RS56508B1 - Primena vip3ab u kombinaciji sa cry1 za upravljanje otpornim insektima - Google Patents

Description

Stanje tehnike

[0001] Ljudi gaje kukuruz za hranu i primene u energiji. Ljudi takoÿe gaje mnoge druge useve, ukljuþujuüi soju i pamuk. Insekti jedu i ošteüuju biljke i time slabe ove ljudske napore. Bilioni dolara su potrošeni svake godine na kontrolu štetoþina u vidu insekata i dodatni bilion je izgubljen na šteti koju oni prouzrokuju. Sintetiþki organski hemijski insekticidi su bili glavno oruÿe korišüeno za kontrolu štetoþina u vidu insekata ali biloški insekticidi, kao što su insekticidni proteini izvedeni iz Bacillus thuringiensis (Bt), su odigrali znaþajnu ulogu u nekim podruþjima. Sposobnost da se proizvedu biljke koje su otporne na insekte kroz transformaciju sa Bt insekticidnim proteinskim genima je revolucionirao modernu poljoprivredu i poveüao važnost i vrednost insekticidnih proteina i njihovih gena.

[0002] Nekoliko Bt proteina je korišüeno za obrazovanje transgenskih biljaka koje su otporne na insekte koje su uspešno registrovane i komercijalizovane do danas. Ovo ukljuþuje Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F i Cry3Bb kod kukuruza, Cry1Ac i Cry2Ab kod pamuka, i Cry3A kod krompira.

[0003] Komercijalni proizvodi koji iskazuju ove proteine iskazuju pojedinaþni protein osim u sluþaju gde je poželjan kombinovani insekticidni spektrum od 2 proteina (npr., Cry1Ab i Cry3Bb kod kukuruza kombinovan kako bi obezbedio otpornost na štetoþine i to lepidoptera i moljac, respektivno) ili gde nezavisno dejstvo proteina þini ih korisnim kao oruÿe za odlaganje razvoja otpornosti kod podložne populacije insekata (npr., Cry1Ac i Cry2Ab kod pamuka kombinovan kako bi obezbedio otpornost na duvanski moljac). Videti takoÿe U.S. Patentnu Prijavu Br. Objave 2009/0313717, koja se odnosi na Cry2 protein plus Vip3Aa, Cry1F, ili Cry1A za kontrolu Helicoverpa zea ili armigerain. WO 2009/132850 odnosi se na Cry1F ili Cry1A i Vip3Aa za kontrolu Spodoptera frugiperda. U.S. Patentna Prijava Br.

Objave 2008/0311096 delom se odnosi na Cry1Ab za kontrolu Cry1F-otpornog ECB.

[0004] To je, neke od kvaliteta transgenskih biljaka otporne na insekte koje su dovele do brzog i širokog prilagoÿavanja ove tehnologije takoÿe izazivalo zabrinutost da üe populacije štetoþina razviti otpornost na insekticidne proteine koje proizvode ove biljke. Nekoliko strategija je predloženo za oþuvanje korisnosti osobine Bt-osnovne insektne otpornosti koja obuhvata rasporeÿivanje proteina pri visokoj dozi u kombinaciji sa ya[titom, i izmenama sa, ili zajedniþko korišüenje, razliþitih toksina (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol.16:144-146).

[0005] Proteini odabrani za primenu u slaganju rukovoÿenja insektne otpornosti (insect resistant management (IRM)) treba da vrši njihov insekticidni efekat nezavisno tako da otpornost razvijena u jednom proteinu se ne dodeljuje otpornosti drugog proteina (odn., nema unakrsne otpornosti na proteine). Ako, na primer, populacija štetoþina koja je otporna na "Protein A" je osteljiva na "Protein B", neko bi zakljuþio da nema unakrsnog otpora i da kombinacija Proteina A i Proteina B bi bila efikasna u odlaganju otpornosti na sam Protein A.

[0006] U odsustvu rezistentnih populacija insekata, procene mogu biti izvedene na osnovu drugih karakteristika za koje se pretpostavlja da su povezane sa mehanizmom delovanja i potencijalom unakrsne otpornosti. Predloženo je korisno vezivanje receptora u identifikaciji insekticidnih proteina koji verovatno ne pokazuju unakrsnu otpornost (van Mellaert et al. 1999). Kljuþni prediktor nedostatka unakrsne otpornosti koji je inherent u ovom pristupu jeste to što se insekticidni proteini ne takmiþe za receptore u osetljivim insektnim vrstama.

[0007] U sluþaju da se dva Bt toksina takmiþe za isti receptor, onda ukoliko taj receptor mutira u tom insektu tako da se jedan od toksina više ne vezuje za taj receptor i stoga nije više insekticidni protiv insekta, može biti sluþaj da üe insekt biti otporan na drugi toksin (koji se konkurentno vezuju za isti receptor). Odnosno, za insekte se kaže da je unakrsno otporan na oba Bt toksina. Meÿutim, ako se dva toksina vezuju za dva razliþita receptora, to bi mogla biti indikacija da insekt neüe biti istovremeno otporan na ta dva toksina.

[0008] Na primer, CrylFa protein je koristan u kontrolisanju mnogih vrsta štetoþina u vidu lepidoptera ukljuþujuüi evropski kukuruzni plamenac (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) i moljac (FAW; Spodoptera frugiperda), i aktivan je protiv plavca šeüerne trske (SCB; Diatraea saccharalis). CrylFa protein, kao što je proizvedeno u transgenskim kukuruznim biljkama koje sadrže sluþaj TC1507, je odgovoran za vodeüu osobinu industrijske inesektne otpornosti za FAW kontrolu. CrylFa dalje se koristi u Herculex®, SmartStax™, i WideStrike™ proizvodima.

[0009] Dodatni Cry toksini su navedeni na websajtu službenog B.t. odbora za nomenklaturu (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Trenutno je gotovo 60 glavnih grupa "Cry" toksina (Cry1-Cry59), sa dodatnim Cyt toksinima i VIP toksinima i sliþno. Mnoge od svake numeriþke grupe imaju podgrupe sa velikim slovom, a podgrupe sa velikim slovima imaju pod-podgrupe sa malim slovom. (Cry1 ima A-L, a Cry1A ima a-i, na primer).

Kratak opis pronalaska

[0010] Predmetni pronalazak se delimiþno odnosi na primenu Vip3Ab proteina u kombinaciji sa Cry1Ca proteinom i Cry1Fa ili Cry1Da proteina. Biljke (i posejana površina se takvim biljkama) koje proizvode takve proteine su obuhvaüene u obimu predmetnog pronalaska.

[0011] Ove naroþite trostruke gomile bi, prema predmetnom pronalasku, povoljno i iznenaÿujuüe pružile tri mesta dejstva protiv FAV. Ovo može pomoüi u smanjenju ili eliminaciji zahteva za površinskom zaštitom.

[0012] Predmetni pronalazak se odnosi delimiþno na iznenaÿujuüe otkriüe da se Vip3Ab ne takmiþi sa Cry1Ca za mesta vezivanja u crevima moljca (Spodoptera frugiperda; FAW).

[0013] Predmetni pronalazak se takoÿe odnosi delimiþno na trostruke gomile ili "piramide" sa þetiri toksina. U nekim poželjnim piramidalnim rešenjima, kombinacija odabranih toksina obezbeÿuje dejstvo ne unakrsne otpornosti protiv FAW.

[0014] Dodatni toksini/geni takoÿe mogu biti dodati prema predmetnom pronalasku dodavajuüi dva dodatna proteina na trostruke gomile gde dva dodatna proteina koja ciljaju ECB, üe obezbediti tri mesta dejstva protiv FAW, i tri mesta dejstva protiv ECB. Ova dva dodata proteina (þetiri i pet proteina) mogu biti odabrana izmeÿu grupe koja se sastoji od Cry2A, Cry1I, DIG-3, i Cry1Ab. Ovo üe rezultovati u peto proteinskoj gomili koja ima tri mesta dejstva protiv dva insekta (ECB i FAW).

Detaljan opis pronalaska

[0015] Predmetni pronalazak se odnosi delimiþno na iznenaÿujuüe otkriüe da Vip3Ab i Cry1Ca se ne takmiþe u vezivanju jedan za drugi u crevima moljca (FAW; Spodoptera frugiperda). Tri predmetna proteina Vip3Ab, Cry1Ca i jedan CryFa ili Cry1Da mogu se koristiti kod transgenskog kukuruza (i drugih biljaka; npr., pamuk i soja, na primer) da odlože ili spreþe FAW da sam razvije otpornost na jedan od ovih proteina. Predmetni proteini mogu biti efikasni kod zaštite biljaka (kao što su kukuruzne biljke i/ili biljke soje) od ošteüenja sa Cry-otpornim moljcem. Odnosno, jedna primena predmetnog pronalaska jeste da zaštiti kukuruz i druge ekonomski važne biljne vrste od ošteüenja i gubitak prinosa izazvan populacijom moljaca koji mogu da razviju otpornost na predmetne proteine.

[0016] Predmetni pronalazak stoga uþi upravljanje složene insektne otpornosti (IRM) koja obuhvata predmetne proteine da spreþe ili ublaže razvoj otpora od strane FAW na bilo koji ili oba ova proteina.

[0017] Otkrivene su kompozicije za kontrolisanje štetoþine lepidopterana koji sadrži üelije koje proizvode Vip3Ab insekticidni protein i Cry1Ca insekticidni protein.

[0018] Pronalazak dalje obuhvata üelije biljke da proizvode predmetne proteine. Predmetni polinukleotid(i) su poželjno u genetskoj konstrukciji pod kontrolom ne-Bacillus-thuringiensis promotera. Predmetni polinukleotidi mogu sadržati kodon korišüen za poboljšanu ekspresiju kod biljaka.

[0019] Dodatno je namenjeno da pronalazak obezbedi postupak kontrolisanja FAW koji obuhvata kontakt pomenutih štetoþina ili okoline pomenutih štetoþina sa efektivnom koliþinom kompozicije koja sadrži predmetne proteine.

[0020] Rešenje pronalaska obuhvata biljku kukuruza koja sadrži ekspresovane gene biljke koji kodiraju predmetne proteine, i seme takve biljke.

[0021] Drugo rešenje pronalaska obuhvata biljku kukuruza gde su ekspresovani geni biljke koji kodiraju predmetne proteine introgresovani u pomenutu biljku kukuruza, i seme takve biljke.

[0022] Kao što je opisano u Primerima, konkurentne studije vezivanja receptora korišüenjem radiooznaþenog Cry1Ca proteina pokazuju da Cry1Ca protein se ne takmiþi za vezivanje u FAW tkivima za koje se Vip3Ab vezuje. Ovi rezultati takoÿe ukazuju da kombinacija Vip3Ab i Cry1Ca proteina može da bude efikasno sredstvo da ublaži razvoj otpornosti u populaciji FAW za bilo koji od ovih proteina. Stoga, delom bazirano na podacima koji su ovde opisani, smatra se da se koprodukcija (slaganje) Cry1Ca i Vip3Ab proteina može koristiti za proizvodnju IRM stožera za velike doze za FAW.

[0023] Drugi proteini mogu biti dodati. Na primer, predmetni pronalazak takoÿe se odnosi delimiþno na gomile ili "piramide" više toksina, sa predmetnim proteinima koji predstavljaju bazu. U nekim poželjnim rešenjima piramide, odabrani toksini imaju tri odvojena mesta dejstva protiv FAW. Pod "odvojenim mestima dejstva," se podrazumeva bilo koji dati protein koji ne izaziva unakrsnu otpornost jedan sa drugim Ove posebne gomile bi, prema predmetnom pronalasku, povoljno i iznenaÿujuüe obezbedile tri mesta dejstva protiv FAW. Ovo može pomoüi u smanjenju ili eliminaciji potreba za površinskom zaštitom.

[0024] U vezi sa nekim specifiþnim rešenjima predmetnog pronalaska, pokazano je da populacija FAW otporna na insekticidnu aktivnost Cry1Fa proteina nije otprona na insekticidnu aktivnost Vip3Ab proteina ili insekticidnu aktivnost Cry1Ca proteina. Pokazano je da Cry1Ca se ne takmiþi za vezujuüa mesta sa Cry1Fa i da Vip3Ab se ne takmiþi za vezujuüa mesta sa CrylFa u crevima FAW. Videti USSN 61/284,281 (podnetu Decembar 16, 2009) koji se odnosi na CrylFa i Cry1Ca, i konkurentno podnete PCT prijave pod naslovom "KOMBINOVANA PRIMENA Vip3Ab I CRY1Fa ZA UPRAVLJANJE OTPRONOSTI INSEKATA")

[0025] Stoga, par toksina CrylFa plus Vip3Ab i CrylFa plus Cry1Ca obezbeÿuju neunakrsnu-otpornu aktivnost protiv FAW. Nemoguünost Vip3Ab1 da se takmiþi za vezivanje Cry1Ca u crevima FAW pokazuje da ova tri proteinska toksina (Cry1Fa, Vip3Ab, i CrylCa) predstavljaju trostruku piramidnu gomilu Cry toksina koja obezbeÿuje tri odvojena ciljana mesta interakcije unutar creva FAW. Ove posebne trostruke gomile üe, prema predmetnom pronalasku, povoljno i iznenaÿujuüe obezbediti ne-unakrsno-otporno dejstvo protiv FAW. Osim toga, dokazom da se ova tri proteina ne takmiþe jedan sa drugim, struþnjak u tehnici üe prepoznati da to može pomoüi u smanjivanju ili eliminaciji potreba za površinskom zaštitom. Kao i u korist ovog pronalaska, biljke koje iskazuju trostruku kombinaciju Cry1Fa, Vip3Ab i Cry1Ca, üe biti korisne u odlaganju ili prevenciji razvoja otpornosti kod FAW prema pojedinaþnom ili kombinaciji ovih proteina.

[0026] Dodatni toksini/geni mogu takoÿe biti dodati prema predmetnom pronalasku. Na primer, ako Cry1Fa je složen sa Vip3Ab i Cry1Ca, dodavanjem dva dodatna proteina ovoj trostukoj gomili gde dva dodata proteina ciljaju ECB, üe obezbediti tri mesta dejstva protiv FAW, i tri mesta dejstva protiv ECB. Ova dva dodata proteina (þetiti i pet proteina) mogu biti izabrana iz grupe koja se sastoji od Cry2A, Cry1I, DIG-3 (videti U.S. Patentnu Prijavu Serijski Br.61/284,278 (podnet Decembar 16, 2009) i US 201000269223), i Cry1Ab. To bi dovelo do petoproteinske gomile koja ima tri mesta dejstva protiv dva insekta (ECB i FAW)

[0027] Stoga, jedna opcija razvoja jeste da se koriste predmetni proteini da ublaže razvoj otpornosti kod FAW na bilo koji od ovih toksina. Prema tome, predmetni pronalazak se takoÿe odnosi na trostruke gomile ili "piramide" tri (ili više) toksina. U nekim poželjnim rešenjima piramide, odabrani toksini imaju tri odvojena mesta dejstva protiv FAW.

[0028] Ukljuþene meÿu opcijama primene predmetnog pronalaska bi trebalo da koriste barem predmetne proteine u podruþjima na kojima se gaji usev gde FAW može razviti otporne populacije.

[0029] Sa Cry1Fa koji je aktivan protiv FAW i ECB, Vip3Ab plus Cry1Ca plus CrylFa bi, prema predmetnom pronalasku, povoljno i iznenaÿujuüe obezbedio tri mesta dejstva protiv FAW. Ovo može da pomogne u smanjenju ili eliminisanju potreba za površinskom zaštitom.

[0030] Cry1Fa je postavljen u Herculex®, SmartStax™, i WidesStrike™ proizvodima. Geni Vip3Ab i Cry1Ca mogu da budu kombinovani u, na primer, Cry1Ca proizvod kao što je Herculex®, SmartStax™, i WideStrike™. Prema tome, predmetni proteini mogu biti znaþajni u smanjivanju pritiska selekcije na ove i druge proteine. Na taj naþin proteini mogu biti korišüeni za kukuruz i druge biljke (na primer, pamuk i soja).

[0031] Kao što je prethodno navedeno, dodatni toksini/geni mogu se takoÿe dodati prema predmetnom pronalasku. Za primenu CrylE (za kontrolu FAW), videti U.S. Patentnu Prijavu Serijski Br.61/284,278 (podnet Decembar 16, 2009).

[0032] Biljke koje proizvode bilo koju od predmetnih kombinacija proteina su obuhvaüeni unutar obima predmetnog pronalaska. Dodatni toksini/geni takoÿe mogu biti dodati, ali pojedine gomile koje su gore razmatrane pogodno i iznenaÿujuüe obezbeÿuju višestruka mesta dejstva protiv FAW i/ili ECB. Ovo može pomoüi u smanjenju ili eliminaciji potrebe za površinskom zaštitom.

[0033] GENBANK takoÿe može da se koristi za dobijanje sekvenci za bilo koji od gena i proteina koji su ovde otkriveni ili navedeni. Pogledajte Dodatak A, u nastavku. Relevantne sekvence su takoÿe dostupne u patentima. Na primer, U.S. Patent Br.5,188,960 i U.S. Patent Br.5,827,514 opisuju CrylFa jezgro toksina koji sadrži proteine pogodne za primenu u izvoÿenju predmetnog pronalaska. U.S. Patent Br.6,218,188 opisuje DNK sekvence koje kodiraju Cry1Fa jezgro toksina koji sadrži proteine koji su pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku. USSN 61 / 284,275 (podneta 16. decembra 2009) obezbeÿuje neke skraüene Cry1Ca proteine koji se mogu koristiti prema predmetnom pronalasku.

[0034] Kombinacije proteina opisane ovde mogu se koristiti za kontrolu štotiþina lepidopterana. Odrasli lepidopterani, na primer, leptirovi i moljci, primarno se hrane na cvetnom nektaru i znaþajni su efektori oprašivanja. Skoro sve larve lepidopterana, odn., gusenice, hrane se na biljkama, a mnogi su ozbiljne štetoþine. Gusenice se hrane na i unutar lista ili na korenima ili stabljici biljke, lišavajuüi biljku hranjivih materija i þesto uništavajuüi strukturu fiziþke podrške biljke. Dodatno, gusenice se hrane na voüu, tkanini, i skladištenim žitaricama i brašnu, uništavajuüi ove proizvode za prodaju ili ozbiljno smanjujuüi njihovu vrednost. Kao što je korišüeno ovde, reference koje upuüuju na štetoþine lepidopterana odnose se na razne životne faze štetoþine, ukljuþujuüi fazu larve.

[0035] Neki himerni toksini predmetnog pronalaska obuhvataju potpuni deo N-terminalnog jezgrenog toksina Bt toksina i, u nekom trenutku prolazeüi pored kraja porcije jezgrenog toksina, protein ima tranziciju u heterolognu sekvencu protokina. N-terminalni, insekticidno aktivni, toksiþni deo Bt toksina se odnosi kao "jezgreni" toksin. Prelazak iz segmenta jezgrenog toksina u heterologni protoksin segment se može desiti na približnom spoju toksina/protoksina ili, alternativno, deo nativnog protoksina (produžetak koji prolazi jezgreni toskiþni deo) može se zadržati, uz prelazak na heterologni deo protoksina koji se javlja nizvodno.

[0036] Kao primer, jedan himerni toksin predmetnog pronalaska je deo celokupnog jezgrenog toksina Cry1Ca (otprilike prvih 600 amino kiselina) i/ili heterolognog protoksina (preostale amino kiseline do C-terminusa). U jednom poželjnom rešenju, deo himernog toksina koji sadrži protoksin je izveden iz Cry1Ab proteinskog toksina. U poželjnom rešenju, deo himernog toksina koji sadrži protoksin je izveden iz Cry1Ab proteinskog toksina.

[0037] Osoba struþna u ovoj tehnici üe ceniti da Bt toksini, þak unutar izvesne klase kao što je Cry1Ca, üe se u odreÿenoj meri razlikovati u dužini i preciznom položaju prelaska sa dela jezgra toksina na deo protoksina. Obiþno, Cry1Ca toksini su oko 1150 do oko 1200 amino kiselina u dužini. Prelazak iz dela jezgrenog toksina u deo protoksina üe obiþno da se desi izmeÿu oko 50% do oko 60% pune dužine toksina. Himerni toksin predmetnog pronalaska üe obuhvatati puno proširenje ovog N-terminalnog dela jezgrenog toksina. Stoga, himerni toskin üe obuhvatati bar oko 50% pune dužine Cry1 Bt toksiþnog proteina. Ovo üe obiþno biti najmanje oko 590 amino kiselina. Što se tiþe protokinskog dela, puno proširenje Cry1Ab protoksiþnog dela proširuje se od kraja dela jezgrenog toksina do C-terminusa molekula.

[0038] Geni i toksini. Geni i toksini korisni prema predmetnom pronalasku obuhvataju ne samo punu dužinu sekvenci koje su otkrivene veü takoÿe i fragmente ovih sekvenci, varjante, mutante, i fuzione proteine koji zadržavaju karakteristiþnu pesticidnu aktivnost toksina posebno ovde navedeni kao primeri. Kao što je korišüeno ovde, termini "varijante" ili "varijacije" gena odnose se na nukleotidne sekvence koje kodiraju iste toskine ili koje kodiraju ekvivalentne toksime koji imaju pesticidnu aktivnost. Kao što je korišüeno ovde, termin "ekvivalentni toksini" se odnosi na toskine koji imaju istu ili bitno istu biološku aktivnost protiv ciljanih štetoþina kao zahtevani toksini.

[0039] Kao što je korišüeno ovde, granice predstavljaju približno 95% (Vip3Ab ’s i Cry1Ca’s), 78% (Vip3Ab’s i Cry1C’s), i 45% (Cry1’s) identiteta sekvence, na osnovu "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, i D.H. Dean.

Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Ovi prekidaþi se mogu primeniti samo na jezgrene toksine.

[0040] Trebalo bi da bude oþigledno osobi struþnoj u ovoj tehnici da geni koji kodiraju aktivne toksine mogu biti identifikovani i dobijeni na nekoliko naþina. Specifiþni geni ili delovi gena koji su ovde navedeni, mogu se dobiti od izolata deponovanih u depozitu kultura. Ovi geni, ili delovi ili njihove varijante, takoÿe mogu biti sintetiþki konstruisani, na primer, primenom sintetizatora gena. Varijacije gena se mogu lako konstruisati koristeüi standardne tehnike za pravljenje taþnih mutacija. Takoÿe, fragmenti ovih gena se mogu napraviti korišüenjem komercijalno dostupnih eksonukleaza ili endonukleaza prema standardnim procedurama. Na primer, enzimi kao što je Bal31 ili mutageneza usmerena na lokaciju mogu se koristiti za sistematsko odstranjivanje nukleotida sa krajeva ovih gena. Geni koji kodiraju aktivne fragmente mogu se takoÿe dobiti korišüenjem razliþitih enzima restrikcije. Proteaze se mogu koristiti za direktno dobijanje aktivnih fragmenata ovih proteinskih toksina.

[0041] Fragmenti i ekvivalenti koji zadržavaju pesticidnu aktivnost izloženih toksina bi bili u okviru predmetnog pronalaska. Takoÿe, zbog otpuštanja genetiþkog koda, varijacije razliþitih sekvenci DNK mogu kodirati sekvence amino kiselina koji su ovde prikazani. Dobro je da sa struþnim osobama obuþenim u tehnici se stvore ove alternativne DNK sekvence koje kodiraju iste, ili suštinski iste, toksine. Ove varijantne DNK sekvenci su u okviru predmetnog pronalaska. Kao što se ovde koristi, upuüivanje na "u suštini istu" sekvencu odnosi se na sekvence koje imaju amino kiselinske supstitucije, brisanje, dodavanje ili umetanje koja ne utiþu materijalno na pesticidnu aktivnost. Fragmenti gena koji kodiraju proteine koji zadržavaju pesticidnu aktivnost takoÿe su ukljuþeni u ovu definiciju.

[0042] Dalji postupak za identifikaciju gena koji kodira toksine i genske delove koristan prema predmetnom pronalasku je upotreba oligonukleotidnih proba. Ove probe su detektabilne nukleotidne sekvence. Ove sekvence se mogu detektovati na osnovu odgovarajuüe etikete ili mogu biti napravljeni suštinski fluorescentnim, kao što je opisano u Meÿunarodnoj Prijavi br. WO93 / 16094. Kao što je dobro poznato u tehnici, ako se ispitivani molekul i uzorak nukleinske kiseline hibridizuje formiranjem jake veze izmeÿu dva molekula, može se razumno pretpostaviti da proba i uzorak imaju znaþajnu homologiju. Poželjno, hibridizacija se sprovodi pod strogim uslovima pomoüu tehnika dobro poznatih u tehnici, kao što je opisano, na primer, u Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp.169-170. Neki primeri koncentracija soli i kombinacija temperature su sledeüi (prema redosledu poveüanja strogosti): 2X SSPE ili SSC na sobnoj temperaturi; 1X SSPE ili SSC na 42° C; 0.1X SSPE ili SSC na 42° C; 0.1X SSPE ili SSC na 65° C. Detekcija probe pruža sredstvo za utvrÿivanje na poznat naþin da li je došlo do hibridizacije. Ovakva analiza probe obezbeÿuje brz postpak za identifikaciju gena koji kodiraju toksin predmetnog pronalaska. Nukleotidni segmenti koji su korišüeni kao probe prema pronalasku mogu se sintetisati korišüenjem sintetizatora DNK i standardnih procedura. Ove nukleotidne sekvence mogu se takoÿe koristiti kao PCR prajmeri za pojaþanje gena predmetnog pronalaska.

[0043] Varijante toskina. Odreÿeni toksini predmetnog pronalaska ovde su posebno predstavljeni, trebalo bi da bude jasno da predmetni pronalazak sadrži varijante ili ekvivalentne toksine (i nukleotidne sekvence koje kodiraju ekvivalentne toksine) koji imaju istu ili sliþnu pesticidnu aktivnost izloženog toksina. Ekvivalentni toksini üe imati homologiju amino kiselina sa izloženim toksinom. Ova homologija amino kiselina üe obiþno biti veüa od 75%, poželjno biti veüa od 90%, a najpoželjnije biti veüa od 95%. Homologija amino kiselina üe biti najveüa u kritiþnim oblastima toksina koji obeležava biološku aktivnost ili su ukljuþeni u odreÿivanje trodimenzionalne konfiguracije koja je na kraju odgovorna za biološku aktivnost. U tom pogledu, odreÿene supstitucije amino kiselina su prihvatljive i mogu se Rþekivati ako su ove supstitucije u oblastima koje nisu kritiþne za aktivnost ili su konzervativne supstitucije amino kiselina koje ne utiþu na trodimenzionalnu konfiguraciju molekula. Na primer, amino kiseline mogu biti postavljene u sledeüe klase: nepolarne, nenaelektrisane polarne, bazne i kiselinske. Konzervativne supstitucije u kojima se jedna amino kiselina jedne klase zamenjuje sa drugom amino kiselinom istog tipa pada u opseg predmetnog pronalaska sve dok supstitucija ne utiþe bitno na biološku aktivnost jedinjenja. Ispod je lista primera amino kiselina koje pripadaju svakoj klasi.

[0044] U nekim sluþejavima, ne-konzervativne supstitucije takoÿe mogu biti napravljene. Kritiþni faktor je taj da ove supstitucije ne smeju znaþajno umanjiti biološku aktivnost toksina.

[0045] Rekombinantni domaüini. Geni koji kodiraju toksine predmetnog pronalaska mogu da budu uvedeni u široki spektar mikrobioloških ili biljnih domaüina. Ekspresije toksiþnih gena rezultuju, direktno ili indirektno, na intraüelijsku proizvodnju i održavanje pesticida.

Konjugalni transfer i rekombinantni transfer mogu biti korišüeni kako bi se obrazovao Bt soj koji iskazuje oba toksina predmetnog pronalaska. Drugi domaüini organizama mogu takoÿe da budu transformisani sa jedan, dva ili tri toksiþna gena koji su se potom koristili za postizanje sinergistiþkog efekta. Sa pogodnim mikrobnim domaüinama, npr., Pseudomonas, mikrobi se mogu primenjivati na mesta štetoþina, gde üe se širiti i biti progutani. Rezultat je kontrola štetoþina. Alternativno, mikrob koji deluje kao domaüin prema toksiþnom genu može biti tretiran pod uslovima koji produžuju aktivnost toksina i stabilizuju üeliju. Tretirane üelije, koje zadržavaju toksiþnu aktivnost, mogu se onda primeniti na okolinu ciljane štetoþine.

[0046] Tamo gde je Bt toskiþni gen uveden preko pogodnog vektora u mikrobni domaüin, i navedeni domaüin je primenjivan na okolinu u živom stanju, jako je bitno da izvesni mikrobni domaüini budu korišüeni. Domaüini mikroorganizama su odabrani koji su poznati da okupiraju "fitosferu" (filoplan, filosfera, rizosfera, i/ili rizoplana) jednog ili više useva od interesa. Ovi mikroorganizmi su odabrani tako da budu sposobni da uspešno konkurišu u odreÿenom okruženju (usev i druga staništa insekata) sa divljim tipom mikroorganizama, obezbeÿen za stabilno održavanje i ekspresiju gena koji ekspresuju polipeptidni pesticid i, poželjno, obezbede za poboljšanu zaštitu pesticida od degradacije i inaktivacije životne sredine.

[0047] Veliki broj mikroorganizama je poznato da naseljavaju filoplan (površina listova biljaka) i/ili rizosferu (tlo koje okružuju koren biljaka) širokog spektra važnih useva. Ovi mikroorganizmi ukljuþuju bakterije, alge i gljivice. Od posebnog interesa su mikroorganizmi, kao što su bakterije, npr., roda Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, i Alcaligenes; gljivice, prvenstveno kvasci, npr., rod Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, i Aureobasidium. Od naroþitog interesa su takve fitosferne bakterijske vrste kao što su Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, i Azotobacter vinlandii; i vrste fitosfernih kvasaca kao što su Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, i Aureobasidium pollulans. Od naroþitog znaþaja su pigmentni mikroorganizmi.

[0048] Dostupan je širok spektar metoda za uvoÿenje Bt gena koji kodira toksin u domaüinu mikroorganizma pod uslovima koji omoguüavaju stabilno održavanje i ekspresiju gena. Ove metode su dobro poznate struþnjacima i opisane su, na primer, u U.S. Patent Br.5,135,867.

[0049] Tretiranje üelija. Bacillus thuringiensis ili rekombinantne üelije koje ekspresuju Bt toskine mogu se tretirati kako bi produžile toskiþnu aktivnost i stabiliziovale üelije. Pesticidna mikrokapsula koja je obrazovana i koja sadrži Bt toksin ili toksine unutar üelijske strukture koja je stabilizovana i koja üe zaštiti toksin kada se mikrokapsula primenjuje na okolinu ciljane štetoþine. Pogodne üelije domaüina mogu obuhvatati ili prokariote ili eukariote, normalno koji su ograniþeni na one üelije koje ne proizvode supstance toskiþne za veüinu organizama, kao što su sisari. Meÿutim, mogu se koristiti organizmi koji proizvode supstance koje su toksiþne za više organizme, gde su toksiþne supstance nestabilne ili nivo primene dovoljno nizak kako bi se izbegle bilo koje moguüe toksiþnosti za sisara domaüina. Kao domaüini, od posebnog interesa üe biti prokarioti i donji eukarioti, kao što su gljivice.

[0050] ûelija üe obiþno biti netaknuta i suštinski u proliferativnom obliku kada se tretira, umesto u spornom obliku, iako u nekim sluþajevima spore mogu biti primenjene.

[0051] Tretiranje mikrobnih üelija, npr. mikrob koji sadrži B.t. toskiþni gen ili gene, može biti sa hemijskim ili fiziþkim sredstvima, ili kombinacijom hemijskih i/ili fiziþkih sredstava, toliko dugo dok ova tehnika ne utiþe štetno na osobine toksina, niti umanjuje üelijsku sposobnost zaštite toksina. Primeri hemijskih reagenasa su sredstva za halogeniranje, naroþito halogeni sa atomskim brojem.17-80. Prvenstveno, jod se može koristiti pod blagim uslovima i dovoljno vremena za postizanje željenih rezultata. Druge pogodne tehnike ukljuþuju tretiranje sa aldehidima, kao što je glutaraldehid; anti-infektivima, kao što je zefiran hlorid i cetilpiridinijum hlorid; alkoholi, kao što je izopropil i etanol; razni histološki fiksativi, kao što je Lugol jodin, Bouin’s fiksativ, razne kiseline i Helly’s fiksativ (Videti: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); ili fiziþke (toplota) i hemijske agense koji þuvaju i produžuju aktivnost toskina proizvedenom u üeliji kada se üelija primenjuje na domaüinsko okruženje. Primeri fiziþkih sredstava su kratka zraþenja talasnih dužina, kao što su gama-zraþenje i X-zraþenje, zamrzavanje, UV zraþenje, liofilizacija i sliþno. Metode za tretiranje mikrobnih üelija su objavljene u U.S. Pat. Br.

4,695,455 i 4,695,462.

[0052] ûelije üe generalno imati poboljšanu strukturnu stabilnost koja üe poveüati otpornost na uslove okoline. Tamo gde je pesticid u proformi, postupak tretiranja üelija treba da bude odabran tako da ne spreþava obradu proforme u zreli oblik pesticida od strane ciljanog štetoþinskog patogena. Na primer, formaldehid üe ukrstiti proteine i može inhibirati obradu proforme polipeptidnog pesticida. Postupak tretiranja treba da zadrži bar znaþajan deo biodostupnosti ili bioaktivnosti toksina.

[0053] Karakteristike od posebnog znaþaja u izboru üelije domaüina u svrhe proizvodnje ukljuþuju jednostavnost uvoÿenja B.t. gena ili gena u domaüina, dostupnost ekspresionih sistema, efikasnost ekspresije, stabilnost pesticida u domaüinu i prisustvo pomoünih genetskih sposobnosti. Karakteristike od interesa za upotrebu kao pesticidne mikrokapsule ukljuþuju zaštitne kvalitete za pesticid, kao što su debeli üelijski zidovi, pigmentacija i intracelularno pakovanje ili formiranje inkluzionih tela; opstanak u vodenoj sredini; nedostatak toksiþnosti sisara; atraktivnost štetoþina za gutanje; lakoüa ubijanja i fiksiranja bez ošteüenja toksina; i sliþno. Drugi razlozi ukljuþuju lakoüu formulacije i rukovanja, ekonomiþnost, stabilnost skladištenja i sliþno.

[0054] Rast üelija. ûelijski domaüin koji sadrži B.t. insekticidni gen ili gene može rasti u bilo kom prikladnom nutritivnom mediju, gde DNK konstruktor pruža selektivnu prednost, obezbeÿujuüi za selektivni medijum tako da suštinski sve ili veüina üelija zadrže B.t. gen. Ove üelije se zatim mogu sakupljati u skladu sa konvencionalnim naþinima. Alternativno, üelije se mogu tretirati pre sakupljanja.

[0055] B.t. üelije koje proizvode toksine pronalaska mogu se kultivisati koristeüi standardni tehniþki medijum i tehnike fermentacije. Po završetku ciklusa fermentacije, bakterije se mogu sakupiti prvo razdvajanjem B.t. spore i kristala iz fermentacije dovedene sredstvima koja su dobro poznata u tehnici. Oporavljene B.t. spore i kristali se mogu formulisati u vlažni prah, koncentrovanu teþnost, granule ili druge formulacije dodavanjem površinski aktivnih supstanci, disperzanata, inertnih nosaþa i ostalih komponenata radi lakšeg rukovanja i primene za odreÿene ciljane štetoþine. Ove formulacije i procedure primene su dobro poznate u struci.

[0056] Formulacije. Formulisane granule mamaca koje sadrže atraktant i spore, kristale i toksine B.t. izolata, ili rekombinantne mikrobe koji sadrže gene dobijene iz B.t. izolata opisani ovde, mogu se primeniti na zemljište. Formulisani proizvod se takoÿe može primeniti kao tretman oblaganja semena ili korena ili ukupan tretman biljke u kasnijim fazama ciklusa useva. Tretmani biljaka i tla B.t. üelija se mogu koristiti kao vlažni prahovi, granule ili prašine, mešanjem sa razliþitim inertnim materijalima, kao što su neorganski minerali (filozilikati, karbonati, sulfati, fosfati i sliþno) ili botaniþki materijali (prahasti kukurzni klip, pirinþane ljuske, ljuske oraha i sliþno). Formulacije mogu ukljuþivati raširene lepljive adjuvanse, sredstva za stabilizaciju, druge pesticidne aditive, ili površinske supstance. Teþne formulacije mogu biti vodene ili ne-vodene i angažovane kao pene, gelovi, suspenzije, emulzivni koncentrati ili sliþno. Sastojci mogu ukljuþivati reološka sredstva, površinske supstance, emulgate, disperzante ili polimere.

[0057] Kao što bi se radilo od strane struþnjaka u struci, pesticidna koncentracija üe se u velikoj meri razlikovati u zavisnosti od prirode odreÿene formulacije, posebno ako je koncentrat ili se direktno koristi. Pesticid üe biti prisutan u najmanje 1% po težini i može biti 100% po težini. Suve formulacije üe imati od oko 1-95% po težini pesticida, dok üe teþne formulacije uglavnom biti od oko 1-60% po težini þvrstih supstanci u teþnoj fazi. Formulacije üe uopšteno imati od oko 10<2>do oko 10<4>üelije/mg. Ove formulacije üe se primenjivati oko 50 mg (teþnost ili suvo) do 1 kg ili više po hektaru.

[0058] Formulacije se mogu primeniti na okolinu lepidopteranske štetoþine, npr., lišüe ili zemljište, orošavanjem, prašenjem, prskanjem, ili sliþno.

[0059] Transformacija biljke. Poželjni rekombinantni domaüin za proizvodnju insekticidnih proteina predmetnog pronalaska je transformisana biljka. Geni koji kodiraju Bt toksiþne proteine, kao što je ovde opisano, mogu biti insertovani u üelije biljke korišüenjem raznih tehnika koje su opšte poznate u tehnici. Na primer, veliki broj klonirajuüih vektora koji sadrže replikacioni sistem u Escherichia coli i marker koji dozvoljava selekciju transformisanih üelija su dostupne za pripremu za ubacivanje stranih gena u više biljke. Vektori sadrže, na primer, pBR322, pUC serije, M13mp serije, pACYC184, inter alia. Prema tome, DNK fragment koji ima sekvencu koja kodira Bt toksiþni protein može biti nsertovan u vektor na pogodnom mestu restrikcije. Rezultujuüi plazmid je korišüen za transformaciju u E. coli. ûelije E. coli su kultivisane u pogodnom nutritivnom medijumu, potom sakupljene i lizovane. Plazmid je oporavljen. Analiza sekvence, restrikciona anliza, elektroforeza, i drugi biohemijskimolekularni biološki postupci su uopšteno izvedeni kao postupci analize. Posle svake manipulacije, korišüena DNK sekvenca može biti odcepljena i spojena za sledeüu DNK sekvencu. Svaka plazmidna sekvenca može biti klonirana u iste ili druge plazmide. U zavisnosti od postupka ubacivanja željenih gena u biljku, druge DNK sekvence mogu biti neophodne. Ako, na primer, Ti ili Ri plazmid je korišüen za transformaciju üelije biljke, onda bar desna ivica, ali þesto desna i leva ivica Ti ili Ri plazmida T-DNK, treba da bude spojen kao boþni region gena koji se ubacuje. Korišüenje T-DNK za transformaciju üelija biljke je intezivno istraživana i dovoljno opisana u EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), i An et al., (1985), i dobro je uspostavljeno u struci.

[0060] Jednom ubaþena DNK koja je integrisana u biljni genom, je relativno stabilan.

TRansformacija vektora normalno sadrži odabrani marker koji daje na transformisanim üelijama biljke otpornost na biocid ili antibiotik, kao što je Bialaphos, Kanamycin, G418, Bleomycin, ili Hygromycin, inter alia. Pojedinaþno korišüeni marker bi prema tome trebalo da dozvoli selekciju transformisanih üelija, a ne üelija koje ne sadrže ubaþenu DNK.

[0061] Veliki broj tehnika je dostupno za ubacivanje DNK u üeliju domaüina biljke. Te tehnike ukljuþuju transformaciju sa T-DNK koristeüi Agrobacterium tumefaciens ili Agrobacterium rhizogenes kao transformacioni agens, fuziju, ubrizgavanje, biolistiku (bombardovanje mikroþesticom), ili elektroporaciju kao i druge moguüe postupke. Ako je Agrobakterija korišüena za transformaciju, DNK koja se ubacuje treba da bude klonirana u posebne plazmide, uglavnom ili u intermedijalni vektor ili u binarni vektor. Intermedijalni vektori mogu biti integrisani u Ti ili Ri plazmid sa homolognom rekombinacijom zahvaljuüi sekvencama koje su homogene za sekvence u T-DNK. Ti ili Ri plazmid takoÿe obuhvata vir region neophodan za prenos T-DNK. Intermedialni vektori ne mogu zamenjivati sami sebe u Agrobakteriji. Intermedijalni vektor može biti prebaþen u Agrobacterium tumefaciens sredstvima pomoünog plazmida (konjugacija). Binarni vektori mogu zamenjivati same sebe oba u E. coli i u Agrobakteriji. Oni obuhvataju odabrani marker gen i linker ili polilinker koji su uokvireni sa Desnim i Levim T-DNK graniþnim regionima. Oni mogu biti transformisani direktno u Agrobakteriju (Holsters et al., 1978). Agrobacterium korišüen kao üelija domaüina jeste da obuhvata plazmid koji nosi viralni region. Viralni region je neophodan za prenos T-DNK u üeliju biljke. Dodatna TDNK može biti sadržana. Bakterija tako transformisana je korišüena za transformaciju üelija biljaka. Uz pomoü eksploatacije biljaka povoljno mogu da se kultivišu Agrobacterium tumefaciens ili Agrobacterium rhizogenes za prenos DNK u üeliju biljke. Celokupne biljke potom mogu biti regenerisane od zaraženog biljnog materijala (na primer, delovi listova, segmenti stabljika, korena, ali i protoplasta ili üelija obraÿenih suspenzijom) u odgovarajuüem mediju, koji može sadržati antibiotike ili biocide za selekciju. Tako dobijene biljke se zatim mogu testirati na prisustvo ubaþene DNK. Nisu napravljeni posebni zahtevi za plazmide u sluþaju ubrizgavanja i elektroporacije. Moguüe je koristiti obiþne plazmide, kao što su, na primer, derivati pUC.

[0062] Transformisane üelije rastu unutar biljaka na uobiþajen naþin. One mogu da formiraju germ üelije i prenose transformisanu osobinu(e) na potomstvo biljaka. Takve biljke se mogu gajiti na normalan naþin i preüi sa biljkama koja imaju iste transformisane nasledne faktore ili druge nasledne faktore. Dobijeni hibridni pojedinci imaju odgovarajuüa fenotipska svojstva.

[0063] U poželjnom rešenju predmetnog pronalaska, biljke üe biti transformisane sa genima gde je upotreba kodona optimizovana za biljke. Vidi, na primer, U.S. Patent Br.5,380,831. Iako su neki skraüeni toksini ovde prikazani, dobro je poznato u Bt tehnici da 130 kDa tipovi (pune dužine) toksina imaju N-terminalnu polovinu koja je jezgro toksina, a C-terminalna polovina koja je protoksin "rep." Prema tome, odgovarajuüi "repovi" mogu se koristiti sa skraüenim / jezgrenim toksinima predmetnog pronalaska. Vidi npr. U.S. Patent Br.6,218,188 i US patent Br.6,673,990. Pored toga, u struci su poznati postupci za stvaranje sintetiþkih Bt gena za upotrebu u biljkama (Stewart i Burgin, 2007). Jedan neograniþavajuüi primer poželjne transformisane biljke je plodna biljka kukuruza koja sadrži ekspresione gene biljke koji kodiraju predmetne proteine.

[0064] Prenos (ili introgresija) predmetnog proteina odreÿenog(ih) "repa(ova)" u uroÿene linije kukuruza može se postiüi ponovnim selekcioniranjem sojeva, na primer, pozadinskim ukrštanjem. U ovom sluþaju, željeni povratni roditelj najpre preÿe na uroÿeni donor (nepovratni roditelj) koji nosi odgovarajuüi gen(e) za osobine. Potomstvo ovog ukrštanja se onda svodi na povratni roditelj, nakon þega sledi izbor u rezultantnom potomstvu za željenu osobinu(e) koja se prenosi iz nepovratnog roditelja. Posle tri, poželjno þetiri, poželjnije pet ili više generacija pozadinsko ukrštanje sa povratnim roditeljem sa selekcijom za željenu(e) osobinu(e), potomstvo üe biti heterozigotno za lokuse koji kontrolišu osobine koje se prenose, ali üe biti kao povratni roditelj za veüinu ili skoro sve druge gene (videti, na primer, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol.1: Theory and Technique, 360-376).

[0065] Strategije Upravljanja Insektnom Otpornosti (IRM). Roush et al., na primer, naglašavaju dve toskiþne strategije, koje se takoÿe zovu "piramidiranje" ili "slaganje," za upravljanje insekticidnim transgenskim usevima. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

[0066] Na njihovoj internet stranici, the United States Environmental Protection Agency (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) objavljuje sledeüe zahteve za pružanje ne-transgenskih (odn., ne-B.t.) zaštita (sekcija ne-Bt useva / kukuruz) za primenu sa transgenskim usevima proizvodeüi pojedinaþni Bt protein aktivan protiv ciljanih štetoþina.

"Specifiþne strukturne potrebe za zaštiüene Bt (CrylAb ili Cry1F) kukuruzne proizvode od kukuruznog plamenca su kao što sledi:

Strukturni zaklon: 20% ne-Lepidopteran Bt kukurzni zaklon u Kukuruznom Pojasu;

50% ne-Lepidopteran Bt zaklon u Pamuþnom Pojasu

Blokovi

Unutrašnji (odn., unutar Bt polja)

Spoljašnji (odn., odvojena polja unutar 1⁄2 milje (1/4 milje ako je moguüe)

Bt polja kako bi se maksimizovalo nasumiþno parenje)

Trake u polju

Trake moraju da budu bar 4 reda širine (poželjno 6 redova) kako bi se smanjili efekti kretanja larve"

[0067] Dodatno, the National Corn Growers Association, na njihovoj internet stranici:

(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)

[0068] takoÿe pruža sliþne smernice u vezi sa zahtevima za zaštitu. Na primer:

"Potrebe Kukuruznog plamenca IRM:

- Zasaditi najmanje 20% vašeg kukuruznog poseda zaštiüenim hibridima

- U regionima proizvodnje pamuka, zaštiüeno mora biti 50%

- Mora biti zasaÿeno unutar 1/2 milja zaštiüenim hibrida

- Zaštitþene biljke mogu biti zasaÿene kao redovi unutar Bt polja; redovi sa zaštiþenim biljkama moraju biti najmanje 4 reda širine

- Zaštiüene biljke mogu se tretirati sa uobiþajenim pesticidima samo ako se postignu ekonomski pragovi za ciljane insekte

- Bt-zasnovani insekticidi koji mogu da se prskaju ne mogu da se koriste na zaštiüenom kukuruzu

- Odgovarajuüa zaštiüena biljka mora biti zasaÿena na svakoj farmi sa Bt kukuruzom"

[0069] Kao što je naglašeno od strane Roush et al. (na stranama 1780 i 1784 desna kolona, na primer), nagomilavanje ili piramidiranje dva razliþita proteina svaki efikasan protiv ciljanih štetoþina i sa malo ili bez unakrsne otpornosti može dozvoliti za primenu malih zaštitnih biljaka. Roush predlaže da za uspešno nagomilavanje, veliþina zaštite od manje od 10% zaštite, može obezbediti poredbeno upravljanje otpornosti do oko 50% zaštite za pojedinaþne (ne-piramidalne) osobine. Za trenutno dostupne piramidalne Bt kukurzne proizvode, U.S. Agencija za Zaštitu Okoline zahteva znaþajno manje (uopšteno 5%) strukturne zaštite ne-Bt kukuruza da bude zasaÿeno nego za pojedinaþne proizvode (uopšteno 20%).

[0070] Postoje razliþiti naþini obezbeÿivanja IRM efekata zaštite, ukljuþujuüi razliþite geometrijske forme zasejavanja na poljima (kao što je veü pomenuto) i mešavine semena u vreüici, o þemu se dalje govori od strane Roush et al. (supra), i U.S. Patent Br.6,551,962.

[0071] Gore navedeni procenti, ili sliþni odnosi zaštite mogu se koristiti za predmetne trostruke gomile ili piramide. Za trostruke gomile sa tri mesta dejstva protiv jedne ciljne štetoþine, cilj bi bio nula zaštite (ili manje od 5% zaštite, na primer). Ovo je posebno važno za komercijalne površine - na primer preko 10 hektara.

[0072] Ukoliko nije posebno naznaþeno ili implicitno, izrazi "a", "an" i "the" oznaþavaju "najmanje jedan" koji se ovde koristi.

[0073] Slede primeri koji ilustruju procedure za izvoÿenje pronalaska. Ovi primeri ne treba da budu smatrani ograniþavajuüim. Svi procenti su težinski i sve proporcije smeše rastvaraþa su zapremine, osim ako nije drugaþije naznaþeno. Sve temperature su u stepenima Celzijusa.

PRIMERI

Primer 1- Proizvodnja i tripsin obrada Vip3Ab i Cry1Ca proteina.

[0074] Geni koji kodiraju Cry1Ca i Vip3Ab1 pro toksini su izraženi u Pseudomonas fluorescens ekspresionim sojevima i proteini u punoj dužini izolovani kao nerastvorna tela inkluzije. Isprana tela inkluzije su rastvorena mešanjem na 37 °C u puferu koji sadrži 20 mM CAPS pufera, pH 11, 10 mM DDT, 0.1% 2-merkaptoetanol, na 2 h. Rastvor je centrifugiran na 27,000 x g 10 min. na 37 °C i supernatant je tretiran sa 0.5% (w/v) TCPK tretiranog tripsina (Sigma). Ovaj rastvor je inkubiran sa dodatnim mešanja od 1 hr. na sobnoj temperaturie, filtriran, zatim napunjen na Pharmacia Mono Q 1010 koloni ekvilibrisanoj sa 20 mM CAPS pH 10.5. Posle ispiranja napunjene kolone sa 2 kolone zapremine pufera, skraüeni toksin je eluiran korišüenjem linearnog gradijenta od 0 do 0.5 M NaCl u 20 mM CAPS u 15 kolonskoj zapremini pri brzini protoka od 1.0 ml/min. Preþišüeni tripsin skraüeni Cry proteini eluirani na oko 0.2-0.3 M NaCl. ýistoüa proteina je proverena sa SDS PAGE i sa vizualizacijom korišüenjem Coomassie briliant plave boje. U nekim sluþajevima, kombinovane frakcije preþišüenog toksina su koncentrovane i sipane u Superose 6 kolonu (1.6 cm preþ., 60 cm dužina), i dalje preþišüena hromatografijom za iskljuþivanje veliþine. Frakcije koje sadrže pojedinaþni pik monomerne molekulske težine su kombinovane, i koncentrovane, rezultujuüi u pripremanju više od 95% homogena za protein koji ima molekulsku težinu od oko 60,000 kDa.

[0075] Obrada Vip3Ab1 je postignuta na sliþan naþin polazeüi od preþišüene pune dužine 85 kDa proteina (DIG-307). Protein (12 mg) je dijalizovan u 50 mM natrijum-fosfatni pufer, pH 8.4, zatim obraÿen dodavanjem 1 mg þvrstog tripsina i inkubiran 1 h na sobnoj temperaturi. Rastvor je sipan u MonQ kolonu razmene jona (1 cm preþ., 10 cm dužine) i eluiran sa linearnim gradijentom NaCl od 0 do 500 mM u 20 mM natrijum fosfatnom puferu, pH 8.4 preko 7 kolona zapremine. Elucija proteina je praüena sa SDS-PAGE. Glavni procesni pojas je imao molekulsku težinu od 65 kDa, kao što je odreÿeno sa SDS-PAGE primenom standarda molekulske težine za poreÿenje.

Primer 2 - Jodinacija Cry1Ca jezgra toksiþnog proteina

[0076] Prethodni rad ukazuje da je Cry1Ca jako težak za radiooznaþavanje korišüenjem uobiþajenih postupaka, iako bi u nekoliko odabranih sluþajeva bili radiooznaþeni i dobro funkcionisali u testu vezivanja receptora. Odluþili smo da radiooznaþimo Cry1Ca korišüenjem<125>I radiooznaþenog fluorescein-5-maleimida, koji predstavlja postupak koji je raÿen da aktivno radiooznaþi Cry1Fa (Prov.69919). Jodinacija fluroescein-5-malemida i potom konjugacija ovog radiooznaþene hemikalije sa Cry1Ca rezultatima u cistein specifiþnom radiooznaþenom proteinu. Takav postupak oznaþavanja je prema tome visoko specifiþan u ostacima koji su oznaþeni. Cry1Ca jezgreni toksiþni segment (ostaci 29-619) sadrži dva cisteinska amino kiselinska ostatka, na pozicijama 210 i 438. Palmer et al. (1997) pokazuje da fenilni prsteni fluorescein-5-maleimida mogu biti radiojodirani i potom reagovani sa proteinima koji sadrže sulfhidril grupe (npr. kao što je obezbeÿeno sa slobodnim cistein ostacima), rezultujuüi u alkilaciji slobodnih cisteina u proteinu, i prema tome obezbeÿujuüi dva cisteinska ostatka i time obezbeÿujuüi supstrat za alkilaciju i radiooznaþavanje proteina na ova dva (specifiþna) mesta.

[0077] Fluorescein-5-maleimid (F5-M) je rastvoren u 10 mM u DMSO (Dimetil Sulfoksid), potom razblažen u 1 mM u fosfat pufernom slanom rastvoru (PBS; 20 mM natrijum fosfat, 0.15 M NaCl, pH7.5), kao što je odreÿeno sa molarnim koeficijentom izumiranja od F 5-M (68,000 M<-1>cm<-1>).100 µL rastvoru PBS koji sadrži dve probušene jodisane kuglice (Thermo Fisher Scientific), dodat je 1.0 mCi Na<125>I iza olovne zaštite. Rastvor je ostavljen da se izmeša na sobnoj temperaturi 5 min, potom 10 µL 1 mM F 5-M rastvora je dodato. Posle reakcije od 10 min, rastvor je uklonjen iz reakcije jodinacije pipetiranjem i rastvoru je dodato 2 µg visoko preþišüenog tripsin-skraüenog Cry1Ca jezgrenog toksiþnog proteina u PBS. Protein je inkubiran na 4°C sa jodiranim F 5-M rastvorom 48 h, kada je reakcija prekinuta dodavanjem ȕ-merkaptoetanola u 14 mM finalne koncentracije. Reakciona smeša je dodata Zebra™ spin koloni (Invitrogen) ekvilibrisanom u 20 mM CAPS, 150 mM KCl, pH9, i centrifugirana na 1500 x g 2 min kako bi odvojio ne-reagovanu jodiranu boju iz proteina.<125>I radiooznaþeni fluorescein-Cry1Ca jezgreni toksiþni protein je izbrojan u gama brojaþu kako bi se odredila njegova specifiþna radioaktivnost, pretpostavljajuüi 80% oporavak ulaznog toksina proteina.

[0078] Specifiþna aktivnost radiooznaþenog Cry1Ca jezgrenog toksina proteina je približno 6.8 mCi/mg proteina. Radiooznaþeni protein je takoÿe okarakterisan sa SDS-PAGE i vizualizovan sa fosfor-prikazom kako bi validirali da radioaktivno merenje je kovalentno povezano sa Cry1Ca jezgrenim toksinom proteina. Coomassie obojeni SDS-PAGE gelovi su prikazani umotavanjem u Mylar™ film (12 mm debljine), i izlaganjem pod Molekularnom Dinamikom (Sunnyvale, CA) skladištenje fosfornog prikaza (35 cm x 43 cm) 1 sat. Ploþe su razvijene korišüenjem Molekularnog Dinamiþnog Storma 820 fosforni-prikaz i analiza slike korišüenjem ImageQuant™ softvera. Jedna radioaktivnost je detektovana u gel regionu mnogo ispod trake Cry1Ca jezgrenog toksina proteina odn. fragmenti manji od Cry1Ca jezgrenog toksina proteina na oko 10 kDa u veliþini i niže). Ovi radioaktivni zagaÿivaþi verovatno predstavljaju male peptide koji su verovatno povezani u skraüenom Cri1Ca proteinu usled dejstva tripsina koji se koristi za uklanjanje proteina do njegove osnovne strukture.

Primer 3 – Analize kompetitivnog vezivanja za BBMVs iz S. frugiperda sa jezgrenim toksiþnim proteinima Cry1Ca i Vip3Ab.

[0079] Homologni i heterologni takmiþarski testovi vezivanja su sprovedeni koristeüi 150 µg/mL BBMV proteina i 2 nM 125I-radiooznaþenog Cry1Ca jezgrenog toskina proteina. Koncentracije homolognog kompetitivnog ne-radiooznaþenog Cry1Ca jezgrenog toksina proteina dodate reakcionoj smeši je 0.1, 1, 10, 100, i 1000 nM. Heterologni tripsin skraüenog Vip3Ab proteina je testiran na 10 i 1,000 nM i proteini su dodati u isto vreme kao radioaktivni Cry1Ca jezgreni toksin proteina kao bi se osiguralo istinsko takmiþenje vezivanja. Inkubacije su izvedene na 1 h na 28°C i koliþina 125I-oznaþenog Cry1Ca jezgrenog toksina proteina nevezanog za BBMV’s (to jest, nije vezan za protein receptora insekata) je odvojen od vezanih proteina centrifugiranjem BBMV smeše na 16,000 x g 8 min, i uklanjanje supernatanta iz dobijene pelete. Pelet se opere tri puta hladnim vezujuüim puferom (PBS; 11.9 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH7.4 plus 0.1% goveÿi serum albumina; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kako bi potpuno uklonili preostali nevezani<125>I oznaþeni Cry1Ca. Dno centrifugalne cevi je iseþeno, a proteinski pelat sadržan unutar ovog dela je postavljen u 13 x 100 mm staklenu cev za kulture i brojan gama brojaþem 10 minuta kako bi se dobila koliþina vezane radioaktivnosti sadržane u pelatnoj frakciji. Koliþina radioaktivnosti u vezanoj prtoeinskoj frakciji obezbeÿuje indikaciju koliþine Cry proteina vezanog za receptor insekta (ukupno vezivanje). Ne-specifiþno vezivanje je predstavljeno brojanjem dobijeno u pelatu u prisustvu od 1,000 nM ne-radiooznaþenog Cry1Ca jezgrenog toksina proteina. Koliþina radiooznaþenog Cry1Ca posebno vezanog za BBMV (posebno vezivanje) je izmerena oduzimanjem nivoa ukupnog vezivanja iz ne specifiþnog vezivanja. Stotinu procenata ukupnog vezivanja smatralo se koliþinom vezivanja u odsustvu bilo kojeg konkurenta Cry1Fa jezgrenog toksina proteina. Podaci su izraženi kao procenat specifiþne granice<125>I Cry1Ca nasuprot koncentraciji konkurentnog neobeleženog liganda.

Primer 4 – Pregled Rezultata

[0080] Rezultati (Slika 1) pokazuju da homolozi neoznaþenog Cry1Ca proteina efikasno zamenjuju radiooznaþeni Cry1Ca jezgreni toksin proteina iz posebnog vezivanja za BBMV proteine u zavisnosti od doze. Vip3Ab nije zamenio vezan 125I-oznaþeni Cry1Ca jezgrenog toskina proteina iz njegovog receptorskog proteina na bilo kojoj od prikazanih koncentracija (10 ili 1,000 nM). Najviša koncentracija kod testirane Vip3Ab (1,000 nM) prikazuje 500-preklopa veüe koncentracije nego radiooznaþene Cry1Ca korišüene u analizi, pokazujuüi da se Vip3Ab ne efikasno takmiþi sa vezivanjem radiooznaþenog Cry1Ca u S. frugiperda BBMV.

[0081] Slika 1 je kriva odziva doze za pomeranje<125>I radiooznaþenog fluorescein-5-maleimid tripsin skraüenog Cry1Ca u BBMV’s iz S. frugiperda (FAW) larve. Slika pokazuje sposobnost ne-oznaþenog Cry1Ca (Ɣ) da zameni oznaþeni Cry1Ca u zavisnosti od doze u opsegu od 0.1 do 1,000 nM. Na grafikonu je prikazan procenat specifiþno vezanih oznaka Cry1Ca (ukupna veza minus nespecifiþna veza) nasuprot koncentraciji dodatih ne-radiooznaþenih liganada. Nemoguünost ne radio-oznaþDþenog Vip3Ab1 (Ÿ) na 10 i 1,000 nM da zamene specifiþno vezani radio-oznaþeni Cry1Ca je prikazan.

Referentna Lista

[0082]

Heckel,D.G., Gahan,L.J., Baxter,S.W., Zhao,J.Z., Shelton,A.M., Gould,F., and Tabashnik,B.E. (2007). The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 95, 192-197.

Luo,K., Banks,D., and Adang,M.J. (1999). Toxicity, binding, and permeability analyses of four bacillus thuringiensis cry1 delta-endotoxins using brush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda. Appl. Environ. Microbiol.65, 457-464.

Palmer, M., Buchkremer, M, Valeva, A, and Bhakdi, S. Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide. Analytical Biochemistry 253, 175-179.1997. Ref Type: Journal (Full)

Sambrook,J. and Russell,D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory).

Schlenz, M. L., Babcock, J. M., and Storer, N. P. Response of Cry1F-resistant and Susceptible European Corn

Borer and Fall Armyworm Colonies to Cry 1A.105 and Cry12Ab2. DAI 0830, 2008.

Indianapolis, Dow AgroSciences. Derbi Report.

Sheets, J. J. and Storer, N. P. Analysis of Cry1Ac Binding to Proteins in Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae (Heleothis zea). Interactions with Cry1F Proteins and Its Implication for Resistance in the Field. DAI-0417, 1-26.2001. Indianapolis, Dow AgroSciences.

Tabashnik,B.E., Liu,Y.B., Finson,N., Masson,L., and Heckel,D.G. (1997). One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1640-1644.

Tabashnik,B.E., Malvar,T., Liu,Y.B., Finson,N., Borthakur,D., Shin,B.S., Park,S.H., Masson,L., de Maagd,R.A., and Bosch,D. (1996). Cross-resistance of the diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillus thuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol.62, 2839-2844.

Tabashnik,B.E., Roush,R.T., Earle,E.D., and Shelton,A.M. (2000). Resistance to Bt toxins. Science 287, 42.

Wolfersberger,M.G. (1993). Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth (Lymantria dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol 24, 139-147.

Xu,X., Yu,L., and Wu,Y. (2005). Disruption of a cadherin gene associated with resistance to Cry1Ac {delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera. Appl Environ Microbiol 71, 948-954.

Dodatak A

[0083]

Lista delta-endotoksina - iz Crickmore et al. website (citiran u prijavi) Pristupni Broj je NCBI unos

SEKVENCA LISTING

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Transgenska biljka koja sadrži DNK koja kodira Vip3Ab insekticidni protein i DNK koja kodira Cry1Ca insekticidni protein, navedena biljka dalje sadrži DNK koja kodira treüi insekticidni protein, navedeni treüi protein je odabran izmeÿu grupe koja se sastoji od Cry1Fa i Cry1Da.

2. Transgenska biljka prema zahtevu 1, gde navedeni treüi protein je Cry1Fa, navedena biljka dalje sadrži DNK koja kodira þetvrti i peti insekticidni protein odabran izmeÿu grupe koja se sastoji od Cry2A, Cry1I, DIG-3, i Cry1Ab.

3. Seme biljke prema bilo kom od zahteva 1-2, gde navedeno seme sadrži navedenu DNK.

4. Smeša semena koja sadrži zaštiüena semena iz ne-Bt zaštiüenih biljaka, i mnoštvo semena prema zahtevu 3, gde navedena zaštiüena semena obuhvataju izmeÿu 5% do 40% svih semena u smeši.

5. Biljka prema bilo kom od zahteva 1-2, gde navedena biljka je odabrana izmeÿu grupe koja se sastoji od kukuruza, soje, i pamuka.

6. Biljka prema zahtevu 5, gde navedena biljka je kukuruzna biljka.

7. Transgenska biljka prema zahtevu 1, navedena biljka dalje sadrži DNK koja kodira Cry1Fa insekticidni protein.

8. Biljna üelija iz biljke prema bilo kom od zahteva 1-2, gde navedena biljna üelija sadrži navedenu DNK koja kodira navedeni Vip3Ab insekticidni protein i navedenu DNK koja kodira navedeni Cry1Ca insekticidni protein, gde navedeni Vip3Ab insekticidni protein je bar 99% identiþan sa SEQ ID NO: 1, i navedeni Cry1Ca insekticidni protein je bar 99% identiþan sa SEQ ID NO:2.

9. Biljka prema bilo kom od zahteva 1-2, gde navedeni Vip3Ab insekticidni protein sadrži SEQ ID NO: 1, i navedeni Cry1Ca insekticidni protein sadrži SEQ ID NO:2.

10. Postupak kontrolisanja insekta moljca kontaktiranjem navedenog insekta sa Vip3Ab insekticidnim proteinom, Cry1Ca insekticidni protein i insecticidnim proteinom odabran iz grupe koja se sastoji od Cry1Fa i Cry1Da.