RS56484B1 - Metode za poboljšanu proizvodnju proteina - Google Patents

Description

STANJE TEHNIKE PREDMETNOG PRONALASKA

[0001] Kultura životinjskih ćelija, posebno kultura ćelija sisara, je obično korišćena za ekspresiju rekombinantno proizvedenih proteina u terapeutske, profilaktičke i dijagnostičke svrhe. Iako su metode kultivacije sisarskih ćelija poželjnije od mikrobnih ekspresionih sistema (npr. sistemi za ekspresiju bakterija ili kvasca), jer su oni pogodniji za ekspresiju proteina visoke molekulske mase i proteina koji imaju kompleksne prostorne strukture, nivoi ekspresije proteina iz sistema koji su na zasnovani na sisarskim ćelijskim kulturama su generalno znatno niži od onih iz mikrobnih ekspresionih sistema. Iako su brojni pristupi pokušali da povećaju ekspresiju proteina iz ćelijske kulture sisara, ovim metodama nedostaje optimizacija uslova za rast ćelija, koji održavaju visoku ćelijsku vijabilnost i proizvodnju velikih količina visokokvalitetnih proteina, time ograničavajući njihovu praktičnu primenu u biofarmaceutskoj industriji.

[0002] Kao takva, postoji potreba u oblasti da se razviju poboljšane metode za velike kulture životinjskih ćelija za proizvodnju i prečišćavanje proteina (npr. antitela i fragmenti antitela, peptidi, enzimi, faktori rasta, hormoni, interleukini, interferoni i vakcine) da se postignu pouzdana i isplativa proizvodnja proteina uz visoke prinose.

REZIME PREDMETNOG PRONALASKA

[0003] U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje metode za povećanje proizvodnje proteina u ćelijskoj kulturi gajenjem ćelija koje proizvode protein u perfuziji do visoke gustine ćelija (npr., najmanje do iznad oko 50x 10<6>ćelija/mL, poželjnije više od oko 60 to 80 × 10<6>ćelija/mL, i najpoželjnije oko približno 100 × 10<6>ćelija/mL), takođe ovde pomenuta kao "veoma visoka gustina", zatim prebacivanjem ćelijske kulture u fed-batch (prehranjivana šaržna), tako da ćelije uđu u fazu visoke proizvodnje proteina. Predmetni pronalazak je baziran, barem delom, na neočekivanom otkiću da je moguće gajiti ćelije u kulturi do mnogo veće gustine nego što se prvobitno mislilo da je moguće. Ovo, zauzvrat, daje značajno više proteina nego što je obično proizvedeno korišćenjem poznatih tehnika za ćelijske kulture. Konkretno, maksimalna gustina ćelija postignuta korišćenjem poznatih tehnika za ćelijske kulture se smatra da je ograničena prisustvom određenih nivoa otpadnih proizvoda (npr. laktat, amonijum, itd.), pošto je poznato da takvi otpadni proizvodi mogu biti toksični za rast ćelija kada se akumuliraju do kritičnih koncentracija (videti, na primer, Schumpp, B. et al., J. Cell Sci., 7(Pt 4):639-647 (Dec. 1990)). Kao takve, poznate tehnike za ćelijske kulture često ograničavaju maksimalnu gustinu do koje se ćelije inicijalno gaje, tako da ćelije ne mogu biti negativno pod uticajem određenih koncentracija otpadnih proizvoda.

[0004] Na primer, metoda za ćelijske kulture opisana u WO 2009/023562 oslanja se na nivoe laktata da signalizira maksimalnu gustinu ćelija koja se teoretski može postići pre iniciranja perfuzione ćelijske kulture. Kao što je učeno u WO 2009/023562, ćelije se gaje do gustine ćelija od oko 1 do 9 miliona ćelija/mL, što rezultira koncentracijom laktata od oko 1 g/L do oko 6 g/L. Prema WO 2009/023562, ovo signalizira optimalnu vremensku tačku za početak perfuzije. Nakon perfuzije, ćelije se onda gaje do otprilike 5 do 40 miliona ćelija/mL i održavaju se u “fed-batch” ćelijskoj kulturi (preranjivanoj šaržnoj ćelijskoj kulturi), kako bi se dobili tirti antitela između 8-10 g/L (između dana 14-17).

[0005] Za razliku od takvih poznatih metoda za ćelijske kulture, nijedan određeni nivo otpadnih proizvoda ne ograničava gustinu rasta ćelija u skladu sa metodama predmetnog pronalaska. Umesto toga, otkriveno je da kada se ćelije inicijalno uzgajaju samo u perfuzionoj ćelijskoj kulturi, ćelije mogu da rastu do mnogo veće gustine ćelija (npr., najmanje iznad 40 x 10<6>ćelija/mL) nego što je prethodno prijavljeno za poznate tehnike za ćelijske kulture, bez obzira na prisustvo otpadnih proizvoda. U posebnom tehničkom rešenju, ćelije se gaje do gustine barem iznad oko 50 x 10<6>ćelija/mL do 60 x 10<6>ćelija/mL, poželjno više od oko 70 x 10<6>ćelija/mL do 90 x 10<6>ćelija/mL, poželjnije više od oko 100×10<6>do 130×10<6>, i najpoželjnije više od oko 140×10<6>to 200×10<6>ćelija/mL ili više. Ova "veoma" visoka gustina ćelija, zauzvrat, omogućava proizvodnju značajno viših količina proteina (npr., 13.8 g/L na dan 6) u kraćem vremenskom periodu nego što je ranije prijavljeno.

[0006] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje još jednu neočekivanu prednost nad poznatim tehnikama za ćelijske kulture u tome što optimizuje proizvodnju velikih količina visokokvalitetnih proteina. Na primer, u jednom tehničkom rešenju, protein koji se sakuplja u skladu sa metodama predmetnog pronalaska dobija se samo iz “fed-batch” ćelijske kulture. Ovo povećava svežinu, stabilnost i kvalitet proteina, za razliku od proteina dobijenog i iz perfuzionih i iz fed-batch kultura podvrgnutih dužim periodima kultivacije, koji je prema tome više podložan degradaciji i generalno lošijeg kvaliteta. Uprkos tome, predmetni pronalazak takodje razmatra sakupljanje proteina i iz perfuzionih i iz “fed-batch” kultura (npr. kada se ćelije kultivišu u jednom bioreaktoru)

[0007] U određenim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak upošljava rekombinantne ćelije koje eksprimiraju protein od interesa. Na primer, ćelije su transfektovane sa najmanje jednom nukleinskom kiselinom koja kodira protein od interesa.

[0008] Metode predmetnog pronalaska mogu biti korišćene za poboljšanje proizvodnje bilo kog proteina od interesa, uključujući, bez ograničenja, enzime, receptore, fuzione proteine, citokine, regulatorne faktore, hormone, dijagnostičke proteine, terapijske proteine i agense za vezivanje antigena. U određenom tehničkom rešenju, protein je antitelo (ili njegov antigen vezujući fragment). Slično tome, širok spektar ćelija može se kultivisati prema metodama predmetnog pronalaska. U posebnom tehničkom rešenju, ćelije su životinjske ćelije. U poželjnom tehničkom rešenju, ćelije su ćelije sisara, kao što su CHO, NS0, BHK i Per C6 ćelije.

[0009] Uslovi za kultivaciju ćelija (npr., pH, temperatura, medijumi, određena posuda za gajenje kultura itd.) mogu se odrediti i prilagoditi od strane prosečnih poznavalaca oblasti u zavisnosti od više faktora, kao što je određena ćelijska linija i protein koji se proizvode. U jednom tehničkom rešenju, perfuzijska ćelijska kultura i ćelijska kultura u režimu “fad batch” se izvode u bioreaktorima. Ovo može uključiti jedan bioreaktor ili više bioreaktora (npr. tako da se perfuzijska ćelijska kultura i ćelijska kultura u režimu “fad batch” izvode u odvojenim bioreaktorima). Na primer, perfuziona ćelijska kultura može se izvesti u jednom bioreaktoru, a zatim ćelije mogu biti prenete u više “fed-batch” bioreaktora.

[0010] Dodatno, uslovi za ćelijske kulture mogu biti optimizovani da se maksimizira proizvodnja proteina. Na primer, parametri ćelijske kultivacije, kao što su pH, DO, temperatura, strategije prehranjivanja, kompozicija prehranjivanjaa, itd. mogu biti optimizovani.

[0011] Ovde su takođe stavljene na uvid javnosti metode za prečišćavanje proteina iz ćelijske kulture. Ovo se postiže podešavanjem pH ćelijske kulture ispod vrednosti neutralnog pH (tj. ispod pH 7) i uspostavljanjem ćelijske kulture, tako da se ćelijska kultura izdvaja da bi formirala sloj supernatanta i sloj ćelijskog materijala (cell-bed), pri čemu je protein prisutan u (i može biti izolovan iz) supernatantnog sloja. Iako se metode mogu primeniti na ćelijske kulture predmetnog pronalaska, one se mogu primeniti kako bi se prečistio protein iz bilo koje ćelijske kulture, uključujući ćelijske kulture visoke gustine.

[0012] Metoda može obuhvatiti podešavanje pH ćelijske kulture na nisku pH vrednost (tj., ispod neutralnog pH od 7, kao što je pH 4-7). Konkretno, pH može biti podešen na pH između oko 4.5 do 6.5. Ova metoda takođe može obuhvatiti uspostavljanje ćelijske kulture barem oko 30 minuta, kako bi se povećalo prečišćavanje ćelijske kulture pre sakupljanja proteina. Međutim, ćelijska kultura se može uspostavljati tokom dužih vremenskih perioda po nahođenju kvalifikovanog stručnjaka. Konkretno, ćelijska kultura se može uspostavljati između oko 30 i 120 minuta.

[0013] Druge poznate tehnike prečišćavanja mogu se opciono koristiti u vezi sa gore opisanom metodom prečišćavanja. Na primer, ćelijska kultura se može centrifugirati pre uspostavljanja (settling - uređivanja, organizovanja, fiksiranja) ćelijske kulture. Alternativno, ćelijska kultura se može centrifugirati nakon uspostavljanja ćelijske kulture, ili ćelijska kultura može biti centrifugirana pre i nakon uspostavljanja ćelijske kulture.

[0014] Drugi opcioni korak koji se može preduzeti da bi se poboljšala metoda prečišćavanja je pranje sloja ćelijskog materijala koji se formirao kao rezultat procesa uspostavljanja sa puferom koji ima nizak pH. U određenom tehničkom rešenju, pH pufera je isti kao i pH ćelijske kulture, tj. kada se kultura ćelija podešava na nisku pH vrednost (t.j., ispod neutralnog pH od 7).

[0015] Pored toga, tehnike filtracije mogu se koristiti za dalje prečišćavanje ćelijske kulture. Na primer, ćelijska kultura se može filtrirati pre nego što se kultura ćelija uspostavi, ćelijska kultura se može filtrirati nakon što se kultura ćelija uspostavi, ili se kultura ćelija može filtrirati pre i nakon što se ćelijska kultura uspostavi. Filtriranje se može izvesti bilo kojim brojem tehnika poznatih u ovoj oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na dubinsku filtraciju i polirajuću filtraciju.

[0016] Druga svojstva i prednosti predmetnog pronalaska će biti očigledni iz detaljnog opisa koji sledi, i iz patentnih zahteva.

KRATAK OPIS NACRTA

[0017]

Slika 1 prikazuje jedan mogući scenario za praktikovanje metoda predmetnog pronalalaska, tj. u kome se proces “fed-batch” ćelijske kulture odlične gustine izvodi u jednom bioreaktoru.

Slika 2 prikazuje još jedan mogući scenario za praktikovanje metoda predmetnog pronalaska, tj. u kome su ćelije perfuzirane u perfuzionom bioreaktoru dok nije postignuta posebna gustina ćelija i zatim prebačene u više “fed-batch” reaktora. Proces “fed-batch” ćelijske kulture je izveden u pojedinačnom bioreaktoru.

Slika 3 je grafikon koji prikazuje profil rasta ćelija i proizvodnje proteina za Eksperiment br. (#) 1.

Slika 4 je grafikon koji prikazuje profil rasta ćelija i proizvodnje proteina za Eksperiment br.2.

Slika 5 je grafikon koji prikazuje profil perfuzionog bioreaktora (tj., gustinu vijabilnih ćelija i procenat vijabilnosti) iz Eksperimenta 3.

Slika 6 je grafikon preklapanja koji prikazuje profile rasta ćelija i produktivnosti iz dva bioreaktora korišćena u Eksperimentu 3.

Slika 7 je grafikon koji prikazuje profile ćelijskog rasta, ćelijske vijabilnosti i proizvodnje proteina u proizvodnom bioreaktoru za Eksperiment 4.

Slika 8 je grafikon koji sumira rezultate produktivnosti sva četiri Eksperimenta kao funkciju ćelijskog integrala.

Slika 9 je grafikon koji prikazuje efekat različitih eksperimentalnih parametara (tj., pH, tj., pH, filtersko pomoćno sredstvo, itd.) na proces prečišćavanja.

Slika 10 je shema koja prikazuje ključne korake u procesu prečišćavanja, kao i opcione tehnike za poboljšanje procesa prečišćavanja.

DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALASKA

[0018] Predmetni pronalazak obezbeđuje poboljšane metode za povećanje proizvodnje proteina u ćelijskoj kulturi gajenjem ćelija koje proizvode protein u perfuzionoj ćelijskoj kulturi do visoke gustine ćelija (tj., barem iznad 40×10<6>ćelija/mL), i zatim prebacivanjem na “fed-batch” ćelijsku kulturu, tako da ćelije uđuu fazu proizvodnje proteina. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje metode za prečišćavanje ćelijskih kultura da se olakša sakupljanje proteina iz kultura.

[0019] Da bi predmetni pronalazak mogao biti lakše shvaćen, određeni termini su prvo definisani. Dodatne definicije su obezbeđene kroz detaljan opis.

I. Definicije

[0020] Termini "ćelijska kultura" i "kultura" uključuju bilo koju kombinaciju ćelija i medijuma. Metode predmetnog pronalaska razmatraju, bez ograničenja, dva opšta tipa ćelijske kulture, tj. perfuzionu ćelijsku kulturu i “fed-batch” ćelijsku kulturu. Principi koji stoje iza ovih tipova ćelijske kulture opisani su ispod.

[0021] Kako se ovde koristi, termini "perfuzirati", "perfuzija" i "perfuziona kultura" se koriste naizmenično kako bi se odnosili na metodu za kultivaciju ćelija, pri čemu je dodati sveži medijum obezbeđen kulturi i potoršeni medijum je uklonjen iz kulture. Perfuzija se započinje nakon što je kultura zasađena i može se odigrati bilo kontinualno ili povremeno, po želji, tokom perioda vremena. Sveži medijum dodat tokom perfuzije obično obezbeđuje nutritivne dodatke za ćelije koje su istrošene tokom procesa kultivisanja. Perfuzija takođe omogućava uklanjanje ćelijskih otpadnih proizvoda i toksičnih sporednih proizvoda iz ćelijske kulture. Perfuzija se vrši tokom faze rasta ćelija, ali se takođe može nastaviti nakon što se ćelije prenose u “fed-batch” kulturu ćelija (razmotreno ispod).

[0022] Kao što se ovde koristi, termin "specifična brzina perfuzije" (SPR) odnosi se na brzinu pri kojoj se obezbeđuje svež medijum kulturi ćelija, a potrošeni medijum se uklanja na osnovu gustine ćelija. SPR se može izračunati korišćenjem sledeće jednačine:

Specifična brzina perfuzije (SPR) = (Zapremina reaktora/dan) / (Ukupna gustina ćelija x (10<6>)).

SPR može biti određena i/ili prilagođena od strane prosečnog poznavaoca oblasti, na osnovu faktora koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na prirodu posebnih ćelija domaćina, brzinu ćelijskog rasta, i ćelijsku gustinu. Na primer, tipična SPR se može kretati od oko 0.01 do oko.1.0 × 10<-6>mL ćelija<-1>dan<-1>. U jednom tehničkom rešenju, SPR je 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02 ili 0.01. U jednom tehničkom rešenju, SPR se kreće od 0.25 do 0.03 × 10<-6>mL ćelija<-1>dan<-1>. U još jednom tehničkom rešenju, SPR se kreće od 0.07 do 0.01 × 10<-6>mL ćelija<-1>dan<-1>. U još jednom tehničkom rešenju, SPR se kreće od 0.07 do 0.03 × 10<-6>mL ćelija<-1>dan<-1>. U posebnom tehničkom rešenju, SPR je održavan pri oko 0.05 × 10<-6>mL ćelija<-1>dan<-1>.

[0023] SPR može ostati konstantna u određenom vremenskom periodu ili se može promeniti (tj. povećati ili smanjiti) tokom perioda perfuzije. Na primer, SPR se može stabilno povećavati tokom vremena, povećavati postepeno tokom vremena, postepeno se smanjivati, ili bilo koja njihova kombinacija. Perfuzija može biti primenjena na kontinuiran način ili naizmenično. Prosečan poznavalac oblasti može odrediti SPR, kao i odgovarajući tajming (podešavanje vremena) početka i prestanka perfuzijskog(ih) perioda i svake izmene u perfuziji, na osnovu praćenja nekog parametra ćelijske kulture.

[0024] Kao što je ovde korišćeno, termin "fed-batch kultura" odnosi se na metodu kultivisanja ćelije, gde je ćelijska kultura obogaćena svežim medijumom, tj. ćelije su “nahranjene” novim medijumom dok je potošeni medijum uklonjen. Tipično, proces "fedbatch" kulture je izveden u bioreaktoru i dodatne komponente (npr., nutritivni suplementi) su dodate kulturi u nekom trenutku nakon inicijacije procesa kulture. Kontrolisano dodavanje nutrijenata direktno utiče na brzinu rasta kulture i omogućava izbegavanje stvaranja prelivanja metabolita (videti, na primer, Wlaschin, K.F. et al., "Fedbatch culture and dynamic nutrient feeding," Cell Culture Engineering, 101:43-74 (2006) i Lee, J. et al., "Control of fedbatch fermentations," Biotechnol. Adv., 17:29-48 (1999)). “Fed-batch” kultura je tipično prekinuta u nekoj tački vremena i ćelije i/ili komponente u medijumu su sakupljene i opciono prečišćene.

[0025] Kao što se ovde koristi, termin "procenat hrane" je procenat zapremine hrane u ukupnoj zapremini ćelijske kulture.

[0026] Kao što se ovde koristi, termin "bolusno hranjenje" odnosi se na jednokratno dodavanje hrane.

[0027] Kao što se ovde koristi, termini "inokulacija", "inokulum" i "sađenje" odnose se na dodavanje ćelija početnom medijumu za početak kultuivacije.

[0028] Kako se ovde koristi, termin "gustina ćelija" se odnosi na broj ćelija u datoj zapremini medijuma. Poželjna je visoka ćelijska gustina u tome što može dovesti do veće produktivnosti proteina. Kao takva, gustina ćelija se rutinski nadgleda u ćelijskim kulturama. Gustina ćelija može se pratiti bilo kojom tehnikom poznatom u oblasti, uključujući, ali bez ograničavanja na, ekstrakciju uzoraka iz kulture i analiziranje ćelija pod mikroskopom, korišćenjem komercijalno dostupnog uređaja za brojanje ćelija ili pomoću komercijalno dostupne odgovarajuće sonde uvedene u sam bioreaktor (ili u petlju kroz koju su propušteni ćelije i medijum i zatim vraćeni u bioreaktor).

[0029] Kao što je ovde korišćeno, termini "veoma visoka ćelijska gustina" i "visoka gustina ćelija" se koriste izmenično i odnose se na gustinu ćelija od najmanje 40 x 10<6>ćelija/mL. Poznate tehnike za ćelijske kulture mogu uključivati ćelije koje rastu do "prvog kritičnog nivoa" (tj. "tačke tokom faze rasta ćelijskog ciklusa, kada vijabilnsot ćelije može biti pod uticajem povećane koncentracije otpadnih proizvoda (npr., inhibitori rasta ćelija i toksični metaboliti, npr., laktat, amonijum, itd.) pre perfuziranja ćelijske kulture i dobijanja otprilike 5 do 40 miliona ćelija/mL). Nasuprot tome, ćelije gajene prema metodama predmetnog pronalaska nisu ograničene otpadnim proizvodima i, stoga, mogu postići veoma visoku gustinu ćelija (tj. barem više od oko 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 x 10<6>ćelija/mL). Konkretno, kao deo predmetnog pronalazaska otkriveno je da kada se ćelije inicijalno gaje u kulturi perfuzionih ćelija, ćelije rastu do mnogo veće gustine ćelija (tj. veoma visoke gustine ćelija), nezavisno od prisustva otpadnih proizvoda, kao što su laktat ili amonijum.

[0030] U predmetnom pronalasku, ćelije gajene u perfuzionoj ćelijskoj kulturi su “prebačene” (pomerene ili prenešene) u režim “fed-batch” kulture onda kada su ćelije dostigle visoku gustinu ćelija. U jednom tehničkom rešenju, prebacivanje se odigrava pri visokoj gustini ćelija od barem više od oko 50 x 10<6>ćelija/mL. U još jednom tehničkom rešenju, prebacivanje se odigrava pri visokoj ćelijskoj gustini od barem između oko 50 x 10<6>ćelija/mL i 200 x 10<6>ćelija/mL. U posebnim tehničkim rešenjima, prebacivanje se odigrava pri visokim gustinama ćelija od oko 51 x 10<6>ćelija/mL, 52 x 10<6>ćelija/mL, 53 x 10<6>ćelija/mL, 54 x 10<6>ćelija/mL, 55 x 10<6>ćelija/mL, 56 x 10<6>ćelija/mL, 57 x 10<6>ćelija/mL, 58 x 10<6>ćelija/mL, 59 x 10<6>ćelija/mL, 60 x 10<6>ćelija/mL, 61 x 10<6>ćelija/mL, 62 x 10<6>ćelija/mL, 63 x 10<6>ćelija/mL, 64 x 10<6>ćelija/mL, 65 x 10<6>ćelija/mL, 66 x 10<6>ćelija/mL, 67 x 10<6>ćelija/mL, 68 x 10<6>ćelija/mL, 69 x 10<6>ćelija/mL, 70 x 10<6>ćelija/mL, 71 x 10<6>ćelija/mL, 72 x 10<6>ćelija/mL, 73 x 10<6>ćelija/mL, 74 x 10<6>ćelija/mL, 75 x 10<6>ćelija/mL, 76 x 10<6>ćelija/mL, 77 x 10<6>ćelija/mL, 78 x 10<6>ćelija/mL, 79 x 10<6>ćelija/mL, 80 x 10<6>ćelija/mL, 81 x 10<6>ćelija/mL m 82 x 10<6>ćelija/mL, 83 x 10<6>ćelija/mL, 84 x 10<6>ćelija/mL, 85 x 10<6>ćelija/mL, 86 x 10<6>ćelija/mL, 87 x 10<6>ćelija/mL, 88 x 10<6>ćelija/mL, 89 x 10<6>ćelija/mL, 90 x 10<6>ćelija/mL, 91 x 10<6>ćelija/mL, 92 x 10<6>ćelija/mL, 93 x 10<6>ćelija/mL, 94 x 10<6>ćelija/mL, 95 x 10<6>ćelija/mL, 96 x 10<6>ćelija/mL, 97 x 10<6>ćelija/mL, 98 x 10<6>ćelija/mL, 99 x 10<6>ćelija/mL, 100 x 10<6>ćelija/mL, 101 x 10<6>ćelija/mL, 102 x 10<6>ćelija/mL, 103 x 10<6>ćelija/mL, 104 x 10<6>ćelija/mL, 105 x 10<6>ćelija/mL, 106 x 10<6>ćelija/mL, 107 x 10<6>ćelija/mL, 108 x 10<6>ćelija/mL, 109 x 10<6>ćelija/mL, 110 x 10<6>ćelija/mL, 111 x 10<6>ćelija/mL, 112 x 10<6>ćelija/mL, 113 x 10<6>ćelija/mL, 114 x 10<6>ćelija/mL, 115 x 10<6>ćelija/mL, 116 x 10<6>ćelija/mL, 117 x 10<6>ćelija/mL, 118 x 10<6>ćelija/mL, 119 x 10<6>ćelija/mL, 120 x 10<6>ćelija/mL, 121 x 10<6>ćelija/mL, 122 x 10<6>ćelija/mL, 123 x 10<6>ćelija/mL, 124 x 10<6>ćelija/mL, 125 x 10<6>ćelija/mL, 126 x 10<6>ćelija/mL, 127 x 10<6>ćelija/mL, 128 x 10<6>ćelija/mL, 129 x 10<6>ćelija/mL, 130 x 10<6>ćelija/mL, 131 x 10<6>ćelija/mL, 132 x 10<6>ćelija/mL, 133 x 10<6>ćelija/mL, 134 x 10<6>ćelija/mL, 135 x 10<6>ćelija/mL, 136 x 10<6>ćelija/mL, 137 x 10<6>ćelija/mL, 138 x 10<6>ćelija/mL, 139 x 10<6>ćelija/mL, 140 x 10<6>ćelija/mL, 141 x 10<6>ćelija/mL, 142 x 10<6>ćelija/mL, 143 x 10<6>ćelija/mL, 144 x 10<6>ćelija/mL, 145 x 10<6>ćelija/mL, 146 x 10<6>ćelija/mL, 147 x 10<6>ćelija/mL, 148 x 10<6>ćelija/mL, 149 x 10<6>ćelija/mL, 150 x 10<6>ćelija/mL, 151 x 10<6>ćelija/mL, 152 x 10<6>ćelija/mL, 153 x 10<6>ćelija/mL, 154 x 10<6>ćelija/mL, 155 x 10<6>ćelija/mL, 156 x 10<6>ćelija/mL, 157 x 10<6>ćelija/mL, 158 x 10<6>ćelija/mL, 159 x 10<6>ćelija/mL, 160 x 10<6>ćelija/mL, 161 x 10<6>ćelija/mL, 162 x 10<6>ćelija/mL, 163 x 10<6>ćelija/mL, 164, x 10<6>ćelija/mL, 165 x 10<6>ćelija/mL, 166 x 10<6>ćelija/mL, 167 x 10<6>ćelija/mL, 168 x 10<6>ćelija/mL, 169 x 10<6>ćelija/mL, 170 x 10<6>ćelija/mL, 171 x 10<6>ćelija/mL, 172, x 10<6>ćelija/mL, 173 x 10<6>ćelija/mL, 174 x 10<6>ćelija/mL, 175 x 10<6>ćelija/mL, 176 x 10<6>ćelija/mL, 177 x 10<6>ćelija/mL, 178 x 10<6>ćelija/mL, 179 x 10<6>ćelija/mL, 180 x 10<6>ćelija/mL, 181 x 10<6>ćelija/mL, 182 x 10<6>ćelija/mL, 183 x 10<6>ćelija/mL, 184 x 10<6>ćelija/mL, 185 x 10<6>ćelija/mL, 186 x 10<6>ćelija/mL, 187 x 10<6>ćelija/mL, 188 x 10<6>ćelija/mL, 189 x 10<6>ćelija/mL, 190 x 10<6>ćelija/mL, 191 x 10<6>ćelija/mL, 192 x 10<6>ćelija/mL, 193 x 10<6>ćelija/mL, 194 x 10<6>ćelija/mL, 195 x 10<6>ćelija/mL, 196 x 10<6>ćelija/mL, 197 x 10<6>ćelija/mL, 198 x 10<6>ćelija/mL, 199 x 10<6>ćelija/mL ili 200 x 10<6>ćelija/mL, ili više. U poželjnom tehničkom rešenju, prebacivanje iz perfuzione kulture u “fed-batch” kulturu se dešava pri ćelijskoj gustini od barem oko 50 x 10<6>ćelija/mL. U poželjnijem tehničkom rešenju, prebacivanje se dešava pri ćelijskoj gustini od barem oko 100 x 10<6>ćelija/mL.

[0031] Kao što je ovde korišćeno, termin "fed-batch proces pri veoma velikoj gustini," "SDF process", i "proces fed-batch ćelijske kulture veoma visoke gustine” su korišćeni naizmenično i odnose se na proces gajenja ćelija u perfuzionoj ćelijskoj kulturi i zatim prebacivanje ćelija u režim “fed-batch” kulture, nakon što ćelije dostignu visoku ćelijsku gustinu (npr., barem iznad 50 x 10<6>ćelija/mL).

[0032] Prelazak sa perfuzijske ćelijske kulture u fed-batch ćelijsku kulturu se javlja kada se postigne visoka ćelijska gustina (kao što je razmotreno iznad). Visoka ćelijska gustina se može postići u bilo koje vreme nakon inokulacije ćelijske kulture, zavisno od brzine rasta ćelijske linije i gustine sađenja. U jednom tehničkom rešenju, može se postići visoka gustina 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24 ili 25 dana posle

1

inokulacije. U poželjnom tehničkom rešenju, visoka gustina je postignuta između oko 4 do 17 dana posle inokulacije.

[0033] Kao što je ovde korišćeno, termin "gustina vijabilnih ćelija" odnosi se na broj živih ćelija prisutnih u datoj zapremini medijuma pod datim sklopom eksperimentalnih uslova.

[0034] Kao što je ovde korišćeno, termin "ćelijska vijabilnost" odnosi se na sposobnost ćelija u kulturi da prežive pod datim sklopom uslova ili eksperimentalnih varijacija. Termin kao što je ovde korišćen takođe se odnosi na onaj deo ćelija koje su žive u određeno vreme u odnosu na ukupan broj ćelija (npr., živih i mrtvih) u toj kulturi u tom trenutku.

[0035] Kao što je ovde korišćeno, "faza rasta" ćelijske kulture se odnosi na fazu tokom koje je gustina vijabilnih ćelija u bilo kojoj vremenskoj tački viša nego u bilo kojoj prethodnoj vremenskoj tački.

[0036] Kao što je ovde korišćeno, "faza proizvodnje" ćelijske kulture se odnosi na fazu tokom koje ćelije proizvode značajne količine proteina, koji se akumulira za buduću obradu.

[0037] Kao što je ovde korišćeno, termin "ćelijski integral" odnosi se na sveukupan broj vijabilnih ćelija u toku profila ćelijskog rasta.

[0038] Kao što je ovde korišćeno, termin "titar" odnosi se na ukupnu količinu proteina proizvedenog od strane ćelijske kulture, podeljenu sa određenom količinom zapremine medijuma. U suštini, termin "titar" se odnosi na koncentraciju i tipično se izražava u jedinicama miligrama polipeptida po litru medijuma. Metode predmetnog pronalaska imaju efekat titra polipeptidnih proizvoda koji se značajno povećava u poređenju sa titrom polipeptidnih proizvoda proizvedenim iz drugih metoda za ćelijske kulture koje su poznate u oblasti.

[0039] Kao što je ovde korišćeno, termini "medijum", "medijum za ćelijske kulture" i "medijum za kulture ", koji uključuju gramatičke varijacije istih, su korišćeni naizmenično, i odnose se na rastvor nutrijenata u kome ćelije (poželjno životinjske ili sisarske ćelije) su gajene u kulturi. Medijum za ćelijske kulture je fiziohemijska, nutritivna, i hormonska sredina za ćelije i tipično obuhvata barem jednu ili više komponenata od sledećih: izvor energije (npr., u obliku ugljenih hidrata kao što je glukoza); esencijalne amino kiseline, uključujući dvadeset osnovnih aminokiselina plus cistein; vitamine i/ili druga organska jedinjenja tipično potrebna u niskim koncentracijama; masti ili slobodne masne kiseline (npr., linoleinska kiselina); i elemente u tragovima (npr., neorganska jedinjenja ili elemente koji se prirodno javljaju koji su tipično potrebni u veoma niskim koncentracijama, obično u mikromolarnom opsegu. Medijum može biti čvrst, želatinozan, tečan, gasovit ili smeša faza i materijala.

[0040] Ćelije koje se koriste u metodama predmetnog pronalaska mogu se gajiti i održavati u bilo kom broju medijuma za ćelijske kulture koji su poznati u oblasti ili su komercijalno dostupni. Prosečan poznavalac oblasti može se odlučiti da koristi jedan ili više poznatih medijuma za ćelijske kulture koji su odabrani da maksimiziraju rast ćelija, vijabilnost ćelija i/ili proizvodnju proteina u određenoj kultivisanoj ćeliji domaćina. Medijumi za kulture ćelija koji služe kao primer obuhvataju bilo koji medijum pogodan za kultivisanje ćelija koje mogu da eksprimiraju protein od interesa, uključujući, ali ne ograničavajući se na životinjski medijum oslobođen komponenata, kao što je EX-CELL® TiterHigh medijum (SAFC), i hemijski definisan medijum, kao što je CD CHO medijum (Invitrogen, Carlsbad, Kalif.) i CD OptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, Kalif.))

[0041] Pored toga, medijum za ćelijske kulture može se opciono obogatiti da uključi jednu ili više dodatnih komponenti, u odgovarajućim koncentracijama ili količinama, po potrebi ili želji, kao što bi bilo poznato i praktikovano od strane prosečnih poznavalaca oblasti. Suplementi koji služe kao primer uključuju, ali nisu ograničeni na, hemijske agense za selekciju gena, hormone i druge faktore rasta, (npr., insulin, transferin, epidermalni faktor rasta, serum, somatotropin, ekstrakt hipofize, aprotinin); soli (npr., kalcijum, magnezijum i fosfat) i pufere (npr., HEPES (4- [2-hidroksietil]-1-piperazinetansulfonska kiselina)); nukleozide i baze (npr., adenozin, timidin, hipoksantin); proteine i hidrolizate; antibiotike (npr., gentamicin); zaštitne agense ćelija (npr. Pluronic poliol (PLURONIC® F68)) i ekstracelularne matriksne proteine (npr., fibronektin). Suplementi koji podržavaju rast i održavanje određenih ćelijskih kultura mogu se lako odrediti od strane prosečnih poznavalaca oblasti, kao što je opisano, na primer, od strane Barnes et al. (Cell, 22:649 (1980)); u Mammalian Cell Culture, Mather, J.P., ed., Plenum Press, NY (1984); i u Američkom patentu br. 5,721,121.

[0042] Kao što je ovde korišćeno, termin "bioreaktor" odnosi se na bilo koji aparat, zatvoreni kontejner ili sud (npr., komora za fermentaciju) koji se koristi za uzgajanje ćelijskih kultura. Bioreaktori dozvoljavaju kontrolisanje raznih parametara tokom procesa ćelijske kulture, uključujući, ali bez ograničenja na, tok cirkulacione petlje, pH, temperaturu, prekomerni pritisak, i/ili srednju brzinu perfuzije. Bioreaktori uključuju komercijalno dostupne bioreaktore, klasične fermentere i perfuzione sisteme za ćelijske kulture, kao i bioreaktore za jednokratnu upotrebu.

[0043] Bioreaktor može biti bilo koje veličine koja je korisna za kultivisanje ćelija na poželjnoj skali u skladu sa metodom predmetnog pronalaska. Na primer, bioreaktor koji se koristi u metodama predmetnog pronalaska može biti barem 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 5,500, 6,000, 6,500, 7,000, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,0000, 13,000, 14,000, 15,000 litara ili više, ili bilo koja srednja zapremina.

[0044] Metode predmetnog pronalaska mogu koristiti jedan ili više bioreaktora. Na primer, u jednom tehničkom rešenju, perfuzijska ćelijska kultura i “fed-batch” ćelijska kultura mogu se izvesti u istom bioreaktoru. U još jednom tehničkom rešenju, perfuzijska ćelijska kultura se može izvesti u odvojenim bioreaktorima. U još jednom tehničkom rešenju, ćelije iz perfuzijske ćelijske kulture mogu se preneti u više “fed-batch” bioreaktora.

[0045] Pogodan bioreaktor može biti sastavljen od (tj., izrađen od) bilo kog materijala koji je pogodan za držanje ćelijskih kultura u uslovima kulture predmetnog pronalaska i pogodan za rast ćelija i vijabilnost. Na primer, bioreaktor koji se koristi u metodama predmetnog pronalaska može se napraviti od stakla, plastike ili metala. Međutim, materijali koji sadrže bioreaktor ne bi trebalo da ometaju ekspresiju ili stabilnost polipeptidnog proizvoda. Odgovarajući bioreaktori su poznati u oblasti i komercijalno dostupni.

[0046] Perfuzioni bioreaktor koji se koristi u postupcima predmetnog pronalaska može biti perfuzioni bioreaktor za jednokratnu upotrebu ili bilo koji drugi tradicionalni perfuzioni bioreaktor. Bioreaktor može opciono biti opremljen sa bilo kojim unutrašnjim ili spoljašnjim uređajima za zadržavanje ćelija, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, spin filtere, filtere tangencijalnog membranskog protoka, dinamičke membrane, ultrazvučne separatore, gravitacione komore (gravity settlers), kontinualnu centrifugu ili u akustični uređaj za zadržavanje ćelija, uređaje za mikrofiltraciju, uređaje za ultrafiltraciju itd. U posebnom tehničkom rešenju, bioreaktor je bioreaktor za jednokratnu upotrebu opremljen sa mikrofiltracionom membranom koja ima veličinu pora od 1.2 do 10 µm.

[0047] Kao što je ovde korišćeno, termin "antipenušajući agens" odnosi se na agens koji se može dodati u ćelijsku kulturu da se spreči nastanak viška pene. Primeri agenasa protiv penušanja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, 3% simetikon proizveden od strane Invitrogen

1

iHyClone. Antipenušajući agensi su komercijalno dostupni i mogu biti korišćeni po nahođenju prosečnog poznavaoca oblasti.

[0048] Ćelijske kulture obuhvaćene metodama predmetnog pronalaska mogu da se gaje pri bilo kojoj temperaturi odgovarajućoj za tip ćelije i uslove kultivacije. U jednom tehničkom rešenju, poželjno je koristiti temperaturu između oko 30 °C i 38 °C, da se poboljša proizvodnja proteina. U još jednom tehničkom rešenju, temperatura je barem oko 25 °C, 26 °C, 27°, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, 40 °C, ili 41 °C. Takođe može biti poželjno da se kotiste različite temperature pri različitim vremenima tokom kultivacije.

A. Ćelijska kultura

[0049] Kao što je ovde korišćeno, termin ćelija", odnosi se na životinjske ćelije, sisarske ćelije, kultivisane ćelije, ćelije domaćina, rekombinantne ćelije, i rekombinantne ćelije domaćina. Takve ćelije su generalno dobijene ili izvedene iz sisarskih tkiva koja su sposobna da rastu i preživljavaju kada se postave u medijume koji sadrže odgovarajuće nutrijente i/ili faktore rasta. Ćelije korišćene u metodama predmetnog pronalaska su generalno životinjske ili sisarske ćelije koje mogu da eksprimiraju i sekretuju, ili koje mogu biti molekularno projektovane da eksprimiraju i sekretuju, velike količine određenog proteina u medijum za kulturu. U jednom tehničkom rešenju, protein proizveden od strane ćelije može biti endogen ili homolog u odnosu na ćeliju. Alternativno, protein je heterologan, tj. stran, u odnosu na ćeliju.

[0050] Svaka ćelija koja je sposobna da eksprimira protein od interesa može se kultivisati prema metodama predmetnog pronalaska. Brojne ćelijske linije su dostupne iz komercijalnih izvora, koje uključuju, ali nisu ograničene na Američku kolekciju tipova kultura (American Tipe Culture Collection - ATCC). U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, ćelijska kultura koristi hibridomske ćelije. Konstrukcija hibridomskih ćelija koje proizvode antitela je dobro poznata u oblasti. U još jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, ćelijska kultura koristi CHO ćelije.

[0051] Reprezentativne ćelije koje se mogu koristiti u metodama predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na, ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), NSO, Per C6, HEK, COS, VERO076, BRL-3A, HepG2, MRC 5, 293T, A431, 3T3, CV-I, C3H10T1/2, Colo205, 293, L ćelije, HL-60, FRhL-2, U937, HaK, Jurkat ćelije, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, Mix, murinske mijelomske (npr., SP2/0 i NSO) i C2C12 ćelije, DG44 (Chasin et al., Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556 (1986); i Kolkekar et al., Biochemistry, 36:1090110909 (1997)), CHO-K1 Tet-On ćelijska linija (Clontech), CHO označene ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO klon B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF označene ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), RR-CHOK1 označene ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), dihidrofolat reduktaza negativne CHO ćelije (CHO/-DHFR, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), i dp12.CHO ćelije (Američki patent br. 5,721,121); CV1 ćelije bubrega majmuna transformisane pomoću SV40 (COS ćelije, COS-7, ATCC® CRL-1651); humane embrionske ćelije bubrega (npr., 293 ćelije, ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC® CCL-10); ćelije bubrega majmuna (CV1, ATCC® CCL-70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC® CRL-1587; VERO, ATCC® CCL-81); mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA, ATCC® CCL-2); ćelije bubrega psa (MDCK, ATCC® CCL-34); humane ćelije pluća (W138, ATCC® CCL-75); humane ćelije hepatoma (HEP-G2, HB 8065); mišje tumorske ćelije mlečne žlezde (MMT 060562, ATCC® CCL-51); ćelije jetre bizonskog pacova (buffalo rat) (BRL 3A, ATCC® CRL-1442); TRI ćelije (Mather, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MCR 5 ćelije; FS4 ćelije, kao i transfomisane ćelijske linije primata, hibridoma, normalne diploidne ćelije, i ćelijske loze izvedene iz in vitro kulture primarnog tkiva i primarnih eksplantata.

[0052] Ćelije koje su pogodne za kultivaciju u metodama predmetnog pronalaska mogu sadržati uvedene (npr. putem transformacije, transfekcije, infekcije ili injekcije) ekspresione vektore (konstrukti), kao što su plazmidi i slično, koji štite kodirajuće sekvence (ili njihove delove) koji kodiraju željeni protein. Takvi ekspresioni vektori sadrže neophodne elemente za transkripciju i translaciju ubačene kodirajuće sekvence i uglavnom uključuju, ali nisu ograničeni na, jedno ili više od sledećih: signalnu sekvencu, jedan ili više marker gena, element pojačivača, promotor, i sekvencu završetka transkripcije.

[0053] Metode i tehnike za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju proizvedene proteine, kao i odgovarajuće transkripcione i translacione kontrolne elemente, koji su dobro poznati u oblasti. Takve metode obuhvataju in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike, i in vivo genetičku rekombinaciju (videti, na primer, Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. (1989) i u Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1989)).

1

[0054] Ekspresioni konstrukti mogu biti uvedeni u ćelije pomoću širokog spektra rutinskih metoda prenošenja gena koje su poznate u oblasti. Na primer, takve metode mogu da obuhvate, ali nisu ograničene na, konvencionalne tehnike transfekcije gena, kao što su koprecipitacija kalcijum fosfata, lipozomalna transfekcija, mikroubrizgavanje, elektorporacija, i infekcija ili viralna transdukcija (videti, na primer, Američki patent br.

4,399,216, Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990), i Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

[0055] Bilo koji broj poznatih ekspresionih vektora može biti pogodan za eukariotske ćelije domaćina koje su gajene u kulturi u skladu sa metodama predmetnog pronalaska, uključujući, ali bez ograničenja na, vektore za sisarske ćelije domaćina (npr., BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc vektore, pCMV vektore, pSG5 vektore (Stratagene), retrovirusne vektore (npr., pFB vektore (Stratagene)), pcDNA-3 (Invitrogen), adenovirusne vektore; vektore povezane sa adeno virusom, baculovirusne vektore, vektore kvasca (npr., pESC vektore (Stratagene)), ili modifikovane oblike bilo čega prethodno navedenog. Vektori takpđe mogu da sadrže sekvence pojačivača uzvodno ili nizvodno od sekvenci promoterskog regiona za optimizaciju genske ekspresije.

[0056] Kontrolni elementi (npr., regulatorne sekvence) su oni netranslatirani regioni vektora, npr., pojačivači, promotori, 5 'i 3' netranslatirani regioni, koji interaguju sa ćelijskim proteinima domaćina da izvršavaju transkripciju i translaciju. Takvi elementi variraju u svojoj snazi i specifičnosti. U zavisnosti od sistema vektora i određene ćelije domaćina, može se koristiti bilo koji broj odgovarajućih elemenata transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere. U sistemima ćelija sisara su poželjni promoteri iz gena sisara ili virusa sisara. Konstrukti za primenu u sistemima ekspresije proteina dizajnirani su da sadrže samo jedan promoter, sekvencu pojačivača (opciono za sisarske sisteme ekspresije) i druge sekvence koje su neophodne ili potrebne za pravilnu transkripciju i regulaciju ekspresije gena (npr., sekvence za iniciranje i prekidanje transkpricije, poreklo mesta replikacije, sekvence poliadenilacije). Izbor odgovarajućeg vektora za pravilnu transkripciju, ekspresiju i izolaciju proteina koji su proizvedeni u eukariotskim (npr., sisarskim) ekspresionim sistemima je dobro poznat prosečnim poznavaocima oblasti.

[0057] Eukariotske kontrolne sekvence koje se obično koriste za primenu u sisarskim ekspresionim vektorima obuhvataju promotere i kontrolne sekvence kompatibilne sa sisarskim ćelijama, kao što su, na primer, citomegalovirusni (CMV) promoter (CDM8 vektor)

1

i sarkoma virus ptica (avian sarcoma virus - ASV). Drugi uobičajeno korišćeni promoteri obuhvataju rane i kasne promotere iz Simian Virusa 40 (SV40) (Fiers et al., Nature, 273:113 (1973)), ili druge virusne promotere kao što su oni izvedeni iz polioma, Adenovirusa 2, i goveđeg papiloma virusa. Inducibilni promoter, kao što je hMTII (Karin et al., Nature, 299:797-802 (1982)) može takođe biti korišćen.

B. Proizvodnja proteina

[0058] Kao što je ovde korišćeno, termini "polipeptid", "polipeptidni proizvod", "protein" i "proteinski proizvod" se koriste naizmenično i, kao što je poznato u oblasti, odnose se na molekul koji se sastoji od dve ili više aminokiselina, npr. barem jednog lanca aminokiselina koji je vezan preko sekvencijalnih peptidnih veza. U jednom tehničkom rešenju, “protein od interesa" ili "polipeptid od interesa" je protein kodiran od strane egzogenog molekula nukleinske kiseline koji je transformisan u ćeliju domaćinu, pri čemu egzogena DNK određuje sekvencu aminokiselina. U još jednom tehničkom rešenju, "protein od interesa" je protein koji je kodiran pomoću molekula nukleinske kiseline koja je endogena za ćeliju domaćina.

[0059] Brojni polipeptidi mogu se proizvesti metodama predmetnog pronalaska. Polipeptidi koji služe kao primer uključuju proizvode gena, prirodne proteine, homologe, ortologe, paraloge, fragmente i druge ekvivalente, varijante i analoge prethodno navedenih. Polipeptidi mogu takođe obuhvatiti jednu ili više modifikacija kao što su, na primer, lipidni deo, fosfat, šećerni deo itd. Posebni polipeptidi koji mogu biti poželjni za ekspresiju u metodi predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, citokine, receptore citokina, faktore rasta (npr., epidermalni faktor rasta (EGF), receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2 (HER-2), fibroblastni faktor rasta-alfa (FGF-α.), fibroblastni faktor rasta-beta (FGF-β), transformišući faktor rasta-alfa (TGF-α), transformišući faktor rasta-beta (TGF-β), faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF), insulinu sličan faktor rasta-1 (IGF-1), insulinu sličan faktor rasta 2 (IGF-2), faktor rasta nerava (NGF), faktor rasta nerava beta (NGF-β)); receptori faktora rasta, uključujući fuzione ili himerne proteine, hormone rasta (npr., humani hormon rasta, goveđi hormon rasta); insulin (npr., lanac A insulina i lanac B insulina), proinsulin; eritropoetin (EPO); faktori koji stimulišu kolonije (npr., faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF)); interleukini (npr., IL-1 do IL-12); vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF) i njegov receptor (VEGF-R); interferoni (npr., IFN-α, β, ili γ) i njihovi receptori; faktor nekroze tumora (npr., TNF-α i TNF-β) i njihovi receptori,

1

TNFR-1 i TNFR-2; trombopoetin (TPO); trombin; moždani natriuretični peptid (BNP); faktori koagulacije (npr., Faktor VIII, Faktor IX, von Willebrands faktor, i slično); antikoagulacioni faktori; aktivator tkivnog plazminogena (TPA), npr., urokinaza ili TPA iz humanog urina ili TPA tkivnog tipa; folikulo stimulirajući hormon (FSH); luteinizairajući hormon (LH); kalcitonin; CD proteini (npr., CD3, CD4, CD8, CD28, CD19, itd.); CTLA proteini (npr., CTLA4); T-ćelijski i B-ćelijski receptorni proteini; morfogeni proteini kostiju (BMPs, npr., BMP-1, BMP-2, BMP-3, itd.); neurotrofični faktori, npr. neurotrofični faktor izveden iz kostiju (BDNF); neurotrofini, npr., 3-6; renin; reumatoidni faktor; RANTES (regulisan aktivacijom normalno eksprimiranih i sekretovanih T-ćelija); albumin; relaksin; relaksin skiA-lanac; relaksinski B-lanac; prorelaksin; inhibitori proteina makrofaga (npr., MIP-1, MIP-2); virusni proteini ili antigeni; proteini površinske membrane; proteini jonskih kanala; enzimi; regulatorni proteini; antitela; imunomodulatorni proteini, (npr., HLA, MHC, familija B7); “homing” receptori (receptori za naseljavanje, udomljavanje); transportni proteini; superoksid dismutaza (SOD); proteini G protein spregnutih receptora (GPCRs); neuromodulatorni proteini; proteini i peptidi povezani sa Alchajmerovom bolešću (npr., A-β), paratiroidni hormon; tirodini stimulirajući hormon; lipoproteini; glukagon; atrijali natriuretički faktor; plućni surfactant; bombezin; hemopoetski faktor rasta; enkefalinaza; serum albumin (npr., humani serum albumin); mullerian-inhibirajuća supstanca; gonadotropin-povezani peptid; DNaza; inhibin; aktivin; receptori za hormone ili faktore rasta; integrin; protein A ili D; CD proteini kao što su CD-3, CD-4, CD-8 i CD-19; PD-1 i PD-L1 (B7-H1 i ligand); i B7-H4, osteoinduktivni faktori; imunotoksini; faktor koji ubrzava raspadanje; i drugi poznati u oblasti, fuzioni proteini i polipeptidi, himerni proteini i polipeptidi, i fragmenti ili delovi, ili mutanti, varijante ili analozi bilo kog od prethodno pomenutih proteina i polipeptida.

[0060] U daljim tehničkim rešenjima, metode predmetnog pronalaska mogu se koristiti za proizvodnju imunoglobulina (npr., antitela), molekula koji sadrže imunoglobulinu slične domene (npr., molekuli koji sadrže ankirin ili fibronektin domen) i Fc-fuzione proteine. Termin "Fc-fuzioni protein", kao što je ovde korišćen, podrazumeva obuhvatanje terapeutskih proteina koji sadrže deo izveden iz imunoglobulina (tj. Fc deo) i deo koji je izveden iz drugog, ne-imunoglobulinskog proteina.

[0061] U posebnom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, polipeptid proizveden metodama predmetnog pronalaska je antitelo. Termin "antitelo" se koristi u najširem smislu da pokrije bilo koji tip poznatog antitela, uključujući, ali bez ograničenja na, monoklonska

1

antitela (uključujući monoklonska antitela u punoj dužini), poliklonska antitela, monospecifična antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), imunoadhezine, himere antitelo-imunoadhezin, humanizovana, humana, himerna, jednolančana, sintetička, rekombinantna, hibridna, mutirana, graftovana, ili in vitro generisana antitela. Antitelo može biti antitelo u punoj dužini ili fragment antitela. Antitelo može biti izabrano iz bilo kojeg poznatog izotipa antitela, na primer, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM. Antitelo može biti monomer, dimer ili multimer (npr. trimer ili pentamer).

[0062] Termin "antitelo" ili "imunoglobulin," kao što je ovde naizmenično korišćeno, obuhvata cela antitela i bilo koji antigen vezujući fragment (tj., "antigen-vezujući deo") ili njihove pojedinačne lance. "Antitelo" sadrži barem dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (skraćen ovde kao VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (skraćen ovde kao VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži jedan domen, CL. VHi VLregioni mogu dalje biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementranost (CDR), protkane sa regionima koji su više konzervirani, označeni kao okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDRs i četiri FRs, raspoređena od amino-terminusa do karboksi-teminusa po sledećem redu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0063] Termin "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "deo antitela"), kao što je ovde korišćeno, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koje zadržava sposobnost da se specifično veže za antigen. Pokazano je da antigen-vezujuća funkcija antitela može biti izvedena fragmentima antitela u punoj dužini. Primeri vezujućih fragmenata su obuhvaćeni u sklopu termina " antigen-vezujući deo " antitela obuhvataju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta vezana pomoću disulfidnog mosta na regionu zgloba; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb koje uključuju VH i VL domene; (vi) dAb fragment (Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)), koji se sastoji od VHdomena; (vii) dAb koji se sastoji od VH ili VL domena; i (viii) izolovani region koji određuje

1

komplementarsnost (CDR) ili (ix) kombinacija dva ili više izolovanih CDRS koji mogu biti opciono udruženi pomoću sintetičkog veznika. Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirani odvojenim genima, oni se mogu udružiti, korišćenjem rekombinantnih metoda, pomoću sintetičkog veznika koji im omogućava da budu načinjeni kao pojedinačni proteinski lanac u kome se VLi VHregioni sparuju da formiraju monovalentne molekule (poznati kao jednolančani Fv (scFv); videti, npr., Bird et al., Science, 242:423-426 (1988); i Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)). Takva jednolančana antitela takođe treba da budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući deo" antitela. Ovi fragmenti antitela se dobijaju korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su poznate prosečnim poznavaocima oblasti, i fragmenti su testirani za korisnost na isti način kao što su i intaktna antitela. Antigen-vezujući delovi mogu biti proizvedeni tehnikama rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih imunoglobulina.

[0064] Termin "monoklonsko antitelo", kao što je ovde upotrebljeno, odnosi se na antitelo koje se dobija od populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična osim za moguće prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv pojedinačnog antigenskog mesta. Pored toga, za razliku od konvencionalnih (poliklonskih) antitela koja tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante antigena. Na primer, monoklonska antitela mogu se proizvoditi koristeći konvencionalnu hibridomsku tehnologiju koju je prvi opisao Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili ona mogu biti napravljena korišćenjem metoda rekombinantne DNK (videti, npr., Američki patent br. 4,816,567). Monoklonska antitela mogu takođe biti izolovana iz biblioteka fagnih antitela, npr., korišćenjem tehnikama koje su opisane u Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); i Američkim patentima br. 5,223,409; 5,403,484; 5,571,698; 5,427,908 5,580,717; 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; i 6,593,081.

[0065] "Bispecifično" ili "bifunkcionalno antitelo" je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teških/lakih lanaca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela mogu se proizvoditi različitim metodama uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992).

2

[0066] "Izolovano antitelo", kao što je ovde korišćeno, bi trebalo da se odnosi na antitelo koje je suštinski oslobođeno drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti. Osim toga, izolovano antibilo je obično u značajnoj meri suštinski oslobođeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, više "izolovanih" monoklonalnih antitela koja imaju različite vezivne specifičnosti se kombinuju u dobro definisanom sastavu.

[0067] Kao što je ovde korišćeno, "izotip" odnosi se na klasu antitela (npr., IgM ili IgG1) koaj je kodirana pomoću gena za konstantni region teškog lanca. U jednom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen vezujući deo je izotip odabran od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, ili IgE izotipa antitela.

[0068] Monoklonska antitela opisana ovde uključuju "himerna" i "humanizovana" antitela u kojima deo teškog i/ili lakog lanca je identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima koja su izvedena iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima koja su izvedena iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (Američki patent br. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). "Humanizovani" oblici ne-humanih (npr., murinskih) antitela su himerna antitela koje sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima se ostaci hipervarijabilnog regiona primalaca zamenjuju ostacima hipervarijabilnog regiona iz nehumane vrste (antitelo donora) kao što su miš, pacov, zec ili ne-humani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, Fv ostaci okvirnog regiona (FR) zamenjuju se odgovarajućim ne-humanim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji se ne mogu naći u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije su načinjene da bi se dalje da dalje rafinisale performanse antitela. Uopšteno govoreći, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sva od najmanje jednog, tipčno dva, varijabilna domena, u kojima sve ili u suštini sve hipervarijalne petlje odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi regioni FR su oni od humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovana antitela opciono će takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog od humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). Himerna ili humanizovana antitela mogu biti pripremljena na osnovu sekvence murinskog monoklonskog antitela koje je pripremljeno kao što je opisano iznad. DNK koja kodira imunoglobuline teškog i lakog lanca može biti dobijena iz murinskog hibridoma od interesa i projektovana da sadrži ne-murinske (npr., humane) imunoglobulinske sekvence korišćenjem tehnika molekularne biologije. Na primer, da bi se kreiralo himerno antitelo, murinski varijabilni regioni, mogu biti vezani za humane konstantne regione korišćenjem metoda koje su poznate u oblasti (videti, npr., Američki patent br. 4,816,567 od Cabilly et al.). Da bi se kreiralo humanizovano, murinski CDR regioni mogu biti insertovani u humani okvirni region korišćenjem metoda koje su poznate u oblasti (videti, npr., Američki patent br. 5,225,539 od Winter, i Američki patenti br. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i6,180,370 od Queen et al.).

[0069] Monoklonska antitela opisana ovde takođe uključuju "humana" antitela, koja mogu biti izolovana iz raznih izvora, uključujući, npr., iz krvi humanog pacijenta ili rekombinantno pripremljena korišćenjem transgenih životinja. Primeri takvih transgenih životinja uključuju KM-MOUSE® (Medarex, Inc., Princeton, NJ) koji ima transgen humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca (videti WO 02/43478), XENOMOUSE® (Abgenix, Inc., Fremont CA; opisano u, npr., Američkim patentima sa brojem 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 i 6,162,963 od Kucherlapati et al.), i HUMAB-MOUSE® (Medarex, Inc.; opisano u, npr., Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research, 20:6287-6295 (1992); Chen, J. et al., International Immunology, 5:647-656 (1993); Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3720-3724 (1993); Choi et al., Nature Genetics, 4:117-123 (1993); Chen, J. et al., EMBO J., 12: 821-830 (1993); Tuaillon et al., J. Immunol., 152:2912-2920 (1994); Taylor, L. et al., International Immunology, 6: 579-591 (1994); i Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996); Američki patenti sa brojem 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; 5,545,807; Objave PCT prijava sa brojevima WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 i WO 99/45962, WO 01/14424 od Korman et al.). Humana monoklonska antitela predmetnog pronalaska mogu takođe biti pripremljena korišćenjem SCID miševa u koje su takođe rekonstituisane humane imune ćelije tako da odgovor humanog antitela može biti generisan po imunizaciji. Takvi miševi su opisani u, na primer, Američkim patentima sa brojem 5,476,996 i 5,698,767 od Wilson et al.

[0070] Još jedan primer tipa proteina koji može biti proizveden korišćenjem metoda predmetnog pronalaska je fuzioni protein. Fuzioni protein je protein, domen ili protein (npr., solubilni vanćelisjki domen) fuzionisan za heterologni protein ili peptid. Reprezentativni fuzioni proteini obuhvataju, ali nisu ograničeni na, proteine koji su eksprimirani kao fuzija sa delom imunoglobulinskog molekula, proteine eksprimirane kao fuzioni proteini sa “ziper” (rajsfešlus) segmentom, i nove polifunkcionalne proteine, kao što su fuzioni protein citokina i faktor rasta. WO 93/08207 i WO 96/40918 opisuju pripremu raznih solubilnih oligomernih oblika molekula označenog kao CD40L, uključujući imunoglobulinski fuzioni protein i ziper fuzioni protein, redom. Tehnike opisane u WO 93/08207 i WO 96/40918 su primenjive na druge proteine. Generalno govoreći, bilo koji molekul može biti eksprimiran kao fuzioni protein uključujući, ali bez ograničenja na, vanćelijski domen ćelijskog receptornog molekula, hormon, enzim, citokin, deo imunoglobulinskog molekula, ziper domen, i epitop.

C. Prečišćavanje i purifikacija ćelijske kulture

[0071] Predmetna specifikacija stavlja na uvid javnosti poboljšane metode za prečišćavanje ćelijske kulture npr., kako bi se olakšalo sakupljanje eksprimiranog proteina. Konkretno, predmetna specifikacija opisuje metodu za prečišćavanje proteina iz ćelijske kulture prilagođavanjem pH ćelijske kulture ispod vrednosti neutralnog pH (tj., ispod pH 7) i uspostavljanjem ćelijske kulture, tako da se ćelijska kultura izdvaja da bi se formirao supernatantni sloj i sloj ćelijskog materijala, pri čemu je protein prisutan i može se izolovati iz supernatantnog sloja. Metode stavljene na uvid javnosti u ovoj specifikaciji mogu sadržati korake za poboljšanje procesa prečišćavanja. Na primer, nakon što se protein izoluje iz supernatantnog sloja, postupci mogu dalje obuhvatati ispiranje ćelijskog sloja sa puferom sa istim pH, dodatnim uspostavljanjem, i dodatnom filtracijom tako da se više prinosa proteina može dobiti iz ćelijske kulture. Metode prečišćavanja opisane ovde mogu se koristiti u kombinaciji sa gore opisanom metodom za ćelijske kulture ili bilo kojom drugom metodom za ćelijske kulture.

[0072] Kao što je ovde korišćeno, termin "sloj supernatanta ćelijske kulture" odnosi se na tečnu frakciju ćelijske kulture, uključujući tečnu fazu ćelijskog materijala.

[0073] Kao što je ovde korišćeno, termin "sloj ćelijskog materijala" odnosi se na sloj biomase ćelijske kulture.

[0074] Kao što je ovde korišćeno, termin "uspostavljanje" odnosi se na proces omogućavanja ćelijskoj kulturi da odstoji nesmetano tokom perioda vemena, tako da olakša separaciju suepernatanta od ćelijskog materijala. Ćelijska kultura može biti uspostavljena tokom bilo kog perioda vremena, uključujući, ali bez ograničenja na oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,

2

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137,138, 139, 140, 141, 142, 143,144, i 145 minuta. U jednom tehničkom rešenju, ćelijska kultura može biti uspostavljena tokom između oko 30-120 minuta. U još jednom tehničkom rešenju, ćelijska kultura može biti uspostavljena tokom između oko 30-60, 60-90 ili 90-120 minuta.

[0075] Ćelijske kulture se mogu prečistiti korišćenjem metoda opisanih ovde samostalno ili u kombinaciji sa drugim poznatim tehnikama za prečišćavanje i purifikaciju. Takvi poznati procesi uključuju, ali nisu ograničeni na, filtraciju, centrifugiranje, precipitaciju (npr., etanolsku precipitaciju ili precipitaciju amonijum sulfatom), fazno odvajanje, afinitetno prečišćavanje, gel filtriranje, jonoizmenjivačku hromatografiju, hidrofobnu interakcionu hromatografiju (HIC; korišćenjem smola kao kao fenil etar, butil etar ili propil etar), HPLC ili frakcionisanje na imunoafinitetnoj ili jonoizmenjivačkoj koloni, reverzni SDS-PAGE ili bilo koju kombinaciju ovih tehnika. Inhibitor proteaze kao što je fenil metil sulfonil fluorid (PMSF) takođe može biti koristan za inhibiciju proteolitičke degradacije tokom prečišćavanja.

[0076] Prosečan poznavalac oblasti će ceniti da metode prečišćavanja pogodne za protein od interesa mogu zahtevati modifikaciju da bi se objasnile promene u karakteru proteina nakon ekspresije u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi. Dodatno, željeni stepen prečišćavanja zavisi od određenog proteina i nameravane upotrebe proteina. Proteini konačno izolovani korišćenjem metode opisane ovde mogu biti pogodni za terapeutske i dijagnostičke primene.

[0077] Kao što je ovde korišćeno, termin "dubinska filtracija" odnosi se na vrstu filtracije koja se izvršava pomoću dubinskog filtera. Dubinski filter obično ima više slojeva filtracionog medijuma, svaki različite veličine i gustine, koji progresivno postaju finiji i gusšći u donjem sloju. Dubinski filter zaustavlja u okviru svoje strukture, ne samo na površini.

[0078] Kao što je ovde korišćeno, termin "polirajuća filtracija" odnosi se na finiji stepen dubinske filtracije i membranske filtracije.

[0079] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima koje ne bi trebalo tumačiti kao dodatno ograničavajuće.

PRIMERI

Primer 1: Fed-batch proces kultivacije veoma gustih ćelija

A. Eksperimentalne metode

[0080] Rekombinantne CHO ćelije (tj., antitelo koje proizvodi CHOK1SV ćelije) su raširene u posudama za ćelijske kulture pre inokulacije pomoću Wave perfuzionog bioreaktora. Perfuzioni bioreaktor je korišćen sa istim osnovnim medijumom koji se koristi u procesu ekspanzije ćelija. Brzina perfuzije prilagođena je kako bi održala zdravu kulturu sa visokim vijabilitetom ćelija. U nekim eksperimentima, ćelije su koncentrovane do veće ćelijske gustine, kako je odgovarajuće, prilagođavajući brzine protoka medijuma unutra i napolje. Jednom kada je gustina vijabilnih ćelija dostigla više od 50×10<6>ćelija/mL, započet je proces fed-batch proizvodnje. Kultura se hranila kombinacijom bolusnih i kontinuiranih načina prehranjivanja, kako bi se kontrolisala osmolalnost i nivo glukoze. Ćelijska kultura je zatim sakupljena kada je vijabilnost ćelija smanjena na oko 60-10%.

B. Eksperiment 1

[0081] Ćelije su inokulirane u BIOSTAT Cultibag (Sartorius) pri približno 0.84×10<6>ćelija/mL. Brzina specifične perfuzije (SPR) se kretala od 0.25 do 0.03 x 10<-6>mL ćelija<-1>dan<-1>. Ćelije su koncentrovane oko 2.6 puta kada je gustina vijabilnih ćelija dostigla 12.6 × 10<6>ćelija/mL. Nakon koncentrisanja, ćelije su gajene do 108.8×10<6>ćelija/mL. Kada su ćelije dostigle 108.8×10<6>ćelija/mL, perfuzija je zaustavljena i odmah je započet “fed-batch” proces. Tokom fed-batch procesa, jedno ili dva bolusna hranjenja pri 3 do 10% (tj., procenat zapremine hranjenja prema zapremini nakon hranjenja) su izvođena svaki dan da bi se održala ćelijska vijabilnost. Glukoza je takođe obogaćena bolusnim hranjenjem da bi se održao dovoljan nivo. Ćelijska gustina je dostigla 124.66 × 10<6>ćelija/mL sa 98% vijabilnosti drugi dan nakon što je započeo fed-batch proces. Ukupan procenat hranjenja je bio oko 40%. Kao što je pokazano na profilu rasta i proizvodnje prikazanom na Slici 3, finalna produktivnost od 8.8 g/L iz fed-batch procesa je postignuta nakon 6 dana pri vijabilnosti od 39%.

C. Eksperiment 2

[0082] Ćelije su inokulirane u WAVE BIOREACTOR® (GE Healthcare, Fairfield, CT) pri približno 0.81×10<6>ćelija/mL. Brzina specifične perfuzije (SPR) se kretala od 0.07 do 0.01 x 10<-6>mL ćelija<-1>dan<-1>i varirala je na različitim vremenskim tačkama. Ćelije su koncentrovane oko 1.5 put preko noći između dana 15 i 16. Na dan 16, ćelijska gustina je dostigla oko

2

136.5×10<6>ćelija/mL. U ovom trenutku, proces perfuzije je zaustavljen i započet je “fedbatch” proces. Jedan ili dva bolusna hranjenja pri 1 do 6% su izvedena u prva dva dana da bi se održala vijabilnost ćelija. Kontinuirano snabdevanje glukozom i/ili drugim hranjivim sastojcima započelo je prvog dana fed-batch procesa kako bi se održao nivo glukoze, kao i promovisanje povoljnog trenda povećanja osmolalnosti, uz obezbeđivanje dovoljno hranljivih sastojaka.

[0083] Ćelije su rasle do 142.0 ×10<6>ćelija/mL oko 7 sati nakon što je fed-batch proces počeo i ukupan procenat hranjenja (snabdevanja) je bio oko 28%. Kao što je pokazano u profilu rasta i proizvodnje prikazanom na Slici 4, finalna produktivnost od 13.8 g/L je postignuta nakon 6 dana pri vijabilnosti od 61% iz faze proizvodnje.

[0084] Tokom ovog eksperimenta, primećeno je da su sve komponente hranjenja ispale iz rastvora u cevovodu pumpe tokom procesa kontinualnog hranjenja, moguće zbog usporene brzine protoka. Kao takve, neke modifikacije hranjenja su napravljene u narednoj studiji (videti Eksperiment br.5 ispod) kako bi se sprečilo precipitiranje komponenti za hranjenje u cevovodu pumpe.

D. Eksperiment 3

[0085] Ćelije su inokulirane u bioreaktoru WAVE BIOREACTOR® (GE Healthcare, Fairfield, CT) pri približno 1.20 x 10<6>ćelija/mL. Brzina specifične perfuzije (SPR) se kretala od 0.07 do 0.03 (npr., 0.05) x 10<-6>mL ćelija<-1>dan<-1>i varirala je na različitim vremenskim tačkama. Kao što je prikazano na Slici 5, ćelije su delimično prebačene na dan 13 i dan 18 u dva odvojena bioreaktora sa rezervoarima koji se mešaju od 5 litara pri gustini ćelija od oko 50 × 10<6>ćelija/mL. Antipenušajući agens je takođe dodat da se savlada penušanje u bioreaktorima. Kao što je pokazano u profilu rasta i proizvodnje koji je prikazan na Slici 5, finalna produktivnost od 6.3 g/L pri oko 40% vijabilnosti je postignuta iz fed-batch ćelija prebačenih na dan 13 (tj., 2391AB) (see Slika 6). Finalna produktivnost od 7.1 g/L pri oko 38% vijabilnosti je postignuta iz fed-batch ćelija prebačenih na dan 18 (tj., 2391BB) (videti Sliku 6).

E. Eksperiment 4

[0086] Dalje izvođenje perfuzije je izvedeno da se ponovi proces kultivacije ćelija iz prethodnih primera u pojedinačnom perfuzionom reaktoru (tj., tako da su i perfuzija i fedbatch izvedeni u istom bioreaktoru). Kroz optimizaciju perfuzionog procesa (npr., brzina specifične perfuzije (SPR)), gustina ćelija dostigla je preko 100 × 10<6>ćelija/mL na dan 8.

2

SPR je održavana u opsegu od oko 0.15 do 0.05, da se ćelije drže u stabilnim i zdravim uslovima. Ovo je dovelo do više od 100% povećanja stope ćelijskog rasta, u poređenju sa inicijalnim izvođenjima perfuzije (Eksperimenti br. 1 i 2). Gustina ćelija se povećala za oko 70% po danu.

[0087] Kada je gustina ćelija dostigla preko 100 × 10<6>ćelija/mL, fed-batch proces je počeo odmah i srednja perfuzija je zaustavljena. Dva do tri puta bolusna hranjenja od 2 do 6% su izvođena svaki dan tokom tri dana. Drugog dana nakon započinjanja fed-batch procesa, gustina ćelija je dostigla 119.5 × 10<6>ćelija/mL i postignuta je vijabilnost od 98%. Kontinuirano snabdevanje glukozom i/ili drugim hranjivim sastojcima obavljeno je tokom fed-batch procesa radi održavanja nivoa glukoze i kontrole stope povećanja osmolaliteta. Ukupan procenat količine hranjenja je oko 60%.

[0088] Optimizacija koncentracija i odnosa komponenti hranjenja dovela je do bistrog rastvora u cevovodu pumpe tokom kontinualnog procesa hranjenja. Nije bilo vidljivih taloženja. Međutim, zapremina hranjenja se značajno povećala u poređenju sa eksperimentom broj 2, što je rezultiralo razblaženom koncentracijom proizvoda. Kao što je prikazano na slici 7, konačna volumetrijska produktivnost iznosila je 8.9 g/L.

F. Rezime eksperimenata 1-4

[0089] Slika 8 sumira produktivnost i ćelijski integral eksperimenata br. 1-3 (tj., gde je fedbatch proces započeo sa preko 100 x 10<6>ćelija/mL) i eksperimenta br. 4 (tj., u kome je započet proces fed-batch sa oko 50 x 10<6>ćelija/mL). Produktivnost je predstavljena u smislu stvarno opaženog finalnog titra, kao i normalizovanog titra (npr. normalizovan pomoću početne zapremine i finalne gustine perfuzionih ćelija na 100 miliona ćelija/mL). Na primer, normalizovani titar se može izračunati na sledeći način:

Normalizovani titar = opaženi titar / (početna zapremina kulture x Finalna gustina perfuzionih ćelija

u 10<6>ćelija/mL) x 100

G. Optimizacija uslova za ćelijske kulture

[0090] Različiti eksperimentalni parametri se mogu prilagoditi kako bi se optimizovali uslovi za kulture ćelija. Na primer, osnovni medijum se može optimizovati koncentrisanjem hranjivih materija, kako bi se potencijalno smanjio volumen perfuzije. Alternativno ili dodatno, pH-puferska komponenta u osnovnom medijumu može se optimizovati radi

2

snalaženja sa uslovima niskog pH tipičnog za tradiscionalne bioreaktore sa rezervoarima za mešanje. Nadalje, sastav hrane i/ili strategija hranjenja mogu se optimizovati kako bi se unapredila produktivnost i efikasnost, uz istovremeno održavanje dobre rastvorljivosti.

Primer 2: Proces prečišćavanja veoma guste “fed-batch” ćelijske kulture [0091] Usled veoma velikih gustina ćelija proizvedenih u gore opisanim metodama kultivacije, dobijena kultura je imala visok procenat volumena čvrstog ćelijskog materijala (npr., 20% volumen ćelijskog materijala za kulture kada je ćelijska gustina preko 100 × 10<6>ćelija/mL prirodnim upostavljanjem ili centrfugiranjem) i veoma mutan supernatant. Kao takvo, veoma je izazovno sakupiti protein. Prema tome, nekoliko različitih eskeprimentalnih metoda je testirano da se poboljša efikasnost procesa sakupljanja tj., uspostavljanja ćelija, filtersko pomoćno sredstvo, dodavanje CaCl2, smanjivanje pH do 5.5 pre uspostavljanja ćelija, kao i razne kombinacije ovih tehnika.

[0092] Konkretno, razni uslovi su testirani korišćenjem 1201-09-29311AB izvođenja iz Eksperimenta # 3 (opisanog iznad). Kao što je prikazano na Slici 9, pH je smanjen na 4.5 ili 5.5, sa ili bez dodavanja pomoću filterskog pomoćnog sredstva, pre uspostavljanja ćelijske kulture tokom 90 minuta. Svi uslovi koji su testirani znatno su smanjili zamućenost (prikazani kao stubići na Slici 9) nakon uspostavljanja ćelija. U poređenju sa kontrolnim bioreaktorskim titrom, pH 4.5 u kombinaciji sa pomoćnim filterskim sredstvom dovela je do gubitka nekog proizvoda pomoću HPLC testa proteina A (prikazan kao dijamantski simboli na Slici 9).

[0093] Pored toga, smanjivanjem pH ili dodatkom kalcijumovih soli i/ili pomoću filterskog pomoćnog sredstva pre uspostavljanja, volumen ćelijskog materijala povećan je na oko 40-50% i proizveden je mnogo čistiji ćelijski supernatant. Ovaj poboljšani postupak prečišćavanja je takođe testiran na druge proteine i dobijeni su slični rezultati. U globalu, strategija uspostavljanja niske pH vrednosti povećala je značajan kapacitet filtracije i takođe je povećala kvalitet filtrata.

[0094] Dodatni koraci, kao što je pranje materijala pomoću pufera koji je kompatibilan sa proizvodom ili razređen pomoću PBS u istim uslovima pH koji se koristi za uspostavljanje ćelija, dodatno uspostavljanje i dodatna filtracija, opciono se mogu izvršiti kako bi se poboljšao proces prečišćavanja, kao što je prikazano na Slici 10. Međutim, treba napomenuti da Slika 10 nije namenjena da bude ograničavajuća, a dodatni opcioni koraci (npr., filtriranje,

2

centrifugiranje, ispiranje, itd.) mogu se pojaviti u drugačijem redosledu nego što je prikazano na Slici 10. Na primer, centrifugiranje se opciono može izvesti pre ili nakon procesa uspostavljanja.

2

Claims (10)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Metoda povećanja proizvodnje proteina u ćelijskoj kulturi, koja sadrži:

a) gajenje ćelija koje proizvode protein u perfuzionoj ćelijskoj kulturi do gustine ćelija od barem iznad oko 50×10<6>ćelija/mL; i

b) prebacivanje ćelija u “fed-batch” (prehranjivanu šaržnu) ćelijsku kulturu, tako da ćelije uđu u fazu proizvodnje;

gde ćelije su ćelije životinja.

2. Metoda iz patentnog zahteva 1, gde su ćelije gajene u perfuzionoj ćelijskoj kulturi do gustine ćelija od između oko 50×10<6>ćelija/mL i 150×10<6>ćelija/mL.

3. Metoda iz patentnog zahteva 1 ili 2, gde su ćelije gajene u perfuzionoj ćelijskoj kulturi do gustine ćelija od barem iznad oko 100×10<6>ćelija/mL.

4. Metoda iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, gde protein je antitelo.

5. Metoda iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, gde protein je odabran iz grupe koja se sastoji od enzima, receptora, fuzionih proteina, citokina, regulatornih faktora, hormona, antigen-vezujućih agenasa, terapeutskih proteina, i dijagnostičkih proteina.

6. Metoda iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, gde su perfuziona ćelijska kultura i “fed batch” ćelijska kultura gajene u pojedinačnom bioreaktoru.

7. Metoda iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, gde su perfuziona ćelijska kultura i “fed batch” ćelijska kultura gajene u odvojenim bioreaktorima.

8. Metoda iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5 i 7, gde je “fed-batch” ćelijska kultura gajena u više bioreaktora.

9. Metoda iz patentnog zahteva 7 ili 8, koja dalje sadrži sakupljanje proteina iz “fedbatch” ćelijske kulture a ne perfuzione ćelijske kulture.

10. Metoda iz patentnog zahteva 6, koja dalje sadrži sakupljanje proteina i iz perfuzione ćelijske kulture i iz “fed-batch” ćelijske kulture.

1