RS56559B1 - Upotreba p3 fuzionih proteina bakteriofaga kao vezujućih agenasa amiloida - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na fuzione proteine, koji sadrže fragment za vezivanje amiloida od g3p proteina filamentoznog bakteriofaga ili mutantne ili varijantne oblike takvog vezujućeg fragmenta amiloida. Obuhvaćene su molekule nukleinskih kiselina i konstrukti koji kodiraju takve fuzione proteine, ćelije transformisane sa takvim molekulima nukleinske kiseline i metode izrade takvih fuzionih proteina rekombinantno. Dodatno, pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije, koje sadrže ovde opisane fuzione proteine, kao i na upotrebu takvih kompozicija terapeutski i profilaktički za smanjenje amiloidnog opterećenja povezanog sa bolestima, kao što su sistemska i periferna amiloidna oboljenja, neurodegenerativne bolesti, uključujući neurodegenerativne tauopatije i transmisivne spongiformne encefalopatije (bolesti povezane sa prionima). Takođe je obuhvaćena upotreba tih kompozicija kako bi se sprečilo akumuliranje amiloidnog opterećenja povezanog sa ovim bolestima, te korišćenje tih kompozicija kao dijagnostika za detekciju amiloida i na taj način, dijagnostikovanje takvih bolesti.

[0002] Filamentozni bakteriofag M13 i srodni filamentozni fag su pokazali korisnost na životinjskim modelima sa bolestima nepravilnog oblikovanja proteina i stoga predstavljaju potencijalnu terapijsku klasu za bolesti usled nepravilnog oblikovanja proteina. Videti SAD patentnu publikaciju US 2011/0142803, koja je ovde u celosti inkorporirana referencom. Posebno, otkriveno je da filamentozni bakteriofag ima sposobnost posredovanja u klirensu amiloida, koji su već formirani u mozgu. Videti, npr., WO2006083795 i WO2010060073. [0003] M13 fag, član familije faga Ff, ima zreli g3p od 406 aminokiselina. GenBank Ref Seq NP_510891.1 daje referentnu sekvencu, koja uključuje 18 ostataka amino-terminalne signalne sekvence. Uobičajene su varijante koje imaju aminokiselinske razlike u poređenju sa objavljenim sekvencama. Filamentozni fag I-familije ima g3p koji se razlikuje od članova familije Ff, ali čak i između familija, g3p je i dalje visoko konzerviran. Stassen i sar., J Mol Evol (1992) 34: 141-52.

[0004] Za g3p je dostupna kristalna struktura. Lubkowski i sar., Structure (1998) 7 (6) 711-722. Protein sadrži 3 preklopljena domena odvojena pomoću fleksibilnih linker sekvenci bogatih glicinom. Postoje dva amino-terminalna domena, N1 i N2, koji sadrže 262 aminokiseline koje deluju u interakciji, kako bi se formirao N1-N2 kompleks. Karboksi-terminalni (CT, takođe nazvan N3) domen je izgrađen od 146 aminokiselina i služi za sidrenje g3p u česticama faga putem hidrofobnih interakcija sa g8p. Marvin, Current Opin. in Structural Biology (1998) 8: 150-158. Javno dostupna struktura trake, pripremljena korišćenjem N1-N2 domena fuzionog proteina 2g3p prema Holligeru, J Mol. Biol. (1999) 288(4):649-57 je prikazana na Sl.1.

[0005] Za razliku od većine proteina, razvijanje domena N1 i N2 iz latentnog zaključanog oblika je neophodno za g3p da stekne svoju prirodnu biološku aktivnost. Eckert & Schmid, J. Mol. Biol. (2007) 373: 452-461. U početnom koraku infekcije, N2 vezuje bakterijski F-pilus preko ostataka na spoljašnjem obodu N2. Deng & Perham, 2002. Ovo inicijalno vezivanje pomoću N2 "otključava" g3p "otvaranjem" kompleksa N1-N2, dozvoljavajući N1 da zatim vezuje koreceptor TolA. U N1-N2 fragmentu g3p, toplotni prelaz za početni korak otključavanja u kome se N2 odvija se javlja na temperaturi topljenja (TM) od 48,1 ° C. Deo procesa uključuje izomerizaciju na Gln212-Pro213 peptidnoj vezi. Pretvaranje Pro213 je trans u otključanom stanju. N1 ostaje stabilno preklopljen do drugog koraka, koji se javlja pri TMod 60,2 ° C, Pregledano u Eckert & Schmid, 2007.

[0006] Mutacije u fragmentu N1-N2 su korišćene za ispitivanje stabilnosti i infektivnosti različitih mutanata, Eckert & Schmid, 2007. Jedna varijanta, označena kao "3A" je oštetila vezivanje pilusa i smanjila stabilnost N2 domena. Za ovu mutaciju, TMse smanjuje na 42,6 °C. 3A nosi sledeće mutacije: W181A, F190A i F194A. Drugi mutant u N2, G153D, destabilizovao je N2, smanjujući TMna 44,4 ° C. Mutant Q129H stabilizuje N2, povećavajući TMna 51,4 °C. Varijanta IY sadrži mutacije T1011 i D209Y u šarki i povećava stabilnost fragmenta N1-N2 (TM= 56,5 ° C). IHY sadrži mutacije T101I, Q129H i D209Y (TM= 60,1 ° C). IIΗΥ sadrži mutacije T13I, T101I, Q129H i D209Y (TM= 61,8 ° C). Obe Q129Y i T13I mutacije se stabilizuju, a dodavanje ovih mutacija dalje povećava temperaturu topljenja, TMInfektivnost faga varira obrnuto sa jačinom interakcija domena unutar g3p. Eckert & Schmid, 2007. Brisanje domena N2 (fag fd (ΔN2)) je povećalo infektivnost uklanjanjem blokirajućeg efekta domena N2 na N1 vezivanje TolA. Id. WO2006/083795A1 opisuje bakteriofag koristan za inhibiciju ili lečenje moždane inflamacije udružene sa amiloidnim depozitima. WO2004/018685A1 opisuje fuzione proteine, koji sadrže ekspresioni protein i proteinski fragment omotača faga. US2009/105090A1 opisuje metod prikaza faga korišćenjem mutantnog p3 proteina, koji ima aminokiselinski ostatak ubačen između ostatka prolina na položaju 11 i ostatka histidina na položaju 12 u jednom p3 proteinu M13 faga. Kather i sar.

"Stabilni bez disufida gen-3-protein faga fd generisan in vitro evolucijom", J. Mol. Biol., (2005), 354, str 666-678 opisuju ulogu specifičnih disulfidnih veza u vezi sa stabilnošću g3p. WO2009/143465A1 opisuje filamentozni agens kompleksiran sa agensom za snimanje, za korišćenje u detekciji abnormalnih amiloidnih depozita ili plakova pomoću MRI.

[0007] Nedavno je otkriveno da g3p takođe posreduje vezivanje filamentoznog faga za amiloid, na način koji je analogan procesu kojim fag inficira bakteriju. WO 2013/082114 otkriva da g3p faga direktno vezuje amiloidna vlakna i da disagregacija posredovana fagom zavisi od ovog inicijalnog koraka vezivanja. Prepoznavanje da je g3p odgovoran za vezivanje amiloida, posredovano preko filamentoznog faga, obezbeđuje osnovu za nove klase terapeutika i dijagnostika. Sadašnji pronalazak obezbeđuje one terapeutske i dijagnostičke preparate kao i metode za njihovo korišćenje radi otkrivanja, dijagnoze, lečenja, sprečavanja ili odlaganja početka bolesti i poremećaja povezanih sa amiloidnom agregacijom.

[0008] Dodatni predmeti i prednosti prema pronalasku prikazani su delimično u opisu koji sledi i biće očigledni iz opisa, ili se mogu naučiti primenom pronalaska. Predmeti i prednosti pronalaska biće realizovani i postignuti pomoću elemenata i kombinacija posebno naznačenih u priloženim patentnim zahtevima. Treba shvatiti da su i prethodni opšti opis i sledeći detaljni opis primeri i samo radi objašnjenja, a ne ograničavaju pronalazak, kao što se i zahteva.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0009]

Slika 1 predstavlja strukturu trake N1 i N2 domena g3p i zglob.

Slike 2A-2C prikazuju poravnanja g3p-a iz različitih izvora. Sl. 2A je poravnanje g3p od faga M13 (SEK ID BR: 1), fd (SEK ID BR: 2) i f1 (SEK ID BR: 3), uključujući konsenzusnu sekvencu (SEK ID BR: 4). Slika 2B prikazuje poravnanje g3p od faga I2-2 (SEK ID BR: 5) i Ike (SEK ID BR: 6), uz konsenzusnu sekvencu između I2-2 i Ike (SEK ID NO: 7). Sl.2C predstavlja aminokiselinsku sekvencu g3p iz faga If (SEK ID BR: 8).

Slike 3A i 3B predstavljaju ispitivanja vezivanja faga površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Vezivanje za Aβ fibrile je poređeno sa vezivanjem na Αβ monomere upotrebom 10<14>faga / ml, koji protiče preko biosenzorskog čipa. Slika 3B prikazuje Ka, Kdi KDizračunati iz SPR podataka prikazanih na Slici 3A.

Slike 4A i 4B predstavljaju studije vezivanja. Sl. 4A pokazuje direktni test vezivanja za dve doze faga (10<11>/ mL i 10<12>/ mL) sa povećanjem molskih količina fAβ42. Sl. 4B je studija konkurentskog vezivanja i obezbeđuje alternativni način za određivanje KDza vezivanje M 13. Koristi se konstrukt 1.

Slika 5 prikazuje rezultate vezivanja konkurencije, korišćenjem materijala denaturisanih toplotom (kutije - 90 ° C u trajanju od 10 minuta) nasuprot nativnoj konformaciji (krugovi) M13 (Konstrukt 1), u kompetitivnom testu vezivanja amiloidnih vlakana.

Slika 6 prikazuje test fluorescencije Tioflavina T (ThT) korišćenjem fAβ42 inkubiranog u prisustvu ili odsustvu 2 koncentracije M13 faga (Konstrukt 1).

Slike 7A i 7B pokazuju efekat različitih individualnih parametara ispitivanja u testu disagregacije ThT. Sl. 7A prikazuje procente disagregacije u prisustvu dve koncentracije soli (0,15 M i 1,5 M). Sl. 7B prikazuje procente fAβ koji ostaju na dve temperature (4 ° C i 37 ° C). Korišćen je konstrukt 1.

Sl. 8A i 8B predstavljaju M13-amiloidne testove vezivanja korišćenjem fAp42. Na Sl. 8A, M13 vezivanje je prijavljeno korišćenjem temperatura inkubacije od 18 ° C do 58 ° C tokom 3 sata. Sl. 8B pokazuje kinetiku vezivanja za inkubacije na 37 ° C nasuprot 50° C.

Slike 9A-9C prikazuju efekat proteolitičkog uklanjanja g3p na fag-amiloidne interakcije. Proteaza Arg C je korišćena za isecanje g3p iz M13 faga (M13Δg3p). Sl. 9A predstavlja rezultate kompetitivne studije vezivanja za Αβ korišćenjem M13Δg3p faga u poređenju sa prirodnim fagom (tretiran identično sa fagom, tretiranim sa ArgC, ali bez tretmana proteaze). Slika 9B prikazuje efekat tretmana Arg C na infektivnost faga M13Δg3p, u poređenju sa prirodnim fagom. Sl.9C upoređuje Fag tretiran sa ArgC sa prirodnim fagom u testu disagregacije.

Slike 10A i 10B prikazuju rezultate testa kompetitivnog vezivanja pomoću N1-N2 fragmenta g3p-a, ovde označenog kao rekombinantno rastvorljivi N1N2 (rs-g3p (N1N2), "Konstrukt 3"), M13Δg3p (tretiranog sa Arg C), i M13 kao konkurente označenog M13 vezivanja za fAβ42. Slika 10B prikazuje ponavljanje kompetitivnog testa. Slika 11 prikazuje kompetitivne podatke za fag fd, IIΗΥ, AAA i M13. Fagi fd, AAA i IIΗΥ su prethodno aktivirani na 50 ° C, u trajanju od 1,5 sata, zatim aktivirani i neaktivirani Fd, AAA, & IIHY su upoređeni zbog njihove sposobnosti da se takmiče sa označenim M13 za vezivanje za Αβ tokom 45 minuta inkubacije na 37 ° C.

Sl. 12A prikazuje šematski prikaz rs-g3p (N1N2) (Konstrukt 3). Sl. 12B predstavlja profil jonskog izmenjivanja za rs-g3p (N1N2). Sl. 12C prikazuje rezultate gel filtracione analize korišćenjem Sephacryl S-300 i rs-g3p (N1N2).

Sl. 12D prikazuje Western Blot analizu rs-g3p (N1N2) zajedno sa g3p i g8p kontrolama. M13 fagi su proticali u trakama 1 i 2 kao pozitivna kontrola i detektovani su sa poliklonskim anti-M13 antitelom, koje detektuje i g8p i g3p. Prečišćeni rs-g3p je propuštan u trakama 3 i 4 i detektovan je sa istim poliklonskim anti-M13 antitelom.

Slika 13 prikazuje SPR podatke korišćenjem rs-g3p (N1N2) (Konstrukta 3). rs-g3p (N1N2) snažno vezuje fAβ42, sa KDod oko 160 nM, ali ne vezuje monomere.

Slika 14 prikazuje ThT fluorescencijski test, koji se koristi za merenje amiloida, koji je prisutan u datom uzorku.10 μM monomera Αβ42 je inkubirano u prisustvu ili odsustvu 5 koncentracija rs-g3p (N1N2) (Konstrukta 3) na 37 ° C, tokom 3 dana. Količina formiranih vlakana na kraju 3 dana je merena kvantifikacijom vezane ThT fluorescencije. IC 50 je približno 20 nM što ukazuje da rs-g3p (N1N2) snažno inhibira stvaranje vlakana Αβ42. Ova slika takođe pokazuje da je vezivanje zavisno od doze. Ponovljeni eksperimenti pokazuju da je IC 50 između 20n i 100nM. Slika 15A prikazuje rezultate transmisione elektronske mikrografije (TEM) inkubiranjem fAβ42 u prisustvu ili odsustvu rs-g3p (N1N2) (Konstrukta 3). Slika 15B prikazuje rezultate testa fluorescencije ThT korišćenjem Aβ42 i 2 μM rs-g3p (N1N2) (Konstrukta 3), inkubirane 7 dana na 37 ° C, rs-g3p (N1 N2) blokira formiranje fAβ42.

Slika 16 prikazuje da rs-g3p (N1N2) (Konstrukt 3) snažno inhibira formiranje α-sinukleinskih vlakana. 25 μM αsinukleina sakupljeno je mešanjem na 300 rpm, tokom 4 dana, na 37 ° C (videti, traka 1). Druga traka na grafikonu predstavlja alfa-sinukleinske monomere plus 1x10-<13>pentamerni M13 fag, trešenjem na 37 ° C, tokom 3 dana. Rezultati prikazani na traci 2 ukazuju da pentamerni M13 blokira udruživanje α-sinukleinskih vlakna. Treća traka na grafikonu predstavlja monomere alfa-sinukleina 83 nM rsg3p monomera. Rezultati prikazani na traci 3, ukazuju da su monomeri manje efikasni u inhibiranju formiranja α-sinukleinskog vlakna od pentamernog M13. Traka 4 je negativna kontrola, koja pokazuje alfa sinukleinske monomere u vremenu nula. U traci 5, prikazani su g3p monomeri bez α -sinukleinskih vlakana da bi se utvrdilo da li se g3p vezuje za pTAA i sekvestracije boja od vezivanja na vlakna. Rezultati prikazani u traci 5 pokazuju da se g3p ne vezuje za pTAA.

Slika 17 prikazuje konkurentske podatke vezivanja za rs-g3p (N1N2) (Konstrukt 3), M13 (Konstrukt 2), rs-g3p (N1N2)-hIgG4-Fc fuzioni protein (Konstrukt 4) i IgG4-Fc negativnu kontrolu.

Slika 18 prikazuje konkurentske podatke vezivanja, koji upoređuju M13 (Konstrukt 2; kvadrate), rs-g3p (N1N2) (Konstrukt 3; trouglove), rs-g3p (N1N2)-hIgG4-Fc fuzioni protein (Konstrukt 4; trouglove postavljene naopako) i rekombinantnu IgG4-Fc negativnu kontrolu (dijamanti).

Slika 19 prikazuje analizu pomoću filtera klopke, u kojoj se poredi pet koncentracija vlakana Αβ42 plus ili minus dve koncentracije M13 (Konstrukt 2), 800 nM rs-g3p (N1N2) (Konstrukt 3) i tri koncentracije rs-g3p (N1N2)-hIgG4-Fc fuzionog proteina (Konstrukt 4).

Slika 20 prikazuje konkurentske podatke vezivanja za rs-g3p (N1N2) (Konstrukt 3; "monomer") i streptavidin konjugovani rs-g3p (N1N2) ("SA [g3pN1N2]n=2-4"; "SAg3p"; "tetramer"). rs-g3p (N1N2) i SA-g3p su upoređivani zbog njihove sposobnosti da se takmiče sa obeleženim M13 za vezivanje za Αβ, tokom tri sata inkubacije na 37 ° C.

Slika 21 prikazuje test filtera klopke, koji poredi pet koncentracija fAβ42 plus ili minus dve koncentracije rs-g3p (N1N2) (Konstrukta 3; "monomera") i dve koncentracije SA-g3p ("tetramera").

Slike 22A i 22B prikazuju TEM fAβ42 u vremenu nula (Sl. 22A) i tri dana nakon inkubacije sa SA-g3p (Sl.22B). Slika 23 prikazuje aminokiselinsku sekvencu jednog rs-g3p (N1N2)-hIgG4-Fc konstrukta "Konstrukt 4" (SEK ID BR: 9). Region N1N2 "Konstrukta 4" je izveden iz regiona N1N2 "Konstrukta 1" (SEK ID BR: 10).

Slika 24 prikazuje aminokiselinsku sekvencu drugog rs-g3p (N1N2)-hIgG4-Fc konstrukta "Konstrukt 5" (SEK ID BR: 11). Region N1N2 "Konstrukta 5" izveden je iz regiona N1N2 "Konstrukta 2" (SEK ID BR: 12).

Slika 25 prikazuje aminokiselinsku sekvencu jednog rs-g3p (N1N2)-hIgG1-Fc konstrukta "Konstrukt 6" (SEK ID BR: 13). Region N1 N2 "Konstrukta 6" je izveden iz regiona N1 N2 "Konstrukta 2".

Slika 26 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence N2 od: fd (SEK ID BR: 14), f1 (SEK ID BR: 15), M13 (SEK ID BR: 16), Ike (SEK ID BR: 17), I2 -2 (SEK ID BR: 18) i If1 (SEK ID BR: 19). Zvezdica "*"označava položaje koji imaju jedan, potpuno konzervisani ostatak. Dvotačka ":" označava konzervaciju između grupa jako sličnih svojstava, koje imaju veću vrednost od 0,5 u matrici Gonnet PAM 250. Period "." ukazuje na očuvanje između grupa slabo sličnih osobina, koja su jednaka ili manja od 0,5 u matrici Gonnet PAM 250.

Slika 27A prikazuje shemu Konstrukta 3. Sl. 27B prikazuje DNK sekvencu g3p dela Konstrukta 3 (SEK ID BR: 23). Sl.27C prikazuje aminokiselinsku sekvencu g3p dela Konstrukta 3 (SEK ID BR: 24).

Slika 28 prikazuje rezultate eksperimentalnog testiranja dva rs-g3p (N1 N2)-IgG fuziona proteina na njihovu sposobnost da smanjuju amiloid β u transgenom mišjem modelu Alchajmerove bolesti. rs-g3p (N1 N2)-hIgG4-Fc (Konstrukt 5) i rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukt 6) su oboje značajno smanjili nivo amiloida β u hipokampusu miševa sa Alchajmerovom bolešću.

Slika 29 prikazuje rezultate eksperimentalnog testiranja dva rs-g3p (N1 N2) - IgG fuziona proteina na njihovu sposobnost da smanjuju amiloid β u transgenom mišjem modelu Alchajmerove bolesti. rs-g3p (N1 N2) - hIgG4-Fc (Konstrukt 5) i rs-g3p (N1 N2) - hIgG1-Fc (Konstrukt 6) su uspeli oboje da značajno smanje nivo amiloida β u moždanom korteksu miševa sa Alchajmerovom bolešću .

Slike 30A i 30B prikazuju skupnu inhibiciju Αβ42 sa rs-g3p (N1 N2) - hIgG1-Fc (Konstrukt 6). Sl. 30A prikazuje "prirodni" agarozni gel napravljen bez SDS-a. Uzorci se izvode u TEA puferu, bez SDS-a i nisu kuvani. Rezultati ukazuju na to da je Konstrukt 6 sposoban za inhibiciju sakupljanja fAβ42. Sl. 30B predstavlja ThT fluorescentnu analizu, koja se koristi za merenje amiloida prisutnog u datom uzorku. 10 μM monomera Αβ42 je inkubirano u prisustvu ili odsustvu 2 koncentracije rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukt 6), na 37 ° C, tokom 1 dana. Količina vlakana formiranih na kraju prvog dana merena je kvantifikacijom vezane ThT fluorescencije. rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukt 6) snažno inhibira formiranje Αβ42 vlakana. Slika takođe pokazuje da je inhibicija formiranja vlakana sa Konstruktom 6 dozno zavisna.

Slike 31 A, 31 B, 31 C i 31 D predstavljaju reprezentativne kružne podatke o dihroizmu, koji pokazuju da je skup Αβ42 inhibiran pomoću rs-g3p (N1N2) (Konstrukta 3). Kružni dihroizam meri sadržaj α-heliksa i β-ploče Αβ vlakana za procenu. Sl. 31 A prikazuje eiliptičnost u odnosu na talasnu dužinu za Αβ42 na T = 0, T = 24 sata i T = 48 sati. Sl. 31 B prikazuje eiliptičnost u odnosu na talasnu dužinu za Αβ42 plus Konstrukt 3 pri T = 0, T = 24 sata i T = 48 sati. Sl. 31 C prikazuje reprezentativnu ThT analizu gde je količina vlakana formiranih između 24 i 48 sati merena kvantifikacijom vezane ThT fluorescencije. Konstrukt 3 snažno inhibira formiranje Αβ42 vlakana. Sl.31 D prikazuje eiliptičnost u odnosu na talasnu dužinu za konstrukt 3 pri T = 0, T = 24 sata i T = 48 sati. Zajedno, ovi podaci potvrđuju sposobnost konstrukta 3 da inhibira skup Αβ42.

Slika 32 predstavlja reprezentativne podatke koji pokazuju da M13 (Konstrukt 2) i rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukt 6) blokiraju toksičnost N2a ćelija uzrokovanu oligomerom. Videti, npr., Stine i sar. (2003) J. Biol. Chem. 278 (13): 11612-11622 i Stine i sar. (2011) Erik D. Roberson (ed.) Alzheimerova bolest i Frontotemporalna Demencija, Metode u molekularnoj biologiji, vol. 670:13-32. N2a ćelije su diferencirane serumskim gladovanjem, 48 sati pre lečenja, Αβ42 oligomeri (2uM) su prethodno inkubirani sa Konstruktom 2 i Konstruktom 6 na 37 ° C tokom 3 sata, pre dodavanja ćelijama N2a. Kompleksi u vremenu nula ("TO") nisu bili prethodno inkubirani. Nakon 24 sata inkubacije, praćeno je oslobađanje adenilat kinaze ("AK"). Oslobađanje AK u medijumu označava smrt ćelija / lizu. Oligomeri Αβ42 su izrađeni kao što je opisano od strane Stine i sar., 2011. Rezultati pokazuju da su M13 i rs-g3p (N1 N2) -hIgG1-Fc snažni inhibitori toksičnih oligomera.

Slika 33 prikazuje test filtera klopke, koji poredi šest koncentracija Αβ42 vlakana plus ili minus 1 x 10<12>/ ml M13 (Konstrukt 2); 80 nm i 800 nM rs-g3p (N1 N2) - hIgG4-Fc konstrukt (Konstrukt 5); i 80 nm i 800 n rs-g3p (N1 N2) - hIgG1-Fc (Konstrukt 6). Vlakna Αβ42 su inkubirana sa Konstruktima 2, 5 i 6, na 37 ° C, tokom 3 dana, nakon čega sledi usporavanje procesa filtriranja. Filter je proban sa mAt 6E10 (1: 15000), koje prepoznaje vlakna Αβ42 zadržana na filteru. 800nM Konstrukta 5 ili Konstrukta 6 jednako je 5 x 10<14>/ ml Konstrukta 2 pomoću molekularnog molariteta. Rezultati pokazuju da Konstrukti 2, 5, i 6 snažno razdvajaju β-amiloidna vlakna.

Slike 34A i 34B predstavljaju reprezentativne testove, koji se koriste za merenje količine M13 (Konstrukta 2) vezanog za fAβ42, nakon 3 sata preininkubacije sa ftau. 5 μM Αβ42 monomera vezanih za Konstrukt 2 je inkubirano u prisustvu ili odsustvu 4 koncentracije ftau na 37 ° C, tokom 3 sata. Budući da fAbeta:M13-Alexa488 daje pelete ali, ftau:M13-Alexa488 ne daje pelete, merenje gubitka fluorescencije iz peletiranog materijala ukazuje na to da se ftau takmičio za vezivanje fAbeta. Ovde je količina M13-fAβ formirana na kraju 3 sata merena kvantifikacijom fluorescencije Alexa488 u kompetitivnoj reakciji peletiranog vezivanja. Rezultati pokazuju da je ftau sposoban da se takmiči sa M13-Alexa488 (Konstruktom 2) za vezivanje fΑβ42.

Slika 35 prikazuje rezultate jednog reprezentativnog SPR testa koji testira sposobnost rs-g3p (N1 N2) - hIgG4-Fc (Konstrukta 4) da se veže na ftau. Rezultati ukazuju da Konstrukt 4 snažno vezuje ftau.

Slike 36A i 36B pokazuju sposobnost rs-g3p (N1 N2) - hIgG1-Fc (Konstrukta 6) da razdvoji ftau. Tau vlakna su pripremljena razblaživanjem 40 uM ponavljajućeg vezujućeg regiona mikrotubule ("MTBR") iz tau u 50 mM superoksid dizmutaze ("Sod"). Različite koncentracije Konstrukta 6 i pripremljenog ftau su inkubirane u acetatnom puferu na pH 7,0, 37 ° C tokom 72 sata. ThT fluorescencija je zabeležena u prisustvu viška ThT od 5 puta. Sl.36A predstavlja rezultate reprezentativnog ThT testa koji pokazuje sposobnost Konstrukta 6 da razdvoji ftau. Sl. 36B pokazuje drugi reprezentativni eksperiment kojim se potvrđuje sposobnost konstrukta 6 da razdvoji tau. Slike 36A i 36B takođe pokazuju da je dezagregacija ftau od strane Konstrukta 6 zavisna od doze.

Slike 37A, 37B, 37C i 37D predstavljaju reprezentativne eksperimente, koji pokazuju inhibiciju agregacije Αβ pomoću rs-g3p (N1 N2) - hIgG1-Fc (Konstrukta 6) i rs-g3p (N1 N2) (Konstrukta 3) tokom vremena. Aβ42 je rastvoren u DMSO i razblažen u PBS-u, koji sadrži NaN3. Αβ42 je agregiran na 37 ° C sa plus ili minus različitim koncentracijama Konstrukta 3 i Konstrukta 6. Agregacija Αβ42 je merena pomoću ThT fluorescencije. Sl. 37A prikazuje SDS PAGE uzoraka. Sl. 37B prikazuje rezultate jednog reprezentativnog eksperimenta. Sl.37C prikazuje rezultate drugog reprezentativnog eksperimenta. Sl.37D sumira rezultate.

Sl. 38A i Sl. 38B prikazuju rezultate eksperimenata koji pokazuju sposobnost rs-g3p (N1 N2) -hIgG1 Fc (Konstrukta 6) da blokira konverziju PrP u PrP-Sc. Konstrukt 6 i IgG ćelijski lizati su podvrgnuti ultracentrifugiranju za odvajanje rastvorljivih (supernatanta) i nerastvorljivih (peleta) PrP vrsta. PrP vrste su vizualizovane biohemijski sa anti-PrP monoklonskim antitelom (6D11). U prisustvu IgG-a, postoji raspodela PrP u rastvorljivim i nerastvorljivim frakcijama. U prisustvu Konstrukta 6, postoji ograničen nerastvorljivi PrP. Podaci predstavljaju n = 4.

Sl. 39A i Sl. 39B prikazuju rezultate eksperimenata koji pokazuju sposobnost rs-g3p (N1 N2) -hIgG1-Fc (Konstrukta 6) da smanji sakupljanje i agregaciju PrP<Sc>u modelu ćelijske kulture prionske bolesti. Sl.39A pokazuje biohemijski razgrađene nedigestirane i PK-digestirane N2a22L<Sc>ćelijske lizate, nakon tretmana sa Konstruktom 6 i IgG-om. Značajno smanjenje nivoa PrP<Sc>se jasno primećuje u ćelijama, koje su tretirane sa povećanim koncentracijama Konstrukta 6. Približno 50% smanjenja PrP<Sc>nivoa se postiže sa tretmanom od ~0,08 μg/ml Konstrukta 6. Tretman sa 10 μg/ml Konstrukta 6 smanjuje nivoe PrP<Sc>na 5,725%, p <0,0001. Nisu zabeležene značajne promene u nivoima PrP<Sc>u N2A22L<Sc>ćelijama tretiranim sa 1 μg/ml mišjeg IgG-a. Za sliku 39B, rendgenski filmovi su zatim digitalizovani i inicijalno normalizovani na efekat u IgG tretiranim N2a22L<Sc>ćelijama iz istog prolaza za koje se smatra da su 100%. Denzitometrijski podaci iz PK-digestiranih blotova su zatim analizirani u odnosu na ekvivalentno blotirane nedigestirane lizate i izraženi kao procentna promena PrP<Sc>/PrPc. Podaci predstavljaju n = 4.

Slika 40 prikazuje rezultate eksperimentalnog testiranja dva fuziona proteina rs-g3p (N1 N2) IgG, na njihov uticaj na nivoe sinaptofizina u hipokampusu, u transgenom mišjem modelu Alchajmerove bolesti, nakon tretmana sa rsg3p (N1 N2) - hIgG4-Fc (Konstruktom 5) i rs-g3p (N1 N2) - hIgG1-Fc (Konstruktom 6). Oba konstrukta značajno povećavaju nivo sinaptofizina u hipokampusu miševa sa Alzheimerovom bolešću.

Slika 41 prikazuje rezultate eksperimentalnog testiranja dva fuziona proteina rs-g3p (N1 N2) -IgG, na njihov uticaj na nivoe Iba-1, u hipokampusu transgenog mišjeg modela Alzheimerove bolesti, nakon tretmana sa rs-g3p (N1 N2 )-hIgG4-Fc (Konstruktom 5) i rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstruktom 6). Oba konstrukta značajno povećavaju nivo Iba-1 u hipokampusu miševa sa Alzheimerovom bolešću.

Slika 42 prikazuje rezultate eksperimentalnog testiranja dva rs-g3p (N1 N2) - IgG fuziona proteina, na njihov uticaj na nivoe GFAP-a u hipokampusu, u transgenom mišjem modelu Alzheimerove bolesti, nakon tretmana sa rs-g3p (N1 N2) - hIgG4-Fc (Konstruktom 5) i rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstruktom 6). Nijedan od dva konstrukta nije značajno promenio nivo GFAP-a u hipokampusu miševa sa Alzheimerovom bolešću.

Sl. 43 prikazuje rezultate eksperimenta vezivanja, dizajniranog radi poređenja rs-g3p (N1 N2) - hIgG4 - Fc (Konstrukta 5) i rs-g3p (N1 N2) - hIgG1-Fc (Konstrukta 6). Konstrukti se snažno vezuju za fΑβ sa sličnim KD(~11).

Slike 44A i 44B prikazuju sposobnost rs-g3p (N1 N2) (Konstrukta 3) da blokira skup tau-a. Na Sl. 44A, 1 μM tau je inkubiran samostalno ili inkubiran zajedno sa 1 μM Konstrukta 3 i analiziran TEM-om, nakon 5 dana. Konstrukt 3 blokira skup tau. Sl.44B prikazuje rezultate testa ThT fluorescencije, korišćenjem ftau inkubiranog u prisustvu ili odsustvu 3 koncentracije rs-g3p (N1 N2) (Konstrukta 3). Konstrukt 3 blokira skup tau-a zavisno od doze.

Slika 45 prikazuje shemu eksperimenta za analizu interakcije između fAβ42 i rs-g3p (N1 N2) (Konstrukta 3). Slika 46 prikazuje rezultate NMR ispitivanja za analizu interakcija između fAβ42 i rs-g3p (N1 N2) (Konstrukta 3). H predstavlja vodonik, a D predstavlja deuterijum. Vodonici Αβ vlakana se razmenjuju deuterijumom tokom vremena i na brzinu se utiče vezivanjem Konstrukta 3 sa vlaknima. Rezultati ukazuju na molekularnu interakciju između Konstrukta 3 i fAβ42 , na ostacima 17-22 i 33-40 fAβ42.

Slike 47A, 47B, 47C i 47D prikazuju reprezentativne TEM-ove Konstrukta 3 razgradnjom prethodno formiranog fAβ42, nakon inkubacije tokom 744 časova. Sl. 47A prikazuje sam fAβ42. Sl. 47B prikazuje fΑβ42 plus Konstrukt 3. Sl. 47C prikazuje sam fAβ42, pri povećanom uvećanju u odnosu na Sl. 47A. Sl. 47D prikazuje fAβ42 plus Konstrukt 3, pri većem uvećanju u odnosu na Sl.47B.

Slika 48 prikazuje rezultate reprezentativnog SPR testa, koji pokazuje da rs-g3p (N1 N2) -hIgG1-Fc (Konstrukt 6) snažno vezuje ftau.

Sl. 49A predstavlja rezultate reprezentativnog ThT testa, koji pokazuje sposobnost Konstrukta 6 da razgrađuje ftau.

Sl. 49B prikazuje grafički prikaz eksperimenta sa Sl. 49A. Slike 49A i 49B takođe prikazuju da je dezagregacija ftau od strane Konstrukta 6 dozno zavisna.

Sl. 50A predstavlja SPR studiju rs-g3p (If1 - N1 N2) - hIgG4-Fc (Konstrukta 8) koji se vezuje za Aβ vlakna. Rezultati pokazuju da Konstrukt 8 snažno vezuje Αβ vlakna (KD~ 36 nM). N1 N2 fragment g3p-a (koji nije povezan sa Fc domenom) je pokazao slabije vezivanje (KD~ 36 nM). Sl. 50B predstavlja rezultate testa vezivanja konkurencije, koji pokazuje sposobnost rs-g3p (If1-N1 N2) - hIgG1-Fc (Konstrukta 8) da se vezuje za fAβ1-42. N1 N2 fragment g3p (koji nije povezan sa Fc domenom) je pokazao slabije vezivanje.

Slika 51 prikazuje poređenje aminokiselina između If1 g3p (SEK ID BR: 29) i fd g3p (SEK ID BR: 30). Aminokiseline koje su identične između If1 i fd u domenu N1 g3p-a su zatamnjene. N1 domen je u kutiji.

Slike 52A i 52B predstavljaju rezultate eksperimenata, koji pokazuju sposobnost rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukta 6) da značajno smanjuje taloženje Αβ i tau vlakana, nakon direktne injekcije u mozak na in vivo modelu Alchajmerove bolesti. Na Sl. 52A, nivo Aβ je značajno smanjen kod miševa koji su primili Konstrukt 6 u poređenju sa kontrolom. Na Sl. 52B, nivo tau je značajno smanjen kod miševa koji su primili Konstrukt 6 u poređenju sa kontrolom.

Slike 53A i 53B prikazuju rezultate eksperimenata, koji pokazuju sposobnost rs-g3p (N1 N2) -hIgG1-Fc (Konstrukta 6) za lečenje AD kada se daje sistemski, radije nego kao direktna injekcija u mozak. Sl. 53A i 53B prikazuju da su AD miševi koji su primili Konstrukt 6 imali smanjenu hiperaktivnost u odnosu na miševe kojima je data kontrola.

Slika 54 prikazuje rezultate eksperimenata, koji pokazuju sposobnost rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukta 6) za lečenje AD kada se primenjuje sistemski, a ne kao direktna injekcija u mozak. Na Sl.54, sposobnost AD miševa da kruže je smanjena kod miševa koji su primili Konstrukt 6 u poređenju sa kontrolom.

Slika 55 prikazuje rezultate eksperimenata, koji pokazuju sposobnost rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukta 6) za lečenje AD kada se daje sistemski, a ne kao direktna injekcija u mozak. Na Sl. 55, ugaono skakanje AD miševa je značajno smanjeno kod miševa koji su primili Konstrukt 6 u poređenju sa kontrolom.

Slika 56 prikazuje rezultate eksperimenata koji pokazuju sposobnost rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukta 6) za lečenje AD kada se daje sistemski, a ne kao direktna injekcija u mozak. Na Sl. 56, AD miševi koji primaju Konstrukt 6 ispoljavaju značajno više spontanih promena ulazaka na krake u Y-lavirintu u odnosu na miševe koji primaju kontrolni PBS.

KRATAK OPIS SEKVENCI

OPIS REALIZACIJA

[0010] Pronalazak obezbeđuje fuzione proteine, koji sadrže fragment g3p, koji vezuje amiloid ili njegov mutant ili varijantu. Fuzioni proteini prema pronalasku dalje sadrže Fc fragment od konstantnog regiona imunoglobulina. U jednom aspektu ovih realizacija, fuzioni proteini su rastvorljivi. U drugom aspektu ovih realizacija, fuzioni proteini smanjuju amiloid pomoću, na primer, razgrađivanja i / ili sprečavanja ili inhibiranja agregacije amiloida (npr., amiloidnog plaka). Fuzioni proteini prema pronalasku se vezuju za amiloid. U nekim realizacijama, fuzioni proteini pronalaska uklanjaju i / ili inhibiraju stvaranje toksičnih oligomera.

[0011] Pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije fuzionih proteina prema pronalasku, za upotrebu u terapiji, kao i za njihovu upotrebu da vezuju i smanjuju amiloid. Smanjenje amiloida obuhvata, na primer, razgradnju amiloida, sprečavanje i / ili inhibiranje agregacije amiloida i uklanjanje i / ili sprečavanje stvaranja toksičnih oligomera. Obuhvaćena je upotreba preparata za otkrivanje depozita amiloida i dijagnostikovanje bolesti i poremećaja koje karakteriše amiloid.

Definicije

[0012] Izraz "g3p" kada se koristi sam ili u izrazima kao što su "g3p-izveden" odnosi se na bilo koji divlji tip ili rekombinantni g3p protein filamentoznog faga (uključujući fragmente, varijante i mutante g3p-a). Izraz ne treba tumačiti kao ograničen na g3p, koji je izveden iz bilo kog određenog filamentoznog bakteriofaga. Kao primer, izraz "g3p" uključuje SEK ID BR: 1 i srodne proteine prikazane na Slici 2.

[0013] Izraz "domen" označava region polipeptida (uključujući proteine), koji ima karakterističnu fizičku osobinu ili ulogu, uključujući na primer nezavisno presavijenu strukturu sastavljenu od jednog dela polipeptidnog lanca. Domen može sadržati sekvence karakterističnih fizičkih osobina polipeptida ili može sadržati fragment od fizičke osobine koja zadržava svoje karakteristike vezivanja (tj., može se vezati za drugi domen). Domen može biti povezan sa drugim domenom. Drugim rečima, prvi domen se može prirodno vezati za drugi domen. Na primer, domen g3p N2 vezuje F-piIi, a domen g3p N1 vezuje TolA.

[0014] Izrazi "amiloid", "amiloidni fibrili" i "amiloidna vlakna", kako se ovde koriste, su generički izrazi za tercijarnu strukturu, koja se formira agregacijom bilo kog od nekoliko različitih proteina i koja se sastoji od uređenog rasporeda β ploča složenih okomito na osovinu vlakana. Sunde i sar., J. Μοl. Biol. (1997) 273: 729-39. Jedan amiloid iz primera je agregat amiloid-β nastao u Alchajmerovoj bolesti, koji je sastavljen od beta-amiloidnog peptida "βΑ", koji su 39-43 aminokiselinski unutrašnji fragmenti, koji se cepaju iz humanog amiloidnog prekursorskog proteina (hAPP). Postoje kratki oblici, kao Αβ40 i duge forme, kao što su više fibrilogenični Αβ izoform, Αβ42. Ostali primeri amiloidnih proteina uključuju nepravilno savijen α-sinuklein (povezan sa Parkinsonovom bolešću), huntingtin (povezan sa Huntingtonovom bolešću), tau (povezan, sa Alchajmerovom bolešću) i abnormalnom konformacijom prionskog proteina PrP<Sc>. Dodatni primeri su navedeni u celom opisu i poznati su stručnjacima u tehnici (videti, na primer, Aguzzi (2010), i Eichner i Radford, Mol. Cell (2011) 43: 8-18). Stoga, ukoliko nije specificiran protein ili peptid, upotreba izraza "amiloid", "amiloidni fibrili" ili "amiloidna vlakna" ne treba tumačiti kao ograničene na bilo koji poseban protein ili bolest.

[0015] Izraz "fragment za vezivanje amiloida g3p" se odnosi na fragment g3p, koji održava sposobnost vezivanja za amiloid. Izraz "Vezujući fragment amiloida g3p" se takođe odnosi na mutante i varijante g3p-a, uključujući N-, C-, ili N- i C-terminalna skraćivanja g3p-a, koja održavaju sposobnost vezivanja za amiloid.

[0016] Izraz "beta amiloidni peptid" je sinonim za "β-amiloidni peptid", "βAP," "βΑ" i "Αβ". Svi ovi izrazi se odnose na peptid koji formira amiloid izveden iz humanog amiloidnog prekursorskog proteina (hAPP).

[0017] Fuzioni proteini prema pronalasku ili kompozicije, koje sadrže one fuzione proteine opisane kao "razgrađujuće" ili "posrednike u razgradnji" smanjuju agregate koji su već formirani. Dezagregacija se može meriti pomoću testa filtera klopke. Wanker i sar., Method Enzymol (1999) 309: 375-86. Test filtera klopke je ovde opisan i može se koristiti i za detekciju agregata i za praćenje razgradnje posredovane kompozicijama iz ovog pronalaska. Dezagregacija se detektuje kao smanjeno zadržavanje amiloida na filteru, što je pokazano smanjenjem u bojenju, u prisustvu povećanih koncentracija razlagajućeg agensa.

[0018] Kao što je ovde korišćeno, fuzioni protein ili preparat koji "smanjuje amiloid" ili "smanjuje amiloidno opterećenje", čini jedan ili više od sledećih: inhibira nastanak amiloida, uzrokuje razgradnju amiloida, promoviše klirens amiloida, inhibira agregaciju amiloida, blokira i / ili sprečava formiranje toksičnih amiloidnih oligomera i / ili promoviše klirens toksičnih amiloidnih oligomera.

[0019] Svaki od proizvoda ili kompozicija iz ovog pronalaska opisan kao "zaštita neurona od amiloidnog oštećenja" sprečava akumulaciju novog amiloida i / ili sprečava nastanak toksičnih amiloidnih oligomera. Proizvodi ili preparati pronalaska opisani kao "zaštita neurona od amiloidnih oštećenja" mogu se uzimati profilaktički. Bez obzira da li ili ne proizvod ili sastav štiti neurone od amiloidnog oštećenja, koje se može meriti analizom citotoksičnosti kulture neuronskih ćelija, ovde opisanih.

[0020] Kao što se ovde koristi, "PrP protein", "PrP" i "prion" se odnose na polipeptide, koji su sposobni pod odgovarajućim uslovima, za indukciju formiranja agregata odgovornih za bolesti nepravilnog uvijanja proteina. Na primer, normalni ćelijski prionski protein (PrP<c>) se konvertuje u takvim uslovima u odgovarajuću izoformu scrapIe (PrP<Sc>) koja je odgovorna za bolesti kao što su, ali ne ograničavajući se na, goveđu spongiformnu encefalopatiju (BSE) ili bolest ludih krava, mačje spongiformne encefalopatije, kuru, Creutzfeldt-Jakobovu bolest (CJD), Gerstmann-Straussler-Scheinkerovu bolest (GSS) i fatalnu familijarnu nesanicu (FFI).

[0021] Izraz "varijanta", koji se ovde koristi u vezi sa fuzionim proteinom ili vezujućim fragmentom amiloida od g3p dela fuzionog proteina, odnosi se na odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu, koja sadrži najmanje jednu aminokiselinsku razliku (supstituciju, umetanje ili deleciju) u odnosu na referentnu supstancu. U određenim izvođenjima "varijanta" ima visoku homologiju aminokiselinske sekvence i / ili konzervativne aminokiselinske supstitucije, delecije i / ili umetanja u odnosu na referentnu sekvencu. U nekim realizacijama varijanta nema više od 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 aminokiselinskih razlika, kao što je poređeno u odnosu na referentnu sekvencu. "Konzervativna supstitucija" se odnosi na zamenu prve amino kiseline sa drugom aminokiselinom, koja ne menja značajno hemijske, fizičke i / ili funkcionalne osobine proteina, polipeptida ili aminokiselinske sekvence, kao što je npr. g3p protein ili vezujući fragment amiloida g3p (npr., g3p protein ili vezujući fragment amiloida zadržava isti naboj, strukturu, polaritet, hidrofobnost / hidrofilnost, i / ili čuva funkcije, kao što je sposobnost prepoznavanja, vezivanja i / ili smanjenja amiloida). Takve konzervativne modifikacije aminokiselina se zasnivaju na relativnoj sličnosti aminokiselinskih supstituenata bočnih lanaca, na primer, njihove hidrofobnosti, hidrofilnosti, naelektrisanja, veličine i slično. Primerne konzervativne supstitucije, koje uzimaju u obzir razne prethodne karakteristike su dobro poznate stručnjacima u tehnici i uključuju: arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leucin i izoleucin. Izrazi "g3p varijanta" ili "varijanta vezujućeg fragmenta amiloida od g3p-a" takođe obuhvataju polipeptide, koji imaju najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 78%, najmanje 80%, najmanje 82%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa divljim tipom g3p ili njegovim odgovarajućim fragmentom.

[0022] Izraz "mutant" se odnosi na fuzioni protein ili fragment g3p fuzionog proteina, koji vezuje amiloid, koji je mutiran u jednoj ili više aminokiselina, kako bi se modulisala njegova terapeutska ili dijagnostička efikasnost. U određenim realizacijama, mutant sadrži supstituciju, deleciju i / ili umetanje na amino, koji je poznat da stupa u interakciju sa amiloidom. U drugim realizacijama, mutant sadrži supstituciju, deleciju i / ili umetanje na amino koji je očuvana aminokiselina prisutna u g3p-u divljeg tipa ili njegovom vezujućem fragmentu amiloida. U nekim realizacijama mutant nema više od 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 aminokiselinskih razlika u poređenju sa referentnom sekvencom. U nekim realizacijama, aminokiselinske supstitucije su konzervativne supstitucije. Izrazi "varijanta" i "mutant" koriste se ovde izmenično, osim što je "varijanta" obično nerekombinantna u prirodi, dok je "mutant" obično rekombinantan. Izrazi "mutant g3p" ili "mutant amiloid vezujućeg fragmenta g3p", takođe obuhvataju polipeptide koji imaju najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 78%, najmanje 80%, najmanje 82%, najmanje 85% , najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95% , najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa divljim tipom g3p ili njegovim odgovarajućim fragmentom.

[0023] "Fuzioni protein" je protein koji nije prisutan u prirodi, koji sadrži najmanje dva polipeptidna domena. Fuzioni proteini prema pronalasku sadrže fragment g3p, koji vezuje amiloid, povezan, spojen ili konjugovan sa drugim proteinom ili polipeptidom. U specifičnim realizacijama, fuzioni proteini sadrže amiloid-vezujući fragment g3p i Fc fragment imunoglobulina.

[0024] Izrazi "aktivna jedinjenja", "aktivno sredstvo" i "aktivni sastojak" se ovde koriste izmenično, s tim da se odnose na deo fuzionog proteina, koji obezbeđuje biološku aktivnost fuzionog proteina. g3p deo fuzionih proteina prema pronalasku je "aktivno jedinjenje", "aktivno sredstvo" ili "aktivni sastojak". Slično tome, g3p deo fuzionih proteina iz pronalaska je biološki aktivan ili terapeutski efikasan deo. g3p deo fuzionog proteina iz predmetnog pronalaska se ne koristi da bi se olakšalo preklapanje proteina fuzionog partnera, koji zatim deluje kao terapeutski agens koji nije povezan sa g3p, kao što je opisano u WO 2004/018685. Niti se fuzioni proteini iz pronalaska koriste za prikaz faga, kao što je opisano u US 2009/ 105090.

[0025] Izraz "imunogeni" se ovde koristi za označavanje sposobnosti preparata da izazove imunološki odgovor kod sisara, koji je bio izložen preparatu.

[0026] Kao što se ovde koristi, "Konstrukt 1" je izveden iz divljeg tipa M13 (pogledati Genbank datoteku: NC_003287.2, verzija GI: 56718463. U Konstruktu 1, u poređenju sa divljim tipom M13, Ser378 (AGC) je promenjen u Gli(GGC), i Ile87 (ATT) je promenjen u Asn (AAC). Stoga, dok kod divljeg tipa M13 postoji "G" kod nukleinske kiseline broj 2710, u Konstruktu 1 na ovoj poziciji postoji "A". Isto tako, kod divljeg tipa M13 postoji "A" kod nukleinske kiseline broj 4479, u Konstruktu 1 postoji "T" na ovoj poziciji. Konačno, kod divljeg tipa M13 postoji "C" kod nukleinske kiseline broj 4480, dok je kod Konstrukta 1 na ovoj poziciji "T". Konstrukt 1 sadrži nukleinske kiseline SEK ID BR: 10.

[0027] "Konstrukt 2" je izolovani M13 divljeg tipa (GenBank JX412914.1). Konstrukt 2 sadrži nukleinske kiseline SEK ID BR: 12.

[0028] "Konstrukt 3" je rekombinantni rastvorljivi g3p fragment, koji sadrži domene N1 i N2 g3p (rs-g3p (N1 N2)), koji sadrže aminokiseline SEK ID BR: 20.

[0029] "Konstrukt 4" je rekombinantni rastvorljivi g3p fragment IgG4 Fc fuzionog proteina (rs-g3p (N1 N2)-hIgG4-Fc), koji sadrži aminokiseline SEK ID BR: 9. Region N1 N2 "Konstrukta 4" izveden je iz regiona N1 N2 "Konstrukta 1". "Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira "Konstrukt 4 "je navedena u SEK ID BR: 26.

[0030] Prvih 21 aminokiselina navedenih u SEK ID BR: 9 predstavljaju signalnu sekvencu, koja se cepa između aminokiselina 20 i 21, tokom rekombinantne proizvodnje. Metionin u aminokiselini 21 od SEK ID BR: 9 je artefakt kloniranja (kodiran sa više mesta za kloniranje, koji se koristi za spajanje signalne sekvence u sekvencu N1-N2) i ponekad se takođe cepa tokom rekombinantne proizvodnje. Alanin u aminokiselini 22 od SEK ID BR: 9 odgovara N-terminalnoj amino kiselini g3p, izolovanoj iz M13 faga. Alanin u aminokiselini 22 iz SEK ID BR: 9 ponekad se takođe cepa tokom rekombinanta. C-terminalni lizin u aminokiselini 506 od SEK ID BR: 9 takođe se ponekad odvaja tokom rekombinantne proizvodnje u eukariotskim ćelijama. Proizvodi koji sadrže jednu ili više od gore identifikovanih N- i C-terminalnih delecija su deo sadašnjeg pronalaska.

[0031] Stoga, u nekim realizacijama, g3p fuzioni protein opisan kao "Konstrukt 4" je "Zreli oblik Konstrukta 4" i sadrži aminokiselinu 21-506 od SEK ID BR: 9. U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 22-506 od SEK ID BR: 9 ("N-terminalni Met-odsečeni zreli oblik Konstrukta 4"). U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 23-506 iz SEK ID BR: 9 ("N-terminalni Met-Ala-odsečeni zreli oblik Konstrukta 4"). U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 21-505 SEK ID BR: 9 ("C-terminalni Lis-skraćeni zreli oblik Konstrukta 4"). U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 22-505 iz SEK ID BR: 9 ("N-terminalni Met-skraćeni, C-terminalni Lis-skraćeni zreli oblik Konstrukta 4"). U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 23-505 iz SEK ID BR: 9 ("N-terminalni Met-Ala-skraćeni, C-terminalni Lisskraćeni zreli oblik Konstrukta 4").

[0032] Slično, obuhvaćene su nukleinske kiseline koje kodiraju celokupnu dužinu, N-, C- i N- i C- terminalne skraćene oblike Konstrukta 4, kako je ovde opisano. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina koja kodira g3p fuzioni protein sadrži nukleotide iz SEK ID BR: 26. U drugim realizacijama, nukleinska kiselina koja kodira g3p fuzioni protein je deo SEK ID BR: 26, koja kodira g3p deo ili deo g3p-Ig, isključujući nukleotide koji kodiraju signalnu sekvencu (tj. isključujući nukleotide koji kodiraju aminokiseline 1-20, 1-22 ili 1-23 iz SEK ID BR: 9).

[0033] "Konstrukt 5" je rekombinantni rastvorljivi g3p fragment IgG4 Fc fuzionog proteina (rs-g3p (N1 N2)-hIgG4-Fc), koji sadrži aminokiseline iz SEK ID BR: 11. Region N1 N2 "Konstrukta 5" izveden je iz regiona N1 N2 "Konstrukta 2". Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira "Konstrukt 5" je navedena u SEK ID BR: 27.

[0034] Prvih 21 aminokiselina navedenih u SEK ID BR:11 predstavljaju signalnu sekvencu, koja se cepa između aminokiselina 20 i 21, tokom rekombinantne proizvodnje. Metionin u aminokiselini 21 od SEK ID BR: 1 je artefakt kloniranja (kodiran sa više mesta za kloniranje, koji se koristi za spajanje signalne sekvence u sekvencu N1-N2) i ponekad se takođe cepa tokom rekombinantne proizvodnje. Alanin u aminokiselini 22 od SEK ID BR: 11 odgovara N-terminalnoj amino kiselini g3p-a izolovanoj iz M13 faga. Alanin u aminokiselini 22 od SEK ID BR: 11 se ponekad takođe razdvaja tokom rekombinantne proizvodnje. C-terminalni lizin u aminokiselini 506 od SEK ID BR: 11 se takođe ponekad odvaja tokom rekombinantne proizvodnje. Proizvodi koji sadrže jednu ili više od gore identifikovanih N- i C-terminalnih delecija su deo sadašnjeg pronalaska.

[0035] Prema tome, u jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein opisan kao "Konstrukt 5" je "Zreli oblik Konstrukta 5" i sadrži aminokiseline 21-506 SEK ID BR: 11. U nekim realizacijama g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 22-506 SEK ID BR: 11 ("N-terminalni Met-skraćeni zreli oblik Konstrukta 5"). U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 23-506 SEK ID BR:11 ("N-terminalni Met-Ala-skraćeni zreli oblik Konstrukta 5"). U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 21-505 SEK ID BR: 11 ("C-terminalni Liz-skraćeni zreli oblik Konstrukta 5"). U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 22-505 SEK ID BR: 11 ("N-terminalni Met-skraćeni, C-terminalni Liz-skraćeni zreli oblik Konstrukta 5"). U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 23-505 SEK ID BR: 11 ("N-terminalni Met-Ala-skraćeni, C-terminalni Lizskraćeni zreli oblik Konstrukta 5").

[0036] Isto tako, obuhvaćene su nukleinske kiseline koje kodiraju celokupnu dužinu, N-, C- i N- i C- terminalne skraćene oblike Konstrukta 5, kako je ovde opisano. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina, koja kodira fuzioni protein g3p sadrži nukleotide SEK ID BR: 27. U drugim izvođenjima, nukleinska kiselina, koja kodira g3p fuzioni protein je deo SEK ID BR: 27, koja kodira deo g3p ili deo g3p-Ig, isključujući nukleotide koji kodiraju signalnu sekvencu (tj. isključujući nukleotide koji kodiraju aminokiseline 1-20, 1-22 ili 1-23 SEK ID BR: 11).

[0037] "Konstrukt 6" je rekombinantni rastvorljivi G3p fragment IgG1 Fc fuzionog proteina (rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc), koji sadrži aminokiseline od SEK ID BR: 13. Region N1 N2 "Konstrukta 6" izveden je iz regiona N1 N2 "Konstrukta 2". "Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira "Konstrukt 6" je navedena u SEK ID BR: 28.

[0038] Prvih 21 aminokiselina navedenih u SEK ID BR: 13 predstavljaju signalnu sekvencu koja se cepa između aminokiselina 20 i 21 tokom rekombinantne proizvodnje. Metionin u aminokiselini 21 SEK ID BR: 13 je artefakt kloniranja (kodiran sa više mesta za kloniranje, koji se koristi za fuziju signalne sekvence u sekvencu N1-N2) i ponekad se takođe cepa tokom rekombinantne proizvodnje. Alanin u aminokiselini 22 od SEK ID BR: 13 odgovara N-terminalnoj aminokiselini g3p-a, izolovanoj iz M13 faga. Alanin u aminokiselini 22 iz SEK ID BR: 13 se ponekad takođe razdvaja tokom rekombinantne proizvodnje. C-terminalni lizin u aminokiselini 509 od SEK ID BR: 13 se takođe ponekad cepa tokom rekombinantne proizvodnje. U rekombinantnoj proizvodnji antitela i povezanih fuzionih proteina uklanjanje C-terminalnog lizina nije neuobičajeno (J Lou i sar., Biotechnol Bioeng 2012 Sep; 109 (9): 2306-15). Proizvodi koji sadrže jednu ili više gore identifikovanih N- i C-terminalnih delecija su deo sadašnjeg pronalaska,

[0039] Stoga, u nekim realizacijama, g3p fuzioni protein opisan kao "Konstrukt 6" je "zreli oblik Konstrukta 8", koji obuhvata aminokiseline 21-509 SEK ID BR: 13. U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 22-509 SEK ID BR: 13 ("N-terminalni Met-skraćeni zreli oblik Konstrukta 6"). U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 23-509 od SEK ID BR: 13 ("N-terminalni Met-Ala-skraćeni zreli oblik Konstrukta 6"). U nekim realizacijama g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 21-508 od SEK ID BR: 13 ("C-terminalni Lis-skraćeni zreli oblik Konstrukta 6"). U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 22-508 iz SEK ID BR: 13 ("N-terminalni Met-skraćeni, C-terminalni Liz-skraćeni zreli oblik Konstrukta 6"). U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 23-508 iz SEK ID BR: 13 ("N-terminalni Met-Ala-skraćeni, C-terminalni Liz-skraćeni zreli oblik Konstrukta 6").

[0040] Isto tako, obuhvaćene su nukleinske kiseline, koje kodiraju celokupnu dužinu, N-, C- i N- i C-terminalne skraćene oblike Konstrukta 6, kako je ovde opisano. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina koja kodira g3p fuzioni protein sadrži nukleotide od SEK ID BR: 28. U drugim realizacijama, nukleinska kiselina koja kodira g3p fuzioni protein je deo SEK ID BR: 28, koja kodira deo g3p ili deo g3p-Ig, isključujući nukleotide koji kodiraju signalnu sekvencu (tj. isključujući nukleotide koji kodiraju aminokiseline 1-20, 1-22 ili 1-23 od SEK ID BR: 13).

[0041] "Konstrukt 8" je rekombinantni rastvorljivi g3p fragment IgG1 Fc fuzionog proteina (rs-g3p (If1 N1 N2)-hIgG1-Fc), koji sadrži aminokiseline od SEK ID BR: 31. G3p regioni "Konstrukta 8" su izvedeni iz If 1. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira "Konstrukt 8" je navedena u SEK ID BR: 32.

[0042] SEK ID BR: 31 je niže navedena i prikazuje aminokiseline Konstrukta 8. N1 domen g3p-a je iz If1, izuzev ako određeni If1 faga ima promenu cisteina (C) do triptofana (W), kao što je naznačeno pomoću osvetljenog/uokvirenja ispod, a dok je niže prikazano, prvih 21 aminokiselina koje odgovara sekretornoj sekvenci IL2, koja je deo pFUSE Ig-fuzionog vektora od Invivogena. Sledeći deo aminokiselina je u boldu i podvučen, a odgovara g3p N1 domenu If1. Zabeleška da je promena aminokiseline C→W osvetljena i uokvirena. Sledeći deo aminokiselina, koji je podvučen je linker sekvenca koja se nalazi između domena N1 i N2 g3p If1. N2 domen g3p-a iz If1 je u kurzivu. N2 domen g3p-a je praćen drugom linker sekvencom koja u If1 povezuje domene N2 i N3 (prikazano kurzivom i podvučeno). Konačno, boldirane, u kurzivu i podvučene amino kiseline su IgG1-Fc sekvence iz pFUSE vektora.

(SEK ID BR:31 (Aminokiselina Konstrukta 8))

[0043] Prvih 21 aminokiselina navedenih u SEK ID BR: 31 predstavljaju signalnu sekvencu, koja se razdvaja između aminokiselina 20 i 21, tokom rekombinantne proizvodnje. Metionin u aminokiselini 21 od SEK ID BR: 31 je artefakt kloniranja (kodiran sa više mesta za kloniranje korišćenih za fuziju signalne sekvence u N1-N2 sekvencu) i ponekad se takođe razdvaja tokom rekombinantnog postupka. Alanin u aminokiselini 22 iz SEK ID BR: 31 odgovara N-terminalnoj aminokiselini g3p-a izolovanoj iz M13 faga. Alanin u aminokiselini 22 od SEK ID BR: 31 se ponekad takođe, razdvaja tokom rekombinantne proizvodnje. C-terminalni lizin u aminokiselini 528 od SEK ID BR: 31 je takođe ponekad razdvojen tokom rekombinantne proizvodnje. U rekombinantnoj proizvodnji antitela i povezanih fuzionih proteina uklanjanje C-terminalnog lizina nije neuobičajeno (J Lou i sar., Biotechnol Bioeng 2012 Sep; 109 (9): 2308-15). Proizvodi koji sadrže jednu ili više gore identifikovanih N- i C-terminalnih delecija su deo sadašnjeg pronalaska.

[0044] Stoga, u nekim realizacijama, g3p fuzioni protein opisan kao "Konstrukt 8" je "zreli oblik Konstrukta 8" i sadrži aminokiseline 21-528 od SEK ID BR: 31. U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 22-528 od SEK ID BR: 31 ("N-terminalni Met-skraćeni zreli oblik Konstrukta 8"). U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 23-528 od SEK ID BR: 31 ("N-termininalni Met-Ala-skraćeni zreli oblik Konstrukta 8 "). U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 21-527 od SEK ID BR: 31 ("C-terminalni Liz-skraćeni zreli oblik Konstrukta 8"). U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 22-527 od SEK ID BR: 31 ("N-terminalni Met-skraćeni, C-terminalni Liz-skraćeni zreli oblik Konstrukta 8"). U nekim izvođenjima, g3p fuzioni protein sadrži aminokiseline 23-527 od SEK ID BR: 31 ("N-terminalni Met-Alaskraćeni, C-terminalni Liz-skraćeni zreli oblik Konstrukta 8"). Sekvenca nukleinske kiseline, koja kodira " Konstrukt 8 " je navedena u SEK ID BR: 32.

[0045] Obuhvaćene su nukleinske kiseline koje kodiraju celokupnu dužinu, N-, C- i N- i C-terminalne skraćene oblike Konstrukta 8, kako je ovde opisano. U jednom realizaciji, nukleinska kiselina koja kodira g3p fuzioni protein, sadrži nukleotide od SEK ID BR: 32. U drugim realizacijama, nukleinska kiselina koja kodira g3p fuzioni protein je deo od SEK ID BR: 32, koja kodira deo g3p ili deo g3p-Ig, isključujući nukleotide koji kodiraju signalnu sekvencu (tj. isključujući nukleotide koji kodiraju aminokiseline 1-20, 1-22 ili 1-23 od SEK ID BR: 31).

[0046] Konstrukti 4, 5, 6, kao i njihovi mutanti i varijante, su primerni g3p fuzioni proteini iz pronalaska.

G3p Fuzioni proteini

[0047] G3p fuzioni proteini prema pronalasku sadrže g3p vezujući fragment amiloida, koji je aktivno sredstvo, aktivni sastojak, aktivno jedinjenje, biološki aktivan deo, terapeutski efikasan deo i / ili farmaceutski efikasan deo svake fuzije. Fuzioni proteini koji sadrže mutanat, varijantu i fragment g3p-a su obuhvaćeni pronalaskom. U jednom aspektu, g3p fuzioni protein sadrži fragment g3p-a, koji se vezuje za amiloid. U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein iz ovog pronalaska sadrži g3p N1 N2 domen ili mutanta, varijantu ili njegov fragment, pri čemu je fragment vezivanja amiloida od g3p-a povezan, spojen, konjugovan, kuplovan ili udružen sa najmanje jednim proteinom koji nije g3p. U fuzionim proteinima prema pronalasku, protein koji nije g3p je Fc fragment imunoglobulina. G3p deo fuzionog proteina nije obezbeđen radi lakšeg preklapanja proteina od terapeutskog fuzionog partnera, kao što je opisano u WO 2004/018685, ili za prikaz faga kao što je opisano u US 2009/105090.

[0048] U drugim aspektima, fuzioni protein sadrži g3p polipeptid, koji se vezuje za amiloid i sadrži g3p N2 domen ili mutanta, varijantu, ili fragment, pri čemu je fragment vezivanja amiloida od g3p-a povezan, spojen, konjugovan, kuplovan ili udružen sa najmanje jednim proteinom koji nije g3p. U fuzionim proteinima iz pronalaska, protein koji nije g3p je Fc fragment imunoglobulina. U još nekim aspektima, fuzioni protein sadrži g3p polipeptid koji se vezuje za amiloid i sadrži domen g3p N1 N2, pri čemu g3p N2 domen sadrži mutanta, varijantu ili fragment g3p N2, koji stabilizuje g3p N1 domen, ili na drugi način postavlja g3p N2 domen u konformaciju koja je podesna za vezivanje g3p.

[0049] G3p deo fuzionog proteina je povezan, spojen, konjugovan, kuplovan ili udružen sa / na najmanje jedan dodatni protein ili proteinski domen sa kojim nije obično povezan. Protein koji nije g3p deo od g3p fuzionog proteina prema pronalasku sadrži Fc fragment imunoglobulina. U jednoj realizaciji, fuzioni protein je g3p fuzioni protein, koji sadrži vezujući fragment amiloida od g3p-a povezanog sa drugim domenom koji sadrži Fc fragment imunoglobulina. U drugoj realizaciji, fuzioni protein se sastoji od amiloid-vezujućeg fragmenta g3p proteina povezanog sa Fc fragmentom imunoglobulina. Kao što je napomenuto, neki fuzioni proteini prema pronalasku sadrže mutirani ili varijantni amiloid- vezujući fragment g3p, kao što je mutirani ili varijantni domen N1 N2 ili domen N2, koji vezuje amiloidna vlakna. Stoga, fuzioni proteini koji sadrže ove mutirane ili varijantne oblike su takođe deo sadašnjeg pronalaska.

[0050] Vezujući fragment amiloida od g3p-a i polipeptid fuzionog partnera mogu biti deo kontinualne aminokiselinske sekvence sa polipeptidom fuzionog partnera, koji je vezan direktno ili preko kratkog peptidnog linkera bilo na N terminusu ili na C terminusu g3p-a ili polipeptida vezujućeg fragmenta amiloida. U takvim slučajevima, vezujući fragment amiloida od g3p-a i polipeptid fuzionog partnera mogu se prevesti kao jedan polipeptid iz kodirajuće sekvence, koja kodira i amiloid vezujući fragment g3p i polipeptid fuzionog partnera.

A. G3p delovi g3p fuzionih proteina

[0051] G3p ima dva amino-terminalna domena, N1 i N2, koji međusobno intereaguju da bi formirali kompleks N1-N2 i jedan karboksi-terminalni domen, N3 (takođe nazvan "CT"). Šarka omogućava otvaranje i zatvaranje između N1 i N2. Ponekad se šarka smatra delom N2, dok se u drugim slučajevima tretira kao poseban element. N1 i N2 su takođe povezani fleksibilnom linker sekvencom, koja je bogatom glicinom. U okviru N1, postoje dva disulfidna mosta između Cis7 i Cis36 i između Cis46 i Cis53. Postoji jedan disulfidni most u N2, između Cis188 i Cis201. U karboksi terminalnom domenu se nalazi disulfidni most između Cis354 i Cis371. Marvin, 1998. U g3p-u ne postoje interdomeni disulfidnih mostova.

[0052] Primeri vezujućih fragmenata amiloida od g3p-a uključuju domen N2 bilo sa šarkom ili bez šarke; i domene N1-N2, sa ili bez intervencije sekvence linkera, i sa ili bez šarke. U bilo kom od gore navedenih primera, N2 ili N1 N2 fragmenti mogu biti N2 ili N1 N2, koji se nalaze u divljem tipu filamentoznog bakteriofaga ili rekombinantnom N2 ili N1 N2. U bilo kom od prethodnih primera, fragmenti N2 ili N1 N2 fragmenti mogu biti mutanti ili varijante sekvence filamentoznog bakteriofaga divljeg tipa.

[0053] Primarna struktura poravnanja N2 od: fd, f1, M13, Ike, I2-2 i If1 je prikazana kao slika 26. Aminokiseline fd prikazane su u SEK ID BR: 14; f1 u SEK ID BR: 15; M13 u SEK ID BR: 16; Ike u SEK ID BR: 17; I2-2 u SEK ID BR: 18; i If1 u SEK ID BR: 19. Koristeći ovu sliku i poravnanje kao smernicu, jedna realizacija pronalaska obuhvata g3p fuzioni protein, koji sadrži g3p polipeptid, koji se vezuje za amiloid i sadrži g3p N2 domen ili fragment g3p N2 domena. U nekim aspektima, domen g3p N2 stabilizuje amiloid vezujuće delove g3p-a u kompoziciji. Bilo koji g3p fuzioni protein, koji sadrži g3p N2 domene uključuje mutante, varijante i fragmente g3p N2. Fragment g3p N2 je bilo koji g3p N2 domen pune dužine sa najmanje jednim skraćivanjem na bilo kom ili oba N- ili C-završetka. G3p N2 polipeptidi su prikazani primerima aminokiselina iz SEK ID BR: 14, 15, 18, 17, 18 ili 19 i njihovih fragmenata, varijanti i mutanata.

[0054] Primarna struktura poravnanja fd, f1 i M13 je prikazana kao Sl. 2A, a Ike, I2-2 i If1 kao Sl. 2B. Koristeći ovo poravnanje kao smernicu, jedna realizacija pronalaska obuhvata fuzioni protein koji sadrži g3p polipeptid koji se vezuje za amiloid i sadrži g3p N1 N2 domen ili fragment g3p N1 N2 domena. G3p fuzioni protein koji sadrži g3p N1 N2 domene uključuje mutante, varijante i fragmente g3p N1 N2. Fragment g3p N1 N2 je bilo koji g3p N1 N2 pune dužine, koji ima najmanje jedno skraćivanje na bilo kojem ili oba N- ili C-završetka. G3p N1 N2 polipeptidi su prikazani primerima aminokiselina bilo kojih od SEK ID BR-a: 1-9, 11, 13, 20, 24 i 29-31, njihovih fragmenata, varijanti i mutanata.

B. Delovi g3p fuzionih proteina koji nisu g3p

[0055] Fuzioni proteini iz pronalaska mogu sadržati kao drugi domen Fc fragment konstantnog regiona imunoglobulina. Fuzioni proteini sastavljeni od konstantnih regiona imunoglobulina, koji su povezani sa proteinom od interesa ili njegovim fragmentom su opisani (videti, npr., US Patent broj 5,480,981 i 5,808,029; Gascoiqne i sar.

1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2934; Capon i sar. 1989, Nature 337: 525; Traunecker i sar. 1989, Nature 339: 68; Zettmeissl i sar. 1990, DNA Cell Biol. USA 9: 347; Byrn i sar.1990, Nature 344: 667; Watson i sar.1990, J. Gen. Biol.110: 2221; Watson i sar. 1991, Nature 349: 164; Aruffo i sar.1990, Cell 61: 1303; Linsley i sar. 1991, J. Exp. Med. 173: 721; Linsley i sar. 1991, J. Exp. Med. 174: 561; Stamenković i sar. 1991, Cell 68: 1133; Ashkenazi i sar. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535; Lesslauer i sar. 1991, Eur. J. Immunol. 27: 2883; Pepper i sar.1991, J. Exp. Med.174: 1483; Bennett i sar.1991, J. Biol. Chem.266: 23060; Kurschner i sar.1992, J. Biol. Chem. 267: 9354; Chalupny i sar. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10360; Ridgway i German, 1991, J. Cell. Biol. 115, Apstrakt br. 1448; Zheng i sar. 1995, J. Immune. 154: 5590). Ovi molekuli obično poseduju i biološku aktivnost povezanu sa vezanim molekulom od interesa, kao i efektorsku funkciju ili neke druge željene karakteristike povezane sa konstantnim regionom imunoglobulina (npr., biološka stabilnost, ćelijska sekrecija).

[0056] Fc ekspresione kasete se mogu kupiti komercijalno. Fc fragment se može sastojati od domena CH2 i CH3 imunoglobulina i zglobnog regiona imunoglobulina. Fc fragment može biti Fc fragment IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U jednoj specifičnoj realizaciji, deo konstantnog regiona imunoglobulina je Fc fragment IgG1. U drugoj realizaciji, deo konstantnog regiona imunoglobujina je Fc fragment IgG4. U još jednoj realizaciji, deo konstantnog regiona imunoglobulina je Fc fragment IgM.

[0057] Stoga, u jednoj realizaciji, rekombinantni rastvorljivi amiloid-vezujući fragment g3p je spojen sa Fc domenom imunoglobulina, korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Rekombinantni rastvorljivi amiloid-vezujući fragment g3p može biti mutiran ili variran. Na primer, fragment g3p, koji se vezuje za amiloid, kao što je domen N1 N2 ili domen N2, može biti kloniran u IgGFc fuzioni ekspresioni vektor. Primerni fuzijski vektori IgGFc uključuju, na primer, jedan od pFUSE-Fc vektora koji su dostupni od InvivoGen-a. U nekim izvođenjima, rezultujući dvovalentni (npr., g3p (N1 N2) - IgGFc ili g3p (N2)-IgGFc) fuzioni protein će imati veći aviditet za vezivanje amiloida od rekombinantnog rastvorljivog g3p, pošto je sada dvovalentan.

[0058] U drugim realizacijama, fuzioni protein sadrži najmanje dva amiloid-vezujuća fragmenta g3p. U drugim realizacijama, fuzioni protein sadrži tri ili više amiloid-vezujućih fragmenata g3p. U drugim realizacijama, fuzioni protein sadrži pet amiloid-vezujućih fragmenata g3p. Takvi dimerni i mulitimerni fuzioni proteini obezbeđuju interakcije većeg aviditeta, jer uključuju više od jednog amiloid-vezujućeg fragmenta g3p-a.

[0059] U određenim realizacijama, fuzioni protein sadrži albumin. Videti, na primer, Američki patent br.6,686,179.

C. Primeri g3p fuzionih proteina pronalaska

[0060] U nekim realizacijama fuzioni protein sadrži prvi domen, koji sadrži amiloid vezujući fragment g3p-a, a drugi domen sadrži protein koji nije g3p kao što je, na primer, Fc fragment imunoglobulina. Prvi domen, koji sadrži amiloid vezujući fragment g3p-a je aktivni sastojak i daje terapeutsku, biološku aktivnost fuzionom proteinu. U nekim aspektima, deo g3p fuzionog proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identična sa delom g3p iz SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili SEK ID BR: 31 ili bilo kojim od N, C ili N i C terminalnih skraćivanja SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili SEK ID BR: 31, ovde opisanih. U jednom aspektu ove realizacije, deo g3p fuzionog proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu, koja je identična delu g3p iz SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili SEK ID BR: 31. U drugim realizacijama, deo g3p može biti mutant, varijanta ili fragment, kao što je poređeno sa bilo kojim delom g3p navedenim u SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK D BR: 13 ili SEK ID BR: 31 i sposoban je da se vezuje za amiloid. U drugom aspektu, fuzioni protein je odabran od aminokiselina 21-506 iz SEK ID BR: 9, aminokiselina 22-506 iz SEK ID BR: 9, aminokiselina 23-506 iz SEK ID BR: 9, aminokiselina 21-505 iz SEK ID BR: 9, aminokiselina 22-505 iz SEK ID BR: 9, aminokiselina 23-505 iz SEK ID BR: 9, aminokiselina 21-506 iz SEK ID BR: 11, aminokiselina 22-506 iz SEK ID BR: 11, aminokiselina 23-506 iz SEK ID BR: 11, aminokiselina 21-505 iz SEK ID BR: 11, aminokiselina 22-505 iz SEK ID BR: 11, aminokiselina 23-505 iz SEK ID BR: 11, aminokiselina 21-509 iz SEK ID BR: 13, aminokiselina 22-509 iz SEK ID BR: 13, aminokiselina 23-509 iz SEK ID BR: 13, aminokiselina 21-508 iz SEK ID BR: 13, aminokiselina 22-508 iz SEK ID BR: 13, aminokiselina 23-508 iz SEK ID BR: 13, aminokiselina 21-528 iz SEK ID BR: 31, aminokiselina 22-528 iz SEK ID BR: 31, aminokiselina 23-528 iz SEK ID BR: 31, aminokiselina 21-527 iz SEK ID BR: 31, aminokiselina 22-527 iz SEK ID BR: 31 ili aminokiselina 23-527 iz SEK ID BR: 31, ili je mutant ili varijanta bilo kog od ovih fuzionih proteina.

[0061] U još jednom aspektu, deo g3p fuzionog proteina je mutant g3p, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu, koja ima od 1 do 20 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajućim delom g3p bilo koje od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili SEK ID BR: 31, pri čemu je fuzioni protein manje imunogen kod čoveka od njegovog nemodifikovanog suprotnog dela. U nekim aspektima ovih realizacija, fuzioni protein ima od 1 do 10 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajući delom g3p bilo koje od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID Br: 13 ili SEK ID BR: 31. U drugim aspektima, fuzioni protein ima od 1 do 5 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajućim g3p delom bilo koje od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili SEK ID BR: 31 . U još nekim aspektima, supstitucije aminokiselina su prisutne u g3p delu fuzionog proteina (npr. aminokiseline 21, 22 ili 23 do 238 od SEK ID NO: 9, aminokiseline 21, 22 ili 23 do 238 od SEK ID BR: 11, aminokiseline 21, 22, ili 23 do 238 od SEK ID BR: 13 ili aminokiseline 21, 22, ili 23 do 296 od SEK ID BR: 31).

[0062] U drugim realizacijama, manje imunogeni fuzioni protein je varijanta aminokiselina 21, 22 ili 23 do 505 ili 506 od SEK ID BR; 9, aminokiselina 21, 22 ili 23 do 505 ili 506 od SEK ID BR : 11, aminokiselina 21, 22 ili 23 do 508 ili 509 od SEK ID BR: 13 ili aminokiselina 21, 22 ili 23 do 527 ili 528 od SEK ID BR: 31, pri čemu se varijanta razlikuje od navedene aminokiselinske sekvence samo sa 1 do 20 aminokiselinskih supstitucija u regionu aminokiselina 22 ili 23 do 238 od SEK ID BR: 9, aminokiselina 22 ili 23 do 238 od SEK ID BR: 11, aminokiselina 22 ili 23 do 238 od SEK ID BR: 13 ili aminokiselina 22 ili 23 do 296 od SEK ID BR: 31, respektivno. U nekim aspektima ovih realizacija, fuzioni protein ima od 1 do 10 aminokiselinskih supstitucija. U drugim aspektima, fuzioni protein ima od 1 do 5 aminokiselinskih supstitucija.

[0063] Manje imunogeni fuzioni proteini, gore navedeni, mogu se identifikovati korišćenjem dobro poznatih procesa deimunizacije. Tipično, g3p delovi fuzionih proteina se pretražuju kako bi se utvrdilo gde sadrže T-ćelijske epitope. Takvi potencijalni T-ćelijski epitopi se obično definišu kao bilo koja sekvenca aminokiselinskog ostatka sa sposobnošću vezivanja za MHC molekule klase II. U drugim izvođenjima, ceo fuzioni protein se pretražuje za T-ćelijske epitope.

[0064] U ovoj oblasti tehnike su obezbeđene metode koje omogućavaju otkrivanje T-ćelijskih epitopa, pomoću računarskih sredstava za skeniranje prepoznatljivih motiva sekvence u eksperimentalno određenim T-ćelijskim epitopima ili alternativno, korišćenjem računarskih tehnika za predviđanje vezujućih peptida MHC klase II i posebno DR-vezujućih peptida. Na primer, W098/52976 i WO00/3431 podučavaju računarske pristupe navođenja za identifikaciju polipeptidnih sekvenci sa potencijalom vezivanja podskupa humane MHC klase 11 DR alotipova. WO08/044032 podučava skrining primarne aminokiselinske sekvence nasuprot baze poznatih T-ćelijskih epitopa za identifikaciju T-ćelijskih epitopa u toj sekvenci.

[0065] Alternativno, peptidni delovi proteina, koji će biti deimunizovani (npr., g3p delovi od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11 ili SEK ID BR: 13) mogu biti sintetisani i testirani in siliko ili u ćelijskom testu ili in vivo za utvrđivanje da li se oni vezuju za MHC molekule (videti, npr. US Patent 7,208,147).

[0066] Kada su jednom identifikovani predviđeni T-ćelijski epitopi, opravdana aminokiselinska supstitucija unutar primarne sekvence od g3p dela fuzionog proteina iz pronalaska je korišćena u pokušaju da se smanji imunogenost. Ovi predviđeni deimunizovani mutanti od g3p dela iz SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 i SEK ID BR: 31, su zatim ponovo skenirani, kako na aktivnost tako i na imunogenost da bi identifikovali one koji zadržavaju aktivnost, ali imaju smanjenu ili ne pokazuju imunogenost u odnosu na g3p deo bilo koje od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11 ili SEK ID BR: 13. Tipično, ovo će zahtevati supstituciju od 1 do oko 20 aminokiselina.

[0067] U svim slučajevima, amiloid vezujući fragment g3p u fuzionom proteinu prema pronalasku obuhvata njegove mutante i varijante.

[0068] Generalno, fuzioni proteini se vezuju za amiloid najmanje jednako efikasno kao odgovarajući nepovezani amiloid vezujući fragment g3p. Kada je primenljivo, fuzioni proteini su najmanje podjednako efikasni u posredovanju disagregacije amiloida, promovisanju amiloidnog klirensa, inhibiranju agregacije amiloida i / ili uklanjanju ili sprečavanju nastajanja toksičnih oligomera kao odgovarajući nevezani amiloid vezujući fragment g3p. U nekim realizacijama fuzioni protein vezuje amiloid i najmanje je podjednako efikasan u posredovanju disagregacije amiloida, promovisanju amiloidnog klirensa, inhibiranju agregacije amiloida i / ili uklanjanju ili sprečavanju nastajanja toksičnih oligomera, kao što je rekombinantni, rastvorljivi g3p, koji sadrži SEK ID BR: 1. U još nekim realizacijama, fuzioni protein vezuje amiloid i najmanje je podjednako efikasan u posredovanju disagregacije amiloida, promovisanju amiloidnog klirensa, inhibiranju agregacije amiloida i / ili uklanjanju ili sprečavanju stvaranja toksičnih oligomera kao fag M13. U još nekim realizacijama, fuzioni protein vezuje amiloid i efikasniji je u posredovanju disagregacije amiloida, promovisanju amiloidnog klirensa, inhibiranju agregacije amiloida i / ili uklanjanju ili sprečavanju stvaranja toksičnih oligomera od faga M13. U nekim realizacijama, fuzioni protein vezuje amiloid i najmanje je podjednako efikasan u redukciji amiloida, kod bolesti usled nepravilnog uvijanja proteina kao fag M13. U još nekim realizacijama, fuzioni protein vezuje amiloid i efikasniji je u redukciji amiloida, kod bolesti usled nepravilnog uvijanja proteina kao fag M13. U još nekim realizacijama, fuzioni protein vezuje amiloid i najmanje je ili više efikasan u sprečavanju formiranja amiloida kao fag M13.

[0069] Fuzioni proteini mogu biti sintetisani korišćenjem tehnika poznatih u stanju tehnike. Na primer, fuzioni proteini pronalaska mogu se sintetisati rekombinantno u ćelijama (videti, npr., Sambrook i sar. 1989, Molekularno kloniranje A Laboratorijski priručnik, Laboratorija Cold Spring Harbor, N.Y. i Ausubel i sar. 1989, Aktuelni protokoli u molekularnoj biologiji, Greene Publishing Associates i Wiley Interscience, N.Y.). Alternativno, fuzioni proteini iz pronalaska mogu se sintetisati korišćenjem poznatih sintetičkih postupaka, kao što je sinteza čvrste faze. Sintetičke tehnike su dobro poznate u struci (videti, npr., Merrifield, 1973, Hemijski Polipeptidi, (Katsoyannis i Panayotis eds.) str.335-61; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc.85: 2149; Davis i sar.1985, Biochem. Intl. 10: 394; Finn i sar. 1976, Proteini (3d ed.) 2: 105; Erikson i sar. 1976, Proteini (3d ed.) 2: 257; U.S. Patent br. 3,941,763. Alternativno, konačni konstrukt može deliti u suštini istu funkciju kao rekombinantno proizvedeni fuzioni protein, ali se jednostavno može proizvoditi korišćenjem ne-rekombinantnih tehnika, kao što je hemija ligacije. Komponente fuzionih proteina mogu se pripremiti korišćenjem iste opšte metodologije opisane za g3p ekspresiju i g3p mutacije.

D. Nukleinske kiseline koje kodiraju g3p fuzione proteine

[0070] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline, koja kodira fuzioni protein iz pronalaska, koji sadrži amiloid, vezujući fragment g3p, pri čemu deo g3p fuzionog proteina sadrži mutirani ili varijantni amiloid vezujući fragment g3p, koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična sa g3p delom od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili SEK ID BR: 31. U jednom aspektu ovih realizacija, sekvenca nukleinske kiseline je odabrana od SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 28 i SEK ID BR: 32 (aktuelne sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 i SEK ID BR: 31, respektivno), ili sekvencu nukleinske kiseline koja je degenerativna prema, ali kodira isti polipeptid, kao bilo koja od gore pomenutih. U drugom aspektu ovih realizacija, sekvenca nukleinske kiseline je izabrana iz g3p-Ig kodirajućeg dela SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 28 ili SEK ID BR: 32 (tj. sekvenca nukleinske kiseline koja kodira bilo koju od: aminokiselina 21, 22, ili 23 do 505, ili 506 SEK ID BR: 9, aminokiselina 21, 22, ili 23 do 505 ili 506 SEK ID BR: 11, aminokiselina 21, 22, ili 23 do 508 ili 509 SEK ID BR: 13 ili aminokiselina 21, 22 ili 23 do 527 ili 528 SEK ID BR: 31) spojenih na svom 5’ kraju i u okviru sa nukleotidnom sekvencom koja kodira signalnu sekvencu ili sekvencu nukleinske kiseline koja je degenerativna za, ali kodira isti polipeptid, kao bilo koja od prethodnih. U nekim realizacijama signalna sekvenca je od sisara.

[0071] U drugom aspektu ovih realizacija, sekvenca nukleinske kiseline je odabrana od g3p kodirajućeg dela iz SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 28 ili SEK ID BR: 32 (tj. sekvenca nukleinske kiseline koja kodira bilo koju od: aminokiselina 21, 22, ili 23 do 238 SEK ID BR: 9, aminokiselina 21, 22, ili 23 do 238 SEK ID BR: 11, aminokiselina 21, 22, ili 23 do 238 SEK ID BR: 13 ili aminokiselina 21, 22, ili 23 do 296 SEK ID BR: 31) spojenih na svom 5’ kraju i u okviru sa nukleotidnom sekvencom, koja kodira signalnu sekvencu ili sekvencu nukleinske kiseline koja je degenerativna, ali kodira isti polipeptid, kao bilo koja od prethodnih. U nekim realizacijama signalna sekvenca je od sisara.

[0072] U nekim realizacijama nukleinska kiselina koja kodira g3p fuzioni protein sadrži SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 28 i SEK ID BR: 32, gde su nukleinske kiseline koje kodiraju signalnu sekvencu (tj. aminokiseline 1-20, 1-21 ili 1-22 bilo koje od SEK ID BR-a: 9, 11, 13 ili 31) isključene. U određenim realizacijama, nukleinska kiselina koja kodira g3p fuzioni protein, ali isključuje nukleotide koji kodiraju signalnu sekvencu je izabrana od i) nukleotida 61, 64, ili 67 do 1521 bilo koje od SEK ID BR-a: 26 ili 27; ii) nukleotida 61, 64, ili 67 do 1527 od SEK ID BR: 28; i iii) nukleotida 61, 64 ili 67 do 1587 SEK ID BR: 32. U nekim realizacijama, sekvenca nukleinske kiseline kodira g3p N1 N2 domen ili mutanta, varijantu ili njegov fragment.

[0073] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu, koja ima od 1 do 20 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa delom g3p bilo koje od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13, ili SEK ID BR: 31, gde je fuzioni protein manje imunogen kod čoveka od g3p dela bilo koje od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13, ili SEK ID BR: 31. U drugim aspektima ovih realizacija, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein ima od 1 do 10 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa g3p delom SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili SEK ID BR: 31. U drugim aspektima ovih realizacija, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein ima od 1 do 5 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa g3p delom SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili SEK ID BR: 31. U još nekim aspektima ovih realizacija, sekvenca nukleinske kiseline kodira jednog polipeptida, gde su sve supstitucije aminokiselina prisutne u g3p delu fuzionog proteina (npr. aminokiseline 21, 22, ili 23 do 238 SEK ID BR: 9, aminokiseline 21, 22, ili 23 do 238 SEK ID BR: 11, aminokiseline 21, 22, ili 23 do 238 SEK ID BR: 13, ili aminokiseline 21, 22, ili 23 do 296 SEK ID BR: 31, ili njihovi mutanti, varijante ili fragmenti).

[0074] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein koji je varijanta bilo koje od: aminokiselina 21, 22, ili 23 do 505 ili 506 SEK ID BR: 9, aminokiselina 21, 22, ili 23 do 505 ili 506 SEK ID BR: 11, aminokiselina 21, 22, ili 23 do 508 ili 509 SEK ID BR: 13, ili aminokiselina 21, 22, ili 23 do 527 ili 528 SEK ID BR: 31 i manje imunogena od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13, SEK ID BR: 31, pri čemu se varijanta razlikuje od njegove odgovarajuće aminokiselinske sekvence samo sa 1 do 20 aminokiselinskih supstitucija u regionu g3p (tj. aminokiseline 21, 22, ili 23 do 238 SEK ID BR: 9, aminokiseline 22 ili 23 do 238 SEK ID BR: 11, aminokiseline 22 ili 23 do 238 SEK ID BR: 13, ili aminokiseline 22 ili 23 do 296 SEK ID BR: 31, respektivno). U nekim aspektima ovih realizacija, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein ima od 1 do 10 takvih aminokiselinskih supstitucija. U drugim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline kodira fuzioni protein ima od 1 do 5 takvih aminokiselinskih supstitucija.

E. Mutantni g3p fuzioni proteini

[0075] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na fuzione proteine, koji sadrže mutantne amiloid-vezujuće fragmente g3p-a. Fuzioni proteini koji sadrže mutantne amiloid-vezujuće fragmente g3p-a mogu biti proizvedeni, ili odabrani zbog svojstava, koja doprinose terapeutskoj efikasnosti farmaceutskih preparata, opisanih u ovoj prijavi. Na primer, fragmenti za vezivanje amiloida od g3p-a mogu biti rekombinantno mutirani ili drugačije odabrani tako da poseduju jednu ili više sledećih osobina u odnosu na g3p od M13: povećani afinitet za vezivanje amiloida, smanjenu TMzgloba, povećan aviditet (aviditet se razlikuje od afiniteta u tome da se aviditet koristi da opiše sumu svih raspoloživih amiloidnih vezivanja, gde g3p sadrži više od jednog mesta za vezivanje amiloida), povećanu sposobnost razgradnje amiloidnih agregata ili povećanu sposobnost za sprečavanje agregacije amiloidnih fibrila. Alternativno, ili pored toga, mutanti amiloidni fragmenti g3p-a mogu uneti i druga korisna svojstva opisana drugde u opisu.

[0076] Mutantni amiloidni fragmenti g3p-a mogu se proizvoditi mutagenezom faga, ili pomoću rekombinantnih tehnika, kao što je PCR-bazirana mutageneza usmerena mestom ili slučajna mutageneza.

[0077] Amiloid vezujući fragmenti g3p-a, npr., N1 N2 domeni ili N2 domeni, takođe mogu biti mutagenizovani, korišćenjem rekombinantnih tehnika i inkorporirani u fuzione proteine pronalaska. Na primer, jedan vektor, kao što je ovde opisano nosi g3p ili njegov fragment vezivanja amiloida (npr., N1 N2 ili N2), može biti mutiran korišćenjem strategija mutageneze baziranih na PCR-u. Kodirani, mutirani protein se tada eksprimira i vezivanje amiloida i afinitet mutanta je ocenjen, kao što je opisano.

[0078] Mutantni amiloid vezujući fragmenti g3p-a takođe mogu biti izvedeni iz mutantnog g3p-a. Na primer, mutiranjem g3p i / ili biranjem mutiranog g3p sa poželjnim svojstvima i zatim dobijanjem željenog fragmenta za vezivanje amiloida iz njega, npr., putem proteolize i naknadnog prečišćavanja.

[0079] U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein iz pronalaska sadrži mutantni amiloid- vezujući fragment g3p, koji vezuje amiloid sa afinitetom koji je najmanje 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ili čak 1000 viši od vezivanja odgovarajućeg nemutiranog g3p fragmenta iz M 13, ili odgovarajućeg nemutiranog g3p fuzionog proteina. U drugim realizacijama, fuzioni protein, koji sadrži mutantni fragment za vezivanje amiloida g3p zadržava vezivanje amiloida koje je najmanje 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% podjednako jako kao vezivanje odgovarajućeg nemutiranog amiloid-vezujućeg g3p fragmenta od M 13, ili odgovarajućeg neumutiranog g3p fuzionog proteina. U nekim realizacijama, jedan mutantni amiloid vezujući fragment g3p, koji pokazuje niži afinitet za vezivanje amiloida od odgovarajućeg nemutiranog oblika takođe, poseduje još jedno poželjno biološko svojstvo (npr., veća mogućnost dezagregacije amiloida; veća sposobnost sprečavanja agregacije amiloidnih fibrila) ili farmaceutsko svojstvo (npr., veća metabolička stabilnost, pogodan farmakokinetički profil, veća rastvorljivost), koje je poboljšano u poređenju sa odgovarajućim neumutiranim oblikom. Vezivanje amiloida se može proceniti površinskom plazmonskom rezonancom ili u kompetitivnom ELISA testu, kao što je opisano u Primerima.

[0080] U nekim realizacijama, varijante i / ili mutanti amiloidnih fragmenata od g3p-a mogu se identifikovati skriningom DNK biblioteka, korišćenjem hibridizacije na M13 g3p-u da bi se izabrale srodne DNK, koje se hibridizuju do M13 g3p-a pod visoko strogim ili umereno strogim uslovima.

[0081] U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein iz pronalaska, koji sadrži mutirani amiloidni fragment g3p-a se rekombinantno proizvodi i sadrži fragment za vezivanje amiloida g3p, koji se razlikuje od nemutiranog g3p polipeptida, pomoću najmanje jednog aminokiselinskog ostatka, ali i dalje vezuje amiloid. U nekim realizacijama, individualne tačke mutacije su specificirane, obezbeđivanjem aminokiseline neumutiranog g3p-a, na određenom ostatku g3p polipeptida i zamenom aminokiseline na tom ostatku. Na primer, "F194A" znači da je fenilalanin na položaju 194 zrele M13 sekvence (SEK ID BR: 1) promenjen u alanin. U drugim realizacijama, opisan je jedan mutirani g3p, specificiranjem procenta sličnosti aminokiseline sa određenom aminokiselinskom sekvencom, opet uz upozorenje da mutirani g3p vezuje amiloidna vlakna. U ovim izvođenjima, mutirani deo g3p fuzionog proteina prema pronalasku deli najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89% , najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% % identičnosti preko cele dužine odgovarajućeg dela SEK ID BR: 1. U ovim realizacijama prema pronalasku, koje sadrže mutirani amiloid vezujući fragment g3p, mutirani fragment za vezivanje amiloida deli najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti preko celokupne dužine odgovarajućeg fragmenta SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13, ili SEK ID BR: 31.

[0082] Kao praktična stvar, da li je određeni polipeptid najmanje 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa drugom sekvencom, može se konvencionalno odrediti korišćenjem poznatih računarskih programa, kao što je Bestfit program. Kada se koristi Bestfit ili drugi program za poravnavanje sekvence da bi se utvrdilo da li je određena sekvenca, na primer, 95% identična sa referentnom sekvencom, u skladu sa sadašnjim pronalaskom, parametri se naravno, utvrđuju da je procenat identičnosti računat preko pune dužine dela referentne aminokiselinske sekvence, koja je homologna sa sekvencom upita.

[0083] U nekim realizacijama različitih aspekata, mutantni amiloid-vezujući fragmenti od g3p dela, g3p fuzionih proteina prema pronalasku ne uključuju mutacije na aminokiselinskom ostatku koji je konzerviran među odgovarajućim delom g3p familije Ff, I-familije, ili obe Ft i I-familije. U drugim realizacijama, mutantni amiloid vezujući fragmenti od g3p-a, uključuju najviše mutacija na 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka, koji su očuvani između odgovarajućeg dela g3p iz familije Ff, I-familije, ili obe Ff i I-familije. U drugim realizacijama, mutantni amiloid vezujući fragmenti od g3p-a, uključuju najviše mutacija na 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka, koji nisu konzervirani među odgovarajućim delom g3p od familije Ff, I-familije ili obe Ff i I-familije. U još jednoj realizaciji, mutantni amiloid vezujući fragmenti od g3p-a uključuju najviše mutacija na 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka, koji nisu konzervirani između odgovarajućeg dela jednog ili više I22, Ike i If1. U još nekim realizacijama, mutantni vezujući fragmenti amiloida od g3p-a uključuju najviše mutacija na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka, koji nisu konzervirani između odgovarajućeg dela g3p od Ff familije, I-familije, ili obe Ff i I-familije. U nekim realizacijama, najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mutacija se nalazi uutar domena N1. U nekim realizacijama najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mutacija se nalazi unutar domenua N2. U nekim realizacijama, najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mutacija se nalazi unutar N2 domena i nisu unutar zglobnog regiona.

[0084] Mestom usmerena mutageneza može ciljati ostatke za koje je poznato da su važni za stabilnost g3p, N1N2 ili domena N2. Na primer, mutacije zamene alanina na D94 i T95; E115; N122; L125; E126 i E127; E127 i E128; Q129; Q145; T154 i T156; Q157; T159 i D160; K163 i T164; Y166; i E196 i D197 su prethodno pokazale da ne utiču značajno na vezivanje faga na F-pili, Deng & Perham, 2002. Prema tome, ovi položaji su tolerantni na mutaciju i mutacija na jednom ili više ovih položaja može ili poboljšati ili imati neutralan uticaj na sposobnost vezivanja amiloida u g3p fuzionim proteinama prema pronalasku. Stoga, u nekim realizacijama, pronalazak uključuje g3p fuzioni protein, koji sadrži g3p fragment za vezivanje amiloida, koji je mutiran na jednom ili više od D94, T95, E115, N122, L125, E126, E127, E128, Q129, Q145, T154, T156, Q157, T159, D160, K163, T164, Y166, E196 ili D197 (u odnosu na SEK ID BR: 1). U nekim realizacijama, mutacija je na jednom ili više od D94, T95, E115, N122, L125, E126, E127, E128, Q129, Q145, T154, T156, Q157, T159, D160, K163, T164, Y166, E196, ili D197 nije isključivo mutacija za alanin.

[0085] Mutacije zamene alanina na F194; F190 i H191; K184, R186 i D187; R142 i R144 su prethodno pokazale da smanjuju vezivanje za F-pili, Deng & Perham, 2002. Stoga, u nekim realizacijama, jedna mutacija u g3p delu fuzionog proteina prema pronalasku je odabrana od mutacije, koja ne uključuje jedan ili više od sledećih ostataka: R142, R144, W181, K184, R186, D187, F190, H191 ili F194 (numeracija u odnosu na SEK ID BR: 1). Međutim, zamena R142, R144, W181, K184, R186, D187, F190, H191, ili F194 sa nealaninskim ostatkom može povećati vezivanje amiloida. Stoga, u jednoj realizaciji, mutacija je nealaninska mutacija na jednom ili više od R142, R144, W181, K184, R186, D187, F190, H191 ili F194. U jednoj realizaciji, mutacija je nealaninska mutacija na F194. U drugoj realizaciji, mutacija je nealaninska mutacija na F190 i H191. U drugoj realizaciji, mutacija je nealaninska mutacija na K184, R186 i D187. U drugoj realizaciji, mutacija je nealaninska mutacija na W181. U drugoj realizaciji, mutacija je nealaninska mutacija na R142 i R144. U određenim realizacijama mutacija, nije isključivo jedna, neka ili sve od: T13I, T101I, Q129H, G153D, W181A, F190A, F194A i D209Y.

[0086] U nekim realizacijama, mutacija u g3p delu fuzionog proteina prema pronalasku je na jednom ili više ostataka lociranih na površini N2 domena, koji je deo g3p koji vezuje F-pili. U jednoj realizaciji, mutacija je na jednom ili više ostataka lociranih na spoljašnjem obodu N2 domena. U drugim realizacijama, mutacija je na jednom ili više ostataka lociranih na površini N1 domena, koji je deo g3p koji vezuje TolA. U jednoj realizaciji, mutacija u g3p delu fuzionog proteina prema pronalasku je na jednom ili više ostataka lociranih na spoljašnjem obodu N1 domena. U drugoj realizaciji, mutacija je na jednom ili više dostupnih rastvorljivih ostataka na g3p-u. U još jednoj realizaciji, mutacija (e) pomeraju cis/trans ravnotežu na Pro213 na više od 50, 80, 70, 80, 90 ili 95% trans. Stoga, u nekim realizacijama, g3p fuzioni protein sadrži mutirani g3p sa cis/trans ravnotežom na Pro213 koja je najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 ili najmanje 95% trans.

[0087] U nekim realizacijama, fragment vezivanja amiloida g3p u g3p delu fuzionog proteina prema pronalasku ne uključuje mutacije u strukturno očuvanim ostacima. Primeri strukturno konzerviranih ostataka uključuju ostatke, koji su, uprkos potencijalnim umetanjima sekvence, uključeni u obezbeđenje strukture domena i kod članova Ff i I-familija.

[0088] U nekim realizacijama, bilo koja mutacija napravljena u g3p delu fuzionog proteina iz pronalaska zadržava vezivanje amiloida. U drugim izvođenjima, mutacija ne zamenjuje ostatak prolina.

[0089] U nekim realizacijama, bilo koja mutacija napravljena u g3p delu fuzionog proteina iz pronalaska zadržava vezivanje amiloida i ne zamenjuje ostatak cisteina. U nekim realizacijama, mutacija zadržava sve, najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri ili sva četiri disulfidna mosta nađena unutar g3p-a. Stoga, u jednom izvođenju, bilo koja mutacija zadržava dva disulfidna mosta u N1 između Cis7 i Cis36 i između Cis46 i Cis53. U još jednom izvođenju, bilo koja mutacija zadržava jedan od, ali ne i oba, disulfidna mosta u N1 između Cis7 i Cis36 i između Cis46 i Cis53. U jednoj realizaciji, očuvan je disulfidni most između Cis188 i Cis201. U nekim realizacijama, očuvan je svaki od disulfidnih mostova Cis7 i Cis36, Cis46 i Cis53, Cis188 i Cis201. U jednoj realizaciji, mutacije zadržavaju disulfidni most između Cis354 i Cis371. U nekim realizacijama mutacije zadržavaju disulfidne mostove između Cis7 i Cis36, Cis46 i Cis53, Cis188 i Cis201, Cis354 i Cis371.

[0090] U nekim realizacijama, bilo koja mutacija napravljena u g3p delu fuzionog proteina pronalaska zadržava vezivanje amiloida i smanjuje temperaturu topljenja (TM) N1 N2. TMse može meriti pomoću bilo koje metode opisane u Primerima. Očekuje se da se mutanti, koji smanjuju TMN1 N2 pokazuju bolje vezivanje za Αβ, u većoj meri inhibiraju Αβ sakupljanje i da budu barem toliko efikasni u ispitivanju disagregacije kao g3p iz M13. Shodno tome, očekuje se da takvi fuzioni proteini, koji sadrže ove mutantne amiloid vezujuće fragmente od g3p-a budu najmanje isto tako terapeutski efikasni kao odgovarajuće sekvence M13, fuzioni proteini koji sadrže odgovarajuće nemutirane amiloid vezujuće fragmente g3p-a i neoštećeni M13, respektivno u lečenju jedne ili više bolesti nepravilnog uvijanja proteina.

[0091] Fuzioni proteini, koji sadrže mutantne amiloid vezujuće fragmente od g3p takođe mogu biti dizajnirani tako da uključuju ciljnu sekvencu. Takve ciljne sekvence mogu biti ubačene u regione fleksibilnih linkera između N1 N2, ili između N2 i drugog domena u N2 fuzionom proteinu. Ciljanje sekvenci lokalizacije nukleusa (NLS) može biti korisno kod Huntingtonove bolesti. Ciljanje endozoma može biti korisno kod Parkinsonove bolesti.

[0092] Pored ciljanja specifičnih regiona u ćeliji, ciljne sekvence mogu biti korišćene za ciljanje različitih vrsta amiloida. Nukleacijske sekvence mogu povećati afinitet i usmeriti mutantni protein na određeni amiloid. Drugi mutantni amiloid vezujući fragmenti od g3p-a u g3p fuzionim proteinama iz pronalaska, mogu biti pripremljeni da uključuju peptidne sekvence koje su tako hidrofobne da same precipitiraju. Na primer, za g3p i ili njegove amiloid vezujuće fragmente (npr., N2 i N1 N2) i / ili njihove fuzione proteine mogu se dodati višestruke AVVAI sekvence, za generisanje himernih proteina koji imaju poboljšane, višestruke sekvence vezivanja. Neki primeri peptida, koji vezuju amiloid i mogu se inkorporirati u mutanta ili himerni amiloid-vezujući fragment g3p-a i fuzioni proteini koji sadrže ove mutantne ili himerne amiloid vezujuće fragmente od g3p su inhibitori peptida na bazi GxFxGxF (SEK ID BR: 21) okvira opisanog u Sato, Biochemistry (2006) 45: 5503-16 i peptida KLVFF (SEK ID NO: 22) opisanog u Tjernberg i sar., J. Biol. Chem. (1996) 271: 8545-48. Ostali ciljni ostaci su poznati i mogu biti korišćeni u sadašnjem pronalasku. Videti, npr. Sciarretta i sar., Methods in Enzymology (2006) 413: 273-312. Izrazi "varijanta" i "mutant" se ovde koriste izmenično osim što je "varijanta" obično ne-rekombinantna u prirodi, dok je "mutant" tipično rekombinantan.

Rekombinantne tehnike

[0093] Generalno, DNK koja kodira g3p fuzioni protein (kao i mutante i njihove varijante) se priprema korišćenjem konvencionalne rekombinantne DNK tehnike i može uključivati kloniranje g3p gena, direktnu sintezu DNK ili izolovanjem odgovarajuće DNK iz biblioteke korišćenjem, na primer, M13 sekvence kao probe. (Videti, npr., Sambrook i sar. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. i Ausubel i sar. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).

[0094] Za rekombinantnu proizvodnju, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira g3p fuzioni protein iz pronalaska ili njegov fragment za vezivanje amiloida je ubačena u odgovarajući ekspresioni vektor, koji sadrži neophodne elemente za transkripciju i translaciju umetnute kodirajuće sekvence ili u slučaju RNK virusnog vektora, neophodne elemente za replikaciju i translaciju. Kodirajuća nukleinska kiselina ubacuje se u vektor u odgovarajući okvir za čitanje.

[0095] Shodno tome, pronalazak obezbeđuje vektore koji sadrže polinukleotide, koji kodiraju g3p fuzione proteine, koji su ovde opisani, uključujući mutante i njihove varijante. Takođe su obezbeđeni vektori, koji sadrže polinukleotide, koji kodiraju jedan g3p ili g3p-fuzioni molekul. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, DNK vektore, vektore faga, virusne vektore, retrovirusne vektore, itd.

[0096] Primeri tipova ćelija za rekombinantnu ekspresiju uključuju: ćelije insekata, uključujući sistem Baculovirusa; gljivične ćelije, uključujući Pichia, Saccharomyces i Aspergillus ćelije; bakterijske ćelije, uključujući ćelije E. coli; životinjske ćelijske linije, uključujući NSO, CHO, HEK293, COS, HeLa ili bilo koje druge utvrđene ćelijske linije životinja; i transgene životinje, npr., kozu.

[0097] U nekim realizacijama izabran je jedan vektor, koji je optimizovan za ekspresiju polipeptida u CHO ili CHO-izvedenim ćelijama. Primeri takvih vektora su opisani, npr., u Running Deer et al., Biotechnol. Prog. (2004) 20: 880-889.

[0098] U nekim realizacijama, jedan vektor je izabran za in vivo ekspresiju g3p-a, njevogog amiloid vezujućeg fragmenta i / ili g3p fuzionih molekula kod životinja, uključujući ljude. U nekim takvim izvođenjima, ekspresija polipeptida je pod kontrolom promotera koji funkcioniše na specifičan način u tkivu.

[0099] Ekpresioni vektori su transfektovani ili ko-transfektovani u odgovarajuću ciljnu ćeliju, koja će izražavati polipeptide. Neograničavajući primerne metode transfekcije su opisane, npr., od strane Sambrook i sar., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001). Nukleinske kiseline mogu biti prolazno ili stabilno transfektovane u željenim ćelijama domaćina, prema postupcima poznatim u stanju tehnike. Mnoštvo sistema ekspresionih vektora domaćina može biti korišćeno za ekspresiju proteina ovde opisanih, uključujući i prokariotske ili eukariotske ćelije. Ovi uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme, kao što su bakterije (npr., E. coli) transformisane sa rekombinantnom DNK bakteriofaga ili DNK plazmida ekspresionih vektora, koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; kvasci ili filamentozne gljivice transformisane sa rekombinantnim ekspresionim vektorima kvasca ili gljivica, koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; sistemi ćelija insekata inficiranih sa ekspresionim vektorima rekombinantnog virusa (npr., bakulovirusa), koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; sisteme biljnih ćelija inficiranih sa rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr., mozaičnim virusom karfiola ili mozaičnim virusom duvana) ili transformisani sa ekspresionim vektorima rekombinantnog plazmida (npr. Ti plazmida), koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; ili sistemi životinjskih ćelija, uključujući ćelije sisara (npr. CHO, Cos, HeLa ili HEK-293 ćelije). Proteini takođe mogu biti proizvedeni rekombinantno u biljci vodenom sočivu. Videti, npr., U.S. Patent 8,022,270.

[0100] Vektori koji se koriste u transformaciji obično sadrže selektivni marker, koji se koristi za identifikaciju transformanata. U bakterijskim sistemima, ovo može uključiti gen za otpornost na antibiotike, kao što su ampicilin ili kanamicin. Selektivni markeri za upotrebu na kultivisanim ćelijama sisara, uključuju gene koji daju otpornost na lekove, kao što su neomicin, higromicin i metotreksat. Selektivni marker može biti pojačani selektivni marker. Jedan selektivni marker koji se može amplifikovati je DHFR gen. Drugi pojačani selektivni marker je DHFRr cDNK (Simonsen i Levinson. Proc. Natl, Acad. Sci. (USA), (1983) 80: 2495). Selektivni markeri su dati pregledno od strane Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) i izbor selektivnih markera je dobar na nivou prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti tehnike.

[0101] Ekspresioni elementi ekspresionih sistema variraju po svojoj jačini i specifičnostima. U zavisnosti od korišćenog sistema domaćin / vektor, bilo koji od odgovarajućih transkripcionih i translacionih elemenata, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere, može se koristiti u ekspresionom vektoru. Na primer, kada se klonira u bakterijskim sistemima, mogu se koristiti promoteri za indukciju, kao što su pL bakteriofaga A, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hibridni promoter) i slično; kada se klonira u insekatnim ćelijskim sistemima, mogu se koristiti promoteri, kao što je promoter bakulovirusnog polihedrona; kada se klonira u sistemima biljnih ćelija, promoteri koji se dobijaju iz genoma biljnih ćelija (npr., promoteri toplotnih šokova, promoter za malu podjedinicu RUBISCO-a, promoter za vezujući protein hlorofila a / b) ili mogu biti korišćeni od biljnih virusa (npr. 35S RNK promoter CaMV-a; promoter omotača proteina TMV); kada se klonira u ćelijskim sistemima sisara mogu biti korišćeni, promoteri izvedeni iz genoma ćelija sisara (npr., promoter metalotioneina) ili od virusa sisara (npr. kasni promoter adenovirusa, 7,5 K promoter virusa vakcinije); kada generišu ćelijske linije, koje sadrže višestruke kopije proizvoda ekspresije, vektori na bazi SV40-, BPV- i EBV-a mogu biti korišćeni sa odgovarajućim selektivnim markerom.

[0102] U slučajevima gde se koriste biljni ekspresioni vektori, ekspresija sekvenci koje kodiraju linearne ili neciklizovane oblike proizvoda ekspresije iz pronalaska, može biti vođena sa bilo kojim od brojnih promotera. Na primer, mogu biti korišćeni virusni promoteri, kao što su 35S RNK i 19S RNK promoteri CaMV-a (Brisson i sar., Nature (1984) 310: 511-514), ili promoter proteinskog omotača TMV (Takamatsu i sar., EMBO J. (1987) 6: 307-311); alternativno, biljni promoteri, kao što su mala podjedinica RUBISCO (Coruzzi i sar., EMBO J. (1984) 3: 1671-1680; Broglie i sar., Science (1984) 224: 838-843) ili promoteri toplotnog šoka, npr. soja hsp17.5-E ili hsp17.3-B (Gurley i sar., Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 559-565). Ovi konstrukti mogu biti uvedeni u biljnu ćeliju korišćenjem Ti plazmida, Ri plazmida, vektora biljnih virusa, direktnom DNK transformacijom, mikroinjektiranjem, elektroporacijom, itd. Za pregled takvih tehnika pogledajte, npr., Weissbach & Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Odeljak VIII, str. 421-463: i Grierson & Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch.7-9.

[0103] U jednom ekspresionom sistemu insekata, koji se može koristiti za proizvodnju proteina iz pronalaska, Autographa californica virus nuklearne polihidroze (AcNPV) se koristi kao vektor za izražavanje stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda. Kodirajuća sekvenca može biti klonirana u ne-suštinske regione (na primer, polihedron gena) virusa i stavljena pod kontrolu AcNPV promotera (na primer, promotera polihedron). Uspešno ubacivanje kodirajuće sekvence rezultiraće inaktivacijom polihedron gena i proizvodnjom rekombinantnog virusa bez omotača (tj. virusa koji nema proteinski sloj omotača, kodiran od strane polihedron gena). Ovi rekombinantni virusi se zatim koriste za inficiranje ćelija Spodoptera frugiperda u kojima je ubačeni gen izražen. (videti, npr. Smith i sar., J. Virol. (1983) 46: 584; Američki patent br. 4,215,051). Drugi primeri ovog ekspresionog sistema mogu se naći kod Ausubel i sar., eds. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

[0104] U ćelijama domaćinima sisara, mogu biti korišćeni brojni ekspresioni sistemi bazirani na virusima. U slučajevima kada se koristi adenovirus kao ekspresioni vektor, kodirajuća sekvenca može biti povezana sa kompleksom za kontrolu transkripcije / translacije adenovirusa, na primer, kasni promoter i tripartit lider sekvenca. Ovaj fuzioni gen se zatim može ubaciti u adenovirusni genom in vitro ili in vivo rekombinacijom. Ubacivanje u nesuštinski region virusnog genoma (npr. region E1 ili E3) rezultiraće rekombinantnim virusom, koji je održiv i sposoban za ekspresiju peptida, kod inficiranih domaćina (videti, npr., Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81: 3655). Alternativno, može se koristiti promoter vakcinije 7,5 K (videti, npr., Mackett i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79: 7415; Mackett i sar., J. Virol. (1984) 49: 857; Panicali i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79: 4927). Drugi virusni ekspresioni sistemi, uključuju, adeno-povezani virus i lentiviruse.

[0105] Ćelije domaćina koje sadrže DNK konstrukte su rasle u odgovarajućem medijumu za rast. Kao što je ovde korišćeno, izraz "odgovarajući medijum rasta" označava, medijum, koji sadrži hranljive sastojke potrebne za rast ćelija. Rekombinantno proizvedeni protein iz pronalaska se može izolovati iz medijuma za kulturu, korišćenjem konvencionalnih tehnika u struci.

In Vitro Testovi

[0106] U nekim realizacijama, disagregacija amiloida se može pratiti korišćenjem testa Tioflavin T Fluorescencije (ThT).

[0107] U nekim realizacijama, disagregacija je testirana praćenjem solubilizacije deterdženta u prisustvu ili odsustvu fuzionog proteina ili sastava iz pronalaska. Na primer, agregirani α -sinuklein se može tretirati sa kompozicijom pronalaska. Fuzioni protein ili kompozicija koja razgrađuje agregirani α - sinukluin prouzrokovaće da se α- sinukleinska vlakna brže rastvaraju u deterdžentima kao što je SDS, u poređenju sa netretiranim vlaknima. Ova konverzija amiloidnih vlakana u rastvorljive oblike može biti praćena inkorporiranjem proporcije obeleženih (npr., sa Ci5) α -sinukleinskih monomera tokom agregacije.

[0108] U nekim realizacijama, sprečavanje stvaranja toksičnih amiloidnih oligomera se testira pomoću testa citotoksičnosti kulture ćelija neurona. U ovom testu, diferencirane ćelije N2a neuroblastoma ili ekvivalenti su zajedno inkubirani sa Αβ42 oligomerima. Oligomeri vezuju membrane i uzrokuju membransku perturbaciju i curenje citosolnih enzima u medijum. Produžena inkubacija sa visokim koncentracijama oligomera ubija ćelije. Kada se oligomeri prethodno tretiraju sa fagom ili g3p-om pre inkubiranja sa ćelijama, oligomeri su najmanje manje toksični i ponekad netoksični. Ovaj neutrališući efekat može biti kvantifikovan merenjem oslobađanja adenilat kinaze, jednog primernog citosolnog enzima, koji se oslobađa od strane neuronskih ćelija nakon perturbacije membrane.

[0109] U nekim realizacijama, jedan g3p fuzioni protein ili kompozicija iz ovog pronalaska inhibira konverziju rastvorljivog prionskog proteina u konformer otporan na proteinazu K u testu ciklične amplifikacije nepravilno uvijenog proteina (PMCA). Wang i sar., Science, (2010) 327: 1132-35. U ovom testu, rekombinantni PrP se pomeša sa lipidnim POPG i RNK, bilo u prisustvu ili odsustvu fuzionog proteina ili sastava iz pronalaska. Materijal se potom podvrgava višestrukim (npr., 48) ciklusima, ultrazvuku 30 sekundi, nakon čega sledi 29,5 minuta inkubacije. Zatim se koristi frakcija reakcione smeše za zasejavanje druge cevi supstrata i ciklus se ponavlja. Svaki krug se testira na prisustvo otpornog materijala na proteinazu K, što je indikativno za infektivni oblik PrP. Redukcija u proteinaza K rezistentnom materijalu u prisustvu kompozicije prema pronalasku, pokazuje da fuzioni protein ili sastav inhibira stvaranje PK rezistentnog konformera.

[0110] Kao što je gore pomenuto, amiloidni oblici određenih prionskih proteina, kao što je prionski protein kvasca NM, takođe mogu biti detektovani analizom filtera klopke. Shodno tome, u zavisnosti od prethodnog proteina, u nekim izvođenjima, sposobnost fuzionog proteina ili sastava prema pronalasku da razgrađuje agregate prionskih proteina može biti testirana uz pomoć testa filtera klopke.

In Vivo funkcionalni testovi

[0111] Pored aktivnosti kao što je povećanje afiniteta vezivanja za amiloid ili smanjenje TM, što se može pokazati u in vitro testovima, fuzioni proteini ili kompozicije iz ovog pronalaska mogu takođe da redukuju amiloid u jednom od nekoliko in vivo testova. Jedna metoda za određivanje redukcije amiloida in vivo koristi pozitronsku emisionu tomografiju (PET) sa sredstvom za snimanje florbetapirom (F18-AV-45, Eli Lilly), pre i nakon tretmana da bi se uporedio broj i / ili distribuciju β-amiloida. Naravno, pošto su identifikovani dodatni biomarkeri, oni se takođe mogu koristiti za merenje redukcije amiloida.

[0112] Druga metoda za određivanje da li jedan g3p fuzioni protein ili kompozicija prema pronalasku smanjuje amiloid in vivo koristi hAPP mišji model. Rockenstein, J Neurosci Res. (2001) 66 (4): 573-82. Ovi miševi razvijaju visoke nivoe β-amiloida u ranom stadijumu (3-4 meseca). Sposobnost fuzionog proteina ili sastava prema pronalasku da smanji amiloid može se odrediti injektiranjem kompozicija iz pronalaska miševima, upoređujući nivoe amiloida kod tih miševa u poređenju sa neinjektiranim kontrolama. Takođe je moguće injektirati fuzioni protein ili kompoziciju pronalaska u samo jednu hemisferu hAPP miša, što omogućava poređenje nivoa amiloida između injektiranih i neinjektiranih hemisfera kod istog miša.

[0113] U drugom primeru, ispituju se fuzioni protein ili kompozicije prema pronalasku na transgenom mišjem modelu na Alchajmerovu bolest (TgAD) opisano u US2011/0142803, Hsiao i sar., Science (1996) 274: 99-102, ili Duyckaerts i sar., Acta Neuropathol (2008) 115: 5-38. Ukratko, divlji tip, kao i transgeni miševi su izazivani. Da bi se procenio potencijal fuzionog proteina ili sastava iz pronalaska da deluje kao sredstvo za razgradnju, kompozicija se injektira intrakranijalnim ili sistemskim putem transgenim miševima (Taconic, APPSWE (2576), starosti 10 meseci). Na primer, za intrakranijalnu injekciju, kompozicije koje sadrže fuzione proteine prema pronalasku mogu se injektirati u jednu hemisferu, dok se na kontralateralnoj strani primjenjuje fosfatni slani pufer (PBS) kao kontrola. Tretirani miševi se zatim žrtvuju u različitim vremenskim tačkama i mozak se post-fiksira preko noći u 4% paraformaldehidu i seče pomoću mikrotoma. Tioflavin-S (ThS) bojenje se izvodi za procenu amiloidnog opterećenja. Isečci su obojeni Majerovim hematoksilinom kako bi se suzbila nuklearna autofluorescencija i nakon pranja ThS rastvor (1%) se primenjuje 3 minuta. Diferencijacija se vrši korišćenjem 1% sirćetne kiseline u trajanju od 20 minuta, a posle pranja slajdovi se osuše i nameštaju sa sredstvom protiv bledila. Amiloidno opterećenje se izračunava korišćenjem LEICA Qwin programa. Alternativno, amiloidno opterećenje se može se proceniti sa antiamiloidnim antitelima.

[0114] Biodistribucija radioaktivnog (npr., I<125>) ili fluorescentno obeleženog fuzionog proteina ili kompozicija, ili neobeleženog fuzionog proteina ili kompozicija se može takođe meriti da bi se pokazalo da fuzioni protein ili sastav pronalaska vezuje amiloid in vivo. Na primer, fuzioni protein može biti radioaktivno ili fluorescentno obeležen. BALB / c miševi su podeljeni u grupe. Svaki miš je onda primio intranazalno fuzioni protein u toku jednog sata. Prva grupa miševa je žrtvovana sat nakon primene intrakardijalne perfuzije, korišćenjem 4% paraformaldehida. Druga grupa je žrtvovana 3 sata nakon tretmana, a poslednja grupa, nakon 24 sata. Nakon perfuzije, uklanjaju se mozak, kao i periferni organi i meri se oznaka. Alternativno, neobeleženi fuzioni proteini ili kompozicije mogu se proceniti za vezivanje korišćenjem sličnih metoda, ali ko-bojenjem isečaka mozga sa bojom koja prepoznaje amiloid i bojom koje prepoznaje sastav ili fag.

[0115] Drugi transgeni modeli bolesti usled nepravilne konformacije proteina mogu takođe biti korišćeni da bi se pokazalo da jedan fuzioni protein ili preparat iz pronalaska smanjuje amiloid. Neograničavajući primeri uključuju "D liniju" α-sinuklein miševe (model Parkinsonove bolesti, Masliah i sar., Science (2000) 287: 1265-1269); Tg2576 miševi (model Alchajmerove bolesti, Hsiao i sar., Science (1998) 274: 99-102 i Duyckaerts i sar., Acta Neuropathol (2008) 115: 5-38 at 9); razni Jax® miševi za istraživanje Parkinsonove bolesti (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME); i modeli miševa i pacova koji su dostupni od JSW Lifescience, uključujući one za Parkinsonovu bolest, Alchajmerovu bolest, Huntingtonovu bolest.

Farmaceutske kompozicije

[0116] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutski prihvatljive preparate, koji sadrže bilo koji od g3p fuzionih proteina, gore opisanih, uključujući fuzione proteine SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili SEK ID BR: 31 , ili njihove fragmente, mutante ili varijante. Posebno, farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu sadržati aminokiseline 21-506 SEK ID BR: 9, aminokiseline 22-506 SEK ID BR: 9, aminokiseline 23-506 SEK ID BR: 9, aminokiseline 21-505 SEK ID BR: 9, aminokiseline 22-505 SEK ID BR: 9, ili aminokiseline 23-505 SEK ID BR: 9; ili mutante ili varijante bilo koje od ovih sekvenci, kao što je gore opisano. U drugim realizacijama, farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu da sadrže aminokiseline 21-506 SEK ID BR: 11, aminokiseline 22-506 SEK ID BR: 11, aminokiseline 23-506 SEK ID BR: 11, aminokiseline 21-505 SEK ID BR: 11, aminokiseline 22-505 SEK ID BR: 11, ili aminokiseline 23-505 SEK ID BR: 11; aminokiseline 21-508 SEK ID BR: 13, aminokiseline 22-508 SEK ID BR: 13, aminokiseline 23-508 SEK ID BR: 13, aminokiseline 21-507 SEK ID BR: 13, amino kiseline 22-507 SEK ID BR: 13, ili aminokiseline 23-507 SEK ID BR: 13; ili aminokiseline 21528 SEK ID BR: 31, aminokiseline 22-528 SEK ID BR: 31, aminokiseline 23-528 SEK ID BR: 31, aminokiseline 21-527 SEK ID BR: 31, aminokiseline 22-527 SEK ID BR: 31, ili aminokiseline 23-527 SEK ID BR: 31 ili mutante ili varijante bilo koje od ovih sekvenci, kao što je gore opisano.

[0117] Jedna "farmaceutska kompozicija / preparat " se odnosi na terapeutski efikasnu količinu jednog g3p fuzionog proteina, kao što je ovde opisano sa fiziološki pogodnim nosačem i / ili ekscipijensom, pri čemu je deo g3p fuzionog proteina odgovoran za terapeutski efekat fuzionog proteina. Farmaceutska kompozicija ne uzrokuje značajnu iritaciju organizma. Izrazi "fiziološki prihvatljiv nosač" i "farmaceutski prihvatljiv nosač", koji se mogu koristiti izmenično se odnose na nosač ili razblaživač, koji ne uzrokuje značajnu iritaciju organizma i ne ukida biološku aktivnost i svojstva primenjene kompozicije.

[0118] Izraz "ekscipijens" se odnosi na inertnu supstancu dodatu u farmaceutsku kompoziciju za dodatno olakšavanje primene aktivnog sastojka. Primeri, bez ograničenja, uključuju, na primer, fiziološki rastvor, kalcijum karbonat, kalcijum fosfat, različite šećere i vrste skroba, derivate celuloze, želatin, biljna ulja, polietilen glikole i surfaktante, uključujući, na primer, polisorbat 20.

[0119] Farmaceutske kompozicije za upotrebu, u skladu sa sadašnjim pronalaskom, mogu biti formulisane na konvencionalan način, korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, koji sadrže ekscipijense i pomoćne sastojke, koji olakšavaju obradu aktivnih sastojaka g3p u kompozicije, koje mogu biti korišćene farmaceutski. Odgovarajuća formulacija zavisi od odabranog puta primene i od prirode preparata za isporuku.

[0120] Pogodni putevi primene farmaceutskih preparata prema pronalasku mogu, na primer, da uključuju transmukozalnu, naročito transnazalnu isporuku; parenteralnu isporuku, uključujući intramuskularne, subkutane, intramedularne, intratekalne, intraventrikularne, intravenozne, intraperitonealne, intranazalne ili intraokularne injekcije; oralnu; ili rektalnu isporuku.

[0121] U nekim realizacijama farmaceutski preparat se primenjuje lokalno, radije nego na sistemski način, na primer, injektiranjem farmaceutske kompozicije direktno u mozak pacijenta. U nekim realizacijama, tehnika injektiranja je bilo koja tehnika, koja izbegava krvno-moždanu barijeru, na primer, direktnom intramedularnom, intratekalnom ili intraventrikularnom injekcijom.

[0122] Za injektiranje, aktivni sastojci pronalaska mogu biti formulisani u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što je Hankov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Za transmukozalnu primenu, u formulaciji se koriste odgovarajući penetranti prema barijeri za permeaciju. Takvi penetranti su generalno poznati u tehnici.

[0123] U nekim realizacijama, farmaceutski preparat prema pronalasku se primenjuje intranazalnom primenom. Prijavljeno je da je intranazalna isporuka omogućila direktan ulazak virusa i makromolekula u cerebrospinalnu tečnost (CSF) ili CNS. Mathison i sar., 1998; Chou i sar., 1997; Draghia i sar., 1995.

[0124] Za primenu intranazalnim putem, kompozicije se pogodno isporučuju u obliku aerosol spreja, pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz upotrebu pogodnog propelenta, npr. dihidrodifluorometana, trihlorofluorometana, dihloro-tetrafluoroetana ili ugljen dioksida. U slučaju aerosola pod pritiskom, jedinica doziranja se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporuku merne količine. Kapsule i patrone, na primer, želatin za upotrebu u dozatoru, mogu biti formulisani da sadrže praškastu mešavinu jedinjenja i pogodnu praškastu bazu, kao što je laktoza ili skrob.

[0125] Razni fuzioni proteini, koji su ovde opisani kao komponente farmaceutskih preparata, mogu takođe biti isporučeni u mozak korišćenjem neurona olfaktornih receptora, kao tačke isporuke. Na primer, adenovirusni vektor, koji sadrži gen, koji kodira bilo koji od tih proteina može biti isporučen preko neurona olfaktornih receptora. Draghia i sar., 1995.

[0126] Ovde opisani preparati mogu biti formulisani za parenteralnu primenu, npr. bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Farmaceutske kompozicije za parenteralnu primenu uključuju, vodene rastvore preparata, u obliku, koji se rastvara u vodi. Pored toga, suspenzije aktivnih sastojaka mogu biti pripremljene kao injekcione suspenzije na bazi ulja ili vode. Pogodni lipofilni rastvarači ili vehikulumi uključuju masne kiseline, kao što su sezamovo ulje, ili estri sintetičkih masnih kiselina, kao što su etil oleat, trigliceridi ili liposomi. Vodene injekcione suspenzije mogu sadržati supstance, koje povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Opciono, suspenzija takođe može da sadrži pogodne stabilizatore ili agense (npr. surfaktante, kao što je polisorbat (Tween 20)), koji povećava rastvorljivost aktivnih sastojaka, kako bi se omogućila priprema visoko koncentrovanih rastvora. Agens na bazi proteina kao što je, na primer, albumin se može koristiti za sprečavanje adsorpcije M13 na površinu isporuke (tj. IV kese, katetera, igle itd.).

[0127] Za oralnu primenu, preparati se mogu lako formulisati kombinovanjem aktivnih jedinjenja sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, dobro poznatim u stanju tehnike.

[0128] Formulacije mogu biti predstavljene u jediničnom doznom obliku, npr. u bočicama, ampulama ili u višedoznim kontejnerima sa opciono, dodatim konzervansom. Kompozicije mogu biti suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim vehikulumima i mogu sadržati formulacijska sredstva, kao što su sredstva za suspendovanje, sredstva za stabilizaciju i / ili disperzna sredstva. Pojedinačni dozni oblici mogu biti u tečnom ili čvrstom obliku. Pojedinačni dozni oblici mogu se direktno primenjivati na pacijentima bez modifikacije ili se mogu razblažiti ili rekonstituisati pre primene. U određenim realizacijama, pojedinačni dozni oblik se može primeniti u bolus obliku, npr., pojedinačna injekcija, pojedinačna oralna doza, uključujući oralnu dozu, koja sadrži više tableta, kapsula, pilula itd. U alternativnim realizacijama, pojedinačni dozni oblik može biti primenjen, tokom određenog vremenskog perioda, kao što je infuzija ili putem implantirane pumpe, kao što je ICV pumpa. U drugoj realizaciji, pojedinačni dozni oblik može biti infuziona kesa ili rezervoar pumpe napunjen sa fuzionim proteinom. Alternativno, kesa za infuziju ili rezervoar pumpe se mogu pripremiti neposredno pre primene na pacijentu, mešanjem pojedinačne doze fuzionog proteina sa infuzionom kesom ili rastvorom iz rezervoara pumpe.

[0129] Drugi aspekt pronalaska, uključuje, postupke za pripremu farmaceutskog preparata iz pronalaska. Tehnike formulisanja lekova mogu se pronaći, na primer, u izdanju "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., poslednje izdanje, koje je ovde uključeno referencom u celosti.

[0130] Farmaceutski preparati pogodni za upotrebu u kontekstu predmetnog pronalaska, uključuju, preparate u kojima su aktivni sastojci g3p sadržani u količini, koja je efikasna da bi se postigla namena. Farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku sadrže g3p fuzione proteine, pri čemu je g3p deo fuzionog proteina u količini, koja je efikasna za smanjenje amiloida, inhibiranje stvaranje amiloida, inhibiranje agregacije amiloida ili uklanjanje i / ili sprečavanje stvaranje toksičnih oligomera, kod pacijenta kome je potrebno. Preparat ne sadrži bakteriofag.

[0131] Određivanje terapeutske ili dijagnostičke efikasne količine je dobro u okviru sposobnosti stručnjaka u struci, naročito u svetlu detaljnog obelodanjivanja, koje je ovde obezbeđeno.

[0132] Mogu se individualno podešavati količina doze i interval doziranja, kako bi se obezbedili nivoi nosača u mozgu sa prikazom faga, koji su dovoljni za lečenje ili dijagnozu određene bolesti, poremećaja ili stanja mozga (minimalna efikasna koncentracija, MEC). MEC će se razlikovati za svaku pripremu, ali se može proceniti iz podataka in vitro. Doze neophodne za postizanje MEC zavisiće od individualnih karakteristika.

[0133] Intervali doziranja se takođe mogu odrediti korišćenjem MEC vrednosti. Preparate treba primenjivati korišćenjem režima, koji održava moždane nivoe iznad MEC za 10-90% vremena, poželjno između 30-90% i najpoželjnije 50-90%.

[0134] U zavisnosti od ozbiljnosti i odgovora stanja koje treba lečiti, doziranje može biti pojedinačno ili višestrukom primenom, uz lečenje, koje traje od nekoliko dana do nekoliko nedelja ili dok se ne izleči ili se postigne smanjenje bolesnog stanja.

[0135] Količina preparata koja će se primenjivati će, naravno, zavisiti od subjekta koji se leči ili dijagnostikuje, težine bolesti, procene lekara koji je propisao terapiju, itd.

[0136] Kompozicije sadašnjeg pronalaska, koje sadrže g3p fuzione proteine, ili njihove mutante ili varijante ovde opisane, mogu, ako je poželjno, biti predstavljene u pakovanju ili uređaju za doziranje, kao što je komplet odobren od strane FDA, koji može sadržati jedan ili više jediničnih doznih oblika, koji sadrže aktivni sastojak. Pakovanje može, na primer, da sadrži metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Uređaj za pakovanje ili dozator može biti praćen uputstvima za primenu. Pakovanje ili dozator može biti smešten sa uputstvom povezanim sa kontejnerom, u obliku propisanom od agencije vlade koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih proizvoda, a to obaveštenje odražava odobrenje od strane agencije oblika preparata ili ljudsku ili veterinarsku primenu. Takvo obaveštenje, na primer, može biti označeno da je odobreno od strane Američke Uprave za hranu i lekove, za lekove koji se izdaju na recept ili uputstvom odobrenog proizvoda. Kompozicije koje sadrže preparat prema pronalasku, formulisan u kompatibilnom farmaceutskom nosaču takođe mogu biti pripremljene, smeštene u odgovarajući kontejner i označene za lečenje indikovanog stanja, kao što je gore navedeno detaljnije.

Terapijske upotrebe

[0137] Drugi aspekt pronalaska, odnosi se na upotrebu bilo kojeg od g3p fuzionih proteina ili kompozicija pronalaska u lečenju i / ili prevenciji bolesti usled nepravilne konformacije proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na bolesti koje uključuju bilo koji od fΑβ42, fαsyn, fNM ili ftau.

[0138] Drugi aspekt pronalaska, odnosi se na upotrebu bilo kojeg od g3p fuzionog proteina ili kompozicija prema pronalasku, za smanjenje amiloida, inhibiranje nastanka amiloida, inhibiranje agregacije amiloida i / ili uklanjanje i / ili sprečavanje stvaranja toksičnih oligomera, kod pacijenta kod kojih je to potrebno.

[0139] U kontekstu lečenja i / ili prevencija, izrazi "pacijent", "subjekt" i "primalac" se koriste izmenično i uključuju ljude, kao i druge sisare. U nekim realizacijama, pacijent je čovek, koji je pozitivan za biomarker, povezan sa bolestima usled greške u uvijanju proteina. U jednoj realizaciji, pacijent ispoljava β-amiloidne depozite, kao što je detektovano pomoću PET snimanja sa florbetapirom.

[0140] Izraz "lečenje" ima za cilj smanjenje, usporavanje ili promenu progresije bolesti kod pacijenta, koji ispoljava jedan ili više kliničkih simptoma bolesti. "Lečenje" takođe ima za cilj smanjenje, usporavanje ili promenu simptoma bolesti kod pacijenta, koji pokazuje još jedan klinički simptom bolesti. U jednoj realizaciji, pacijent pokazuje depozite β-amiloida, kao što je detektovano PET snimanjem sa florbetapirom, a broj depozita β-amiloida je smanjen lečenjem. U jednoj realizaciji, pacijent ispoljava depozite β-amiloida, kao što je otkriveno pomoću g3p kompozicija iz sadašnjeg pronalaska, a broj depozita β-amiloida se smanjuje ili održava tretmanom. U drugoj realizaciji, pacijent ispoljava bilo koji tip amiloidnih depozita, kao što je detektovano PET snimanjem i kognitivna funkcija pacijenta se poboljšava tretmanom. Poboljšanje kognitivne funkcije se može analizirati metodama i testovima prema McKhann i sar., Alzheimer's & Dementia (2011) May; 7 (3): 263-9.

[0141] "Profilaksa" se razlikuje od lečenja i odnosi se na primenu kompozicije na pojedincu pre pojave bilo kakvih kliničkih simptoma. Kao što je ovde korišćeno, upotreba g3p fuzionog proteina ili kompozicije iz pronalaska "profilaktički" je sinonim sa upotrebom g3p fuzionog proteina ili kompozicije prema pronalasku "preventivno". Obuhvaćena je profilaksa korišćenjem bilo kojeg od fuzionih proteina ili kompozicija iz sadašnjeg pronalaska.

Profilaksa može biti implicirana kod osoba za koje je poznato da su pod većim rizikom za nastanak bolesti ili su sigurni da će razviti bolest, isključivo na osnovu jednog ili više genetičkih markera. Mnogi genetički markeri su identifikovani za različite bolesti usled nepravilne konformacije proteina. Na primjer, pojedinci sa jednom ili više Švedskih mutacija, Indijana mutacije ili Londonske mutacije u humanom amiloidnom prekursorskom proteinu (hAPP) imaju povećani rizik za razvoj Alchajmerove bolesti ranog početka i tako su kandidati za profilaksu. Slično, pojedinci sa ponovljenim trinukleotidnim CAG-om u huntingtin genu, posebno oni sa 36 ili više ponavljanja, na kraju će razviti Huntingtonovu bolest i tako su kandidati za profilaksu.

[0142] Izraz "nepravilno uvijanje proteina" se odnosi na bolesti koje su karakterisane formiranjem amiloidnog proteina pomoću agregacionog proteina (peptida koji formira amiloid), kao što su, ali nisu ograničeni na, β-amiloid, serumski amiloid A, cistatin C, IgG kappa laki lanac ili prionski protein. Bolesti za koje je poznato da su povezane sa nepravilnim uvijanjem i / ili agregiranim amiloidnim proteinom uključuju, Alzheimerovu bolest, koja uključuje, rani početak Alzheimerove bolesti, kasni početak Alzheimerove boleste i presimptomatsku Alzheimerovu bolest, Parkinsonovu bolest, SAA amiloidozu, cistatin C, nasledni islandski sindrom, senilnost, multipli mijelom, prionske bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na kuru, Creutzfeldt-Jakobovu bolest (CJD), Gerstmann-Straussler-Scheinkerovu bolest (GSS), fatalnu familijarnu nesanicu (FFI), scrapie i goveđi spongiformni encefalitis (BSE); amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS), spinocerebelarnu ataksiju (SCA1), (SCA3), (SCA6), (SCA7), Huntingtonovu bolest, entatorubralno-pallidoluysian atrofiju, spinalnu i bulbarnu mišićnu atrofiju, naslednu cerebralnu amiloidnu angiopatiju, familijarnu amiloidozu, demenciju frontotemporalnog režnja, Britansku / Dansku demenciju i familijarnu encefalopatiju. G3p fuzioni proteini i kompozicije iz ovog pronalaska mogu se koristiti za lečenje bolesti "poremećaja konformacije proteina".

[0143] Mnoge od ovih bolesti sa greškom u uvijanju proteina i / ili agregiranim amiloidnim proteinom se javljaju u centralnom nervnom sistemu (CNS). Neki primeri bolesti, koje se javljaju u CNS-u su Parkinsonova bolest; Alchajmerova bolest; frontotemporalna demencija (FTD), uključujući i one pacijente, koji imaju sledeće kliničke sindrome: varijanta ponašanja FTD (bvFTD), progresivna nefluentna afazija (PNFA) i semantička demencija (SD); frontotemporalne lobarne degeneracije (FTLDs); i Huntingtonova bolest. G3p fuzioni proteini ili kompozicije iz pronalaska mogu se koristiti za lečenje bolesti karakterisane nepravilnim uvijanjem proteina i / ili agregiranim amiloidnim proteinima, koji se javljaju u centralnom nervnom sistemu (CNS).

[0144] Pogrešno uvijanje i / ili agregacija proteina se takođe mogu javiti izvan CNS-a. Amiloidoza A (AA) (za koju je prekursorski protein serumski apolipoprotein akutne faze, SAA) i multipli mijelom (prekusorski proteini imunoglobulinskog lakog / ili teškog lanca) su dve široko poznate nepravilne konformacijske i / ili agregirane proteinske bolesti, koje se javljaju izvan CNS-a. Ostali primeri uključuju bolest, koja uključuje amiloid formiran od strane β2-mikroglobulina, transtiretina (Familijarna amiloidna polineuropatija [FAP], familijarna amiloidna kardiomiopatija [FAC] i Senilna sistemska amiloidoza [SSA]), (apo) serum AA, apolipoproteina AI AII. i AIV, gelsolina (Finski oblik familijarne amiloidne polineuropatije), lizozima, fibrinogena, cistatina C (Cerebralna amiloidna angiopatija, nasledno cerebralno krvarenje sa amiloidozom, islandskog tipa), (pro)kalcitonina, ostrvca amiloidnog polipeptida (IAPP amiloidoza), atrijalnog natriuretičkog faktora, prolaktina, insulina, laktahedrina, keratoepitelina, laktoferina, odontogenog proteina povezanog sa ameloblastom i semenogelina I. G3p fuzioni protein ili kompozicije iz ovog pronalaska se mogu koristiti za lečenje bolesti koje uključuju greške u uvijanju i / ili agregaciju proteina, koje se javljaju izvan CNS-a.

[0145] Neurodegenerativne bolesti mogu takođe da uključuju tau lezije. (Pregledano u Lee i sar. (2001) Annu, Rev. Neurosci.24: 1121-159). Tau proteini su mikrotubularno povezani proteini, izraženi u aksonima neurona centralnog i perifernog nervnog sistema. Obuhvaćene su neurodegenerativne tauopatije (ponekad nazvane tauopatije) i mogu se tretirati pomoću g3p fuzionih proteina i kompozicija, ovde opisanih. Primeri tauopatija uključuju Alzheimerovu bolest, kompleks Amiotrofične lateralne skleroze / parkinsonizma-demencije, Argyrophilic grain demenciju, Kortikobazalnu degeneraciju, Creutzfeldt-Jakobovu bolest, Dementia pugilistica, difuzne neurofibrilarne čvorove sa kalcifikacijom, Daunov sindrom, Frontotemporalne demencije uključujući, frontotemporalne demencije sa parkinsonizmom povezanim za hromozom 17, Gerstmann-Straussler-Scheinkerovu bolest, Hallervorden-Spatzovu bolest, Miotoničnu distrofiju, Niemann-Pickovu bolest tipa C, ne-gvamanske bolesti motornih neurona sa neurofibrilarnim čvorovima, Pickovu bolest, postencefalitički parkinsonizam, prion proteinsku cerebralnu amiloidnu angiopatiju, progresivnu subkortikalnu gliozu, progresivnu supranuklearnu paralizu, subakutni sklerozni panencefalitis i samo demenciju. Neke od ovih bolesti, mogu takođe, da uključuju depozite fibrilarnih amiloidnih β peptida. Na primer, Alzheimerova bolest pokazuje i depozite amiloida β i tau lezije. Slično tome, bolesti posredovane prionima, kao što su Creutzfeldt-Jakobova bolest, prion protein cerebralna amiloidna angiopatija i Gerstmann-Straussler-Scheinkerov sindrom mogu takođe imati tau lezije. Stoga, indikacija da je bolest "tauopatija" ne treba tumačiti kao isključivanje bolesti iz drugih klasifikacija neurodegenerativnih bolesti ili grupacija, koje su obezbeđene samo kao podesnost. G3p fuzioni protein ili kompozicije pronalaska se mogu koristiti za lečenje neurodegenerativnih bolesti, kao i bolesti koje uključuju tau lezije.

[0146] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija, kako je ovde opisano, koristi se za upotrebu u postupku redukcije amiloida kod pacijenta, koji ispoljava simptome vezane za prisustvo amiloida ili koji je pozitivan za biomarker povezan sa bolestima nepravilne konformacije proteina, kao što je florbetapir (AV-45, Eli Lilly). U jednoj realizaciji, način primene je odabran od intratekalne injekcije, direktne intraventrikularne injekcije, intraparenhimalne injekcije ili intranazalne isporuke.

[0147] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija, kako je ovde opisano, koristi se za upotrebu u postupku održavanja nivoa amiloida kod pacijenta, koji ispoljava simptome, koji se odnose na prisustvo amiloida ili koji je pozitivan za biomarker povezan sa bolestima usled greške u uvijanju proteina, kao što je florbetapir (AV-45, Eli Lilly). Pacijentu se daje efikasna količina G3p fuzionog proteina, farmaceutskog preparata ili formulacije, kako je ovde opisano. U jednoj realizaciji, način primene je odabran od intratekalne injekcije, direktne intraventrikularne injekcije, intraparenhimalne injekcije ili intranazalne isporuke.

[0148] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija je za upotrebu u postupku razgradnje amiloida kod pacijenta, koji obuhvata davanje pacijentu, koji ima amiloid, efikasne količine g3p fuzionog proteina, farmaceutskog preparata ili formulacije, kako je ovde opisano. U jednoj realizaciji, način primene je odabran od intratekalne injekcije, direktne intraventrikularne injekcije, intraparenhimalne injekcije ili intranazalne isporuke. [0149] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija je namenjena za upotrebu u postupku uzrokovanja razgradnje β-amiloidnih depozita u mozgu, koji obuhvata injektiranje direktno u mozak pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine farmaceutskog preparata, kao što je ovde opisano, čime se uzrokuje smanjenje β-amiloidnih depozita u mozgu.

[0150] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija je za upotrebu u postupku redukcije stvaranja amiloida u mozgu. Redukcija obrazovanja amiloida u mozgu može sprečiti, lečiti ili smanjiti simptome ili težinu bolesti nastale usled greške u uvijanju proteina ili neurodegenerativne bolesti. U jednoj realizaciji, način primene je odabran od intratekalne injekcije, direktne intraventrikularne injekcije, intraparenhimalne injekcije ili intranazalne isporuke.

[0151] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutska kompozicija ili formulacija prema pronalasku je za upotrebu u postupku pospešivanja amiloidnog klirensa u mozgu. Pospešivanje amiloidnog klirensa može sprečiti, tretirati ili smanjiti simptome ili težinu bolesti usled greške u uvijanju proteina ili neurodegenerativne bolesti. U jednoj realizaciji, način primene je odabran od intratekalne injekcije, direktne intraventrikularne injekcije, intraparenhimalne injekcije ili intranazalne isporuke.

[0152] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija prema pronalasku je za upotrebu u postupku za inhibiciju agregacije amiloida u mozgu. Inhibicija amiloidne agregacije u mozgu može sprečiti, lečiti ili smanjiti simptome ili ozbiljnost usled nepravilne konformacije proteina ili neurodegenerativnog oboljenja. U jednoj realizaciji, način primene je odabran od intratekalne injekcije, direktne intraventrikularne injekcije, intraparehimalne injekcije ili intranazalne isporuke.

[0153] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija prema pronalasku je nemenjena za upotrebu u postupku za čišćenje toksičnih amiloidnih oligomera u mozgu. Čišćenje toksičnih amiloidnih oligomera u mozgu može sprečiti, lečiti ili smanjiti simptome ili ozbiljnost bolesti usled nepravilnog uvijanja proteina ili neurodegenerativne bolesti. U jednoj realizaciji, način primene je odabran od intratekalne injekcije, direktne intraventrikularne injekcije, intraparenhimalne injekcije ili intranazalne isporuke.

[0154] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija prema pronalasku je za upotrebu u postupku sprečavanja stvaranja toksičnih amiloidnih oligomera u mozgu. Sprečavanje stvaranja toksičnih oligomera u mozgu može sprečiti, lečiti ili smanjiti simptome ili ozbiljnost bolesti usled nepravilnog uvijanja proteina ili neurodegenerativne bolesti. U jednoj realizaciji, način primene je odabran od intratekalne injekcije, direktne intraventrikularne injekcije, intraparenhimalne injekcije ili intranazalne isporuke.

[0155] U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija prema pronalasku je za upotrebu u postupku za zaštitu neurona od amiloidnog oštećenja. Zaštita neurona od amiloidnog oštećenja može sprečiti, lečiti ili smanjiti simptome ili ozbiljnost bolesti usled nepravilnog uvijanja proteina ili neurodegenerativne bolesti. U jednoj realizaciji, način primene je odabran od intratekalne injekcije, direktne intraventrikularne injekcije, intraparenhimalne injekcije ili intranazalne isporuke. U jednoj realizaciji, g3p fuzioni protein, farmaceutski preparat ili formulacija prema pronalasku za upotrebu u zaštiti neurona od amiloidnog oštećenja se primenjuje profilaktički.

[0156] U nekim realizacijama, pacijent je pozitivan na biomarker povezan sa bolešću usled greške u uvijanju proteina i / ili bolesti agregacije. U jednoj realizaciji, biomarker je florbetapir (AV45, Eli Lilly).

[0157] U nekim realizacijama, pacijent pokazuje simptome neurodegenerativne bolesti koja je povezana sa prisustvom amiloida. U različitim realizacijama, amiloid je bilo koji od fAβ42, fαsin, fNM ili ftau.

[0158] U određenim realizacijama, neurodegenerativna bolest je Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest ili Huntingtonova bolest. U jednoj realizaciji, neurodegenerativna bolest je Alzheimerova bolest. U jednoj realizaciji, neurodegenerativna bolest je Alzheimerova bolest, a pacijent pokazuje β-amiloid, kao što je detektovano pomoću sredstva za snimanje florbetapira (AV-45, Eli Lilly).

[0159] U nekim realizacijama, pacijent pokazuje simptome bolesti posredovane prionom.

[0160] U izvesnim realizacijama, bolest posredovana prionom je izabrana od Creutzfeldt-Jakobove bolesti, kuru, fatalne familijarne nesanice, ili Gerstmann-Straussler-Scheinkerovog sindroma.

[0161] U nekim realizacijama, pacijent pokazuje simptome neurodegenerativne tauopatije, drugačije od Alchajmerove bolesti. U određenim realizacijama, bolest koja se tretira je odabrana od Argyrophilic grain demencije, kortikobazalne degeneracije, Dementia pugilistica, difuznih neurofibrilarnih čvorova sa kalcifikacijom, Daunovog sindrom, frontotemporalne demencije, uključujući frontotemporalnu demenciju sa parkinsonizmom povezanim sa hromozomom 17, Hallervorden-Spatzovu bolest, miotoničnu distrofiju, Niemann-Pickovu bolest tipa C, Non-Guamanian motornu neuronsku bolest sa neurofibrilarnim čvorovima, Pickovu bolest, postencefalitički parkinsonizam, progresivnu subkortikalnu gliozu, progresivnu supranuklearnu paralizu, subakutni sklerozni panencefalitis i samo demenciju.

Dijagnostički agensi

[0162] U drugom aspektu prema pronalasku, g3p fuzioni proteini i preparati ovde opisani, su korišćeni in vitro i / ili in vivo, u dijagnostičkoj primeni povezanoj sa različitim bolestima, ovde opisanim. Na primer, vezivanje g3p fuzionog proteina ili kompozicije prema pronalasku, kada se koristi kao sredstvo za snimanje ili in vivo ili in vitro može biti deo dijagnoze jedne od opisanih bolesti usled greške u uvijanju proteina.

[0163] Obuhvaćeni su dijagnostički agensi, inače, ovde označeni, kao dijagnostički preparati i mogu sadržati bilo koji od gore opisanih fuzionih proteina ili kompozicija pronalaska. Dijagnostički agens može dalje da sadrži detektibilnu oznaku, ili može drugačije biti detektovan in vivo.

[0164] U nekim realizacijama, g3p fuzioni protein iz pronalaska ili preparat koji sadrži fuzioni protein je korišćen kao sredstvo za snimanje amiloida. Sredstvo za snimanje može detektovati amiloid i dijagnostikovati bolesti u vezi sa sa amiloidom. Budući da fuzioni proteini i preparati iz pronalaska vezuju amiloid, bez obzira na vrstu vlakna, oni imaju prednost u tome što mogu da snime bilo koji amiloidni agregat (Αβ, tau, α-sinuklein, itd.) - sve sa jednim sredstvom za snimanje. Trenutno, ne postoje prihvatljivi agensi za snimanje / metode za tau ili alfa sinukleinske agregate u CNS-u. I dok postoje agensi za snimanje β-amiloida, još uvek postoji potreba za dodatnim agensima koji mogu da obezbede poboljšanu korelaciju između kognitivne funkcije i rezultata snimanja i / ili da bolje predvide koji će pacijenti imati pogoršanje nasuprot onima koji ostaju stabilni. Za pregled, videti Resnick & Sojkova, Alzheimer's Res Ther. (2011) 3 (1): 3

[0165] Dijagnostički g3p fuzioni proteini i preparati prema pronalasku mogu biti korišćeni kao sredstva za snimanje u kombinaciji sa sredstvom za snimanje, koje je specifično za β-amiloid kao što je, na primer, F18-AV-45, Eli Lilly. Pošto trenutno ne postoje poznati agensi za snimanje, za agregate koji nisu β-amiloidni, upotreba dijagnostičkog preparata iz ovog pronalaska, zajedno sa agensom za snimanje, specifičnim za β-amiloid, rezultiraće detekcijom agregata koji nisu β-amiloidni, na osnovu diferencijalne detekcije. Stoga, u jednoj realizaciji, dijagnostički g3p fuzioni protein ili preparat prema pronalasku je korišćen kao sredstvo za snimanje u kombinaciji sa agensom za snimanje β-amiloida za detekciju ne-β-amiloidnih agregata.

[0166] U drugoj realizaciji, dijagnostički preparat prema pronalasku je korišćen kao sredstvo za snimanje u detekciji β-amiloida u CNS-u, uključujući mozak.

[0167] Dijagnostički preparat prema pronalasku generalno, zahteva da komponenta fuzionog proteina za vezivanje amiloida bude vezana za jedan ili više detektabilnih obeleživača, kada se koristi kao sredstvo za snimanje. Na komponentu dijagnostičkog preparata za vezivanje amiloida mogu se vezati različite oznake, korišćenjem standardnih tehnika za obeležavanje proteina. Primeri oznaka uključuju fluorescentne oznake i radiooznake. Postoji širok spektar radiooznaka koje se mogu koristiti, ali uopšte obeležavanje se često bira od radioaktivnih obeleživača, uključujući, ali bez ograničenja na,<18>F,<11>C i<123>I . Ovi i drugi radioizotopi se mogu vezati za protein, korišćenjem dobro poznate hemije. U jednoj realizaciji, oznaka se detektuje korišćenjem pozitronske emisione tomografije (PET). Međutim, svaka druga pogodna tehnika za detekciju radioizotopa se takođe može koristiti za detekciju radiotrejsera.

[0168] Dijagnostički preparati prema pronalasku, mogu biti primenjeni korišćenjem istih puteva primene opisanim za terapeutske preparate. U jednoj realizaciji, intratekalna primena se koristi kao put za primenu dijagnostičkog preparata. U drugoj realizaciji, intravenska primena se koristi kao put za primenu dijagnostičkog preparata.

Primeri

[0169] Iako pokazana terapeutska efikasnost filamentnog faga kao vezujućeg i antiagregacijskog sredstva nije uslovljena bilo kojim posebnim mehanizmom delovanja, razumevanje mehanizma omogućuje dizajn faga sa većom terapeutskom efikasnošću. Pored toga, služi kao osnova za pripremu dodatnih agenasa protiv agregacije.

[0170] Kao što je prethodno navedeno, pokazano je se da se M13 vezuje za i razgrađuje najmanje četiri različita amiloidna vlakna: amiloid-β 1-42 vlakna (fAβ42), α-sinukleinska vlakna (fαsin), prionska NM vlakna kvasca (fNM) i tau vlakna (ftau). Četiri proteina koja čine ova amiloidna vlakna imaju nepovezanu primarnu aminokiselinsku sekvencu, ali sva četiri su pogrešno uvijena u utvrđeni amiloidni prevoj. Eichner & Radford, 2011. Sposobnost M13 da se vezuje za i posreduje u disagregaciji svakog od ovih, pokazuje da M13 prepoznaje strukturni motiv, kao što je konformacija unakrsne beta ploče ili konformacionu karakteristiku kao što su hidrofobne šume, koje oboje definišu karakteristike svih amiloidnih vlakana.

[0171] Ali, dezagregacija amiloida nije opšte svojstvo svih faga. Na primer, strukturno različiti ikozahedralni fag T7 ne posreduje disagregaciju fAβ42, čak i kada se T7 inkubira sa fAβ42 tokom 3 dana, na 37 ° C. Bakteriofag T7 nije pokazao nikakvu disocijacionu aktivnost ni u koncentracijama pri kojima M13 disocira preko 70% koinkubiranih amiloidnih vlakana. Nasuprot tome, bakteriofag fd, koji nosi negativno naelektrisanu aminokiselinu u svom g8p u poređenju sa M13 (i stoga pokazuje 2800 više negativnih naboja/ faga od M13, s obzirom na broj kopija g8p), vezanog i razdvojenog fΑβ42 slično sa M13. Ove inicijalne studije, zajedno sa otkrićem da bi amiloidna disagregacija takođe mogla biti posredovana sa mozaičnim virusom duvana (TMV) E. coli pili i repnim cevima T4, od kojih svi takođe imaju oblik spiralnog cilindra i ponavljajuće jedinice (videti US 2011/0182948), sugerišući da oblik faga može biti kritičan za njegovu aktivnost disocijacije amiloidnih vlakana.

[0172] Međutim, sledeći primeri opisuju alternativni (iako ne međusobno isključivi) mehanizam za prijavljeno vezivanje i anti-agregacijska svojstva filamentoznog faga. Na osnovu ovih primera i mehanizma delovanja koji podržavaju, obezbeđeni su g3p fuzioni proteini koji imaju poboljšano vezivanje za amiloid.

Primer 1: M13 fag preferentno vezuje Αβ fibrile

[0173] Vezivanje M13 za Αβ fibrile nasuprot Αβ monomera je određeno pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR).

[0174] M13 fag preferencijalno vezuje Αβ fibrile; on ne vezuje Αβ monomere. Studije površinske plazmonske rezonance, korišćenjem 10<14>faga/ml, koji je prolazio preko biosenzorskog čipa sa imobilisanim fAβ prikazani su na Sl. 3. Slika 3 pokazuje da je vezivanje KDM13 oko 4 nM, što je uporedivo sa vezivanjem monoklonskog antitela. Ova visoko afinitetna interakcija ukazuje na to da nastaje specifični proces vezivanja između faga i amiloidnog vlakna.

Primer 2: Vezivanje M13 za Aβ fibrile je dozno zavisno

[0175] M13 vezivanje za fAβ42 je takođe dozno zavisno. Na Slici 4A je poređeno vezivanje dve doze faga sa povećanjem molarnih količina fAβ42. U ovom testu vezivanja M13-amiloidno vlakno, M13-Alexa488 je pomešan sa Αβ (fAβ) tokom 2-3 sata, kako bi se omogućilo formiranje kompleksa, a onda se kompleks taloži centrifugiranjem na 7500 rpm, tokom 10 minuta. Fluorescencija pelete je bila proporcionalna sa M13 vezanim za amiloid. Ovaj test obezbeđuje i kvantitativnu meru vezivanja faga na fAβ i obezbeđuje sistem za procenu sposobnosti drugih agenasa da se takmiče sa fagom za vezivanje. Slika 4B pokazuje da je takmičenje za vezivanje KDza M13 slično onome koje je primećeno za vezivanje korišćenjem površinske plazmonske rezonance.

Primer 3: Vezivanje M13 za Αβ fibrile zahteva nativnu konformaciju

[0176] Kada se M13 fag zagreva na 90°C tokom 10 minuta, njegova sposobnost da se takmiči za vezivanje je suštinski ukinuta. Slika 5 pokazuje rezultate vezivanja konkurencije korišćenjem toplotno obrađenih (kutija) nasuprot nativnoj konformaciji (krugovima) M13 u testu konkurentskog vezivanja amiloidnih vlakana.

Primer 4: Temperatura je u korelaciji sa interakcijama M13-amiloida

[0177] M13 snažno razdvaja amiloidna vlakna. Slika 6 prikazuje Thioflavin T (ThT) test fluorescencije, korišćenjem fAβ. U prisustvu M13, fAβ42 disagregira.

[0178] Sl. 7A prikazuje da promena koncentracije soli u ThT fluorescenciji 10 puta (od 0,15 do 1,5 M) rezultira razlikom od samo 2-3 puta u procentu razdvojenog fAβ. Ovo ukazuje da su hidrofobne interakcije odgovorne za većinu uočenih dezagregacija.

[0179] Za razliku od relativno malog efekta koncentracije soli, Sl. 7B prikazuje da promena temperature od 4 ° C do 37 ° C dovodi do razlike od 8-10 puta u disagregaciji.

[0180] Ovi rezultati ukazuju da disagregacija M13 zavisi od proteina, koji je aktivniji na višoj temperaturi i da je relativno neosetljiva prema efektu soli u testu, što implicira hidrofobnu interakciju. Fag g3p odgovara ovom opisu. Njegovi N1 i N2 domeni su povezani fleksibilnim linkerom bogatim glicinom, koji se "otvara" nakon vezivanja N2 za bakterijski F-pilus. N1 je onda dostupan za vezivanje bakterijskog ko-receptora kao dela u procesu infekcije. Očekuje se da će povećanje temperature u testu disagregacije "otvoriti" N2 i N1 domene g3p-a.

[0181] Dok inaktivacija M13 na visokoj temperaturi (90 ° C, 10 minuta, videti Sliku 5) ukida vezivanje, povećanje temperature inkubacije u testu vezivanja M13-amiloida ima pozitivan efekat na vezivanje. Sl. 8A pokazuje da povećanje temperature od 18 ° C do 58 ° C rezultira u progresivno boljem vezivanju do približno TMšarke, koja se odvija na oko 50 ° C, u ovoj tačci vezivanje počinje da se smanjuje. Ova optimalna temperatura vezivanja je konzistentna sa temperaturom odvijanja u N1-N2 (tzv. temperatura topljenja ili TM) u g3p-u, koja je 48,1 ° C. Povećanje temperature inkubacije na 50 ° C nasuprot 37 ° C takođe rezultira bržim vezivanjem M13 za fAβ42. Sl.

8B.

Primer 5: potreban je g3p za M13-β-amiloidnu interakciju

[0182] Za direktno ispitivanje da li je potreban g3p za interakciju M13-β-amiloida, g3p je uklonjen iz faga proteolitičkim tretmanom sa ArgC (M13Δg3p) i fagom M13Δg3p u poređenju sa ponovo uvijenim fagom za vezivanje Αβ. Tretman sa ArgC, Bacillus proteazom, selektivno uklanja g3p podjedinice od faga. Rezultati su prikazani na Slici 9A. Ponovo uvijen M13 se još uvek takmiči sa divljim tipom M13, u testu kompetitivnog vezivanja, mada na sniženom nivou. Međutim, M13Δg3p se čak 15 puta slabije takmičio, ako i uopšte sa divljim tipom M13. Ova nesposobnost da se takmiči sa divljim tipom M13 je u skladu sa gubitkom infektivnosti u M13Δg3p fagu. Sl.9B. ArgC tretman je takođe prouzrokovao gubitak aktivnosti disagregacije. Sl.9C.

[0183] Ako g3p posreduje vezivanje na način analogan svojoj ulozi u infekciji, onda se domeni N1 i N2, koji su važni za infekciju takođe takmiče sa M13 za vezivanje. Da bi se ovo testiralo, pripremljen je rekombinantno rastvorljiv N1 N2 ("rs-g3p (N1 N2)"; "Konstrukt 3") i testiran u kompetitivnom testu. Kao što je prikazano na Sl.

10A i 10B, M13 se takmiči sa obeleženim M13 za vezivanje za fAβ42, ali ne M13Δg3p. Nasuprot tome, rs-g3p (N1 N2) je bio sposoban da se takmiči sa M13, što ukazuje da su domeni N1 i N2 g3p-a dovoljni za vezivanje βamiloida. Slični rezultati su dobijeni ponavljanjem kompetitivnog testa. Sl.10B.

Primer 6: g3p razvijene mutacije šarke moduliraju vezivanje amiloida

[0184] Mutacije koje utiču na sposobnost zglobnog regiona između N1 i N2 domena g3p-a da se otvori, takođe, treba da utiču na sposobnost faga koji nosi te mutacije, da se takmiči sa divljim tipom M13 za vezivanje za Αβ. Eckert & Schmid, 2007, opisali su nekoliko varijanti faga koji su korišćeni da testiraju ovu hipotezu. Varijanta "AAA" (takođe poznata i kao "3A") slabi vezivanje pilusa i smanjuje stabilnost N2 domena. AAA nosi sledeće mutacije u g3p-u: W181A, F190A i F194A. IIHY sadrži mutacije T13I, T101I, Q129H i D209Y, koje stabilizuju N2 domen i povećavaju TM.

[0185] Konkurenstko vezivanje je procenjeno za fag fd, koji ima istu aminokiselinsku sekvencu, kao M13 g3p u domenima N1 i N2 (Sl. 2); IIHY, koji ima višu Tm šarke od M13 i AAA. Fagovi fd, AAA i IIHY su prethodno aktivirani na 50°C tokom 1,5 sata, zatim su aktivirani i neaktivirani Fd, AAA i IIHY upoređeni na njihovu sposobnost da se takmiče sa obeleženim M13. Slika 11 prikazuje rezultate. Divlji tip fd je bio bolji konkurent kada je aktiviran grejanjem. Suprotno, grejanje je imalo mali uticaj na IIHY, koji ima višu Tm šarke. AAA, koja je smanjila stabilnost N2 domena u odnosu na M13, bila je bolji konkurent sa ili bez toplotnog predtretmana.

[0186] Ovi podaci podržavaju zaključak da se interakcija M13 sa β-amiloidom odvija putem mehanizma sličnog onome pomoću koga M13 inficira bakteriju. Prvo, oni pokazuju da su hidrofobne interakcije važne za M13-βamiloidnu interakciju. Drugo, temperaturna zavisnost vezivanja M13 i aktivnosti razgrađivanja odražavaju Tm razvijanja N1-N2 šarke.Treće, selektivna proteoliza g3p-a ukida M13-β -amiloidne interakcije.

Primer 7: Jedan g3p fragment selektivno & snažno vezuje amiloid, ali ne monomere

[0187] Da bi se procenilo da li fragment g3p-a zadržava sposobnost vezivanja za amiloid, pripremljen je jedan g3p fragment, koji sadrži N1 i N2 i procenjen za njegovu sposobnost da vezuje Aβ fibrile nasuprot Αβ monomerima pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR). Rezultati ukazuju da rs-g3p (N1N2) preferentno vezuje Αβ fibrile; on ne vezuje Αβ monomere. Na slici 13 su prikazane studije površinske plazmonske rezonance korišćenjem 4 μM rs-g3p (N1N2), što takođe pokazuje vezivanje KDrs-g3p (N1N2) koje je oko 160 nM. Ova visoko afinitetna interakcija ukazuje na to da se specifičan proces vezivanja javlja između rs-g3p (N1N2) i amiloidnog vlakna.

[0188] Dodatni konstrukti su procenjeni pomoću SPR-a. U tabeli ispod su sumirani rezultati.

Primer 8: Jedan g3p fragment snažno blokira sposobnost Αβ42 vlakana da se udružuju

[0189] Da se testira da li jedan g3p fragment može blokirati udruživanje amiloidnih vlakana, ispitan je rs-g3p (N1 N2) u ThT testu fluorescencije, na njegovu sposobnost da sprečava agregaciju vlakana fΑβ42. Rezultati ukazuju da rs-g3p (N1 N2) snažno blokira udruživanje Αβ42. Sl. 14A prikazuje rezultate ovog eksperimenta, da rs-g3p (N1 N2) sprečava udruživanje Αβ42 u vlakna, na način koji zavisi od doze. Sl. 14B prikazuje IC50da bude približno 20 nM.

[0190] U odvojenom eksperimentu, Αβ42 je inkubiran sa ili bez rs-g3p (N1 N2), pri koncentraciji od 2 μM, tokom sedam dana, na 37 ° C, a integritet vlakana Αβ42 vlakana je procenjen pomoću transmisione elektronske mikrografije. Sl. 15A prikazuje rezultate ovog eksperimenta, da rs-g3p (N1 N2) blokira sposobnost Αβ42 da se udružuju u amiloidna vlakna. Sl.15B prikazuje rezultate ThT testa na ovim istim uzorcima.

Primer 9: rs-g3p (N1 N2) blokira α-sinuklein, ftau i sakupljanje Aβ i g3p-Ig fuzioni protein blokira sakupljanje i inhibira agregaciju Aβ

[0191] Da bi se utvrdilo da li g3p može da blokira udruživanje α-sinukleinskih vlakna, a takođe i da se utvrdi da li valenca (tj. broj kopija g3p-a) igra ulogu, sproveden je test koji ispituje sposobnost pentamernog g3p-a (5 kopija g3p-a) i monomernog g3p-a (jedna kopija g3p-a) da blokiraju aktivnost α-sinukleina. Rezultati prikazuju da g3p blokira udruživanje α-sinukleinskog vlakna i da je pentamerni g3p efikasniji od monomernog g3p u ovoj aktivnosti. Videtii Sliku 16.

[0192] Takođe je procenjena sposobnost rs-g3p (N1 N2) (Konstrukta 3) i jednog reprezentativnog g3p fuzionog proteina, rs-g3p (N1 N2)- hIgG1- Fc (Konstrukta 6), da sprečavaju udruživanje Αβ42. Kao što je prikazano na Sl.

30 i Sl. 31 , Konstrukt 3 i Konstrukt 6 su sposobni da sprečavaju sastavljanje fAβ42, na način koji zavisi od doze. Kao što je prikazano na Sl.37, Konstrukt 3 i Konstrukt 6 su sposobni da inhibiraju agregaciju fΑβ42.

[0193] Takođe je procenjena sposobnost rs-g3p (N1 N2) (Konstrukta 3) da inhibira udruživanje ftau-a. Kao što je prikazano na Sl.44A i Sl.44B, Konstrukt 3 je sposoban da spreči sklapanje ftau-a u zavisnosti od doze.

Primer 10: Jedan g3p fuzioni protein se vezuje za i razgrađuje Αβ

[0194] Da bi se procenilo da li g3p valenca igra ulogu u jačini vezivanja g3p-a za amiloid, napravljen je jedan Ig fuzioni protein, koji je dvovalentan za rs-g3p (N1 N2) ("rs-g3p (N1 N2) ~ Ig fuzija") i upoređen je sa petovalentnim M13, za njegovu sposobnost da se vezuje za Αβ vlakna. Kao što je prikazano na Slici 17, rs-g3p (N1 N2)-Ig fuzija se vezuje za Αβ sa sličnim afinitetom kao M13, i jače od samog rs-g3p (N1 N2), što ukazuje na to da valenca g3p-a može biti važna. Slični rezultati su dobijeni ponavljanjem kompetitivnog testa. Slika 18. Na Slici 18, kvadrati predstavljaju Konstrukt 2 (M13); trouglovi predstavljaju Konstrukt 3 (rs-g3p (N1 N2)); trouglovi okrenuti naopako predstavljaju Konstrukt 4 (rs-g3p (N1 N2) - Ig fuziju); a dijamanti predstavljaju jednu r-IgG4 Fc negativnu kontrolu.

[0195] Da bi potvrdili da se g3p fuzioni proteini prema pronalasku ne vezuju nespecifično i za ne-amiloidne proteine i polimere, kao što su, na primer, hidrofobni proteini i proteinski polimeri, Konstrukt 6 (50 nM ili 200 nM) je testiran na vezivanje za ne-amiloidne proteine / polimere, kazein (hidrofobni), želatin (polimer), elastin (kolagenski polimer) i goveđi serumski albumin (hidrofobni serumski protein). Αβ42 vlakna su korišćena kao pozitivna kontrola. Korišćen je ELISA format u kome je 100 ng od svakog testiranog proteina imobilisano na visoke adsorbentne mikrotitarske bazenčiće (dva testirana tipa), a zatim inkubirano sa Konstruktom 6 ili nepovezanim negativnim kontrolnim IgG1 antitelom (200 nM), tokom 1 časa, na 37 ° C. Detektovanje vezanog Konstrukta 6 ili IgG1 negativne kontrole je izvedeno nakon blokiranja i koraka ispiranja, korišćenjem antihumanog-Fc antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP). Kvantifikacija je određena apsorpcijom na 405 nm, nakon dodavanja HRP razvijača. Rezultati prikazuju da Konstrukt 6 preferencijalno vezuje amiloidna vlakna u poređenju sa proteinskim polimerima, koji nisu amiloidni ili hidrofobnim proteinima. Vezivanje konstrukta 6 za ne-amiloidne proteine bilo je uporedivo sa nepovezanim hIgG1-negativnim kontrolnim antitelom.

[0196] Da bi se procenilo da li ili ne valenca takođe igra ulogu u disagregaciji, dvovalentna rs-g3p (N1 N2) -Ig fuzija ("Konstrukt 4") je upoređivana sa pentavalentnim M13 u testu filtera klopke. Slika 19. Rezultati ukazuju da i dvovalentna rs-g3p (N1 N2) -Ig fuzija i pentavalentni M13 snažno disagregiraju β-amiloidna vlakna. Takođe je naznačeno da valenca može biti važna za jačinu disagregacije, što je pokazano sposobnošću 1,7 nM pentavalentnog M13 da smanjuje agregate na sličnom nivou sa 40 nM rs-g3p (N1 N2) -Ig fuzije. Sl.19.

[0197] U sličnom testu, analizirano je 1 x 10<12>/ ml M13 (Konstrukta 2); 80 nm i 800 nM rs-g3p (N1 N2)-hIgG4-Fc (Konstrukta 5); i 80 nm i 800 nM rs-g3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukta 6) na njihovu sposobnost da razdvajaju vlakna Αβ42 u testu sa filterom. Konstrukti 2, 5 i 6 snažno razgrađuju β-amiloidna vlakna. Sl. 33. Stoga, g3p fuzioni proteini mogu biti korišćeni terapeutski ili profilaktički za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja gde je prisutan amiloid.

Primer 11: Tetramerni streptavidin-[biotin-g3p (N1 N2)] protein se vezuje za i razgrađuje fAβ

[0198] Da bi se dalje procenila uloga valence na sposobnost g3p-a da se vezuje i disagregira amiloid, pripremljen je tetramerni streptavidin konjugovani g3p (N1 N2), kombinovanjem rs-g3p (N 1 N2) sa Biotin-Liz-NTA u prisustvu NiSO4. Višak liganda je uklonjen pomoću MWCO 3KDa membrane. Dodat je streptavidin, a višak rs-g3p (N1N2)-Biotin je uklonjen korišćenjem MWCO 100 KDa membrane. Dobijeni g3p konstrukt, streptavidin-[biotin-g3p (N1N2)], ima četiri rs-g3p (N1 N2) ostatka. Streptavidin-[biotin-g3p (N1 N2) 3 je poređen sa rs-g3p (N1 N2) ("Konstruktom 3") u testu vezivanja. Sl. 20. Tetramerni streptavidin-[biotin-g3p (N1 N2)] vezan za fΑβ jače od monomernog rs-g3p (N1 N2), pruža dodatnu indikaciju da je valenca važna za jačinu vezivanja. Slika 20. Međutim, čak i monomerni rs-g3p (N1 N2) vezan za fΑβ je u terapijski prihvatljivim nivoima.

[0199] Da bi se utvrdilo da li ili ne valenca takođe igra ulogu u disagregaciji, monomerni rs-g3p (N1 N2) je upoređivan sa tetramernim streptavidin-[biotin-g3p (N1 N2)] u analizi sa filterom. Slika 21. Rezultati ukazuju da i monomerni rs-g3p (N1 N2) i tetramerni streptavidin-[biotin-g3p (N1 N2) snažno razgrađuju fΑβ vlakna. Takođe je naznačeno da valenca može biti važna za jačinu disagregacije, što je pokazano superiornom sposobnošću 360 nM tetramernog streptavidin-[biotin-g3p(N1 N2)] za uklanjanje do 200 ng fAβ agregata, u poređenju sa smanjenom disagregacijom Αβ pomoću 2.5μM monomernog rs-g3p (N1 N2). Slika 21, red 2 u poređenju sa redom 4, na primer.

[0200] Dezagregacija Αβ pomoću streptavidin-[biotin-g3p (N1 N2)] je takođe procenjena pomoću TEM-a. Streptavidin-[biotin-g3p (N1 N2)] potpuno razgrađuje fAβ42, nakon tri dana inkubacije. Slika 22.

Primer 12: g3p ~ Ig fuzioni proteini značajno redukuju postojeći Αβ plak u mišjem modelu Alzheimerove bolesti

[0201] Korišćenjem dobro poznatog modela miša za proučavanje Alzheimerove bolesti (Hsiao i sar., Science (1996) 274: 99-102; Duyckaerts i sar., Acta Neuropathol (2008) 115: 5-38), mužjacima Tg2576 miševa, starosti više od 500 dana, injektirana su (2 μL / injekciji) bilateralno u hipokampus, dva različita preparata od N1 N2- Ig fuzija (Konstrukt 5 pri 7,8 μg / injekciji i Konstrukt 6 pri 8,2 μg / injekciji) ili fiziološki rastvor kao negativna kontrola, a žrtvovani su 7-og dana. Tkivo mozga je sakupljeno, presečeno i obojeno za kvantifikaciju opterećenja plaka korišćenjem anti-amiloidnog beta monoklonskog antitela (82E1; kat.# MBS490005-IJ10323 od MyBioSource-a). Kao što je prikazano na Sl. 28, oba N1-N2-Ig fuziona proteina značajno smanjuju punjenje plaka, mereno u hipokampusu, u poređenju sa miševima tretiranim sa fiziološkim rastvorom. Kao što je prikazano na Sl.

29, oba N1 N2-Ig fuziona proteina značajno smanjuju opterećenje plaka mereno u cerebralnom korteksu u poređenju sa miševima tretiranim sa fiziološkim rastvorom.

[0202] Nivo sinaptofizina, komponente neurona u sinapsama, meren je u hipokampusu miševa Tg2576, nakon tretmana sa Konstruktima 5 i 6. Korišćeno je antitelo anti-sinaptofizina SY38 (Milliporte). Poznato je da nivoi sinaptofizina koreliraju sa sinaptičkom gustinom i time povećavaju ekspresiju, ukazujući na oporavak od prethodnog oštećenja plaka. Videti DaRocha-Souto i sar. (2011) J. Neuropathol Exp Neurol 70 (5): 360-376. Kao što je prikazano na Sl. 40, oba N1N2-IgG fuziona proteina značajno povećavaju nivo sinaptofizina u hipokampusu miševa kod Alzheimerove bolesti. Rezultati ukazuju na to da pored smanjenja nivoa plaka, lečenje miševa sa Alzheimerovom bolešću sa N1N2-Ig fuzionim proteinima rezultira dodatnim fiziološkim prednostima.

[0203] Slično, nivo Iba-1, markera aktivacije mikroglija, za koji se veruje da je neophodan za uklanjanje plaka (videti, npr., Wilcock i sar. (2004) J. Neurosci.24 (27): 6144-6151), bio je izmeren u hipokampusu Tg2576 miševa, nakon tretmana sa Konstruktima 5 i 6 korišćenjem antitela anti-Iba-1. Kao što je prikazano na Sl. 41, oba N1 N2-IgG fuziona proteina značajno povećavaju nivo Iba-1 u hipokampusu miševa kod Alzheimerove bolesti, kada su testirani 7 dana / nedelja nakon terapije. Rezultati su potvrda da lečenje miševa sa Alzheimerovom bolešću sa N1N2-Ig fuzionim proteinima rezultira uklanjanjem plaka.

[0204] U hipokampusu miševa Tg2576 izmereni su nivoi glijalnog fibrilarnog kiselinskog proteina (GFAP), markera aktivacije astrocita i inflamacije mozga, nakon tretmana sa Konstruktima 5 i 6, korišćenjem anti-GFAP antitela (Millipore # AB5804). Poznato je da se nivoi GFAP povećavaju sa oštećenjem mozga. Videti, na primer, DaRocha-Souto i sar. (2011) J. Neuropathol Exp Neurol 70 (5): 360 – 376, strana 374. Stoga, GFAP može biti korišćen kao marker, nakon bilo kog posebnog tretmana, kako bi se procenilo da li tretman povećava nivoe GFAP-a, što ukazuje na to da tretman može da oštećuje mozak. Kao što je prikazano na Sl. 42, niti N1N2-IgG fuzioni proteini značajno povećavaju nivo GFAP-a u hipokampusu miševa kod Alzheimerove bolesti, što ukazuje na to da lečenje miševa sa Alzheimerovom bolešću N1N2-IgG fuzionim proteinima ne oštećuje hipokampus. Stoga, g3p fuzioni proteini mogu biti korišćeni terapeutski ili profilaktički za lečenje Alzheimerove bolesti.

Primer 13: g3p - Ig fuzioni proteini blokiraju citotoksičnost indukovanu Αβ oligomerom

[0205] Αβ oligomeri izazivaju otpuštanje izvesnih toksičnih enzima u ćelijama neurona. Enzim se može analizirati kako bi se utvrdilo da li jedinjenje može inhibirati citotoksičnost

indukovanu Αβ oligomerom. Sl. 32 predstavlja reprezentativne podatke, koji pokazuju da M13 (Konstrukt 2) i rsg3p (N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukt 6) blokiraju toksičnost izazvanu oligomerom na ćelije N2a. G3p-Ig fuzioni proteini su zato snažni inhibitori citotoksičnosti izazvane Αβ oligomerom.

Primer 14: g3p-Ig fuzioni proteini se vezuju za i dezagregiraju tau i smanjuju Αβ plak & p-tau kod starih 3xTg miševa i kod starih tau transgenih miševa

[0206] Da bi se procenilo da li se jedan g3p-Ig fuzioni protein vezuje za tau, jedan g3p fragment-Ig fuzionog proteina, koji sadrži N1 i N2 je pripremljen i procenjen na njegovu sposobnost da vezuje ftau pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR). Slika 35 prikazuje rezultate jednog reprezentativnog SPR testa, koji pokazuje da rsg3p (N1 N2)-hIgG4-Fc (Konstrukt 4) snažno vezuje ftau. Slika 48 prikazuje rezultate drugog reprezentativnog SPR testa, koji pokazuje da rs-g3p(N1 N2)-hIgG1-Fc (Konstrukt 6) snažno vezuje ftau.

[0207] Da bi se testiralo da li jedan fuzioni protein g3p-Ig može razgraditi tau, jedan g3p fragment-Ig fuzinog proteina, koji sadrži N1 i N2 je testiran u ThT testu fluorescencije, na njegovu sposobnost da degradira prethodno formirani ftau. Rezultati ukazuju da jedan g3p-Ig fuzioni protein snažno disagregira ftau. Videti, Slika 36A, Slika 36B, Slika 49A i Slika 49B.

[0208] Da bi se testiralo da li je jedan g3p-Ig fuzioni protein efikasan in vivo, mužjacima i ženkama miševa 3xTg, starosti 19-20 meseci, koji su prepoznati kao model za Alchajmerovu bolest (videti Sterniczuk i sar., 2010 Brain Res 1348: 139; Sterniczuk i sar., 2010 Brain Res 1348: 149), data je direktna injekcija rs-g3p (N1 N2)-hIgG-Fc (Konstrukta 6) ili kontrola u hipokampalni region mozga. Moždano tkivo je dobijeno 7 dana nakon injekcije. Sekcije su imunoobojene za Αβ plak sa anti-amiloidnim beta monoklonskim antitelom (82E1; kat.# MBS490005-IJ10323 od MyBioSource-a), ili za p-Tau sa anti-PHF1 antitelom (videti Kosik i sar., 1986, Proc Natl Acad Sci USA 83 (11): 4044; PHF = upareni spiralni filament (i)) . Upareni spiralni filamenti su jedna familija vlakana koja sadrže tau, koja se akumuliraju u velikim citoplazmatskim agregatima poznatim kao neurofibrilarni čvorovi i prepoznati su kao marker za tau. Rezultati prikazuju da Konstrukt 6 značajno smanjuje nivoe plakova Αβ u hipokampusu tretiranih miševa u poređenju sa kontrolama. Videti, Sl.52A. Rezultati takođe prikazuju da Konstrukt 6 značajno smanjuje nivoe tau u hipokampusu lečenih miševa u poređenju sa kontrolama. Videti, Sl.52B. Korišćen je jednostrani Dunnetov test (* p < 0,05; ** p < 0,01).

[0209] Da bi se procenila sposobnost g3p fuzionih proteina prema pronalasku za redukciju tau u drugačijem in vivo modelu, proučavani su stari tau (P301 L) transgeni miševi. Tau (P301 L) miševi prekomerno eksprimiraju tau i prepoznati su kao model za ispitivanje Alzheimerove bolesti. Videti, Lewis J i sar. (2000) Nat Genet 25: 402-405. Stari miševi P301 L ispoljavaju označenu hipoaktivnost kao fenotip, koji je povezan sa tau patologijom. Konstrukt 6 (pri oko 2 mg / Kg) je primenjen kao infuzija na leđima tau (P301 L) miševa (N = 7) hronično, putem implantiranih intratekalnih pumpi, tokom 14 dana. Nakon 14 dana, primećene su motorne aktivnosti miševa (pređeno rastojanje preko 10 min) na slepi način. Miševi tretirani konstruktom 6, ali ne i miševi tretirani PBS-om, pokazali su značajno veću motoričku aktivnost. Konstrukt 6 nije imao efekta kod miševa divljeg tipa (N = 10). Stoga, g3p fuzioni proteini prema pronalasku mogu biti korišćeni terapeutski i / ili profilaktički kod bilo koje bolesti ili poremećaja gde je prisutan tau.

Primer 15: g3p-Ig fuzioni proteina inhibiraju PrP<Sc>akumulaciju, agregaciju i PrP<Sc>formiranje u modelu ćelijske kulture prionske bolesti (N2a22L<Sc>)

[0210] Prionske bolesti su karakterisane konverzijom normalnog ćelijskog prionskog proteina (PrP<c>) u patološku formu PrP<Sc>rezistentnu na proteazu. PrP<Sc>se razlikuje od PrP<c>na bazi otpornosti na proteazu: proteaza delimično degradira PrP<Sc>da bi se formirao fragment C-terminalnog jezgra otporan na proteazu (PrPres), koji ima neglikozilovan oblik sa molekulskom težinom od 19-21 kDa. Inhibicija, promena i smanjenje PrP<Sc>čine održivi terapeutski pristup za lečenje nekoliko degenerativnih bolesti.

[0211] Da bi se utvrdilo da li jedan g3p-Ig fuzioni protein, koji sadrži N1 i N2 ometa nastanak patoloških prionskih konformera (PrP<Sc>) na in vitro modelima prionske bolesti i da se verifikuje disagregacija ili promena rastvorljivosti PrP u N2a22L<Sc>ćelijama, u prisustvu ili odsustvu g3p-Ig fuzionog proteina, ćelije su kultivisane tokom 24 h, u odsustvu ili prisustvu 1 μg / ml Konstrukta 6 ili IgG-a i sakupljene u puferu za lizu. 100 μg ukupnog proteina je ultracentrifugirano na 4 ° C tokom 90 min, na 55,000 rpm u TLA 100.1 rotoru u Beckman Optima TL ulfracentrifugi. Uzorci od 25 μl solubilizovanih peleta i supernatanta su podvrgnuti SDS-PAGE i nishodnoj analizi sa anfi-PrP antitelom 6D11 mAt. Povećana nerastvorljivost deterdženta prethodi nastanku proteinaza K rezistencije (PK) pomoću PrP<Sc>ili PrP mutanata, stoga je procenjena sposobnost g3p-Ig fuzionog proteina da menja rastvorljivost PrP-a. Ćelije koje su tretirane sa Konstruktom 6 pokazuju značajno smanjene količine agregiranog / nerastvornog PrP u poređenju sa IgG tretiranim N2a22L<Sc>ćelijama. Videti Sl.38A i Sl.38B.

[0212] Za Sl. 38A i 38B, N2a22L<Sc>ćelije su generisane kao što je prethodno opisano (Pankiewicz i sar., Eur. J. Neurosci. (2006) 23: 2635-2647). Ukratko, mozgovi terminalno obolelih CD-1 miševa inficiranih sa mišjim adaptiranim prionskim sojem 22L su homogenizovani sonikacijom (10% težine / zapremine) u hladnom fosfatnopuferovanom fiziološkom rastvoru i 5% dekstrozi, pod sterilnim uslovima. Za infekciju, homogenat mozga je dodatno razblažen na 2% u Opti-MEM i dodan u subkonfluentne ploče sa šest bazenčića (Corning, Acton, MA, SAD), 1 ml na 10 cm<2>bazenčića. Nakon 5 sati, dodato je 1 mL regularnog MEM i ćelije su inkubirane u prisustvu infektivnog homogenata mozga, tokom dodatnih 12 sati. Ćelije su isprane i dodat je standardni MEM medijum za rast. Ćelije su gajene do konfluentnih, a zatim su razdvojene u razblaženja od 1: 2 i prenete u bočice od 25 cm<2>(Corning). Ćelije koje su gajene u jednoj od bočica podeljene su na 1:2, svakih 4 dana kako bi se dovele do sledećih prolaza, dok su ćelije koje su gajene u drugoj bočici sakupljene i homogenizovane da prate nivo PrP<Sc>. Na osnovu prethodnih studija, prisustvo izvedenog inokuluma PrP<Sc>je samo otkriveno u prvom i drugom prolazu, tako da su ćelije prolaza 4 (P4) korišćene za sve sledeće studije. Ćelije su lizirane u puferu za homogenizaciju sastavljenom od (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM etilen glikol tetrasirćetne kiseline (EGTA), 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 2,5 mM Na4P2O7, 1 mM β-glicerofosfata, 1% NP-40, 0,25% natrijum deoksiholata, 0,5 mM fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF), 1 mM leupeptina, 1 mM pepstatina A, 1 mM) ili bez PMSF za PK digestiju) tokom 5 min, na 4 ° C i nerastvorni materijali su uklonjeni centrifugiranjem na 10,000 g tokom 10 min, na 4 ° C. Za frakcionisanje ćelija, 100 μg proteina je centrifugirano na 55,000 rpm tokom 90 min, nakon čega je talog ponovo rekonstituisan u početnoj zapremini.20% obe pelete i supernatanta je rešeno i okarakterisano biohemijski.

[0213] Da bi se rešilo da li g3p-Ig fuzioni proteini menjaju prostiranje PrP<Sc>u zavisnosti od doze, disagregacijom ili promenom njegovih fizičko-hemijskih svojstava, ćelije N2a22L<Sc>su kultivisane tokom 24h u odsustvu ili prisustvu povećanih koncentracija Konstrukta 6 ili IgG-a i sakupljene u lizirajućem puferu. Alikvoti liziranih ćelija sa i bez PK tretmana su podvrgnuti SDS-PAGE i nishodnoj analizi sa anti-PrP antitelom 6D11 i 6H4 mAt. Procenjena je imunoreaktivnost PrP-a u biokemijski razgrađenom PK digestiranom i nedigestiranom lizatu iz Kontrolnog IgG-a i ćelija tretiranih sa Konstruktom 6. Tretmani su obuhvatali: N2a22L<Sc>+ 10 μg / ml, 3 μg / ml, 1 μg / ml, 0,333 μg / ml, 0,111 μg / ml, 0,037 μg / ml, 0,012 μg / ml, i 0,004 μg / ml Konstrukta 6, ili N2a22L<Sc>+ 1 μg / ml mIgG-a.

[0214] Rezultati ukazuju na značajno smanjenje PrP<Sc>, u zavisnosti od doze, u prisustvu Konstrukta 6, sa 50% manje PrP<Sc>generisanog u prisustvu 0,08 μg / ml Konstrukta 6 u poređenju sa 1 μg / ml IgG-a. Videti Sl.39A i Sl.

39B. Ponovljeni eksperimenti su potvrdili ove rezultate.

[0215] Za procenu proteinaza K (PK)-rezistentnog konformera PrP-a, alikvoti liziranih ćelija, tretirani su sa PK (1 μg / μg) razblaženje 1: 50, na 37 ° C, tokom 30 min, prema prethodnim metodama (Perrier i sar., J. Neurochem (2004) 84: 454-463, Pankiewicz i sar., Eur J Neurosci (2006) 23: 2635-2647). Nakon inkubacije, digestija je zaustavljena dodavanjem PMSF-a do 4 mM.

[0216] Koncentracije proteina su određene pomoću seta BCA proteinskog testa (Pierce). Uzorci su razblaženi u puferu za uzorke (250 mM Tris-HCL pH 6,8, 10% SDS, 5 mM β-merkaptoetanol, 50% glicerol, 0,02% Coomassie plava G250) i kuvani 5 min. Obrađeni uzorci su rešeni pomoću SDS-PAGE pod redukcionim uslovima.

[0217] Anti-PrP monoklonsko antitelo 6D11 (videti Sadowski i sar. (2009) Neurobiol Dis. 34 (2): 267-278) i 6H4 (videti Cordes i sar. (2008) J Immunol Methods 337: 106-120), kao i anti-aktin su bili korišćeni za karakterizaciju uzoraka. Kompleksi antigen-antitelo su detektovani korišćenjem ren peroksidaze-konjugovanog anti-mišjeg IgG-a (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK) i vizuelizovani korišćenjem ECL sistema (GE Healthcare UK Limited) prema uputstvima proizvođača. Kvantifikacija proteinskih traka je izvedena pomoću denzitometrijske analize filmova (slika J, NIH).

[0218] Preuzeti zajedno, rezultati prikazani na Sl. 38A i 38B i Sl. 39A i 39B pokazuju sposobnost g3p-Ig fuzionog proteina da direktno inhibira formiranje PrP<Sc>in vitro. Stoga, g3p fuzioni proteini prema pronalasku mogu biti korišćeni terapeutski i / ili profilaktički u bilo kojoj bolesti ili poremećaju gde su prisutni prioni.

Primer 16: NMR studije

[0219] Da bi se procenili ostaci na fΑβ42, koji stupaju u interakciju sa rs-g3p (N1 N2) (Konstruktom 3), analizirano je ponašanje zamene vodonik/deuterijum (H/D) fAβ42, korišćenjem<15>N-HSQC NMR. Videti, npr., Sanchez i sar. (2011) J. Am. Chem Soc. 133: 6505-08. Izmerena je izmena vodonika / deuterijuma (H / D) osnove amidnih vodonika, kako bi se utvrdila brzina disocijacije molekula Αβ vlakna, kako bi se odredio vezani ostatak prikazan na amiloidnom vlaknu, kao i da se prati da li je vlaknasta struktura poremećena vezivanjem Konstrukta 3.

[0220] Generisana su zrela amiloidna vlakna (fAβ42) od ravnomerno<15>N-obeleženih Αβ monomera i izložena D2O od 0 do 744 sati (0-31 dana), na 37° C, u prisustvu i odsustvu Konstrukta 3. Praćenjem izlaganja Konstruktu 3, vlakna su podvrgnuta liofilizaciji, a liofilizovan materijal je rastvoren u rastvaraču dimetilsuifoksid / dihlorsirćetna kiselina (DMSO / DCA). Odnos H prema D je povezan sa svakom aminokiselinom, zatim je meren korišćenjem<15>N-HSQC NMR spektara. Kako je došlo do neke dalje razmene H/D u DMSO / DCA rastvoru, za svaki put izlaganja vlakana prema D2O, izmerena je vremenska zavisnost odnosa H do D u DMSO / DCA rastvoru i podaci su ekstrapolirani do vremena rastvaranja u

DMSO / DCA. Videti, npr., Whittemore i sar. (2005) Biochemistry 44: 4434-41 i Sanchez i sar. (2011) J. Am. Chem Soc 133: 6505-08 za metode.

[0221] Eksperimenti H/D razmene su izvedeni u prisustvu i odsustvu Konstrukta 3, pri stehiometrijskom odnosu od 1: 3 Konstrukt 3: fAβ42 (25:75 μM). Da bi se osiguralo zasićeno vezivanje korišćen je višak od 10 puta.

[0222] Rezultati ukazuju da se H / D razmena ne uklapa u monofazni proces, kao što je ranije primećeno za Αβ vlakna i za druge amiloide (Yamaguchi i sar. (2004) J. Mol. Bio 338: 559-571; Sanchez i sar., 2011). U odsustvu Konstrukta 3, profil razmene pokazuje da su dva odseka Aβ1-42 sekvence, ostaci 17-27 i 31-40, relativno zaštićeni od H/D razmene. Dodavanje Konstrukta 3 povećava zaštitu za ostatke 17-22 i 33-40. Stoga, rezultati ukazuju na to da Konstrukt 3 prepoznaje Αβ vlakna preko hidrofobnih ostataka jezgra. Naznaka da su ostaci 18, 32, 36 i 41 izostavljeni iz analize zbog preklapanja signala i ostaci 2, 7, 8, 14, 30 i 38 su razmenjeni u mrtvom vremenu DMSO / DCA rastvaranja, pa efekti na ove ostatke nisu bili prijavljeni, a njihov doprinos se može samo zaključiti iz podataka o susednim aminokiselinama.

[0223] Rezultati takođe ukazuju da se zaštita prvenstveno manifestuje u sporijoj fazi razmene, koja je snažno potisnuta.

[0224] Interakcija između Konstrukta 3 i fAβ42 takođe je analizirana pomoću TEM-a. Rezultati prikazuju da inkubacija Konstrukta 3 sa prethodno formiranim fAβ42, tokom 744 sati, povećava amorfne agregate i na taj način dezagregira prethodno formirani fAβ42. TEM fAβ42 generisan pri pH 2,0 konzistentno pokazuje guste mreže vlakana, a često je neophodno desetostruko razblaživanje za jasno određivanje morfologije. Formirana vlakna su bila posebna pojedinačna vlakna sa zapaženim uvijanjem i malim lateralnim udruživanjem, slično onima, koja su prethodno primećena za Αβ42 (Olofsson i sar. (2006) J. Biol Chem 281: 477-83) i uvijeni Αβ40 (Petkova i sar. (2005) Science 307: 262-65). Amorfni agregati su bili relativno retki, dok su oligomerne strukture primećene u većini slika, kao manje pozadinske vrste. Oligomeri i amorfni agregati, zajedno sa malim količinama vlakna, opaženi su sa većom učestalošću na slikama iz supernatanta, koji su ostali nakon centrifugiranja na 190 000 RCFMAX.

[0225] TEM uzoraka uzetih tokom vremena razmene H / D (u puferu pH 7,4), ali nisu centrifugirani, ukazuju na povećanu količinu amorfnog agregata u odnosu na originalni preparat. Amorfni agregati nisu centrifugirani sa Αβ42. Nakon 744 časova, materijal koji nije centrifugiran sadrži manje vlakana kada je bio prisutan Konstrukt 3. Stoga, na 744 časova, Konstrukt 3 razgrađuje prethodno formiran fAβ42.

[0226] Shema eksperimenta je prikazana na Sl. 45. Sl. 46 prikazuje grafički prikaz ostataka na fAβ42, koji intereaguju sa Konstruktom 3. Sl. 47 prikazuje reprezentativni TEM Konstrukta 3, koji razgrađuje prethodno formirani fAβ42 na 744 časova.

Primer 17: If1 N1 N2 fuzioni protein se snažno vezuje na Αβ42

[0227] If1 fag i M13 fag dele oko 30% identičnosti duž N1 domena g3p, ali praktično nemaju identičnost duž domena N2. G3p N1 N2-IgG-Fc fuzioni konstrukt je napravljen gde je region N1 N2 g3p-a bio iz If1 faga (Konstrukt 8, SEK ID Br-i: 31 i 32). Konstrukt 8 je analiziran pomoću SPR-a da bi se odredio njegov afinitet vezivanja za Αβ vlakna.100μM Αβ42 vlakana (rPeptid Aβ1-42 udružen u 10mM HCl tokom 3 dana) 1: 1 pomešani su sa 10mM NaAc pH 5,0 i imobilisani na CM3 površinama. Približno 2μM Konstrukta 3 (N1 N2 g3p nefuzioni protein) i Konstrukt 8 u puferu koji teče [10mM HEPES pH 7,5, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% P20] propušteni su preko površine biočipa, pri 5 μl / min, tokom 10 - 12min. Svi uzorci su pripremljeni na 25° C. Rezultati su prikazani na Sl. 50A. Konstrukt 8 snažno vezuje Αβ fibrile sa KDod ~ 36 nM. N1 N2 fragment g3p-a (koji nije povezan sa Fc domenom) pokazuje slabije vezivanje (KD~ 36 nM).

[0228] Sledeće, sprovedeno je drugo ispitivanje vezivanja amiloidnog vlakna da bi se poredila sposobnost If1 N1 N2 g3p i M13 N1 N2 g3p da vezuje fAβ. U ovom testu, M13-Alexa488 je pomešan sa Αβ (fAβ) tokom 2-3 sata, kako bi se omogućilo formiranje kompleksa, dodati su ispitivani konstrukti (If1 N1 N2 g3p i M13 N1 N2 g3p; oba bez Fc domena), zatim su kompleksi sedimentirani centrifugiranjem na 7500xg, tokom 10 minuta. Fluorescencija pelete je bila proporcionalna sa M13 vezanim za amiloid. Ovaj test obezbeđuje i kvantitativnu meru vezivanja faga na fAβ i pruža sistem za procenu sposobnosti drugih agenasa da se takmiče sa fagom za vezivanje. Sl. 50B predstavlja rezultate, koji pokazuju da se If1 N1 N2 g3p vezuje oko četiri puta bolje od M13 N1 N2 g3p.

Primer 18: g3p-Ig fuzioni proteini redukuju amiloid i poboljšavaju ponašanje povezano sa Alzheimerovom bolešću kod starijih Tg2576 miševa kada se primenjuju sistemski

[0229] Da bi se utvrdilo da li su g3p-Ig fuzioni proteini efikasni u lečenju Alzheimerove bolesti kada se primenjuju sistemski, 10 mg / kg rs-g3p (N1 N2) - hIgG1-Fc (Konstrukta 6) ili PBS-a je primenjeno na starijim Tg2576 miševima (21 do 23 meseca stari sojevi mužjaka) intraperitonealno. Svi miševi su primili anti-CD4 predtretman (0.5 mg-iP), kako bi se suzbio potencijalni periferni imuni odgovor sistemski primenjenog rs-g3p (N1 N2) -hIgG1-Fc (Konstrukta 6).

[0230] U trećoj nedelji, miševi su procenjivani za mioklonski skok u uglu, koji procenjuje funkciju hipokampusa, striatuma i regiona koji su uključeni u motornu koordinaciju & kontrolu (moždani stub, mali mozak, motorni korteks). Videti Lalonde & Strazielle, 2012, Neurosci Res, 74 (2): 69. Ovo ponašanje je analogno mioklonusu, koji se vidi kod pacijenata sa Alzheimerovom bolešću u kasnoj fazi. Videti Lalonde i sar., 2012, Rev. Neurosci, 23 (4): 363. Miševi su posmatrani tokom perioda od 5 minuta u novom okruženju i zabeležen je broj napada kontinuiranog skakanja i / ili penjanja, dok se podižu nasuprot uglu kaveza. Rezultati ukazuju da su miševi koji su primili Konstrukt 6 ispoljili značajno manje mioklonske epizode skakanja u uglu u poređenju sa miševima, koji su primali kontrolni PBS. Videti, Sl.55.

[0231] Miševi su procenjeni na hiperaktivnost u 6-oj nedelji, procenjivanjem ukupne udaljenosti, videti. Sl. 53A i Sl. 53B, i aktivnosti kruženja, videti Sl. 54. Ovi testovi testiraju ameliorizaciju hiperaktivnosti merenjem ukupne razdaljine pređene u novom okruženju. Ovi testovi ponašanja modeluju povećanu agitaciju, koja se rutinski opaža kod pacijenata sa Alzheimerovom bolešću. Videti Mega i sar., 1996 Neurology 46: 130; i King i sar., 1999 Brain Res, 103: 145. Miševi su smešteni u kvadratnu arenu 40 cm x 40 cm tokom 10 minuta, a spontano kretanje i ponašanje je bodovano u realnom vremenu sa video sistemom za praćenje. Rezultati pokazuju da su miševi koji su primali Konstrukt 6 imali značajno smanjenu spontanu lokomotornu aktivnost u poređenju sa miševima koji su primali kontrolni PBS. Videti, Sl. 53A i 53B. Miševi koji su primali Konstrukt 6 su takođe smanjili ponašanje kruženja u poređenju sa miševima koji su primali kontrolni PBS. Videti, Sl.54.

[0232] U 9-oj nedelji, miševi su procenjeni na spontanu promenu u jednom Y-lavirintu, koji procenjuje kratkotrajnu prostornu memoriju i istraživanje novina kod pacova. Videti, Hughes, 2004 Neurosci & Biobehav Rev, 28: 497. Videti, Sl. 56. Miševi koji imaju poremećaj u kratkotrajnoj memoriji, kao što je model Tg2576 miševa, ispoljavaju manje spontanih promena u odnosu na miševe sa normalnom kratkotrajnom memorijom. Ovaj zadatak imitira oštećenja u kratkotrajnoj memoriji i prostornoj memoriji, vidljivoj kod pacijenata sa Alzheimerovom bolešću. Miševi su postavljeni u Y-lavirint tokom 10 minuta, a ulasci miševa u krake lavirinta su praćeni pomoću automatizovanog sistema praćenja na bazi video. Miševi koji su primali Konstrukt 6 su ispoljili značajno više spontanih promena prilikom ulaza na krake u Y-lavirintu u odnosu na miševe koji su primali kontrolni PBS, što ukazuje na poboljšanu memoriju. Sledeći je šematski prikaz koji prikazuje vremenske periode injektiranja PBS ili Konstrukta 6 (strelice), kao i vreme za procenu ponašanja (zvezdice).

[0233] U 10-oj nedelji, miševi tretirani sa Konstruktom 6 i miševi tretirani sa PBS-om su žrtvovani i procenjeni za smanjenje opterećenja Αβ plaka pomoću bojenja anti-Aβ antitela i bojenja sa tioflavinom S. Rezultati ukazuju da sistemska primena g3p-Ig fuzionog proteina značajno smanjuje opterećenje Αβ plaka u hipokampusu miševa sa Alzheimerovom bolešću. [0234] U posebnom eksperimentu, Konstrukt 6 je bio isporučen intraperitonealno (ip), nedeljno na Tg2576 modelu Alchajmerove bolesti, kod miševa starijih od 19 meseci, u trajanju od 10 nedelja, od 3 dozne grupe (0,2 mg / Kg, N = 13; 2 mg / Kg, N = 12; i 20 mg / kg, N = 13). PBS tretirana grupa (N = 13) je služila kao negativna kontrola. Ispitivanje spontanog izmenjivanja miševa tretiranih sa Konstruktom 6 pokazalo je poboljšanje prostorne memorije u zavisnosti od doze, tako da je grupa koja je primila 20 mg / Kg bila značajno poboljšana.

[0235] Kombinovani, ovi rezultati pokazuju da g3p-Ig fuzioni proteini ublažavaju mnoge psihomotorne fenotipove i kognitivne deficite kod Tg2578 miševa, koji su analogni simptomima zapaženim kod pacijenata sa Alzheimerovom bolešću od srednjeg do kasnog stadijuma, kao i da redukuju amiloid u mozgu. Stoga, sistemski primenjeni g3p fuzioni proteini mogu biti korišćeni terapeutski ili profilaktički za lečenje Alchajmerove bolesti.

Primer 19: Kloniranje, ekspresija i prečišćavanje Konstrukta 6

[0236] M13 ssDNK je ekstrahovana pomoću QIAprep Spin M13 kompleta (Qiagen, Kat # 27704). N1-linker-N2-linker domena M13 g3p-a (g3pN1 N2) je pojačan pomoću PCR-a sa prednjim prajmerom (AAAAAAGGGAATTCGATGGCTGAAACTGTTGAAAGTTG; SEK ID BR: 33) i zadnjim prajmerom (AAAAAACCATGGCACCGGAACCAGAGCCAC; SEK ID N0: 34). G3pN1 N2 PCR proizvod (koji je kodirao aminokiseline 22-277 od SEK ID BR: 13) i pFU8E-hIgG1-Fc2 vektor (InvivoGen, Kat# pfuse-hgIfc2) su digestirani sa restrikcionim enzimima EcoRI-HF (New England Biolabs, Kat # R3101) i NcoI-HF (New England Biolabs, Kat # R3193). Ovaj vektor kodira signalnu sekvencu IL2 (aminokiseline 1-20 od SEK ID BR: 13), položaj višestrukog kloniranja i humanu IgG1-Fc2 (aminokiseline 287-509 SEK ID BR: 13). Digestirani vektor je defosforilovan i ligiran sa digestiranim umetkom. Proizvod ligacije je transformisan u NEB 5-alfa kompetentnu E. coli (New England Biolabs, Kat # C2987). Predviđen je ligacioni proizvod za kodiranje metionina (aminokiseline 21 SEK ID BR: 13), između signalne sekvence i prve aminokiseline g3PN1N2, usled korišćenja mesta višestrukog kloniranja u pFUSE-hIgG1-Fc2 vektoru. Transformanti jedne kolone su odabrani i gajeni za pripremu plazmida. Plazmidi su ekstrahovani i testirani na veličinu umetaka pomoću restrikcione digestije i agarozne gel elektroforeze. Plazmidski kandidati IgG1 Fc-g3p (N1 N2) su potvrđeni DNK sekvencioniranjem.

[0237] Plazmidi su pripremljeni pomoću Maxi-kompleta bez endotoksina (Qiagen) i sterilisanih filtera. Proteinska ekspresija sa visokim prinosom je izvedena korišćenjem Expi293<TM>Ekpresionog sistema (Life Technologies, Kat # A14635), kao što je opisano u nastavku.

[0238] Expi293F<TM>ćelije su kultivisane prema uputstvima proizvođača. Transfekcije su izvedene u serijama od 30 ml do 0,5 L u bočicama za trešenje. Ćelije su razblažene na 2x10<6>ćelija / ml dan pre transfekcije. Za transfekciju 30ml ćelijske suspenzije (2,5x10<6>ćelija / ml), 30 μg plazmidske DNK je razblaženo u 1,5 ml Opti-MEM i 80 μl ExpiFectamine<TM>293 Reagensa je razblaženo u 1,5 ml Opti-MEM. Svaka smeša je inkubirana tokom 5 minuta, pre dodavanja plazmidske DNK u ExpiFectamine<TM>293 reagens, praćeno dodatnom inkubacijom od 20-30 minuta. Mešavina reagensa DNK-ExpiFectamine<TM>293 reagensa polako je dodata ćelijama dok se blago vrtela. Ćelije su inkubirane približno 16 sati, pre dodatka 150 μl ExpiFectamine<TM>293 Transfekcionog Inhensera I i 1,5 ml ExpiFectamine<TM>293 Transfekcionog Inhensera II. Ćelije su inkubirane još 5 do 8 dana pre sakupljanja medijuma. Ćelijski medijum se sakuplja centrifugiranjem na 10,000xg, tokom 30 minuta i čuva sterilan na 4 ° C do prečišćavanja.

[0239] Prečišćavanje eksprimiranog fuzionog proteina je izvršeno pomoću kolona HiTrap<TM>rProtein A FF (GE Healthcare, Uppsala, Švedska). Kolone su bile regenerisane sa puferom za eluiranje 0,1 M glicin-HCl pufer pH 3, ekvilibrisan sa 20 mM natrijum fosfatnim puferom pH 7 i uzorak je dodat u skladu sa preporukom proizvođača. Nakon ispiranja sa 20mM natrijum-fosfatnim puferom pH7, protein je eluiran sa 0,1 M glicin-HCl puferom pH 3 u cevi, koje sadrže Tris-pufer pH 9. Čistoća fuzionog proteina proverena je na SDS-PAGE gelu praceno Coomassie bojenjem, nakon kojeg je protein dijalizovan u PBS pH 7, koncentrovan i sterilisan filterom, korišćenjem spin filtera Amicon<®>Ultracel 30k (EMD Millipore Corp, Billerica, MA) i Ultrafree CL spin kolona respektivno (EMD Millipore Corp, Billerica, MA), Svi proteini su bili skladišteni na 4 ° C pre upotrebe.

[0240] Dobijeni fuzioni protein je predviđen da odgovara aminokiselinama 21-509 od SEK ID BR: 13. Sekvenciranje peptida prečišćenog fuzionog proteina otkrilo je aminokiselinsku sekvencu, koja odgovara aminokiselinama 23-508 SEK ID BR: 13, što ukazuje na to da su Met21, Ala22 i Liz509 uklonjeni iz ćelija Expi293F<TM>tokom rekombinantne proizvodnje. Nije poznato da li bi se slična prerada desila i, ako jeste, do kojeg stepena, nakon rekombinantne proizvodnje u drugim eukariotskim ili ne-eukariotskim ekspresionim sistemima. Nije očekivano da takva prerada (ili njen nedostatak) utiče na sposobnost izraženog fuzionog proteina da se veže i izazove razgradnju amiloida.

Primer 20: g3p-Ig fuzioni proteini redukuju amiloid u amiotrofičnoj lateralnoj sklerozi (ALS)

[0241] Da bi se utvrdilo da li su g3p fuzioni proteini korisni u redukciji amiloida u amiotrofičnoj lateralnoj sklerozi (ALS), reprezentativni g3p-Ig fuzioni protein (Konstrukt 6) je testiran na njegovu sposobnost da ometa SOD-1 skupine vlakana, što je implicirano u patologiji ALS-a. SOD-1 monomeri (apo-enzim, 3,5 μM u PBS-u, 5 mM EDTA, 1 mM βME) su mešani na 100 rpm u toku 24 sata, u prisustvu ili odsustvu Konstrukta 6 (1,5 μM, 0,75 μM, 0,15 μM). Formiranje vlakna (tj., agregacija monomera u vlakna) je merena pomoću tioflavin T (ThT) fluorescencije. SOD-1 monomeri formirali su vlakna u odsustvu Konstrukta 6. Međutim, Konstrukt 6 inhibira formiranje vlakana SOD-1 sa IC50 od ~0,75 μM. Stoga,

g3p-Ig fuzioni proteini prema pronalasku redukuju amiloid u modelu za ALS i stoga mogu biti korišćeni terapeutski i / ili profilaktički za lečenje ALS-a.

Primer 21: g3p-Ig fuzioni proteini redukuju alfa-sinuklein u Parkinsonovoj bolesti

[0242] Da bi testirali efikasnost g3p fuzionih proteina iz pronalaska na in vivo modelu Parkinsonove bolesti (PD), humanim miševima starim 6 meseci, koji prekomerno eksprimiraju alfa-sinuklein (Linija 61, E. Masliah, N = 9 / grupa) je injektirano 2 μL Konstrukta 6 (5,3 mg / mL) ili PBS-a u kaudat bilateralno. Miševima koji nisu transgeni (N = 5) je takođe injektiran PBS kao dalja kontrola. Svi miševi su žrtvovani 14 dana nakon injekcije i mozgovi su sakupljeni za neuropatologiju i biohemijske analize. Merenje proteinaze-K rezistentnog alfa-sinukleina u striatum homogenatima je pokazalo da miševi koji su tretirani sa Konstruktom 6 imaju značajno snižene alfa-sinukleinske agregate i značajno povećane nivoe tirozin hidroksilaze (enzima sinteze dopamina), obe su mere kliničkog poboljšanja. Stoga, g3p fuzioni proteini prema pronalasku redukuju amiloid na modelu Parkinsonove bolesti i stoga mogu biti korišćeni terapeutski ili profilaktički za lečenje Parkinsonove bolesti.

Primer 22: proteini g3p fuziona su uspešni u lečenju amiloidoze

[0243] Agregirani transtiretin (ttr) je znak amiloidoze. Da bi se potvrdilo da su g3p fuzioni proteini prema pronalasku sposobni za lečenje amiloidoze, jedan reprezentativni g3p fuzioni protein je testiran na njegovu sposobnost da se veže na agregirani ttr. Ttr eksprimiran iz E. coli i prečišćen do > 90% čistoće je agregiran inkubacijom pri 0,2 mg / mL u agregacionom puferu (100 nM natrijum acetata, 100 mM KCl, 1 nm EDTA, pH 4,3) na 37 ° C, sa ili bez mešanja (350 rpm). Dobijena vlakna, verifikovana ThT fluorescencijom i transmisionom elektronskom mikroskopijom, serijski su razblažena na nitroceluloznoj membrani za Western blot analizu. Membrane su inkubirane bilo sa Konstruktom 6, jednim reprezentativnim g3p fuzionim proteinom iz pronalaska, (100 nM) ili anti-ttr antitelom, za kvantifikaciju vezivanja. Nativni ttr (tetrameri) i Αβ42 vlakna su korišćeni kao kontrola. Konstrukt 6 je detektovan HRP-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG antitelom. Rezultati pokazuju da Konstrukt 6 kvantitativno vezuje ttr vlakna, napravljena sa ili bez mešanja, ali ne prepoznaje matični ttr.

Membrana tretirana sa anti-ttr antitelom poslužila je kao kontrola vezivanja i pokazala je da su agregirani i nativni ttr preparati i kvantitativno zadržani na membrani, i da anti-ttr antitelo nije prepoznalo kontrolu Αβ42 vlakna. Stoga, g3p fuzioni proteini, uključujući Konstrukt 6, snažno vezuju agregiran ttr, koji je uključen u patofiziologiju amiloidoze, a ne vezuje nativni ttr, normalni fiziološki tetramer. Ovi podaci potvrđuju da se g3p fuzioni proteini prema pronalasku vezuju za amiloidnu konformaciju ttr-a i zato su korisni terapeutski i profilaktički u lečenju amiloidoze.

Claims (14)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Fuzioni protein, koji sadrži fragment za vezivanje amiloida g3p i Fc fragment imunoglobulina, naznačen time da protein sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od:

(a) aminokiselina 21-509 iz SEK ID BR: 13;

(b) aminokiselina 22-509 iz SEK ID BR: 13;

(c) aminokiselina 23-509 iz SEK ID BR: 13;

(d) aminokiselina 21-508 iz SEK ID BR: 13;

(e) aminokiselina 22-508 iz SEK ID BR: 13;

(f) aminokiselina 23-508 iz SEK ID BR: 13;

(g) aminokiselina 21-506 iz SEK ID BR: 9;

(h) aminokiselina 22-506 iz SEK ID BR: 9;

(i) aminokiselina 23-506 iz SEK ID BR: 9;

(j) aminokiselina 21-505 iz SEK ID BR: 9;

(k) aminokiselina 22-505 iz SEK ID BR: 9;

(l) aminokiselina 23-505 iz SEK ID BR: 9;

(m) aminokiselina 21-506 iz SEK ID BR: 11;

(n) aminokiselina 22-506 iz SEK ID BR: 11;

(o) aminokiselina 23-506 iz SEK ID BR: 11;

(p) aminokiselina 21-505 iz SEK ID BR: 11;

(q) aminokiselina 22-505 iz SEK ID BR: 11;

(r) aminokiselina 23-505 iz SEK ID BR: 11;

(s) aminokiselina 21-528 iz SEK ID BR: 31;

(t) aminokiselina 22-528 iz SEK ID BR: 31;

(u) aminokiselina 23-528 iz SEK ID BR: 31;

(v) aminokiselina 21-527 iz SEK ID BR: 31;

(w) aminokiselina 22-527 iz SEK ID BR: 31;

(x) aminokiselina 23-527 iz SEK ID BR: 31; i

(y) jednog mutanta ili varijante koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom

sekvencom bilo koje od (a)-(x) i sposobna je za vezivanje za amiloid.

2. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da vezujući fragment amiloida g3p u bilo kojem od (a)-(x) ima do 5 aminokiselinskih supstitucija.

3. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da fuzioni protein sadrži

(a) aminokiseline 21-509 SEK ID BR: 13, ili mutanta ili varijantu koja sadrži do 5

aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajućim delom g3p SEK ID BR: 13;

(b) aminokiseline 22-509 SEK ID BR: 13, ili mutanta ili varijantu koja sadrži do 5

aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajućim delom g3p SEK ID BR: 13;

(c) aminokiseline 23-509 SEK ID BR: 13, ili mutanta ili varijantu koja sadrži do 5

aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajućim delom g3p SEK ID BR: 13;

(d) aminokiseline 21-508 SEK ID BR: 13, ili mutanta ili varijantu koja sadrži do 5

aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajućim delom g3p SEK ID BR: 13;

(e) aminokiseline 22-508 SEK ID BR: 13, ili mutanta ili varijantu koja sadrži do 5

aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajućim delom g3p SEK ID BR: 13;

(f) aminokiseline 23-508 SEK ID BR: 13, ili mutanta ili varijantu koja sadrži do 5

aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajućim delom g3p SEK ID BR: 13.

4. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1 sadrži aminokiseline 23-508 od SEK ID BR:13.

5. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time što je fuzioni protein manje imunogen kod ljudi od SEK ID BR: 9, SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 13 ili ili SEK ID BR: 31.

6. Farmaceutski preparat, koji sadrži terapijski efikasnu količinu fuzionog proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

7. Farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu u terapiji.

8. Farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja odabranih od Alzheimerove bolesti, uključujući rani početak Alzheimerove bolesti, kasni početak Alzheimerove bolesti, presimptomatske Alzheimerove bolesti; Parkinsonove bolesti; SAA amiloidoze; cistatin C; naslednog islandskog sindroma; senilnosti; multiplog mijeloma; prionske bolesti, kuru, Creutzfeldt-Jakobove bolesti (CJD), Gerstmann-Straussler-Scheinkerove bolesti (GSS), fatalne familijarne nesanice (FFI), scrapie i goveđeg spongiformnog encefalitisa (BSE); amiotrofne lateralne skleroze (ALS); spinocerebelarne ataksije (SCA1, SCA3, SCA6 ili SCA7), Huntingtonove bolesti; dentatorubral-pallidoluysian atrofije; spinalne i bulbarne mišićne atrofije; nasledne cerebralne amiloidne angiopatije; familijarne amiloidoze; demencije frontotemporalnog režnja; Britanske/Danske demencije i familijarne encefalopatije.

9. Farmaceutski preparat za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili 8, naznačen time što je pacijent pozitivan na biomarker florbetapir, kada se taj biomarker koristi kao sredstvo za snimanje u pozitron emisionoj tomografiji.

10. Farmaceutski preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7-9, naznačen time, da je bolest ili stanje Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest ili Huntingtonova bolest.

11. Sekvenca nukleinske kiseline, koja kodira fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5.

12. Vektor, koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 11.

13. Ćelija domaćina, koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 12.

14. Postupak izrade fuzionog proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, koji obuhvata ekspresiju fuzionog proteina kodiranog nukleinskom kiselinom u vektoru prema patentnom zahtevu 12 i izolovanje eksprimiranog proteina.