RS56638B1 - Cgrp antitela - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak je iz oblasti medicine, naročito iz oblasti antitela za peptid povezan sa genom za kalcitonin (CGRP). Speifičnije, pronalazak se odnosi na CGRP antitela i na upotrebu CGRP antitela za terapiju migrena.

[0002] Peptid povezan sa genom za kalcitonin (CGRP) je neuropeptid od 37 aminokiselina koji izlučuju nervi centralnog i perifernog nervnog sistema. CGRP je široko raširen u senzornim nervima, kako u perifernom tako i u centralnom nervnom sistemu i ispoljava veliki broj različitih bioloških aktivnosti. Objavljeno je da CGRP ima ulogu. Kada je oslobođen iz trigeminalnih i drugih nervnih vlakana, veruje se da CGRP posreduje svoje biološke odgovore vezivanjem za specifične receptore na ćelijskoj površini.

[0003] Objavljeno je da CGRP ima ulogu u migrenama jer se CGRP oslobađa posle stimulacije senzornih nerava i ima potentnu vazodilatatornu aktivnost. Oslobađanje CGRP povećava vaskularnu propustljivost i kasnije curenje proteina plazme (ekstravazacija proteina plazme) u tkivima inervisanim trigeminalnim nervnim vlaknima posle stimulacije ovih vlakana. Pored toga, studije su objavile da je infuzija CGRP kod pacijenata koji pate od migrena rezultovala u simptomima sličnim migreni.

[0004] Takođe je objavljeno da CGRP ima ulogu u osteoartritisu (OA). OA je hronično stanje koje pogađa veliki procenat ljudi širom sveta. Bol kod artritisa je okarakterisan hiperalgezijom (prekomerna osetljivost na stimuluse koji normalno nisu štetni) i spontanim bolom (bol prilikom mirovanja). Inflamacija zgloba izaziva perifernu i centralnu senzitizaciju. Kod periferne senzitizacije, nociceptori koji sadrže CGRP sa normalno visokim pragom počinju da daju odgovor na laki pritisak povezan sa normalnim kretanjem zgloba. CGRP deluje kao lokalni olakšivač inflamatornih procesa. Ovaj kontinuirani proces konačno dovodi do centralne senzitizacije u kičmenoj moždini tako da neuroni postaju responsivni na stimulaciju upaljenih ćelija kao i neupaljeno tkivo. U prekliničkim modelima OA bola kod pacova, zabeleženo je povećanje u broju CGRP pozitivnih nervnih vlakana, koje je u pozitivnoj korelaciji sa količinom bola.

[0005] Trenutni standard nege za OA bol sastoji se od nesteroidnih anti-inflamatornih lekova (NSAIDs) i selektivnih inhibitora Cox-2. Vremenom, mnogi pacijenti će postati neosetljivi na ove tretmane ili nisu sposobni da tolerišu visoke doze potrebne za efikasno olakšanje bola. Sledeći tretmani sastoje se od intra-artikularnih injekcija (hijaluronan) ili opijata. Krajnji tretman je hirurška potpuna zamena zgloba. Mnogi od ovih tretmana imaju negativne sporedne efekte, u opsegu od gastro-intestinalnih (NSAIDs) do kardiovaskularnih (inhibitori Cox-2), otežani su i/ili nisu veoma efikasni (intra-artikularne injekcije), nose rizik od zloupotrebe (opijati), ili su ograničeni samo na 1 zglob (intra-artikularne injekcije, operacija).

[0006] Iako su opisana CGRP antitela za lečenje migrena i za lečenje inflamatornog bola (migrene-WO 2007/076336 o WO 2007/054809; OA-videti, antitelo G1 prema WO2009/109908A1), još uvek postoji potreba za alternativama. Poželjno, alternativna tretmana je bezbedna i efikasna. Poželjnije, alternativan tretman za OA će obezbediti olakšanje dugotrajnog bola u višestrukim zglobovima koji se toleriše kod pacijenata bez rizika od zavisnosti i/ili zloupotrebe.

[0007] Predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), pri čemu navedeni LCVR sadrži aminokiselinske sekvence LCDR1, LCDR2 i LCDR3 i HCVR sadrži aminokiselinske sekvence HCDR1, HCDR2 i HCDR3, gde LCDR1 je RASKDISKYLN (SEQ ID NO: 6), LCDR2 je YTSGYHS (SEQ ID NO: 7), LCDR3 je QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 je AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO: 16) i HCDR3 je LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39).

[0008] Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde navedeni LCVR sadrži aminokiselinske sekvence LCDR1, LCDR2 i LCDR3 i HCVR sadrži aminokiselinske sekvence HCDR1, HCDR2 i HCDR3, koje su izabrane iz grupe koja se sastoji od:

a) LCDR1 je RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 je AIYEGTGDTRYIQKFAG (SEQ ID NO: 13) i HCDR3 je LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14);

b) LCDR1 je RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 je AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15) i HCDR3 je LSDYVSGFSY (SEQ ID NO: 14);

c) LCDR1 je RASRPIDKYLN (SEQ ID NO: 8), LCDR2 je YTSEYHS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 je AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15) i HCDR3 je LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39); i

d) LCDR1 je RASQDIDKYLN (SEQ ID NO: 9), LCDR2 je YTSGYHS (SEQ ID NO: 7), LCDR3 je QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 je AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO: 15), i HCDR3 je LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39),

gde se humano konstruisano CGRP antitelo vezuje za humani CGRP.

[0009] Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR i HCVR, gde LCDR1 je SEQ ID NO: 3, LCDR2 je SEQ ID NO: 4, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 12, HCDR2 je SEQ ID NO: 13 i HCDR3 je SEQ ID NO: 14, gde se humano konstruisano CGRP antitelo vezuje za humani CGRP. Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR i HCVR, gde LCDR1 je SEQ ID NO: 3, LCDR2 je SEQ ID NO: 4, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 12, HCDR2 je SEQ ID NO: 15 i HCDR3 je SEQ ID NO: 14, gde se humano konstruisano CGRP antitelo vezuje za humani CGRP. Predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR i HCVR, gde LCDR1 je SEQ ID NO: 6, LCDR2 je SEQ ID NO: 7, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 12, HCDR2 je SEQ ID NO: 16 i HCDR3 je SEQ ID NO: 39, gde se humano konstruisano CGRP antitelo vezuje za humani CGRP. Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR i HCVR, gde LCDR1 je SEQ ID NO: 8, LCDR2 je SEQ ID NO: 4, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 12, HCDR2 je SEQ ID NO: 15 i HCDR3 je SEQ ID NO: 39, gde se humano konstruisano CGRP antitelo vezuje za humani CGRP. Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR i HCVR, gde LCDR1 je SEQ ID NO: 9, LCDR2 je SEQ ID NO: 7, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 12, HCDR2 je SEQ ID NO: 15, i HCDR3 je SEQ ID NO: 39, gde se humano konstruisano CGRP antitelo vezuje za humani CGRP.

[0010] Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR i HCVR, gde LCDR1 je RASX1X2IX3X4YLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2 je YTSX5YHS (SEQ ID NO: 11), LCDR3 je QQGDALPPT(SEQ ID NO: 5) i HCDR1 je GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO:12), HCDR2 je AIYEGTGX6TX7YIQKFAX8(SEQ ID NO: 37) i HCDR3 je LSDYVSGFX9Y (SEQ ID NO: 38), gde X1je Q, R, ili K; X2je D ili P, X3je D ili S, X4je N ili K, X5je G ili E, X6je K ili D, X7je V ili R, X8je D ili G, i X9je G ili S, gde se antitelo vezuje za humani CGRP.

[0011] Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR sadrži DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASX1X2IX3X4YLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSX5YHSGVPSRFSGSGSGTDFTX6TISSLQPEDX7ATYYCQQGDALPPTFGX8GTKX9EIK gde X1je Q, K, ili R; X2je D ili P; X3je D ili S; X4je K ili N; X5je E ili G; X6je F ili L; X7je I ili F; X8je Q ili G; i X9je L ili V. (SEQ ID NO: 42) i HCVR sadrži QVQLVQSGAEVKKPGX1SVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAI YEGTGX2TX3YIQKFAX4RVTX5TX6DX7STSTX8YMELSSLRSEDTAVYYCARLSDY VSGFX9YWGQGTX10VTVSS, gde X1=A ili S; X2=K ili D; X3=V ili R; X4=G ili D; X5=M ili I; X6=R ili A; X7=T ili K; X8=V ili A; X9=G ili S; i X10=L ili T. (SEQ ID NO: 43), gde se antitelo vezuje za humani CGRP.

[0012] U drugom primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde navedena aminokiselinska sekvenca LCVR je SEQ ID NO: 19 i navedena aminokiselinska sekvenca HCVR je SEQ ID NO: 24

[0013] Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR i HCVR su aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od:

a. LCVR je SEQ ID NO: 17 i HCVR je SEQ ID NO: 22;

b. LCVR je SEQ ID NO: 18 i HCVR je SEQ ID NO: 23;

c. LCVR je SEQ ID NO: 20 i HCVR je SEQ ID NO: 25; i

d. LCVR je SEQ ID NO: 21 i HCVR je SEQ ID NO: 26.

[0014] Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR prema SEQ ID NO: 17 i HCVR prema SEQ ID NO: 22. Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR prema SEQ ID NO: 18 i HCVR prema SEQ ID NO: 23. Predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR prema SEQ ID NO: 19 i HCVR prema SEQ ID NO: 24. Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR prema SEQ ID NO: 20 i HCVR prema SEQ ID NO: 25. Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR prema SEQ ID NO: 21 i HCVR prema SEQ ID NO: 26.

[0015] Predmetni pronalazak takođe daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži laki lanac (LC) i težak lanac (HC), gde aminokielinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 29 i aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 34

[0016] Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži laki lanac (LC) i težak lanac (HC), gde su aminokiselinske sekvence LC i HC izabrane iz grupe koja se sastoji od:

a) LC je SEQ ID NO: 27 i HC je SEQ ID NO: 32;

b) LC je SEQ ID NO: 28 i HC je SEQ ID NO: 33;

c) LC je SEQ ID NO: 30 i HC je SEQ ID NO: 35; i

d) LC je SEQ OD NO: 31 i HC je SEQ ID NO: 36.

[0017] Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrže LC prema SEQ ID NO: 27 i HC prema SEQ ID NO: 32. Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LC prema SEQ ID NO: 28 i HC prema SEQ ID NO: 33. U primeru izvođenja, humano konstruisano CGRP antitelo sadrži LC prema SEQ ID NO: 29 i HC prema SEQ ID NO: 34. Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LC prema SEQ ID NO: 30 i HC prema SEQ ID NO: 35. Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LC prema SEQ ID NO: 31 i HC prema SEQ ID NO: 36. Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži dva laka lanca i dva teška lanca gde svaka aminokiselinska sekvenca LC je SEQ ID NO: 27 i svaka aminokiselinska sekvenca HC je SEQ ID NO: 32. Dalje je ovde opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži dva laka lanca i dva teška lanca gde svaka aminokiselinska sekvenca LC je SEQ ID NO: 28 i svaka aminokiselinska sekvenca HC je SEQ ID NO: 33. U jednom primeru izvođenja, humano konstruisano CGRP antitelo sadrži dva laka lanca i dva teška lanca gde svaka aminokiselinska sekvenca LC je SEQ ID NO: 29 i svaka aminokiselinska sekvenca HC je SEQ ID NO: 34. Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži dva laka lanca i dva teška lanca gde svaka aminokiselinska sekvenca LC je SEQ ID NO: 30 i svaka aminokiselinska sekvenca HC je SEQ ID NO: 35. Ovde je dalje opisano humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, gde svaka aminokiselinska sekvenca LC je SEQ ID NO: 31 i svaka aminokiselinska sekvenca HC je SEQ ID NO: 36. Predmetni pronalazak takođe daje antigenvezujući fragment antitela koja su ovde opisana.

[0018] Predmetni pronalazak takođe daje humana konstruisana CGRP antitela koja imaju IC50 < 1.0 nM u analizi koja je esencijalno kao što je opisana u Primeru 4. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR i HCVR, gde LCDR1 je SEQ ID NO: 6, LCDR2 je SEQ ID NO: 7, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 12, HCDR2 je SEQ ID NO: 16 i HCDR3 je SEQ ID NO: 39 i gde se humano konstruisano CGRP antitelo vezuje za humani CGRP i takođe ima IC50 < 1.0 nM u analizi esencijalno kao što je opisana u Primeru 4. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu LCVR prema SEQ ID NO: 19 i aminokiselinsku sekvencu HCVR prema SEQ ID NO: 24, gde humano konstruisano CGRP antitelo ima IC50 < 1.0 nM u analizi esencijalno kao što je opisana u Primeru 4. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu LC prema SEQ ID NO: 29 i aminokiselinsku sekvencu HC prema SEQ ID NO: 34, gde humano konstruisano CGRP antitelo ima IC50 < 1.0 nM u analizi esencijalno kao što je opisana u Primeru 4.

[0019] Predmetni pronalazak takođe daje humana konstruisana CGRP antitela koja imaju IC50 < 0.5 nM u analizi esencijalno kao što je opisana u Primeru 4. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži LCVR i HCVR, gde LCDR1 je SEQ ID NO: 6, LCDR2 je SEQ ID NO: 7, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 12, HCDR2 je SEQ ID NO: 16 i HCDR3 je SEQ ID NO: 39 i gde se humano konstruisano CGRP antitelo vezuje za humani CGRP i takođe ima IC50 < 0.5 nM nM u analizi esencijalno kao što je opisana u Primeru 4. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu LCVR prema SEQ ID NO: 19 i aminokiselinsku sekvencu HCVR prema SEQ ID NO: 24, gde humano konstruisano CGRP antitelo ima IC50 < 0.5 nM u analizi koja je esencijalno kao što je opisana u Primeru 4U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu LC prema SEQ ID NO: 29 i aminokiselinsku sekvencu HC prema SEQ ID NO: 34, gde humano konstruisano CGRP antitelo ima IC50 < 0.5 nM u analizi esencijalno kao što je opisana u Primeru 4.

[0020] Predmetni pronalazak takođe daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži humano konstruisano CGRP antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili eskcipijens. Predmetni pronalazak dalje daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži CGRP antitelo prema predmetnom pronalasku zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i izborno, druge terapeutske sastojke.

[0021] Ovde je opisan postupak za lečenje bola od osteoartritisa koji sadrži primenu na pacijenta kod koga postoji potreba za tim, gumanog konstruisanog CGRP antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku. Ovde je dalje opisan postupak za lečenje migrena koji sadrži primenu na pacijenta kod koga postoji potreba za tim humanog konstruisanog CGRP antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku.

[0022] Predmetni pronalazak takođe daje humano konstruisano CGRP antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku za upotrebu u terapiji. Ovde je opisano humano konstruisano CGRP antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku za lečenje bola od osteartritisa. U dodatnom aspektu, predmetni pronalazak daje humano konstruisano CGRP antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predemtnom pronalasku za lečenje migrena.

[0023] Ovde je opisana upotreba humanog konstruisanog CGRP antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku za upotrebu u lečenju bola od osteoartritisa. Dalje je opisana upotreba humanog konstruisanog CGRP antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema predmetnom pronalasku za upotrebu u lečenju migrena. Dalje je ovde opisana upotreba humanog konstruisanog CGRP antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta u proizvodnji leka za lečenje osteoartritisa. Ovde je opisana upotreba humanog konstruisanog CGRP antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u proizvodnji leka za lečenje migrena.

[0024] Antitelo cele dužine kao što postoji prirodno je molekul imunoglobulina koji sadrži 2 teška (H) lanca i 2 laka (L) lanca međusobno vezana disulfidnim vezama. Amino terminalni deo svakog lanca obuhvata varijabilni region od oko 100-110 aminokiselina primarno odgovoran za prepoznavanje antigena preko regiona za određivanje komplementarnosti (CD Rs) koji su tu sadržani. Karboksi terminalni deo svakog lanca definiše kontantni region primarno odgovoran za efektornu funkciju.

[0025] CDRs su pomešani sa regionima koji su konzervativniji, koji su označeni terminom okvirni regioni (FR). Varijabilni region svakog lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR) je sastavljen od 3 CD Rs i 4 FRs, uređeni od amino terminusa do karboksi terminusa po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 3 CDRs lakog lanca su označeni kao "LCDR1, LCDR2 i LCDR3" i 3 CDRs teškog lanca su označeni kao "HCDR1, HCDR2 i HCDR3." CDRs sadrže većinu ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. Numeracija i položaj CDR aminokiselinskih ostataka unutar LCVR i HCVR regiona je u skladu sa dobro poznatom konvencijom Kabat numeracije.

[0026] Laki lanci su klasifikovani kao kapa i lambda, i okarakterisani su određenim konstantnim regionom kao što je poznat u stanu tehnike. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, ili IgE, respektivno. IgG antitela mogu biti dalje podeljena u podklase, npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Svaki tip teškog lanca je okarakterisan određenim konstantnim regionom sa sekvencom dobro poznatom u stanju tehnike.

[0027] Kao što je ovde korišćen, termin "monoklonsko antitelo" (Mab) označava antitelo koje je poreklom od jedne kopije ili klona uključujući, na primer, bilo koji eukariotski, prokariotski ili fagni klon, a ne postupak pomoću koga je proizvedeno. Mabs prema predmetnom pronalasku postoje u homogenoj ili značajno homogenoj populaciji. Kompletna Mabs sadrže 2 teška lanca i 2 laka lanca. "Antigen-vezujući fragmenti" takvih monoklonskih antitela obuhvataju, na primer, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab’)2fragmente i jednolančane Fv fragmente. Monoklonska antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti prema predmetnom pronalasku mogu biti proizvedeni, na primer, pomoću rekombinantnih tehnologija, tehnologija fagnog prikaza, sintetičkih tehnologija, npr., CDR-graftinga, ili kombinacija takvih tehnologija ili drugih tehnologija poznatih u stanju tehnike. Na primer, miševi mogu biti imunizovani sa humanim CGRP ili njegovim fragmentima, dobijena antitela mogu biti izolovana i prečišćena, i određivanje da li ona poseduju vezujuće i funkcionalne osobine slične ili iste kao jedinjenja antitela opisana ovde može biti procenjeno pomoću postupaka opisanih u Primerima u daljem tekstu. Antigen-vezujući fragmenti takođe mogu biti pripremljeni pomoću konvencionalnih postupaka. Postupci za proizvodnju i prečišćavanje antitela i antigen-vezujućih fragmenata su dobro poznati u stanju tehnike i mogu se naći, na primer, u Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 i 15, ISBN 0-87969-314-2.

[0028] Izraz "humana konstruisana CGRP antitela" označava monoklonska antitela stvorena i/ili manipulisana tako da imaju vezujuće i funkcionalne osobine prema pronalasku, vezuju se za humani CGRP, i da imaju okvirne regione koji su značajno humani ili potpuno humani susedni CDRs poreklom od nehumanog antitela. "Antigen-vezujući fragmenti" takvih humanih konstruisanih antitela obuhvataju, na primer, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab’)2fragmente i jednolančane Fv fragmente. "Okvirni region" ili "okvirna sekvenca" označava bilo koji od okvirnih regiona 1 do 4. Humana konstruisana antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti obuhvaćeni predmetnim pronalaskom obuhvataju molekule u kojima je bilo koji ili više okvirnih regiona 1 do 4 značajno ili potpuno humano, tj., gde je prisutna bilo koja od mogućih kombinacija pojedinačnih značajno ili potpuno humanih okvirnih regiona 1 do 4. Na primer, ovo obuhvata molekule u kojima su okvirni region 1 i okvirni region 2, okvirni region 1 i okvirni region 3, okvirni region 1, 2 i 3, itd., značajno ili potpuno humani. Značajni humani okviri su oni koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvenci sa poznatom okvirnom sekvencom humane klicine linije. Poželjno, značajno humani okviri imaju najmanje oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili oko 99% identičnosti sekvence sa poznatom okvirnom sekvencom humane klicine linije.

[0029] Potpuno humani okviri su oni koji su identični sa poznatom okvirnom sekvencom humane klicine linije. Okvirne sekvence humane klicine linije mogu biti dobijene iz ImMunoGeneTics (IMGT) preko njihove internet stranice http://imgt.cines.fr, ili iz The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Na primer, okviri lakog lanca klicine linije mogu biti izabrani iz grupe koja se sastoji od: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2 i O8, i okviri teškog lanca klicine linije mogu biti izabrani iz grupe koja se sastoji od: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 i VH5-51.

[0030] Humana konstruisana antitela pored onih koja su ovde opisana koja ispoljavaju slične funkcionalne osobine prema predmetnom pronalasku mogu biti generisana upotrebom nekoliko različitih postupaka. Specifična jedinjenja antitela koja su ovde opisana mogu biti korišćena kao obrasci ili jedinjenja ishodnog antitela za pripremu dodatnih jedinjenja antitela. U jednom pristupu, CDRs jedinjenja ishodnog antitela su graftovani u humani okvir koji ima visoku identičnost sekvence sa okvirom jedinjenja ishodnog antitela. Identičnost sekvence novog okvira generalno će biti najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 99% identična sa sekvencom odgovarajućeg okvira u jedinjenju ishodnog antitela. Ovo graftovanje može da rezultuje u redukciji u afinitetu vezivanja u poređenju sa onim od ishodnog antitela. Ukoliko je to slučaj, okvir može biti obrnuto-mutiran u ishodni okvir na određenim položajima na osnovu specifičnih kriterijuma opisanih od strane Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Dodatne reference koje opisuju postupke korisne u humanizaciji mišjih antitela obuhvataju U.S. patente br 4,816,397; 5,225,539 i 5,693,761; kompjuterske programe ABMOD i ENCAD kao što je opisano u Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620; i postupak koji su dali Winter i saradnici (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; i Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536.

[0031] Identifikacija ostataka za razmatranje za obrnute-mutacije može se izvesti na sledeći način:

[0032] Kada aminokiselina spada pod sledeću katergoriju, okvirna aminokiselina sekvence humane klicine linije koja je korišćena ("akceptorski okvir") je zamenjena okvirnom aminokiselinom iz okvira jedinjenja ishodnog antitela ("donorski okvir"):

(a) aminokiselina u humanom okvirnom regionu akceptorskog okvira je neuobičajena za humane okvire na tom položaju, dok je odgovarajuća aminokiselina u donorskom imunoglobulinu tipična za humane okvire na tom položaju;

(b) položaj aminokiseline je neposredno susedan jednom od CDRs; ili

(c) bilo koji atom bočnog lanca okvirne aminokiseline je unutar oko 5-6 angstrema (centarprema-centru) bilo kog atoma aminokiseline CDR u trodimenzionalnom modelu imunoglobulina.

[0033] Kada je svaka od aminokiselina u humanog okvirnom regionu akceptorskog okvira i odgovarajuća aminokiselina u donorskom okviru generalno neuobičajena za humane okvire na tom položaju, takva aminokiselina može biti zamenjena aminokiselinom tipičnom za humane okvire na tom položaju. Ovaj kriterijum obrnute-mutacije omogućava obnavljanje aktivnosti jedinjenja ishodnog antitela.

[0034] Sledeći pristup za generisanje humanih konstruisanih antitela koja ispoljavaju slične funkcionalne osobine jedinjenjima antitela opisanim ovde obuhvata slučajnu mutaciju aminokiselina unutar graftovanih CDRs bez promene okvira, i skrining rezultujućih molekula za vezujući afinitet i druge funkcionalne osobine koje su dobre kao ili bolje od onih od jedinjenja ishodnog antitela. Pojedinačne mutacije takođe mogu biti uvedene na svakom aminoiselinskom položaju unutar svakog CDR, nakon čega sledi procena efekata takvih mutacija o vezujućem afinitetu i drugih funkcionalnih osobina. Pojedinačne mutacije koje proizvode poboljšane osobine mogu biti kombinovane za procenu njihovih efekata u međusobnoj kombinaciji.

[0035] Pored toga, moguća je kombinacija oba od gore navedenih pristupa. Posle CDR graftinga, moguće je obrnuto-mutirati specifične okvirne regione pored uvođenja aminokiselinskih promena u CDRs. Ova metodologija je opisana u Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162.

[0036] Primenom navoda prema predmetnom pronalasku, stručnjak iz date oblasti tehnike može da koristi uobičajene tehnike, npr., mutagenezu usmerenu na mesto, za supstituciju aminokiselina unutar sada opisanih CDR i okvirnih sekvenci i na taj način generiše dodatne aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona poreklom od predmetnih sekvenci. Sve alternativne prirodne aminokiseline mogu biti uvedene na specifično supstituciono mesto. Postupci koji su ovde opisani mogu zatim biti korišćeni za skrining ovih dodatnih aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona za identifikaciju sekvenci koje imaju naznačene in vivo funkcije. Na ovaj način, mogu biti identifikovane dodatne sekvence pogodne za pripremu humanih konstruisanih antitela i njihovih antigen-vezujućih delova u skladu sa predmetnim pronalaskom. Poželjno, aminokiselinska supstitucija unutar okvira je ograničena na jedan, dva ili tri položaja unutar bilo kog od 4 okvirna regiona lakog lanca i/ili teškog lanca koji su ovde navedeni. Poželjno, aminokiselinska supstitucija unutar CDRs je ograničena na jedan, dva ili tri položaja unutar bilo kog ili više od 3 CDRs lakog lanca i/ili teškog lanca. Kombinacije različitih promena unutar ovih okvirnih regiona i CDRs opisane u prethodnom tekstu su takođe moguće.

[0037] Termin "lečenje" (ili "lečiti" ili "tretman") označava postupke koji obuhvataju usporavanje, pekidanje, zustavljanje, kontrolisanje, stopiranje, redukovanje ili reverziju napredovanja ili težine simptoma, poremećaja, stanja ili bolesti, ali ne obuhvata neophodno potpunu eliminaciju svih simptoma povezanih sa bolešću, stanjem, ili poremećajem povezanih sa aktivnošću CGRP.

[0038] Termin "migrena(e)" kao što je ovde korišćen označava "migrene bez aure" (ranije "obična migrena") i "migrene sa aurom" (ranije "klasične migrene") prema Headache Classification Committee of the International Headache Society (International Headache Society, 2004). Na primer, "migrene bez aure", tipično mogu biti okarakterisane tako da imaju pulsirajući kvalitet, srednji ili težak intenzitet, otežane su rutinskom fizičkom aktivnošću, jednostrano su locirane i povezane sa mučninom i sa fotofobijom i fonofobijom. "Migrene sa aurom" mogu da obuhvataju poremećaje vida, poremećaje u drugim čulima, jednostranu slabost i u nekim slučajevima teškoće u govoru.

[0039] Humana konstruisana antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti korišćena kao lekovi u humanoj medici, primenjena različitim putevima. Najpoželjnije, takve kompozicije su za parenteralnu primenu. Takve farmaceutske kompozicije mogu biti pripremljene pomoću postupaka dobro poznatih us tannu tehnike (videti, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) i sadrže humano konstruisano antitelo kao što je ovde opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijens.

[0040] Rezultati sledećih analiza pokazuju da ilustrovana monoklonska antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti prema predmetnom pronalasku mogu biti korišćeni za lečenje bola od osteoartritisa.

Primer 1-Proizvodnja antitela

[0041] Antitela I-V mogu biti pripremljena i prečišćena na sledeći način. Odgovarajuća ćelija domaćin, kao što je HEK 293 EBNA ili CHO, je prolazno ili stabilno transficirana sa ekspresionim sistemom za izlučivanje antitela upotrebom optimalno unapred određenog HC:LC vektorskog odnosa ili jednog vektorskog sistema koji kodira oba LC, kao što je SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, ili SEQ ID NO: 31, i HC, kao što su SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 ili SEQ ID NO: 36. Razbistreni medijum, u koji je izlučeno antitelo, je prečišćen upotrebom bilo koje od mnogih uobičajeno korišćenih tehnika. Na primer, medijum može biti pogodno nanet na Protein A ili G Sepharose FF kolonu koja je ekvilibrisana sa kompatibilnim puferom, kao što je fosfatno puferisani fiziološki rastvor (pH 7.4). Kolona je isprana radi uklanjanja nespecifičnih vezujućih komponenti. Vezano antitelo je eluirano, na primer, pomoću pH gradijenta (kao što je 0.1 M natrijum fosfatni pufer pH 6.8 do 0.1 M natrijum citratni pufer pH 3.0). Frakcije antitela su detektovane, kao što je pomoću SDS-PAGE, i zatim su sakupljene. Dodatno prečišćavanje je izborno, u zavisnosti od namerave upotrebe. Antitelo može biti koncentrovano i/ili sterilno filtrirano upotrebom uobičajenih tehnika. Rastvoriljivi agregati i multimeri mogu biti efikasno uklonjeni pomoću uobičajenih tehnika, uključujući ekskluziju prema veličini, hidrofobnu interakciju, jonsku izmenu ili hidroksiapatitnu hromatografiju. Čistoća antitela posle ovih hromatografskih koraka je veća od 99%. Proizvod može biti odmah zamrznut na -70°C ili može biti liofilizovan. Aminokiselinske sekvence za ova ilustrovana antitela su date u daljem tekstu.

Tabela 1 – SEQ ID NOs antitela

PRIMER 2: Merenja afiniteta (Kd) za humana konstruisana CGRP antitela

[0042] Vezujući afinitet ilustrovanih antitela za CGRP je određen upotrebom analize površinske plazmon rezonance na Biacore T100 instrumentu prajmovanim sa HBS-EP+ (GE Healthcare, 10 mM Hepes pH7.4 150 mM NaCl 3 mM EDTA 0.05% surfaktant P20) radnim puferom i temperaturom analize podešenom na 37°C. CM5 čip koji sadrži imobilizovani protein A (generisan upotrebom standardnog NHS-EDC kuplovanja amina) na sve četiri protočne ćelije (Fc) je korišćen za upotrebu metodologije hvatanja. Uzorci antitela su pripremljeni u 2 µg/mL razblaženjem u radnom puferu. Uzorci humanog CGRP su pripremljeni u krajnjim koncentracijama od 5.0, 2.5, 1.3, 0.63, 0.31 i 0 (blanko) nM razblaženjem u radnom puferu. Sveža alikvota za jednu upotrebu CGRP je korišćena za svaki ponovljeni eksperiment da bi se izbegli višestruki ciklusi zamrzavanja-odmrzavanja. Svaki ciklus analize se sastoji od (1) uzoraka hvatajućeg antitela na posebnim protočnim ćelijama (Fc2, Fc3 i Fc4), (2) injekcije od 350 µL (210-sek) CGRP u sve Fc na 100 µL/min, (3) vaćanja u protok pufera na 10 min da bi se pratila faza disocijacije, (4) regeneracije površina čipa sa injekcijom od 5 µL (15-sek) glicina, pH1.5, (5) ekvilibracije površina čipa sa injekcijom od 5 µL (15-sek) HBS-EP+. Svaka koncentracija CGRP je injektirana u duplikatu. Podaci su obrađeni upotrebom standardnog dvostrukog izjednačavanja sa standardom i aproksimirani sa 1:1 vezujućim modelom upotrebom Biacore T100 Evaluation softvera, verzije 2.0.1, da bi se odredila stopa asocijacije (kon, M<-1>s<-1>jedinice), stopa disocijacije (koff, s-<1>jedinice), i Rmax (RU jedinice). Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je izračunata kao iz veze KD= koff/kon, i u molarnim je jedinicama. Vrednosti date u Tabeli 2 su srednje vrednosti n broja eksperimenata. Tabela 2 pokazuje da se ilustrovana antitela prema predmetnom pronalasku vezuju za CGRP sa afinitetima < 200 pM.

Tabela 2- Afiniteti vezivanja antitela.

PRIMER 3- Redukcija bola u MIA modelu.

[0043] Injekcija monojodosirćetne kiseline (MIA) u zglob kolena pacova proizvodi akutni inflamatorni insult koji se zatim razvija u hroničnu degeneraciju tkiva zgloba u injektiranom zglobu. Bol koji je rezultat povrede zgloba može biti meren preko diferencijalnog podizanja tereta zadnjih nogu upotrebom testera nesposobnosti. MIA model je dobro opisan u literaturi i korišćen je za pokazivanje efikasnosti naspram bola za različite mehanizme i jedinjenja. Efikasnost je rutinski merena preko sposobnosti jedinjenja da delimično normalizuje raspodelu težine.

[0044] Da bi se odredila sposobnost ilustrovanih antitela prema predmetnom pronalasku za redukciju bola, korišćeni su mužjaci Lewis pacova (Harlan, Indianapolis, IN) približno osam nedelja starosti u vreme MIA injekcije. Pacovi su smešteni u grupe od dva ili tri po kavezu i održavani na konstantnoj temperaturi i ciklusu od 12 časova svetlosti/12 časova mraka. Životinje imaju slobodan pristup hrani i vodi u sva vremena, osim u toku sakupljanja podataka. Svi eksperimenti su izvedeni prema protokolima odobrenim od strane Eli Lilly Institutional Animal Care and Use Committee.

[0045] U desno koleno svakog pacova injektirano je 0.3 mg MIA u 50 µL rastvora soli i u levo koleno 50 µL rastvora soli na dan 0. Datog dana posle MIA, humana IgG4 kontrola ili test CGRP antitelo je potkožno primenjenu u PBS (n= 6 po grupi). Tri dana posle doziranja sa test CGRP antitelom, bol je meren upotrebom tstiranja nesposobnosti koji meri razliku u podizanju tereta zadnjom šapom izmeđiu kolena tretiranih sa MIA i kolena u koje je injektiran fiziološki rastvor. Svako merenje je srednja vrednost tri posebna merenja, svaki meren tokom 1 sekunde.

[0046] Podaci su predstavljeni kao procenat inhibicije bola izračunat deljem srednje vrednosti grupe tretirane CGRP antitelom srednjom vrednošću grupe koja je primala kontrolno antitelo, ioduzimanjem ove vrednosti od 1 i množenjem ove dobijene vrednosti sa 100. Grupe tretirane sa CGRP su takođe upoređivane sa grupama koje su primale nosač pomoću „one way“ analize srednjih vrednosti i Dunnett-ovog testa upotrebom JMP (verzija 5.1 i 6) programa za statističku analizu (SAS Institute Inc., Cary, NC). Razlike se smatraju značajnim ako je P vrednost manja od 0.05. Kao što je prikazano u Tabeli 3, podaci pokazuju da ilustrovana CGRP antitela prema predmetnom pronalasku značajno redukuju bol.

Tabela 3- Procenat inhibicije bola indukovanog sa MIA

PRIMER 4-Inhibicija formiranja cAMP indukovanog sa CGRP u SK-N-MC ćelijama

[0047] Da bi se upoređivala sposobnost antitela prema predmetnom pronalasku sa sposobnošću antitela G1 (LCVR- SEQ ID NO: 40 i HCVR- SEQ ID NO: 41), određena je inhibicija formiranja cAMP indukovanog sa CGRP u SK-N-MC. Vezivanje CGRP za njegov receptor rezultuje u stimulaciji proizvodnje cAMP. CGRP receptor je hetero-trimerni kompleks koji se sastoji od receptora sličnog receptoru za kalcitonin (CLR, receptor spojen sa G-proteinom) i proteina koji modifikuje aktivnost receptora (RAMP)-1, spojenog citoplazmatično za proteinom komponentom receptora (RCP). Humana ćelijska linija neuroepitelioma SKN-MC eksprimira ova 3 molekula prirodmno i može prema tome biti korišćena za procenu efekta CGRP na događaje prenosa signala. Proizvodnja cAMP je standardna mera za aktivaciju receptora spojenog za G-protein.

[0048] SK-N-MC ćelije su kultivisane u MEM, koji sadrži 10% FBS, 1X MEM neesenacijalne aminokiseline, 1X 100 mM MEM natrijum piruvat, 1X Pen/Strep, i 2 mM L-glutamin. Posle sakupljanja, ćelije su isprane jednom i resuspendovane u puferu za analizu (pufer za stimulaciju (HBSS sa Mg i Ca, 5 mM HEPES, 0.1 % BSA, 100 uM askorbinska kiselina) razblažene 1:2 sa Dulbecco-ovim PBS koji sadrži krajnju koncentraciju od 0.5 mM IBMX) i zasejane u 96-komorne ploče u 15,000 ćelija po komorici. U ćelije je dodato test antitelo ili kontrolno humano IgG4 antitelo (serijska 4-struka razblaženja u puferu za analizu, 10 koncentracija), a zatim fiksirana količina humanog α-CGRP (2 nM; Bachem H1470).

Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Nivoi cAMP su mereni pomoću homogenog vremenski razloženog fluorescentnog (HTRF) sistema za analizu (Cisbio).

[0049] Količina cAMP indukovanog sa 2 nM humanog CGRP u prisustvu različitih koncentracija antitela je izračunata kao procenat inhibicije u poređenju sa samim CGRP. Koncentracija antitela koja proizvodi 50% inhibicije proizvodnje cAMP (IC50) je zatim izračunata iz 4-parametarskog modela aproksimacije krive. Praćenjem postupaka kao što su ovde opisani, antitelo III (IC50 od 0.41 nM) je inhibiralo količinu cAMP indukovanog sa CGRP do mnogo većeg stepena od antitela G1 (IC50 od 5.36 nM) moguće zahvaljujući bržoj stopi Konantitela III (Konstopakao što je merena pomoću Biacore)

PRIMER 5- Model ekstravazacije proteina plazme tvrde moždanice pacova (PPE)

[0050] PPE model pacova je dobro ustanovljeni preklinički model koji može biti korišćen za procenu efikasnosti anti-CGRP antitela za lečenje migrene.

[0051] 2 mg/mL rastvor anti-CGRP antitela (Ab) je pripremljen u fiziološkom rastvoru. Sva kasnija razblaženja su pripremljena sa slanim rastvorom.2 mg/mL rastvor kontrolnog antitela monoklonskog izotipa (IgG) je takođe pripremljen u fiziološkom rastvoru.

[0052] Mužjaci Sprague-Dawley pacova iz Harlan Laboratories (250 do 350 g) su anestezirani nembutalom (60 mg/kg, ip.) i postavljeni u stereotaksični okvir (David Kopf Instruments) sa držačem gornjih zubva podešenim na -2.5 mm. Posle sagitalnog reza srednje linije skalpa, dva para bilatrnalnih otvora su probušeni kroz lobanju (3.2 mm posteriorno, 1.8 i 3.8 mm lateralno, sve koordinate su u odnosu na bregmu). Parovi stimulirajućih elektroda od nerđajućeg čelika (Rhodes Medical Systems Inc), izolovanih osim na vrhovima, su spuštene kroz otvore u obe hemisfere do dubine od 9.2 mm ispod dure. Test antitela ili nosač fiziološki rastvor su primenjeni intravenski preko femoralne vene (1 mL/kg). Osam minuta kasnije rastvor goveđeg serum albumina (BSA) obojenog bojom fluoroscein izotiocijanatom (FITC) (FITC-BSA, Sigma A9771) (20 mg/kg, iv.) je injektiran u femoralnu venu tako da funkcioniše kao marker za ekstravazaciju proteina. Deset minuta posle doziranja test antitelima ili nosačem, leva trigeminalna ganglija je stimulisana u trajanju od 5 minuta na intenzitetu struje od 1.0 mA (5 Hz, trajanje 5 ms) sa Model S48 Grass Instrument Stimulator. Pet minuta posle stimulacije, pacovi su ubijeni eksangvinacijom sa 40 mL fiziološkog rastvora. Eksangvinacija takođe ispira preostali FITC/BSA iz krvnih sudova. Vrh lobanje je uklonjen da bi se sakupile tvrde moždane membrane. Uzorci membrane su uklonjeni iz obe hemisfere, isprani vodom i rašireno ravno po mikroskopskim pločicama. Pločice su sušene 15 minuta na grejaču pločica i pokrivene pokrovnim staklom sa 70% glicerolom/vodenim rastvorom.

[0053] Fluorescentni mikroskop (Zeiss) opremljen difrakcionim monohromatorom i spektrofotometromje korišćen za kvantitativno određivanje FITC-BSA boje u svakom uzorku dure. Mikroskop je opremljen sa motorizovanom platformom povezanog pomoću interfejsa sa personalnim kompjuterom. Ovo olakšava kretanje platforme kontrolisano preko kompjutera, sa merenjem fluorescencije na 25 tačaka (500 µm koraci) na svakom uzorku dure. Ekstravazacija indukovana električnom stimulacijom trigeminalne ganglije je ispilateralni efekat (tj. javlja se samo na strani dure u kojoj je stimulisana trigeminalna ganglija). Ovo omogućava da se druga (nestimulisana) polovina tvrde moždane opne koristi kao kontrola. Izračunavan je odnos ekstravazacije (tj. odnos količine ekstravazacije u tvrdoj moždanici iz stimulisane strane u poređenju sa nestimulisanom stranom).

SEKVENCE

[0054]

ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF (SEQ ID NO:1)

ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF (SEQ ID NO:2)

X1je Q, R ili K;

X2je D ili P;

X3je D ili S; X4je N ili K; i X5je G ili E.

X6je K ili D; X7je V ili R; X8je D ili G; i X9je G ili S.

X1=Q, K, ili R;

X2=D ili P;

X3D ili S;

X4=K ili N;

X5=E ili G;

X6=F ili L;

X7=I ili F;

X8=Q ili G; i

X9=L ili V. (SEQ ID NO: 42)

X1=A ili S;

X2=K ili D;

X3=V ili R;

X4=G ili D;

X5=M ili I;

X6=R ili A;

X7=T ili K;

X8=V ili A;

X9=G ili S; i

X10=L ili T. (SEQ ID NO: 43)

LISTING SEKVENCI

[0055]

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Humano konstruisano CGRP antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), naznačeno time što navedeni LCVR sadrži aminokiselinske sekvence LCDR1, LCDR2, LCDR3 i HCVR sadrži aminokiselinske sekvence HCDR1, HCDR2, HCDR3, gde LCDR1 je RASKDISKYLN (SEQ ID NO: 6), LCDR2 je YTSGYHS (SEQ ID NO: 7), LCDR3 je QQGDALPPT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO: 12), HCDR2 je AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO: 16), i HCDR3 je LSDYVSGFGY (SEQ ID NO: 39).

2. Humano konstruisano CGRP antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što navedena aminokiselinska sekvenca LCVR je SEQ ID NO: 19 i navedena aminokiselinska sekvenca HCVR je SEQ ID NO: 24.

3. Humano konstruisano CGRP antitelo prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što navedeno antitelo sadrži laki lanac i težak lanac, gde aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 29 i aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 34.

4. Humano konstruisano CGRP antitelo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što navedeno antitelo sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, gde svaka aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 29 i svaka aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 34.

5. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži humano konstruisano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

6. Humano konstruisano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 za upotebu u terapiji.

7. Humano konstruisano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 za upotebu u lečenju migrena.

8. Antigen-vezujući fragment humanog konstruisanog CGRP antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 ili 6-7.