2004/0110704, SAD patent br. 7,517,670 i Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614-22]. Kao sledeći primer, EP 1,176,195 od Hanai et al. Opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalno disruptovanim FUT8 genom, koji kodira fukozil transferazu, tako da antitela eksprimirana u takvoj ćelijskoj liniji pokazuju hipofukozilaciju smanjivanjem ili eliminacijom alfa 1,6 vezom-povezanog enzima. Hanai et al. takođe opisuju ćelijske linije koje imaju nisku enzimsku aktivnost za dodavanje fukoze N-acetilglucozaminu koji se vezuje za Fc region antitela ili nemaju enzimsku aktivnost, na primer ćelijska linija YB2/0 (ATCC CRL 1662) mijeloma pacova. Alterenativno, inženjeringom dobijene glikoforme, naročito afukozilacija, može se uraditi korišćenjem inhibitora malih molekula enzima glikozilacionog puta [videti, na primer, Rothman et al. (1989) Mol. Immunol.

26(12): 113-1123; Elbein (1991) FASEB J.5:3055; PCT/US2009/042610 i SAD patent br.7,700,321]. PCT objava WO 03/035835 opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Lec13 ćelije, sa smanjenom sposobnošću da vežu fukozu za Asn(297)-vezane ugljene hidrate, što takođe rezultuje u hipofukozilaciji antitela eksprimiranih u toj ćeliji domaćinu [videti takođe Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740]. PCT objava WO 99/54342 opisuje ćelijske linije konstruisane da eksprimiraju glikoprotein-modifikujuće glikozil transferaze (npr. beta(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferaza III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u inženjeringom dobijenim ćelijskim linijama pokazuju povećane bisekcione GlcNac strukture što rezultuje u povećanoj ADCC aktivnosti antitela [videti takođe Umana et al. (1999) Nat. Biotech.17:176-180].

[0145] Alternativno, fukozni ostaci antitela mogu se iseći korišćenjem enzima fukozidaze. Na primer, fukozidaza alfa-L-fukozidaze uklanja fukozil ostatke iz antitela [Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem.14:5516-23].

[0146] Sledeća modifikacija antitela ovde koja je predviđena pronalaskom je pegilacija. Antitelo može biti pegilovano da bi se, na primer, povećao biološki (npr. serumski) polu-život antitela. Da bi se pegilovalo antitelo, antitelo, ili njegov fragment, tipično reaguje sa polietilen glikolom (PEG), kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat PEG, pod uslovima u kojima se jedna ili više PEG grupa vezuje za antitelo ili fragment antitela. Poželjno, pegilacija je izvedena preko reakcije acilacije ili reakcije alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi). Kao što je ovde korišćeno, namera je da termin "polietilen glikol" obuhvata bilo koji od oblika PEG koij su korišćeni da se derivatizuju drugi proteini, kao što je mono (C1-C10) alkoksi ili ariloksi-polietilen glikol ili polietilen glikol-maleimid. U određenim primerima izvođenja, antitelo koje treba pegilovati je aglikozilovano antitelo. Postupci za pegilaciju proteina su poznati u tehnici i mogu se primeniti na antitela pronalaska. Videti, na primer, EP 0154316 i EP 0401384.

[0147] U dodatnim primerima izvođenja, na primer u upotrebi antitela opisa za dijagnostičke ili detekcione svrhe, antitela mogu sadržati obeleživač. Pod "obeleženim" ovde se podrazumeva da jedinjenje ima vezano najmanje jedan element, izotop ili hemijsko jedinjenje da bi se omogućila detekcija jedinjenja. Generalno, obeleživači spadaju u tri klase: a) izotopski obeleživači, koji mogu biti radioaktivni ili teški izotopi; b) magnetni, električni, termalni; i c) obojeni ili luminescentne boje; iako obeleživači takođe uključuju enzime i čestice kao što su magnetne čestice. Poželjni obeleživači uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorescentne lantanidne komplekse (uključujući one europijuma i terbijuma), i fluorescentntne obeleživače uključujući, ali se ne ograničavajući na, kvantum tačke, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, erihrozin, kumarin, metil-kumarine, piren, Malacite green, stilben, Lucifer Yellow, Cascade Blue, Texas Red, Alexa boje, Cy boje, i druge opisane u 6th Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland.

Linkeri

[0148] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo-partner konjugate gde je antitelo vezano sa partnerom preko hemijskog linkera. U nekim primerima, linker je peptidil linker, drugi linkeri uključuju hidrazin i disulfidne linkere. Dodatno linkerima koji su vezani za partnera, predmetni opis takođe obezbeđuje ruke linkera koje se mogu seći koje su odgovarajuće za vezivanje za suštinski bilo koju vrstu molekula. Ruka linkera može ovde biti data primerom referencom na njihovo vezivanje za terapeutsku grupu. Biće, međutim, sasvim jasno stručnjacima da se linkeri mogu vezati za raznovrsne vrste uključujući, ali se ne ograničavajući na, dijagnostičke agense, analitičke agense, biomolekule, agense za ciljanje, detektabilne obeleživače i slično.

[0149] Upotreba peptidil i drugih linkera u antitelo-partner konjugatima opisana je u SAD provitionim patentnim prijavama serijski br. 60/295,196; 60/295,259; 60/295342; 60/304,908; 60/572,667; 60/661,174; 60/669,871; 60/720,499; 60/730,804; i 60/735,657 i SAD patentne prijave serijski br. 10/160,972; 10/161,234; 11/134,685; 11/134,826; i 11/398,854 i SAD patent br. 6,989,452 i PCT patentna prijava br. PCT/US2006/37793. Dodatni linkeri su opisani u SAD patent br. 6,214,345, SAD patentna prijava 2003/0096743 i SAD patentna prijava 2003/0130189, de Groot et al, J. Med. Chem. 42, 5277 (1999); de Groot et al. J. Org. Chem. 43, 3093 (2000); de Groot et al., J. Med. Chem. 66, 8815, (2001); WO 02/083180; Carl et al., J. Med. Chem. Lett. 24, 479, (1981); Dubowchik et al., Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998); i SAD proviziona patentna prijava serijski br.

60/891,028.

[0150] U jednom primeru, predmetni opis se odnosi na linkere koij su korisni za vezivanje ciljnih grupa za terapeutske agense i markere. U sledećem primeru, ovaj opis obezbeđuje linkere koji daju stabilnost jedinjenjima, smanjuju njihovu in vivo toksičnost, ili na drugi način povoljno utiču na njihovu farmakokinetiku, bioraspoloživost i/ili farmakodinamiku. Generalno je poželjno da je u takvim primerima, linker isečen, oslobađajući aktivni lek, kada je dopremljen na mesto svog dejstva. Stoga, u jednom primeru izvođenja, linkeri predmetnog opisa su u tragovima, tako da kada su uklonjeni iz terapeutskog agensa ili markera (kao što je tokom aktivacije), ne ostaje trag prisustva linkera. U drugom primeru izvođenja, linkeri su karakterisani njihovom sposobnošću da budu isečeni na mestu u ili blizu ciljne ćelije kao što je na mestu terapeutskog dejstva ili aktivnosti markera. Takvo isecanje može biti po prirodi enzimsko. Ova osobina doprinosi smanjenju sistemske aktivacije terapeutskog agensa ili markera, smanjivanju toksičnosti i sistemskih sporednih efekata. Poželjne grupe koje se mogu za enzimsko isecanje uključuju peptidne veze, estarske veze, i disulfidne veze. U drugim primerima izvođenja, linkeri su senzitivni na pH i isečeni su preko promena u pH.

[0151] Aspekt predmetnog opisa je sposobnost kontrolisanja brzine kojom se linkeri isecaju. Često je poželjan linker koji se brzo iseca. U nekim primerima izvođenja, međutim, linker koji se iseca sporije može biti poželjan. Na primer, u formulaciji sa produženim oslobađanjem ili u formulaciji i sa komponentom sa brzim oslobađanjem i sa komponentnom sa sporim oslobađanjem, može biti korisno obezbediti linker koij se iseca sporije. WO 02/096910 obezebeđuje nekoliko specifičnih ligand-lek kompleksa koji imaju hidrazin linker. Međutim, ne postoji način da se "naštimuje" kompozicija linkera zavisna od stope potrebne ciklizacije, i određena opisana jedinjenja isecaju ligand iz leka sa sporijom stopom nego što je poželjno za mnoge lek-linker konjugate. Nasuprot tome, hidrazin linkeri predmetnog opisa obezbeđuju opseg stopa ciklizacije, od veoma brze do veoma spore, čime omogućavaju selekciju određenog hidrazin linkera na osnovu poželjne stope ciklizacije.

[0152] Na primer, veoma brza ciklizacija može se postići sa hidrazin linkerima koji proizvode pojedinačan 5-člani prsten nakon isecanja. Poželjne stope ciklizacije za ciljano dopremanje citotoksičnog agensa ćelijama su postignute korišćenjem hidrazin linkera koji proizvode, nakon isecanja, ili dva 5-člana prstena ili jedan 6-člani prsten koji je rezultat linkera koji ima dva metila na geminalnom položaju. Pokazano je da gem-dimetil efekat ubrzava stopu reakcije ciklizacije u poređenju sa jednim 6-članim prstenom bez dva metila na geminalnom položaju. Ovo je rezultat oslobađanja od istezanja u prstenu. Nekada, međutim, supstituenti mogu usporiti reakciju umesto da je ubrzaju. Često se razlozi za usporavanje mogu naći u steričkom ometanju. Na primer, gem dimetil supstitucija omogućava da se reakcija ciklizacije odigra mnogo brže u poređenju kada je geminalni ugljenik CH2.

[0153] Važno je napomenuti, međutim, da u nekim primerima izvođenja, linker koji se iseca sporije može biti poželjan. Na primer, u formulaciji sa produženim oslobađanjem i sa komponentom sa brzim oslobađanjem i sa komponentom sa sporim oslobađanjem, može biti korisno obezbediti linker koji se iseca sporije. U određenim primerima izvođenja, spora stopa ciklizacije je postignuta korišćenjem hidrazin linkera koji proizvodi, po isecanju, ili jedan 6-člani prsten, bez gem-dimetil supstitucije, ili jedan 7-člani prsten. Linkeri takođe služe da stabilizuju terapeutski agens ili marker u odnosu na degradaciju dok su u cirkulaciji. Ova osobina obezbeđuje značajnu korist jer takva stabilizacija rezultuje u prolongiranju polu-života vezanog agensa ili markera u cirkulaciji. Linker takođe služi da ublaži dejstvo vezanog agensa ili markera tako da je konjugat relativno benigan dok je u cirkulaciji i ima željeni efekat, na primer, toksičan je, nakon aktivacije na željenom mestu dejstva. Za konjugate terapeutskog agensa, ova osobina linkera služi da poboljša terapeutski indeks agensa.

[0154] Stabilizujuće grupe su poželjno izabrane da bi ograničile klirens i metabolizam terapeutskog agensa ili markera sa enzimima koji mogu biti prisutni u krvi ili ne-ciljnim tkivima i dodatno su selektovani da ograniče transport agensa ili markera u ćelije. Stabilizujuće grupe služe da blokiraju degradaciju agensa ili markera i mogu takođe delovati u obezbeđivanju drugih fizičkih karakteristika agensa ili markera. Stabilizujuća grupa može takođe poboljšati stabilnost agensa ili markera tokom skladištenja ili u formulisanom ili ne-formulisanom obliku.

[0155] Idealno, stabilizujuća grupa je korisna da stabilizuje terapeutski agens ili marker ukolliko služi da zaštiti agens ili marker od degradacije kada je testiran skladištenjem agensa ili markera u humanoj krvi na 37°C 2 časa i rezultuje u manje od 20%, poželjno manje od 10%, poželjnije manje od 5% i još poželjnije manje od 2%, isecanja agensa ili markera sa enzimima prisutnim u humanoj krvi pod datim uslovima analize. Predmetni opis se takođe odnosi na konjugate koji sadrže ove linkere. Određenije, opis se odnosi na upotrebu prolekova koji se mogu koristiti za tretman bolesti, naročito za hemoterapiju kancera. Specifično, upotreba ovde opisanih linkera obezbeđuje prolekove koji pokazuju visoku specifičnost dejstva, smanjenu toksičnost, i poboljšanu stabilnost u krvi u odnosu na prolekove slične strukture. Linkeri predmetnog opisa kao što su ovde opisani mogu biti prisutni u različitim položajima unutar molekula partnera.

[0156] Stoga, obezbeđen je linker koji može sadržati bilo koju od različitih grupa kao deo svog lanca koji će se isecati in vivo, npr. u krvotoku, sa stopom koja je poboljšana u odnosu na istu kod konstrukata kojima nedostaju takve grupe. Takođe su obezbeđeni konjugati ruku linkera sa terapeutskim i dijagnostičkim agensima. Linkeri su korisni da formiraju analoge prolekova terapeutskih agensa i da reverzibilno vezuju terapeutski ili dijagnostički agens sa ciljanim agensom, detektabilnim obeleživačem, ili čvrstom podlogom. Linkeri mogu biti inkorporisani u komplekse koji uključuju citokine.

[0157] Vezivanje proleka za antitelo može dati dodatne bezbednosne koristi u odnosu na konvencionalne konjugate antitela citotoksičnih lekova. Aktivacija proleka može se postići esterazom, i unutar ćelija tumora i u nekoliko normalnih tkiva, uključujući plazmu. Pokazano je da je nivo relevantne aktivnosti esteraze kod ljudi veoma sličan onom uočenom kod pacova i ne-humanih primata, iako manji nego onaj uočen kod miševa. Aktivacija proleka može se takođe postići isecanjem sa glukuronidazom. Dodatno peptidnoj, hidrazinskoj, ili disulfidnoj grupi koja se može isecati, jedna ili više auto-imolativnih linker grupa su izborno uvedene između citotoksina i ciljanog agensa. Ove linker grupe se takođe mogu opisati kao spejser grupe i sadrže najmanje dve reaktivne funkcionalne grupe. Tipično, jedna hemijska funkcionalna grupa spejser grupe se vezuje za hemijsku funkcionalnu grupe terapeutskog agensa, npr. citotoksina, dok se druga hemijska funkcionalna grupa spejser grupe koristi za vezivanje sa hemijskom funkcionalnom grupom agensa sa ciljanim dejstvom ili linkera koji se iseca. Primeri hemijskih funkcionalnih grupa spejser grupa uključuju hidroksi, merkapto, karbonil, karboksi, amino, keton, i merkapto grupe.

[0158] Auto-imolativni linkeri su generalno supstituisana ili nesupstituisana alkil, supstituisana ili nesupstituisana aril, supstituisana ili nesupstituisana heteroaril ili supstituisana ili nesupstituisana heteroalkil grupa. U jednom primeru izvođenja, alkil ili aril grupe mogu sadržati između 1 i 20 atoma ugljenika. One takođe mogu sadržati polietilen glikol grupu.

[0159] Primeri spejser grupa uključuju, na primer, 6-aminoheksanol, 6-merkaptoheksanol, 10-hidroksidekansku kiselinu, glicin i druge aminokiseline, 1,6-heksandiol, β-alanin, 2-amoetanol, cisteamin (2-aminoetantiol), 5-aminopentanska kiselina, 6-aminoheksanska kiselina, 3-maleimidobenzojeva kiselina, ftalid, α-supstituisani ftalidi, karbonil grupa, životinjski estri, nukleinske kiseline, peptidi i slično.

[0160] Spejser može služiti da introdukuje dodatnu molekulsku masu i hemijsku funkcionalnu grupu u citotoksin kompleks agensa sa ciljanim dejstvom. Generalno, dodatna masa i funkcionalna grupa uticaće na polu-život u serumu i druge osobine kompleksa. Stoga, preko pažljive selekcije spejser grupa, mogu se proizvesti citotoksin kompleksi sa opsegom polu-života u serumu.

[0161] Kada je prisutno više spejsera, mogu se koristiti ili identični ili različiti spejseri.

[0162] Može se koristiti dodatna linker grupa koja poželjno daje povećanu rastvorljivost ili osobine smanjene agregacije konjugatima korišćenjem linkera koji sadrži grupu ili modifikuje stopu hidrolize konjugata, takvi linkeri ne moraju biti auto-imolativni. U jednom primeru izvođenja, vezujuća grupa je supstituisani alkil, nesupstituisani alkil, supstituisani aril, nesupstituisani aril, supstituisani heteroaril, ili nesupstituisani heteroalkil, gde bilo koji od njih može biti prav, grant, ili cikličan. Supstitucije mogu biti, na primer, niži (C1-C6) alkil, alkoksi, alkiltio, alkilamino, ili dialkilamino. U određenim primerima izvođenja, linkeri sadrže ne-cikličnu grupu. U sledećem primeru izvođenja, linkeri sadrže bilo koji pozitivno ili negativno naelektrisani aminokiselinski polimer, kao što je polilizin ili poliarginin. Linkeri mogu sadržati polimer kao što je polietilen glikol grupa. Dodatno linker može sadržati, na primer, i komponentu polimera i malu hemijsku grupu. U poželjnom primeru izvođenja, takvi linkeri sadrže polietilen glikol (PEG) grupu.

[0163] PEG deo može biti između 1 i 50 jedinica dugačak. Poželjno, PEG će imati 1-12 ponovljenih jedinica, poželjnije 3-12 ponovljenih jedinica, poželjnije 2-6 ponovljenih jedinica, ili još poželjnije 3-5 ponovljenih jedinica i najpoželjnije 4 ponovljene jedinice. Linker se može sastojati samo od PEG grupe, ili može takođe sadržati dodatni supstituisani ili nesupstituisani alkil ili heteroalkil. Korisno je kombinovati PEG kao deo grupe da se poboljša rastvorljivost kompleksa u vodi. Dodatno, PEG deo smanjuje stepen agregacije koja se može javiti tokom konjugacije leka sa antitelom.

[0164] Za dalje razmatranje tipova citotoksina, linkera i drugih postupaka za konjugovanje terapeutskih agenasa sa antitelima, videti takođe PCT objavu WO 2007/059404 od Gangwar et al. i pod nazivom "Cytotoxic Compounds And Conjugates," Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Kancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Kancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Kancer 2:750-763; Pastan, I. i Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. i Springer, CJ. (2001) Adv. Drag Deliv. Rev.53:247-264.

Partner molekuli

[0165] Predmetni pronalazak uključuje antitelo konjugovano sa partner molekulom, kao što je citotoksin, lek (npr. imunosupresiv) ili radiotoksin. Takvi konjugati su ovde takođe označeni kao "imunokonjugati." Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više toksina ovde su označeni kao "imunotoksini." Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan (npr. ubija) ćelije.

[0166] Primeri partner molekula predmetnog pronalaska uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i njihovi analozi ili homolzi. Primeri partner molekula takođe uključuju, na primer, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuće agense (npr. mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis- dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antraciklini (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotici (npr. daktinomicin (prethodno aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i anti-mitotski agensi (npr. vinkristin i vinblastin).

[0167] Drugi poželjni primeri partner molekula koji mogu biti konjugovani sa antitelom pronalaska uključuju duokarmicini, kaliheamicini, majtanzini i auristatini, i njihovi derivati. Primer kaliheamicin antitelo konjugata je komercijalno dostupan (Mylotarg®; American Home Products).

[0168] Poželjni primeri partner molekula su CC-1065 i duokarmicini. CC-1065 je prvo izolovan iz Streptomyces zelensis 1981 od strane Upjohn Company (Hanka et al, J. Antibiot. 31: 1211 (1978); Martin et al., J. Antibiot. 33: 902 (1980); Martin et al., J. Antibiot. 34: 1119 (1981)) i nađeno je da ima potentno antitumorsko i antimikrobno dejstvo i in vitro i u eksperimentalnim životinjama (Li et al., Kancer Res. 42: 999 (1982)). CC- 1065 se vezuje za dvolančanu B-DNK unutar male brazde (Swenson et al., Kancer Res. 42: 2821 (1982)) sa preferencom sekvence 5’-d(A/GNTTA)-3’ i 5’-d(AAAAA)-3’ i alkiluje N3 poziciju 3’-adenin sa svojom CPI jedinicom na levoj strani prisutnoj u molekulu (Hurley et al., Science 226: 843 (1984)).

[0169] Uprkos svom potentnom i širokom antitumorskom dejstvu, CC-1065 ne može se koristiti kod ljudi jer izaziva odloženu smrt kod eksperimentalnih životinja. Mnogi analozi i derivati CC-1065 i duokarmicini su poznati u tehnici. Istraživanja strukture, sinteze i osobina mnogih jedinjenja je dato pregledno. Videti, na primer, Boger et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996); i Boger et al., Chem. Rev. 97: 787 (1997). Grupa na Kyowa Hakko Kogya Co., Ltd. Pripremila je brojne CC-1065 derivate. Videti, na primer, SAD pat br. 5,101, 038; 5,641,780; 5,187,186; 5,070,092; 5,703,080; 5,070,092; 5,641,780; 5,101,038; i 5,084,468; i objavljena PCT prijava, WO 96/10405 i objavljena Evropska prijava 0537575 A1. Upjohn Company (Pharmacia Upjohn) takođe je bila aktivna u pripremi derivata CC-1065. Videti, na primer, SAD patent br. 5,739,350; 4,978,757, 5,332, 837 i 4,912,227.

Fizičke osobine antitela

[0170] Antitela predmetnog pronalaska mogu se dalje karakterizovati različitim fizičkim osobinama anti-BST1 antitela. Različite analize se mogu koristiti da detektuju i/ili razlikuju različite klase antitela na osnovu ovih fizičkih osobina.

[0171] U nekim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu sadržati jedno ili više glikozilacionih mesta u varijabilnom regionu ili lakog ili teškog lanca. Prisustvo jednog ili više glikozilacionih mesta u varijabilnom regionu može rezultovati u povećanoj imunogenosti antitela ili izmeni pK antitela usled izmenjenog vezivanja antigena [Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA i Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706]. Poznato je da se glikozilacija dešava na motivima koji sadrže N-X-S/T sekvencu. Glikozilacija varijabilnog regiona može biti testirana korišćenjem glikoblot analize, koja seče antitelo da bi se proizveo Fab, i zatim testira glikozilaciju korišćenjem analize koji meri oksidaciju perjodata i formiranje Schiff-ove baze. Alternativno, glikozilacija varijabilnog regiona može se testirati korišćenjem Dionex light hromatografije (Dionex-LC), koja seče saharide iz Fab u monosaharide i analizira sadržaj pojedinačnih saharida. U nekim slučajevima, poželjno je imati anti-BST1 antitelo koje ne sadrži glikozilaciju varijabilnog regiona. Ovo se može postići ili selekcijom antitela koja ne sadrže glokozilacioni motiv u varijabilnom regionu ili mutiranjem ostataka unutar glikozilacionog motiva korišćenjem standardnih tehnika pozantih u tehnici.

[0172] U poželjnom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska ne sadrže mesta izomerizma asparagina. Deamidacija ili efekat izoasparaginske kiseline može se javiti na N-G ili D-G sekvencama, respektivno. Deamidacija ili efekat izoasparaginske kiseline rezultuje u stvaranju izoasparaginske kiseline koja smanjuje stabilnost antitela stvaranjem zakrivljene strukture sa karboksi terminusa bočnog lanca pre nego sa glavnog lanca. Stvaranje izoasparaginske kiseline može se meriti korišćenjem izo-kvant analize, koja koristi reverzno-faznu HPLC za testiranje izoasparaginske kiseline.

[0173] Svako antitelo će imati jedinstvenu izoelektričnu tačku (pI), ali će antitela generalno spadati u pH opseg između 6 i 9.5. pI za IgG1 antitelo tipično spada unutar pH opsega od 7-9.5 i pI za IgG4 antitelo tipično spada unutar opsega pH od 6-8. Antitela mogu imati pI koja je izvan ovog opsega. Iako su efekti generalno nepoznati, pretpostavlja se da antitela sa pI izvan normalnog opsega mogu imati nešto raspakivanja i nestabilnosti pod in vivo uslovima. Izoelektrična tačka se može testirati korišćenjem analize kapilarnog izoelektričnog fokusiranja, koje stvara gradijent pH i može koristiti lasersko fokusiranje za povećanu preciznost [Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67]. U nekim slučajevima, poželjno je imati anti-BST1 antitelo koje sadrži pI vrednost koja je unutar normalnog opsega. Ovo se može postići ili selekcijom antitela sa pI u normalnom opsegu, ili mutiranjem naelektrisanih površinskih ostataka korišćenjem standardnih tehnika dobro poznatih u tehnici.

[0174] Svako antitelo će imati temperaturu topljenja koja je indikativna za termalnu stabilnost [Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71]. Veća termalna stabilnost je indikacija ukupne stabilnosti antitela in vivo. Tačka topljenja antitela može se meriti korišćenjem tehnika kao što su diferencijalna skening kalorimetrija [Chen et al. (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett 68:47-52]. TM1 je indikacija temperature inicijalnog raspakivanja antitela. TM2 je indikacija temperature kompletnog raspakivanja antitela. Generalno, poželjno je da je TM1 antitela predmetnog pronalaska veća od 60°C, poželjno veća od 65°C, još poželjnije veća od 70°C. Alternativno, termalna stabilnost antitela može biti izmerena korišćenjem cirkularnog dihroizma [Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9].

[0175] U poželjnom primeru izvođenja, izabrana su antitela koja se ne degradiraju brzo. Fragmentacija anti-BST1 antitela može se meriti korišćenjem kapilarne elektroforeze (CE) i MALDI-MS, kao što se podrazumeva u tehnici [Alexander AJ i Hughes DE (1995) Anal. Chem.67:3626-32].

[0176] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, izabrana su antitela koja imaju minimalne agregacione efekte. Agregacija može voditi do okidanja neželjenog imunog odgovora i/ili izmenjenih ili neželjenih farmakokinetičkih osobina. Generalno, prihvatljiva su antitela sa agregacijom od 25% ili manje, poželjno 20% ili manje, još poželjnije 15% ili manje, još poželjnije 10% ili manje i još poželjnije 5% ili manje. Agregacija se može meriti sa nekoliko tehnika dobro pozantih u tehnici, uključujući ekskluzionu (SEC) tečnu hromatografiju visokih performasi na koloni (HPLC), i rasipanja svetlosti da bi se identifikovali monomeri, dimeri, trimeri ili multimeri.

Postupci za inženjering antitela

[0177] Kao što je prethodno razmatrano, anti-BST1 antitela sa VHi VKsekvencama opisanim ovde mogu se koristiti da se stvore nova anti-BST1 antitela modifikacijom VHi/ili VKsekvenci, ili konstantnog regiona (ili više njih) vezanog za njih. Stoga, u sledećem primeru, strukturne osobine anti-BST1 antitela iz opisa, npr. BST1_A2, BST1_A1 ili BST1_A3, korišćene su da se stvore strukturno srodna anti-BST1 antitela koja zadržavaju najmanje jednu funkcionalnu osobinu antitela pronalaska, kao što je vezivanje za humani BST1. Na primer, jedan ili više CDR regiona BST1_A2, BST1_A1 ili BST1_A3, ili njihove mutacije, mogu se rekombinantno kombinovati sa poznatim okvirnim regionima i/ili drugim CDR da bi se stvorila dodatna, rekombinatnim inženjeringom dobijena, anti-BST1 antitela iz opisa, kao što je prethodno razmatrano. Drugi tipovi modifikacija uključuju one opisane u prethodnom odeljku. Početni materijal za postupak inženjeringa je jedna ili više VHi/ili VKsekvenci obezbeđenih ovde, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Da bi se stvorilo antitelo napravljeno inženjeringom, nije neophodno da se svarno pripremi (tj. eksprimira kao protein) antitelo koje ima jednu ili više VHi/ili VKsekvenci obezbeđenih ovde, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Radije je informacija sadržana u sekvenci (sekvencama) korišćena kao početni materijal da bi se stvorila sekvenca (sekvence) "druge generacije" izvedena iz originalne sekvence (ili više njih) i zatim je sekvenca "druge generacije" pripremljena i eksprimirana kao protein.

[0178] Shodno tome, u sledećem primeru, opis obezbeđuje postupak za pripremu anti-BST1 antitela koji sadrži: obezbeđivanje: (i) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca antitela koja sadrži CDR1 sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 9 i 56, CDR2 sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 12 ili 51, 11 i 57, i/ili CDR3 sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 14, 13 i 58; i/ili (ii) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela koja sadrži CDR1 sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 16, 15 i 59, CDR2 sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18, 17 i 60 i/ili CDR3 sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 20, 19 i 61, sa izmenom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka unutar sekvence varijabilnog regiona teškog lanca antitela i/ili sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela da bi se stvorila najmanje jedna izmenjena sekvenca antitela; i eksprimiranje izmenjene sekvence antitela kao proteina.

[0179] Standardne tehnike molekularne biologije mogu se koristiti da se pripremi i eksprimira iznmenjena sekvenca antitela.

[0180] Poželjno, antitelo kodirano izmenjenom sekvencom (sekvencama) antitela je ona koja zadržava jednu, nekoliko ili sve funkcionalne osobine anti-BST1 antitela opisanih ovde, pri čemu funkcionalne osobine uključuju, ali nisu ograničene na: (a) vezivanje za humani BST1 sa KDod 1x10<-7>M ili manje; (b) vezuje se za humane CHO ćelije transfektovane sa BST1.

[0181] Funkcionalne osobine izmenjenih antitela mogu se proceniti korišćenjem standardnih analiza dostupnih u tehnici i/ili opisanih ovde, kao što su one date u Primerima (npr. protočna citometrija, analize vezivanja).

[0182] U određenim primerima postupaka inženjeringa antitela iz opisa, mutacije se mogu introdukovati po principu slučajnosti ili selektivno duž cele ili dela kodirajuće sekvence anti-BST1 antitela i može biti izvršen skrining rezultujućih modifikovanih anti-BST1 antitela u odnosu na aktivnost vezivanja i/ili druge funkcionalne osobine kao što je ovde opisano. Postupci mutacije opisani su u tehnici. Na primer, PCT objava WO 02/092780 opisuje postupke za stvaranje i skrining mutacija antitela korišćenjem saturacione mutageneze, sastavljanja preko sintetičkog vezivanja, ili njihovom kombinacijom. Alternativno, PCT objava WO 03/074679 opisuje postupke korišćenja računarskih skrining postupaka za optimizaciju fizičko-hemijskih osobina antitela.

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju antitela pronalaska

[0183] Sledeći aspekt pronalaska odnosi se na molekule nukleinske kiseline koji kodira antitela pronalaska. Nukelinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišćenom ili u značajno čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "načinjena značajno čistom" kada je prečišćena iz drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanata, npr. drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući alkalni/SDS tretman, CsCl stvaranje traka, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge dobro poznate u tehnici. Videti, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing i Wiley Interscience, N. Y. Nukelinska kiselina pronalaska može biti, na primer, DNK ili RNK i može ili ne mora sadržati intronske sekvence. U poželjnom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je molekul cDNK.

[0184] Nukelinske kiseline pronalaska mogu se dobiti korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Za antitela eksprimirana od strane hibridoma, cDNK koje kodiraju lake i teške lance antitela stvorene od strane hibridoma mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom ili tehnikama kloniranja cDNK. Za antitela dobijena iz biblioteke imunoglobulinskog gena (npr. korišćenjem tehnike fagnog prikaza), nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo mogu se rekuperovati iz biblioteke.

[0185] Poželjni molekuli nukleinskih kiselina opisa su oni koji kodiraju VHi VKsekvence BST1_A2, BST1_A1 ili BST1_A3 monoklonskih antitela. DNK sekvence koje kodiraju VHsekvence BST1_A2, BST1_A1 ili BST1_A3 prikazane su u SEQ ID NOs: 6, 5 i 54, respektivno. DNK sekvence koje kodiraju VKsekvence BST1_A2, BST1_A1 ili BST1_A3 su prikazane u SEQ ID NOs: 8, 7 i 55, respektivno.

[0186] Druge poželjne nukleinske kiseline opisa su nukelinske kiseline koje imaju najmanje 80% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence, sa jednom od sekvenci prikazanom u SEQ ID NOs: 6, 5, 8, 7, 54 i 55, pri čemu nukleinske kiseline kodiraju antitelo pronalaska, ili njegov antigen vezujući deo.

[0187] Procenat identičnosti između dve sekvence nukleinske kiseline je broj položaja u sekvenci u kojima je nukelotid identičan, uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koja se mora introdukovati za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvence i određeivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je algoritam od Meyers i Miller ili XBLAST program od Altschul opisan prethodno.

[0188] Dodatno, poželjene nukleinske kiseline opisa sadeže jedan ili više CDR-kodirajućih delova sekvenci nukleinske kiseline prikazane u SEQ ID NOs: 6, 5, 8, 7, 54 i 55. U ovom primeru, nukleinska kiselina može kodirati CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvencu teškog ili lakog lanca BST1_A2, BST1_A1 ili BST1_A3.

[0189] Nukleinske kiseline koje imaju najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence, pri čemu je takav CDR-kodirajući deo SEQ ID NOs: 6, 5, 8, 7, 54 i 55 (VHi VKsekv) takođe poželjne nukleinske kiseline opisa. Takve nukleinske kiseline se mogu razlikovati od odgovarajućeg dela SEQ ID NOs: 6, 5, 8, 7, 54 i 55 u ne-CDR kodirajućem regionu i/ili u CDR-kodirajućem regionu. Gde je razlika u CDR-kodirajućem regionu, CDR region nukleinske kiseline kodiran od strane nukelinske kiseline tipično sadrži jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence kao što je definisano ovde u poređenju sa odgovarajućom CDR sekvencom BST1_A2, BST1_A1 ili BST1_A3.

[0190] Kada su dobijeni DNK fragmenti koji kodiraju VHi VK, ovi DNK fragmenti se mogu dalje manipulisati standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer, da se konvertuju geni varijabilnog regiona u gene pune dužine lanca antitela, u gene Fab fragmenta, ili scFv gen. U ovim manipulacijama, DNK fragment koji kodira VK-ili VHje operativno vezan sa drugim DNK fragmentom koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Namera je da termin "operativno vezan", kao što je korišćeno u ovom kontekstu, označava da dva DNK fragmenta spojena tako da su aminokiselinske sekvence kodirane od strane dva DNK fragmenta ostaju unutar okvira.

[0191] Izolovana DNK koja kodira VHregion može se konvertovati u gen teškog lanca pune dužine preko operativnog vezivanja VH-kodirajuće DNK sa drugim DNK molekulom koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence mišjih gena konstantnog regiona teškog lanca poznati su u tehnici [videti npr. Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health i Human Services, NIH Publication No. 91-3242] i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region, ali je najpoželjnije IgG1 ili IgG4 konstantni region. Za gen teškog lanca Fab fragment, VH-kodirajuća DNK se može operativno vezati za drugi DNK molekul koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.

[0192] Izolovana DNK koja kodira VL/ VKregion može se konvertovati u gen lakog lanca pune dužine (kao i gen lakog lanca Fab) operativnim vezivanjem VL-kodirajuće DNK sa drugim DNK molekulom koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence mišjih gena konstantnog regiona lakog lanca su poznati u tehnici [videti , npr. Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health i Human Services, NIH Publication No. 91-3242] i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. U poželjnim primerima izvođenja, konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region.

[0193] Da bi se stvorio scFv gen, VH- i VL/ VK-kodirajući DNK fragmenti su operativno vezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr. kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)3, tako da VHi VL/ VKsekvence mogu biti eksprimirane kao susedni jednolančani protein, sa VL/ VKi VHregionima spojenim sa fleksibilnim linkerom [videti npr. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554].

Proizvodnja monoklonskih antitela

[0194] Prema pronalasku BST1 ili njegov fragment ili derivat može se koristiti kao imunogen da bi se stvorila antitela koja imunospecifično vezuju takav imunogen. Takvi imunogeni mogu se izolovati bilo kojim konvencionalnim načinima. Stručnjak će prepoznati da su mnoge procedure dostupne za proizvodnju antitela, na primer, kao što je opisano u Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow i David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y. Stručnjak će takođe shvatiti da se vezujući fragmenti ili Fab fragmenti koji imitiraju antitela mogu takođe pripremiti iz genetičke informacije različitim procedurama [Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol.149, 3914-3920 (1992)].

[0195] U jednom primeru, proizvedena su antitela na specifični domen BST1. U specifičnom primeru, hidrofilni fragmenti BST1 su korišćeni kao imunogeni za proizvodnju antitela.

[0196] U proizvodnji antitela, skrining za poželjno antitelo može se postići tehnikama poznatim u tehnici, npr. ELISA (imunoenzimska analiza). Na primer, da bi se izabrala antitela koja prepoznaju specifični domen BST1, mogu se analizirati stvoreni hibridomi u odnosu na proizvod koji se vezuje sa BST1 fragmentom koji sadrži takv domen. Za selekciju antitela koje specifično vezuje prvi BST1 homolog, ali koji se ne vezuje specifično za (ili se vezuje sa manjim aviditetom) drugi BST1 homolog, selekcija se može izvršiti na osnovu pozitivnog vezivanja za prvi BST1 homolog i nedostatak vezivanja za (ili smanjeno vezivanje za) drugi BST1 homolog. Slično, za selekciju antitela koje se specifično vezuje za BST1, ali koje se ne vezuje specifično za (ili se vezuje sa manjim aviditetom) različitu izoformu istog proteina (kao što je različita glikoforma koja ima isto peptidno jezgro kao BST1), selekcija se može izvršiti na osnovu pozitivnog vezivanja za BST1 i nedostatak vezivanja (ili smanjeno vezivanje) različitu izoformu (npr. različitu glikoformu). Stoga, predmetni opis obezbeđuje antitelo (kao što je monoklonsko antitelo) koje se vezuje sa većim afinitetom (na primer najmanje 2-puta, kao što je najmanje 5-puta, naročito najmanje 10-puta većim afinitetom) za BST1 nego za različitu izoformu ili izoforme (npr. glikoforme) BST1.

[0197] Poliklonska antitela koja se mogu koristiti u postupcima opisa su heterogene populacije molekula antitela izvedene iz seruma imunizovanih životinja. Takođe se može koristiti nefrakcionisani imuni serum. Različite procedure poznate u tehnici mogu se koristiti za proizvodnju poliklonskih antitela na BST1, fragment BST1, BST1-srodni polipeptid, ili fragment BST1-srodnog polipeptida. Na primer, jedan način je da se prečiste polipeptidi od interesa ili da se sintetišu polipeptidi od interesa korišćenjem, npr. postupaka sinteze peptida čvrste faze dobro poznatog u tehnici. Videti, npr. Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol. Vol 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzymol. Vol 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38: 1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995; Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44: 1326-31, 1996. Selektovani proteini se zatim mogu koristiti za imunizaciju injekcijom različitih životinja domaćina, uključujući, ali se ne ograničavajući na zečeve, miševe, pacove itd., da bi se stvorila poliklonska ili monoklonska antitela. Mogu se koristiti različiti ađuvansi (tj. imunostimulanti) da se poboljša imuni odgovor, u zavisnosti od vrste domaćina, uključujući, ali se ne ograničavajući na, kompletan ili nekompletan Freund-ov ađuvans, ili mineralni gel kao što je aluminijum hidroksid, površinski akivna supstanca kao što je lizolecitin, pluronic poliol, polianjon, peptide, uljana emulzija, hemocijanin puža prilepka, dinitrofenol, i ađuvans kao što je BCG (bacil Calmette-Guerin) ili corynebacterium parvum. Dodatni ađuvansi su takođe dobro poznati u tehnici.

[0198] Za pripremu monoklonskih antitela (mAbs) usmerenih protiv BST1, može se koristiti bilo koja tehnika koja obezbeđuje proizvodnju molekula antitela kontinuiranim ćelijskim linijama u kulturi. Na primer, tehnika hibridoma originalno razvijena od strane Kohler i Milstein (1975, Nature 256:495-497), kao i tehnika trioma, tehnika humanog B-ćelijskog hibridoma [Kozbor et al. (1983) Immunology Today 4:72], i tehnika EBV-hibridoma da bi se proizvela humana monoklonska antitela [Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies i Kancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]. Takva antitela mogu biti bilo koje klase imunoglobulina uključujući IgG, IgM, IgE, IgA, IgD i bilo koju njihovu potklasu. Hibridom koji proizvodi monoklonska antitela može se kultivisati in vitro ili in vivo. U dodatnom primeru izvođenja pronalaska, monoklonska antitela se mogu proizvesti u životinjama bez klica korišćenjem poznate tehnologije (PCT/US90/02545).

[0199] Poželjni životinjski sistem za pripremu hibridoma je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je veoma dobro ustanovljena procedura. Imunizacioni protokoli i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u tehnici. Fuzioni partneri (npr. ćelije mišjeg mijeloma) i fuzione procedure su takođe poznate.

[0200] Monoklonska antietla uključuju, ali nisu ograničena na humana monoklonska antitela i himerna monoklonska antitela (npr. humane-mišje himere).

[0201] Himerna ili humanizovana antitela predmetnog pronalaska se mogu pripremiti na osnovu sekvence nehumanog monoklonskog antitela pripremljenog kao što je prethodno opisano. DNK koja kodira teški i laki lanac imunoglobulina može se dobiti iz ne-humanog hibridoma od interesa i inženjeringom načiniti da sadrži ne-mišje (npr. humane) sekvence imunoglobulina korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, da bi se stvorilo himerno antitelo, varijabilni regioni miša se mogu vezati sa humanim konstantnim regionima korišćenjem postupaka poznatih u tehnici (videti npr. SAD patent br.4,816,567 od Cabilly et al.). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, mišji CDR regioni se mogu u baciti u humane okvirne regione korišćenjem postupaka poznatih u tehnici (videti npr. SAD patent br. 5,225,539 od Winter, i SAD patenti br. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 od Queen et al.).

[0202] Kompletno humana antitela mogu se proizvesti korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nisu sposobni da eksprimiraju gene imunoglobulina za teški i laki lanac, ali koji mogu da eksprimiraju humane gene teškog i lakog lanca. Transgeni miševi su imunizovani na uobičajen način sa izabranim antigenom, npr. celim ili delom BST1. Monoklonska antitela usmerena protiv antigena mogu se dobiti korišćenjem konvencionalne tehnologije hibridoma. Humani imunoglobulin transgeni koji su u transgenim miševima rearanžiraju se tokom diferencijacije B ćelije, i nakon toga podležu promeni klase i somatskoj mutaciji. Stoga, korišćenjem takve tehnike, moguće je proizvesti terapeutski korisna IgG, IgA, IgM i IgE antitela. Ovi transgeni i transhromozomski miševi uključuju miševe HuMAb Mouse® (Medarex ®, Inc.) i KM Mouse® sojeve. HuMAb Mouse® soj (Medarex ®, Inc.) je opisan u Lonberg i Huszar (1995, Int. Rev. Immunol.13:65-93). Za detaljno razmatranje ove tehnologije za proizvodnju humanih antitela i humanih monoklonskih antitela i protokola za proizvodnju takvih antitela, videti, npr. SAD patent 5,625,126; SAD patent 5,633,425; SAD patent SAD patent 5,569,825; SAD patent 5,661,016; i SAD patent 5,545,806. KM mouse® soj se odnosi na miša koji nosi transgen humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca i detaljno je opisan u PCT objavi WO 02/43478 od Ishida et al.

[0203] Dodatno, alternativni transgeni životinjski sistemi koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina dostupni su u tehnici i mogu se koristiti da se izazovu anti-BST1 antitela pronalaska. Na primer, može se koristiti alternativni transgeni sistem označen kao Xenomouse (Amgen, Inc.); takvi miševi su opisani u, na primer, SAD patent br.5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 i 6,162,963 od Kucherlapati et al.

[0204] Potpuno humana antitela koja prepoznaju izabrani epitop mogu se stvoriri korišćenjem tehnike označene kao "vođena selekcija". U ovom pristupu izabrano ne-humano monoklonsko antitelo, npr. mišje antitelo, koristi se za vođenje selekcije potpuno humanog antitela koje prepoznaje isti epitop [Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899-903].

[0205] Dodatno, alternativni transhromozomski životinjski sistemi koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina su dostupni u tehnici i mogu se koristiti da izazovu anti-BST1 antitela. Na primer, mogu se koristiti miševi koji nose i transhromozom humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca, označeni kao "TC miševi"; takvi miševi su opisani u Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Dodatno, krave koje nose transhromozome humanog teškog i lakog lanca opisani su u tehnici [Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894] i PCT objavi br. WO2002/092812 i mogu se koristiti da izazovu anti-BST1 antitela.

[0206] Humana monoklonska antitela pronalaska mogu se takođe pripremiti korišćenjem SCID miševa u kojima su rekonstituisane humane imune ćelije tako da se može stvoriti odgovor humanog antitela nakon imunizacije. Takvi miševi su opisani u, na primer, SAD patent br.5,476,994 i 3,698,767.

[0207] Antitela predmetnog pronalaska mogu se generisati korišćenjem tehnologije fagnog prikaza da bi se proizvele i izvršio skrining biblioteka polipeptida za vezivanje za izbrane ciljne strukture [videti, npr. Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990; Devlin et al., Science 249, 404-6, 1990, Scott i Smith, Science 249, 386-88, 1990; i Ladner et al., SAD patent br. 5,571,698]. Osnovni koncept postupaka fagnog prikaza je ustanovljavanje fizičke veze između DNK koja kodira polipeptid za koji treba izvršiti skrining i polipeptida. Fizička veza je obezbeđena česticom faga, koji prikazuje polipeptid kao deo kapsida koji omotava genom faga koji kodira polipeptid. Ustanovljavanje fizičke veze između polipeptida i njihovog genetičkog materijala omogućava simultani masovni skrining veoma velikog broja faga koji nose različite polipeptide. Fag koji prikazuje polipeptid sa afinitetom za ciljnu strukturu vezuje se za ciljnu strukturu i ovi fagi su obogaćeni afinitetnim skriningom za ciljnu strukturu. Identičnost polipeptida prikazanih od ovih faga može se odrediti iz njihovih respektivnih genoma. Korišćenjem ovih postupaka polipeptid identifikovan da ima afinitet vezivanja za željenu ciljnu strukturu se onda može sintetisati masovno konvencionalnim načinima. Videti, npr. SAD patent br.6,057,098. Naročito, takav fag se može koristiti da prikaže antigen vezujuće domene eksprimirane iz repertoara ili kombinatorne biblioteke antitela (npr. humane ili mišje). Fag koji eksprimira antigen vezujući domen koji vezuje antigen od interesa može se selektovati ili identifikovati sa antigenom, npr. korišćenjem obeleženog antigena ili antigen vezanog ili zarobljenog na čvrstoj površini ili kuglici. Fag korišćen u ovim postupcima je tipično filamentozni fag uključujući fd i M13 vezujuće domene eksprimirane iz faga sa Fab, Fv ili disulfidno stabilizovanim domenima Fv antitela rekombinantno fuzionisanih sa ili genom III faga ili proteinom gena VIII. Postupci fagnog prikaza koji se mogu koristiti da bi se stvorila antitela predmetnog pronalaska uključuju ona opisana u Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al. (1997) Gene 1879-18; Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280; PCT prijavi br PCT/GB91/01134; PCT objavama WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; i SAD patenti br. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108.

[0208] Kao što je opisano u perthodnim referencama, nakon selekcije faga, kodirajući regioni antitela iz faga se mogu izolovati i korisiti da se stvore cela antitela, uključujući humana antitela, ili bilo koji drugi antigen vezujući fragment, i eksprimirati u bilo kom poželjnom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekta, biljne ćelije, kvasac, i bakterije, npr. kao što je detaljno opisano u nastavku. Na primer, tehnike da se rekombinatno proizvedu Fab, Fab’ i F(ab’)2 fragmenti takođe se mogu upotrebiti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici kao što su one opisane u PCT objavi WO 92/22324; Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6):864-869; i Sawai et al. (1995) AJRI 34:26-34; i Better et al. (1988) Science 240:1041-1043.

[0209] Primeri tehnika koje se mogu koristiti da se proizvedu jednolančani Fvs i antitela uključuju one opisane u SAD patentima 4,946,778 i 5,258,498; Huston et al. (1991), Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al. (1993) PNAS 90:7995-7999; i Skerra et al. (1988) Science 240:1038-1040.

[0210] Pronalazak obezbeđuje funkcionalno aktivne fragmente, derivate ili analoge anti-BST1 imunoglobulinskih molekula. Funkcionalno aktivni označava da je fragment, derivat ili analog sposoban da izazove anti-anti-idiotip antitela (tj. tercijarna antitela) koja prepoznaju isti antigen koji je prepoznat od strane antitela iz koga je izveden fragment, derivat ili analog. Specifično, u naročitom primeru izvođenja antigenost idiotipa molekula imunoglobulina može se poboljšati delecijom okvirnog regiona i CDR sekvenci koje su C-terminalo od CDR sekvence koja specifično prepoznaje antigen. Da bi se odredilo koje CDR sekvence vezuju antigen, mogu se koristiti sintetički peptidi koji sadrže CDR sekvence u testovima vezivanja sa antigenom preko bilo kog testa vezivanja poznatog u tehnici.

[0211] Predmetni pronalazak obezbeđuje fragmente antitela kao što su, ali bez ograničavanja na, F(ab’)2 fragmente i Fab fragmente. Fragmenti antitela koji prepoznaju specifične epitope mogu se stvoriti poznatim tehnikama. F(ab’)2 fragmenti se sastoje od varijabilnog regiona, konstantnog regiona lakog lanca i CH1 domena teškog lanca i stvoreni su digestijom molekula antitela pepsinom. Fab fragmenti su stvoreni redukcijom disulfidnih mostova F(ab’)2 fragmenata. Pronalazak takođe obezbeđuje dimere teškog lanca i lakog lanca antitela pronalaska, ili bilo koji njihov minimalni fragment kao što je Fvs ili jednolančana antitela (SCAs) [npr. kao što je opisano u US Patent 4,946,778; Bird, (1988) Science 242:423-42; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; i Ward et al. (1989) Nature 334:544-5], ili bilo koji drugi molekul sa istom specifičnošću kao antitelo pronalaska. Jednolančana antitela su obrazovana vezivanjem fragmenata teškog i lakog lanca Fv regiona preko aminokiselinskog mosta, rezultujući u jednolančanom polipeptidu. Mogu se koristiti tehnike za sastavljanje funkcionalnih Fv fragmenata u E. coli [Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041].

[0212] U drugim primerima, opis obezbeđuje fuzione proteine imunoglobulina pronalaska (ili njihove funkcionalno aktivne fragmente), na primer u kojima je imunoglobulin fuzionisan preko kovalentne veze (npr. peptidne veze), ili na N-terminusu ili na C-terminusu sa aminokiselinskom sekvencom drugog proteina (ili njegovog dela, poželjno dela proteina od najmanje 10, 20 ili 50 aminokiselina) koji nije imunoglobulin. Poželjno imunoglobulin, ili njegov fragment, je kovalentno vezan sa drugim proteinom na N-terminusu konstantnog domena. Kao što je prethodno navedeno, takvi fuzioni proteini mogu olakšati prečišćavanje, povećati polu-život in vivo, i poboljšati dopremanje antigena preko epitelne barijere u imuni sistem.

[0213] Imunoglobulini pronalaska uključuju analoge i derivate koji su modifikovani, tj. kovalentno vezani za bilo koji tip molekula dok god takvo kovalentno vezivanje ne onemogućava imunospecifično vezivanje. Na primer, ali bez ograničavanja, derivati i analozi imunoglobulina uključuju one koji su dodatno modifikovani, npr. glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom sa poznatim zaštitinim/blokirajućim grupama, proteolitičkim isecanjem, vezivanjem sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinom, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može se izvesti poznatim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na specifično hemijsko isecanje, acetilaciju, formilaciju, itd. Dodatno, analog ili derivat može sadržati jedan ili više ne-klasičnih aminokiselina.

Imunizacija miševa

[0214] Miševi se mogu imunizovati sa prečišćenim ili obogaćenim preparatom BST1 antigena i/ili rekombinantnim BST1, ili ćelijama koje eksprimiraju BST1. Poželjno, miševi će biti 6-16 nedelja starosti nakon prve infuzije. Na primer, prečišćeni ili rekombinantni preparat (100 µg) BST1 antigena može se koristiti za imunizaciju miševa intraperitonealno.

[0215] Kumulativno iskustvo sa različitim antigenima pokazalo je da miševi odgovaraju kada su imunizovani intraperitonealno (IP) sa antigenom u kompletnom Freund-ovom ađuvansu. Međutim, nađeno je da su ađuvansi različiti od Freund-ovog takođe efikasni. Dodatno, nađeno je da su cele ćelije u odsustvu ađuvansa visoko imunogene. Imuni odgovor može biti praćen tokom imunizacionog protokola sa uzorcima plazme dobijenim iz retroorbitalne krvi. Može se izvršiti skrining plazme sa ELISA (kao što je opisano u nastavku) da bi se testirali u odnosu na zadovoljavajuće titre. Miševi mogu biti bustovani intravenski sa antigenom 3 uzastopna dana sa žrtvovanjem i uklanjanjem slezine 5 dana kasnije. U jednom primeru izvođenja, mogu se koristiti A/J mišji sojevi (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.).

Stvaranje transfektoma koji proizvode monoklonska antitela

[0216] Antitela pronalaska se mogu proizvesti u transfektom ćeliji domaćinu korišćenjem, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i postupaka transfekcije gena kao što je dobro poznato u tehnici [npr. Morrison, S. (1985) Science 229:1202].

[0217] Na primer, da bi se eksprimirala antitela, ili njihovii fragmenti antitela, DNK koje kodiraju deo ili lake i teške lance pune dužine, mogu se dobiti standardnim tehnikama molekularne biologije (npr. PCR amplifikacijom ili cDNK kloniranjem korišćenjem hibridoma koji eksprimira antitelo od interesa) i DNK se mogu ubaciti u ekspresione vektore tako da su geni operativno vezani sa kontrolnim sekvencama transkripcije i translacije. U ovom kontekstu, namera je da termin "operativno vezan" označava da je gen antitela vezan u vektor tako da kontrolne sekvence za transkripciju i translaciju unutar vektora služe njihovoj nameravanoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i sekvence koje kontrolišu ekspresiju izabrane su da budu kompatibilne sa korišćenom ekspresionom ćelijom domaćinom.

[0218] Ćelija domaćin može biti ko-transfektovana sa dva ekspresiona vektora pronalaska, gde prvi vektor kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugi vektor kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu sadržati identične selektabilne markere koji omogućavaju jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Alternativno, može se koristiti jedan vektor koji kodira polipeptide i teškog i lakog lanca. U takvim situacijama, laki lanac treba da bude postavljen ispred teškog lanca da bi se izbegao višak toksičnog slobodnog teškog lanca [Proudfoot (1986) Nature 322:52; Kohler (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197]. Kodrirajuće sekvence za teške i lake lance mogu sadržati cDNK ili genomsku DNK.

[0219] Geni antitela su ubačeni u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr. vezivanjem komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena antitela i vektoru, ili vezivanjem za tupi kraj ukoliko ne postoje restrikciona mesta). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela opisani ovde mogu se koristiti da se stvore geni pune dužine antitela bilo kog izotipa antitela njihovim ubacivanjem u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teških i lakih lanaca željenog izotipa tako da je VHsegment operativno vezan za CHsegment(e) unutar vektora i VKsegment je operativno vezan za CLsegment unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinatni ekspresioni vektor može kodirati signalni peptid koij olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može se klonirati u vektor tako da je signalni peptid vezan u okviru sa amino terminusom gena lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili hetereologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz ne-imunoglobulinskog proteina).

[0220] Dodatno genima lanaca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanaca antitela u ćeliji domaćinu. Namera je da termin "regulatorna sekvenca" uključuje promotore, enhansere i druge ekspresione kontrolne elemente (npr. poliadenilacioni signali) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Stručnjaci će shvatiti da dizajn ekspresionog vektora, uključujući selekciju regulatornih sekvenci, može zavisiti od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja se transformiše, nivoa ekspresije željenog proteina, itd. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju ćelije domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promotori i/ili enhanseri izvedeni iz citomegalovirusa (CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovirusa, (npr. glavnog kasnog promotora adenovirusa (AdMLP) i polioma. Alternativno, mogu se koristiti ne-virusne sekvence, kao što je ubikvitin promotor ili β-globin promotor. Dodatno, regulatorni elementi sastavljeni od sekvenci iz različitih izvora, kao što je sistem SRα promotora, koji sadrži sekvence iz SV40 ranog promotora i dugački terminalni ponovak virusa tipa 1 humane T ćelijske leukemije [Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol.8:466-472].

[0221] Dodatno genima lanca antitela i regulatornim sekvencama, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćinima (npr. oridžini replikacije) i selektabilne marker gene. Selektabilni marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je introdukovan vektor (videti, npr. SAD patente br. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi od Axel et al.). Na primer, tipično selektabilni marker gen daje rezistenciju na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju je vektor introdukovan. Poželjni selektabilni marker geni uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr- ćelijama domaćinima sa selekcijom/amplifikacijom sa metotreksatom) i neo gen (za G418 selekciju).

[0222] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodira teške i lake lance je transfektovan u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Namera je da različiti oblici termina "transfekcija" obuhvataju veoma raznovrsne tehnike uobičajeno korišćene za introdukciju egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporacija, taloženje sa kalcijum-fosfatom, DEAE-dekstran transfekcija i slično. Iako je teoretski moguće eksprimirati antitela pronalaska ili u prokariotskim ili u eukariotskim ćelijama domaćinima, ekspresija u eukariotskim ćelijama, i najpoželjnije sisarskim ćelijama domaćinima, je najpoželjnija jer će takve eukariotske ćelije, i naročito ćelije sisara, verovatnije od prokariotskih ćelija sastaviti i izlučiti ispravno spakovano i imunološki aktivno antitelo. Objavljeno je da je prokariotska ekspresija gena antitela neefikasna za proizvodnju visokog prinosa aktivnog antitela [Boss, M. A. i Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13].

[0223] Poželjne sisarske ćelije domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela pronalaska uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), zajedno sa vektorom kao što je glavni neposredni rani genski promotorni element iz humanog citomegalovirusa [Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al. (1990) BioTechnology 8:2], dhfr-CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, korišćene sa DHFR selektabilnim markerom, npr. kao što je opisano u R. J. Kaufman i P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), ćelije NSO mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Naročito, za upotrebu sa ćelijama NSO mijeloma, drugi poželjni ekspresioni sistem je ekspresioni sistem GS gena opisan u WO 87/04462 (od Wilson), WO 89/01036 (od Bebbington) i EP 338,841 (od Bebbington).

[0224] Raznovrsni sistemi za ekspresiju vektora od strane domaćina mogu se koristiti za ekspresiju molekula antitela pronalaska. Takvi ekspresioni sistemi domaćina predstavljaju vehikulume preko kojih se mogu proizvesti i nakon toga prečistiti kodirajuće sekvence od interesa, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu da, kada su transformisane ili transfektovane sa odgovarajućim kodirajućim nukleotidnim sekvencama, eksprimiraju molekul antitela pronalaska in situ. Oni uključuju ali nisu ograničeni na mikroorganizme kao što su bakterije (npr. E. coli, B. subtilis) transformisane sa ekspresionim vektorima sa DNK rekombinantnog bakteriofaga, DNK plazmida ili DNK kozmida koji sadrže kodirajuće sekvence antitela; kvasac (npr. Saccharomyces, Pichia) transformisan sa rekombinantnim ekspresionim vektorima koji sadrže kodirajuće sekvence antitela; sistemi ćelije insekta inficiranih sa rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr. bakulovirus) koji sadrže kodirajuće sekvence antitela; sistemi biljne ćelije inficirane sa rekombinantnim virusnim vektorom (npr. mozaični virus karfiola, CaMV; mozaični virus duvana, TMV) ili transformisane sa rekombinantnim plazmidnim ekspresionim vektorima (npr. Ti plazmid) koji sadrže kodirajuće sekvence antitela; ili sistemi ćelije sisara (npr. COS, CHO, BHK, 293, 3T3 ćelija) koje nose ekspresione konstrukte koji sadrže promotore izvedene iz genoma ćelija sisara (npr. metalotionein promotor) ili iz sisarskih virusa (npr. adenovirusni kasni promotor; 7.5K promoter vakcinia virusa).

[0225] U bakterijskim sistemima, određen broj ekspresionih vektora može se pogodno izabrati u odnosu na nameravanu upotrebu molekula antitela koje se eksprimira. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog proteina, za stvaranje farmaceutskih kompozicija koje sadrže molekul antitela, mogu biti poželjni vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa proizvoda fuzionih proteina koji se mogu lako prečistiti. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, E. coli ekspresioni vektor pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791), u kojem kodirajuća sekvenca antitela može biti vezana pojedinačno u vektor u okviru sa lac Z kodirajućim regionom tako da se proizvodi fuzioni protein; pIN vektori [Inouye & Inouye (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster (1989) J. Biol. Chem. 24:5503-5509]; i slični pGEX vektori se takođe mogu koristiti da eksprimiraju strane polipeptide kao fuzione proteine sa glutation S-transferazom (GST). Generalno, takvi fuzioni proteini su rastvorljivi i mogu se lako prečistiti iz liziranih ćelija sa apsorpcijom i vezivanjem za matriks glutationagaroznih kuglica nakon čega sledi eluiranje u prisustvu slobodnog glutationa. pGEX vektori su dizajnirani da uključuju trombin ili faktor Xa mesta isecanja proteaze tako da klonirani ciljni genski proizvod može biti oslobođen iz GST dela.

[0226] U insekatskom sistemu, Autographa californica jedarni polihedrozni virus (AcNPV) je korišćen kao vektor da eksprimira strane gene. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda. Kodirajuća sekvenca antitela može biti klonirana pojedinačno u ne-esencijalne regione (na primer polihedrin gen) virusa i stavljena pod kontrolu AcNPV promotora (na primer polihedrin promotora). U sisarskim ćelijama domaćinima, može se koristiti određen broj ekspresionih sistema zasnovanih na virusu (npr. adenovirusni ekspresioni sistem).

[0227] Kao što je prethodno razmatrano, može se izabrati soj ćelija domaćina koji modulira ekspresiju ubačenih sekvenci, ili modifikuje i obrađuje proizvod gena na željeni specifični način. Takve modifikacije (npr. glikozilacija) i obrada (npr. isecanje) proteinskih proizvoda mogu biti važne za funkciju proteina.

[0228] Dugoročno, za proizvodnju rekombinantnih antitela u visokom prinosu, poželjna je stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju antitelo od interesa mogu se proizvesti transfekcijom ćelija sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleotidnu sekvencu antitela i nukleotidnu sekvencu selektabilnog (npr. neomicin ili higromicin), i selekciju ekspresije selekttabilnog markera. Takve inženjeringom dobijene ćelije mogu biti naročito korisne u skriningu i proceni jedinjenja koja direktno ili indirektno interaguju sa molekulom antitela.

[0229] Nivoi ekspresije molekula antitela mogu se povećati amplifikacijom vektora [za pregled, videti Bebbington i Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNK cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)]. Kada je moguće amplifikovati marker u vektorskom sistemu koji eksprimira antitelo, povećanje nivoa inhibitora prisutnog u kulturi ćelija domaćina povećaće broj kopija marker gena. Kako je amplifikovani region povezan sa genom antitela, takođe će se povećati proizvodnja antitela [Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol.3:257].

[0230] Kada su rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela introdukovani u sisarske ćelije domaćine, antitela su proizvedena kultivisanjem ćelija domaćina u vremenskom periodu koji je dovoljan da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćinima ili, poželjnije, da izluči antitelo u medijum kulture u kome rastu ćelije domaćini. Kada je molekul antitela pronalaska rekombinantno eksprimiran, može se prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici za prečišćavanje molekula antitela, na primer, hromatografijom (npr. jonoizmenjivačkom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom kao što je sa proteinom A ili specifičnim antigenom, i ekskluzionom hromatografijom), centrifugiranjem, različitom rastvorljivošću, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina.

[0231] Alternativno, bilo koji fuzioni protein se može lako prečistiti korišćenjem antitela specifičnog za fuzioni protein koji je eksprimiran. Na primer, sistem opisan od strane Janknecht et al. omogućava lako prečišćavanje nedenaturisanih fuzionih proteina eksprimiranih u humanim ćelijskim linijama [Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897]. U ovom sistemu, gen od interesa je subkloniran u vakcinia rekombinantni plazmid tako da je otvoreni okvir čitanja gena translaciono fuzionisan sa amino-terminalnim tagom koji se sastoji od šest histidinskih ostataka. Tag služi kao matriksni vezujući domen za fuzioni protein. Ekstrakti iz ćelija inficiranih sa rekombinantnim vakcinia virusom napunjeni su u Ni<2+>nitrilosirćetna kiselina-agarozne kolone i histidin-obeleženi proteini su selektivno eluirani sa puferima koji sadrže imidazol.

Karakterizacija vezivanja antitela sa antigenom

[0232] Antitela koja su stvorena ovim postupcima mogu zatim biti selektovana prvo sa skriningom u odnosu na afinitet i specifičnost sa prečišćenim polipeptidom od interesa i, ukoliko je neophodno, poređenjem rezultata sa afinitetom i specifičnošću antitela sa polipeptidima za koje se želi da budu isključeni iz vezivanja. Antitela se mogu testirati za vezivanje za BST1 sa, na primer, standardnom ELISA. Procedura skrininga može uključivati imobilizaciju prečišćenih polipeptida u zasebnim komoricama mikrotitarskih ploča. Rastvor koji sadrži potencijalno antitelo ili grupe antitela je zatim postavljen u respektivne mikrotitarske komorice i inkubiran oko 30 min do 2 č. Mikrotitarske komorice su zatim isprane i komoricama je dodato obeleženo sekundarno antitelo (na primer, anti-mišje antitelo konjugovano sa alakalnom fosfatozom ukoliko su izazvana antitela mišja antitela) i inkubirano oko 30 min i zatim isprano. Komoricama je dodat supstrat i obojena reakcija će se pojaviti gde je prisutno imobilizovano antitelo na polipeptid(e).

[0233] Tako identifikovana antitela se zatim mogu dodatno analizirati u odnosu na afinitet i specifičnost u izabranom dizajnu analize. U razvoju imunoanaliza za ciljni protein, prečišćeni ciljni protein deluje kao standard sa kojim se procenjuje osetljivost i specifičnost imunoanalize korišćenjem antitela koja su izabrana. Kako se afinitet vezivanja različitih antitela može razlikovati, određeni parovi antitela (npr. u sendvič analizi) mogu biti u međusobnoj steričkoj interferenciji, itd., performansa antitela u analizi može biti važnija mera od apsolutnog afiniteta i specifičnosti antitela.

[0234] Stručnjaci će prepoznati da se mogu preduzeti mnogi pristupi u proizvodnji antitela ili vezujućih fragmenata i skriningu i selekciji u odnosu na afinitet i specifičnost za različite polipeptide, ali ovi pristupi ne menjaju obim pronalaska.

[0235] Da bi se odredilo da li se izabrana anti-BST1 monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, svako antitelo može biti biotinilovano korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa (Pierce, Rockford, IL). Studije kompeticije korišćenjem neobeleženih monoklonskih antitela i biotinilovanih monoklonskih antitela mogu se izvesti korišćenjem BST1 obloženih-ELISA ploča. Vezivanje biotinilovanog mAb se može detektovati sa streptavidin-alkalna fosfataza probom.

[0236] Da bi se odredio izotip prečišćenih antitela, može se izvesti izotipska ELISAs korišćenjem reagenasa specifičnih za antitela određenog izotipa.

[0237] Anti-BST1 antitela se mogu dalje testirati za reaktivnost sa BST1 antigenom sa Western blotom. Ukratko, BST1 se može pripremiti i podvrgnuti elektroforezi na natrijum dodecil sulfat poliakrilamidnom gelu. Nakon elektroforeze, razdvojeni antigeni su preneti na nitrocelulozne membrane, blokirani sa 10% fetalnim telećim serumom, i testirani sa monoklonskim antitelima za testiranje.

[0238] Vezujuća specifičnost antitela pronalaska može se takođe odrediti praćenjem vezivanja antitela sa ćelijama koje eksprimiraju BST1, na primer, protočnom citometrijom. Tipično, ćelijska linija, kao što je CHO ćelijska linija, može se transficirati sa ekspresionim vektorom koji kodira BST1. Transfektovani protein može sadržati tag, kao što je myctag, poželjno na N-terminusu, za detekciju korišćenjem antitela protiv taga. Vezivanje antitela pronalaska za BST1 može se odrediti inkubacijom transfektovanih ćelija sa antitelom, i detektovanjem vezanog antitela. Vezivanje antitela za tag na transfektovanom proteinu može se koristiti kao pozitivna kontrola.

[0239] Specifičnost antitela pronalaska za BST1 može se dalje istražiti određivanjem da li se ili ne antitelo vezuje za druge proteine, kao što su drugi član Eph porodice korišćenjem istih postupaka sa kojima je određeno vezivanje za BST1.

Imunokonjugati

[0240] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje anti-BST1 antitelo, ili njegov fragment, konjugovan sa terapeutskim delom, kao što je citotoksin, lek (npr. imunosupresiv) ili radiotoksin. Takvi konjugati su ovde označeni kao "imunokonjugati". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina označavaju se kao "imunotoksini". Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan (npr. ubija) ćelije. Primeri uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i njihove analoge ili homologe. Terapeutski agensi takođe uključuju, na primer, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuće agense (npr. mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (prethodno daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. dactinomicin (prethodno actinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i anti-mitotičke agense (npr. vinkristin i vinblastin).

[0241] Drugi poželjni primeri terapeutskih citotoksina koji se mogu konjugovati sa anttitelom pronalaska uključuju duokarmicine, kaliheamicine, majtanzine i auristatine, i njihove derivate. Primer kaliheamicin antitelo konjugata je komercijalno dostupan (Mylotarg®; American Home Products).

[0242] Citotoksini se mogu konjugovati sa antitelima pronalaska korišćenjem tehnologije linkera dostupne u tehnici. Primeri tipova linkera koji su korišćeni za konjugaciju citotoksina sa antitelom uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrazone, tioetre, estre, disulfide i linkere koji sadrže peptide. Može se izabrati linker koji je, na primer, osetljiv na isecanje na niskoj pH unutar lizozomskog kompartmana ili osetljiv na isecanje sa proteazama, kao što su proteaze preferencijalno eksprimirane u tkivu tumora kao što su katepsini (npr. katepsini B, C, D).

[0243] Primeri citotoksina su opisani, na primer, u SAD patentima br. 6,989,452, 7,087,600, i 7,129,261, i u PCT prijavama br. PCT/US2002/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US2006/37793, PCT/US2006/060050, PCT/US2006/060711, WO2006/110476, i u SAD patentnoj prijavi br. 60/891,028. Za dalje razmatranje tipova citotoksina, linkera i postupaka za konjugovane terapeutske agense sa antitelima, videti takođe Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Kancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Kancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Kancer 2:750-763; Pastan, I. i Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. i Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev.

53:247-264.

[0244] Antitela predmetnog pronalaska takođe se mogu konjugovati sa radioaktivnim izotopom da bi se stvorili citotoksični radiofarmceutici, takođe označeni kao radioimunokonjugati. Primeri radioaktivnih izotopa koji se mogu konjugovati sa antitelima za dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu uključuju, ali nisu ograničeni na, jod131, indijum111, itrijum90 i lutecijum177. Postupci za pripremu radioimunokonjugata ustanovljeni su u tehnici. Primeri radioimunokonjugata su komercijalno dostupni, uključujući Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) i Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), i slični postupci mogu se koristiti da se pripreme radioimunokonjugati korišćenjem antitela pronalaska.

[0245] Konjugati antitela pronalaska mogu se koristiti da se modifikuje dati biološki odgovor, i ne treba shvatiti deo sa lekom kao ograničavajući za klasične hemijske terapeutske agense. Na primer, deo sa lekom može biti protein ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključiti, na primer, enzimski aktivni toksin, ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-γ; ili, modifikatori biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonije granulocita makrofaga ("GM-CSF"), faktor stimulacije kolonije granulocita ("G-CSF"), ili drugi faktrori rasta.

[0246] Tehnike za konjugovanje takvih terapeutskih delova sa antitelima su dobro poznati, videti, npr. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Kancer Therapy," u Monoclonal Antibodies i Kancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," u Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Kancer Therapy: A Review," u Monoclonal Antibodies ’84: Biological i Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, i Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Kancer Therapy," u Monoclonal Antibodies For Kancer Detection i Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Bispecifični molekuli

[0247] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje bispecifične molekule pronalaska koje sadrže anti-BST1 antitelo, ili njegov fragment. Antitelo pronalaska, ili njegovi antigen-vezujući delovi, mogu se derivatizovati ili vezati sa drugim funkcionalnim molekulom, npr. drugim peptidom ili proteinom (npr. drugo anttitelo ili ligand za receptor) da bi se stvorio bispecifični molekul koji se vezuje najmanje za dva različita vezujuća mesta ili ciljna molekula. Antitelo pronalaska može u stvari biti derivatizovano ili vezano za više od jednog drugog funkcionalnog molekula da bi se stvorili multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita mesta vezivanja i/ili ciljne molekule; namera je da takvi multispecifični molekuli budu obuhvaćeni terminom "bispecifični molekul" kao što je ovde korišćeno. Da bi se stvorio bispecifični molekul pronalaska, antitelo pronalaska može se funkcionalno vezati (npr. hemijskim kuplovanjem, gentičkom fuziojom, nekovalentnom asocijacijom ili drugačije) za jedan ili više drugih vezujućih molekula, kao što je drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili vezujući mimetik, što rezultuje u bispecifičnom molekulu.

[0248] Shodno tome, predmetni pronalazak uključuje bispecifične molekule koje sadrže najmanje jednu prvu vezujuću specifičnost za prvi ciljni epitop (tj. BST1) i drugu vezujuću specifičnost za drugi ciljni epitop. Drugi ciljni epitop može biti prisutan na istom ciljnom proteinu kao što je onaj vezan sa prvom vezujućom specifičnošću; ili drugi ciljni epitop može biti prisutan na različitom ciljnom proteinu od onoga koji je vezan sa prvim proteinom od onoga vezanog sa prvom vezujućom specifičnošću. Drugi ciljni epitop može biti prisutan na istoj ćeliji kao prvi ciljni epitop (tj. BST1); ili drugi ciljni epitop može biti prisutan na ciljnoj strukturi koja nije prikazana od strane ćelije koja prikazuje prvi ciljni epitop. Kao što je korišćeno ovde, termin ’vezujuća specifičnost’ odnosi se na grupu koji sadrži najmanje jedan varijabilni domen antitela.

[0249] U jednom primeru izvođenja pronalaska, drugi ciljni epitop je Fc receptor, npr. humani FcγRI (CD64) ili humani Fcα receptor (CD89). Stoga, pronalazak uključuje bispecifične molekule sposobne da vezuju efektorske ćelije koje eksprimiraju i FcγR ili FcαR (npr. monociti, makrofage ili polimorfonuklearne ćelije (PMNs), i za ciljne ćelije koje eksprimiraju BST1. Ovi bispecifični molekuli omogućavaju ciljanje BST1 od strane efektornih ćelija i okidaju Fc receptor posredovana dejstva efektornih ćelija, kao što je fagociteza ćelija koje eksprimiraju BST1, antitelo zavisna ćelijski-posredovana citotoksičnost (ADCC), oslobađanje citokina, ili stvaranje superoksidnog anjona.

[0250] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, drugi ciljni epitop je CD3 ili CD5. Stoga, pronalazak uključuje bispecifične molekule sposobne da se vezuju za efektorne ćelije koje eksprimiraju i CD3 ili CD5 (npr. CD3 ili CD5 eksprimirajuće citotoksične T ćelije), i za ciljne ćelije koje eksprimiraju BST1. Ovi bispecifični molekuli omogućavaju ciljanje BST1 eksprimirajućih ćelija od strane efektornih ćelija i okidaju CD3 ili CD5-posredovana dejstva efektornih ćelija, kao što je T ćelijska klonalna ekspanzija i T ćelijska citotoksičnost. U ovom primeru izvođenja, bispecifično antitelo pronalaska može imati ukupno ili dva ili tri varijabilna domena antitela, gde je prvi deo bispecifičnog antitela sposoban da regrutuje aktivnost humane imune efektorne ćelije specifičnim vezivanjem sa antigenom efektora smeštenom na humanoj imunoj efektornoj ćeliji, u kojoj je efektorni antigen humani CD3 ili CD5 antigen, gde se pomenuti prvi deo sastoji od jednog varijabilnog domena antitela, i drugi deo bispecifičnog antitela je sposoban da se specifično vezuje za ciljni antigen različit od efektornog antigena npr. BST1, pri čemu je pomenuti ciljni antigen smešten na ciljnoj ćeliji različitoj od pomenute humane imune efektorne ćelije, i pri čemu drugi deo sadrži jedan ili dva varijabilna domena antitela.

[0251] U primeru izvođenja pronalaska u kojem je bispecifični molekul multispecifičan, molekul može dalje uključiti treću vezujuću specifičnost, dodatno anti-Fc vezujućoj specifičnosti ili anti-CD3 ili CD5 vezujućoj specifičnosti i anti-BST1 vezujućoj specifičnosti. U jednom primeru izvođenja, treća vezujuća specifičnost je deo sa „anti-enhancement“ faktorom (EF), npr. molekulom koji se vezuje za površinski protein uključen u citotoksično dejstvo i time povećava imuni odgovor protiv ciljne ćelije. "deo sa „anti-enhancement“ faktorom" može biti antitelo, funkcionalni fragment antitela ili ligand koji se vezuje za dati molekul, npr. antigen ili receptor, i time rezultuje u poboljšanju efekta vezujućih determinantni za Fc receptor ili ciljni antigen ćelije. "Deo sa „antienhancement“ faktorom" može vezati Fc receptor ili antigen ciljne ćelije. Alternativno, deo sa „anti-enhancement“ faktorom se može vezati za entitet koji je različit od entiteta za koji se vezuju prva i druga vezujuća specifičnost. Na primer, deo sa „anti-enhancement“ faktorom može se vezati za citotoksičnu T-ćeliju (npr. preko CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ili druge imune ćelije što rezultuje u povećanom imunom odgovoru protiv ciljne ćelije).

[0252] U jednom primeru izvođenja, bispecifični molekuli pronalaska sadrže kao vezujuću specifičnost najmanje jedno antitelo, ili fragment tog antitela, uključujući, npr. Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fd, dAb ili jednolančani Fv. Antitelo može takođe biti dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili bilo koji njegov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što je opisan u SAD patentu br.4,946,778.

[0253] U jednom primeru izvođenja, vezujuća specifičnost za Fcγ receptor je obezbeđena sa monooklonskim antitelom, čije vezivanje nije blokirano humanim imunoglobulinom G (IgG). Kao što je ovde korišćeno, termin "IgG receptor" se odnosi na bilo koji od osam gena γ-lanca lociranih na hromozomu 1. Ovi geni kodiraju ukupno dvanaest transmembranskih ili rastvorljivih izoformi receptora koji su grupisani u tri klase Fcγ receptora: FcγRI (CD64), FcγRII(CD32), i FcγRIII (CD16). U jednom poželjnom primeru izvođenja, Fcγ receptor je humani FcγRI visokog afiniteta. Humani FcγRI je 72 kDa molekul, koji pokazuje visoki afinitet za monomerni IgG (108-109 M-1).

[0254] Proizvodnja i karakterizacija određenih poželjnih anti-Fcγ monoklonskih antitela su opisani u PCT objavi WO 88/00052 i u SAD patentu br. 4,954,617. Ova antitela se vezuju za epitop FcγRI, FcγRII ili FcγRIII na mestu koje je različito od Fcγ vezujućeg mesta receptora i, stoga, njihovo vezivanje nije značajno blokirano fiziološkim nivoima IgG. Specifična anti-FcγRI antitela korisna u ovom pronalsku su mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 i mAb 197. Hibridom koji proizvodi mAb 32 je dostupan od American Type Culture Collection, ATCC pristupni br. HB9469. U drugim primerima izvođenja, anti-Fcγ receptor antitelo je humanizovani oblik monoklonskog antitela 22 (H22). Proizvodnja i karakterizacija H22 antitela je opisana u Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 i PCT objavi WO 94/10332. Ćelijska linija koja proizvodi H22 antitelo je deponovana u American Type Culture Collection pod oznakom HA022CL1 i ima pristupni br. CRL 11177.

[0255] U sledećim poželjnim primerima izvođenja, vezujuća specifičnost za Fc receptor je obezbeđena antitelom koje se vezuje za humani IgA receptor, npr. Fc-alfa receptor [FcαRI (CD89)], čije vezivanje poželjno nije blokirano humanim imunoglobulinom A (IgA). Namera je da termin "IgA receptor" uključuje genski proizvod jednog α-gena (FcαRI) lociranog na hromozomu 19. Poznato je da ovaj gen kodira nekoliko alternativno splajsovanih transmembranskih izoformi od 55 do 110 kDa. FcαRI (CD89) je konstitutivno eksprimiran na monocitima/makrofagama, eozinofilnim i neutrofilnim granulocitima, ali ne na ne-efektorskim populacijama ćelija. FcαRI ima srednji afinitet (≈ 5310<7>M<-1>) i za IgA1 i za IgA2, koji je povećan po izlaganju citokinima kao što su G-CSF ili GM-CSF [Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]. Opisana su četiri FcαRI-specifična monoklonska antitela, identifikovana kao A3, A59, A62 i A77, koja vezuju FcαRI van IgA ligand vezujućeg domena [Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol.148:1764].

[0256] FcαRI i FcγRI su poželjni receptori okidači za upotrebu u bispecifičnim molekulima pronalaska jer su (1) primarno eksprimirani na imunim efektornim ćelijama, npr. monocitima, PMNs, makrofagama i dendritskim ćelijama; (2) eksprimirani u visokim nivoima (npr. 5,000-100,000 po ćeliji); (3) medijatori citoksičnog dejstva (npr. ADCC, fagocitoza); i (4) posreduju u poboljšanom prikazivanju antigena, uključujući auto-antigene, koji su ciljani.

[0257] Antitela koja se mogu upotrebiti u bispecifičnim molekulima pronalaska su mišja, humana, himerna i humanizovana monoklonska antitela.

[0258] Bispecifični molekuli predmetnog pronalaska mogu se pripremiti konjugovanjem konstitutivnih vezujućih specifičnosti, npr. anti-FcR, anti-CD3, anti-CD5 i anti-BST1 vezujućih specifičnosti, korišćenjem postupaka poznatih u tehnici. Na primer, vezujuća specifičnost svakog bispecifičnog molekula može se stvoriti zasebno i zatim međusobno konjugovati. Kada su vezujuće specifičnosti proteini ili peptidi, raznovrsni kuplujući ili unakrsno-vezujući agensi se mogu korisiti za kovalentnu konjugaciju. Primeri unakrsno-vezujućih agenasa uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-Sacetil-tioacetat (SATA), 5,5’-ditiobis(2-nitrobezojeva kiselina) (DTNB), o-fenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) [videti npr. Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med.

160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648]. Drugi postupci uključuju one opisane u Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, i Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375. Poželjni agensi za konjugovanje su SATA i sulfo-SMCC, oba dostupna od Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)].

[0259] Dodatni bivalentni rad je obavljen za bispecifičnost konstruisanjem dvostrukog vezivanja u formate koji su slični antitelu pune dužine (Wu et al., 2007, Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297; USSN12/477,711; Michaelson et al., 2009, mAbs 1[2]:128-141; PCT/US2008/074693; Zuo et al., 2000, Protein Engineering 13[5]:361-367; USSN09/865,198; Shen et al., 2006, J Biol Chem 281[16]:10706-10714; Lu et al., 2005, J Biol Chem 280[20]:19665-19672; PCT/US2005/025472).

[0260] Kada su vezujuće specifičnosti antitela, ona mogu biti konjugovana preko sulfhidril vezivanja C-terminus zglobnih regiona dva teška lanca. U naročito poželjnom primeru izvođenja, zglobni region je modifikovan da sadrži neparan broj sulfhidril ostataka, poželjno jedan, pre konjugacije.

[0261] Alternativno, obe vezujuće specifičnosti mogu se kodirati u istom vektoru i eksprimirane su i sastavljene u istoj ćeliji domaćinu. Ovaj postupak je naročito koristan gde je bispecifični molekul mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2ili ligand x Fab fuzioni protein. Bispecifični molekul pronalaska može biti jednolančani molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i vezujuću determinantu, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve vezujuće determinante. Bispecifični molekuli mogu sadržati najmanje dva jednolančana molekula. Postupci za pripremanje bispecifičnih molekula su opisani na primer u SAD patentima broj 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; i 5,482,858.

[0262] Vezivanje bispecifičnih molekula sa njihovim specifičnim ciljevima može se potvrditi sa, na primer, imunoenzimskom analizom (ELISA), radioimunoanalizom (RIA), FACS analizom, bioanalizom (npr. inhibicijom rasta), ili Western Blot analizom. Svaka od ovih analiza generalno otkriva prisustvo protein-antitelo kompleksa od naročitog interesa upotrebom obeleženog reagensa (npr. antitela) specifičnog za kompleks od interesa. Na primer, FcR-antitelo kompleksi mogu se detektovati korišćenjem npr. antitela sa vezanim enzimom ili fragmentom antitela koje prepoznaje i specifično se vezuje za komplekse antitelo-FcR. Alternativno, kompleksi se mogu detektovati korišćenjem bilo koje od drugih imunoanaliza. Na primer, antitelo može biti radioaktivno obeleženo i korišćeno u radioimunoanalizi (RIA) (videti, na primer, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). Radioaktivni izotop se može detektovati takvim načinima kao što je upotreba γ brojača ili scintilacionog brojača ili autoradiografijom.

Fragmenti antitela i mimetici antitela

[0263] Predmetni pronalazak nije ograničen na tradicionalna antitela i može se izvoditi upotrebom fragmenata antitela. Kao što je detaljno dato u nastavku, širok opseg tehnologija fragmenata antitela i mimetika antitela je sada razvijen i i široko poznat u tehnici. Dok je određen broj ovih tehnologija, kao što su domen antitela, nanotela, i unitela koriste fragmente od, ili druge modifikacije, tradicionalnih struktura antitela, takođe postoje alterantivne tehnologije, kao što su afitela, DARPins, antikalini, avimeri, i versatela koji koriste vezujuće strukture koje, iako imitiraju vezivanje tradicionalnog antitela, stvoreni su i funkcionišu preko različitih mehanizama.

[0264] Domen antitela (dAbs) su najmanje funkcionalne vezujuće jedinice antitela, koja odgovaraju varijabilnim regionima ili teških (VH) ili lakih (VL) lanaca humanih antitela. Domen antitela imaju molekulsku težinu od približno 13 kDa. Domantis je razvio seriju velikih i visoko funkcionalnih biblioteka potpuno humanih VHi VLdAbs (više od deset milijardi različitih sekvenci u svakoj biblioteci), i koristi ove biblioteke da selektuje dAbs koje su specifične za terapeutske agense. Za razliku od mnogih konvencionalnih antitela, domen antitela su dobro eksprimirana u sistemima ćelija bakterija, kvasca, i sisara. Dodatni detalji o domen antitelima i postupci za njihovu proizvodnju mogu se dobiti na osnovu reference na SAD patente br. 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; SAD serijski br. 2004/0110941; Evropsku patentnu prijavu br. 1433846 i Evropske patentne 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 i WO03/002609.

[0265] Nanotela su terapeutski proteini izvedeni iz antitela koji sadrže jedinstvene strukturne i funkcionalne osobine teških lanaca antitela koji se javljaju u prirodi. Ova antitela teških lanaca sadrže jedan varijabilni domen (VHH) i dva konstantna domena (CH2 i CH3). Važno je da je klonirani i izolovani VHH domen savršeno stabilan polipeptid sa punim kapacitetom vezivanja antigena originalnog teškog lanca antitela. Nanotela imaju visoku homologiju sa VHdomenima humanih antitela i mogu se dodatno humanizovati bez bilo kakvog gubitka aktivnosti. Važno je da nanotela imaju nizak imunogeni potencijal, koji je potvrđen u studijama na primatima sa vodećim jedinjenjima nanotela.

[0266] Nanotela kombinuju prednosti konvencionalnih antitela sa važnim karakteristikama lekova malih molekula. Kao konvencionalna antitela, nanotela pokazuju visoku ciljnu specifičnost, visoki ciljni afinitet i nisku inherentnu toksičnost. Međutim, kao i lekovi malog molekula mogu inhibirati enzime i lako pristupiti pukotinama u receptoru.

Dodatno, nanotela su ekstremno stabilna, mogu se osim injekcije primeniti na druge načine (videti npr. WO 04/041867) i laka su za proizvodnju. Druge prednosti nanotela uključuju prepoznavanje neuobičajenih ili skrivenih epitopa kao rezultat njihove male veličine, vezivanje unutar šupljina ili aktivnih mesta ciljnih proteina sa visokim afinitetom i selektivnošću ulsed njihove jedinstvene 3-dimenzionalne, fleksibilnosti u obliku leka, prilagođavanja polu-života i lakoće i brzine otkrivanja leka.

[0267] Nanotela su kodirana pojedinačnim genima i efikasno su proizvedena u skoro svim prokariotskim i eukariotksim domaćinima npr. E. coli (videti npr. SAD 6,765,087), plesnima (na primer Aspergillus ili Trichoderma) i kvascima (na primer Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula ili Pichia) (videti npr. SAD 6,838,254). Proizvodni proces je skalabilan i proizvedene su multi-kilogramske količine nanotela. Kako nanotela prikazuju superiornu stabilnost u poređenju sa konvencionalnnim antitelima, mogu se formulisati kao rastvori spremni za upotrebu sa dugim rokom trajanja.

[0268] Nanoclone postupak (videti npr. WO 06/079372) je vlasnički postupak za stvaranje Nanotela protiv željene ciljne strukture, zasnovan na automatizovanoj visokopropusnoj selekciji B-ćelija i može se koristiti u kontekstu predmetnog opisa.

[0269] Unitela su sledeća tehnologija fragmenata antitela; međutim ona je zasnovana na uklanjanju zglobnog regiona IgG4 antitela. Delecija zglobnog regiona rezultuje u molekulu koji je suštinski polovina veličine tradicionalnih IgG4 antitela i ima univalentni vezujući region pre nego bivalentni vezujući region IgG4 antitela. Takođe je dobro poznato da su IgG4 antitela inertna i stoga ne interaguju sa imunim sistemom, što može biti prednost za tretman bolesti gde imuni odgovor nije poželjan, i ova prednost je preneta na unitela. Na primer, unitela mogu funkcionisati tako da inhibiraju ili utišaju, ali ne ubiju, ćelije za koje su vezana. Dodatno, vezivanje unitela za ćelije kancera ne stimuliše ih na proliferaciju. Dodatno, kako su unitela oko polovine veličine tradicionalnih IgG4 antitela, mogu pokazati bolju distribuciju u velikim solidnim tumorima sa potencijalnom efikasnošću koja predstavlja prednost. Unitela se izbacuju iz tela sa sličnom stopom kao cela IgG4 antitela i sposobna su da se vežu sa sličnim afinitetom za njihove antigene kao cela antitela. Dodatni detalji o unitelima mogu se dobiti referencom na patentnu objavu WO2007/059782.

[0270] Molekuli afitela predstavljaju novu klasu afinitetnih proteina zasnovanih na proteinskom domenu od 58-aminokiselinskih ostataka, izvedeni iz jednog od IgG-vezujućih domena stafilokoknog proteina A. Ovaj domen sastavljen od grupe od tri heliksa korišćen je kao skelet za konstrukciju kombinatornih biblioteka fagemida, iz koje se mogu selektovati varijante afitela koje ciljno deluju na željene molekule korišćenjem tehnologije fagnog prikaza [Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA (1997) ’Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain’ Nat Biotechnol 15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA (2002) ’Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A’ Eur J Biochem. 269:2647-55.]. Jednostavna, robusna struktura molekula afitela u kombinaciji sa njihovom malom molekulskom težinom (6 kDa), čini ih pogodnim za široku upotrebu, na primer, kao detekcionih reagensa [Ronmark J. et al. (2002) ’Construction i characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli’ J Immunol Methods 261:199-211] i da inhibiraju interakcije receptora [Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA (2003) ’Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering’ Protein Eng 16:691-7]. Dodatni detalji o afitelima i postupcima njihove proizvodnje mogu se dobiti referencom na SAD patent br.5831012.

[0271] Obeležena afitela mogu takođe biti korisna za vizuelizaciju za određivanje abundantnosti izoformi.

[0272] DARPins (dizajnirani proteini sa ankirin ponovcima) su jedna primer mimetika antitela DRP (dizjaniranih proteina sa ponovcima) tehnologije koja je razvijena da bi se iskoristile vezujuće sposobnosti ne-antitelo polipeptida. Proteini sa ponovcima kao što su proteini sa ponovcima bogati ankirinom ili leucinom, su sveprisutni vezujući molekuli, koji se javljaju, za razliku od antitela, intra i ekstracelularno. Njihova jedinstvena modularna arhitektura karakteriše se ponovljenim strukturnim jedinicama (ponovcima), koji se ređaju zajedno da bi formirali izdužene ponovljene domene koij prikazuju varijabilne i modularne površine koje vezuju antigene. Na osnovu ove modularnosti, mogu se stvoriti kombinatorne biblioteke polipeptida sa visoko raznovrsnim vezujućim specifičnostima. Ova strategija uključuje konsenzus dizajn auto-kompatibilnih ponovaka koji prikazuju varijabilne površinske ostatke i njihovo sastavljanje po principu slučajnosti u ponovljene domene.

[0273] DARPins se mogu proizvoditi u bakterijskim ekspresionim sistemima sa veoma visokim prinosom i pripadaju najstabilnijim poznatim proteinima. Izabrani su visoko specifični, DARPins sa visokim afinitetom za širok opseg ciljnih proteina, uključujući humane receptore, citokine, kinaze, humane proteaze, viruse i membranske proteine. Mogu se dobiti DARPins koji imaju afinitete u jednocifrenom nanomolarnom do pikomolarnom opsegu.

[0274] DARPins imaju široku upotrebu, uključujući ELISA, sendvič ELISA, protočno citometrijsku analizu (FACS), imunohistohemiju (IHC), čip primene, prečišćavanju prema afinitetu ili Western bloting. Takođe se pokazalo da su DARPins visoko aktivni u intracelularnom kompartmanu, na primer, kao intracelularni marker proteini fuzionisani sa zelenim fluorescentnim proteinom (GFP). DARPins su dalje korišćeni da inhibiraju ulazak virusa sa IC50u pM opsegu. DARPins nisu idealni samo za blokiranje protein-protein interakcija, već i da inhibiraju enzime. Proteaze, kinaze i transporteri su uspešno inhibirani, najčešće sa alosteričkim modom inhibicije. Veoma brzo i specifično obogaćivanje na tumorima i veoma povoljni odnosi tumora prema krvi čine DARPins pogodnim za in vivo dijagnostiku ili terapeutske pristupe.

[0275] Dodatne informacije u pogledu DARPins i drugih DRP tehnologija mogu se naći u SAD patentnoj objavi br. 2004/0132028, i Internacionalnoj patentnoj prijavi br. WO 02/20565.

[0276] Antikalini su dodatna tehnologija mimetika antitela. Međutim, u ovom slučaju vezujuća specifičnost je izvedena iz lipokalina, porodice proteina sa niskom molekulskom masom koji su prirodno i bogato eksprimirani u humanim tkivima i telesnim tečnostima. Lipokalini su evoluirali za izvođenje opsega funkcija in vivo povezanih sa fiziološkim transportom i skladištenjem hemijski osetljivih ili nerastvorljivih jedinjenja. Lipokalini imaju robusnu unutrašnju strukturu koja sadrži visoko konzervativno β-barel koje je potpora za četiri petlje na jednom terminusu proteina. Ove petlje formiraju ulazno mesto za vezujući džep i konformacione razlike u ovom delu molekula odgovorne su za varijacije u specifičnosti vezivanja između pojedinačnih lipokalina.

[0277] Iako celokupna struktura hipervarijabilnih petlji podržana sa konzervativnom okvirnom β-pločom podseća na imunoglobuline, lipokalini se značajno razlikuju od antitela po veličini, jer su sastavljeni od jednog polipeptidnog lanca od 160-180 aminokiselina koji je marginalno veći od jednog domena imunoglobulina.

[0278] Lipokalini su klonirani i njihove petlje su potvrgnute inženjeringu da bi se stvorili antikalini. Stvorene su biblioteke strukturno različitih antikalina i prikaz antikalina omogućava selekciju i skrining vezujuće funkcije, praćene ekspresijom i proizvodnjom rastvorljivog proteina za dodatne analize u prokariotskim i eukariotskim sistemima. Studije su uspešno pokazale da se mogu razviti antikalini koji su specifični za praktično sve humane ciljne proteine, mogu se izolovati i dobiti vezujući afiniteti u nanomolarnom ili većem opsegu.

[0279] Antikalini se takođe mogu formatirati kao dualni ciljani proteini, takozvani duokalini. Duokalin vezuju dve zasebne terapeutske ciljne strukture u jednom lako proizvedenom monomernom proteinu korišćenjem standardnih procesa proizvodnje uz zadržavanje ciljne specifičnosti i afiniteta nezavisno od strukturne orijentacije njegova dva vezujuća domena.

[0280] Modulacija više ciljnih struktura preko jednog molekula je naročita prednost kod bolesti za koje se zna da uključuju više od jednog uzročnog faktora. Dodatno, bi- ili multivalentni vezujući formati kao što su Duokalini imaju značajan potencijal u ciljanju molekula na ćelijskoj površini kod bolesti, posredovanju u agonističkim efektima na puteve prenosa signala ili indukciji poboljšanih efekata internalizacije preko vezivanja i klasterovanja na receptorima na površini ćelije. Dodatno, visoka unutrašnja stabilnost duokalina je uporediva sa monomernim antikalinima, pružajući fleksibilnu formulaciju i potencijal za dopremanje duokalina.

[0281] Dodatne informacije u pogledu antikalina mogu se naći u SAD patentu br. 7,250,297 i Internacionalnoj patetntnoj objavi br. WO 99/16873.

[0282] Sledeća tehnologija mimetika antitela korisna u kontekstu predmetnog opisa su avimeri. Avimeri su evoluirali iz velike porodice domena humanog ekstracelularnog receptora sa in vitro egzonskim mešanjem i fagnim prikazom, stvaranjem multidomenskih proteina sa osobinama vezivanja i inhibicije. Pokazano je da vezivanje više nezavisnih vezujućih domena stvara aviditet i rezultuje u poboljšanom afinitetu i specifičnosti u poređenju sa konvencionalnim vezujućim proteinima sa jednim epitopom. Druge potencijalne prednosti uključuju jednostavnu i efikasnu proizvodnju multitarget-specifičnih molekula u Escherichia coli, poboljšanoj tremostabilnosti i rezistenciji na proteaze. Avimeri sa sub-nanomolarnim afinitetima su dobijeni protiv raznovrsnih ciljnih struktura.

[0283] Dodatne informacije koje se tiču avimera mogu se naći u SAD patentnoj prijavi objavi br. 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756.

[0284] Versatela su sledeća tehnologija mimetika antitela koja se može koristiti u kontekstu predmetnog opisa. Versatela su mali proteini od 3-5 kDa sa >15% cisteina, koja formiraju skelet sa visokom disulfidnim gustinom, zamenjujući hidrofobno jezgro koje imaju tipični proteini. Zamena velikog broja hidrofobnih aminokiselina, koje sadrži hidrofobno jezgro, sa malim brojem disulfida rezultuje u proteinu koji je manji, hidrofilniji (manja agregacija i nespecifično vezivanje), rezistentnijem na proteaze i toplotu, i ima nižu gustinu T-ćelijskih epitopa, jer ostaci koji najviše doprinose MHC prikazivanju su hidrofobni. Dobro je poznato da sve četiri od ovih osobina utiču na imunogenost, i očekivano je da zajedno izazovu veliko smanjenje imunogenosti.

[0285] Inspiracija za versatela dolazi od prirodnih injektabilnih biofarmaceutika proizvedenih od strane pijavica, zmija, pauka, škorpija, puževa, i sasa, za koje se zna da pokazuju neočekivano nisku imunogenost. Počinjući od izabranih porodica prirodnih proteina, dizajniranjem i skriningom, veličina, hidrofobnost, proteolitička obrada antigena i gustina epitopa su minimizovani do nivoa koji je daleko ispod prosečnog za prirodne injektabilne proteine.

[0286] Uzimajući u obzir strukturu versatela, ovi mimetici antitela nude svestrani format koji uključuje multivalentnost, multi-specifičnost, raznovrstnost mehanizama polu-života, module za ciljanje tkiva i odsustvo Fc region antitela. Dodatno, versatela se proizvode u E. coli u visokom prinosu, i zbog njihove hidrofobnosti i male veličine, versatela su visoko rastvorljiva i mogu se formulisani u visokim koncentracijama. versatela su izuzetno stabilna u odnosu na toplotu (mogu ključati) i daju produženi rok trajanja.

[0287] Dodatne informacije koje se tiču versatela mogu se naći u SAD patentnoj prijavi objavi br.2007/0191272.

[0288] Nije namera da prethodno obezbeđen detaljan opis tehnologija fragmenta antitela i mimetika antitela bude obiman spisak svih tehnologija koje se mogu koristiti u kontekstu predmetne specifikacije. Na primer, i takođe bez ograničavanja, različite dodatne tehnologije uključujući alternativne tehnologije zasnovane na polipeptidima, kao što su fuzije regiona koji određuju komplementarnost kao što je data u Qui et al. (2007) Nature Biotechnology 25(8):921-929, kao i tehnologije zasnovane na nukleinskim kiselinama, kao što su RNK aptamer tehnologije opisane u SAD patentima br. 5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774, i 6,387,620 mogu se koristiti u kontekstu predmetnog opisa.

Farmaceutske kompozicije

[0289] U sledećem aspektu, predmetni opis obezbeđuje kompoziciju, npr. farmceutsku kompoziciju, koja sadrži jedno ili kombinaciju monoklonskih antitela, ili njihovog antigen-vezujućeg dela (delova), predmetnog pronalaska, formulisanu zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu uključiti jedan ili kombinaciju (npr. dva ili više različitih) antitela, ili imunokonjugata ili bispecifičnih molekula pronalaska. Na primer, farmaceutska kompozicija opisa može sadržati kombinaciju antitela (ili imunokonjugata ili bispecifičnih) koja se vezuje za različite epitope na ciljnom antigenu ili koja ima komplementarna dejstva.

[0290] Farmaceutske kompozicije prema opisu takođe se mogu primeniti u kombinovanoj terapiji, tj. kombinovanoj sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može uključivati antitelo predmetnog pronalaska kombinovano sa najmanje jednim drugim anti-tumorskim agensom, ili anti-inflamatornim ili imunosupresivnim agensom. Primeri terapeutskih agenasa koji se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji su opisani detaljnije u nastavku u odeljku o upotrebama antitela pronalaska.

[0291] Kao što je ovde korišćeno, "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i agense koji odlažu apsorpciju, i slično što je fiziološki kompatibilno. Poželjno, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, potkožnu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. injekcijom ili infuzijom). Zavisno od puta primene, aktivno jedinjenje, tj. antitelo, imunokonjugat, ili bispecifični molekul, može biti obložen materijalom da bi se zaštitilo jedinjenje od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati jedinjenje.

[0292] Farmaceutska jedinjenja prema opisu mogu uključivati jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na so koja zadržava željenu biološku aktivnost roditeljskog jedinjenja i ne daje bilo kakve neželjene toksikološke efekte [videti, npr. Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19]. Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što je hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforna i slično, kao i od netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenilsupstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfokiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one izvedene iz zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i od netoksičnih organskih amina, kao što su N,N’-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.

[0293] Farmaceutska kompozicija prema opisu takođe može uključivati farmaceutski prihvatljivi anti-oksidant. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanata uključuju: (1) antioksidante rastvorljive u vodi, kao što je askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidanti rastvorljivi u ulju, kao što je askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfatokoferol, i slično; i (3) metal helatirajući agensi, kao što je limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.

[0294] Primeri pogodnih vodenih i ne-vodenih nosača koji se mogu upotrebiti u farmaceutskim kompozicijama prema opisu uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glilkol, i slično), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat.

Ispravna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzija, i korišćenjem površinski aktivnih sredstava.

[0295] Ove kompozicije takođe mogu sadržati ađuvante kao što su konzervansi, agensi za vlaženje, emulzifikatori i agensi za disperziju. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se osigurati i procedurama sterilizacije, navedenim prethodno, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline, i slično. Takođe može biti poželjno u kompozicije uključiti izotonične agense, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično. Dodatno, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može se postići uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju kao što je aluminijum monostearat i želatin.

[0296] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporalnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u tehnici. Osim ukoliko bilo koji konvencionalni medijum ili agens je nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, predviđena je njihova upotreba u farmaceutskim kompozicijama prema opisu. Suplementarna aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporisati u kompozicije.

[0297] Terapeutske kompozicije moraju biti sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Ispravna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih sredstava. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključivanje u kompoziciju izotoničnih agenasa, na primer, šećera, polialkohola kao što je manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koja odlaže apsorpciju, na primer, monostearat soli i želatin.

[0298] Sterilni injektabilni rastvori se mogu pripremiti inkorporacijom aktivnog jedinjenja u zahtevanoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka prethodno navedenih, kao što je zahtevano, praćeno sterilizacionom mikrofiltracijom. Generalno, disperzije su pripremljene inkorporacijom aktivnog jedinjenja u sterilnom vehikulumu koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druge neophodne sastojke od onih prethodno nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koja daje prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0299] Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača da bi se proizveo jedan dozni oblik zavisiće od subjekta koji se tretira, i naročitog načina primene. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa materijalom nosača da bi se proizveo jedan dozni oblik generalno će biti ona količina kompozicije koja proizvodi terapeutski efekat. Generalno, od 100 procenata, ova količina će biti u opsegu od oko 0.01 procenat do oko 99 procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenta do oko 70 procenata, najpoželjnije od oko 1 procenat do oko 30 procenata aktivnog jedinjenja u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0300] Dozni režimi su podešeni da bi se obezbedio optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je indikovano terapeutskom situacijom. Naročita je prednost formulisati parenteralne kompozicije u obliku dozne jedinice za laku primenu i uniformnost doze. Oblik dozne jedinice kao što je ovde korišćeno odnosi se na fizički zasebne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za subjekte koji treba da se tretiraju; svaka jedinica sadrži predodređenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatog da proizvede željeni teraputski efekat zajedno sa neophodnim farmaceutskim nosačem. Speciifkacija za oblike jedinice doze prema opisu diktirana je i direktno zavisna od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i naročitog terapeutskog efekta koji treba postići, i (b) ograničavanja inherentna u tehnici stvaranja jedinjenja kao što je aktivno jedinjenje za tretman osetljivosti kod pojedinaca.

[0301] Za primenu antitela, doza je u opsegu od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i češće 0.01 do 5 mg/kg, težine tela domaćina. Na primer doze mogu biti 0.3 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili unutar opsega od 1-10 mg/kg. Primer režima tretmana podrazumeva primenu jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka 3 meseca ili jednom svaka tri do 6 meseci. Poželjni dozni režimi za anti-BST1 antitelo pronalaska uključuju 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine preko intravenske primene, sa davanjem antitela korišćenjem jednog od sledećeih doznih rasporeda: (i) svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; (ii) svaka tri meseca; (iii) 3 mg/kg telesne težine jednom praćeno sa 1 mg/kg telesne težine svake tri nedelje.

[0302] U nekim postupcima, dva ili više monoklonska antitela sa različitim vezujućim specifičnostima primenjeno je simultano, u kom slučaju doza svakog primenjenog antitela je unutar naznačenog opsega. Antitelo je obično primenjeno više puta. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti, na primer, nedeljno, mesečno, svaka tri meseca ili godišnje. Intervali takođe mogu biti nepravilni kao što je naznačeno merenjem nivoa antitela na ciljni antigen u krvi pacijenta. U nekim postupcima, doza je podešena da bi se postigla koncentracija antitela u plazmi od oko 1-1000 µg/ml i u nekim postupcima oko 25-300 µg/ml.

[0303] Alternativno, antitelo se može primeniti kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je neophodna manje učestana primena. Doza i učestanost variraju u zavisnosti od polu-života antitela kod pacijenta. Generalno, humana antitela pokazuju najduži polu-život, praćena humanizovanim antitelima, himernim antitelima, i ne-humanim antitelima. Doza i učestalost primene može varirati u zavisnosti da li je tretman profilaktički ili terapeutski. U profilaktičkim primenama, relativno niska doza je primenjena u relativno manje čestim intervalima tokom dugog vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju tretman do kraja svog života. U terapeutskim primenama, realtivno visoka doza u relativno kratkim intervalima je nekada neophodna dok se ne smanji progresija bolesti ili ne zaustavi, i poželjno dok pacijent pokazuje delimično ili potpuno olakšavanje simptoma bolesti. Nakon toga, na pacijenta se može primeniti prolfilaktički režim.

[0304] Stvarni nivoi doze aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog opisa mogu se varirati da bi se dobila količina aktivnog sastojka koja je efikasna da se postigne željeni terapeutski odgovor za određenog pacijenta, kompoziciju, i način primene, bez da je toksičan za pacijenta. Izabrani dozni nivo će zavisiti od raznovrsnih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenih upotrebljenih kompozicija predmetnog pronalaska, ili njenog estra, soli ili amida, puta primene, vremena primene, stope ekskrecije određenog upotrebljenog jedinjenja, trajanja tretmana, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala korišćenih u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne istorije bolesti pacijenta koji se tretira, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskoj tehnici.

[0305] "Terapeutski efikasna doza "anti-BST1 antitela pronalaska poželjno rezultuje u smanjenju težine simptoma bolesti, povećanju učestalosti i trajanju perioda bez simptoma bolesti, ili sprečavanju pogoršanja ili onesposobljavanja usled dejstva bolesti. Na primer, za tretman BST1 posredovanih tumora, "terapeutski efikasna doza" poželjno inhibira rast ćelija ili rast tumora za najmanje oko 20%, poželjnije najmanje oko 40%, još poželjnije najmanje oko 60%, i još poželjnije najmanje oko 80% u odnosu na netretirane subjekte. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može se proceniti u životinjskom model sistemu prediktivnom za efikasnost kod humanih tumora. Alternativno, ova osobina kompozicije može se proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija, takva inhibicija može se meriti in vitro analizama poznatim stručnjacima. Terapeutski efikasna količina terapeutskog jedinjenja može smanjiti veličinu tumora, ili na drugi način olakšati simptome bolesti kod subjekta. Prosečan stručnjak će biti u stanju da odredi takve količine na osnovu takvih faktora kao što su veličina subjekta, težina simptoma subjekta, i određene kompozicije ili izabranog načina primene.

[0306] Kompozicija predmetnog pronalaska može se primeniti preko jednog ili više puteva primene korišćenjem jednog ili više od raznovrsnih postupaka poznatih u tehnici. Kao što će biti jasno stručnjaku, put i/ili način primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni putevi primene za antitela pronalaska uključuju intravensku, intramuskularnu, intradermalnu, intraperitonealnu, subkutanu, spinalnu ili druge parenteralne puteve primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralna primena" kao što je ovde korišćeno označava načine primene različite od enteralne i topikalne primene, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, potkožnu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidalnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0307] Alternativno, antitelo pronalaska može se primeniti preko ne-parenteralnog puta, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozalni put primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.

[0308] Aktivna jedinjenja se mogu pripremiti sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere, i mikroinkapsulirane sisteme dopremanja. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polilaktid. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentnirani ili opšte poznati stručnjacima [videti, npr. Sustained i Controlled Release Dr ug Delivery Systems (1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y].

[0309] Terapeutske kompozicije se mogu primeniti sa medicinskim uređajima poznatim u tehnici. Na primer, u poželjnom primeru izvođenja, terapeutska kompozicija pronalaska može se primeniti sa uređajem za hipodermalno injektiranje bez igle, kao što su uređaji opisani u SAD patent br. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implanata i modula korisnih u predmetnom pronalasku uključuju: SAD patent br. 4,487,603, koji opisuje implantabilnu mikro-infuzionu pumpu za oslobađanje medikamenta sa kontrolisanom stopom; SAD patent br. 4,486,194, koji opisuje terapeutski uređaj za primenu medikamenata preko kože; SAD patent br. 4,447,233, koji opisuje infuzionu pumpu za medikamente za dopremanje medikamenata sa preciznom infuzionom stopom; SAD patent br.4,447,224, koji opisuje implantabilni infuzioni aparat sa varijabilnim protokom za kontinuirano dopremanje leka; SAD patent br.4,439,196, koji opisuje osmotski sistem za dopremanje leka koji ima kompartmane sa višestrukim komorama; i SAD patent br. 4,475,196, koji opisuje osmotski sistem za dopremanje leka. Mnogi drugi takvi implanti, sistemi dopremanja, i moduli su poznati stručnjacima.

[0310] U određenim primerima izvođenja, monoklonska antitela pronalaska mogu se formulisati da bi se osigurala ispravna distribucija in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Da bi se osiguralo da terapeutska jedinjenja pronalaska prolaze kroz BBB (ukoliko je poželjno), ona mogu biti formulisana, na primer, u lipozomima. Za postupke proizvodnje lipozoma, videti, npr. US Patents 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu sadržati jedan ili više delova koji su selektivno transportovani u specifične ćelije ili organe, čime se poboljšava ciljno dopremanje leka [videti, npr. V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol.29:685]. Primeri ciljajućih grupa uključuju folat ili biotin (videti, npr. US Patent 5,416,016.); manozide [Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]; antitela [P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]; surfaktant protein A receptor [Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134]; p120 [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090]; videti takođe K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. Uses and Methods.

[0311] Antitela, kompozicije antitela i postupci predmetnog pronalaska imaju brojne in vitro i in vivo dijagnostičke i terapeutske upotrebe uključujući dijagnozu i tretman BST1 posredovanih poremećaja.

[0312] U nekim primerima izvođenja, ovi molekuli se mogu primeniti na ćelije u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili na humane subjekte, npr. in vivo, za tretman, prevenciju i za dijagnozu raznovrsnih bolesti. Kao što je ovde korišćeno, namera je da termin "subjekat" uključuje humane i ne-humane životinje. Ne-humane životinje uključuju sve kičmenjake, npr. sisare i ne-sisare, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, krave, konji, kokoške, vodozemci i gmizavci. Poželjni subjekti uključuju humane pacijente koji imaju poremećaje posredovane sa BST1 aktivnošću. Postupci su naročito pogodni za tretiranje humanih pacijenata koji imaju poremećaj povezan sa aberantnom BST1 ekspresijom. Kada su antitela na BST1 primenjena zajedno sa drugim agensom, oba mogu biti primenjena bilo kojim redom ili istovremeno.

[0313] Uzimajući u obzir specifično vezivanje antitela pronalaska za BST1, antitela pronalaska se mogu koristiti da se specifično detektuje BST1 ekspresija na površini ćelija, i dodatno, mogu se koristiti da se prečisti BST1 preko imunoafinitetnog prečišćavanja.

[0314] Dodatno, uzimajući u obzir ekspresiju BST1 na ćelijama tumora, antitela, kompozicije antitela i postupci predmetnog pronalaska mogu se koristiti za tretiranje subjekta sa tumorigenim poremećajem, npr. poremećajem karakterisanim sa prisusutvom tumorskih ćelija koje eksprimiraju BST1 uključujući, na primer akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), B-ćelijsku hroničnu limfocitnu leukemiju, kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer bubrega, kancer glave i vrata, kancer pluća, kancer jajnika i kancer pankreasa. Pokazano je da se BST1 interanalizuje po vezivanju sa antitelom kao što je ilustrovano u Primeru 5 u nastavku, čime je omogućeno da se antitela pronalaska koriste u bilo kom mehanizmu dejstva npr. ADC pristup, radioimunokonjugat, ili ADEPT pristup.

[0315] U jednom primeru, antitela (npr. monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i kompozicije) opisa mogu se koristiti da se detektuju nivoi BST1, ili nivoi ćelija koje sadrže BST1 na površini njihove membrane, pri čemu ti nivoi onda mogu biti povezani sa određenim simptomima bolesti. Alternativno, antitela se mogu koristiti da inhibiraju ili blokiraju funkciju BST1 koja, zauzvrat, može biti povezan sa prevencijom ili olakšavanjem određenih simptoma bolesti, čime se implicira BST1 kao medijator bolesti. Ovo se može postići kontaktom uzorka i kontrolnog uzorka sa anti-BST1 antitelom pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela i BST1. Bilo koji kompleksi formirani između antitela i BST1 su detektovani i upoređeni u uzorku i kontroli.

[0316] U sledećem primeru, antitela (npr. monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i kompozicije) prema opisu mogu se inicijalno testirati za vezujuću aktivnost povezanu sa terapeutskom ili dijagnostičkom upotrebom in vitro. Na primer, kompozicije prema opisu mogu se testirati korišćenjem protočno citometrijskih analiza opisanim u Primerima u nastavku.

[0317] Antitela (npr. monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli, imunokonjugati i kompozicije) pronalaska imaju dodatnu upotrebu u terapiji BST1 povezanih bolesti. Na primer, monoklonska antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli i imunokonjugati mogu se koristiti za izazivanje in vivo ili in vitro jedne ili više sledećih bioloških aktivnosti: da inhibiraju rast i/ili ubijaju ćelije koje eksprimiraju BST1; da posreduju u fagocitozi ili ADCC ćelije koja eksprimira BST1 u prisustvu humanih efektorskih ćelija, ili da blokiraju vezivanje BST1 liganda za BST1.

[0318] U naročitom primeru izvođenja, antitela (npr. monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i kompozicije) su korišćeni in vivo za tretiranje, prevenciju ili dijagnozu različitih BST1-povezanih bolesti. Primeri BST1-povezanih bolesti uključuju, između ostalog, humana kancer tkiva koja predstavljaju akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), B-ćelijsku hroničnu limfocitnu leukemiju, kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer bubrega, kancer glave i vrata, kancer pluća, kancer jajnika i kancer pankreasa.

[0319] Pogodni putevi za primenu kompozicija antitela (npr. monoklonskih antitela, multispecifičnih i bispecifičnih molekula i imunokonjugata) pronalaska in vivo i in vitro su dobro pozanti u tehnici i mogu se izabrati od strane stručnjaka. Na primer, kompozicije antitela se mogu primeniti injekcijom (npr. intravenskom ili potkožnom). Pogodne doze korišćenih molekula će zavisiti od starosti i težine subjekta i koncentracije i/ili formulacije kompozicije antitela.

[0320] Kao što je prethodno opisano, anti-BST1 antitela pronalaska mogu biti ko-primenjena sa jednim ili više drugih terapeutskih agenasa, npr. citotksičnim agensom, radiotoksičnim agensom ili imunosupresivnim agensom. Antitelo može biti povezano sa agensom (kao imunokompleks) ili može biti primenjeno zasebno od agensa. U poslednje pomenutom slučaju (zasebna primena), antitelo može biti primenjeno pre, nakon ili zajedno sa agensom ili može biti ko-primenjeno sa drugim poznatim terapijama, npr. anti-kancer terapijom, npr. radijacijom. Takvi terapeutski agensi uključuju, između ostalog, anti-neoplastične agense kao što su doksorubicin (adriamicin), cisplatin bleomicin sulfat, karmustin, hlorambucil, i ciklofosfamid hidroksiurea koji, sami po sebi, su efikasni samo u nivoima koji su toksični ili subtoksičnmi za pacijenta. Cisplatin je intravenski primenjen kao 100 mg/kg doza jednom svake četiri nedelje i adriamicin je intravenski primenjen kao 60-75 mg/ml doza jednom svaki 21 dan. Drugi agensi pogodni za ko-primenu sa antitelima pronalaska uključuju druge agense korišćene za tretman kancera, npr. akutne mijeloidne leukemije (AML), B-ćelijske hronične limfocitne leukemije, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera glave i vrata, kancera pluća, kancera jajnika ili kancera pankreasa, kao što su Avastin®, 5FU i gemcitabin. Ko-primena anti-BST1 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, predmetnog pronalaska sa hemoterapeutskim agensima obezbeđuje dva anti-kancer agensa koji deluju preko različitih mehanizama koji daju citotoksični efekat na ćelije humanog tumora. Takva ko-primena može rešiti probleme usled razvoja rezistencije na lekove ili promene u antigenosti tumorskih ćelija koje bi ih načinile nereaktivnim sa antitelom.

[0321] Ciljno specifične efektorne ćelije, npr. efektorne ćelije povezane sa kompozicijama (npr. monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) pronalaska mogu se takođe koristiti kao terapeutski agensi. Efektorne ćelije za ciljanje mogu biti humani leukociti kao što su makrofagi, neutrofili ili monociti. Druge ćelije uključuju eozinofile, ćelije prirodne ubice i druge ćelije koje nose IgG- ili IgA-receptor. Ukoliko je poželjno, efektorne ćelije se mogu dobiti iz subjekta koga treba tretirati. Ciljno-specifične efektorne ćelije mogu se primeniti kao suspenzija ćelija u fiziološki prihvatljivom rastvoru. Broj primenjenih ćelija može biti reda veličine 10<8>-10<9>, ali će varirati u zavisnosti od terapeutske namene. Generalno, količina će biti dovoljna da se dobije lokalizacija na ciljnoj ćeliji, npr. tumorskoj ćeliji koja eksprimira BST1, i da utiče na ubijanje ćelija, npr. fagocitozom. Putevi primene takođe mogu varirati.

[0322] Terapija sa ciljno-specifičnim efektornim ćelijma može se izvesti u vezi sa drugim tehnikama za uklanjanje ciljanih ćelija. Na primer, anti-tumor terapija korišćenjem kompozicija (npr. monoklonskih antitela, multispecifičnih i bispecifičnih molekula) pronalaska i/ili efektornih ćelija naoružanih sa ovim kompozicijama mogu se koristiti zajedno sa hemoterapijom. Dodatno, može se koristiti kombinovana imunoterapija da usmeri dve različite citotksične efektorske populacije prema odbacivanju tumorskih ćelija. Na primer, anti-BST1 antitela vezna za anti-Fc-gama RI ili anti-CD3 mogu se koristiti zajedno sa IgG- ili IgA-receptor specifičnim vezujućim agensima.

[0323] Bispecifični i multispecifični molekuli pronalaska mogu se takođe koristiti za modulaciju nivoa FcγR ili FcγR na efektornim ćelijama, kao što je prekrivanjem i eliminacijom receptora na ćelijskoj površini. Smeše anti-Fc receptora se takođe mogu koristiti u ove svhe.

[0324] Kompozicije (npr. monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) pronalaska koji imaju vezujuća mesta komplementa, kao što su delovi iz IgG1, -2, ili -3 ili IgM koji vezuju komplement, takođe se mogu korisiti u prisustvu komplementa. U jednom primeru izvođenja, ex vivo tretman populacije ćelija koja sadrži ciljne ćelije sa vezujućim agensom pronalaska i odgovarajuće efektorne ćelije može se dopuniti dodavanjem komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ciljnih ćelija obloženih sa vezujućim agensom pronalaska može se poboljšati vezivanjem proteina komplementa. U sledećem primeru izvođenja ciljne ćelije obložene sa kompozicijama (npr. monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) pronalaska mogu se takođe lizirati komplementom. U sledećem primeru izvođenja, kompozicije pronalaska ne aktiviraju komplement.

[0325] Kompozicije (npr. monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokojnugati) pronalaska se mogu takođe primeniti zajedno sa komplementom. U određenim primerima izvođenja, predmetni opis obezbeđuje kompozicije koje sadrže antitela, multispecifične ili bispecifične molekule i serum ili komplement. Ove kompozicije mogu predstavljati prednost kada je komplement lociran blizu antitela, multispecifičnih ili bispecifičnih molekula. Alternativno, antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli pronalaska i komplement ili serum mogu se primeniti zasebno.

[0326] Takođe su unutar obima predmetnog pronalaska kompleti koji sadrže kompozicije antitela pronalaska (npr. monoklonska antitela, bispecifične ili multispecifične molekule pronalaska, ili imunokonjugate) i uputstva za upotrebu. Komplet može dalje sadržati jedan ili više dodatnih reagenasa, kao što je imunosupresivni reagens, citotksični agens ili radiotoksični agens, ili jedno ili više dodatnih antitela pronalaska (npr. antitelo koje ima komplementarnu aktivnost koje se vezuje za epitop u BST1 antigenu različit od prvog antitela).

[0327] Shodno tome, pacijentima tretiranim sa kompozicijama antitela pronalaska mogu se dodatno primeniti (pre, zajedno sa, ili nakon primene antitela pronalaska) drugi terapeutski agens, kao što je citotoksični ili radiotoksični agens, koji poboljšava ili dopunjuje terapeutski efekat antitela.

[0328] U drugim primerima izvođenja, subjekat se može dodatno tretirati sa agensom koji modulira, npr. poboljšava ili inhibira, ekspresiju ili aktivnost Fcγ ili Fcγ receptora preko, na primer, tretiranja subjekta sa citokinom. Poželjni citokini za primenu tokom tretmana sa multispecifičnim molekulom uključuju faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), faktor stimulacije koolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ), i faktor nekroze tumora (TNF).

[0329] Kompozicije (npr. antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) prema opisu takođe se mogu koristiti za ciljanje ćelija koje eksprimiraju FcγR ili BST1, na primer, za obeležavanje takvih ćelija. Za takvu upotrebu, vezujući agens se može povezati za molekul koji se može detektovati. Stoga, opis obezbeđuje postupke za lokalizaciju ex vivo ili in vitro ćelija koje eksprimiraju Fc receptore, kao što su FcγR, ili BST1. Detektabilni obeleživač može biti, npr. radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim, ili ko-faktor enzima.

[0330] U naročitom primeru, opis obezbeđuje postupke za detektovanje prisutstva BST1 antigena u uzorku, ili merenje kličine BST1 antigena, koji sadrži dovođenje u kontakt uzorka, i kontrolnog uzorka, sa monoklonskim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim delom, koji se specifično vezuju za BST1, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog dela i BST1. Formiranje kompleksa je zatim detektovano, gde je razlika u formiranju kompleksa između uzorka u poređenju sa kontrolnim uzorkom indikativna za prisustvo BST1 antigena u uzorku.

[0331] U drugim primerima, opis obezbeđuje postupke za tretiranje BST1 posedovanog poremećaja kod subjekta, npr. humanih kancera i humane inflamatorne bolesti, uključujući bolest pronalaska.

[0332] U sledećem primeru, imunokonjugati pronalaska se mogu koristiti za ciljanje jedinjenja (npr. terapeutskih agenasa, obeleživača, citokina, radiotoksina, imunosupresiva, itd.) prema ćelijama koje imaju BST1 receptore na ćelijskoj površini vezivanjem takvih jedinjenja sa antitelom. Na primer, anti-BST1 antitelo se može konjugovati za bilo koje od jedinjenja toksina opisanih u SAD patentu br. 6,281,354 i 6,548,530, SAD patentnoj objavi br.

2003/0050331, 2003/0064984, 2003/0073852, i 2004/0087497, ili objavljeno u WO 03/022806. Stoga, opis takođe obezbeđuje postupke za lokalizaciju ex vivo ili in vivo ćelija koej eksprimiraju BST1 (npr. sa detektabilnim obeleživačem, kao što je radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim, ili ko-faktor enzima). Alternativno, imunokonjugati se mogu koristiti za ubijanje ćelija koje imaju BST1 receptore na ćelijskoj površini ciljanjem citotksina ili radiotoksina prema BST1.

[0333] Sve reference citirane u ovoj specifikaciji, uključujući bez ograničenja sve radove, objave, patente, patentne prijave, prezentacije, tekstove, izveštaje, rukopise, brošure, knjige, postove na internetu, radove u časopisima, periodike, podatke o proizvodu, i slično. Namera je da razmatranje referenci ovde samo rezimira tvrdnje njihovih autora i ne priznaje se da bilo koja referenca čini prethodnu tehniku i prijavioci zadržavaju pravo da ospore tačnost i relevantnost citiranih referenci.

[0334] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima koje ne treba shvatiti kao dodatno ograničavajuće.

Primer 1: Konstruisanje biblioteke fagnog prikaza

[0335] Rekombinantni protein sastavljen od aminokiselina 29-292 iz BST1 (SEQ ID NO:44) je eukariotski sintetisan standardnim rekombinantnim tehnikama i korišćen kao antigen za imunizaciju.

Imunizacija i izolacija iRNA

[0336] Biblioteka fagnog prikaza za identifikaciju BST1-vezujućih molekula je konstruisana kao što sledi. A/J miševi (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.) su imunizovani intraperitonealno sa rekmbinatnim BST1 antigenom (ekstracelularni domen), korišćenjem 100 μg proteina u kompletnom Freund-ovom ađuvansu, na dan 0, i sa 100 μg antigena na dan 28. Uzimanje krvi miševa za test obavljeno je preko punkture retro-orbitalnog sinusa. Ukoliko je, testiranjem titara, utvrđeno da su visoki sa ELISA korišćenjem biotinilovanog BST1 antigena imobilizovanog preko neutravidina (Reacti-Bind™) NeutrAvidin(TM)-Coated Polystyrene Plates, Pierce, Rockford, Ill.), miševi su bustovani sa 100 μg proteina na dan 70, 71 i 72, sa žrtvovanjem nakon toga i spleneoktomijom na dan 77. Ukoliko titri antitela nisu bili zadovoljavajući, miševi su bustovani sa 100 μg antigena na dan 56 i uzimanje krvi za test je urađeno na dan 63. Ukoliko su dobijeni zadovoljavajući titri, životinje su bustovane sa 100 μg antigena na dan 98, 99, i 100 i slezine su sakupljene na dan 105.

[0337] Slezine su sakupljene u laminarnoj protočnoj komori i prenesene na petri šolje, isecajući i odbacujući masno i vezivno tkivo. Slezine su brzo macerirane sa klipom iz sterilnog 5 cc šprica u prisustvu 1.0 ml rastvora D (25.0 g guanidin tiocijanat (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 29.3 ml sterilne vode, 1.76 ml 0.75 M natrijum citrata pH 7.0, 2.64 ml 10% sarkozil (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.), 0.36 ml 2-merkaptoetanola (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.). Ova suspenzija slezina je provučena kroz iglu 18G dok sve ćelije nisu lizirane i viskozni rastvor je prenet u epruvetu za mikrocentrifugu. Petri šolja je isprana sa 100 μl rastvora D da bi se rekuperovala preostala slezina. Ova suspenzija je zatim provučena kroz iglu 22G dodatnih 5-10 puta.

[0338] Uzorak je podeljen na jednake delove između dve epruvete za mikrocentrifugu i sledeće je dodato, po redosledu, sa mešanjem uz inverziju nakon svakog dodavanja: 50 μl 2 M natrijum acetata pH 4.0, 0.5 ml zasićenog vodenog rastvora fenola (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.), 100 μl hloroform/izoamil alkohola 49:1 (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.). Rastvor je vorteksovan 10 sekundi i inkubiran na ledu 15 min. Nakon centrifugiranja na 14 krpm 20 min na 2-8°C, vodena faza je preneta u čistu epruvetu. Dodata je jednaka zapremina zasićenog vodenog rastvora fenol:hloroform:izoamil alkohol (50:49:1), i epruveta je vorteksovana deset sekundi. Nakon 15 min inkubacije na ledu, uzorak je centrifugiran 20 min na 2-8°C, i vodena faza je preneta u čistu epruvetu i istaložena sa jednakom zapreminom izopropanola na -20°C minimum 30 min. Nakon centrifugiranja na 14 krpm 20 min na 4°C, supernatant je uklonjen aspiriranjem, epuverte su kratko centrifugirane i svi tragovi tečnosti su uklonjeni iz RNK peleta.

[0339] Svaki RNK pelet je rastvoren u 300 μl rastvora D, kombinovan, i istaložen sa jednakom zapreminom izopropanola na -20°C minimum 30 min. Uzorak je centrifugiran na 14 krpm 20 min na 4°C, supernatant je aspiriran kao prethodno, i uzorak je ispran sa 100 μl ledeno hladnog 70% etanola. Uzorak je ponovo centrifugiran na 14 krpm 20 min na 4°C, 70% rastvor etanola je aspiriran, i RNK pelet je osušen in vacuo. Pelet je resuspendovan u 100 μl sterilne vode tretirane dietil pirokarbonatom. Koncentracija je određena sa A260 korišćenjem apsorbance od 1.0 za koncentraciju od 40 μg/ml. RNK su uskladištene na -80°C.

Priprema komplementarne DNK (cDNK)

[0340] Ukupna RNK prečišćena iz slezina miševa kao što je opisano prethodno korišćena je direktno kao šablon za pripremu cDNK. RNK (50 μg) je razblažena do 100 μL sa sterilnom vodom, i dodato je 10 μL 130 ng/μL oligo dT12 (sinetisanog na Applied Biosystems Model 392 DNA synthesizer). Uzorak je zagrevan 10 min na 70°C, zatim ohlađen na ledu. Dodato je četrdeset μL 5* first strand pufera (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.), zajedno sa 20 μL 0.1 M ditiotreitola (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.), 10 μL 20 mM dezoksinukleozid trifosfata (dNTP’s, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), i 10 μL vode na ledu. Uzorak je zatim inkubiran na 37°C 2 min. Dodato je deset μL reverzne transkriptaze (Superscript™) II, Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.) i inkubacija je nastavljena na 37°C 1 č. cDNK proizvodi su korišćeni direktno za lančanu reakciju polimeraze (PCR).

Amplifikacija gena antitela sa PCR

[0341] Da bi se amplifikovali u značajnom stepenu svi geni H i L lanca korišćenjem PCR, izabrani su prajmeri koji su odgovarali u značajnom stepenu svim objavljenim sekvencama. Kako nukleotidne sekvence aminoterminusa H i L sadrže značajnu raznovrsnost, 33 oligonukleotida je sintetisano da bi služili kao 5’ prajmeri za H lance, i 29 oligonukleotida je sintetisano da služe kao 5’ prajmeri za kapa L lance kao što je opisano u US 6,555,310. Nukleotidne sekvence konstantnog regiona za svaki lanac zahtevale su samo jedan 3’ prajmer za H lance i jedan 3’ prajmer za kapa L lance.

[0342] 50 μL reakcija je izvedena za svaki par prajmera sa 50 μmol 5’ prajmera, 50 μmol 3’ prajmera, 0.25 μL Taq DNK polimeraze (5 units/μL, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 3 μL cDNK (pripremljena kao što je opisano), 5 μL 2 mM dNTP, 5 μL 10*Taq DNK polimeraza pufera sa MgCl2(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), i H2O do 50 μL. Amplifikacija je urađena korišćenjem GeneAmp(R) 9600 thermal cycler (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) sa sledećim programom termo ciklusa: 94°C 1 min; 30 ciklusa od 94°C 20 sek, 55°C 30 sek, i 72°C 30 sek, 72°C 6 min; 4°C.

[0343] dsDNK proizvodi PCR procesa su zatim podvrgnuti asimetričnoj PCR korišćenjem samo 3’ prajmera da bi se stvorili u značajnom stepenu samo anti-sens lanci ciljnih gena. Urađena je 100 μL reakcija za svaki dsDNK proizvod sa 200 μmol 3’ prajmera, 2 μL ds-DNK proizvoda, 0.5 μL Taq DNK polimeraze, 10 μL 2 mM dNTP’s, 10 μL 10*Taq DNK polimeraza pufera sa MgCl2(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), i H2O do 100 μL. Isti PCR program kao onaj opisan prethodno korišćen za amplifikaciju jednolančane (ss)-DNK. Prečišćavanje jednolančane DNK sa tečnom hromatografijom visoke performanse i kinaznom jednolančanom DNK.

[0344] ss-PCR proizvodi H lanca i jednolančani PCR proizvodi lakog lanca istaloženi su sa etanolom dodavanjem 2.5 zapremine etanola i 0.2 zapremine 7.5 M amonijum acetata i inkubiranjem na -20°C najmanje 30 min. DNK je peletirana centrifugiranjem u Eppendorf centrifugi na 14 krpm 10 min na 2-8°C. Supernatant je pažljivo aspiriran, i epruvete su kratko centrifugirane drugi put. Poslednja kap supernatanta je uklonjena sa pipetom. DNK je osušena in vacuo 10 min na umerenoj toploti. Proizvodi H lanca su pulovani u 210 μL vode i proizvodi L lanca su pulovani zasebno u 210 μL vode. Jednolančana DNK je prečišćena tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) korišćenjem Hewlett Packard 1090 HPLC i Gen-Pak™) FAX jono-izmenjivačke kolone (Millipore Corp., Milford, Mass.). Gradijent korišćen za prečišćavanje jednolančane DNK je prikazan u Tabeli 1, i temperatura pećnice je bila 60°C. Absorbansa je praćena na 260 nm. jednolančana DNK eluirana iz HPLC sakupljena je u 0.5 min frakcijama. Frakcije koje su sadržavale jednolančanu DNK su istaložene sa etanolom, peletirane i osušene kao što je prethodno opisano. Osušeni DNK pelet je pulovan u 200 μL sterilne vode.

Tabela 1 - HPLC gradijent za prečišćavanje ss-DNK

[0345] Jednolančana DNK je 5’-fosforilisana u pripremi za mutagenezu. Svakom uzorku je dodato dvadeset četiri μL 10* kinaznog pufera (United States Biochemical, Cleveland, Ohio), 10.4 μL 10 mM adenozin-5’-trifosfata (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), i 2 μL polinukleotidne kinaze (30 units/μL, United States Biochemical, Cleveland, Ohio), i epruvete su inkubirane na 37°C 1 č. Reakcije su zaustavljene inkubiranjem epruveta na 70°C 10 min. DNK je prečišćena sa jednom ekstrakcijom Tris ekvilibrisanog fenola (pH>8.0, United States Biochemical, Cleveland, Ohio):hloroform:izoamil alkohol (50:49:1) i jednom ekstrakcijom sa hloroform:izoamil alkohol (49:1). Nakon ekstrakcija, DNK je istaložena sa etanolom i peletirana kao što je prethodno opisano. DNK pelet je osušen, zatim rastvoren u 50 μL sterilne vode. Koncentracija je određena merenjem apsorbancije alikvota DNK na 260 nm korišćenjem 33 μg/ml za apsorbanciju od 1.0. Uzorci su uskladišteni na -20°C.

Priprema uracil šablona korišćenih za stvaranje fagne biblioteke antitela slezine

[0346] Jedan ml E. coli CJ236 (BioRAD, Hercules, Calif.) prekonoćne kulture je dodato 50 ml 2*YT u 250 ml pregrađenoj boci za šejkiranje. Kultura je uzgajana na 37°C do OD600=0.6, inkubirana sa 10 μl 1/100 razblaženja stoka BS45 vektor faga (opisano u US 6,555,310) i rast je nastavljen 6 č. Oko 40 ml kulture je centrifugirano na 12 krpm 15 min na 4°C. Supernatant (30 ml) je prenet u čistu epruvetu za kulturu i inkubiran na sobnoj temepraturi 15 min nakon dodavanja 15 μl 10 mg/ml Rnkaze A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.). Izvršeno je taloženje faga sa dodavanjem 7.5 ml 20% polietilen glikola 8000 (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.)/3.5M amonijum acetata (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) i inkubacijom na ledu 30 min. Uzorak je centrifugiran na 12 krpm 15 min na 2-8°C. Supernatant je pažljivo odbačen, i epruveta je kratko centrifugirana da bi se uklonili svi tragovi supernatanta. Pelet je resuspendovan u 400 μl pufera sa visokim sadržajem soli (300 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8.0,1 mM EDTA), i prenet u 1.5 ml epruvetu.

[0347] Stok faga je ekstrahovan ponovljeno sa jednakom zapreminom ekvilibrisanih fenol:hloroform:izoamil alkohol (50:49:1) do vidljivog uklanjanja belog interfejsa, i zatim je ekstrahovan sa jedanakom zapreminom hloroform:izoamil alkohol (49:1). DNK je istaložena sa 2.5 zapremine etanola i 1/5 zapremine 7.5 M amonijum acetata i inkubirana 30 min na -20°C. DNK je centrifugirana na 14 krpm 10 min na 4°C, pelet je jednom ispran sa hladnim 70% etanolom, i osušen in vacuo. Uracil šablon DNK je rastvoren u 30 μl sterilne vode i koncentracija je određena sa A260 korišćenjem apsorbancije od 1.0 za koncentraciju od 40 μg/ml. Šablon je razblažen sa 250 ng/μL sa sterilnom vodom, podeljen na alikvote i uskladišten na -20°C.

Mutageneza uracil šablona sa ss-DNK i elektroporacija u E. coli da bi se stvorile fagne biblioteke antitela

[0348] Biblioteke fagnog prikaza antitela stvorene su istovremenim uvođenjem jednolančanih gena teškog i lakog lanca u uracil šablon vektora fagnog prikaza. Tipična mutageneza je izvedena u 2 μg razmeri mešanjem sledećeg u 0.2 ml epruveti za PCR reakciju: 8 μl (250 ng/mL) uracil šablona, 8 μL 10* pufera za aniling (200 mM Tris pH 7.0, 20 mM MgCl2, 500 mM NaCl), 3.33 μl kinaziranog jednolačanog inserta teškog lanca (100 ng/mL), 3.1 μl kinaziranog jednolančanog inserta lakog lanca (100 ng/μL), i sterilne vode do 80 μl. Aniling DNK je izvršen u GeneAmp(R) 9600 thermal cycler korišćenjem sledećeg termalnog profila: 20 sek na 94°C, 85°C 60 sek, 85°C do 55°C rampa preko 30 min, zadržavanje na 55°C 15 min. DNK je preneta na led nakon završetka programa. Ekstenzija/ligacija je izvedena dodavanjem 8 μl 10* pufera za sintezu (5 mM each dNTP, 10 mM ATP, 100 mM Tris pH 7.4, 50 mM MgCl2, 20 mM DTT), 8 μL T4 DNK ligaze (1 U/μL, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 8 μL razblažene T7 DNK polimeraze (1 U/μL, New England BioLabs, Beverly, Mass.) i inkubiranje na 37°C 30 min. Reakcija je zaustavljena sa 300 μL stop pufera za mutagenezu (10 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA). DNK za mutagenezu je ekstrahovana jednom sa ekvilibrisanim fenolom (pH>8):hloroform:izoamil alkohol (50:49:1), jednom sa hloroform:izoamil alkoholom (49:1), i DNK je istaložena sa etanolom na - 20°C najmanje 30 min. DNK je peletirana i supernatant je pažljivo uklonjen kao što je prethodno opisano. Uzorak je ponovo kratko centrifugiran i svi tragovi etanola su uklonjeni sa Pipetman. Pelet je osušen in vacuo. DNK je resuspendovana u 4 μL sterilne vode.

[0349] Jedan μL DNK za mutagenezu (500 ng) je transformisan u 40 μl elektrokompetentne E. coli DH12S (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.) korišćenjem elektroporacije. Transformisane ćelije su pomešane sa približno 1.0 ml prekonoćnih XL-1 ćelija koje su razblažene sa 2*YT buljonom do 60% originalne zapremine. Smeša je zatim preneta u 15-ml sterilne epruvete za kulturu i 9 ml agara dodato je odgore za postavljanje na 150-mm LB agar ploče. Ploče su inkubirane 4 č na 37°C i zatim prenete na 20°C preko noći. Prva runda antitelo fag je napravljena eluiranjem faga sa ovih ploča u 10 ml 2*YT, uklanjanjem taloga centrifugiranjem, i uzimanjem supernatanta. Ovi uzorci su biblioteke fagnog prikaza antitela korišćene za selekciju antitela protiv BST1. Efikasnost elektroporacija je merena postavljanjem na ploče 10 μl 10<-4>razređenja suspendovanih ćelija na LB agar pločama, praćena sa prekonoćnom inkubacijom ploča na 37°C. Efikasnost je izračunata množenjem broja plakova na ploči sa 10<-4>razblaženjem sa 10<6>. Efikasnosti elektroporacije biblioteke su tipično veće od 1*10<7>faga pod ovim uslovima.

Transformacija E. coli elektroporacijom

[0350] Elektrokompetentne E. coli ćelije su odmrznute na ledu. DNK je pomešana sa 40 L ovih ćelija pažljivim pipetiranjem ćelija gore i dole 2-3 puta, pazeći da se ne unese vazdušni mehurić. Ćelije su prenete na Gene Pulser kivetu (0.2 cm gap, BioRAD, Hercules, Calif.) koja je bila hlađena na ledu, ponovo pazeći da se ne uvede mehurić vazduha pri prenosu. Kiveta je postavljena u E. coli Pulser (BioRAD, Hercules, Calif.) i elektroporisana sa voltažom postavljenom na 1.88 kV prema preporuci proizvođača. Transformisani uzorak je odmah resuspendovan u 1 ml 2*YT buljona ili 1 ml smeše 400 μl 2*YT/600 μl prekonoćnih XL-1 ćelija i obrađen kako su procedure nalagale.

Postavljanje M13 faga ili ćelija transformisanih sa vektorom za mutagenezu sa fagnim prikazom antitela na ploče

[0351] Uzorci faga su dodati u 200 µL prekonoćne kulture E. coli XL1-Blue kada je postavljena na 100 mm LB agar ploče ili u 600 µL prekonoćnih ćelija kada su postavljene na 150 mm ploče u sterilnim 15 µl epruvetama za kulturu. Nakon dodavanja LB top agara (3 ml za 100 mm ploče ili 9 ml za 150 mm ploče, top agar uskladišten na 55°C (videti, Appendix A1, Sambrook et al., supra.), smeša je podjednako distribuirana na LB agar ploči koja je prethodno ugrejana (37°C-55°C) da bi se uklonio bilo kakav višak vlažnosti na površini agara. Ploče su hlađene na sobnoj temperaturi dok top agar nije očvrsnuo. Ploče su invertovane i inkubirane na 37°C kao što je naznačeno.

Priprema biotinilovane ADP-ribozil ciklaze 2 i biotinilovanih antitela

[0352] Koncentrovani rekombinantni BST1 antigen (puna dužina ekstracelularnog domena) ekstenzivno je dijalizirana u BBS (20 mM borat, 150 mM NaCl, 0.1% NaN3, pH 8.0). Nakon dijalize, 1 mg BST1 (1 mg/ml u BBS) reagovan je sa 15-strukim molarnim viškom biotin-XX-NHS estra (Molecular Probes, Eugene, Oreg., stok rastvor na 40 mM u DMSO). Reakcija je inkubirana na sobnoj temperaturi 90 min i zatim ugašena sa taurinom (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) u finalnoj koncentraciji od 20 mM. Biotinilovana reakciona smeša je zatim dijalizirana nasuprot BBS na 2-8°C. Nakon dijalize, biotinilovani BST1 je rastvoren u puferu za paning (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mg/ml BSA, 0.1% Tween 20, pH 7.5), podeljeno u alikvote, i uskladišteno na -80°C do upotrebe.

[0353] Antitela su reagovana sa 3-(N-maleimidilpropionil)biocitin (Molecular Probes, Eugene, Oreg.) korišćenjem slobodnog cisteina lociranog na karboksi terminusu teškog lanca. Antitela su redukovana dodavanjem DTT do finalne koncentracije od 1 mM 30 min na sobnoj temperaturi. Redukovana antitela su propuštena kroz Sephadex G50 kolonu za odsoljavanje ekvilibrisanu u 50 mM kalijum fosfatu, 10 mM bornoj kiselini, 150 mM NaCl, pH 7.0.

3-(N-maleimidilpropionil)-biocitin je dodat do finalne koncentracije od 1 mM i dozvoljeno je da se reakcija odvija na sobnoj temperaturi 60 min. Uzorci su zatim dijalizirani ekstenzivno nasuprot BBS i uskladišteni na 2-8°C.

Priprema Avidin magnetnog lateksa

[0354] Magnetni lateks (Estapor, 10% solids, Bangs Laboratories, Fishers, Ind.) je detaljno resuspendovan i 2 ml je podeljeno u alikvote u 15 ml koničnu epruvetu. Magnetni lateks je suspendovan u 12 ml destilovane vode i izdvojen iz rastvora 10 min korišćenjem magneta (PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass.). Tokom održavanja razdvajanja magnetnog lateksa sa magnetom, tečnost je pažljivo uklonjena korišćenjem 10 ml sterilne pipete. Ovaj proces ispiranja je ponavljan dodatna tri puta. Nakon finalnog ispiranja, lateks je resuspendovan u 2 ml destilovan vode. U zasebnoj 50 ml koničnoj epruveti, 10 mg avidin-HS (NeutrAvidin, Pierce, Rockford, Ill.) je rastvoreno u 18 ml 40 mM Tris, 0.15 M natrijum hlorida, pH 7.5 (TBS). Tokom vorteksovanja, dodato je 2 ml ispranog magnetnog lateksa razblaženog avidin-HS i smeša je mešana dodatnih 30 sek. Ova smeša je inkubirana na 45°C 2 č, šejkiranjem svakih 30 min. Avidin magnetni lateks je razdvojen od rastvora korišćenjem magneta i ispran tri puta sa 20 ml BBS kao što je prethodno opisano. Nakon finalnog ispiranja, lateks je resuspendovan u 10 ml BBS i uskladišten na 4°C.

[0355] Neposredno pre upotrebe, avidin magnetni lateks je ekvilibrisan u puferu za paning (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mg/ml BSA, 0.1% Tween 20, pH 7.5). Avidin magnetni lateks potreban za paning eksperiment (200 ml/uzorku) dodat je u sterilnu 15 ml epruvetu za centrifugu i doveden do 10 ml sa puferom za paning. Epruveta je postavljena na magnet 10 min da bi se odvojio lateks. Rastvor je pažljivo uklonjen sa 10 ml sterilnom pipetom kao što je prethodno opisano. Magnetni lateks je resuspendovan u 10 ml pufera za paning da bi se započelo drugo ispiranje. Magnetni lateks je ispran ukupno 3 puta sa puferom za paning. Nakon finalnog ispiranja, lateks je resuspendovan u puferu za paning do početne zapremine.

Primer 2: Selekcija rekombinatnih poliklonskih antitela protiv BST1 antigena

[0356] Vezujući reagensi koji se specifično vezuju za BST1 izabrani su iz biblioteka fagnog prikaza stvorene iz hiperimunizovanih miševa kao što je opisano u Primeru 1.

Paning

[0357] Prva runda faga sa antitelom je pripremljena kao što je opisano u Primeru 1 korišćenjem BS45 uracil šablona. Elektroporacije DNK za mutagenezu su izvedene dajući uzorke faga izvedene iz različitih imunizovanih miševa. Da bi se stvorila veća raznovrsnost u rekombinantnoj poliklonskoj biblioteci, za svaki uzorak faga paning je izveden zasebno.

[0358] Pre prve runde funkcionalnog paninga sa biotinilovanim BST1 antigenom, biblioteke faga sa antitelom su izabrane u odnosu na fage koji prikazuju i teške i lake lance na njihovoj površini paningom sa 7F11-magnetnim lateksom (kao što je opisano u Primerima 21 i 22 SAD 6,555,310). Funkcionalni paning ovih obogaćenih biblioteka je izveden u principu kao što je opisano u Primeru 16 SAD 6,555,310. Specifično, 10 µL of 1*10<-6>M biotinilovanog BST1 antigena je dodato uzorcima faga (približno 1*10<-8>M finalne koncentracije BST1), i dozvoljeno je da smeša dostigne ravnotežu preko noći na 2-8°C.

[0359] Nakon dostizanja ravnoteže, izvršen je paning uzoraka sa avidin magnetnim lateksom da bi se zarobio fag sa antitelom vezanim za BST1. Ravnotežni avidin magnetni lateks (Primer 1), 200 μL lateksa po uzorku, inkubiran je sa fagom 10 min na sobnoj temperaturi. Nakon 10 min, svakom uzorku faga dodato je približno 9 ml paninig pufera, i magnetni lateks je izdvojen iz rastvora korišćenjem magneta. Nakon desetominutne separacije, nevezani fag je pažljivo uklonjen korišćenjem sterilne pipete od 10 ml. Magnetni lateks je zatim resuspendovan u 10 ml paning pufera da bi se započelo drugo ispiranje. Lateks je ispran ukupno tri puta kao što je prethodno opisano. Za svako ispiranje, epruvete su bile u kontaktu sa magnetom 10 min da bi se izdvojio nevezani fag od magnetnog lateksa. Nakon trećeg ispiranja, magnetni lateks je resuspendovan u 1 ml paning pufera i prenet u epruvetu od 1.5 mL. Celokupna zapremina magnetnog lateksa za svaki uzorak je zatim sakupljena i resuspendovana u 200 μl 2*YT i postavljena na 150 mm LB ploče kao što je opisano u Primeru 1 da bi se amplifikovao vezani fag. Ploče su inkubirane na 37°C 4 č, zatim preko noći na 20°C.

[0360] 150 mm ploče korišćene za amplifikaciju vezanog faga korišćene su za stvaranje sledeće runde faga sa antitelom. Nakon inkubacije preko noći, druga runda faga sa antitelom je eluirana sa 150 mm ploča pipetiranjem 10 mL 2*YT medijuma na podlogu i ploča je pažljivo šejkirana na sobnoj temepraturi 20 min. Uzorci faga su zatim preneti na 15 ml potrošne sterilne epruvete za centrifugu sa čepovima, i talog sa LB ploče je peletiran centrifugiranjem epruveta 15 min na 3500 rpm. Supernatant koji sadrži drugu rundu faga sa antitelom je zatim prenet u novu epruvetu.

[0361] Druga runda funkcionalnog paniniga je postavljena razblaživanjem 100 μL svakog stoka faga u 900 μL paning pufera u 15 ml potrošnim sterilnim epruvetama za centrifugiranje. Biotinilovani BST1 antigen je zatim dodat svakom uzorku kao što je opisano za prvu rundu paninga, i uzorci faga su inkubirani 1 č na sobnoj temepraturi. Uzorci faga su zatim panirani sa avidin magnetnim lateksom kao što je prethodno opisano. Napredovanje paninga je praćeno u ovoj tački postavljanjem alikvota svakog lateks uzorka na 100 mm LB agar ploče da bi se odredio procenat kapa pozitivnih. Najveći deo lateksa iz svakog paninga (99%) je postavljen na 150 mm LB agar ploče da bi se amplifikovao fag vezan za lateks. 100 mm LB agar ploče su inkubirane na 37°C 6-7 č, nakon čega su ploče prenete na sobnu temperaturu i nitrocelulozni filteri (veličina pore 0.45 mm, BA85 Protran, Schleicher i Schuell, Keene, N.H.) su postavljeni preko plakova.

[0362] Ploče sa nitroceluloznim filterima su inkubirane preko noći na sobnoj temepraturi zatim su razvijene sa kozja anti-mišja kapa alkalna fosfataza konjugatom da bi se odredio procenat kapa pozitivnih kao što je opisano u nastavku. Uzorci faga sa nižim procentima (<70%) kapa pozitivnih u populaciji su podvrgnuti rundi paninga sa 7F11-magnetnim lateksom pre izvođenja treće funkcionalne runde paninga preko noći na 2-8°C korišćenjem biotinilovanog BST1 antigena na približno 2*10<-9>M. Ova runda paninga je takođe praćena u odnosu na kapa pozitivne. Pojedinačni uzorci faga koji su imali procente kapa pozitivnih veće od 80% su pulovani i podvrgnuti finalnoj rundi paninga preko noći na 2-8°C sa 5*10<-9>M. Geni BST1 antitela sadržani unutar eleuiranog faga iz ove četvrte runde funkcionalnog paninga su subklonirani u ekspresioni vektor, pBRncoH3.

[0363] Proces subkloniranja je generalno urađen kao što je opisano u Primeru 18 SAD 6,555,310. Nakon subkloniranja, ekspresioni vektor je elektroporisan u DH10B ćelije i smeša je uzgajana preko noći u 2*YT koji sadrži 1% glicerola i 10 μg/ml tetracikclina. Nakon druge runde rasta i selekcije u tetraciklinu, alikvoti ćelija su zamrznuti na -80°C kao izvor za BST1 poliklonsku proizvodnju antitela. Monoklonska antitela su izabrana iz ovih poliklonskih smeša postavljanjem uzorka smeše na LB agar ploče sa 10 μg/ml tetraciklina i skriningom antitela koja su prepoznavala BST1.

Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnih antitela protiv ADP-ribozil ciklaze 2

[0364] Inokulum u boci za šejkiranje je stvoren preko noći od -70°C ćelijske banke u Innova 4330 inkubatorom sa šejkerom (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.) podešenom na 37°C, 300 rpm. Inokulum je korišćen za zasejavanje 20 L fermentora (Applikon, Foster City, Calif.) koji sadrži definisani medijum kulture [Pack et al. (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277] sa dodatkom 3 g/L L-leucina, 3 g/L L-izoleucin, 12 g/L digestovanog kazeina (Difco, Detroit, Mich.), 12.5 g/L glicerola i 10 mg/ml tetraciklina. Temperatura, pH i rastvoreni kiseonik u fermentoru su kontrolisani na 26°C, 6.0-6.8 i 25% zasićenja, respektivno. Pena je kontrolisana dodavanjem polipropilen glikola (Dow, Midland, Mich.). Glicerol je dodat fermentoru u fed-batch modu. Fab ekspresija je indukovana dodavanjem L(+)-arabinoze (Sigma, St. Louis, Mo.) do 2 g/L tokom kasne logaritamske faze rasta. Gustina ćelija je merena optičkom gustinom na 600 nm u UV-1201 spektrofotometru (Shimadzu, Columbia, Md.). Nakon završetka procesa i podešavanja pH do 6.0, kultura je pasažirana dva puta kroz M-210B-EH Microfluidizer (Microfluidics, Newton, Mass.) na 17,000 psi. Homogenizacija ćelija pod visokim pritiskom oslobodila je Fab u supernatant kulture.

[0365] Prvi korak u prečišćavanju bila je afinitetna hromatografija sa upotrebom imobilizovanih metala u raširenom sloju (EB-IMAC). Streamline™ helatirajuća smola (Pharmacia, Piscataway, N.J.) napunjena je sa 0.1 M NiCl2i i zatim je ekspandirana i ekvilibrisana u 50 mM acetatu, 200 mM NaCl, 10 mM imidazola, 0.01% NaN3, pH 6.0 puferu koji protiče u smeru nagore. Stok rastvor je korišćen da bi se doveo homogenat kulture do 10 mM imidazole, nakon čega je razblažen dvostruko ili više u ravnotežnom puferu da bi se smanjio sadržaj vlažnih čvrstih supstanci na manje od 5% po težini. Zatim je napunjen u Streamline kolonu sa protokom nagore sa površinkom brzinom od 300 cm/č. Ćelijski talog je neometano prošao, ali su Fab zarobljeni preko interakcije visokog afiniteta između nikla i heksahistidinskog taga na Fab teškom lancu. Nakon ispiranja, rašireni sloj je konvertovan u kondenzovani sloj i Fab je eluiran sa 20 mM borat, 150 mM NaCl, 200 mM imidazol, 0.01% NaN3, pH 8.0 pufer koji protiče u smeru nadole.

[0366] Drugi korak u prečišćavanju koristio je jono-izmenjivačku hromatografiju (IEC). Q Sepharose FastFlow smola (Pharmacia, Piscataway, N.J.) je ekvilibrisan u 20 mM boratu, 37.5 mM NaCl, 0.01% NaN3, pH 8.0. Fab eluiranje pula iz EB-IMAC koraka je razblažena četvorostruko u 20 mM borat, 0.01% NaN3, pH 8.0 i napunjen u IEC kolonu. Nakon ispiranja, Fab je eluiran sa 37.5-200 mM NaCl gradijentom soli. Eluirane frakcije su procenjene u odnosu na čistoću korišćenjem Xcell II™ SDS-PAGE sistema (Novex, San Diego, Calif.) pre pulovanja. Konačno, Fab pul je koncentrovan i dijafiltriran u 20 mM borate, 150 mM NaCl, 0.01% NaN3, pH 8.0 pufer za uskladištenje. Ovo je postignuto u Sartocon Slice™ sistemu opremljenim sa 10,000 MWCO kasetom (Sartorius, Bohemia, N.Y.). Finalni prečišćeni prinosi bili su tipično 50%. Koncentracija prečišćenog Fab je merena sa UV apsorbancijom na 280 nm, pretpostavljajući apsorbanciju od 1.6 za 1 mg/ml rastvor.

Primer 3: Specifičnost monoklonskih antitela za BST1 određena protočno citometrijskom anallizom

[0367] Specifičnost antitela protiv BST1 izabranih u Primeru 2 je testirana protočnom citometrijom. da bi se testirala sposobnost antitela da se vezuju za BST1 protein na ćelijskoj površini, antitela su inkubirana sa BST1-eksprimirajućim ćelijama, A549 i H226, iz humanog adenokarcinoma pluća i humanog skvamoznog karcinoma pluća, respektivno. Ćelije su isprane u FACS puferu (DPBS, 2% FBS), centrifugirane i resuspendovane u 100 μl razblaženog primarnog BST1 antitela (takođe razblaženog u FACS puferu). Antitelo-A549 kompleks je inkubiran na ledu 60 min i zatim dva puta ispran sa FACS puferom kao što je prethodno opisano. Ćelija-antitelo pelet je resuspendovan u 100 μl razblaženog sekundarnog antitela (takođe razblaženog u FACS puferu) i inkubirano na ledu 60 min. Pelet je ispran kao prethodno i resuspendovan u 200μl FACS pufera. Uzorci su napunjeni u BD FACScanto II protočni citometar i podaci su analizirani korišćenjem BD FACSdiva softvera.

REZULTATI

[0368] Rezultati protočno citometrijske analilze pokazali su da su se 4 monoklonska antitela označena BST1_A1, BST1_A2 i BST_A3 efikasno vezivala za humani BST1 na ćelijskoj membrani. Slika 3a prikazuje vezujuće specifičnosti i BST1_A1 i BST1_A2 sa BST1 na A549 i H226 ćelijama, respektivno. Slika 3b prikazuje vezujuće specifičnosti BST1_A3 sa BST1 na A549 i H226 ćelijama. Rezultati ukazuju na jako vezivanje tih antitela protiv BST1 sa A549 i H226.

Primer 4: Strukturna karakterizacija monoklonskih antitela na BST1

[0369] cDNK sekvence koje kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca BST1_A2 i BST1_A1 monoklonskih antitela dobijene su korišćenjem standardnih PCR tehnika i sekvencirane su korišćenjem standardnih tehnika sekvenciranja DNK.

[0370] Sekvence antitela mogu biti podvrgnute mutagenezi da bi se vratili ostaci iz klicine linije na jednom ili više ostataka.

[0371] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca BST1_A2 su SEQ ID NO: 6 i 2, respektivno. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca BST1_A2 su SEQ ID NO: 8 i 4, respektivno.

[0372] Poređenje BST1_A2 sekvence teškog lanca imunoglobulina sa poznatim sekvencama teškog lanca imunoglobulina klicine linije pokazalo je da teški lanac BST1_A2 koristi VHsegment iz mišje klicine linije VH1-39. Dodatna analiza BST1_A2 VHsekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona dovela je do razgraničenja CDR1, CDR2 i CDR3 regiona teškog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NOs:22, 24 i 26, respektivno. Poravnanja BST1_A2 CDR1 i CDR2 VHsekvenci sa VH1-39 sekvencom klicine linije su prikazani na Slici 1a i 1b.

[0373] Poređenje BST1_A2 sekvence lakog lanca imunoglobulina sa poznatim mišjim sekvencama lakog lanca imunoglobulina klicine linije pokazalo je da BST1_A2 laki lanac koristi VKsegment iz mišje VK4-55 klicine linije. Dodatna analiza BST1_A2 VKsekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona dovela je do razgraničenja CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NOs:28, 30 i 32, respektivno. Poravnanja BST1_A2 CDR1, CDR2 i CDR3 VKsekvenci sa VK4-55 sekvencama klicine linije prikazana su na Slikama 2a, 2b i 2c.

[0374] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca BST1_A1 su SEQ ID NO: 5 i 1, respektivno.

[0375] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca BST1_A1 su SEQ ID NO: 7 i 3, respektivno.

[0376] Poređenje BST1_A12 sekvence teškog lanca imunoglobulina sa poznatim mišjim sekvencama teškog lanca imunoglobulina klicine linije pokazalo je da BST1_A1 teški lanac koristi VHsegment iz mišje VH1-80 klicine linije. Dodatna analiza BST1_A1 VHsekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona dovela je do razgraničenja CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NOs:21, 23 i 25, respektivno. Poravnanja BST1_A1 CDR1 i CDR2 VHsekvenci sa VH1-80 sekvencama klicine linije su prikazane na Slici 1a i 1b.

[0377] Poređenje BST1_A1 sekvence lakog lanca imunoglobulina sa poznatim mišjim sekvencama lakog lanca imunoglobulina klicine linije pokazalo je da BST1_A1 laki lanac koristi VKsegment iz mišje VK4-74 klicine linije. Dodatna analiza BST1_A1 VKsekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona dovela je do razgraničenja CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NOs:27, 29 i 31, respektivno. Poravnanja BST1_A1 CDR1, CDR2 i CDR3 VKsekvenci sa VK4-74 sekvencama klicine linije prikazana su na Slikama 2a, 2b i 2c.

[0378] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca BST1_A3 su SEQ ID NO: 54 i 52, respektivno.

[0379] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca BST1_A3 su SEQ ID NO: 55 i 53, respektivno.

[0380] Poređenje BST1_A3 sekvence teškog lanca imunoglobulina sa poznatim mišjim sekvencama teškog lanca imunoglobulina klicine linije pokazalo je da BST1_A3 teški lanac koristi VHsegment iz mišje VH69-1 klicine linije. Dodatna analiza BST1_A3 VHsekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona dovela je do razgraničenja CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NOs: 62, 63 i 64, respektivno. Poravnanje BST1_A3 CDR1, CDR2 i CDR3 VHsekvenci sa VH69-1 sekvencama klicine linije prikazano je na Slici 1a i 1b.

[0381] Poređenje BST1_A3 sekvence lakog lanca imunoglobulina sa poznatim mišjim sekvencama lakog lanca imunoglobulina klicine linije pokazalo je da BST1_A3 laki lanac koristi VKsegment iz mišje VK44-1 klicine linije. Dodatna analiza BST1_A3 VKsekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona dovela je do razgraničenja CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NOs: 65, 66 i 67, respektivno. Poravnanja BST1_A3 CDR1, CDR2 i CDR3 VKsekvenci sa VK44-1 sekvencama klicine linije prikazana su na Slikama 2a, 2b i 2c.

Primer 5: Internalizacija i MabZAP od BST1 A1 i BST1 A2 u A549 i H226 ćelijama.

[0382] Internalizacija BST1_A1 i BST1_A2_ od strane H226 i A549 ispitivani su korišćenjem MabZap analize. MabZAP analiza je pokazala internalizaciju anti-BST1 monoklonskih antitela preko vezivanja anti-humannih IgG sekundarnih antitela vezanih za toksin saporin. (Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100). Prvo, BST1 Fab je vezan za površinu ćelija. Zatim, MabZAP antitela su vezana za primarna antitela. Zatim, MabZAP kompleks je internalizovan od strane ćelija. Ulazak Saporina u ćelije rezultovao je u inhibiciji sinteze proteina i konačno smrti ćelije.

[0383] MabZAP test je izveden kao što sledi. Svaka od ćelija je zasejana sa gustinom od 5x10<3>ćelija po komorici. Anti-BST1 monoklonsko antitelo ili izotipsko kontrolno humano IgG je serijski razblaženo zatim dodato ćelijama i inkubirano 15 min na 25°C. MabZAP je zatim dodat i inkubiran 72 č na 37°C. Vijabilnost ćelija u pločama je detektovana sa CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega, G7571) i ploče su očitane i analizirane korišćenjem Promega Glomax. Smrt ćelija je bila proporcionalna koncentraciji anti-BST1 monoklonskih antitela. Slike 4a i 4b pokazuju da su anti-BST1 monoklonska antitela, BST1_A1 i BST1_A2 efikasno internalizovana od strane H226 i A549 ćelija, u poređenju sa anti-humanim IgG izotipskim kontrolnim antitelom.

Primer 6: Humanizacija BST1 A2

[0384] Da bi se dizajnirale humane sekvence BST1_A2 VHi VL, aminokiseline okvirnog regiona važne za formiranje CDR strukture identifikovane su korišćenjem trodimenzionalnog modela. Humane VHi VL, sekvence sa visokim homologijama sa BST1_A2 su takođe izabrane iz GenBank baze. CDR sekvence zajedno sa identifikovanim okvirnim aminokiselinskim ostacima graftovane su iz BST1_A2 u humane okvirne sekvence (Slike 5-7).

Primer 7 Antitelo-zavisna ćelijska citotoksičnost posredovana sa Anti-BST1 mAbs

[0385] Prvo, 25 μl roditeljskih i ne-fukozilovanih anti-BST1 antitela (BST1_A2 i BST1_A2_NF) sa koncentracijama u opsegu od 10nm/L do 0.1nm/L dodato je da se razdvoje komorice 96 komorne ploče sa v dnom zajedno sa 50 μl BST1-eksprimirajućih A549 i U937 ćelija. Zatim je komoricama dodato 25 μl efektorskih ćelija da bi se dobio finalni odnos efektor:cilj (E: T) od 10:1 i 25:1. Ploča je zatim pažljivo centrifugirana na 1000 rpm 2 minuta, nakon čega je inkubirana 4 č u inkubatoru na 37°C, 5% CO2. 3 č posle inkubacije, svakoj od komorica koja je sadržala samo BST1-eksprimirajuću ćeliju dodato je 10 μl rastvora za lizu da bi se izmerilo maksimalno oslobađanje LDH, i jednom setu komorica koje su sadržale samo medijum za kontrolnu korekciju zapremine.

[0386] Nakon inkubacije, ćelije su pažljivo centrifugirane na 1000 rpm 2 minuta, nakon čega je 50 μl supernatanta preneto na 96 komornu ploču sa ravnim dnom. Korišćenjem CytoTox 96® NonRadioactive Cytotoxicity Assay dostupnim od Promega (Cat #: G1780), komponente kompleta su rekonstituisane prema specifikacijama proizvođača i 50 μl smeše supstrata je dodato u svaku komoricu. Ploča je zatim pokrivena i ostavljena da se inkubira 30 minuta na 25°C zaštićena od svetlosti. Nakon ovoga, dodato je 50 μl Stop rastvora u svaku komoricu i apsorbancija je registrovana na 490 nm korišćenjem varioskan čitača ploča.

[0387] Korišćenjem antitela poznatog da podstiče ubijanje ćelija preko ADCC kao pozitivne kontrole i kontrolnog humanog IgG1 izotipa kao negativne kontrole, rezultati su pokazali da su BST1_A2 i BST1_A2_NF bili sposobni da izazovu ADCC na BST1-eksprimirajućim A549 i U937 ćelijama. Na BST1-eksprimirajućim A549 ćelijama, pokazano je da BST1_A2_NF imaju približno 45% ubijanja na 10 nmol/L (Slika 8a). Na BST1-eksprimirajućim U937 ćelijama, pokazano je da BST1_A2 iamju približno 20% ubijanja na 1 nmol/L i pokazano je da BST1_A2_NF imaju približno 45% ubijanja na 1 nmol/L (Slika 8b).

Primer 8: Specifičnost monoklonskih antitela na BST1 određena protočno citometrijskom analizom kod AML pacijenata

[0388] Sposobnost BST_A2 da se vezuju za limfoblaste iz pacijenata sa AML testirana je sa protočno citometrijskom analizom. Krv je uzeta od 20 AML pacijenata. Korišćenjem procedure kao što je opisana u Primeru 3, pokazano je da se BST_A2 vezuje za AML blast kod približno 80% AML pacijenata.

LISTING SEKVENCI

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kojе se specifično vezuje za BST-1 koje sadrži:

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

i) prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10;

ii) drugi vhCDR koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 51;

iii) treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 14; i

b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

i) prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 16;

ii) drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 18; i

iii) treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 20.

2. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1 koje sadrži:

a) teški lanac najmanje 95% identičan SEQ ID NO: 2, i

laki lanac najmanje 95% identičan SEQ ID NO: 4; ili

b) teški lanac najmanje 95% identičan SEQ ID NO: 46, i

laki lanac najmanje 95% identičan SEQ ID NO: 49.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde antitelo je antitelo pune dužine IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa.

4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 kojе dalje sadrži kovalentno vezan deo, izborno gde je pomenuti deo lek.

5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 4 gde je pomenuti lek izabran iz grupe koja se sastoji od majtanzinoida, dolastatina, auristatina, trihotecena, kaliheamicina, CC1065 i njihоvih derivata.

6. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od prethodnoh patentnih zahteva, gde pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući deo indukuje T ćelijsku citotoksičnost i/ili je bispecifično antitelo.

7. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, gde pomenuto antitelo indukuje antitelo-zavisnu ćelijskiposredovanu citotoksičnost (ADCC), ili komplement zavisnu citotoksičnost (CDC), izborno gde antitelo je antitelo stvoreno inženjeringom koje ima povećano vezivanje Fc receptora i/ili povećanu potenciju za ADCC.

8. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, gde je antitelo bispecifično ili multispecifično antitelo koje se specifično vezuje za prvi antigen koji sadrži BST1 i drugi antigen izabran iz grupe koja se sastoji od CD3 antigena i CD5 antigena.

9. Nukleinska kiselina koja kodira:

a) teški lanac antitela ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva; i

b) laki lanac antitela ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

10. Ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 9.

11. Postupak za stvaranje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 10 pod uslovima gde je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo eksprimiran i izborno izolovanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela.

12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patetntnih zahteva 1-8 za upotrebu u terapiji gde:

a) antitelo ili njegov antigen-vezujući deo je internalizovan od strane ćelije koja eksprimira BST1, gde pomenuto antitelo sadrži kovalentno vezan konjugat leka; ili

b) antitelo koje indukuje antitelo-zavisnu ćelijski-posredovanu citotoksičnost (ADCC), komplement zavisnu citotoksičnost (CDC) i/ili T-ćelijsku citotoksičnost.

13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 gde upotreba je tretman kancera, uključujući akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), B-ćelijsku hroničnu limfocitnu leukemiju, kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer bubrega, kancer glave i vrata, kancer pluća, kancer jajnika ili kancer pankreasa.

14. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo za koji je tražena zaštita prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 za upotrebu u terapiji ili za upotrebu kao medikament.