RS56737B1 - Humana monoklonska antitela koja su specifična za protein e virusa denge serotipa 1 i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na humana neutralizujuda monoklonska antitela za virus denge, posebno, serotip 1. Pronalazak se dalje odnosi na kompozicije i postupke za lečenje ili prevenciju infekcije denga virusom kod subjekata kičmenjaka. Obezbeđeni su postupci za davanje antitela subjektu kičmenjaka u količini koja je efektivna da smanji, eliminiše, ili spreči povratak infekcije.

PRETHODNO STANJE

[0002] Denga je najznačajnija virusna bolest koja pogađa ljude, koju prenose komarci. Trenutno se smatra da se, blizu 2,5 milijardi ljudi koji žive u više od 100 zemalja koje su endemske za dengu u tropskom/sub-tropskom pojasu nalazi u riziku od razvoja denga groznice. Vrsta komaraca koja se nalazi u urbanim predelima, Aedes aegypti glavni je prenosilac virusa ljudima. Infekcija virusom denge može da dovede do različitog spektra kliničkih manifestacija koje imaju opseg od asimptomatske infekcije do denga groznice (DF), akutne febrilne bolesti, do hemoragijske denga bolesti (DHF) i denga šok sindroma (DSS) koje predstavljaju ozbiljne, životno ugrožavajude komplikacije koje se karakterišu vaskularnim krvarenjem. Trenutni tretman ograničen je upotrebom analgetika da bi se simptomi ublažili i nema dostupnih vakcina. Denga bolest pogađa 50 miliona ljudi godišnje, sa čestim i rekurentnim epidemijama. Tokom 1990-godina došlo je do povratka denga bolesti u različitim delovima sveta uprkos strogim kontrolama komaraca, sa najvedom ikada pojavom epidemije 2005 u Singapuru. Preko 80% prijavljenih slučajeva bili su mladi sa povezanim uticajem na njihovu sposobnost da rade plus značajnim troškovima zdravstvene zaštite za njihovo lečenje. Prema tome, u neposrednom roku, alternative za denga vakcine, kao što su terapije pasivnim antitelima i/ili antivirusne terapije hitno su potrebne za kontrolu bolesti koje su povezane sa dengom. Ovi predloženi terapeutici imaju potencijal da pomognu velikom broju inficiranih individua čak iako se daju individuama koje se nalaze u riziku za razivijanje težih oblika bolesti (oko 10% od ukupnog broja). Sa povedanjem prevalencije denge kod razvijenih nacija kao što su Južna Amerika plus Australija, i odsustva vakcine, takvo antitelo može da obezbedi koristan lek. Predmetni pronalazak obezbeđuje u potpunosti humana monoklonska antitela da bi se zadovoljile ove i druge potrebe.

KRATAK PREGLED

[0003] Ovde su opisane kompozicije i postupci za lečenje ili prevenciju infekcije virusom denga kod subjekta kičmenjaka.

[0004] Posebno, ovde je prikazan primer dobijanja u potpunosti humanih neutrališudih monoklonskih antitela iz pacijenata koji su se nedavno oporavili od Denga infekcije serotipa 1. Antitelo ispoljava i profilaktičku i terapeutsku aktivnost u sprečavanju Denga infekcije serotipa 1 in vitro i in vivo i može da obrazuje osnovu novog leka. Pronalazak koristi postupak za dobijanje imortalizovanih memorijskih B delija od pacijenata koji su se oporavili prečišdavanjem njihovih CD22 pozitivnih delija iz uzorka krvi koji se uzima 60 dana nakon što se pacijent oporavi od infekcije. Prečišene B delije se nakon toga imortalizuju, infekcijom Epstein Barr Virusom (EBV). Ovaj postupak dovodi do nastanka panela imortalizovanih memorijskih B delijskih linija koje mogu da proizvode u potpunosti humana antitela koja nakon toga mogu da se pretraže za specifičnost za virus Denge. Ove B delijske linije nakon toga mogu da se koriste kao obogaden izvor imunoglobulinskih matrica za identifikaciju i kloniranje rekombinantnih monoklonskih antitela sa neutrališudom aktivnosti za virus Denge in vitro i in vivo. Kao što je ovde prikazano, opisujemo izolaciju, pretraživanje, kloniranje i in vitro/in vivo karakterizuaciju prvih u potpunosti humanih monoklonskih antitela koja su specifična za serotip 1 Denga virusa.

[0005] Postupak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov deo koji se specifično vezuje za protein omotača (E) serotipa 1 virusa Denge ili njegov fragment, pri čemu je antitelo humano antitelo sa neutrališudom aktivnosti koje se vezuje za dva proteina E u virusu, pri čemu vezivanje preko proteina E obuhvata vezivanje za DI i zglob između DI i II na jednom E proteinu i DIII susednog proteina E.

[0006] U različitim izvođenjima ovog aspekta, antitelo ili njegov deo može da bude(a) ceo molekul imunoglobulina; (b) scFv; (c) Fab fragment; (d) F(ab’)2; ili (e) Fv povezan disulfidnim vezama.

[0007] U drugim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment mogu da sadrže konstantni domen teškog lanca imunoglobulina koji je odabran iz grupe koja se sastoji od: (a) konstantnog domena humanog IgM antitela; (b) konstantnog domena humanog IgG1 antitela; (c) konstantnog domena humanog IgG2 antitela; (d) konstantnog domena humanog IgG3 antitela; (e) konstantnog domena humanog IgG4 antitela; ili (f) konstantnog domena humanog IgA1/2 antitela.

[0008] U još drugim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment mogu da sadrže konstantni domen lakog lanca imunoglobulina koji može da bude: (a) humani Ig kapa konstantni domen; ili (b) humani Ig lambda konstantni domen.

[0009] U dodatnim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment sadrži teški lanac koji obuhvata najmanje jedan CDR koji je odabran iz grupe CDR sekvenci koje su prikazane na Slici 4(B).

[0010] U daljim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment sadrži laki lanac koji obuhvata najmanje jedan CDR koji je odabran iz grupe CDR sekvenci koje su prikazane na Slici 4(B).

[0011] U drugim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment sadrži teški lanac koji obuhvata tri CDR sekvence kao što je prikazano na slici 4(B).

[0012] U drugim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment sadrži teški lanac koji obuhvata tri CDR sekvence kao što je prikazano na slici 4(B).

[0013] U daljim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment sadrži IGHV1-2*02 okvir čitanja teškog lanca i najmanje jednu od CDR sekvenci kao što je prikazano na slici 4(B).

[0014] U još drugim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment sadrži IGKV3-20*01 okvir čitanja teškog lanca najmanje jednu od CDR sekvenci kao što je prikazano na slici 4(B).

[0015] U jednom izvođenju, antitelo sadrži sekvencu teškog lanca kao što je prikazano na slici 4(B).

[0016] U drugom izvođenju, antitelo sadrži sekvencu lakog lanca kao što je prikazano na slici 4(B).

[0017] U još drugom izvođenju, antitelo je 14c10, klon 8.

[0018] U nekim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment vežu se za antigen sa konstantom afiniteta (KD) koja ima vrednost manju od 1 x 10<-8>M.

[0019] U drugim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment vežu se za antigen sa konstantom afiniteta (KD) koja ima vrednost manju od 1 x 10<-9>M.

[0020] U daljim izvođenjima, antitelo ili njegov fragment poreklom je od B delija pacijenta koji se izlečio od infekcije virusom Denge.

[0021] U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje virus Denge ima specifčnost vezivanja 14c10, klona 8.

[0022] U daljem izvođenju, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov fragment prema bilo kojim odgovarajudim izvođenjima koji su gore navedeni i farmaceutski prihvatljivog nosača koji je efikasan da smanji ili spreči infekciju virusom Denge kod subjekta. U nekim izvođenjima, farmaceutske kompozicije mogu dalje da sadrže drugi agens, na primer, antivirusni lek ili analgetički lek.

[0023] U daljem izvođenju, pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela u postupku pasivne imunizacije koji obuhvata davanje efikasne količine antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kojim relevantnim izvođenjima kao što je navedeno gore u tekstu.

[0024] U dodatnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela u postupku lečenja infekcije virusom Denga koji obuhvata davanje subjektu kome je potrebno količine antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kojim relevantnim izvođenjima kao što je navedeno gore u tekstu, koja je efikasna da smanji ili spreči bolest.

[0025] U nekim izvođenjima, antitelo se daje intravenozno (IV), subkutano (SC), intramuskularno (IM), transdermalno, ili oralno.

[0026] U drugim izvođenjima, antitelo se daje u količini koja se nalazi u opsegu od 1 to 100 milligrama po kilogramu mase tela subjekta.

[0027] Takvo davanje, dalje može da sadrži davanje drugog agensa, koji može, na primer, antivirusni lek ili analgetički lek.

[0028] U drugim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ili njegov fragment prema bilo kojim relevantnim aspektima i izvođenjima koja se nalaze gore u tekstu. Takve izolovane nukleinske kiseline mogu da se nalaze u ekspresionom vektoru. Takvi ekspresioni vektori mogu da se nalaze unutar delije domadina, kao što je bakterijska, eukariotska, ili sisarska delija.

KRATAK OPIS SLIKA

[0029]

Slika 1: Dijagram toka postupka pretraživanja antitela, ekspresije i karakterizacije. Izolovane su CD22+ B delije iz pacijenata inficiranih Dengom koji su primljeni u bolnicu Nacionalnog Univerziteta (NUH). Ove B delije su imortalizovane sa EBV u prisustvu aktivatora poliklonskih B delija (2,5µg/ml CpG sekvenci, IL2 i IL4) koji se dodaju kako bi se poboljšala efikasnost imortalizacije. B delije su zasejane u koncentraciji od 30delija/bunaridu u 96 bunarida sa okruglim dnom sa 1x10<5>alogenim, ozračenim PBMC-a koji se dobijaju iz slojeva leukocita i trombocita (<„>buffy coat“). Nakon dve nedelje, supernatanti iz ovih klonova se pretražuju pomodu ELISA, PRNT i CPE za aktivnost vezivanja/neutralizacije. Ekstrahuje se iRNK pozitivnih B delijskih linija i sekvence teških i lakih lanaca antitela se kloniraju u „kudni“ pCMV vektor i vrši se transfekcija u Freestyle® 293F delije da se dobiju visoke koncentracije rekombinantnih antitela. Rekombinantna antitela sa željnom specifičnošdu se identifikuju i dalje karakterišu. Slika 2: Skrining supernatanta imortalizovanih B delijskih linija sa CPE i PRNT za aktivnost neutralizacije Denge. (A) BHK-21 su stimulisane sa DV u prisustvu supernatanta poreklom od B-delijskih linija imortalizovanih sa EBV. (upotrebom ovog pristupa pretraženo je 2000 delijskih linija). Citopatski efekat je procenjen bojenjem ostalih intaktnih delija kristalno ljubičastom elucijom sa sirdetnom kiselinom i određivanjem apsorbance na 595 nm. Krajnja tačka testa se definiše ako 50% citopatski efekat i virusna koncentracija se optimizuje. Testovi supernatanta se pretražuju početno u razblaženju 1 u 4. Top 10% klonova su ponovo testirani pomodu PRNT.

(B) Dobijanje humane delijske linije B limfocita koja sekretuje neutralizujuda humana antitela protiv Denge. BHK delije sa 80% konfluentnosti inficiraju se virusom Denge u trajanju od 3 dana. Virusni plakovi se vizualizuju upotrebom boje kristal violet (Sigma- Aldrich, Singapore) koja se vezuje za vijabilne delije. Supernatanti iz B delijskih klonova (poreklom iz oporavljenih individua koji su inficirani virusom Denge 1) testirani su za neutralizujudu aktivnost. Denga 1 (50 pfu) je inkubiran sa supernatantima delijske kulture (razblažen<1>/4) 1 sat pre dodavanja BHK delijama. Pronađeno je da delijska linija 14c10 sekretuje antitela koja značajno smanjuju brojeve plakova.

Slika 3: Matrice antitela eksprimirane od strane B delijske linije 14C10 i udružene CDR aminokiselinske sekvence.

(A) Plazmidna mapa pokazuje mesta restrikcionih enzima i kloniranja inserata teških i lakih lanaca za dobijanje rekombinantnog humanog IgG1 antitela upotrebom identifikovanih matrica iz 14c10. (B) Sve identifikovane i klonirane sekvence teškog i lakog lanca 14c10 sa njihovim CDR regionima (CDR 1, CDR 2 i CDR 3 redom) plus 12 permutacija u kombinacijama teškog i lakog lanca koriste se za dobijanje različitih rekombinanatnih antitela.

Slika 4: Matrica antitela 14c10.8 kodira rekombinantno antitelo sa aktivnosti vezivanja za denga serotip 1. (A) Sendvič ELISA se koristi za testiranje svih rekombinantno eksprimiranih antitela poreklom iz B delijske linije 14c10 ekprimiranih i prečišdenih iz supernatanta 293F. Broj matrice 8 jasno daje pozitivni signal za denga virus serotipa 1. (B) Istaknuta je puna nukleotidna i aminokiselinska sekvenca 14c10.8 teških i lakih lanaca sa CDR regionima.

Slika 5: Serotipska specifičnost 14c10.8 antitela sa PRNT i ELISA. (A) Sendvič ELISA pokazuje specifičnost rekombinantnog IgG114c10 antitela prema živom celom denga virusu serotipa 1. Nema vidljive aktivnosti vezivanja za Denga serotipove 2,3 ili 4. (B) PRNT podaci pokazuju specifičnost rekombinantnog 14c10.8 antitela prema Westpac 74 Denga virusu serotipa 1. Nije uočena značajna neutralizujuda aktivnost za Denga serotip 2,3 ili 4. (C) Neobrađeni PRNT podaci pokazuju serotipsku specifičnost 14c10.8 za Denga virus serotipa 1.

Slika 6: 14c10.8 pokazuje poboljšanje koje zavisi od homotipskog antitela (ADE) ali bez poboljšanja koje zavisi od heterotipskog antitela za vitro denga infekciju. Serijski razblaženo 14c10.8 antitelo inkubira se sa jednakom zapreminom virusa (MOI ili 1) u trajanju od 1hr na 37°C nakon čega se prebacuje na humanu mijelomonocitnu delijsku liniju K562 (delijska linija koja se obično upotrebljava za ADE testove) i inkubira na 37°C u trajanju od 4 dana. Supernatanti se nakon toga pokupe sa inficiranih K562 delija and i dobijeni virusni titar se procenjuje pomodu PRNT. ADE se definise povedanim virusni titrima u odnosu na kontrole gde antitelo nije dodato (tačkasta plava linija). Podaci pokazuju prisustvo ADE kod denga virusa serotipa 1 ali ne kod serotipa 2, 3 i 4. Ovo zapažanje sugeriše da 14c10.8 treba da bude bezbedno antitelo za davanje pacijentima inficiranim denga 1 virusom pod uslovom da se radije daje u koncentracijama za neutralizaciju nego za poboljšanje.

Slika 7: Konverzija 14c10.8 prema različitim IgG sub-klasama ima uticaj na njegovu homotipsku aktivnost pojačanja. Mi smo konvertovali 14c10 iz humanog IgG1 u humani IgG3 i humani IgG4 upotrebom navedenih konstrukata. Oni su eksprimirani kao rekombinantna antitela u 293F delijama nakon čega se prečišduju na kolonama Protein-A sefaroze za dalje testiranje. Testiranjem homotipskog pojačanja upotrebom K562 delijskih linija kao što je opisano na Sl. 6. IgG3 ispoljava maksimalnu aktivnost pojačanja dok je IgG1 srednji i IgG4 ima najmanje nivoe poboljšanja aktivnosti.

Slika 8: 14c10.8 je specifičan za E-protein virusa Denge. (i) Delije su inficirane DV u trajanju od dva dana. Zatim, dolazi do liziranja delija u smešu virusa se dodaje metionin S<32>da bi se inkorporiralo radioaktivno jedinjenje. U smešu se dodaje antitelo nakon čega sledi dodavanje kuglica sa Protein A-agarozom i inkubiranje 1 hr na 4°C. Nakon inspiranja, proteini se ispiraju sa neredukujudim puferom za punjenje i postavljaju na 15% SDS-poliakrilamidni gel nakon čega sledi srebrno bojenje u skladu sa protokolom proizvođača (SilverQuest kit za bojenje, Invitrogen). Traka od 56 Kd odgovara proteinu E virusa Denge. (ii) Prečišdeni celi virus Denge (denaturisani i ne-denaturisani) postavlja se ne-denaturišudi gel i prebacuje na membranu gde se blotuje sa 14C10 antitelom. Prikazani rezultati pokazuju da se 14C10 slabo vezuje za linearni epitop E proteina Denga virusa.

Slika 9: Neutralizujuda aktivnost rekombinantnog 14c10 antitela protiv različitih genotipova serotipa 1 virusa denge.

Povedane koncentracije antitela se dodaju u 50 jedinica koje obrazuju plak (p.f.u.) različitih genotipova serotipa 1 virusa Denge (ime genotipa virusa je dato je u zagradi) i inkubiraju se na 37°C u trajanju od 1 hr.100µl smeše dodaje se u monosloj BHK-21 delija u ploču sa 24 bunarida i inkubira se 1hr na 37°C. Supernatant se uklanja i na inficirane delije se nanosi 1ml 2% (mas/v) karboksil metil celuloze u RPMI plus 2% FBS. Nakon dalje inkubacije na 37°C u trajanju od 4 dana, bunaridi se boje sa 0,5% (mas/v) kristal violet bojom koja je rastvorena u 25% (v/v) formaldehidu da bi se omogudila vizuelizacija plakova.

Slika 10: 14c10 ispoljava i profilaktičku i terapeutsku aktivnost in vivo: (A) Profilaktička aktivnost 14c10.8 uočava se injektiranjem AG129 (n=6) miševa sa različitim koncentracijama antitela 24 časa pre infekcije sa serotipom 1 denge. Jedna terapeutska doza od 250 µg/mišu antitela daje se jednoj grupi (n=6) 24 časa nakon infekcije denga virusom. Viremija koja se dobija kvantifikuje se u serumu krvi inficiranih miševa pomodu PRNT 4 dana nakon infekcije.

(B) 14c10.8 ispoljava profilaktičku aktivnost na koncentracijama od 1-5 µg/mišu. Pri nižim koncentracijama antitela postoje neki dokazi o povedanoj infekciji.

Slika 11: HM14c10 je humano antitelo specifično za DENV1. (A) HM14c10 ispoljava neutrališudu aktivnost koja je specifčna za DENV1 sa 50% i 90% PRNT vrednostima 0,328 µg/ml i 1,313 µg/ml, redom. (B) HM14c10 indukuje homotipski ADE za DENV1 na sub-neutrališudim koncentracijama ali bez heterotipskog ADE za DENV2, DENV3 ili DENV4. HM4G2 indukuje ADE aktivnost za sva 4 serotipa (C) (a) Fab fragment ili mutacija (N297Q) IgG1 Fc regiona HM14c10 značajno smanjuje homotipsku ADE. (b) Različite subklase humanog IgG (HM14c10) posreduju različitim nivoima homotipskog ADE. (D) HM14c10 je visoko neutralizujudi za brojne DENV1 genotipove u odnosu na HM4G2. Genotipovi su naznačeni u zagradama pored oznake za virus. Stubidi greške predstavljaju standardne devijacije triplikata uzoraka, i svi eksperimenti se izvode najmanje tri puta.

Slika 12: HM14c10 vezuje epitop virusa koji zavisi od kvaternarne strukture.. (A) KrioEM mapa Fab 14c10:DENV1 kompleksa pokazuje 120 Fab-ova (plavo) koji vezuju 180 proteina E na površini virusa (cijan). Crni trougao predstavlja asimetričnu jedinicu. (B) Prikaz veznih gustina Fab HM14c10(I) prema epitopu E proteina (ljubučaste sfere). E protein E-DI, E-DII i E-DIII obojeni su u crveno, žuto i plavo, redom. (C) Gustine Fab molekula na Cα lancima E proteina u dve asimetrične jedinice. Fab HM14c10(I) i HM14c10(II) su dva nezavisna molekula u asimetričnoj jedinici. (D) Epitopi Fab HM14c10(I) (ljubučaste sfere) i HM14c10(II) (cijan sfere) na tri E proteina (u sivoj boji) u asimetričnoj jedinici.

Slika 13: HM14c10 blokira vezivanje DENV1 za BHK delije i ispoljava potentu zaštitnu aktivnost in vivo.

(A) Konfokalna mikroskopija sa vremenskim prekidima („time lapse“) pokazuje DENV1 infekciju BHK delija domadina u prisustvu (a) mAt izotipske kontrole, (b) HM4G2 i (c) HM14c10 mAt. Levi paneli: DENV1 i Mat-a obeleženi su sa Alexafluor-647 (crveno) i Alexafluor-488 (zeleno), redom. Desni paneli pokazuju granice delija (bele istačkane linije) i distribucija DENV1 u delijama. (B) Bliži pregled uživo događaja infekcije. DENV1 su uočene unutar BHK delija od 18 min u kontrolama izotipa i od 28 min sa HM4G2. HM14c10:DENV1 kompleksi ne mogu da se vežu za BHK delije. (C) Unutrašnji intenzitet crvene fluorescencije od 120 nasumično odabranih delija kvantifikuje se kao mera internalizacije virusa tokom 1 h. jednostruka ANOVA koristi se za poređenje 3 grupe. **p<0,0001. (D) HM14c10 se testira za upotrebu kao profilaktički agens i terapeutski agens; antitelo se daje AG129 miševima koji su inficirani sa DENV1 u danu 0 i danu 2 nakon infekcije, redom. HM14c10 pokazuje zaštitni odgovor bilo da je virus injektiran (a) subkutano ili (b) intraperitonealno. Nivo viremije u krvi testira se tokom dana 3 ili 4 redom, nakon infekcije pomodu testa plaka. N=5 u oba modela i T-test se koristi za poređenje testova uzorka, ** p<0,0001, * p<0,05 poređenje sa PBS kontrolama.

Slika 14: Identifikacija i rekombinantna ekspresija u potpunosti humanog antitela sa neutralizujudom aktivnosti za virus Denge. (A)(a) Dve hiljade EBV-B-delijskih linija su dobijene od pacijenta koji je inficiran DENV1 i supernatanti su pretraženi pomodu ELISA za aktivnost vezivanja prema DENV1 ali ne DENV2, 3 ili 4. Identifikovano je sedam pozitivnih EBV-BCL delijskih linija. (b) Test smanjenja i neutralizacije plaka (PRNT) izvodi se za testiranje aktivnosti neutralizacije. Podaci se eksprimiraju kao PRNT100 (tj. kompletna neutralizacija) na najvedem faktoru razblaženja i predstavlja prosečnu vrednost iz 3 eksperimenata. (B)(a) Šematski prikaz pTT5 vektora koji se koristi za eksprimiranje matrica teškog lanca i lakog lanca poreklom od EBV-BCL u HEK293 delijama. (b) Dvanaest rekombinantnih humanih IgG1 mAt-a klonirani su i eksprimiraju se EBV-BCL 14c10 delijskoj liniji i testiraju se za aktivnost vezivanja prema DENV1 pomodu ELISA. Kao pozitivna kontrola se koristi humanizovano mišje monoklonsko 4G2 antitelo (HM4G2). Matrica rekombinantnog antitela 8 (označena HM14c10) ispoljava aktivnost vezivanja prema DENV1. (C)(a) PRNT aktivnost HM14c10 na DENV1, 2, 3 i 4. (b) HM14c10 se testira za akztivnost vezivanja prema DENV1, 2, 3 i 4 pomodu ELISA. Ovi podaci predstavljaju srednju vrednost 3 eksperimenata i stubidi greške su jednaki standardnoj devijaciji srednje vrednosti triplikata setova uzoraka.

Slika 15: HM14c10 ispoljava aktivnost vezivanja za brojne DENV1 kliničke izolate. HM14c10 aktivnost vezivanja za nekoliko DENV1 izolata se poredi sa humanizovanim mišjim monoklonskim antitelom HM4G2 na različitim koncentracijama upotrebom uspostavljenog ELISA protokola. Svi DENV1 izolati se koriste pri 1x10<6>pfu/ml i pokrivaju preko nodi na 4 °C sa HB112 koji se koristi kao agens za hvatanje. HM14c10 ili HM4G2 antitelo se dodaje u koncentraciji od 5 µg/ml i konjugati anti-humanog IgG HRP se koriste za detekciju aktivnosti vezivanja.

Slika 16: Uklapanje kristalne strukture DENV1 E proteina nakon fuzije u krioEM mapu Fab HM14c10 u kompleksu sa Denga 1 virusom. (A) Pogled odzgo na denga 1 E proteine. KrioEM mapa se prikazuje sa visokim nivoom kontura od 5.5σ tako da može da se uoči jasan pregled gustina E proteina. Na ovom nivou kontura, Fab gustine nestaju, što ukazuje na to da nisu svi epitopi E proteina okupirani Fab molekulima na površini virusa. Gustine elektrona na površini virusa interpretiraju se podešavanjem strukture DENV1 E proteina nakon fuzije u kristalnu strukturu (18). S obzirom da se kristalna struktura DENV1 E proteina nakon fuzije ne uklapa dobro u krioEM mapu kao čvrsto telo, tri domena E proteina moraju da se uklapaju nezavisno. Domeni I, II i III E proteina su obojeni u crveno, žuto i plavo, redom. E proteini iz dve asimetrične jedinice ovde su prikazani sa jednom asmetričnom jedinicom koja je naznačena trouglom. (B) Bočni pogled uklopljenih E proteina na površinu DENV1. Mogu da se uoče gustine Fab molekula, spoljašnji domen E proteina i transmembranski (Tm) heliksi. Strelicama su označene gustine koje odgovaraju glikanima na poziciji Asn159 na dva susedna E proteina i naznačena je pozicija spoljašnjeg i unutrašnjeg sloja lipidnog dvosloja. KrioEM mapa prikazana je na 2.5σ nivou kontura.

Slika 17: Stereo-dijagram Fab HM14c10 i vezujudeg interfejsa E proteina. Gustina Fab HM14c10(II) pokazuje jasne veze sa E proteinima na površini virusa. Ostaci blizu mesta kontakta su naznačeni sferama. KrioEM gustina prikazana je na 2.5σ nivou kontura.

Slika 18: Superpozicija varijabilnih regiona homologije modela HM14c10 (zeleno) sa referencom humanog monoklonskog antitela (PDB kod 2GHW) (plavo). Slika prikazuje (A) bočni i (B) pogled odozgo na varijabilne regione antitela.

Slika 19: Uklapanje modela homologije HM14c10 varijabilnog regiona u HM14c10:DENV1 krioEM mapu gustine. (A) Gustine koje odgovaraju zasebnim lancima (a i b) varijabilnog regiona antitela zaokružene su sa krioEM mape. Ostaci na mestu kontakta uklopljenih E proteina naznačeni su cijano sferama. E-DI, E-DII i E-DIII su obojeni u crveno, žuto i plavo, redom. (B) Modeli homologije lakih i teških lanaca zasebno su uklopljeni u varijabilni region Fab krioEM gustina.<a>Za oznaku Fab pozicije vidi Sl. 12.<b>Za oznaku Fab gustine vidi (A).<c>Uklapanja modela homologije u HM14c10:DENV1 krioEM mapu (postavljeno na nivou konture od 3σ) su optimizovana upotrebom funkcije za uklapanje u mapu u Himeri (35). (C) Uklopljeni HM14c10 variabilni region modela homologije (zeleno) prikazuje CDR-ove u magentima. Prikazano uklapanje ima laki lanac u Fab gustini a, i teški lanac u Fab gustini b.

Slika 20: HM14c10 epitop na denga serotipu 1 (genotip PVP159) i poređenje epitopa sa (A) drugim DENV1 genotipovima i (B) denga serotipovima i virusom Zapadnog Nila (WNV).

Uobičajeni ostaci aminokiselina između epitopa koje prepoznaju Fab HM14c10(I) i Fab HM14c10(II) u asimetričnoj jedinici obojeni su zeleno. Ostaci koji se jedinstveno prepoznaju pomodu Fab HM14c10(I) ili Fab HM14c10(II) obojeni su ljubičastvo i cijano, redom. Aminokiselinske sekvence epitopa koje su prepoznate od strane Fab HM14c10 konzervisane su u okviru DENV1 genotipova, ali ne kroz denga serotipove ili virus Zapadnog Nila. To je u skladu sa zapažanjem da Fab HM14c10 vezuje vedinu denga 1 genotipova, ali nema ukrštenu reaktivnost sa drugim denga serotipovima ili flavivirusima sa zasenčenim otiscima (tragovima) antitela (a) na poziciji X1 i II ili (b) poziciji X2 i I.

Slika 21: Infektivnost i in vivo efikasnost obeleženog DENV1. (A) Obeležavanje živog DENV izvodi se kao što je prethodno opisano (22). Infektivnost i vijabilnost obeleženog virusa se testira pomodu testa plaka kroz titraciju na BHK delijama. (B) In vivo efikasnost HM14c10 testira se u dva in vivo modela koji koriste različite sojeve/koncentracije DENV1 virusa plus različite načine isporuke virusa. Predstavljen je šematski prikaz oba ova modela. (a) U modelu 1, 1x10<6>pfu soja EHID1 injekcira se subkutano (S.C.) i viremija u serumu se prati 4 dana kasnije pomodu testa plaka. Profilakse se daju 24 h pre infekcije DENV1 i terapeutske primene u danu plus 2 nakon infekcije. (b) Takođe se koristi drugi agresivniji model infekcije DENV1. Miševi su injektirani intraperitonealno sa 1,25x10<7>pfu Westpac DENV1 sojem. Virusna infekcija plus profilaktički i terapeutski tretmani daju se intraperitonealnom (I.P.) injekcijom u istim vremenskim tačkama kao u modelu 1. U ovom modelu, viremija plazme dostiže maksimum dana+3 nakon infekcije i tada se mere efekti datih antitela na prisutnu viremiju u serumu. Obe grupe su dobile kontrole sa jednakim zapreminama sterilnog slanog rastvora.

Slika 22: Poređenje epitopa koji je vezan antitelom CR4354 virusa Zapadnog Nila i denga 1 specifičnog HM14c10. (A) Podešavanje HM CR4354 i HM 14c10 sa E proteinima na WNV (levo) (25) i DENV (desno), redom. Gustina krioEM je prikazan na 2.8σ (CR4354:WNV) ili 2.5σ (HM14c10:DENV1 nivou kontura. (B) Asimetrična jedinica WNV (levo) i DENV1 (desno) sa otiscima antitela CR4354 ili HM14c10 prikazana je u sferama. Epitopi na dva nezavisna mesta vezivanja u asimetričnoj jedinici obojena su ljubičasto i cijan. Tri E proteina u asimetričnoj jedinici su zasenčena sivo. Asimetrična je prikazana kao crni trougao. (C) Poređenje ostataka u dva nezavisna epitopa (a i b) između CR4354 (na WNV) i HM 14c10 (na DENV). Ostaci u dva nezavisna epitopa obojeni su kao pod (B).

DETALJNI OPIS

[0030] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na kompozicije i postupke za prevenciju ili lečenje infekcije denga virusom kod subjekta kičmenjaka. Posebno, mi smo izolovali CD22+ B delije iz pacijenata inficiranih denga virusom koji su primljeni u odeljenje za infektivne bolesti bolnice Nacionalnog Univerziteta (NUH). Ove B delije su imortalizovane sa EBV in vitro kao poliklonske delijske linije. Dodaje se poliklonski B delijski aktivator (CpG sekvence) da bi se poboljšala efikasnost imortalizacije B delija zajedno sa faktorima rasta B delija, Interleukinom 2 i Interleukinom 4 (1000U/ml svaki). Humane B delijske linije prave se u 96 bunarčida pri čemu su bunarčidi sa okrugim dnom. Nakon dve nedelje, supernatanti iz ovih klonova se pretražuju pomodu ELISA testa („Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)“), Testa smanjenja plaka neutralizacijom (PRNT) i Testa za citopatski efekat (CPE) da bi se analizirala aktivnost vezivanja/neutralizacije za denga virus. B delijske linije koje proizvode pozitivna antitela koriste se kao izvor iRNK za umnožavanje gena lakih i teških lanaca. Sekvence teških i lakih lanaca antitela kloniraju se u „kudni“ pCMV vektor i vrši se transfekcija u Freestyle® 293F delije da se dobiju visoke koncentracije rekombinantnog antitela. Upotrebom ove metodologije, mi smo klonirali i eksprimirali rekombinantno antitelo koje je isključivo specifično za denga serotip 1 i ima široku specifičnost za različite genotipove denga serotipa. Ovo antitelo ne veže se za druge viruse roda Flavivirus i kao takvo, pokazuje malo ili nimalo povedanja u infekciji makrofaga prema drugim flavivirusima iznad onih koji su očekivani za denga serotip 1. In vivo eksperimenti su pokazali izuzetnu profilaktičku i terapeutsku efikasnost u mišjem modelu infekcije denga virusom. Kao takvo, ovo antitelo predstavlja najbolji kandidat terapeutika koji postoji za infekciju denga 1 virusom.

DEFINICIJE

[0031] Treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen određenim postupcima, reagensima, jedinjenjima, kompozicijama ili biološkim sistemima, koji naravno, mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je terminologija koja se ovde koristi samo za svrhu opisivanja određenih izvođenja, bez namere da bude ograničavajuda. Kao što se korisi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici jednine uključuju reference u množini osim ukoliko sadržaj jasno ne ukazuje drugačije.

[0032] Termin "oko" kao što se ovde koristi kada se odnosi na merenje vrednosti kao što je količina, vremensko trajanje, i slično, ima za cilj da obuhvati varijacije od 620% ili 610%, poželjnije 65%, još poželjnije 61%, još više poželjno 60,1% od navedene vrednosti, jer su takve varijacije pogodne za izvođenje prikazanih postupaka.

[0033] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je obično poznato prosečnom stručnjaku iz oblasti tehnike na koga se pronalazak odnosi. Pored toga što su mnogi postupci i materijali slični ili jednaki onima koji se ovde opisuju, mogu da se koriste u praksi za testiranje predmetnog pronalaska, poželjni materijali i postupci su ovde opisani.

[0034] "Kičmenjak," "sisar," "subjekat," "sisarski subjekat," ili "pacijent" naizmenično se koriste i odnose se na sisare kao što su humani pacijenti, nečovekoliki mamuni, kao i eksperimentalne životinje kao što su zečevi, pacovi, i miševi, krave, konji, koze, i drugi sisari. Životinje uključuju sve kičmenjake, npr., sisare i ne-sisare, kao što su miševi, ovde, psi, krave, vrste ptica, patke, guske, svinje, kokoške, vodozemce, i reptile.

[0035] "Lečenje" ili "tretman" generalno se odnosi na ili (i) prevenciju infekcije ili reinfekcije, npr., profilaksa, ili (ii) smanjenje ili eliminaciju simptoma bolesti od interesa, npr., terapija. Lečenje subjekta sa kompozicijama pronalaska može da spreči ili smanji rizik infekcije virusom Denge, posebno serotipom 1. Tretman može da bude profilaktički (da se sprečili ili odloži početak bolesti, ili da se spreči ispoljavanje njenih kliničkih ili subkliničkih simptoma) ili terapeutska supresija ili ublažavanje simptoma nakon ispoljavanja bolesti.

[0036] "Sprečavanje" ili "prevencija" se odnosi na profilaktičko davanje sa kompozicijama pronalaska.

[0037] "Terapeutski efikasna količina" ili "količina efikasna da smanji ili eliminše infekciju" ili "efikasna količina" odnosi se na količinu kompozicije antitela koja je dovoljna da se spreči denga virusna infekcija ili ublaži (npr., olakša, smanji, redukuje) najmanje jedan od simptoma koji su povezani sa takvom infekcijom. Nije neophodno da davanje kompozicije eliminiše simptome Denga infekcije, sve dok su vede koristi kompozije koja se daje u odnosu na štete. Slično tome, termini "lečiti" i "tretiranje" u odnosu na denga infekciju, kao što se ovde koristi, nisu namenjeni da znače da je subjekat neophodno izlečen od infekcije ili da su svi njeni klinički znaci eliminisani, ved samo da je neko ublažavanje ili poboljšanje kod stanja subjekta pod uticajem primene kompozicije.

[0038] "Pasivni imunitet" se generalno odnosi na prenos aktivnog humoralnog imuniteta u obliku prethodno stvorenih antitela iz jedne individue na drugu. Prema tome, pasivni imunitet je oblik kratkotrajne imunizacije koja može da se postigne prenosom antitela, koja mogu da se daju u nekoliko mogudih oblika, na primer, u obliku humane ili životinjske krvne plazme ili seruma, kao ukupni životinjski ili humani imunoglobulin za intravenoznu (IVIG) intramuskularnu (IG) upotrebu, kao visoki titar IVIG humanog ili životinjskog porekla ili IG iz imunizovanih subjekata ili od donora koji se oporavljaju od bolesti, i u obliku monoklonskih antitela. Pasivni transfer može da se koristi profilaktički za prevenciju početka bolesti, kao i za lečenje nekoliko tipova akutnih infekcija. Obično, imunitet koji se dobija na osnovu pasivne imunizacije traje samo kratak vremenski period, i obezbeđuje trenutnu zaštitu, ali telo ne razvija memoriju, prema tome pacijent se nalazi u riziku da kasnije bude inficiran istim patogenom.

ANTITELA

[0039] Kao što se ovde koristi, termin "antitelo" odnosi se na bilo koji imunoglobulin ili intaktni molekul kao i njihove fragmente koji se vezuju za specifični epitop. Takva antitela uključuju, ali nisu ograničena na poliklonska, monoklonska, himerna, humanizovana, jednolančana, Fab, Fab’, F(ab)’ fragmente i/ili F(v) delove celog antitela i njegove varijante. Svi izotipovi su obuhvadeni ovim terminom, uključujudi IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM.

[0040] Kao što se ovde koristi, termin "fragment antitela" se specifično odnosi na nekompletni ili izolovani deo cele sekvence antitela roditeljskog antitela koji zadržava funkciju vezivanja antigena. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2, i Fv fragmente; diantitela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i antitela sa višestrukom specifičnošdu koja se dobijaju iz fragmenata antitela.

[0041] Intaktno "antitelo" sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koja su povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skradeno kao HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji iz tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji iz varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skradeno kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji iz jednog domena, CL. Regioni VH i VL mogu dalje da se podele u regione hipervarijabinosti, koji se zovu regioni određuju komplementarnost (CDR), koji se nalaze zajedno između regiona koji su više konzervisani, koji se zovu okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji iz tri CDR-a i četiri FR-a, koji su uređeni od amino-kraja do karboksi-kraja prema slededem redu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže domen za vezivanje koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domadina, uključujudi različite delije imunskog sistema (npr., efektorske delije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa. Termin antitelo uključuje delove za vezivanje antigena intaktnog antitela koji zadržavaju kapacitet vezivanja. Primeri vezivanja uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji iz VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab’)2 fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta koja su i povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fd fragment koji se sastoji iz VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragmenta (Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)), koji se sastoji iz VH domena; i (vi) izolovanog regiona koji određuje komplementarnost (CDR).

[0042] Kao što se ovde koristi, termin "jednolančana antitela" ili "jednolančani Fv (scFv)" odnosi se na fuzioni molekul antitela od dva domena Fv fragmenta, VL i VH. Iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, oni mogu da se spoje, upotrebom postupaka rekombinacije, pomodu sintetičke grupe za vezivanje koja im omogudava da se dobiju kao jedan lanac proteina gde su regioni VL i VH spareni pri čemu se dobijaju monovalentni molekuli (poznato kao jednolančani Fv (scFv); vidi, npr., Bird et al., Science, 242:423-426 (1988); i Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879-5883 (1988)). Takva jednolančana antitela uključena su referencom terminom fragmenti "antitela" koji mogu da se dobiju pomodu tehnika rekombinacije ili enzimskim ili hemijskim isecanjem intaktnih antitela.

[0043] Kao što se ovde koristi, termin "antitelo humane sekvence" uključuje antitela sa varijabilnim i konstantnim regionima (ukoliko su prisutna) koja su poreklom od humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Antitela sa humanim sekvencama pronalaska mogu da uključe ostatke aminokiselina koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije koje se uvode nasumičnom ili mesto – specifičnom in vitro mutagenezom ili pomodu somatske mutacije in vivo). Takva antitela mogu da se dobiju u ne-humanim transgenim životinjama, npr., kao što se opisuje u PCT App. Pub. br. WO 01/14424 and WO 00/37504. Međutim, termin "antitelo sa humanom sekvencom", kao što se ovde koristi, nema nameru da uključi antitela kod kojih su CDR poreklom iz germinativnih delija drugih sisarskih vrsta, kao što je miš, prebačeni u obliku grafta u okvir čitanja humanih sekvenci (npr., humanizovana antitela).

[0044] Takođe, mogu da se dobiju rekombinantni imunoglobulini. Vidi, Cabilly, U.S. Patent No.

4,816,567; and Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:10029-10033 (1989).

[0045] Kao što se ovde koristi, termin "monoklonsko antitelo" odnosi se na dobijanje molekula antitela jedne molekulske kompozicije. Kompozicija monoklonskog antitela ispoljava vezivanje i afinitet jedne specifičnosti za određeni epitop. Prema tome, termin "humano monoklonsko antitelo" odnosi se na antitela koja ispoljavaju jednu specifičnost vezivanja sa varijabilnim i konstantnim regionima (ukoliko su prisutni) poreklom od humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. U jednom aspektu, humana monoklonska antitela se dobijaju od hibridoma koji uključuje B delije koje se dobijaju iz transgene ne-humane životinje, npr., transgenog miša, koji ima genom koji se sastoji od humanog transgena teškog lanca i transgena lakog lanca koji su fuzionisani sa imortalizovanom delijom.

[0046] Kao što se ovde koristi, termin "antigen" se odnosi na supstancu koja podstiče stvaranje antitela i može da prouzrokuje imunski odgovor. U predmetnom prikazu može naizmenično da se koristi sa terminom "imunogen". U užem smislu, imunogeni su one supstance koje podstiču odgovor imunskog sistema, pri čemu se antigeni definišu kao supstance koje vezuju specifična antitela. Antigen ili njegov fragment može da bude molekul (tj., epitop) koji omogudava kontakt određenim antitelom. Kada se protein ili fragment proteina koristi za imunizaciju životinje domadina, brojni regioni proteina mogu da indukuju nastajanje antitela (tj., pokrenu imunski odgovor), koja se specifično vezuju za antigene (date regione ili tri-dimenzionalne strukture na proteinu).

[0047] Kao što se ovde koristi, termin "humanizovano antitelo," odnosi se na najmanje jedan molekul antitela gde je aminokiselinska sekvenca u regionima koji nisu određeni za vezivanje antigena i/ili antigen-vezujudim regionima izmenjena tako da antitelo više podseda na humano antitelo, i dalje zadržava njegovu originalnu sposobnost vezivanja.

[0048] Dodatno, mogu da se koriste tehnike razvijene za dobijanje "himernih antitela" (Morrison, et al., Proc Natl Acad Sci, 81:6851-6855 (1984)) splajsovanjem gena iz mišjeg antitela sa odgovarajudom specifičnosti za antigen zajedno sa genima iz humanog molekula antitela sa odgovrajudom biološkom aktivnosti. Na primer, geni iz mišjeg molekula antitela koje je specifično za autoinducer mogu da se splajsuju zajedno sa genima molekula humanog antitela odgovarajude biološke aktivnosti. Himerno antitelo je molekul kod koga su različiti delovi poreklom iz različitih životinjskih vrsta, kao što su oni koji imaju varijabilni region poreklom iz mišjeg mAb i konstantni region humanog imunoglobulina.

[0049] Dodatno, razvijene su tehnike za dobijanje humanizovanih antitela (vidi, np., U.S. Patent No.

5,585,089 and U.S. Patent No. 5,225,539). Varijabilni region teškog ili lakog lanca imunoglobulina sastoji se iz regiona "okvira" koji je prekinut sa tri hipervarijabilna regiona, koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR-i). Ukratko, humanizovana antitela su molekuli antitela iz nehumanih vrsta koja imaju jedan ili više CDR-a iz ne-humanih vrsta i region okvira iz molekula humanog imunoglobulina.

[0050] Alternativno, tehnike koje se opisuju za dobijanje jednolančanih antitela mogu da se prilagode za proizvodnju jednolančanih antitela prema imunogenom konjugatu predmetnog pronalaska. Jednolančana antitela se obrazuju povezivanjem fragmenata teškog i lakog lanca Fv regiona pomodu aminokiselinskog mosta, pri čemu se dobija jednolančani polipeptid. Fab i F(ab’)2 delovi molekula antitela mogu da se dobiju proteolitičkom reakcijom upotrebom papaina i pepsina, redom, na u osnovi intaktne molekule antitela pomodu dobro poznatih postupaka. Vidi npr., U.S. Patent br.

4,342,566. Takođe su dobro poznati Fab’ delovi molekula antitela i proizvode se iz F(ab’)2 delova nakon čega sledi redukcija disulfidnih veza povezivanjem dva dela teških lanaca pomodu merkaptoetanola, i zatim sledi alkilacija dobijenog protein merkaptana sa reagensom kao što je jodoacetamid.

TESTOVI ZA ANTITELA

[0051] U oblasti tehnike su poznati brojni skrining testovi za testitanje antitela od interesa za potvrdu njihove specifičnosti i afiniteta i određivanja da li ova antitela imaju ukrštenu reaktivnost sa drugim proteinima.

[0052] Termini "specifično vezivanje" ili "specifično vezano" odnosi se na interakciju između antigena i njegovih odgovarajudih antitela. Interakcija zavisi od prisustva određene strukture proteina koja se prepoznaje od strane vezujudeg molekula (tj., antigen ili epitop). Da bi vezivanje bilo specifično, treba da uključi vezivanje antitela za epitop(e) od interesa a ne pozadinske antigene.

[0053] Jednom kada se antitela proizvedu, ona se testiraju za dobijanje potvrde njihove specifičnosti za antigen od interesa i određivanje da li ispoljavaju bilo koju ukrštenu reaktivnost sa drugim antigenima. Jedan postupak za izvođenje takvih testova je test skrininga seruma kao što se opisuje u U.S. App. Pub. No. 2004/0126829. Međutim, drugi postupci testiranja za kontrolu kvaliteta su u veštini stučnjaka u oblasti tehnike i prema tome su takođe se nalaze u okviru predmetnog prikaza.

[0054] Antitela, ili antigen-vezujdi fragmenti, varijante ili njihovi derivativi predmetnog prikaza takođe mogu da se opišu ili navedu u terminima njihovog afiniteta vezivanja za antigen. Afinitet antitela za antigen može eksperimentalno da se odredi upotrebom pogodnog postupka. (Vidi, e.g., Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); i postupke koji se ovde opisuju). Izmereni afinitet određene antitelo-antigen interakcije može da varira ukoliko se meri pod različitim uslovima (npr., koncentracija soli, pH). Prema tome, merenja afiniteta i drugih parametara vezivanja antigena (npr., KD, Ka, Kd) poželjno se izvode sa standardizovanim rastvorima antitela ili antigena, i standardizovanim puferom.

[0055] Konstanta afiniteta vezivanja (Kaff) može da se odredi upotrebom sledede formule:

gde je

[0056] [mAb] je koncentracija sloodnih mesta za antigen, i [mAg] je koncentracija slobodnih monoklonskih mesta za vezivanje kao što je utvrđeno na dve različite koncentracije antigena (tj., [mAg]t i [mAg’]t) (Beatty et al., J Imm Meth, 100:173-179 (1987)).

[0057] Termin "visok afinitet" za antitelo se odnosi na ekvilibrijum konstante povezivanja (Kaff) od najmanje oko 1 x 10<7>litara/molu, ili najmanje oko 1 x 10<8>litara/molu, ili najmanje oko 1 x 10<9>litara/molu, ili najmanje oko 1 x 10<10>litara/molu, ili najmanje oko 1 x 10<11>litara/molu, ili najmanje oko 1 x 10<12>litara/molu, ili najmanje oko 1 x 10<13>litara/molu, ili najmanje oko 1 x 10<14>litara/molu ili više. "Visok afinitet" vezivanja može da varira od izotipova antitela. KD, ekvilibrijum kostante disocijacije, je termin koji se takođe koristi da se opiše afinitet antitela i to je inverzna vrednost Kaff.

[0058] KD, ekvilibrijum konstante disocijacije, je termin koji se takođe koristi da se opiše afinitet antitela i to je inverzna vrednost Kaff. Ukoliko se KD koristi, termin "visok afinitet" za antitelo se odnosi na ekvilibrijum konstante disocijacije (KD) koji je manji od 1 x 10<-7>mola/litrima, ili manje od oko 1 x 10<-8>mola/litrima, ili manje od oko 1 x 10<-9>mola/litrima, ili manje od oko 1 x 10<-10>mola/litrima, ili manje od oko 1 x 10-11 mola/litrima, ili manje od oko 1 x 10-12 mola/litrima, ili manje od oko 1 x 10<-13>mola/litrima, ili manje od oko 1 x 10<-14>mola/litrima ili niže.

[0059] Dobijanje antitela prema predmetnom pronalasku obezbeđuje antitela sa karakteristikama onih koja se dobijaju u toku fiziološkog humanog imunskog odgovora, tj. specifičnosti antitela koja mogu samo da se odaberu pomodu humanog imunskog sistema. U ovom slučaju, ovo uključuje odgovor prema humanom patogenu denga virusu, serotipa 1. U nekim izvođenjima, antitela predmetnog pronalaska imaju karakteristike onih koji se proizvode u slučaju odgovora na infekciju denga virusom. Ova antitela mogu da se koriste kao profilaktički ili terapeutski agensi po odgovarajudoj formulaciji.

[0060] U odnosu na određeni patogen, "neutralizujude antitelo", "široko neutalizujude antitelo", ili "neutralizujude monoklonsko antitelo", svi koji se ovde naizmenično koriste, je ono koje može da neutrališe sposobnost patogena da pokrene i/ili održi infekciju kod domadina. U nekim izvođenjima, monoklonska antitela koaj su proizvedena prema predmentom pronalasku iamju neutralizujudu aktivnost, pri čemu antitelo može da neutralizuje an koncentraciji od 10<-9>M ili niže (npr. 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M ili niže).

[0061] Imunoglobulinski molekuli predmetnog pronalaska mogu da budu bilo kojeg tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), ili subklase molekula imunoglobulina. U nekim izvođenjima, antitela su fragmenti vezivanja antitela za antigen (npr., humani) i uključuju, ali bez ograničenja, Fab, Fab’ i F(ab’)2, Fd, jednolančane Fv-e (scFv), jednolančana antitela, disulfidom povezane Fv-e(sdFv) i fragmente koji sadrže ili VL ili VH domene. Fragmenti antitela za vezivanje za antigen, uključujudi jednolančana antitela, mogu samo da sadrže varijabilne region(e) ili u kombinaciji sa slededom celinom ili delom: regionom zgloba, CH1, CH2, i CH3 domenima. Takođe su u predmetnom pronalasku uključeni fragmenti za vezivanje za antigen koji sadrže bilo koju kombinaciju varijabilnih region(a) sa regionom zgloba, CH1, CH2, i CH3 domenima.

IZOLACIJA B DELIJA

[0062] Kao što se ovde koriste, termini "B delija", "B memorijska delija", "B limfocit", "B memorijski limfocit", "memorijske delije", "memorijske B delije", i njihove varijante se naizmenično koriste i odnose se na B delije humoralnog imunskog odgovora. Kao što se razume u oblasti tehnike, B delije su limfociti koji imaju ulogu u humoralnom imunskom odgovoru (za razliku od imunskog odgovora koji je posredovan delijama, koji je regulisan T delijama). Najmanje jedna funkcija B delija je da naprave antitela u odnosu na antigen, izvedu ulogu antigen prezentujudih delija (APC-a) i na kraju da se razviju u memorijske B delije nakon aktivacije interakcijom sa antigenom. B delije su komponente adaptivnog imunskog sistema.

[0063] Fraza "primarna B delija" u nekim izvođenjima može da se odnosi na B deliju koja se uzima direktno iz živog organizma (npr., čovek). U nekim izvođenjima, primarna B delija može da se gaji u primarnoj kulturi delija. Primarna B delija može da bude poreklom, da se dobije ili uzme od subjekta na bilo koji način koji je poznat stručnjacima u oblasti tehnike. U nekim izvođenjima, primarna B delija se dobija od subjekta koji je inficiran sa ili ima antigen od interesa.

[0064] Postupci predmetnog pronalaska mogu da se primene za identifikaciju monoklonskih antitela koja se eksprimiraju od strane humanih B delija koje su odabrane od donora, kao što su pacijenti koji su izloženi infektivnom agensu, npr., denga virusu. Stoga, donor može da bude naivan, vakcinisan, pogođen sa jednom ili više bolesti ili infekcija, ved izložen i/ili rezistentan na određene terapeutske tretmane, predstavlja specifičan klinčki indeks ili status, slučajno izložen patogenu, itd.

[0065] Serum donora može kao takav da se koristi za početno određivanje njihove seropozitivnosti prema antigenu, s obzirom na to da dugotrajno održavanje adaptivnih imunskih odgovora (čak godinama nakon poslednjeg izlaganja ovom antigenu) može da omogudi kvantitativno određivanje koje je dovoljno za biranje donora. Priroda i senzitivnost skrining testova koji se koriste je kritična za identifikaciju najpogodnijeg donora i, poželjno, test koji se koristi za skrining seruma donora treba da bude isti kao onaj koji se koristi za skrining supernatanta od imortalizovanih B delija koje sekretuju antitela i dizajniran da detektuje antitelo sa željenom funkcionalnom aktivnosti (tj., aktivnosti neutralizacije).

[0066] Odabir tkiva ili organa od kojih de se delije prečistiti može da zavisi od dostupnosti odgovarajudih delija u dovoljnoj količini. Delije mogu da se dobiju od svežih ili zamrznutih uzoraka i/ili od uzoraka dobijenih od brojnih individua koji su objedinjeni da se obezbedi dovoljno početnog materijala.

[0067] Preliminarni skrining može da se izvede na panelu kandidata donora, upotrebom uzoraka koji sadrže delije koje sekretuju antitela (kao što je ukupna periferna krv ili serum). Posebno, mononuklearne delije mogu da se izoluju iz krvi ili limfnih tkiva upotrebom standardnih tehnika razdvajajnja za izolaciju mononuklearnih delija periferne krvi (PBMCs), kao što je centrifugiranje na gradijentu. Nakon i/ili pre ovog koraka razdvajanja, uzorci seruma (ili plazme), supernatanti kulture delija, ili delije (koje su dobijene od različitih pacijenata, iz različitih tkiva, i/ili u različitim vremenskim tačkama) mogu da pre-skrinuju upotrebom standardnih tehnologija za detektovanje prisustva antitela i delija koje sekretuju antitela (npr. ELISA, BIACORE, Western blot, FACS, SERPA, testovi za antigene, neutralizacija virusne infekcije u sistemu delijske kulture, ili ELISPOT testovi).

[0068] Primeri u oblasti tehnike uključuju, na primer, upotrebu ELISPOT za određivanje imunskog odgovora kod vakcinisanih donora (Crotty S et al., 2004), upotrebu mikročipova za antigen kao dijagnostičkog alata za novoinficirane pacijente (Mezzasoma L et al., 2002), i druge tehnologije za merenje antigen-specifičnih imunskih odgovora (Kern F et al., 2005).

[0069] Ova preliminarna kvalitativna analiza odgovora antitela prema terapeutskoj meti treba da omogudi identifikaciju donora sa B delijama koje eksprimiraju visoke titre antitela koja su usmerena na željeni prečišdeni antigen (npr. specifični rekombinantni virusni protein), smešu srodnih antigena (npr. dobijenih od delimično pročišdenih virusnih preparata), ili biotestova (npr. neutralizacija virusne infektivnosti).

[0070] Jednom kada se jedan ili više donora izaberu, izvor B delija može da bude slezina, krv, limfni čvorovi, kostna srž, limfociti koji se infiltriraju u tumor, limfociti koji su poreklom sa mesta hronične infekcije/inflamacije. Međutim, obično je lakše da se od donora dobije periferna krv, da se skladišti, I da se prati serološki odgovor prema antigenu tokom definisanog vremenskog perioda.

[0071] Na primer, počevši od 5-50 ml periferne krvi, približno 10-100 miliona PBMC-a (mononuklearnih delija periferne krvi) mogu da se prečiste brojne delije koje bi omogudile skrining dovoljno velike populacije delija koje sekretuju antitela nakon imortalizacije upotrebom postupaka koji se ovde opisuju.

[0072] Nakon izolacije PBMC-a iz bioloških uzoraka, može da se izvede specifični odabir delija koje sekretuju antitela, upotrebom postupaka koji su poznati u oblasti tehnike, na osnovu ekspresije delijskih površinskih markera na njihovoj površini i, ukoliko je potrebno, drugih proteina, kao i aktivnosti proliferacije, metaboličkog i/ili morfološkog statusa delija.

[0073] Posebno, različite tehnologije za prečišdavanje delija koje sekretuju antitela iz humanih uzoraka koriste različita sredstva i uslove za pozitivnu ili negativnu selekciju. Ove delije mogu efikasno da se selektuju pomodu fizičkog razdvajanja onih koje ekspimiraju markere na delijskoj površini koji su specifični za delije koje eksprimiraju i sekretuju antitela (npr. humane B delije). U oblasti tehnike mogu da se pronađu specifični protokoli (vidi, npr., Callard R and Kotowicz K "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F. (ed.) Oxford University Press, 2000, pg.17-31).

[0074] Odabir može da se izvede upotrebom antitela koja se specifično vezuju za jedan od ovih proteina na delijskoj površini i koja mogu da se vežu za čvrste podloge (npr. mikrokuglice ili plastične podloge) ili koja su obeležena fluorohromom koja može da se detektuje upotrebom fluorescencijom aktiviranih delijskih sortera (FACS). Na primer, humane B delije su odabrane na osnovu njihovog afiniteta za podloge (kao što su mikrokuglice) vezivanjem CD19, CD27, i/ili CD22 mikrokuglica, ili zbog nedostatka afiniteta vezivanja antitela koja su specifična za određene izotipove pre imortalizacije EBV-om (Li H et al., 1995, Bemasconi N et al., 2003; Traggiai E et al., 2004).

[0075] Kao što je ovde pokazano, CD22, koji je transmembranski protein ograničen na B-delije koji kontroliše puteve signalne transdukcije koji su povezani sa prepoznavanjem anitgena i aktivacijom B delija (Nitschke L, 2005), može da se upotrebi za početni odabir B delija. S obzirom da CD22 pozitivna populacija sadrži delije koje eksprimiraju antitela različith izotipova i specifičnosti, drugi markeri delijske površine takođe mogu da se koriste za odabir delija.

[0076] Alternativno ili dodatno, može da se dobije specifično obogadivanje delija koje sekretuju antitela primenom selekcije na osnovu CD27 dodatno sa selekcijom na osnovu CD22 selekcije. CD27 je poznat kao marker humanih B delija koje imaju somatski mutirane gene varijabilnog regiona (Borst J et al., 2005). Dodatni markeri kao što su CD5, CD24, CD25, CD86, CD38, CD45, CD70, ili CD69 takođe mogu da se koriste ili da osiromaše ili obogate željenu populaciju delija. Prem tome, u zavisnosti od istorije prethodnog izlanja donora antigenu (npr. virusni, bakterijski, parazit), titar antitela, ukupne B delije, CD22 obogadene B delije, ili mogu da se dalje koriste obogadene B delijske subpopulacije kao što su CD27 pozitivne B delije.

EBV TRANSFORMACIJA B DELIJA

[0077] Odabrana i stimulisana populacija delija koje eksprimiraju antitela specifičnih izotipova mogu da se imortalizuju upotrebom virusnog agensa za imortalizaciju. Različiti agensi imortalizacije mogu da se koriste na delijama koje sekretuju antitela da bi se dobile imortalizovane delije koje sekretuju antitela.

[0078] Među virusnim agensima koji vrše imortalizaciju, virus koji inficira i imortalizuje deliju koja sekretuje antitela može poželjno da se koristi u praksi pronalaska. Virusi koji se uobičajeno koriste su limfotropni virusi, grupisani u gama klasu herpesvirusa. Članovi ove familije virusa inficiraju limfocite na način koji zavisi od vrste, i povezani su sa limfoproliferativnim poremedajima i razvojem nekoliko maligniteta (Nicholas J, 2000; Rickinson A, 2001).

[0079] EBV (Epstein-Barr virus, takođe poznat kao herpesvirus 4), i HHV-8 (humani herpesvirus 8, takođe poznat kao KSHV, Herpervirus povezan sa Kapošijevim sarkomom) inficira i imortalizuje humane limfocite. MHV-68 (mišji herpesvirus 68), HVS (herpesvirus Samiri), RRV (Rhesus Rhadinovirus), LCV (Limfokriptovirus primata), EHV-2 (Herpesvirus 2 konja) HVA (Herpesvirus Ateles), i AHV-1 (Alcelafin Herpesvirus 1) predstavljaju druge onkogene, limfotropne herpesviruse koji imaju zajedničke genetičke karakteristike koje su među njima konzervisane i slične patogene efekte kod različitih sisarskih domadina. Ovi virusu mogu da se koriste u praksi predmetnog pronalaska.

[0080] Dodatno sa upotrebom intaktnih virusa, za imortalizaciju B delija se uspešno koriste rekombinantni DNK konstrukti koji sadrže specifične virusne proteine (Damania B 2004; Kilger E et al., 1998). Vektori koji sadrže virusne gene mogu da se prebace transdukcijom u delije, ponekad koristedi retroviralne sisteme ili pakovanja delijskih linija koje obezbeđuju sve neophodne in trans faktore za obrazovanje takvih partikula sličnih virusima, takođe mogu da se koriste u postupcima koji se ovde prikazuju.

[0081] Imortalizacija posredovana EBV-om je kompleksni proces koji uključuje imortalizaciju B delija zbog proteina koji su eksprimirani odstrane EBV, i regulisan je interakcijom između EBV i proteina delija domadina (Sugimoto M et al., 2004; Bishop G E, and Busch L K, 2002). Po potrebi, proces imortalizacije može da se prati merenjem ekspresije specifičnih EBV proteina i transkripata kao što su EBNA2, EBNA1, LMP2, LMP1, ili EBERs (Thorley-Lawson D A, 2001). Ovi proteini mogu da se detektuju PCR-om, imunofluorescencijom, Western blot-om, ili drugim postupcima koji omogudavaju detekciju EBV DNK i proteina kod inficiranih delija (Schlee M et al., 2004; Park C H et al., 2004; Humme S et al., 2003; Konishi K et al., 2001; Haan K et al., 2001).

SKRINING I IZOLACIJA TRANSFORMISANIH B DELIJA

[0082] U nekim izvođenjima, transformisane i/ili aktivirane B delije mogu da se pretraže za one koje imaju željenu antigensku specifičnost, i nakon toga iz pozitivnih delija mogu da se proizvedu individualni klonovi B delija. Korak skrininga može da se izvede upotrebom ELISA, bojenjem tkiva ili delija (uključujudi delije kod kojih je izvršena transfekcija), test neutralizacije, i/ili jedan od brojnih drugih postupaka koji su poznati u oblasti tehnike za identifikaciju specfičnosti željenog antitela. Test može da odabere na osnovu jednostavnog prepoznavanja antigena, ili može da izabere na osnovu dodatne poželjne funkcije, npr. anititela koja neutralizuju pre nego samo antitela koja vezuju antigen.

[0083] U nekim izvođenjima, korak kloniranja za razdvajanje individualnih klonova iz smeše pozitivnih delija može da se izvede upotrebom ograničenog razblaživanja, mikormanipulacije, odlaganjem pojedinačnih delija pomodu sortiranja delija, i/ili bilo kojim drugim postupkom koji je poznat u oblasti tehnike. U nekim izvođenjima, kloniranje se izvodi upotrebom ograničenog razblaživanja. U nekim izvođenjima, klonirane B delije su poreklom od B delija koje su imortalizovane upotrebom EBV-transformacije koja je kuplovana sa inhibicijom urođenog imunskog odgovora prema proliferativnim signalima koji su posredovani aktivatorom.

[0084] U nekim izvođenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje proizvodnju imortalizovanih B delija koje proizvode antitela koja imaju željenu antigensku specifičnost. Takve B delije mogu da se koriste na različite načine, npr. kao izvor monoklonskih antitela, kao izvor nukleinske kiseline (DNK ili iRNK) kodiranje monoklonskog antitela od interesa, za davenje subjektima koji primaju delijsku terapiju, kao terapeutik ili farmaceutik.

[0085] U nekim izvođenjima, supernatant poreklom od B delija u kulturi može da se pretraži za anititelo od interesa upotrebom poznatih postupaka u oblasti tehnike. Skrining se izvodi za identifikaciju jednog ili više monoklonskih antitela koji mogu da se vežu za antigen od interesa. Skrining tog tipa može da se izvodi na supernatantu kulutre i/ili prečišdenim antitelima. Alternativno, skrining može da se izvede upotrebom supernatanta kulture i/ili prečišdenih antitela iz aktiviranih i/ili imortalizovanih B delija. Dodatno, gde su od interesa antitela sa ukrštenom reaktivnosti, može da se odredi sposobnost monoklonskih antitela da ukršteno reaguju sa dva ili više različita antigena. Osim toga, u nekim izvođenjima, može da bude pože poželjan skrining antitela sa određenim funkcionalnim karakteristikama (npr. aktivnost neutralizacije).

[0086] Specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koja se proizvode predmetnim pronalaskom može, na primer, da se odredi u imunotestu, npr. imunoprecipitacijom drugim testovima in vitro vezivanja, kao što je radioimunotest (RIA) ili enzimom-vezanom imunoadsorbentnom testu (ELISA).

[0087] Reprezentativne opšte klase postupaka skrininga koji mogu da se koriste uključuju, ali bez ograničenja, (a) testove hvatanja antitela; (b) testove hvatanja antigena; i (c) skrining funkcija.

[0088] U testovima za hvatanje antitela, na čvrstoj fazi može da bude vezan antigen, monoklonskim antitelima koja treba da se vežu za antigen se omogudava da se vežu za antigen, antitela koja se nisu vezala se uklanjaju ispiranjem, i nakon toga se detektuju vezana antitela, npr. ili upotrebom sekundarnog reagensa kao što je obeleženo antitelo koje specifično prepoznaje antitelo.

[0089] U testovima za hvatanje antigena, antigen može da bude obeležen direktno. U jednom izvođenju, monoklonska antitela koja treba da se testiraju mogu da se vežu za čvrstu podlogu i nakon toga reaguju sa po potrebi obeleženim antigenom. Alternativno, kompleksu antigen-antitelo može da se omogudi da se obrazuje pomodu imunoprecipitacije pre vezivanja monoklonskog antitela koje treba da se testira na čvrstoj fazi. Jednom kada se antigen-antitelo kompleksi vežu za čvrstu podlogu, antigen koji se nije vezao može da se ukloni ispiranjem i pozitivni mogu da se identifikuju detekcijom antigena.

[0090] Postoje različiti funkcionalni skrininzi za identifikaciju monoklonskih antitela with sa željenim aktivnostima. U predmetnom pronalasku, jedan takav skrining, kao što se opisuje u Primerima, je test neutralizacije.

REKOMBINANTNA EKSPRESIJA

[0091] Postupci predmetnog pronalaska takođe obezbeđuju dobijanje i/ili sekvenciranje nukleinske kiseline antitela iz odabranog B delijskog klona; i upotrebom nukleinske kiseline da se dobiju delije domadina koje mogu da eksprimiraju antitelo od interesa.

[0092] U nekim izvođenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira željeno antitelo može da se sekvencira i nakon toga koristi u heterolognim ekspresionim sistemima, npr. 293 delijama ili CHO delijama. U nekim izvođenjima, antitelo može da bude rekombinantno eksprimirano dobijanjem jedne ili više nukelinskih kiselina (npr. geni teškog i/ili lakog lanca) iz B delijskog klona koji kodira antitelo od interesa i ubacivanje nukleinske kiseline u deliju domadina da bi se u tom domadinu omogudila ekspresija antitela od interesa.

[0093] Dobijanje antitela upotrebom postupaka rekombinantne DNK opisuje se, na primer, u U.S. Pat. No.4,816,567. Za rekombinantno dobijanje antitela, izoluje se nukleinska kiselina koja ga kodira i insertuje u replikativni vekor za dalje kloniranje (umnožavanje DNK) ili za ekspresiju. DNK koja kodira monoklonsko antitelo se brzo izoluje i sekvencira upotrebom konvencionalnih postupaka (npr., upotrebom oligonukleotidnih proba koje mogu specifično da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Vektori koji mogu da se koriste uopšteno uključuju, ali bez ograničenja, jedan ili više od slededih: signalnu sekvencu, mesto početka replikacije, jedan ili više marker gena, element pojačivača, promoter, i sekvencu za terminaciju transkripcije. Primeri komponenata takvog ekspresionog sistema prikazani su u, na priemr, U.S. Pat. No.5,739,277. Pogodne delije domadini za kloniranje ili eksprimiranje DNK u vektorima ovde su delije prokariota, kvasca, ili delije viših eukariota (vidi, npr., U.S. Pat. No.5,739,277).

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE

[0094] Sadašnji predmetni prikaz obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela koja se dobijaju u skladu sa predmetnim pronalaskom. U nekim izvođenjima, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže transformisane i/ili aktivirane B delije. U nekim izvođenjima, farmaceutska kompozicija može da sadrži jedno ili više monoklonskih antitela koja se proizvode korišdenjem postupaka koji se ovde prikazuju. U nekim izvođenjima, i monoklonska antitela kao i transformisane i/ili aktivirane B delije sadašnjeg predmetnog prikaza mogu da budu uključena u farmaceutsku kompoziciju. U nekim izvođenjima, panel monoklonskih antitela koji se proizvodi prema predmetnom pronalasku može da bude uključen u farmaceutsku kompoziciju. U nekim izvođenjima, monoklonska antitela i/ili B delije koje se dobijaju prema predmetnom pronalasku mogu da budu uključena sa jednim ili više dodatnih agenasa, na primer, antivirusnim lekovima ili analgeticima.

[0095] U nekim izvođenjima farmaceutska kompozicija može takođe da sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač ili adjuvans za davanje antitela. U nekim izvođenjima, nosač je farmaceutski prihvatljiv za upotrebu kod ljudi. Nosač ili adjuvans ne treba samostalno da pokrede proizvodnju antitela koja su štetna pojedincu koji dobija kompoziciju i ne treba dabude toksičan. Pogodni nosači mogu da budu veliki, makromolekuli koji se sporo metabolišu kao što su proteini, polipeptidi, lipozomi, polisaharidi, polimlečne kiseline, poliglikolen kiseline, polimerne aminokiseline, kopolimeri aminokiselina i inaktivne čestice virusa.

[0096] Za farmaceutski prihvatljive soli mogu da se koriste, na primer soli mineralnih kiselina, kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati i sulfati, ili soli organskihkiselina, kao što su acetati, propionati, malonat i benzoati.

[0097] Farmaceutski prihvatljivi nosači u terapeutskim kompozicijama mogu dodatno da sadrže tečnosti kao što je voda, slani rastvor, glicerol i etanol. Dodatno, pomodne supstance, kao što su sredstva za vlaženje ili emulgovanje ili pH supstance pufera, mogu da se nalaze u takvim kompozicijama. Takvi nosači omoguduju farmaceutskim kompozicijama da budu formulisani u obliku tableta, pilula, dražeja, kapsula, tečnosti, gelova, sirupa, gustih supstanci i suspenzija, za uzimanje (ingestiju) od strane pacijenta.

[0098] Kompozicije sadašnjeg predmetnog prikaza mogu dalje da sadrže nosač koji de da olakša dobijanje kompozicije i pripremu. Može da se koristi bilo koje pogodno sredstvo za isporuku ili nosač, uključujudi, ali bez ograničenja, mikrokapsulu, na primer mikrosferu ili nanosferu (Manome et al. (1994) Cancer Res 54:5408-5413; Saltzman & Fung (1997) Adv Drug Deliv Rev 26:209-230), glikozaminoglikan (U.S. Pat. No.6,106,866), masnu kiselinu (U.S. Pat. No.5,994,392), emulziju masti (U.S. Pat. No. 5,651,991), lipid ili derivativ lipida (U.S. Pat. No. 5,786,387), kolagen (U.S. Pat. No.

5,922,356), polisaharid ili njegov derivativ (U.S. Pat. No. 5,688,931), nanosuspenziju (U.S. Pat. No.

5,858,410), polimernu micelu ili konjugat (Goldman et al. (1997) Cancer Res 57:1447-1451 and U.S. Pat. Nos. 4,551,482, 5,714,166, 5,510,103, 5,490,840, and 5,855,900), i polizom (U.S. Pat. No.

5,922,545).

[0099] Sekvence antitela mogu da se kupluju sa aktivnim agensima ili nosačima upotrebom postupaka koji su poznati u oblasti tehnike, uključujudi ali bez ograničenja konjugaciju karbodiimida, esterifikaciju, oksidaciju natrijum perjodata nakon čega sledi reduktivna alkilacija, i ukršteno povezivanje glutar aldehidom(Goldman et al. (1997) Cancer Res. 57:1447-1451; Cheng (1996) Hum. Gene Ther. 7:275-282; Neri et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:1271-1275; Nabel (1997) Vectors for Gene Therapy. In Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, New York; Park et al. (1997) Adv. Pharmacol.40:399-435; Pasqualini et al. (1997) Nat. Biotechnol.15:542-546; Bauminger & Wilchek (1980) Meth. Enzymol. 70:151-159; U.S. Pat. No. 6,071,890; and European Patent No. 0 439095).

[0100] Terapeutska kompozicija predmetnog pronalaska u nekim izvođenjima sadrži farmaceutsku kompoziciju koja uključuje farmaceutski prihvatljivi nosač. Pogodne formulacije uključuju vodene i ne-vodene injekcije sterilnih rastvora koji mogu da sadrže anti-oksidanse, pufere, bakteriostatike, bakterijske antibiotike i rastvore koji daju izotoničnost formulaciji sa telesnim tečnostima primaoca kome je namenjeno; vodene i ne-vodene sterilne suspenzije koje mogu da uključe agense za suspenziju i agense za stvrdnjavanje. Formulacije mogu da se nalaze u kontejnerima za jediničnu dozu ili kontejnerima za više doza, na primer zatvorenim ampulama i bočicama, i mogu da se skladište u zamrznutim uslovima, ili uslovima koji su osušeni zamrzavanjem (liofilizovani) koji zahtevaju samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Neki primeri sastojaka su SDS koji se nalazi u nekim izvođenjima u opsegu od 0,1 do 10 mg/ml, u nekim izvođenjima oko 2,0 mg/ml; i/ili manitol ili drugi šeder koji se nalazi u nekim izvođenjima u opsegu od 10 do 100 mg/ml, u nekim izvođenjima oko 30 mg/ml; i/ili fosfatni pufer (PBS). Imajudi u vidu vrstu formulacije koja je u pitanju. bilo koji drugi agensi koji su uobičajeni u oblasti tehnike mogu da se iskoriste. U nekim izvođenjima, nosač je farmaceutski pihvatljiv. U nekim izvođenjima nosač je farmaceutski prihvatljiv za upotrebu kod ljudi.

[0101] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da ima vrednost pH koja je između 5,5 i 8,5, poželjno između 6 i 8, i poželjnije oko 7. Korišdenjem pufera može da se održava vrednost pH. Kompozicija može da bude sterilna i/ili bez pirogena. Kompozicija može da bude izotonična u odnosu na ljude. Farmaceutske kompozicije sadašnjeg predmetnog prikaza mogu da se isporuče u hermetički zatvorenim posudama.

[0102] Farmaceutske kompozicije mogu da uključe efikasnu količinu jednog ili više antitela kao što se ovde opisuje. U određenim izvođenjima, farmaceutska kompozicija može da sadrži količinu koja je dovoljna da se leči, ublaži, ili spreči željena bolest ili stanje, ili da se ispolji uočljivi terapeutski efekat. Terapeutski efekti takođe uključuju smanjenje kod fizičkih simptoma. Precizna efektivna količina za bilo koji određeni subjekat zaviside od veličine subjekta i zdravstvenog stanja, prirode i ozbiljnosti stanja, i terapeutika ili kombinacije terapeutka koji su odabrani za davanje. U datoj situaciji efikasna količina se određuje rutinskim eksperimentom kao što praktikuje onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike.

REŽIMI LEČENJA: FARMAKOKINETIKA

[0103] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu da se daju u različitim jediničnim doznim oblicima u zavisnosti od načina davanja. Stručanjcima u oblasti tehnike su dobro poznate tipične doze za farmaceutske kompozicije antitela. Takve doze se obično daju po savetu, i prilagođavaju se u zavisnosti od određenog terapeutskog konteksta ili tolerancije pacijenta. Količina antitela koja je adekvatna da se ovo postigne definiše se kao "terapeutski efikasna doza." Dozni raspored i efikasna količina za ovu upotrebu, tj., "dozni režim," zaviside od različitih faktora, uključujudi stupanj bolesti ili stanja, ozbiljnosti bolesti ili stanja, opšteg zdravstvenog stanja pacijenta, fizičkog statusa pacijenta, godina, farmaceutske formulacije i koncentracije aktivnog agensa, i slično. Kod računanja doznog režima pacijenta, takođe mora da se uzme u obzir i način davanja. Dozni režim takođe mora da uzme u obzir farmakokinetike, tj., brzinu apsorpcije farmaceutske kompozicije, biodostupnost, metabolizam, čišdenje, i slično. Visi, npr., the latest Remington’s; Egleton, Peptides 18: 1431-1439, 1997; Langer, Science 249: 1527-1533, 1990.

[0104] U svrhu predmetnog pronalaska, terapeutski efikasna količina kompozicije koja sadrži antitelo, sadrži oko 0,05 do 1500 µg proteina, poželjno oko 10 do 1000 µg proteina, poželjnije oko 30 do 500 µg i najpoželjnije oko 40 to 300 pg, ili bilo koji broj između ovih vrednosti. Na primer, antitela pronalaska mogu da se daju subjektu u dozi od oko 0,1 µg do oko 200 µg, npr., od oko 0,1 µg do oko 5 µg, od oko 5 µg do oko 10 µg, od oko 10 µg do oko 25 µg, od oko 25 µg do oko 50 µg, od oko 50 µg do oko 100 µg, od oko 100 µg do oko 500 µg, od oko 500 µg do oko 1 µg, od oko 1 µg do oko 2 µg, sa opcionim pojačivačima koji se daju na, na primer, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, dva meseca, tri meseca, 6 meseci i/ili godinu dana kasnije. Razume se da specifični dozni nivo za bilo kog određenog pacijenta zavisi od različitih faktora uključujudi aktivnost specifičnog antitela koje se koristi, godina, mase tela, opšteg zadravstvenog stanja, pola, ishrane, vremena davanja, načina davanja, brzine ekskrecije, kombinacije leka i ozbiljnosti određene bolesti koja se podrvgava terapiji.

[0105] Načini davanja uključuju, ali bez ograničenja, oralno, topikalno, subkutano, intramuskularno, intravenozno, subkutano, intradermalno, transdermalno i subdermalno davanje. U zavisnosti od načina davanja, zapremina po dozi je poželjno oko 0,001 do 10 ml, poželjnije oko 0,01 do 5 ml, i njapoželjnije oko 0,1 do 3 ml. Kompozicije mogu da se daju kao tretman sa jednom dozom ili u tretmanim sa više doza po rasporedu i vremenskom periodu koji je odgovarajudi za godine, težinu i stanje subjekta, posebno formulacije antitela koje se koriste, i način davanja.

KITOVI

[0106] Kitovi su obezbeđeni tako da sadrže antitela koja se proizvode u skladu sa predmetnim pronalaskom koja mogu da se koriste, na primer, za terapijske primene koa što se opisuje gore u tekstu. Predmet proizvodnje sadrži kontejner sa oznakom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, i epruvete. Kontejneri mogu da se dobiju iz različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejneri drže kompozicije koje uključuju aktivni agens koji je efikasan za terapeutsko davanje, kao što se opisuje gore u tekstu. Aktivni agens u kompoziciji može da sadrži antitelo. Naznaka na kontejneru ukazuje na to da se kompozicija koristi za određenu terapijsku ili neterapijsku primenu, i takođe može da ukazuje na smerove za ili in vivo ili in vitro upotrebu, kao što su oni koji su opisani gore utekstu.

[0107] Slededi primeri specifičnih aspekata za izvođenje predmetnog pronalaska služe samo za ilustrativne svrhe, i nemaju nameru da ograniče obim predmetnog pronalska koa što je navedenou patentnim zahtevima na bilo koji način.

PRIMERI

Postupci i materijali

Etička izjava

[0108] Informativni pristanak je dobijena i sve procedure su izvedene prema odobrenom protokolu Nacionalnog Univerziteskog Institucionalnog odbora za ispitivanje (NUS-IRB broj je 06-196).

Delije i virusi

[0109] C6/36 delije i BHK-21 delije postavljaju se u kulture kao što je prethodno opisano (28). Svi sojevi denge osim EHI i PVP 159 sojeva dobijeni su od Novartis Instituta za Tropske Bolesti, Singapor (NITD). EHI je dobijen od Environmental Health Institute, Singapor (EHI) i PVP 159 (DENV1/SG/07K3640DK1/2008) od EDEN kohorte pacijenta (29).

Kloniranje B delija

[0110] Izolacija i imortalizacija B delija izvodi se kao što je prethodno opisano (10). Nakon 15 dana kulture, vrši se skrining supernatanta za DENV-specifična antitela pomodu ELISA i PRNT.

ELISA testovi vezivanja

[0111] Ploče da 96 bunarida sa ravnim dnom (Maxisorp plates, Nunc) obložene su mišjim 4G2 antitelom preko nodi na 5 µg/ml preko nodu. Ploče su tri puta isprane sa PBS/Tween-20 0,01%. Različiti DENV sojevi se dodaju u koncentraciji od 1x10<5>pfu u 50 µl po bunaridu idalje inkubiraju u trajanju od 2 h. Ploče su tri puta isprane sa PBS/Tween-200,01%. U ploče se dodaje HM14C10 i dalje inkubira u trajanju od 1 hr. Ploče su tri puta isprane sa PBS/Tween-20 0,01%. Anti-humani IgG konjugovan sa HRP (Pierce, Singapore) se dodaje i inkubira u trajanju od 1 h. TMB substrat (GE healthcare, Singapore) se dodaje i koristi se 0,1 M sumporna kiselina da sezaustavi reakcija.

Dobijanje rekombinantnog HM14c10

[0112] RNK iz B delija se ekstrahuje upotrebom RNK kita za ekstrakciju (Qiagen). Kloniranje i ekspresija rekombinantnih antitela se izvodi kao što je prethodno opisano (30).

Test pojačanja koji zavisi od antitela

[0113] Denga virus (5 X 10<2>pfu/ml) je prethodno inkubiran sa medijumom, individualnim monoklonskim antitelima (HM4G2, HM14c10 ili HM14c10 N297Q) ili subklasama HM14c10 monoklonskih antitela (IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) nakon čega se dodaje u 10<5>K562 delijama. Nakon jednog sata, delije se intenzivno ispiraju sa PBS da bi se uklonio virus koji se nije vezao i monoklonsko antitelo. Nakon dodatnih 48 h, supernatanti se pokupe i virusni titri se određuju pomodu testa plaka na BHK-21 delijama.

In vivo eksperimenti na miševima

[0114] AG129 miševi su deficijenti za IFN-α/β i -γ receptore (31). Miševi su obrađeni u skladu sa Institucionalnom zaštitim životinja i preporukama Komiteta za zaštitu životinja (IACUC protokol br: 018/11). Šematski dijagram kojije obezbeđen u Slici 21 detaljno opisuje profilaktičke i terapeutske primene HM14c10 u odnosu na kontrole koje su tretirane PBS-om. Miševi su žrtvovani i viremija se kvantifikuje uspostavljenim testom plaka (32).

Konfokalno slikanje živih delija sa vremenskim prekidima

[0115] Sva mikroskopija živih delija sa vremenskim prekidima izvodi se na invertovanom A1Rsi konfokalnom mikroskopu (Nikon, Japan) upotrebom Plan-Apochromat 100X 1.4 numeričkog otvora (N.A.) sočiva. Slikanje živih delija se izvodi na živim, nefiksiranim BHK deliajma koje se uzgajaju na pokrovnim pločicama od stakla 25 mm (Marienfeld GmbH, Germany) koja se montiraju na držač komore (Nikon, Japan). Delije su zasejane u gustini od 4 X 10<4>/bunaridu 1 dan pre eksperimenta i kultivisane u RPMI 1640 koji je dopunjen sa 10% FCS. Z aistovremenu detekciju antitela koja su obeležena Alexa Fluor-488 i Alexa Fluor-647 obeleženih DEN1 virusa, 488 nm linija argonskog jonskog lasera i svetlo od 633-nm helijumskog neonskog lasera je usmereno preko HFT UV/488/633 razdeljivača zaraka, i fluorescencija se detektuje upotrebom NFT 545 razdeljivača zraka u kombinaciji sa 505-530 filterom za propuštanje savijanja za detekciju Alexa Fluor-488 i filter za propuštanje 650 dugog prolaza za detekciju Alexa Fluor-647. Slike su uhvadene na intervalima od 30 sec u 1 frejmu po sec (fps) za 30 do 60 min. Svi eksperimenti slikanja živih delija se izvode upotrebom delija koje se inkubiraju na 37 °C u 5% CO2mikroskopskom kavezu sistema inkubatora (OkoLab, Italy). Slike se analiziraju i procesuju pomodu Nikon Imaging Software (NIS) elements C software (64 bit, version 3, SP7/build 547) [Nikon, Japan].

Kvantifikacija unutardelijske fluorescencije

[0116] Efekat antitela na endocitozu DENV1 procenjuje se merenjem relativnog nivoa fluorescencije unutar živih delija. Nakon tretmana sa određenim antitelom, slike od najmanje 100 delija dobijaju se nasumično upotrebom A1Rsi konfokalnog mikroskopa iz tri nezavisna eksperimenta. Unutardelijski region delija se nakon toga ručno razgraniči upotrebom "regiona od interesa" [ROI] funkcijom NIS Elements software (Nikon, Japan) i relativni nivo fluoresecencije Alexa Fluor-488 unutar svake delije se meri pomodu statističke ROI funkcije softvera. Srednja vrednost, standardna devijacija i studentov t-test se računaju za svaku populaciju delija upotrebom Microsoft Excel. Fluorescencija iz netretiranih populacija delija koje su inficirane sa DEN1 normalizuje se do 100% i koristi za poređenje sa inficiranim delijama koje su tretirane sa antitelom.

KrioEM

[0117] Denga virus (soj PVP 159) se priprema ko što je prethodno opisano (3). Virus se meša sa Fab HM14c10 u molarnom odnosu od 1:1, inkubira na 37 °C 30 min, i nakon toga 4 °C 2 h. Kompleks se nakon toga brzo zamrzne u tečnom etanu na čipkastim mrežama od ugljenika, koje su obložene tankim slojem ugljenika u kontinuiteta. Čestice virusa su snimljene sa 300 kV FEI Titan Krios u slededim uslovima: doza elektrona od 16 e-/ Å<2>, uvedanje od 47,000, opseg defokusa od 1 µm do 3 µm. Slike su snimljene na 4K pomodu 4K Gatan CCD kamere pri čemu se dobija velidina piksela od 1,9 Å po pikselu. Ukupno 5566 čestica je u kutiji i parametri funkcije kontrasta se određuju upotrebom programa „boxer“ i „ctfit“, redom, u EMAN (33) programskom paketu. Orijentacija čestica se određuje upotrebom „multi-path simulated annealing“ (MPSA) protokola (34). Virus Zapadnog Nila se koristi kao početni model (26). Tri dimenzionalna mapa se dobija upotrebom programa koji pravi3d u EMAN. Nađeno je da je rezolucija konačne mape rezolucija od 7 Å kao što je određeno pomodu „fourier shell“ prekidom koeficijenta od 0,5. Kristalna struktura DENV1 E proteina nakon fuzije (18) ne uklapa se dobro u krioEM mapu gustine kao čvrsto telo, prema tome su domeni E proteina razdvojeni i uklopljeni zasebno. Uklapanje molekula u krioEM mapu (postavljena na 4σ nivo kontura) se nakon toga optimizuje upotrebom "fit-in-map" funkcije Chimera (35). Da bi se dobio model homologije HM14c10 varabilnog regiona, bira se struktura sa najboljim poklapanjem sekvenci (PDB kod 2GHW) i model homologije se dobija upotrebom Modeller (19). Težak i laki lanac modela homologije se nezavisno uklapa u krioEM mapu (postavljena na 3σ nivo kontura) u dve mogude orijentacije Fab-a (Fig.19).

Primer 1: Izolacija jako neutralizujudeg, DENV1 specifičnog antitela 14c10 iz oporavljenog DENV1 inficiranog pacijenta.

[0118] Identifikovane su grupe delijskih linija B limfocita koje sekretuju antitela sa serotip-specifičnim vezivanjem i neutralizujudom aktivnosti prema DENV1, nakon čega su delija sub-klonirane i proširene. Jedna od ovih delijskih linija, BCL-14c10, proizvodi IgG sa značajno jačom aktivnosti vezivanja i neutralizacijom u odnosu na druge (Fig. 14A). Ova delijska linija se koristi kao izvor matrica za gene imunoglobilina za PCR umnožavanje i ekspresiju rekombinantnih humanih IgG1-a (Sl. 14B(a)). Jedno rekombinantno humano antitelo (HM) 14c10 ima uporedivu vezujudu aktivnost za DENV1 da roditeljskim BCL-14c10 (Fig. 14B(b)). HM14c10 neutralizuje i veže se za DENV1 ali ne DENV2, 3 ili 4 (Sl.14C), i ispoljavaju jaku neutralizujudu aktivnost sa PRNT50od 0,328 µg/ml in vitro (Sl.11A).

[0119] Predloženo je da se javlja ADE aktivnost koja povezana sa razdvojem DHF i DSS kada subneutralizujude koncentracije antitela i DENV obrazuju komplekse koji se vezuju za delije koje nose Fc receptor. Ovo dovodi do povedanja u unosu virusa i sekreciji pro-inflamatornih citokina i hemokina (11). Mi smo upoređivali ADE aktivnost HM14c10 sa humanizovanim anti-Flavivirus monoklonskim antitelom HM4G2 upotrebom utvrđenog in vitro testa koji koristi mijelomonocitne delijske linije K562 koja eksprimira FcγR (12). HM4G2 ima ukrštenu serotip-vezujudu aktivnost i kao cilj ima konzervisanu fuzionu petlju E-DII na DENV1-4 (13). Uočavamo da HM14c10 ispoljava neko homotipsko pojačanje DENV1 infekcije pri sub-neutralizujudim koncentracijama ali bez aktivnosti pojačanja za DENV2, 3 ili 4, za koje se ne vezuje. Suprotno, HM4G2 posreduje u pojačanju svih četiri serotipova na subneutralizujudim koncentracijama (Sl.11B). Da bi se istražio doprinos K562 FcγR-a prema uočenoj ADE aktivnosti HM14c10, mi eksprimiramo antitelo kao Fab fragment ili smanjeno FcγR vezivanje uklanjanjem mesta glikozilacije na humanom IgG1 pomodu supstitucije ostatka asparagina (N) na poziciji 297 za glutamin (Q) (14). I HM14c10Fab i N297Q mutant ispoljavaju smanjenje u njihovoj homotipskoj ADE aktivnosti u odnosu na ukupne IgG1 kontrole (Sl.11C(a)). Nakon toga smo poredili uticaj sub-klase IgG na aktivnost ADE i uočili delimičnu korelaciju sa prijavljenim aktivnostima vezivanja za FcγRIIA na K562 (15). ADE aktivnost može da se rangira prema slededem: IgG3>IgG1>IgG2>IgG4 pri čemu je sa IgG3 najveda i IgG4 najmanja (Sl. 11C(b)). Prema tome, izgleda da ADE aktivnost ovog neutralizujudeg anti-DENV antitela zavisi od FcγR vezivanja iako treba primetiti da uticaj FcγR1 visokog afiniteta i komponenata komplementa na neutralizaciju virusa, nije obrađen u ovom eksprimentu (16).

[0120] Dodatna kompleksnost u DENV je prisustvo brojnih genotipova u okviru jednog serotipa. DENV 1 genotipovi mogu da variraju do 3% u njihovoj kompoziciji aminokiselina i prethodni izveštaji od mišjih anti-DENV antitela sugerišu da zaštitna aktivnost može da varira između genotipova (17). Mi poredimo aktivnost vezivanja HM14c10 za brojne DENV1 kliničke izolate koji predstavljaju dva različita DENV1 genotipa (I i IV) sa HM4G2. Oba HM14c10 i HM4G2 ipoljavaju aktivnost vezivanja za genotipe koji se testiraju, pri čemu HM4G2 ispoljava bolje karakterstike vezivanja u svim slučajevima (Sl. 15). Suprotno, HM14c10 ispoljava superiorniju aktivnost neutrallizacije u odnosu na HM4G2 za sve izolate/genotipove koji se testiraju (Sl.11D).

Primer 2: HM14c10 vezuje epitop koji zavisi od kvarternarne strukture.

[0121] Tačna priroda interakcije između datog antitela i DENV mora da nosi ključ za objašnjenje neutralizacije. Da bi se ovo odredilo, struktura Fab HM14c10):DENV1 kompleksa dobijena krioelektronskom mikroskopiom razvijenaje do rezolucije od 7 Å (Sl. 12A). U punom obimu, 120 kopija Fab HM14c10 vezuju se za sve dostupne 180 kopije E proteina na površini virusa. Da bi se identifikovao trag HM14c10 na E proteinu, kristalna struktura DENV1 E proteina (18) se uklapa u krioEM mapu gustine (Sl.16 i Tabela 1). Rezolucija od 7 Å krioEM mape pokazuje jasne povezanosti u gustinama između HM14c10 Fab-a i E protein-a, pri čemu se omogudava identifikacija ostataka E proteina na površini koja stupa u interakciju (Sl.12B i Sl.17). Epitop koji prepoznaje HM14c10 zavisi od kvateranarne strukture virusa. Dva Fab-a HM14c10 vezuju se za tri E proteina u asimetričnoj jedinici virusa (Sl. 12C i D). Svako antitelo se vezuje preko dva susedna E proteina sa polovinom epitopa na E-DIII i drugom polovinom na E-DI i EDI- E-DII zglobu susednog E proteina.

[0122] Da bi se razumela Fab interakcija sa E proteinom, napravljen je model homologije varijabilnog regiona HM14c10 (Sl. 18) na osnovu reference strukture humanog antitela (PDB kod 2GHW) upotrebom Modeller (19). Varijabilni region teškog i lakog lanca modela homologije nakon toga se uklapaju u krioEM gustine. Iako su strukture oba lanca slične, postoji poseban oblik koji daje bolju korelaciju sa gustinom (Sl.19A i B). Analiza mesta spajanja Fab-E proteina sugeriše da su svi regioni koji određuju komplementarnost (CDR) teških i lakih lanaca uključeni u interakciju (Sl. S6C).

Tabela 1: Uklapanje domena DENV 1 E proteina u HM14c10:DENV1 krioEM gustinu.

[0123] Otisci vezivanja dva HM14c10 Fab-a u asimetričnoj jedinici nisu identična (Sl. 12D), sa dvanaest aminokiselina koje su zajedničke za oba mesta spajajnja ali četiri su jedinstvena (Tabela 2). Poređenje sekvenci ostataka epitopa između različitih DENV1 izolata ukazuje na to da je vedina ostataka konzervisano (Sl. 20A), u skladu sa uočenom aktivnosti neutralizacije HM14c10. Suprotno, ovi ostaci nisu konzervisani kod drugih DENV serotipova ili virusa Zapadnog Nila (WNV) (Sl.20B).

Tabela 2. Fab HM14c10 epitop na DENV 1 E proteinima.

Primer 3: Konfokalna mikroskopija sa vremenskim prekidom otkriva mehanizam neutralizacije HM14c10.

[0124] Antitela mogu da neutralizuju infekcije virusima pomodu različitih mehanizama koji uključuju inhibiciju vezivanja virusa ili fuziju sa endozomalnim membranama, ili blokiranjem virusom indukovanih konformacionih promena na površini glikoproteina (20, 21). Da bi se razumeo mehanizam HM14c10 neutralizacije DENV1, koristi se konfokalna mikroskopija sa vremenskim prekidima da se prati infekcija delija pomodu živog, fluorescentno obeleženog DENV (22) (Sl. 13 i 21A). Kada se BHK delije inkubiraju sa DENV1 i Mab-a izotipske kontrole (koje se ne vezuju za DENV), virus se sjedinjava u višestruke, predominantno perinuklearne, intradelijske kompartmente (Sl.

14A(a)). Neutralizujude koncentracije HM4G2 indukuju obrazovanje virusnih agregata u ekstradelijskom prostoru pri čemu se oni takođe uspešno internalizuju, što potvrđuje da HM4G2 ne inhibira vezivanje/internalizaciju virusa (Sl.13A(b)). Suprotno, HM14c10 indukuje obrazovanje manjih agregata, ali efikasno blokira vezivanje, pri čemu najmanje čestice ostaju u ekstradelijskom prostoru nakon jednog sata (Sl. 13A(c)). HM4G2 odlaže nakupljane unutardelijskih virusa u poređenju sa izotipskom kontrolom (Sl.13B, gornji i srednji paneli). HM14c10:DENV1 kompleksi ne mogu da uđu u deliju ali može da se vidi njihovo odbijanje sa površine (Sl. 13B, donji panel). Kvantifikuje se stepen internalizovanog fluorescentnog DENV1 pod sva tri uslova (Fig. 13C). Ovi podaci ukazuju na to da je primarni način inhibicije DENV1 sa HM14c10 blokiranjem vezivanja virusa virusa za deliju domadina.

Primer 4: HM14c10 ispoljava veliku profilaktičku i terapeutsku aktivnost in vivo.

[0125] S obzirom da DENV nije prirodni patogen kod imunokompetentnih glodara, mogude je indukovati dozno zavisnu viremiju kod AG129 miševa koji su deficijentni za receptore Tipa I/II IFN. Ovim miševima smo subkutano dali injekciju DENV1 (model I, Sl.21B(a)) ili intraperitonealno (model II, Sl. 21B(b)) zatim se viremija kvantifikuje 3-4 dana kasnije redom (20). Dva DENV1 klinička izolata, koja predstavljaju različite genotipove (EHI-D1 genotip I u odnosu na Westpac genotip IV), se koristi da se odredi in vivo efikasnost HM14c10. U oba modela, HM14c10 sprečava bolest miševa 24-časa pre infekcije DENY1, ili kada se daje 48 h nakon infekcije (Sl.13D). Pri najnižoj koncentraciji HM14c10 uočeno je značajno smanjenje u viremiji od 0,6 µg po mišu (ili 160 pM), štp predstavlja in vivo potencijal koji se ne poklapa sa bilo kojom drugom anti-DENV terapeutskom formulacijom.

Diskusija

[0126] Nedavni izveštaji o humoralnim odgovorima koji su izazvani DENV infekcijom (23, 24) sugerišu da postoji dominacija antitela koja vedinom ukršteno reaguju sa DENV serotipom sa slabim aktivnostima neutralizacije. iako su oskudna u repertoaru huamnog seruma, E-DIII antitela su predložena kao zaštita protiv DENV infekcije (23, 24) i ovo je u skladu sa istraživanjima odgovora mišjih antitela na DENV (7). Okarakterisana humana antitela u osnovi su specifična za DI i DII virusnog E proteina. Uočeno je da se manji broj okarakterisanih antitela vezuju za ceo virus ali ne za rekombinantni E protein što ukazuje na specifičnost za epitope koji su zavisni od kvarternarne strukture (23). U ovom istraživanju, mi smo izolovali i temeljno okarakterisali potentno neutralizujude antitelo protiv DENV serotipa 1. Ovo antitelo je visoko neutalizujude za i in vitro i in vivo sisteme. S obzirom da se vezuje samo za DENV1, ne dovodi do povedane infekcije mijelomonocitnih delija sa drugim DENV serotipovima.

[0127] Rezolucija 7 Å krioEM strukture of Fab HM14c10 u kompleksu sa DENV1, pokazuje detalje vezivanja između Fab i E proteina. Ovaj nivo detalja nije uočen kod prethodnih krioEM struktura antitelo-Flavivirus kompleksa . Otisak HM14c10 se prostire kroz E-DIII i E-DI:E-DII od susednog E proteina (Sl.12D). Izveštaj o humanom antitelu CR4354 koje je specifično za WNV takođe ukazuje na to da je ovaj region ciljna meta imuniteta (25). Iako je krioEM struktura WNV u kompleksu sa Fab CR4354 razvijena do niže rezolucije (14 Å resolution) (Sl. 22A), uklapanje Fab CR4354 kristalne strukture dovodi do pseudo-atomske rezolucije strukture. Ovo mogudava identifikaciju ostataka koji stupaju u interakciju. Poređenje CR4354 epitopa na WNV i HM14c10 epitopa na DENV1 (Sl. 22B) pokazuje da CR4354 ima vedi deo otisaka na E-DIII pri čemu HM14c10 ima najviše ostataka koji interaguju na E-DI. Poređenja sekvenci epitopa pokazuju da se približno samo 20% CR4354 preklapa sa HM14c10 epitopima, i da ostaci koji se preklapaju uglavnom nisu konzervisani (Sl.22C).

[0128] Iako epitopi CR4354 i HM14c10 nisu identični, vezivanje ovih antitela treba da drži susedne E proteine zajedno čime se zaključava struktura virusa i sprečavaju se konformacione promene koje su ključne za uspešnu infekciju tj., vezivanje virusa za receptore domadina i fuzija sa delijom domadina putem endocitoze. Konfokalna mikroskopija sa snimanjem uživo uz vremenske prekide pokazuje da HM14c10 inhibira vezivanje DENV za delije domadina. Suprotno, za CR4354 je pokazano da preferncijalno inhibira WNV fuziju što ukazuje na to da ciljanje ovog regiona antitelima dovodi do više od jednog mehanizma inhibicije.

[0129] Predloženo je da površinski proteini DENV prolaze kroz konstantne promene u fiziološkom stanju – sa nazivom "disanje" (21). Mogude je da disanje može da igra ulogu u olakšanju vezivanja virusa za delije. S obzirom da HM14c10 ukršteno povezuje površinske E proteine, onda može da inhibira vezivanje sprečavanjem disanja površinskih proteina. Alternativno, pokazano je da je E-DIII važa za vezivanje za deliju domadina, prema tome vezivanje HM14c10 za EDIII može sterno da ometa ovaj proces. HMAb CR4354, iako se vezuje za sličan region kao HM14c10, ne inhibira vezivanje WNV. Ovo ukazuje na to da WNV koji uzrokuje encefalitis i DENV koji uzrokuje febrilno oboljenje ne dele identične determinante receptora za vezivanje.

[0130] Pokazano je da HMAb CR4354 sprečava fuziju virusa sa endozomalnom membranom na niskoj pH vrednosti (25). S obzirom na to da se HM14c10 takođe vezuje kroz susedne E proteine, ne može da se isključi mogudnost da HM14c10 može da inhibira uređenje dimernih E do trimernih struktura u toku fuzije. Potencijal inhibiranja vezivanja oba receptora i fuzije može da objasni izuzetnu in vivo efikasnost HM14c10.

[0131] Vedina E-proteina flavivirusa imaju sličnu kvaternarnu strukturu na osnovu visokog stepena sličnosti između krioEM struktura WNV (26) i DENV (27). Prema tome, svi površinski E proteini flavivirusa mogu da imaju slične strukturne rearanžmane tokom njihovog ciklusa infekcije. Antitela koja ciljaju slični region kao HM14c10 ili CR4354 kod drugih flavivirusa mogu prema tome da budu zaštitna. S obzirom da su HM14c10 i CR4354 antitela jedina dva antitela koja su okarakterisana da imaju ovu aktivnost vezivanja i da su oba poreklom iz humanih izvora, ukazuje na to da je ovaj tip epitopa verovatno determinanta za opšti imunitet u odnosu na Flavivirus. Ovo ima važne implikacije za dizajn i procenu bududih vakcina.

[0132] Konačno, s obzirom da HM14c10 ima jake profile neutralizacije protiv vedine klinčkih DENV1 izolata i izvrsnu in vivo efikasnost, ovo antitelo predstavlja dobar terapeutski kandidat za lečenje pacijenata inficiranih sa DENV1.

REFERENCE

[0133]

1. S. B. Halstead, E. J. O’Rourke, Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by nonneutralizing antibody. J Exp Med 146, 201-217 (1977).

2. A. B. Sabin, Research on dengue during World War II. Am J Top Med Hyg 1, 30-50 (1952).

3. R. J. Kuhn, W. Zhang, M. G. Rossmann, S. V. Pletnev, J. Corver, E. Lenches, C. T. Jones, S. Mukhopadhyay,

P. R. Chipman, E. G. Strauss, T. S. Baker, J. H. Strauss, Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell 108, 717-725 (2002).

4. F. A. Rey, F. X. Heinz, C. Mandl, C. Kunz, S. C. Harrison, The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature 375, 291-298 (1995).

5. Y. Zhang, W. Zhang, S. Ogata, D. Clements, J. H. Strauss, T. S. Baker, R. J. Kuhn, M. G. Rossmann, Conformational changes of the flavivirus E glycoprotein. Structure 12, 1607-1618 (2004).

6. G. D. Gromowski, A. D. Barrett, Characterization of an antigenic site that contains a dominant, type-specific neutralization determinant on the envelope protein domain III (ED3) of dengue 2 virus. Virology 366, 349-360 (2007).

7. S. Sukupolvi-Petty, S. K. Austin, W. E. Purtha, T. Oliphant, G. E. Nybakken, J. J. Schlesinger, J. T. Roehrig, G. D. Gromowski, A. D. Barrett, D. H. Fremont, M. S. Diamond, Type- and subcomplex-specific neutralizing antibodies against domain III of dengue virus type 2 envelope protein recognize adjacent epitopes. J Virol 81, 12816-12826

(2007).

8. C. M. Midgley, M. Bajwa-Joseph, S. Vasanawathana, W. Limpitikul, B. Wills, A. Flanagan, E. Waiyaiya, H. B. Tran, A. E. Cowper, P. Chotiyarnwon, J. M. Grimes, S. Yoksan, P. Malasit, C. P. Simmons, J. Mongkolsapaya, G. R. Screaton, An in-depth analysis of original antigenic sin in dengue virus infection. J Virol 85, 410-421.

9. W. M. Wahala, A. A. Kraus, L. B. Haymore, M. A. Accavitti-Loper, A. M. de Silva, Dengue virus neutralization by human immune sera: role of envelope protein domain III-reactive antibody. Virology 392, 103-113 (2009).

10. E. Traggiai, S. Becker, K. Subbarao, L. Kolesnikova, Y. Uematsu, M. R. Gismondo, B. R. Murphy, R. Rappuoli, A. Lanzavecchia, An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med 10, 871-875 (2004).

11. S. B. Halstead, Neutralization and antibody-dependent enhancement of dengue viruses. Adv Virus Res 60, 421-467 (2003).

12. R. Littaua, I. Kurane, F. A. Ennis, Human IgG Fc receptor II mediates antibodydependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol 144, 3183-3186 (1990).

13. J. T. Roehrig, R. A. Bolin, R. G. Kelly, Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica. Virology 246, 317-328 (1998).

14. J. Lund, G. Winter, P. T. Jones, J. D. Pound, T. Tanaka, M. R. Walker, P. J. Artymiuk, Y. Arata, D. R. Burton, R. Jefferis, et al., Human Fc gamma RI and Fc gamma RII interact with distinct but overlapping sites on human IgG. J Immunol 147, 2657-2662 (1991).

15. M. S. Chiofalo, G. Teti, J. M. Goust, R. Trifiletti, M. F. La Via, Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol 114, 272-281 (1988).

16. E. Mehlhop, C. Ansarah-Sobrinho, S. Johnson, M. Engle, D. H. Fremont, T. C. Pierson, M. S. Diamond, Complement protein C1q inhibits antibody-dependent enhancement of flavivirus infection in an IgG subclass-specific manner. Cell Host Microbe 2, 417-426 (2007).

17. J. D. Brien, S. K. Austin, S. Sukupolvi-Petty, K. M. O’Brien, S. Johnson, D. H. Fremont, M. S. Diamond, Genotypespecific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. J Virol 84, 10630-10643.

18. V. Nayak, M. Dessau, K. Kucera, K. Anthony, M. Ledizet, Y. Modis, Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J Virol 83, 4338-4344 (2009).

19. N. Eswar, B. Webb, M. A. Marti-Renom, M. S. Madhusudhan, D. Eramian, M. Y. Shen, U. Pieper, A. Sali, Comparative protein structure modeling using Modeller. Curr Protoc Bioinformatics Chapter 5, Unit 56 (2006).

20. R. Rajamanonmani, C. Nkenfou, P. Clancy, Y. H. Yau, S. G. Shochat, S. Sukupolvi-Petty, W. Schul, M. S. Diamond, S. G. Vasudevan, J. Lescar, On a mouse monoclonal antibody that neutralizes all four dengue virus serotypes. J Gen Virol 90, 799-809 (2009).

21. S. M. Lok, V. Kostyuchenko, G. E. Nybakken, H. A. Holdaway, A. J. Battisti, S. Sukupolvi-Petty, D. Sedlak, D. H. Fremont, P. R. Chipman, J. T. Roehrig, M. S. Diamond, R. J. Kuhn, M. G. Rossmann, Binding of a neutralizing antibody to dengue virus alters the arrangement of surface glycoproteins. Nat Struct Mol Biol 15, 312-317 (2008).

22. S. L. Zhang, H. C. Tan, B. J. Hanson, E. E. Ooi, A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods 167, 172-177 (2010).

23. R. de Alwis, M. Beltramello, W. B. Messer, S. Sukupolvi-Petty, W. M. Wahala, A. Kraus, N. P. Olivarez, Q. Pham, J. Brian, W. Y. Tsai, W. K. Wang, S. Halstead, S. Kliks, M. S. Diamond, R. Baric, A. Lanzavecchia, F. Sallusto, A. M. de Silva, In-depth analysis of the antibody response of individuals exposed to primary dengue virus infection. PLoS Negl Trop Dis 5, e1188.

24. M. Beltramello, K. L. Williams, C. P. Simmons, A. Macagno, L. Simonelli, N. T. Quyen, S. Sukupolvi-Petty, E. Navarro-Sanchez, P. R. Young, A. M. de Silva, F. A. Rey, L. Varani, S. S. Whitehead, M. S. Diamond, E. Harris, A. Lanzavecchia, F. Sallusto, The human immune response to Dengue virus is dominated by highly cross-reactive antibodies endowed with neutralizing and enhancing activity. Cell Host Microbe 8, 271-283.

25. B. Kaufmann, M. R. Vogt, J. Goudsmit, H. A. Holdaway, A. A. Aksyuk, P. R. Chipman, R. J. Kuhn, M. S. Diamond, M. G. Rossmann, Neutralization of West Nile virus by crosslinking of its surface proteins with Fab fragments of the human monoclonal antibody CR4354. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18950-18955.

26. S. Mukhopadhyay, B. S. Kim, P. R. Chipman, M. G. Rossmann, R. J. Kuhn, Structure of West Nile virus. Science 302, 248 (2003).

27. W. Zhang, P. R. Chipman, J. Corver, P. R. Johnson, Y. Zhang, S. Mukhopadhyay, T. S. Baker, J. H. Strauss, M. G. Rossmann, R. J. Kuhn, Visualization of membrane protein domains by cryo-electron microscopy of dengue virus. Nat Struct Biol 10, 907-912 (2003).

28. C. Y. Huang, S. Butrapet, D. J. Pierro, G. J. Chang, A. R. Hunt, N. Bhamarapravati, D. J. Gubler, R. M. Kinney, Chimeric dengue type 2 (vaccine strain PDK-53)/dengue type 1 virus as a potential candidate dengue type 1 virus vaccine. J Virol 74, 3020-3028 (2000).

29. J. G. Low, E. E. Ooi, T. Tolfvenstam, Y. S. Leo, M. L. Hibberd, L. C. Ng, Y. L. Lai, G. S. Yap, C. S. Li, S. G. Vasudevan, A. Ong, Early Dengue infection and outcome study (EDEN) -study design and preliminary findings. Ann Acad Med Singapore 35, 783-789 (2006). 30. B. J. Hanson, A. C. Boon, A. P. Lim, A. Webb, E. E. Ooi, R. J. Webby, Passive immunoprophylaxis and therapy with humanized monoclonal antibody specific for influenza A H5 hemagglutinin in mice. Respir Res 7, 126 (2006).

31. M. F. van den Broek, U. Muller, S. Huang, M. Aguet, R. M. Zinkernagel, Antiviral defense in mice lacking both alpha/beta and gamma interferon receptors. J Virol 69, 4792-4796 (1995).

32. G. K. Tan, J. K. Ng, S. L. Trasti, W. Schul, G. Yip, S. Alonso, A non mouse-adapted dengue virus strain as a new model of severe dengue infection in AG129 mice. PLoS Negl Trop Dis 4, e672 (2010).

33. S. J. Ludtke, P. R. Baldwin, W. Chiu, EMAN: semiautomated software for highresolution single-particle reconstructions. J Struct Biol 128, 82-97 (1999).

34. X. Liu, W. Jiang, J. Jakana, W. Chiu, Averaging tens to hundreds of icosahedral particle images to resolve protein secondary structure elements using a Multi-Path Simulated Annealing optimization algorithm. J Struct Biol 160, 11-27 (2007).

35. E. F. Pettersen, T. D. Goddard, C. C. Huang, G. S. Couch, D. M. Greenblatt, E. C. Meng, T. E. Ferrin, UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem 25, 1605-1612 (2004).

36. Kohler and Milstein. Continuous culture of fused cells secreting antibody of redefined specificity. Nature, 1975.256, pp495-497,

37. Rosen, A.; Gergely, P.; Jondal, M.; Klein, G. and Britton, S. Polyclonal Ig production after Epstein-Barr virus infection of human lymphocytes in vitro. Nature, 1977. 267, p.

52-54, Steinitz, M.; Klein, G.; Koskimies, S. and Makel, O. EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature, 1977.269, p.420-422,

38. Gubler, D.J., Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and economic problem in the 21st century. Trends Microbiol, 2002.10(2): p.100-3. 39. Mackenzie, J.S., D.J. Gubler, and L.R. Petersen, Emerging flaviviruses: the spread and resurgence of Japanese encephalitis, West Nile and dengue viruses. Nat Med, 2004.

10(12 Suppl): p. S98-109 Gubler, D.J., Cities spawn epidemic dengue viruses. Nat Med, 2004. 10(2): p. 129-30. > Pinheiro, F.P. and S.J. Corber, Global situation of dengue and dengue haemorrhagic fever, and its emergence in the Americas. World Health Stat Q, 1997.50(3-4): p.161-9.

41. Ooi, E.E., K.T. Goh, and D.J. Gubler, Dengue prevention and 35 years of vector control in Singapore. Emerg Infect Dis, 2006.12(6): p.887-93.

42. Edelman, R., Dengue vaccines approach the finish line. Clin Infect Dis, 2007.45 Suppl 1: p. S56-60.

43. Zhang W, Chipman PR, Corver J, Johnson PR, Zhang Y, Mukhopadhyay S, Baker TS, Strauss JH, Rossmann MG, Kuhn RJ. Visualization of membrane protein domains by cryoelectron microscopy of dengue virus. Nat Struct Biol, 2003.10(11): p.907-912.

[0134] Iako su specifični aspekti ovog pronalaska opisani i ilustrovani, takve aspekte treba razmatrati samo kao ilustraciju pronalaska i ne kao ograničenje pronalaska kao što se tumači u skladu sa priloženim zahtevima.

[0135] Iako je gornji pronalazak opisan u nekim detaljima pomodu ilustracije i primera u cilju jasnode razumevanja, stručnjaku u oblasti tehnike je jasno da u svetlu učenja ovog pronalaska određene promene i modifikacije mogu da se naprave bez odstupanja od obima priloženih zahteva.

Claims (24)

1. Patentni zahtevi 1. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji se specifično veže za protein (E) omotača Denga virusa serotipa 1 ili njegov fragment, što je antitelo humano antitelo sa neutralizujudom aktivnošdu koje se vezuje preko dva proteina E u virusu, pri čemu vezivanje preko dva proteina E obuhvata vezivanje za DI i zglob između DI i II na jednom proteinu E i DIII na susednom proteinu E.
2. 2. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, što se antitelo ili njegov fragment bira iz grupe koja se sastoji od: (a) celog molekula imunoglobulina; (b) scFv; (c) Fab fragmenta; (d) F(ab’)2; i (e) disulfidom povezan Fv.
3. 3. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrže: teški lanac konstantnog domena imunoglobilina koji se bira iz grupe koju čine: (a) konstantni domen humanog IgM; (b) konstantni domen humanog IgG1; (c) konstantni domen humanog IgG2; (d) konstantni domen humanog IgG3; (e) konstantni domen humanog IgG4; i (f) konstantni domen humanog IgA1/2;
4. 4. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrže: teški lanac koji se sastoji iz najmanje jednog CDR koji se bira iz grupe CDR-a sa sekvencama aminokiselina SYGMH, VIWYDGSKTYYGDSVKG ili GIAGGWAFW.
5. 5. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrže: teški lanac koji sadrži tri CDR-a sa sekvencama aminokiselina SYGMH, VIWYDGSKTYYGDSVKG i GIAGGWAFW.
6. 6. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrže: teški lanac sa sekvencom aminokiselina
7. 7. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrže: okvir teškog lanca IGHV1-2*02 i najmanje jedan CDR sa sekvencom aminokiselina SYGMH, VIWYDGSKTYYGDSVKG ili GIAGGWAFW.
8. 8. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrže: laki lanac konstantnog domena imunoglobulina koji se bira iz grupe koju čine: (a) humani Ig kapa konstantni domen; i (b) humani Ig lambda konstantni domena.
9. 9. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrže: laki lanac koji sadrži najmanje jedan CDR koji se bira iz grupe CDR-a sa sekvencama aminokiselina RASQNVYSYLG, GVTSRAT ili QQYAG.
10. 10. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrže: laki lanac koji sadrži tri CDR-a sa sekvencama aminokiselina RASQNVYSYLG, GVTSRAT i QQYAG.
11. 11. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrže: laki lanac sa sekvencom aminokiselina ;
12. 12. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1 ili 2, što antitelo ili njegov fragment sadrži: okvir lakog lanca IGKV3-20*01 i najmanje jedan od CDR-a sa sekvencama amino kiselina RASQNVYSYLG, GVTSRAT ili QQYAG.
13. 13. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kojim zahtevima 1-12, što antitelo: koje se vezuje za Denga virus sa specifičnošdu vezivanja antitela sa sekvencom aminokiselina teškog lanca EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKG LEWVAVIWYDGSKTYYGDSVKGRFTISKDNSKKMVNLQMDSLGV EDTAFYYCARGIAGGWAFWGIDLWGQGTLVTVSS i sekvencom aminokiselina lakog lanca ili
14. 14. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-12, što antitelo: je antitelo sa sekvencom aminokiselina teškog lanca EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKTYYGDSVKGRF TISKDNSKKMVNLQMDSLGV EDTAFYYCARGIAGGWAFWGIDLWGQGTLVTVSS i sekvencom aminokiselina lakog lanca
15. 15. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-14, što se antitelo ili njegov fragment vezuju za antigen sa konstantom afiniteta (KD) koja je manja od 1 x 10<-8>M, i opciono vezuju za antigen sa konstantom afiniteta (KD) koja je manja od 1 x 10<-9>M.
16. 16. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-15, što je antitelo poreklom od B delija pacijenta koji se oporavio od infekcije Denga virusom.
17. 17. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-16 i farmaceutski prihvatljiv nosač koji je efikasan za smanjenje ili prevenciju infekcije Denga virusom kod subjekta.
18. 18. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 17, koja dalje sadrži drugi agens.
19. 19. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-16 za upotrebu u postupku pasivne imunizacije protiv infekcije Denga virusom koji obuhvata davanje subjektu efikasne količine antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kojom od zahteva 1-16.
20. 20. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-16 za upotrebu u postupku lečenja infekcije Denga virusom koji obuhvata davanje subjektu kome je potrebno količine antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kom od zahteva 1-16 koja je efikasna da se smanji ili spreči bolest.
21. 21. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 20, pri čemu: se antitelo daje intravenozno (IV), subkutano (SC), intramuskularno (IM), transdermalno, ili oralno; ili se antitelo daje u količini koja je u opsegu od 1 do 100 miligrama po kilogramu mase tela subjekta; ili pomeuta upotreba dalje obuhvata davanje drugog agensa, opciono kada je drugi agens antivirusni lek ili analgetički lek.
22. 22. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-16.
23. 23. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 22.
24. 24. Delija domadina koja obuhvata ekspresioni vektor 23, opciono kada je delija domadina bakterijska delija, eukariotska delija, ili delija sisara.