RS56564B1

RS56564B1 - Modifikovan kolagen

Info

Publication number: RS56564B1
Application number: RS20171104A
Authority: RS
Inventors: Alexandra Dietrich; Michael Myers
Original assignee: Innocoll Pharm Ltd
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2013-01-09
Publication date: 2018-02-28
Also published as: JP2019065017A; LT3255106T; LT2802624T; WO2013104687A2; JP7213205B2; EP2802624A2; PL2802624T3; US20190359689A1; PT3255106T; SI2802624T1; US10487134B2; TR201907156T4; RS58935B1; DK3536748T3; PL3536748T3; JP2015508403A; US20170022266A1; EP3536748A1; EP3255106A1; RS61726B1

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na modifikovan kolagen koji se može dobiti obezbeđivanjem izolovanog kolagena; zamrzavanjem izolovanog kolagena; dehidratacijom zamrznutog kolagena; i sazrevanjem dehidriranog kolagena. Takođe su opisani postupci proizvodnje modifikovanog kolagena i njegove upotrebe.

Pozadina pronalaska

[0002] U ovoj oblasti, dobro su poznati postupci za pripremu materijala na bazi kolagena za upotrebu u humanoj i veterinarskoj medicini sušenjem ili liofilizacijom vodenih disperzija kolagena radi formiranja membrana ili sunđera. Takođe je poznata upotreba filmova ili membrana na bazi kolagena kao privremenih, biorazgradivih barijera za razdvajanje susednih površina traumatizovanog tkiva nakon operacije kako bi se sprečilo ili smanjilo formiranje postoperativnih adhezija.

[0003] Obično, kolagen korišćen za naknadnu proizvodnju materijala na bazi kolagena prvo se izoluje ekstrakcijom iz kože ili tetive sisara, prečisti, enzimski tretira da bi se uklonili ne-spiralni telopeptidi, delimično rastvara sa kiselinom, i konačno istaloži povećanjem pH da bi se obezbedila vodena disperzija prečišćenog, vlaknastog kolagena. Kada se jednom izoluje, disperzija kolagena može dalje da se obrađuje za proizvodnju materijala na bazi kolagena neposredno, ili se inače čuva dok čeka dalju obradu. Radi lakšeg čuvanja na komercijalnom nivou, disperzija kolagena se obično koncentriše uklanjanjem vode upotrebom centrifugiranja da bi se smanjila zapremina, a time formirala vlažna masa. Vlažna masa mora se čuvati zamrznuta da bi se očuvao kolagen i sprečio razvoj bakterija. Kada je potrebna proizvodnja materijala na bazi kolagena, vlažna masa zamrznutog kolagena obično se odmrzava i ponovo disperguje. Bilo da se izolovani kolagen koristi neposredno ili zamrznut i odmrznut kao vlažna masa, disperzija kolagena je uopšteno viskozna i na komercijalnom nivou teška za preradu u membrane na bazi kolagena ili liofilizirane sunđere. Ono što je potrebno je postupak za smanjenje viskoznosti disperzije kolagena bez daljeg razblaženja, budući da će smanjenje koncentracije kolagena u disperziji samo povećati količinu vode koja se mora ukloniti naknadnim sušenjem ili liofilizacijom, što je i neefikasno i skupo na komercijalnom nivou.

[0004] Prema tome, cilj ovog pronalaska je da se modifikuje izolovani kolagen na takav način da se smanji viskoznost disperzije, ali bez ugrožavanja svojstava materijala na bazi kolagena izrađenih od njega. Poželjno, dalji cilj ovog pronalaska je da se modifikuje kolagen na takav način da se smanji viskoznost disperzije i da se takođe poboljšaju svojstva kolagenske membrane izrađene od nje za upotrebu kao postoperativna adhezivna barijera.

[0005] Ovi ciljevi postižu se prema ovom pronalasku obezbeđivanjem modifikovanog kolagena koji olakšava efikasnu proizvodnju materijala na bazi kolagena na komercijalnom nivou i poboljšava potencijalnu efikasnost onih materijala u oblasti humane i veterinarske medicine.

Sažetak pronalaska

[0006] Ovaj pronalazak je kao što je navedeno u patentnim zahtevima 1- 12 ovde.

[0007] Prema prvom aspektu ovog otkrića obezbeđen je modifikovan kolagen koji se može dobiti obezbeđivanjem izolovanog kolagena, opciono disperzije izolovanog kolagena; zamrzavanjem izolovanog kolagena; i dehidratacijom zamrznutog kolagena.

[0008] Prema drugom aspektu ovog otkrića obezbeđen je modifikovan kolagen koji se može dobiti obezbeđivanjem izolovanog kolagena, opciono disperzije izolovanog kolagena; zamrzavanjem izolovanog kolagena; dehidratacijom zamrznutog kolagena; i sazrevanjem dehidriranog kolagena.

[0009] Izraz "disperzija" znači mešavina u kojoj su čestice kolagena dispergovane u fluidu, opciono tečnoj, dalje opciono vodenoj, sredini. Čestice kolagena mogu da obuhvataju molekule kolagena, ili njihove agregate; koji su dispergovani u fluidu, opciono tečnoj, dalje opciono vodenoj, sredini. Opciono, čestice kolagena, koje su dispergovane u fluidu, opciono tečnoj, dalje opciono vodenoj, sredini; imaju dužinu (ili najveću dimenziju) od najmanje jednog mikrometra.

[0010] "Sazrevanje" znači obrada dehidriranog kolagena pod uslovima pogodnim da se omogući starenje dehidriranog kolagena bez suštinske degradacije ili kontaminacije.

[0011] Prema trećem aspektu ovog otkrića obezbeđen je postupak za pripremu modifikovanog kolagena, gde taj postupak obuhvata faze:

(a) obezbeđivanja izolovanog kolagena, opciono disperzije izolovanog kolagena;

(b) zamrzavanja izolovanog kolagena; i

(c) dehidratacije zamrznutog kolagena.

[0012] Prema četvrtom aspektu ovog otkrića obezbeđen je postupak za pripremu modifikovanog kolagena, gde taj postupak obuhvata faze:

(a) obezbeđivanja izolovanog kolagena, opciono disperzije izolovanog kolagena;

(b) zamrzavanja izolovanog kolagena;

(c) dehidratacije zamrznutog kolagena; i

(d) sazrevanja dehidriranog kolagena.

[0013] Opciono, faza obezbeđivanja obuhvata fazu uklanjanja fluida, opciono tečne, dalje opciono vodene, sredine; pre faze obezbeđivanja. Dalje opciono, faza obezbeđivanja obuhvata fazu uklanjanja najmanje malo fluida, opciono tečne, dalje opciono vodene, sredine; pre faze obezbeđivanja. Još dalje opciono, faza obezbeđivanja obuhvata fazu uklanjanja najmanje malo fluida, opciono tečne, dalje opciono vodene, sredine; pre faze obezbeđivanja; da bi se obezbedila disperzija izolovanog kolagena.

[0014] Opciono, faza obezbeđivanja obuhvata fazu uklanjanja fluida, opciono tečne, dalje opciono vodene, sredine; pre faze obezbeđivanja da bi se obezbedila disperzija koja ima koncentraciju od oko 3-30%, opciono 3-4 mas.% čestica kolagena.

[0015] Opciono, faza zamrzavanja obuhvata zamrzavanje do neke temperature od oko -33°C do oko -42°C. Dalje opciono, faza zamrzavanja obuhvata zamrzavanje do neke temperature od oko -38°C. Još dalje opciono, faza zamrzavanja obuhvata zamrzavanje pri brzini od oko 0,3°C do oko 1,5°C po minuti, opciono pri brzini od oko 0,5°C po minuti.

[0016] Opciono, faza dehidratacije obuhvata uklanjanje vodene faze. Dalje opciono, faza dehidratacije obuhvata uklanjanje vodene faze smanjenjem pritiska. Još dalje opciono, faza dehidratacije obuhvata uklanjanje vodene faze smanjenjem pritiska na oko 0,05 do oko 0,5 mbar. Još dalje opciono, faza dehidratacije obuhvata uklanjanje vodene faze primenom vakuuma.

[0017] Opciono ili dodatno, faza dehidratacije obuhvata povećanje temperature zamrznutog kolagena. Dalje opciono ili dodatno, faza dehidratacije obuhvata povećanje temperature zamrznutog kolagena pod vakuumom. Još dalje opciono ili dodatno, faza dehidratacije obuhvata povećanje temperature kolagena do oko 30°C. Još dalje opciono ili dodatno, faza dehidratacije obuhvata povećanje temperature kolagena do oko 30°C pod vakuumom.

[0018] Opciono ili dodatno, faza dehidratacije obuhvata povećanje temperature kolagena do oko 30°C pri brzini od oko 0,3°C do oko 1,5°C po minuti, dalje opciono pri brzini od oko 0,5°C po minuti. Dalje opciono ili dodatno, faza dehidratacije obuhvata povećanje temperature kolagena do oko 30°C pri brzini od oko 0,3°C do oko 1,5°C po minuti, dalje opciono pri brzini od oko 0,5°C po minuti, pod vakuumom.

[0019] Opciono, faza dehidratacije obuhvata najmanje jednu fazu uravnotežavanja.

[0020] Opciono, najmanje jedna faza uravnotežavanja obuhvata održavanje temperature na nekoj konstantnoj temperaturi, dovoljnoj da omogući da zamrznuti kolagen dostigne željenu temperaturu. Dalje opciono, najmanje jedna faza uravnotežavanja obuhvata održavanje temperature na nekoj konstantnoj temperaturi za dovoljan period vremena da se omogući da zamrznuti kolagen dostigne željenu temperaturu. Još dalje opciono, najmanje jedna faza uravnotežavanja obuhvata održavanje temperature na nekoj konstantnoj temperaturi tokom najmanje 10min, opciono najmanje 20min, dalje opciono najmanje 30min, još dalje opciono najmanje 45min, još dalje opciono najmanje 60min; da bi se omogućilo da zamrznuti kolagen dostigne željenu temperaturu.

[0021] Opciono, najmanje jedna faza uravnotežavanja sprovodi se kada se temperatura poveća na najmanje -20°C. Opciono ili dodatno, najmanje jedna faza uravnotežavanja sprovodi se kada se temperatura poveća na najmanje -10°C. Opciono ili dodatno, najmanje jedna faza uravnotežavanja sprovodi se kada se temperatura poveća na najmanje 0°C. Opciono ili dodatno, najmanje jedna faza uravnotežavanja sprovodi se kada se temperatura poveća na najmanje 10°C. Opciono ili dodatno, najmanje jedna faza uravnotežavanja sprovodi se kada se temperatura poveća na najmanje 20°C. Opciono ili dodatno, najmanje jedna faza uravnotežavanja sprovodi se kada se temperatura poveća na najmanje 30°C.

[0022] Opciono, faza dehidratacije obuhvata šest faza uravnotežavanja, gde se svaka faza uravnotežavanja sprovodi kada se temperatura poveća za oko 10°C. Dalje opciono, faza dehidratacije obuhvata šest faza uravnotežavanja, gde se svaka faza uravnotežavanja sprovodi kada se temperatura poveća do oko -20°C, oko -10°C, oko 0°C, oko 10°C, oko 20°C, i oko 30°C.

[0023] Opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 2°C. Dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 10°C. Još dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 20°C. Još dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 30°C. Još dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 40°C. Još dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 50°C. Još dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 60°C. Još dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 70°C. Još dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 80°C.

[0024] Opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 30°C. Dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 40°C. Još dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 65°C.

[0025] Opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od 30°C. Dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od 40°C. Još dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od 65°C.

[0026] Opciono, faza sazrevanja sprovodi se tokom perioda od najmanje jedne nedelje, opciono najmanje dve nedelje, dalje opciono najmanje tri nedelje, još dalje opciono najmanje četiri nedelje, još dalje opciono najmanje pet nedelja, još dalje opciono najmanje šest nedelja.

[0027] Opciono, faza sazrevanja sprovodi se tokom perioda od najmanje dva meseca, opciono najmanje četiri meseca, dalje opciono najmanje šest meseci, još dalje opciono najmanje dvanaest meseci.

[0028] Opciono, faza sazrevanja sprovodi se tokom perioda od jedne nedelje, opciono dve nedelje, dalje opciono tri nedelje, još dalje opciono četiri nedelje.

[0029] Opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 2°C tokom perioda od najmanje šest meseci. Dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od 2°C tokom perioda od šest meseci.

[0030] Opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 30°C tokom perioda od najmanje dva meseca. Dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od 30°C tokom perioda od dva meseca.

[0031] Opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 40°C tokom perioda od najmanje šest nedelja. Dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od 40°C tokom perioda od šest nedelja.

[0032] Opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 65°C tokom perioda od najmanje jedne nedelje. Dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od 65°C tokom perioda od jedne nedelje.

[0033] Opciono, faza sazrevanja sprovodi se u relativnoj vlažnosti manjoj od 100%, opciono manjoj od 90%, dalje opciono manjoj od 80%, još dalje opciono manjoj od 70%, još dalje opciono manjoj od 60%, još dalje opciono manjoj od 50%, još dalje opciono manjoj od 40%, još dalje opciono manjoj od 30%.

[0034] "Relativna vlažnost" predstavlja meru maksimalne količine vode u mešavini gasa i vodene pare, opciono na datoj temperaturi gasa i atmosferskom pritisku, opciono na konstantnom atmosferskom pritisku, opciono izražena kao procenat maksimalne količine vodene pare unutar gasa na datoj temperaturi gasa i atmosferskom pritisku. Za svrhe ove specifikacije, izraz "relativna vlažnost" ima za cilj da označi meru količine vodene pare u mešavini okolnog vazduha i vodene para, u kojoj se sprovodi faza sazrevanja, na konstantnom atmosferskom pritisku, i izražena je u procentima. Za svrhe ove specifikacije, atmosferski pritisak podrazumeva se da je oko 980 do oko 1040 milibara.

[0035] Podrazumeva se da, u sprovođenju faze sazrevanja, parametri temperature, vremena, pritiska, i relativne vlažnosti nisu nužno međusobno isključivi, a prosečan stručnjak prepoznaće da kako jedan parametar varira, u skladu sa tim jedan ili više drugih parametara mogu, takođe, da variraju.

[0036] Opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 40°C tokom perioda od najmanje šest nedelja, i u relativnoj vlažnosti manjoj od 80%. Dalje opciono, faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od 40°C tokom perioda od 6 nedelja, i u relativnoj vlažnosti od 75%.

[0037] Opciono, izolovani kolagen je vlaknasti kolagen. Dalje opciono, izolovani kolagen odabran je od kolagena tipa I, kolagena tipa II, kolagena tipa III, i njihovih mešavina. Još dalje opciono, izolovani kolagen je kolagen tipa I.

[0038] Opciono, postupak dalje obuhvata fazu mehaničke degradacije modifikovanog kolagena pre faze sazrevanja. Opciono, faza mehaničke degradacije obuhvata mlevenje. Dalje opciono, faza mehaničke degradacije odabrana je od mlevenja, sečenja, drobljenja, i njihove mešavine.

[0039] Prema petom aspektu ovog otkrića obezbeđen je postupak za izolovanje kolagena, gde taj postupak obuhvata faze:

(a) obezbeđivanja izvora kolagena; i

(b) povećanja pH izvora kolagena do oko 6,5 do oko 7,5.

[0040] Opciono, izvor kolagena je disperzija kolagena.

[0041] Opciono, faza obezbeđivanja obuhvata fazu uklanjanja fluida, opciono tečne, dalje opciono vodene, sredine; pre faze obezbeđivanja. Dalje opciono, faza obezbeđivanja obuhvata fazu uklanjanja najmanje malo fluida, opciono tečne, dalje opciono vodene, sredine; pre faze obezbeđivanja. Još dalje opciono, faza obezbeđivanja obuhvata fazu uklanjanja najmanje malo fluida, opciono tečne, dalje opciono vodene, sredine; pre faze obezbeđivanja; da bi se obezbedila disperzija izolovanog kolagena.

[0042] Opciono, pH izvora kolagena, opciono disperzije kolagena, povećava se do oko 7,5.

[0043] Opciono, izvor kolagena je fibrozno tkivo, opciono vezivno tkivo. Dalje opciono, izvor kolagena je tetiva, opciono životinjska tetiva, dalje opciono konjska ili goveđa tetiva, poželjno konjska tetiva.

[0044] Opciono, postupak obuhvata fazu degradacije izvora kolagena pre faze pH-povećanja. Dalje opciono, faza degradacije obuhvata mehaničku degradaciju izvora kolagena pre faze pH-povećanja. Opciono ili dodatno, faza degradacije obuhvata hemijsku degradaciju izvora kolagena pre faze pH-povećanja.

[0045] Opciono, faza mehaničke degradacije obuhvata mlevenje. Dalje opciono, faza mehaničke degradacije odabrana je od mlevenja, sečenja, drobljenja, granulisanja, i njihove mešavine. Opciono ili dodatno, faza hemijske degradacije obuhvata dovođenje u kontakt izvora kolagena sa enzimom, opciono proteolitičkim enzimom. Opciono, proteolitički enzim odabran je od himozina, katepsina E, i pepsina; poželjno pepsin.

[0046] Opciono, faza hemijske degradacije sprovodi se pri pH od oko 2,5.

[0047] Opciono, postupak dalje obuhvata fazu uklanjanja kontaminacije iz izvora kolagena. Opciono, faza uklanjanja obuhvata dovođenje u kontakt izvora kolagena sa bazom, opciono jakom bazom, dalje opciono natrijum hidroksidom, još dalje opciono vodenim rastvorom natrijum hidroksida.

[0048] Opciono, postupak obuhvata fazu filtracije degradiranog izvora kolagena, opciono degradirane disperzije kolagena, pre faze pH-povećanja.

[0049] Opciono, postupak obuhvata fazu koncentrovanja kolagena. Opciono, faza koncentrovanja obuhvata izolovanje kolagena. Dalje opciono, faza koncentrovanja obuhvata izolovanje kolagena centrifugiranjem.

[0050] Opciono, faza koncentrovanja obuhvata fazu uklanjanja fluida, opciono tečne, dalje opciono vodene, sredine; da bi se obezbedila disperzija koja ima koncentraciju od oko 3-30 mas.%, opciono 3-4 mas.% čestica kolagena.

[0051] Opciono, izolovani kolagen je zamrznut. Dalje opciono, izolovani kolagen je zamrznut na manje od -20°C. Opciono, zamrznuti izolovani kolagen se odmrzava pre pripreme modifikovanog kolagena.

[0052] Prema šestom aspektu ovog otkrića, obezbeđena je kompozicija koja obuhvata modifikovan kolagen prema prvom aspektu ovog otkrića, ili modifikovan kolagen pripremljen prema drugom aspektu ovog otkrića, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju hirurških adhezija.

[0053] Opciono, upotreba obuhvata davanje kompozicije na biološku membranu, opciono biološko tkivo. Dalje opciono, upotreba obuhvata davanje kompozicije u biološku membranu, opciono biološko tkivo, unutar telesne duplje. Još dalje opciono, upotreba obuhvata davanje kompozicije u biološku membranu, opciono biološko tkivo, unutar telesne duplje kao što su peritonealna duplja, perikardijalna duplja, materična duplja, ili sinovijalna duplja.

[0054] Opciono, upotreba obuhvata topikalno davanje kompozicije u biološku membranu, opciono biološko tkivo. Dalje opciono, upotreba obuhvata topikalno davanje kompozicije u biološku membranu, opciono biološko tkivo, unutar telesne duplje. Još dalje opciono, upotreba obuhvata topikalno davanje kompozicije u biološku membranu, opciono biološko tkivo, unutar telesne duplje kao što su peritonealna duplja, perikardijalna duplja, materična duplja, ili sinovijalna duplja.

[0055] Prema sedmom aspektu ovog otkrića obezbeđen je postupak za proizvodnju kompozicije koja obuhvata modifikovan kolagen prema prvom aspektu ovog otkrića ili modifikovan kolagen pripremljen prema drugom aspektu ovog otkrića, gde taj postupak obuhvata faze:

(a) obezbeđivanja modifikovanog kolagena;

(b) pripreme vodene disperzije modifikovanog kolagena;

(c) degradacije vodene disperzije; i

(d) dehidratacije vodene disperzije.

[0056] Opciono, faza pripreme obuhvata dodavanje zagrejane vode, opciono zagrejane prečišćene vode, modifikovanom kolagenu. Opciono, voda, opciono prečišćena voda zagreva se na oko 35 do oko 42°C pre dodavanja modifikovanom kolagenu.

[0057] Opciono, faza pripreme sprovodi se pri pH od oko 4,0.

[0058] Opciono, faza degradacije obuhvata mehaničku degradaciju vodene disperzije. Opciono, faza mehaničke degradacije obuhvata mešanje pri smicanju.

[0059] Opciono, kompozicija obuhvata modifikovan kolagen u količini od oko 0,4 mas.% do 1,5 mas.%.

[0060] Opciono, kompozicija ima pH od oko 4,0.

[0061] Opciono, faza dehidratacije obuhvata uklanjanje tečnosti iz vodene disperzije tako da kompozicija obuhvata tečnost u količini manjoj od 30 mas.%, opciono manjoj od 20 mas.%, dalje opciono manjoj od 15 mas.%, kompozicije. Dalje opciono, faza dehidratacije obuhvata uklanjanje tečnosti iz vodene disperzije tako da kompozicija obuhvata tečnost u količini manjoj od 13 mas.%, poželjno manjoj od 12 mas.%, kompozicije.

1

[0062] Opciono, faza dehidratacije obuhvata uklanjanje tečnosti iz vodene disperzije upotrebom konvektivne sušare.

[0063] Prema osmom aspektu ovog otkrića obezbeđena je kompozicija za dostavu leka koja se može dobiti obezbeđivanjem izolovanog kolagena, opciono disperzije izolovanog kolagena; zamrzavanjem izolovanog kolagena; i dehidratacijom zamrznutog kolagena.

[0064] Prema devetom aspektu ovog otkrića obezbeđena je kompozicija za dostavu leka koja se može dobiti obezbeđivanjem izolovanog kolagena, opciono disperzije izolovanog kolagena; zamrzavanjem izolovanog kolagena; dehidratacijom zamrznutog kolagena; i sazrevanjem dehidriranog kolagena.

[0065] Prema desetom aspektu ovog otkrića, obezbeđen je postupak pripreme kompozicije za dostavu leka za produženo oslobađanje leka, gde taj postupak obuhvata faze:

(a) obezbeđivanja izolovanog kolagena, opciono disperzije izolovanog kolagena;

(b) zamrzavanja izolovanog kolagena; i

(c) dehidratacije zamrznutog kolagena.

[0066] Prema jedanaestom aspektu ovog otkrića, obezbeđen je postupak pripreme kompozicije za dostavu leka za produženo oslobađanje leka, gde taj postupak obuhvata faze:

(a) obezbeđivanja izolovanog kolagena, opciono disperzije izolovanog kolagena;

(b) zamrzavanja izolovanog kolagena;

(c) dehidratacije zamrznutog kolagena; i

(d) sazrevanja dehidriranog kolagena.

[0067] Opciono, postupak dalje obuhvata fazu obezbeđivanja leka, opciono rastvora leka, kom se dodaje sazreo kolagen, ili koji se dodaje sazrelom kolagenu.

[0068] Opciono, lek je odabran od aminoglikozidnog antibiotika, ili njegove soli ili proleka; i anestetika, ili njegove soli ili proleka.

[0069] Dalje opciono, lek je odabran od gentamicina ((3R,4R,5R)-2-{[(1S,2S,3R,4S,6R)-4,6-diamino-3-{[(2R,3R,6S)-3-amino-6-[(1R)-1-(metilamino)etil]oksan-2-il]oksi}-2-hidroksicikloheksil]oksi}-5-metil-4-(metilamino)oksan-3,5-diol), ili njegove soli ili proleka; i bupivakaina ((RS)-1-butil-N-(2,6-dimetilfenil)piperidin-2-karboksamid), ili njegove soli ili proleka.

[0070] Opciono, lek je vodeni rastvor leka. Dalje opciono, lek je vodeni rastvor leka koji obuhvata neku kiselinu, opciono sirćetna kiselina.

[0071] Opciono, postupak dalje obuhvata fazu mešanja, opciono homogenizovanja, kompozicije za dostavu leka koja sadrži lek, opciono rastvor leka.

[0072] Opciono, postupak dalje obuhvata fazu liofilizacije i/ili dehidratacije kompozicije za dostavu leka koja sadrži lek, opciono rastvor leka.

Kratak opis slika

[0073] Primeri izvođenja ovog pronalaska sada će biti opisani pozivajući se na neograničavajuće primere koji slede i priložene slike gde stubići greške predstavljaju standardne devijacije, u kojima:

Fig.1 je grafikon koji prikazuje karakteristiku viskoznosti kompozicija pripremljenih od svežeg kolagena, zamrznutog kolagena, i dehidriranog zamrznutog kolagena, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari liofilizirani mleveni kolagen);

Fig.2A je grafikon koji prikazuje karakteristiku apsorbcije vode kompozicija pripremljenih od svežeg kolagena, zamrznutog kolagena, i dehidriranog zamrznutog kolagena, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari liofilizirani mleveni kolagen);

Fig.2B je grafikon koji prikazuje karakteristiku bubrenja kompozicija koje obuhvataju svež kolagen, zamrznuti kolagen, i dehidriran zamrznuti kolagen, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari liofilizirani mleveni kolagen);

Fig.3A je grafikon koji prikazuje karakteristiku rastvaranja kompozicija koje sadrže gentamicin pripremljenih od zamrznutog kolagena i dehidriranog zamrznutog kolagena, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari liofilizirani mleveni kolagen);

Fig.3B je grafikon koji prikazuje karakteristiku rastvaranja kompozicija koje sadrže bupivakain pripremljenih od zamrznutog kolagena i dehidriranog zamrznutog kolagena, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari liofilizirani mleveni kolagen); Fig.4 je grafikon koji prikazuje karakteristiku viskoznosti kompozicija pripremljenih od svežeg kolagena, zamrznutog kolagena, dehidriranog zamrznutog kolagena, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari liofilizirani mleveni kolagen), dehidriranog zamrznutog kolagena (nesazreo LMC), i modifikovanog kolagena prema prvom aspektu ovog otkrića, sazreo za 2, 4, i 6 nedelja (LMC sazreo);

Fig.5 je grafikon koji prikazuje karakteristiku viskoznosti kompozicija pripremljenih od dehidriranog zamrznutog kolagena (nesazreo liofilizirani mleveni kolagen), i modifikovanog kolagena prema prvom aspektu ovog otkrića (LMC sazreo);

Fig.6 je grafikon koji prikazuje relativnu sposobnost bubrenja kompozicija pripremljenih od zamrznutog kolagena (FWC) i dehidriranog zamrznutog kolagena, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari LMC); zamrznutog kolagena (FWC) i modifikovanog kolagena prema prvom aspektu ovog otkrića (LMC sazreo); i dehidriranog zamrznutog kolagena (nesazreo LMC) i modifikovanog kolagena prema prvom aspektu ovog otkrića (LMC sazreo);

Fig.7 je grafikon koji prikazuje karakteristiku degradacije kompozicija pripremljenih od dehidriranog zamrznutog kolagena (nesazreo LMC), i modifikovanog kolagena prema prvom aspektu ovog otkrića (LMC sazreo);

Fig.8A je grafikon koji prikazuje karakteristiku rastvaranja kompozicija koje sadrže gentamicin pripremljenih od zamrznutog kolagena (FWC), dehidriranog zamrznutog kolagena (nesazreo LMC), i modifikovanog kolagena prema prvom aspektu ovog otkrića (LMC sazreo);

Fig.8B je grafikon koji prikazuje karakteristiku rastvaranja kompozicija koje sadrže bupivakain pripremljenih od dehidriranog zamrznutog kolagena, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari LMC), i dehidriranog zamrznutog kolagena (nesazreo LMC); i

Fig.9 je grafikon koji prikazuje karakteristiku viskoznosti modifikovanog kolagena prema prvom aspektu ovog otkrića, sazreo za do 4 nedelje (LMC sazreo).

Primeri

Primer 1 – Izolovanje kolagena

[0074] Kolagen može da se izoluje iz velikog broja izvora, na primer, životinjskih koža i životinjskih tetiva. U poželjnom primeru izvođenja, kolagen se izoluje iz životinjske tetive, na primer konjske ili goveđe tetive; iako, bilo koji izvor kolagena, uključujući fibrozno tkivo, opciono vezivno tkivo, može da se koristi i odabere od strane stručnjaka u ovoj oblasti. Poželjno, kolagen se izoluje iz konjske tetive. U

1

postupku izolovanja, konjske tetive su samlevene da bi se degradirao izvor kolagena. Mlevene konjske tetive tretirane su velikim brojem reagenasa, uključujući 1 N natrijum hidroksid (NaOH) da bi se uklonila mikrobiološka kontaminacija kao što su prioni na početku postupka. Faze tretiranja vodonik peroksidom i faze ispiranja pri različitim pH vrednostima su sprovedene, a nakon njih faza mlevenja, koja je korišćena da se poveća površina za sledeću fazu tretiranja. Molekulska masa izvora kolagena dodatno je smanjena tretiranjem sa proteolitičkim enzimom pepsinom na približnoj pH od 2,5. pH je podešena korišćenjem vodenog rastvora 1 N HCl. Pepsin je korišćen da se degradiraju kantaminirajuće komponente seruma kao što je konjski serum albumin (ESA) i došlo je do odvajanja ne-spiralnih delova molekula kolagena (telopeptidi). Tokom ovog postupka, kolagenski materijal takođe je delimično rastvoren u kiseloj sredini. Nakon filtracije, pH nivo je povećan od 2,5 na 7,5 dodavanjem 1 N natrijum hidroksida (NaOH). Ovo podešavanje pH rezultovalo je taloženjem vlaknastog kolagena iz rastvora, koji je potom koncentrovan centrifugiranjem da bi se obezbedila disperzija kolagena koja ima koncentraciju od oko 3-30 mas.%. Dobijeni materijal označen je kao svež kolagen. Svež kolagen može da se obrađuje na nekoliko načina.

[0075] Svež kolagen može da se upakuje u pogodnim porcijama i zamrzne na -20°C da bi se čuvao u zamrzivaču dok ne bude potreban za upotrebu. Dobijeni materijal označen je kao zamrznuti kolagen (FWC). Zamrznuti kolagen se odmrzava pre upotrebe na isti način kao svež kolagen.

[0076] Alternativno, zamrznuti kolagen može da se osuši zamrzavanjem (liofilizuje), i opciono naknadno samelje. Za ovu svrhu, zamrznuti kolagen ručno je distribuiran na ravnu površinu, na primer polistirenski kalup, pri čemu je zamrznuti kolagen imao debljinu sloja između oko 5mm i oko 10mm. Kalupi ispunjeni kolagenom preneti su na police komercijalno dostupne sušare zamrzavanjem (Christ Epsilon) i zamrznuti do neke temperature od oko -38°C sa brzinom rampe između 0,3°C i 1,5°C. Nakon perioda ravnoteže od približno 30 minuta, izazvan je vakuum i temperatura police je sekvencijalno povećavana od oko -38°C do oko 30°C pri brzini od oko 0,5°C po minuti. Kombinacija vakuuma i sekvencijalnog povećanja temperature police od oko -38°C do oko 30°C olakšala je sublimaciju leda iz zamrznutog kolagena sve dok kolagen nije dostigao temperaturu od 0°C. Da bi se osiguralo ravnomerno povećanje temperature kolagena, sprovedena je najmanje jedna faza uravnotežavanja u kojoj je temperatura police održavana na konstantnoj željenoj temperaturi tokom približno 30min, ili sve dok kolagen nije dostigao željenu temperaturu. Na primer, faza uravnotežavanja sprovođena je svakih 10°C između temperatura od -20°C i 30°C da bi se osiguralo ravnomerno povećanje temperature kolagena. Faza uravnotežavanja, na primer na -20°C obuhvatala je održavanje temperature police na nekoj konstantnoj temperaturi od -20°C tokom oko 30min. Jednom kada je led uklonjen sublimacijom, a kolagen dostigao temperaturu od 0°C, sadržaj zaostale vode je dalje smanjen nastavljanjem sekvencijalnog povećavanja temperature police do oko 30°C pri brzini od oko 0,5°C po minuti. Liofilizirani kolagen je potom mleven upotrebom komercijalno dostupnog mlina za sečenje (Rotoplex, Hosokawa Alpine). Dobijeni materijal je označen kao nesazreo liofilizirani mleveni kolagen (nesazreo LMC).

[0077] Opciono, nesazreo liofilizirani mleveni kolagen je sazrevao čuvanjem u polietilenskim kontejnerima (kesama) pod ambijentalnim uslovima od oko 2-8°C na atmosferskom pritisku tokom perioda od oko 1-3 godine do potrebe za upotrebom. Dobijeni materijal je označen kao stari liofilizirani mleveni kolagen (stari LMC).

[0078] Alternativno, nesazreo liofiliziran mleveni kolagen (nesazreo LMC) sazreo je čuvanjem u polietilenskim kontejnerima (kesama) kako je ovde opisano do potrebe za upotrebom, na primer čuvan je na 40°C tokom 2-6 nedelja. Dobijeni materijal označen je kao sazreo liofiliziran mleveni kolagen (sazreo LMC).

Primer 2 – Postupak sjedinjavanja i oprema

[0079] Vodena modifikovana disperzija kolagena pripremljena je u posudi od nerđajućeg čelika upotrebom prethodno zagrejane (35 - 42°C) prečišćene vode, koja je podešena na pH 4,0 ± 0,2. Mešanje pri visokom smicanju bilo je potrebno da bi se razgradila masa modifikovanog kolagena i izložila vlakna kolagena kiseloj sredini. Mikser visokog smicanja (homogenizator) obuhvatao je glavu rotora/statora koja je izvedena da stvara visoke smicajne sile povlačenjem modifikovanog kolagena kroz rotirajuću glavu homogenizatora i forsirajući modifikovan kolagen prema proksimalnoj stacionarnoj glavi statora. Ovaj dizajn je taj koji je obezbezbedio visoke smicajne sile potrebne da se razdvoji vlaknasta masa kolagena na početku pripreme vodene disperzije. Međutim, druga uporediva oprema za mešanje može takođe da se koristi; i može se odabrati od strane stručnjaka u ovoj oblasti. Na primer, IKA Ultra-Turrax mikser može da se koristi pri visokoj brzini za oko 2 do oko 5 minuta.

[0080] Ako je potrebno, iako nije neophodno, dobijena vodena disperzija može da bude filtrirana i degazirana, na primer upotrebom filtera od 250 mikrona i pogodnog sredstva za degaziranje, na primer ultrasonikacija. Koncentracija kolagena u krajnjoj vodenoj disperziji može da bude u opsegu od 0,4% do 1,5%, a pH može da bude u opsegu od 4,0 ± 0,2. Krajnja vodena disperzija može se zatim preneti u zatvorenu posudu od nerđajućeg čelika opremljenu košuljicom, opciono gde se temperatura košuljice održava na 37°C i vodena disperzija lagano meša koristeći podešavanje niskog smicanja.

[0081] Disperzija je napunjena u, na primer 10 x 10 cm, blister kasete ili kalupe za liofilizaciju upotrebom, na primer, pumpe sa pozitivnim izduvavanjem. Pumpa može da bude pumpa bez ventila,

1

opciono koja ima keramičke klipove. Alternativno, peristaltička pumpa može takođe da se korsti. Masa punjenja podešena je na osnovu sadržaja kolagena vodene disperzije da bi se postigao ciljni sadržaj kolagena po površini, na primer oko 0,1 do oko 10,0 mg/cm<2>, opciono oko 4 mg/cm<2>. Po završetku postupka punjenja, napunjeni blisteri ili kalupi postavljeni su u konvektivnu sušaru. Komercijalno dostupna sušara (LabAir; Bleymehl) na 31°C korišćena je za ovaj postupak sušenja. Faza sušenja može obično da zahteva između 1 i 3 dana da bi se uklonio višak vode, što rezultuje krajnjom kompozicijom, na primer membranom, koja se zadržava u blisterima ili kalupima.

[0082] Nakon završetka postupka sušenja, blisteri ili kalupi uklonjeni su iz sušare. Dobijena kompozicija, na primer membrana, isečena je na željnu veličinu, na primer upotrebom pneumatske boje. Postupak pakovanja bio je dvofazni postupak koji obuhvata uvođenje u unutrašnju i spoljašnju vrećastu ambalažu (etilen oksid; EO tip; PMS MEDICAL LTD) praćeno pneumatskim toplotnim zaptivanjem. Jedna strana spoljašnje vrećice obuhvatala je providni laminat folije od poliestra ili polietilena male gustine (LDPE) sa zaptivačem od traka polietilena velike gustine (HDPE). Druga strana je bio neprozirni poliestar ili LDPE laminat. Mogu da se koriste i drugi spoljašnji vrećasti ambalažni materijali, uključujući polietilenske materijale prevučene aluminijum oksidom ili, ako se koristi radijacija E-zracima za sterilizaciju, može da se koristi aluminijumska spoljašnja vrećica. Pneumatski toplotni uređaj za zaptivanje olakšava formiranje kontinuiranog zaptivača na otvorenom kraju vrećice. Gornji deo vrećice uključivao je dva otvora ili trake prekrivene zaptivačem od traka polietilena visoke gustine (HDPE). Ovi otvori/prozorčići specifično su izvedeni za postupak sterilizacije sa EO gasom i samo su propustljivi za gas. Propustljivost prozorčića olakšala je propuštanje EO gasa tokom terminalnog postupka EO sterilizacije. Nakon sterilizacije i ventilacije, spoljašnja vrećica ponovo je zaptivena ispod gasno propusnih otvora/prozorčića, a ovaj gasno propusni (gornji) deo potom je uklonjen iz vrećice. Ovo je dovelo do potpuno zaptivene spoljašnje vrećice koja sadrži terminalno sterilisanu gotovu kompoziciju, na primer membranu.

[0083] Etilen oksid (EO; C2H4O) je gas koji, na određenim radnim temperaturama, steriliše delovanjem kao snažan alkilirajući agens. Pod pravim uslovima, ćelijski konstituenti organizama kao što su kompleksi nukleinske kiseline, funkcionalni proteini, i enzimi reagovaće sa etilen oksidom, izazivajući dodavanje alkil grupa. Kao rezultat alkilovanja, sprečena je ćelijska reprodukcija i nastupa ćelijska smrt. Sterilizator korišćen u ovim primerima bio je DMB 15009 VD (DMB Apparatebau GmbH, Nemačka). Mešavina EO/CO2u odnosu od 15:85 korišćena je kao gas sterilizacije tokom perioda od 6 sati na pritisku od 4 bar. Za uspešan završetak ovog postupka, potrebno je da proizvod sadrži nivo vlage koji nije manji od 9%, koji se može postići njegovim držanjem u oblasti pod kontrolisanim uslovima sredine. Nakon postupka EO sterilizacije, proizvod je bio ventiliran tokom najmanje 3 do 4 nedelje da bi se smanjio nivo zaostalog gasa etilen oksida i bilo kojih ostataka iz kompozicije, na primer membrane, i ambalažnih materijala.

1

Primer 3 – Karakterizacija

[0084] Sve kompozicije (membrane) pripremljene su od 0,6% disperzije upotrebom postupka pethodno opisanog ovde. Svi testovi na disperziji kolagena izvedeni su u okviru 1 dana nakon sjedinjavanja; i svi eksperimenti karakterizacije sa membranama izvedeni su unutar 1 meseca nakon proizvodnje membrane upotrebom nesterilisanih membrana.

Viskoznost disperzije

[0085] Vrednosti viskoznosti 0,9% disperzija kolagena pripremljene od svakog od svežeg kolagena, zamrznutog kolagena, nesazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena, i sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena prema primeru 2 izmerene su korišćenjem Brookfield viskozimetra (digitalni reometar DV-III+ zajedno sa TC-501 protočnim kupatilom). Vrednosti viskoznosti izmerene su pri konstantnoj brzini smicanja (15 s<-1>) i u temperaturnom opsegu od 25 do 40°C sa inkrementima od 5°C. Izračunat je prosek 60 merenja po temperaturi radi dobijanja pouzdanih rezultata.

[0086] Viskoznost disperzije zavisi od temperature i smanjuje se kada se disperzija zagreva. Profili viskoznosti svežeg i zamrznutog kolagena mogu da se porede u testiranom temperaturnom opsegu. Liofilizirani mleveni kolagen, koji je čuvan na temperaturi od 2-8°C tokom 3 godine pre sjedinjavanja (stari LMC), pokazao je značajno manju viskoznost na svim ispitivanim temperaturama u poređenju sa svežim kolagenom i zamrznutim kolagenom (videti Fig.1). Liofilizirani mleveni kolagen, koji je sjedinjen bez čuvanja (nesazreo LMC), pokazao je manju viskoznost na svim ispitivanim temperaturama u poređenju sa svežim kolagenom i zamrznutim kolagenom (videti Fig.4). Liofilizirani mleveni kolagen, koji je sazreo (čuvan na temperaturi od 40°C pre sjedinjavanja; sazreo LMC), pokazao je manju viskoznost u poređenju sa nesazrelim LMC (videti Fig.4), i mogao je da se poredi sa starim liofiliziranim mlevenim kolagenom.

[0087] Kao što se može videti na Fig.5, sazrevanje liofiliziranog mlevenog kolagena kako je ovde opisano rezultuje poboljšanom viskoznošću na svim ispitivanim temperaturama u poređenju sa nesazrelim liofiliziranim mlevenim kolagenom, koji nije podvrgnut fazi sazrevanja opisanoj ovde.

[0088] Razlika u viskoznosti je prednost za obradu membrana. Kolagen sa manjom viskoznošću može da bude lakše degaziran, i napunjen ili izliven; i vreme sušenja takođe se smanjuje kako se kolageni koji imaju više koncentracije mogu obraditi. Modifikovan kolagen ovog otkrića obezbeđuje poboljšane karakteristike viskoznosti u poređenju sa svežim kolagenom i zamrznutim kolagenom; i faza sazrevanja obezbeđuje uporedive karakteristike viskoznosti u poređenju sa liofiliziranim mlevenim kolagenom, koji

1

je čuvan na temperaturi od 2-8°C tokom 3 godine pre sjedinjavanja (stari LMC), čime se obezbeđuju poboljšane karakteristike viskoznosti ostarelog kolagena (stari LMC) bez produženog perioda starenja.

Apsorbcija vode i bubrenje

[0089] Tri pravougaona uzorka (veličine 1,5 x 4 cm) odsečeni su od 5 membrana pripremljenih od svakog od svežeg kolagena, zamrznutog kolagena, starog liofiliziranog mlevenog kolagena, i sazrelog liofiliziranig mlevenog kolagena. Svaki od ovih uzoraka je natapan u WFI (voda za injekciju) tokom 10 minuta, i analiziran u pogledu apsorbcije vode (vlažna masa - suva masa) i bubrenja (vlažna debljina – suva debljina). Debljina uzoraka izmerena je upotrebom Mitutoyo mikrometra IP54.

[0090] Membrane pripremljene od liofiliziranog mlevenog kolagena, koji je čuvan na temperaturi od 2-8°C tokom 3 godine pre sjedinjavanja (stari LMC), pokazale su manju apsorbciju vode i bubrenje nego membrane pripremljene od svežeg kolagena i od zamrznutog kolagena (videti Fig.2a i 2b). Varijabilnost rezultata bila je suštinski manja za membrane pripremljene od liofiliziranog mlevenog kolagena, koji je čuvan na temperaturi od 2-8°C tokom 3 godine pre sjedinjavanja (stari LMC) nego za membrane pripremljene od svežeg kolagena i od zamrznutog kolagena.

[0091] Kao što se može videti na Fig.6, promena debljine za svaku testiranu kolagensku membranu pokazala je da su poboljšane karakteristike apsorbcije vode i bubrenja membrana pripremljenih od sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena preko membrana pripremljenih od liofiliziranog mlevenog kolagena, koji je čuvan na temperaturi od 2-8°C tokom 3 godine pre sjedinjavanja (stari LMC), uporedive sa poboljšanim karakteristikama apsorbcije vode i bubrenja membrana pripremljenih od sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena preko membrana pripremljenih od zamrznutog kolagena.

[0092] Smanjenje karakteristike bubrenja membrana pripremljenih od sazreog liofiliziranog mlevenog kolagena je prednost jer membrane mogu da se implantiraju u ograničene anatomske prostore sa manjim rizikom od pritiskanja i potencijalnog oštećenja vitalnih organa. Tako, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju hirurških adhezija, membrane pripremljene od modifikovanog kolagena mogu da se koriste u većoj raznovrsnosti anatomskih geometrija i hirurških procedura.

Degradacija sa kolagenazom

[0093] Studije degradacije sprovedene su upotrebom 4 do 5 membrana po šarži svakog od svežeg kolagena, zamrznutog kolagena, starog liofiliziranog mlevenog kolagena, i sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena. Jedna membrana (veličina 4,5 x 4,5cm) postavljena je u biker i prekrivena sa 15mL

1

0,2N fosfatnog pufera (pH 7,4 sa CaCl2). Kolagenaza (kolagenaza tipa IA-S, sterilna, 50 mg, SIGMA, REF C5894) rekonstituisana je sa 5mL WFI, i 0,5mL dobijenog rastvora dodato je mešavini. Rastvor u bikeru izmešan je upotrebom tresućeg vodenog kupatila (Julabo SW 22) na 37°C (120 o/min) za 60 minuta. Degradacija je dokumentovana pravljenjem fotografija uzoraka svakih 5 minuta. Rezultati su prikazani u Tabeli 1. Membrane pripremljene od liofiliziranog mlevenog kolagena degradirale su najbrže bez ostatka, dok su membrane pripremljene od svežeg kolagena i zamrznutog kolagena degradirale znatno sporije, i ostavile su iza sebe male aglomerate vlakna.

Tabela 1: Degradacija membrana od konjskog kolagena u prisustvu kolagenaze

[0094] U daljoj studiji, uzorci membrane 3,1 x 3,1 cm uronjeni su u 15 mL pufera opisanog gore; kom je dodato 100 µL rastvora rekonstituisane kolagenaze.1 mL uzoraka uklonjen je nakon 5, 10, 15, 25, 40, 60, i 90 minuta; uzorci su isfiltrirani kroz špric filter od 0,45 µm, i 100 µL alikvota razblaženo je 1:30. UV apsorpcioni spektri između 210 i 230 nm (2 nm inkrementi) izmereni su protiv praznog rastvora korišćenjem UV-VIS fotometra Specord 205 (Analytic Jena). Degradirana frakcija u svakoj vremenskoj tački izračunata je iz maksimalne apsorpcije u odnosu na 90 minutnu vremensku tačku (definisana kao 100%). Rezultati se mogu videti na Fig.7, koja prikazuje da su membrane pripremljene od sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena degradirale brže nego membrane pripremljene od liofiliziranog mlevenog kolagena.

[0095] Kompozicija za upotrebu u lečenju ili sprečavanju hirurških adhezija, na primer membrana za upotrebu kao adhezivna barijera, mora ostati netaknuta tokom određenog vremena da bi se efikasno inhibirala adhezija. Produženo prisustvo membrane može dovesti do povećanog rizika od infekcija, s obzirom da je poznato da je kolagen podloga za bakterijski rast. Ovi in vitro eksperimenti pokazuju da membrane pripremljene od sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena degradiraju brže od membrana pripremljenih od starog liofiliziranog mlevenog kolagena, a još brže od membrana pripremljenih od svežeg kolagena i zamrznutog kolagena, sugerišući da će ovaj efekat takođe biti istinit za in vivo ponašanje. Prema tome, kompozicija koja obuhvata modifikovan kolagen prema prvom aspektu ovog otkrića, ili modifikovan kolagen pripremljen prema drugom aspektu ovog otkrića, za upotrebu u lečenju hirurških adhezija, može da smanji verovatnoću infekcija kao štetan efekat upotrebe adhezivne barijere.

[0096] Uzeti zajedno, primeri ovde obezbeđeni pokazuju da kompozicija koja obuhvata modifikovan

1

kolagen prema prvom aspektu ovog otkrića, ili modifikovan kolagen pripremljen prema drugom aspektu ovog otkrića - na primer, membrane pripremljene od sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena -pokazuju značajno izmenjena svojstva u poređenju sa membranama izrađenim od svežeg kolagena, zamrznutog kolagena, ili nesazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena. Faza sazrevanja obezbeđuje izmenjena svojstva ostarelog kolagena bez produženog perioda starenja; i tako može da bude naročito korisna u proizvodnji kompozicija za upotrebu u sprečavanju ili lečenju hirurških adhezija.

Primer 4 - Rastvaranje

Priprema kompozicija koje obuhvataju gentamicin

[0097] Kompozicije (sunđeri) koje sadrže gentamicin sulfat (Fujian Fukang Pharmaceutical Co. Ltd, Kina) pripremljene su za ispitivanje rastvaranja iz 1,6 mas.% disperzije kolagena korišćenjem modifikovane verzije postupka prethodno opisanog ovde. Svaki sunđer bio je dimenzija 2,5 x 2,5 x 0,5 cm i sadržavao je 50mg kolagena i 50mg gentamicin sulfata. Ukratko, gentamicin sulfat (1,6 mas.%) i 1 N sirćetna kiselina dodati su vodi za injekciju (WFI), i mešani dok se nije dobio bistar rastvor. Kolagen (1,6 mas.%) je dodat rastvoru, ili kao zamrznuti kolagen (odmrznut direktno pre proizvodnje); kao nesazreo liofiliziran mleveni kolagen (nesazreo LMC; liofiliziran direktno pre proizvodnje); ili kao modifikovan kolagen prema ovom otkriću (sazreo LMC). Mešavina je homogenizovana upotrebom komercijalno dostupnog miksera visokog smicanja (Ultraturrax, IKA, Nemačka) za 1 do 5 minuta na temperaturi između 38 i 42°C dok se nije dobila homogena viskozna disperzija. Disperzija je filtrirana kroz mrežu sa okcima od 250µm i mešana tokom približno 30 minuta. Alikvoti disperzija napunjeni su u blistere i postavljeni na police pogodnog uređaja za sušenje zamrzavanjem i liofilizirani. Blisteri ispunjeni disperzijom preneti su na police komercijalno dostupnog uređaja za sušenje zamrzavanjem i zamrznute do neke temperature od oko -38°C sa brzinom rampe između 0,3°C i 1,5°C. Nakon perioda ravnoteže od približno 30 do 60 minuta, vakuum je pokrenut i temperatura polica je sekvencijalno povećavana od oko -38°C do oko 30°C pri brzini od oko 0,5°C po minuti. Kombinacija vakuuma i sekvencijalnog povećanja temperature polica od oko -38°C do oko 30°C olakšala je sublimaciju leda iz zamrznute disperzije sve dok proizvod nije dostigao temperaturu od 0°C. Da bi se osigurilao da temperatura kolagena raste ravnomerno, sprovedena je najmanje jedna faza uravnotežavanja, u kojoj je temperatura police održavana na konstantnoj željenoj temperaturi tokom najmanje 30min, ili dok kolagen nije dostigao željenu temperaturu. Kompozicija porozna poput sunđera uklonjena je iz šupljina blistera i spakovana u vrećice kako je prethodno ovde opisano u primeru 2.

Priprema kompozicija koje obuhvataju bupivakain

2

[0098] Kompozicije (sunđeri) koje sadrže bupivakain HCl proizvedene su za ispitivanje rastvaranja prema sličnom postupku kao što je naveden gore. Sunđeri su proizvedeni od zamrznutog kolagena (FWC) i dehidriranog zamrznutog kolagena, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari LMC). Svaki sunđer bio je dimenzija 5 x 5 x 0,5 cm i sadržavao je 75mg kolagena i 100mg bupivakaina HCl (videti Fig.3). Sunđeri su takođe proizvedeni od dehidriranog zamrznutog kolagena, kom je omogućeno da stari pod ambijentalnim uslovima tokom 3 godine (stari LMC) i dehidriranog zamrznutog kolagena (nesazreo LMC), dimenzija 10 x 10 x 0,5cm i koji je sadržavao 100 mg bupivakain-HCl i 300 mg kolagena. (videti Fig.8B). Ukratko, 1 N sirćetna kiselina dodata je u WFI i kratko mešana. Kolagen (0,6 mas.%; ili zamrznut kolagen; liofiliziran mleveni kolagen; ili sazreo LMC) dodat je rastvoru. Mešavina je homogenizovana upotrebom komercijalno dostupnog miksera visokog smicanja (Ultraturrax, IKA, Nemačka) za 1 do 5 minuta na temperaturi između 38 i 42°C dok se nije dobila homogena viskozna disperzija. Disperzija je filtrirana kroz mrežu sa okcima od 250µm. Bupivakain HCl (0,8 mas.%) rastvoren je u maloj količini WFI i dodat disperziji kolagena. Mešavina je mešana tokom približno 30 minuta. Alikvoti disperzije napunjeni su u kalupe i preneti na police komercijalno dostupnog uređaja za sušenje zamrzavanjem i zamrznute do neke temperature od oko -38°C sa brzinom rampe između 0,3°C i 1,5°C. Nakon perioda ravnoteže od približno 30 do 60 minuta vakuum je pokrenut i temperatura polica je sekvencijalno povećavana od oko -38°C do oko 30°C pri brzini od oko 0,5°C po minuti. Kombinacija vakuuma i sekvencijalnog povećanja temperature polica od oko -38°C do oko 30°C olakšala je sublimaciju leda iz zamrznute disperzije sve dok proizvod nije dostigao temperaturu od 0°C. Da bi se osiguralo da temperatura kolagena ravnomerno raste, sprovedena je najmanje jedna faza uravnotežavanja, u kojoj je temperatura polica održavana na konstantnoj željenoj temperaturi tokom najmanje 30min, ili dok kolagen nije dostigao željenu temperaturu. Porozne kompozicije poput sunđera uklonjene su iz kalupa i spakovane u vrećice, kako je prethodno ovde opisano u primeru 2.

Studije rastvaranja gentamicina

[0099] Svojstva rastvaranja kompozicija (sunđera) koje sadrže gentamicin sulfat analizirana su u duplikatu korišćenjem aparata za rastvaranje tipa II (Distek Inc., SAD), prema instrukcijama proizvođača. Da bi se sprečilo plutanje sunđera, postavljeni su u potapače od nerđajućeg čelika izrađene po narudžbini. Ponderisani sunđeri uronjeni su u 500mL PBS pufera (fosfatno puferisan slani rastvor, pH 7,4, temperatura kupatila 37°C) i mešani sa 50 o/min tokom 24 sata.4,0mL uzorka uklonjeno je nakon 5, 10, 30, 45, 60, 120, 180, 240 i 1440 minuta. Uzorci su podvrgnuti hemijskoj reakciji derivatizacije sa ftalaldehidom (4 mL uzorka 1,6 mL rastvora koji obuhvata 1% ftalaldehid 4,4 mL metanola) na 60°C za 15 min (razblaženje 4/10). Dobijeni rastvori su filtrirani i analizirani u HPLC sistemu (Shimadzu Corp., Japan), prema instrukcijama proizvođača. Korišćene su RP-18 HPLC kolona i pokretna faza koja obuhvata WFI, metanol, sirćetnu kiselinu i Na-1-heptansulfonat sa brzinom protoka od 0,5 mL/min. Pikovi gentamicina C1, C2 i C2a na 330 nm su integrisani, i koncentracija gentamicina izračunata je iz površine ispod krive uzoraka i iz referentnog standarda koji je podvrgnut identičnoj pripremi uzorka.

Studije rastvaranja bupivakaina

[0100] Svojstva rastvaranja kompozicija (sunđera) koje sadrže bupivakain HCl analizirane su u duplikatu korišćenjem aparata za rastvaranje tipa II (Distek Inc., SAD), kako je opisano gore. Da bi se sprečilo plutanje sunđera, postavljeni su u potapače od nerđajućeg čelika izrađene po narudžbini. Ukratko, ponderisani sunđeri uronjeni su u 500 mL PBS pufera (fosfatno puferisan slani rastvor, pH 6,8, temperatura kupatila 37°C) i mešani sa 50 o/min tokom 24 sata.4,0 mL uzorka uklonjeno je nakon 5, 10, 30, 45, 60, 120, 180, 240 i 1440 minuta. Uzorci su razblaženi 1:1 sa PBS puferom, filtrirani i analizirani u HPLC sistemu (Shimadzu Corp., Japan). Korišćene su RP-18 HPLC kolona i pokretna faza koja obuhvata fosfatni pufer pH 4,5 i acetonitril sa brzinom protoka od 0,5 mL/min. Pik bupivakaina na 230 nm integrisan je, i koncentracija bupivakaina je izračunata iz površine ispod krive uzoraka i iz referentnog standarda.

[0101] Rezultati studija rastvaranja su prikazani na Fig.3A, 3B, i 8A i 8B.

[0102] Rezultati ovih studija rastvaranja pokazali su da modifikovan kolagen prema ovom otkriću obezbeđuje kompoziciju za dostavu leka, gde je brzina oslobađanja biološki aktivnih supstanci iz kompozicije na bazi kolagena smanjenja u odnosu na one kompozicije izrađene od izolovanog kolagena bez modifikacije, čime se obezbeđuje kompozicija za dostavu leka koja ima više produženu akciju oslobađanja leka (videti Fig.3A i 3B).

[0103] Štaviše, kao što se može videti sa Fig.8A i 8B, sazreo LMC obezbeđuje kompoziciju za dostavu leka, koja pokazuje značajno smanjenu brzinu oslobađanja biološki aktivnih supstanci u poređenju sa kompozicijama pripremljenim od nesazrelog liofiliziranog LMC ili zamrznutog kolagena; čime se obezbeđuje kompozicija za dostavu leka koja ima više produženu akciju oslobađanja leka.

[0104] Ovo produženo oslobađanje može biti korisno za proizvode na bazi kolagena koji sadrže aktivne farmaceutske sastojke (API) sa dobrom rastvorljivošću u vodi. Usporavanje kinetika oslobađanja za ovu kombinaciju inače se teško postiže bez hemijskog umrežavanja kompozicije za dostavu leka. I kod topikalne administracije i administracije implanta, produženo oslobađanje sastojka iz kompozicije za dostavu leka može dovesti do dužeg terapeutskog delovanja i poboljšane lokalne efikasnosti.

Primer 5 - Čuvanje

[0105] Nesazreo liofiliziran mleveni kolagen (nesazreo LMC) pripremljen je kako je opisano u primeru 1; a sazrevao je čuvanjem u polietilenskim kontejnerima (kesama) kako je opisano ovde tokom do 4 nedelje. Dobijeni materijal označen je kao sazreo liofiliziran mleveni kolagen (sazreo LMC).

[0106] Vrednosti viskoznosti izmerene su u svakom od naznačenih vremenskih perioda (1, 2, 3, i 4 nedelje čuvanja) kako je opisano u primeru 3. Ukratko, vrednosti viskoznosti izmerene su korišćenjem Brookfield viskozimetra (digitalni reometar DV-III+ zajedno sa TC-501 protočnim kupatilom) pri konstantnoj przini smicanja (15 s<-1>) i tokom temperaturnog opsega od 30 do 65°C. Izmerene su vrednosti viskoznosti sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena koji ima mali sadržaj vlage od 1 - 2% i visok sadržaj vlage od 13 - 15%.

[0107] Kao što se može videti sa Fig.9, uopšteno, na viskoznost sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena ne utiče sadržaj vlage sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena. Štaviše, povećanje temperature čuvanja ubrzava smanjenje viskoznosti sazrelog liofiliziranog mlevenog kolagena. Sigurno, sazrevanje liofiliziranog mlevenog kolagena kako je ovde opisano rezultuje poboljšanjem viskoznosti za sva ispitivana vremena čuvanja. Na nižoj temperaturi čuvanja, produženo je vreme potrebno da se dostigne ciljna viskoznost.

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za pripremu modifikovanog kolagena, pri čemu taj postupak obuhvata faze:

(a) obezbeđivanja izolovanog kolagena;

(b) zamrzavanja izolovanog kolagena;

(c) dehidratacije zamrznutog kolagena; i

(d) sazrevanja dehidriranog kolagena, gde faza sazrevanja obuhvata čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 40 °C tokom najmanje šest nedelja, ili čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 65 °C tokom najmanje jedne nedelje, ili čuvanje dehidriranog kolagena na temperaturi od najmanje 30 °C tokom najmanje dva meseca.

2. Postupak prema zahtevu 1, u kom faza obezbeđivanja obuhvata obezbeđivanje disperzije izolovanog kolagena koja ima koncentraciju od 3-30 mas.% čestica kolagena.

3. Postupak prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, u kom faza zamrzavanja obuhvata zamrzavanje do temperature od -33 °C do -42 °C.

4. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kom faza dehidratacije obuhvata uklanjanje vodene faze smanjenjem pritiska na 0,05 do 0,5 mbar.

5. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kom faza dehidratacije obuhvata povećanje temperature kolagena na 30°C.

6. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kom faza dehidratacije obuhvata najmanje jednu fazu uravnotežavanja, pri čemu ta ili svaka faza uravnotežavanja obuhvata održavanje temperature na nekoj konstantnoj temperaturi tokom najmanje 10min.

7. Postupak prema zahtevu 6, u kom faza dehidratacije obuhvata šest faza uravnotežavanja, pri čemu se svaka faza uravnotežavanja sprovodi kada se temperatura poveća za 10°C.

8. Postupak prema zahtevu 1, u kom se modifikovan kolagen melje pre faze sazrevanja.

9. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kom se faza sazrevanja sprovodi u relativnoj vlažnosti manjoj od 80%.

10. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kome taj postupak dalje obuhvata fazu obezbeđivanja leka kom se dodaje sazreo kolagen, ili koji se dodaje sazrelom kolagenu, da bi se obezbedila kompozicija za dostavu leka za produženo oslobađanje.

11. Postupak prema zahtevu 10, u kom lek predstavlja vodeni rastvor leka.

12. Postupak za proizvodnju kompozicije koja obuhvata modifikovan kolagen pripremljen prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu taj postupak obuhvata faze:

(a) obezbeđivanja modifikovanog kolagena prema postupcima bilo kog od prethodnih zahteva; (b) pripreme vodene disperzije modifikovanog kolagena dodavanjem zagrejane vode modifikovanom kolagenu;

(c) degradacije vodene disperzije; i

(d) dehidratacije vodene disperzije.