RS56461B1 - Tretman bolesti iz spektra autizma upotrebom glicil-l-2-metilprolil-l-glutaminske kiseline - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se generalno odnosi na terapiju bolesti iz spektra autizma (ASD), uključujući autizam, sindrom fragilnog X hromozoma, Rett-ov sindrom (RTT), autistični poremećaj, Asperger-ov sindrom, dezintegrativni sindrom u detinjstvu i nespecifični pervazivni razvojni poremećaj (PDD-NOS), i patološki sindrom izbegavanja poslušnosti (PDA). Naročito, ovaj pronalazak se odnosi na tretman poremećenog socijalnog funkcionisanja i repetitivnog ponašanja kod ASD korišćenjem glicil-2-metil-prolil-glutamata (G-2-MePE).

OSNOVA

Opis srodne tehnike

[0002] Dijagnoza spektra autističnih poremećaja se povećava. Spektar autističnih poremećaja (ASD) je skup vezanih razvojnih poremećaja, koji se karakterišu abnormalnostima u socijalnoj interakciji i komunikaciji, ograničenim interesovanjima i repetitivnim ponašanjima. Trenutna klasifikacija ASD prepoznaje pet različitih oblika: klasični autizam ili autistični poremećaj, Asperger-ov sindrom, Rett-ov sindrom, dezintegrativni sindrom u detinjstvu i nespecifični pervazivni razvojni poremećaj (PDD-NOS). Šesti sindrom, patološki sindrom izbegavanja poslušnosti (PDA) je sledeći specifični pervazivni razvojni poremećaj.

[0003] EP 0366 638 opisuje GPE (tri-peptid koji se sastoji od aminokiselina Gly-Pro-Glu) i njegove di-peptidne derivate Gly-Pro i Pro-Glu. EP 0 366 638 opisuje da je GPE efikasan kao neuromodulator i da može uticati na električne osobine neurona.

[0004] WO95/172904 opisuje da GPE ima neuroprotektivne osobine i da primena GPE može smanjiti oštećenje centralnog nervnog sistema (CNS) prevencijom ili inhibicijom smrti nervnih i glijalnih ćelija.

[0005] WO 98/14202 opisuje da primena GPE može povećati efikasnu količinu holin acetiltransferaze (ChAT), deakarboksilaze glutaminske kiseline (GAD), azot monoksid sintaze (NOS) u centralnom nervnom sistemu (CNS).

[0006] WO99/65509 opisuje da povećanje efikasne količine GPE u CNS, kao što je primenom GPE, može povećati efikasnu količinu tirozin hidroksilaze (TH) u CNS da bi se povećala TH-posredovana proizvodnja dopamina u lečenju bolesti kao što je Parkinson-ova bolest.

[0007] WO02/16408 opisuje određene GPE analoge koji imaju aminokiselinske supstitucije i određene druge modifikacije koje su sposobne da indukuju fiziološki efekat ekvivalentan sa GPE unutar pacijenta. Primene GPE analoga uključuju tretman akutne povrede mozga i neurodegenerativnih bolesti, uključujući povredu ili bolest u CNS.

[0008] WO 2008/153929 opisuje postupke za tretman Rett-ovog sindroma i drugih poremećaja funkcije i sazrevanja sinapse korišćenjem IGF1, (1-3)IGF-1, (1-3)IGF-1 analoga (ili više njih) i/ili srodnih terapeutskih molekula.

[0009] SAD patent br.7,041,314 opisuje kompozicije supstance i postupke za upotrebu G-2-MePE.

REZIME

[0010] Trenutno ne postoji efikasan tretman ASD i briga o pacijentu je ograničena na rukovođenje simptomima.

[0011] Predmetni pronalazak obezbeđuje glicil-2-metil-L-prolil-L-glutamat (G-2-MePE) za upotrebu u tretmanu simptoma izabranog iz grupe koja se sastoji od poremećenog socijalnog funkcionaisanja i repetitivnog ponašanja iz spektra autističnih poremećaja (ASD) kod životinje, oralnom primenom efikasne količine G-2-MePE.

KRATAK OPIS SLIKA

[0012] Predmetni pronalazak je opisan u odnosu na njegove specifične primere izvođenja. Drugi aspekti i karakteristike predmetnog pronalaska mogu se shvatiti u odnosu na Slike, u kojima:

Sl. 1 je opšta šema pripreme sintetičkih analoga GPE.

Sl. 2 i 3 prikazuju šeme za modifikovanje glicinskih ostataka na GPE.

Sl. 4 do 9 prikazuju šeme za modifikovanje ostataka glutaminske kiseline GPE.

Sl. 10 i 11 prikazuje šeme za modifikovanje peptidnih veza GPE.

Sl. 12-15 prikazuje grafike koji rezimiraju rezultate testiranja neurona in vitro sa GPE ili G-2-MePE i okadainskom kiselinom.

Sl. 12 prikazuje grafik koji prikazuje efekte GPE na kortikalne neurone povređene sa okadainskom kiselinom.

Sl. 13 prikazuje grafik koji prikazuje efekte G-2-MePE na kortikalne neurone povređene sa okadainskom kiselinom.

Sl. 14 prikazuje grafik koji prikazuje efekte G-2-MePE, GPE na cerebelarne mikroeksplante povređene sa okadainskom kiselinom.

SL. 15 prikazuje grafik koji prikazuje efekte G-2-MePE ili GPE na ćelije strijatuma povređene sa okadainskom kiselinom.

Sl. 16 prikazuje efekte potkožne injekcije G-2-MePE (sa dozama od 0.012, 0.12, 1.2 i 12 mg/kg) na brojnim ChAT-pozitivnim neuronima u strijatumu pacova starih 18 meseci.

Sl. 17 prikazuje efekte G-2-MePE tretmana retenciju prostornog pamćenja kod sredovečnih pacova starih 12 meseci.

Sl. 18A i 18B prikazuju efekte G-2-MePE na prostorno radno pamćenje starih pacova (starih 17 meseci) u 8-krakom kružnom lavirintu nakon 3-nedeljnog tretmana i ispiranja od devet dana. Sl. 18A prikazuje akvizicione profile lavirinta po danima za različite grupe. Sl. 18B prikazuje proporciju ispravnih izbora lavirinta kao srednju vrednost prema danima za grupe.

Sl. 19A prikazuje efekte jedne intraperitonealne primene 4 doze G-2-MePE na proliferaciju neuroblasta kao što je procenjeno brojem PCNA pozitivnih ćelija u subventrikularnoj zoni (SVZ) starih pacova.

Sl. 19B prikazuje efekte jedne intraperitonealne primene 4 doze G-2-MePE na ko-lokalizaciju PCNA i dvostruko kortin bojenje kod pacova tretiranih sa najvišom dozom G-2-MePE (desni panel) u poređenju sa pacovom tretiranim vehikulumom (levi panel).

Sl. 19C prikazuje efekte G-2-MePE na proliferaciju neuroblasta kao što je procenjeno sa PCNA imunohistohemijskim bojenjem kod sredovečnih pacova.

Sl. 20A prikazuje značajno povećanje broja reaktivnih astrocita kao što je procenjeno GFAP bojenjem u hipokampusu kod starih pacova u poređenju sa mladim pacovima (*p<0.01) i sredovečnim pacovima (*p<0.01).

Sl. 20B prikazuje fotografiju preseka cerebralnog korteksa starog pacova, koji prikazuje astrocite kao što je procenjeno sa GFAP bojenjem, od kojih su neke povezane sa formiranjem kapilara (strelice).

Sl. 20C prikazuje dozno-zavisne efekte G-2-MePE tretmana (sa dozama od 0.12, 0.12, 1.2 i 12 mg/kg/day) na smanjenje broja astrocita kao što je procenjeno korišćenjem GFAP bojenja u CA4 sub-regionu hipokampusa starih pacova.

Sl. 20D prikazuje dozno-zavisne efekte G-2-MePE tretmana (sa dozama od 0.12, 0.12, 1.2 i 12 mg/kg/day) na smanjenje broja astrocita kao što je procenjeno korišćenjem GFAP bojenja u cerebelarnom korteksu.

Sl. 21 prikazuje farmakokinetičke karakteristike GPE i G-2-MePE u cirkulaciji pacova nakon intravenske injekcije.

Sl. 22 prikazuje efekte G-2-MePE na povećano trajanje preživljavanja kod MeCP2 deficijentnih miševa u poređenju sa MeCP2 deficijentnim miševima tretiranim fiziološkim rastvorom.

Sl. 23 prikazuje efekte G-2-MePE na hipokampusnu dugoročnu potencijaciju kao što je mereno sa fEPSP nagibom kod MeCP2 deficijentnih miševa, u poređenju sa MeCP2 deficijentnim miševima tretiranim fiziološkim rastvorom.

Sl. 24 prikazuje grafik koji prikazuje efekte G-2-MePE na dužinu dendrita u funkciji rastojanja od some ćelije.

DETALJNI OPIS

Definicije

[0013] Termin "oko" u odnosu na dozu ili vreme odnosi se na promenljivu i opseg oko te promenljive koji je unutar normalne merne greške koja je unutar 20% vrednosti promenljive. Termin "oko" u odnosu na uočeni rezultat označava da je variranje unutar 20% vrednosti uočene promenljive.

[0014] Termin "životinja" uključuje ljude i ne-humane životinje, kao što su kućni ljubimci (mačke, psi, i slično) i domaće životinje (goveda, konji, ovce, koze, svinje, i slično).

[0015] Termin "bolest" uključuje bilo koje nezdravo stanje životinje uključujući naročito Parkinson-ovu bolest, Huntington-ovu bolest, Alzheimer-ovu bolest, multiplu sklerozu, dijabetes, motorne poremećaje, napadi, kognitivne disfunkcije usled starosti i spektar autističnih poremećaja, sindrom fragilnog X hromozoma, Rett-ov sindrom (RTT), autistični poremećaj, Asperger-ov sindrom, dezintegrativni sindrom u detinjstvu i nespecifični pervazivni razvojni poremećaj (PDD-NOS), i patološki sindrom izbegavanja poslušnosti (PDA).

[0016] Termin "faktor rasta" označava ekstracelularni polipeptd-signalni molekul koji stimuliše ćeliju da raste ili proliferiše.

[0017] Termin "povreda" uključuje bilo koje akutno oštećenje životinje uključujući ne-hemoragični šlog, traumatsku povredu mozga, perinatalnu asfikciju povezanu sa fetalnim stresom kao što je nakon abrupcije, okluzije pupčane vrpce ili povezanu sa intrauterinom retardacijom rasta, perinatalnu asfiksiju povezana sa neuspešnim adekvatnim veštačkim oživljavanjem ili disanjem, teške CNS povrede povezane sa preživljavanjem od davljenja, preživljavanjem iznenadne smrti, udisanjem ugljen monoksida, amonijaka ili intoksikacija drugim gasovima, srčani zastoj, komu, meningitis, hipoglikemiju i status epilepticus, epizode cerebralne asfiksije povezane sa operacijom koronarim bajpasom, hipotenzivne epizode i hipertenzivne krize, cerebralnu traumu i toksičnu povredu.

[0018] "Poremećaji pamćenja" ili "kognitivni poremećaji" su poremećaji koji se karakterišu trajnim ili privremenim oštećenjem ili gubitkom sposobnosti učenja, pamćenja ili sećanja. Poremećaj pamćenja može biti rezultat normalnog starenja, povrede mozga, tumora, neurodegenerativne bolesti, vaskularnih stanja, genetičkih stanja (Huntington-ova bolest), hidrocefalusa, drugih bolesti (Pick-ove bolesti, Creutzfeld-Jakob-bolesti, AIDS, meningitisa), toksičnih supstanci, nedostataka u ishrani, biohemijskih poremećaja, psiholoških ili psihijatrijskih disfunkcija. Prisustvo poremećaja pamćenja kod čoveka može se ustanoviti putem ispitivanja istorije pacijenta, fizičkog pregleda, laboratorijskih testova, testova vizuelizacije i neuropsiholoških testova. Standardni neuropsihološki testovi uključuju, ali nisu ograničeni na Brief Visual Memory Test-Revised (BVMT-R), Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB), Children’s Memory Scale (CMS), Contextual Memory Test, Continuous Recognition Memory Test (CMRT), Controlled Oral Word Association Test and Memory Functioning Questionnaire, Denman Neuropsychology Memory Scale, Digit Span and Letter Number Sequence sub-test of the Wechsler Adult Intelligence Scale-III, Fuld Object Memory Evaluation (FOME), Graham-Kendall Memory for Designs Test, Guild Memory Test, Hopkins Verbal Learning Test, Learning and Memory Battery (LAMB), Memory Assessment Clinic Self-Rating Scale (MAC-S), Memory Assessment Scales (MAS), Randt Memory Test, Recognition memory Test (RMT), Rey Auditory and Verbal Learning Test (RAVLT), Rivermead Behavioral Memory Test, Russell’s Version of the Wechsler Memory Scale (RWMS), Spatial Working Memory, Test of Memory i Learning (TOMAL), Vermont Memory Scale (VMS), Wechsler Memory Scale, Wide Range Assessment of Memory and Learning (WRAML).

[0019] Termin "farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" označava ekscipijent koji je koristan u pripremanju farmaceutske kompozicije koji je generalno bezbedan, netoksičan, i poželjan, i uključuje ekscipijente koji su prihvatljivi za veterinarsku upotrebu kao i za humanu farmaceutsku upotrebu. Takvi ekscipijenti mogu biti čvrsti, tečni, polučvrsti, ili, u slučaju aerosolne kompozicije, gasoviti.

[0020] Termin "farmaceutski prihvatljiva so" označava so koja je farmaceutski prihvatljiva i ima poželjne farmakološke osobine. Takve soli uključuju soli koje se mogu formirati gde kiseli protoni prisutni u jedinjenjima reaguju sa neorganskim ili organskim bazama. Pogodne neorganske soli uključuju one formirane sa alkalnim metalima, npr. natrijumom i kalijumom, magnezijumom, kalcijumom, i aluminijumom. Pogodne organske soli uključuju one formirane sa organskim bazama kao što su amini npr. etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamin, N-metilglukamin, i slično. Soli takođe uključuju kisele adicione soli formirane reakcijom amino grupe ili grupa prisutnih u jedinjenju sa kiselinom. Pogodne kiseline uključuju neorganske kiseline (npr. hlorovodoničnu i bromovodoničnu kiselinu) i organske kiseline (npr. sirćetnu kiselinu, limunsku kiselinu, maleinsku kiselinu, i alkan- i aren-sulfokiseline kao što je metansulfonska kiselina i benzensulfonska kiselina). Kada su dve kisele grupe prisutne u jedinjenju, farmaceutski prihvatljiva so može biti monokiselina mono-so di-so; i slično gde su više od dve kisele grupe prisutne, sve ili neke od takvih grupa se mogu salifikovati. Isto se može primeniti kada su dve ili više amino grupa prisutne u jedinjenju.

[0021] Termin "zaštitna grupa" je grupa koja selektivno blokira jedno ili više reaktivnih mesta u multifunkcionalnom jedinjenju tako da se hemijska reakcija može izvesti selektivno na drugom nezaštićenom reaktivnom mestu i tako da se grupa može lako ukloniti nakon završetka selektivne reakcije.

[0022] Termin "terapeutski efikasna količina" označava količinu agensa koja, kada se primeni na životinju za tretiranje bolesti, je dovoljna da izvede tretman te bolesti kao što je mereno korišćenjem test sistema koji je prepoznat u tehnici.

[0023] Termin "tretiranje" ili "tretman" bolesti može uključiti sprečavanje pojave bolesti kod životinje koja može imati predispoziciju za bolest, ali još uvek na oseća ili pokazuje simptome bolesti (profilaktički tretman), inhibira bolest (usporava ili zaustavlja razvoj), obezbeđuje olakšanje od simptoma ili sporednih efekata bolesti (uključujući palijativni tretman), i olakšava bolest (uzrokujući regresiju bolesti).

[0024] Termin "funkcionalni deficit" označava ponašajni deficit povezan sa neurološkim oštećenjem. Takvi deficiti uključuju deficite hoda, kao što se uočavaju kod pacijenata sa Parkinson-ovom bolešću, motorne abnormalnosti kao što se uočavaju kod pacijenata sa Huntington-ovom bolešću. Funkcionalni deficit takođe uključuje abnormalno postavljena stopala i poremećaje pamćenja opisane ovde.

[0025] Termini "G-2-MePE" i "NNZ-2566" označavaju L-glicil-2-metil-L-prolil-L-glutamat.

[0026] Termin "napad" označava nenormalni obrazac nervne aktivnosti u mozgu koja rezultuje u motornom deficitu ili nedostatku motorne kontrole što rezultuje u abnormalnim pokretima, uključujući spazmodične pokrete. "Napad" uključuje elektroencefalografske abnormalnosti, bilo da su praćemne ili nisu praćene abnormalnom motornom aktivnošću.

[0027] Prisutni atomi vodonika (kao što su atomi vodonika na pirolidin prstenu, itd.) izostavljeni su iz formule zbog jasnoće, ali se podrazumeva da su prisutni.

Spektar autističnih poremećaja

[0028] Spektar autističnih poremećaja (ASD) je skup vezanih razvojnih poremećaja, koji se karakterišu abnormalnostima u socijalnoj interakciji i komunikaciji, ograničenim interesovanjima i repetitivnim ponašanjima. Trenutna klasifikacija ASD prepoznaje pet različitih oblika: klasični autizam ili autistični poremećaj, Asperger-ov sindrom, Rett-ov sindrom, dezintegrativni sindrom u detinjstvu i nespecifični pervazivni razvojni poremećaj (PDD-NOS). Šesti sindrom, patološki sindrom izbegavanja poslušnosti (PDA), je sledeći specifični pervazivni razvojni poremećaj. Međutim, iako je PDA sve više prepoznat kao ASD, još uvek nije deo Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSMIV), objavljenog od strane American Psychiatric Association, niti je deo predložene revizije, DSM-V.

Autizam

[0029] Klasični autizam je visoko varijabilni neurorazvojni poremećaj. Tipično je dijagnostifikovan tokom veoma ranog ili ranog detinjstva, sa očiglednim simptomima često jasnim od starosti od 6 meseci, i ustanovljenim sa 2-3 godine. Prema kriterijumima postavljenim u DSM-IV, dijagnoza autizma zahteva prisutnost trijade simptoma, uključujući (a) poremećaje u socijalnoj interakciji, (b) poremećaje u komunikaciji i (c) ograničena i repetitivna interesovanja i ponašanja. Druge disfunkcije, kao što je atipično jedenje, takođe su uobičajene ali nisu esencijalne za dijagnozu. Od ovih poremećaja, poremećaji socijalne interakcije su naročito važni za dijagnozu, i dva od sledećih poremećaja moraju biti prisutna za dijagnozu autizma:

(i) poremećaji u upotrebi višestrukih neverbalnih ponašanja (npr. kontakt pogledom) za regulisanje socijalne interakcije;

(ii) neuspeh u razvoju vršnjačkih veza odgovarajućih za razvojni nivo;

(iii) nedostatak spontanog traženja da se podeli uživanje, interesovanja, ili dostignuća;

(iv) nedostatak socijalnog ili emocionalnog reciprociteta.

[0030] Poremećaji komunikacije u autizmu mogu biti ispoljeni u jednom ili više sledećih načina: kašnjenje u (ili potpuni nedostatak) razvoja govornog jezika; izrazit poremećaj u sposobnosti da inicira ili održi konverzaciju; stereotipna i repetitivna upotreba jezika; i/ili nedostatak spontane igre uloga. Ograničeni, repetitivni i stereotipni obrasci ponašanja su takođe neophodni za dijagnozu, kao što je preokupacija sa jednim ili više interesovanja koji se smatraju abnormalnim po intenzitetu, nefleksibilnom pridržavanju rutina ili rituala, repetitivni motorni manirizam i/ili stalni fokus na delove objekata.

[0031] Na kraju, za dijagnozu autizma, neophodno je da poremećaj u funkcionisanju u najmanje jednoj oblasti (tj. socijalnoj interakciji, jeziku, ili maštovitoj igri) mora početi pre 3 godine starosti.

[0032] Autizam je uobičajeno povezan sa epilepsijom ili epileptiformnom aktivnošću na elektroencefalogramu (EEG). Čak 60 procenata pacijenata sa autizmom ima epileptiformnu aktivnost na njihovim EEGs (Spence i Schneider, 2009 Ped Res 65: 599-606).

[0033] Autizam je takođe povezan sa poremećajima u funkciji IGF-1, koji je depletiran u centralnom nervnom sistemu (CNS) pacijenata sa autizmom (Riikonen et al., 2006 Devel Med Child Neurol 48: 751-755). Nivoi IGF-1 u CNS se povećavaju kod pacijenata sa autizmom nakon tretmana sa agensima koji smanjuju simptome kao što je fluoksetin (Makkonen et al., 2011 Neuropediatrics 42:207-209).

[0034] Važno je da autizam deli karakteristike sa Rett-ovim sindromom i sindromom fragilnog X hromozoma u odnosu na nervnu konektivnost. Sva tri poremećaja se karakterišu defektima u sinaptičkoj funkciji i nervnoj konektivnosti. Ovo se odražava u post mortem studijama humanih mozgova kod ovih grupa pacijenata, gde svi pokazuju neuspeh u formiranju normalnih sinaptičkih veza. Ovo se odražava preko izmenjenih morfoloških karakteristika, bilo da je smanjenje gustine dendritskih trnova neurona, ili povećana gustina dendritskih trnova, ali povezanih sa nezrelim sinapsama. Ovo se odražava u životinjskim modelima autizma, Rett-ovog sindroma i sindroma fragilnog X hromozoma, koji su zasnovani na genetičkim promenama za koje se zna da su patološke u ovim poremećajima. U ovim životinjskim modelima, defekti nervne konektivnosti se otkrivaju morfološki, i takođe kao neuspešnost dugotrajne potencijacije (LTP). Ovo je važno jer IGF-1, IGF-1[1-3] i G-2-MePE povećavaju formiranje sinapsi.

Asperger-ov sindrom

[0035] Asperger-ov sindrom ili Asperger-ov poremećaj je sličan autizmu, i deli sa njim određene karakteristike. Kao autizam, Asperger-ov sindrom se takođe karakteriše poremećajem u socijalnoj intereakciji i ovo je praćeno sa ograničenim i repetitivnim interesovanjima i ponašanjem. Stoga, dijagnoza Asperger-ovog sindroma se karakteriše istom trijadom poremećaja kao autizam. Međutim, razlikuje se od drugih ASDs po tome što nema opšte kašnjenje u jeziku ili kognitivnom razvoju i nema deficit u interesovanjima u okruženju subjekta. Dodatno, Asperger-ov sindrom je tipično sa manje teškom simptomima od klasičnog autizma i pacijenti sa Asperger-ovim sindromom mogu funkcionisati samostalno i voditi relativno normalne živote.

Dezitegrativni poremećaj u detinjstvu

[0036] Dezintegratvni poremećaj u detinjstvu (CDD), takođe poznat kao Heller-ov sindrom, je stanje kod kojeg se deca normalno razvijaju do starosti od 2-4 godine (tj. kasnije nego kod autizma i Rett-ovog sindroma), ali zatim pokazuju težak gubitak socijalnih, komunikacionih i drugih veština. Dezintegratvni poremećaj u detinjstvu je veoma sličan autizmu i oba uključuju normalan razvoj praćen značajnim gubitkom jezika, socijalne igre i motornih veština. Međutim, dezintegratvni poremećaj u detinjstvu se tipično javlja kasnije od autizma, uključuje dramatičniji gubitak veština i daleko je manje uobičajen.

[0037] Dijagnoza CDD je zavisna od dramatičnog gubitka prethodno stečenih veština u dve ili više sledećih oblasti: jezik, socijalne veštine, igra, motorne veštine (kao što je dramatičan pad u sposobnosti hoda, penjanja, držanja, itd), kontrole creva ili bešike (uprkos prethodnoj naučenosti na odlazak u toalet). Gubitak razvojnih veština može biti nagao i odigrati se tokom nekoliko dana do nedelja ili može biti postepeniji.

Nespecifični pervazivni razvojni poremećaj (PDD-NOS)

[0038] Nespecifični pervazivni razvojni poremećaj (PDD-NOS) je ASD koji opisuje pacijente koji pokazuju neke, ali ne sve, od simptoma povezanih sa drugim dobro definisanim ASDs. Ključni kriterijumi za dijagnozu ASD uključuju teškoću socijalizacije sa drugima, repetitivna ponašanja, i naglašnu osetljivost na određene stimuluse. Svi se oni nalaze kod prethodno opisanih ASDs. Međutim, autizam, Asperger-ov sindrom, Rett-ov sindrom i dezintegratvni poremećaj u detinjstvu, svi imaju druge karakteristike koje omogućavaju njihovu specifičnu dijagnozu. Kada se ne može uspostaviti specifična dijagnoza jednog od ova četiri oboljenja, ali je očigledan ASD, uspostavlja se dijagnoza PDD-NOS. Takva dijagnoza može biti rezultat simptoma koji počinju u kasnijim godinama nego što je primenjivo za druga stanja u spektru.

Rett-ov sindrom

[0039] Rett-ov sindrom (RTT) je neurorazvojni poremećaj koji gotovo isključivo pogađa individue ženskog pola (1 u 10:000 živorođenih). RTT je klasifikovan kao poremećaj iz autističnog spektra (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition - Revised (DSM-IV-R). Oko 16,000 pacijenata je trenutno pogođeno njime u SAD. (Rett Syndrome Research Trust data). Za dijagnozu Rett-ovog sindroma, sledeći sindromi su karakteristični: poremećaj razvoja od starosti od 6-18 meseci; smanjenje stope rasta glave sa početkom od između starosti od 3 meseca i 4 godine; teško poremećen govor; repetitivni i sterotipni pokreti ruke; i abnormalnosti hoda, nrp. hod na prstima ili nestabilni hod sa ukočenim nogama. Postoje brojni dodatni kriterijumi koji mogu pomoći dijagnozi Rettovog sindroma, ali nisu neophodni za dijagnozu. Oni uključuju teškoće pri disanju, EEG abnormalnosti, napade, rigidnost i spastičnost mišića, skoliozu (krivljenje kičme), škrgutanje zubima, male ruke i stopala u odnosu na visinu, usporeni rast, smanjene telesne masnoće i mišićne mase, abrnormalni obrasci spavanja, iritabilnost ili agitacija, teškoće pri žvakanju i/ili gutanju, slaba cirkulacija i konstipacija.

[0040] Početak RTT je obično između 6-18 meseci starosti sa usporavanjem razvoja i stopa rasta. Ovo je praćeno fazom regresije (tipično kod dece starosti 1-4 godine), pseudo-stacionarnom fazom (2-10 godina starosti) i sledećim progresivnim stanjem motornog propadanja. RTT-ovi simptomi uključuju iznendano usporenje rasta i regresiju u jezičkim i motornim veštinama uključujući zamenu kontrolisanih pokreta ruku sa stereotipnim, autistične osobine, napade slične panici, poremećaje u ciklusu spavanja, tremore, napade, respiratorne disfunkcije (epizodne apnee, hiperpnea), apraksiju, distoniju, diskineziju, hipotoniju, progresivnu kifozu ili skoliozu i težak kognitivni poremećaj. Većina RTT pacijenata preživljava do odraslog doba sa teškim invalidnostima i zahteva 24-časovnu brigu.

[0041] Objavljeno je da je između 85% i 95% slučajeva RTT izazvano mutacijom Mecp2 gena (Amir et al. 1999. Nat Genet 23:185-188; Rett Syndrome Research Trust) – gena koji kodira metil-CpG-vezujući protein 2 (MeCP2). Mecp2 je mapiran na X-hromozomu (lokacija Xq28) i iz tog razloga, mutacije gena kod individua muškog pola su obično letalne. Iako je RTT genetički poremećaj, manje od 1% registrovanih slučajeva je nasleđeno; skoro sve mutacije Mecp2 dešavaju se de novo, pri čemu su dve trećine izazvane mutacijama na 8 CpG dinukleotidima (R106, R133, T158, R168, R255, R270, R294 i R306) lociranim na trećim i četvrtim egzonima.

[0042] MeCP2 je protein koji vezuje metilovane CpG dinukleotide da bi izveo transkripciono utišavanje DNK u CNS. Izgleda da je ključni efekat smanjenja ili odsustva MeCP2 poremećaj razvoja dendritskih trnova i formiranja sinapsi. Izgleda da je ekspresija MeCP2 privremeno u korelaciji sa sazrevanjem mozga, što objašnjava zašto se simptomi tipično javljaju oko 18 meseci starosti.

Prikazivanje karakteristika zajedničkih za ASD

[0043] Uzimajući ASDs zajedno, jasno je da nema zajedničkog u prikazivanju simptoma između svih 5 oblika. Ove zajedniičke osobine su poremećaji normalnih socijalnih kompetencija i repetitivna ponašanja. Kod svih osim kod Asperger-ovog sindroma postoji konzistentno prikazivanje odloženog intelektulanog razvoja koje se najčešće manifestuje u nedostatku u jezičkim veštinama. Kognitivni gubitak u odnosu na normalne parametre prema starosti je često veoma uočljiv kod autizma, Rett-ovog sindroma, CDD i PDD-NOS. Prisustvo epilepsije ili abnormalne aktivnosti na EEG je takođe zajedničko za autizam, sindrom fragilnog X hromozoma i Rett-ov sindrom. Epilepsija se javlja u situacijama abnormalne nervne konektivnosti. Poremećena nervna konektivnost i poremećena sinaptička funkcija je zajednička karkateristika autizma, sindroma fragilnog X hromozoma i Rett-ovog sindroma i kod životinjskih modela ovih stanja.

Genetički modeli ASD

[0044] Da bi bili validni, životinjski modeli ASD moraju prikazivati slične simptome kao klinička stanja i moraju imati prihvatljiv stepen potencijalne validnosti u odnosu na etiologiju ovih simptoma. Poznato je da klasični autizam može biti izazvan mnogim različitim genetičkim poremećajima i smatra se da nijedan pojedinačni genetički defekt nije odgovoran za više od nekoliko procenata slučajeva autizma. Zaista, nedavne studije su otkrile de novo strukturne varijacije lokacija na hromozomima za koje se smatralo da su u osnovi ASD, dodatno retkim nasleđenim genetičkim defektima (Marshall et al, 2008; Sebat et al, 2007). Stoga, varijacija broja kopija (CNV), translokacija i inverzija sekvenci gena na 20 ključnih mesta ili više, uključujući 1p, 5q, 7q, 15q, 16p, 17p i Xq, mapirani su kao ASD lokusi.

[0045] Međutim, uprkos poligenetičke pozadine koja je u osnovi ASD, i kompleksnosti etiologije, poznato je da određeni gentički efekti mogu proizvesti ASD. Neki od najbolje okarakterisanih defekata nastaju od hromozomskih aberacija gena koji kodiraju klaster proteina postsinaptičke gustine, uključujući neuroligin-3 (NLGN3), neuroligin-4 (NLGN4), neureksin-1α (NRXN1) i shank3 (Sebat et al, 2007). Važno je da ovi defekti ukazuju na izmenjenu sinaptičku funkciju i stoga poremećenu nervnu konektivnost kao krajnji zajednički put kod autizma i srodnih poremećaja (Minshew and Williams 2007 Arch Neurol. 64:945-950; Gilman et al., 2011 Neuron. 70:898-907). Takvi deficiti konektivnosti se odražavaju na morfološke nalaze u post mortem pregledu, koji otkriva povećanu gustinu dendritskih trnova kod autizma (Hutsler and Zhang 2010 Brain Res.1309:83-94).

[0046] NLGN3 i NLGN4 su postsinaptički ćelijski adhezioni molekuli prisutni u glutamatergičnim sinapsama. Imaju ulogu u koordinaciji presinaptičkog kontakta sa postsinaptičkim mestom i takođe interaguju sa postsinaptičkim skeletnim proteinom shank3. Mutacije NLGN3 i NLGN4 su uočene kod ASD populacije i čine možda 1% svih ASD slučajeva (Lintas & Persico, 2008). Jamain i kolege su prvi objavili missens na NLGN3 i pomeranje okvira u odnosu na NLGN4 kod dva nesrodna subjekta, što rezultuje u Asperger-ovom sindromu i klasičnom autizmu respektivno (Jamain et al, 2003). Dok je incidenca NLGN3 ili NLGN4 mutacija kod ASD populacije niska (zaista, nije mnogo mutacija uočeno u studiji 96 ASD pacijenata u Kanadskoj studiji; Gauthier et al, 2005), u prekliničkim studijama je potvrđeno da mutacije neuroligina mogu zaista proizvesti autistične simptome u modelu. Stoga, introdukcija u miševe istog R451C missensa za NLGN3 koji je registrovan klinički rezultuje u mutantnom mišjem sloju koji pokazuje smanjenu socijalnu interakciju i poboljšanu inhibitornu sinaptičku transmisiju (Tabuchi et al, 2007).

[0047] R451C mutantni miš stoga predstavlja model za ASD zasnovan na NLGN3 mutaciji. U ovom slučaju, mutacija na R451 poziciji NLGN3 rezultuje u mutaciji ’dobijanja funkcije’.

[0048] Nasuprot tome, modelovanje kliničke mutacije NLGN4 kod miševa je postignuto mutacijom ’gubitka funkcije’ NLGN4 (klasični knockout model). U ovom modelu, mutantni miševi prikazuju deficit socijalne interakcije i smanjenu ultrazvučnu vokalizaciju (Jamain et al, 2008). Deficiti komunikacije su glavni za ASD i kod NLGN4 knockout miševa i smanjenje u ultrazvučnoj vokalizaciji od strane mužjaka miševa izloženih ženkama divljeg tipa podržava potencijalnu validnost soja kao modela ASD.

[0049] Presinaptički neureksin proteini indukuju postsinaptičku diferencijaciju kod suprotnih dendrita preko interakcija sa postsinaptičkim neuroligin odgovarajućim delovima. Mutacije neureksin-1α (NRXN1) gena registrovane su u brojnim studijama (Sebat et al, 2007; Marshall et al, 2008; Kim et al, 2008; Yan et al, 2008) i iste su uočene u obliku varijanti broja kopija. Kao što je to slučaj sa NLGN mutacijama, kad je mutacija NRXN1 gena introdukovana u miševe (u obliku genskog knockout), proizvodi se mutantni soj sa određenim ASD-sličnim karakteristikama (Etherton et al, 2009). Ovi NRXN1 knockout miševi pokazuju smanjenje u frekvenciji hipokampusne minijaturne ekscitatorne postsinaptičke struje (mEPSC) i smanjenom odnosu ulazno-izlaznih izazvanih struja. Ovi elektrofiziološki efekti odnose se na smanjenu ekscitatornu transmisiju u hipokampusu. Dodatno smanjenoj ekscitatornoj neurotransmisiji, NRXN1 knockout miševi pokazuju smanjenje u pre-pulsnoj inhibiciji, iako izgleda da socijalno ponašanje nije pogođeno (Etherton et al, 2009).

[0050] Deleći određene karakteristike sa neureksin-NLGN trans-sinaptičkim konstruktom, ćelijski adhezioni molekul 1 (CADM1) je protein iz familije imunoglobulina prisutan i pre- i post-sinaptički koji je takođe uključen u sinaptičku trans-ćelijsku adhezionu aktivnost (Biederer et al, 2002). Mutacije CADM1 gena su detektovane kod ASD pacijenata i izgleda da predstavljaju dalji mogući uzork ovih stanja (Zhiling et al, 2008).

[0051] Analiza CADM1 knockout miševa otkriva da ove životinje pokazuju povećano ponašanje slično anksioznosti, poremećenu socijalnu interakciju i poremećenu socijalnu memoriju i prepoznavanje. Dodatno CADM1 knockout miševi pokazuju slabije motorne veštine (Takayanagi et al, 2010). Ove disfunkcije su ponovo konzistentne sa ASD simptomatologijom.

[0052] 22q13 delecioni sindrom (takođe poznat kao Phelan-McDermid sindrom), je retki genetski poremećaj izazvan mikrodelecijom na q13.3 terminalnom kraju hromozoma 22. Ova mikrodelecija se retko otkriva tipičnim genetičkim skriningom i preporučuje se fluorescentni in situ test hibridizacije da bi se potvrdila dijagnoza. Skoriji radovi ukaztuju da je sindrom izazvan greškama u genu shank3, proteinu postsinaptičke gustine kritičnom za normalno nervno funkcionisanje. Interesantno je da greške u ovom genu takođe povezane sa ASD i 22q13 delecionim sindromom mogu zajedno voditi do ASD dijagnoze (Durand et al, 2007; Moessner et al, 2007; Sykes et al, 2009). Uzimajući u obzir blisku povezanost 22q13 delecionog sindroma i posledičnu dijagnozu ASD, razvijen je mutantni mišji model ove mutacije.

[0053] shank3 knockout miš prikazuje nekoliko deficita koji odražavaju ASD simptome, uključujući smanjenu ultrazvučnu vokalizaciju (tj. smanjenu socijalnu komunikaciju) kao i poremećaj socijalne interakcije između miševa. Dodatno, ovi miševi imaju poremećenu hipokampusnu CA1 ekscitatornu transmisiju, merenu sa odnosima ulazno-izlaznih izazvanih struja i poremećenu dugotrajnu potencijaciju (LTP). Veruje se da je LTP fiziološki proces koji je u osnovi formiranja i konsolidacije pamćenja. Stoga, model pokazuje sličan fenotip sa NLGN4 knockout, konzistentan sa ASD.

[0054] Kao što je napomenuto, 22q13 delecioni sindrom sam po sebi je veoma redak. Međutim, on obezbeđuje važne informacije da specifični geni mogu učestvovati u etiologiji ASD. Dodatno shank3, ovaj poremećaj otkriva dodatni mogući genski defekt kod ASD. Od 50 ili više opisanih slučajeva 22q13 delecionog sindroma, svi osim jednog imaju deleciju gena koji se pruža izvan shank3 da bi uključio dodatni gen, poznat kao Islet Brain-2 gen (IB2) (Sebat et al, 2007). IB2 protein interaguje sa mnogim drugim proteinima uključujući MAP kinaze i amiloid prekursor protein, izgleda da utiče na transport proteina u neuritima, i obogaćen je na postsinaptičkim gustinama (Giza et al, 2010). Miševi kojima nedostaje protein (IB2-/- knockout miševi) pokazuju poremećenu socijalnu interakciju (smanjeno vreme socijalnog njuškanja i interakcije), smanjeno istraživanje i kognitivne i motorne deficite (Giza et al, 2010). Ovaj ponašajni fenotip je bio povezan sa smanjenom ekscitatornom transmisijom u cerebelarnim ćelijama. Kao što je to slučaj sa shank3 knockout, fenotip IB2 mutacije je stoga takođe konzistentan sa ASD.

[0055] Dodatno životinjskim modelima prethodno opisanih postsinaptičkih gustina proteina, drugi monogenetički sindromi koji dele različite karakteristike sa ASD mogu voditi autizmu i nude dodatne puteve za ciljane lekove za ASD. Odličan primer ovoga je sindrom fragilnog X hromozoma.

[0056] Sindrom fragilnog X hromozoma (FXS) je izazvan ekspanzijom pojedinačne trinukleotidne genske sekvence (CGG) na X-hromozomu koja rezultuje u neuspešnoj ekspresiji proteina kodiranog sa fmr1 genom. FMR1 (fragilni X mentalna retardiranost 1) je protein neophodan za normalni nervni razvoj. FXS može izazvati da dete ima autizam (Hagerman et al, 2010); kod 2-6% od sve dece sa dijagnostifikovanim autizmom uzrok je mutacija FXS gena. Dodatno, oko 30% od FXS dece ima neki stepen autizma i dodatnih 30% je dijagnostifikovano sa PDD-NOS (Hagerman et al, 2010). Zaista, sindrom fragilnog X hromozoma je najčešći poznati uzrok autizma poreklom od pojedinačnog gena. Razvijeni su FMR1 knockout miševi kao model FXS i, stoga, kao dodatni model ASD. Pokazano je da knockout mutacija FMR1 gena rezultuje u deficitima nervne konektivnosti kao što je abnormalni razvoj i skraćivanje dendritskih trnova (Comery et al, 1997), zajedno sa povezanom disregulacijom dendritskih skeletnih proteina (uključujući shank1) i podjedinice glutamat receptora u postsinaptičkim gustinama (Schćtt et al, 2009). Ovi efekti na morfologiju dendrita rezultuju deficitima u funkcionalnim merama konektivnosti kao što je poremećaj LTP u korteksu i amigdali (Zhao et al, 2005) i hipokampusu (Lauterborn et al, 2007), kao i poremećene kognitivne karakteristike (Kreuger et al, 2011) i povećanje u socijalnoj anksioznosti (Spencer et al, 2005). Ovi deficiti konektivnosti se odražavaju kod FXS pacijenata, koji pokazuju povećanu gustinu dendritskih trnova u post mortem analizi (Irwin et al., 2000 Cereb Cortex 10:1034-1048). Ova povećana gustina dendritskih trnova praćena je sa nezrelim sinapsama (Klemmer et al., 2011 J Biol Chem. 286:25495-25504), tj. može predstavljati funkcionalno nezrelo stanje.

[0057] Za razliku od ASD autizma, Asperger, CDD i PDD-NOS, izgleda da Rett-ov sindrom ima skoro monogenetičku osnovu i može se modelovati kod miševa sa dobrom potencijalnom validnošću. Smatra se da je Rett-ov sindrom izazvan, u do 96% slučajeva, deficitom u Mecp2 genu (Zoghbi, 2005). Kao rezultat, MeCP2 knockout mutantni miševi obezbeđuju životinjski model sa svim znacima kliničkog Rett-ovog sindroma, sa fenotipom koji pokazuje nešto preklapanja sa NLGN4, shank3 i IB2 knockout modelima ASD. Stoga, MeCP2 knockout miševi prikazuju jasni poremećaj LTP u hipokampusu zajedno sa odgovarajućim smanjenjem socijalnog i prostornog pamćenja (Moretti et al, 2006) i poremećenim prepoznavanjem objekata (Schaevitz et al, 2010). Ovaj poremećaj u LTP je praćen sa smanjenjem gustine dendritskih trnova. Pacijenti sa Rett-ovim sindromom pokazuju smanjenu gustinu dendritskih trnova (Belichenko et al., 1994 Neuroreport 5:1509-1513).

[0058] Stoga, ASD kod ljudi ima mnogo zajedničkih karakteristika sa kognitivnim ili razvojnim poremećajima kod životinja, uključujući glodare. Stoga, studije terapija ASD kod glodara kao što su miševi i pacovi su prilično prediktivne za rezultate dobijene kod ljudi. Zajednička karakteristika uočena kod autizma, sindroma fragilnog X hromozoma i Rett-ovog sindroma je prisustvo deficita nervne konektivnosti, koje se odražava ili u smanjenoj gustini dendritskih trnova ili povećanoj gustini dendritskih trnova sa nezrelim sinapsama. Funkcionalne posledice ovih morfoloških promena su slične u životinjskim modelima ovih poremećaja, kao odraz, na primer, u deficitima LTP.

Tretman kliničkog ASD i ASD životinjskog modela sa G-2-MePE

[0059] Kao što je prethodno opisano, konzervativna patologija je uočena kod ASD koja uključuje poremećeni razvoj neurita, poremećenu sinaptičku konektivnost i odgovarajući poremećaj u socijalnom i kognitivnom funkcionisanju kao rezutlat. Takve sinaptičke disfunkcije rezultuju iz genetički izmenjenih funkcija proteina postsinaptičke gustine. Normalni rast neurita i postsinaptički razvoj može biti regulisan i popravljen faktorima rasta kao što je neurotrofički faktor izveden iz mozga (BDNF; Chapleau et al, 2009) i faktor rasta sličan insulinu-1 (IGF-1; Riikonen et al, 2006; Tropea et al, 2009). Zaista, IGF-1 je esencijalan za normalan rast dendritskih trnova i formiranje sinapse (Cheng et al., 2003 J Neurosci Res. 73:1-9). Lekovi koji promovišu funkciju faktora rasta se stoga mogu koristiti u tretmanu progresivnih razvojnih poremećaja kao što su ASD. G-2-MePE mali molekul metilovani analog terminalnog tripeptida IGF-1, IGF1(1-3). Kao IGF-1 mimetik analog, G-2-MePE izvodi trofičke i neuroprotektivne efekte u različitim životinjskim modelima. G-2-MePE je stoga efikasan u tretiranju ASD simptoma kao što su oni koji se odnose na sinaptičke disfunkcije koje su rezultat prethodno opisane mutacije gena.

[0060] U kliničkom smislu, ASD pacijenti, sa autizmom, Asperger-ovim sindromom, Rett-ovim sindromom, dezintegrativnim poremećajem u detinjstvu i PDD-NOS, kao i pacijenti sa 22q13 delecionim sindromom, sindromom fragilnog X hromozoma i patološkim izbegavanjem poslušnosti tretirani su sa G-2-MePE. Pacijenti pokazuju socijalne i komunikacione poremećaje kao i kognitivni deficit. Uočeno je da tretman sa G-2-MePE, na primer, na dnevnoj bazi i u drugom primeru, oralnim putem, indukuje poboljšanje u stereotipnim repetitivnim pokretima, poboljšanom socijalnom funkcionisanju i poboljšanom kognitivnom performansom nakon tretmana lekom.

[0061] U životinjskim modelima ASD, dnevni G-2-MePE tretman oralnom gavažom ili intraperitonealnom injekcijom knockout miševima poboljšaće ASD-slične simptome. G-2-MePE je efikasan u sledećim modelima ASD mutantnih miševa: NLGN3 (R451C) mutant, NLGN4 knockout, NRXN1 knockout, CADM1 knockout, shank3 knockout, IB2 knockout, FMR1 knockout i MeCP2 knockout. Kada je primenjen sub-hronično (1-10 nedelja) na dnevnoj bazi, G-2-MePE je efikasan u poboljšanju LTP u hipokampusu nakon „burst“ stimulacije ili stimulacije sa visokom učestanošću. Slično, G-2-MePE povećava ekscitatornu neurotransmisiju kao što je mereno elektrofiziološkim snimcima polja ekstracelularnog postsinaptičkog potencijala u korteksu, hipokampusu i cerebelumu. Kao rezultat poboljšane ekscitatorne neurotransmisije (nestajanje uočenog ASD-sličnog deficita neurotransmisije), uočeno je da G-2-MePE poboljšava rezultate kognitivnih i motoričkih testova kognitivne performanse. Stoga, G-2-MePE poboljšava performansu u testovima Morris-ovog vodenog lavirinta i lavirinta sa radijalnim kracima. Kod modela sa socijalnom interakcijom, G-2-MePE, primenjen na ASD mutantne miševe, povećava vreme potrošeno od strane knockout mužjaka u socijalnoj interakciji sa ženkama divljeg tipa. Dodatno, povećana je ultrazvučna vokalizacija sa ženkama divljeg tipa. U modelima u kojima je posmatrana dužina života koja je smanjena kod mutantnih miševa u poređenju sa kontrolama divljeg tipa (kao što je MeCP2 knockout mišji model Rett-ovog sindroma), tretman sa G-2-MePE povećava dužinu života životinja.

[0062] Nađeno je da G-2-MePE inhibira ne-konvulzivne napade (NCS) kod životinja sa hipoksičnim ishemijskim povredama izazvanim sa okluzijom srednje cerebralne arterije (MCaO; U.S. Pat. No. 7,714,020; Lu et al., NNZ-2566, glipromat analog, ublažava nekonvulzivne napade izazvane ishemijom mozga kod pacova, J Cerebral Blood Flow metabolism (2009) 1-9) i inhibira neuroinflamaciju kod životinja sa penetrirajućom balističkom povredom (pTBI; Wei et al., NNZ-2566 treatment inhibits neuroinflammation and pro-inflammatory cytokine expression induced by experimental penetrating ballistic-like brain injury in rats, J. Neuroinflammation (2009) 6:19, 1-10).

[0063] Naši nalazi da je G-2-MePE takođe efikasan u tretiranju Rett-ovog sindroma i ASD, su potpuno neočekivani na osnovu prethodne tehnike. Ovo je stoga što je NCS u MCaO modelu izazvan hipoksijom-ishemijom, a inflamatorna ekspresija citokina kod pTBI modela je izazvana penetrirajućom traumom, pri čemu su obe akutne povrede koje su veoma različite od hroničnih efekata MECP2 ili drugih mutacija na sinaptičko sazrevanje.

[0064] Kako se G-2-MePE odnosi na neurološke mehanizme u osnovi (npr., smanjenu nervnu inflamaciju preko inhibicije oslobađanja inflamatornih citokina), on može obezbediti više od kratkotrajnog rukovanja simptomima. Pre G-2-MePE može poboljšati nervnu funkciju, promovisati migraciju nervnih ćelija, promovisati neurogenezu, promovisati diferencijaciju nervnih stem ćelija, promovisati izrastanje aksona i dendrita, i promovisati sinaptičku transmisiju, čime se olakšavaju teški simptomi ASDs.

Farmakologija i upotreba

[0065] G-2-MePE može imati anti-inflamatorne, anti-apoptotske, anti-nekrotičke i neuroprotektivne efekte. Njegova aktivnost in vivo se može meriti brojem ćelija, specifičnim bojenjem željenih markera, ili postupcima kao što su oni razmatrani u Klempt ND et al: Hypoxia-ischemia induces transforming growth factor β1 mRNA in the infant rat brain. Molecular Brain Research: 13: 93-101. Njegova aktivnost se takođe može meriti in vitro korišćenjem postupaka poznatih u tehnici ili opisanih ovde.

[0066] Stanja koja utiču na funkciju mozga preovlađuju u populacijama starih. Gubitak pamćenja i poremećaj pamćenja su stresni za pogođene pacijente i njhove porodice. Gubitak ili poremećaj pamćenja može biti rezultat normalnog starenja, povrede mozga, neurodegenerativne bolesti i psiholoških ili psihijatrijskih disfunkcija. Stoga je velika korist za pacijente, njihove porodice i društvo da se identifikuju i karakterizuju nova jedinjenja koja poboljšavaju pamćenje i/ili kognitivnu funkciju, i tretiraju ili sprečavaju gubitak ili poremećaj pamćenja.

[0067] Poželjno je proučiti efekte potencijalnih terapeutskih agenasa u životinjskim sistemima. Jedan takav koristan sistem je pacov. Poznato je da sa starenjem, pacovi i druge životinje (uključujući ljude) mogu pokazivati simptome gubitka pamćenja, poremećaja pamćenja i druge kognitivne disfunkcije. Dalje, poznato je da su studije terapeutskih agenasa na pacovima prediktivne za terapeutske efekte kod ljudi. Stoga, studije efekata GPE i G-2-MePE i kognitivne funkcije kod starih pacova su prilično prediktivne za terapeutske efekte tih agenasa kod starih ljudi koji imaju ili su skloni dobijanju deficita u pamćenju ili drugoj kognitivnoj disfunkciji. G-2-MePE takođe mogu poboljšati kognitivnu funkciju i/ili tretirati poremećaje memorije. Aktivnost kognitivnog poboljšanja i teraputska aktivnost in vivo može se meriti standardnim neuropsihološkim ili ponašajnim testovima poznatim stručnjacima. Takvi testovi se mogu izabrati iz širokog opsega dostupnih prethodno opisanih testova, i variraće u zavisnosti od kognitivne funkcije koja se testira i stanja životinje.

[0068] Standardni ponašajni testovi korisni za testiranje kognitivne funkcije kod eksperimentalnih životinja uključuju, ali nisu ograničeni na test Morris-ovog vodenog lavirinta, test pasivnog izbegavanja odgovora, test prepoznavanja novog objekta, test olfaktorne diskriminacije, test u 8-krakom radijalnom lavirintu i test sa T-lavirintom. Ovi testovi se mogu direktno primeniti na studije efekata GPE i G-2-MePE na kognitivnu funkciju kod starih pacova.

[0069] Aktivnost G-2-MePE može se meriti postupcima poznatim u tehnici, i razmatranim u dokumentima citiranim ovde, i postupcima korišćenim za merenje aktivnosti GPE.

[0070] Terapeutski odnos jedinjenja može se odrediti, na primer, poređenjem doze koja daje efikasnu antiinflamatornu, anti-apoptotsku i anti-nekrotičnu aktivnost u pogodnom in vivo modelu kao što je hipoksičnaishemijska povreda (Sirimanne ES, Guan J, Williams CE i Gluckman PD: Two models for determining the mechanisms of damage i repair after hypoxic-ischemic injury in the developing rat brain (Journal of Neuroscience Methods: 55: 7-14, 1994) na pogodnoj životinjskoj vrsti kao što je pacov, sa dozom koja daje značajne uočljive sporedne efekte kod vrste test životinje.

[0071] Terapeutski odnos jedinjenja se takođe može odrediti, na primer poređenjem doze koja daje poboljšanje efikasne kognitivne funkcije ili tretira poremećaj pamćenja u pogodnom in vivo modelu (Primeri 4, 5 i 6 u nastavku) na pogodnoj životinjskoj vrsti kao što je pacov, sa dozom koja daje značajan gubitak težine (ili druge uočljive sporedne efekte) kod vrste test životinje.

[0072] Dodatno, kao što je detaljnije opisano u nastavku, G-2-MePE za upotrebu prema predmetnom pronalasku može biti koristan za tretman Rett-ovog sindroma, uključujući produžavanje života, povećanje nervne aktivnosti i tretiranje napada povezanih sa Rett-ovim sindromom.

[0073] U jednoj studiji Rett-ovog sindroma kod miševa (korišćenjem MeCP2 knock-out modela), nađeno je da GPE ima efekte na produžavanje života i povećanje nervne funkcije (SAD objava br. 2009/0099077). Međutim, kao što je ovde dodatno opisano, GPE, uzimajući u obzir da je peptid koji se javlja u prirodi, rapidno se razgrađuje in vivo i in vitro, i njegova upotreba u hroničnoj terapiji pacijenata sa Rett-ovim sindromom je stoga nejasna.

Farmaceutske kompozicije i primena

[0074] Generalno, G-2-MePE za upotrebu prema ovom pronalasku može se primeniti u terapeutski efikasnim količinama bilo kojim od uobičajenih načina poznatih u tehnici, bilo pojedinačno ili u kombinaciji sa najmanje jednim drguim konvencionalnim terapeutskim agensom za bolest koja se tretira. Terapeutski efikasna količina može široko varirati u zavisnosti od bolesti ili povrede, težine bolesti, starosti i relativnog zdravlja tretirane životinje, potencije jedinjenja (ili više njih), i drugih faktora. Na primer, doze kao što su oko 1 do oko 100 mg/Kg, npr. oko 10 mg/Kg, su odgovarajuće za primenu postupcima kao što je oralna primena. Prosečan stručnjak će biti u stanju da bez nepotrebnog eksperimentisanja, u odnosu na tu sposobnost i ovaj opis, odrediti terapeutski efikasnu količinu jedinjenja predmetnog pronalaska za datu bolest ili povredu.

[0075] Generalno, G-2-MePE za upotrebu prema predmetnom pronalasku može se primeniti kao farmaceutske kompozicije. Kompozicije mogu biti u obliku tableta, pilula, kapsula, polučvrstih supstanci, praškova, formulacija sa produženim dejstvom, rastvora, suspenzija, eliksira, aerosola, rastvorljivih gelova ili bilo kojih drugih odgovarajućih kompozicija; i sadrže G-2-MePE u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ili fiziološki prihvatljivim ekscipijentom. Pogodni ekscipijenti su dobro poznati stručnjacima, i oni, i postupci za formulisanje kompozicija, mogu se naći u takvim standardnim referencama kao što je Gennaro AR: Remington: The Science i Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000. Pogodni tečni nosači uključuju vodu, fiziološki rastvor, vodeni rastvor dekstroze, glikole i slično.

[0076] G-2-MePE za upotrebu prema predmetnom pronalasku primenjen je oralno, na primer u tabletama ili kapsulama. U nekim primerima izvođenja, G-2-MePE se može pripremiti u voda-u-ulju emulzijama u obliku mikroemulzija, grubim emulzijama, tečnim kristalima, ili nanokapsulama (SAD prijava br. 12/283,684, sada SAD prijava br. 7,887,839). Kako G-2-MePE može imati značajnu oralnu bioraspoloživost, može se kao prednost koristiti za pogodnu i hroničnu primenu. Dodatno, oralno dostupne kompozicije uključuju rastvorljive hidrogelove koji sadrže aktivna jedinjenja, čime dozvoljavaju oralnu primenu neuroprotektivnih jedinjenja bez potrebe da pacijent guta tabletu ili kapsulu. Takvi materijali sa sporim oslobađanjem i gelovi su poznati u tehnici.

[0077] G-2-MePE se takođe može pogodno primeniti sistemom sa produženim oslobađanjem ili gel materijalom sa G-2-MePE ugrađenim u njega. Pogodni primeri kompozicija sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne uobličene polimerne matrikse, npr., filmovi, ili mikrokapsule. Matriksi sa produženim dejstvom uključuju polkilaktide (SAD patent br. 3,773,919; EP 58,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamat (Sidman et al., 1983), poli(2-hidroksietil metaksrilat) (Langer et al., 1981), etilen vinil acetat (Langer et al., supra), ili poli-D-(-)-3-hidroksibutenu kiselinu (EP 133,988). Dodatno, mogu se koristiti gel kompozicije zasnovane na polisaharidima (npr., karboksimetil celuloza, karboksietil celuloza, hitozan ili drugi derivati celuloze) i derivati polietilen oksida (npr., polietilen glikoli). Ove gel kompozicije su rastvorljive u vodenim rastvorima, biokompatibilne su, netoksične i stoga se mogu koristiti za primenu na bilo koju mukoznu površinu, uključujući oralnu šupljinu.

[0078] Kompozicije sa produženim dejstvom takođe uključuju lipozomski zarobljeno jedinjenje. Lipozomi koji sadrže jedinjenje su pripremljeni postupcima poznatim per se: DE 3,218,121; Epstein et al., 1985; Hwang et al., 1980; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanska patentna prijava 83-118008; SAD patenti br. 4,485,045 i 4,544,545; i EP 102, 324. Uobičajeno, lipozomi su malog (od ili oko 200800 Angstrema) unilamelarnog tipa u kojima je lipidni sadržaj veći od oko 30 molskih procenata holesterola, gde je izabrani odnos podešen za najefikasniju terapiju.

[0079] G-2-MePE se takođe može vezati za polietilen glikol ("PEGilovan") da bi se povećao njegov život in vivo, na osnovu, npr., tehnologije za konjugate opisane u WO 95/32003.

[0080] Poželjno, ukoliko je moguće, kada su primenjena kao anti-inflamatorni, anti-apoptotski agens, antinekrotični agens, ili anti-neurodegenerativni agens, jedinjenja se mogu primeniti oralno. Količina jedinjenja u takvoj kompoziciji može veoma varirati zavisno od tipa kompozicije, veličine jedinice doze, vrste ekscipijenata, i drugih faktora dobro poznatih stručnjacima. Generalno, finalna kompozicija može sadržati od oko 0.0001 procenta po težini (% tež.) do oko 10% tež. jedinjenja, poželjno oko 0.001% tež. do oko 1% tež., sa ostatkom koji je ekscipijent ili ekscipijenti.

[0081] Kompozicija može sadržati, dodatno jedinjenju predmetnog pronalaska, najmanje jedan agens izabran od, na primer, faktora rasta i povezanih derivata (insulinu-sličan faktor rasta-I (IGF-I), insulinu-sličan faktor rasta-II (IGF-II), transformišući faktor rasta-β1, aktivin, hormon rasta, faktor nervnog rasta, neurotrofički faktor izveden iz mozga (BDNF), protein koji vezuje hormon rasta, IGF-vezujući proteini (naročito IGFBP-3), bazni faktor rasta fibroblasta, kiseli faktor rasta fibroblasta, proizvod hst/Kfgk gena, FGF-3, FGF-4, FGF-6, faktor rasta keratinocita, androgen indukovani faktor rasta. Dodatni članovi FGF familije uključuju, na primer, int-2, homologi faktor-1 faktora rasta fibroblasta (FHF-1), FHF-2, FHF-3 i FHF-4, faktor rasta keratinocita 2, faktor aktivacije glije, FGF-10 i FGF-16, cilijarni neurotrofički faktor, faktor rasta izveden iz mozga, neurotrofin 3, neurotrofin 4, morfogenetski protein kosti 2 (BMP-2), neurotrofni faktor izveden iz glijalne ćelijske linije, neurotrofički faktor zavisan od aktivnosti, citokin leukemija inhibirajući faktor, onkostatin M, interleukin), α-, β-, γ-, ili konsenzus interferon, i TNF-α. Drugi oblici neuroprotektivnih teraputskih agenasa uključuju, na primer, klometiazol; kinurenska kiselina, Semax, takrolimus, L-treo-1-fenil-2-dekanoilamino-3-morfolino-1-propanol, adrenokortikotropin-(4-9) analog [ORG 2766] i dizolcipin (MK-801), selegilin; antagoniste glutamata kao što su mematin (Namenda) NPS1506, GV1505260, MK-801, GV150526; AMPA antagoniste kao što su 2,3-dihidroksi-6-nitro-7-sulfamoilbenzo(f)hinoksalin (NBQX), LY303070 i LY300164; anti-inflamatorne agense usmerene protiv adresin MAdCAM-1 i/ili njegovih integrin α4 receptora (α4β1 i α4β7), kao što je anti-MAdCAM-1mAb MECA-367 (ATCC pristupni br. HB-9478). Takođe može biti korisna kombinovana terapija sa metabotropnim antagonistima glutamat receptora kao što je fenobam. Takođe, dodatno jedinjenju predmetnog pronalaska, kompozicija može uključivati selektivni inhibitor ponovnog preuzimanja serotonina kao što je fluoksetin, selektivni inhibitor ponovnog preuzimanja norepinefrina kao što je viloksazin, ili atipični anti-psihotik kao što je risperidon. Većina ovih agenasa, naročito peptidi kao što su faktori rasta, itd., nisu oralno aktivni, i zahtevaće primenu injekcijom ili infuzijom.

Priprema kompozicija

[0082] Početni materijali i reagensi korišćeni za pripremu G-2-MePE su ili dostupni od komercijalnih dobavljača kao što su Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis.), Bachem (Torrance, Calif.), Sigma (St.Louis, Mo.), ili su pripremljeni postupcima koji su dobro poznati stručnjacima praćenjem procedura opisanih u takvim referencama kao što su Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Sinteza, vols 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989; Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; March J; Advanced Organic Chemistry, 4th ed. John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992; i Larock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989. U većini slučajeva, aminokiseline i njihovi estri ili amidi, i zaštićene aminokiseline, su široko komercijalno dostupni; i priprema modifikovanih aminokiselina i njihovih amida ili estara je detaljno opisana u hemijskoj i biohemijskoj literaturi i stoga je dobro poznata stručnjacima. Na primer, N-pirolidinsirćetna kiselina je opisana u Dega-Szafran Z and Pryzbylak R. Sinteza, IR, i NMR studies of zwitterionic α-(1-pyrrolidine)alkanocarboxylic acids and their N-metil derivatives. J. Mol. Struct.: 436-7, 107-121, 1997; i N-piperidinsirćetna kiselina je opisana u Matsuda O, Ito S, and Sekiya M. Reaction of N-(alkoxymetil)dialkylamines and N,N’-metilenebisdialkylamines with isocyanides. Chem. Pharm. Bull.: 23(1), 219-221, 1975.

[0083] Početni materijali, intermedijeri, i G-2-MePE mogu biti izolovani i prečišćeni korišćenjem konvencionalnih tehnika, uključujući filtraciju, destilaciju, kristalizaciju, hromatografiju i slično. Oni se mogu karakterizovati korišćenjem konvencionalnih postupaka, uključujući fizičke konstante i spektralne podatke.

[0084] G-2-MePE se može pripremiti postupcima opisanim u nastavku i kao što su dati u Primerima.

[0085] Generalno, G-2-MePE se može pripremiti postupcima za sintezu peptida i modifikovanih peptida kao što su već dobro poznati stručnjacima, praćenjem reakcionih šema datih na Sl. 11 koje prate ovu specifikaciju, ili praćenjem drugih postupaka za sintezu peptida i analoga dobro pozantih stručnjacima.

[0086] Pogodno, sintetička proizvodnja G-2-MePE može biti prema sintetičkom postupku čvrste faze opisanom od strane Merrifield et al. Solid phase peptide sinteza. I. The synthesis of a tetrapeptide: J. Amer. Chem. Soc.: 85, 2149-2156, 1963. Ova tehnika je dobro poznata i uobičajeni je postupak za pripremu peptida. Generalni koncept ovog postupka zavisi od vezivanja prve aminokiseline lanca za čvrsti polimer kovalentnom vezom. Sledeće zaštićene aminokiseline su dodate, jedna po jedna (strategija u koracima), ili u blokovima (strategija segmenta), dok se ne sastavi željena sekvenca. Konačno, zaštićeni peptid je uklonjen iz podloge sa čvrstom smolom i zaštitne grupe su isečene. Ovom procedurom, reagensi i sporedni proizvodi su uklonjeni filtracijom, čime se eliminiše neophodnost prečišćavanja intermedijera.

[0087] Aminokiseline se mogu vezati za bilo koji pogodni polimer kao smola. Smola mora sadržati funkcionalnu grupu za koju se prva zaštićena aminokiselina može čvrsto vezati kovalentnom vezom. Različiti polimeri su pogodni za ovu svrhu, kao što je celuloza, polivinil alkohol, polimetilmetakrilat i polistiren. Pogodne smole su komercijalno dostupne i dobro poznate stručnjacima. Odgovarajuće zaštitne grupe koje se mogu koristiti u takvoj sintezi uključuju tercbutiloksikarbonil (BOC), benzil (Bzl), t-amiloksikarbonil (Aoc), tozil (Tos), o-bromofenilmetoksikarbonil (BrZ), 2,6-dihlorobenzil (BzlCl2), i fenilmetoksikarbonil (Z ili CBZ). Dodatne zaštitne grupe su identifikovane u Merrifield, citiranom prethodno, kao i u McOmie JFW: Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973, obe reference izričito uključene ovde u celini.

[0088] Opšte procedure za pripremanje peptida uključuju inicijalno vezivanje karboksil-terminalno zaštićene aminokiseline sa smolom. Nakon vezivanja smola je filtrirana, isprana i zaštitna grupa (poželjno BOC) na I-amino grupi karboksil-terminalne aminokiseline je uklonjena. Uklanjanje ove zaštitne grupe se mora odigrati, naravno, bez prekida veze između te aminokiseline i smole. Sledeća amino, i ukoliko je neophodno, aminokiselina sa zaštićenim bočnim lancem, se zatim kupluje za slobodnu I-amino grupu aminokiseline na smoli. Ovo kuplovanje se odigrava formiranjem amidne veze između slobodne karboksil grupe i aminogrupe prve aminokiseline vezane za smolu. Ovaj redosled događaja se ponavlja sa sukcesivnim aminokiselinama dok se sve aminokiseline ne vežu za smolu. Konačno, zaštićeni peptid je isečen iz smole i zaštitne grupe su uklonjene da bi se oslobodio željeni proizvod. Tehnike isecanja korišćene za razdvajanje peptida od smole i da se uklone zaštitne grupe zavise od izbora smole i zaštitnih grupa i poznate su stručnjacima.

[0089] Alternativne tehnike za sintezu peptida opisane su u Bodanszky et al, Peptide Synthesis, 2nd ed, John Wiley and Sons, New York, 1976. Na primer, G-2-MePE se takođe može sintetisati korišćenjem metodologije sinteze peptida u standardnom rastvoru, uključujući ili u koracima ili blok kuplovanje aminokiselina ili fragmenata peptida korišćenjem hemijskih ili enzimskih postupaka za formiranje amidne veze. (Videti, npr., H. D. Jakubke in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, New York, 1987, p. 103-165; J. D. Glass, ibid., pp. 167-184; i Evropski patent 0324659 A2, koji opisuje postupke za enzimsku sintezu peptida.) Ovi postupci sinteze u rastvoru su dobro poznati u tehnici.

[0090] Komercijalni sintetizatori peptida, kao što je Applied Biosystems Model 430A, dostupni su za izvođenje ovih postupaka.

[0091] Stručnjak neće morati da nepotrebno eksperimentiše, uzimajući u obzir tu veštinu i dostupno znanje, i ovaj opis, da bi razvio jedan ili više pogodnih sintetičkih postupaka za G-2-MePE.

PRIMERI

[0092] Namera je da sledeći primeri ilustruju primere izvođenja predmetnog pronalaska.

Primer 1: Sinteza of Glicil-L-2-Metil-L-Prolil-L-Glutamata (G-2-MePE)

Glicil-L-2-Metilprolil-L-glutaminska kiselina (G-2MePE)

Šema 1 Reagensi, uslovi i prinosi: (i) SOCl2, MeOH, 79°C, N2, 24 č (104%); (ii) Et3N, DCC, CH2Cl2, 0°C do RT, N2, 20 č; (iii) 1 M vod. NaOH, 1,4-dioksan, 19 č (60%, 2 koraka); (iv) Et3N, BoPCl, CH2Cl2, RT, N2, 17 č (89%); (v) H2, 10% Pd/C, 91:9 MeOH-H2O, RT, 23 č (86%).

[0094] L-2-Metilprolin i L-glutaminska kiselina dibenzil estar p-toluensulfonat su kupljeni od Bachem, N-benziloksikarbonil-glicin od Acros Organics i bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfinski hlorid (BoPCl, 97%) od Aldrich Chem. Co.

Metil L-2-metilprolinat hidrohlorid 2

[0095] Tionil hlorid (5.84 cm<3>, 80.1 mmol) je pažljivo dodat u kapima mešanom rastvoru (L)-2-metilprolina 1 (0.43 g, 3.33 mmol) u anhidrovanom metanolu (30 cm<3>) na -5 °C pod atmosferom azota. Reakciona smeša je mešana pod refluksom 24 č, i rezultujući bledo žuto obojeni rastvor je koncentrovan do sušenja in vacuo. Ostatak je rastvoren u 1:1 smeši metanola i toluena (30 cm<3>) zatim koncentrovan do sušenja da bi se uklonio rezidualni tionil hlorid. Ova procedura je ponovljena još dva puta, dajući hidrohlorid 2 (0.62 g, 104%) kao higroskopsku, spektroskopski čistu, prljavo belu čvrstu supstancu: mp 127-131 °C; [α]D-59.8 (c 0.24 in CH2Cl2); νmax(film)/cm<-1>3579, 3398 br, 2885, 2717, 2681, 2623, 2507, 1743, 1584, 1447, 1432, 1374, 1317, 1294, 1237, 1212, 1172, 1123, 981, 894, 861 i 764; δH(300 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.88 (3H, s, Proα-CH3), 1.70-2.30 (3H, br m, Proβ-HAHBi Proγ-H2), 2.30-2.60 (1H, br m, Proβ-HAHB), 3.40-3.84 (2H, br m, Proδ-H2), 3.87 (3H, s, CO2CH3), 9.43 (1H, br s, NH) i 10.49 (1H, br s, HCl); δC(75 MHz; CDCl3) 21.1 (CH3, Proα-CH3), 22.4 (CH2, Proγ-C), 35.6 (CH2, Proβ-C), 45.2 (CH2, Proδ-C), 53.7 (CH3, CO2CH3), 68.4 (kvat., Proa-C) i 170.7 (kvat., CO); m/z (FAB+) 323.1745 [M2.H<35>Cl.H<+>: (C7H13NO2)2. H<35>Cl.H zahteva 323.1738] i 325.1718 [M2.H<37>Cl.H<+>: (C7H13NO2)2. H<37>Cl.H zahteva 325.1708].

N-Benziloksikarbonil-glicil-L-2-metilprolin 5

[0096] Anhidrovani trietilamin (0.45 cm<3>, 3.23 mmol) je dodat u kapima smeši metil L-2-metilprolinat hidrohlorida 2 (0.42 g, 2.34 mmol) i N-benziloksikarbonil-glicina (98.5%) 3 (0.52 g, 2.45 mmol) u metilen hloridu (16 cm<3>), na 0 °C, pod atmosferom azota. Rezultujući rastvor je mešan 20 min i rastvor 1,3-dicikloheksilkarbodiimida (0.56 g, 2.71 mmol) u metilen hloridu (8 cm<3>) na 0 °C je dodat u kapima i reakciona smeša je zagrevana do sobne temperature i mešana dodatnih 20 č. Rezultujuća bela smeša je filtrirana kroz jastučić Celite™ da bi se delimično uklonila 1,3-dicikloheksilurea, i jastučić je ispran sa metilen hloridom (50 cm<3>). Filtrat je ispran sukcesivno sa 10% vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (50 cm<3>) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (50 cm<3>), osušen (MgSO4) filtriran, i koncentrovan do sušenja in vacuo. Dodatno prečišćavanje ostatka sa „flash“ hromatografijom na koloni (35 g SiO2; 30-70% etil acetat – heksan; gradijent eluiranja) dalo je uslovno metil N-benziloksikarbonil-glicil-L-2-metilprolinat 4 (0.56 g), koji sadrži 1,3-dicikloheksilureu, kao belu polu-čvrstu supstancu: Rf0.65 (EtOAc); m/z (EI+) 334.1534 (M<+>. C17H22N2O5zahteva 334.1529) i 224 (1,3-dicikloheksilurea).

[0097] Rastvoru prolinata sa nečistoćama 4 (0.56 g, ca. 1.67 mmol) u 1,4-dioksanu (33 cm<3>) u kapima je dodat 1M vodeni rastvor natrijum hidroksida (10 cm<3>, 10 mmol) i smeša je mešana 19 č na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat metilen hlorid (100 cm<3>) i organski sloj je ekstrahovan sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (2 X 100 cm<3>). Kombinovani vodeni slojevi su pažljivo acidifikovani sa hlorovodoničnom kiselinom (32%), ekstrahvoani sa metilen hloridom (2 X 100 cm3), i kombinovani organski slojevi su osušeni (MgSO4) filtrirani, i koncentrovani do sušenja in vacuo. Prečišćavanje rezultujućeg ostatka (0.47 g) sa „flash“ hromatografijom na koloni (17 g SiO2; 50% etil acetat – heksan do 30% metanol – dihlorometan; gradijent eluiranja) dalo je N-zaštićeni dipeptid 5 (0.45 g, 60%) kao bela pena u dva koraka od hidrohlorida 2. Pokazano je da dipeptid 5 isključivo transorijentisani konformer sa NMR analizom: Rf0.50 (20% MeOH - CH2Cl2); [α]D-62.3 (c 0.20 u CH2Cl2); νmax(film)/cm<-1>3583, 3324 br, 2980, 2942, 1722, 1649, 1529, 1454, 1432, 1373, 1337, 1251, 1219, 1179, 1053, 1027, 965, 912, 735 i 698; δH(300 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.59 (3H, s, Proα-CH3), 1.89 (1H, 6 linija, J 18.8, 6.2 i 6.2, Proβ-HAHB), 2.01 (2H, dtt, J 18.7, 6.2 i 6.2, Proγ-H2), 2.25-2.40 (1H, m, Proβ-HAHB), 3.54 (2H, t, J 6.6, Proδ-H2), 3.89 (1H, dd, J 17.1 i 3.9, Glyα-HAHB), 4.04 (1H, dd, J 17.2 i 5.3, Glyα-HAHB), 5.11 (2H, s, OCH2Ph), 5.84 (1H, br t, J 4.2, N-H), 7.22-7.43 (5H, m, Ph) i 7.89 (1H, br s, -COOH); δC(75 MHz; CDCl3) 21.3 (CH3, Proα-CH3), 23.8 (CH2, Proy-C), 38.2 (CH2, Proβ-C), 43.6 (CH2, Glyα-C), 47.2 (CH2, Proδ-C), 66.7 (kvat., Proα-C), 66.8 (CH2, OCH2Ph), 127.9 (CH, Ph), 127.9 (CH, Ph), 128.4, (CH, Ph), 136.4 (kvat., Ph), 156.4 (kvat., NCO2), 167.5 (kvat., Gly-CON) i 176.7 (kvat., CO); m/z (EI+) 320.1368 (M<+>.C16H20N2O5zahteva 320.1372).

Dibenzil N-benziloksikarbonil-glicil-L-2-metilprolil-L-glutamat 7

[0098] Trietilamin (0.50 cm3, 3.59 mmol) je u kapima dodat rastvoru dipeptida 5 (0.36 g, 1.12 mmol) i ptoluensulfonat dibenzil estar L-glutaminska kiseline 6 (0.73 g, 1.46 mmol) u metilen hloridu (60 cm3) pod azotom na sobnoj temperaturi, i reakciona smeša je mešana 10 min. Bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfinski hlorid (BoPCl, 97%) (0.37 g, 1.41 mmol) je dodat i bezbojni rastvor je mešan 17 č. Rastvor metilen hlorida je sukcesivno ispran sa 10% vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (50 cm<3>) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (50 cm<3>), osušen (MgSO4), filtriran, i uparen do sušenja in vacuo. Prečišćavanje rezultujućeg ostatka ponovljenom (2x) „flash“ hromatografijom na koloni (24 g SiO2; 30-70% etil acetat - heksan; eluiranje gradijentom) dalo je potpuno zaštićeni tripeptid 7 (0.63 g, 89%) kao bezbojno ulje. Pokazano je da je tripeptid 7 isključivo transorijentisani konformer sa NMR analizom: Rf0.55 (EtOAc); [α]D-41.9 (c 0.29 in CH2Cl2); νmax(film)/cm<1>3583, 3353 br, 2950, 1734, 1660, 1521, 1499, 1454, 1429, 1257, 1214, 1188, 1166, 1051, 911, 737 i 697; δH(400 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.64 (3H, s, Proα-CH3), 1.72 (1H, dt, J 12.8, 7.6 i 7.6, Proβ-HAHB), 1.92 (2H, 5 linija, J 6.7, Proγ-H2), 2.04 (1H, 6 linija, J 7.3 Gluβ-HAHB), 2.17-2.27 (1H, m, Gluβ-HAHB), 2.35-2.51 (3H, m, Proβ-HAHBi Gluγ-H2), 3.37-3.57 (2H, m, Proδ-H2), 3.90 (1H, dd, J 17.0 i 3.6, Glyα-HAHB), 4.00 (1H, dd, J 17.1 i 5.1, Glyα-HAHB), 4.56 (1H, td, J 7.7 i 4.9, Gluα-H), 5.05-5.20 (6H, m, 3 x OCH2Ph), 5.66-5.72 (1H, br m, Gly-NH), 7.26-7.37 (15H, m, 3 3 Ph) i 7.44 (1H, d, J 7.2, Glu-NH); δC(100 MHz; CDCl3) 21.9 (CH3, Proα-CH3), 23.4 (CH2, Proγ-C), 26.6 (CH2, Gluβ-C), 30.1 (CH2, Gluγ-C), 38.3 (CH2, Proβ-C), 43.9 (CH2, Glyα-C), 47.6 (CH2, Proδ-C), 52.2 (CH, Gluα-C), 66.4 (CH2, OCH2Ph), 66.8 (CH2, OCH2Ph), 67.1 (CH2, OCH2Ph), 68.2 (kvat., Proα-C), 127.9 (CH, Ph), 128.0 (CH, Ph), 128.1, (CH, Ph), 128.2, (CH, Ph), 128.2, (CH, Ph), 128.3, (CH, Ph), 128.4, (CH, Ph), 128.5, (CH, Ph), 128.5, (CH, Ph), 135.2 (kvat., Ph), 135.7 (kvat., Ph), 136.4 (kvat., Ph), 156.1 (kvat., NCO2), 167.3 (kvat., Gly-CO), 171.4 (kvat., CO), 172.9 (kvat., CO) i 173.4 (kvat., CO); m/z (FAB+) 630.2809 (MH+. C35H40N3O8zahteva 630.2815).

Glicil-L-2-metilprolil-L-glutaminska kiselina (G-2-MePE)

[0099] Smeša zaštićenog tripeptida 7 (0.63 g, 1.00 mmol) i 10 tež. % paladijuma na aktiviranom ugljeniku (0.32 g, 0.30 mmol) u 91:9 metanol – voda (22 cm<3>) je mešana pod atmosferom vodonika na sobnoj temperaturi, zaštićeno od svetlosti, 23 č. Reakciona smeša je filtrirana kroz jastučić Celite™ i jastučić je ispran sa 75:25 metanol – voda (200 cm<3>). Filtrat je koncentrovan do sušenja pod sniženim pritiskom i ostatak je triturisan sa anhidrovanim dietil etrom da bi se dobila 38:1 smeša G-2-MePE i uslovno metilamin 8 (0.27 g, 86%) kao ekstremno higroskopna bela čvrsta supstanca. Analitičke studije reverzno-fazne HPLC na smeši [Altech Econosphere C18 Si kolona, 15034.6 mm, 5 | m; 5 min ispiranje sa H2O (0.05% TFA) zatim stabilni gradijent tokom 25 min do MeCN kao eluenta na stopi protoka od 1 ml/min; detekcija korišćenjem diodnog niza] odredile su da je to bila smeša 38:1 dva eluciona pika sa retencionim vremenima od 13.64 i 14.44 min na 207 i 197 nm, respektivno. Pokazano je da je G-2-MePE 73:27 trans:cis smeša konformera sa<1>H NMR analizom (odnos je procenjen iz relativnih intenziteta duplog dubleta i tripleta na δ 4.18 i 3.71, dodeljenim Gluα-H protonima glavnih i minornih konformera, respektivno): mp 144 °C<φ>;

[α]D-52.4 (c 0.19 u H2O); δH(300 MHz; D2O; interni MeOH) 1.52 (3H, s, Proα-CH3), 1.81-2.21 (6H, m, Proβ-H2, Proγ-H2i Gluβ-H2), 2.34 (1.46H, t, J 7.2, Gluγ-H2), 2.42* (0.54H, t, J 7.3, Gluγ-H2), 3.50-3.66 (2H, m, Proδ-H2), 3.71* (0.27H, t, J 6.2, Gluα-H), 3.85 (1H, d, J 16.6, Glyα-HAHB), 3.92 (1H, d, J 16.6, Glyα-HAHB) i 4.18 (0.73H, dd, J 8.4 i 4.7, Gluα-H); δC(75 MHz; D2O; interni MeOH) 21.8 (CH3, Proα-CH3), 25.0 (CH2, Proy-C), 27.8* (CH2, Gluβ-C), 28.8 (CH2, Gluβ-C), 32.9 (CH2, Gluγ-C), 40.8 (CH2, Proβ-C), 42.7 (CH2, Glyα-C), 49.5 (CH2, Proδ-C), 56.0* (CH, Gluα-C), 56.4 (CH, Gluα-C), 69.8 (kvat., Proα-C), 166.5 (kvat., Gly-CO), 177.3 (kvat., Pro-CON), 179.2 (kvat., Gluα-CO), 180.2* (kvat., Gluγ-CO) i 180.6 (kvat., Gluγ-CO); m/z (FAB+) 316.1508 (MH+. C13H22N3O6zahteva 316.1509).

Primer 2: In Vitro neuroprotekcija

[0100] Terapeutski efekti GPE analoga su istraživani u seriji eksperimenata in vitro da bi se odredili njhovi efekti na neurodegeneraciju nervnih ćelija različitog porekla. In vitro sistemi opisani ovde su dobro ustanovljeni u tehnici i pozanto je da su prediktivni za neuroprotektivne efekte uočene in vivo, uključujući efekte kod ljudi koji boluju od neurodegenerativnih poremećaja.

Materijal i metode

[0101] Sledeći eksperimentalni protokol pratio je uputstva odobrena od strane University of Auckland Animal Ethics Committee.

Priprema kultura kortikalnih astrocita za prikupljanje metabolisanog supernatanta ćelijske kulture

[0102] Korišćena je jedna kortikalna hemisfera od pacova postnatalnog dana 1 i sakupljena u 4ml DMEM. Trituracija je izvedena korišćenjem 5ml staklene pipete i iglom veličine 18. Suspenzija ćelija je prosejana kroz 100µm aparat za bojenje ćelija i ispran u 50 ml DMEM (centrifugiranje 5 min na 250g). Sediment je resuspendovan u 20ml DMEM+10% fetalnog telećeg seruma. Suspenzija je dodata u dve 25cm<3>bočice (10 ml po bočici) i kultivisana na 37°C u prisustvu 10% CO2praćeno sa promenom medijuma dva puta nedeljno. Kada su ćelije dostigle konfluencu, isprane su tri puta sa PBS, podešene do Neurobasal/B27 i inkubirane još 3 dana. Ovaj supernatant je zamrznut za privremeno skladištenje na -80°C.

Priprema tkiva strijatuma i kortikalnog tkiva od embriona pacova E18/E19

[0103] Skotne ženke su žrtvovane tretmanom sa CO2, i zatim su pripremljene za carski rez. Nakon operacije, embrioni su uklonjeni iz njihovih amnionskih kesa i dekapitovani. Glave su stavljene na led u DMEM/F12 medijumu za strijatum i PBS 0.65% D(+)- glukoza za korteks.

Procedura ekstrakcije tkiva strijatuma i priprema ćelija

[0104] Ceo mozak je uklonjen iz lobanje sa centralnom stranom postavljenom nagore u DMEM/F12 medijumu. Strijatum je disekovan iz obe hemisfere pod stereomiikroskopom i tkivo strijatuma je stavljeno u Falcon epruvetu na ledu. Tkivo strijatuma je zatim triturisano korišćenjem P1000 pipetora u 1 ml zapremine. Tkivo je triturisano nežnim pipetiranjem rastvora gore i dole u vrhu pipete oko 15 puta, korišćenjem sile smicanja na naizmeničnim tokovima. Delovi tkiva pali su na dno Falcon epruvete unutar 30 sekundi. Supernatant koji sadrži suspenziju disociranih pojedinačnih ćelija je zatim prenet u novu sterilnu Falcon epruvetu na ledu. Delovi tkiva su ponovo triturisani da bi se izbeglo prekomerno oštećenje već disociranih ćelija, sa njihovim prekomernim triturisanjem. Delovima tkiva u prvoj epruveti dodat je 1 mililitar ledeno hladnog DMEM/F12 medijuma i triturisano kao ranije. Dozvoljeno je da se delovi tkiva istalože i supernatant je uklonjen u novu sterilnu Falcon epruvetu na ledu. Ćelije su centrifugirane na 250g 5 minuta na 4°C.

Postavljanje na ploče i kultivacija ćelija strijatuma

[0105] Ćelije strijatuma su postavljene na ploče u Poly-L-Lysine (0.1mg/ml obložene 96-komorne ploče (samo 60 unutrašnjih komorica) sa gustinom od 200,000 ćelija/cm<2>u Neurobasal/B27 medijumu (Invitrogen). Ćelije su kultivisane u prisustvu 5% CO2na 37°C pod 100% vlažnošću. Medijum je menjan na dane 1, 3 i 6.

Procedura ekstrakcije kortikalnog tkiva i pripremanje ćelija

[0106] Dve kortikalne hemisfere su pažljivo uklonjene spatulom iz celog mozga sa ventralnom stranom okrenutom na gore u petri šolji koja sadrži PBS 0.65%D(+)- glukoze. Forceps jhe stavljen u rostralni deo (blizu B.

olfactorius) korteksa da bi se fiksiralo tkivo i načinjena su dva lateralno-sagitalna reza da bi se uklonili piriformni i entorinalni korteksi. Načinjen je frontalno orijentisani rez na posteriornom kraju da bi se ulonila hipokampalna formacija. Finalni frontalni rez je napravljen nekoliko milimetara dalje od poslednjeg reza da bi se uhvatila oblast 17/18 vizuelnog korteksa.

[0107] Korteksi su stavljeni na led u PBS+0.65%(+)- glukoza i centrifugirani na 350g 5 minuta. Supernatant je uklonjen i dodat je tripsin/EDTA (0.05%/0.53mM) 8min na 37°C. reakcija je zaustavljena dodavanjem jednake količine DMEM i 10% fetalnog telećeg seruma. Supernatant je uklonjen centrifugiranjem praćenim sa dva naknadna ispiranja u Neurobasal/B27 medijumu.

[0108] Ćelije su triturisane jednom sa staklenom Pasterovom pipetom u 1 ml Neurobasal/B27 medijuma i naknadno dva puta korišćenjem 1 ml insulinskog šprica sa iglom veličine 22. Ćelijska suspenzija je propuštena kroz 100 µm aparat za ćelijsko bojenje i isprano sa 1ml Neurobasal/B27 medijuma. Ćelije su izbrojane i podešene do 50,000 ćelija po 60 µl.

Postavljanje na ploče i kultivacija kortikalnih ćelija

[0109] 96-komorne ploče su obložene sa 0.2mg/ml Poly-L-Lysine i naknadno obležene sa 2µg/ml laminina u PBS, nakon čega je svakoj komorici dodato 60 µl medijuma kondicioniranog za kortikalne astrocite. Nakon toga, dodato je 60 µl suspenzije kortikalnih ćelija. Ćelije su kultivisane u prisustvu 10% CO2na 37°C pod 100% vlažnosti. Na dan 1, medijum je kompletno zamenjen (1:1 - Neurobasal/B27 i medijum kondicioniran za astrocite) sa dodavanjem 1 µM citozin-β-D-arabino-furanozida (inhibitor mitoze). Na dane 2 i 5, 2/3 medijuma je zamenjeno.

Cerebelarni mikroeksplanti iz P8 životinja: priprema, kultivacija i fiksacija

[0110] Laminirani cerebelarni korteksi dve hemisfere su eksplantirani iz P8 pacova, isečeni u male delove u PBS 0.65% D(+) glukoza rastvoru i triturisani sa iglom veličine 23 i nakon toga istisnuti kroz sito sa veličinom pore od 125μm. Dobijeni mikroeksplanti su centrifugirani (60g) dva puta (zamena medijuma) u STARTV-medijum bez seruma sa dodatkom BSA (Biochrom). za kultivaciju, 40μl ćelijske suspenzije je adhezijom postavljeno 3 časa na 0.1mg/ml Poly-L-Lysine obloženo pokrovno staklo postavljeno u 6-komorne ploče veličine 35 mm u prisustvu 5% CO2pod 100% vlažnošću na 34°C. nakon toga, dodat je 1 ml STARTV-medium zajedno sa toksinima i lekovima. Kulture su praćene (procenjivane) nakon 2-3 dana kultivacije u prisustvu 5% CO2pod 100% vlažnošću. Za analizu brojanja ćelija, kulture su fiksirane u rastućim koncentracijama paraformaldehida (0.4%, 1.2%, 3% i 4% u toku 3 min svaka) praćeno sa ispiranjem u PBS.

Primena toksina i leka na nervne ćelije In Vitro i analiza podataka

[0111] Da bi se proučavali neuroprotektivni efekti GPE analoga, izveli smo seriju eksperimenata in vitro korišćenjem okadainske kiseline da bi se izazvala toksična povreda nervnih ćelija. Okadainska kiselina je toksin prepoznat u tehnici za koji je poznato da izaziva povrede neurona. Dodatno, rekuperacija nervnih ćelija ili funkcije nervnih ćelija nakon povrede sa okadainskom ćelijom je prepoznata kao prediktivna za oporavak od povreda izazvanih drugim toksinima.

[0112] Da bi se izazvala toksična povrda neurona, izložili smo neurone 1:100 delova okadainske kiseline sa koncentracijama od 30nM ili 100nM i 0.5mM 3-nitropropionske kiseline (samo za cerebelarne mikroeksplante).

GPE (1nM-1mM) ili G-2-MePE (1nM-1mM) je korišćen na 8 dana in vitro (DIV) za koritkalne kulture i 9DIV za kulture strijatuma. Vreme inkubacije bilo je 24 časa. Stopa preživljavanja je određena kolorimetrijskom krajnjom tačkom MTT-analize na 595 nm u multi-komornom čitaču ploča. Za cerebelarne mikroeksplante izabrana su četiri prozora (oblast od 0.65 mm<2>) sa najvećom ćelijskom gustinom i izbrojane su ćelije koje prikazuju izrastanje neurona.

Rezultati

[0113] GPE analog G-2-MePE pokazao je uporedive neuroprotektivne efekte u okviru sva tri testirana in vitro sistema (Sl.12-15).

[0114] Kortikularne strukture su odgovorile na 10mM koncentracije GPE (Sl. 12) ili G-2-MePE (10mM, Sl. 13) sa 64% i 59% neuroprotekcije, respektivno.

[0115] Druga 2 tipa kultura pokazala su neuroprotekciju na nižim dozama G-2-MePE (cerebelarni mikroeksplanti:

Sl. 14 i ćelije strijatuma: Sl.15). Ćelije strijatuma su pokazale neuroprotekciju unutar opsega od 1nM do 1mM G-2-MePE (Sl.15), dok su postnatalni cerebelarni mikroeksplanti pokazali neuroprotekciju sa G-2-MePE u opsegu doze između oko 1nM i oko 100nM (Sl. 14). Stoga, zaključujemo da je G-2-MePE neuroprotektivni agens i može imati teraputske efekte kod ljudi koji boluju od neurodegenerativnih poremećaja. Kako G-2-MePE može biti neuroprotektivan kada se direktno primeni na neurone u kulturi, taj G-2-MePE može biti efikasan in vivo kada je direktno primenjen na mozak pogođenih životinja.

Referentni Primer 3: Efekti G-2-MePE na holinergičke neurone strijatuma kod starih pacova

[0116] Da bi se odredilo da li G-2-MePE može uticati na holinergičke neurone, proučavali smo stare pacove. Holin acetiltransferaza (ChAT) je enzim koji je uključen u biosintezu neurotransmitera za holinergičke nerve, acetilholin. Dobro je poznato da se imunodetekcija ChAT može korisiti za određivanje broja holinergičkih nerava prisutnih u tkivu. Takođe je poznato da je broj prisutnih holinergičkih nerava povezan sa fiziološkom funkcijom holinergičkih nervnih puteva u mozgu.

[0117] U ovom eksperimentu, testirali smo efekte G-2-MePE na broj ChAT-pozitivnih neurona u mozgovima pacova starih 18-meseci.

Postupci

[0118] Mužjaci pacova stari osamnaest meseci primili su jedan od pet tretmana. Kontrolna grupa je tretirana sa vehikulumom (samo fiziološki rastvor (n=4) i četiri grupe su tretirane sa jednom dozom G-2-MePE. Doze od 0.012 (n=4), 0.12 (n=5), 1.2 (In=5) i 12 mg/kg (n=3), respektivno, date su potkožno. Pacovi su žrtvovani sa prekomernom dozom pentobarbitala 3 dana nakon tretmana lekom. Izvršena je perfuzija mozgova sa normalnim fiziološkim rastvorom i 4% paraformaldehida i fiksirani su u perfuzionom fiksativu preko noći. Mozgovi su uskladišteni u 25% saharoze u 0.1M PBS (pH7.4) dok tkiva nisu potonula. Zamrznuti koronalni preseci strijatuma isečeni su sa mikrotomom i uskladišteni u 0.1% natrijum azidu u 0.1M PBS na 4°C. Imunoreaktivnost za holin acetiltransferazu (ChAT) je ustanovljena sa bojenjem korišćenjem postupka plutajućeg preseka. Ukratko, antitela su razblažena u 1% kozjem serumu. Preseci su inkubirani u 0.2% triton u 0.1M PBS/Triton™ na 4°C preko noći pre imunohistohemijskog bojenja. Preseci su prethodno tretirani sa 1% H2O2u 50% metanolu 20 min. Preseci su zatim inkubirani sa zečjim (Rb) anti-ChAT (1:5000) antitelima (primarna antitela) u 4D na šejkeru dva dana. Preseci su isprani korišćenjem PBS/Triton™ (15 minuta x 3d) i zatim inkubirani sa kozjim anti-zečjim biotinilovanim sekundarnim antitelima (1:1000) na sobnoj temperaturi preko noći. Preseci su isprani i inkubirani u ExtrAvidin™ (Sigma) (1:1000) 3 časa i nakon toga u H2O2(0.01%) u 3,3-diaminobenzin tetrahidrohloridu (DAB, 0.05%) da bi se proizveo obojeni reakcioni proizvod. Ovi preseci su postavljeni na hrom alum-obložene pločice, osušeni, dehidrirani i pokriveni.

[0119] Neuroni strijatuma u obe hemisfere koji pokazuju specifične imunoreaktivnosti koje odgovaraju ChAT izbrojani su korišćenjem svetlosnog mikroskopa i 1 mm 2x1000 mreže. Veličina regiona strijatuma korišćena za brojanje je merena korišćenjem analizatora slike. Ukupan broj neurona/mm<2>poređen je između grupa.

[0120] Podaci su analizirani korišćenjem t-testa za zavisne uzorke i predstavljeni kao srednja vrednost /- SEM. Rezultati su prikazani na Sl.16.

Rezultati

[0121] Sl. 16A pokazuje da se broj ChAT-imunopozitivnih neurona povećao u mozgovima životinja tretiranim sa G-2-MePE. Ovo jasno ukazuje da je primena G-2-MePE efikasna u povećavanju nivoa ChAT u mozgovima starih pacova. Kako je ChAT enzim uključen u sintezu holinergičkog neurotransmitera acetilholina, zaključujemo da G-2-MePE može povećati količinu holinergičkih transmitera u mozgovima sredovečnih pacova.

Referentni Primer 4: Efekti G-2-MePE na prostorno referentno pamćenje kod pacova

[0122] Kako smo pokazali da G-2-MePE može povećati ChAT i stoga ima potencijal da poboljša holinergičku nervnu funkciju, zatim smo proučavali da li G-2-MePE može biti koristan u tretmanu promena u kognitivnim funkcijama i/ili pamćenju povezanim sa starenjem. Stoga, izveli smo seriju studija na pacovima korišćenjem dobro ustanovljenih testova za pamćenje.

Eksperiment 1: Morris-ov test sa vodenim lavirintom

[0123] Morris-ov test sa vodenim lavirintom je dobro prepoznat test da se proceni prostorno referentno pamćenje kod pacova.

Subjekti

[0124] Koristili smo mužjake Wistar pacova stare 12, 8 ili 4 meseca.

Metodi

Okruženje i aparat za test

[0125] Morris-ov test sa vodenim lavirintom je izveden korišćenjem crnog plastičnog bazena napunjenog do dubine od 25 cm sa vodom obojenom crno sa netoksičnom bojom. Bazen je imao kružni crni umetak tako da su zidovi takođe izgledali uniformno crno. bazen je podeljen na četiri kvadranta (sever, jug, istok i zapad) sa dve imaginarne normalne linije koje presecaju centar bazena. Metalna platforma je postavljena u geografski centar SE kvadranta 50cm od ivice bazena, tako da je bila 2cm ispod površine vode i nevidljiva. Platforma je ostala u toj poziciji tokom treninga.

[0126] Eksperiment je koristio signale van bazena (tj. objekti u sobi koja okružuje bazen) koje pacovi mogu da koriste za navigaciju do platforme. Prepoznatljivi postori ili slike su zakačeni na zidove. Nameštaj u sobi nije pomeran tokom perioda testiranja. Položaj bazena je omogućavao eksperimentatoru lak pristup bazenu sa svih strana. Bazen je pražnjen i ponovo punjen dnevno tokom testiranja, sa vodom na 25°C /- 2°C.

[0127] Najdalja tačka u bazenu (u odnosu na položaj eksperimentatora) označena je kao "sever", i druge tačke kompasa "istok", "jug" i "zapad" bile su najviše desno, dole i najviše levo tačke bazena respektivno. Ove tačke su obeležene sa trakom na spoljašnjosti bazena.

Faza akvizicije

[0128] Pacovi u svakoj grupi su trenirani da plivaju do potopljene platforme. Pacovi su imali šest testova od 60 sekundi dnevno četiri uzastopna dana. Test je počeo postavljanjem u vodu okrenutim ka zidu bazena, na jednu od četiri početne lokacije (sever, jug, istok, zapad). Sekvenca početnih lokacija je izabrana pseudorandomizovano, tako da je početna lokacija bilo kog datog testa bila različita od one kod prethodnog testa, i nijedna početna lokacija nije korišćena više od dva puta tokom dnevnog treninga. Ista sekvenca lokacija je korišćena za sve pacove na dati dan, ali je menjana između dana. Test se završavao kada je pacov pronašao platformu, ili za 60 sekundi, šta god se prvo dogodilo. Testovi su mereni štopericom. Ukoliko je pacov pronašao platformu, dozvoljeno mu je da tu ostane 15 sekundi pre nego što je uklonjen u spremnik. Ukoliko platforma nije nađena, pacov je vođen do tamo manuelno i postavljen na platformu 15-sekundi. Interval između testova bio je 60 sekundi. Spremnik je pokriven da bi se minimizovala bilo kakva interferencija između testova. Po završertku dnevnog testiranja za pacova, životinja je osušena peškirom i postavljena pod lampu za zagrevanje u kofi do sušenja krzna. Vreme potrebno da se locira platforma (latencija, sekunde) dobijena je za svakog pacova u svakom testu treninga. Ukoliko pacov nije našao platformu u datom testu njihov rezultat latencije bio je maksimalne dužine tog testa (60 sekundi).

Tretman sa lekom

[0129] Tri dana nakon završetka faze akvizicije, mini-osmotske pumpe (Alzet) su implantirane potkožno pod anestezijom halotanom) da bi se lek ili vehikulum ispuštao kontinuirano 1 ili 3 nedelje. Nakon završetka infuzije pumpe su uklonjene i rane su ponovo zašivene.

[0130] 5 grupa za tretman su bile:

1. fiziološki rastvor 1 nedelja (n je originalno bio 7, ali je jedan pacov koji je rapidno gubio težinu isključen i kasnije je pronađeno da ima tumor na hipofizi);

2. fiziološki rastvor 3 nedelje (n=8);

3. G-2-MePE niska doza (0.96 mg/dan) 1 nedelja (n=8);

4. G-2-MePE niska doza (0.96 mg/dan) 3 nedelje (n=8);

5. G-2-MePE visoka doza (4.8 mg/dan) 3 nedelje (n=7).

[0131] Četiri (n=3) i osam meseci stari (n=9) kontrolni pacovi nisu dobili tretman lekom. Pacovi stari 12-meseci su dodeljeni jednoj od pet grupa na osnovu njihovog vremena plivanja naspram akvizicije, tako da su grupe bile približno ekvivalentne u njihovoj srednjoj vrednosti performanse pre primanja bilo kakvog leka.

Retenciona (referentno pamćenje) faza

[0132] Sposobnost pacova da zapamte ili ponovo nauče originalnu lokaciju platforme testirana je četiri nedelje nakon originalnog treninga. To znači da bi rezidualni lek bio ispran minimum 7 dana u slučaju 3-nedeljnih pumpi, i 21 dan u slučaju 1-nedeljnih pumpi. Procedura testiranja retencije bila je identična onoj kod akvizicije. Farmakokinetičke studije ukazuju da je koncentracija u plazmi potkožno primenjenog G-2-MePE podignuta do vrha i zatim smanjena sa približnim obrascem prvog kinetičkog reda, sa polu-životom u plazmi (t 1⁄2) od između oko 30 i 60 minuta. Stoga, do vremena kada je izvedena studija retencije, najmanje 7 dana nakon uklanjanja pumpi sa G-2-MePE, skoro sav G-2-MePE je iizbačen iz cirkulacije životinje.

Analiza podataka

[0133] Latencija plivanja za svakog pacova je registrovana za svaki test za svaki dan akvizicione i retencione faze i promene između faza su ispitivane korišćenjem analize varijanse.

[0134] 3-nedeljni vehikulum i 3-nedeljna visoka doza G-2-MePE su upoređeni za akviziciju i retenciju. Visoka doza G-2-MePE, data tokom 3 nedelje poboljšala je retenciju originalnog testa sa vodenim lavirintom nakon 4-nedeljnog odlaganja.

Rezultati

[0135] Sl. 17 prikazuje poređenje između starih pacova tretiranih sa visokom dozom (4.8 mg/dan) G-2-MePE i niskom dozom (0.96 mg/dan) i starih pacova tretiranih sa fiziološkim rastvorom, sa mladim kontrolama (4 meseca) korišćenim kao kontrole. Pre tretmana sa G-2-MePE, nije bilo razlike između startih (12 meseci starih) grupa. Nasuprot tome, 4 meseca stare životinje zahtevale su manje vremena da stignu do platforme nego starije životinje. Nakon 3-nedeljnog perioda bez testiranja, tokom kojeg vremena je primenjen ili fiziološki rastvor ili G-2-MePE, životinje koje su primile samo fiziološki rastvor nisu pokazivale poboljšanu sposobnost da dostignu platformu, što je indikovano sličnim potrebnim vremenima na dan 4 testa akvizicione faze i dan 1 testa retencione faze. Nasuprot tome, životinje koje su primile tretman sa G-2-MePE ili sa visokim ili niskim dozama, imale su poboljšano pamćenje što se odražava u smanjenju vremena potrebnom da se dostigne platforma u poređenju sa kontrolama tretiranim fiziološkim rastvorom. Dodatno, G-2-MePE-tretirane životinje imale su slične performanse kao mlade životinje stare 4 meseca (Sl. 17) i stare životinje stare 8 meseci (podaci nisu prikazani). Stoga, zaključujemo da G-2-MePE može poboljšati pamćenje kod sredovečnih pacova koji su prethodno pokazivali deficite pamćenja u odnosu na mladim pacovima. Dodatno, kako je do vremena ponovnog testiranja, G-2-MePE ispran iz cirkulacije, zaključujemo da su efekti poboljšanja pamćenja sa G-2-MePE veoma verovatno nastali usled poboljšanja u funkciji holinergičkih neurona.

Eksperiment 2: Test sa 8-krakim radijalnim lavirintom

[0136] Pet meseci nakon originalnog eksperimenta sada 17 meseci stari pacovi su ponovo testirani u odnosu na prostorno radno pamćenje u lavirintu sa radijalnim kracima.

Metodi

Aparat

[0137] Aparat se sastoji od centralne platforme koja komunicira sa 8 identičnih kraka, svakim sa čašom sa hranom na kraju kraka.

Procedura testiranja

[0138] Pacovi su delimično izgladnjivani najmanje 10 dana pre, i tokom procedure sa radijalnim lavirintom.

[0139] Lavirint je sastavljen i pozicioniran tako da eksperimetator može jasno uočiti ponašanje pacova sa prethodno određene lokacije. Eksperimentator je numerisao krake lavirinta prema njihovoj orijentaciji od jedan do osam u pravcu kazaljke na satu.

Pre-trening (Pre-lek)

[0140] Na dan jedan vrata su ubačena u krake i svaki pacov je zatvoren u centralnoj platformi sa 20 kuglica hrane 5 minuta. Ovo je nastavljeno jednom dnevno tokom četiri dana, i uočeno je da su svi pacovi konzumirali nešto kuglica. Sledećeg dana pacovima je dozvoljeno da pet minuta istražuju ceo lavirint. U sve krake su postavljeni mamci od dve kuglice hrane u čaši za hranu lociranoj na kraju svakog kraka, i jedna kuglica i na ulazu i sredini svakog kraka. Ovo je ponovljeno najmanje pet, ali do osam dana za pacove koji su istraživali manje od osam krakova u dve uzastopne sesije. Svi pacovi su imali finalnu sesiju devetog dana pre-tretninga. U tom trenutku je odlučeno da jedan od starih pacova koji je ušao samo u jedan krak osmog od devet dana treba da se isključi iz budućeg testiranja u ovoj proceduri. Inače su svi pacovi uključeni bez obzira na količinu istraživanja koju su izveli u pre-treningu. Nije bilo statistički značajne razlike između starih grupa u broju krakova u koje su ušli u finalnoj pre-trening sesiji (Lek: F(2,31)=0.44, p=0.65).

Tretman lekom

[0141] 30 dana pre testa (pet dana nakon pre-treninga) 17 mužjaka Wistar pacova starih mesec dana implantirane su (pod anestezijom halotana) potkožne mini-osmotske pumpe (Alzet) da bi se lek primenio kontinuirano 3 nedelje. Nakon završetka infuzije pumpe su uklonjene i rane su ponovo zašivene (dozvoljeno 9-dana ispiranja).

[0142] Grupe za tretman su bile:

1. mlade kontrole (4 meseca stare), n=6;

2. fiziološki rastvor n=10;

3. G-2-MePE niska doza (2.4mg/kg/dan) n=13

4. G-2-MePE visoka doza (12.4mg/kg/dan) n=5

[0143] Grupe sa fiziološkim rastvorom i niskom dozom sastavljene su od svih pacova koji su primili te tretmane u fazi 1 ovog eksperimenta (kada su pacovi bili 12 meseci stari) bez obzira da li su imali jednu ili tri nedelje tretmana. Jedan pacov u svakoj od grupa sa fiziološkim rastvorom i grupa sa visokom dozom izbačeni su zbog tumora kože. Jedan od pacova sa niskom dozom nije učestvovao u ovom eksperimentu usled činjenice da nije mogao biti pretreniran (videti u nastavku).

Testiranje (Post-lek)

[0144] Testiranje radnog pamćenja započeto je devetog dana ispiranja. Pacovi su imali 10 dnevnih sesija treninga tokom 12 dana. Procedura je bila ista kao i za pre-treniing ali mamci su stavljeni samo u čaše za hranu. Pacovi su imali 6 minuta da naprave do 16 izbora posećivanjem bilo kog od osam krakova. Izbor je definisan kao da se odigrao kad su sve četiri šape bile unutar kraka. Eksperimentator je registrovao sekvencu ulaska u krake sa olovkom i papirom. Sesije su završene nakon ulaska u svih osam krakova, 16 izbora načinjeno, ili prošlo 6 minuta. Vreme potrebno da se uđe u svih osam krakova, kada se dogodilo, je registrovano.

Analiza podataka

[0145] Izbor kraka je smatran ispravnim kada je pacov ušao u krak koji nije prethodno posećen. Performansa je klasifikovana dnevno prema sledećim parametrima:

1) Tačan izbor (CC) 8-12 je broj napravljenih ispravnih izbora podeljen sa ukupnim brojem napravljenih izbora. Za životinje koje nisu posetile svih 8 krakova u testu, smatrano je da je denominator ovog odnosa 12.

2) Radni ispravni izbor (WCC) 8-12 je mera iz koje su izvedeni podaci za radno pamćenje. Podaci su sakupljeni kao što je opisano za CC 8-12 prethodno, ali za ovaj parametar, uključeni su samo pacovi koji su ušli u svih 8 krakova u sesiji.

[0146] Pacovi koji su imali manje ulazaka od 8 krakova nisu uzeti za procenu radnog pamćenja jer nisu mogli da zapamte koje su krake prethodno posetili i stoga su imali toliko oštećeno pamćenje da nisu mogli završiti test, za razliku od životinja koje, iz bilo kog razloga, nisu istraživale lavirint.

Rezultati

[0147] CC8-12: Postojalo je generalno poboljšanje sa svim grupama tokom 10 dana (F(9,324)=4.01, p<0.0001), ali bez značajnog grupnog efekta (F(3,36)=1.19, ns) ili grupa X dani interakcije (F(27,324)=1.05, ns) (podaci nisu prikazani).

[0148] WCC8-12: Sl. 18A prikazuje akvizicioni profil prema WCC8-12 rezultatu tokom 10 dana testiranja. Postojao je značajan efekat grupe (F(3,12)=4.27, p=0.029) i dana (F(9,108)=2.09, p=0.036) ali interakcija između ovih faktora nije bila značajna (F(27,108)=1.06, ns). Grupa sa visokom dozom G-2Me-PE pokazala je najveće poboljšanje tokom dana, praćeno sa mladim kontrolama. Postojala je veoma mala razlika između niske doze G-2Me-PE i fiziološkog rastvora.

[0149] Sl. 18B prikazuje rezultate koji pokazuju da su pacovi izloženi većoj dozi G-2-MePE (n=5) napravili više ispravnih ulazaka za uzimanje kuglica hrane u poređenju sa pacovima tretiranim vehikulumom (*p<0.05, n=10). Iz ove studije zaključujemo da G-2-MePE poboljšava prostorno pamćenje kod starih pacova.

Referentni primer 5: G-2-MePE povećava proliferaciju neuroblasta i smanjuje astrocitozu u mozgovima starih pacova

[0150] Kako nervna degradacija može rezultovati u smanjenom broju neurona, jedan poželjni terapeutski cilj je povećanje broja neurona u mozgu. Neuroni su izvedeni iz neuroblasta, manje diferencirane ćelije od neurona, ali unutar nervne linije. Tipično, neuroblast je izložen uslovima koji dovode do sazrevanja u zreli fenotip, sa definisanom somom, nervnim nastavcima (aksonima i dendritima) i konačno, stvaranjem veza sa drugim neuronima (npr., sinapsi). Stoga, merenje proliferacije neuroblasta postalo je dobro poznat rani marker za proliferaciju nervne ćelije. Stoga, detektovanje povećanja u proliferaciji neuroblasta indukovano farmaceutskim agensom je prihvaćen postupak za predviđanje rasta nervnih ćelija kod životinja. Kako pacovi i ljudi dele slične mehanizme u odnosu na proliferaciju nervne ćelije, detekcija promena u proliferaciji neuroblasta kod pacova in vivo je prediktivna za slične efekte kod ljudi.

[0151] Takođe je poznato da jedan histološki korelat oštećene kognitivne funkcije je povećanje u broju astrocitnih ćelija u mozgu pogođenih životinja. Stoga, da bi se odredilo da li G-2-MePE može biti koristan u stimulaciji proliferacije neuroblasta i u tretiranju astrocitoze, izveli smo seriju studija kod starih pacova.

Metode i materijal

Imunohistohemija

[0152] Da bi se izvele ove studije, tkiva su fiksirana i ukalupljena u parafin i preseci su dobijeni korišćenjem standardnih postupaka. Koronalni preseci (6 mm) koji sadrže nivo hipokampusa su isečeni i monitrani na hromalum obložene pločice za bojenje. Preseci su deparafinisani u ksilenu, dehidrirani u seriji etanola i inkubirani u 0.1 M fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS).

[0153] Primarna antitela protiv glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) i jedarnog antigena proliferišuće ćelije (PCNA) korišćeni su za obeležavanje reaktivnih glijalnih ćelija i ćelija koje podležu apoptozi i proliferaciji, respektivno. Za demaskiranje antigena (kaspaza-3 i PCNA bojenje), preseci su zagrevani u 10 mM natrijum citratnom puferu (pH 6.0) 1 min na visokoj snazi. Svi preseci su prethodno tretirani sa 1% H2O2u 50% metanolu 30 min da bi se ugasila aktivnost endogene peroksidaze. Onda je primenjeno ili 1.5% normalnog konjskog seruma ili 2.5% normalnog ovčijeg seruma u PBS tokom 1 č na sobnoj temperaturi da bi se blokiralo nespecifično pozadinsko bojenje. Sekcije su zatim inkubirane sa sledećim primarnim antitelima: monoklonsko mišje anti-GFAP antitelo (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A. razblaženo 1:500); mišje anti-PCNA antitelo (DAKA, A/S, Denmark, razblaženo 1: 100). Nakon inkubacije sa primarnim antitelima na 4°C 2 d (izuzev za PCNA bojenje koje je inkubirano preko noći) preseci su inkubirani sa biotinilovanim konjskim anti-mišjim ili kozjim anti-zečijim sekundarnim antitelom (1:200, Sigma) na 4°C preko noći. ExtrAvidin™ (Sigma, 1:200), koji je pripremljen 1 č pre korišćenja, primenjen je 3 č na sobnoj temperaturi, i zatim je reagovan sa 0.05% 3,3-diaminobenzidinom (DAB) i PBS da bi se proizveo braon reakcioni proizvod. Preseci su dehidrirani u serijama alkohola do ksilena i pokriveni pokrovnim staklima sa medijumom za pravljenje preparata.

[0154] Imunohistohemijsko bojenje je izvedeno na uzorcima mozga uzetih i iz kontrole i G-2-MePE tretiranih grupa mladih (4 meseca starih), sredovečnih (9 meseci starih) i starih pacova (18 meseci starih).

[0155] Kontrolni preseci su obrađeni na isti način izuzev što je primarno antitelo izostavljeno iz rastvora za inkubaciju. Broj PCNA pozitivnih ćelija je izbrojan u subventrikularnoj zoni i GFAP pozitivne ćelije su bodovane u cerebralnom korteksu.

Eksperiment 1: G-2-MePE stimuliše proliferaciju neuroblasta u mozgovima starih pacova

[0156] Subventrikularna zona (SVZ) i gyrus dentatus (DG) su dva regiona mozga u kojima se odigrava adultna neurogeneza. Dobro je dokumentovano da je smanjenje neurogeneze i u SVZ i u DG korelisano sa slabljenjem pamćenja sa starenjem i registrovano je da su efekti nervnog faktora rasta i epidermalnog faktora rasta na poboljašnje pamćenja usled povećanja proliferacije progenitora SVZ. Korišćenjem PCNA kao markera za ćelijsku proliferaciju, ćelijska proliferacija u SVZ je istraživana brojanjem broja ćelija koje su pozitivne za PCNA. U izabranim životinjama, najmanje neke od proliferišućih ćelija su identifikovane kao neuroblasti, kao što su bojene sa agensom specifičnim za nervne ćelije, doublecortin.

[0157] Osamnaest meseci stari mužjaci pacova su tretirani intraperitonealno sa pojedinačnim dozama G2-MePE (doze od ili 0, 0.012, 0.12. 1.2, 12 mg/kg). Mozgovi su sakupljeni 3 dana nakon tretmana i izvedeno je imunohistohemijsko bojenje PCNA i GFAP. Broj PCNA pozitivnih ćelija je izbrojan u SVZ i broj ćelija je zatim izračunat kao prosečna vrednost ćelije/mm u zavisnosti od dužine zida ventrikuluma korišćenog za brojanje (Sl.

19A). Grupa tretirana sa najvećom dozom (12 mg/kg, n=5) pokazala je značajno povećanje u broju PCNA pozitivnih ćelija u poređenju sa grupom tretiranom sa vehikulumom (*p<0.05, n=7). Podaci su pokazali doznozavisni efekat G-2PE na poboljšanje neurogeneze.

[0158] Fluorescentno duplo obeležavanje pokazalo je ko-lokalizaciju PCNA sa doublecortin, markerom za neuroblaste. Sl. 19B je fotografija dela mozga pacova koja pokazuje povećanje i u PCNA (zeleno, x20) i doublecortin (crveno, x20) kod pacova tretiranih sa najvećom dozom G-2-MePE (desni panel) u poređenju sa pacovom tretiranim vehikulumom (levi panel). Dva markera su jasno ko-lokalizovana (Slika 19B, foto, x100). Zaključujemo da G-2-MePE može stimulisati proliferaciju ćelija mozga, uključujući neuroblaste. Kako su neuroblasti prekursorske ćelije za neurone, dodatno zaključujemo da G-2-MePE može povećati populaciju neurona u mozgovima životinja tretiranih sa jedinjenjem predmetnog pronalaska.

Eksperiment 2: G-2-MePE stimuliše proliferaciju neuroblasta u SVZ mozgova sredovečnih pacova

[0159] Efekti G-2-MePE (1.2mg/kg) su proučavani u grupi sredovečnih, 9 meseci starih pacova. G-2-MePE (1.2 mg/kg) ili vehikulum je primenjen intraperitonealno (i.p.). Proliferacija ćelija u SVZ je ispitivana 3 dana nakon tretmana korišćenjem PCNA imunohistohemijskog bojenja. Sl. 19C pokazuje značajno povećanje u broju PCNA pozitivnih ćelija nakon tretmana G-2-MePE (**p<0.005, n=4). Kako su neke od proliferišućih ćelija bojenih sa PCNA identifikovane kao neuroblasti (videti Eksperiment 1 prethodno), zaključujemo da G-2-MePE može stimulisati proliferaciju neuroblasta kod mozgova sredovečnih pacova.

Eksperiment 3: Astrocitoza u starim mozgovima

[0160] Sve veći broj dokaza sugeriše da disfunkcija astrocita u starosti može inicirati inflamaciju, što vodi daljoj nervnoj degeneraciji. Ushodna regulacija aktiviranih astrocita je registrovna i blisko je povezana sa slabljenjem pamćenja sa starenjem, možda preko zaustavljene endogene neurogeneze.

[0161] Korišćenjem GFAP kao markera za reaktivne astrocite, broj GFAP-pozitivnih ćelija je izbrojan u CA4 subregionu hipokampusa starih pacova tretiranih sa G-2MeP ili vehikulumom. Pronašli smo značajno povećanje u rekativnim astrocitama u hipokampusu starih životinja (Slika 20A), i u cerebralnom korteksu. Neke od astrocita su povezane sa kapilarima (Slika 20B foto, strelice) kod starih pacova u poređenju sa mladim (*p<0.01) i sredovečnim pacovima (*#p<0.01).

[0162] Kao deo vaskularne komponente, GFAP pozitivni astrociti takođe igraju ulogu u angiogenezi (Sl. 20B, strelice), što takođe doprinosi inflamatornom odgovoru u mozgovima. Stoga povećane GFAP astrocite uočene kod starih mozgova mogu ukazivati na hronični stadijum degeneracije mozga.

Eksperiment 4: G-2-MePE smanjuje astrocitozu kod starih mozgova

[0163] Takođe smo procenili efekte G-2-MePE na astrocitozu u CA4 sub-regionu hipokampusa kod starih pacova.

18-meseci stari mužjaci Wistar pacova su dodeljeni u 5 grupa za tretman kao što sledi: vehikulum, 0.12 mg/kg/day, 0.12, 1.2 i 12 mg/kg/day (svaka n=6).

[0164] GFAP-pozitivne ćelije su izbrojane korišćenjem kompjuterizovanog pograma (Discovery 1). Rezultati su prikazani na Sl 20C i 20D. G-2-MePE je primenjen intra-peritonealno i broj GFAP-pozitivnih ćelija je procenjen 3d nakon injekcije. Korišćenjem vizuelnog sistema bodovanja (0 = bez astrocita, 1 = malo astrocita, 2 <50%, 3>50%) procenili smo broj astrocita u 5 različitih koritkalnih regiona.

[0165] Tretman sa G-2-MePE smanjio je broj reaktivnih astrocita u CA4 regionu hipokampusa u poređenju sa grupom tretiranom vehikulumom (Sl. 20C; *p<0.05), naročito grupama tretiranim sa dozama od 0.12 i 12 mg/kg. Sličan efekat je uočen za G-2-MePE u cerebralnom korteksu (Sl.20D).

[0166] Normalno postoji nekoliko GFAP-pozitivnih astrocita lociranih u dubokom sloju korteksa mozgova pacova i one koje su prisutne su obično blisko povezane sa traktovima bele mase. Međutim, pronašli smo da je bilo GFAP-pozitivnih ćelija u srednjem sloju korteksa, blisko povezanih sa krvnim sudovima.

[0167] Rezultati studija prikazanih ovde ukazuju da je starenje povezano sa nekoliko promena u mozgu. Prvo, postoji gubitak pamćenja i kognitivne funkcije zavisan od starosti. Drugo, postoji povećanje astrocita zavisno od starosti. Svi ovi nalazi kod pacova su međusobno konzistentni i sa poznatim ulogama holinergičkih nerava u održavanju kognitivne funkcije i pamćenja kod eksperimentalnih životinja i kod ljudi.

[0168] Iznenađujuće smo pronašli da GPE analog, G-2-MePE, dopremljen starim životinjama najmanje delimično preokreće sve od prethodnih promena povezanih sa starenjem. Prvo, G-2-MePE povećava količinu ChAT prisutnih u ćelijama mozga životinja izloženih neurotoksinima okadainskom kiselinom ili 3-NP. Ovaj efekat G-2-MePE imitira onaj od dobro poznatog neuropeotektivnog agensa, GPE. Ovi efekti su uočeni kod kortikalnih ćelija, cerebelarnih ćelija i u ćelijama strijatuma, ukazujući da su efekti bili široko rasprostranjeni u različitim delovima mozga. Drugo, G-2-MePE je povećao ChAT u strijatumu, ukazujući da su holinergički neuroni senzitivni na G-2-MePE. Ove uočene hemijske i histološke promene bile su u skladu sa promenama u ponašanju. Stare životinje tretirane sa G-2-MePE pokazivale su poboljšano pamćenje u dva dobro poznata sistema u poređenju sa kontrolama tretiranim vehikulumom. Sledeće, G-2-MePE je indukovao proliferaciju neuroblasta kod starih mozgova. Konačno, tretman sa G-2-MePE preokrenuo je povećanje u astrocitozi uočeno u hipokampusu i korteksu starih mozgova.

Efekti G-2-MePE nisu bili usled akutnih efekata agensa; jer je u mnogim ovde citiranim studijama, dovoljno vremena prošlo od prestanka dopremanja leka u test, tako da je verovatno malo ili nimalo leka prisutno.

Referentni primer 6: Poređenje farmakokinetike GPE i G-2-MePE

[0169] Svrha ovih studija je bila da se uporede farmakokinetički profili GPE i G-2-MePE kod životinja in vivo korišćenjem standardnih farmakokinetičkih postupaka.

Postupci

[0170] Adultni mužjaci Wistar pacova težine između 180 i 240g korišćeni su da se odredi farmakokinetika GPE i G2MePE. Da bi se olakšale intravenske bolus injekcije i uzorkovanje krvi, svi pacovi su hirurški implantirani sa stalnom kanilom u jugularnoj veni pod anestezijom sa halotanom tri dana pre eksperimenta. Grupama od šest pacova data je pojedinačna intravenska bolus injekcija ili 30 mg/kg GPE ili 10 mg/kg G2MePE rastvoreno u 0.1M sukcinatnom puferu (pH 6.5). Uzorci krvi (oko 220 ml svaki) sakupljeni su u heparinizovane epruvete koje sadrže Sigma koktel inhibitora proteaze za tkiva sisara na 10 i 0 min pre injekcije ili GPE ili G2MePE, i 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 i 128 min nakon injekcije ili GPE ili G2MePE. Uzorci su centrifugirani na 3000g 15 min na 4°C i plazma je uklonjena i uskladištena na -80°C do ekstrakcije i analize sa ili radioimuno anallizom ("RIA") ili reverzno faznom HPLC. Korišćeni RIA i HPLC postupci bili su konvencionalni.

[0171] Nađeno je da je eliminacija leka nakon pojedinačne intravenske bolus injekcije proces prvog reda koji prati jednačinu C= C0e<-kt>, gde C predstavlja koncentraciju leka u bilo kojoj vremenskoj tački, Coje koncentracija kada je vreme (t) jednako nula i k je konstanta stope prvog reda izražena u jedinicama koncentracije na čas. k i polu-život (t1/2) su izračunati iz nagiba prave linearne regresije u eliminacionoj fazi semi-logaritamski grafik plazma koncentracije nasuprot vremenu kao: Log C = -kt/2.3 log Co. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± standardna greška.

Rezultati

[0172] Sl. 21 prkazuje grafik koncentracije u plazmi in vivo GPE i G-2-MePE nakon intravenske (i.v.) injekcije. Puni kvadrati predstavljaju koncentracije GPE u svakoj vremenskoj tački, i puni trouglovi predstavljaju koncentracije G-2-MePE u svakoj vremenskoj tački.

[0173] Koncentracije u plazmi GPE i G-2-MePE su izrazito povećani unutar 1 min nakon injekcije. Nakon injekcije od 30 mg/kg GPE, uočen je pik koncentracije od 40.0 ± 10.8 mg/ml. Koncentracija u plazmi GPE zatim je rapidno smanjena u skladu sa kinetičkim procesom prvog reda. Pronađeno je da je konstanta stope prvog reda za GPE 0.15 ± 0.014 ng/ml/min, nađeno je da je t1/24.95 ± 0.43 min i nađeno je da je procenjeni klirens GPE iz plazme 137.5 ± 12.3 ml/č.

[0174] Nakon injekcije od 10 mg/kg G-2-MePE, nađeno je da je pik koncentracije 191 ± 16.1 mg/ml. Koncentracije u plazmi G-2-MePE su zatim smanjene u skladu sa kinetičkim procesom prvog reda. Nađeno je da je konstanta stope prvog reda za G-2-MePE 0.033 ± 0.001 ng/ml/min, nađeno je da je t1/220.7 ± 0.35 min i nađeno je da je procenjeni klirens 30.1 ± 0.5 ml/č.

[0175] Nakon injekcije, maksimalna koncentracija G-2-MePE bila je oko 4.8 puta veća od maksimalne koncentracije GPE u plazmi, uprkos dopremljenoj većoj dozi GPE (30 mg/kg) u poređenju sa dopremljenom dozom G-2-MePE (10 mg/kg).

[0176] Nalaz većih koncentracija G-2-MePE nego GPE u plazmi u svim vremenskim tačkama manjim od 125 minuta, uprkos nižoj dopremljenoj dozi G-2-MePE, bio je potpuno neočekivan na osnovu poznatih koncentracija GPE u plazmi. t1/2za G-2-MePE bio je preko 4 puta duži nego t1/2za GPE.

[0177] Nalaz povećanog polu-života G-2-MePE u poređenju sa GPE bio je potpuno neočekivan na osnovu t1/2GPE. Povećani t1/2G-2-MePE znači da je G-2-MePE sporije izbačen iz cirkulacije. Ovaj nalaz je potpuno neočekivan na osnovu stope klirensa GPE.

[0178] Iz ovih studija zaključujemo da je G-2-MePE potentni agens koji je sposoban da preokrene mnoge od štetenih efekata starenja u mozgovima životinja, uključujući ljude. GPE analozi, uključujući G-2-MePE stoga, mogu proizvesti poželjne terapeutske efekte, uključujući neuroprotekciju, poboljšano pamćenje, povećanu proliferaciju neuroblasta i smanjenje astrocitoze, i mogu biti korisni za preokretanje ili smanjenje štetnih efekata starenja kod ljudi.

[0179] Iako je predmetni pronalazak opisan u odnosu na određene poželjne primer izvođenja, stručnjaku će biti očigledno uzimajući u obzir to znanje i ovaj opis da se mogu pripremiti i primeniti ekvivalenti jedinjenja predmetnog pronalaska za uslove opisane u ovoj prijavi, i namera je da svi takvi ekvivalenti budu uključeni unutar patentnih zahteva ove prijave.

Referentni Primer 7: Tretman Rett-ovog sindroma I

Efekti G-2-MePE na dužinu života i dugotrajnu potencijaciju u modelu Rett-ovog sindroma (RTT)

[0180] Da bi se odredilo da li G-2-MePE tretman može uticati na razvoj i napredovanje Rett-ovog sindroma u mišjem modelu poremećaja, koristili smo hemizigotne MeCP2(1lox) mužjake miša. MeCP2 knock-out (MeCP2-KO) mišji sistem je široko prihvaćen u tehnici jer blisko imitira opseg i težinu fizioloških i neuroloških abnormalnosti karakterističnih za humani poremećaj, Rett-ov sindrom.

[0181] Svi eksperimenti su izvedeni u University of Texas Southwestern Medical Center i odobreni od strane University of Texas Southwestern Medical Center Animal Care i Use Committee. G-2-MePE je sintetisan u Albany Molecular Research Inc. (Albany, NY) i obezbeđen od strane Neuren Pharmaceuticals Limited.

Metodi

Tretman

[0182] Tretirali smo hemizigotne MeCP2(1lox) mužjake miševa sa 20 mg/kg/dan G-2-MePE ili fiziološkog rastvora, (0.01%BSA, n=15 po grupi u eksperimentu preživljavanja i n=20 u LTP eksperimentu). Tretmani su primenjeni intraperitonealno od 4 nedelje nakon rođenja. Za eksperimente preživljavanja tretman je održavan tokom eksperimenta. Za LTP eksperiment miševi su tretirani do nedelje 9 kada su korišćeni za pripremanje preseka.

Preživljavanje

[0183] MeCP2 deficijentni mutantni miševi razvijaju RTT simptome na oko 4-6 nedelja starosti i umiru između 10-12 nedelja (Chen et al., 2001. Nat Genet 27: 327-331). Uporedili smo preživljavanje kontrola divljeg tipa i MeCP2 deficijentnih životinja u grupama tretiranim vehikulumom i G-2-MePE. Preživljavanje je mereno nedeljno od početka tretmana (4 nedelje) i korišćeno da se proizvedu Kaplan-Meier krive preživljavanja da bi se prikazala proporcija miševa koji su preživeli (y osa) u svakom nedeljnom intervalu (x osa) (videti Sl. 22).

Dugotrajna potencijacija (elektrofiziologija)

[0184] Prethodno je registrovano da MeCP2 deficijentni miševi pate od funkcionalne i ultrastrukturne sinaptičke disfunkcije, značajnog poremećaja hipokampus zavisnog pamćenja i hipokampusne dugotrajne potencijacije (LTP) (Moretti et al. The Journal of Neuroscience. 2006. 26(1):319-327). Da bi se testirali efekti G-2-MePE tretmana na sinaptičku funkciju u RTT modelu uporedili smo hipokampusnu LTP i kod životinja tretiranih vehikulumom i G-2-MePE na 9 nedelja starosti. Da bi se to uradilo, izmerili smo nagib fEPSP kao % bazalne potencijacije u neuronima u presecima hipokampusa iz MeCP2 deficijentnih miševa tretiranih ili sa fiziološkim rastvorom ili G-2-MePE (Sl.

23).

Rezultati

[0185] Sl. 22 prikazuje da je G-2-MePE tretman povećao preživljavanje MeCP2 deficijentnih miševa. Miševi divljeg tipa (gornja linija) su kontrolne životinje, i stoga je njihovo preživljavanje bilo 100% u svakoj vremenskoj tački. MeCP2 deficijentni miševi tretirani samo sa fiziološkim rastvorom uginuli su mnogo brže (tačkasta linija) od miševa divljeg tipa, tako da je oko 11 nedelja, samo 50% MeCP deficijentnih miševa preživelo. Potpuno nasuprot tome, međutim, neočekivano smo pronašli da su MeCP2 deficijentni miševi tretirani sa G-2-MePE preživeli značajno duže od miševa tretiranih fiziološkim rastvorom. Na oko 15 nedelja, 50% životinja je preživelo. Inicijalno prikazani podaci pokazali su da su MeCP2 miševi pogođeni u pogledu preživljavanja tako da je 50 procenata životinja uginulo do 11 nedelja u netretiranom slučaju. G-2-MePE tretirane životinje pokazale su poboljšano preživljavanje, sa 50 procenata uginulih na 16 nedelja. U ovoj studiji, podaci o dugovečnosti su kompromitovani nekonzistentnim veterinarskim procedurama, tako da miševima nisu konzistentno skraćivani zubi – zahtev kod mecp2 miševa neprepoznat na početku eksperimenta. Posledica je bila uočavanje ranih smrti životinja koje nisu povezane sa Rett-ovim sindromom (naročito u kontrolnoj grupi). Ponovno ispitivanje podataka je prikazalo da je efekat G-2-MePE ostajao kada je kontrolna grupa ponovo urađena, iako su razlike u grupama bile manje (vreme do 50 procenata smrti 13.5 nedelja kod kontrola, 16 nedelja kod G-2-MePE tretiranih životinja). Nije bilo bezbednosnih problema sa G-2-MePE tretmanom mecp2 miševa.

[0186] Ovi rezultati su pokazali da G-2-MePE može značajno povećati preživljavanje MeCP2 deficijentnih miševa. Kako su MeCP2 deficijentni miševi prediktivni za patologiju i terapeutsku efikasnost kod ljudskih bića sa Rettovim sindromom, zaključujemo da G-2-MePE može povećati dužinu života ljudskih bića sa Rett-ovim sindromom.

[0187] Sl. 23 prikazuje rezultate naših studija da bi se odredilo da li je G-2-MePE tretman povećao hipokampalnu dugotrajnu potencijaciju (LTP) kao što je mereno sa fEPSP nagibom kod MeCP2 deficijentnih životinja u poređenju sa mutantnim miševima tretiranim fiziološkim rastvorom. Kao što je prikazano na Sl. 23, neočekivano smo našli da je G-2-MePE povećao nagib fESPS kod MeCP2 deficijentnih miševa u poređenju sa životinjama tretiranim samo sa fiziološkim rastvorom.

[0188] Ovi podaci su pokazali da G-2-MePE može biti efikasan u tretiranju MeCP2 deficijentnim miševima in vivo. Kako su MeCP2 deficijentni miševi prediktivni za patologiju i terapeutsku efikasnost kod ljudskih bića sa Rettovim sindromom, zaključujemo da G-2-MePE može biti efikasna terapija za ljude sa Rett-ovim sindromom.

Referentni Primer 8: G-2-MePE poboljšava dendritsku arborizaciju i povećava dužinu dendritskog trna

[0189] Procenili smo efekte G-2-MePE tretmana na dendrite. Transgenim mecp2 knockout miševima (n = 15 do 20) primenjen je G-2-MePE intraperitonealno sa dozom od 20 mg/kg jednom dnevno. Nakon žrtvovanja gustina dendritskih trnova, dužina trna i arborizacija su ispitani nakon Golgi bojenja nakon devet nedelja, kao prema Tabeli 1 u nastavku:

Tabela 1: Veličina uzorka za sve analize morfologije i trnova neurona

MUŽJACI

<STAROST>Veličina uzorka Veličina uzorka (prosečan broj<Analiza>(Nedelje)(br. miševa) neurona ili dendrita po životinji) KO-NNZ-G-KO-vehikulum<KO-NNZ->KO-vehikulumG-2MePE2MePE Morfologija

9 3 3 4 4 neurona

Analiza

trnova<9 3 3 10 10>

Dužina dendrita je procenjena preko udaljenosti od some reprezentativnih hipokampusnih CA1 neurona od 9 nedelja starih mužjaka mecp2 null mutantnih miševa tretiranih ili sa fiziološkim rastvorom (3 neurona analizirana od 3 zasebna miša, n=9) ili G-2-MePE (20 mg/kg i.p. 1/dan, od nedelje 4; 3 neurona analizirana od 3 zasebna miša, n=9).

[0190] Uočili smo da je G-2-MePE poboljšao dendritsku arborizaciju i povećao dužinu dendritskog trna. Sl. 24 ilustruje rezultate ove studije. Dužina dendrita u mm (vertikalna osa) je plotovana nasuprot udaljenosti (u µm; horizontalna osa) od some ćelija. Za ćelije sa dendritima blizu soma, dendriti su bili kratki. Međutim, kako se udaljenost od soma povećavala tretman fiziološkim rastvorom (prazni kvadrati) proizveo je dužine dendrita koje su se povećale do maksimuma na udaljenosti od 70 µm od some i smanjivale se na udaljenostima daljim od soma. Nasuprot tome, tretman sa G-2MePE (puni kvadrati) proizveli su duže dendrite duž najvećeg dela opsega udaljenosti od soma.

Referentni Primer 9: Tretman Rett-ovog sindroma kod miševa II

Parenje miševa i genotipizacija

[0191] MeCP2 klicina linija null alel miševi su korišćeni (Chen et al., 2001). Genotipizacija je izvedena kao u Chen et al. (Chen et al., 2001).

G-2-MePE tretman

[0192] Za merenja preživljavanja, analiza noćne aktivnosti i imunoblot analiza, G-2-MePE (sintetisan u Albany Molecular Research Inc. (Albany, NY) i dobavljen od Neuren Pharmaceuticals Limited) je primenjen dnevno preko intra-peritonealnih injekcija (20 mg/kg, vehikulum=fiziološki rastvor, 0.01% BSA). Tretman počinje na P15 i održavan je tokom eksperimenata. Za eksperimente intracelularne fiziologije, miševi su injektirani dnevno sa G-2-MePE (20 mg/kg telesne težine, vehikulum=fiziološki rastvor, 0.01% BSA) 2 nedelje, od P15 do P28-P32 kada su korišćeni za pripremu akutnih preseka. Za eksperimente optičke vizuelizacije, miševi su injektirani sa G-2-MePE (20 mg/kg telesne težine, vehikulum=fiziološki rastvor, 0.01% BSA) dnevno od dana šava na kapku do dana vizuelizacije.

Priprema fiziologije isečaka

[0193] Koronalni preseci (300 µm debljine) na ili blizu sensorimotorog korteksa su isečeni na <4°C ACSF korišćenjem Vibratome. Preseci su inkubirani na 37°C 20 minuta nakon sečenja, i na sobnoj temperaturi za ostatak ekperimenta. Preseci su preneti u Warner komoru i snimanja su uzimana od vizuelno identifikovanih piramidalnih neurona lociranih u sloju 5. Veštačka cerebrospinalna tečnost (ACSF) koja sadrži 126 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1 mM NaHPO4, 3 mM KCl, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, i 14 mM dekstroza, podešena je na 315-320 mOsm i 7.4 pH, i barbotirana sa 95% O2/5% CO2. Rastvor za intracelularnu pipetu sadržao je 100 mM kalijum glukonata, 20 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP, i 10 mM Na-fosfokreatin.

Intracelularni snimci cele ćelije

[0194] Borosilikatne pipete (3-5 MΩ, WPI) su izvučene korišćenjem Sutter P-80 puller (Sutter Instruments). Ćelije su vizuelizovane sa Achroplan 40x sočivima za vodenu imerziju sa infracrvenom-DIC optikom (Zeiss) i detektovane sa infracrvenom kamerom (Hamamatsu) sa projektovanjem na video monitor. Eksperimenti su vođeni napravljenim softverom za akviziciju i analizu u realnom vremenu napisanom u Matlab (Mathworks, Natick, Mass.) korišćenjem Multiclamp 700B pojačala (Axon Instruments) povezanog sa BNC-2110 konektorskim blokom i M-Series dvokanalnom karticom za akviziciju (National Instruments). Gigaseal i ruptura je postignuta i snimci cele ćelije su kontinuirano verifikovani u odnosu na niske nivoe curenja i serijskog otpora. Za svaki snimak, 5 mV test puls je primenjen u nametnutoj voltaži ∼10 puta da bi se izmerio ulaz i serijska otpornost. Zatim u nametnutoj struji ∼10 pulseva (500 ms, 40-140 pA sa 10 pA inkrementima), su primenjeni da bi se kvantifikovale izazvane stope okidanja i ćelijske ekscitabilnosti. Pristupni otpor, curenje i unutrašnja ćelijska ekscitabilnost su verifikovani kao konzistentni po grupama. Konačno, spontani EPSCs pod nametnutom voltažom na -60 mV su uzorkovani na 10 kHz i low-pass filtrirani na 1 kHz. Analiza je izvedena korišćenjem napravljenog softverskog paketa napisanog u Matlab, pri čemu su svi događaji detektovani prema automatizovanim pragovima i slepo verifikovani za svaki događaj pojedinačno od strane eksperimentatora.

Golgi bojenje

[0195] Uzorci (<1 cm) od P28 miševa su fiksirani u 10% formalinu i 3% kalijum bihromatu 24 časa. Tkivo je zatim preneto u 2% srebro nitrat 2 dana u mraku na sobnoj temperaturi. Preseci iz ovih uzoraka su zatim isečeni na 50 µm debljine u destilovanoj vodi. Preseci koji odgovaraju motornom korteksu su montirani na pločice, osušeni na vazduhu 10 minuta, i zatim dehidrirani putem sekvencijalnih ispiranja sa 95% alkoholom, 100% alkoholom, i ksilenom, i zatim zapečaćeni sa pokrovnim staklom. Slike su dobijene na 10x (cela ćelija) i 100x (vizuelizacija trnova) korišćenjem Zeiss Pascal 5 Exciter konfokalnog mikroskopa.

Optička vizuelizacija unutrašnjih signala

[0196] Adultne (>P60) divljeg tipa (SVEV ili BL6) i MeCP2 (+/-) mutantne ženke (BL6) korišćene su za ovaj eksperiment. Kontrolna grupa divljeg tipa je sastavljena i od MeCP2+/- ženki divljeg tipa iz istog legla ili SVEV ženki diljeg tipa uparene na osnovu starosti. Za monokularnu deprivaciju, životinje su anestezirane sa Avertin (0.016 ml/g) i kapci jednog oka su ušiveni tokom 4 dana. Pre vizuelizacije, šav je uklonjen i zatvoreno oko je ponovo otvoreno. Za sesiju vizuelizacije korišćene su samo životinje gde su deprivacioni šavovi intaktni i stanje zatvorenog oka naizgled zdravo. Za aktivaciju G-2-MePE signalizacije, rastvor koji sadrži G-2-MePE je injektiran intra-peritonealno (IP) dnevno tokom celog perioda deprivacije. Za sesije vizuelizacije miševi su anestezirani sa uretanom (1.5 g/kg; 20% pune doze je primenjeno IP svakih 20-30 minuta do finalne doze, 0.02 ml hloroprotiksena 1% je takođe injektirano zajedno sa prvom primenom). Lobanja je izložena i ploča po meri je zalepljena na glavu da bi se minimizovali pokreti. Lobanja je stanjena preko VI sa Dremel bušilicom i pokrivena sa rastvorom agaroze u fiziološkom rastvoru (1.5%) i pokrovnim staklom. Tokom sesije vizuelizacije, životinja je konstantno oksigenisana, temperatura je održavana sa ćebetom za zagrevanje i oči su periodično tretirane sa silikonskim uljem; fiziološki uslovi su stalno praćeni. Anestezirani miš je postavljen ispred monitora koji prikazuje periodični stimulus prikazan bilo kom oku, monokularno; stimulus se sastojao od plutajuće vertikalne ili horizontalne bele trake dimenzija 9°x72°, plutajući na 9 sek/ciklusu, preko uniformno sive podloge. Površina lobanje je osvetljena crvenim svetlom (630 nm) i promena luminiscencije je uhvaćena sa CCD kamerom (Cascade 512B, Roper Scientific) sa stopom od 15 frejmova/sek tokom svake sesije sa stimulusom od 25 minuta. Temporalni filter visokog prolaza (135 frejmova) je upotrebljen da bi se uklonio spori šum signala, nakon čega je signal kompjuterski obrađen da bi se ekstrahovala, na svakom pikselu, temporalna komponenta brze Furijeove transformacije (FFT) koja odgovara frekvenciji stimulusa. FFT amplituda je korišćena da se meri snaga vizuelnog izazvanog odgovora svakog oka. Indeks okularne dominatnosti je izveden iz odgovora svakog oka (R) na svakom pikselu kao ODI=(Rcontra-Ripsi)/(Rcontra+Ripsi). Binokularna zona je definisana kao region aktiviran stimulacijom oka ipsilateralnog na vizuelizovanu hemisferu.

Merenje pulsa

[0197] Srčani puls u realnom vremenu je meren korišćenjem štipaljke za rep sa senzorom (Mouse OX Oximeter-Oakmont, PA). Miševi nisu anastezirani već fizički imobilisani u podešenu otvorenu plastičnu cev. Pre sesije snimanja cev je preko noći stavljena u kaveze sa eksperimentalnim životinjama da bi se omogućilo navikavanje. Temperatura tela je održavana na ∼82-84°F tokom snimanja. Snimili smo 3 testa od 15 minuta za svakog miša, miševi su 8 nedelja stari i tretirani su sa vehikulumom ili G-2-MePE od P15.

Merenje noćne aktivnosti

[0198] Spontana motorna aktivnost je merena korišćenjem infracrevene komore sa aktivacijom na pokret (Opto-Varimax-MiniA; Columbus Instruments, Columbus, Ohio). za svaki eksperiment, miš je postavljen u komoru najmanje 3 č pre početka snimanja. Kretanje je praćeno tokom normalnog 12-č tamnog ciklusa (7 uveče do 7 ujutru.). Uzet je jedan tamni ciklus po životinji po vremenskoj tački.

Rezultati

[0199] Da bi se testiralo da li će G-2-MePE tretman uticati na razvoj glavnih karakteristika RTT bolesti, 2 nedelje starim mutantnim životinjama date su dnevne intra-peritonealne injekcije tokom trajanja njihovog života. Merenja sinaptičke fizologije, sinaptičkog molekularnog sastava, i kortikalne plastičnosti su zatim dobijena kao što je dato u nastavku, zajedno sa merenjima vezanim za zdravstveno stanje kao što je puls, nivoi lokomotorne aktivnosti, i dužina života.

Efekti G-2-MePE na sinaptičku fiziologiju MeCP2 mutantnih miševa

[0200] Nedavne studije su registrovale da neuroni duž više regiona mozga MeCP2-/y miševa pokazuju veliko smanjenje u spontanoj aktivnosti (Chang et al., 2006; Chao et al., 2007; Dani et al., 2005; Nelson et al., 2006) fenotip koji je spasen prekomernomm ekspresijom BDNF (Chang et al., 2006). Slično, pokazano je da akutna primena IGF1 derivata podiže amplitude izazvane ekscitatorne postsinaptičke struje (EPSC) za 40% u kulturama hipokampusa pacova (Ramsey et al., 2005; Xing et al., 2007). Da bi se testirala efikasnost G-2-MePE u spasavanju MeCP2-/y fiziološkog fenotipa, dobili smo intracelularne snimke u celoj ćeliji u presecima akutnog mozga, merenjem ekscitatornog sinaptičkog impulsa (amplituda i frekvencija spontane EPSC) u sloju 5 koritikalnih neurona. Ovde, EPSCs snimljene kod -/y životinja su značajno smanjene u amplitudi u poređenju sa EPSCs merenim kod životinja divljeg tipa. Trend je delimično preokrenut kod EPSCs snimaka kod MeCP2-/y životinja tretiranih sa G-2-MePE, koje su značajno veće u amplitudi od EPSCs od MeCP2-/y miševa tretiranih sa vehikulumom. Ove razlike su takođe uočene u prosečnim vrednostima u ćelijama. Tokom ovih merenja, takođe je verifikovano da su pristupni otpor, curenje, i unutrašnja ćelijska ekcitabilnost konzistentni po grupama. Kvantifikovanje EPSC intervala takođe pokazuje blago povećanje intervala između EPSC događaja (smanjena frekvencija EPSC) između životinja divljeg tipa wild-type i MeCP2-/y (P=0.04, Kolmogorov-Smirnov test). Naši nalazi stoga ukazuju da su smanjenje ekscitatornog sinaptičkog impulsa u kortikalnim ćelijama MeCP2-/y miševa, i njegovo delimično spasavanje nakon G-2-MePE tretmana, delimično usled promene EPSC amplitude kao posledice promene u snazi sinapsi koje posreduju u ekscitatornoj transmisiji u ovom regionu.

G-2-MePE tretman stimuliše sazrevanje kortikalnih trnova

[0201] Koristili smo Golgi bojenje za razređeno i uočljivo obeležavanje neurona, i primenili smo konfokalnu vizuelizaciju visoke rezolucije da bi se merila gustina dendritskih trnova i morfologija u obeleženim ćelijama, ograničavajući analizu na sloj 5 piramidalnih neurona u presecima motornog korteksa miševa iz kritičnog perioda (P28).

[0202] Iako vizuelizacija sa malim uveličanjem jasno razgraničava stepen dendrita piramidalnih ćelija koristili smo veća uveličanja da bi izbrojali sinaptičke kontakte i odredili morfološku klasu svakog trna. Klasifikovali smo trnove ili kao velike i bulbozne ("pečurka", M), kratke i zdepaste ("zdepasti", S), kratke i tanke ("tanki", T) ili filopodije (F). Poređenje gustine trnova po jediničnoj grani prikazuje trend smanjene gustine trnova kod knockout neurona koji je veoma ublažen kod knockout sa tretmanom.

[0203] Zajedno ovi rezultati ukazuju na potencijal za deficite u broju i statusu maturacije dendritskih kontakata kod knockout da bi se poduprli funkcionalni defekti u ekscitatornoj transmisiji, na način koji se može tretirati nakon primene G-2-MePE.

Plastičnost okularne dominatnosti (OD) kod adultnih MeCP2+/- miševa je smanjena sa G-2-MePE

[0204] Razvojne promene plastičnosti OD su delimično kontrolisane od strane aktivacije IGF-1 puta, i primena (1-3)IGF-1 može smanjiti plastičnosti OD kod mladih miševa divljeg tipa (Tropea et al., 2006). Stoga smo testirali da li G-2-MePE tretman može stabilizovati prolongiranu plastičnost OD uočenu kod adultnih MeCP2 mutanata. Izvršena je deprivacija od 4 dana ženki MeCP2+/- miševa, starih P60 ili više, i tretirane su istovremeno sa G-2-MePE. G-2-MePE tretman smanjuje plastičnost OD kod adultnih Mecp2+/- miševa, ukazujući da G-2-MePE zaista može brzo indukovati stabilizaciju ili sazrevanje sinapse.

Bradikardija kod MeCP2-/y miševa je tretirana sa G-2-MePE

[0205] Dodatno ispitivanju efikasnosti G-2-MePE u ublažavanju neurofizioloških simptoma, tražili smo da karakterizujemo njegove efekte na opšte zdravstveno stanje organizma. Klinički i eksperimentalni dokazi pokazuju disfunkcije autonomnog sistema kao što su labilni disajni ritmovi i smanjeni bazalni srčani vagusni ton kod pacijenata sa Rett-ovim sindromom (Julu et al., 2001). Slaba kontrola mehanizama povratne sprege koji regulišu homeostazu krvnog pritiska preko simpatičkog sistema, na primer hiperventilacijom-indukovano smanjenje pulsa, uobičajeno je kod pacijenata sa Rett-ovim sindromom i može izazvati srčane aritmije opasne po život (Acampa i Guideri, 2006; Julu et al., 2001).

[0206] Patogeneza srčane disautonomije, iako nije dobro shvaćena, sugeriše da nezrele nervne veze u moždanom stablu mogu biti uzrok. Da bi se ispitale abnormalnopsti pulsa kod MeCP2-/y miševa i efekat G-2-MePE tretmana, pratili smo puls u realnom vremenu kod neanesteziranih životinja divljeg tipa i MeCP2-/y tretiranih sa vehikulumom ili G-2-MePE. Miševi divljeg tipa prikazuju regularnu distribuciju merenja pulsa centriranu oko 750 udaraca u minuti. Nasuprot tome, MeCP2-/y miševi pokazuju neregularniji puls sa nižom prosečnom stopom, čija je pojava značajno smanjena nakon tretmana sa G-2-MePE.

G-2-MePE primena poboljšava lokomotornu aktivnost i dužinu života

[0207] MeCP2-/y miševi razvijaju Rett-slične simptome sa početkom od 4-6 nedelja starosti kada progresivno postaju letargični, razvijaju ataksiju hoda i umiru između 10 i 12 nedelja starosti (Chen et al., 2001). Bazalna lokomotorna aktivnost je takođe snimljena kod miševa nakon 6 nedelja brojanjem noćnih događaja prelaska preko infracrvenog zraka unutar kaveza. MeCP2 knockout miševi (KO) pokazuju izrazito smanjene nivoe lokomotorne aktivnosti u poređenju sa miševima divljeg tipa (WT), ali tretman sa G-2-MePE (KO-T) podiže ove nivoe.

[0208] Konačno, u poređenju sa MeCP2 KO iz istog legla, MeCP2-/y mišecvi tretirani sa G-2-MePE takođe pokazuju ∼50% povećanje u očekivanoj dužini života (povećanjeu 0.5 verovatnoći stope preživljavanja).

[0209] Takođe smo merili efekat G-2-MePE tretmana na veličinu some neurona u hipokampusu. Miševi su tretirani sa G-2-MePE kao što je prethodno opisano za lokomotornu aktivnost. Veličina some neurona u CA3 regionu hipokampusa je značajno promenjena kod MeCP2 KO životinja u odnosu na životinje divljeg tipa. G-2-MePE tretman povećava prosečnu veličinu some kod KO životinja, ali ima mali ili nikakv efekat na veličinu some životinja divljeg tipa.

Primer 10: Efekat oralnog G-2-MePE na preživljavanje kod Rett-ovog sindroma kod miševa

[0210] Kako je Rett-ov sindrom hronični, onesposobljavajući poremećaj koji uključuje gubitak motornih veština, poželjno je tretirati Rett-ov sindrom korišćenjem lako primenjivih preparata. U tom smislu, mogu se iskoristiti prednosti neočekivano korisnih terapeutskih i farmakokinetičkih karakteristika G-2-MePE i srodnih jedinjenja (SAD. pat. br.7,041,314, 7,605,177, 7,714, 070, 7,863,309 i SAD prijave br.11/315,784 i 12/903,844).

[0211] Stoga, primenili smo G-2-MePE oralno na MeCP2 deficijentne miševe kao što je opisano u SAD 2009/0074865. Ukratko, vodeni rastvor, emulzija voda u ulju (mikroemulzija, gruba emulzija ili tečni kristal), ili gel kompozicija koja sadrži farmaceutski efikasnu količinu G-2-MePE (20 ili 80 mg/kg po životinji) primenjena je dnevno. Kod kontrolnih MeCP2 deficijentnih životinja, primenili smo samo fiziološki rastvor, i životinje divljeg tipa su korišćene da bi se dobili bazalni podaci slično dizajnu studija opisanih u prethodnom Primeru 7.

[0212] Kod životinja divljeg tipa, preživljavanje je definisano tako da je 100% u svakoj vremenskoj tački. Kod MeCP2 deficijentnih životinja, preživljavanje je značajno smanjeno. Međutim, nakon oralne primene G-2-MePE na MeCP2 deficijentne miševe, preživljavanje je značajno povećano.

Primer 11: Efekat G-2MePE na aktivnost napada kod Rett-ovog sindroma kod miševa

[0213] Kako su napadi prominentni, rizični i teški za lečenje aspekti Rett-ovog sindroma, odredili smo efekte G-2MePE na aktivnost napada kod MeCP2 deficijentnih životinja. G-2-MePE može biti efikasan u tretiranju aktivnosti napada kod životinja sa neurodegenerativnom bolešću (SAD pat. br. 7,714,020). Stoga, izveli smo eksperimente da odredimo da li G-2-MePE može takođe lečiti aktivnost napada kod MeCP2 deficijentnih miševa.

[0214] Elektroencefalografski snimci miševa divljeg tipa i MeCP2 deficijentnih miševa tretiranih ili sa fiziološkim rastvorom ili sa G-2-MePE dobijeni su korišćenjem postupaka opisanih u SAD pat. br.7,714,020.

[0215] Pronašli smo da G-2MePE može biti efikasan u smanjivanju i motornih napada i napada bez konvulzija.

Zaključci

[0216] Na osnovu naših in vivo i in vitro studija MeCP2 deficijentnih životinja, zaključujemo da G-2-MePE može biti efikasna terapija za tretiranje ljudi sa Rett-ovim sindromom. Dodatno, kako G-2-MePE ima neočekivano duži polu život od jedinjenja koje se javlja u prirodi ((1-3) IGF-1; Glicil-Prolil-Glutamat ili GPE) (Sl. 21), zaključujemo da upotreba G-2-MePE ima uočljive i značajne prednosti u odnosu na druge farmaceutske agense, uključujući GPE.

[0217] Na primer, G-2-MePE se ne razlaže od strane gastrointestinalnih ćelija, preuzimaju ga gastrointestinalne ćelije, i aktivan je u centralnom nervnom sistemu nakon oralne primene (Wen et al., SAD prijava br. 12/283,684; U.S. 2009/0074865, SAD pat. br. 7,887,839), Stoga, G-2MePE ne mora biti dopremljen intravenski, potkožno, intraventrikularno, ili parenteralno. Ustvari, oralne formulacije koje sadrže mikroemulzije, grube emulzije, preparate sa tečnim kristalom, nanokapsule i hidrogelovi mogu se koristiti u proizvodnji preparata za oralnu primenu kao što su tablete, kapsule i gelovi koji mogu poboljšati neurološku funkciju i tretirati neurodegenerativna stanja (SAD pat. br. 7,887,839). G-2-MePE se može koristiti u situacijama u kojima je motorno funkcionisanje pacijenta ispod onoga potrebnog da se proguta tableta ili kapsula. Postoji nekoliko tipova rastvorljivih gelova oralnu primenu jedinjenja, i oni se mogu koristiti za dopremanje G-2-MePE pacijentu. Kako se G-2-MePE može lako primeniti oralno i oralno je efikasan u tretiranju neurodegenerativnih poremećaja, uključujući Rett-ov sindrom, zaključujemo da G-2-MePE može biti pogodan i koristan za dugoročnu terapiju pacijenata sa Rett-ovim sindromom.

[0218] Dalje, kako Rett-ov sindrom deli ključne karakteristike sa drugim poremećajima iz autističnog spektra, G-2-MePE može biti koristan u obezbeđivanju terapeutskih koristi od životinja koji imaju druge ASD, i kod ljudi sa autizmom, Asperger-ovim sindromom, dezinetegrativnim poremećajem u detinjstvu, i nespecifični pervazivni razvojni poremećaj (PDD-NOS).

Primer 12: Tretman ASD

Shank3-deficijentni mišji model

[0219] Shank3-deficijentni miševi su korišćeni u studiji kao model za 22q13 delecioni sindrom povezan sa ASD.

[0220] 22q13 delecioni sindrom je povezan sa delecijama ili mutacijama u Shank3 genu (Bonaglia et al, 2006). Shank3 gen kodira glavni skeletni protein koji formira okvir glutamatergičkih sinapsi (Boeckers et al, 2006). Shank3 je ključni deo jezgra postsinaptičke gustine (PSD) i regrutuje mnoge ključne funkcionalne elemente u PSD i sinapsi, uključujući komponente α-amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazol-propionsku kiselinu (AMPA), metabotropni glutamat (mGlu), N-metil-D-asparaginsku ksielinu (NMDA) glutamatnih receptora, kao i citoskeletne elemente. Nedavne studije istraživanja stope 22q13 delecija / Shank3 mutacija sugerišu da haploinsuficijencija Shank3 može izazvati monogenski oblik ASD sa učestanošću od 0.5% do 1% ASD slučajeva (Durand et al, 2007; Moessner et al, 2007; Gauthier et al, 2008).

[0221] Generisanje mišjeg modela sa disruptovanom ekspresijom Shank3 pune dužine je prethodno opisano u tehnici (Bozdagi et al., Molecular Autism 2010, 1:15, p4). Ukratko, Bruce4 C57BL/6 embrionalne stem ćelije su korišćene za generisanje mišje linije koja je imala loxP lokuse inserirane pre egzona 4 i egzona 9. Floksovani alel je isečen i održana je linija sa delecijom egzona 4 do 9, tj. kompletna delecija ankirin ponavljajućih domena Shank3. Miševi divljeg tipa (+/+), heterozigotni (+/-) i knockout (-/-) su proizvedeni, sa Mendelovim učestanostima od heterozigot-heterozigot ukršatanja. 50% smanjenja pune dužine Shank3 iRNA je potvrđeno kod heterozigota (qPCR) kao i smanjena ekspresija Shank3 proteina (imunoblotingom sa Shank3 antitelom N69/46).

[0222] Heterozigotni miševi generisani ukrštanjem miševa divljeg tipa sa heterozigotima korišćeni su u ovom primeru da bi predstavljali najbolji model haploinsuficijencije Shank3, odgovorne za 22q13 delecioni sindrom.

Metodi

Tretman lekom

[0223] 1 do 3 meseca stari miševi divljeg tipa i heterozigotni Shank3-deficijentni miševi su podeljeni u 4 grupe za tretman: placebo tretirani divlji tip, placebo tretirana Shank3-deficijentna grupa i dve Shank3-deficijentne G-2-MePE tretirane grupe. Životinjama je dat placebo (voda) ili G-2-MePE formulisan u vodi datoj oralno, b.i.d 14 dana. G-2-MePE je primenjen u dve doze: 15 ili 60 mg/kg.

Metodologija

[0224] Detaljan opis metodologije može se naći u Bozdagi et al. (Molecular Autism 2010, 1:15).

Analiza ponašanja

[0225] Procene ponašanja su urađene u nekoliko vremenskih tačaka, i uključuju analizu socijalnih interakcija i ultrazvučne socijalne komunikacije, zajedno sa metodologijom opisanom od strane Bozdagi et al. Ukratko, procenjivane su mužjak-ženka socijalne interakcije u svakoj grupi tretmana. Subjekti mužjaci su smešteni zajedno i individualno testirani u čistim kavezima sa čistom prostirkom. Svaka sesija testa trajala je 5 min. Svaki od subjekata miševa je uparen sa različitom nepoznatom estrusnom C57BL/6J ženkom. Digitalna televizijska kamera zatvorenog kola (Panasonic, Secaucus, NJ, USA) postavljena je horizontalno 30 cm od kaveza. Ultrazvučni mikrofon (Avisoft UltraSoundGate condenser microphone capsule CM15; Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany) postavljen je 20 cm iznad kaveza. Učestanost uzorkovanja za mikrofon je 250 kHz, i rezolucija je 16 bita. Iako korišćena oprema ne može napraviti razliku između zova emitovanog od subjekta mužjaka i ženskog partnera, preponderansa zova tokom interakcije mužjak-ženka kod miševa je obično emitovana od strane mužjaka. Čitav aparat se nalazio u komori koja ublažava zvukove (ENV-018V; Med Associates, St Albans, VT, USA) osvetljenoj sa crvenim svetlom od 25-Watt. Video snimci od subjekata mužjaka su nakon toga bodovani od strane istraživača neobaveštenog o genotipu subjekta i grupi tretmana na osnovu mera nos-nos njuškanja, nos-anogenitalno njuškanje i njuškanje drugih regiona tela, korišćenjem Noldus Observer softvera (Noldus Information Technology, Leesburg, VA, USA). Ultrazvučne vokalizacije su identifikovane ručno od strane dva visoko utrenirana istraživača neobaveštena u odnosu na informacije o genotipu/grupi tretmana, i osnovni statistički parametri su izračunati korišćenjem Avisoft paketa. Konkordanca je 95%. Podaci su analizirani korišćenjem Student-ovog t-test za nezavisne uzorke.

[0226] Testiranje olfaktorne habituacije/dishabituacije je izvedeno kod mužjaka i ženki miševa za svaku grupu. Metodologija je kao što je prethodno opisana (Silverman et al 2010, Yang et al 2009 i Silverman et al 2010). Nesocijalni i socijalni mirisi su prezentovani na seriji pamučnih štapića sekvencijalno ubacivanih u kavez, svaki 2 min, u sledećem redosledu: voda, voda, voda (destilovana voda); badem, badem, badem (1:100 razblaženje ekstrakta badema); banana, banana, banana (1:100 razređenje veštačkog ukusa banane); socijalni 1, socijalni 1, socijalni 1 (prevučenih od dna kaveza sa nepoznatim po polu odgovarajućim B6 miševima); i socijalni 2, socijalni 2, socijalni 2 (prevučenih od drugog dna kaveza sa drugom grupom nepoznatih po polu odgovarajućih 129/SvImJ miševa). Jednofaktorska ANOVA sa ponovljenim merenjima je izvedena unutar svake grupe tretmana za svaki set događaja habituacije i svaki događaj dishabituacije, nakon čega je urađen Tukey post hoc test.

Elektrofiziologija preseka hipokampusa

[0227] Post-mortem, kosi preseci hipokampusa (350 mm) pripremljeni su od miševa korišćenjem aparata za sečenje tkiva. Preseci su održavani i eksperimenti su izvedeni na 32°C. Izvršena je perfuzija preseka sa Ringer-ovim rastvorom koji sadrži (u mM): NaCl, 125.0; KCl, 2.5; MgSO4, 1.3; NaH2PO4, 1.0; NaHCO3, 26.2; CaCl2, 2.5; glukoza, 11.0. Ringer-ov rastvor je barbotiran sa 95% O2/5% CO2, na 32°C, tokom ekstracelularnih snimanja (rastvor za elektrode: 3 M NaCl). Preseci su održavani 1 č pre ustanovljavanja bazalnog nivoa polja ekscitatornih postsinaptičkih potencijala (fEPSPs) snimljenih na striatum radiatum u oblasti CA1, izazvanih stimulacijom Schaffer-ovih kolateralnih-komisuralnih aferenata (100 ms puls svakih 30 s) sa bipolarnim tungsten elektrodama postavljenim u oblast CA3. Intenzitet test stimulusa je podešen da se dobiju fEPSPs sa amplitudama koje su jednake polovini maksimalnog odgovora. EPSP inicijalni nagib (mV/ms) određen je iz prosečnog talasa četiri uzastopna odgovora. Ulazno-izlazne (I/O) krive su generisane plotovanjem fEPSP nagiba nasuprot „fiber volley“ amplitude u rastvoru sa niskom koncentracijom Mg<2+>(0.1 mM). AMPA receptor-posredovani i NMDA receptorposredovani I/O odnosi su mereni u prisustvu jonotropnih antagonista glutamat receptora: 2-amino-2-fosfonopentanske kiseline APV (50mM) i 6-cijano-7-nitrohinoksalin-2,3-diona CNQX (100mM). Upareni-pulsni odgovori su mereni sa interstimulus intervalima od 10 do 200 ms, i izraženi su kao odnos prosečnih odgovora na drugi stimulacioni puls prema prvom stimulacionom pulsu.

[0228] LTP je indukovan ili visokofrekventnim stimulusom (četiri puta od 100 Hz, 1 s stimulacija razdvojena sa 5 min), ili sa teta-burst stimulacijom (TBS) (10 puta burst od četiri pulsa na 100 Hz razdvojeni sa 200 ms), ili sa pojedinačnom 100 Hz stimulacijom, za kontrolne i genetički modifikovane miševe. Da bi se indukovala dugotrajna depresija (LTD), Schaffer-ove kolaterale su stimulisane sa niskom frekvencijom uparenog pulsa stimulusa niske frekvencije (900 pulseva na 1 Hz 15 min) da bi se indukovao mGlu receptor-zavisni LTD. Rezultati su izraženi kao srednje vrednosti ± SD, i statističke analize su izvedene korišćenjem analize varijanse (ANOVA) ili Student-ovim ttestom, sa značajnošću postavljenom na α nivo od 0.05.

Rezultati

Ponašanje

[0229] Kumulativno trajanje ukupnog socijalnog njuškanja od strane mužjaka test subjekata je niže u placebo tretiranoj Shank3-deficijentnoj grupi nego u placebo tretiranoj grupi divljeg tipa. Dodatno, manje ultrazvučnih vokalizacija je emitovano od strane placebo tretirane Shank3-deficijentne grupe nego kontrola divljeg tipa tokom mužjak-ženka socijalnih interakcija.

[0230] G-2-MePE tretman u dve Shank3-deficijentne grupe rezultuje u značajnom povećanju kumulativnog trajanja ukupnog socijalnog njuškanja u poređenju sa placebo tretiranom Shank3-deficijentnom grupom. Dodatno, G-2-MePE tretirane grupe prikazuju povećan broj ultrazvučnih vokalizacija nego placebo tretirana mutantna grupa.

[0231] U studiji olfaktorne habituacije/dishabituacije, namenjenoj da potvrdi da su miševi sposobni da detektuju socijalne feromone, sve 4 grupe prikazuju normalne nivoe habituacije (indikovane smanjenim vremenom provedenim u njuškanju sekvence tri ista mirisa), i očekivane dishabituacije (indikovane povećanim vremenom provedenim u njuškanju različitog mirisa).

Elektrofiziologija

[0232] Plotovanje nagiba polja ekscitatornog postsinaptičkog potencijala (fEPSP) nasuprot intenziteta stimulusa pokazuje smanjenje u I/O krivama kod placebo tretirane Shank3-deficijentne grupe nasuprot kontrolnoj grupi. U heterozigotnoj placebo tretiranoj grupi takođe uočavamo smanjenje u AMPA receptor-posredovanim poljima potencijala, što se odražava u 50% smanjenju prosečnog nagiba I/O funkcije u poređenju sa kontrolnom grupom divljeg tipa. Nasuprot tome, kada je I/O odnos analiziran u prisustvu kompetitivnog CNQX antagonista AMPA/kainat receptora da bi se merila sinaptička funkcija NMDA receptora, nema razlike između divljeg tipa i placebo tretiranih heterozigotnih grupa. Ovi rezultati pokazuju da postoji specifično smanjenje u AMPA receptorposredovanoj bazalnoj transmisiji kod Shank3 heterozigotnih miševa.

[0233] G-2-MePE tretman u obe heterozigotne grupe normalizuje AMPA receptor-posredovana polja potencijala i izaziva povećanje u prosečnom nagibu I/O funkcije u poređenju sa Shank3-deficijentnom grupom tretiranom placebom.

[0234] Održavanje LTP u Shank3-deficijentnoj grupi tretiranoj placebom je jasno poremećeno u poređenju sa kontrolom divljeg tipa. TBS LTP testovi (10 puta burst od 4 pulsa na 100 Hz razdvojeni sa 200 ms) takođe pokazuju značajno smanjenje u potencijaciji 60 min nakon TBS u Shank3-deficijentnoj grupi tretiranoj placebom.

Nasuprot izmenjenoj sinaptičkoj plastičnosti uočenoj sa LTP, dugotrajna depresija (LTD) nije značajno promenjena u mutantnoj grupi. G-2-MePE tretman je povećao hipokampusnu dugotrajnu potencijaciju (LTP) i njeno održavanje kod obe Shank3-deficijentne grupe u poređenju sa Shank3-deficijentnom grupom tretiranom placebom.

Diskusija

[0235] Slaba socijalna kompetentnost i repetitivna ponašanja su zajedničke karakteristike i ključne dijagnostičke mere svih oblika ASD. Usporeni intelektualni razvoj i manje razvijene jezičke veštine su takođe zajedničke karakteristike prisutne u svim ASD, sa izuzetkom Asperger-ovog sindroma.

[0236] Prethodno opisani životinjski modeli prihvaćeni su u tehnici da demonstriraju slične simptome kao humana klinička stanja. Svi mutantni modeli razmatrani prethodno (NLGN3, NLGN4, CADM1, NRXN1, FMR1, shank3) pokazuju poremećene socijalne veštine ili povećanu socijalnu anksioznost. Smanjena ekscitatorna transmisija u hipokampusu identifikovana je kod NRXN1, shank3, MeCP2 i FMR1 mutantnih životinjskih modela. Trenutno nisu opisani poligenetički ili multifaktorski modeli ASD. Prethodno opisani životinjski modeli, zasnovani na genetičkim defektima za koje se zna da daju ASD u humanoj populaciji, obezbeđuju najbolju priliku za testiranje efikasnosti ASD terapija.

[0237] Stoga efikasnost G-2-MePE u životinjskim modelima ASD je prilično prediktivna za njenu efikasnost u humanom subjektu koji pati od ASD.

Primer 13: G-2-MePE tretman menja morfologiju neurona u in vitro humanom modelu Rett-ovog sindroma

[0238] Da bi se testirali efekti G-2-MePE na morfologiju neurona, koristili smo in vitro model RTT opisan u Marchetto et al., A model for neural development i treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells, Cell 143:527-539 (2010) (uključujući suplement). Model koristi indukovane pluripotenetne stem ćelije (iPSCs) generisane iz fibroblasta humanih RTT pacijenata koji nose različite MeCP2 mutacije.

Metodi

Ćelijska kultura i retrovirusna infekcija

[0239] RTT fibroblasti (koji nose 4 različite MeCP2 mutacije) i kontrolni fibroblasti su generisani od eksplanata dermalnih biopsija. shRNA protiv ciljnog MeCP2 gena je kloniran u LentiLox3.7 lentivirusni vektor (kao što je opisano u Marchetto et al.). Fibroblasti su inficirani sa retrovirusnim reprogramirajućim vektorima (Sox2, Oct4, c-Myc i Klf4). Dva dana nakon infekcije, fibroblasti su postavljeni na ploče na mitotički inaktivirane mišje embrionalne fibroblaste sa hESC medijumom. Nakon 2 nedelje, iPSC kolonije koje se pojavljuju iz pozadine fibroblasta su ručno pokupljene i prenete na matrigel-obložene petri šolje bez uslova za hranjenje (BD) korišćenjem mTeSR™ (Stem Cell Technologies) medijuma kulture embrionalnih stem ćelija i pasažirane su ručno. Profili ekspresije gena generisanih klonova mereni su korišćenjem Affymetrix Gene Chip™ nizova humanog genoma da bi se potvrdilo da je reprogramiranje uspešno.

Nervna diferencijacija: NPCs i zreli neuroni

[0240] Da bi se dobile nervne progenitorske ćelije (NPCs), embrioidna tela (EBs) su formirana mehaničkom disocijacijom ćelijskih klastera i postavljanjem na šolje sa niskom adhezivnošću u hESC medijumu bez FGF25-7 dana. Nakon toga, EBs su postavljene na poli-ornitin/laminin-obložene šolje u DMEM/F12 plus N2 medijum (suplement za rast i ekspresiju post mitotičkih ćelija bez seruma). Rezultujuće rozete su sakupljene nakon 7 dana i disocirane sa akutazom i postavljene na obložene ploče sa NPC medijumom (DMEM/F12; 0.5X N2; 0.5X B27 i FGF2). Homogene populacije NPCs su postignute nakon 1-2 pasaža sa akutazom u istim uslovima. Da bi se dobili zreli neuroni, plutajuće EBs su tretirane sa 1uM ili retinoinskom kiselinom 3 nedelje (dajući ukupno vreme deferencijacije od 4 nedelje). Zrele EBs su disocirane sa papainom i DNKazom 1 č na 37°C i postavljene na poliornitin/laminin-obložene posude u NPC medijumu bez FGF2.

Tretman sa G-2-MePE

[0241] RTT kulture neurona su tretirane sa G-2-MePE (1nM-10mM) 1 nedelju.

Imunohistohenija i kvantifikacija morfologije neurona

[0242] Ćelije su fiksirane u 4% paraformaldehidu i permeabilizovane sa 0.5% Triton-X100 u PBS. Ćelije su zatim blokirane u PBS sa 0.5% Triton-X100 i 5% serumom magarca 1 č na sobnoj temeperaturi. Fluorescentni signali su detektovani korišćenjem Zeiss invertnog mikroskopa i slike su obrađene sa Photoshop CS3. Korišćena su sledeća primarna antitela: TRA-1-60, TRA-1-81 (1:100), Nanog i Lin28 (1:500), human Nestin (1:100), Tuj-1 (1:500), Map2 (1:100); meCP2 (1:1000; VGLUT1 (1:200), Psd95 (1:500), GFP (1:200), Sox1 (1:250), Mushasi1 (1:200) i me3H3K27 (1:500). Veličina some ćelije je merena korišćenjem pogodnog softvera (npr. ImageJ) nakon identifikacije neurona korišćenjem Syn::EGFP™. Morfologije dendrita i trnova neurona proučavani su sa pojedinačnih projekcija z-stekova optičkih preseka i skenirani u 0.5um inkrementima koji su u korelaciji sa vrednošću rezolucije na z-ravni. Svaki optički presek je rezultat 3 skena na 500 lps nakon čega je izvršeno Kalman filtriranje. Za kvantifikaciju sinapse, slike su uzete sa z-step od 1um korišćenjem Biorad radiance 2100™ konfokalnog mikroskopa. Kvantifikacija sinapsi je urađena slepo u odnosu na genotip. Brojani su samo VGLUT1 punktumi duž Map2-pozitivnih nastavaka. Statistička značajnost je testirana korišćenjem dvofaktorskog ANOVA testa i Bonferroni post-testa.

Vizuelizacija kalcijuma

[0243] Neuronske mreže izvedene iz humanih iPSCs su inficirane sa lentivirusnim vektorom koji nosi Syn:DsRed reporter konstrukt. Ćelijske kulture su isprane dva puta sa sterilnim Krebs HEPES puferom (KHB) i inkubirane sa 2-5 mM Fluo-4AM™ (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) u KHB 40 minuta na sobnoj temepraturi. Višak boje je uklonjen ispiranjem dva puta sa KHB, i urađeno je dodatnih 20 minuta inkubacije da bi se uravnotežila koncentracija intracelularne boje i omogućila de-esterifikacija. Sekvence slika tokom vremena (100X uveličanje) od 5000 frejmova su dobijene na 28 Hz sa regionom od 336 x 256 piksela, korišćenjem Hamamatsu ORCA-ER™ digitalne kamere (Hamamatsu Photonics K.K., Japan) sa 488 nm (FITC) filterom na Olympus IX81 invertnom fluorescentnom konfokalnom mikroskopu (Olympus Optical, Japan). Slike su dobijene sa MetaMorph 7.7™ (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). Slike su nakon toga obrađene korišćenjem ImageJ™ i po potrebi napravljenim rutinama u Matlab 7.2™ (Mathworks, Natick, MA).

Elektrofiziologija

[0244] Snimanja postupkom lokalne fiksacije potencijala iz cele ćelije izvedena su sa ćelija co-kultivisanim sa astrocitama nakon 6 nedelja diferencijacije. Vršena je stalna perfuzija kupatila sa svežim HEPES-puferovanim fiziološkim rastvorom (videti postupke u suplementu za recept). Mikropipete za snimanje (otpor vrha 3-6 MΩ) su napunjene sa internim rastvorom opisanim u Suplementu. Snimanja su izvedena korišćenjem Axopatch 200B™ pojačala (Axon Instruments). Signali su filtrirani na 2 kHz i uzorkovani na 5 kHz. Kapacitivnost cele ćelije je u potpunosti kompenzovana. Serijski otpor je nekompenzovan ali je praćen tokom eksperimenta preko amplitude kapacitivne struje kao odgovor na 10-mV puls. Sva snimanja su izvedena na sobnoj temepraturi i hemikalije su kupljene od Sigma. Frekvencija i amplituda spontanih postsinaptičkih struja mereni su sa Mini Analysis Program™ softverom (Synaptosoft, Leonia, NJ). Statistička poređenja WT i RTT grupa su napravljena korišćenjem neparametrijskog Kolmogorov-Smirnov dvosmernog testa, sa kriterijumom značajnosti od p = 0.05. EPSCs su blokirani sa CNQX ili DNQX (10-20 mM) i IPSPs su inhibirani sa bikukulinom (20 mM).

Rezultati

[0245] RTT iPSC-izvedeni neuroni su karakterizovani smanjenim brojem glutamatergičkih sinapsi, smanjenom gustinom trnova i manjom veličinom some. RTT neuroni takođe pokazuju određene elektrofiziološke defekte, tj. značajno smanjenje frekvencije i amplitude spontanih sinaptičkih struja u poređenju sa kontrolama. RTT neuroni pokazuju smanjenu frekvenciju intracelularnih kalcijum tranzijenata.

[0246] Testiramo G-2-MePE u prethodni model da bi testirali da li se bilo koja od patologija RTT fenotipa može ublažiti.

[0247] Tretman ćelijskih kultura sa svakom koncentracijom leka poboljšava sve morfološke i fiziološke parametere tretiranih RTT ćelijskih kultura u poređenju sa ne-tretiranim RTT kontrolama. Specifično, uočavamo značajno povećanje u broju glutamatergičkih sinapsi u G-2-MePE tretiranim RTT ćelijama. Sve koncentracije G-2-MePE tretmana povećavaju broj VGLUT1 punktuma u RTT-izvedenim neuronima. G-2-MePE tretman normalizuje frekvenciju i amplitudu spontanih postsinaptičkih struja kao i frekvenciju kalcijum tranzijenata generisanih sinaptičkom aktivnošću G-2-MePE tretiranih RTT neurona.

[0248] U sadašnjem in vitro modelu humanog RTT, iPSCs izvedene iz RTT pacijenata i neurona diferenciranih od njih su karakterizovani abnormalnostima u MeCP2 ekspresiji. Kao što je razmatrano u prethodnom detaljnom opisu pronalaska, velika većina RTT slučajeva su povezani sa mutacijama MeCP2 gena. Stoga je efikasnost G-2-MePE u sadašnjem in vitro modelu humanog RTT prilično prediktivna za njegovu efikasnost kod humanog subjekta koji pati od RTT.

Primer 14: Efekti G-2-MePE kod ljudi sa Rett-ovim sindromom

Metodi

[0249] Trideset subjekata sa Rett-ovim sindromom je regrutovano. Subjekti su žene i starosti 16 i 29 godina (Srednja vrednost = 12.1 SD = 4.4). Svi subjekti imaju IQ <60 i mutacije MECP2 gena. Subjekti takođe pokazuju ili šiljke u EEG ili povećanje u trakama niske frekvencije EEG kao što je detekovano sa brzom Furijeovom transformacijom (FFT). Subjekti su dobili instrukcije da medikamenti koji se istovremeno primenjuju treba da budu stabilni najmanje šest nedelja pre studije. Subjekti koji primaju medikamente za tretiranje znakova nepažnje testirani su ujutru i date su im instrukcije da uzimaju njihove medikamente popodne. Subjekti sa QTc intervalom >451 msec su isključeni.

[0250] Studija je randomizovana dvostruko slepa placebo kontrolisana paralelna studija sa tri doze ili placeba, 10 mg/kg T.I.D oralnog G-2-MePE pet dana, ili 30 mg/kg T.I.D. oralnog G-2-MePE.

[0251] Subjekti su testirani na bazalnom nivou korišćenjem sledećih instrumenata: The Rett Syndrome Natural History / Clinical Severity Scale, Aberrant Behavior Checklist Community Edition (ABC), Vinelands, Clinical Global Impression of Severity (CGI-S) i njihovi staraoci su popunili Caregiver Strain Questionnaire (CSQ).

[0252] Subjekti su dovedeni na kliniku na stacionarnoj bazi da bi se omogućilo inicijalno snimanje bazalnog nivoa EEG, ECG i stope disanja kontinuirano 24 časa korišćenjem tehnologije polisomnografije. Pokreti ruku su takođe snimani korišćenjem Q-Sensor™. Izvedene EEG mere uključuju: šiljci u jedinici vremena u EEG, ukupna snaga traka frekvencije EEG, QTc i varijabilnost pulsa (HRV), i nepravilnost disanja.

[0253] Štetni događaji su takođe snimljeni korišćenjem standardnih bezbedonosnih postupaka i SMURF izazivanjem štetnih događaja.

[0254] Statistički, efekat tretmana sa G-2-MePE je analiziran izvođenjem ponovljene analize kovarijanse (ANCOVA) na efekte tretmana u odnosu na promenu od skorova bazalnog nivoa.

Results

[0255] Tretman sa G-2-MePE ne prozviodi više štetnih događaja nego što su prisutni tokom tremana sa placebom, pri čemu su svi štetni događaji bili kratkotrajni i blagi. Nisu prijavljeni nikakvi ozbiljni štetni događaji. Nisu prijavljena povećanja QTC.

[0256] Nisu uočeni efekti na stopu disanja ili varijabilnost pulsa.

[0257] Tretman sa G-2-MePE proizvodi značajno ukupno smanjenje šiljaka po jedinici vremena u EEG. Tretman sa 30 mg/kg T.I.D. oralnog G-2-MePE smanjuje aktivnost šiljaka u poređenju sa placebom. Ova doza G-2-MePE takođe smanjuje jačinu delta trake EEG u poređenju sa placebom.

[0258] Tretman sa G-2-MePE takođe smanjuje ukupne pokrete ruke u periodu od dvadeset četiri časa kao što je izbrojano sa Q-Sensor™ uređajem. Ovaj efekat je značajan za 30 mg/kg T.I.D. dozu u poređenju sa placebom.

[0259] Tretman sa G-2-MePE nema ukupan značajan efekat na Rett Syndrome Natural History / Clinical Severity Score. Međutim, 30 mg/kg T.I.D. oralnog G-2-MePE, u poređenju sa placebom, proizvodi značajne efekte na sledećim subskalama: "Testirana neverbalna komunikacija pri ovoj poseti"; "Epilepsija/Napadi pri ovoj poseti: i "Upotreba ruke".

Zaključci

[0260] Tretman sa G-2-MePE proizvodi značajna poboljšanja u funkciji centralnog nervnog sistema u predmetnoj studiji. Uprkos relativno kratkotrajnog tretmana, abnormalnost u električnoj aktivnosti mozga je smanjena, što je jasan signal efikasnosti. Ovaj efekat je zavisan od doze, uočen nakon tretmana sa 30 mg/kg T.I.D. oralnog G-2-MePE. Ovi efekti odražavaju poboljšavanja u funkciji CNS uočene u mecp2 mišjem knockout transgenom modelu Rett-ovog sindroma nakon primene G-2-MePE.

[0261] Efekti zavisni od doze takođe su uočeni kod korišćenja ruku, kao što je procenjeno objektivnim uređajem za brojanje i subjektivnom ocenom. Ovo je od interesa jer je besmisleno uvrtanje ruku i karakterisitčno za klinički fenotip Rett-ovog sindroma i specifično je za ovaj poremećaj.

[0262] Ocena neverbalne komunikacije Rett-ovog sindroma u Natural History / Clinical Severity Scale je popravljena tretmanom. Ova mera primarno procenjuje kontakt očima. Ova daje nadu da dugoročni tretman sa G-2-MePE može popraviti socijalno povezivanje u populaciji.

[0263] G-2-MePE se dobro toleriše u ovoj pouplaciji. Nisu uočeni efekti ili u standardnim merama ili u oblastima od specifičnog interesa u populaciji pacijenata, kao što je prolongiranje QTc intervala ili apnea.

Primer 15: Efekti G-2MePE na ljude sa poremećajima iz autističnog spektra

Metodi

[0264] Da bi se odredilo da li G-2-MePE može tretirati simptome ASD, izveli smo studiju kod ljudi sa ASD. Regrutovano je dvadeset subjekata sa poremećajem iz spektra autizma. Subjekti su muškarci i starosti između 16 i 65 godina (Srednja vrednost = 18.1 SD = 3.4). Svi subjekti imaju IQ >60 i striktnu DSM-IV-TR dijagnozu autističnog poremećaja ili Asperger-ovog poremećaja. Subjekti takođe ispunjavaju kriterijume za poremećaj iz spektra autizma prema ADI-R i ADOS-G instrumentima, i ispunjavaju predložene DSM-V kriterijume za poremećaj iz spektra autizma. Subjekti su dobili instrukcije da medikamenti koji se istovremeno primenjuju treba da budu stabilni najmanje šest nedelja pre studije. Subjekti koji primaju medikamente za tretiranje znakova nepažnje testirani su ujutru i date su im instrukcije da uzimaju njihove medikamente popodne. Subjekti bolje tretirani sa atipičnim anti-psihotičkim medikamentima namenjenim autizmu su isključeni. Izvršen je skrining za poznate genetičke poremećaje uključujući i one sa sindromom fragilnog X hromozoma ili tuberoznom sklerozom su isključeni. Subjekti sa nekontrolisanom epilepsijom su isključeni.

[0265] Studija je duplo slepa placebo-kontrolisana ukrštena studija sa tri faze. Subjekti ulaze u svaku fazu ukršanja po randomizovanom redosledu. U test fazama, subjekti primaju ili palcebo, 10 mg/kg T.I.D oralnog G-2-MePE pet dana, ili 30 mg/kg T.I.D. oralnog G-2-MePE. Svaka faza ukrštanja je razdvojena periodom ispiranja od četrnaest dana.

[0266] Subjekti su testirani na bazalnom nivou korišćenjem sledećih instrumenata: Wechsler IQ, Abberant Behavior Checklist Community Edition (ABC), Vinelands, Yale-Brown Obsessive Compulsive Scale (YBOCS) compulsion subscale, Social Responsiveness Scale (SRS), Clinical Global Impression of Severity (CGI-S) i njihovi staraoci su popunili Caregiver Strain Questionnaire (CSQ).

[0267] Subjekti su ispunili dva zadatka –Reading the Mind in the Eyes Test- Revised (RMET) i Eye Tracking (ET) zadatak, kao i Clinical Global Impression of Improvement (CGI-I). Zadaci počinju dva sata nakon primene placeba ili bilo koje doze G-2-MePE. RMET je kompjuterski zasnovan zadatak koji procenjuje sposobnost čitanja osećanja iz očiju suptilnih afektivnih facijalnih izraza i široko je urađeni test prepoznavanja osećanja kod pacjenata sa autizmom (2001). Važno je da je RMET sposoban da otkrije poboljšanje čak i sa jednom dozom farmakološkog agensa (Guastella et al., 2010). Problemi sa praćenjem očiju karaketristični su za pacijente sa autizmom koji provedu manje vremena gledajući u oči na fotografijama ljudskih lica. Ponovo, jedna primena farmakološke intervencije može ublažiti teškoće praćenja kod autizma (Andari et al, 2010).

[0268] Štetni događaji su takođe zabeleženi upotrebom standardnih mera bezbednosti.

[0269] Statistički, efekat tretmana sa G-2-MePE je analiziran izvođenjem ponovljene analize kovarijanse (ANCOVA) na efektu tretmana na promenu od polaznih ocena.

Rezultati

[0270] Tretman sa G-2-MePE ne proizvodi više štetnih efekata nego što su prisutni u toku tretmana sa placebom, pri čemu su svi štetni događaji kratkog trajanja i umerene težine. Nisu objavljeni ozbiljni štetni događaji.

[0271] Tretman sa G-2-MePE proizvodi značajno ukupno poboljšanje u učinku RMET testa. Tretman sa 30 mg/kg T.I.D. oralnim G-2-MePE povećava procenat ispravnih odgovora na RMET.

[0272] Tretman sa G-2-MePE proizvodi značajno ukupno poboljšanje u vremenu potrošenom u gledanju na region oka u ET testu. CGI-I ocene na kraju perioda tretmana pokazuju značajnu razliku. Pozitivni efekti tretmana su povezani sa polaznim CSQ ocenama.

Zaključci

[0273] Tretman sa G-2-MePE proizvodi značajna poboljšanja u učinku u Reading the Mind in the Eyes Test -Revised, i u učinku Eye Tracking zadatka. Ovaj efekat je zavistan od doze, zabeležen posle tretmana 30 mg/kg T.I.D. oralno G-2-MePE.

[0274] Poboljšanje u ovim merama reflektuje poboljšanje u obradi socijalnih informacija. Deficiti u socijanoj interakciji su osnovni simptom dijagnostički za poremećaje iz spektra autizma, i ovo je prema tome ključni nalaz.

[0275] G-2-MePE takođe proizvodi ukupno poboljšanje u funkciji kao što je indeksirano pomoću Kliničkog globalnog utiska poboljšanja. Objašnjenje slobodnog teksta Obrazaca prikaza slučaja iz studije ukazuje na to da je ovaj efekat povezan sa poboljšanjem u socijalnoj povezanosti. Ovo ukazuje na to da promene zabeležene u RMET i ET zadatku mogu imati značaj za socijalne aktivnosti u svakodnevnom životu.

[0276] G-2-MePE je dobro tolerisan u ovoj populaciji.

Primer 16: Životinjski modeli za određivanje efekata G-2-MePE na poremećaje iz spektra autizma

[0277] Efekti G-2-MePE su dalje testirani u sledećim genetičkim modelima ASD: Tbx1 heterozigotni miš, Cntnap2 „knockout“ miš i Slc9a6 „knockout“ miš. G-2-MePE je takođe testiran u fmr1 „knockout“ mišjem modelu sindroma fragilnog X.

[0278] Tbx1. Mutacije TBX1 gena su povezane sa poremećajima iz spektra autizma (Paylor et al., 2006). Transgeni Tbx1 miševi su selektivno oštećeni u socjalnoj interakciji, ultrazvučnoj vokalizaciji, repetitivnim ponašanjima i radnom pamćenju (Hiramoto et al., 2011).

[0279] Cntnap2. Dve trećine pacijenata sa mutacijama gena za contactin associated protein-like 2 (CNTNAP2) su dijagnostifikovani sa poremećajem iz spektra autizma (Alarcon et al., 2008; Arking et al., 2008; Bakkaloglu et al., 2008; Strauss et al., 2006; Vernes et al., 2008). Cntnap2 „knockout“ (KO) miševi ispoljavaju fenotipe povezane sa ASD u socijalnom ponašanju, ultrazvučnoj vokalizaciji i repetitivnim ponašanjima (Penagarikano et al., 2011).

[0280] Slc9a6. Ovaj gen je uključen u sindromski ASD i on kodira natrijum-vodonični izmenjivač 6 (NHE6). Mutacije u SLC9A6 su povezane sa intelektualnom nesposobnošću (Gilfillan et al., 2008) i autističnim ponašanjem (Garbern et al., 2010). Na Slc9a6 KO miševi ispoljavaju motornu hiperaktivnost i cerebelarnu disfunkciju (Stromme et al., 2011).

[0281] Fmr1. Utišavanje FMR1 gena proizvodi sindrom fragilnog X hromozoma, čiji fenotip obuhvata autizam; dve trećine pacijenata sa sindromom fragilnog X hromozoma ispunjavaju kriterijume za poremećaj iz spektra autizma (Harris et al., 2008). Pedijatrijski pacijenti sa sindromom fragilog X hromozoma takođe pokazuju sniženi prag konvulzija. fmr1 „knockout“ miš replicira veći deo fenotipa sindroma fragilnog X hromozoma, uključujući podložnost juvenilnim konvulzijama (Yan et al., 2004).

Metode

[0282] Životinje u svakom od gore navedenih modela su generisane u skladu sa metodologijom opisanom u citiranoj literaturu. Ekvivalenti divljeg tipa su takođe dobijeni za svaki genetički model. Životinje u svakom modelu su podeljene u tri grupe (n=10 do n=20): placebom tretirani miševi divljeg tipa, mutantna G-2-MePE-tretirana grupa i mutantna placebom-tretirana kontrolna grupa. Tretmani su primenjivani intraperitonealno: placebo (fiziološki rastvor) ili 20 mg/kg/dan G-2-MePE. Mere ključnih karakteristika ASD kao što je ispoljen u svakom modelu su uzete u skladu sa citiranom literaturom.

Rezultati

[0283] G-2-MePE tretman značajno poboljšava sve mere povezane sa ASD fenotipom.

Reference

[0284]

Alarcon, M., Abrahams, B.S., Stone, J.L., Duvall, J.A., Perederiy, J.V., Bomar, J.M., Sebat, J., Wigler, M., Martin, C.L., Ledbetter, D.H., Nelson, S.F., Cantor, R.M., and Geschwind, D.H. (2008). Linkage, association, and gene-expression analyses identify CNTNAP2 as an autism-susceptibility gene. Am. J. Hum. Genet.82, 150-159.

Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U, Zoghbi HY. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding metil-CpG-binding protein 2. Nat Genet.199923:185-188

Andari E, Duhamel JR, Zalla T, Herbrecht E, Leboyer M, Sirigu A. (2010) Promoting social behavior with oxytocin in high-functioning autism spectrum disorders. PNAS 107:4389-4394

Arking, D.E., Cutler, D.J., Brune, C.W., Teslovich, T.M., West, K., Ikeda, M., Rea, A., Guy, M., Lin, S., Cook, E.H., and Chakravarti, A. (2008). A common genetic variant in the neurexin superfamily member CNTNAP2 increases familial risk of autism. Am. J. Hum. Genet.82, 160-164.

Bakkaloglu, B., O’Roak, B.J., Louvi, A., Gupta, A.R., Abelson, J.F., Morgan, T.M., Chawarska, K., Klin, A., Ercan-Sencicek, A.G., Stillman, A.A., Tanriover, G., Abrahams, B.S., Duvall, J.A., Robbins, E.M., Geschwind, D.H., Biederer,T., Gunel, M., Lifton, R.P., and State MW (2008). Molecular cytogenetic analysis and resequencing of contactin associated protein-like 2 in autism spectrum disorders.

Bakkaloglu, B., O’Roak, B.J., Louvi, A., Gupta, A.R., Abelson, J.F., Morgan, T.M., Chawarska, K., Klin, A., Ercan-Sencicek, A.G., Stillman, A.A., Tanriover, G., Abrahams, B.S., Duvall, J.A., Robbins, E.M., Geschwind, D.H., Biederer, T., Gunel, M., Lifton, R.P., and State MW (2008). Molecular cytogenetic analysis and resequencing of contactin associated protein-like 2 in autism spectrum disorders. Am. J. Hum. Genet. 82, 165-173.

Baron-Cohen S, Wheelwright S, Hill J, Raste Y, Plumb and (2001) The "Reading the Mind in the Eyes" test, revised version: A study with normal adults, and adults with Asperger’s syndrome or high-functioning autism. J Child Psychol Psychiatry 42:241-251.

Belichenko PV, Oldfors A, Hagberg B, Dahlström A. Rett syndrome: 3-D confocal microscopy of cortical pyramidal dendrites and afferents. Neuroreport.19945:1509-1513

Biederer T, Sara Y, Mozhayeva M, Atasoy D, Liu X, Kavalali ET, Sćdhof TC. (2002) SynCAM, a synaptic adhesion molecule that drives synapse assembly. Science 297(5586): 1525-1531.

Chapleau CA, Larimore JL, Theibert A, Pozzo-Miller L. (2009) Modulation of dendritic spine development and plasticity by BDNF and vesicular trafficking: fundamental roles in neurodevelopmental disorders associated with mental retardation and autism. J. Neurodev. Disord.1: 185-196.

Cheng CM, Mervis RF, Niu SL, Salem N Jr, Witters LA, Tseng V, Reinhardt R, Bondy CA. Insulin-like growth factor 1 is essential for normal dendritic growth. J Neurosci Res.200373:1-9

Comery TA, Harris JB, Willems PJ, Oostra BA, Irwin SA, Weiler IJ, Greenough WT. (1997) Abnormal dendritic spines in fragile X knockout mice: maturation and pruning deficits. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 5401-5404.

Durand CM, Betancur C, Boeckers TM, Bockmann J, Chaste P, Fauchereau F, Nygren G, Rastam M, Gillberg IC, Anckarsäter H, Sponheim E, Goubran-Botros H, Delorme R, Chabane N, Mouren-Simeoni MC, de Mas P, Bieth E, Rogé B, Héron D, Burglen L, Gillberg C, Leboyer M, Bourgeron T. (2007) Mutations in the gene encoding the synaptic scaffolding protein SHANK3 are associated with autism spectrum disorders. Nat Genet.

39: 25-27.

Etherton MR, Blaiss CA, Powell CM, Sćdhof TC. (2009) Mouse neurexin-1α deletion causes correlated electrophysiological and behavioural changes consistent with cognitive impairments. Proc. Nat. Acad. Sci. 106: 17998-18003.

Garbern, J.Y., Neumann, M., Trojanowski, J.Q., Lee, V.M., Feldman, G., Norris, J.W., Friez, M.J., Schwartz, C.E., Stevenson, R., and Sima,A.A. (2010). A mutation affecting the sodium/proton exchanger, SLC9A6, causes mental retardation with tau deposition. Brain 133, 1391-1402.

Gauthier J, Bonnel A, St-Onge J, Karemera L, Laurent S, Mottron L, Fombonne E, Joober R, Rouleau GA. (2005) NLGN3/NLGN4 gene mutations are not responsible for autism in the Quebec population. Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet.132B(1): 74-75.

Gilfillan, G.D., Selmer, K.K., Roxrud, I., Smith, R., Kyllerman, M., Eiklid, K., Kroken, M., Mattingsdal, M., Egeland, T., Stenmark, H., Sjoholm, H., Server, A., Samuelsson, L., Christianson, A., Tarpey, P., Whibley, A., Stratton, M.R., Futreal, P.A., Teague, J., Edkins, S., Gecz, J., Turner, G., Raymond, F.L., Schwartz, C., Stevenson, R.E., Undlien, D.E., and Stromme, P. (2008). SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am. J. Hum. Genet.82, 1003-1010.

Gilman SR, Iossifov I, Levy D, Ronemus M, Wigler M, Vitkup D. Rare de novo variants associated with autism implicate a large functional network of genes involved in formation and function of synapses. Neuron. 2011 70:898-907

Giza J, Urbanski MJ, Prestori F, Bandyopadhyay B, Yam A, Friedrich V, Kelley K, D’Angelo E, Goldfarb M. (2010) Behavioural and cerebellar transmission deficits in mice lacking autism-linked gene Islet Brain-2. J. Neurosci.30: 14805-14816.

Guastella AJ, Einfeld SL, Gray KM, Rinehart NJ, Tonge BJ, Lambert TJ, Hickie IB. (2010) Intranasal oxytocin improves emotion recognition for youth with autism spectrum disorders. Biol Psychiatry.67:692-694 Hagerman R, Hoem G, Hagerman P. (2010) Fragile X and autism: Intertwined at the molecular level leading to targeted treatments. Mol. Autism 1: 12-24.

Harris SW, Hessl D, Goodlin-Jones B, Ferranti J, Bacalman S, Barbato I, Tassone F, Hagerman PJ, Herman H, Hagerman RJ. (2008) Autism profiles of males with fragile X syndrome. Am J Ment Retard.113:427-438.

Hiramoto T, Kang G, Suzuki G, Satoh Y, Kucherlapati R, Watanabe Y, Hiroi N. (2011) Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse model. Hum Mol Genet. 201120:4775-4785.

Hutsler JJ, Zhang H. Increased dendritic spine densities on cortical projection neurons in autism spectrum disorders. Brain Res.20101309:83-94

Irwin SA, Galvez R, Greenough WT. Dendritic spine structural anomalies in fragile-X mental retardation syndrome. Cereb Cortex.200010:1038-1044

Jamain S, Quach H, Betancur C, Rastam M, Colineaux C, Gillberg IC, Soderstrom H, Giros B, Leboyer M, Gillberg C, Bourgeron T; Paris Autism Research International Sibpair Study. (2003) Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat. Genet.34: 27-29.

Jamain S, Radyushkin K, Hammerschmidt K, Granon S, Boretius S, Varoqueaux F, Ramanantsoa N, Gallego J, Ronnenberg A, Winter D, Frahm J, Fischer J, Bourgeron T, Ehrenreich H, Brose N. (2008) Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism. Proc. Nat. Acad. Sci.105: 1710-1715.

Kim HG, Kishikawa S, Higgins AW, Seong IS, Donovan DJ, Shen Y, Lally E, Weiss LA, Najm J, Kutsche K, Descartes M, Holt L, Braddock S, Troxell R, Kaplan L, Volkmar F, Klin A, Tsatsanis K, Harris DJ, Noens I, Pauls DL, Daly MJ, MacDonald ME, Morton CC, Quade BJ, Gusella JF. (2008) Disruption of neurexin 1 associated with autism spectrum disorder. Am. J. Hum. Genet.82: 199-207.

Klemmer P, Meredith RM, Holmgren CD, Klychnikov OI, Stahl-Zeng J, Loos M, van der Schors RC, Wortel J, de Wit H, Spijker S, Rotaru DC, Mansvelder HD, Smit AB, Li KW. Proteomics, ultrastructure, and physiology of hippocampal synapses in a fragile X syndrome mouse model reveal presynaptic phenotype. J Biol Chem.

2011286:25495-25504

Krueger DD, Osterweil EK, Chen SP, Tye LD, Bear MF. (2011) Cognitive dysfunction and prefrontal synaptic abnormalities in a mouse model of fragile X syndrome. Proc. Natl Acad. Sci. USA 108: 2587-2592.

Lauterborn JC, Rex CS, Kramár E, Chen LY, Pandyarajan V, Lynch G, Gall CM. (2007) Brain-derived neurotrophic factor rescues synaptic plasticity in a mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27: 10685-10694.

Lintas C, Persico AM. (2009) Autistic phenotypes and genetic testing: state-of-the-art for the clinical geneticist. J. Med. Genet.46: 1-8.

Makkonen I, Kokki H, Kuikka J, Turpeinen U, Riikonen R. Effects of fluoxetine treatment on striatal dopamine transporter binding and cerebrospinal fluid insulin-like growth factor-1 in children with autism. Neuropediatrics.

201142:207-209

Marchetto et al. (2010) A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell 143:527-539 (incl. supplemental information) Marshall CR, Noor A, Vincent JB, Lionel AC, Feuk L, Skaug J, Shago M, Moessner R, Pinto D, Ren Y, Thiruvahindrapduram B, Fiebig A, Schreiber S, Friedman J, Ketelaars CE, Vos YJ, Ficicioglu C, Kirkpatrick S, Nicolson R, Sloman L, Summers A, Gibbons CA, Teebi A, Chitayat D, Weksberg R, Thompson A, Vardy C, Crosbie V, Luscombe S, Baatjes R, Zwaigenbaum L, Roberts W, Fernandez B, Szatmari P, Scherer SW. (2008) Structural variation of chromosomes in autism spectrum disorder. Am J Hum Genet.82: 477-488.

Minshew NJ, Williams DL. The new neurobiology of autism: cortex, connectivity, and neuronal organization. Arch Neurol.200764:945-950

Moessner R, Marshall CR, Sutcliffe JS, Skaug J, Pinto D, Vincent J, Zwaigenbaum L, Fenandez B, Roberts W, Szatmari P, Scherer SW. (2007) Contribution of SHANK3 mutations to autism spectrum disorder. Am. J. Hum. Genetics 81: 1289-1297.

Moretti P, Levenson JM, Battaglia F, Atkinson R, Teague R, Antalffy B, Armstrong D, Arancio O, Sweatt JD, Zoghbi HY. (2006) Learning and memory and synaptic plasticity are impaired in a mouse model of Rett syndrome. J. Neurosci.26: 319-327.

Paylor, R., Glaser, B., Mupo, A., Ataliotis, P., Spencer, C., Sobotka, A., Sparks, C., Choi, C.H., Oghalai, J., Curran, S., Murphy, K.C., Monks, S., Williams, N., O’Donovan, M.C., Owen, M.J., Scambler, P.J., and Lindsay, E. (2006). PNAS 103, 7729-7734.

Penagarikano, O., Abrahams, B.S., Herman, E.I., Winden, K.D., Gdalyahu, A., Dong, H., Sonnenblick, L.I., Gruver, R., Almajano, J., Bragin, A., Golshani, P., Trachtenberg, J.T., Peles, E., and Geschwind, D.H. (2011). Absence of CNTNAP2 Leads to Epilepsy, Neuronal Migration Abnormalities, and Core Autism-Related Deficits. Cell 147, 235-246.

Riikonen R, Makkonen I, Vanhala R, Turpeinen U, Kuikka J, Kokki H. (2006) Cerebrospinal fluid insulin-like growth factors IGF-1 and IGF-2 in infantile autism. Dev. Med. Child Neurol.48: 751-755.

Sebat J, Lakshmi B, Malhotra D, Troge J, Lese-Martin C, Walsh T, Yamrom B, Yoon S, Krasnitz A, Kendall J, Leotta A, Pai D, Zhang R, Lee YH, Hicks J, Spence SJ, Lee AT, Puura K, Lehtimäki T, Ledbetter D, Gregersen PK, Bregman J, Sutcliffe JS, Jobanputra V, Chung W, Warburton D, King MC, Skuse D, Geschwind DH, Gilliam TC, Ye K, Wigler M. (2007) Strong association of de novo copy number variation mutations with autism. Science 316(5823): 445-449.

Schaevitz LR, Moriuchi JM, Nag N, Mellot TJ, Berger-Sweeney J. (2010) Cognitive and social functions and growth factors in a mouse model of Rett syndrome. Physiol. Behav.100: 255-263.

Schćtt J, Falley K, Richter D, Kreienkamp HJ, Kindler S. (2009) Fragile X mental retardation protein regulates the levels of scaffold proteins and glutamat receptors in postsynaptic densities. J. Biol. Chem. 284: 25479-25487.

Silverman JL, Turner SM, Barkan CL, Tolu SS, Saxena R, Hung AY, Sheng M, Crawley JN: Sociability and motor functions in Shank1 mutant mice. Brain Res 2010.

Silverman JL, Yang M, Lord C, Crawley JN: Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nat Rev Neurosci 2010, 11:490-502.

Spence SJ, Schneider MT. The role of epilepsy and epileptiform EEGs in autism spectrum disorders. Pediatr Res. 200965:599-606.

Spencer CM, Alekseyenko O, Serysheva E, Yuva-Paylor LA, Paylor R. (2005) Altered anxiety-related and social behaviors in the Fmr1 knockout mouse model of fragile X syndrome. Genes Brain Behav.4: 420-430. Strauss,K.A., Puffenberger,E.G., Huentelman,M.J., Gottlieb,S., Dobrin,S.E., Parod,J.M., Stephan,D.A., and Morton, D.H. (2006). Recessive symptomatic focal epilepsy and mutant contactin-associated protein-like 2. N. Engl. J. Med.354, 1370-1377.

Stromme, P., Dobrenis, K., Sillitoe, R.V., Gulinello, M., Ali, N.F., Davidson, C., Micsenyi, M.C., Stephney, G., Ellevog, L., Klungland, A., and Walkley, S.U. (2011). X-linked Angelman-like syndrome caused by Slc9a6 knockout in mice exhibits evidence of endosomal-lysosomal dysfunction. Brain.134:3369-3383.

Sykes NH, Toma C, Wilson N, Volpi EV, Sousa I, Pagnamenta AT, Tancredi R, Battaglia A, Maestrini E, Bailey AJ, Monaco AP; International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC). (2009) Copy number variation and association analysis of SHANK3 as a candidate gene for autism in the IMGSAC collection. Eur. J. Hum. Genet.17: 1347-1353.

Tabuchi K, Blundell J, Etherton MR, Hammer RE, Liu X, Powell CM, Sćdhof TC. (2007) A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science 318(5847): 71-76. Takayanagi Y, Fujita E, Yu Z, Yamagata T, Momoi MY, Momoi T, Onaka T. (2010) Impairment of social and emotional behaviors in Cadm1-knockout mice. Biochem. Biophys. Res. Commun.396: 703-708.

Tropea D, Giacometti E, Wilson NR, Beard C, McCurry C, Fu DD, Flannery R, Jaenisch R, Sur M. (2009) Partial reversal of Rett Syndrome-like symptoms in MeCP2 mutant mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106: 2029-2034.

Vernes, S.C., Newbury, D.F., Abrahams, B.S., Winchester, L., Nicod, J., Groszer, M., Alarcon, M., Oliver, P.L., Davies, K.E., Geschwind, D.H., Monaco, A.P., and Fisher, S.E. (2008). A functional genetic link between distinct developmental language disorders. N. Engl. J. Med.359, 2337-2345.

Yan J, Noltner K, Feng J, Li W, Schroer R, Skinner C, Zeng W, Schwartz CE, Sommer SS. (2008) Neurexin 1alpha structural variants associated with autism. Neurosci Lett.438: 368-370.

Yan QJ, Asafo-Adjei PK, Arnold HM, Brown RE, Bauchwitz RP. (2004) A phenotypic and molecular characterization of the fmr1-tm1Cgr fragile X mouse. Genes Brain Behav.3:337-359.

Yang M, Crawley JN: Simple behavioural assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci 2009, Chapter 8(Unit 8):24.

Zhiling Y, Fujita E, Tanabe Y, Yamagata T, Momoi T, Momoi MY. (2008) Mutations in the gene encoding CADM1 are associated with autism spectrum disorder. Biochem. Biophys. Res. Commun.377: 926-929.

Zhao MG, Toyoda H, Ko SW, Ding HK, Wu LJ, Zhuo M. (2005) Deficits in trace fear memory and long-term potentiation in a mouse model for fragile X syndrome. J. Neurosci. 25: 7385-7392. (Erratum in: J Neurosci.

2005, 25: 8112)

Zoghbi HY. (2005) MeCP2 dysfunction in humans and mice. J Child Neurol.20: 736-740.

Claims (7)

Patentni zahtevi

1. Glicil-2-metil-L-prolil-L-glutamat (G-2-MePE) za upotrebu u lečenju simptoma izabranog iz grupe koja se sastoji od poremećenog socijalnog funkcionisanja i repetitivnog ponašanja bolesti iz spektra autizma (ASD) kod životinje, oralnom primenom efikasne količine G-2-MePE.

2. G-2-MePE za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što navedeno lečenje proizvodi poboljšanje u navedenom simptomu kao što je procenjeno pomoću jednog ili više bihejvioralnih testova izabranih iz grupe koja se sastoji od The Rett Syndrome Natural History / Clinical Severity Scale, Aberrant Behavior Checklist Community Edition (ABC), Vinelands, Clinical Global Impression of Severity (CGI-S) i the Caregiver Strain Questionnaire (CSQ), ili jednog ili više fizioloških testova izabranih iz grupe koja se sastoji od učestalosti šiljaka elektroencefalograma (EEG), ukupne snage u trakama učestalosti EEG, kretanja ruku, QTc i varijabilnosti pulsa (HRV), i respiratornih nepravilnosti u poređenju sa kontrolnim životinjama koje ne pate od navedenog simptoma.

3. G-2-MePE za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time što navedeni ASD je izabran iz grupe koja se sastoji od autizma, sindroma fragilnog X hromozoma, Rett-ovog sindroma (RTT), autističnog poremećaja, Asperger-ovog sindroma, dezintegrativnog sindroma u detinjstvu i nespecifičnog pervazivnog razvojnog poremećaja (PDD-NOS), i patološkog sindroma izbegavanja poslušnosti (PDA).

4. G-2-MePE za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što navedena efikasna količina G-2-MePE je u opsegu od 1 mg/Kg do 100 mg/Kg.

5. G-2-MePE za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što je drugo terapeutsko sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od: faktora rasta I sličnog insulinu (IGF-I), faktora rasta II sličnog insulinu (IGF-II), glicil-prolil-glutamata (GPE), transformišućeg faktora rasta-β1, aktivina, hormona rasta, nervnog faktora rasta, neurotrofnog faktora poreklom iz mozga (BDNF), vezujućeg proteina hormona rasta, IGF-vezujućih proteina (naročito IGFBP-3), osnovnog faktora rasta fibroblasta, kiselog faktora rasta fibroblasta, hst/Kfgk genskog proizvoda, FGF-3, FGF-4, FGF-6, faktora rasta keratinocita, androgenom-indukovanog faktora rasta, int-2, homologog faktora 1 faktora rasta fibroblasta (FHF-1), FHF-2, FHF-3 i FHF-4, faktora rasta 2 keratinocita, glijalnog-aktivirajućeg faktora, FGF-10 i FGF-16, cilijarnog neurotrofnog faktora, faktora rasta poreklom iz mozga, neurotrofina 3, neurotrofina 4, morfogenetskog proteina 2 kostiju (BMP-2), neurotrofnog faktora poreklom iz glijalne ćelijske linije, neurotrofnog faktora zavisnog od aktivnosti, citokina inhibitornog faktora leukemije, onkostatina M, interleukina, α-, β-, γ-, ili konsenzus interferona, TNF-α, klometiazola; kinurenske kiseline, Semax, takrolimusa, L-treo-1-fenil-2-dekanoilamino-3-morfolino-1-propanola, andrenokortikotropin-(4-9) analoga [ORG 2766] i dizolcipina (MK-801), selegilina; antagonista glutamata kao što je mematin (Namenda) NPS1506, GV1505260, MK-801, GV150526; antagonista AMPA kao što je 2,3-dihidroksi-6-nitro-7-sulfamoilbenzo(f)honoksalin (NBQX), LY303070 i LY300164; anti-inflamatornih sredstava usmerenih protiv adresina MAdCAM-1 i/ili njihovih integrin α4 receptora (α4β1 i α4β7), kao što je anti-MAdCAM-lmAb MECA-367 (ATCC pristupni br. HB-9478), fenobama, selektivnog inhibitora ponovnog preuzimanja serotonina kao što je fluoksetin, ili atipičnog anti-psihotika kao što je risperidon, primenjenog na životinju.

6. G-2-MePE za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što doza navedenog jedinjenja je 10 mg/kg tri puta na dan ili 30 mg/kg tri puta na dan.

7. G-2-MePE za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time što navedena životinja je čovek.