RS56707B1 - Varijanta gp-120 hiv-a - Google Patents

Varijanta gp-120 hiv-a

Info

Publication number
RS56707B1
RS56707B1 RS20171235A RSP20171235A RS56707B1 RS 56707 B1 RS56707 B1 RS 56707B1 RS 20171235 A RS20171235 A RS 20171235A RS P20171235 A RSP20171235 A RS P20171235A RS 56707 B1 RS56707 B1 RS 56707B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
hiv
polypeptide
virus
antibody
antibodies
Prior art date
Application number
RS20171235A
Other languages
English (en)
Inventor
Herranz María Eloísa Yuste
Merino Víctor Sánchez
Carolina Ferreira
Original Assignee
Esteve Labor Dr
Fundacio Privada Inst De Recerca De La Sida Caixa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Esteve Labor Dr, Fundacio Privada Inst De Recerca De La Sida Caixa filed Critical Esteve Labor Dr
Publication of RS56707B1 publication Critical patent/RS56707B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/112—Retroviridae (F), e.g. leukemia viruses
    • C07K16/114—Lentivirus (G), e.g. human immunodeficiency virus [HIV], feline immunodeficiency virus [FIV] or simian immunodeficiency virus [SIV]
    • C07K16/1145—Env proteins, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, principal neutralising domain [PND] or CD4-binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G01N2333/162—HIV-1, HIV-2 env, e.g. gp160, gp110/120, gp41, V3, peptid T, DC4-Binding site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Sadašnji pronalazak se odnosi na postupak za brzu selekciju imunogena, koji može izazvati aktivnosti visoko neutrališućih antitela (nAt). Nekoliko primera ovih imunogena sa poboljšanim aktivnostima neutrališućih antitela je otkriveno i objašnjeno primerima. Naročito, otkriveni su imunogeni sa povećanim afinitetom antitela za HIV-1 Env epitope.
STANJE TEHNIKE
[0002] Procenjuje se da je od 1982. godine više od 60 miliona ljudi širom sveta inficirano virusom humane imunodeficijencije. Skoro polovina ovih zaraženih osoba je umrla od nastalog sindroma stečene imunodeficijencije SIDE (engl. AIDS-a) u istom vremenskom okviru. Iako, izgleda da je širenje virusa dostiglo plato u poslednje vreme, u 2009. godini prijavljeno je 2,5 miliona novih HIV infekcija. HIV je i dalje veliki javni zdravstveni problem. Videti UNAIDS, Izveštaj o globalnoj epidemiji SIDE za 2010. godinu.
[0003] HIV-1 je jedan od genetski najrazličitijih virusnih patogena koji su do sada opisani. Postoje tri glavne grane filogenetskog stabla HIV-1, grupe M (glavna), N (nova) i O (izlazne). Virusi grupe M su najrasprostranjeniji, čine više od 99% globalnih infekcija. Ova grupa je trenutno podeljena u devet različitih genetskih podtipova ili filogenetskih grana (A do K), zasnovanih uglavnom na kratkim env (omotač) genskim sekvencama. Videti McCutchan F, AIDS 2000; 14 (S3): S31-S44 i Robertson D, i sar., Science 2000; 288: 55-56.
[0004] Env je najvarijabilniji HIV-1 gen, sa do 35% različitosti sekvence između filogenetskih grana, 20% različitosti sekvence unutar filogenetskih grana i do 10% različitosti sekvence kod pojedinačne inficirane osobe. Videti Kuiken C, i sar., AIDS 1996; 10: 31-37 i Shankarappa R., i sar., J. Virol. 1999; 73: 10489-10502. Podtip B je dominantan u Evropi, Americi i Australiji. Videti Kuiken C, i sar., AIDS 1996; Am. J. Epidemiol. 2000; 152: 814-822. Podtip C je uobičajen u južnoj Africi, Kini i Indiji i trenutno inficira više ljudi širom sveta nego bilo koji drugi podtip. Videti McCutchan, 2000, supra. Podtipovi A i D su poznati u centralnoj i istočnoj Africi.
[0005] Međutim, mnoge viruse je teško klasifikovati u podtipove zbog zajedničkog mešanja kocirkulišućih virusa koji dovode do među filogenetskih rekombinanti. Videti Heyndrickx L, i sar., J. Virol. 200; 74: 363-370 i McCutchan F, i sar., Virology 1999; 254: 226-234. Neke rekombinantne forme su zapravo dovele do porasta važnih epidemijskih rodova, koji se nazivaju cirkulišući rekombinantni oblici (CRF). Dva najčešća od njih su CRF01 (AE), otkriven na Tajlandu, koji je inicijalno bio klasifikovan kao podtip E, iako je kasnije utvrđeno da je podtip E nađen jedino u omotaču i podtip A u drugim delovima genoma, a CRF02, AG rekombinantna forma je uobičajena u zapadnoj Africi. Videti Robertson, 2000, supra. Globalno, podtipovi A do D i CRF01 AE i CRF02 AG rekombinante predstavljaju više od 90% globalnih infekcija.
[0006] Neutrališuća antitela (nAt) protiv proteina virusnog omotača (Env) su prva linija adaptivne imunološke odbrane protiv izlaganja virusu HIV-1, blokiranjem infekcije osetljivih ćelija. Videti Kvong P, i sar., Nature 1998; 393: 648-659, Moore J, i sar., J. Virol. 1994; 68: 469-484, Moore P, i sar., J. Virol. 1996; 70: 1863-1872, i Parren P, i sar., AIDS 1999; 13: S137-S162. Efikasnost vakcina protiv nekoliko virusa pripisana je njihovoj sposobnosti da izazovu nAt-a. Videti Burton D, Nat. Rev. Immunol. 2002; 2: 706-713 i Zinkerangel R, i sar., Adv. Immunol. 2001; 79: 1-53 BHATTACHARYYA i sar. (J. BIOL. CHEM.., 2010, vol. 285. br. 35, str. 27100-27110) i LI i sar. (J. VIROL., 2005, vol. 79, br. 16, str. 10108-10125) otkrivaju HIV-1 gp120 varijante sa višestrukim mutacijama u poređenju sa env HIV-1 AC10 izolatom, koji indukuje neutrališuća antitela i omogućava otkrivanje neutrališućih antitela. Međutim, postignut je ograničen napredak u pravcu razvoja efikasnih imunogena HIV-1 uprkos velikim naporima. Videti Burton, 2002, supra, McMichael A, Hanke T, Nat. Med. 2003; 9: 874-880, i Moore, 1996, supra. Dizajn ovih imunogena zahteva identifikaciju epitopa sposobnih za indukovanje boljih odgovora nAt-a. Nažalost, svi pokušaji da se razviju imunogeni koji izazivaju odgovore široko neutrališućih antitela su propali do sada.
[0007] Stoga, u struci postoji potreba za novim imunogenima HIV-1 sposobnim da indukuju bolje odgovore neutrališućih antitela.
SUŠTINA PRONALASKA
[0008] Ovaj pronalazak je u svom najširem smislu, kao što je definisan u nezavisnim zahtevima. Sadašnji pronalazak se odnosi na postupak za brzu selekciju imunogena (RIS), koji može izazvati visoke aktivnosti nAt-a, kada se koriste kao B ćelijski imunogeni. Postupak obuhvata: i) slučajno mutiranje nukleotidne kodirajuće sekvence epitopa divljeg tipa, koji je od interesa za generisanje biblioteke varijanti pomenutog epitopa; ii) testiranje biblioteke sa antitelom ili njegovim delovima, za koje je poznato da imaju afinitet prema divljem tipu epitopa i iii) odabiranje varijanti epitopa koje povećavaju afinitet antitela. Poželjno, epitop je HIV epitop. Još poželjnije, epitop je jedan Env epitop.
[0009] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na nukleotidne sekvence i peptide dobijene RIS metodom, kao što su nukleotidne sekvence SEK ID BR: 1. Pronalazak se odnosi na nukleotidne sekvence definisane pomoću SEK ID BR: 3.
[0010] U trećem aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu nukleotidnih sekvenci i peptida dobijenih RIS metodom, za prevenciju i lečenje bolesti izazvanih u potpunosti ili delimično dejstvom epitopa divljeg tipa, koji je od interesa. Poželjno, bolest je SIDA (engl.AIDS) ili bolest uzrokovana HIV infekcijom.
[0011] U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na dijagnostičku upotrebu RIS metode.
KRATAK OPIS SLIKA
[0012]
Slika 1. Sekvenca mutanata identifikovanih korišćenjem RIS metode iz ovog pronalaska. Najgornja sekvenca odgovara aminokiselinama 121 do 160 polipeptida AC10 gp 160. Sekvence odgovarajućih regiona u izolovanim klonovima su prikazane kao tačke, gde je aminokiselina istovetna kao u AC10 gp 160 ili sa odgovarajućom aminokiselinom u onim položajima gde se sekvenca mutanta razlikuje od one divljeg tipa .
Slika 2. Predložena interakcija između 4E10 antitela i LR1-C1 specifičnog mutanta. Prikazano je jedanaest aminokiselinskih supstitucija kroz celokupan env gen, uključujući gubitak 3 potencijalna N-povezana mesta glikozilacije. Mutacija C131Y je naročito važna, jer ova supstitucija eliminiše prirodnu disulfidnu vezu između C131 i C157, ometajući arhitekturu V1 / V2 petlje.
Slika 3. LR1-C1 virion identifikovan korišćenjem RIS metode prema pronalasku pokazuje povećan afinitet prema široko neutrališućem antitelu 4E10. Grafikon pokazuje titraciju vezivanja viriona na ploče obložene sa antitelom 4E10, kako je određeno dodavanjem povećane količine izolata AC 10 divljeg-tipa i izolata LR1-C1 na ploče obložene sa antitelom 4E10 ili netretiranim. Dijagram ilustruje 4-struko povećanje afiniteta antitela 4E10 prema LR1-C1 u poređenju sa varijantom divljeg tipa.
Slika 4. LR1-C1 virion identifikovan korišćenjem RIS metode prema pronalasku sa antitelom 4E10 ne pokazuje povećani afinitet prema drugim široko neutrališućim antitelima. Grafikon prikazuje titraciju vezivanja viriona na ploče obložene sa 2F5 (panel A), 2G12 (panel B) ili b12 (panel C) antitelima, kako je utvrđeno dodavanjem povećane količine izolata AC 10 divljeg-tipa, LR1 -C1 izolata ili viriona koji nose deleciju u env genu na pločama ili obloženim sa antitelima ili netretiranim.
Slika 5. Usklađivanje SEK ID BR: 31 sa HXB2 sekvencom AC 10 divljeg-tipa. SEK ID BR: 31 ima afinitet prema antitelu PG16. Modifikovana sekvenca pokazuje dve mutacije: i) N203S, u potencijalnom mestu glikozilacije i ii) G604E, u gp41 imunodominantnom regionu.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
A. Metoda brze selekcije imunogena (RIS)
[0013] Pronalazak se odnosi na novi pristup za optimizaciju proteina omotača HIV-1 (Env) kao imunogena. Ovaj pristup uzima u obzir da sposobnost epitopa za izazivanje antitela zavisi od njegove izloženosti virionu. Metoda je zasnovana na selekciji varijanti sa povećanim afinitetom za široko nAt-a iz biblioteke viriona sa slučajno mutiranim proteinima omotača.
[0014] Prema pronalasku, env gen pune dužine iz soja HIV-a AC 10 je korišćen za generisanje biblioteka slučajno mutiranih omotača pomoću metode bazirane na PCR-u. Kloniranje je izvedeno u kontekstu pNL4-3, a virioni su dobijeni prolaznom transfekcijom u 293 T ćelije. Odabir virusa sa povećanim afinitetom za široko nAt 4E10 je izvršen pomoću poboljšanog testa za hvatanje viriona u rastvoru. RNA je ekstrahovana iz zarobljene populacije virusa i izvedena je reverzna transkripcija PCR-a da bi se dobio env gen iz odgovarajućih virusa za dalje sekvenciranje i kloniranje nazad u kontekst pNL4-3. Nakon jednog kruga selekcije, izolovan je omotač sa 4-strukim povećanjem afiniteta prema 4E10 antitelu. Videti primere.
[0015] Stoga, u prvom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za identifikaciju imunogena sposobnih da izazivaju neutrališuća antitela protiv polipeptida koji obuhvata:
(i) kontaktiranje neutrališućeg antitela specifičnog za pomenuti polipeptid sa bibliotekom rekombinantnih virusa, svaki od pomenutih rekombinantnih virusa koji sadrže randomizovani gen koji kodira varijantu pomenutog polipeptida i koji eksprimira navedeni polipeptid,
(ii) odvajanje onih članova biblioteke rekombinantnih virusa koji se vezuju za neutrališuće antitelo od članova koji se ne vezuju, na osnovu njihove sposobnosti da se vezuju za neutrališuće antitelo, i (iii) određivanje sekvence varijantnih polipeptida pronađenih u članovima biblioteke rekombinantnih virusa odabranih u koraku (ii).
[0016] Izraz "imunogen" kako se ovde koristi, ima za cilj da označava supstancu od materije, koja je sposobna da indukuje adaptivni imuni odgovor kod pojedinca, pri čemu je navedeni adaptivni imuni odgovor sposoban da izazove imuni odgovor, koji značajno uključuje patogene agense, koji dele imunološke karakteristike sa imunogenom.
[0017] Izraz "izazivanje" kada se odnosi na imunološki odgovor, kako se koristi u predmetnom pronalasku, odnosi se na specifično kontrolisanje ili uticanje na aktivnost imunološkog odgovora i uključuje aktiviranje imunološkog odgovora, povećanje imunološkog odgovora, poboljšanje imunološkog odgovora i / ili promenu imunološkog odgovora (kao što je izazivanje tipa imunološkog odgovora, koji zauzvrat menja preovlađujući tip imunološkog odgovora kod subjekta od onog koji je štetan ili neefikasan do onog koji je koristan ili zaštitni).
[0018] Izraz "neutrališuće antitelo" je bilo koje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za patogena i ometa sposobnost patogena da inficira ćeliju i / ili uzrokuje bolest kod subjekta. Tipično, neutrališuća antitela koja se koriste u postupku iz sadašnjeg pronalaska se vezuju za površinu patogena i inhibiraju ili smanjuju infekciju od strane patogena za najmanje 99 procenata, najmanje 95 procenata, najmanje 90 procenata, najmanje 85 procenata, najmanje 80 procenata, najmanje 75 procenata, najmanje 70 procenata, najmanje 60 procenata, najmanje 50 procenata, najmanje 45 procenata, najmanje 40 procenata, najmanje 35 procenata, najmanje 30 procenata, najmanje 25 procenata, najmanje 20 procenata ili najmanje 10 procenata u odnosu na infekciju od strane patogena u odsustvu navedenog antitela ili u prisustvu negativne kontrole. Neutrališuća antitela se zatim mogu testirati da bi se utvrdilo da li poseduju neutrališuću aktivnost ili BNAt aktivnost, korišćenjem bilo koje od metoda, koje su ovde obezbeđene. Ako su neutrališuća antitela ili BNAt-a potstaknuta na nehumanim životinjama, CDR-ovi se mogu preneti iz ne-humanog okvira u humani okvir, kako bi se proizvelo antitelo pogodno za primenu kod čoveka. Metode za određivanje da li je antitelo nAt su opisane u tehnici. Videti Li M, i sar., J. Virol. 2005; 79: 10108-10125, Wei X, i sar., Nature 2003; 422: 307-312, i Montefiori D, Curr. Protoc. Immunol. 2005; Jan, Poglavlje 12: Jedinica 12.11. Ove metode su zasnovane na određivanju smanjenja ekspresije reporter gena, nakon jedne runde virusne infekcije, korišćenjem receptivne ćelijske linije, korišćenjem virusa koji kodira reporter gen.
[0019] Izraz "virus", kako se ovde koristi, odnosi se na mali infektivni agens, koji se može replikovati samo unutar živih ćelija organizama. Neograničavajući primeri virusnih porodica koje se mogu koristiti u postupku prema sadašnjem pronalasku uključuju adenoviridae, viruse Afričke svinjske groznice, arenaviridae, arterivirus, astroviridae, baculoviridae, birnaviridae, bunyaviridae, caliciviridae, circoviridae, coronaviridae, deltavirus, filoviridae, flaviviridae, hepadnaviridae, hepeviridae, herpesviridae, orthomyxoviridae, paramyxoviridae, picomaviridae, poxyviridae, reoviridae, retroviridae i rhabdoviridae.
A.1 Korak kontaktiranja
[0020] U prvom koraku, postupak prema pronalasku uključuje kontaktiranje neutrališućeg antitela, specifičnog za polipeptid, prikazan na površini pomenutog virusa sa bibliotekom rekombinantnih virusa, svaki od pomenutih rekombinantnih virusa, koji sadrže randomizovani gen, koji kodira varijantu pomenutog polipeptida prikazanog na površini virusa.
[0021] Izraz "biblioteka", kako se ovde koristi, odnosi se na raznovrsnu kolekciju ili mešavinu polinukleotida koji sadrže polinukleotide, koji kodiraju različite rekombinantne polipeptide. Veličina i složenost biblioteka koje će biti korišćene u postupcima iz sadašnjeg pronalaska mogu biti raznolike. Na primer, metode pronalaska mogu biti korišćene za prikazivanje biblioteka sa do 500000 različitih članova, ili biblioteka sa 1x10<6>, 1x10<8>ili više članova. Tipične biblioteke virusa imaju 1x10<8>do 1x10<13>članova, a takve biblioteke mogu biti prikazane korišćenjem postupaka iz ovog pronalaska. Zaista, takve biblioteke su poželjne, mada se metode jasno mogu koristiti za skrining mnogo manjih biblioteka (npr. biblioteke sa 1000 do 50,000, 50 do 1000, ili 100 do 500, ili 10 do 100 ili 5 do 100 članova). Raznolikost u varijantnoj biblioteci se može generisati putem mutageneze gena, koji kodiraju varijante na nivou DNK tripleta, tako da su pojedinačni kodoni šaroliki (npr. korišćenjem prajmera delimično randomizovanih sekvenci u PCR reakciji).
[0022] Kada se ovde nazivaju biblioteke molekula, izraz može biti korišćen za označavanje takve biblioteke na nivou nukleinske kiseline ili proteina (tj. pre ili nakon ekspresije kodiranih proteina). Očigledno, međutim, takve biblioteke ekspresije moraju biti prisutne na nivou proteina, kako bi se izabrali interaktivni vezujući partneri za dešavanje. Stoga, kako bi se korak kontaktiranja (a) uspešno javio, biblioteke trebaju biti prisutne na nivou proteina (iako u početku mogu biti prisutne na nivou nukleinske kiseline).
[0023] U poželjnom aspektu, polipeptid protiv koga su neutrališuća antitela korišćena u koraku (i) su eksprimirana u virusu. U poželjnom aspektu, polipeptid se prikazuje "na površini virusa". Kako se ovde koristi, ovaj izraz se odnosi na bilo koji polipeptid koji je dostupan prema reagensima, kao što su antitela, bez potrebe za poremećajem strukture virusa. Biće shvaćeno da polipeptid koji je prikazan na površini može biti kapsidni polipeptid za viruse bez omotača ili polipeptid omotača za viruse sa omotačem. U poželjnom aspektu, polipeptid prikazan na površini virusa je polipeptid omotača.
[0024] Svaki virusni protein omotača može biti konstruisan kako bi se dobila biblioteka rekombinantnih virusa, svaki od pomenutih rekombinantnih virusa koji sadrže randomizovani gen koji kodira varijantu pomenutog polipeptida. Ilustrativni antigeni uključuju one odabrane od hemaglutinina virusa gripa, glikoproteina G humanog respiratornog sincicijskog virusa, proteina jezgra, proteina matriksa ili drugih proteina virusa Dengue, hemaglutinina virusa malih boginja, glikoproteina gB herpes simpleks virusa tipa 2, poliovirusa I VP1, omotača ili kapsidnih glikoproteina HIV-1 ili HIV-II, površinskog antigena hepatitisa B, toksina difterije, streptococcus 24M epitopa, gonokoknog pilina, g50 (gpD) pseudorabies virusa, pseudorabies virusa II (gpB), pseudorabies virusa gIII (gpC), glikoproteina H pseudorabies virusa, glikoproteina E pseudorabies virusa, glikoproteina 195 transmisivnog gastroenteritisa, matriksnog proteina transmisivnog gastroenteritisa, glikoproteina 38 svinjskog rotavirusa, kapsidnog proteina svinjskog parvovirusa, zaštitnog antigena Serpulinahydodysenteriae, glikoproteina 55 goveđe virusne dijareje, hemaglutinin-neuraminidaze virusa Newcastle bolesti, hemaglutinina svinjskog gripa, neuraminidaza svinjskog gripa, virusa bolesti stopala i ustiju, virusa svinjske kolere, virusa svinjskog gripa, virusa afričke svinjske groznice, liyopneutiioniae mikoplazme, virusa infektivnog goveđeg rinotraheitisa, glikoproteina E, glikoproteina G virusa infektivnog goveđeg rinotraheitisa, virusa infektivnog laringotraheitisa, glikoproteina G ili glikoproteina I virusa infektivnog laringotraheitisa, glikoproteina virusa La Crosse, virusa neonatalne teleće dijareje, Venecuelanskog virusa konjskog encefalomijelitisa, punta toro virusa, virusa leukemije miševa, virusa mišjeg tumora dojke, proteina jezgra virusa hepatitisa B i površinskog antigena virusa hepatitisa B ili njegovog fragmenta ili derivata, antigena virusa konjske influence ili virusa konjskog herpesa, uključujući i neuraminidazu konjskog virusa gripa tipa A / Alaska 91, neuraminidazu konjskog virusa tipa A / Miami 63, neuraminidazu konjskog virusa gripa tipa A / Kentucky 81, glikoproteina B konjskog herpes virusa tipa 1 i glikoproteina D konjskog herpes virusa tipa 1, antigena goveđeg respiratornog sincicijskog virusa ili virusa parainfluenze goveda, vezanog proteina goveđeg respiratornog sincicijskog virusa (BRSV G), fuzionog proteina goveđeg respiratornog sincicijskog virusa (BRSV F), nukleokapsidnog proteina goveđeg respiratornog sincicijskog virusa (BRSVN), fuzionog proteina virusa parainfluence goveda tipa 3, hemaglutinin neuraminidaze virusa parainfluenze goveda tipa 3, glikoproteina 48 i glikoproteina 53 virusa goveđe virusne dijareje.
[0025] Poželjno, biblioteka rekombinantnih virusa je biblioteka retrovirusa. Izraz "retrovirus" označava bilo koji RNK virus koji se replikuje u ćeliji domaćina preko enzimske reverzne transkriptaze da bi proizveo DNK iz svog genoma RNK i koji pripada porodici retroviridae.
[0026] Izraz "retrovirus" se ovde koristi u njegovom konvencionalnom značenju i generalno obuhvata klase virusa u kojima je genetski materijal jednolančana RNK i koji koriste reverznu transkriptazu za prepisivanje viralne RNK u DNK u retrovirusima domaćina, kako je ovde određeno mogu posebno da pripadaju virusnoj familiji retroviridae, a naročito podfamilijama oncovirinae, lentivirinae ili spumavirinae retrovirusa, kako je ovde određeno, mogu biti patogeni. Env sekvence mogu biti izvedene iz bilo kog poznatog retrovirusa, uključujući, ali neograničavajući se na HIV, MuLV, SMRV, SFV, HPV, MMTV, SRVs, HTLV-I, HTLV-II, BLV, BIV, SIV, visna virus, EIAV, FIV, i EIAV, i iz bilo koje retrovirusne podfamilije (npr. oncovirinae, lentivirinae ili spumavirinae). Mnogi retrovirusni klonovi, uključujući HIV-1 klonove, su dobro okarakterisani i dostupni.
[0027] Posebno, ovde određeni su retrovirusi koji inficiraju životinje, poželjnije retrovirusi toplokrvnih životinja, čak poželjnije od životinja kičmenjaka, još poželjnije od sisara, a još poželjnije primata i najpoželjnije od ljudi. Posebno su ovde poželjni humani retrovirusi, uključujući bez ograničenja HIV-1, HIV-2, HTLV-I i HTLV-2. Dobro uspostavljene repozitorije informacija o HIV (i drugim retrovirusnim) sekvencama uključuju GenBank, EMBL, DDBJ i NCBI. Dobro okarakterisani HIV-1 klonovi uključuju HXCB2, HIV-l-MN i HIV-l-MN-ST. 1. Videti Hall L, i sar., J. Virol. 1992; 66 (9): 5553-5560.
[0028] U poželjnom aspektu, biblioteka rekombinantnih virusa je biblioteka HIV virusa koja je rezultat randomizacije najmanje jednog površinskog polipeptida. Akronim "HIV" se ovde koristi da generički upućuje na viruse humane imunodeficijencije i uključuju sve grane i / ili sojeve virusa humane imunodeficijencije tipa 1 (HIV-1) i virusa humane imunodeficijencije tipa 2 (HIV-2) i sinonim je sa starijim izrazima za HIV, kao što su HTLVIII i LAV.
[0029] U još poželjnijem aspektu, različiti članovi HIV biblioteke su randomizovani u env genu. Kao što se ovde koristi, izraz env gen označava polinukleotid virusnog genoma koji kodira protein omotača HIV-a. Kako se ovde koristi, izrazi "Env polipeptid" ili "polipeptid omotača" odnose se na molekul izveden iz proteina omotača HIV-a. Protein omotača HIV-a je glikoprotein od oko 160 kd (gp160). Tokom virusne infekcije ćelije domaćina, gp160 se cepa pomoću proteaza ćelija domaćina kako bi se formirao gp120 i integralni protein membrane, gp41.
[0030] Jedan "gp 120 polipeptid" je jedan molekul izveden iz jednog gp120 regiona Env polipeptida. Zreli gp 120 polipeptida divljeg tipa imaju oko 500 aminokiselina u njihovoj primarnoj sekvenci. Gp120 je u velikoj meri N-glikozilovan, što dovodi do očigledne molekulske težine od 120 kD. Aminokiselinska sekvenca gp120 je približno 511 aminokiselina. Gp 120 sadrži pet relativno konzervisanih domena (C1-C5), koji su rasuti sa pet varijabilnih domena (V1-V5). Varijabilni domeni sadrže rasprostranjene aminokiselinske supstitucije, umetanja i brisanja. Jedan "gp 120 polipeptid" uključuje i pojedinačne podjedinice i multimere. Gp41 deo je usidren u (i obuhvata) membranski dvosloj viriona, dok gp120 segment strči u okolnom okruženju. Domen receptorskog vezivanja gp120 je lokalizovan na N-terminalnoj polovini proteina. Ovo je praćeno regionom bogatim prolinom (PRR), koji se predlaže da se ponaša ili kao šarka ili okidač za komunikaciju vezivanja receptora na fuzionu mašineriju. C-terminus gp 120 je visoko konzervisan i intereaguje sa gp41. Primerne sekvence divljeg tipa gp 160 polipeptida su dostupne. Videti Genbank pristupni br. AAB05604 i AAD12142.
[0031] Randomizacija env gena se može izvesti preko kompletne env sekvence gena ili, poželjno, preko dela env gena koji odgovara regionu kodiranja za gp120, jer je to molekul koji intereaguje sa receptorom na ciljnoj ćeliji i koji sačinjava najboljeg kandidata za vezivanje za neutrališuća antitela. Štaviše, randomizacija regiona env gena koji kodira gp120 može biti izvedena preko celokupne sekvence ili usmerena na jedan ili više domena gp120 polipeptida. Stoga, RIS metod prema pronalasku obuhvata upotrebu HIV biblioteka koje su rezultat randomizacije u bilo kojoj od očuvanih petlji (C1 do C5) gp120, u bilo kojoj varijabilni petlji (V1-V5) u gp120 ili u poželjnoj kombinaciji očuvanih regiona i promenljivih petlji. U poželjnom aspektu, randomizacija se vrši preko celog env gena. U drugom aspektu, randomizacija se vrši u regionu env gena koji odgovara gp120. U drugom aspektu, randomizacija se vrši u regionima env gena koji odgovaraju V1 i / ili V2 regionima gp120.
[0032] Bilo koje tehnike mutageneze mogu biti korišćene za uvođenje mutacije u molekul nukleinske kiseline. Videti Sambrook J, i sar., "Molekularno kloniranje. Laboratorijski priručnik" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, SAD, 1989), Bishop T, i sar., "Nukleinska kiselina i sekvenca proteina. Praktični pristup" (IRL Press, Oksford, Engleska, 1987), Reznikoff W, Izd., "Maksimiziranje genske ekspresije" (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, SAD, 1987), Davis L, i sar.,"Osnovne metode u molekularnoj biologiji" (Elsevier Science Publishing Co., Njujork, NY, SAD, 1986), Schleef M, Izd., "Plazmid za terapiju i vakcinaciju" (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Nemačka 2001), Adereth Y, i sar., Biotehnike 2005, 38: 864-868, Allan J, i sar., Biotehnike 1995; 18: 746-750, Bubeck A, i sar., J. Virol. 2004, 78: 8026-8035, Doran B, US Pat. Pub.20070111201, Locher C, i sar., DNA Cell Biol. 2005; 24: 256-263, Vasl J, i sar., Biotehnike 2004; 37: 726-730, Weiss G, i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 8950-8954 i Delcourt M, US 6,924,112. Strategije mutageneze uključuju slučajnu mutagenezu, mutagenezu pretraživanja Ala, mutagenezu specifičnu za mesto i himeričnu rekombinaciju. Mutagenezni kompleti i usluge su široko dostupne komercijalno.
[0033] Izraz "neutrališuća antitela" uključuje podklase BNAt-a. Kao što je ovde korišćeno, "široko neutrališuće antitelo" ili "BNAt" je shvaćeno kao antitelo dobijeno bilo kojim postupkom, koje kada je isporučeno u efikasnoj dozi može biti korišćeno kao terapeutsko sredstvo za prevenciju ili lečenje HIV infekcije ili AIDS-a protiv više od 7 sojeva HIV-a, poželjno više od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više sojeva HIV-a. Pogodna neutrališuća antitela za upotrebu u RIS metodu prema predmetnom pronalasku uključuju, bez ograničenja, antitela usmerena protiv membranskog proksimalnog spoljnog regiona (MPER), antitela usmerena protiv mesta vezivanja CD4 i antitela usmerena protiv visoko manoznih glikana. U poželjnim aspektima, neutrališuća antitela za upotrebu u RIS metodu prema predmetnom pronalasku uključuju jedno ili više antitela izabranih iz grupe koju čine:
a) antitelo 4E10 koje prepoznaje segment ektodomena gp41, koji se nalazi pored virusne membrane. Videti Cardoso R, i sar., Immunity 2005; 22: 163-173, PHSL pristupni broj 90.091703, NIH ARRRP kataloški broj 10091, i Katinger H, i sar., US 5,753,503;
b) antitelo 2F5 koje prepoznaje segment ektodomena gp41, koji se nalazi pored virusne membrane. Videti Ofek G, i sar., J. Virol. 2004; 78: 10724-10737, PHSL pristupni broj 90.091704, NIH ARRRP kataloški broj 1475 i Katinger, supra;
c) antitela opisana u EP 0822941 koja se vezuju za dve različite antigenske determinante HIV-1, pri čemu su antigenske determinante fragmenti gp160 i odgovaraju aminokiselinskim sekvencama 79 do 184 i 326 do 400 obrađenih gp120 HIV-1 izolata BH 10. Videti PHSL pristupne brojeve 95032240 i 95032241;
d) 2G12 koji prepoznaje ugljene hidrate na spoljašnjoj površini gp120 (mAt 2G12). Videti Trkola A, i sar., J. Virol. 1996; 70: 1100-1108, EACC pristupni broj 93091517, i NIH ARRRP kataloški broj 1476;
e) b12 antitelo koje prepoznaje mesto vezivanja CD4. Videti Burton D, i sar., Science 1994; 266: 1024-1027, katalog NIH ARRRP broj 2640 i Burton D, i sar., EP 0675904; i
f) neutrališuća antitela PG9, PG16, PG20, PGG14 i PGC14. Videti Chan-Hui P, i sar., WO2010107939.
[0034] Metode za određivanje da li je antitelo netrališuće antitelo su opisane u tehnici. Neke od ovih metoda su zasnovane na određivanju smanjenja efekta antitela na ekspresiju reporterskog gena nakon jedne runde virusne infekcije, korišćenjem receptivne ćelijske linije koja kodira reporterski gen. Videti Li, 2005, Wei, 2003, Montefiori, 2005, supra, i Alvin C, WO2009117661.
[0035] Neutrališući kapacitet antitela za upotrebu prema sadašnjem pronalasku, može biti karakterisan pomoću IC50 (tj. koncentracije antitela koja uzrokuje 50% redukcije infekcije kod ciljne ćelije). Poželjno, neutrališuća antitela za upotrebu prema sadašnjem pronalasku imaju IC50 od 2 μg/ml ili niži (manje od 0,15 μg/mL, manje od 0,125 μg/mL, manje od 0,10 μg/mL, manje od 0,075 μg/mL, manje od 0,05 μg/mL, manje od 0,025 μg/mL, manje od 0,02 μg/mL, manje od 0,015 μg/mL, manje od 0,0125 μg/mL, manje od 0,01 μg/mL, manje od 0,0075 μg/mL, manje od 0,005 μg/mL ili manje od 0,004 μg/mL (koncentracija antitela od
10<-8>ili niža, poželjno 10<-9>M ili niža, poželjno 10<-10>M ili niža, tj.10<-11>M, 10<-12>M, 10<-13>M ili niža). Ovo znači da su samo vrlo male koncentracije antitela potrebne za 50 procentnu neutralizaciju kliničkog izolata HIV-a in vitro. Jačina može biti izmerena korišćenjem standardnog testa neutralizacije, kao što je opisano u struci.
[0036] Korak kontaktiranja se sprovodi pod adekvatnim uslovima, tako da se oni članovi biblioteke rekombinantnih virusa sposobni da se specifično vezuju za neutrališuća antitela zapravo vezuju za navedena antitela.
[0037] Kako se ovde koristi, izraz "specifično vezuju" (ili njihovih derivata), odnosi se na interakciju između vezujućih parova (npr. dva proteina ili jedinjenja). U nekim aspektima, interakcija ima konstantu afiniteta od najviše 10<-6>mola/litar, najviše 10<-7>mola/litar, ili najviše 10<-8>mola/litar. Generalno, izraz "specifično vezuje" odnosi se na specifično vezivanje jednog jedinjenja za drugo, pri čemu je nivo vezivanja, kao što je mereno bilo kojim standardnim testom (npr. imunoanalizom), statistički značajno viši od kontrolne podloge za ispitivanje.
[0038] Uslovi tokom koraka kontaktiranja mogu biti određeni rutinski od strane stručnjaka. Primeri uslova "kontaktiranja" mogu sadržati inkubaciju tokom 15 minuta do 4 sata (npr. jedan sat, na 4 ° C, 37 ° C ili na sobnoj temperaturi). Međutim, oni mogu biti promenjeni prikladno prema, na primer, prirodi interaktivnih partnera za vezivanje. Uzorak može opciono i poželjno biti podvrgnut nežnom trešenju, mešanju ili rotaciji. Pored toga, mogu se dodati i drugi odgovarajući reagensi, kao što su blokirajući agensi za smanjenje nespecifičnog vezivanja. Na primer, može se koristiti 1-4 % BSA ili drugi pogodni blokator (npr. mleko). Međutim, biće prihvaćeno da se uslovi kontakta mogu menjati i prilagoditi od strane stručnjaka u zavisnosti od cilja metode skrininga. Na primer, ako je temperatura inkubacije, na primer, sobna temperatura ili 37 ° C, to može povećati mogućnost identifikacije vezivnih ageanasa, koji su stabilni pod ovim uslovima (npr. u slučaju inkubacije na 37 ° C, vezivni agensi koji su stabilni pod uslovima nađenim u ljudskom telu). Takvo svojstvo može biti izuzetno povoljno ako su jedan ili oba partnera za vezivanje bili kandidati koji će biti korišćeni u nekom vidu terapeutske primene (npr. antitelo). Takve adaptacije su unutar obima stručnjaka.
[0039] U poželjnom aspektu, neutrališuće antitelo, korišćeno u koraku kontaktiranja može biti imobilisano na čvrstom nosaču, korišćenjem različitih tehnika poznatih onima iz oblasti tehnike, koje su opširno opisane u patentnoj i naučnoj literaturi. Čvrsta podloga može biti bilo koji materijal poznat stručnjacima u struci na koje se antitelo može vezati. Na primer, čvrsta podloga može biti test bazenčić u mikrotitarskoj ploči ili nitrocelulozni filter ili druga pogodna membrana. Alternativno, podloga može biti zrno ili disk, kao što je staklo, stakleno vlakno, lateks ili plastični materijal, kao što je polistiren ili polivinilhlorid. Nosač može biti i magnetna čestica ili vlaknasti optički senzor. Videti Jorgenson R, i sar., US 5,359,681.
[0040] Antitelo može biti imobilisano na čvrstoj podlozi korišćenjem raznih tehnika poznatih onima u struci, koje su opširno opisane u patentnoj i naučnoj literaturi. U kontekstu sadašnjeg pronalaska imobilizacija uključuje i nekovalentno udruživanje, kao što je adsorpcija, i kovalentno vezivanje (koje može biti direktna veza između antigena i funkcionalnih grupa na nosaču ili može biti veza preko agensa unakrsnog povezivanja). Poželjna je imobilizacija putem adsorpcije na bazenčiću u mikrotitarskoj ploči ili na membrani. U takvim slučajevima, adsorpcija može biti postignuta kontaktiranjem antitela, u odgovarajućem puferu sa čvrstim nosačem, tokom odgovarajućeg vremenskog perioda. Vreme kontakta varira sa temperaturom, ali je tipično između oko 1 sata i 1 dana. U jednom aspektu, kontaktiranje bazenčića plastične mikrotitarske ploče (kao što je polistiren ili polivinilhlorid) sa količinom antitela u rasponu od oko 10 ng do oko 1 μg, a poželjno oko 100-200 ng, dovoljno je da imobiliše adekvatnu količinu polipeptida.
[0041] Kovalentno vezivanje antitela na čvrstu podlogu, takođe se može postići prvo reagovanjem podloge sa bi-funkcionalnim reagensom, koji će reagovati i sa nosačem i funkcionalnom grupom, kao što je hidroksil ili amino grupa, na antitelu. Na primer, antitelo može biti kovalentno vezano za nosače, koji imaju odgovarajuću polimernu oblogu korišćenjem benzohinona ili kondenzovanjem aldehidne grupe na podlozi sa aminom i aktivnim vodonikom na vezujućem partneru, korišćenjem dobro poznatih tehnika.
[0042] Alternativno, umesto imobilizacije neutrališućeg antitela na nosač ili kovalentno ili nekovalentno, pronalazak obuhvata mogućnost imobilizacije antitela vezivanjem za prvo antitelo specifično za Fc ili fragment antitela protiv Fc; koje je prethodno imobilisano na podlozi. Pored toga što pomaže u hvatanju antitela, prvo antitelo usmerava neutrališuće antitelo, kako bi se povećao procenat imobilisanih antitela koja su aktivna za vezivanje za članove virusne biblioteke. Na primer, imobilizacija se može izvesti tako što se prvo kontaktira antitelo koje je imobilisano na čvrstoj podlozi, obično bazenčiću mikrotitarske ploče sa bibliotekom, tako da je onim virusima unutar biblioteke koji pokazuju afinitet prema uzorku neutrališućeg antitela dozvoljeno da se vezuju na imobilisano antitelo. Nevezani uzorak se zatim uklanja iz imobilisanih kompleksa antitelo-virus. Specifičnije, kada je antitelo imobilisano na nosaču, kao što je prethodno opisano, preostala mesta vezivanja proteina na nosaču su obično blokirana.
A.2 Korak odvajanja
[0043] U drugom koraku, RIS metod pronalaska obuhvata odvajanje onih članova biblioteke rekombinantnih virusa koji se vezuju za neutrališuće antitelo od članova koji se ne vezuju, na osnovu njihove sposobnosti da se vezuju za neutrališuće antitelo.
[0044] Navedeni korak odvajanja može se odnositi na fizičko odvajanje (npr. na zrnima ili FACS) ili uklanjanje čvrste faze iz reakcione smeše ili može da se odnosi na korak u kojem je čvrsta faza podvrgnuta jednom ili više koraka pranja, kako bi se uklonile druge komponente reakcione smeše. U aspektima, gde se vrši fizičko odvajanje ili uklanjanje čvrste faze, tada, poželjno, čvrsta faza takođe podleže jednom ili više koraka pranja.
[0045] Koraci pranja mogu biti izvedeni na odgovarajući način u zavisnosti od prirode čvrste faze i interaktivnih partnera vezivanja vezanih za nju. Odgovarajuće metode pranja čvrste faze čestica su dobro poznate stručnjaku u tehnici. Na primer, ako je čvrsta faza čestica, koraci pranja mogu se odvijati centrifugiranjem čestica pod takvim uslovima da formiraju pelete dok se supernatant uklanja. Zatim, čestice mogu biti ponovo suspendovane u odgovarajućem vodenom medijumu (npr. isti medijum koji se koristi u koraku kontaktiranja). Kriterijum pranja (ili zaista, kontaktni korak) se može modifikovati dodavanjem odgovarajućih reagensa, koji su dobro poznati stručnjaku u tehnici (npr. Tween) kako bi, na primer, smanjili pozadinsko ili nespecifično vezivanje. Ovakvi koraci peletiranja i ponovnog suspendovanja bi činili jedno pranje. Bilo koji odgovarajući broj pranja se može obaviti. Ako je, međutim, čvrsta faza bila magnetna, tada su koraci pranja mogli pogodno biti izvedeni primenom magnetnog polja u posudi u kojoj je izveden kontaktni kontakt, uklanjanjem supernatanta i ponovnog suspendovanja čvrste faze u odgovarajućem vodenom medijumu. Takvi koraci magnetskog odvajanja i ponovnog suspendovanja činili bi jedan korak pranja i mogao bi se izvesti bilo koji odgovarajući broj pranja. Ako čvrsta podloga nije čestična (npr. ravna površina kao što je ploča, posuda ili filter), onda su opet odgovarajuće metode pranja takvih čvrstih faza dobro poznate stručnjaku u datoj oblasti tehnike.
[0046] Pored gore opisanih opcionih koraka pranja, treba napomenuti da se jedan ili više koraka pranja mogu izvesti i u bilo kojoj drugoj odgovarajućoj fazi u RIS metodi. Na primer, jedan ili više koraka pranja čvrstih faza takođe se mogu izvesti nakon što se izvrši bilo koji korak imobilizacije, na primer, za uklanjanje neutrališućih antitela koja nisu vezana za čvrstu fazu. Zaista, takvi koraci pranja su poželjni. Takođe, jedan ili više koraka pranja mogu se obavljati na čvrstim fazama u drugim odgovarajućim vremenimskim periodima u toku postupka za uklanjanje, na primer, nevezanih entiteta. Broj potrebnih pranja može lako utvrditi stručnjak.
[0047] Jednom kada se uklanjaju komponente reakcione smeše koje se slabije vezuju ili vezuju nespecifično za neutrališuća antitela, korak odvajanja se konačno izvodi eluiranjem onih članova biblioteke rekombinantnih virusa koji su se vezali specifično za neutrališuća antitela. U zavisnosti od vrste imobilizacije, pomenuti korak eluiranja može da se izvede bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je npr. korišćenjem alkalnog, deterdženta ili sličnog sredstva koji kida nekovalentne veze, nakon čega sledi neutralizacija, kako bi omogućio partnerima u interakciji ponovno uvijanje i vezivanje jednih za druge. U slučaju biotinskih oznaka, generalno, konstrukti biblioteka koji sadrže takve oznake su konstruisani tako da sadrže neku vrstu mesta za cepanje, kao što je proteazno mesto, mesto restrikcionog enzima ili razdvojeni S-S linker ostatak koji se može otvoriti pomoću ditiotreitola (DTT). TEA, takođe može biti korišćen. Mesta cepanja, kao što su ona gore opisana, mogu biti korišćena sa bilo kojim tipom oznake, kako bi se omogućilo ili olakšalo eluiranje.
[0048] Oslobađanje virusa iz neutrališućeg antitela kao rezultat koraka elucije može se obično izvršiti merenjem prisustva jednog ili više virusnih polipeptida u supernatantu. U poželjnom aspektu, testirani polipeptid je virusni kapsidni polipeptid. Kada se posebno koristi biblioteka HIV-a, neograničavajući primeri proteina HIV-a koji mogu biti pogodni za upotrebu u aspektima, ovde predstavljenim, uključuju HIV gag proteine p53, p24, pl7, p7, p6, p2 ili p1, HIV env glikoproteine gp120, gp41 ili gp160, HIV enzime uključujući integrazu (p31), reverznu transkriptazu (p51 ili p66), RNazu H (p15), proteaze (p10), HIV nef proteine (p25 / p27), HIV vif protein p23, HIV rev protein p19, HIV vpr protein (p12/p10), HIV vpu protein (p16) ili HIV tat proteine (p16/p14). U poželjnom aspektu, polipeptid HIV-a testiran da uspostavi da li je odabrani virus efikasno eluiran iz neutrališućeg antitela je p24.
[0049] Kako se ovde koristi, izraz "HIV p24" se odnosi na genski proizvod gag regiona HIV-a, okarakterisan tako da ima očiglednu relativnu molekulsku težinu od oko 24,000 daltona. Izraz "HIV p24" se takođe odnosi na modifikacije i fragmente p24, koji imaju imunološku aktivnost p24.
[0050] P24 može biti izmeren pomoću enzimskih imunoloških analiza, dok otkrivanje vezanih p24 zahteva prethodno tretiranje kiselinom do disocijacije kompleksa. Iako se procedure razlikuju između proizvođača, HIV p24 antigen testovi koriste ELISA tehnologiju sa modifikacijama za detekciju antigena, ne antitela. U reprezentativnom testu, kao što je tip "sendvič antitela", specifično monoklonsko antitelo za HIV p24 je vezano za čvrstu fazu (mikrotitarsku ploču - bazenčić ili polistirensko zrno), koja deluje da "zarobi" virusni antigen u uzorku kada je dodat. Deterdžent (npr. Triton X100) se dodaje da bi poremetio virione i ako je antigen prisutan u medijumu, antigen će se vezati na monoklonsko antitelo na čvrstoj fazi.
A.3 Korak otkrivanja
[0051] U trećem koraku, RIS postupak prema pronalasku obuhvata određivanje sekvence pomenutog varijantnog peptida prikazanog na površini virusa na onim članovima biblioteke odabranih u koraku (ii).
[0052] Kada jedan ili više setova interaktivnih članova virusnih biblioteka budu izabrani ili izolovani u skladu sa metodama pronalaska, oni se podvrgavaju daljoj analizi. Pomenute dalje analize ili upotrebe, generalno zahtevaju da se partneri za vezivanje kandidata odvoje, uklone, izoluju ili eluiraju iz neutrališućeg antitela i dalje eksprimiraju ili proizvedu. Stoga, postupak prema sadašnjem pronalasku dalje sadrži korak u kome se pomenuti članovi virusne biblioteke sposobni da specifično intereaguju sa neutrališućim antitelom odvajaju, uklanjaju, eluiraju ili poželjno izoluju ili su izraženi ili proizvedeni izolovano jedni od drugih. Pomenute dalje analize, generalno podrazumevaju izolaciju pojedinačnih interaktivnih članova biblioteke putem izolacije RNK iz vezanih virusa, reverznog prepisivanja virusne RNK u cDNK i kloniranje pomenute cDNK u pogodan ekspresioni vektor.
[0053] Jednom kada su DNK, koje kodiraju vezujuće partnere klonirane u pogodnom ekspresionom vektoru, DNK koja kodira vezujućeg partnera može biti sekvencirana ili protein može biti eksprimiran u rastvorljivom obliku i podvrgnuti odgovarajućim vezivnim studijama, kako bi se dalje okarakterisali kandidati na nivou proteina. Odgovarajuće studije vezivanja će zavisiti od prirode vezujućih partnera i uključuju, ali nisu ograničene na metodu ELISA, testove skrininga filtera, FACS ili imunofluorescentne analize, BiaCore merenja afiniteta ili druge metode za kvantifikaciju konstanti vezivanja, bojenje slajdova tkiva ili ćelija i drugih imunohistohemijske metode. Takve metode su dobro utvrđene u literaturi i jedna ili više njih se mogu koristiti za analizu odabranih varijanti proteina omotača.
[0054] Kao što je prethodno pomenuto, odgovarajuće metode za analizu individualnih interaktivnih partnera za vezivanje su poznate u struci. Jedna od omiljenih metoda biće sekvenciranje genetskog materijala virusa iz biblioteke, koji se specifično vezuje za neutrališuće antitelo.
[0055] Tipično, u slučaju retrovirusa koji imaju RNK kao genetski materijal, korak otkrivanja uključuje izolaciju RNK, reverznu transkripciju RNK da bi se dobila jednolančana cDNK, tretiranje jednolančane DNK, kako bi se dobila dvostruko lančana DNK i kloniranje dvostruke lančane cDNK u vektoru izbora i sekvenciranje cDNK.
[0056] Reverzna transkripcija se izvodi korišćenjem metoda koje su poznate stručnjaku i mogu se izvoditi izotermalno, kao i korišćenjem termostabilnih RNK polimeraza u prisustvu RNK-zavisne DNK polimeraze, uključujući, bez ograničenja, AMV, klonirani AMV, MMLV, SuperscriptII, ReverTraAce, Tth reverznu transkriptazu, reverznu transkriptazu hepatitisa B, reverznu transkriptazu virusa mozaika karfiola, bakterijsku reverznu transkriptazu i Thermoscript. Enzimi korišćeni u sadašnjem pronalasku, uključuju one koji imaju smanjenu, suštinski smanjenu ili potpuno eliminisanu aktivnost RNaze H. Enzimom sa "suštinski smanjenom aktivnošću RNaze H" podrazumeva se enzim koji ima manje od oko 20%, poželjno manje od oko 15%, 10% ili 5%, a najpoželjnije manje od oko 2% aktivnosti RNaze H odgovarajućeg divljeg tipa ili enzima RNaze H+, kao što su reverzne transkriptaze divljeg tipa Moloney virusa mišje leukemije (M-MLV), Ptičjeg mijeloblastoznog virusa (AMV) ili Rous sarkomnog virusa (RSV). Aktivnost RNaze H bilo kog enzima može biti određena raznim poznatim testovima. Videti Kotewicz M, i sar., Nucl. Acids Res. 1988; 16: 265-277, Gerard G, i sar., Focus 1992; 14 (5): 91-93, i Kotewicz M, i sar., US 5,244,797. Posebno poželjni polipeptidi za upotrebu u pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na M-MLV reverznu transkriptazu, RSV reverznu transkriptazu, AMV reverznu transkriptazu, RAV (Rous-pridruženi virus) reverznu transkriptazu, MAV (mijeloblastoza-povezani virus) reverznu transkriptazu i HIV reverznu transkriptazu. Vidi Kotewicz M, i sar., US 5,244,797, i Gerard G, i sar., WO1998047912. Međutim, obično će biti shvaćeno od strane stručnjaka, da svaki enzim sposoban za proizvodnju molekula DNK iz molekula ribonukleinske kiseline (tj., koji ima aktivnost reverzne transkriptaze) može biti ekvivalentno korišćen u preparatima, postupcima i kompletima pronalaska. Jednolančana cDNK se može tretirati tako da se dobije dvolančana DNK, korišćenjem bilo koje metode poznate u struci. Poželjno, konverzija jednolančane cDNK u dvolančanu DNK se vrši korišćenjem in vitro tehnologija amplifikacije, kao što su polimerazna lančana reakcija (PCR), lančana reakcija ligazom (LCR), amplifikacija bazirana na sekvenci nukleinskih kiselina (NASBA), amplifikacija pomeranjem lanaca (LDAP), amplifikacija posredovana transkripcijom (TMA), tehnologija razgranate DNK (bDNK), amplifikacija DNK uz pomoć linkera (LADA), amplifikacija Q-beta replikaze (Q-beta), izotermalna amplifikacija pomoću petlje (LAMP) i amplifikaciona tehnologija Rolling Circle (RCAT) ili drugih in vitro enzimskih tehnologija amplifikacije. Korak umnožavanja (amplifikacije) se izvodi korišćenjem prajmera koji odgovaraju sekvencama adapterskih regiona. Dobijena dvostruko-lančana DNK može biti prečišćena korišćenjem kolone za prečišćavanje, elektromagnetnih perli na koje je vezan prajmer, ili elektroforezom kroz agarozni gel.
[0057] Dobijena dvolančana DNK se zatim može ubaciti u izabrani vektor, korišćenjem metoda poznatih u struci. U poželjnom aspektu, prajmeri koji se koriste tokom koraka PCR-amplifikacije sadrže unutar njihovih 5’ regiona ciljna mesta za restrikcione endonukleaze, koje generišu kompatibilne krajeve sa onima prisutnim u vektoru od izbora. Ciljna mesta endonukleaze omogućavaju generisanje kohezivnih krajeva, koji se mogu koristiti za kloniranje polinukleotida u odgovarajućim vektorima.
[0058] Korak sekvenciranja se može izvršiti korišćenjem bilo kog poznatog sredstva za sekvenciranje, kao što je hemijsko sekvenciranje (Maxam-Gilbert), Sanger dideoksi sekvenciranje, pirosekvenciranje, sekvenciranje detekcijom fluorescencije i sekvenciranje DNK masenom spektrometrijom.
B. Imunogeni polipeptidi, polinukleotidi, vektori i ćelije domaćina
[0059] Metoda brze selekcije imunogena (RIS) prema sadašnjem pronalasku omogućava identifikaciju polipeptida, koji predstavljaju polipeptidne varijante prikazane na površini virusa i koji su kandidati za generisanje neutrališućih antitela i stoga, za njihovu upotrebu kao imunogenih preparata ili vakcina. Stoga, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptide koji su identifikovani metodom iz pronalaska. Izraz "polipeptid", koji je ovde korišćen zamenljivo sa proteinom, odnosi se na lanac aminokiselina bilo koje dužine, pri čemu su različite aminokiseline povezane jedne sa drugima pomoću peptidnih veza ili disulfidnih mostova.
[0060] U posebnom slučaju, gde je odabrani virus prema postupku pronalaska retrovirus, onda je polipeptid varijanta proteina omotača. U poželjnom aspektu, retrovirus je HIV, a polipeptid u skladu sa sadašnjim pronalaskom je varijanta gp120.
[0061] Polipeptid identifikovan prema RIS metodu pronalaska poželjno, sadrži najmanje jednu mutaciju u regionu, izabranom iz grupe koju čine konstantni region C1, varijabilni region V1, varijabilni region V2, konstantni region C2, konstantni region C5 i ektodomen gp41.
[0062] U poželjnijem aspektu, mutacija u konstantnom regionu C1 je mutacija na položaju 88. U poželjnijem aspektu, mutirani ostatak na položaju 88 je Asp. U još poželjnijem aspektu, mutacija u konstantnom regionu C1 je mutacija N88D.
[0063] U poželjnijem aspektu, mutacija u varijabilnom regionu V1 je mutacija na jednom ili više položaja, odabranih iz grupe koja se sastoji od položaja 131, 132 i 138. U poželjnijem aspektu, mutirani ostaci na položajima 131, 132 i 138 u regionu V1 su Y, N i/ili G, respektivno. U još poželjnijem aspektu, mutacija u regionu V1 je C131Y, T132N i/ili D138G.
[0064] U poželjnijem aspektu, mutacija u varijabilnom regionu V2 je mutacija na jednom ili više položaja, odabranih iz grupe koja se sastoji od položaja 160 i 187. U poželjnijem aspektu, mutirani ostaci u regionu V2 su Y na položaju 160 i/ili Asp na položaju 187. U još poželjnijem aspektu, mutacija u regionu V2 je N160Y i/ili N191D.
[0065] U poželjnijem aspektu, mutacija u konstantnom regionu C2 je mutacija na položaju 219. U poželjnijem aspektu, mutirani ostatak na položaju 219 u regionu C2 je Val. U još poželjnijem aspektu, mutacija u regionu C2 je I219V.
[0066] U poželjnijem aspektu, mutacija u konstantnom regionu C5 je mutacija na jednom ili više položaja, odabranih iz grupe koja se sastoji od položaja 479 i 507. U poželjnijem aspektu, mutirani ostaci na položajima 479 i 507 u regionu C5 su Ile i Trp, respektivno. U još poželjnijem aspektu, mutacija u regionu C5 je M475I i/ili R507W.
[0067] U poželjnijem aspektu, varijanta gp120 ili njegov fragment prema pronalasku mutant nosi mutacije C131Y, T132N, D138G i N160Y.
[0068] U poželjnijem aspektu, varijanta gp120 ili njegov fragment prema pronalasku mutant nosi mutacije N88D, C131Y, T132N, D138G, N160Y, N191D, A226V, M479I, R507W i Y647N.
[0069] U drugom aspektu, varijanta gp120 ili njegov fragment prema pronalasku nosi N203S i G604E mutacije.
[0070] U poželjnijem aspektu, mutacija u gp41 ektodomenu je T643N.
[0071] Numerisanje gore pomenutih položaja se odnosi na sekvencu gp160 preproteina kodiranog env genom (SEK ID BR: 1) izolata HIV AC10 HXb2 prikazanog u SEK ID BR: 2, koji je kodiran env genom prikazanim u SEK ID BR: l. Videti Li, 2005, supra i NCBI pristupni broj AY835446. Imunogeni polipeptid prema pronalasku obuhvata env polipeptid LR1-C1 izolata (SEK ID BR: 4) kodiran pomoću polinukleotida SEK ID BR: 3. LR1-C1 izolat sadrži mutacije N88D, C131Y, T132N, D138G, T132N, N160Y, N191D, A226V, M479I, R507W i Y647N u odnosu na numerisanje SEK ID BR: 2.
[0072] U poželjnom aspektu, imunogeni polipeptid prema pronalasku sadrži env polipeptid klona 10 izolovan sa PG16 antitelom (SEK ID BR: 31) ili njegovim fragmentom. Modifikovana sekvenca prikazuje mutacije N203S i G604E.
[0073] U poželjnom aspektu, imunogena varijanta gp120 prema pronalasku ili njegov fragment sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 18, SEK ID BR: 19, SEK ID BR: 20, SEK ID BR: 21, SEK ID BR: 22, SEK ID BR: 23, SEK ID BR: 24, SEK ID BR: 25, SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 28, SEK ID BR: 29 i SEK ID BR: 31.
[0074] Iako su mutanti gp120, koji pokazuju povećani afinitet prema neutrališućim antitelima utvrđeni u sadašnjem opisu, izvedeni su iz AC 10 HIV izolata (NCBI pristupni broj AY835446 i env gena prikazanog u SEK ID BR: l), biće priznato da imunogeni polipeptidi prema sadašnjem pronalasku mogu da potiču iz drugih HIV izolata zamenom odgovarajućih položaja u env genu pomenutih drugih HIV izolata. Odgovarajući položaji u drugim HIV izolatima mogu biti utvrđeni bez dalje teškoće, korišćenjem bilo kojeg pogodnog algoritma za poravnanje sekvence.
[0075] Metode poravnanja sekvenci za upoređivanje su dobro poznate u struci. Optimalno poravnanje sekvenci za upoređivanje može biti sprovedeno, na primer, sa lokalnim algoritmom homologije Smith-Watermana, algoritmom homologije poravnanja Needleman-Wunscha, pomoću metode pretraživanja sličnosti Pearson-Lipmana, pomoću kompjuterizovanih implementacija ovih algoritama ili ručnim poravnanjem i vizuelnim pregledom. Videti Smith T, Waterman M, Adv. Appl. Math.1981;2: 482-489; Needleman S, Wunsch C, J. Mol. Biol. 1970; 48: 443-453; Pearson W, Lipman D, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448; GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA programs, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, SAD; Ausubel F, i sar., Izd, "Kratki protokoli u molekularnoj biologiji", 4. izd. (John Wiley and Sons, Inc., Njujork, NY, SAD).
[0076] "Fragment" je jedinstveni deo polinukleotida, koji kodira HIV-1 polipeptid omotača iz sadašnjeg pronalaska, kraći u dužini od roditeljske sekvence. Slično, izraz "fragment" se odnosi na HIV-1 polipeptid omotača iz sadašnjeg pronalaska, koji sadrži do celokupne dužine definisane peptidne sekvence minus jedan aminokiselinski ostatak i njegovu nukleotidnu sekvencu kodiranja. Na primer, fragment može sadržati od 5 do 2500 susednih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka. Fragment koji se koristi kao proba, prajmer, antigen, terapeutski molekul ili u druge svrhe može biti najmanje 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250, 500 ili najmanje 700 susednih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka u dužini. Fragmenti mogu biti prioritetno odabrani od određenih regiona molekule. Na primer, polipeptidni fragment može sadržati određenu dužinu susednih aminokiselina odabranih od prvih 250 ili 500 aminokiselina (ili prvih 25 ili 50 procenata) polipeptida, kao što je prikazano u određenoj definisanoj sekvenci. Očigledno je da su ove dužine primerne, a svaka dužina koja je podržana specifikacijom, uključujući listing sekvenci, tabele i slike, može biti obuhvaćena sadašnjim aspektom. Sadašnje obelodanjivanje se odnosi na konstrukte nukleinskih kiselina, uključujući polinukleotidne sekvence koje kodiraju antigenske gp120 polipeptide HIV-1. Ovi polinukleotidi uključuju DNK, cDNK i RNK sekvence koje kodiraju polipeptid od interesa.
[0077] Izraz "polinukleotid", kako se koristi u ovom pronalasku, odnosi se na polimer, koji se formira promenljivim brojem monomera, gde su monomeri nukleotidi, uključujući i ribonukleotide i deoksiribonukleotide. Polinukleotidi uključuju monomere modifikovane metilacijom, kao i nemodifikovane oblike. Izrazi "polinukleotid" i "nukleinska kiselina" se koriste izmenično u ovom pronalasku i uključuju mRNA, cDNK i rekombinantne polinukleotide. Kao što se koristi u ovom pronalasku, polinukleotidi nisu ograničeni na polinukleotide, kao što se javljaju u prirodi, ali uključuju polinukleotide koji sadrže nukleotidne analoge koji nisu prirodni i internukleotidne veze.
[0078] Metode za manipulaciju i umetanje nukleinskih kiselina ovog pronalaska u vektore su dobro poznate u struci. Videti Sambrook, 1989, supra i Ausubel F, i sar., Izd., "Kratki protokoli u molekularnoj biologiji", 4. izd. (John Wiley and Sons, Inc., Njujork, NY, SAD, 2002).
[0079] Tipično, konstrukti nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide gp120 iz pronalaska su plazmidi. Međutim, drugi vektori (npr. virusni vektori, fag, kosmidi) mogu biti korišćeni za replikovanje nukleinskih kiselina. U kontekstu ovog pronalaska, konstrukti nukleinskih kiselina su tipično ekspresioni vektori koji sadrže promotersku sekvencu, koja olakšava efikasnu transkripciju ubačene genetičke sekvence. Ekspresioni vektor tipično sadrži poreklo replikacije, promotera, kao i specifične sekvence nukleinskih kiselina, koje omogućavaju fenotipsku selekciju transformisanih ćelija.
[0080] Generalno, polinukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptide gp120 iz ovog pronalaska mogu biti operativno povezane sa bilo kojim promoterom i/ili inhenserom, koji je sposoban da vodi ekspresiju nukleinske kiseline nakon uvođenja u ćeliju domaćina. Promoter je niz kontrolnih sekvenci nukleinske kiseline, koji usmerava transkripciju nukleinske kiseline. Promoter uključuje potrebne sekvence nukleinskih kiselina (koje mogu biti) blizu mesta početka transkripcije, kao što je u slučaju promotera tipa polimeraze II (TATA element). Promoter takođe može da uključuje distalnog inhensera ili represorske elemente koji se mogu nalaziti čak i kao nekoliko hiljada baznih parova sa početnog mesta transkripcije. Uključeni su i konstitutivni i inducibilni promoteri. Videti Bitter G, i sar., Meth. Enzymol.
1987; 153: 516-544.
[0081] Da bi se proizveli takvi konstrukti nukleinskih kiselina, polinukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptide gp120 se ubacuju u pogodan ekspresioni vektor, kao što je ekspresioni vektor plazmida. Postupci za proizvodnju polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju polipeptide gp120 i za manipulaciju njima in vitro su dobro poznati stručnjacima u datoj oblasti tehnike. Videti Sambrook, 1989, i Ausubel, 2002, supra.
[0082] Polinukleotidne sekvence koje kodiraju imunogeni gp120 polipeptid mogu biti ubačene u ekspresioni vektor koji uključuje, ali nije ograničen na, plazmid, virus ili drugi nosač koji se može manipulisati, kako bi se omogućilo ubacivanje ili inkorporiranje sekvenci i može se eksprimovati bilo u prokariotima ili u eukariotima. Domaćini mogu da uključuju mikrobiološke, kvasne, insektne i sisarske organizme. Metode ekspresije sekvenci DNK koje imaju eukariotske ili virusne sekvence u prokariotima su dobro poznate u tehnici. Biološki funkcionalni virusni i plazmidni DNK vektori sposobni za ekspresiju i replikaciju u domaćinu su poznati u tehnici.
[0083] Transformacija ćelije domaćina sa rekombinantnom DNK se može izvoditi konvencionalnim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima u struci. Gde je domaćin prokariotski, kao što je E. coli, kompetentne ćelije koje su sposobne za preuzimanje DNK mogu se pripremiti od ćelija sakupljenih nakon eksponencijalne faze rasta i naknadno tretiranih pomoću metode CaCl2,korišćenjem postupaka dobro poznatih u struci. Alternativno, može se koristiti MgCl2ili RbCl. Transformacija takođe može biti izvedena nakon formiranja protoplasta ćelije domaćina ako je poželjno, ili elektroporacijom.
[0084] Kada je domaćin eukariot, takve metode transfekcije DNK kao koprecipitata kalcijum fosfata mogu se koristiti konvencionalne mehaničke procedure kao što su mikroinjektiranje, elektroporacija, ubacivanje plazmida zatvorenih u liposomima ili virusnim vektorima. Eukariotske ćelije takođe mogu biti ko-transformisane sa polinukleotidnim sekvencama, koje kodiraju imunogeni gp120 polipeptid, a drugi strani molekul DNK koji kodira selektabilni fenotip, kao što je gen za timidin kinazu herpes simpleksa. Druga metoda je da se koristi eukariotski virusni vektor, kao što je Simijan virus 40 (SV40) ili goveđi papilloma virus, da prolazno inficiraju ili transformišu eukariotske ćelije i eksprimiraju protein. Videti Gluzman Y, Izd.,"Eukariotski Virusni Vektori" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, SAD, 1982).
C. Antitela
[0085] Varijante gp120 i njihovi fragmenti prema predmetnom pronalasku takođe mogu biti korišćeni za generisanje antitela sposobnih za prepoznavanje i neutralisanje HIV-a, kada su virus ili njegove čestice prisutne u biološkoj tečnosti subjekta. Stoga, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo koje se specifično vezuje za imunogeni polipeptid prema pronalasku. Kao što se koristi u sadašnjem pronalasku, izraz "antitelo" odnosi se na monomerni ili multimerni protein koji sadrži najmanje jedan polipeptid koji ima sposobnost vezivanja za određeni antigen i koji obuhvata celi ili deo varijabilnog regiona lakog ili teškog lanca molekule imunoglobulina. Antitela iz ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničena na, monoklonska antitela, monospecifična antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela, dimere, trimere, tetramere, humana antitela, humanizovana antitela, kamelizovana antitela, himerna antitela, antitela sa jednim lancem, antitela sa jednim domenom, Fab fragmente, F(ab') fragmente, F(ab')2fragmente, Fv fragmente (tj. najmanji funkcionalni modul antitela), Fvs sa jednim lancem (scFv), disulfidno stabilizovani Fvs (dsFv), Fd, VH, VL, Vα, Vβi anti-idiotipska (anti-Id) antitela (npr. anti-Id antitela na antitela iz pronalaska), intratela i fragmente koji se vezuju za epitop bilo kojeg od prethodno navedenih. U nekim aspektima, antitela su monoklonska antitela. U drugim aspektima, antitela su Fv fragmenti, uključujući VHi VL, regione.
[0086] Ova antitela mogu biti generisana konvencionalnim sredstvima korišćenjem peptida iz ovog pronalaska. Videti Kieber-Emmons T, i sar., WO 1991004273. Na primer, poliklonska antitela mogu biti generisana konvencionalnim stimulisanjem imunog sistema odabrane životinje sa jednim ili oba prethodno identifikovana peptida ili multivalentnim konstruktima, omogućavajući imunskom sistemu da proizvodi prirodna antitela na njih i sakupljanje ovih antitela iz životinjske krvi ili druge biološke tečnosti. Poliklonska antitela visokog titra mogu biti dobijena korišćenjem multivalentnih konstrukata opisanih iznad kao antigena. Dobijena antitela su sposobna da vezuju izabrani HIV antigen kao što se to pojavljuje u biološkim tečnostima inficiranog subjekta.
[0087] Dodatno, peptidi iz sadašnjeg pronalaska se takođe mogu koristiti za generisanje antitela, koja se mogu koristiti kao šabloni za stvaranje anti-idiotipskih antitela, koja imaju unutrašnju sliku neutrališuće epitopne strukture sadržane u peptidnoj sekvenci. Ova antitela, poliklonska ili monoklonska, mogu onda biti korišćena u formulacijama vakcina ili u aktivnoj imunoterapiji. Shodno tome, sadašnji pronalazak takođe uključuje monoklonska ili poliklonska antitela koja nose unutrašnju sliku peptida, kao i metode za generisanje ovih antitela. Videti Kieber-Emmons, supra.
[0088] Gde je poželjno da se dobiju i koriste monoklonska antitela (MAt) za preparate i postupke iz ovog pronalaska, hibridomske ćelijske linije koje eksprimiraju poželjna MAt-a mogu biti generisane, korišćenjem raspoloživih linija tumorskih ćelija sa dobro poznatim konvencionalnim tehnikama. Videti Kohler G, Milstein C, Nature 1975; 256 (5517): 495-497.
[0089] Rekombinantna antitela mogu biti generisana korišćenjem poznatih tehnika za njihovu proizvodnju. Videti Huse W, i sar., Science 1989; 246: 1275-1281. Poželjna antitela visokog titra mogu takođe biti generisana primenom poznatih rekombinantnih tehnika za monoklonska ili poliklonska antitela, razvijenim za ove antigene. Videti Amit R, i sar., Science 1986; 233: 747-753, Queen C, i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 86: 10029-10033; Riechmann L, i sar., Nature 1988; 332: 323-327, i Barbas C, i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 4457-4461 i Winter P, GB 2188638.
D. Imunogene kompozicije sposobne da generišu neutrališuća antitela
[0090] Polipeptidi varijante gp120 i molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide varijante gp120, ovde opisane, mogu biti korišćeni kao imunogeni ili za proizvodnju imunogena za izazivanje imunološkog odgovora (imunogene kompozicije) protiv gp120 ili gp120 eksprimiranog virusom, za sprečavanje, smanjenje ili kontrolu, na primer, HIV-1 infekcije ili njenih srodnih simptoma. Nakon primene terapeutski efikasne količine otkrivenih terapeutskih preparata, subjekt može biti praćen na HIV-1 infekciju, simptome povezane sa HIV-1 infekcijom ili oboje. Stoga, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na imunogeni preparat koji sadrži polipeptid varijante HIV-1 gp120 ili njegov imunogeni fragment prema pronalasku, polinukleotid koji kodira navedeni polipeptid ili ekspresioni vektor koji sadrži navedeni polinukleotid.
[0091] Odgovarajući imunogeni fragmenti gp120 pogodni za upotrebu u imunogenim preparatima uključuju peptide relativno male veličine, kao što su veličine oko 5 do 100 aminokiselina, na primer oko 5, oko 6, oko 7, oko 8, oko 9, oko 10, oko 15, oko 20, oko 25, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 80, oko 90, ili oko 100. Stoga, fragmenti (npr. epitopi ili drugi antigeni fragmenti) polipeptida gp120, kao što je bilo koji od polipeptida gp120, ovde opisanih ili njegov fragment, mogu biti korišćeni kao imunogeni.
[0092] Izraz "imunogeni preparat" odnosi se na kompoziciju koja izaziva imunološki odgovor koji proizvodi antitela ili ćelijski-posredovane imuno odgovore na određeni imunogen. Injektabilne kompozicije mogu biti pripremljene, na primer, kao tečni rastvori, suspenzije i emulzije. Izraz "antigenski preparat" se odnosi na kompoziciju koja može biti prepoznata od strane imunskog sistema domaćina. Na primer, antigenski preparat sadrži epitope koji mogu biti prepoznati humoralnim (npr. antitelo) i/ili ćelijskim (npr. T limfociti) komponentama imunskog sistema domaćina.
[0093] Izraz "vakcina" se odnosi na imunogeni preparat za in vivo primenu na domaćinu, koji može biti primat, posebno humani domaćin, da bi pružio zaštitu od bolesti, posebno virusne bolesti.
[0094] Imunogeni preparati prema pronalasku su korisni za lečenje ili prevenciju bolesti uzrokovanih HIV infekcijom. U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na peptid, nukleinsku kiselinu, vektor, imunogeni preparat ili vakcinu prema pronalasku, za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koja je rezultat infekcije HIV-1. Alternativno, pronalazak se odnosi na upotrebu peptida, nukleinske kiseline, vektora, imunogenog preparata ili vakcine prema pronalasku za proizvodnju leka za prevenciju bolesti koja je rezultat infekcije HIV-1. Alternativno, pronalazak se odnosi na postupak za prevenciju bolesti kod subjekta, koja je rezultat HIV-1 infekcije, koja obuhvata primenu kod navedenog subjekta peptida, nukleinske kiseline, vektora ili imunogenog preparata ili vakcine prema pronalasku.
[0095] Izraz "lečenje", kao što se ovde svuda koristi, obuhvata bilo koju vrstu terapije, koja ima za cilj okončanje, sprečavanje, poboljšanje i/ili smanjenje podložnosti prema kliničkom stanju, kao što je ovde opisano. U poželjnoj realizaciji, izraz lečenje se odnosi na profilaktički tretman (tj. terapiju za smanjenje osetljivosti kliničkog stanja, poremećaja ili stanja, kao što je ovde definisano).
[0096] Stoga, "lečenje", "tretiranje" i slično, kako se ovde koriste, odnose se na dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta, koji obuhvata bilo koje tretiranje patološkog stanja ili poremećaja kod sisara, uključujući i čoveka. Efekat može biti profilaktički u smislu potpunog ili delimičnog sprečavanja poremećaja ili njegovog simptoma i/ili može biti terapeutski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja za poremećaj i/ili neželjeni uticaj koji se može pripisati poremećaju. To znači da "lečenje" uključuje (1) sprečavanje poremećaja da se pojavljuje ili ponavlja kod subjekta, (2) sprečavanje poremećaja, kao što je sprečavanje njegovog razvoja, (3) zaustavljanje ili završetak poremećaja ili bar simptoma povezanih s ovim, tako da domaćin više ne pati od poremećaja ili njegovih simptoma, kao što je izazivanje regresije poremećaja ili njegovih simptoma, na primer, obnavljanjem ili popravkom izgubljene, nedostajuće ili defektne funkcije ili podsticanjem neefikasnog procesa ili (4) oslobađanjem, ublažavanjem ili poboljšanjem poremećaja, ili simptoma povezanih s njim, gde se ublažavanje koristi u širem smislu tako se odnosi na najmanje smanjenje veličine parametra, kao što su inflamacija, bol i/ili imuno deficijencija.
[0097] Izrazi "sprečava", "sprečavanje" i "prevencija", kako se ovde koriste, odnose se na smanjenje pojavljivanja patoloških ćelija kod životinja. Prevencija može biti potpuna (npr. potpuno odsustvo patoloških ćelija kod subjekta). Prevencija može takođe biti delimična, takva da je na primer pojavljivanje patoloških ćelija kod subjekta manje od onog što bi se dogodilo bez sadašnjeg pronalaska. Prevencija se takođe odnosi na smanjenu osetljivost na kliničko stanje.
[0098] Imunogeni preparati prema pronalasku mogu dalje da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0099] "Farmaceutski prihvatljiv nosač", "farmaceutski prihvatljiv razblaživač" ili "farmaceutski prihvatljiv ekscipijens" ili "farmaceutski prihvatljiv vehikulum", koji se ovde naizmenično koriste, odnose se na netoksični čvrsti, polučvrsti ili tečni punioc, razblaživač, ili materijal za inkapsulaciju, ili pomoćnu formulaciju bilo kojeg konvencionalnog tipa. Farmaceutski prihvatljiv nosač je u suštini netoksičan za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama i kompatibilan je sa drugim sastojcima formulacije. Na primer, nosač za formulaciju koja sadrži polipeptide ne bi normalno uključivao oksidaciona sredstva i druga jedinjenja za koja je poznato da su štetna za polipeptide. Pogodni nosači uključuju, ali nisu ograničeni na vodu, dekstrozu, glicerol, fiziološki rastvor, etanol i njihove kombinacije. Nosač može da sadrži dodatna sredstva, kao što su sredstva za vlaženje ili sredstva za emulgovanje, sredstva za puferovanje pH ili adjuvansi koji povećavaju efikasnost formulacije.
Adjuvansi mogu na primer biti odabrani iz grupe koju čine: AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), silicijum-dioksid, alum, Al(OH)3, Ca3(PO4)2, kaolin, ugljenik, aluminijum hidroksid, muramil dipeptidi, N-acetil-muramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-DMP), N-acetil-nornuramil-L-alanil-D-izoglutamin (CGP 11687, takođe poznat kao nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroksi fosforiloksi)-etilamin (CGP 19835 A, takođe poznat kao MTP-PE) RIBI (MPL TDM CW S) u 2 procentnoj skvalen/Tween-80<®>emulziji, lipopolisaharidi i njihovi različiti derivati, uključujući lipid A, Freundov potpuni adjuvans (FCA), Freundov nekompletni adjuvans, Merckov adjuvans 65, polinukleotidi (na primer, poli IC i poli AU kiseline), vosak D iz Mycobacteriuma, tuberkuloza, supstance pronađene u Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis i članovi roda Brucella, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN, derivati lipida A, derivati koleratoksina, derivati HSP, derivati LPS, sintetske peptidne matrice ili GMDP, interleukin 1, interleukin 2, Montanide ISA-51 i QS-21, CpG oligonukleotid, poli I:C i GM-CSF. Videti Hunter R, US 5,554,372 i Jager E, Knuth A, WO 1997028816.
[0100] Varijanta gp120 polipeptida prema pronalasku može biti kovalentno vezana za nosač, koji je imunogeni makromolekul na koju se može vezati antigenski molekul. Kada je vezan za nosač, vezani polipeptid postaje više imunogen. Nosači su izabrani da povećaju imunogenost vezanog molekula i/ili da izazivaju veće titre antitela protiv nosača koji su dijagnostički, analitički i/ili terapeutski korisni. Kovalentno vezivanje molekula sa nosačem može dati poboljšanu imunogenost i T ćelijsku zavisnost. Videti Pozsgay V, i sar., PNAS 1999; 96: 5194-5197, Lee S, i sar., J. Immunol.1976; 116: 1711-1718 i Dintzis R, i sar., PNAS 1976; 73: 3671-3675. Korisni nosači uključuju polimerne nosače, koji mogu biti prirodni (npr. polisaharidi, polipeptidi ili proteini iz bakterija ili virusa), polusintetski ili sintetski materijali koji sadrže jednu ili više funkcionalnih grupa na koje se može vezati reaktantski ostatak.
Bakterijski proizvodi i virusni proteini (npr. površinski antigen hepatitisa B i antigen jezgra) takođe mogu biti korišćeni kao nosači, kao i proteini iz viših organizama, kao što su hemocijanin iz prilepka, hemocijanin potkovice kraba, edestin, serumski albumini sisara i imunoglobulini sisara. Dodatni bakterijski proizvodi za upotrebu kao nosači uključuju bakterijske zidne proteine i druge proizvode (na pr. streptokokne ili stafilokokne ćelijske zidove i lipopolisaharide (LPS)).
[0101] Sadašnji pronalazak se dalje odnosi na sprečavanje ili smanjenje simptoma povezanih sa HIV infekcijom. Ovo uključuje simptome povezane sa manjom simptomatičnom fazom HIV infekcije, uključujući, na primer, crvenilo, osip kože i infekcije noktiju, rane u ustima, povratne infekcije nosa i grla i gubitak težine. Pored toga, dodatni simptomi povezani sa glavnom simptomatičkom fazom HIV infekcije uključuju, na primjer, oralnu i vaginalnu kandidijazu (Candida), upornu dijareju, gubitak težine, uporni kašalj, reaktivnu tuberkulozu i periodične herpesne infekcije, kao što su hladne rane (herpes simpleks). Simptomi AIDS-a u punom jeku, koji se mogu tretirati u skladu sa sadašnjim pronalaskom uključuju, na primer, dijareju, mučninu i povraćanje, ustobolju i rane u ustima, uporne, povratne vaginalne infekcije i rak grlića materice, stalnu generalizovanu limfadenopatiju (PGL), ozbiljne infekcije kože, bradavice i tinea, respiratorne infekcije, pneumoniju, naročito Pneumocystis carinii pneumonia (PCP), herpes zoster (ili kožni osip), probleme sa nervnim sistemom, kao što su bolovi, ukočenost ili "igle i iglice" u rukama i stopalima, neurološke abnormalnosti, Kapošijev sarkom, limfom, tuberkulozu i druge oportunističke infekcije.
[0102] Korisni efekti peptida, nukleinskih kiselina i vektora prema pronalasku uključuju, na primer, sprečavanje ili odlaganje početne infekcije pojedinca izloženog HIV-u; smanjenje virusnog opterećenja kod pojedinca inficiranog sa HIV-om; produžavanje asimptomatske faze infekcije HIV-om; održavanje niskih virusnih opterećenja kod pacijenata inficiranih sa HIV-om čiji su virusni nivoi sniženi antiretrovirusnom terapijom (ART); povećanje nivoa CD4 T ćelija ili smanjenje opadanja CD4 T ćelija, kako HIV-1 specifičnih tako i nespecifičnih, kod pacijenata na lekovima i kod pacijenata tretiranih ART-om, što povećava ukupno zdravlje ili kvalitet života kod pojedinca sa AIDS-om; i produžavajući očekivani životni vek pojedinca sa AIDS-om. Kliničar može uporediti efekat imunizacije sa stanjem pacijenta pre lečenja ili sa očekivanim stanjem nelečenog pacijenta, kako bi se utvrdilo da li je lečenje efikasno u inhibiranju SIDE (engl. AIDS-a).
[0103] Imunogeni preparat se može primeniti bilo kojim sredstvima poznatim stručnjaku, kao što su intramuskularnom, subkutanom ili intravenoznom injekcijom, i oralnom, nazalnom ili analnom primenom. Videti Banga A, "Parenteralno kontrolisana isporuka terapeutskih peptida i proteina" u terapeutskim peptidima i proteinima (Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, US, 1995). Da bi se produžilo vreme tokom kojeg je peptid ili protein dostupan za stimulisanje odgovora, peptid ili protein se mogu obezbediti kao implant, uljana injekcija, ili kao čestični sistem. Sistem čestica može biti mikročestica, mikrokapsula, mikrosfera, nanokapsula ili slične čestice. Videti Banga, 1995, supra. Pokazano je da nosač čestica na bazi sintetskog polimera deluje kao adjuvans za poboljšanje imunološkog odgovora, pored obezbeđivanja kontrolisanog oslobađanja. Soli aluminijuma se takođe mogu koristiti kao adjuvansi za stvaranje imunološkog odgovora.
[0104] Imunogene kompozicije se mogu formulisati u jediničnom doznom obliku, pogodnom za individualnu primenu preciznih doziranja. U pulsnim dozama je obezbeđena bolusna primena imunogene kompozicije, koja uključuje otkriveni imunogen, praćena vremenskim periodom u kome se ne daje obelodanjeni imunogen subjektu, a zatim sledi druga bolusna primena. Terapeutski efikasna količina imunogenog sastava može se primenjivati u pojedinačnoj dozi ili u višestrukim dozama, na primer dnevno, tokom procedure lečenja. U specifičnim, neograničavajućim primerima, pulsne doze imunogenog preparata, koje uključuju otkriveni imunogen se primenjuju tokom dana, tokom nedelje ili tokom meseca.
[0105] Imunogene kompozicije mogu biti primenjene bilo kada je efekat (kao što su smanjenje znakova, simptoma ili laboratorijskih rezultata HIV-1 infekcije) poželjan. Generalno, doza je dovoljna za lečenje ili poboljšanje simptoma ili znakova bolesti bez stvaranja neprihvatljive toksičnosti prema subjektu. Može biti korišćena sistemska ili lokalna primena.
[0106] Efikasne količine za terapijsku upotrebu mogu zavisiti od težine bolesti i uzrasta, težine, opšteg stanja pacijenta i drugih kliničkih faktora. Stoga, konačno određivanje odgovarajućeg režima lečenja vrši prisutni kliničar. Tipično, doze koje se koriste in vitro mogu da obezbede korisno rukovođenje u količinama korisnim za in-situ primenu farmaceutske kompozicije, a životinjski modeli se mogu koristiti za određivanje efikasnih doza za lečenje posebnih poremećaja. Videti Gilman R, i sar., Izd., Goodman i Gilman's: Farmakološke osnove terapeutika, 8. izd. (Pergamon Press, New York, NY, US, 1990) i Gennaro A, Izd., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, PA, US, 1990). Obično je opseg doza za gp120 polipeptid od oko 0,1 μg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine. Ostali pogodni opsezi uključuju doze od oko 1 μg/kg do 10 mg/kg telesne težine. U jednom primeru, doza je oko 1,0 μg do oko 50 mg, na primer, 1 μg do 1 mg, kao što je 1 mg peptida po subjektu. Raspored doziranja se može razlikovati od svakodnevno do retko kao jedanput godišnje, zavisno od kliničkih faktora, kao što su osetljivost subjekta prema peptidu i tempo njihove bolesti. Prema tome, subjekt može da primi prvu dozu otkrivenog terapeutskog molekula, a zatim da dobije drugu dozu (ili čak više doza) u nekom kasnijem vremenskom periodu (ima), kao što je najmanje jedan dan kasnije, kao što je najmanje nedelju dana kasnije.
[0107] Ovde otkriveni farmaceutski preparati, mogu biti pripremljeni i primenjeni u doznim jedinicama. Čvrste dozne jedinice uključuju tablete, kapsule, transdermalne sisteme za isporuku i supozitorije. Primena terapeutske količine se može izvesti i pojedinačnom primenom u obliku pojedinačne dozne jedinice, ili u nekoliko manjih doznih jedinica, kao i višestrukim primenama podeljenih doza u specifičnim intervalima. Pogodne pojedinačne ili podeljene doze uključuju, ali nisu ograničene na oko 0,01, 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 10, 15, 30 ili 50 μg proteina/kg/dan.
[0108] Konstrukti nukleinskih kiselina koji kodiraju antigenske gp120 polipeptide, ovde opisane, koriste se, na primer, u kombinaciji kao farmaceutske kompozicije (lekovi) za upotrebu u terapeutskim, na primer, profilaktičkim režimima (kao što su vakcine) i primenjuju se na subjektima (npr. subjektima primata, kao što su humani subjekti) za izazivanje imunskog odgovor na jedan ili više grana ili soja HIV-a. Na primer, ovde opisani preparati mogu se primenjivati kod humanog (ili ne-humanog) subjekta pre infekcije HIV-om kako bi se inhibirala infekcija ili replikacija virusa. Prema tome, prethodno opisani farmaceutski preparati se mogu primenjivati kod subjekta da izazovu zaštitni imuni odgovor protiv HIV-a. Da bi se izazvao imuni odgovor, terapeutski efikasna (na primer, imunološki efikasna) količina konstrukata nukleinskih kiselina se primenjuje kod subjekta, kao što je humani (ili ne-humani) subjekt.
[0109] Imunizacija konstruktima nukleinskih kiselina je dobro poznata u struci i poučena, na primer. Videti Robinson H, i sar., US 5,643,578 (koji opisuje metode imunizacije kičmenjaka uvođenjem DNK koja kodira željeni antigen, kako bi izazvala ćelijski-posredovan ili humoralni odgovor); Weiner D, i sar., US 5,593,972 i Weiner D, i sar., US 5,817,637 (koji opisuju operativno povezivanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira antigen za regulatorne sekvence koje omogućavaju ekspresiju), i Urban R, i sar., US 5,880,103 (koji opisuje nekoliko načina isporuke nukleinskih kiselina koje kodiraju imunogene peptide ili druge antigene u organizmu). Metode uključuju liposomalnu isporuku nukleinskih kiselina (ili samih sintetskih peptida) i imunostimulišućih konstrukata ili ISCOMS<®>negativno naelektrisane strukture poput kaveza, veličine od 30-40 nm, formirane spontano pri mešanju holesterola i QUIL A<®>(saponina).
[0110] Za primenu molekula nukleinske kiseline gp120, nukleinska kiselina može biti isporučena intracelularno, na primer, ekspresijom iz odgovarajućeg ekspresionog vektora nukleinske kiseline, koji se primenjuje tako da postaje intracelularan, kao što je upotreba retrovirusnog vektora, direktnim injektiranjem, korišćenjem mikročestičnog bombardovanja (npr. genski pištolj, Biolistic, Dupont Corp, Delware, DE, US), oblaganje sa lipidima, receptorima ćelijske površine ili transfekcionim agensima, ili njihovom primenom u vezi sa peptidom poput homeoboksa, koji je poznat da ulazi u nukleus. Videti Morgan J, i sar., US 4,980,286, i Joliot A, i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88: 1864-1868. Predmetni pronalazak uključuje sve oblike isporuke nukleinskih kiselina, uključujući sintetski oligos, golu DNK, plazmid i virus, integrirane ili ne u genom.
[0111] U drugom pristupu za upotrebu nukleinskih kiselina za imunizaciju, imunogeni gp120 polipeptid takođe može biti eksprimiran pomoću oslabljenih virusnih domaćina ili vektora ili bakterijskih vektora. Rekombinantni virus vakcinije, adeno-pridruženi virus (AAV), virus herpesa, retrovirus ili drugi virusni vektori mogu biti korišćeni za ekspresiju peptida ili proteina, na taj način izazivajući CTL odgovor. Na primer, vektori vakcinije i metode korisne u protokolima TB imunizacije obezbeđuju druge potencijalne nosače za peptide iz pronalaska. Videti Paoletti E, i sar., US 4,722,848, i Stover C, i sar., Nature 1991; 351: 456-460.
[0112] U jednom primeru, korišćen je virusni vektor. Ovi vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, adenovirus, herpes virus, vakciniju ili virus RNK, kao što je retrovirus. U jednom primeru, retrovirusni vektor je derivat mišjeg ili ptičijeg retrovirusa. Primeri retrovirusnih vektora u koje se može ubaciti jedan strani gen uključuju, ali nisu ograničeni na: Moloney virus mišje leukemije (MoMuLV), Harvey virus mišjeg sarkoma (HaMuSV), virus mišjeg tumora dojke (MuMTV) i virus Rous sarkoma (RSV). Kada je subjekt čovek, može se koristiti vektor kao što je virus leukemije gibona majmuna (GaLV). Brojni dodatni retrovirusni vektori mogu inkorporirati više gena. Svi ovi vektori mogu preneti ili inkorporirati gen za selektivni marker tako da transdukovane ćelije mogu biti identifikovane i generisane. Ubacivanjem sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid gp120 u virusni vektor, zajedno sa drugim genom koji kodira ligand za receptor na specifičnoj ciljnoj ćeliji, na primer, vektor je sada ciljno specifičan. Retrovirusni vektori mogu biti ciljno specifični, vezivanjem, na primer, šećera, glikolipida ili proteina. Poželjno, ciljanje se postiže korišćenjem antitela za ciljanje retrovirusnog vektora. Stručnjaci u ovoj oblasti će znati ili mogu lako utvrditi bez nepotrebnog eksperimentisanja, specifične polinukleotidne sekvence koje mogu biti ubačene u retrovirusni genom ili pričvršćene za virusni omotač, kako bi se omogućila ciljna specifična isporuka retrovirusnog vektora, koji sadrži polinukleotid, koji kodira polipeptid gp120.
[0113] Pogodne formulacije za konstrukte nukleinskih kiselina, uključuju vodene i nevodene rastvore, izotonične sterilne rastvore, koji mogu da sadrže antioksidanse, pufere i bakteriostate, i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da uključuju sredstva za suspendovanje, solubilizatore, sredstva za zgušnjavanje, stabilizatore, i konzervanse. Formulacije se mogu predstaviti u jediničnim doznim ili višedoznim zatvorenim kontejnerima, kao što su ampule i bočice i mogu se čuvati u liofilizovanom stanju, koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer, vode, neposredno pre upotrebe. Ex tempore rastvori i suspenzije mogu biti pripremljeni od sterilnih praškova, granula i tableta. Poželjno, nosač je puferovani rastvor soli. Poželjnije, kompozicija za upotrebu u postupku je formulisana da zaštiti konstrukte nukleinskih kiselina od oštećenja pre primene. Na primer, kompozicija može biti formulisana da bi se smanjio gubitak adenovirusnih vektora na uređajima koji se koriste za pripremu, skladištenje ili primenu ekspresionog vektora, kao što su staklo, špricevi ili igle. Kompozicije mogu biti formulisane kako bi se smanjila osetljivost na svetlost i/ili temperaturna osetljivost komponenata. S tim u vezi, preparat poželjno sadrži farmaceutski prihvatljiv tečni nosač, kao što su, na primer, oni gore opisani, i sredstvo za stabilizaciju odabrano iz grupe koju čine polisorbat 80, L-arginin, polivinilpirolidon, trehaloza i njihove kombinacije.
[0114] U terapeutskim primenama, terapeutski efikasna količina kompozicije se primenjuje kod subjekta pre ili nakon izlaganja ili infekcije HIV-om. Kada se primenjuje pre izlaganja, terapeutska aplikacija se može odnositi kao profilaktička primena (kao što je u obliku vakcine). Pojedinačne ili višestruke primene kompozicija se primenjuju u zavisnosti od doziranja i frekvencije kao što je to potrebno i tolerisanja od strane subjekta. U jednom aspektu, doziranje se primenjuje jednom kao bolus, ali u drugom aspektu se može primeniti periodično sve dok se ne postigne terapeutski rezultat, kao što je zaštitni imuni odgovor. Generalno, doza je dovoljna za lečenje ili poboljšanje simptoma ili znakova bolesti bez stvaranja neprihvatljive toksičnosti prema subjektu. Može biti korišćena sistemska ili lokalna primena.
[0115] U kontekstu vakcina sa nukleinskom kiselinom, prirodne ili sintetske imunostimulatorne kompozicije koje se vezuju za i stimulišu receptore uključene u urođenom imunitetu, mogu se primenjivati zajedno sa konstruktima nukleinskih kiselina koji kodiraju polipeptide gp120. Na primer, agensi koji stimulišu određene Toll-nalik receptore (kao što su TLR7, TLR8 i TLR9) mogu biti primenjeni u kombinaciji sa konstruktima nukleinskih kiselina koji kodiraju polipeptide gp120. U nekim aspektima, konstrukt nukleinske kiseline je primenjen u kombinaciji sa imunostimulatornim CpG oligonukleotidima.
[0116] Konstrukti nukleinskih kiselina koji kodiraju polipeptide gp120 mogu biti uvedeni in vivo kao goli DNK plazmidi. DNK vektori mogu biti uneti u željene ćelije domaćina metodama poznatim u struci, uključujući ali ne ograničavajući se na transfekciju, elektroporaciju (npr. transkutanu elektroporaciju), mikroinjektiranje, transdukciju, fuziju ćelija, DEAE dekstran, precipitaciju kalcijum fosfata, upotrebu genskog pištolja, ili upotrebu transportera vektora DNK. Videti Wu C, i sar., J. Biol. Chem. 1992; 267: 963-967, Wu C i Wu G, Biol. Chem. 1988; 263: 14621-14624, i Williams R, i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88: 2726-2730. Takođe su poznati postupci za formulisanje i primenu gole DNK u mišićno tkivo sisara. Videti Felgner P, i sar., US 5,580,859 i US 5,589,466. Ostali molekuli su takođe korisni za olakšavanje transfekcije nukleinske kiseline in vivo, kao što su katjonski oligopeptidi, peptidi izvedeni iz DNK vezujućih proteina ili katjonskih polimera. Videti Bazile D, i sar., WO1995021931, i Byk G, i sar., WO1996025508.
[0117] Druga dobro poznata metoda koja se može koristiti za uvođenje konstrukata nukleinskih kiselina koji kodiraju gp120 imunogene u ćelije domaćina je bombardovanje česticama (aka biolistička transformacija). Biolistička transformacija se obično ostvaruje na jedan od nekoliko načina. Jedna uobičajena metoda uključuje pokretanje inertnih ili biološki aktivnih čestica u ćelijama. Videti Sanford J, i sar., US 4,945,050, US 5,036,006 i US
5,100,792.
[0118] Alternativno, vektor može biti uveden in vivo pomoću lipofekcije. Upotreba katjonskih lipida može promovisati inkapsulaciju negativno naelektrisanih nukleinskih kiselina, kao i promovisati fuziju sa negativno naelektrisanim ćelijskim membranama. Videti Felgner P, Ringold G, Science 1989; 337: 387-388. Opisane su naročito korisna lipidna jedinjenja i kompozicije za prenos nukleinskih kiselina. Videti Felgner P, i sar., US 5,459,127, Behr J, i sar., WO1995018863 i Byk G, WO1996017823.
[0119] Kao i sa imunogenim polipeptidom, kompozicije nukleinske kiseline mogu se primenjivati u pojedinačnoj dozi, ili se mogu primenjivati višestruke doze odvojene vremenskim intervalom, kako bi se indukovao imuni odgovor protiv HIV-a. Na primer, dve doze ili tri doze ili četiri doze ili pet doza ili šest doza ili više se mogu primenjivati kod subjekta tokom perioda od nekoliko nedelja, nekoliko meseci ili čak nekoliko godina, kako bi se optimizovao imuni odgovor.
[0120] Može biti korisno da se imunogene kompozicije ovde opisane, primenjuju sa drugim agensima kao što su proteini, peptidi, antitela i drugi agensi protiv HIV-a. Primeri takvih anti-HIV terapijskih agenasa uključuju inhibitore nukleozidne reverzne transkriptaze, kao što su abakavir, AZT, didanozin, emtricitabin, lamivudin, stavudin, tenofovir, zalcitabin, zidovudin i slični, inhibitori ne-nukleozidne reverzne transkriptaze, kao što su delavirdin, efavirenc, nevirapin, inhibitori proteaze kao što su amprenavir, atazanavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir osamprenavir, ritonavir, sakvinavir, tipranavir i slično i inhibitori fuzionog proteina kao što su enfuvirtid i slično. U određenim aspektima, imunonogene kompozicije se primenjuju istovremeno sa drugim anti-HIV terapijskim agensima. U određenim aspektima, imunonogene kompozicije se primenjuju sekvencijalno sa drugim terapeutskim agensima protiv HIV-a, kao što je pre ili posle drugog agensa. Prosečan stručnjak u ovoj oblasti bi znao da sekvencijalna primena može značiti odmah nakon ili nakon odgovarajućeg vremenskog perioda, kao što su sati dana, nedelja, meseca ili čak i nekoliko godina kasnije.
E. Metode za detekciju anti-HIV antitela u biološkom uzorku i postupci za detekciju odgovora neutrališućeg antitela
[0121] Imunogeni opisani u sadašnjem pronalasku su pogodni za identifikaciju antitela, specifičnih za pomenute imunogene u uzorku pacijenta. Kako imunogeni prema predmetnom pronalasku specifično vezuju neutrališuća antitela, imunogeni mogu biti korišćeni za detekciju onih pacijenata koji su razvili neutrališuuća antitela. Na ovaj način, antitela mogu pomoći u identifikaciji personalizovanih terapija na osnovu toga da li pacijent pokazuje neutrališuća antitela ili ne. Stoga, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za detekciju u uzorku neutrališućih antitela specifičnih prema virusu koji obuhvata:
(i) kontaktiranje pomenutog uzorka sa polipeptidom prema pronalasku, i
(ii) otkrivanje formiranja imuno kompleksa između pomenutog polipeptida.
[0122] Termini i izrazi "neutrališuća antitela", "virus", "polipeptid" su detaljno gore opisani.
[0123] U poželjnom aspektu, virus je HIV, a polipeptid je polipeptid varijante gp120 ili njegov imunogeni fragment, kao što je gore definisano. U poželjnijem aspektu, uzorak je od HIV-1 inficiranog pacijenta ili od primaoca vakcine protiv AIDS-a.
[0124] Bilo koji od širokog mnoštva formata analize, može biti korišćen u skladu sa postupcima iz sadašnjeg pronalaska. Takvi formati mogu biti heterogeni ili homogeni, sekvencijalni ili simultani, kompetitivni ili nekompetitivni. Videti Peterson M, i sar., US 5,563,036, Cheng A, i sar., US 5,627,080, Lee J, i sar., US 5,633,141, Peterson M, i sar., US 5,679,525, Draetta G, i sar., US 5,691,147, Lucas F, i sar., US 5,698,411, Yan C, i sar., US 5,747,352, Davidson R, US 5,811,526, Oh C, i sar., US 5,851,778 i Landrum E, i sar., US 5,976,822. Takvi testovi mogu biti formatirani da budu kvantitativni, da bi se izmerila koncentracija ili količina anti-HIV antitela, ili se mogu formatirati kako bi bili kvalitativni, da bi se izmerilo prisustvo ili odsustvo anti-HIV antitela. Dodatni opisi imunoloških analiza koji se mogu prilagoditi za upotrebu u skladu sa principima iz sadašnjeg pronalaska su dostupni u naučnoj literaturi. Videti Gnann J, i sar., Methods Enzymol. 1989; 178: 693-714, Dopel S, i sar., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1991; 29: 331-337, Manocha M, i sar., Immunol. Lett. 2003; 85 (3): 275-278, Brattegaard K, i sar., AIDS 1995; 9 (6): 656-657, Beristain C, i sar., J. Clin. Lab. Anal. 1995; 9: 347-350, Modrow S, i sar., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 1989; 2: 141-148, Gueye-Ndiaye A, i sar., AIDS 1993; 7: 475-481, Sabatier J, i sar., AIDS 1989; 3: 215-220, Sommerfelt M, i sar., Expert Opin. Biol. Ther. 2004; 4: 349-361, Alcaro M, i sar., Curr. Protein Pept. Sci. 2003; 4: 285-290, Smith R, i sar., Arch. Pathol. Lab. Med. 1990; 114: 254-258, Petrov R, i sar., Biomed. Sci. 1990; 1: 239-244, Zolla-Pazner S, Nat. Rev.
Immunol. 2004; 4: 199-210, Baillou A, i sar., J. Clin. Microbiol.1991; 29: 1387-1391, i McGaughey G, i sar., Curr. HIV Res.2004; 2: 193- 204.
[0125] Heterogene tehnike imunološke analize obuhvataju tipično, upotrebu materijala čvrste faze na koju reakcioni proizvod postaje vezan, ali mogu takođe biti prilagođene da uključuju vezivanje neimobilisanih antigena i antitela (tj. imunotest u fazi rastvora). Reakcioni proizvod je odvojen od viška uzorka, reagensa za testiranje i drugih supstanci uklanjanjem čvrste faze iz reakcione smeše (npr. pranjem). Jedan tip imunotesta čvrste faze, koji se može koristiti u skladu sa ovim pronalaskom je sendvič imunotest. U testu sendviča, što je više analita prisutno u uzorku, veća količina oznake je prisutna na čvrstoj fazi. Ovaj tip testiranog formata je uglavnom poželjan, naročito za vizuelizaciju niske koncentracije analita, jer se lakše detektuje pojavljivanje oznake na čvrstoj fazi.
[0126] U skladu sa poželjnim aspektima sadašnjeg pronalaska, peptid iz sadašnjeg pronalaska koji je specifično reaktivan sa anti-HIV antitelom je vezan za čvrstu podlogu (tj. imobilisan) i inkubiran u kontaktu sa biološkim uzorkom, koji se testira na prisustvo anti-HIVantitela. Sredstvo za blokiranje se može dodati da bi se smanjilo nespecifično vezivanje.
[0127] Kao što će biti cenjeno, peptid može biti inkubiran sa biološkim uzorkom u nevezanom stanju, a zatim naknadno vezan za čvrsti nosač (tj. imobilisan). Podloge se zatim poželjno, u velikoj meri tretiraju (npr. pranjem) da bi se značajno uklonila ne-HIV antitela koja mogu biti prisutna, ali koja nisu uspela da se vežu za vezani peptid. Kao posledica takvog tretmana, imuni kompleks se formira između peptida i anti-HIV antitela.
[0128] Poželjno je onda dodati detektabilno označeno drugo antitelo (sposobno za vezivanje za inicijalno antitelo (npr. anti-humano IgG antitelo)), a podloga se inkubira pod uslovima koji su dovoljni da omoguće da se drugo antitelo veže za bilo koje anti-HIV antitelo, koje može biti prisutno. Podloga se zatim poželjno u velikoj meri tretira (npr. pranjem) da bi se suštinski uklonilo bilo koje drugo nevezano antitelo. Ako je anti-HIV antitelo prisutno u testiranom uzorku, onda će ova dva antitela formirati imunski kompleks sa imobilizovanim peptidom (tj. drugo antitelo/anti-HIV antitelo/imobilizovani peptidni sendvič). U takvom testu, otkrivanje drugog antitela vezanog za podlogu pokazuje anti-HIV antitela u uzorku koji se testira. Videti Schuurs A, i sar., US 3,791,932 i US 4,016,043, i Pankratz T, i sar., US 5,876,935. Drugo antitelo može biti prirodni imunoglobulin izolovan od nehumanih vrsta (npr. anti-humano IgG mišje antitelo, anti-humano IgG kozje antitelo, anti-humano IgM kozje antitelo), ili se može dobiti rekombinantno ili sintetski. To može biti intaktni imunoglobulin ili fragment imunoglobulina (npr. FAb, F[Ab]2). Kao što je poželjno, drugi molekuli za vezivanje (sposobni da se vezuju za anti-HIV antitela) mogu biti korišćeni u skladu sa ili umesto takvih drugih antitela. Na primer, anti-HIV antitela mogu biti biotinilovana, a drugo antitelo može biti zamenjeno sa obeleženim avidinom ili streptavidinom.
[0129] Da bi se eliminisao korak razdvajanja, bez ograničenja i smanjilo vreme i neophodna oprema u testu hemijskog vezivanja, može se alternativno koristiti homogeni format analize. U takvim testovima, jedna komponenta vezujućeg para se i dalje može imobilizovati; međutim, prisustvo druge komponente vezujućeg para je detektovano bez razdvajanja, bez ograničenja. Primeri homogenih optičkih metoda su EMIT metoda (Syva, Sunnyvale, CA, US), koja funkcioniše preko detekcije suzbijanja fluorescencije; metoda laserske nefelometrijske aglutinacije lateksnih čestica Behringwerke (Marburg, DE) koja funkcioniše otkrivanjem promena u rasipanju svetlosti; metoda aglutinacije lateksnih čestica LPIA (Mitsubishi Chemical Industries, Tokio, JP); metoda depolarizacije TDX fluorescencije (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, SAD); i metoda prenosa energije fluorescencije (Cis Bio International, Pariz, FR). Bilo koji od takvih testova može biti prilagođen za upotrebu u skladu sa ciljevima sadašnjeg pronalaska. Test vezivanja prema predmetnom pronalasku može biti konfigurisan kao kompetitivni test. U kompetitivnom testu, što je više anti-HIV antitela prisutno u testiranom uzorku, niža je količina oznake prisutna na čvrstoj fazi.
[0130] Na način sličan sendvič analizi, kompetitivni test se može izvesti obezbeđivanjem definisane količine obeleženog anti-HIV antitela i određivanjem da li ispitivana tečnost sadrži anti-HIVantitelo, koje bi se takmičilo sa obeleženim antitelom za vezivanje za podlogu. U ovakvom kompetitivnom testu, količina uhvaćenih obeleženih antitela je obratno proporcionalna količini analita prisutnog u ispitivanom uzorku. Nekoliko testova ove vrste je opisano u tehnici. Videti Smith D, i sar., US 4,401,764, Clagett J, i sar., US 4,746,631, Li C, i sar., US 4,661,444, Chieregatt E, i sar., GB 2084317, Mochida E, i sar., US 4,185,084, Sadeh D, i sar., US 4,243,749, Lucas F, i sar., US 5,698,411, Landrum, supra, Leuvering J, US 4,313,734, Gribnau T, i sar., US 4,373,932 i Baugher B, i sar. US 5,501,985 US. Poželjna je upotreba enzima (naročito alkalne fosfataze, beta-galaktozidaze, peroksidaze rena ili ureaze) kao detektabilne oznake (tj. enzimski imunološki test ili EIA).
[0131] Prisustvo enzimskih oznaka može biti otkriveno, upotrebom hromogenih supstrata (uključujući one koji razvijaju ili adsorbuju fluorescentnu, UV, vidljivu svetlost) kao odgovor na katalizu pomoću oznake enzima. Još poželjnije, mogu se koristiti hemijske oznake (npr. koloidno zlato, oznake zrnaca lateksa).
[0132] Detekcija oznake se može postići korišćenjem višestrukih detektora, filtera višestrukog prolaza, rešetki ili spektralno različitih fluora. Videti Ward D, i sar., US 5,759,781. Naročito je poželjno korišćenje peroksidaze kao enzimske oznake, posebno u skladu sa hromogenim supstratom 3,3',5,5'-tetrametilbenzidinom (TMB), OPD ili ABTS. U slučaju obeležavanja antitela sa peroksidazom kao enzimom, moguće je koristiti tehniku periodata ili prijavljenog postupka u kojem su partneri povezani sa heterobifunkcionalnim reagensom. Videti Nakane P, i sar., J. Histochem. Cytochem.1974; 22: 1084-1090. Bilo koji od širokog mnoštva čvrstih nosača može biti korišćen u imunološkim testovima iz sadašnjeg pronalaska. Pogodni materijali za čvrsti nosač su sintetski kao što su polistiren, polivinil hlorid, poliamid ili drugi sintetski polimeri, prirodni polimeri kao što su celuloza, kao i derivati prirodnih polimera kao što su celuloza acetat ili nitroceluloza i staklo, naročito staklena vlakna. Podloga može biti u obliku sfera, šipki, cevi i mikro proba ili mikrotitarskih ploča. Strukture nalik listu, kao što su papirne trake, male ploče i membrane su takođe pogodne. Površina nosača može biti propustljiva i nepropustljiva za vodene rastvore.
[0133] Iako se prethodno opisuje ispitivanje prisustva anti-HIV antitela u biološkim uzorcima koji su tečnosti (npr. serumi, krv, urin, pljuvačka, pankreasni sok, cerebrospinalna tečnost, sperma), biće prihvaćeno da bilo koji tečni biološki uzorak (npr. ekstrakti tkiva ili biopsije, ekstrakti izmeta, sputum) takođe može biti korišćen u testovima iz sadašnjeg pronalaska. Najpoželjnije, biološki uzorak koji se analizira biće serum ili plazma.
[0134] Pošto su imunogeni prema sadašnjem pronalasku sposobni da indukuju proizvodnju široko neutrališućih antitela, ovi imunogeni takođe mogu biti korišćeni za otkrivanje odgovora neutrališućeg antitela prema patogenu kod pacijenta. Stoga, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za detekciju odgovora neutrališućeg antitela protiv virusne infekcije kod subjekta, koji obuhvata detektovanje u pomenutom subjektu prisustva neutrališućih antitela, korišćenjem postupka za otkrivanje neutrališućih antitela prema pronalasku, pri čemu prisustvo neutrališućih antitela u pomenutom subjektu u odnosu na kontrolni subjekt ukazuje na odgovor neutrališućeg antitela prema pomenutoj virusnoj infekciji kod pomenutog subjekta.
[0135] U poželjnom aspektu, virus je HIV i gde je polipeptid gp120 varijantni polipeptid ili njegov fragment prema pronalasku. U poželjnijem aspektu, uzorak je od HIV-1 inficiranog pacijenta ili od primaoca vakcine protiv AIDS-a.
OPŠTE PROCEDURE
1. Reagensi
[0136] Korišćeni su sledeći reagensi:
(a) Plazmidi. Plazmid pNL4.3 je dobijen iz Nacionalnog instituta programa zdravstvenog istraživanja AIDS-a i referentnih reagensa (NIH ARRRP, NIH, Bethesda, MD, US). Plazmid pcDNA 3.1 je dobijen od Invitrogena (Carslbad, CA, US).
(b) izolat HIV-1. Korišćen je primarni izolat HIV-1 podtipa B, AC-10 (NeutNet konzorcijum, Milano, IT).
(c) Ćelijske linije. TZM-bl ćelije (CD4<+>CXCR4<+>CCR5<+>) su dobijene iz NIH repozitorija (NIH, Bethesda, Maryland, US). 293T i TZM-bl ćelije su održavane u Dulbecco modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma, 20 mM L-glutamina, 100 U penicilina / ml i 100 μg streptomicina / ml.
(d) Antitela. Korišćena su anti-Env-HIV-1 monoklonska antitela (MAt-a) sa široko
neutrališućom aktivnošću (specifičnosti epitopa su naznačene u zagradama) (NIH ARRRP, NIH, Bethesda, MD, US, Polymun AG, Beč, AT). Ona uključuju: 4E10 (membranski-proksimalan spoljašnji region; MPER), 2F5 (MPER), b12 (CD4 vezujuće mesto), 2G12 (gp120 visoko manozni glikani) i PG16 (gp120 virusni šiljci).
2. In vitro nasumična mutageneza
[0137] Mutacije su uvedene u HIV-1 AC-10 env korišćenjem kompleta Genemorph II za nasumičnu mutagenezu (Stratagene, La Jolla, CA, US). Biblioteka himernih HIV viriona je generisana prenosom nasumično mutiranih omotača u pNL4-3 i pcDNA3.1 plazmide. Prenošenje je bilo posredovano uvođenjem restrikcionih mesta, čuvajući sekvencu virusa i digestiju sa enzimima Xbal i Notl (New England Biolabs, Ipswich, MA, US).
3. Kloniranje i proizvodnja biblioteke
[0138] PCR proizvodi su klonirani u vektore pNL4.3 i pcDNA3.1 korišćenjem kompleta za brzu ligaciju DNK (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) prema specifikacijama proizvođača. Rekombinantni vektori pNL4.3 i pcDNA3.1 su uvedeni u kompetentne ćelije MAX Efficiency<®>Stbl2 ™ i kompetentne ćelije MAX Efficiency<®>DH5α ™ (Invitrogen, Carslbad, CA, US), respektivno i pojačani preko noći (ON ) na 30 ° C uz mešanje u zapremini od 3 mL. Nekoliko transformacija je izvršeno istovremeno kako bi se izbegao gubitak varijabilnosti i pomešani zajedno u proširenju amplifikacije (250 mL, 30 ° C, ON uz mešanje). Nakon inkubacije, naneto je 20 μL i plazmidska DNK je prečišćena korišćenjem Pure Yield ™ Plasmid Maxiprep sistema (Promega, Madison, WI, US). Oba proizvoda su dalje digestirana pomoću Xbal i Notl-a da bi se potvrdilo prisustvo env gena. Ako su pozitivni, klonovi su sekvencirani i/ili su korišćeni za transfekciju. Virusi su proizvedeni prolaznom kotransfekcijom 293T ćelija, korišćenjem pNL4.3 konstrukata. Supernatanti ćelijske kulture koji sadrže virione su sakupljeni na 2 dana nakon transfekcije, a virioni su koncentrovani pomoću Amicon<®>Ultra centrifugalne filterske jedinice. Virioni su ponovo suspendovani u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS).
4. Test hvatanja viriona
[0139] Mikrotitarski bazenčici su obloženi preko noći na 4 ° C sa poliklonskim anti-Fc-om
(5 μg/mL u 100 μl PBS). Bazenčići su blokirani sa 3% goveđeg serumskog albumina (BSA) u PBS-u tokom 1 sata na 37 ° C. 100 μl virusa (1000 ng/mL) poreklom iz biblioteke je dodato u mikrotitarske bazenčiće. 5 μL uhvaćenog MAt-a (100 ng/mL) je dodato u odgovarajuće bazenčiće, a ploča je inkubirana na 37 ° C uz mešanje (450 obrtaja u minuti). Nakon 2 sata inkubacije, bazenčići su isprani šest puta sa PBS-om, a ekvivalenti virusa su kvantifikovani pomoću p24 enzimski povezanog imunosorbentnog testa (ELISA) ili RNK ekstrahovane sa kompletom visoke čistoće virusne RNK (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, US) prema uputstvima proizvođača.
5. Usađena RT-PCR HIV-1 env RNK amplifikacija
[0140] Izolovana HIV-1 env RNK je umnožena pomoću lančane reakcije polimeraze reverzne transkriptaze (RT-PCR), korišćenjem RT-PCR kompleta (GeneAmp® Gold RNA PCR Reagent Kit; Applied Biosystems, Carlsbad, CA, US) i Expand High Fidelity PCR System (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Zapremina templejta RNK od 8 μL je korišćena za RT-PCR reakciju, a RNK je transkribovana suprotno sa prajmerom 102 (obrnuto) na 50 ° C u trajanju od 20 minuta. Env region je amplifikovan sa prajmerima 101 (napred) i 104 (obrnuto) od 5 μL zapremine cDNK praćene usađenim PCR-om sa prajmerom 179 (napred) i 180 (obrnuto), korišćenjem 2 μL zapremine templejta. Videti Tabelu 1. Uslovi obe env PCR amplifikacije su bili: i) 1 ciklus od 94 ° C za 2 min, ii) 35 ciklusa od 94 ° C za 2 min, 55 ° C za 1 min i 72 ° C za 3 min, iii) 1 ciklus od 72 ° C za 7 min i iv) zaustavljanje na 4 ° C. Dobijeni amplikon (2583 bp) je bio elektroforeziran zajedno sa markerom molekulske težine od 1 Kb u 1,0 % agaroznom gelu obojenom sa SYBR<®>bezbednom DNK gelnom bojom.
6. Kloniranje i sekvenciranje env gena
[0141] PCR proizvodi iz prethodnog koraka su klonirani u vektorima pNL4.3 i pcDNA3.1 kao što je gore opisano. Kompetentne ćelije Stbl2 i DH5α su transformisane sa ovim plazmidima, kao što je prethodno ilustrovano. Plazmidska DNK je prečišćena pomoću QIAprep Spin Miniprep kompleta (Qiagen, Valencia, CA, US) i dalje digestirana sa Xbal i Notl-om da bi se potvrdilo prisustvo env gena. Env-pozitivni klonovi su sekvencirani korišćenjem BigDye® Terminator v3.1 i prajmera 183 (napred), 185 (napred), 186 (napred), 190 (obratno), 192 (obratno) i 193 (obratno). Videti Tabelu 1.
7. Analiza sekvence
[0142] Poravnanje nukleotidnih sekvenci je sprovedeno korišćenjem CLUSTAL W programa (EMBL-EBI, http://www.ebi.ac.uk/FTP/, februar 2011) i aplikacija Contig Assembly Program (CAP) integrisanih u BioEdit 7.0.9.0 verziju, a potom ručno uređen. Videti Thompson J, i sar., Nucl. Acids Res. 1994; 22 (22): 673-4680 i Huang X, Genomics 1992; 14 (1): 18-25.
Tabela 1: Prajmer sekvence i lokacija gena. Lokacija gena je bazirana na HIV-1 HXB2
genomu (GenBank pristupni broj K03455).<1>Wei X, i sar., Antimicrob. Agents Chemother.2002; 46 (6) : 1896-1905.
8. Proizvodnja rekombinantnih virusa
[0143] Klonovi koji eksprimiraju glikoproteine omotača 4E10-specifične sa relevantnim mutacijama (gubitak potencijalnih mesta glikozilacije i promene u arhitekturi V1/V2 petlji) su amplifikovane ON, u zapremini od 250 ml na 30 ° C uz mešanje. Plazmidska DNK je prečišćena korišćenjem Pure Yield ™ Plasmid Maxiprep sistema (Promega, Madison, WI, US) i korišćena je za prolaznu ko-transfekciju 293T ćelija. Supernatanti koji sadrže pseudovirus su sakupljeni dva dana nakon transfekcije. Nivo p24 je kvantifikovan pomoću ELISA.
9. Testovi vezivanja
[0144] Vezivanje monoklonskih antitela (4E10, 2F5, 2G12, b12 i PG16) za intaktne virione je određeno sa prethodno opisanim testom hvatanja. Prvo, virus je inkubiran sa BMAt-om u rastvoru, kako bi se olakšao vezivanje virus-BMAt. Zatim su kompleksi virus-BMAt bili zarobljeni sa Anti-FC antitelima, koja su prethodno imobilisana u ploči. Imobilizovani virus-BMAt je liziran sa 1% Triton-X u PBS-u. p24 u lizatu virusa je kvantifikovan pomoću ELISA, kao što je gore opisano. Konstrukt ΔΕnν pNL4.3 je korišćen kao negativna kontrola. Povećanje afiniteta vezivanja je određeno poređenjem sa divljim tipom AC-10 virusa.
[0145] Dok je gore pomenuti pronalazak opisan u nekim detaljima u svrsi jasnoće i razumevanja, stručnjak iz struke će ceniti iz čitanja ovog obelodanjivanja da se mogu izvršiti različite promene u obliku i detaljima bez odstupanja od stvarnog obima pronalaska, koji je kao što je definisano u priloženim zahtevima.
LISTING SEKVENCI
[0146]

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Polipeptid, sposoban za izazivanje neutrališućih antitela protiv virusa, koji obuhvata jednu varijantu HIV-1 gp120 ili jedan njegov imunogeni fragment, naznačen time, što polipeptid ili njegov imunogeni fragment sadrži SEK ID BR: 4.
2. Antitelo, koje se specifično vezuje za polipeptid prema patentnom zahtevu 1.
3. Polinukleotid, koji kodira polipeptid prema patentnom zahtevu 1.
4. Polinukleotid prema patentnom zahtevu 3, koji ima sekvencu SEK ID BR: 3.
5. Ekspresioni vektor, koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 4.
6. Ćelija domaćin, koja sadrži polipeptid prema patentnom zahtevu 1, polinukleotid prema patentnom zahtevu 3 ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 5.
7. Imunogeni preparat ili vakcina, koja sadrži polipeptid prema patentnom zahtevu 1, polinukleotid prema patentnom zahtevu 3 ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 5.
8. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, polinukleotid prema patentnom zahtevu 3, ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 5 ili imunogeni preparat ili vakcina prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu u medicini.
9. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, polinukleotid prema patentnom zahtevu 3, ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 5 ili imunogeni preparat ili vakcina prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu u prevenciji bolesti izazvane HIV infekcijom.
10. Postupak za detekciju neutrališućih antitela specifičnih prema datom patogenu u uzorku, koji obuhvata:
(i) kontaktiranje pomenutog uzorka sa polipeptidom prema patentnom zahtevu 1 i (ii) otkrivanje stvaranja imunog kompleksa između pomenutog polipeptida i pomenutih neutrališućih antitela.
(iii)
11. In vitro postupak za detekciju odgovora neutrališućeg antitela protiv virusne infekcije kod subjekta, koji obuhvata otkrivanje prisustva neutrališućih antitela u uzorku od pomenutog subjekta korišćenjem postupka prema patentnom zahtevu 10, naznačen time da je prisustvo neutrališućih antitela u pomenutom uzorku u odnosu na kontrolni subjekat indikativno za odgovor neutrališućeg antitela na virusnu infekciju kod pomenutog subjekta.
12. Postupak prema patentnim zahtevima 10 ili 11, naznačen time, što je virus HIV.
13. Postupak kao što je definisan u patentnom zahtevu 12, naznačen time, što je uzorak od HIV-1 inficiranog pacijenta ili gde je uzorak od primaoca vakcine protiv AIDS-a.
RS20171235A 2011-02-25 2012-02-24 Varijanta gp-120 hiv-a RS56707B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161446595P 2011-02-25 2011-02-25
EP11382051A EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2011-02-25 Rapid immunogen selection method using lentiviral display
PCT/EP2012/053185 WO2012113921A1 (en) 2011-02-25 2012-02-24 Rapid selection method for hiv gp-120 variants
EP12705689.3A EP2678351B1 (en) 2011-02-25 2012-02-24 Hiv gp-120 variant

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56707B1 true RS56707B1 (sr) 2018-03-30

Family

ID=44246584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171235A RS56707B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Varijanta gp-120 hiv-a

Country Status (23)

Country Link
US (1) US9605030B2 (sr)
EP (2) EP2492279A1 (sr)
JP (1) JP6140614B2 (sr)
KR (1) KR20140025356A (sr)
CN (1) CN103459410B (sr)
AU (1) AU2012219418C1 (sr)
CA (1) CA2827967A1 (sr)
CY (1) CY1119638T1 (sr)
DK (1) DK2678351T3 (sr)
ES (1) ES2651124T3 (sr)
HR (1) HRP20171697T1 (sr)
HU (1) HUE035432T2 (sr)
IL (1) IL228094A0 (sr)
LT (1) LT2678351T (sr)
ME (1) ME03045B (sr)
MX (1) MX348459B (sr)
PL (1) PL2678351T3 (sr)
PT (1) PT2678351T (sr)
RS (1) RS56707B1 (sr)
RU (1) RU2603732C2 (sr)
SI (1) SI2678351T1 (sr)
SM (1) SMT201700571T1 (sr)
WO (1) WO2012113921A1 (sr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
EP2698377A1 (en) * 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
CN104697830B (zh) * 2015-02-10 2018-06-15 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 用于hiv检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法
CN107988428B (zh) * 2017-11-10 2021-04-06 杭州众测生物科技有限公司 虾虹彩病毒(siv)的raa恒温荧光检测方法及试剂
JP2019153618A (ja) * 2018-02-28 2019-09-12 株式会社ジャパンディスプレイ 光センサ装置
CA3140693A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 Kamlendra Singh Peptide inhibitors for the inhibition of hiv capsid
CN116256436A (zh) * 2021-12-01 2023-06-13 中国科学院大连化学物理研究所 基于Top-down策略的膜蛋白质变体鉴定方法

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
JPS604422B2 (ja) 1976-10-07 1985-02-04 持田製薬株式会社 抗原の定量方法
IL51667A (en) 1977-03-16 1979-10-31 Miles Yeda Ltd Immunoassay for the determination of a hapten
NL7807532A (nl) 1978-07-13 1980-01-15 Akzo Nv Metaal-immunotest.
NL8000173A (nl) 1980-01-11 1981-08-03 Akzo Nv Toepassing van in water dispergeerbare, hydrofobe kleurstoffen als label in immunochemische testen.
US4401764A (en) 1980-02-07 1983-08-30 Technicon Instruments Corporation Immunoassays employing labeled reagent and a conjugate having two binding sites
GB2084317B (en) 1980-09-30 1984-01-18 Erba Farmitalia Antigen-linked competitive enzymeimmunoassay
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4661444A (en) 1984-03-29 1987-04-28 Ortho Diagnostic Systems Inc. Homogeneous immunoassays employing double antibody conjugates comprising anti-idiotype antibody
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4746631A (en) 1985-05-09 1988-05-24 Ultra Diagnostics Corporation Immunoassay method, device, and test kit
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5585279A (en) 1986-01-23 1996-12-17 Davidson; Robert S. Time-resolved luminescence binding assays using a fluorescent transition metal label other than ruthenium
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5554372A (en) 1986-09-22 1996-09-10 Emory University Methods and vaccines comprising surface-active copolymers
EP0310361A3 (en) 1987-09-30 1989-05-24 Beckman Instruments, Inc. Tridentate conjugate and method of use thereof
DE3855134T2 (de) 1987-11-13 1996-10-02 Hermann Katinger Monoklonale menschliche antikörper gegen hiv-i
US5244797B1 (en) 1988-01-13 1998-08-25 Life Technologies Inc Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
WO1991004273A2 (en) 1989-09-22 1991-04-04 Idec Pharmaceuticals Corp. Novel peptides associated with the cd4 binding region of gp120 and their methods of use
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017764A1 (en) * 1990-05-16 1991-11-28 Dana Farber Cancer Institute Immunogenic peptides, antibodies and uses thereof relating to cd4 receptor binding
EP0467078B1 (en) 1990-07-18 1996-05-08 Abbott Laboratories An analyte-subtitute reagent for use in specific binding assay methods, devices and kits
US5552284A (en) 1991-03-29 1996-09-03 Genentech, Inc. Detection of interleukin-8 receptors by nudeic acid hybridization
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
AU681360B2 (en) 1992-09-30 1997-08-28 Scripps Research Institute, The Human neutralizing monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus
US5359681A (en) 1993-01-11 1994-10-25 University Of Washington Fiber optic sensor and methods and apparatus relating thereto
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2715847B1 (fr) 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
US5563036A (en) 1994-04-29 1996-10-08 Tularik, Inc. Transcription factor-DNA binding assay
WO1995032307A1 (en) 1994-05-20 1995-11-30 Tularik, Inc. Epstein-barr virus transcription factor binding assay
US5747352A (en) 1994-05-23 1998-05-05 Beckman Instruments, Inc. Reagents and methods for the rapid and quantitative assay of pharmacological agents
US5691147A (en) 1994-06-02 1997-11-25 Mitotix, Inc. CDK4 binding assay
US5627080A (en) 1994-07-29 1997-05-06 Beckman Instruments, Inc. Detergent-facilitated immunoassay for the rapid and quantitative assay of pharmacological agents
FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
ATE219105T1 (de) 1995-04-19 2002-06-15 Polymun Scient Immunbio Forsch Monoklonale antikörper gegen hiv-1 und davon hergestellte impfstoffe
US5976822A (en) 1995-05-18 1999-11-02 Coulter International Corp. Method and reagent for monitoring apoptosis and distinguishing apoptosis from necrosis
US5698411A (en) 1995-05-18 1997-12-16 Coulter Corporation Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells
US5759781A (en) 1995-12-22 1998-06-02 Yale University Multiparametric fluorescence in situ hybridization
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
US5876935A (en) 1997-01-08 1999-03-02 Dade Behring Inc. Luminescent specific binding assay
EP1005481B1 (en) 1997-04-22 2009-10-14 Life Technologies Corporation Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits
US6924112B1 (en) 1997-12-04 2005-08-02 Biomethodes S.A.R.L. Cloning method by multiple-digestion, vectors for implementing same and applications
US6762031B2 (en) * 2000-06-16 2004-07-13 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Targeting viral vectors to specific cells
CA2419822C (en) * 2000-08-14 2011-02-08 Gary J. Nabel Modifications of hiv env, gag, and pol enhance immunogenicity for genetic immunization
CN1339319A (zh) * 2000-08-18 2002-03-13 清华大学 一种治疗艾滋病的药物及其制备方法
US20070111201A1 (en) 2001-04-30 2007-05-17 Benjamin Doranz Reverse transfection of cell arrays for structural and functional analyses of proteins
RU2237065C2 (ru) * 2002-10-03 2004-09-27 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Иммуногенная библиотека химерных пептидов, мимикрирующая генетическое многообразие гипервариабельного района v3 белка оболочки gp120 вируса иммунодефицита человека
BRPI0414443A (pt) * 2003-09-17 2006-11-21 Univ Duke imunógenos consensuais/ancestrais
WO2009117661A2 (en) 2008-03-20 2009-09-24 United States Department Of The Army, As Represented By The Secretary Of The Army, On Behalf Of The Walter Reed Army Institute Of Research Carrier neutralization assay
SI3260136T1 (sl) 2009-03-17 2021-05-31 Theraclone Sciences, Inc. Humani imunodeficientni virus (HIV)-nevtralizirajoča protitelesa
EP2542703A4 (en) * 2010-03-02 2013-10-23 Int Aids Vaccine Initiative NEW HIV-1 SLEEVE GLYCOPROTEIN
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display

Also Published As

Publication number Publication date
US20140037667A1 (en) 2014-02-06
HRP20171697T1 (hr) 2018-01-26
NZ614753A (en) 2015-10-30
CA2827967A1 (en) 2012-08-30
US9605030B2 (en) 2017-03-28
KR20140025356A (ko) 2014-03-04
MX2013009757A (es) 2013-12-02
CY1119638T1 (el) 2018-04-04
DK2678351T3 (en) 2017-12-04
SI2678351T1 (en) 2018-01-31
SMT201700571T1 (it) 2018-01-11
EP2678351A1 (en) 2014-01-01
CN103459410B (zh) 2016-05-25
CN103459410A (zh) 2013-12-18
EP2678351B1 (en) 2017-09-13
ME03045B (me) 2018-10-20
WO2012113921A1 (en) 2012-08-30
AU2012219418B2 (en) 2017-05-25
IL228094A0 (en) 2013-09-30
AU2012219418C1 (en) 2017-10-05
AU2012219418A1 (en) 2013-09-19
EP2492279A1 (en) 2012-08-29
LT2678351T (lt) 2018-01-25
MX348459B (es) 2017-06-14
HUE035432T2 (en) 2018-05-02
RU2013143295A (ru) 2015-03-27
ES2651124T3 (es) 2018-01-24
PT2678351T (pt) 2017-12-11
JP6140614B2 (ja) 2017-05-31
PL2678351T3 (pl) 2018-03-30
RU2603732C2 (ru) 2016-11-27
JP2015508279A (ja) 2015-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Emini et al. Antibody-mediated in vitro neutralization of human immunodeficiency virus type 1 abolishes infectivity for chimpanzees
Decker et al. Antigenic conservation and immunogenicity of the HIV coreceptor binding site
Kothe et al. Ancestral and consensus envelope immunogens for HIV-1 subtype C
US7939083B2 (en) Soluble, stabilized, proteolytically cleaved, trimeric HIV-1 gp140 proteins comprising modifications in the N-terminus of the gp41 ectodomain
EP2678351B1 (en) Hiv gp-120 variant
AU2011223677A1 (en) Novel HIV-1 envelope glycoprotein
US7364744B2 (en) Synthetic peptide vaccines for HIV: the CBD epitope as an effective immunogen to elicit broadly neutralizing antibodies against HIV
US9486518B2 (en) Membrane proximal region of HIV GP41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine
JP2013528370A (ja) Ｈｉｖ−１サブタイプｃエンベロープ糖タンパク質における遺伝子シグネチャー
EP2698377A1 (en) Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
NZ614753B2 (en) Rapid selection method for hiv gp-120 variants
Zhang et al. Mimotopes selected by biopanning with high-titer HIV-neutralizing antibodies in plasma from Chinese slow progressors
US20160122395A1 (en) Immunogenic compositions and a process for producing same
Wang et al. Antigenic conservation and immunogenicity of the HIV coreceptor binding site
Protection Vaccination of Rhesus Macaques with
Colpas Characterization of Rabbit Monoclonal Antibodies Produced by an HIV-1 Vaccine
Salazar Ancestral and consensus envelope immunogens for HIV1 subtype C