RS56676B1

RS56676B1 - Poboljšana tnf veziva

Info

Publication number: RS56676B1
Application number: RS20171299A
Authority: RS
Inventors: Marie-Ange Buyse; Joachim Boucneau; Peter Casteels; Heeke Gino Van
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2018-03-30
Also published as: AU2023200113A1; PH12018501025A1; ME02954B; PE20181317A1; CR20180311A; RU2018120524A; JP6962915B2; KR20240029115A; MX385207B; MA41653A; IL259269B2; ES2662418T3; CA3005085A1; CO2018005915A2; HRP20171949T1; KR20180083382A; BR112018009714A8; CN108473563B; US10544211B2; RU2018120524A3

Description

Opis

REZIME

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na poboljšane pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina teškog lanaca (u daljem tekstu kao “ISV “ ili “ISVD“) koji se vezuju za faktor nekroze tumora alfa prema priloženom patentnom zahtevu. Drugi aspekti, otelotvorenja, svojstva, upotreba i prednosti ovog pronalaska biće jasni stručnjaku na osnovu obelodanjenja u ovom tekstu.

POZADINA PRONALASKA

[0002] U predmetnoj prijavi, ostaci/pozicije aminokiselina u varijabilnom domenu imunoglobulina teškog lanca biće označeni numerisanjem prema Kabatu. Pogodnosti radi, Slika 1 daje tabelu koja sadrži neke pozicije aminokiselina koje će ovde biti specificirane i njihovo numerisanje će biti izvršeno prema nekim alternativnim sistemima numeracije (kao što su Aho i IMGT. Napomena: osim ako nije drugačije naznačeno, za predmetni opis i patentne zahteve, Kabat numeracija je presudna, drugi brojevi su navedeni samo kao referenca).

[0003] Što se tiče CDR, kako je poznato u stanju tehnike, postoji više konvencija za definisanje i opisivanje CDR od VH ili VHH fragmenta, kao što su Kabat definicija (koja se zasniva na varijabilnosti sekvence i najčešće se koristi) i Chothia definicija (koja se zasniva na lokaciji oblasti strukturalne petlje). Na primer, referenca se može naći na veb stranici http://www.bioinf.org.uk/abs/. Za svrhu ovog opisa i patentnih zahteva, iako se CDR prema Kabatu takođe mogu pominjati, CDR najpoželjnije je definisan na osnovu Abm definicije (koja se zasniva na Oksfordovom molekularnom AbM softveru za modeliranje antitela), kako se ovo smatra optimalnim kompromisom između definicija Kabat i Chothia. Ponovo se upućuje na veb stranicu http://www.bioinf.org.uk/abs/.

[0004] Inflamatorna bolest creva (IBD), Kronova bolest (CD) i ulcerativni kolitis (UC) su hronična, onesposobljavajuća i progresivna oboljenja. Većina nebioloških terapija kao što su aminosalicilati, steroidi i imunomodulatori pruža simptomatsko poboljšanje, ali ne uspeva da zaustavi osnovni inflamatorni proces i ne menja bolesti. Pojava faktora nekroze anti-tumora-α (anti-TNF-α) (infliksimab, adalimumab, certolizumab pegol) dramatično je promenila način na koji se IBD tretira promenom oba, kursa bolesti (manje operacija, manje hospitalizacija, bolji kvalitet života, smanjenje steroida, veća stopa kliničke remisije i stope zarastanja sluzokože na CD i UC), kvaliteta života i produktivnosti rada (cf. Amiot and Peyrin-Biroulet 2015 Ther Adv Gastroenterol 8:66-82). Najčešći način primene ovih terapijskih proteina je injekcija. S obzirom da većina ovih proteina ima kratak polu-život u serumu, potrebno ih je često ili u velikim dozama davati da bi bili efikasni. Sistemsko davanje dalje je povezano sa povećanim rizikom od infekcija. Ovo zajedno dovodi do gubitka usaglašenosti sa pacijentom (cf. Singh i dr.2008 J Pharm Sci 97:2497-2523).

[0005] Međutim, nepoželjni dugoročni neželjeni efekti i oportunističke infekcije, uključujući tuberkulozu i ne-Hodgkinov limfom, uzrokovani su generalizovanom imunosupresijom i rezultatom ponovljenih sistemskih injekcija trenutno korišćenog tretiranja monoklonskim antitelima (Ali i dr., 2013; Galloway i dr., 2011; Ford & Peyrin-Biroulet, 2013; Kozuch & Hanauer, 2008; Schreiber i dr., 2007; Syed i dr., 2013).

[0006] Oralnim davanjem anti-TNF-α antitela trebalo bi izbeći neki od ovih neželjenih efekata.

[0007] Međutim, ovi agensi anti-TNF-α su složeni proteini. Oralno davanje rezultira degradacijom u kiseloj i proteazom bogatoj sredini gastrointestinalnog (GI) trakta.

[0008] Kod korišćenja lažnih proteina za zaštitu terapeutskog antitela, ispitivanje zasnovano na pacijentu koje sadrži poliklonska bovin kolostralna antitela u ljudskom TNF alfa (AVX-470) davana oralnim putem, nedavno je sprovedeno od strane Avaxia Biologics Inc. kod pacijenata sa ulcerativnim kolitisom. Međutim, ispitivanje je prekinuto.

[0009] Stoga, postoji potreba za novim IBD lekovima.

[0010] ISVD (i naročito Nanotela) koji se mogu vezati za TNF i njihove upotrebe dobro su poznate u struci, na primer iz WO 2004/041862 i WO 2006/122786, koji opisuje Nanotela protiv TNF i njihovu upotrebu pri prevenciju i/ili tretiranju bolesti i poremećaja povezanih i/ili posredovanih sa TNF-α ili TNF-α signalizacijom, kao što su inflamacija, reumatoidni artritis, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, sindrom inflamatornog creva, multipla skleroza, Addison-ova bolest, autoimuni hepatitis, autoimuni parotitis, dijabetes tip 1, epididimitis, glomerulonefritis, Graves-ova bolest, Guillain-Barre sindrom, Hashimoto-ova bolest, hemolitička anemija, sistemski lupus eritematozus, neplodnost kod muškaraca, mijastenija gravis, pemfigus, psorijaza, reumatska groznica, sarkoidoza, skleroderma, Sjogren-ov sindrom, spondiloartropatije, tiroiditis i vaskulitis.

[0011] WO 2006/122786 obelodanjen je kao SEQ ID NO: 125 specifična anti-TNF-α Nanotela označena kao NC55TNF_NC7 (PMP6C11). Sekvenca ovog Nanotela prema stanju tehnike data je u tabeli A ispod kao SEQ ID NO: 58. Tabela A takođe daje (kao SEQ ID NO: 1) sekvencu verzije optimizovane za sekvencu (takođe ovde označenu kao „Referenca A”) ovog poznatog TNF veziva, zajedno sa njegovim CDR (u skladu sa konvencijama Kabat i Abm). Kao što se vidi iz poravnanja na Slici 2, ova optimizovana verzija sadrži, u poređenju sa sekvencom iz prethodnog stanja tehnike SEQ ID NO: 58, sledeće mutacije: Q1E, A14P, Q27F, S29F, P40A, A49S, K73N, Q75K, V78L, D82aN, K83R i Q108L (prema Kabat numerisanju).

[0012] WO 2015/1733256 se odnosi na poboljšane domene imunoglobulina, koji obuhvataju C-terminalne nastavke koji sprečavaju vezivanje takozvanih već postojećih antitela („PEA”). WO 2015/1733256 obelodanjuje SEQ ID NO: 345 kao specifična anti-TNF-α Nanotela, koja se ovde nazivaju i kao TNF345 (SEQ ID NO: 59). Kao što se može videti iz poravnanja na Slici 2, verzija sa optimizovanom sekvencom Reference A sadrži, u poređenju sa sekvencom iz stanja tehnike SEQ ID NO: 59, sledeće mutacije: V11L i L89V (prema Kabat numerisanju).

[0013] Nedavno je predložen koktel koji neutralizuje toksine molekulskih fragmenata monoklonskih VHH fragmenata kod lama za potencijalnu oralnu terapiju (Hussack i dr., 2011 J Biol Chem 286, 8961-76.). Međutim, Dumoulin i dr. (2002 Protein Sci, 11, 500-15), Harmsen i dr. (2006 Appl Microbiol Biotechnol, 72, 544-51) i Hussack i dr. (2012 Methods Mol Biol, 911, 417-29) tvrdili su da su fragmenti antitela kod lama sa jednim domenom izuzetno podložni proteolitičkom razaranju unutar ljudskog gastrointestinalnog sistema.

[0014] WO2007/025977 opisuje tretiranje hroničnog enterokolitisa, koji uključuje in situ sekreciju anti-mTNF Nanotela oralnim davanjem L. lactis bakterije.

REZIME PRONALASKA

[0015] Predmetni pronalazak ima za cilj pružanje poboljšanih TNF veziva, kao što je anti-TNF ISVD. Poboljšana TNF veziva data pronalaskom ovde se ovde nazivaju “TNF veziva prema pronalasku” ili “ TNF veziva ”.

[0016] Naročito, predmetni pronalazak ima za cilj da obezbedi poboljšana TNF veziva koja bi bila od koristi pri tretiranju bolesti digestivnog trakta, kao što su na primer inflamatorna bolest creva (IBD), sindrom iritabilnog creva, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, mukozitis, aftozni stomatitis, celiakija, trauma digestivnog trakta i kancer digestivnog trakta. Ta TNF-veziva trebalo bi da budu stabilna i pogodna za oralno davanje.

[0017] Očekuje se da oralno davana TNF-veziva ne samo da neutrališu TNF u lumenu digestivnog trakta, već imaju pristup lamini proprii i submukozi, jer intestinalna barijera digestivnog trakta može biti prekinuta ili kompromitovana putem grube inflamacije i/ili ulceracijom, uključujući, ali ne ograničavajući se na peridontalnu bolest, aftozni stomatitis, bakterijske, virusne, gljivične ili parazitske infekcije digestivnog trakta, peptične ulceracije, ulceracije povezane sa stresom ili H. pilori infekciju, oštećenje uzrokovano refluksom ezofagea, inflamatorne bolesti creva, oštećenje izazvano kancerom digestivnog trakta, netoleranciju hrane, uključujući celiakiju, ili ulceracije izazvane sa NSAID ili drugim uzetim ili sistemski isporučenim lekovima.

[0018] Prema tome, pronalazak ima za cilj da obezbedi poboljšana TNF veziva koja su varijante reference A i koja imaju smanjeno vezivanje pomoću faktora koji ih ometaju (uopšteno se nazivaju “prethodno postojeća antitela” ili „PEA”) koji mogu biti prisutni u serumu kod nekog zdravog ljudskog subjekta, kao i kod pacijenata. Upućuje se na WO 2012/175741, WO 2013/024059, kao i na primer, Holland i dr. (J. Clin Immunol., 2013, 33 (7): 1192-203), kao i na očekivano objavljenu PCT prijavu WO2015/173325 (prij. br.

PCT/EP2015/060643) od strane Ablynx N.V. podnetu 13. maja 2015 i pod nazivom “Poboljšani varijabilni domeni imunoglobulina”.

[0019] Kao što je dalje opisano, TNF veziva prema pronalasku poželjno imaju istu kombinaciju CDR (npr., CDR1, CDR2 i CDR3) koja je prisutna u Referenci A.

[0020] TNF vezivo prema pronalasku jedinstveni je varijabilni domen imunoglobulina (ISVD) koji ima sekvencu aminokiselina prema SEQ ID NO: 40.

[0021] Neka poželjna, ali neograničavajuća TNF veziva opisana su na Slici 3 kao SEQ ID NO: 8 do 41, 62, 63, 64, 65, 66 i 69. Slika 4 prikazuje poravnanje sekvenci SEQ ID NO: 8-41 sa SEQ ID NO: 1 (Referenca A) i SEQ ID NO: 58 (PMP6C11). Veziva SEQ ID NO: 22 do 41, 62-66 i 69 primeri su TNF veziva prema obelodanjenju koja imaju C-terminalni alanin nastavak, npr., alanin ostatak na C-terminalnom kraju ISVD-sekvence (takođe ponekad nazvane „pozicija 114”) u poređenju sa uobičajenom C-terminalnom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO: 55, kao što je prikazano u Referenci A). Kao što je opisano u WO 2012/175741 (ali takođe i u primeru u WO 2013/024059 i WO2015/173325), ovaj C-terminalni nastavak alanina može sprečiti vezivanje takozvanih „prethodno postojećih antitela” (pretpostavljeno da su IgG) za predloženi epitop koji se nalazi na C-terminalu regiona ISVD. Pretpostavlja se da ovaj epitop uključuje, između drugih ostataka, ostatke aminokiselina izloženih površinama C-terminalne sekvence VTVSS, kao i ostatak aminokiselina na poziciji 14 (i ostatak aminokiselina susedne/bliske istoj aminokiselinskoj sekvenci, kao što su pozicije 11, 13 i 15) i može takođe sadržati ostatak aminokiseline na poziciji 83 (i ostatak aminokiselina susedne/bliske istoj aminokiselinskoj sekvenci, kao što su pozicije 82, 82a, 82b i 84) i/ili ostatak aminokiseline na poziciji 108 (i ostatak aminokiselina susedne/bliske istoj aminokiselinskoj sekvenci, kao što je položaj 107).

[0022] Međutim, iako prisustvo takvog C-terminalnog alanina (ili uglavnom C-terminalnog nastavka) može u velikoj meri smanjiti (i u većini slučajeva čak i u potpunosti sprečiti) vezivanje „već postojećih antitela” koja se mogu naći u serumu kod različitih subjekata (kod oba, zdravih subjekata i pacijenata) otkriveno je da serumi od nekih subjekata (kao što su serumi pacijenata sa nekim imunološkim oboljenjima kao što je SLE) mogu sadržati prethodna antitela koja se mogu vezati za područje C-terminala ISVD (kada je takva oblast izložena), čak i kada ISVD sadrži takav C-terminalni alanin (ili uopšteno takav C-terminalni nastavak). Ponovo se upućuje na objavljenu PCT patentnu prijavu WO2015/173325 od strane Assignee koja je podneta 13. maja 2015. godine i pod naslovom “Poboljšani varijabilni domeni imunoglobulina”.

[0023] Shodno tome, jedan specifičan cilj pronalaska je da daju TNF veziva koja su poboljšane varijante anti-TNF Nanotela ovde označene kao “Referenca A” i koja imaju smanjeno vezivanje tzv. „prethodno postojećih antitela”, a posebno vrste opisane u WO2015/173325 (npr., ona prethodno postojeća antitela koja se mogu vezati za izloženu C-terminalnu oblast ISVD čak i u prisustvu C-terminala).

[0024] Generalno, pronalazak postiže ovaj cilj obezbeđivanjem jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina (ISVD) koji ima sekvencu aminokiselina prema SEQ ID NO: 40. Takođe su obelodanjene sekvence aminokiselina koje su varijante sekvence SEQ ID NO: 1 koje sadrže sledeći ostaci aminokiseline (npr., mutacije upoređene sa sekvencom SEQ ID NO: 1):

• 89T; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V; ili

• 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 110Q ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 112Q ili 112Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 110Q ili 110Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 112Q ili 112Q.

[0025] Konkretno, u TNF vezivima datim obelodanjenjem:

• ostatak aminokiseline na poziciji 11 poželjno je izabran iz L ili V; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 89 poželjno pogodno je izabran iz T, V ili L; i • ostatak aminokiseline na poziciji 110 poželjno pogodno je izabran iz T, K ili Q; i • ostatak aminokiseline na poziciji 112 poželjno pogodno je izabran iz S, K ili Q; tako da (i) pozicija 89 je T; ili (ii) pozicija 89 je L, a pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je L, a pozicija 110 je K ili Q; ili (iv) pozicija 89 je L, a pozicija 112 je K ili Q; ili (v) pozicija 89 je L, a pozicija 11 je V, a pozicija 110 je K ili Q; ili (vi) pozicija 89 je L, a pozicija 11 je V, a pozicija 112 je K ili Q; ili (vii) pozicija 11 je V, a pozicija 110 je K ili Q; ili (vii) pozicija 11 je V, a pozicija 112 je KorQ.

[0026] Od sekvenci aminokiselina datih obelodanjenjem, sekvence aminokiselina u kojima je pozicija 89 T ili u kojima je položaj 11 V, a pozicija 89 je L (opciono u odgovarajućoj kombinaciji sa 110K ili 110Q mutacijom i/ili 112K ili 112q mutacijom, a naročito u kombinaciji sa 110K ili 110Q mutacijom) posebno su poželjne. Još poželjnije su sekvence aminokiselina u kojima je pozicija 11 V, a pozicija 89 je L, opciono sa 110K ili 110Q mutacijom.

[0027] U posebno poželjnim primerima, u TNF vezivima datim otelotvorenjem, ostatak aminokiseline na poziciji 11 je V, ostatak aminokiseline na poziciji 89 je L, ostatak aminokiseline na poziciji 110 je T, a ostatak aminokiselina na pozicija 112 je S.

[0028] U posebno poželjnom primeru, predmetno obelodanjenje se odnosi na TNF veziva, kao što su pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina (ISVD), koji imaju:

• CDR1 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina GFTFSTADMG (SEQ ID NO:

5); i

• CDR2 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina RISGIDGTTI (SEQ ID NO: 6); i • CDR3 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina PRIADKVSAIDI (SEQ ID NO:

4); i imaju:

• stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan, kao i CDR se ne uzimaju u obzir za određivanje stepena identiteta sekvence) najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%;

• i/ili

• ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiselina” (kao što je ovde definisano, a ne uzimajući u obzir neku od gore navedenih mutacija u pozicije 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, mogu biti prisutne u okvirima i/ili CDR-u, ali su poželjno prisutne samo u okvirima, a ne u CDR-u);

• i

• ostatak aminokiseline na poziciji 11 je V; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 89 je L; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 110 je T; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 112 je S; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 49 je A; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 74 je S.

[0029] Kao što je pomenuto, sekvence aminokiselina omogućene pronalaskom opisanim u priloženom patentnom zahtevu mogu se vezati (a naročito mogu se specifično vezati) za TNF.

[0030] Sekvence aminokiseline omogućene pronalaskom poželjno imaju EC50 vrednost u analizi na bazi ćelije koristeći KYM ćelije opisane u Primeru 1, pod 3), WO 04/041862, koja je bolja od 50nM, poželjnije bolja od 25 nM, kao što je manja od lOnM.

[0031] Tabela B navodi neke neograničavajuće moguće kombinacije ostataka aminokiseline koje mogu biti prisutne na pozicijama 11, 89, 110 i 112 u TNF vezivima. Kombinacije koje su posebno poželjne označene su podebljanim slovima, a najpoželjnije kombinacije označene su podebljano/podvučeno.

[0032] Međutim, nakon optimizacije sekvenci („optimizacija sekvence”) TNF-veziva sa obzirom na minimiziranje ili uklanjanje mesta vezivanja za prethodno postojeća antitela sa jedne strane i humanizaciju s druge strane, različita svojstva TNF-veziva, uključujući stabilnost, bila su (izuzetno) negativno pogođena. Konkretno, temperatura topljenja kao mera fizičke stabilnosti se smanjila, proizvodnja u oba, eukariotskom domaćinu P. pastoris i prokariotskom domaću E. coli je smanjena, a stabilnost u GI fluidima je smanjena.

[0033] Umesto da „mutiraju unazad” mesta vezivanja za PEA i humanizirajuće mutacije, time dovodeći u pitanje optimizaciju sekvence, pronalazači iznenađujuće otkrivaju da bi ostaci aminokiselina 49 i/ili 74 mogli biti izmenjeni tako da su ispunjena oba međusobno isključiva zahteva. Tabele B-1 i B-2 navode neke neograničavajuće moguće kombinacije ostataka aminokiseline koji mogu biti prisutni na pozicijama 11, 89, 110, 112, 49 i/ili 74 u TNF vezivima.

[0034] TNF veziva koja se daju ovim obelodanjenjem dalje su opisana u opisu, primerima i slikama ovde, npr., imaju CDR koji su opisani ovde i imaju ukupan stepen identiteta sekvence (kao što je ovde definisano) sa sekvencom SEQ ID NO: 1 koji je ovde obelodanjen i/ili može imati ograničeni broj „razlika aminokiselina” (kao što je ovde opisano) sa (jednim od) ovih referentnih sekvenci.

[0035] TNF veziva prema obelodanjenju sadrže sledeće CDR (u skladu sa Konvencijom Kabat):

• CDR1 (prema Kabatu) koja je sekvenca aminokiselina TADMG (SEQ ID NO: 2); i • CDR2 (prema Kabatu) koja je sekvenca aminokiselina RISGIDGTTIIDEPVKG (SEQ ID NO: 3); i

• CDR3 (prema Kabatu) koja je sekvenca aminokiselina PRIADKVSAIDI (SEQ ID NO: 4).

[0036] Alternativno, kada se CDR daju u skladu sa Abm konvencijom, vezivna sredstva TNF obuhvataju sledeće CDR:

• CDR1 (prema Abm) koja je sekvenca aminokiselina GFTFSTADMG (SEQ ID NO:

5); i

• CDR2 (prema Abm) koja je sekvenca aminokiselina RISGIDGTTI (SEQ ID NO: 6); i • CDR3 (prema Abm) koja je sekvenca aminokiselina PRIADKVSAIDI (SEQ ID NO:

4).

[0037] TNF vezivo iz obelodanjenja poželjno takođe ima:

• stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (gde bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan, kao i CDR se ne uzimaju u obzir za određivanje stepena identiteta sekvence) najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%; i/ili

• ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiseline” (kao što je ovde definisano, a ne uzimajući u obzir neku od gore navedenih mutacija kod pozicija 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako mogu biti prisutni u okvirima i/ili CDR, ali su poželjno prisutni samo u okvirima, a ne u CDR).

[0038] Što se tiče različitih aspekata i poželjnih aspekata TNF veziva iz obelodanjenja, kada je u pitanju stepen identiteta sekvence u odnosu na SEQ ID NO: 1 i/ili broj i vrsta “razlike aminokiselina” koja može biti prisutna u takvom vezivu prema pronalasku (npr., u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1), treba napomenuti da, kada se kaže da (i) sekvenca aminokiselina prema datom pronalasku ima stepen identiteta sekvence sa sekvencu SEQ ID NO: 1 najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95% (kod koje CDR, bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan, kao i mutacije na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 zahtevani od strane specifičnog aspekta, nisu uzeti u obzir za određivanje stepena

1

identiteta sekvence); i/ili kada se kaže da (ii) sekvenca aminokiselina prema pronalasku nema više od 7, poželjno ne više od 5, kao što je samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiseline” sa sekvencom SEQ ID NO: 1 (opet, ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan i ne uzimajući u obzir mutacije na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 koje zahteva specifični aspekt), onda to uključuje i sekvence koje nemaju razlika u aminokiselini sa sekvencom SEQ ID NO: 1, osim mutacija na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 zahtevanih od strane specifičnog aspekta) i bilo koje C-terminalni nastavak koji može biti prisutan.

[0039] Prema tome, u jednom specifičnom aspektu obelodanjenja, TNF veziva prema pronalasku mogu imati 100% identičnost sekvence sa SEQ ID NO: 1 (uključujući CDR, ali ne uzimajući u obzir mutaciju ili kombinaciju mutacija na pozicijama 11, 49, 74, 89, 110 i/ili 112 koja je ovde obelodanjeni i/ili bilo koje C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) i/ili ne moraju imati razlike aminokiselina sa SEQ ID NO: 1 (npr., osim mutacije ili kombinacije mutacija na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 koje su ovde obelodanjene i bilo koje C-terminalni nastavak koji može biti prisutan).

[0040] Kada su prisutne bilo kakve razlike aminokiselina (npr., osim bilo kojeg nastavka C-terminala i mutacija na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 koje su potrebne za određeni aspekt pronalaska), ove razlike aminokiselina mogu biti prisutne u CDR i/ili u okvirnim oblastima, ali su poželjno prisutne samo u okvirnim oblastima (kao što je definisano Abm konvencijom, npr., ne u CDR kako je definisano u skladu sa Abm konvencijom), npr., tako da TNF veziva iz obelodanjenja imaju iste CDR (definisane prema Abm konvenciji), kako su prisutne u SEQ ID NO: 1.

[0041] Takođe, kada TNF vezivo iz obelodanjenja prema bilo kom aspektu pronalaska ima jednu ili više razlika aminokiseline sa sekvencom SEQ ID NO: 1 (pored mutacija na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 koje su potrebne prema specifičnom aspektu), onda su neki specifični, ali neograničavajući primeri takvih mutacija/razlika aminokiseline koje mogu biti prisutne (npr., u poređenju sa sekvencama SEQ ID NO: 1), na primer, E1D, P40A, P40L, P40S (i naročito P40A), S49A, A74S, L78V, T87A ili bilo koja pogodna kombinacija istih. Takođe, TNF veziva iz otelotvorenju mogu pogodno da sadrže (odgovarajuću kombinaciju) D60A, E61D i/ili P62S mutacije, naročito kao ADS motiv na pozicijama 60-62 (videti SEQ ID NO: 39 za neograničavajući primer). Drugi primeri mutacija su (pogodna kombinacija) jedne ili više pogodnih “humanizirajućih” supstitucija; referenca je, na primer, data u WO 2009/138519 (ili u prethodnom članku u WO 2009/138519) i WO 2008/020079 (ili u prethodnom članku u WO 2008/020079), kao i Tabele A-3 do A-8 iz WO 2008/020079 (koje su spiskovi koji pokazuju moguće humanizovane zamene).

[0042] Od pomenutih mutacija, poželjno je prisustvo mutacije S49A, A74S i/ili L78V (ili bilo koje pogodne kombinacije bilo koje dve mutacije od navedenih, uključujući i sve tri od navedenih) (videti SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 i 62-63). Slika 5 prikazuje poravnanje SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 31 i SEQ ID NO: 36 do 41.

[0043] Takođe, kada su TNF veziva prema pronalasku prisutna na i/ili formiraju N-terminalni deo polipeptida ili jedinjenja u kojem su prisutna, onda poželjno sadrže D na poziciji 1 (npr., mutacija E1D u poređenju sa referencom A). Shodno tome, u sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid prema pronalasku (koji je ovde dalje opisan) koji ima TNF vezivo prema pronalasku (što je dalje opisano ovde) na njegovom N-terminalu, pri čemu navedeno TNF vezivo prema pronalasku ima D na poziciji 1.

[0044] Slično tome, kada se TNF vezivo prema pronalasku koristi u monovalentnom formatu, poželjno ima i C-terminalni nastavak X(n) kao što je ovde opisano i D na poziciji 1.

[0045] Neki preferirani, ali neograničavajući primeri monovalentnih TNF veziva sa D na poziciji 1 i C-terminalnim nastavkom dati su kao SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 i 62-63, poželjno SEQ ID NO: 36, 39 i 40, najpoželjnije, SEQ ID NO: 40. U tom pogledu treba napomenuti da TNF veziva SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 i 62-63 se takođe mogu koristiti u jedinjenju ili polipeptidu prema pronalasku koji nije u monovalentnom obliku. U tom slučaju, TNF veziva SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 i 62-63 poželjno će imati E umesto D na svom N-terminalu (npr., mutacija D1E u poređenju sa Sekvencama SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 i 62-63) kada nisu prisutna na N-terminalu pomenutog polipeptida ili jedinjenja iz otelotvorenja (umesto toga, poželjno, N-terminal ISVD navedenog polipeptida ili jedinjenja iz otelotvorenja će imati D na poziciji 1, takođe, poželjno neće sadržati C-terminalni nastavak (kao što je C-terminalni alanin prisutan u SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 i 62-63) kada nisu prisutna na C-terminalu jedinjenja ili polipeptida (umesto toga, poželjno, C-terminal ISVD navedenog polipeptida ili jedinjenja iz otelotvorenja će imati C-terminalni nastavak).

[0046] Pomoću poželjnih, ali ne ograničavajućih primera, SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38 i 62-63 takođe su primeri TNF veziva iz obelodanjenja koja imaju dalje razlike aminokiselina sa SEQ ID NO: 1, odnosno S49A, A74S i/ili L78V. Prema tome, u specifičnom aspektu pronalazak se odnosi na TNF veziva prema pronalasku (npr., imaju mutacije na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 kao što je ovde opisano, a takođe su dalje opisane ovde) koje imaju bar odgovarajuću kombinaciju S49A, A74S i/ili L78V mutacija, a poželjno odgovarajuća kombinacija bilo kojih od ovih mutacija, kao što su sve tri ove mutacije.

[0047] TNF veziva prema pronalasku, kada se koriste u monovalentnom obliku i/ili kada su prisutna na i/ili formiraju C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili nekog drugog jedinjenja ili sklopa u kojem su prisutna (ili kada u suprotnom imaju „izloženi” C-terminalni kraj u takvom proteinu, polipeptidu ili drugom jedinjenju ili sklopu, čime se generalno podrazumeva da C-terminalni kraj ISV nije priključen sa ili povezan sa konstantnim domenom (kao što je CH1 domen), ponovo se upućuje na WO 2012/175741 i WO 2015/1733256), poželjno je i da imaju C-terminalni nastavak formule (X)n, u kojoj je n od 1 do 10, poželjno od 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svako X je (poželjno prirodno prisutan) ostatak aminokiseline koji je nezavisno izabran iz prirodnih ostataka aminokiseline (iako prema preferiranom aspektu, ne sadrži bilo koji ostatak cisteina), a poželjno je izabran nezavisno iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I).

[0048] Prema nekim poželjnim, ali neograničavajućim primerima takvi C-terminalni nastavci X(n), X i n mogu biti kao što sledi:

1. (a) n = 1 i X = Ala;

2. (b) n = 2 i svako X = Ala;

3. (c) n = 3 i svako X= Ala;

4. (d) n = 2 i najmanje jedno X = Ala (sa ostalim ostacima aminokiseline X je nezavisno izabrano iz bilo koje prirodne aminokiseline, ali poželjno je nezavisno izabrano iz Val, Leu i/ili Ile);

5. (e) n = 3 i najmanje jedno X = Ala (sa ostalim ostacima aminokiseline X je nezavisno izabrano iz bilo koje prirodne aminokiseline, ali poželjno je nezavisno izabrano iz Val, Leu i/ili Ile);

1

6. (f) n = 3 i najmanje dva X = Ala (sa ostalim ostacima aminokiseline X je nezavisno izabrano iz bilo koje prirodne aminokiseline, ali poželjno je nezavisno izabrano iz Val, Leu i/ili Ile);

7. (g) n = 1 i X = Gli;

8. (h) n = 2 i svako X = Gli;

9. (i) n = 3 i svako X = Gli;

10. (j) n = 2 i najmanje jedno X = Gli (sa ostalim ostacima aminokiseline X je nezavisno izabrano iz bilo koje prirodne aminokiseline, ali poželjno je nezavisno izabrano iz Val, Leu i/ili Ile);

11. (k) n = 3 i najmanje jedno X = Gli (sa ostalim ostacima aminokiseline X je nezavisno izabrano iz bilo koje prirodne aminokiseline, ali poželjno je nezavisno izabrano iz Val, Leu i/ili Ile);

12. (l) n = 3 i najmanje dva X = Gli (sa preostalom aminokiselinom ostataka X je nezavisno izabran iz bilo koje prirodne aminokiseline, ali poželjno je nezavisno izabran iz Val, Leu i/ili Ile);

13. (m) n = 2 i svako X = Ala ili Gli;

14. (n) n = 3 i svako X = Ala ili Gli;

15. (o) n = 3 i najmanje jedno X = Ala ili Gli (jedno X); ili

16. (p) n = 3 i najmanje dva X = Ala ili Gli (jedno X);

sa aspektima (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) i (n) koji su posebno poželjni, sa aspektima u kojima su n = 1 ili 2 poželjni i aspekti u kojima je n = 1 posebno poželjno.

[0049] Takođe treba napomenuti da, poželjno, bilo koji C-terminalni nastavak prisutan u TNF vezivu prema pronalasku ne sadrži (slobodan) cisteinski ostatak (osim ako navedeni cisteinski ostatak ne se koristi ili se namerava za dalju funkcionalizuju, na primer za pegilaciju).

[0050] Neki specifični, ali neograničavajući primeri korisnih C-terminalnih nastavaka su sledeće sekvence aminokiseline: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA ili GAG.

[0051] Kada TNF veziva iz obelodanjenja sadrže mutacije na pozicijama 110 ili 112 (opciono u kombinaciji sa mutacijama na poziciji 11 i/ili 89 kao što je ovde opisano), ostaci C-terminalnih aminokiselinskih okvira 4 (počevši od pozicije 109) mogu biti kao što sledi: (i) ako nema prisustva C-terminala: VTVKS (SEQ ID NO: 43), VTVQS (SEQ ID NO: 44), VKVSS (SEQ ID NO: 45) ili VQVSS (SEQ ID NO: 46) ; ili (ii) ako je prisutan C-terminalni nastavak: VTVKSX(n)(SEQ ID NO: 47), VTVQSX(n)(SEQ ID NO: 48), VKVSSX(n)(SEQ ID NO: 49) ili VQVSSX(n)(SEQ ID NO: 50), kao što je VTVKSA (SEQ ID NO: 51), VTVQSA (SEQ ID NO: 52), VKVSSA (SEQ ID NO: 53) ili VQVSSA (SEQ ID NO: 54). Kada TNF veziva iz obelodanjenja ne sadrže mutacije na pozicijama 110 ili 112 (ali samo mutacije na poziciji 11 i/ili 89 kao što je ovde opisano), ostaci C-terminalnih aminokiselina okvira 4 (počevši od položaja 109) obično će biti: (i) kada nije prisutan nikakav C-terminalni nastavak: VTVSS (kao u sekvenci SEQ ID NO: 1); ili (ii) kada je prisutan C-terminalni nastavak: VTVSSX(n)(SEQ ID NO: 56) kao što je VTVSSA (SEQ ID NO: 57). U ovim C-terminalnim sekvencama, X i n su kao što je ovde definisano za C-terminalne nastavke.

[0052] Kao što se može videti iz poravnanja na Slici 4, kao i sa Slike 3, TNF veziva SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 i 62-63 imaju i E1D mutaciju i C-terminalni alanin nastavak. Kao što je pomenuto, prisustvo oba D na poziciji 1 kao i C-terminalni nastavak čine ova TNF veziva (i druga TNF veziva prema pronalasku sa D na poziciji 1 i C-terminalnim nastavkom) posebno pogodna za upotrebu u monovalentnom formatu (npr., za opisane ovde svrhe).

[0053] Shodno tome, u sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na TNF vezivo prema pronalasku (što je dalje opisano ovde) koje ima D na poziciji 1 i C-terminalni nastavak X(n)(koji je poželjno jedinstveni Ala ostatak). Navedena TNF veziva poželjno su (korišćena i/ili namenjena za upotrebu) u monovalentnom obliku. U jednom specifičnom aspektu, pomenuto monovalentno TNF vezivo je SEQ ID NO: 40.

[0054] Neki poželjni, ali neograničavajući primeri TNF veziva iz obelodanjenja data su u SEQ ID NO: 8 do 41 i 62-69, a svaka od ovih sekvenci čini još jedan aspekt obelodanjenja (kao što su proteini, polipeptidi ili druga jedinjenja ili formulacije koji sadrže jednu od ovih sekvenci).

[0055] Neka od posebno poželjnih TNF veziva iz obelodanjenja su sekvence SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 i 62-63 (ili, kao što je ovde opisano, njihove varijante sa E na

1

poziciji 1 i/ili bez C-terminala, u zavisnosti od njihove nameravane upotrebe u polipeptidu ili jedinjenju obelodanjenja).

[0056] Prema tome, u prvom aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

• CDR1 (prema Kabatu) koji je sekvenca aminokiselina TADMG (SEQ ID NO: 2); i • CDR2 (prema Kabatu) koji je sekvenca aminokiselina RISGIDGTTIIDEPVKG (SEQ ID NO: 3); i

• CDR3 (prema Kabatu) koji je sekvenca aminokiselina PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); i imaju:

• stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (gde bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan, kao i CDR se ne uzimaju u obzir za određivanje stepena identiteta sekvence) najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%;

• i/ili

• ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 “razlika aminokiseline” (kao što je ovde definisano, a ne uzimajući u obzir neku od gore navedenih mutacija kod pozicija 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, mogu biti prisutne u okvirima i/ili CDR, ali su poželjno prisutni samo u okvirima, a ne u CDR);

• i opciono imaju:

• C-terminalni nastavak (X)n, u kojem je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što su 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svako X je (poželjno prirodno prisutan) ostatak aminokiseline koji je nezavisno izabran i poželjno nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izolevcin (I);

u kojima:

• ostatak aminokiseline na poziciji 11 poželjno je izabran iz L ili V; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 89 poželjno je izabran iz T, V ili L; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 110 poželjno je izabran iz T, K ili Q; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 112 poželjno je izabran iz S, K ili Q;

tako da (i) pozicija 89 je T; ili (ii) pozicija 89 je L, a pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je L, a pozicija 110 je K ili Q; ili (iv) pozicija 89 je L, a pozicija 112 je K ili Q; ili

1

(v) pozicija 89 je L, a pozicija 11 je V, a pozicija 110 je K ili Q; ili (vi) pozicija 89 je L, a pozicija 11 je V, a pozicija 112 je K ili Q; ili (vii) pozicija 11 je V, a pozicija 110 je K ili Q; ili (vii) pozicija 11 je V, a pozicija 112 je K ili Q.

[0057] U sledećem aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

• CDR1 (prema Kabatu) koji je sekvenca aminokiselina TADMG (SEQ ID NO: 2); i • CDR2 (prema Kabatu) koji je sekvenca aminokiselina RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); i

• CDR3 (prema Kabatu) koji je sekvenca aminokiselina PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); i koji ima:

• stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan, kao i CDR ne uzimaju se u obzir za određivanje stepena identiteta sekvence) najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%;

• i/ili

• ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 “razlike aminokiselina” (kao što je ovde definisano, a ne uzimajući u obzir neku od gore navedenih mutacija u pozicije 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako prisutni, mogu biti prisutni u okvirima i/ili CDR, ali su poželjno prisutni samo u okvirima, a ne u CDR);

i opciono ima:

• C-terminalni nastavak (X) n, u kojem je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što su 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki Ks je (poželjno prirodno prisutan) ostatak aminokiseline koji je nezavisno izabran i poželjno nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izolevcin (I);

koji jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina sadrži sledeće ostatke aminokiseline (npr., mutacije u poređenju sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1) na pomenutim pozicijama (numeracija prema Kabatu):

• 89T; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V; ili

• 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

1

• 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q.

[0058] Naročito, TNF veziva prema predmetnom pronalasku poželjno imaju ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjnije ne više od 3, kao što je 3, 2, ili 1 „razlike aminokiseline” (kao što je opisano ovde, i ne uzimaju u obzir bilo koju od iznad ispisanih mutacija na pozicijama 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj pomenute razlike aminokiseline, ako su prisutne, mogu biti prisutna u okviru i/ili u CDR ali su poželjno prisutne samo u okvirima i ne u CDR).

[0059] Naročito, kod TNF veziva datih u obelodanjenju, ostatak aminokiseline na poziciji 11 je V, ostatak aminokiseline na poziciji 89 je L, ostatak aminokiseline na poziciji 110 je T i ostatak aminokiseline na poziciji 112 je S.

[0060] Kao što je ovde opisano, neki specifični, ali neograničavajući primeri takvih mutacija/razlika aminokiseline koje mogu biti prisutne (npr., u odgovarajućoj kombinaciji) jesu primeri E1D, P40A, P40L, P40S (i posebno u P40A), S49A, A74S, L78V, T87A u bilo kojoj odgovarajućoj njihovoj kombinaciji, kao i na primer (odgovarajuća kombinacija od) D60A, E61D i/ili P62S mutacije (posebno kao ADS motiv na pozicijama od 60-62) i (odgovarajuća kombinacija videti npr., SEQ ID NO: 39) jedne ili više odgovarajućih „humanizovanih” supstitucija. Kao što je takođe pomenuto, prisustvo S49A, A74S i/ili L78V mutacija (ili bilo koje odgovarajuće kombinacije bilo koje dve navedene uključujući sve tri navedene) je poželjno (kao i prisustvo D na poziciji 1 kada je TNF vezivo prisutno u i/ili obliku na N-terminalnom kraju jedinjenja polipeptida obelodanjenja ili je u monovalentnom formatu).

[0061] TNF veziva prema pronalasku kao što je ISVD sadrže alanin na poziciji 49 (A49).

[0062] U poželjnom aspektu, TNF vezivo iz obelodanjenja kao što je ISVD sadrži serin na poziciji 74 (S74).

1

[0063] U daljem poželjnom aspektu, TNF vezivo iz obelodanjenja kao što je ISVD sadrži asparagin na poziciji 73 (N73) i lizin na poziciji 75 (K75).

[0064] Kao što je pomenuto, u obelodanjenju, sekvence aminokiseline u kojima je pozicija 89 T ili u kojoj je položaj 11 V, a pozicija 89 je L (opciono u odgovarajućoj kombinaciji sa 110K ili 110Q mutacijom i/ili 112K ili 112Q mutacijom, i posebno u kombinaciji sa 110K ili 110Q mutacijom) posebno su poželjne. Još poželjnije su sekvence aminokiselina u kojima je pozicija 11 V, a pozicija 89 je L, opciono sa 110K ili 110Q mutacijom.

[0065] Prema tome, u jednom poželjnom aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

• CDR3 (prema Kabatu) koji je sekvenca aminokiselina PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4). i koji ima:

• i/ili

• ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlike aminokiseline“ (kao što je ovde definisano, a ne uzimajući u obzir neku od gore navedenih mutacija u pozicije 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj pomenuta razlika aminokiseline, ako je prisutna, može biti prisutna u okviru i /ili CDR, ali poželjno je prisutna samo u okviru i ne u CDR).

i opciono ima:

u kojima:

1

• ostatak aminokiseline na poziciji 11 je poželjno izabran iz L ili V; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 89 je T; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 110 je poželjno izabrano od T, K ili Q (i poželjno je T); i

• ostatak aminokiseline na poziciji 112 poželjno je pogodno izabran iz S, K ili Q (i poželjno S).

[0066] U još jednom poželjnom aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

• i/ili

i opciono imajući:

u kojima:

• ostatak aminokiseline na poziciji 11 je V; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 89 je L; i

2

• ostatak aminokiseline na poziciji 110 poželjno je pogodno izabran iz T, K ili Q; i • ostatak aminokiseline na poziciji 112 poželjno je pogodno izabran iz S, K ili Q.

[0067] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, TNF veziva obuhvataju sledeće ostatke aminokiseline (npr., mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim pozicijama (numeracija prema Kabatu):

• 11V u kombinaciji sa 89L; ili

• 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q;

• 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q;

• 11V u kombinaciji sa 89L i 110K ili 110Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 89L i 112K ili 112Q;

i imaju CDR (prema Kabatu) i imaju ukupan stepen identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 kao što je ovde opisano.

[0068] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, TNF veziva obuhvataju sledeće ostatke aminokiseline (npr., mutacije u poređenju sa sekvencom SEK ID NO: 1) na navedenim pozicijama (numeracija prema Kabatu):

• 89L u kombinaciji sa 11V; ili

• 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q;

[0069] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, TNF veziva obuhvataju sledeće ostatke aminokiseline (npr., mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim pozicijama (numeracija prema Kabatu):

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V; ili

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 89L; ili

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V i 89L;

[0070] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, TNF veziva obuhvataju sledeće ostatke aminokiseline (npr., mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim pozicijama (numeracija prema Kabatu):

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V; ili

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 89L; ili

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V i 89L;

[0071] U drugom aspektu, TNF veziva iz obelodanjenja sadrže T na poziciji 89 i imaju CDR (prema Kabatu) i imaju ukupan stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 kao što je ovde opisano.

[0072] U drugom aspektu, TNF veziva obuhvataju V na poziciji 11 i L na poziciji 89 i imaju CDR (prema Kabatu) i imaju ukupan stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 kao što je ovde opisano.

[0073] Kao što je pomenuto, TNF veziva iz obelodanjenja prema gore navedenim aspektima dalje su poželjno takva da sadrže pogodnu kombinaciju mutacije S49A, A74S i/ili L78V i poželjno odgovarajuće kombinacije bilo koje dve od ovih mutacija, kao što su sve tri navedene mutacije (i ponovo, kada je TNF vezivo monovalentno ili prisutno na N-terminalu jedinjenja ili polipeptida obelodanjenja, poželjna takođe E1D mutacija).

[0074] U drugom aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

• CDR1 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5);

i

• CDR2 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); i • CDR3 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); i ima:

o stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan, kao i CDR se ne uzimaju u obzir za određivanje stepena identiteta sekvence) najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%;

o i/ili

o ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 “razlike aminokiselina” (kao što je ovde definisano, a ne uzimajući u obzir neku od gore navedenih mutacija u pozicije 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako prisutni, mogu biti prisutni u okvirima i/ili CDR, ali su poželjno prisutni samo u okvirima, a ne u CDR); i opciono ima:

o C-terminalni nastavak (X)n, u kojem je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što su 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svako X je (poželjno prirodno prisutan) ostatak aminokiseline koji je nezavisno izabran i poželjno nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izolevcin (I);

u kojima:

o ostatak aminokiseline na poziciji 11 poželjno je izabran od L ili V; i o ostatak aminokiseline na poziciji 89 poželjno je pogodno izabran iz T, V ili L; i

o ostatak aminokiseline na poziciji 110 poželjno je pogodno izabran iz T, K ili Q; i

o ostatak aminokiseline na poziciji 112 poželjno je pogodno izabran iz S, K ili Q;

tako da (i) pozicija 89 je T; ili (ii) pozicija 89 je L, a pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je L, a pozicija 110 je K ili Q; ili (iv) pozicija 89 je L, a pozicija 112 je K ili Q; ili (v) pozicija 89 je L, a pozicija 11 je V, a pozicija 110 je K ili Q; ili (vi) pozicija 89 je L, a pozicija 11 je V, a pozicija 112 je K ili Q; ili (vii) pozicija 11 je V, a pozicija 110 je K ili Q; ili (vii) pozicija 11 je V, a pozicija 112 je K ili Q.

[0075] U sledećem aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

• CDR1 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina GFTFSTADMG (SEQ ID NO:

5); i

• CDR2 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6);

i

2

• CDR3 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

i ima:

o i/ili

o ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 “razlike aminokiselina” (kao što je ovde definisano, a ne uzimajući u obzir neku od gore navedenih mutacija u pozicije 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako prisutni, mogu biti prisutni u okvirima i/ili CDR, ali su poželjno prisutni samo u okvirima, a ne u CDR); i opciono imajući:

o 89T; ili

o 89L u kombinaciji sa 11V; ili

o 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

o 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

o 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

o 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q; ili

o 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

o 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q.

[0076] Kao što je pomenuto, kada je TNF vezivo prema pronalasku u monovalentnom formatu i/ili kada je prisutno na C-terminalnom kraju jedinjenja obelodanjenja (kao što je ovde definisano), TNF vezivo (i kao posledica, dobijeno jedinjenje iz obelodanjenja) poželjno ima C-terminalni nastavak X(n), gde C-terminalni nastavak može biti kao što je ovde opisano za TNF veziva prema pronalasku i/ili kao što je definisano u WO 2012/175741 ili WO2015/173325.

[0077] Kao što je pomenuto, u obelodanjenju, sekvence aminokiseline kod kojih je pozicija 89 T ili kod kojih je pozicija 11 V i pozicija 89 je L (opciono u pogodnoj kombinaciji sa 110K ili 110Q mutacijom i/ili 112K ili 112Q mutacijom, i naročito u kombinaciji sa 110K ili 111Q mutacijom) posebno su poželjna. Čak su poželjnije sekvence aminokiseline u kojima je pozicija 1 V i pozicija 89 je L, opciono sa 110K ili 110Q mutacijom.

[0078] Prema tome, u jednom poželjnom aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

• CDR1 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina GFTFSTADMG (SEQ ID NO:

5); i

4); i ima:

o i/ili

o ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 “razlike aminokiselina” (kao što je ovde definisano, a ne uzimajući u obzir neku od gore navedenih mutacija u pozicije 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, mogu biti prisutne u okvirima i/ili CDR, ali su poželjno prisutni samo u okvirima, a ne u CDR); i opciono ima:

• C-terminalni nastavak (X)n, u kojem je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što su 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svako X je (poželjno prirodno prisutan) ostatak

2

aminokiseline koji je nezavisno izabran i poželjno nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izolevcin (I);

u kojima:

• ostatak aminokiseline na poziciji 11 je poželjno izabran iz L ili V; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 89 je T; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 110 je poželjno izabran iz T, K ili Q (i poželjno je T); i

[0079] U još jednom poželjnom aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

• CDR1 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina GFTFSTADMG (SEQ ID NO:

5); i

• CDR2 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); i • CDR3 (prema Abm) koji je sekvenca aminokiselina PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); i imaju:

• i/ili

• ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 “razlike aminokiselina” (kao što je ovde definisano, a ne uzimajući u obzir neku od gore navedenih mutacija u pozicije 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimaju u obzir bilo koji C-terminalni nastavak koji može biti prisutan) sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, mogu biti prisutne u okvirima i/ili CDR-u, ali su poželjno prisutni samo u okvirima, a ne u CDR);

i opciono imaju:

• C-terminalni nastavak (X) n, u kojem je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što su 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svako X je (poželjno prirodno prisutan) ostatak aminokiseline koji je nezavisno izabran i poželjno nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izolevcin (I);

u kojima:

2

• ostatak aminokiseline na poziciji 11 je V; i

• ostatak aminokiseline na poziciji 89 je L; i

[0080] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, TNF veziva obuhvataju sledeće ostatke aminokiseline (npr., mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim pozicijama (numeracija prema Kabatu):

• 11V u kombinaciji sa 89L; ili

• 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q;

• 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q;

• 11V u kombinaciji sa 89L i 110K ili 110Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 89L i 112K ili 112Q;

i imaju CDR (prema Abm) i imaju ukupan stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 kao što je ovde opisano.

[0081] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, TNF veziva obuhvataju sledeće ostatke aminokiseline (npr., mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim pozicijama (numeracija prema Kabatu):

• 89L u kombinaciji sa 11V; ili

• 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q;

[0082] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, TNF veziva obuhvataju sledeće ostatke aminokiseline (npr., mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim pozicijama (numeracija prema Kabatu):

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V; ili

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 89L; ili

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V i 89L;

2

[0083] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, TNF veziva obuhvataju sledeće ostatke aminokiseline (npr., mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim pozicijama (numeracija prema Kabatu):

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V; ili

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 89L; ili

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V i 89L;

[0084] U drugom aspektu, TNF veziva iz obelodanjenja sadrže T na poziciji 89 i imaju CDR (prema Abm) i imaju ukupan stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 koja su kao što su opisana ovde.

[0085] U drugom aspektu, TNF veziva obuhvataju V na poziciji 11 i L na poziciji 89 i imaju CDR (prema Abm) i imaju ukupan stepen identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 koja su kao što su opisana ovde.

[0086] Kao što je pomenuto, TNF veziva iz obelodanjenja prema gore navedenim aspektima poželjno su dalje takva da sadrže pogodnu kombinaciju mutacije S49A, A74S i/ili L78V i poželjno odgovarajuće kombinacije bilo koje dve od ovih mutacija, kao što su sve tri od ovih mutacija (i opet, kada je TNF vezivo monovalentno ili prisutno na N-terminalu jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku, poželjno takođe i E1D mutaciji).

[0087] Pronalazak se odnosi na TNF vezivo kao što je definisano u priloženom patentnom zahtevu, a posebno na vezivo TNF koje je u monovalentnom obliku i koje ima D na poziciji 1 (i/ili E1D mutaciji) i C-terminalnog nastavka X(n) kao što je definisano u priloženom zahtevu (kao što je ostatak C-terminalnog alanina).

[0088] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji je ili u suštini sastoji od sekvence aminokiseline izabrane iz jedne od sledećih amino-kiselinskih sekvenci: SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:

2

12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 i SEQ ID NO: 68.

[0089] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji je ili u suštini sastoji od sekvence aminokiseline izabrane iz jedne od sledećih amino-kiselinskih sekvenci: SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 i SEQ ID NO: 68.

[0090] U svrhe pronalaska, digestivni trakt se sastoji od usta, ždrela, jednjaka, želuca, tankog creva (duodenum, jejunum, ileum), debelog creva (cekuma, debelog creva, rektuma) i anusa.

[0091] U svrhe pronalaska, pod pojmom „gastrointestinalni trakt” ili „GI trakt” podrazumeva se želudac, tanko crevo (duodenum, jejunum, ileum), debelo crevo (cekum, debelo crevo, rektum) i anus. Termin „digestija želuca”, kako se ovde koristi, podrazumeva da opisuje varenje u stomaku, tankom crevu i/ili debelom crevu.

[0092] Termin „degradacija želuca” antitela se ovde koristi da se odnosi na degradaciju ISVD, jedinjenja ili polipeptida pronalaska u stomaku, tankom crevu, debelom crevu endogenim ili egzogenim enzimima prisutnim u želucu, tankom crevu i debelom crevu ili zbog izloženosti kiselim uslovima tokom varenja u želucu.

[0093] Pod pojmom „stabilizovani ISVD”, „stabilizovana jedinjenja” i „stabilizovani polipeptidi”, kao što je ovde korišćeno, podrazumeva se opis ISVD, jedinjenja ili polipeptida respektivno koji je projektovan da bi postao stabilniji na degradaciju u digestivnom traktu kada se daje topikalno. U poređenju sa ISVD, jedinjenjem ili polipeptidom koji nije procesiran ili napravljen u skladu sa pronalaskom, stabilizovani ISVD, jedinjenje ili polipeptid koji je projektovan prema pronalasku raspada se sporije ili u manjoj meri pomoću digestije želuca, kao što je digestija endogenim ili egzogenim enzimima prisutnim u stomaku,

2

tankom crevu i debelom crevu i/ili kiselim stanjima prisutnim u stomaku. „Stabilizovani ISVD”, „stabilizovana jedinjenja” i „stabilizovani polipeptidi” takođe se nazivaju „ISVD sa povećanom stabilnošću na degradaciju u GI traktu”, „jedinjenja sa povećanom stabilnošću na degradaciju u GI traktu” i „polipeptidi sa povećanom stabilnošću na degradaciju u GI traktu “, respektivno.

[0094] Topikalna primena ISVD, jedinjenja ili polipeptida u digestivnom traktu je izazovna jer digestivni trakt degradira i digestira topikalno primenjene ISVD, jedinjenja i polipeptide. U stomaku, niski pH i proteaza pepsin degradiraju digestirane ISVD, jedinjenja i polipeptide. U tankom crevu, enzimi tripsin i cimotripsin, između ostalog, razgrađuju uzimane ISVD, jedinjenja i polipeptide. U debelom crevu bakterijski derivati proteaze razgrađuju primenjene ISVD, jedinjenja i polipeptide. ISVD, jedinjenja i polipeptidi sa poboljšanom stabilnošću na digestiju želuca bi bili poželjni za lokalnu primenu u GI traktu.

[0095] Stabilizovani ISVD, jedinjenja i polipeptidi mogu biti generisani mutacijom jednog ili više ostataka aminokiseline koji su podložni degradaciji želuca u ostatke aminokiselina koji su otporni na degradaciju želuca. Stabilizovani ISVD, jedinjenja i polipeptidi mogu biti generisani mutacijom višestrukih ostataka aminokiseline koji povećavaju stabilnost prema degradaciji želuca.

[0096] Prema tome, predmetno obelodanjenje se odnosi na identifikaciju ostataka aminokiseline koji pružaju stabilnost TNF veziva prema pronalasku i povećavaju stabilnost TNF veziva. Poželjno, TNF vezivo postaje otpornije na degradaciju želuca pomoću jedne ili više niskih pH vrednosti ili aktivnosti jedne ili više proteaza kao što su pepsin, tripsin, hemotripsin i/ili bakterijski dobijene proteaze.

[0097] U jednom otelotvorenju obelodanjenje se odnosi na postupak identifikacije ostatka aminokiseline koji daje stabilnost ISVD, jedinjenja ili polipeptida za degradaciju želuca, koji obuhvata korake: (a) degradiranje ISVD, jedinjenje ili polipeptid jedne ili više proteaza u fragmente; i (b) analiziranje fragmenata iz koraka (a) odgovarajućim sredstvima, kao što je npr., LC-MS; čime se identifikuju ostaci aminokiselina koji daju stabilnost ISVD, jedinjenja ili polipeptida do degradacije u želucu.

[0098] U jednom aspektu, obelodanjenje se odnosi na postupak povećanja stabilnosti ISVD, jedinjenja ili polipeptida za degradaciju želuca koji sadrži korake (a) i (b) iznad, a zatim slede: (c) mutiranje ostataka aminokiseline za stabilnost ISVD, jedinjenja ili polipeptida do degradacije želuca; i (d) ponavljanja koraka (a) i (b) gore; pri čemu odsustvo jednog ili više fragmenata ukazuje na povećanu stabilnost ISVD, jedinjenja ili polipeptida za degradaciju u želucu.

[0099] U predmetnom opisu:

• termin „imunoglobulin jednoznačna varijabla domena” (takođe nazvan “ISV” ili ISVD”) generalno se koristi tako da se odnosi na varijabilne domene imunoglobulina (koji mogu biti domeni teškog lanca ili lakog lanca, uključujući VH, VHH ili VL domene) koji mogu formirati funkcionalno mesto za vezivanje antigena bez interakcije sa drugim varijabilnim domenom (npr., bez VH/VL interakcije kao što je potrebno između VH i VL domena konvencionalnog monoklonskog antitela sa 4 lanca.) Primeri ISVD biće jasni stručnim osobama i na primer uključuju Nanotela (uključujući VHH, humanizovani VHH i/ili kamelizirani VH kao što su kamelizirani humani VH), IgNAR, domeni, (jednostruki domeni) antitela (kao što je dAb's™) koji su VH domeni ili koji potiču iz VH domena i antitela (jednostruki domeni) kao što su dAb's™) koji su VL domeni ili koji potiču iz VL domena. Ukoliko nije eksplicitno navedeno drugačije ovde, ISVD koji su zasnovani na i/ili izvedeni iz varijabilnih domena teškog lanca (kao što su VH ili VHH domeni) su uglavnom poželjni.

Najpoželjnije, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, ISVD će biti Nanotelo. • termin „Nanotelo” generalno je definisan u WO 2008/020079 ili WO 2009/138519, i stoga u specifičnom aspektu generalno označava VHH, humanizovanu VHH ili kamelizovanu VH (kao što je kamelizirani humani VH) ili generalno optimizovanu sekvencu VHH (npr., optimizovana za hemijsku stabilnost i/ili rastvorljivost, maksimalno preklapanje sa poznatim ljudskim okvirom i maksimalnom ekspresijom). Primetno je da su termini Nanotelo ili Nanotela registrovani zaštitni znaci Ablynx N.V. i stoga se mogu nazvati i Nanotelo® i/ili Nanotela®);

• Generalno, ukoliko nije drugačije naznačeno u ovom tekstu, ISVD, Nanotela, polipeptidi, proteini i druga jedinjenja i formulacije ovde pomenuti će biti namenjeni za upotrebu u profilaksi ili tretiranju bolesti ili poremećaja kod čoveka (i/ili opciono i kod toplokrvnih životinja i posebno sisara). Prema tome, generalno, ISVD, Nanotela, polipeptidi, proteini i druga jedinjenja i formulacije ovde opisani su poželjno su takvi

1

da se mogu koristiti kao i/ili mogu biti pogodni kao (biološki) lek ili druga farmaceutski ili terapeutski aktivna jedinjenja i/ili farmaceutski proizvodi ili sastavi. Takav lek, jedinjenje ili proizvod poželjno je takvo da je pogodno za primenu kod ljudi, npr., za profilaksu ili tretiranje subjekta koji zahteva takvu profilaksu ili tretiranje ili na primer kao deo kliničkog ispitivanja. Kao što je dalje ovde opisano, za ovu svrhu takav lek ili jedinjenje može sadržati druge grupe, entitete ili jedinice veziva pored ISVD koja su predviđena pronalaskom (koji, kao što je ovde opisano, može, na primer, biti jedan ili više drugih dodatnih terapijskih delova i/ili jedna ili više drugih grupa koje utiču na farmakokinetske ili farmakodinamičke osobine biološki zasnovane na ISVD ili Nanotelu, kao što je njegov polu-život). Pogodni primeri takvih dodatnih terapeutskih ili drugih delova biće jasni stručnjaku i na primer generalno mogu uključiti bilo koji terapeutski aktivni protein, polipeptid ili drugi vezivni domen ili jedinjenje veziva, kao i na primer modifikacije kao što su one opisane na stranama 149 do 152 iz WO 2009/138159. ISVD zasnovana biološka ili Nanotelo-zasnovana biološka su poželjno terapeutska ili namenjena za upotrebu kao terapeutska (koji uključuje profilaksu i dijagnozu) i u ovu svrhu poželjno sadrže najmanje jedan ISVD protiv terapeutski relevantnog cilja (kao npr., RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 ili drugi interleukini, itd.). Za neke specifične, ali neograničavajuće primere takvih bioloških izvora zasnovanih na ISVD ili Nanotelu, referenca se odnosi na primere od 8 do 18, kao i na primer na različite primene kompanije Ablynx N.V (kao na primer i bez ograničenja WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 i WO 2009/068627), kao i na primer (i bez ograničenja) na prijave kao što su WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 i WO 2007/085814. Takođe, kako je dalje ovde opisano, dodatni deo može biti ISVD ili Nanotelo kao što je ovde opisano usmereno protiv (humanog) serumskog proteina kao što je (humani) serumski albumin, a takav ISVD ili Nanotelo takođe može pronaći terapeutske primene, posebno u i/ili za proširenje poluvremena TNF veziva opisanih ovde. Na primer, referenca je data na WO 2004/041865, WO 2006/122787 i WO 2012/175400, koji generalno opisuju upotrebu serum-albumin vezujućih Nanotela za produženje poluživota. Takođe, u predmetnom opisu, osim ukoliko nije ovde naročito pomenuto, svi navedeni termini imaju značenje dato u WO 2009/138519 (ili u prethodnom članku iz WO 2009/138519) ili WO 2008/020079 (ili u prethodnom stanju tehnike citirano u WO 2008/020079). Takođe, tamo gde postupak ili stanje tehnike nije specifično

2

opisano, može se izvršiti kao što je opisano u WO 2009/138519 (ili u prethodnom članku u WO 2009/138519) ili WO 2008/020079 (ili u prethodnom članku navedenom u WO 2008/020079). Takođe, kao što je ovde opisano, bilo koji farmaceutski proizvod ili sastav koji sadrži bilo koji ISVD ili jedinjenje prema datom pronalasku može takođe sadržati jednu ili više dodatnih komponenata koje su po sebi poznate za upotrebu u farmaceutskim proizvodima ili preparatima (npr., u zavisnosti od planiranog farmaceutskog oblika) i/ili primer jednog ili više drugih jedinjenja ili aktivnih principa namenjenih za terapeutsku upotrebu (npr., da obezbede kombinovani proizvod).

[0100] Takođe, kada se koriste u predmetnom opisu ili patentnim zahtevima, sledeći termini imaju isto značenje kao što je navedeno u, i/ili gde se može odrediti na način opisan na stranicama 62-75 u WO 2009/138519: „agonist”, „antagonist”, „inverzni agonist”, „nepolarni, nezapaženi ostatak aminokiseline”, „polarni nenaelektrisani ostatak aminokiseline”, „polarni, naelektrisani ostatak aminokiseline”, „identitet sekvence”, „potpuno isti” i „amino (u obliku)“, „domen“, „vezujući domen“, „antigenska determinanta“, „epitop“, „protiv“ ili „kiselinska razlika“ (kada se radi o poređenju sekvence dve sekvence aminokiseline) „usmeren protiv” (antigen), „specifičnost” i „poluživot”. Pored toga, termini „modulisanje” i „modulacija”, „lokacija interakcije”, „specifična za”, „unakrsni blok”, „unakrsno blokiran“ i „unakrsno blokiranje” i „suštinski nezavisni od pH“ definisani su na (i/ili mogu biti određeni kako je opisano na) stranicama 74-79 WO 2010/130832 Ablynx N.V. kada se odnosi na sklop, jedinjenje, protein ili polipeptid pronalaska, termini kao što su „monovalentni”, „dvovalentni” (ili “multivalentni”), „bispecifični” (ili „multispecifični”) i „biparatopični” (ili „multiparatopski”) mogu imati značenje dato u WO 2009/138519, WO 2010/130832 ili WO 2008/020079.

[0101] Termin „polu-život” koji se koristi ovde u odnosu na ISVD, Nanotelo, ISVD-biološki zasnovani ili biološko Nanotelo ili bilo koju drugu sekvencu aminokiselina, jedinjenje ili polipeptid koji se ovde pominje, može se generalno definisati kao što je opisano u paragrafu o) na strani 57 WO 2008/020079 i kao što je pomenuto u njemu, odnosi se na vreme potrebno za serumsku koncentraciju sekvence aminokiseline, jedinjenja ili polipeptida da se smanji za 50%, in vivo, na primer zbog degradacije sekvence ili jedinjenja i/ili čišćenja ili sekvestracije sekvence ili jedinjenja prirodnim mehanizmima. Polu-život in vivo aminokiseline, jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku može se odrediti na bilo koji način poznat po sebi, kao što je farmakokinetička analiza. Odgovarajuće tehnike biće jasne stručnjaku i mogu, na primer, generalno biti opisane u paragrafu o) na strani 57 WO 2008/020079. Kao što je pomenuto u paragrafu o) na strani 57 WO 2008/020079, polu-život se može izraziti pomoću parametara kao što su t1/2-alfa, t1/2-beta i površina ispod krive (AUC). U tom pogledu treba napomenuti da se termin „polu-život”, kako se ovde koristi posebno, odnosi na t1/2-beta ili terminalno poluvreme (u kojem t1/2-alfa i/ili AUC ili oboje mogu ne smeju se razmatrati). Na primer, referenca je data u Eksperimentalnom delu u daljem tekstu, kao i na standardne priručnike, kao što su Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996).

Upućuje se i na "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982). Slično tome, termini „povećanje polu-života” ili „povećani poluživot” takođe su definisani u paragrafu o) na strani 57 WO 2008/020079, a posebno se odnose na povećanje t1/2-beta, bilo sa ili bez povećanja t1/2-alfa i/ili AUC ili oba.

[0102] Shodno tome, u jednom aspektu ovo obelodanjenje se odnosi na jedinjenje kao što je ovde opisano, pri čemu navedeno jedinjenje dalje sadrži vezujući protein u serumu.

[0103] U sledećem aspektu, predmetno obelodanjenje se odnosi na jedinjenje kao što je ovde opisano, pri čemu pomenuti vezivni protein za serum vezuje serumski albumin.

[0104] Kada pojam ovde nije posebno definisan, u struci ima uobičajeno značenje, što će biti jasno stručnjaku. Na primer, referenca se odnosi na standardne priručnike, kao što su Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2nd.Ed.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel i dr., eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, “Genes John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old i dr., “Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt i dr., “Immunology” (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt i dr., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); and Janeway i dr., “Immunobiology” (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005),, kao i generalna pozadina stanja tehnike citirana ovde.

[0105] Takođe, kako je već navedeno, ostaci aminokiseline Nanotela numerisani su u skladu sa opštom numeracijom za VH koja je data u Kabat i dr. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.

4

91), kao što je primenjeno na VHH domene iz Camelida u članku Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; ili kao što je ovde naznačeno. Prema ovoj numeraciji, FR1 Nanotelo sadrži ostatke aminokiseline na pozicijama 1-30, CDR1 Nanotelo sadrži ostatke aminokiseline na pozicijama 31-35, FR2 Nanotelo sadrži ostatke aminokiseline na pozicijama 36-49, CDR2 Nanotelo sadrži ostatke aminokiseline na pozicijama 50-65, FR3 Nanotelo sadrži ostatke aminokiseline na pozicijama 66-94, CDR3 Nanotelo sadrži ostatke aminokiseline na pozicijama 95-102 i FR4 Nanotelo sadrži ostatke aminokiseline na pozicijama 103-113. [U tom pogledu, treba napomenuti da - kako je dobro poznato u stanju tehnike VH domena i za VHH domene - ukupan broj ostataka aminokiseline u svakom od CDR može varirati i možda ne odgovara ukupnom broju ostataka aminokiseline označenih Kabat numeracijom (to jest, jedna ili više pozicija prema Kabat numeraciji ne može biti zaokupljena u stvarnom nizu, ili stvarna sekvenca može sadržati više ostataka aminokiseline nego broj koji je dozvoljen Kabat numeracijom). To znači da, generalno, numerisanje prema Kabatu može ili ne mora odgovarati stvarnom numerisanju ostataka aminokiseline u stvarnom nizu. Generalno, međutim, može se reći da, prema Kabat numeraciji i bez obzira na broj ostataka aminokiseline u CDR, pozicija 1 prema Kabat numeraciji odgovara početku FR1 i obrnuto, položaj 36 prema Kabat numeraciji odgovara početku FR2 i obrnuto, pozicija 66 prema Kabat numeraciji odgovara početku FR3 i obrnuto, a položaj 103 prema Kabat numeraciji odgovara početku FR4 i obrnuto.].

[0106] Alternativne metode za numerisanje ostataka aminokiseline VH domena, gde se metode takođe mogu primeniti na analogni način za VHH domene od Camelida i Nanotela, su metode opisane u Chothia i dr. (Nature 342, 877-883 (1989)), tzv. „AbM definicija” i tzv. „Definicija kontakta”. Međutim, u sadašnjem opisu, aspektima i slikama, numeracija prema Kabatu, koja se primenjuje na VHH domene od strane Riechmann i Muyldermans, biće praćena, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0107] Takođe treba napomenuti da su Slike, bilo koja Lista Sekvenci i Eksperimentalni deo/primeri dati samo radi dalje ilustracije pronalaska i ne treba ih tumačiti ili konstruisati kao ograničavanje obima pronalaska i/ili priloženog patentnog zahteva na bilo koji način, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno.

[0108] Obelodanjenje se takođe odnosi na proteine, polipeptide i druge formulacije, molekule ili hemijske entitete koji sadrže ili se u suštini sastoje od TNF veziva prema pronalasku kao što je ovde opisano (npr., koje sadrže ili se u suštini sastoje od jednog ili više takvih TNF veziva, kao što je jedan, dva ili tri takva TNF veziva); na metode za ekspresiju/proizvodnju TNF veziva prema pronalasku i/ili za ekspresiju/proizvodnju proteina, polipeptida i drugih formulacija, molekula ili hemijskih jedinjenja koje sadrže istu; na sastave i proizvode (kao što su farmaceutski sastavi i proizvodi) koji sadrže TNF veziva prema pronalasku i/ili proteine, polipeptide i druge formulacije, molekule ili hemijske entitete koji sadrže ista; na nukleotidnu sekvencu i nukleinske kiseline koji kodiraju TNF veziva prema pronalasku i/ili koji kodiraju proteine ili polipeptide koji sadrže ista; i na upotrebu (i naročito terapeutsku, profilaktičku i dijagnostičku upotrebu) TNF veziva iz pronalaska i proteina, polipeptida i drugih formulacija, molekula ili hemijskih entiteta koji sadrže iste.

[0109] Ovi i drugi aspekti, otelotvorenja, prednosti, primene i upotreba obelodanjenja će se razjasniti u daljem opisu u ovom dokumentu.

[0110] Shodno tome, u daljem aspektu, obelodanjenje se odnosi na proteine (kao što su fuzioni proteini), polipeptide, formulacije, jedinjenja ili druge hemijski subjekte koji sadrže ili se u suštini sastoje od najmanje jednog (kao jedan, dva ili tri) TNF veziva prema pronalasku (koji se zajedno ovde nazivaju „jedinjenja obelodanjenja”, „polipeptidi obelodanjenja “, „formulacije obelodanjenja “ ili „fuzioni proteini obelodanjenja“). Prema tome, jedinjenje obelodanjenja može biti polipeptid.

[0111] Takva jedinjenja obelodanjenja mogu, pored jednog ili više TNF veziva pronalaska, dalje da sadrže jednu ili više drugih sekvenci aminokiseline, hemijskih entiteta ili delova. Ove druge sekvence aminokiseline, hemijska jedinjenja ili grupe mogu dodati jedno ili više željenih svojstava u (rezultujuće) jedinjenje obelodanjenja i/ili mogu promeniti svojstva (nastalog) jedinjenja obelodanjenja na željeni način, na primer obezbeđivanjem (rezultujuće) jedinjenje obelodanjenja sa željenom biološkom i/ili terapeutskom aktivnošću (na primer, da bi se dobijeno rezultujuće jedinjenje obelodanjenja s afinitetom i poželjnim potencijalom protiv druge terapeutski relevantnog cilja tako da rezultujuće jedinjenje postaje „bispecifično” u pogledu TNF i onog drugog terapeutski relevantnog cilja), kako bi se dobio željeni polu-život i/ili (na neki drugi način) modifikovala ili poboljšala farmakokinetska i/ili farmakodinamička svojstva, ciljanje jedinjenja obelodanjenja specifičnim ćelijama, tkivima ili organima ( uključujući ćelije kancera i tkiva karcinoma), radi ostvarenja citotoksičnog efekta i/ili za upotrebu kao detektujuća oznaka ili etiketa. Neki neograničavajući primeri takvih drugih sekvenci aminokiseline, hemijskih entiteta ili delova su:

• jedan ili više odgovarajućih veznika (kao što su 9GS, 15GS ili 35GS veznici); i/ili • jedan ili više vezivnih domena ili jedinjenja za vezivanje koji su usmereni protiv terapeutski relevantnog cilja osim TNF (npr., kako bi se dobilo jedinjenje prema pronalasku koje je bispecifično za TNF i za druge terapeutski relevantne ciljeve); i/ili • jedan ili više vezivnih domena ili jedinjenja vezivanja koji obezbeđuju povećanje polu-života (na primer, vezivni domen ili jedinjenje vezivanja koja se može vezati protiv serumskih proteina kao što je serumski albumin); i/ili

• jedan ili više vezivnih domena ili jedinjenja za vezivanje koje ciljaju jedinjenje obelodanjenja u željenu ćeliju, tkivo ili organ (kao što je ćelija kancera); i/ili

• jedan ili više vezivnih domena ili jedinjenja za vezivanje koje obezbeđuju povećanu specifičnost protiv TNF (obično, oni će se moći vezati za TNF, ali generalno sami po sebi neće biti funkcionalni protiv TNF); i/ili

• vezivni domen, jedinjenje vezivanja ili drugi hemijski entitet koji dozvoljava da se jedinjenje obelodanjenja internalizuje u (željenu) ćeliju (na primer, internacionalizujuće anti-EGFR Nanotelo kao što je opisano u WO 2005/044858); i/ili • deo koji poboljšava polu-život, kao što je odgovarajuća grupa polietilenglikola (npr., PEGilacija) ili sekvenca aminokiselina koja obezbeđuje povećani polu-život, kao što je humani serum albumin ili njegov odgovarajući fragment (npr., fuzija albumina) ili na primer serum albumin vezujući peptid kao što je opisano u WO 2008/068280; i/ili • opterećenje kao što je citotoksično korisno opterećenje; i/ili

• detektabilna etiketa ili oznaka, kao što je radio oznaka fluorescentna oznaka; i/ili • oznaka koja može pomoći pri imobilizaciji, otkrivanju i/ili prečišćavanju jedinjenja obelodanjenja, kao što je oznaka HIS ili FLAG3; i/ili

• oznaka koja se može funkcionalizovati, kao što je C-terminal GGC ili GGGC oznaka;

i/ili

• C-terminalni nastavak X(n)koji može biti dalje opisan za TNF veziva prema pronalasku i/ili kao što je opisano u WO 2012/175741 ili WO 2015/173325.

[0112] Iako je obično manje poželjeno, nije isključeno da jedinjenja obelodanjenja mogu takođe da sadrže jedan ili više delova ili fragmenta (poželjno ljudskog) konvencionalnog antitela (kao što je Fc deo ili njegov funkcionalni fragment ili jedan ili više konstantnih domena) i/ili iz Camelida antitela samo teškog lanca (kao što je jedan ili više konstantnih domena).

[0113] U određenom aspektu, predmetno obelodanjenje se odnosi na sklop koji se sastoji od ili u suštini sastoji od ISVD kao što je ovde definisano ili jedinjenja kako je ovde definisano, a koja dalje sadrže jednu ili više drugih grupa, ostataka, grupa ili jedinica vezivanja, opciono povezanih preko jednog ili više peptidnih veznika.

[0114] U još jednom posebnom aspektu, predmetno obelodanjenje se odnosi na sklop kao što je ovde definisano, u kome se pomenuta jedna ili više drugih grupa, ostataka, grupa ili jedinjenja vezivanja iz grupe koja se sastoji od molekula polietilenglikola, serumskih proteina ili njihovih fragmenata, jedinica vezivanja koje se mogu vezati za serumske proteine, deo Fc i male proteine ili peptide koji se mogu vezati za serumske proteine.

[0115] Kada jedinjenja obelodanjenja sadrže jedan ili više dodatnih vezujućih domena ili jedinjenja za vezivanje (npr., još jedan u suštini nefunkcionalni domen vezivanja ili jedinjenje vezivanja protiv TNF koji obezbeđuje povećanu specifičnost protiv TNF, vezujućeg domena ili jedinice vezivanja protiv terapeutskog cilja drugog od TNF, vezujućeg domena ili jedinice vezivanja protiv cilja kao što je humani serum albumin koji obezbeđuje povećani polu-život i/ili vezujući domen ili jedinjenje vezivanja koje cilja jedinjenje obelodanjenja specifičnoj ćeliji, tkivu ili organu i/ili koji dozvoljava da se jedinjenje obelodanjenja internalizuje u ćeliju), drugi vezujući domeni ili jedinice za vezivanje poželjno sadrže jedan ili više ISVD, a poželjnije su svi ISVD. Na primer, i bez ograničenja, ovi ili više drugih vezujućih domena ili vezujućih jedinica mogu biti jedno ili više Nanotela (uključujući VHH, humanizovani VHH i/ili kamelizirani VHs, kao što su kamelizirani humani VH), antitela (jednostruki domen) koja su VH domeni ili su izvedena iz VH domena, dAb koje je ili se u suštini sastoji od VH domena ili koje je izveden iz VH domena, ili čak (jednostrukog) domena antitela ili dAb koje je ili je u suštini sastavljeno od VL domena. Konkretno, ovi ili više vezujućih domena ili jedinjenja vezivanja, kada su prisutni, mogu da sadrže jedno ili više Nanotela, a naročito sva Nanotela.

[0116] Kada jedinjenje obelodanjenja ima ISVD na svom C-terminalu (gde C-terminal ISVD može biti TNF vezivo prema pronalasku ili može biti, na primer, ako je prisutan u jedinjenju prema pronalasku, dalje suštinski nefunkcionalan ISVD protiv TNF koji obezbeđuje povećanu specifičnost protiv TNF, ISVD protiv terapijskih ciljeva osim TNF, ISVD protiv cilja kao što je humani serum albumin koji obezbeđuje povećani polu-život ili ISVD koji cilja jedinjenje obelodanjenja specifične ćelije, tkiva ili organa i/ili koja dozvoljava da se jedinjenje obelodanjenja internalizuje u ćeliju), tada jedinjenje obelodanjenja (npr., pomenuti C-terminal ISVD) poželjno ima C-terminalni nastavak X(n), gde C-terminalni nastavak može biti kao što je ovde opisano za TNF veziva iz obelodanjenja i/ili kao što je opisano u WO 2012/175741 ili WO2015/173325.

[0117] Kada jedinjenje obelodanjenja sadrži, pored jednog ili više TNF veziva iz ovog pronalaska, bilo koje dalje ISVD (gde jedan ili više daljih ISVD mogu, kako je pomenuto, da budu dalje nefunkcionalni ISVD protiv TNF koji omogućava povećanje specifičnost protiv TNF, ISVD protiv terapeutskog cilja osim TNF, ISVD protiv cilja kao što je humani serum albumin koji obezbeđuje povećani polu-život i/ili ISVD koji cilja jedinjenje obelodanjenja na određenu ćeliju, tkivo ili organ i/ili koji dozvoljava da se jedinjenje obelodanjenja internalizuje u ćeliju), i gde su tak ISVD Nanotela ili su ISVD, koji su u suštini sastavljeni od i/ili koji potiču iz VH sekvenci, onda prema poželjnom aspektu obelodanjenja kažemo da će jedan ili više (i poželjno svih) dodatnih ISVD prisutnih u jedinjenju obelodanjenja sadržati unutar njihove sekvence jednu ili više okvirnih mutacija koje smanjuju vezivanje sa predegzistencijom g antitela. Posebno, prema ovom aspektu obelodanjenja, takvi dodatni ISVD mogu sadržati (odgovarajuću kombinaciju) ostatke aminokiseline/mutacije na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 koji su opisani u WO 2015/173325 i/ili u suštini su kao što je ovde opisano za TNF veziva prema pronalasku. U jednom specifičnom aspektu, kada jedinjenje obelodanjenja ima takav ISVD na svom C-terminalu (npr., nema vezivni TNF prema pronalasku na svom C-terminalu), onda je najmanje pomenuti ISVD koji je prisutan na i/ili oblika C-terminala imaju takve okvirne mutacije koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela (i pomenuti C-terminal ISVD će poželjno imati i C-terminalni nastavak X(n) kao što je ovde opisano).

[0118] Kao što je pomenuto, kada jedinjenje obelodanjenja ima povećan polu-život (npr., u poređenju sa monovalentnim TNF vezivima prema pronalasku), jedinjenje obelodanjenja poželjno sadrži najmanje jedan (kao što je jedan) ISVD (a naročito Nanotelo) koji obezbeđuje takav povećani polu-život. Takav ISVD će obično biti usmeren protiv odgovarajućeg serumskog proteina kao što je transferin, a naročito protiv (humanog) serumskog albumina. Konkretno, takav ISVD ili Nanotelo može biti antitelo (pojedinačnog) domena ili dAb protiv humanog serumskog albumina kao što je opisano u primerima EP 2139 918, WO 2011/006915, WO 2012/175400, WO 2014/111550 i posebno može biti vezuju serum albumin vezujućeg Nanotela kao što je opisano u WO 2004/041865, WO 2006/122787, WO 2012/175400 ili WO 2015/173325. Posebno poželjni ISVD vezujući serumski albumini su Nanotela Alb-1 (vidi WO 2006/122787) ili njegove humanizovane varijante kao što su Alb-8 (WO 2006/122787, SEQ ID NO: 62), Alb-23 (WO 2012/175400, 1 i druge humanizovane varijante Alb-1 i/ili varijante Alb-8 ili Alb-23 (ili generalno ISVD koji imaju u suštini iste CDR kao što su Alb-1, Alb-8 i Alb-23).

[0119] Opet, kako je pomenuto, takav ISVD vezujući serum albumin, kada je prisutan, može u svojoj sekvenci sadržati jednu ili više okvirnih mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela. Konkretno, kada je takav ISVD vezujući serum albumin Nanotelo ili antitelo (pojedinačnog) domena, koje se u suštini sastoji od i/ili je izvedeno iz VH domena, ISVD vezujući serum albumin može sadržati (pogodnu kombinaciju) ostataka aminokiseline/mutacija na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 koji su opisani u WO 2015/173325 i/ili su u suštini kao što je ovde opisano za TNF veziva prema pronalasku. Na primer, WO 2015/173325 opisuje niz varijanti Alb-1, Alb-8 i Alb-23 koji sadrže ostatke aminokiseline/mutacije na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 koji smanjuju vezivanje već postojećih antitela koja se mogu koristiti u jedinjenjima obelodanjenja.

[0120] U određenom, ali neograničavajućem aspektu obelodanjenja, pronalazak daje jedinjenje obelodanjenja, kao što je polipeptid obelodanjenja, koji sadrži pored jednog ili više konstrukcijskih blokova, npr., ISVD, TNF vezivo, najmanje jedan vezujući blok koji se vezuje za serum albumin, kao što je ISVD vezujući serum albumin, poželjno vezujući humani serum albumin kao što je ovde opisano, pri čemu se pomenuto ISVD vezivanje serum albumina u suštini sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona za određivanje komplementarnosti (CDR1 do CDR3 respektivno), u kojima je CDR1 SFGMS, CDR2 je SISGSGSDTLYADSVKG i CDR3 je GGSLSR. Poželjno, navedeni ISVD vezujući humani serum albumin se bira iz grupe koju čine Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K) -A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82- Alb82-GG, Alb82-GGG, Alb92 ili Alb223 (tabela D).

[0121] Ponovo, kada je takav ISVD vezujući serum albumin prisutan na C-terminalu jedinjenja obelodanjenja, ISVD vezujući serum albumin (i kao rezultat, jedinjenje iz pronalaska) poželjno ima C-terminalni nastavak X(n), gde C-terminalni nastavak može biti kao što je ovde opisano za TNF veziva prema pronalasku i/ili kao što je opisano u WO

4

2012/175741 ili WO2015/173325. Takođe je poželjno imati mutacije koje smanjuju vezivanje prethodno postojećih antitela, poput (odgovarajuća kombinacija) ostataka aminokiseline/mutacija na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 opisanih u WO2015/173325.

[0122] Međutim, kao što je pomenuto, drugi načini povećanja polu-života jedinjenja obelodanjenja (kao što je PEGilacija, fuzija sa humanim albuminom ili njegovim odgovarajućim fragmentom, ili upotreba pogodnog serumskog albumina vezujućeg peptida), iako manje poželjni, takođe su uključeni u obim pronalaska.

[0123] Shodno tome, u jednom otelotvorenju ovo obelodanjenje se odnosi na jedinjenje kao što je ovde opisano, pri čemu je pomenuti vezujući protein u serumu polipeptid koji nije zasnovan na antitelima.

[0124] U daljem otelotvorenju, predmetno obelodanjenje se odnosi na jedinjenje kao što je ovde opisano, koje dalje sadrži PEG.

[0125] Generalno, kada je jedinjenje obelodanjenje ima povećani polu-život (npr., putem prisustva ISVD koji povećava poluvreme ili bilo koji drugi pogodni način povećanja poluvremena), rezultujuće jedinjenje obelodanjenja poželjno ima polu-život (kao što je ovde definisano) koji je najmanje 2 puta, poželjno najmanje 5 puta, na primer najmanje 10 puta ili više od 20 puta, veći od polu-života monovalentnog TNF veziva prema pronalasku (mereno bilo u čoveku i/ili odgovarajućem modelu životinje, kao što je majmun ili makaki majmun). Konkretno, jedinjenje obelodanjenja poželjno ima polu-život (kako je ovde definisano) kod ljudi od najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana.

[0126] Biće jasno iz datog obelodanjenja da jedinjenja obelodanjenja koja su zasnovana na jednom ili više ISVD mogu imati različite „forme”, npr., u suštini monovalentne, bivalentne ili trivalentne, mogu biti monospecificna, bispecifična, trispecifična i slično, i mogu biti biparatopična (kao što je ovde definisano i na primer WO 2009/068625). Na primer, jedinjenje obelodanjenja može biti:

• (u suštini) monovalentno, npr., (u suštini) koje sadrži jedinstveno TNF vezivo prema pronalasku. Kao što je pomenuto, kada se koristi u monovalentnom obliku, TNF vezivo prema pronalasku poželjno ima C-terminalni nastavak X(n) kako je dalje opisano ovde. Takvo jedinjenje pronalaska može takođe imati produženi polu-život; • (u suštini) bivalentno ili trivalentno i monospecificno. Takvo jedinjenje obelodanjenja će sadržati dva ili više ISVD protiv TNF, koji mogu biti isti ili različiti i kada se različiti mogu usmeriti protiv istog epitopa na TNF ili protiv različitih epitopa na TNF (u drugom slučaju, kako bi se obezbedilo biparatopsko ili multiparatopsko jedinjenje obelodanjenja). Takvo jedinjenje obelodanjenja može takođe može imati produženo vreme polu-života;

• (u suštini) bivalentno, trivalentno (ili multivalentno) i bispecifično ili trispecifično (ili multispecifično). Takvo jedinjenje obelodanjenja će biti usmereno protiv TNF i barem još jednog cilja. Kao što je ovde opisano, pomenuti drugi cilj može, na primer, biti još jedan terapeutski relevantan cilj (npr., osim TNF), tako da se dobije jedinjenje obelodanjenja koje je bispecifično u odnosu na TNF i pomenuti drugi terapijski cilj. Sa druge strane cilj je takođe cilj koji omogućava povećanje vremena poluraspada (kao što je humani serumski albumin), kako bi se dobilo jedinjenje obelodanjenja koje ima povećan polu-život. Kao što je pomenuto i ovde, takav drugi cilj može dopustiti i da jedinjenje obelodanjenja bude ciljano na specifične ćelije, tkiva ili organe ili može dozvoliti da jedinjenje obelodanjenja bude internalizovano u ćeliju. Takođe je moguće kombinovati ove pristupe/ISVD, na primer, da obezbede jedinjenje obelodanjenja koje je bispecifično za TNF i za još jedan drugi terapeutski relevantan cilj, a to je produženo vreme polu-života.

[0127] Ponovo, poželjno, kada ova jedinjenja obelodanjenja sadrže jedan ili više ISVD, pored najmanje jednog TNF veziva prema pronalasku, bar jedan i poželjno svi ostali ISVD će u svojoj sekvenci sadržati jednu ili više okvirnih mutacija koje smanjuju vezivanje prethodno postojećih antitela (kao što je, naročito, kombinacija ostataka aminokiseline/mutacija na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 koja je kao što je ovde opisano za TNF veziva prema pronalasku i/ili kao što je generalno opisano u WO2015/173325). Takođe, kada takva jedinjenja obelodanjenja imaju TNF vezivo prema pronalasku na njihovom C-terminalu, onda pomenuto C-terminalno TNF vezivo (i kao rezultat, jedinjenje obelodanjenja) poželjno ima C-terminalni nastavak X(n) kao što je ovde opisano. Slično tome, kada takva jedinjenja obelodanjenja imaju drugi ISVD na svom C-terminalu (npr., ne vezuju TNF pronalazak, ali na primer polu-život prolongira ISVD), onda pomenuti C-terminal ISVD (i kao rezultat, jedinjenje prema pronalasku) poželjno će imati C-terminalni nastavak X(n) kao što je ovde opisano i/ili će u svojoj sekvenci sadržati jednu ili više okvirnih mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela (opet, kako je dalje opisano ovde i u WO2015/173325).

[0128] Kao što će biti jasno stručnjaku, kada je jedinjenje obelodanjenja namenjeno lokalnoj upotrebi (npr., na koži ili u očima) ili je na primer namenjeno da ima (lokalizovano) terapeutsko dejstvo negde na primer u GI traktu (Gastrointestinalni, npr., nakon oralne primene ili primene supozitorija) ili u plućima (npr., nakon primene inhalacijom) ili ako se inače sme direktno naneti na njegovo namereno mesto delovanja (na primer, direktnim ubrizgavanjem), jedinjenje obelodanjenja obično neće zahtevati produženje polu-života. Takođe, za tretiranje određenih akutnih stanja ili indikacija, možda bi bilo poželjno da ne bude produženo vreme polu-života. U ovim slučajevima upotreba monovalentnog jedinjenja obelodanjenja ili jedinjenja obelodanjenja (koje sadrži TNF vezivo) bez produženja poluživota (na primer, jedinjenje prema pronalasku koje je dvovalentno ili biparatopično u odnosu na TNF) je poželjno.

[0129] Neki poželjni, ali neograničavajući primeri takvih jedinjenja obelodanjenja su šematski predstavljeni u Tabeli C-1 dole, i svaki od njih čini još jedan aspekt pronalaska. Drugi primeri pogodnih jedinjenja obelodanjenja bez produženja vremena polu-života biće jasni stručnim osobama na osnovu obelodanjenja u ovom tekstu.

[0130] Kao što će biti jasno stručnjaku, kada je jedinjenje obelodanjenja namenjeno za sistemsku primenu i/ili za prevenciju i/ili tretiranje hroničnog oboljenja ili poremećaja, obično će biti poželjno da navedeno jedinjenje obelodanjenja ima povećano vreme poluživota (kao što je ovde definisano), npr., u poređenju sa TNF vezivima koja su prisutna u takvom jedinjenju obelodanjenja. Poželjnije, takvo jedinjenje obelodanjenja će sadržati ISVD koji produžava vreme polu-života, kao što je, poželjno, ISVD, a naročito vezivanje Nanotela za humani serum albumin (kao što je ovde opisano).

[0131] Neki poželjni, ali neograničavajući primeri takvih jedinjenja obelodanjenja su šematski prikazani u Tabeli C-2 u nastavku, i svako od njih čini još jedan aspekt pronalaska. Drugi primeri pogodnih jedinjenja obelodanjenja sa produženim vremenom polu-života će biti jasni stručnim osobama na osnovu obelodanjenja u ovom dokumentu. Uopšteno govoreći, za jedinjenja obelodanjenja sa produženim vremenom polu-života, prisustvo C-terminalnog nastavka je mnogo poželjnije.

4

[0132] Domeni jedinstvene varijable imunoglobulina mogu se koristiti kao „konstrukcijski blok” za pripremu jedinjenja, kao što je polipeptid obelodanjenja, koji opciono može sadržati jedan ili više dodatnih „konstrukcijskih blokova”, kao što je ISVD, protiv istog ili drugog epitopa na TNF i/ili protiv jednog ili više drugih antigena, proteina ili ciljeva od TNF, npr., konstrukcijske blokove koji imaju terapeutski način delovanja.

[0133] Uopšteno govoreći, jedinjenja, polipeptidi ili formulacije koji sadrže ili su u suštini sastoje od jednog konstrukcijskog bloka, pojedinačnog varijabilnog domena pojedinačnog imunoglobulina ili jednog Nanotela, biće ovde označeni kao „monovalentna” jedinjenja ili „monovalentni” polipeptidi ili kao „monovalentne formulacije”. Jedinjenja, polipeptidi ili formulacije koji sadrže dva ili više konstrukcijskih blokova ili jedinjenja vezivanja (kao što je npr., ISVD) takođe će ovde biti označeni kao “multivalentna” jedinjenja, polipeptidi ili formulacije, kao i konstrukcijski blokovi/ISVD prisutni u takvim jedinjenjima, polipeptidima ili formulacijama takođe će biti označeni kao „multivalentni format”. Na primer, „dvovalentno” jedinjenje ili polipeptid može sadržati dva pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina, opciono vezana preko vezivne sekvence, dok trivalentno jedinjenje ili polipeptid može da sadrži tri različita domena pojedinih imunoglobulina, opciono povezanih putem dve vezivne sekvence; dok „tetravalentno” jedinjenje ili polipeptid može obuhvatati četiri varijable domena imunoglobulina, opciono povezane putem tri vezivne sekvence, itd.

[0134] U multivalentnom jedinjenju, polipeptidu ili sklopu, dva ili više ISVD, kao što su Nanotela, mogu biti ista ili različita i mogu biti usmerena protiv istog antigena ili antigenske determinante (na primer protiv istog dela ili epitopa (a) ili protiv različitih delova ili epitopa) ili alternativno mogu biti usmereni protiv različitih antigena ili antigenskih determinanti; ili bilo koje pogodne kombinacije. Jedinjenja, polipeptidi ili formulacije koji sadrže najmanje dva konstrukcijska bloka (npr., ISVD) u kojima je najmanje jedan konstrukcijski blok usmeren protiv prvog antigena (npr., TNF) i najmanje jednog konstrukcijskog bloka usmerenog protiv drugog antigena ( npr., različitog od TNF) takođe će se nazvati „multispecifičnim” jedinjenjima, polipeptidima ili formulacijama, a konstrukcijski blokovi (kao što je npr., ISVD) prisutni u takvim jedinjenjima, polipeptidima ili formulacijama takođe će ovde biti označeni kao u „multispecifičnom formatu”. Tako, na primer, „bispecifično” jedinjenje ili polipeptid obelodanjenja je jedinjenje ili polipeptid koji sadrži najmanje jedan ISVD usmeren protiv prvog antigena (npr., TNF) i najmanje jednog dodatnog ISVD usmerenog protiv drugog antigena (npr., različitog od TNF), dok je „trispecifično” jedinjenje ili polipeptid obelodanjenja jedinjenje ili polipeptid koji sadrži najmanje jedan ISVD usmeren protiv prvog antigena (npr., TNF), najmanje jedan dodatni ISVD usmeren protiv drugog antigena (npr., različit od TNF) i najmanje jedan dodatni ISVD usmeren protiv trećeg antigena (npr., različitog od TNF i drugog antigena); itd.

[0135] „Multiparatopska” jedinjenja, „multiparatopski” polipeptidi i „multiparatopski” formulacije, kao što su npr., „biparatopska” jedinjenja, polipeptidi ili formulacije ili „triparatopska” jedinjenja, polipeptidi ili formulacije, sastoje se ili su u suštini sastoje od dva ili više konstrukcijskih blokova koji imaju drugačiji paratop.

[0136] Shodno tome, ISVD prema pronalasku koji vezuju TNF mogu biti u suštinski izolovanoj formi (kao što je ovde definisano), ili mogu formirati deo jedinjenja, polipeptida ili sklopa, koji može da sadrži ili u suštini da se sastoji od jednog ili više ISVD koji vezuju TNF i koji opciono mogu dalje obuhvatati jednu ili više dodatnih sekvenci aminokiseline (svi opciono povezani preko jednog ili više pogodnih veznika). Predmetno obelodanjenje se odnosi na jedinjenje, polipeptid ili sklop koji sadrži ili se sastoji od najmanje jednog ISVD prema pronalasku, kao što je jedan ili više ISVD iz pronalaska (ili odgovarajući njihovi fragmenti), TNF vezivo kao što je ovde definisano.

[0137] Jedan ili više ISVD prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti kao jedinjenje vezivanja ili konstrukcijski blok u takvom jedinjenju, polipeptidu ili sklopu, kako bi se obezbedilo monovalentno, multivalentno ili multiparatopsko jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja, respektivno, sve kao što je ovde opisano. Predmetno obelodanjenje se takođe odnosi na jedinjenje ili polipeptid koji je monovalentni koji sadrži ili se u suštini sastoji od jednog monovalentnog polipeptida ili ISVD pronalaska. Predmetno obelodanjenje stoga se odnosi i na jedinjenje, polipeptid ili sklop koji je multivalentno jedinjenje, multivalentni polipeptid ili multivalentni sklop, respektivno, na primer, dvovalentno ili trivalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop koji sadrži ili u suštini sadrži dva ili više ISVD pronalaska (za multivalentna i multispecifična jedinjenja ili polipeptide koji sadrže jedan ili više VHH domena i njihovu pripremu, upućuje se i na Conrath i dr. (J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001), kao na primer i na WO 96/34103, WO 99/23221 i WO 2010/115998).

4

[0138] Obelodanjenje se dalje odnosi na multivalentno jedinjenje ili polipeptid (takođe ovde označeno kao “multivalentno jedinjenje iz pronalaska” i “multivalentni polipeptidi iz pronalaska”, respektivno) koji sadrži ili (u suštini) se sastoji od najmanje jednog ISVD (ili odgovarajućeg fragmenta) usmerenog protiv TNF, poželjno humanog TNF i jednog dodatnog ISVD.

[0139] U jednom aspektu, u najjednostavnijem obliku, multivalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop pronalaska je dvovalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja koji sadrži prvi ISVD, kao što je Nanotelo, usmereno protiv TNF, i identičan drugi ISVD, kao što je Nanotelo, usmereno protiv TNF, pri čemu navedeni prvi i pomenuti drugi ISVD, kao što su Nanotela, mogu opciono biti povezana preko vezivne sekvence (kao što je ovde definisano). U najjednostavnijem obliku, multivalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja može biti trivalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja, koji sadrži prvi ISVD, kao što je Nanotelo, usmereno protiv TNF, identičan drugi ISVD, kao što je Nanotelo, usmereno protiv TNF i identičnog trećeg ISVD, kao što je Nanotelo, usmereno protiv TNF, u kome pomenuti prvi, drugi i treći ISVD imunoglobulina, kao što su Nanotela, mogu opciono da budu povezana preko jedne ili više, a posebno dve, vezivne sekvence.

[0140] U drugom aspektu, multivalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja može biti bispecifično jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja, koje sadrži prvi ISVD, kao što je Nanotelo, usmereno protiv TNF, i drugi ISVD, kao što je Nanotelo, usmereno protiv drugog antigena, u kome pomenuti prvi i drugi ISVD, kao što su Nanotela, mogu opciono biti povezana preko vezivne sekvence (kao što je ovde definisano); dok multivalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja takođe može biti trispecifično jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja, koji sadrži prvi ISVD, kao što je Nanotelo, usmeren protiv TNF, drugi ISVD, kao što je Nanotelo, usmeren protiv drugi antigena i treći ISVD, kao što je Nanotelo, usmeren protiv trećeg antigena, u kome pomenuti prvi, drugi i treći ISVD, kao što su Nanotela, mogu opciono biti povezani preko jednog ili više, a naročito dve, vezivne sekvence.

[0141] U određenom aspektu, jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja je trivalentno, bispecifično jedinjenje, polipeptid ili sklop, respektivno. Trivalentno, bispecifično jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja u svom najjednostavnijem obliku može biti trivalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop pronalaska (kako je ovde definisan), koji sadrži dva identična

4

ISVD, kao što su Nanotela, protiv TNF i treći ISVD, kao što je Nanotelo, usmereno protiv drugog antigena, u kojem pomenuti prvi, drugi i treći ISVD, kao što su Nanotela, mogu opciono da budu povezani preko jednog ili više, a naročito dve, vezivne sekvence.

[0142] U drugom aspektu, jedinjenje ili polipeptid obelodanjenja je bispecifično jedinjenje ili polipeptid. Bispecifično jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja u svom najjednostavnijem obliku može biti bivalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop pronalaska (kako je ovde definisan), koji sadrži ISVD, kao što je Nanotelo, protiv TNF i drugi ISVD, kao što je Nanotelo, usmeren protiv drugog antigena, u kome pomenuti prvi i drugi ISVD, kao što su Nanotelo, mogu opciono da budu povezani preko vezivne sekvence.

[0143] U poželjnom aspektu, multivalentno jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja sadrži ili u suštini se sastoji od dva ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina usmerenih protiv TNF. U jednom aspektu, obelodanjenje se odnosi na jedinjenje, polipeptid ili sklop koji sadrži ili u suštini se sastoji od najmanje dva ISVD prema pronalasku, kao što su 2, 3 ili 4 ISVD (ili odgovarajući fragmenti), vezujući TNF. Dva ili više ISVD mogu se opciono povezati preko jednog ili više peptidnih veznika.

[0144] U poželjnom aspektu, jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja sadrži ili se u suštini sastoji od najmanje dva ISVD, pri čemu navedena najmanje dva ISVD mogu biti ista ili različita, ali od kojih je najmanje jedan ISVD usmeren protiv TNF, kao što je kao vezujući TNF.

[0145] U određenom aspektu, jedinjenje, polipeptid ili sklop obelodanjenja sadrži ili se u suštini sastoji najmanje od dva ISVD, pri čemu su najmanje dva ISVD nezavisno izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8 - 41 i 61-66 i 69.

[0146] Relativni afiniteti mogu zavisiti od lokacije ISVD u nastalom jedinjenju, polipeptidu ili sklopu obelodanjenja. Biće prihvaćeno da redosled ISVD u jedinjenju ili polipeptidu obelodanjenja (orijentacija) može biti izabran prema potrebama stručnjaka. Redosled pojedinačnih ISVD, kao i da li jedinjenje ili polipeptid sadrži veznik, je stvar izbora dizajna. Neke orijentacije, sa ili bez veznika, mogu pružiti svojstva vezivanja u odnosu na druge orijentacije. Na primer, redosled prvog ISVD (npr., ISVD 1) i druge ISVD (npr., ISVD 2) u jedinjenju, polipeptidu ili sklopu obelodanjenja može biti (od N-terminusa do C-terminusa):

4

(i) ISVD 1 (npr., Nanotelo 1) - [veznik] - ISVD 2 (npr., Nanotelo 2); ili (ii) ISVD 2 (npr., Nanotelo 2) - [veznik] - ISVD 1 (npr., Nanotelo 1); (gde je veznik neobavezan). Sve orijentacije su obuhvaćene pronalaskom. Jedinjenja, polipeptidi i formulacije koji sadrže orijentaciju ISVD koji omogućavaju željene svojstva vezivanja mogu se lako identifikovati rutinskim proveravanjem.

[0147] U jedinjenjima ili formulacijama obelodanjenja, kao što su polipeptidi obelodanjenja, dva ili više sklopivna blokova, kao što je npr., ISVD i opciono jedna ili više drugih grupa, lekova, agenasa, ostataka, grupa ili jedinjenja za vezivanje mogu biti direktno povezani jedni sa drugima (kao što je npr., opisano u WO 99/23221) i/ili mogu biti povezani jedan sa drugim putem jednog ili više pogodnih distancera ili veznika, ili bilo koje njihove kombinacije.

Odgovarajući distanceri ili veznici za upotrebu u multivalentnim i multispecifičnim jedinjenjima ili polipeptidima će biti jasni stručnjaku i može biti generalni veznik ili distancer koji se koristi u struci za povezivanje sekvence aminokiselina. Poželjno, navedeni veznik ili distancer je pogodan za upotrebu u sklopu jedinjenja, sklopa, proteina ili polipeptida koji su namenjeni za farmaceutsku upotrebu.

[0148] U jednom otelotvorenju, obelodanjenje se odnosi na jedinjenje ili polipeptid kao što je ovde definisano, pri čemu su pomenuti ISVD direktno povezani jedni sa drugima ili su povezani preko veznika. U još jednom otelotvorenju, obelodanjenje se odnosi na jedinjenje ili polipeptid kao što je ovde definisano, pri čemu je prvi vezani ISVD i/ili drugi ISVD i/ili eventualno treći ISVD i/ili eventualno ISVD vezujući serum albumin povezan preko veznika.

[0149] Neka posebno poželjna veznici i distanceri uključuju distancere i veznike koji se koriste u struci za povezivanje fragmenata antitela ili domena antitela. Ovo uključuje veznike navedene u opštem stanju tehnike navedenom iznad, kao i na primer veziva koji se koriste u opštem stanju tehnike za konstrukciju dvojakih tela ili ScFv fragmenata (u tom pogledu, međutim, treba napomenuti da, kod diatela i u ScFv fragmenata, korišćene vezivne sekvence treba da imaju dužinu, stepen fleksibilnosti i druga svojstva koja omogućavaju da se relevantni VH i VL domeni udružuju kako bi se formiralo kompletno antigen vezujuće mesto, ne postoji posebno ograničenje dužine ili fleksibilnosti veziva koja se koristi u polipeptidu obelodanjenja, pošto svaki ISVD, kao što je Nanotelo, samo po sebi formira kompletno antigensko vezujuće mesto).

4

[0150] Na primer, veznik može biti pogodna sekvenca aminokiselina, a naročito sekvence aminokiseline od 1 do 50, poželjno između 1 i 30, kao što je između 1 i 10 ostataka aminokiseline. Neki poželjniji primeri takvih sekvenci aminokiselina uključuju gli-ser veznike, na primer vrste (glyxsery)z, kao što (na primer, (gly4ser)3ili (gly3ser2)3, kao što je opisano u WO 99/42077 i GS30, GS15, GS9 i GS7 veznike opisane u prijavama navedenim u Ablynx-u (videti npr., WO 06/040153 i WO 06/122825), kao i regioni poput zglobova, kao što su zglobni regioni prirodnih antitela teških lanaca ili slične sekvence (kao što je opisano u WO 94/04678). Preferirani veznici prikazani su u Tabeli E, npr., SEQ ID NO: 85-100.

[0151] Neki drugi posebno poželjni veznici su poli-alanin (kao što je AAA), kao i veznici GS30 (SEQ ID NO: 85 u WO 06/122825) i GS9 (SEQ ID NO: 84 u WO 06/122825).

[0152] U jednom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na jedinjenje kako je ovde definisano, pri čemu je navedeni veznik izabran iz grupe koja se sastoji iz veznika 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, 35GS i 40GS.

[0153] Ostali pogodni veznici obično sadrže organska jedinjenja ili polimere, posebno one pogodne za upotrebu u proteinima za farmaceutsku upotrebu. Na primer, poli (etilenglikol) delovi korišćeni su za povezivanje domena antitela, videti na primer WO 04/081026.

[0154] U okviru obelodanjenja obuhvaćeno je da dužina, stepen fleksibilnosti i/ili druga svojstva povezanih veznika (iako nisu kritični, kao što se obično odnosi na veznike koji se koriste u ScFv fragmentima) mogu imati određeni uticaj na svojstva konačnog jedinjenja ili formulacije obelodanjenja, kao što je polipeptid obelodanjenje, uključujući ali ne ograničavajući se na afinitet, specifičnost ili avidnost za hemokin ili za jedan ili više drugih antigena. Na osnovu obelodanjenja u ovom tekstu, stručna osoba će moći da odredi optimalne veznike za upotrebu u specifičnom jedinjenju ili sklopu obelodanjenja, kao što je polipeptid obelodanjenja, opciono posle nekih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0155] Na primer, u multivalentnim jedinjenjima ili polipeptidima obelodanjenja koja sadrže sklopivne blokove, kao što su ISVD ili Nanotela usmerena protiv TNF i drugih ciljeva, dužina i fleksibilnost veznika poželjno su takvi da dozvoljavaju svakom sklopivnom bloku, kao što je ISVD, prema pronalasku koji je prisutan u polipeptidu da se veže za njegovu srodnu metu, npr., antigenu determinantu na svakoj od meta. Ponovo, na osnovu

4

obelodanjenja u ovom tekstu, stručna osoba će moći da odredi optimalne veznike za upotrebu u specifičnom jedinjenju ili sklopu obelodanjenja, kao što je polipeptid iz ovog pronalaska, opciono posle nekih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0156] Takođe se nalazi u obimu obelodanjenja da korišteni veznici daju jedno ili više drugih povoljnih osobina ili funkcionalnosti jedinjenjima ili formulacijama obelodanjenja, kao što su polipeptidi obelodanjenja i/ili pružaju jednu ili više lokacija za formiranje derivata i/ili za vezivanje funkcionalnih grupa (npr., kao što je ovde opisano za derivate ISVD pronalaska). Na primer, veznici koja sadrže jednu ili više naelektrisanih aminokiselina mogu da obezbede poboljšana hidrofilna svojstva, dok veznici koja formiraju ili sadrže male epitope ili oznake mogu se koristiti za svrhe obelodanjenja, identifikaciju i/ili prečišćavanje. Ponovo, na osnovu obelodanjenja u ovom tekstu, stručna osoba će moći da odredi optimalne veznike za upotrebu u specifičnom jedinjenju, polipeptidu ili sklopu obelodanjenja, opciono nakon nekih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0157] Konačno, kada se dva ili više veznika koriste u jedinjenjima ili formulacijama kao što su polipeptidi obelodanjenja, ovi veznici mogu biti isti ili različiti. Ponovo, na osnovu obelodanjenja u ovom tekstu, stručna osoba će moći da odredi optimalne veznike za upotrebu u specifičnom jedinjenju ili sklopu ili polipeptidu obelodanjenja, opciono nakon nekih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0158] Za opšti opis multivalentnih i multispecifičnih jedinjenja i polipeptida koji sadrže jedno ili više Nanotela i njihove pripreme, upućuje se i na Conrath i dr., J. Biol. Chem., Vol.

276, 10.7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; kao i na primer WO 1996/34103, WO 1999/23221, WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0159] Obelodanjenje se takođe odnosi na nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline koje kodiraju sekvence aminokiseline, TNF veziva, polipeptide, fuzione proteine, jedinjenja i formulacije opisane ovde. Obelodanjenje dalje obuhvata genske formulacije koji uključuju prethodne nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline i jedan ili više elemenata za poznate genetičke formulacije same po sebi. Genetski sklop može biti u obliku plazmida ili vektora. Opet, takve formulacije mogu biti generalno opisani u objavljenim patentnim prijavama Ablynx N.V., kao što su na primer WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0160] U jednom aspektu obelodanjenje se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira ISVD, polipeptid, jedinjenje ili sklop prema obelodanjenju.

[0161] U drugom aspektu, obelodanjenje se odnosi na ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema obelodanjenju.

[0162] Obelodanjenje se takođe odnosi na domaćine ili ćelije domaćina koji sadrže takve nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline i/ili koji vrše ekspresiju (ili mogu da vrše ekspresiju) sekvence aminokiselina, TNF veziva, polipeptida, fuzionog proteina, jedinjenja i formulacija opisanih ovde. Opet, takve ćelije domaćina mogu biti generalno opisane u objavljenim patentnim prijavama Ablynx N.V., kao što su na primer WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0163] U jednom aspektu, obelodanjenje se odnosi na domaćina ili ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu prema obelodanjenju, ili ekspresioni vektor prema obelodanjenju.

[0164] Obelodanjenje se takođe odnosi na postupak za pripremu sekvence aminokiseline, TNF veziva, polipeptida, fuzionog proteina, jedinjenja ili sklopa kao što je ovde opisano, a postupak obuhvata kultivaciju ili održavanje ćelije domaćina kao što je ovde opisano pod uslovima u kojima navedena ćelija domaćina proizvodi ili vrši ekspresiju sekvence aminokiseline, TNF veziva, polipeptida, fuzionog proteina, jedinjenja ili sklopa kao što je ovde opisano, a opciono dalje obuhvata izolovanje sekvence aminokiseline, TNF veziva, polipeptida, fuzionog proteina, jedinjenja ili konstruisane tako proizvedene. Opet, takve metode se mogu izvesti kao što je generalno opisano u objavljenim patentnim prijavama Ablynx N.V., kao što je na primer WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0165] U određenom aspektu, obelodanjenje se odnosi na postupak za proizvodnju ISVD prema pronalasku ili na jedinjenje prema opisu ili polipeptidu u skladu sa obelodanjenjem, navedeni postupak najmanje sadrži korake:

1

1. a) vršenje ekspresije u odgovarajućoj ćeliji domaćina ili organizmu domaćina ili u drugom odgovarajućem ekspresionom sistemu sekvencu nukleinske kiseline kako je ovde definisano; opciono prati:

2. b) izolovanje i/ili prečišćavanje ISVD prema pronalasku, jedinjenja prema obelodanjenju ili polipeptida prema obelodanjenju, respektivno.

[0166] Obelodanjenje se takođe odnosi na sastav koji sadrži najmanje jednu sekvencu aminokiselina, TNF vezivo, polipeptid, fuzioni protein, jedinjenje ili sklop kao što je ovde opisano.

[0167] Obelodanjenje se takođe odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži najmanje jednu sekvencu aminokiselina, TNF vezivo, polipeptid, fuzioni protein, jedinjenje ili sklop kao što je ovde opisano, a opciono najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent i/ili katalizator i opciono sadrži jedan ili više dodatnih farmaceutski aktivnih polipeptida i/ili jedinjenja. Takvi preparati, nosači, ekscipijenti i razblaživači mogu generalno biti opisani u objavljenim patentnim prijavama Ablynx N.V., kao što su na primer WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0168] Kada sekvence aminokiselina, TNF veziva, polipeptidi, fuzioni proteini, jedinjenja ili formulacije opisani ovde imaju povećan polu-život, se poželjno daju cirkulaciji. Kao takvi, mogu se primeniti na bilo koji pogodan način koji dozvoljava sekvence aminokiselina, TNF veziva, polipeptide, fuzione proteine, jedinjenja ili sklopa da dospeju u cirkulaciju, kao što je intravenozno davanje, putem injekcije ili infuzije ili na bilo koji drugi pogodan način ( uključujući oralnu primenu, subkutanu primenu, intramuskularnu primenu, primenu preko kože, intranazalnu administraciju, administraciju preko pluća itd.) koji dozvoljava sekvence aminokiselina, TNF veziva, polipeptide, fuzione proteine, jedinjenja ili sklopa da dospeju u cirkulaciju. Odgovarajuće metode i načini primene biće jasni stručnjaku, opet na primer i iz učenja objavljenih patentnih prijava Ablynx N.V., kao što su na primer WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0169] U drugom aspektu, obelodanjenje se odnosi na postupak za prevenciju i/ili tretiranje najmanje jedne bolesti ili poremećaja koji se mogu sprečiti ili tretirati korišćenjem sekvence aminokiseline, TNF veziva, polipeptida, fuzionog proteina, jedinjenja ili konstruisati kao što je ovde opisano, koji metod obuhvata davanje, subjektu kojem je to potrebno, farmaceutski

2

efektivnu količinu sekvence aminokiseline, TNF veziva, polipeptida, fuzionog proteina, jedinjenja ili sklopa prema pronalasku, i/ili farmaceutskog sastava koji sadrži navedeno. Bolesti i poremećaji koji se mogu sprečiti ili tretirati upotrebom polipeptida, fuzionog proteina, jedinjenja ili sklopa kao što je ovde opisano, generalno će biti isti kao i bolesti i poremećaji koji se mogu sprečiti ili tretirati korišćenjem terapeutskog dela koji prisutan je u polipeptidu, fuzionom proteinu, jedinjenju ili sklopu pronalaska. Naročito, predmetno obelodanjenje se odnosi na jedinjenje, sastav, sklop, polipeptid, TNF vezivo ili ISVD kao što je ovde opisano za upotrebu kao lek.

[0170] U kontekstu ovog pronalaska, termin „prevencija i/ili tretman” ne obuhvata samo sprečavanje i/ili tretiranje bolesti, već i generalno obuhvata sprečavanje pojave bolesti, usporavanje ili promenu napretka bolesti, sprečavanje ili usporavanje početka jednog ili više simptoma povezanih sa bolesti, smanjenje i/ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolesti, smanjivanje ozbiljnosti i/ili trajanja bolesti i/ili bilo kakvih simptoma povezanih s njom i/ili sprečavanje daljeg povećanja ozbiljnosti bolesti i/ili bilo kakvih simptoma povezanih s njim, sprečavanje, smanjenje ili promenu bilo koje fiziološke štete prouzrokovane bolešću, i generalno bilo koje farmakološko dejstvo koje je korisno za pacijenta koji se leči. Sastav obelodanjenja ne treba da utiče na potpuno tretiranje, ili iskorenjivanje svakog simptoma ili ispoljavanja bolesti, da bi predstavljalo održivo terapeutsko sredstvo. Kao što je prepoznato u odgovarajućem polju, lekovi koji se koriste kao terapeutski agensi mogu smanjiti ozbiljnost datog stanja bolesti, ali ne moraju ukinuti svaku manifestaciju bolesti da bi se smatrali korisnim terapijskim agensima. Slično tome, profilaktički primenjeni tretiranje ne mora biti potpuno efikasan u sprečavanju nastanka stanja kako bi se postigao održivi profilaktički agens. Jednostavno smanjivanje uticaja bolesti (na primer, smanjenjem broja ili ozbiljnosti njegovih simptoma ili povećanjem efikasnosti drugog tretmana ili stvaranjem drugog korisnog efekta), ili smanjivanje verovatnoće da će bolest nastati ili pogoršati u subjektu, je dovoljno.

[0171] U jednom aspektu, indikacija da je terapeutski efikasna količina preparata davana pacijentu, je trajno poboljšanje u odnosu na osnovnu vrednost indikatora koji odražava težinu određenog poremećaja. Farmaceutski sastavi ovog prikaza sadrže terapeutski efikasnu količinu ISVD, jedinjenja ili polipeptida predmetnog obelodanjenja formulisani zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenata. Prema „terapeutski efikasnoj količini” ISVD, jedinjenje ili polipeptid obelodanjenja podrazumeva količinu sastava koje daje terapeutski efekat prema tretiranom subjektu, uz razumni odnos koristi/rizika koji se primenjuje na bilo koji medicinski tretman. Terapeutski efekat je dovoljan da se „tretira” pacijent, kao što se taj pojam koristi ovde.

[0172] U jednom otelotvorenju, ovo obelodanjenje se odnosi na sastave, sklop, jedinjenje, TNF vezivo, ISVD ili polipeptid kao što je ovde opisano, za upotrebu pri tretiranju bolesti i/ili poremećaja digestivnog trakta.

[0173] U jednom otelotvorenju, predmetno obelodanjenje se odnosi na sastav, sklop, jedinjenje, TNF vezivo, ISVD ili polipeptid kao što je ovde opisano, pri čemu je navedena bolest i/ili poremećaj digestivnog trakta inflamatorna bolest creva (IBD), sindrom iritabilnog creva, Kron-ova bolest, ulcerozni kolitis, mukozitisa, aftozni stomatitis, celiakije, traume digestivnog trakta i kancera digestivnog trakta.

[0174] Pacijenti sa sindromom iritabilnog creva imaju promenu intestinalne permeabilnosti uprkos tome što imaju malo ili nemaju uočljive histološke promene u crevima (Dunlop Am J Gastroenterol 2006 Jun, 101 (6): 1288-94). Pacijenti sa celiakijom imaju promenjenu intestinalnu propustljivost i karakteristična oštećenja na resicama tankog creva koja se mogu razlikovati od IBD. Smatra se da je inflamatorna bolest creva posledica disregulisanog imunološkog odgovora započetog interakcijama mikrobiološkog domaćina. Imuni sistem reaguje na nepatogene komensalne bakterije koje stvaraju hroničnu upalu. Slično tome, kod nekrotizujućeg enterokolitisa, naglašeni nerazvijeni imunološki sistem stvara neodgovarajući odgovor na normalne crevne bakterije, izazivajući potencijalno fatalan oblik kolitisa (Jilling et al, 2006, J Immunol, 177, 3273-82).

[0175] Subjekat koji se tretira može biti bilo koja toplokrvna životinja, ali je naročito sisar, a naročito čovek. Kao što će biti jasno stručnjaku, subjekat koji se tretira posebno će biti osoba koja je pri riziku od bolesti i poremećaja pomenutih u ovom tekstu.

[0176] U još jednom otelotvorenju, obelodanjenje se odnosi na postupak za imunoterapiju, a naročito za pasivnu imunoterapiju, čiji postupak obuhvata davanje, subjektu koji boluje od ili je u riziku od pomenutih bolesti i poremećaja, farmaceutski aktivne količine sekvence aminokiseline, TNF veziva, polipeptida, fuzionog proteina, jedinjenja ili sklopa obelodanjenja, i/ili farmaceutski sastavi koja sadrži istu.

4

[0177] Sekvenca aminokiselina, TNF vezivo, polipeptid, fuzioni protein, jedinjenje ili sklop i/ili sastavi koji se sastoje od njih daju se prema režimu tretiranja koji je pogodan za sprečavanje ili tretiranje bolesti ili poremećaja koji treba sprečiti ili tretirati. Lekar će generalno biti u mogućnosti da odredi odgovarajući režim tretiranja, u zavisnosti od faktora kao što je bolest ili poremećaj koji treba sprečiti ili tretirati, težinu bolesti koju treba tretirati i/ili težinu njegovih simptoma, specifičnu sekvencu aminokiselina, TNF vezivo, polipeptid, fuzioni protein, jedinjenje ili sklop obelodanjenja koja će se koristiti, specifični način primene i farmaceutska formulacija ili sastav koji se koristi, starost, pol, težina, dijeta, opšte stanje pacijenta i slični faktori dobro poznati lekaru.

[0178] Generalno, režim tretiranja će obuhvatiti primenu jedne ili više sekvenci aminokiseline, TNF veziva, polipeptida, fuzionih proteina, jedinjenja ili formulacija obelodanjenja ili jednog ili više sastava koji sadrže istu, u jednoj ili više farmaceutski efikasnih količina ili doza. Specifičnu količinu ili dozu koju treba primenjivati može odrediti lekar, ponovo na osnovu gore navedenih faktora.

[0179] Generalno, za prevenciju i/ili tretiranje bolesti i poremećaja ovde pomenutih i u zavisnosti od specifične bolesti ili poremećaja koji treba tretirati, potencijal i/ili polu-život specifičnih fuzionih proteina ili formulacija koji se koriste, specifični način primene i specifična farmaceutska formulacija ili sastav koji se koristi, sekvence aminokiseline, TNF veziva, polipeptidi, fuzioni proteini, jedinjenja ili formulacije obelodanjenja će se generalno davati u količini između 1 grama i 0.01 mikrograma po kg telesne mase dnevno, poželjno između 0.1 grama i 0.1 mikrograma po kg telesne mase dnevno, kao što je oko 1, 10, 100 ili 1000 mikrograma po kg telesne težine dnevno, ili kontinuirano (npr., infuzijom), kao pojedinačna dnevna doza ili kao višestruka podeljena doza okom dana. Lekar će generalno biti u stanju da odredi odgovarajuću dnevnu dozu, u zavisnosti od faktora koji su ovde navedeni. Takođe će biti jasno da u određenim slučajevima lekar može odlučiti da odstupi od ovih iznosa, na primer, na osnovu gore navedenih faktora i njegovog stručnog mišljenja. Uopšteno govoreći, neke smernice o količinama koje treba primeniti mogu se dobiti iz količina koja se obično primenjuju za uporediva konvencionalna antitela ili fragmente antitela protiv istog cilja koji se primenjuje putem suštinski iste rute, uzimajući u obzir ipak razlike u afinitetu/avidnosti, efikasnosti, biodistribuciji, polu-život i slični faktori dobro poznati stručnjaku.

[0180] Obično u gore navedenom postupku će se koristiti pojedinačna sekvenca aminokiselina, TNF vezivo, polipeptid, fuzioni protein, jedinjenje ili sklop obelodanjenja. Međutim, u okviru obelodanjenja koriste se dve ili više sekvenci aminokiseline, TNF veziva, polipeptidi, fuzioni proteini, jedinjenja ili formulacije obelodanjenja u kombinaciji.

[0181] Sekvence aminokiseline, TNF veziva, polipeptidi, fuzioni proteini, jedinjenja ili formulacije obelodanjenja mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih farmaceutski aktivnih jedinjenja ili principa, npr., kao kombinovani režim tretmana koji može ili ne može dovesti na sinergijski efekat. Opet, lekar će moći da odabere takva dodatna jedinjenja ili principe, kao i odgovarajući kombinovani režim tretmana, na osnovu gore navedenih faktora i njegovog stručnog mišljenja.

[0182] Konkretno, sekvence aminokiselina, TNF veziva, polipeptidi, fuzioni proteini, jedinjenja ili formulacije obelodanjenja mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima ili principima koji se mogu ili mogu koristiti za prevenciju i/ili tretiranje bolesti i poremećaja koji mogu biti sprečeni ili tretirani sa sekvencama aminokiselina, TNF veziva, polipeptida, fuzionih proteina, jedinjenja ili sklopa obelodanjenja, a kao rezultat toga sinergijski efekat može ili ne može biti dobijen.

[0183] Efikasnost režima tretiranja koji se primenjuje u skladu sa obelodanjenjem može se odrediti i/ili pratiti na bilo koji način poznat po sebi za bolest ili poremećaj koji je uključen, što će biti jasno lekaru. Lekar će takođe, ukoliko je to pogodno, ili od slučaja do slučaja, moći da promeni ili modifikuje određeni režim tretiranja, kako bi se postigao željeni terapeutski efekat, kako bi se izbegli, ograničili ili smanjili neželjeni efekti i/ili da postignu odgovarajuću ravnotežu između postizanja željenog terapeutskog efekta s jedne strane i izbegavanja, ograničavanja ili smanjenja neželjenih efekata sa druge strane.

[0184] Uopšteno gledano, režim tretiranja će se pratiti sve dok se ne postigne željeni terapeutski efekat i/ili dokle god se želi održati željeni terapeutski efekat. Opet, to može odrediti lekar.

[0185] Kao sekvence aminokiselina, TNF veziva, polipeptidi, fuzioni proteini, jedinjenja ili formulacije obelodanjenja su sposobni da se vezuju za TNF, oni se mogu naročito koristiti za prevenciju i tretiranje bolesti ili poremećaja koji mogu biti tretirani drugim biološkim lekovima (poput antitela, na primer adalimumab/HUMIRA ™ ili Infliximab/REMICADE ™) koji su sposobni za vezivanje za TNF i/ili modulaciju TNF. Takve bolesti i poremećaji će biti jasni stručnjaku. TNF veziva prema pronalasku mogu se naročito koristiti za prevenciju i tretiranje bolesti i poremećaja navedenih u WO 2004/041862 i WO 2006/122786.

[0186] Kao što je pomenuto, jedan specifičan aspekt obelodanjenja se odnosi na TNF veziva prema pronalasku koja su u monovalentnom obliku. Ova monovalentna TNF veziva pronalaska su posebno pogodna za topikalne primene (uključujući primene na koži, u GI traktu ili pluća) i/ili za lokalnu primenu (npr., na kožu), oralno davanje (npr., u GI trakt), primenu kao supozitorija (opet, npr., u GI trakt) i/ili za plućnu primene (npr., inhalacijom). Kao takva, mogu se koristiti za prevenciju i/ili tretiranje bolesti i poremećaja kože, pluća ili GI trakta koji se mogu sprečiti ili tretirati primenom TNF inhibitora na kožu, pluća ili GI trakt (npr., kao inflamatorne i/ili autoimune bolesti koje utiču na kožu, pluća ili GI trakt).

[0187] U jednom otelotvorenju, predmetno obelodanjenje se odnosi na sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD kao što je ovde opisano, pri čemu se sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD primenjuju lokalno na digestivni trakt.

[0188] U jednom otelotvorenju, predmetno obelodanjenje se odnosi na sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD kao što je ovde opisano, pri čemu se sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD daju oralno u doznom obliku pogodnom za oralno davanje gastrointestinalnog trakta (GI).

[0189] U jednom otelotvorenju, predmetno obelodanjenje se odnosi na sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD kao što je ovde opisano, pri čemu se sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD primenjuju u doznom obliku za oralno davanje GI trakt pri čemu je dozni oblik izabran iz tableta, kapsula, praškasta pilula, granula, emulzija, mikroemulzija, rastvora, suspenzija, sirup i eliksir.

[0190] U jednom otelotvorenju, predmetno obelodanjenje se odnosi na sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD kao što je ovde opisano, pri čemu sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD se rektalno primenjuju za tretiranje bolesti ili poremećaja digestivnog trakta.

[0191] U jednom otelotvorenju, predmetno obelodanjenje se odnosi na sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD kao što je ovde opisano, gde se sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD administriraju rektalno u doznom obliku za rektalnu primenu, poželjno izabranu iz supozitorija i klistira.

[0192] U jednom otelotvorenju, predmetno obelodanjenje se odnosi i na sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD kao što je ovde opisano, pri čemu sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD se primenjuju parenteralno subkutanim injekcijama, intrakutanom injekcijom, intravenoznom injekcijom, intramuskularnom injekcijom, intralesionalnom injekcijom ili tehnikama infuzije.

[0193] Neki specifični, ali neograničavajući primeri takvih bolesti i poremećaja su bolesti ili poremećaji GI trakta, kao što su inflamatorna bolest creva (Kron-ova bolest), sindrom iritabilnog creva, ulcerozni kolitis, mukozitis, aftozni stomatitis, celiakija, trauma varenja trakta i/ili kancer digestivnog trakta. Kao što je pomenuto, kada se koriste u ove svrhe, monovalentna TNF veziva prema pronalasku poželjno imaju D (ili E1D) mutaciju na poziciji 1 i C-terminalno produženje (kao što je C-terminalni alanin) i TNF veziva SEQ ID br.: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63 i 65-66 posebno SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64 i 69, naročito SEQ ID NO: 40 su poželjni primeri TNF veziva prema pronalasku koji su posebno pogodni za ove svrhe.

[0194] Prema tome, u sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na TNF vezivo prema pronalasku (kao što je ovde opisano), koje je u suštini u monovalentnom obliku (i to poželjno kao D ili E1D mutacija na poziciji 1 i C-terminalni nastavak kao što je C -terminal alanin) za primenu pri prevenciji i tretiranju bolesti i poremećaja kože, pluća ili GI trakta, a naročito pri prevenciji i tretiranju inflamatornih i/ili autoimunih bolesti koje pogađaju kožu, pluća ili GI trakt. Pomenuto TNF vezivo je SEQ ID NO: 40.

[0195] Pronalazak se takođe odnosi na TNF vezivo prema pronalasku (kako je ovde opisano) koji je u suštini u monovalentnom obliku (i to poželjno kao D ili E1D mutacija na poziciji 1 i C-terminalni nastavak, kao što je C-terminalni alanin) za upotrebu pri prevenciji i tretiranju bolesti ili poremećaja GI trakta, kao što je inflamatorna bolest creva (IBD) Kron-ova bolest, sindrom iritabilnog creva, ulcerativni kolitis, mukozitis, aftozni stomatitis, celiakova bolest, trauma digestivnog trakta i/ili kancer digestivnog trakta, posebno IBD i Kron-ova bolest. Ponovo, pomenuto TNF vezivo je SEQ ID NO: 40.

[0196] Obelodanjenje se odnosi i na farmaceutski sastav koji je namenjen za (i/ili prikladnu za) topikalnu primenu na koži, primenu inhalacijom ili drugim davanjem u pluća i/ili oralnu primenu, rektalnu administraciju ili drugačije davanje u GI trakt, koje obuhvata TNF vezivo prema pronalasku koji je u suštini u monovalentnom obliku (i to poželjno kao D ili E1D mutacija na poziciji 1 i C-terminalni nastavak, kao što je C-terminalni alanin). Ponovo, pomenuto TNF vezivo je poželjno izabrano iz grupe koju čine 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63 i 65-68, posebno SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64 i 69, naročito SEQ ID NO: 40.

Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu TNF veziva prema pronalasku koje je u suštini u monovalentnom obliku (i koji poželjno ima D ili E1D mutaciju na poziciji 1 i C-terminalni nastavak, kao što je C-terminalni alanin) u postupku za sprečavanje ili tretiranje bolesti ili poremećaja kože subjekta kome je potreban takvog tretmana.

[0197] Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu TNF veziva prema pronalasku koja su u suštini u monovalentnom obliku (i koji poželjno ima D ili E1D mutaciju na poziciji 1 i C-terminalni nastavak, kao što je C-terminalni alanin) u postupku za sprečavanje ili tretiranje bolesti ili poremećaja kože, subjekta kome je potreban takvim tretmanom.

[0198] Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu TNF veziva prema pronalasku koja su u suštini u monovalentnom obliku (i koji poželjno ima D ili E1D mutaciju na poziciji 1 i C-terminalni nastavak, kao što je C-terminalni alanin) u postupku za sprečavanje ili tretiranje bolesti ili poremećaja GI trakta, kao što je inflamatorna bolest creva (IBD) Kron-ova bolest, sindrom iritabilnog creva, ulcerativni kolitis, mukozitis, aftozni stomatitis, celiakova bolest, trauma digestivnog trakta i/ili kancera digestivnog trakta, posebno IBD ili Kron-ova bolest, subjekta koji je potreban takvog tretmana.

[0199] Kao što je ranije pomenuto, na mestima upale često je kompromitovana mukozna barijera digestivnog trakta, zbog koje oralno davani proteini mogu ući u creva i sistemsku cirkulaciju. U jednom otelotvorenju, pronalazak se odnosi i na sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD kao što je ovde opisano, pri čemu sastav, jedinjenje, sklop, TNF vezivo, polipeptid ili ISVD dođe do crevnih tkiva i sistemske cirkulacije pacijenta.

[0200] Drugi aspekti, otelotvorenja, prednosti i primene pronalaska postaće jasni iz daljeg opisa u ovom tekstu.

[0201] Pronalazak će se dalje opisati pomoću sledećih neograničavajućih preferiranih aspekata, primera i slika, u kojima:

• Slika 1 je tabela koja prikazuje neke pozicije aminokiselina koje će ovde biti specificirane i njihovo numerisanje prema nekim alternativnim sistemima numeracije (kao što su Aho i IMGT);

• Slika 2 prikazuje poravnanje SEQ ID NO: 1, 59 i 58;

• Slika 3 navodi ovde pomenute sekvence aminokiselina;

• Slika 4 prikazuje poravnanje SEQ ID NO: 1, 8 do 41 i 58;

• Slika 5 prikazuje poravnanje SEQ ID NO: 1, 31 i 36 do 41;

• Na Slici 6 prikazane su dve odgovarajuće tačke podataka dobijene u Primeru 1 kada su uzorci 96 seruma (66 od zdravih ispitanika ljudi i 30 osoba iz SLE pacijenata) testirani na vezivanje za sledeće sekvence aminokiselina: SEQ ID NO: 58 (sa K108L mutacijom), Referenca A, Referenca A (L11V, V89L) -Ala, Referenca A (L11V, A74S, V89L) -Ala i Referenca A (L11V, S49A, V89L) -Ala. Svaka tačka predstavlja nivo vezivanja za jedan od ispitanih 96 uzoraka. Tačke podataka prikazane na desnom i levom panelu su iste; u desnom panelu, tačke podataka izmerene sa svakim pojedinačnim uzorkom za svako od testiranih jedinjenja (npr., do SEQ ID NO: 58 (K108L), Referenca A, Referenca A (L11V, V89L) -A, Referenca A (L11V, A74S, V89L) -A i Referenca A (L11V, S49A, V89L) -A) povezane su pomoću linije (kao rezultat, deklinacija linije daje indikaciju stepena do kojeg je vezivanje već postojećih antitela smanjeno kada se uvedu mutacije pronalaska i C-terminalni alanin);

• Slika 7 je tabela koja sadrži podatke vezivanja (5 kolona koja daju normalizovane nivoe vezivanja PreAb (RU na 125 sekundi) i 4 kolone koji daju procenat smanjenja PreAb vezivanja u poređenju sa referentnim tačkama podataka sa Slike 6.

• Slika 8 mesta cepanja (A) Predviđenog („P”) i Eksperimentalno („E”) određenog tripsina i himotripsin A016600015 sekvence. (B) A016600015 analiza na Coomassie obojenom SDS PAGE gelu. (C) Primer rezultata analize triptičnog razlaganja putem RPC LC-MS iz A016600015 sekvence.

• Slika 9 šematski prikaz SHIME modela.

• Slika 10 konkurentni FACS na HEK293 H-mTNF ćelijama tretiranim sa Enbrelom (EC30 = 0.02 nM; panel A) i Enbrelom (EC90 = 0.2 nM; panel B). IRR000027 = irelevantno Nanotelo.

• Slika 11 prikazuje rezultate ekspresije A016600021, A016600039 i A016600040 na 12% NuPage Bis-Tris gelu pod ne-redukovanim uslovima, primenjeno je 5 ml uzorka. Trake su sledeće: (1) A016600021; (2) A016600039; (3) A016600040; (4) nerelevantni komparator; (5) nerelevantni komparator; (6) Precision Plus Protein Standard (BioRad); (7) Standard 0.5µg; (8) Standard 1.5µg; (9) Standard 2.5µg.

PRIMERI

[0202] Predmetni pronalazači pokušali su da optimizuju sekvencu aminokiselina („Optimizacija sekvence”) TNF-veziva. U ovom slučaju, TNF-veziva namenjena su za oralnu primenu, zbog čega bi TNF-veziva trebalo poželjno da imaju stabilnu proteazu. Štaviše, u procesu optimizacije sekvence takođe je namenjeno (1) humanizirati TNF-veziva; (2) izbaciti potencijalne epitope već postojećih antitela; kao i (3) izbacivanje mesta za post-translacijske modifikacije (PTM). Istovremeno, ove karakteristike treba uskladiti sa funkcionalnim karakteristikama TNF-veziva, npr., inhibiranje TNFα, koje bi poželjno bilo približno isto ili čak poboljšano.

Primer 1: Proizvodnja Nanotela u Pichia pastoris i prečišćavanje preko protein-A veziva

[0203] Pichia pastoris X33 ćelije koje sadrže formulacije anti-TNFα Nanotela su gajene (30°C, 250 rpm) 24 ploča sa otvorima (24 mL) u BGCM citratnom puferu. Posle dva dana, medijum je prebačen u pufer koji sadrži metanol (BMCM citrat) kako bi izazvao ekspresiju. Svež metanol redovno se dodaje kako bi se nadoknadila potrošnja metanola i isparavanje, i medijum je sakupljen nakon dva dana. Nanotela su prečišćena sakupljanjem na protein-A koloni (Poros) ili MEP Hypercel (Pall), nakon čega su eluirana u glicin puferu prema uputstvima proizvođača. Nanotela su zatim desalinirana prema PBS koristeći Zebaspin 2 mL kolonu (Pierce). Frakcije su koncentrovane korišćenjem VivaSpin kolone (MVCO 5000, PES). Koncentracije frakcija Nanotela merene su pomoću Trinean Dropsense. Koncentracija je zasnovana na OD280 merenju sa normalizacijom za OD340 vrednosti. Prečišćenost i integritet Nanotela potvrđeni su SDS-PAGE i MS analizom upotrebom HPLC sistema reverzne faze spojenog sa masenim spektrometrom ESI-Q-TOF (Q-TOF Ultimate (Waters).

Primer 2: Humanizacija

1

[0204] Proteinske sekvence TNF-veziva prema predmetnom pronalasku na kraju su dobijene od lama i delimično se razlikuju od homolognih antitela koja se javljaju prirodno kod ljudi. Prema tome, ova TNF-veziva potencijalno su imunogena kada se primenjuju kod ljudi.

[0205] Generalno, u svrhu humanizacije, sekvence Nanotela čine se homolognije na ljudskoj germinativnoj konsenzusnoj sekvenci. Sa izuzetkom ostataka sa „žigom” Nanotela, specifične aminokiseline u okvirnim regionima koje prave razliku između Nanotela i ljudske germinativne koncenzusne sekvence, izmenjene su na ljudski deo tako da je struktura, aktivnost i stabilnost proteina nepromenjena.

[0206] U ovom slučaju, nakon usklađivanja sa bazom podataka o germinativnom V genu, DP51 je identifikovan da ima najveću homologiju sa SEQ ID NO:58. Sve moguće permutacije detaljno su izložene u pogledu izmenjivanja roditeljske sekvence Nanotela koje su više usklađene sa ljudskom DP51 germinativnom konsenzusnom sekvencom, dok su se poželjno druga svojstva Nanotela održavala nepromenjena ili su ta svojstva čak poboljšana.

[0207] Na kraju je ukupno 12 ostataka aminokiselina uvedeno u SEQ ID NO:58: 1E, 14P, 27F, 29F, 40A, 49S, 73N, 75K, 78L, 82aN, 83R i 108L. Naročito su, Q27F i S29F deo CDR1, ali nisu uticali na vezivanje (cf. SEQ ID NO: 1; podaci nisu prikazani).

Primer 3: Smanjenje vezivanja prethodno postojećih antitela

3.1 Eksperimentalni deo

[0208] Ljudski uzorci korišćeni u Primeru 3.2 ispod su ili dobijeni iz komercijalnih izvora ili iz ljudskih volontera (nakon što su dobijene sve saglasnosti i potvrde) i korišćeni su u skladu sa primenljivim legalnim i regulatornim zahtevima (uključujući ali ne ograničavajući se na one koji se tiču medicinske tajne i privatnosti pacijenta).

[0209] U primeru 3.2 ispod, ukoliko eksplicitno nije drugačije naznačeno, vezivanje prethodno postojećih antitela koja su prisutna u korišćenim uzorcima (npr., iz zdravih volontera, reumatoidnog artritisa i SLE pacijenata) za testirana Nanotela određeno je upotrebom ProteOn kao što sledi:

Nanotela su dobijena ili iz serum albumina ili putem FLAG3 oznake upotrebom monoklonskom anti-FLAG M2.

2

[0210] U slučaju vezivanja prethodno postojećih Nanotela za Nanotela dobijena u ljudskom serum albuminu (HSA) procenjivanje je izvršeno upotrebom ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). PBS/Tween (fosfatno puferisan fiziološki rastvor, pH7.4, 0.005% Tween20) je korišćen kao radni pufer i eksperimenti su izvršeni pri 25°C. Ligand trake senzorskog čipa ProteOn GLC su aktivirane sa EDC/NHS (protok 30µl/min) i HSA je injektiran pri 10µg/ml u ProteOn acetatni pufer pH4.5 (protok 100µl/min) kako bi načinio nivoe imobilizacije približno 3200 RU. Nakon imobilizacije, površine su deaktivirane sa etanolamin HCL (protok flow rate 30µl/min). Nanotela su injektirana tokom 2 minuta pri 45µl/min preko HSA površine kako bi načinili nivoe sakupljanja Nanotela približno 200 RU. Uzorci koji su sadržali prethodno postojeća antitela su centrifugirana tokom 2 minuta pri 14,000rpm i supernatant je razređen 1:10 u PBS-Tween20 (0.005%) pre nego što je injektiran 2 minuta pri 45µl/min što je praćeno sa korakom disocijacije od 400. Nakon svakog ciklusa (npr., pre novog sakupljanja Nanotela i koraka injektiranja uzorka krvi) HSA površine su regenerisane sa dvominutnom injekcijom HCl (100mM) pri 45µl/min. Procesiranje senzograma i analiza podataka izvršena je sa ProteOn Manager 3.1.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Senzogrami koji su pokazivali vezivanje prethodno postojećih antitela dobijeni su nakon dvostrukog referenciranja oduzimanjem 1) HSA-Nanotela disocijacije i 2) nespecifičnog vezivanja za referentnu ligand traku. Nivoi vezivanja prethodno postojećih antitela određeni su postavljanjem kontrolnih tačaka na 125 sekundi (5 sekundi nakon kraja asocijacije). Procenat redukcije u vezivanju prethodno postojećim antitelima je izračunat relativno u odnosu na nivoe vezivanja na 125 sekundi referentnog Nanotela.

[0211] U slučaju vezivanja prethodno postojećih antitela sa FLAG-označenim Nanotelima sakupljanje na monoklonskim anti-FLAG M2 (sigma) procenjeno je upotrebom ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). PBS/Tween (fosfatno puferisan fiziološki rastvor, pH7.4, 0.005% Tween20) korišćen je kao radni pufer i eksperimenti su izvršeni pri 25°C. Ligand trake senzorskog čipa ProteOn GLC su aktivirane sa EDC/NHS (protok 30µl/min) i anti-FLAG M2 mAb je injektiran pri 10µg/ml u ProteOn acetatnom puferu pH4.5 (protok 100µl/min) kako bi se načinio nivo imobilizacije približno 4000 RU. Nakon imobilizacije, površine su deaktivirane sa etanolamin HCl (protok 30µl/min). Nanotela su injektirana tokom 2 minuta sa 45µl/min preko anti-FLAG M2 površine kako bi načinili nivo sakupljanja Nanotela približno RU. Kako bi se smanjilo ne-specifično vezivanje uzoraka krvi za anti-FLAG M2 površinu 100 nM 3xFLAG peptida (Sigma je dodata uzorcima krvi. Uzorci koji su sadržali prethodno postojeća antitela su centrifugirana tokom 2 minuta pri 14,000rpm i supernatant je razblažen 1:10 u PBS-Tween20 (0.005%) pre nego što su injektirana tokom 2 minuta pri 45µl/min i što je praćeno sa korakom disocijacije od 600 sekundi. Nakon svakog ciklusa (npr., pre koraka sakupljanja Nanotela i injektiranja uzoraka krvi) anti-FLAG M2 površine su regenerisane injekcijom Glicin pH1.5 (10nM) u trajanju od 10 sekundi pri 150µl/min. Procesiranje senzograma i analiza podataka izvršeni su sa ProteOn Manager 3.1.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Senzogrami koji su pokazivali vezivanje prethodno postojećih antitela dobijeni su nakon dvostrukog referenciranja oduzimanjem 1) disocijacije antitelaanti-FLAG M2 i 2) ne-specifičnog vezivanja za referentnu ligand traku. Nivoi vezivanja prethodno postojećih antitela određeni su postavljanjem kontrolnih tačaka na 125 sekundi (5 sekundi nakon kraja asocijacije). Procenat redukcije u vezivanju prethodno postojećim antitelima je izračunat relativno u odnosu na nivoe vezivanja na 125 sekundi referentnog Nanotela

3.2: Uvođenje mutacija prema pronalasku u Referenci A (SEQ ID NO: 1) dovodi do smanjenja u vezivanju prethodno postojećih antitela.

[0212] Korišćene su sledeće sekvence aminokiselina: SEQ ID NO: 58 (sa Q108L mutacijom), Referenca A, Referenca A (L11V, V89L)-Ala, Referenca A (L11V, A74S, V89L)-Ala i Referenca A (L11V, S49A, V89L)-Ala, sve sa N-terminalnom HIS6-FLAG3 oznakom (SEQ ID NO: 42). Ova Nanotela testirana su na vezivanje pomoću prethodno postojećih antitela koja su prisutna u uzorcima od 96 uzoraka seruma od zdravih ljudskih volontera. Jedinjenja su uhvaćena upotrebom FLAG-oznake i vezivanje je izmereno upotrebom ProteOn u skladu sa protokolom koji je dat u preambuli ovog Eksperimentalnog dela.

[0213] Rezultati su prikazani na Slici 6. Slika 7 prikazuje rezultate svakog uzorka koji formira jednu od tačaka podataka na Slici 6.

[0214] Može se videti da za većinu od 96 testiranih uzoraka, uvođenje mutacija u skladu sa pronalaskom dovodi do smanjenja u vezivanju prethodno postojećih antitela, gde je nivo smanjenja generalno zavisan od nivoa pri kojem su prethodno postojeća antitela u svakom uzorku bila u stanju da se veži sa Referencu A.

Primer 4: Procenjivanje hemijske stabilnosti

[0215] Hemijska stabilnost raznih humanizovanih i/ili optimizovanih Nanotela procenjena je putem prisiljene oksidacije i testa temperaturnog opterećenja.

4

[0216] Napravljeno je novo referentno jedinjenje, npr., A016600015 (SEQ ID NO: 61). Ovo novo referentno jedinjenje je usklađenije sa pretpostavljenim kliničkim kandidatima, i stoga omogućava bolje procenjivanje uticaja mutacija. A016600015 je identično sa Referencom A (SEQ ID NO: 1) osim C-terminalnog Alanina i Aspartata na ostatku aminokiseline 1. C-terminalni Ala je uveden u pogledu smanjenja PEA u skladu sa WO 2012/175741 (cf. Primer 3). N-terminalni Glutamat je zamenjen sa Asparatom na ostatku aminokiseline 1 nakon procenjivanja formacije piroglutamata. Aktivnost novog referentnog A016600015 virtuelno je identično sa Referencom A (podaci nisu prikazani). Ovo novo jedinjenje A016600015 je dalje korišćeno u primerima kao referentno jedinjenje ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0217] Na osnovu rezultata iz Primera 3, anti-PEA mutacije L11V i V89L su uvedene (između ostalih) u poređenju sa novim referentnim jedinjenjem A016600015, što se ispoljilo u A016600018 (SEQ ID NO: 37) i A016600019 (SEQ ID NO: 38). Sekvence su prikazane na Slici 3.

4.1 Stabilnost pri prisiljenoj oksidaciji

[0218] Uzorci Nanotela referentnog jedinjenja A016600015 (1 mg/ml) izloženi su četiri sata na sobnoj temperaturi i u mraku 10 mM H2O2u PBS, u paraleli sa kontrolnim uzorcima bez H2O2, što je praćeno sa promenom pufera sa PBS upotrebom Zeba rotirajućih kolona za desalinaciju (0.5 ml) (Thermo Scientific). Opterećeni i kontrolni uzorci su zatim analizirani pomoću RPC na serijama 1200 ili 1290 mašine (Agilent Technologies) preko Zorbax 300SB-C3 kolone (Agilent Technologies) pri 70 °C. Oksidacija Nanotela je kvantifikovana određivanjem % oblasti vrha prethodnih vrhova koji su se pojavili kao rezultat oksidacionog opterećenja, u poređenju sa glavnim vrhom proteina.

[0219] Nisu zapažene varijante referentnog jedinjenja A016600015 (podaci nisu prikazani) u uzorcima koji su opterećeni oksidacijom.

4.2 Stabilnost pri temperaturnom opterećenju

[0220] Uzorci Nanotela (1-2 mg/ml) skladišteni su u PBS tokom 4 nedelje na -20 °C (negativna kontrola) 20 i 40 °C. Nakon ovog inkubacionog perioda, Nanotela su razložena sa Trypsin ili LysC. Peptidi opterećenih i kontrolnih uzoraka su zatim analizirani pomoću RPC na serijama 1290 mašine (Agilent Technologies) preko Acquity UPLC BEH300-C18 kolone (Agilent Technologies) na 60 °C. Kolona je povezana za Q-TOF maseni spektrometar (6530 Accurate Mass Q-TOF (Agilent)). Integracija mape peptida UV 214 nm ili EIC (Ekstrahovani jonski hromatogram) hromatogrami omogućavaju pouzdanu kvantifikaciju date modifikacije.

[0221] Samo pri 40 °C neke izomerizacije i piro-glutamat varijante su zapažene. Naročito, ostaci aminokiseline 54D, koji se nalaze u izloženog sredini CDR2 i potencijalno podložni izomerizaciji, pokazali su praktično nikakvu izomerizaciju. Izomerizacija ostataka aminokiseline 1 je nedopustiva ukoliko su Nanotela držana na ili ispod 25 °C tokom produženog vremenskog perioda.

4.3 Temperature topljenja preko testa termalne promene (TSA)

[0222] Temperatura topljenja Nanotela je mera njihove biološke stabilnosti.

[0223] Temperature topljenja raznih Nanotela procenjene su pomoću testa termalne promene (TSA) suštinski prema Ericsson i dr.2006 (Anals of Biochemistry, 357: 289-298). Ukratko, 5 µl prečišćenih monovalentnih Nanotela (800 µg/ml) inkubirano je sa 5 µL fluorescentne sonde Sypro Orange (Invitrogen, S6551) (krajnja koncentracija 10 x) u 10 µL pufera (100 mM fosfat, 100 mM borat, 100 mM citrat, 115 mM NaCl, puferisani pri različitim pH u rasponu od 3.5 do 9). Uzorci su zagrejani u mašini LightCycler 480II (Roche), od 37 do 99 °C pri brzini od 4.4 °C/s, nakon čega su ohlađeni do 37 °C pri brzini 0.03 °C/s. Nakon toplotno-uzrokovanog razvijanja, hidrofobni slojevi proteina su izloženi za koje se vezuje Spyro Orange što se ispoljava u povećanju intenziteta fluorescencije (Ex/Em = 465/580 nm). Tačka infleksije prvog izvoda krive intenziteta fluorescencije služi kao mera temperature topljenja (Tm).

[0224] Referentno jedinjenje A016600015 (SEQ ID NO: 61) je upoređeno sa A016600018 (SEQ ID NO: 37) i A016600019 (SEQ ID NO: 38). Za razliku od A016600015, oba A016600018 i A016600019 sadrže anti-PEA mutacije L11V i V89L prema Primeru 3.

[0225] Rezultati su prikazani u Tabeli 4.3

Tabela 4.3

[0226] Kao što se može videti iz Tabele 4.3, anti-PEA mutacije su pokazale da ili nemaju efekat na Tm (A016600018) ili imaju negativni efekat na Tm (A016600019). Naročito, razlika između A016600018 („00018”) i A016600019 („00019”) je 78L i 78V, respektivno. Uopšteno, bilo koji efekti ove razlike u ostacima aminokiseline 78 su pokazali da su beznačajni u poređenju sa uvođenjem anti-PEA mutacija (videti i ispod).

[0227] Pri proizvodnji, takođe je zapaženo da ekspresija ovih varijanti koje sadrže anti-PEA mutacije je nedovoljno optimalna. Ovo je dalje kvantifikovano upotrebom metode Primera 1.

[0228] Rezultati su prikazani u Tabeli 4.3.

[0229] Zaista, količina koja se može dobiti iz obe varijante koje sadrže anti-PEA mutacije je bila 2-puta manja (A016600018) ili čak 4-puta manja (A016600019) nego kod referentnog Nanotela. Ovo se pojavilo kao kompletno iznenađenje pronalazačima, kako se uvođenje ovih PEA mutacija L11V i V89L nije ispoljilo u tako ozbiljnom padu sposobnosti za dobijanje Nanotela ranije kao što je određeno za bilo koji drugi klon.

4.4 Stabilnost proteaze

[0230] Namenjeno je da se TNF-inhibitori na kraju mogu dati oralno. Međutim, stomak i creva čine prirodno odbojno okruženje kako nisu predviđeni za razgradnje enzima i apsorpciju delimično čvrste hrane. Uopšteno, proteoliza protein supstrata može se desiti ako se 8-10 ostataka aminokiseline u polipeptidnom lancu može vezati i prilagoditi specifičnoj stereohemiji mesta aktivne proteaze (Fontana i dr.2004 Acta Biochim Pol, 51, 299-321). Stoga, podložnost cepanju enzima zavisi u velikom od fizičkih karakteristika supstrata.

[0231] U cilju identifikovanja potencijalnim mesta degradacije proteaze i stvaranja stabilnijih varijanti, predmetni pronalazači krenuli su da identifikuju mesta cepanja tripsina i himotripsina prema standardnim metodama.

[0232] Predviđena mesta proteaze („P”) SEQ ID NO: 58 i novo referentno jedinjenje A016600015 („00015”) prikazani su kao („X”) na Slici 8A za oba, tripsin i hemotripsin.

[0233] Iz ove slike može se već zaključiti da:

• CDR3 sadrži 9 potencijalnih mesta cepanja proteaze.

• humanizirajuća mutacija Q75K (VH3-DP51) je uvela potencijalno mesto cepanja tripsina.

• humanizirajuća mutacija K73N (VH3-DP51) je eliminisala potencijalno mesto cepanja tripsina.

• anti-PEA mutacije L11V i V89L bile su neutralne po ovom pitanju, npr., ove mutacije nisu uvele ili eliminisale potencijalna mesta cepanja proteaze, kao što je očekivano.

[0234] U cilju procenjivanja predviđenih mesta cepanja proteaze u više in vivo podešavanju, Nanotela su razložena sa tripsinom i himotripsinom. Naročito, anti-TNFα Nanotela su inkubirana u 10% tripsin ili α-himotripsin rastvorima. Dva µg Nanotela je izloženo triptičnom razlaganju tokom 2h, 4h i preko noći na 37°C, ili himotriptičnom razlaganju 2h, 4h ili preko noći na 25°C. Proteolitična reakcija zaustavljena je dodavanjem TFA (0.1% krajnje). Reakcione smeše su ili analizirane putem RPC LC-MS ili su razdvojene na SDS PAGE gelu i obojene sa Coomassie plavom- Upotreba količine ImageQuant (GE) neizmenjenog materijala je izračunato i normalizovano do 0h kao referentna vremenska tačka.

[0235] Primerni rezultat triptičnog razlaganja na Coomassie obojenom SDS PAGE gelu dat je na Slici 8B. Primerni rezultat analize triptičnog razlaganja pomoću RPC LC-MS dat je na Slici 8C. Primerna („E”) potvrđena mesta cepanja prikazana su na Slici 8A kao tripsin („E”) i hemotripsin („E”).

[0236] Sa Slike 8a jasno je da je broj stvarnih mesta cepanja smanjen. Svejedno, razna triptična i hemotriptična mesta prepoznavanja preostaju.

[0237] U cilju optimizovanja otpornosti tripsina, 5 pozicija je izabrano u cilju planiranja jedne optimizovane varijante: R38, K64, S94, P95 i R96, ispoljava se u varijanti A016600013; SEQ ID NO: 65.

[0238] Međutim, mutiranjem ovih mesta ispoljilo se u smanjenim nivoima ekspresije i intracelularnoj akumulaciji varijante (A016600013; SEQ ID NO: 65). Zapravo, ostatak aminokiseline 38 je povratno mutiran, što je poboljšalo ekspresiju, rezultirajuća varijanta (A016600014; SEQ ID NO: 66) je potpuno bila u suprotnosti sa očekivanjima više osetljiva na proteazu nego na referentno jedinjenje A016600015 (podaci nisu prikazani). Stoga, odlučeno je da se te pozicije ne mutiraju u referentnom jedinjenju i Nanotelima koja se ispituju, npr., A016600018 i A016600019.

[0239] Rezime rezultata je prikazan u Tabeli 4.4.

Tabela 4.4

Primer 5: Stabilnost u crevnim tečnostima izvedenih iz SHIME modela

[0240] Radi ispitivanja stabilnosti anti-TNFα Nanotela u ljudskom GI traktu, Nanotela su inkubirana u 5 različitih tečnosti dobijenih iz SHIME (Stimulator humanog intestinalnog mikrobiološkog ekosistema), predstavljajući ljudski gastrointestinalni trakt (GI). SHIME model je naučno potvrđeni dinamički model potpunog gastrointestinalnog trakta, koji je korišćen za ispitivanje fizikohemijskih, enzimatskih i mikrobioloških parametara u gastrointestinalnom traktu u kontrolisanoj in vitro postavci.

[0241] SHIME model se sastoji od pet reaktora koji redno stimulišu stomak (kiseli uslovi i pepsin razlaganje), tanko crevo (proces razlaganja) i 3 oblasti debelog creva, npr., ulazno („A”), poprečno („T”) i silazno crevo („D”) (mikrobiološki procesi). Pažljiva kontrola parametara okruženja u ovim reaktorima dozvoljava kompleksne i stabilne mikrobiološke zajednice koje su veoma slične u oba, strukturi i funkciji mikrobiološkim zajednicama u drugim oblastima ljudskog debelog creva (videti Sliku 9). Sve GI tečnosti imaju ProDigest (Technologiepark 4, 9052 Zwijnaarde, Belgium). Anti-TNF Nanotela su testirana tokom maksimalnog perioda od 39 sati u GI-tečnostima. Nakon inkubacije u GI-tečnostima, stabilnost Nanotela je određena putem testa funkcionalnosti u konkurentnom ELISA.

Nanotela su testirana pri fiksiranoj koncentraciji od 100µg/ml na 37°C u 5 različitih GI fluida u SHIME modelu. Pri različitim vremenskim tačkama uzorci su uzeti i skladišteni na -20°C sa ili bez dodataka inhibitora proteaze, prema rasporedu u Tabelu 5.1. Uzorci su preneti u obložene ELISA posude i zatim su testirani u konkurentnom ELISA. Ukratko, A016600015 je obloženo pri koncentraciji od 1µg/ml u PBS. Nakon blokiranja, fiksirana koncentracija od 0.3nM biot-hTNFα zajedno sa serijama titracije varijanti u različitim GI tečnostima je dodata. Detekcija je izvršena sa extravidin-HRP.

Tabela 5.1 Raspored inkubacije

[0242] Primerni rezultat u debelom crevu „T” dat je u Tabeli 5.2

Tabela 5.2

[0243] Na osnovu rezultata sa tečnostima dobijenim iz različitih SHIME odeljaka, procena stabilnosti omogućava rangiranje Nanotela koje predstavljaju stabilnost u svim GI odeljcima: 00015 > 00019 > 00018.

[0244] Kolektivno, eliminisanje mesta cepanja proteaze pokazalo je da nema pozitivne efekte, kao što su stabilnost proteaze i osetljivost ovih porodica Nanotela. Uvođenje anti-PEA mutacija L11V i V89L u A16600015 pokazuje da ima negativan efekat na stabilnost ovih konkretnih Nanotela.

Primer 6: Stabilizovane varijante

[0245] Kako eliminisanje mesta cepanja proteaze nije pokazalo rezultate u očekivanim rezultatima, pronalazači su dalje postavili složene anti-TNF-α varijante, koje bi suštinski bile stabilnije ali u kojima humanizacija i anti-PEA mutacije poželjno ne bi bile kompromitovane. Ovo je zahtevalo nekonvencionalni pristup u pogledu prikaza sličnih međusobnih karakteristika različitih ostataka aminokiselina, kao što su humanizacija naspram stabilnosti proteaze naspram afiniteta.

6.1 unutrašnja cistein veza i eliminacija mesta cepanja CDR3 hemotripsina

[0246] Lociran u CDR3 i potencijalno utiče na svojstva vezivanja, svejedno je odlučeno da se konstruiše varijanta u kojoj je ostatak aminokiseline Y100d, koji je mesto cepanja hemotripsina, eliminisan sa Y100dL supstitucijom (A016600046100dL; SEQ ID NO: 62). Varijanta A016600045 (SEQ ID NO: 69) je osmišljena da proceni uticaj tirozina na poziciji 100d daljeg CDR3.

[0247] Dodatno, pronalazači su postavili hipotezu da mogu osmisliti varijante koje bi suštinski bile stabline uvođenjem intradomenske disulfidne veze (cf. Wozniak-Knopp i dr. 2012 PLoS One.2012; 7(1): e30083). Ovo bi zahtevalo uvođenje dva ostatka cisteina koji bi se zatim uparili da bi formirali cistin. Nakon rešavanja strukture proteina Nanotela i njegove integracije sa ciljanim TNF-α putem ispitivanja kristalizacije (podaci nisu prikazani), pronalazači su odlučili da mutiraju S49C i I69C mutacije aminokiselina radi uvođenja intradomenske disulfidne veze, iako je ostatak aminokiseline S49 susedan CDR2, i uveden je u cilju humanizacije (odnoseći se na ljudski germinativni DP51, videti Primer 2). Nova varijanta koja sadrži S49C, I69C i Y100dL obeležena je sa A016600052 (SEQ ID NO: 63).

[0248] U cilju procenjivanja uticaja pozicije 49 aminokiseline, u dubini, ovaj ostatak aminokiseline je mutiran u alanin. Naročito, ova mutacija na poziciji 49 bi se odnosila na već

1

različiti – ljudski germinativni IgHV3-IgHJ. Sve nove varijante A016600046 (SEQ ID NO: 62), A016600016 (SEQ ID NO: 36), A016600020 (SEQ ID NO: 39) i A016600021 (SEQ ID NO: 40) sadrže A49.

[0249] Dodatno, u varijanti A016600020 (SEQ ID NO: 39) pozicije D60A, E61D i P62S su procenjene u pogledu fizičke stabilnosti. Ostaci aminokiselina A60, D61 i S62 su postavljeni susedno eksperimentalno potvrđenom mestu cepanja himotripsina Y58 i unutar CDR2 prema Kabatu, što ukazuje na visok rizik potencijalnog gubitka.

[0250] U nastavku, mesto cepanja proteaze je slučajno uvedeno humanizirajućim mutacijama Q75K. Bez vezivanja sa bilo kojom teorijom, pronalazači su postavili hipotezu da bi menjanje susedno postavljenih ostataka aminokiseline A74S potencijalno uticalo kako na humanizaciju tako i na osetljivost proteaze, ali samo do određenog stepena, npr., nadalo se da su oba, humanizacija i osetljivost proteaze smanjeni do prihvatljivog nivoa. Varijante koje sadrže S74 su A016600016 (“00016”), A016600020 (“00020”), A016600021(“00021”), A016600046 (“00046”) i A016600052 (“00052”) (SEQ ID NO:s 36, 39, 40, 62 i 63, respektivno). Uporediva varijanta je bila A016600038 (“00038”; SEQ ID NO: 64), koja je identična sa A016600021 (SEQ ID NO: 40), ali sa 74S umesto 74A.

[0251] Dobijene sekvence date su na Slici 3.

6.2 Svojstva stabilizovanih varijante

[0252] Dalje, ove varijante procenjene su za različita svojstva, suštinski iznete u Primerima 3 i 4.

[0253] U prvoj instanci, proizvodnja varijanti 00016, 00020 i 00021 određena je u P.pastoris prema Primeru 1.

[0254] Rezime dobijenih rezultata dat je u Tabeli 6.2A.

Tabela 6.2A

2

[0255] Iz ovih rezultata može se videti sa su ove mutacije pokazale povećanje proizvodnje više od 4-5 puta u odnosu na proizvodnju referentnog jedinjenja, koje je proizvelo 87 µg (cf. Primer 4.3), ili čak više od 20-30 puta u odnosu na blisko povezane varijante 00018 i 00019.

[0256] Dalje, termalna stabilnost ovih varijante je određena prema Primeru 4.3. Rezime dobijenih rezultata takođe je dat u Tabeli 6.2A.

[0257] Ne samo da se proizvodnja drastično povećala, već se i termalna stabilnost neočekivano povećala za 5-16 °C u poređenju sa referentnim jedinjenjem, čak i do 16-19 °C u poređenju sa bližim povezanim varijantama 00018 i 00019.

[0258] Neočekivano, ostatak aminokiseline A49 otklanja uticaj anti-PEA ostataka aminokiseline V11 i L89 na proizvodnju i stabilnost.

[0259] Različite varijante iz Primera 6.1 procenjene su zajedno u GI tečnostima dobijenim iz SHIME modela prema Primeru 5.

[0260] Rezime dobijene aktivnosti na kraju perioda inkubacije pod različitim uslovima A016600021, A016600038, A016600046 i A016600052 dat je u Tabeli 6.2B. Inkubacija u PBS je pokazala inherentnu stabilnost Nanotela (podaci nisu prikazani).

[0261] Varijante A016600046 Y100dL (SEQ ID NO: 62) kod kojih je mesto cepanja proteaze uklonjeno i varijanta A016600052 (SEQ ID NO: 63), koja je dalje stabilizovana putem intradomenske cisteinske veze ali nije pružila nikakva poboljšanja u vezi sa ovim. Naročito, IC50 varijante 00046 i 00052 se povećala 2-5 puta u poređenju sa 00021 (1.13 nM i 3.56 nM, respektivno u poređenju sa 0.67 nM) zbog mutacije u CDR3.

[0262] SHIME rezultati suštinski potvrđuju i proširuju rezultate Tm i proizvodnje. Dodatno SHIME model je otkrio da je varijanta 00021 (SEQ ID NO: 40) posledično stabilnija od varijante A016600040 (“00040”; SEQ ID NO: 67) i varijanta 00038 (SEQ ID NO: 64), što ukazuje na pozitivni dodatak Serina na poziciji 74.

[0263] Naročito, varijanta A016600039 (SEQ ID NO: 68) koja je identična varijanti 00040 (SEQ ID NO: 67) ali je za A74S, pokazala da je S74 posledično manje stabilnija od A74 u SHIME modelu.

[0264] Na osnovu svih rezultata uključujući rezultate sa tečnostima dobijenim iz različitih SHIME odeljaka, sveobuhvatna procena stabilnosti omogućava rangiranje Nanotela koje predstavljaju stabilnost u svim GI odeljcima: 00021 > 00016 > 00020 > 00040 > 00015 > 00019 > 00018.

4

[0265] Stoga, anti-PEA mutacije L11V i V89L kod A16600015 pokazuju da imaju negativan efekat na stabilnost ovog konkretnog Nanotela, što može biti umanjeno sa 49A, ali ne i sa 49C-69C. Sa druge strane, kod Nanotela koje sadrže anti-PEA mutacije L11V i V89L, ostaci aminokiselina 74S bili su od koristi za stabilnost u SHIME modelu.

6.3 A016600021 ima povoljna svojstva (u poređenju sa A016600039 i A016600040)

[0266] Za oralno davanje veruje se da velika doza može biti potrebna pored stabilnosti. U cilju ostvarenja prihvatljivih cena, kandidat se poželjno proizvodi pri većim količinama, prečišćen bez značajnih gubitaka i formulisan pri visokoj koncentraciji. Stoga, pronalazači su izvršili eksperiment kako bi testirali ove parametre.

[0267] Prvo, pronalazači su uporedili nivoe ekspresije A016600039 i A016600040 sa A016600021.

[0268] Kao što se može videti na Slici 11A, ekspresija A016600039 (SEQ ID NO: 68) je bila značajno niža nego nivoi ekspresije A01660021 (SEQ ID NO: 40) i A016600040 (SEQ ID NO: 67). Ovi rezultati su takođe kvantifikovani preko AKTAmicro, čiji su rezultati prikazani u Tabeli 6.3

Tabela 6.3

[0269] Što se tiče proizvodivosti A016600021 u poređenju sa A016600040, oba su testirana na maksimalnoj rastvorljivosti u toku koncentracije fermentacione smeše. Maksimalna rastvorljivost u razblaženoj fermentacionoj smeši je samo 30g/L za A016600040 (u poređenju sa >75g/L za A016600021). Dodatno, značajni gubici susreću se u toku prečišćavanja A016600040.

[0270] Stoga, dodatno stabilnosti, A016600021 takođe ime -neočekivano- povoljna svojstva proizvodnje i prečišćavanja u poređenju sa A016600039 i A016600040.

[0271] Na osnovu povoljnih svojstava stabilnosti, ekspresije i prečišćavanja, pronalazači su se fokusirali na A016600021, za koje je rastvorljivost bila određena. Na potpuno iznenađenje pronalazača, A016600021 je bilo rastvorljivo do jedinstvenih 200 mg/ml u H2O.

Primer 7: Stabilizovane varijante nadmašuju referente oznake

[0272] Varijante A016600021 (SEQ ID NO: 40), A016600038 (SEQ ID NO: 64) i A016600045 (SEQ ID NO: 69) su procenjen za vezivanje sa membranski povezan ljudski TNF (mTNF) u konkurentnom testu sa Enbrel (Etanercept), TNF-R2 zasnovani anti-TNF terapeutski agens. Još uz to ćelijska linija koja stabilno vrši ekspresiju formi koje se ne mogu cepati ljudskog TNF je generisana transfekcijom HEK293H ćelija sa eukariotskim vektorom ekspresije koji enkodira ljudsku TNF R77T/S78T varijantu (nazvana HEK293H-mTNF), kao što je prethodno opisano (Harashima i dr., 2001 J Immunol 166:130-136). Nakon selekcije od strane ko-ekspresije puromicin otpornog gena, sortiranje pojedinih mTNF ekspresionih ćelija je izvršeno sa FACS (BD FACS Aria) nakon bojenja ćelija Remicade (Infliximab) i sekundarnim kozjim F(ab')2 Anti-humanim IgG, mišijim ads-PE. Konstitutivna ekspresija membranski povezanog TNF na izabrane pojedine klonove je potvrđena protočnom citometrijom (BD FACS Array).

[0273] U prvoj instanci, vezivanje Enbrel za mTNF na ovim ćelijama je procenjeno. Uz to je 5.10<5>ćelija jednog HEK293H-mTNF klona zasejano u ploče sa 96 otvora sa okruglim dnom i direktno inkubirano sa različitim koncentracijama Enbrela razređenog u FACS puferu (PBS dopunjen sa 10% FBS i 0,05% natrijum azidom) tokom 90 minuta na 4°C. Ćelije su isprane sa FACS puferom i obojene sa sekundarnim kozjim F(ab')2 Anti-Human IgG, mišijim ads-PE antitelom tokom 30 minuta na 4°C. Nakon ispiranja i inkubiranja ćelija u FACS puferu u prisustvu mrtve oznake TO-PRO-3 jodida, vezivanje Enbrela za mTNF na održivim HEK293H-mTNF ćelijama je izmereno očitavanjem na BD FACS Array. Iz dobijenih krivi reagovanja na dozu EC30 i EC90 vrednosti Enbrela za vezivanje za mTNF su bile definisane respektivno 0.02nM i 0.2nM. Obe koncentracije su kasnije primenjene u konkurentnom testu sa TNF-ciljanim Nanotelima.

[0274] Za procenjivanje mTNF vezivanja A016600021, A016600038 i A016600045, konkurentni eksperiment sa Enbrelom pri fiksiranim EC30 i EC90 koncentracijama je bio podešen. Potentnost anti-TNF Nanotela je upoređena sa referentom vrednosti jedinjenja Cimzia (certolizumab pegol). Dodatno je uključeno irelevantno Nanotelo (IRR00027) kao negativna kontrola. U ovom testu, identični uslovi kao što je opisano iznad za Enbrel vezivanje su primenjeni, osim za prvi inkubacioni korak koji u ovom eksperimentu obuhvata zajedno tretiranje ćelija sa fiksiranim koncentracijama Enbrela (EC30 ili EC90) u kombinaciji sa različitim koncentracijama anti-TNF Nanotela ili Cimzia u rasponu od 300nM do 12.5pM. Čitanje na BD FACS Array je odredilo vezivanje Enbrela na HEK293H-mTNF ćelijama koje je očito bilo smanjeno nakon zajednog tretiranja sa povećanjem koncentracija Nanotela kao i Cimiza što ukazuje konkurentnost anti-TNF agensa sa Enrbelom za vezivanje za mTNF. IC50 vrednosti anti-TNF agenasa određene su kao što je ukazano u Tabeli 7.

[0275] Dobijeni rezultati demonstriraju da A016600021, A016600038 i A016600045 imaju 6-7 puta bolju potentnost nego Cimzia pri EC90 i iznenadnih 15-18 puta bolju potentnost od Cimzia pri EC30. Stabilizovane varijante imaju uporedivu potentnost za poređenje sa Enbrelom za mTNF vezivanje.

[0276] U konkurentnom FACS pokazano je da Nanotela mogu takođe potpuno inhibirati vezivanje Enbrela za mTNF. Ovo bi ukazivalo za superiornu pogodnost kao medikament za oralnu upotrebu. Suprotno tome, visoke koncentracije Cimzia ispoljile su se samo u delimičnom blokiranju Enbrel vezivanja (Slika 10).

Tabela A: Referenca A i njeni CDR i PMP6C11

Tabela B: Moguće kombinacije aminokiselina na pozicijama 11, 89, 110 i 112.

Tabela C-1: Šematski prikaz nekih jedinjenja prema pronalasku bez ISVD koji produžava polu-život.

1

Tabela C-2: Šematski prikaz nekih jedinjenja prema pronalasku bez ISVD koji produžava polu-život.

2

Tabela D: ISVD sekvence vezivanja serum albumina („ID” se odnosi na SEQ ID NO kao što je ovde korišćeno)

4

Tabela E: Razne sekvence aminokiselina (“ID” se odnosi na SEQ ID NO kao što je ovde korišćeno)

LISTA SEKVENCI [0277]

1

2

4

1

11

12

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

14

Claims

Patentni zahtevi

1. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISVD) koji ima sekvencu aminokiselina prema SEQ ID NO: 40.