RS56533B1

RS56533B1 - Supstituisani piperidil-etil-pirimidin kao inhibitor ghrelin o-acil transferaze

Info

Publication number: RS56533B1
Application number: RS20171067A
Authority: RS
Inventors: Grau Maria Angeles Martinez
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2018-02-28
Also published as: US20150133474A1; DK3068775T3; BR112016009488A8; JP2016537371A; CA2926224A1; KR20160068926A; CN105636948B; US9035051B1; EA201690764A1; NO3068775T3; PH12016500895A1; IL244856A0; JO3302B1; LT3068775T; AP2016009189A0; AU2014348967A1; TW201529073A; EP3068775B1; KR101739243B1; EA028550B1

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje korisno za inhibiciju ghrelin O-acil transferaze (GOAT), farmaceutske kompozicije i jedinjenja za upotrebu u postupcima za lečenje bolesti povezanih sa aktivošću GOAT.

[0002] GOAT pripada familiji enzima O-acil transferaze vezanih za membranu (MBOAT). On prevodi desacilghrelin (takođe poznat kao neacilovani ghrelin ili UAG) u biološki aktivan oblik, acil-ghrelin (AG), prenosom masne kiseline do Ser3 ostatka desacilghrelin peptida. Pokazano je da acil-ghrelin povećava unos hrane i povećava adipoznost kod ljudi i kod glodara. Takođe je pokazano da infuzija AG kod ljudi suprimira izlučivanje insulina indukovano glukozom. Pokazano je da eliminacija gena za ghrelin pojačava oslobađanje insulina da bi se sprečila ili poboljšala intolerancije na glukozu kod ob/ob miševa hranjenih hranom sa visokim sadržajem masti.

[0003] Prevalenca gojaznosti i dijabetesa zajedno sa varijabilnom efikasnošću i odgovorima na trenutne tretmane za gojaznost i dijabetes zahtevaju da je više izbora tretmana dostupno pacijentima. Veruje se da je inhibitor GOAT korisno sredstvo u lečenju gojaznosti. Dalje se veruje da inhibitor GOAT takođe može biti koristan u redukciji dobitka telesne težine ili ponovnog dobitka telesne težine kao dodatak ishrani i/ili vežbama, drugim terapeutskim medicinskim sredstvima ili postupcima dizajniranim za redukciju dobitka telesne težine ili za tretman gojaznosti. Slično, inhibitor GOAT može biti koristan u lečenju dijabetesa tipa 2, pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim tretmanima za dijabetes tipa 2. WO2007079239 opisuje biciklična jedinjenja azota kao modulatore receptora za ghrelin. Predmetni pronalazak daje jedinjenje koje je inhibitor GOAT. Naročito, predmetni pronalazak daje jedinjenje formule

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0004] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje jedinjenje koje je inhibitor GOAT formule

[0005] Predmetni pronalazak daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema pronalasku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema pronalasku i jedno ili više drugih terapeutskih sredstava.

[0006] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska daje jedinjenja za upotrebu u postupku za redukciju dobitka telesne težine ili ponovnog dobitka telesne težine ili lečenje dijabetesa tipa 2 ili gojaznosti koji sadrži primenu jedinjenja prema predmetnom pronalasku, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, na pacijenta kod koga postoji potreba za tim.

[0007] Predmetni pronalazak takođe daje jedinjenje prema pronalasku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u u terapiji, naročito za redukciju dobitka telesne težine ili ponovnog dobitka telesne težine ili lečenje dijabetesa tipa 2 ili gojaznosti. Pored toga, predmetni pronalazak daje upotrebu jedinjenja prema pronalasku, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, u proizvodnji leka za redukciju dobitka telesne težine ili ponovnog dobitka telesne težine ili lečenje dijabetesa tipa 2 ili gojaznosti.

[0008] Jedinjenje prema predmetnom pronalasku je generalno efikasno u širokom opsegu doza. Na primer, doze na dan su unutar opsega od oko 0.03 do oko 150 mg/Kg telesne težine. U nekim slučajevima nivoi doze ispod donje granice gore navedenog opsega mogu biti više nego adekvatne, dok u drugim slučajevima još veće doze mogu biti korišćene uz održavanje povoljnog profila koristi/rizika, i prema tome gore navedeni opseg doza nije namenjen da ograniči obim pronalaska ni na koji način. Biće jasno da količina jedinjenja koja će stvarno biti primenjena biti određena od strane lekara, u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući stanje koje se leči, izabrani put primene, stvarno jedinjenje ili jedinjenja koja se koriste, starost, telesnu težinu i odgovor pojedinačnog pacijenta, i težinu simptoma pacijenta.

[0009] Termin "lečenje" (ili "lečiti" ili "tretman") kao što je ovde korišćen označava obuzdavanje, usporavanje, stopiranje ili reverziju napredovanja ili težine postojećeg simptoma, stanja ili poremećaja.

[0010] Kao što je ovde korišćen, termin "redukcija dobitka telesne težine" označava smanjenje povećanja u telesnoj težini pacijenta. Termin "redukcija ponovnog dobitka telesne težine" označava smanjenje povećanja u telesnoj težini pacijenta koji doživljava povratak u telesnoj težini posle gubitka u telesnoj težini. Ponovni dobitak telesne težine može biti posledica povratnog efekta posle prestanka gubitka telesne težine postignutog preko ishrane, vežbanja, modifikacije ponašanja ili odobrenih terapija. Za izbegavanje sumnje, dobitak telesne težine ili ponovni dobitak telesne težine kao što je ovde korišćen označava dobitak telesne težine ili ponovni dobitak telesne težine indukovan putem unosa hrane ili navika u ishrani i ne označava dobitak telesne težine koji nije povezan sa hranom kao što je nagomilavanje tečnosti, težina kao posledica zadržavanja vode, mišićne mase ili inflamacije.

[0011] Jedinjenje prema predmetnom pronalasku može da reaguje tako da formira farmaceutski prihvatljive soli. Farmaceutski prihvatljive soli i uobičajena metologija za njihovu pripremu su dobro poznati u stanju tehnike. Videti, npr., P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.

66, No.1, January 1977.

[0012] Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da se jedinjenje prema pronalasku ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, sastoje od jezgra koji sadrži najmanje jedan hiralni centar:

Iako predmetni pronalazak razmatra sve pojedinačne enantiomere, kao i smeše enantiomera navedenih jedinjenja uključujući racemate, poželjno jedinjenje prema pronalasku je predstavljeno formulom:

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0013] Jedinjenje prema predmetnom pronalasku je poželjno formulisano kao farmaceutske kompozicije primenjene različitim putevima. Takve farmaceutske kompozicije i postupci za pripremu istih su dobro poznati u stanju tehnike. Videti, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21 st ed., Mack Publishing Co., 2005). Naročito je poželjna farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema pronalasku predstavljeno formulom

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili razblaživača.

[0014] Pojedinačni enantiomeri ili diastereomeri mogu biti pripremljeni počevši sa hiralnim reagensima ili pomoću stereoselektivnih ili stereospecifičnih sintetičkih tehnika. Alternativno, pojedinačni enantiomeri ili diastereomeri mogu biti izolovani iz smeša pomoću standardnih hiralnih hromatografskih ili kristalizacionih tehnika na bilo kojoj pogodnoj tački u sintezi jedinjenja prema pronalasku. Pojedinačni enantiomeri i diastereomeri jedinjenja prema pronalasku su poželjni primer izvođenja prema pronalasku.

[0015] Dobro je poznato u stanju tehnike da sredstva za lečenje dijabetesa i/ili gojaznosti mogu biti kombinovana sa drugim sredstvima za lečenje dijabetesa i/ili gojaznosti. Jedinjenje prema pronalasku, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, može biti ko-primenjeno, istovremeno ili uzastopno, sa drugim efikasnim tretmanom (tretmanima) za dijabetes ili gojaznost. Jedinjenje prema pronalasku, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim efikasnim tretmanom (tretmanima) može biti primenjeno, istovremeno ili uzastopno, praćenjem odobrenih medicinskih postupaka kao što su barijatrijske operacije, na primer, operacija želudačnog bajpasa ili postupci podesivog vezivanja želudca.

[0016] Predmetni pronalazak takođe obuhvata postupke za sintezu jedinjenja prema predmetnom pronalasku.

[0017] Pored toga, intermedijeri opisani u sledećim šemama mogu da sadrže određeni broj azotnih zaštitnih grupa. Varijabilna zaštitna grupa može biti ista ili različita u svakom slučaju u zavisnosti od određenih reakcionih uslova i određenih transformacija koje se izvode. Uslovi zaštite i deprotekcije su dobro poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike. Videti. npr., Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, (T. Greene and P. Wuts, eds., 2d ed.

1991).

Pripreme i primeri

[0018] Sledeće Pripreme i Primeri dalje ilustruju pronalazak i predstavljaju tipičnu sintezu jedinjenja prema pronalasku. Reagensi i početni materijali su lako dostupni ili mogu biti lako sintetisani od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike. Trebalo bi razumeti da su Pripreme i Primeri navedeni radi ilustracije, a ne ograničenja, i da stručnjak iz date oblasti tehnike može da napravi različite modifikacije.

[0019] R ili S konfiguracija jedinjenja prema pronalasku može biti određena pomoću standardnih tehnika kao što su rentgenska analiza i korelacija sa vremenom zadržavanja hiralne-HPLC. Imenovanje sledećih Priprema i Primera je generalno izvedeno upotrebom IUPAC funkcije imenovanja MDL Accelrys® Draw verzija 4.0.NET.

[0020] Kao što su ovde korišćeni, sledeći termini imaju naznačena značenja: "ACN" označava acetonitril; "BSA" označava goveđi serum albumin; "DCM" označava dihlorometan; "DIPEA" označava N,N-diizopropiletilamin; "DMF" označava dimetilformamid; "DMSO" označava dimetilsulfoksid; "EDTA" označava etilendiamintetrasirćetnu kiselinu; "EtOAc" označava etil acetat; "EtOH" označava etanol; "FBS" označava fetusni teleći serum; "HRP" označava renovu peroksidazu; "IC50" označava koncentraciju sredstva koja proizvodi 50% maksimalnog odgovora; "IPA" označava izopropil alkohol; "MeOH" označava metanol; "MTBE" označava metil terc-butil etar; "PBS" označava fosfati puferski rastvor soli; "RT" označava sobnu temperaturu; "TEA" označava trietilamin; "TFA" označava trifluorosirćetnu kiselinu; "TR" označava vreme zadržavanja; "THF" označava tetrahidrofuran; i "TMB" označava 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin.

[0021] LC-MS uslovi (niska pH): kolona: Phenomenex Gemini NX C182.1 3 50 mm 3.0 m; gradijent: 5-100% B za 3 min, zatim 100% B za 0.75 min temperatura kolone: 50 °C /-10°C; stopa protoka: 1 mL/min; Rastvarač A: dejonizovana voda sa 0.1% mravljom kiselinom; Rastvarač B: ACN sa 0.1% mravljom kiselinom.

Priprema 1

6-hloro-2-metilpirimidin-4-amin

[0022]

[0023] Napuniti čeličnu posudu od 5 L pod pritiskom (autoklav), 6-dihloro-2-metilpirimidinom (400 g, 2.45 mol) i amonijum hidroksidom (2.8 L) na sobnoj temperaturi. Zagrevati reakciju do 90°C u trajanju od 5 časova. Hladiti reakcionu smešu do sobne temperature i zatim filtrirati čvrstu supstancu kroz Buchner-ov levak. Isprati filter kolač vodom (200 mL) i heksanom (200 mL) i zatim sušiti pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (290 g, 82%). LC-ES/MS m/z 144.0 (M+1).

Priprema 2

6-hloro-5-jodo-2-metilpirimidin-4-amin

[0024]

[0025] Kombinovati 6-hloro-2-metilpirimidin-4-amin (708 g, 4.93 mol) i MeOH (7.08 L) u posudi od 20 L sa okruglim dnom opremljenu mehaničkom mešalicom. Ohladiti do 0-5°C. Dodati jod monohlorid (4.806 kg, 29.6 mol) rastvoren u MeOH (6 L) upotrebom levka za dodavanje tokom perioda od 1 časa. Zagrevati reakcionu smešu do sobne temperature i mešati na sobnoj temperaturi u trajanju od 16 časova. Hladiti reakcionu smešu do 0-5°C i dodati natrijum sulfit (46 L, 20% vodeni rastvor). Filtrirati dobijeni čvrstu supstancu i ispirati vodom (2 L), a zatim heksanom (3 L). Sušiti čvrstu supstancu pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (1061 g, 80%). LC-ES/MS m/z 269.9 (M+1).

Priprema 3

terc-Butil 4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etinil]piperidin-1-karboksilat [0026]

[0027] Rastvoriti 6-hloro-5-jodo-2-metil-pirimidin-4-amin (20 g, 74.22 mmol), terc-butil estar 4-etinil-piperidin-1-karboksilne kiseline (18.64 g, 89.06 mmol) i diizopropilamin (10.44 mL, 74.22 mmol) u THF (200 mL) u posudu sa 3 grlića. Naizmenično isprazniti i napuniti posudu azotom 3 puta. Dodati bis(trifenilfosfin)paladijum (II) hlorid (2.63 g, 3.71 mmol) i bakar (I) jodid (0.713 g, 3.71 mmol) u rastvor. Zagrevati smešu do između 50 do 55°C u trajanju od 16 časova. Hladiti smešu do sobne temperature i dodati još bis(trifenilfosfin)paladijum (II) hlorida (1.31 g, 1.86 mmol), bakar(I)jodida (0.356 g, 1.86 mmol) i terc-butil estra 4-etinil-piperidin-1-karboksilne kiseline (1.55 g, 7.42 mmol). Zagrevati smešu do 60°C u trajanju od 3.5 časa. Hladiti smešu do sobne temperature i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Razblažiti materijal sa DCM (300 mL) i isprati zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida (100 mL), vodom (100 mL), i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (100 mL). Sušiti rastvor preko MgSO4, filtrirati i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak upotrebom hromatografije na silika gelu (800 g kolona silika gela) eluiranjem sa 20% do 100% EtOAc u heksanima. Koncentrovati prečišćene frakcije da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao svetlo narandžasti prah (22.6 g, 86%). LC-ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 351.2/353.1 (M+1).

Priprema 4

terc-Butil 4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]piperidin-1-karboksilat [0028]

[0029] Kombinovati terc-butil 4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etinil]piperidin-1-karboksilat (4.30 g, 12.26 mmol) i platina(IV) oksid (0.139 g, 0.61 mmol) u EtOH (81 mL) i EtOAc (40 mL). Naizmenično isprazniti i puniti posudu vodonikom upotrebom balona vodonika i mešati na sobnoj temperaturi u trajanju od 8 časova. Pratiti reakciju pažljivo tako da se izbegne potencijalni sporedni proizvod koji je rezultat uklanjanja hlorida u molekulu. Treba navesti da je proizvod rastvorljiviji u smeši rastvarača nego početni alkin. Filtrirati smešu kroz dijatomejsku zemlju, ispiranjem sa MeOH. Koncentrovati rastvor pod sniženim pritiskom. U posudu dodati siliku, 1-propantiol (4 g, punjenje = 1.28 mmol/g, SILIABOND® tiol iz SILICYCLE®) (da bi se uklonio rezidualni paladijum iz prethodne reakcije kuplovanja) i EtOAc (300 mL). Mešati materijal na sobnoj temperaturi 3 dana. Filtrirati čvrste supstance i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Ponoviti hidrogenizaciju na rezultujućem ostatku na sledeći način. Napuniti posudu koja sadrži ostatak platina(IV)oksidom (0.139 g, 0.61 mmol), EtOH (81 mL) i EtOAc (40 mL). Naizmenično isprazniti i napuniti posudu vodonikom upotrebom balona vodonika i mešati na sobnoj temperaturi u trajanju od 8 časova. Filtrirati kroz dijatomejsku zemlju, ispiranjem sa MeOH, i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Ponoviti hidrogenizaciju dobijenog ostatka na sledeći način. Napuniti posudu koja sadrži ostatak platina(IV) oksidom (0.139 g, 0.61 mmol), EtOH (81 mL) i EtOAc (40 mL). Naizmenično isprazniti i puniti posudu vodonikom upotrebom balona vodonika i mešati na sobnoj temperaturi u trajanju od 8 časova. Filtrirati kroz dijatomejsku zemlju, ispiranjem sa MeOH. Koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom na silika gelu (20 g). Prečititi materijal upotrebom hromatografije na silika gelu eluiranjem sa 70% do 100% EtOAc u heksanima (120 g kolona). Kombinovati prečišćene frakcije i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Razblažiti ostatak sa DCM i heksanima i koncentrovati pod sniženim pritiskom tri puta. Postaviti materijal pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (3.20 g, 73%). LC-ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 355.2/357.2 (M+1).

Priprema 5

6-Hloro-2-metil-5-[2-(4-piperidil)etil]pirimidin-4-amin, hidrohloridna so

[0030]

[0031] Rastvoriti terc-butil 4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]piperidin-1-karboksilat (29.00 g, 81.72 mmol) u 1,4-dioksanu (145 mL) i dodati 4M hlorovodonik u 1,4-dioksanu (204.2 mL, 817.1 mmol). Mešati rastvor 18 časova na sobnoj temperaturi. Koncedntrovati smešu pod sniženim pritiskom, suspendovati u dimetil etar (250 mL), filtrirati i sušiti dobijenu čvrstu supstancu pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao sirova čvrsta supstanca (29 g). LC-ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 255.2/257.2 (M+1).

Alternativni put za 6-hloro-2-metil-5-[2-(4-piperidil)etil]pirimidin-4-amin (Pripreme 6-10)

Priprema 6

terc-Butil 4-(2-metilsulfoniloksietil)piperidin-1-karboksilat

[0032]

[0033] Kombinovati terc-butil 4-(2-hidroksietil)piperidin-1-karboksilat (4.720 kg, 20.6 mol) sa DCM (40 L) i TEA (3020 mL, 21.63 mol) u 50 L reaktoru pod atmosferom azota. Hladiti rastvor do oko 0°C i lagano dodati metan sulfonil hlorid (2.478 kg, 21.63 mol) u DCM (5 L) uz održavanje reakcione temperature ispod 10°C. Pošto je dodavanje završeno mešati smešu u trajanju od 18 časova na 15°C kada TLC (1:1, heksan:EtOAc) pokazuje da nije preostao početni materijal. Isprati smešu vodom (30 L) i ostaviti faze da se razdvoje. Koncentrovati organsku fazu do čvrste supstance. Suspendovati čvrstu supstancu u MTBE (6 L), sakupiti filtracijom i sušiti u vakuumskoj peći na 50°C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (5.67 kg, 91%).

Priprema 7

terc-Butil 4-(3-cijano-4-etoksi-4-okso-butil)piperidin-1-karboksilat

[0034]

[0035] Kombinovati terc-butil 4-(2-metilsulfoniloksietil)piperidin-1-karboksilat (5.26 kg, 17.1 mol), etil cijanoacetat (7 kg, 62 mol), 21% natrijum etoksid u EtOH (8.25 L, 24.75 mol) i EtOH (35 L) u reaktoru od 50 L pod atmosferom azota. Zagrevati smešu na 35 - 40°C u trajanju od 18 časova kada je NMR analiza pokazala da je ostalo 20% mezilata. Nastaviti zagrevanje smeše na 35 - 40°C u trajanju od 24 časa kada je NMR analiza pokazala samo malu količinu mezilata. Lagano hladiti reakciju do sobne temperature i dodavati glacijalnu sirćetnu kiselinu (1422 mL, 22.68 mol) tokom 30 min. Koncentrovati smešu upotrebom vakuumske destilacije i zatim deljenja između vode (25 L) i EtOAc (35 L). Razdvojiti slojeve i ekstrahovati vodenu fazu sa EtOAc (10 L). Kombinovati organske porcije, isprati fiziološkim rastvorom (15 L), i koncentrovati do crvenog ulja. Prečistiti ulje upotrebom hromatografije na silika gelu (75 kg silika gela, 65-250 mreža), eluiranjem sa heksanom (40 L) i zatim 20% EtOAc/heksanom da bi se dobila frakcija (7.8 kg) koja je 30% etil cijanoacetat/70% željeni proizvod. Koncentrovati materijal pomoću film destilacije na 100°C i 210 mtorr vakuumu, sakupljanjem neisparljive frakcije da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (4.54 kg, 82%).

Priprema 8

terc-Butil 4-[2-(4-amino-6-hidroksi-2-metil-pirimidin-5-il)etil]piperidin-1-karboksilat [0036]

[0037] Kombinovati terc-butil 4-(3-cijano-4-etoksi-4-okso-butil)piperidin-1-karboksilat (2.18 kg, 6.73 mol), acetamidin hidrohlorid (1.27 kg, 13.46 mol, 95% analiza) [Napomena: prethodno osušiti acetamidin hidrohlorid suspendovanjem dva puta u toluenu (10 L) i zatim uklanjanjem lakih frakcija do sušenja pod vakuumom], 21% natrijum etoksidu u EtOH (6.73 L, 20.19 mol) i EtOH (10 L) u reaktoru od 22 L pod atmosferom azotom. Zagrevati reakciju na refluksu u trajanju od 42 časa. Podesiti reakciju od oko pH = 5 sa glacijalnom sirćetnom kiselinom (1.2 L, 20.86 mol). Ukloniti EtOH vakuumskom destilacijom na rotacionim isparivaču. Suspendovati rezultujuće čvrste supstance u vodi (6 L), i zatim sakupiti čvrste supstance filtracijom, isprati dodatnom vodom (2 L). Sušiti čvrste supstance u vakuumskoj peći na 50°C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.72 kg, 76%).<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 4.83 (s, 3H); 4.05 (d, 2H), 2.75 (bs, 2H), 2.39 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 1.78 (d, 2H), 1.43 (m, 1H) 1.42 (s, 9H), 1.40 (m, 2H), 1.38 (m, 2H). Ponoviti postupak, uglavnom kao što je opisano, upotrebom terc-butil 4-(3-cijano-4-etoksi-4-okso-butil)piperidin-1-karboksilata (2.36 kg) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.01 kg, 82%).

Priprema 9

6-Amino-2-metil-5-[2-(4-piperidil)etil]pirimidin-4-ol, dihidrohloridna so

[0038]

[0039] Kombinovati terc-butil 4-[2-(4-amino-6-hidroksi-2-metil-pirimidin-5-il)etil]piperidin-1-karboksilat (3.73 kg, 11.09 mol) i IPA u reaktoru od 50 L pod atmosferom azota. Dodati 12 N hlorovodoničnu kiselinu (3.05 L, 36.6 mol) uz mešanje tokom 3 časa. Zagrevati smešu na 50°C u trajanju od 16 časova, formirajući gustu suspenziju. U to vreme NMR analiza pokazuje da nije preostala BOC grupa. Hladiti reakcionu smešu do 20 - 25°C, razblaživanjem sa THF (12 L). Sakupiti čvrste supstance filtracijom. Filtracija je spora i može trajati 24 časa do završetka. Isprati sa IPA (2 x 10 L). Sušiti materijal u vakuumskoj peći na 50°C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (3.117 kg, 91%).

Priprema 10

6-Hloro-2-metil-5-[2-(4-piperidil)etil]pirimidin-4-amin, dihidrohloridna so

[0040]

[0041] Kombinovati 6-amino-2-metil-5-[2-(4-piperidil)etil]pirimidin-4-ol, dihidrohloridnu so (3.167k g, 10.2 mol) i fosfor oksihlorid (30 L, 300 mol) pod atmosferom azota u reaktoru od 50 L koji je ventiliran kroz kaustični (10% NaOH) čistač. U mešanu suspenziju dodati 85% fosfornu kiselinu (1 L, 8.5 mol). Zagrevati smešu lagano upotrebom temperature od 75°C omotača za zagrevanje reaktora. Na oko 55°C, kada se javlja oslobađanje gasa, hladiti čistač u ledenom vodenom kupatilu. Kada je oslobađanje gasa usporeno, zagrevati smešu na 90 - 95°C u trajanju od 50 časova kada TLC i NMR analiza pokazuje da je reakcija završena. Ukloniti masu viška fosfor oksihlorida putem vakuumske destilacije (22 u Hg vakuumu i 60°C interne temperature) da bi se dobilo 20 L u destilatu. Hladiti smešu do 20 - 25°C i zatim razblažiti toluenom (10 L). Dalje hladiti smešu do < 15°C i lagano ugasiti vodom (1 L) održavajući temperaturu <30°C. Posle dodavanja toluena smeša postaje veoma gusta i teška za mešanje, pri čemu na dnu ostaje faza proizvoda kao viskozna polu-čvrsta supstanca. Podići lopatice uređaja za mešanje u cilju postizanja mešanja. Dodati EtOH (10 L) u smešu i mešati oko 18 časova na 25°C. Na ovoj tački viskozne polu-čvrste supstance nisu još uvek potpuno digestirane, ali su omekšane tako da mogu biti ručno manipulisane. Snažno mešati još 4 - 5 časova da bi se potpuno digestirao. Hladiti dobijenu suspenziju do 5 - 10°C i sakupiti čvrste supstance filtracijom, isprati sa MTBE (8 L) da bi se dobio vlažan proizvod (oko 6 kg).

[0042] Rekristalizovati sirovi proizvod rastvaranjem vlažnog kolača u MeOH (35 L) na 40°C. Koncentrovati rastvor vakuumskom destilacijom, uklanjanjem 15 L rastvarača. Dodati IPA (35 L) i koncentrovati suspenziju vakuumskom destilacijom da bi se uklonilo 13 L rastvarača. Hladiti suspenziju do 5 - 10°C i zatim filtrirati čvrste supstance, isprati sa IPA (2 L), i zatim MTBE (8 L). Supiti čvrste supstance u vakuumskoj peći na 55°C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao prljavo bela čvrsta supstanca (2.77 kg, 82%). Analitičko izračunavanje za C12H21Cl3N4: C, 43.98; H, 6.46; Cl, 32.46; N, 17.10. Zabeleženo: C, 43.63; H, 6.53; Cl, 32.16; N, 16.86.

Priprema 11

terc-Butil N-[(1S)-2-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]-1-metil-2-okso-etil]karbamat

[0044] U svaku od dve posude sa okruglim dnom dodati 6-hloro-2-metil-5-[2-(4-piperidil)etil]pirimidin-4-amin hidrohlorid (12.50 g, 42.92 mmol), diizopropiletilamin (22.46 mL, 128.7 mmol) i DMF (100 mL). Hladiti dve smeše u hladnom vodenom kupatilu i mešati u trajanju od 5 min. Dodati u svaku od smeša [dimetilamino(triazolo[4,5-b]piridin-3-iloksi)metilen]-dimetil-amonijum heksafluorofosfat (17.95 g, 47.21 mmol) i (2S)-2-(tercbutoksikarbonilamino)propionsku kiselinu (8.93 g, 47.21 mmol) u jednoj porciji. Mešati smeše na sobnoj temperaturi u trajanju od 90 min. Sipati smeše u posebne levke za odvajanje zajedno sa vodom (300 mL) i EtOAc (400 mL), mućkati i podeliti. Ekstrahovati vodene slojeve sa EtOAc (3 x 300 mL), isprati odgovarajuće organske slojeve vodom (4 x 250 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaCl (200 mL) i sušiti preko MgSO4, filtrirati i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Prečistiti kombinovane materijale preko hromatografije na silika gelu eluiranjem sa 70% do 100% EtOAc u heksanima. Kombinovati i koncentrovati prečišćene frakcije pod sniženim pritiskom. Razblažiti ostatak sa EtOAc (500 mL) i isprati zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (100 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(100 mL), vodom (100 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (100 mL). Sušiti organske materije preko MgSO4, filtrirati i koncentrovati pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (28.00 g, 76%). LC-ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 426.2/428.2 (M+1).

Priprema 12

(2S)-2-Amino-1-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]propan-1-on [0045]

[0046] Rastvoriti terc-butil N-[(1S)-2-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]-1-metil-2-okso-etil]karbamat (15.78 g, 37.05 mmol) u DCM (185 mL), ukapavanjem dodavati TFA (185 mL) tokom 3 min, i mešati preko noći. Analizirati reakciju pomoću LCMS (niska pH) da bi se pokazala potpuna konverzija. Lagano dodati MeOH (400 mL) zbog egzotermnog mešanja. Prethodno isprati tri SCX kolone (50 g) vodom (20 mL) i zatim sa MeOH (20 mL). Podeliti reakcionu smešu u tri jednake porcije i sipati jednako na SCX kolone. Isparti svaku kolonu vodom (40 mL) i MeOH (40 mL) sakupljanjem tečnih ostataka od ispiranja u vakuumsku posudu. Eluirati željeni materijal iz SCX kolona sa 2 N amonijakom u MeOH (60 mL) u čistoj posudi. Kombinovati rastvore koji sadrže proizvod, koncentrovati pod sniženim pritiskom, pripremiti azeotropnu smešu sa DCM-heksanima (1:1), tri puta, i postaviti pod vakuum da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela pena (10.29 g, 84%). LC-ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 326.2/328.2 (M+1).

Priprema 13

(2S)-2-Amino-1-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]propan-1-on hidrohloridna so

[0047]

[0048] Dodati terct-butil N-[(1S)-2-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]-1-metil-2-oksoetil]karbamat (28.75 g, 67.49 mmol) u 1,4-dioksan (143.7 mL). Zatim dodati 4M hlorovodonik u 1,4-dioksanu (168.7 mL, 674.9 mmol) i mešati u trajanju od 10 min. Dodati MeOH (20 mL) i mešati smešu u trajanju od 3 časa uz snažno mešanje. Koncentrovati smešu pod sniženim pritiskom, razblažiti čvrste supstance dietil etrom (200 mL), i mešati preko noći. Filtrirati materijal, ispiranjem dietil etrom (2 x 25 mL). Sušiti materijal usisavanjem u trajanju od 15 min, zatim postaviti pod vakuumom u trajanju od 1 časa na 45°C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao sirovi beli prah (27.7 g). LC-ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 326.1/328.2 (M+1).

Priprema 14

(2S)-2-Amino-1-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]propan-1-on, dihidrohloridna so

[0049]

[0050] Zagrejati IPA (154 mL) do 50°C i lagano dodavati acetil hlorid (19.3 mL, 271 mmol) zbog egzotermne reakcije. Mešati reakciju na 50°C u trajanju od 10 min i zatim dodati tercbutil N-[(1S)-2-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]-1-metil-2-okso-etil]karbamat (21.0 g, 45.3 mmol). Mešati reakciju u trajanju od 2 časa monitoringa preko LCMS (niska pH). Hladiti reakciju do sobne temperature i dodati dietil etar (386 mL). Mešati suspenziju u trajanju od 15 min. Filtrirati čvrste supstance, ispiranjem dietil etrom (2 x 50 mL) na brzi način jer je materijal hidroskopan. Filtrirati materijal i sušiti preko filtracije u trajanju od 1 min, zatim sušiti u vakuumsoj peći na 50°C preko noći da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao beli prah (18.4 g). LCES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 326.1/328.2 (M+1). Analiza protiv-jona pomoću jonske hromatografije je u skladu sa dihidrohloridnom soli.

Primer 1

N-[(1S)-2-[4-[2-(4-Amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]-1-metil-2-oksoetil]ciklopropankarboksamid

[0051]

[0052] Dodati 1-hidroksi-7-azabenzotriazol (281 mg, 2.03 mmol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (430 mg, 2.21 mmol) u suspenziju ciklopropankarboksilne kiseline (161 µL, 2.03 mmol), (2S)-2-amino-1-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]propan-1-ona (600 mg, 1.84 mmol) u anhidrovanom THF (12 mL). Zatim dodati TEA (770 µL, 5.52 mmol) i mešati dobijenu smešu na sobnoj temperaturi u trajanju od 12 časova. Razblažiti reakcionu smešu sa EtOAc (10 mL), filtrirati preko dijatomejske zemlje, i koncentrovati filtrat in vacuo. Prečistiti dobijeni ostatak pomoću masom-vođene HPLC reverzno-fazne hromatografije (Agilent® 1200 LCMS i MSD maseni spektrometar, 75 x 30 mm Phenomenex Gemini-NX®, 5 µ veličina čestica, kolona sa ograničenjem 10 x 20 mm, 12-46% ACN u 10 mM vodenom rastvoru amonijum bikarbonata, pH 10, gradijent tokom 9 min) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bezbojno staklo (572 mg, 78%). LC-ESMS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 394.2/396.2 (M+H).

Alternativni postupak sa 1-propanfosfonskim anhidridom

[0053] Tretirati smešu (2S)-2-amino-1-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]propan-1-on, dihidrohloridne soli (107.4 g, 183.15 mmol) u DCM (584 mL) sa DIPEA (128 mL, 732.59 mmol). Hladiti reakcionu smešu do 0°C u ledenom kupatilu i dodati ciklopropankarboksilnu kiselinu (21.8 mL, 274.72 mmol). Zatim dodati rastvor 1-propanfosfonskog anhidrida (50% rastvor u EtOAc, 174.8 g, 274.72 mmol), a zatim dodatni DIPEA (40 mL) da bi se reakciona smeša napravila baznom. Mešati na sobnoj temperaturi preko noći. Isprati reakcionu smešu vodom (1 L) i razdvojiti slojeve. Sušiti organsku porciju preko MgSO4i koncentrovati in vacuo da bi se dobio sirovi proizvod kao prljavo bela pena. Prečistiti materijal hromatografijom preko silika gela (800 g, 0-10% MeOH u EtOAc). Odgovarajuće frakcije su kombinovane sa sledećom serijom proizvoda (51 g) dobijenom uglavnom praćenjem istog postuka upotrebom (2S)-2-amino-1-[4-[2-(4-amino-6-hloro-2-metil-pirimidin-5-il)etil]-1-piperidil]propan-1-on, dihidrohloridne soli (77.9 g, 150.42 mmol). Kombinovane serije su koncentrovane in vacuo da bi se dobila bela čvrsta supstanca (114 g). Proizvod je počeo da kristalizuje u toku koncentrovanja. Triturisati materijal vrelim EtOAc (200 mL), hladiti i filtrirati da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (111 g, 84%). LC-ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 394.0/396.0 (M+1). Hiralna analiza (OD-H kolona, 25% MeOH/iPrNH2, 5.0 mL/min, 100 bar, 35°C, 220 nm) >99.9% ee; TR = 1.15 min.

[0054] GOAT je glavni enzim koji prevodi UAG u AG. Za prikaze uloge GOAT i ghrelina videti: Kristy M. Heppner et al, The ghrelin O-aciltransferase-ghrelin system: a novel regulator of glucose metabolism, Current Opinion in Endocrinology, Diabetes & Obesity 2011, 18:50-55; Phillip A. Cole et al., Glucose and Weight Control in Mice with a Designed Ghrelin OAciltransferase Inhibitor, Science. 2010 December 17; 330(6011): 1689-1692. doi:10.1126/science. 1196154, Matthias H. Tschöp et al., Gastric O-acil transferase activates hunger signal to the brain, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 April 29; 105(17): 6213-6214, i Jesus Gutierrez, et al., Ghrelin octanoylation mediated by an orphan lipid transferase, Proc Natl Acad Sci U S A., 2008 April 29, 105 (17): 6320-6325.

[0055] Uloga GOAT je podržana fenotipovima zabeleženim kod miševa bez GOAT gena. Prema tome, očekuje se da inhibicija GOAT smanjuje cirkulišući AG i povećava cirkulišući UAG. Posledično, odnos AG prema ukupnom ghrelinu (UAG AG) je smanjen posle tretmana inhibitorom GOAT.

In vitro bezćelijska enzimska analiza humanog GOAT

[0056] Humani gen za GOAT (pristupni broj: NM_001100916) je subkloniran u pAN51 bakulovirusni ekspresioni vektor. Bakulovirusni stok je pripremljen praćenjem „Bac-to-Bac“ protokola obezbeđenog od strane dobavljača, Invitrogen, California, USA. Pet mililitara humanog GOAT bakulovirusnog stoka dodato je u 500 mL Sf9 ćelija u HyQ SFX-Insect™ medijumu (HyClone kataloški broj SH30278.02) na gustini od 1 x 10<6>ćelija po mililitru u Erlenmeyer posudi od 2 L. Posuda sa humanim Sf9 ćelijama inficiranim sa genom za GOAT je postavljena na uređaj za mućkanje ploče na 120 rpm na 28°C u trajanju od 48 časova. Posle inkubacije od 48 časova, ćelije su centrifugirane na 1,000xg u trajanju od 10 min na 4°C. Ćelijski talozi su sakupljeni i čuvani na -80°C u zamrzivaču sve dok nisu bili spremni za dalju obradu.

Priprema mikrozomalne membrane za enzimsku analizu GOAT enzima:

[0057] Jedan gram ćelijskih taloga je suspendovan u 9 mL ohlađenog homogenzacionog pufera (50 mM Tris-HCl, 250 mM saharoza, podešen do pH 7.5, i sterilno filtriran kroz 0.2 µm Millipore filter). Ćelijska suspenzija je prebačena u Dounce stakleni homogenizator. Ćelijski talozi su homogenizovani sa 40 udaraca na ledu. Homogenat je centrifugiran na 3,000 rpm u „Beckman swing bucket“ rotoru na 4°C u trajanu od 10 min da bi se uklonile neprekinute ćelije. Supernatant je sakupljen i centrifugiran na 40,000 xg u trajanju od 1 časa na 4°C. Dobijeni talog membrane je suspendovan u homogenizacionom puferu upotrebom Dounce staklenog homogenizatora i čuvan na -20°C u zamrzivaču za analizu. Za dugotrajno čuvanje preparata membrane humanog GOAT enzima, suspendovana membrana je čuvana u -80°C zamrzivaču.

Protokol analize humanog GOAT enzima:

[0058] Pripremiti test jedinjenja u DMSO da bi se napravio 0.2 mM stok rastvor. Serijski razblažiti stok rastvor u DMSO da bi se dobila kriva razblaženja od deset tačaka sa krajnjim koncentracijama jedinjenja u opsegu od 10 µM do 0.5 nM u 96-komornoj ploči sa okruglim dnom. Prirpremiti rastvore enzima i supstrata u puferu za analizu (0.02% Tween™-20 u 50 mM Tris, pH 7.5/250 mM saharoza/1 mg/mL BSA/10 mM EDTA). Dodati razblaženo jedinjenje (1 µL) u svaku komoricu reda A do N odgovarajuće 384-komorne ploče sa niskim vezivanjem proteina. Dodati supstratnu mešavinu humanog GOAT (10 µL), koja se sastoji od humanog desacilghrelin-biotina (CPC Scientific Inc., 6.0 µM krajnja), oktanoil-CoA (Sigma, 60 µM krajnja) i AG specifičnog antitela (WO 2006/091381)(1.0 µ/mL krajnja), u jedinjenja. Dodati preparat GOAT-His/sf9 enzima, koji je pripremljen u puferu za analizu (9 µL), u svaku komoricu ploče koja sadrži supstrat i test jedinjenja rezultujući u krajnjoj koncentraciji od 0.01 µg/mL da bi se započela reakcija. Inkubirati smešu 1 čas na sobnoj temperaturi na lagano rotirajućem oscilatoru. Dodati 4 M guanidin hidrohlorid (20 µL) u sve komorice, mešati, i inkubirati 3 časa da bi se zaustavila reakcija.

[0059] Pripremiti ELISA ploče (STREPTAVIDIN SPECTRAPLATE™ 384, Perkin Elmer) blokiranjem sa 2% toplotom-inaktiviranim FBS u PBS (40 µL) (Invitrogen) blokirajućim puferom u trajanju od 3 časa. Usisati blokirajući pufer iz ELISA ploče i dodati blokirajući pufer (23 µL) u kolone 1-24, redove A-N. Rezervisati redove O i P za standardnu krivu acilghrelina. Dodati reakcionu smešu (2 µL) u ELISA ploče. Pripremiti standardnu krivu od 10 tačaka (biotinom-obeležen oktanoil-ghrelin) serijskim 2X razblaženjem u blokirajućem puferu koji sadrži 0.2M guanidin hidrohlorid počevši na 2.5 pM. Inkubirati reakcionu smešu ili biotinom-obeleženi AG standard u ELISA ploči preko noči na 4°C. Sledećeg dana, isprati ploču 3x puferom za ispiranjem (0.1% Tween™-20/PBS, 100 µL po komorici u svakom ciklusu ispiranja). Dodati AG specifično antitelo (WO 2006/091381) (25 µL od 0.5 µg/mL u blokirajućem puferu) u svaku komoricu i inkubirati na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 časa. Isprati ploču 3x puferom za ispiranje, slično prethodnom koraku. Dodati Protein G-HRP (25 µL)(Southern Biotech) razblažen 3,000 x u blokirajućem puferu i inkubirati 1 čas na sobnoj temperaturi. Isprati poslednji 3x puferom za ispiranje, kao u prethodnim koracima. Dodati TMB reagens (25 µL) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) u svaku komoricu i ostaviti da se razvije u trajanju od 20 min i stopirati sa 1 M fosfornom kiselinom (25 µL po komorici). Očitavati ploče na 450 nm upotrebom Envision Multilabel uređaja za očitavanje ploče. Nivoi AG su izračunavani naspram aproksimirane standardne krive i izračunavan je procenat inhibicije. Kriva inhibicije od 10 tačaka je prikazana na grafikonu i aproksimirana sa četvoroparametarskom logističkom jednačinom da bi se dobile IC50vrednosti upotrebom Activity Base (ver.7.3.2.1).

[0060] Praćenjem protokola uglavnom kao što je opisano u prethodnom tekstu, jedinjenje iz Primera 1 ispoljava IC50od oko 192 nM ± 73, (n = 5). Podaci pokazuju da jedinjenje iz Primera 1 inhibira aktivnost prečišćenog GOAT enzima in vitro.

[0061] Poređenje promene u odnosu AG prema ukupnom ghrelinu u grupi tretiranoj jedinjenjem i onog kod grupe tretirane nosačem reflektuje stepen inhibicije GOAT enzima in vivo, zahvaljujući dinamičkoj obradi UAG prema AG pomoću GOAT enzima. U in vivo farmakodinamičkim studijama ovde, nivoi AG i UAG u plazmi i želudcu u grupama tretiranim nosačem i jedinjenjem mereni su pomoću ELISA specifično za ova dva analita. Ukupan nivo ghrelina svakog uzorka je izračunavan kao zbir AG i UAG pomoću ovih ELISA merenja. Odnos AG prema ukupnom ghrelinu je definisan pomoću nivoa AG u svakom uzorku podeljenog sa nivoom ukupnog ghrelina u istom uzorku. Nivoi AG, UAG i odnos AG prema ukupnom ghrelinu u grupi tretiranoj nosačem su izračunati i podešeni na 100%. Relativna promena ovih parametara u grupi tretiranoj jedinjenjem je zatim izračunata da bi se odredila efikasnost test jedinjenja.

In vivo 3-dnevna BID studija zavisna od doze za inhibitor GOAT:

Životinje i tretman:

[0062] Kupiti mužjake C57BL/6 miševa iz Harlan (Indianapolis, IN) starosti 9 nedelja. Smestiti miševe pojedinačno u objekat sa kontrolisanom temperaturom (24°C) sa 12-časovnim ciklusom svetlosti/mraka (svetlost u 22:00 časa), i omogućiti slobodan pristup standardnoj hrani za glodare (diet 2014, Harlan) i vodi. Tipično, koristiti miševe kada su oni starosti 10-13 nedelja u vreme studije. Na dan 0 eksperimenta, randomizovati miševe u grupe za tretman (N=7/grupi) tako da svaka grupa ima slične srednje telesne težine. Na dan 1 i dan 2, tretirati životinje nosačem (1% hidroksietilceluloza, 0.25% Tween 80, 0.05% sredstvo protiv penušanja) ili test jedinjenjem pripremljenim u nosaču kao suspenzija u različitim dozama putem oralne gavaže u 7 sati ujutru i 7 sati uveče. Na dan 3, životinje gladuju, ukloniti ih u čiste kaveze i dozirati nosačem ili test jedinjenjem ponovi u 8 sati ujutru putem oralne gavaže. Tog istog dana u 1 sat popodne, žrtvovati životinje dekapitacijom da bi se sakupila krv. Za detalje sakupljanja krvi i tretmana plazme videti deo Sakupljanje krvi i Ekstrakciju ghrelina iz plazme Plasma u daljem tekstu.

Sakupljanje krvi:

[0063] Sakupiti približno 600 µL krvi u prethodno izmerenu EDTA epruvetu koja sadrži 600 µL (definisan kao Vkonzervans) sveže pripremljenog konzervansa (4 mM PEFABLOC® [4-(2-aminoetil) benzenesulfonil fluorid hidrohlorid], 72 mM NaCl, 58 mM NaF, 0.032 N hlorovodonična kiselina, pH 3.0) i odmah mešati. Poovo izmeriti epruvetu i držati na ledu. Da bi se tačno odredila tačna zapremina krvi svakog uzorka upotrebom ovog postupka sakupljanja krvi, težina krvi za svakog miša je izračunata upotrebom sledeće jedinačine:

Težina krvi = (težina epruvete koja sadrži krv konzervans) – (težina epruvete koja sadrži konzervans)

Zapremina krvi (Vkrvi) = (Težina krvi) / 1.06

[0064] Treba obratiti pažnju da je porazumevano da je gustina krvi glodara 1.06 g/mL.

[0065] U roku od 15 minuta posle sakupljanja krvi, uzorci su centrifugirani na 5000 rpm na 4°C u trajanju od 8 min. Ukloniti plazmu (650 µL) u 5 mL staklenu epruvetu koja sadrži 1 N hlorovodoničnu kiselinu (65 µL), mešati i držati na ledu.

Ekstrakcija ghrelina pomoću SEP-PAK® kolone:

[0066] AG i UAG su ekstrahovani iz plazme upotrebom SEP-PAK®_C18 kolone da bi se uklonila intereferencija pre izvođenja ELISA. Ekstrakcija čvrste faze AG i UAG peptida pomoću SEP-PAK®_C18 kolona može biti izvedena na vakuumskom kolektoru (Waters Corp) ili upotrebom peristaltičke pumpe. Postupak ekstrakcije uzorka SEP-PAK®_kolone je nezavisno primenjen na uzorak plazme dobijen iz svakog pojedinačnog miša. Opšti protokol ekstrakcije je opisan na sledeći način.

[0067] Svi rastvori korišćeni za ceo protokol ekstrakcije sa SEP-PAK® kolonom bi trebalo da su na ledeno hladnim uslovima. Vlažne SEP-PAK®_kolone (WAT054960, Waters Corp, Milford MA) sa 99.9% ACN/0.1% TFA (1 mL rastvora 100 mL ACN/0.1 mL TFA). Primeniti pritisak da bi se podesila stopa protoka do oko 1 mL/min da bi se uklonila tečnost iz sloja kolone, ali ne dozvoliti da se kolona osuši na bilo kojoj tački. Pošto je tečnost uklonjena iz kolone, zaustaviti pritisak. Ekvilibrisati kolone sa 3% ACN/0.1% TFA (1 mL od 97 mL vode, 3 mL ACN, 0.1 mL TFA). Primeniti pritisak da bi se podesila stopa protoka do oko 1mL/min da bi se uklonila tečnost iz sloja kolone, ali ne dozvoliti da se kolona osuši. Razblažiti približno 650 µL zakišeljene plazme plasma (definisano kao Vplazma dodata u kolonu) do 1.4 mL ledeno hladnog 0.1 % TFA. Sipati svu razblaženu zakišeljenu plazmu iz prethodnog koraka na kolone. Primeniti pritisak da bi se podesila stopa protoka do oko 0.5mL/min da bi se omogućilo da uzorak prođe kroz kolonu i da se ghrelin peptidi apsorbuju na smolu kolone. Ne dozvoliti da se kolona osuši. Isprati sa 3% ACN/0.1% TFA (0.9 mL od 97 mL vode, 3 mL ACN, 0.1 mL TFA). Primeniti pritisak da bi se podesila stopa protoka do oko 1mL/min da bi se uklonila tečnost iz sloja kolone, ali ne dozvoliti da se kolona osuši. Ponoviti ispiranje još dva puta. Eluirati sa 60% ACN/0.1% TFA (1 mL od 40 mL vode, 60 mL ACN, 0.1 mL TFA). Postaviti epruvetu za sakupljanje ispod svake kolone, primeniti pritisak da bi se podesila stopa protoka do oko 0.5 mL/min da bi se pogurala tečnost kroz kolonu i sakupio eluent u epruvet za sakupljanje. Zamrznuti odmah na suvom ledu. Liofilizovati uzorke u speed-vac (Model# SC110A, Savant) i čuvati na -20°C sve dok nije izvedena ELISA analiza.

ELISA analiza za ghrelin:

[0068] Obložiti 96-komorne MULTI-ARRAY® MSD® ploče (Meso Scale Discovery, Gaithersberg, MD, Catalog # L15XA-3) sa 100 µL od 1 µg/mL antitela (WO 2005/026211 i WO2006/019577) koje prepoznaje srednji domen oba – acil i neacilovanog oblika ghrelina u PBS (Invitrogen). Potapkati stranice ploče da bi se osigurala pokrivenost komorica, heremetički zatvoriti lepljivim hermetičkim zatvaračem ploče, i inkubirati preko noći na sobnoj temperaturi. Odbaciti sadržaj i dodati Blocker™ kazein u PBS (25 µL) (Thermo Scientific, Rockford, IL, Catalog #37528) u svaku komoricu. Ponovo hermetički zatvoriti ploče i postaviti ih na uređaj za mućkanje ploče na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 časa.

[0069] Rekonstituisati liofilizovane konzervisane uzorke plazme iz ekstrakcije SEP-PAK® C18 kolone u Blocker™ kkazeinu u PBS (400 µL u svaki uzorak, ova zapremina je definisana kao Vrekonstitucije), mešati komoricu sa vorteks mikserom i inkubirati na ledu u trajanju od 45-60 min. Odbaciti sadržaj iz ploča i dodati rekonstituisane uzorke plazme u 25 µL u svaku komoricu. Pripremiti standardne krive acilghrelina i neacilovanog ghrelina počevši sa 8000 pg/mL i izvesti serijska 1:4 razblaženja za ukupno 8 koncentracija. Dodati pripremljene standarde u duplikatu u blokirane ploče sa 25 µL u svakoj komorici. Hermetički zatvoriti ploče i inkubirati na sobnoj temperaturi na uređaju za mućkanje ploče u trajanju od 2 časa.

[0070] Odbaciti sadržaj ploče i isprati tri puta sa PBS uključujući 0.1% Tween™ 20 (150 µL)(PBS-T). Acilghrelin specifično antitelo (WO 2006/091381) ili neacilovano ghrelin specifično antitelo (WO 2006/055347) obeleženi sa MSD SULFO-TAG™ (Meso Scale Discovery) su razblaženi do 0.05 µg/mL u 0.2 x blokatora kazeina koji sadrži 0.05% Tween™ 20, označen kao rastvor sekundarnog antitela. Ukloniti krajnji tečni ostatak od ispiranja i dodati rastvor sekundarnog antitela (25 µL u svaku komoricu) koje specifično prepoznaje AG ili UAG. Ploče su ponovo hermetički zatvorene i inkubirane u trajanju od 1 časa na sobnoj temperaturi na uređaju za mućkanje ploče pre konačnog ispiranja 3 x ponovo sa PBS-T (150 µL/komorici).

[0071] Odbaciti krajnji tečni ostatakl od ispiranja i zameniti sa 1 x MSD puferom za očitavanje (150 µL/komorici). Očitati elektrohemiluminiscentni signal generisan aktivacijom vezanog MSD SULFO-TAG™ obeleživača za elektrode na pločama upotrebom MSD® SECTOR® Imager 6000 analizatora (Meso Scale Discovery). Izračunati koncentracije acilghrelina ili neacilovanog ghrelina na bazi odgovarajuće standardne krive generisane pomoću MSD® softvera. Odrediti stvaru koncentraciju u plazmi za svaki uzorak množenjem izmerenog nivoa acilghrelina ili neacilovanog ghrelina preko faktora razblaženja. Faktor razblaženja za svaki uzorak plazme je izračunat pomoću sledeće jedinačine.

Rezultati:

[0072] Primena jedinjenja iz Primera 2 u trajanju od 3 dana smanjuje AG u plazmi za -1%, 5%, 45% i 48%, i povećava UAG za 2.24, 2.82, 2.53 i 2.89 puta, respektivno u 0.3, 1, 3 i 10 mg/kg (rezultati prikazani u donjoj tabeli). Primena u 0.3, 1, 3 i 10 mg/kg rezultuje u 39, 54, 71 i 77% redukcije respektivno u odnosu AG prema ukupnom ghrelinu u poređenju sa kontrolnim životinjama tretiranim nosačem. Ovi rezultati pokazuju da jedinjenje iz Primera 1 suprimira proizvodnju AG i povećava UAG u cirkulaciji, kao što je prikazano kod GOAT „knock-out“ miša, in vivo.

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 formule
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 3. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2 formule
4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa.
5. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 4 koja sadrži jedno ili više drugih terapeutskih sredstava.
6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u terapiji.
7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u redukciji dobitka telesne težine.
8. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u redukciji ponovnog dobitka telesne težine.
9. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u lečenju gojaznosti.
10. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u lečenju dijabetesa tipa 2.