RS56755B1

RS56755B1 - Anti-miostatin antitela

Info

Publication number: RS56755B1
Application number: RS20180031A
Authority: RS
Inventors: Julian Davies; Bryan Edward Jones; Andrew Ihor Korytko; Pamela Jean Mitchell; Rosamund Carol Smith; Linda O O'bryan; Rong Wang
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2018-04-30
Also published as: NO20082167L; EA200801065A1; BRPI0617345A2; US20100080811A1; AU2006303921B2; US20090131638A1; DK1951755T3; UA92504C2; EP2816058A1; PT2816058T; JP2009511579A; CA2624935C; EA015903B1; CN101282992A; HK1118564A1; CN101282992B; PL1951755T3; JP5031756B2; ES2533462T3; EP2816058B1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak je iz oblasti medicine, naročito iz oblasti monoklonalnih antitela na miostatin. Pronalazak se specifičnije odnosi na himerna ili humanizovana anti-miostatin antitela visokog afiniteta i upotrebu antitela za terapiju, profilaksu ili dijagnozu različitih poremećaja ili stanja kod vrsta sisara i ptica.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Članovi superfamilije proteina transformišućeg faktora rasta beta (TGF-β) uključeni su u embrionalno razviće i homeostazu adultnih tkiva. Članovi TGF-β superfamilije dele zajedničku strukturu uključujući peptidnu signalnu sekvencu neophodnu za izlučivanje proteina i amino-terminalni fragment koji se proteolitički iseca oko 105-140 aminokiselina od karboksi-terminusa velikog prekursorskog proteina da bi se stvorio zreli protein. Zreli protein se karakteriše visoko konzervativnim cisteinskim ostacima, dok je aktivni oblik zrelog proteina disulfidom vezani homodimer proteolitički isečenog proproteina (Gray, A., and Maston, A., Science, 247:1328, 1990).

[0003] Miostatin, takođe označen i kao faktor rasta i diferencijacije-8 (GDF-8) član je TGF-β superfamilije proteina. Miostatin ima strukturne sličnosti sa drugim članovima TGF-β familije. Sadrži hidrofobni aminoterminus koji se ponaša kao sekretorni signal i konzervativni RSRR domen koji je važan za proteolitičku obradu. Isecanje proteina daje aminoterminalni protein povezan sa latencijom i karboksi-terminalni zreli signalni peptid koji stvara biološki aktivni homodimer. Miostatin je većinom eksprimiran u skeletnom mišiću u razvoju i kod adulta i funkcioniše kao negativni regulator skeletnog mišića. Sistemska prekomerna ekspresija miostatina kod adultnih miševa vodi ka gubljenju mišića (Zimmers, et al., Science, 296:1486-1488, 2002) dok se nasuprot tome, miostatin „knock-out“ miševi karakterišu hipertrofijom i hiperplazijom skeletnog mišića što rezultuje u dvostruko do trostruko većoj mišićnoj masi od miševa divljeg tipa iz istog okota i smanjenju akumulacije masti (McPherron, et al. Nature, 387:83-90, 1997). Objavljeno je da čovek sa miostatin „knock-out“ mutacijom ima izrazitu hipertrofiju mišića (Scheulke, et al., New Eng. J. Med. 350:2682, 2004).

[0004] Trenutno je dostupan ograničen broj tretmana za gubitak mišića ili za poremećaje i stanja za koja bi bilo korisno povećanje mišićne mase i/ili mišićne snage uključujući, na primer, mišićnu distrofiju, slabost, atrofiju usled prestanka upotrebe, kaheksiju, kao i poremećaje koji su povezani sa gubitkom mišića, na primer, bubrežna bolest, srčana insuficijencija ili bolest, i bolest jetre. Usled uloge koju ima kao negativni regulator rasta skeletnih mišića, miostatin je poželjna ciljna struktura za terapijsku ili profilaktičku intervenciju za takve bolesti ili stanja i za praćenje napredovanja takvih poremećaja ili stanja. Osim direktne uloge u regulaciji skeletnih mišića, miostatin takođe može biti uključen u druge fiziološke procese uključujući diferencijaciju preadipocita u adipocite (Kim et al. BBRC, 281:902-906, 2001), i, indirektno u homeostazu glukoze (McPherron, A and Lee S-J. JCI 109:595, 2002) i inhibiciju formiranja kostiju (Hamrick, M. Mol. Cell Evol. Biol.272 388-91, 2003; Hamrick et al. Calcif Tissue Int. 71:63, 2002). Stoga, miostatin-specifični antagonisti, npr., miostatin-specifična antitela, mogu se takođe pokazati korisnim za lečenje, prevenciju ili praćenje poremećaja ili stanja kao što su ona koja imaju koristi od povećanja gustine kostiju (npr., osteoporoza), dijabetes tipa II, metabolički sindrom, gojaznost i osteoartritis.

[0005] Miostatin je visko konzervativan između vrsta; aminokiselinska sekvenca zrelog oblika miostatina kod čoveka, miša, pacova, kokoške, ćurke i krave je 100% identična (Videti Sl. 2 i 3). Postoje mutacije miostatina koje se javljaju prirodno kod stoke, koje su povezane sa fenotipom udvostručene mišićne mase (McPherron, et al. PNAS, 94:12457-61, 1997). Kako je sekvenca i funkcija miostatina visoko konzervativna između vrsta, ne samo da anti-miostatin antitelo obezbeđuje obećavajuća sredstva za povećanje mišićne mase, ili lečenje ili prevenciju prethodno navedenih takvih poremećaja ili stanja kod ljudi, već takođe i kod drugih sisara uključujući, npr., domaće životinje (npr., pse i mačke), životinje za sport (npr., konje), životinje koje su izvor hrane (npr., goveda, svinje i ovce) i kod vrsta ptica (npr., kokoške, ćurke, patke i druge lovne ptice i živina).

[0006] Faktor rasta i diferencijacije-11, koji se takođe označava i kao GDF-11 ili BMP-11, član je TGF-β superfamilije proteina koji je najviše homolog miostatinu. Aminokiselinske sekvence zrelih oblika humanog miostatina i GDF-11 su oko 90% identične; međutim, GDF-11 je eksprimiran u širem opsegu tkiva nego GDF-8 uključujući zubnu pulpu, mozak, srce, bubreg i pluća kao i mišićno i masno tkivo (Nakashima, et al. Mech. of Development 80:185, 1999). GDF-11 „knock-out“ miševi umiru u roku od 24 časa od rođenja sa višestrukim anomalijama. Naročito, miševi imaju dodatne parove rebara, nemaju bubrege i pokazuju defekte u želucu, slezini i pankreasu (McPherron et al., Nature Genetics 22:260, 1999; Esquela and Lee, Dev. Biol.257:356, 2003; Harmon et al., Devpt.131:6163, 2004). Nedavno je nađeno da humani GDF-11 upravlja vremenskim okvirima tokom kojih multipotentni progenitori zadržavaju kompetenciju za stvaranje jasno uočljive nervne progenije (Kim, J. et al. Science 308:1927-1930, 2005).

[0007] WO 2004/037861 opisuje antitela protiv faktora rasta i diferencijacije 8 (GDF-8) i njihovu upotrebu u lečenju ili prevenciji degenerativnih poremećaja mišića, kosti ili poremećaja metabolizma insulina.

[0008] Postoji terapijska potreba za anti-miostatin antitelom koje preferencijalno vezuje miostatin u odnosu na druge proteine TGF β superfamilije, naročito GDF-11. Dodatno, postoji potreba za miostatin-specifičnim antitelima koja vezuju miostatin sa visokim afinitetom, naročito sa višim afinitetom (tj. snažnijim afinitetom kao što je pokazano na primer sa nižom KD vrednošću), nego što je onaj sa kojim vezuju GDF-11, i stoga dozvoljavaju da se minimizuje dozni nivo koji pacijenti primaju što može na taj način rezultovati u ređem doziranju sa takvim antitelom nego sa antitelom koje vezuje miostatin sa manjim afinitetom (tj., viša KD). Antitelo visokog afiniteta takođe je poželjno tako da može dozvoliti veću fleksibilnost puta primene antitela na pacijeta jer je manje poželjno da se lek primenjuje na primer intravenski nego potkožno. Takođe postoji potreba za miostatinspecifičnim antitelima sa niskom ili na drugi način poželjnom IC50vrednošću u testu bioaktivnosti miostatina da bi se stvorilo terapeutsko anti-miostatin antitelo sa minimumom efikasne doze. Takođe je poželjno da se obezbede antitela specifična za miostatin gde je bilo koji imuni odgovor na antitelo izazavan kod pacijenta koji prima antitelo smanjen na minimum. Ovaj pronalazak zadovoljava ove potrebe i obezbeđuje povezane prednosti.

[0009] Antitela prema pronalasku su miostatin antitela koja sadrže polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 123 i polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 98. Anti-miostatin monoklonalno antitelo pronalaska može dodatnosadržati konstantni region teškog lanca izabran iz grupe koju čini humani (ili značajno humanog porekla) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM i IgD, poželjno IgG1ili IgG4. Anti-miostatin monoklonalno antitelo pronalaska može dalje sadržati konstantni region humanog kapa ili lambda lakog lanca. Kada antitelo treba da se koristi kao terapija ili preventiva kod čoveka, konstantni region je poželjno u značajnom stepenu ili u potpunosti humanog porekla. Kada antitelo treba da se koristi kao terapija ili preventiva kod ne-humane životinje, ili jaja nehumane životinje, konstantni region poželjno u značajnom stepenu potiče od životinje kod koje se antitelo koristi kao terapeutik. (videti, npr., Clarkson, C. et al., Mol. Imm. 30:1195-1204, 1993; U.S. broj prijave 2002/01651350; i Genbank pristupni brojevi X69797, U03778, X16701, X07174, AB016711).

[0010] Različiti oblici antitela su ovde predviđeni. Na primer, anti-miostatin monoklonalno antitelo pronalaska može sadržati ili se može sastojati od intaktnog antitela (tj., pune dužine, sa intaktnim Fc regionom), u značajnom stepenu intaktnog antitela, njegovog antigenvezujućeg dela (npr., a Fab, Fab’, F(ab’)2) ili jednolančanog Fv fragmenta. Podrazumeva se da su svi takvi oblici antitela obuhvaćeni ovde i u celom tekstu unutar termina "antitelo." Dodatno, antitelo pronalaska može se obeležiti sa detektabilnim obeleživačem, imobilizovano na čvrstoj fazi i/ili konjugovano sa heterolognim jedinjenjem, npr., enzimom ili molekulom polietilen glikola. Dodatno, predviđeno je da antitela pronalaska budu monoklonalnog porekla iako se mogu razlikovati u obrascu glikozilacije.

[0011] U drugom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-miostatin monoklonalno antitelo pronalaska. Farmaceutska kompozicija pronalaska može dalje sadržati farmaceutski prihvatljivi nosač. U pomenutoj farmaceutskoj kompoziciji, anti-miostatin monoklonalno antitelo pronalaska je aktivni sastojak. Poželjno farmaceutska kompozicija sadrži homogenu ili u značajnom stepenu homogenu populaciju anti-miostatin monoklonalnog antitela pronalaska. Kompozicija za terapijsku upotrebu je sterilna i može biti liofilizovana, izborno opremljena sa odgovarajućim razblaživačem.

[0012] Pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju najmanje jedne biološke aktivnosti miostatina kod životinje, poželjno vrste sisara ili ptica, poželjno čoveka, kome je to potrebno, koji obuhvata primenu terapijski efikasne količine, ili profilaktički efikasne količine, ili miostatin-neutrališuće ili miostatin-inhibirajuće količine anti-miostatin monoklonalnog antitela pronalaska na pomenutu vrstu sisara ili ptice. Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za povećanje mišićne mase ili tretiranje ili prevenciju bolesti ili poremećaja ili stanja koje je olakšano neutralizacijom ili antagonizovanjem bioaktivnosti miostatina koje obuhvata primenu na pacijenta (npr., čoveka) kome je potreban takav tretman ili prevencija terapijski ili profilaktički efikasne količine monoklonalnog antitela pronalaska.

[0013] Pronalazak obuhvata anti-miostatin monoklonalno antitelo pronalaska za upotrebu u proizvodnji medikamenta za primenu na sisara, poželjno čoveka, za tretman npr., slabosti, kaheksije, sarkopenije povezane sa starošću, gubitka ili slabljenja mišića, miopatije, mišićne distrofije, osteoporoze, gojaznosti, COPD, insuficijencije ili bolesti bubrega, insuficijencije ili bolesti jetre, insuficijencije ili bolesti srca, metaboličkog sindroma i dijabetesa tipa II kod sisara, poželjno čoveka, kome je to potrebno, primenom na pomenutog sisara terapeutski efikasne količine ili profilaktički efikasne količine anti-miostatin monoklonalnog antitela pronalaska.

[0014] Pronalazak obuhvata proizvodni artikal koji sadrži materijal za pakovanje i antitelo pronalaska sadržano unutar pomenutog materijala za pakovanje i gde materijal za pakovanje sadrži umetak paketa koji ukazuje da antitelo neutrališe aktivnost miostatina ili smanjuje nivo miostatina prisutnog u sistemu.

[0015] Pronalazak dalje obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo pronalaska; vektor (ili vektore) koji sadrže tu nukleinsku kiselinu, izborno operativno vezanu za kontrolne sekvence koje prepoznaje ćelija domaćin transformisana sa vektorom; ćeliju domaćina koja sadrži taj vektor; postupak za proizvodnju antitela pronalaska koji sadrži kultivaciju ćelije domaćina tako da je nukleinska kiselina eksprimirana i, izborno, rekuperovanje antitela iz medijuma kulture ćelije domaćina.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0016] SL. 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog promiostatina sa podvučenom signalnom sekvencom i deo proteina na karboksi terminusu koji čini monomer zrelog oblika miostatina dat u boldu.

SL. 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu monomernog humanog zrelog miostatina. Aktivni humani miostatin je homodimer ovog polipeptida povezan disulfidnim vezama. Ova sekvenca je identična onoj kod zrelog miostatina kod miša, pacova, kokoške, ćurke, psa, konja, i svinje. SL. 3 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence zrelog miostatina različitih vrsta sisara i ptica.

SL. 4 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence zrelog oblika humanog miostatina i humanog GDF-11.

SL. 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu HCVR i LCVR YN41 antitela, primera ishodnog antitela od antitela pronalaska. Slika dalje prikazuje primer nukleotidne sekvence koja kodira HCVR i LCVR YN41 antitela.

SL. 6 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRs LCVR različitih antitela.

SL. 7 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRs HCVR različitih antitela.

SL. 8 prikazuje aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona kapa lakog lanca koji može biti operativno povezan za LCVR antitela pronalaska pri stvaranju lakog lanca antitela pronalaska pune dužine i aminokiselinsku sekvencu IgG4domena konstantnog regiona koji može biti operativno vezan sa HCVR antitela pronalaska pri stvaranju teškog lanca antitela pronalaska pune dužine. Slika dalje prikazuje primer nukleotidne sekvence koja kodira konstantni region kapa lakog lanca i primer nukleotidne sekvence koja kodira domen teškog lanca IgG4.

SL. 9 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence LCVRs različitih antitela prema pronalasku. CDR domeni su podvučeni u sekvenci prvog antitela.

SL. 10 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence HCVRs različitih antitela prema pronalasku. CDR domeni su podvučeni kod sekvence prvog antitela.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Definicije

[0017] Kada je ovde korišćen, termin "zreli miostatin" (videti SEQ ID NO: 2 - čovek, miš, pacov, kokoška, ćurka, pas, konj i svinja) odnosi se na monomerni ili homodimerni oblik proteina koji nastaje nakon proteolitičkog isecanja na Arg 266 proproteinskog oblika miostatina od 375 aminokiselina. Kada je ovde korišćen, termin "miostatin" odnosi se na zreli miostatin. Kada je ovde korišćen, termin "promiostatin" ili "proproteinski oblik miostatina" kada je korišćen u odnosu na humani protein odnosi se na protein koji sadrži sekvencu prikazanu sa SEQ ID NO: 1 bilo kao monomer ili homodimer.

[0018] Antitelo pune dužine kao što postoji u prirodi je molekul imunoglobulina koji se sastoji od četiri peptidna lanca, dva teška (H) lanca (oko 50-70 kDa kada su pune dužine) i dva laka (L) lanca (oko 25 kDa kada su pune dužine) međusobno povezana disulfidnim vezama. Amino terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100-110 ili više aminokiselina primarno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region primarno odgovoran za efektorsku funkciju.

[0019] Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda i karakterišu se naročitim konstantnim regionom kao što je poznato u tehnici. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE, respektivno i nekoliko njih može dalje biti podeljeno u potklase (izotipove) npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Svaki tip teškog lanca karakteriše se naročitim konstantnim regionom poznatim u tehnici. Struktura podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa antitela dobro su poznati u tehnici. Svaki težak lanac se sastoji od N-terminalnog varijabilnog regiona teškog lanca (ovde "HCVR") i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri regiona (CH1, CH2, i CH3) za IgG, IgD, i IgA; i 4 domena (CH1, CH2, CH3, i CH4) za IgM i IgE. Svaki laki lanac je sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde "LCVR") i konstantni region lakog lanca, CL. HCVR i LCVR regioni mogu biti dalje podeljeni u regione hipervarijabilnosti, označeni kao regioni koji određuju komplementarnost (CDRs), pomešani sa regionima koji su konzervativniji, označeni kao okvirni regioni (FR). Svaki HCVR i LCVR se sastoji od tri CDRs i četiri FRs, raspoređena od amino-terminusa do karboksi-terminusa po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ovde su 3 CDRs teškog lanca označeni kao "CDRH1, CDRH2, i CDRH3" i 3 CDRs lakog lanca su označeni kao "CDRL1, CDRL2 i CDRL3." CDRs sadrže najveći deo ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. CDR3 je tipično najveći izvor molekularnog diverziteta unutar vezujućeg mesta antitela. Dodela aminokiselina svakom domenu je u skladu sa dobro poznatim konvencijama [npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ili sa Chothia šemom numerisanja kao što je opisano u Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948, 1997, videti takođe internet stranicu http:www.rubic.rdg.ac.uk/~andrew/bioinforg/abs. Na funkcionalnu sposobnost antitela da vezuje određeni antigen najvećim delom utiče šest CDRs.

[0020] Termin "antitelo," u odnosu na anti-miostatin monoklonalno antitelo pronalaska (ili jednostavno, "monoklonalno antitelo pronalaska"), kao što je ovde korišćeno, odnosi se na monoklonalno antitelo. "Monoklonalno antitelo" kao što je ovde korišćeno odnosi se na himerno antitelo ili humanizovano antitelo. Poželjno monoklonalno antitelo pronalaska postoji u homogenoj ili u značajnom stepenu homogenoj populaciji. Monoklonalna antitela pronalaska mogu se dobiti upotrebom npr., tehnika hibridoma dobro poznatim u tehnici, kao i rekombinantnim tehnologijama, tehnologijama fagnog prikaza, sintetičkim tehnologijama ili kombinacijama takvih tehnologija ili drugih tehnologija opšte poznatim u tehnici. "Monoklonalno antitelo" odnosi se na antitelo koje je izvedeno iz jedne kopije ili klona, uključujući npr., bilo koji eukariotski, prokariotski ili klon faga, a ne na postupak kojim je dobijeno. "Monoklonalno antitelo" može biti intaktno antitelo (koje sadrži kompletni ili Fc region pune dužine), u značajnom stepenu intaktno antitelo, ili deo ili fragment antitela koji sadrži antigen-vezujući deo, npr., Fab fragment, Fab’ fragment ili F(ab’)2fragment himernog, himanizovanog ili humanog antitela.

[0021] Varijabilni regioni svakog para lakog/teškog lanca formiraju antigen-vezujuće mesto antitela. Stoga, intaktno IgG antitelo ima dva vezujuća mesta. Izuzev kod bifunkcionalnih ili bispecifičnih antitela, dva vezujuća mesta su ista. Kao što je ovde korišćeno, "antigenvezujući deo" ili "antigen-vezujući region" ili "antigen-vezujući fragment" odnosi se ovde međusobno zamenjivo na onaj deo molekula antitela, unutar varijabilnog regiona, koji sadrži aminokiselinske ostatke koji interaguju sa antigenom i daju antitelu specifičnost i afinitet za antigen. Ovaj deo antitela uključuje okvirne aminokiselinske ostatke neophodne za održavanje ispravne konformacije antigen-vezujućih ostataka.

[0022] Dodatno, "monoklonalno antitelo" kao što je ovde korišćeno može biti jednolančani Fv fragment koji se može stvoriti spajanjem DNK koja kodira LCVR i HCVR sa linker sekvencom. (Videti, Pluckthun, The Pharmacology of Monoklonalno Antitela, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994). Podrazumeva se da bez obzira da li su fragmenti ili delovi naznačeni, termin "antitelo" kao što je ovde korišćen uključuje takve fragmente ili delove kao i jednolančane oblike. Sve dok protein zadržava sposobnost da specifično ili preferencijalno vezuje nameravani cilj (tj., epitop ili antigen), uključen je terminom "antitelo."

[0023] "Populacija monoklonalnog antitela," odnosi se na homogenu ili u značajnom stepenu homogenu populaciju antitela (tj., najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, poželjnije najmanje oko 97% ili 98% ili najpoželjnije najmanje 99% antitela u populaciji biće u kompeticiji za isti antigen ili epitop u ELISA testu). Antitela mogu ili ne moraju biti glikozilovana i dalje će biti u okviru pronalaska. Monoklonalna antitela mogu biti homogena ukoliko imaju identičnu aminokiselinsku sekvencu iako se mogu razlikovati u postranslacionoj modifikaciji, npr., obrascu glikozilacije.

[0024] "Varijanta" anti-miostatin antitela, ovde se odnosi na molekul koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od aminokiselinske sekvence "ishodnog" anti-miostatin antitela na osnovu dodavanja, delecije i/ili supstitucije jednog ili više aminokiselinskih ostatka(ostataka) u sekvenci ishodnog antitela. U poželjnom primeru izvođenja, varijanta sadrži jednu ili više aminokiselinsku supstituciju(supstitucije) u jednom ili više CDR regionu(regionima) ishodnog antitela. Na primer, varijanta može sadržati najmanje jednu (npr., od oko jedne do oko deset, i poželjno od oko dve do oko pet) supstitucija u jednom ili više CDR regiona ishodnog antitela. Identičnost ili homologija u odnosu na sekvencu varijante ovde je definisana kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci varijante koje su identične ostacima ishodnog antitela, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina (gap), ukoliko je neophodno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence. Nijedna od N-terminalnih, C-terminalnih, ili internih ekstenzija, delecija ili insercija u sekvenci antitela ne treba da bude konstruisana tako da utiče na identičnost ili homologiju sekvenci. Varijanta zadržava sposobnost da vezuje miostatin i poželjno ima osobine koje su superiorne u odnosu na one kod ishodnog antitela. Na primer, varijanta može imati snažniji afinitet za vezivanje, nižu IC50u SBE/reporter testu ili poboljšanu sposobnost inhibicije bioaktivnosti miostatina.

Varijanta antitela od posebnog značaja ovde je ona koja pokazuje najmanje oko 5 puta, poželjno najmanje oko 10 puta, i najpoželjnije najmanje oko 20, 30, ili 50 puta povećanu biološku aktivnost u poređenju sa ishodnim antitelom.

[0025] "Ishodno" antitelo je ovde ono koje je kodirano aminokiselinskom sekvencom upotrebljenom za stvaranje varijante. Ishodno antitelo može imati mišji okvirni, ali poželjno ima humani okvirni region. Ishodno antitelo može biti mišje (videti npr., Slike x ovde), himerno, humanizovano ili humano antitelo.

[0026] Termin "specifično vezuje" kao što je ovde korišćen odnosi se na situaciju u kojoj se jedan član specifičnog vezujućeg para značajno ne vezuje za molekule različite od specifičnog vezujućeg partnera (ili više njih) kao što je mereno postupcima dostupnim u tehnici, npr., kompetitivni ELISA, BIACORE test ili KINEXA test. Termin je takođe primenjiv gde je npr., antigen-vezujući domen antitela pronalaska specifičan za određeni epitop koji nosi više antigena, u kom slučaju će specifično antitelo koje nosi antigen-vezujući domen biti sposobno da specifično vezuje različite antigene koji nose epitop. Shodno tome monoklonalno antitelo ovog pronalaska specifično vezuje GDF-8 i GDF-11.

[0027] Termin "preferencijalno vezuje" kao što je ovde korišćen odnosi se na situaciju u kojoj antitelo vezuje specifični antigen najmanje oko 20% više nego što vezuje drugi antigen kao što je mereno postupcima dostupnim u tehnici, npr., kompetitivni ELISA ili KD merenje sa BIACORE ili KINEXA testom. Shodno tome, monoklonalno antitelo ovog pronalaska preferencijalno vezuje GDF-8 u odnosu na GDF-11. Slično tome, antitelo može preferencijalno vezivati jedan epitop unutar antigena u odnosu na različiti epitop unutar istog antigena.

[0028] Termin "epitop" se odnosi na onaj deo molekula koji se može prepoznati i vezati sa antitelom na jednom ili više antigen-vezujućih regiona antitela. Epitopi se često sastoje od hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i imaju specifične karakteristike trodimenzionalne strukture kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Pod "inhibirajući epitop" i/ili "neutrališući epitop" smatran je epitop, koji kada je u kontekstu intaktnog molekula (u ovom slučaju, miostatina) i kada je vezan antitelom specifičnim za epitop, rezultuje u gubitku ili smanjenju biološke aktivnosti molekula ili organizma koji sadrži molekul in vivo ili in vitro.

[0029] Termin "epitop," kao što je ovde korišćen, dalje se odnosi na deo polipeptida koji ima antigenu i/ili imunogenu aktivnost kod životinje, poželjno sisara, npr., miša ili čoveka. Termin "antigenski epitop," kao što je ovde korišćen, definisan je kao deo poilpeptida za koje se antitelo može specifično vezati kao što je određeno bilo kojim postupkom dobro poznatim u tehnici, na primer, konvencionalnim imunotestovima. Antigenski epitopi ne moraju obavezno biti imunogeni, ali mogu biti imunogeni. "Imunogeni epitop," kao što je ovde korišćen, definisan je kao deo polipeptida koji izaziva odgovor antitela kod sisara, kao što je određeno bilo kojim postupkom dobro poznatim u tehnici. (Videti, npr., Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)).

[0030] Fraze "biološka osobina" ili "bioaktivnost," "aktivnost" ili "biološka aktivnost," u odnosu na antitelo ovog pronalaska, ovde su korišćene kao međusobno zamenjive i uključuju, ali nisu ograničene na, epitop/antigen afinitet i specifičnost, sposobnost neutralisanja ili antagonizacije aktivnosti miostatin in vivo ili in vitro, IC50u miostatin/SBE reporter testu ili drugom in vitro testu aktivnosti, in vivo stabilnosti antitela i imunogenih osobina antitela. Druge biološke osobine antitela koje se mogu identifikovati uključuju, na primer, unakrsnu reaktivnost, (tj., sa ne-humanim homolozima ciljanog peptida, ili sa drugim proteinima ili tkivima, generalno), i sposobnost očuvanja visokih nivoa ekspresije proteina u ćelijama sisara. Prethodno pomenute osobine ili karakteristike mogu se uočiti ili proceniti korišćenjem postupaka prepoznatih u tehnici uključujući, ali se ne ograničavajući na, ELISA, kompetitivni ELISA, analizu površinske plazmon rezonance, in vitro i in vivo testove bez ograničenja, vezivanje receptora, proizvodnju i/ili sekreciju citokina ili faktora rasta, razviće animalnog pola kod Xenopus, prenos signala i imunohistohemiju sa presecima tkiva iz različitih izvora uključujući ljude, primate ili bilo koji drugi izvor po potrebi.

[0031] Termin "aktivnost miostatina" kao što je ovde korišćen odnosi se na jedan ili više fizioloških aktivnosti regulacija rasta ili morfogenetskih aktivnosti povezanih sa aktivnim proteinom miostatinom. Na primer, aktivni miostatin je negativni regulator mase skeletnih mišića. Aktivni miostatin takođe može da modulira proizvodnju enzima specifičnih za mišiće (npr., kreatin kinaza), stimuliše proliferaciju mioblasta, i modulira diferencijaciju preadipocita u adipocite.

[0032] Termin "inhibira" ili "neutralizuje" kao što je ovde korišćen u odnosu na aktivnost antitela pronalaska označava sposobnost da u značajnom stepenu antagonizuje, zaustavi, spreči, zadrži, uspori, poremeti, eliminiše, stopira, redukuje ili obrne npr., progresiju ili težinu onoga što se inhibira uključujući, ali ne ograničavajući se na, biološku aktivnost ili osobinu, bolest ili stanje. Inhibicija ili neutralizacija je poželjno najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili viša.

[0033] Termin "izolovan" kada se koristi u odnosu na nukleinsku kiselinu ili protein (npr., antitelo) odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline ili proteina koja je identifikovana i odvojena od najmanje jednog kontaminanta sa kojim je uobičajeno povezana u svom prirodnom izvoru. Poželjno, "izolovano antitelo" je antitelo koje je u značajnom stepenu oslobođeno od drugih antitela koja imaju druge antigenske specifičnosti (npr., farmaceutske kompozicije pronalaska sadrže izolovano antitelo koje specifično vezuje miostatin i u značajnom stepenu je oslobođeno od antitela koja specifično vezuju antigene različite od miostatina).

[0034] Termini "Kabat numeracija" i "Kabat obeležavanje" ovde su korišćeni kao međusobno zamenjivi. Ovi termini, koji su prepoznati u tehnici, odnose se na sistem numerisanja aminokiselinskih ostataka koji su varijabilniji (tj., hipervarijabilni) od drugih aminokiselinskih ostataka u varijabilnim regionima teških i lakih lanaca antitela (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242 (1991)).

[0035] Polinukleotid je "operativno povezan" kada je postavljen u funkcionalni odnos sa drugim polinukleotidom. Na primer, promotor ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ukoliko utiče na transkripciju sekvence. Pertid je "operativno vezan" sa drugim peptidom kada su polinukleotidi koji ih kodiraju operativno povezani, poželjno su u istom okviru čitanja.

[0036] Termini "individua", "subjekt" i "pacijent," ovde korišćeni kao međusobno zamenjivi, odnose se na životinju, poželjno sisara (uključujući ne-primata i primata) ili vrstu ptice, uključujući, ali se ne ograničavajući na, miševe, majmune, ljude, sisare domaće životinje (npr., goveda, svinje, ovce), sportske životinje sisare (npr., konje), i sisare ljubimce (npr., pse i mačke); poželjno se termin odnosi na ljude. Termin se takođe odnosi na vrste ptica, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kokoške i ćurke. U određenim primerima izvođenja, subjekt, poželjno sisar, poželjno čovek, dalje se karakteriše bolešću ili poremećajem ili stanjem koje bi imalo koristi od smanjenog nivoa ili smanjene bioaktivnosti miostatina. U drugom primeru izvođenja subjekt, poželjno sisar, poželjno čovek, dalje se karakteriše rizikom od razvoja poremećaja, bolesti ili stanja koje bi imalo koristi od smanjenog nivoa miostatina ili smanjene bioaktivnosti miostatina.

[0037] Termin "vektor" uključuje molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan uključujući, ali se ne ograničavajući na, plazmide i virusne vektore. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su introdukovani da se drugi vektori mogu integrisati u genom ćelije domaćina po introdukciji u ćeliju domaćina, i time su replicirani zajedno sa genomom domaćina. Dodatno, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno vezani.

Takvi vektori se označavaju ovde kao "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno "ekspresioni vektori") i primeri vektora su dobro poznati u tehnici.

[0038] Kao što je ovde korišćeno, izrazi "ćelija," "ćelija domaćin," "ćelijska linija," i "kultura ćelija" korišćeni su kao međusobno zamenjivi i uključuju pojedinačnu ćeliju ili kulturu ćelija koja je recipijent bilo kog izolovanog polinukleotida pronalaska ili bilo kog rekombinantnog vektora (ili više njih) koji sadrže sekvencu koja kodira HCVR, LCVR ili monoklonalno antitelo pronalaska. Ćelije domaćina uključuju progeniju pojedinačne ćelije domaćina, i progenija ne mora obavezno biti potpuno identična (po morfologiji ili po totalnom DNK komplemetu) originalnoj ishodnoj ćeliji usled prirodnih, slučajnih, ili namernih mutacija i/ili promena. Ćelija domaćin uključuje ćelije nastale transformacijom, transdukcijom ili infekcijom in vivo ili in vitro sa jednim ili više rekombinantnih vektora ili polinukleotida koji eksprimiraju monoklonalno antitelo pronalaska ili njihov laki ili teški lanac. Ćelija domaćin koja sadrži rekombinantni vektor pronalaska (bilo stabilno inkorporisano u hromozom domaćina ili ne) može se takođe označiti i kao "rekombinantna ćelija domaćin". Poželjne ćelije domaćini za upotrebu u pronalasku su CHO ćelije (npr., ATCC CRL9096), NS0 ćelije, SP2/0 ćelije i COS ćelije (ATCC npr., CRL-1650, CRL-1651), HeLa (ATCC CCL-2). Dodatne ćelije domaćini za upotrebu u pronalasku uključuju biljne ćelije, ćelije kvasca, druge sisarke ćelije i prokariotske ćelije.

Karakterizacija antitela

[0039] Ovaj pronalazak se odnosi na izolovana, monoklonalna antitela koja specifično vezuju miostatin sa visokim afinitetom. Antitela pronalaska su himerna ili humanizovana antitela ili njihovi antigen-vezujući delovi. Dodatno, antitela pronalaska neutrališu ili antagonizuju biološku aktivnost miostatina in vivo ili in vitro. Specifično vezivanje anti-miostatin monoklonalnog antitela pronalaska za miostatin omogućava da se antitela pronalaska koriste kao terapeutici ili profilaktici za stanja povezana sa miostatinom, bolesti ili poremećaje, tj., -stanja, bolesti ili poremećaje koja imaju koristi od snižavanja nivoa miostatina ili antagonizovanja ili inhibicije biološke aktivnosti miostatina. Pronalazak daje anti-miostatin monoklonalno antitelo koje ima IC50od oko 1 nM u in vitro miostatin/SBE reporter testu. IC50anti-miostatin monoklonalnog antitela u in vitro miostatin/SBE reporter testu je oko četiri puta niža od IC50antitela u in vitro GDF-11/SBE reporter testu (kao što je ovde opisano u Primeru 5). Poželjno miostatin i GDF-11 polipeptidi testirani za preferencijalno vezivanje antitela pronalaska su oba homodimerni oblici zrelog proteina, poželjno poreklom od sisara ili ptice, još poželjnije humanog porekla. Međutim, miostatin i GDF-11 polipeptidi testirani za preferencijalno vezivanje antitela pronalaska mogu biti monomerni oblik zrelog proteina ili u obliku proproteina.

[0040] Monoklonalno antitela se može stvoriti korišćenjem hibridoma postupka dobro poznatim u tehnici (videti npr., Kohler et al., Nature, 256:495, 1975) ili se mogu stvoriti postupcima rekombinantne DNK (npr., kao u U.S. Patentu bt. 4,816,567). Generalno, hibridom se može stvoriti fuzionisanjem pogodne besmrtne ćelijske linije (npr., ćelijske linije mijeloma kao što je SP2/0) sa ćelijama koje stvaraju antitela iz imunizovane životinje. Ćelija koja proizvodi antitelo, poželjno ćelija slezine ili limfnih čvorova, dobijena je iz životinja imunizovanih sa antigenom od interesa. Fuzionisane ćelije (hibridoma) mogu se izolovati korišćenjem selektivnih uslova za kulturu, i klonirane ograničenim razblaživanjem. Medijum kulture u kom rastu ćelije hibridoma testiran je u odnosu na proizvodnju monoklonalnog antitela usmerenog protiv antigena. Poželjno, specifičnost vezivanja mabs proizvedenih od strane hibridoma ćelija određena je imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunotest (RIA) ili ELISA. Ćelije koje proizvode antitela sa željenim osobinama vezivanja mogu se selektovati pogodnim skrining testom. Postupci za takvu izolaciju i skrining su dobro poznati u tehnici.

[0041] Mogu se korisiti drugi pogodni postupci za proizvodnju i izolaciju antitela pronalaska, uključujući, na primer, postupke koji vrše selekciju rekombinantnog antitela (npr., jednolančanog Fv ili Fab) iz biblioteke, ili koji se zasnivaju na imunizaciji transgenih životinja (npr., miševi) koje su sposobne da stvore repertoar humanih antitela (videti npr., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993; Lonberg et al., U.S. Patent Number 5,545,806; Surani et al., U.S. Patent broj 5,545,807).

[0042] Jednolančana antitela i himerna ili humanizovana (CDR-graftovana) antitela, kao i himerna ili CDR-graftovana jednolančana antitela, i slično, koja sadrže delove izvedene iz različitih vrsta, takođe su obuhvaćena ovim pronalaskom i terminom "antitelo". Različiti delovi ovih antitela mogu se spojiti hemijski konvencionalnim tehnikama, sintetički, ili mogu biti pripremljeni kao neprekidni protein korišćenjem tehnika genetičkog inženjerstva. Na primer, nukleinske kiseline koje kodiraju himerni ili humanizovani lanac mogu se eksprimirati da proizvedu neprekidni protein. Videti npr., U.S. Patent br.4,816,567; evropski patent br. 0,125,023 B1; U.S. Patent br. 4,816,397; evropski patent br. 0,120,694 B1; WO 86/01533; evropski patent br. 0,194,276 B1; U.S. Patent br. 5,225, 539; evropski patent br.

0,239,400 B1 i U.S. Patenti br. 5,585,089 i 5,698,762. Videti takođe, Newman, R. et al. BioTechnology, 10:1455-1460, 1993, u vezi sa primatizovanim antitelom, i Ladner et al., U.S. Patent br.4,946,778 i Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426, 1988, u odnosu na jednolančana antitela.

[0043] Dodatno, funkcionalni delovi antitela, uključujući antigen-vezujuće delove himernih, humanizovanih, humanih ili jednolančanih antitela, takođe se mogu stvoriti. Funkcionalni delovi prethodno navedenih antitela zadržavaju najmanje jednu antigen-vezujuću funkciju i/ili biološku funkciju ili bioaktivnost antitela pune dužine iz kojeg su izvedeni.

[0044] Delovi ili fragmenti antitela sposobni da vezuju zreli miostatin uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv, Fab, Fab’ i F(ab’)2fragmente i obuhvaćeni su pronalaskom. Takvi fragmenti mogu se proizvesti enzimskim isecanjem ili rekombinantnim tehnikama. Na primer, isecanje papainom ili pepsinom može dati Fab ili F(ab’)2fragmente, respektivno. Najmanji antigen-vezujući fragment je Fv, koji se sastoji od HCVR i LCVR domena. Fab fragment se satoji od HCVR-CH1 i LCVR-CL domena kovalentno vezanih disulfidnom vezom između konstantnih regiona. Da bi se prevazišla tendencija ne-kovalentno vezanih HCVR i LCVR domena u Fv ka disocijaciji kada su ko-eksprimirani u ćeliji domaćinu, može se konstruisati takozvani jednolančani (sc) Fv fragment (scFv), u kom fleksibilni i adekvatno dug polipeptid vezuje bilo C-terminus HCVR za N-terminus LCVR ili C-terminus LCVR za N-terminus HCVR. Najčešće korišćeni linker bio je peptid od 15-ostataka (Gly4Ser)3, ali su drugi linkeri takođe poznati u tehnici. Antitela se takođe mogu stvoriti u različitim skraćenim oblicima korišćenjem gena antitela u kome je jedan ili više stop kodona introdukovano ushodno od prirodnog stop mesta. Na primer, himerni gen koji kodira deo F(ab’)2teškog lanca može se dizajnirati da uključi DNK sekvence koje kodiraju CH1 domen i zglobni region teškog lanca.

[0045] Selekcija fragmenata antitela iz biblioteka upotrebom tehnologija obogaćivanja kao što je fagni prikaz (Matthews DJ and Wells JA. Science. 260:1113-7, 1993), ribozomni prikaz (Hanes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:14130-5,1998), bakterijski prikaz (Samuelson P., et al., Journal of Biotechnology. 96:129-54, 2002) prikaz kvasca (Kieke MC, et al., Protein Engineering, 10:1303-10,1997) pokazale su se kao uspešna alternativa klasičnoj hibridoma tehnologiji (skoriji revijalni radovi: Little M. et al., Immunology Today, 21:364-70, 2000;).

Varijanta antitela

[0046] Mišje monoklonalno antitelo ili humano antitelo (stvoreno npr., u transgenom mišu) kao odgovor na miostatin ili na protein protein koji sadrži imunogeni epitop pronalaska je ishodno antitelo. Mišje ishodno antitelo može biti dodatno izmenjeno da bi se stvoriо himerni ili humanizovani oblik antitela korišćenjem postupaka dobro poznatih u tehnici. Takva himerna ili humanzovana antitela, mogu služiti kao ishodna antitela za dalju varijaciju ili mutagenezu. Ishodna antitela pronalaska mogu biti dalje mutagenizovana npr., unutar CDR domena (ili više njih) (videti, npr., Sl. 6 i 7) da bi se stvorila varijanta antitela sa optimizovanim osobinama od interesa, npr., afinitetom vezivanja, IC50, specifičnošću, itd. Varijanta antitela sa supstitucijom aminokiselina je poželjna i najmanje jedan aminokiselinski ostatak molekula ishodnog antitela je uklonjen i drugi ostatak je umetnut na njegovo mesto. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionalnu mutagenezu uključuju CDR regione, ali su FR izmene takođe predviđene. Poželjne su konzervativne supstitucije aminokiselina. Ukoliko takve supstitucije rezultuju u promeni biološke aktivnosti antitela, onda se značajnije promene, tj., ne-konzervativne promene aminokiselina, mogu uvesti i proizvodi se podvrgnuti skriningu.

[0047] Pogodan način za stvaranje supstitucionih varijanti je sazrevanje prema afinitetu korišćenjem fagnog prikaza. Ukratko, nekoliko mesta CDR regiona mutirana su da generišu sve moguće aminokiselinske supstitucije na svakom mestu. Varijante antitela generisane na taj način prikazane su na monovalentni način iz čestica filamentoznog faga kao fuzije sa proizvodom gena III M 13 spakovanim sa svakom česticom. Fagno prikazane varijante su zatim podvrgnute skriningu u odnosu na njihovu biološku aktivnost (npr., afinitet vezivanja, specifičnost, IC50) kao što je ovde opisano. Da bi se identifikovala mesta kandidati CDR regiona za modifikaciju, mogu se izvesti alanin skrining mutageni da bi se identifikovali ostaci CDR regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu antigen-antitelo kompleksa da bi se identifikovale tačke kontakta između antitela i miostatina. Takvi kontakt ostaci i susedni ostaci kandidati su za supstituciju prema postupcima koji su ovde razmatrani ili poznati u tehnici. Alternativno, ili dodatno, može se izvesti slučajna mutageneza na jednoj ili više CDR sekvenci na jednoj ili više pozicija ostataka, bilo dok je CDR operativno povezan sa varijabilnim regionom ili dok je CDR nezavisan od sekvence drugog varijabilnog regiona i zatim izmenjeni CDR vraćen u varijabilni region korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK. Kada su takve varijante antitela stvorene panel varijanti je podvrgnut skriningu kao što je ovde opisano i mogu biti izabrana antitela sa superiornim karakteristikama u jednom ili više relevantnih testova za dalji razvoj.

[0048] Bilo koji cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje ispravne konformacije antimiostatin antitela pronalaska može biti supstituisan, generalno sa serinom, da bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula i sprečilo aberantno unakrsno vezivanje. Nasuprot tome, cisteinska veza(e) mogu se dodati antitelu da bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito gde je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).

[0049] Drugi tip varijante aminokiseline antitela menja originalni obrazac glikozilacije antitela. Pod izmenom se podrazumeva delecija jedne ili više grupa ugljenih hidrata antitela, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u ishodnom antitelu.

[0050] Glikozilacija antitela je tipično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje grupe ugljenih hidrata za bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, predstavljaju sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje grupe ugljenih hidrata za bočni lanac asparagina. Stoga prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija odnosi se na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze, ilil ksiloze za hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, iako se takođe mogu koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0051] Dodavanje mesta glikozilacije antitelu se pogodno postiže izmenom aminokiselinske sekvence tako da ona sadrži jednu ili više prethodno navedenih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana glikozilaciona mesta). Izmena se takođe može napraviti dodavanjem, ili supstitucijom, jednog ili više ostatka serina ili treonina sekvenci originalnog antitela (za O-vezana glikozilaciona mesta).

Sekvenca

[0052] Monoklonalno antitelo prema pronalasku je miostatin antitelo koje sadrži polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 123 i polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 98.

[0053] Antitelo prema pronalasku je dalje okarakterisano sa IC50u in vitro miostatin/SBE reporter testu koja je jednaka 1 nM u in vitro miostatin/SBE reporter testu. IC50anti-miostatin monoklonalnog antitela u in vitro miostatin/SBE reporter testu je oko četiri puta niža od IC50antitela u in vitro GDF-11/SBE reporter testu (kao što je opisano u Primeru 5 ovde).

Ekspresija antitela

[0054] Ovaj pronalazak je takođe usmeren na ćelijske linije koje eksprimiraju anti-miostatin monoklonalno antitelo pronalaska ili njegov deo. Stvaranje i izolacija ćelijskih linija koje proizvode monoklonalno antitelo pronalaska može se postići korišćenjem standardnih postupaka poznatih u tehnici. Poželjne ćelijske linije uključuju COS, CHO, SP2/0, NS0 i kvasac (dostupni iz javnih repozitorijuma kao što je ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, VA).

[0055] Može se koristiti širok opseg različitih ekspresionih sistema domaćina da bi se eksprimiralo antitelo ovog pronalaska uključujući prokariotske (bakterijske) i eukariotske ekspresione sisteme (kao što je kvasac, bakulovirus, biljna, sisarska ili druga životinjska ćelija, transgene životinje, i ćelije hibridoma), kao i ekspresioni sistemi fagnog prikaza. Primer pogodnog bakterijskog ekspresionog vektora je pUC119, a pogodan eukariotski ekspresioni vektor je modifikovani pcDNA3.1 vektor sa oslabljenim DHFR selekcionim sistemom. Drugi ekspresioni sistemi antitela su takođe poznati u tehnici i ovde su predviđeni.

[0056] Antitelo pronalaska se može pripremiti rekombinantnom ekspresijom gena za laki i teški lanac imunoglobulina u ćeliji domaćinu. Da bi se antitelo rekombinantno eksprimiralo, na ćeliji domaćinu je izvršena transformacija, transdukcija, infekcija ili slično sa jednim ili više rekombinantnih vektora koji nose fragmente DNK koji kodiraju lake i/ili teške lance imunoglobulina antitela tako da su laki i/ili teški lanci eksprimirani u ćeliji domaćinu. Težak lanac i laki lanac mogu biti nezavisno eksprimirani od strane različitih promotora sa kojima su operativno vezani u jednom vektoru ili, alternativno, težak lanac i laki lanac mogu biti eksprimirani nezavisno od drugih promotora za koje su vezani u dva vektora – jedan koji eksprimira težak lanac i jedan koji eksprimira laki lanac. Izborno, težak lanac i laki lanac mogu biti eksprimirani u različitim ćelijama domaćinima. Poželjno, rekombinantna antitela izlučuju se u medijum u kom su ćelije domaćini kultivisani, odakle antitela mogu biti rekuperovana ili prečišćena. Standardni postupci za rekombinantnu DNK koji su korišćeni da bi se dobili geni teškog i lakog lanca antitela, uključuju ove gene u rekombinantne ekspresione vektore, i uvode vektore u ćelije domaćine. Takve standardne tehnike rekombinantne DNK su opisane, na primer, u Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel, et al (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989.

[0057] Izolovana DNK koja kodira HCVR region može se pretvoriti u gen teškog lanca pune dužine operativnim vezivanjem HCVR-kodirajuće DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2, i CH3). Sekvence humanih gena konstantnog regiona teškog lanca pozante su u tehnici. Videti, npr., Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991). DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti npr., standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti bilo kog tipa, (npr., IgG, IgA, IgE, IgM ili IgD), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3i IgG4) ili potlase konstantnog regiona i bilo koje njihove alotipske varijante kao što je opisano u Kabat (supra). Alternativno, antigen-vezujući deo može biti Fab fragment, Fab’ fragment, F(ab’)2fragment, Fd, ili jednolančani Fv fragment (scFv). Za gen Fab fragmenta teškog lanca, HCVR-kodirajuća DNK može biti operativno vezana sa drugim DNK molekulom koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.

[0058] Izolovana DNK koja kodira LCVR region može se pretvoriti u gen lakog lanca pune dužine (kao i u gen Fab lakog lanca) operativnim vezivanjem LCVR-kodirajuće DNK sa drugim DNK molekulom koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence humanih gena konstantnog regiona lakog lanca su poznate u tehnici. Videti, npr., Kabat, supra. DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstanti region.

[0059] Da bi se stvorio scFv gen, fragmenti HCVR- i LCVR-kodirajuće DNK su operativno vezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr., kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)3, tako da HCVR i LCVR sekvence mogu biti eksprimirane kao neprekinuti jednolančani protein, sa LCVR i HCVR regionima spojenim sa fleksibilnim linkerom. Videti, npr., Bird, et al., Science 242:423-6, 1988; Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83, 1988; McCafferty, et al., Nature 348:552-4, 1990.

[0060] Da bi se eksprimiralo antitelo pronalaska, DNK koja kodira delimični ili laki i/ili teški lanac pune dužine, dobijena kao što je prethodno dato, ubačene su u ekspresioni vektor tako da je gen operativno vezan sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. Ekspresioni vektor i kontrolne sekvence ekspresije izabrane su da budu kompatibilne sa ekspresionom ćelijom domaćinom koja se koristi. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu biti ubačeni u različite vektore ili, tipičnije, oba gena su ubačena u isti ekspresioni vektor. Geni antitela su ubačeni u ekspresioni vektor standardnim postupcima. Dodatno, rekombinantni ekspresioni vektor može kodirati signalni peptid koji olakšava izlučivanje lakog i/ili teškog lanca anti-miostatin monoklonalnog antitela iz ćelije domaćina. Gen lakog i/ili teškog lanca anti-miostatin monoklonalnog antitela može biti kloniran u vektor tako da je signalni peptid operativno vezan unutar okvira sa genom amino terminusa lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signal peptid.

[0061] Dodatno genu(genima) teškog i/ili lakog lanca, rekombinantni ekspresioni vektor pronalaska nosi regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena (ili više njih) lanca antitela u ćeliji domaćinu. Termin "regulatorna sekvenca" treba da uključi promotore, pojačivače i druge elemente ekspresione kontrole (npr., poliadenilacione signale), po potrebi, koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena (ili više njih) lanca antitela. Dizajn ekspresionog vektora, uključujući selekciju regulatornih sekvenci, može zavisiti od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja treba da bude transformisana, nivoa ekspresije željenog proteina. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju sisarsku ćelije domaćina uključuje virusne elemente koji daju visoke nivoe ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovirus, (npr., glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)) i polyoma virus.

[0062] Dodatno genima teškog i/ili lakog lanca i regulatornim sekvencama, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćinima (npr., oridžin replikacije) i jedan ili više selektabilnih marker gena. Selektabilni marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je introdukovan vektor. Na primer, tipično selektabilni marker gen daje rezistenciju na lekove, kao što je G418, higromicin, ili metotreksat, u ćeliji domaćinu u koju je vektor introdukovan. Poželjni selektabilni marker geni uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u DHFR-minus ćelijama domaćinima sa metoreksat selekcijom/amplifikacijom), neo gen (za G418 selekciju), i glutamin sintetazu (GS) u GS-negativnoj ćelijskoj liniji (kao što je NS0) za selekciju/amplifikaciju.

[0063] Za ekspresiju lakih i/ili teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodiraju teške i/ili lake lance introdukovan je u ćeliju domaćina standardnim tehnikama npr., elektroporacijom, precipitacijom sa kalcijum fosfatom, DEAE-dekstran transfekcijom, transdukcijom, infekcijom i slično. Iako je teorijski moguća ekspresija antitela pronalaska bilo u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama, poželjne su eukariotske ćelije, i najpoželjnije su sisarske ćelije domaćini, jer je veća verovatnoća da takve ćelije sastave i izluče ispravno pakovano i imunološki aktivno antitelo. Poželjne sisarske ćelije domaćini za ekspresiju rekombinantnog antitela pronalaska uključuju čelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući DHFR-CHO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980, korišćene sa DHFR selektabilnim markerom, npr., kao što je opisano u Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982, NS0 ćelije mijeloma, COS ćelije, i SP2/0 ćelije. Kada su rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela introdukovani u sisarsku ćeliju domaćina, antitela su stvorena kultivacijom ćelija domaćina u vremenskom periodu koji je dovoljan da omogući ekspresiju antitela u ćeliji domaćinu ili, poželjnije, izlučivanje antitela u medijum kulture u kojem su ćelije domaćini uzgajani.

Antitela mogu biti rekuperovana iz ćelija domaćina i/ili medijuma kulture korišćenjem standardnih postupaka prečišćavanja.

[0064] Ćelije domaćini mogu se takođe koristiti da se proizvedu delovi, ili fragmenti, intaktnih antitela, npr., Fab fragmenti ili scFv molekuli konvencionalnim tehnikama. Stručnjaci će shvatiti da su varijacije prethodnih procedura unutar obima ovog pronalaska. Na primer, može biti poželjno da se transficira ćelija domaćin sa DNK koja kodira laki lanac ili teški lanac antitela ovog pronalaska. Tehnologija rekombinantne DNK takođe može biti korišćena za uklanjanje neke ili celokupne DNK koja kodira bilo koji ili oba od lakih i teških lanaca koja nije neophodna za vezivanje miostatina. Molekuli eksprimirani iz tako skraćenih DNK molekula takođe su obuhvaćeni antitelima pronalaska.

[0065] U poželjnom sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela pronalaska, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira i teški lanac antitela i laki lanac antitela introdukovan je u DHFR-CHO ćelije sa npr., kalcijum fosfat posredovanom transfekcijom. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, geni teškog i lakog lanca antitela su svaki operativno povezani sa pojačivačkim/promotorskim regulatornim elementima (npr., izvedenim iz SV40, CMV, adenovirusa i sličnog, kao što je CMV pojačivački/AdMLP promotorski regulatorni element ili SV40 pojačivački/AdMLP promotorski regulatorni element) da bi se dobili visoki nivoi transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji omogućava selekciju CHO ćelija koje su transficirane sa vektorom korišćenjem metotreksat selekcije/amplifikacije. Selektovane trnasformisane ćelije domaćini su kultivisane da bi se omogućila ekspresija teških i lakih lanaca antitela, a intaktno antitelo je rekuperovano iz medijuma kulture. Korišćene su standardne tehnike molekularne biologije da bi se pripremio rekombinantni ekspresioni vektor, transficirale ćelije domaćini, selektovali transformanti, kultivisale se ćelije domaćini i rekuperovalo antitelo iz medijuma kulture. Antitela, ili njegovi antigen-vezujući delovi, pronalaska mogu se eksprimirati u životinji (npr., mišu) koja je transgena za gene humanog imunoglobulina (videti, npr., Taylor, et al., Nucleic Acids Res.

20:6287-95, 1992).

[0066] Jednom eksprimirana, intaktna antitela, njihovi dimeri, pojedinačni laki i teški lanci, ili drugi oblici imunoglobulina ovog pronalaska mogu se prečistiti prema standardnim postupcima tehnike, uključujući precipitaciju amonijum sulfata, jonska izmena, afinitet, reverzna faza, hromatografija na koloni sa hidrofobnom interakcijom, elektroforeza na gelu i slično. U značajnom stepenu čisti imunoglobulini od najmanje oko 90%, -92%, 94%-ili 96% homogenosti su poželjni, i 98 do 99% ili više homognosti najpoželjniji su za farmaceutske upotrebe. Kada su prečišćeni, delimično ili do homogenosti po želji, peptidi se zatim mogu koristiti terapijski ili profilaktički, kao što je ovde dato.

Himerno antitelo

[0067] Kao što je ovde korišćeno, termin "himerno antitelo" uključuje monovalentne, divalentne ili polivalentne imunoglobuline. Monovalentno himerno antitelo je dimer formiran od himernog teškog lanca povezanog preko disulfidnih mostova sa himernim lakim lancem. Divalentno himerno antitelo je tetramer formiran od dva težak lanac-laki lanac dimera povezanih preko najmanje jednog disulfidnog mosta.

[0068] Himerni teški lanac antitela sadrži antigen-vezujući region izveden iz teškog lanca nehumanog antitela specifičnog za miostatin, koji je operativno vezan za najmanje deo humanog ili u značajnom stepenu humanog (ili vrste različite od one od koje je antigen-vezujući region izveden), konstantnog regiona teškog lanca kao što je CH1 ili CH2, ili poželjno za konstantni region teškog lanca pune dužine. Himerni laki lanac antiela za upotrebu kod ljudi sadrži antigen-vezujući region izveden u potpunosti ili u značajnaom stepenu od lakog lanca nehumanog antitela specifičnog za miostatin, operativno vezanog za najmanje deo humanog ili u značajnom stepenu humanog (ili vrste različite od one od koje je antigen-vezujući region izveden), konstantnog regiona lakog lanca (CL), ili poželjno za konstantni region lakog lanca pune dužine. Antitela, fragmenti ili derivati sa himernim teškim lancima i lakim lancima sa istom ili različitom specifičnošću vezivanja varijabilnih regiona, takođe se mogu pripremiti odgovarajućim povezivanjem pojedinačnih polipeptidnih lanaca, prema koracima poznatog postupka.

[0069] Sa ovim pristupom, domaćini koji eksprimiraju himerne teške lance zasebno su kultivisani od domaćina koji eksprimiraju himerne lake lance, a lanci imunoglobiulina su zasebno rekuperovani i zatim povezani. Alternativno, domaćini mogu biti ko-kultivisani i dozvoljeno je da se lanci spontano spajaju u medijumu kulture, praćeno sa rekuperovanjem sklopljenog imunoglobulina ili fragmenta. Postupci za proizvodnju himernih antitela poznati su u tehnici (videti, npr., U.S. Patenti br.: 6,284,471; 5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397).

Humanizovana antitela

[0070] Antitelo za upotrebu u terapijske svrhe poželjno će imati sekvencu okvirnog i konstantnog regiona (do stepena do kog postoji u antitelu) izvedenu iz sisara kod koga će biti upotrebljeno kao terapeutik tako da se smanji mogućnost da sisar razvije imuni odgovor na terapijsko antitelo. Humanizovana antitela su od naročitog interesa jer se smatraju vrednim za terapijsku primenu i izbegavaju odgovor anti-mišjeg antitela koji se često uočava kod glodarskih antitela. Dodatno, kod humanizovanih antitela efektorni deo je humani tako da može bolje interagovati sa drugim delovima huimanog imunog sistema (npr., uništava ciljene ćelije efikasnije sa komplement-zavisnom citotoksičnošću ili antitelo-zavisnom ćelijskom citotoksičnošću). Takođe, injektirana humanizovana antitela mogu imati polu-život više sličan onome kod prirodnih humanih antitela nego što to imaju npr., mišja antitela, čime omogućuju slabije i manje česte doze za primenu. Termin "humanizovano antitelo" kao što je ovde korišćeno odnosi se na antitelo koje sadrži delove antitela različitog porekla, gde je najmanje jedan deo humanog porekla. Na primer, humanizovano antitelo može sadržati delove izvedene iz antitela ne-humanog porekla sa zahtevanom specifičnošću, kao što je mišje, i iz antitela humanog porekla, spojene zajedno hemijski konvencionalnim postupcima (npr., sintetički) ili pripremljena kao neprekidni polipeptid korišćenjem postupaka genetičkog inženjerstva.

[0071] Poželjno, "humanizovano antitelo" ima CDRs koji potiču od ne-humanog antitela (poželjno mišje monoklonalno antitelo) dok su okvirni i konstantni region, do stepena do kog su prisutni, (ili njihov značajan deo, tj., najmanje oko 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) su kodirani informacijom sekvence nukleinske kiseline koja se javlja u humanom regionu imunoglobulina klicine linije (videti, npr., the International ImMunoGeneTics Database) ili u njihovim rekombinantnim ili mutiranim oblicima bilo da su pomenuta antitela proizvedena u humanoj ćeliji ili ne. CDRs humanizovanog antitela mogu biti optimizovani iz CDRs ne-humanog ishodnog antitela iz kojeg potiču da bi se stvorile željene osobine, npr., specifičnost, afinitet i kapacitet. Optimizovani CDRs mogu imati supstitucije aminokiselina, adicije i/ili delecije kada se porede sa ishodnim CDRs. Na primer, aminokiselinske pozicije CDRs koje su podvučene i u boldu na Sl. 6 i 7 su pozicije koje su optimizovane iz ishodnog CDRs kao što je prikazano na Sl 5.

[0072] Humanizovani oblici ne-humanih (npr., mišjih) antitela uključuju intaktno antitelo, u značajnom stepenu intaktno antitelo, deo antitela koje sadrži antigen-vezujuće mesto, ili deo antitela koje sadrži Fab fragment, Fab’ fragment, F(ab’)2, ili jednolančani Fv fragment. Humanizovana antitela poželjno sadrže minimalne sekvence izvedene iz ne-humanog imunoglobulina. Humanizovana antitela mogu takođe sadržati ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaocu niti u uvezenom CDR ili okvirnim sekvencama. Uopšteno, humanizovano antitelo sadržaće u značajnom stepenu sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili u značajnom stepenu sve aminokiseline u CDR regionima odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina i sve ili u značajnom stepenu sve aminokiseline u FR regionima su one iz humane imunoglobulin konsenzusne sekvence. Humanizovano antitelo optimalno takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj od humanog imunoglobulina. [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).]

[0073] Humanizovana antitela mogu se podvrgnuti in vitro mutagenezi upotrebom rutinskih postupaka u tehnici (ili, kada je korišćena životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatske mutageneze) i, stoga, aminokiselinske sekvence okvirnog regiona HCVR i LCVR regiona humanizovanog rekombinantnog antitela su sekvence koje, kada su izvedene od onih srodnih sekvencama humane klicine linije HCVR i LCVR, ne moraju prirodno postojati unutar repertoara antitela humane klicine linije in vivo. Predviđeno je da su takve aminokiselinske sekvence HCVR i LCVR okvirnih regiona humanizovanog rekombinantnog antitela najmanje 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% ili najpoželjnije najmanje 99% identične sekvenci humane klicine linije. Poželjno, ovi okvirni ostaci ishodnog antitela (npr., mišje antitelo ili generalno antitelo iz koga je izvedeno humanizovano antitelo) koji održavaju ili utiču na strukturu mesta kombinovanja biće zadržani. Ovi ostaci mogu biti identifikovani npr., rendgenskom kristalografijom ishodnog antitela ili Fab fragmenta, time identifikujući trodimenzionalnu strukturu antigen-vezujućeg mesta

[0074] Humanizovano antitelo može sadržati ili biti izvedeno iz okvirnnih regiona lakog lanca humane klicine linije. U naročitim primerima izvođenja, sekvenca lakog lanca klicine linije izabrana je iz humanih VK sekvenci uključijući, ali ne ograničavajući se na, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, 012, O14, O18, O2, O4, i 08. U određenim primerima izvođenja, ovaj okvirni region lakog lanca humane klicine linije izabran je od V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, i V5-6. Videti PCT WO 2005/005604 za opis različitih sekvenci klicine linije.

[0075] U drugim primerima izvođenja, humanizovano antitelo može sadržati ili biti izvedeno iz okvirnog regiona teškog lanca humane klicine linije. U naročitim primerima izvođenja, ovaj okvirni region teškog lanca humane klicine linije izabran je od VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, i VH7-81. Videti PCT WO 2005/005604 za opis različitih sekvenci klicine linije.

[0076] U naročitim primerima izvođenja, varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca sadrži okvirni region ili najmanje deo okvirnog regiona (npr., sadrži 2 ili 3 subregiona, kao što su FR2 i FR3). U određenim varijantama, najmanje FRL1, FRL2, FRL3, ili FRL4 je u potpunosti humani. U drugim primerima izvođenja, najmanje FRH1, FRH2, FRH3, ili FRH4 je u potpunosti humani. U nekim primerima izvođenja, najmanje FRL1, FRL2, FRL3, ili FRL4 je sekvenca klicine linije (npr., humane klicine linije) ili sadrži humanu konsenzusnu sekvencu za određeni okvirni region. U drugim primerima izvođenja, najmanje FRH1, FRH2, FRH3, ili FRH4 je sekvenca klicine linije (npr., humana klicina linija) ili sadrži humane konsenzusne sekvence za određeni okvirni region. U poželjnim primerima izvođenja, okvirni region je humani okvirni region.

[0086] Generalno, humanizovana antitela mogu se stvoriti dobijanjem sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju HCVR i LCVR antitela, npr., mišje antitelo antitelo ili antitelo stvoreno u hibridomu, koje vezuje miostatin epitop pronalaska, identifikujući CDRs u pomenutom HCVR i LCVR (ne-humani), i graftujući takve CDR-kodirajuće sekvence nukleinske kiseline u izabrane humane sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju okvirni region. Izborno, CDR region može se optimizovati mutagenezom po principu slučajnosti ili na određenim mestima da bi se supstituisala jedna ili više aminokiselina u CDR sa različitim aminokiselinama pre graftovanja CDR regiona u okvirni region. Alternativno, CDR region može biti optimizovan nakon ubacivanja u humani okvirni region korišćenjem postupaka dostupnih stručnjaku. Poželjno, aminokiselinske sekvence humanog okvirnog regiona su tako izabrane da je rezultujuće antitelo verovatno pogodno za in vivo primenu kod ljudi. Ovo može biti određeno, npr., na osnovu pretohodne upotrebe antitela koje sadrži takvu humanu okvirnu sekvencu. Poželjno, humana okvirna sekvenca samo po sebi neće biti značajno imunogena.

[0087] Alternativno, aminokiselinske sekvence okvirnih regiona antitela koje treba humanizovati mogu se porediti sa onima iz poznatih humanih okvirnih sekvenci za upotrebu za CDR-grafting i izabrane na osnovu sekvenci visoko sličnih ishodnom antitelu, npr., mišje antitelo koje vezuje miostatin. Brojne humane sekvence okvirnog regiona su izolovane i njihove sekvence su objavljene u tehnici. Ovo povećava verovatnoću da će rezultujuće CDR-graftovano humanizovano antitelo, koje sadrži CDRs ishodnog (npr., mišjeg) ili optimizovanog CDRs iz ishodnog antitela graftovanog na izabrane humane okvirne regione (i takođe moguće na humani konstantni region) u značajnom stepenu će zadržati strukturu za vezivanje antigena i stoga zadržati afinitet vezivanja ishodnog antitela. Da bi se zadržao značajan stepen afiniteta za vezivanje antigena, izabrani humani okvirni regioni će poželjno biti oni za koje se očekuje da su pogodni za in vivo primenu, tj., nisu imunogeni.

[0088] U bilo kom postupku, dobijene su DNK sekvence koja kodiraju HCVR i LCVR regione poželjno mišjeg anti-miostatin antitela. Postupak za kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira imunoglobuline dobro su poznati u tehnici. Takvi postupci mogu, na primer, uključivati amplifikaciju imunoglobulin-kodirajućih sekvenci koje treba klonirati korišćenjem odgovarajućih prajmera sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR). Prajmeri za amplifikaciju sekvenci nukleinske kiseline immnoglobulina, i specifično mišje HCVR i LCVR sekvence objavljeni su u literaturi. Nakon što su takve imunoglobulin-kodirajuće sekvence klonirane, biće sekvencirane postupcima dobro poznatim u tehnici.

[0089] Nakon što su CDR-kodirajuće sekvence graftovane na izabrane humane sekvence koje kodiraju okvirni region; rezultirajuće DNK sekvence koje kodiraju "humanizovane" sekvence varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca su zatim eksprimirane da bi proizvele humanizovano Fv ili humanizovano antitelo koje vezuje miostatin. Humanizovani HCVR i LCVR mogu biti eksprimirani kao deo celog anti-miostatin antitelo molekula, tj., kao fuzioni protein sa humanim sekvencama konstantnog domena čije su kodirajuće DNK sekvence dobijene iz komercijalno dostupne biblioteke ili koje su dobijene korišćenjem, npr., jednog od prethodno opisanih postupaka za dobijanje DNK sekvenci, ili su u tehnici. Međutim, HCVR i LCVR sekvence mogu takođe biti eksprimirane u odsustvu konstantnih sekvenci da bi se proizvelo humanizovano anti-miostatin Fv. Međutim, fuzija humanih konstantnih sekvenci sa varijabilnim regionom je potencijalno poželjna jer rezultujuće humanizovano anti-miostatin antitelo može imati humane efektorne funkcije.

[0090] Primeri za sintetisanje DNK koja kodira protein poznate sekvence su dobro poznati u tehnici. Korišćenjem takvih postupaka, DNK sekvence koje kodiraju humanizovane HCVR i LCVR sekvence (sa ili bez konstantnih regiona) su sintetisane, i zatim eksprimirane u vektorskom sistemu pogodnom za ekspresiju rekombinantnih antitela. Ovo može biti postignuto u bilo kom vektorskom sistemu koji obezbeđuje da ove humanizovane HCVR i LCVR sekvence budu eksprimirane kao fuzioni protein sa humanim sekvencama konstantnog domena i da se spoje da bi stvorile funkcionalno (antigen vezujuće) antitelo ili fragmente antitela.

[0091] Sekvence humanog konstantnog regiona su dobro poznate u tehnici, i objavljene su u literaturi. Poželjne sekvence humanog konstantnog lakog lanca uključuju sekvence kapa i lambda konstantnog lakog lanca. Poželjne sekvence humanog konstantnog teškog lanca uključuju humani IgG1, humani IgG2, humani IgG3, humani IgG4, i njihove mutirane verzije koje obezbeđuju izmenjene efektorne funkcije, npr., poboljšanje in vivo polu-života, smanjeno vezivanje Fc receptora, izmenjeni profil deamidacije i slično.

[0092] Ukoliko su prisutne, humani okvirni regioni su poželjno izvedeni iz varijabilnog regiona humanog antitela koji ima sličnu sekvencu sa analognim ili ekvivalentnim regionom donorom antigen vezujućim regionom (tj., ishodno antitelo). Drugi izvori okvirnih regiona za delove humanog porekla humanizovanog antitela uključuju humane varijabilne konsenzusne sekvence (videti npr., Kettleborough, C.A. et al. Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter et al., WO 94/04679. Na primer, sekvenca antitela ili varijabilnog regiona korišćena da se dobije ne-humani deo može se uporediti sa humanim sekvencama kao što je opisano u Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). U naročito poželjnom primeru izvođenja, okvirni regioni lanca humanizovanog antitela izvedeni su iz humanog varijabilnog regiona koji ima najmanje oko 60% ukupne identičnosti sekvence, poželjno najmanje oko 70% ukupne identičnosti sekvence i poželjnije najmanje oko 85% ukupne identičnosti sekvence, sa varijabilnim regionom ne-humanog donora. Humani deo može takođe biti izveden iz humanog antitela koje ima najmanje oko 65% identičnosti sekvence, i poželjno najmanje oko 70% identičnosti sekvence, unutar određenog dela (npr., FR) koji je korišćen, u poređenju sa ekvivalentnim delom (npr., FR) ne-humanog donora.

[0093] Reference koje dalje opisuju postupke uključene u humanizovanje mišjeg antitela koje se mogu koristiti su npr., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991; U.S. Pat. br. 5,693,761; U.S. Pat. br. 4,816,397; U.S. Pat. br. 5,225,539; kompjuterski programi ABMOD i ENCAD kao što je opisano od strane Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:595-620,1983; humanizacija može biti suštinski izvedena praćenjem postupaka iz Winter i saradnika [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)].

Upotrebe

[0094] Antitela ovog pronalaska su korisna u terapijskim, profilaktičkim i istraživačkim primenama kao što je ovde opisano. Antitelo pronalaska može se koristiti za dijagnozu poremećaja ili bolesti povezane sa ekspresijom humanog miostatina. Na sličan način, antitelo pronalaska se može koristiti u testu za praćenje nivoa miostatina kod subjekta lečenog od određenog miostatin-povezanog stanja. Istraživačka primena uključuje postupke koji koriste antitelo pronalaska i obeleživač da bi se detektovao miostatin u uzorku, npr., u humanoj telesnoj tečnosti ili u ćeliji ili ekstraktu tkiva. Antitela pronalaska mogu biti korišćena sa ili bez modifikacije, i obeležena su sa kovalentnim ili nekovalentnim vezivanjem detektabilne grupe. Detektabilna grupa može biti ona koja je sposobna da proizvede, bilo direktno ili indirektno, detektabilan signal. Na primer, detektabilna grupa može biti radioizotop kao što je, npr.,<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I, fluorescentno ili hemiluminescentno jedinjenje, kao što je fluorescein izotiocijanat, rodamin, ili luciferin; ili enzim, kao što je alkalna fosfataza, betagalaktozidaza, ili peroksidaza rena. Može se koristiti svaki postupak poznat u tehnici koji zasebno konjuguje antitela i detektabilne grupe, uključujući one postupke opisane od strane Hunter, et al., Nature 144:945, 1962; David, et al., Biochemistry 13: 1014, 1974; Pain, et al., J. Immunol. Meth.40: 219, 1981; i Nygren, J. Histochem. And Cytochem.30: 407, 1982.

[0095] Različiti konvencionalni protokoli za merenje miostatina, uključujući npr., ELISAs, RIAs, i FACS, poznati su u tehnici i obezbeđuju osnovu za dijagnostiku izmenjenih ili abnormalnih nivoa ekspresije miostatina. Normalne ili standardne ekspresione vrednosti ustanovljene su korišćenjem postupaka poznatih u tehnici, npr., kombinovanjem uzorka koji sadrži miostatin polipeptid sa, npr., antitelima pod uslovima pogodnim da se formira antigen:antitelo kompleks. Antitelo je direktno ili indirekto obeležen sa detektabilnom supstancom da bi se olakšala detekcija vezanog ili nevezanog antitela. Pogodne detektabilne supstance uključuju različite enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičnih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; primeri luminescentnog materijala uključuju luminol; i primeri radioaktivnog materijala uključuju<125>I,<131>I,<35>S, ili<3>H. (See, npr., Zola, Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). Količina formiranog standardnog kompleksa je kvantifikovana različitim postupcima, kao što su, npr., fotometrijski načini. Količine miostatin polipeptida eksprimirani u uzorcima su zatim poređeni sa standardnim vrednostima.

[0096] Pogodno, antitelo ovog pronalaska može biti obezbeđeno u kompletu, spakovanoj kombinaciji reagensa u predodređenim količinama sa instrukcijama za izvođenje dijagnostičkog testa. Gde je antitelo obeleženo sa enzimom, komplet će uključiti supstrate i kofaktore koji su neophodni enzimu (npr., prekursor supstrata koji obezbeđuje detektabilni hromofor ili fluorofor). Dodatno, mogu biti uključeni drugi aditivi kao što su stabilizatori, puferi (npr., blokirajući pufer ili pufer za lizu) i slično. Relativne količine različitih reagensa mogu se široko varirati da bi se obezbedile koncentracije reagensa u rastvoru koji u značajnom stepenu optimizuju osetljivost testa. Naročito, reagensi mogu biti obezbeđeni kao suvi praškovi, obično liofilizovani, uključujući ekscipijente koji će po rastvaranju obezbediti rastvor reagensa koji ima odgovarajuću koncentraciju.

Terapijske upotrebe antitela

[0097] Miostatin ima ulogu u razvoju mišića i u određenom broju povezanih poremećaja ili bolesti. Kod adulta, iRNK miostatina se primarno detektuje u skeletnom mišiću iako su niže koncentracije takođe pronađeni u masnom i srčanom tkivu (Sharma, M., et al, J. Cell Physiol.

180:1, 1999). Miostatin „knockout“ miševi imaju dva do tri puta veću mišićnu masu nego miševi divljeg tipa iz istog okota. Povećana mišićna masa je rezultat hipertrofije i hiperplazije vlakana (McPherron, A., et al. Nature 387:83-90, 1997 i Zhu, X. et al., FEBS Letters 474:71). Dodatno, miostatin „knockout“ miševi akumuliraju manje masti od miševa divljeg tipa iz istog okota ali inače izgledaju normalno i zdravo. Nedavno je pokazano da je miostatin važni regulator adipogeneze (Rebbapragada, A., et al., Mol. and Cell. Bio. 23:7230-7242, 2003). Dodatno, struktura i sadržaj kostiju nedavno je proučavana kod miševa sa deficijencijom miostatina (Hamrick M.W., et al., J. Orthopaedic Research 21:1025, 2003; Hamrick, M.W., et al., Calcif Tissue Int 71:63, 2002.

[0098] Stoga, farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-miostatin monoklonalno antitelo pronalaska može se koristiti za povećanje mišićne mase, povećanje gustine kostiju, smanjenje gubitka mišića, ili može biti korisna za tretman ili prevenciju stanja gde prisustvo miostatina izaziva ili doprinosi neželjenim patološkim efektima ili smanjenje nivoa miostatina ima terapijsku korist kod sisara, poželjno ljudi, uključujući, ali ne ograničavajući se na, gubitak mišića, povredu mišića, hiruršku intervenciju, popravku oštećenog mišića, slabost, sarkopeniju povezanu sa starošću, atrofiju usled neaktivnosti, osteoporozu, osteoartritis, rast i oporavljenje ligamenata, gojaznost, supresiju akumulacije telesne masti, gojaznost, mišićnu distrofiju bilo kog tipa, miopatiju kod intenzivne nege, alkoholnu miopatiju, kaheksiju (npr., kancer povezane ili HIV indukovane ili kao rezultat COPD, hronične plućne bolesti, oporavak od sepse, insuficijenciju bubrega, insuficijenciju jetre, insuficijenciju ili bolesti srca), metabolički sindrom, gubitak mišića nakon opekotina, i dijabetes tipa II. Atrofija kao posledica neaktivnosti može biti rezultat brojnih uzorka ili incidenata uključujući bilo koji poremećaj ili bolest ili stanje koje vodi do produžene nepokretnosti ili neaktivnosti ili ležanja uključujući, ali se ne ograničavajući na, transplantaciju čvrstog organa, zamenu zgloba, šlog, povredu kičmenog stuba, oporavak od teških opekotina, sedentarnu hroničnu hemodijalizu, i izlaganje mikrogravitaciji. Kako miostatin ima visoko konzervativnu sekvencu i funkciju između vrsta, antitela pronalaska mogu se koristiti da bi se povećala mišićna masa, povećala gustina kostiju ili tretirati ili sprečiti stanja kod ne-humanih vrsta sisara i ptica [npr., domaće životinje (npr., psi i mačke), sportske životinje (npr., konji), životinje koje su izvor hrane (npr., goveda, svinje, i ovce), vrste ptica (npr., kokoške, ćurke, druge lovne ptice ili živina)] gde prisustvo miostatina izaziva ili doprinosi neželjenim patološkim efektima ili smanjenje nivoa miostatina ima terapijsku korist.

[0099] Ovde je predviđena upotreba anti-miostatin monoklonalnog antitela ovog pronalaska za tretiranje ili prevenciju najmanje jednog od prethodno pomenutih poremećaja kod kojih je aktivnost miostatina štetna ili koja imaju koristi od smanjenih nivoa bioaktivnog miostatina. Dodatno, predviđena je upotreba anti-miostatin monoklonalnog antitela ovog pronalaska za upotrebu u proizvodnji medikamenta za tretiranje najmanje jednog od prethodno navedenih poremećaja.

[0100] Kao što je ovde korišćeno, termini "tretman", "tretiranje", i slično, odnose se na željeni farmakološki i/ili fiziološki efekat. Efekat može biti profilaktički u smislu potpune ili delimične prevencije bolesti ili njenih simptoma i/ili može biti terapeutski u smislu delimičnog ili potpunog leka za bolest i/ili štetnog efekta koji potiče od bolesti. "Tretman", kao što je ovde korišćeno, uključuje primenu jedinjenja ovog pronalaska za treman bolesti ili stanja kod sisara, naročito čoveka, i uključuje: (a) prevenciju pojavljivanja bolesti kod subjekta koji može imati predispoziciju za bolest, ali mu još nije dijagnostifikovana; (b) inhibiciju bolesti, tj., zaustavljanje njenog razvoja; i (c) ublažavanje bolesti, tj., uzrokovanje regresije bolesti ili poremećaja ili ublažavanja njenih simptoma ili komplikacija. Dozni režimi mogu biti podešeni da obezbede optimum željenog odgovora (npr., terapijski ili profilaktički odgovor). Na primer, može se primeniti pojedinačni bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je indikovano hitnošću terapijske situacije.

Farmaceutska kompozicija

[0101] Antitelo pronalaska može biti inkorporisano u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu na subjekta. Jedinjenja pronalaska mogu se primeniti zasebno ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem, i/ili ekscipijentima, u pojedinačnim ili višestrukim dozama. Farmaceutske kompozicije za primenu su dizajnirane da budu odgovarajuće za izabrani način primene, i farmaceutski prihvatljivi razblaživači, nosači, i/ili ekscipijenti kao što su agensi za disperziju, puferi, površinski aktivna sredstva, konzervansi, agensi za povećanje rastvorljivosti, agensi za postizanje izotoničnosti, stabilizujući agensi i slično korišćeni su kao odgovarajući. Pomenute kompozicije su dizajnirane u skladu sa konvencionalnim tehnikama kao u npr., Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 koja obezbeđuje priručnik tehnika formulacije kao što su opšte poznati stručnjacima.

[0102] Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-miostatin monoklonalno antitelo ovog pronalaska može se primeniti na subjekta koji je u riziku od ili pokazuje patologije kao što su ovde opisane korišćenjem standardnih tehnika primene uključujući oralnu, intravensku, intraperitonealnu, potkožnu, pulmonalnu, transdermalnu, intramuskularnu, intranazalnu, bukalnu, sublingvalnu, ili primena supozitorijama.

[0103] Farmaceutska kompozicija pronalaska poželjno je "terapijski efikasna količina" ili "profilaktički efikasna količina" antitela pronalaska. "Terapijski efikasna količina" odnosi se na količinu efikasnu, sa potrebnim dozama i vremenskim periodima, da bi se postigao željeni terapijski efekat. Terapijski efikasna količina antitela može varirati prema faktorima kao što je stanje bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i sposobnosti antitela ili dela antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapijski efikasna količina je takođe ona u kojoj je bilo koji toksični ili štetni efekat antitela, nadjačan terapijski korisnim efektima. "Profilaktički efikasna količina" odnosi se na količinu efikasnu, sa potrebnim dozama i vremenskim periodima, da bi se postigao željeni profilaktički efekat. Tipično, kako je profilaktička doza korišćena kod subjekata pre ili na ranijim stadijumima bolesti, profilaktički efikasna količina biće manja od terapijski efikasne količine.

[0104] Terapijski efikasna količina ili profilaktički efikasna količina je najmanja minimalna doza aktivnog agensa koja je neophodna da bi dala terapijsku korist za subjekta. Drugim rečima, terapijski efikasna količina antitela pronalaska je količina koja kod sisara, poželjno čoveka, povećava mišićnu masu, povećava gustinu kostiju, ili tretira stanja gde prisustvo miostatina izaziva ili doprinosi neželjenim patološkim efektima ili smanjenje nivoa miostatina rezultuje u korisnom terapijskom efektu kod sisara, poželjno čoveka, uključujući, ali se ne ograničavajući na, gubitak mišića, povredu mišića, slabost posle hirurške intervencije, sarkopeniju povezanu sa starošću, atrofiju usled neaktivnosti, osteoporozu, osteoartritis, rast i obnavljanje ligamenta, gojaznost, supresiju akumulacije telesne masti, mišićnu distrofiju bilo kog tipa, miopatiju kod intenzivne nege, alkoholnu miopatiju, kaheksiju (npr., povezane sa kancerom ili indukovane HIV-om ili kao rezultat COPD, hronične plućne bolesti, opravak od sepse, insuficijenciju bubrega, insuficijenciju jetre, insuficijenciju ili bolesti srca), metabolički sindrom, gubitak mišića nakon opekotina, i dijabetes tipa II. Atrofija kao posledica neaktivnosti može biti rezultat brojnih uzorka ili incidenata uključujući bilo koji poremećaj ili bolest ili stanje koje vodi do produžene nepokretnosti ili prestanka upotrebe ili ležanja uključujući, ali se ne ograničavajući na, transplantaciju čvrstog organa, zamenu zgloba, šlog, povredu kičmenog stuba, oporavak od teških opekotina, sedentarnu hroničnu hemodijalizu, i izlaganje mikrogravitaciji.

[0105] Način primene antitela ovog pronalaska može biti oralno, parenteralno, inhalacijom, ili topikalno. Poželjno, antitela pronalaska mogu se inkorporirati u farmaceutsku kompoziciju pogodnu za parenteralnu primenu. Termin parenteralno kao što je ovde korišćen uključuje intravensku, intranuskularnu, potkožnu, rektalnu, vaginalnu, ili intraperitonealnu primenu. Poželjno je periferno sistemsko dopremanje intravenskom ili intraperitonealnom ili potkožnom injekcijom. Pogodni nosači za takve injekcije su očigledni u tehnici.

[0106] Farmaceutske kompozicije tipično moraju biti sterilne i stabilne pod proizvodnim i skladišnim uslovima u obezbeđenom spremištu, uključujući npr., zapečaćenu vijalicu ili špric. Stoga, farmaceutske kompozicije mogu biti sterilno filtrirane nakon stvaranja formulacije, ili na drugi način učinjene mikrobiološki prihvatljivim. Tipična kompozicija za intravensku infuziju može imati zapreminu i do 250-1000 ml tečnosti, kao što je sterilni Ringer-ov rastvor, fiziološki slani rastvor, rastvor dekstroze i Hank-ov rastvor i terapijski efikasnu dozu , (npr., 1 do 100 mg/mL, ili) koncentracije antitela. Doza može varirati u zavisnosti od tipa i težine bolesti. Kao što je dobro poznato u medicinskoj tehnici, doze za bilo kog subjekta zavise od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, određenog jedinjenja koje se primenjuje, pola, vremena i načina primene, opšteg zdravstvenog stanja, i drugih lekova koji se istovremeno primenjuju. Tipična doza može biti, na primer, u opsegu od 0.001 do 1000 μg; međutim, doze ispod ili iznad ovog primernog opsega su predviđene, naročito razmatrajući prethodno pomenute faktore. Dnevni parenteralni dozni režim može biti oko 0.1 μg/kg do oko 100 mg/kg ukupne telesne težine, poželjno od oko 0.3 μg/kg do oko 10 mg/kg i poželjnije od oko 1 μg/kg do 1 mg/kg, još više poželjno od oko 0.5 do 10 mg/kg telesne težine na dan. Progres se može pratiti periodičnom procenom. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, zavisno od stanja, tretman je ponovljen dok ne dođe do željene supresije simptoma bolesti. Međutim, drugi dozni režimi mogu biti korisni i ovde nisu isključeni. Željena doza može biti dopremljena pojedinačnom bolus primenom, višestrukim bolus primenama, ili primenom kontinuirane infuzije antitela, zavisno od obrasca farmakokinetičkog razlaganja koji onaj koji primenjuje želi da postigne.

[0107] Ove predložene količine antitela podložne su u velikoj meri terapijskoj diskreciji. Ključni faktor u izboru odgovarajuće doze i režima je dobijeni rezultat. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se leči, određenog sisara koji se tretira, kliničkog stanja individualnog pacijenta, uzroka poremećaja, mesta dopremanja antitela, naročitog tipa antitela, postupka primene, režima primene, i drugih faktora poznatih lekarima.

[0108] Terapijski agensi pronalaska mogu biti zamrznuti ili liofilizovani za skladištenje i rekonstituisani u pogodnom sterilnom nosaču pre upotrebe. Liofilizacija i rekonstitucija može voditi do različitih stepena gubitka aktivnosti antitela. Možda će biti potrebno podešavanje doze da bi se izvršila kompenzacija. Generalno, pH između 6 i 8 je poželjna.

Proizvodni artikal

[0109] U drugom primeru izvođenja pronalaska, obezbeđen je proizvodni artikal koji sadrži materijale korisne za tretman ili prevenciju poremećaja ili stanja koji su prethodno opisani. Proizvodni artikal sadrži spremište i oznaku. Pogodna spremišta uključuju, na primer, boce, vijalice, špriceve, i epruvete. Spremišta se mogu formirati od različitih materijala kao što je staklo ili plastika. Spremište sadrži kompoziciju pronalaska koja je efikasna za prevenciju ili tretman poremećaja i stanja i može imati steilno pristupno mesto (na primer spremište može sadržati kesu sa intravenskim rastvorom ili vijalicu sa čepom koji se može probušiti iglom potkožne injekcije). Aktivni agens u kompoziciji je anti-miostatin antitelo pronalaska. Oznaka na, ili povezana sa, spremištem označava da se kompozicija koristi za tretman stanja po izboru. Proizvodni artikal može dalje sadržati drugo spremište koje sadrži farmaceutski prihvatljivi pufer, kao što je fosfatno puferovani slani rastvor, Ringer-ov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje uključivati druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve, i umetke za paket sa uputstvima za upotrebu.

[0110] Sledeći primeri su ponuđeni samo u svrhu ilustracije, i nije nameravano da ograničavaju obim pronalaska na bilo koji način.

PRIMERI

Primer 1: ELISA test

A. Miostatin i GDF-11 obložene ploče

[0111] Mišji/humani himerni anti-miostatin Fabs ovog pronalaska testirani su u ELISA testu, u kome je mereno vezivanje Fab za zreli miostatin (dimerni oblik) obložen sa različitim koncentracijama na 96-komorno ploči. Takođe je testirano vezivanje Fabs za GDF-11.

[0112] Svaka komorica od dve 96-komorne ploče je obložena sa 50 µl rekombinantnog humanog miostatina (R&D systems, bez nosača, prvo resuspendovano u 4 mM HCl i zatim obloženo sa 1 µg/ml u karbonatnom puferu, pH 9.6) ili 50 µl rekombinantnog humanog GDF-11 (Peprotech, Inc., Cat. # 120-11, bez nosača, prvo resuspendovano u 4 mM HCl i zatim obloženo sa 1 µg/ml u karbonatnom puferu, pH 9.6). Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Komorice su aspirirane i dva puta isprane sa PBST (PBS 0.1% Tween-20). Ploče su blokirane sa 200 µl blokirajućeg pufera po komorici (1% BSA u PBST 1 čas).

[0113] Fabs iz periplazmаtskih ekstrakata za testiranje serijski su razblaženi u PBST. Dodato je pedeset mikrolitara svakog Fab rastvora u GDF-8 i GDF-11 obložene kolone ploča. Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Komorice su zatim oprane 3 puta sa PBST.

[0114] Sekundarno antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom (50 µl kozje anti-mišje kapa AP (Southern Biotech), razblaženo 1:1000 u PBST) dodato je u svaku komoricu i inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi. Komorice su zatim isprane 3 puta sa PBST. Dodato je pedeset mikrolitara hromogenog supstrata (AMP/PMP) u svaku komoricu i dozvoljeno je da se razvije na sobnoj temperaturi. Apsorbanca komorica očitavana je na OD od 560 nm. Za svaki Fab titraciona kriva je je dobijena i relativna OD na srednjoj tački referentne Fab krive je registrovana.

[0115] Ovi podaci pokazuju da se sva testirana Fabs vezuju za humani zreli miostatin vezan za ploču sa unakrsnom reaktivnošću sa GDF11.

B. ELISA sa zarobljavanjem Fab

[0116] 96-komorna ploča je obložena sa 50 µl kozjeg-anti-humanog kapa antitela sa 2 µg po ml u karbonantnom puferu. Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Komorice su aspirirane i dva puta isprane sa PBST (PBS 0.1% Tween-20). Ploče su blokirane sa 200 µl blokirajućeg pufera po komorici (1% BSA u PBST 1 čas).

[0117] Fabs iz periplazmatskih ekstrakata za testiranje zarobljeni su na kolonama 2 časa na 37°C. Nakon ispiranja 3 puta sa PBST, dodato je 50 µl dvostrukih serijskih razblaženja biotinilovanog Miostatina (od 100 nM do 780 pM) svakoj koloni zarobljenih Fabs i inkubirano je 1 čas na 37°C. Ploča je zatim isprana sa PBST i inkubirana sa PBST na 37 stepeni C 1-3 časova.

[0118] Svakoj komorici dodat je Neutravidin konjugovan sa alkalnom fosfatazom (Pierce, razblažen 1:1000 u PBST) i inkubirano je 2 minuta na sobnoj temperaturi. Komorice su zatim isprane 3 puta sa PBST. Svakoj komorici je dodato 50 µl hromogenog supstrata (AMP/PMP) i dozvoljen je razvoj na sobnoj temperaturi. Apsorbanca komorica očitavana je na OD od 560 nm. Relativna OD poređena je sa maksimalnom OD koja je registrovana za referentni Fab.

[0119] Svi testirani Fabs pronalaska vezuju rastvorljivi humani zreli miostatin.

Primer 2 Test neutralizacije miostatina

[0120] Ektodermalni eksplanti uklonjeni su sa stadijuma 8-9 blastule embriona Xenopus standardnim procedurama i kultivisani su u 0.5X MBS (1X MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES, 2.5 mM NaHCO3, 1:1000 zapr./zapr. gentamicina, 0.1% goveđi serum albumin) sa dodatkom faktora rasta (GDF8 ili GDF11) plus ili indikovanim, u toku 18 časova na 18°C, za koje vreme kontrolni embrioni dostižu stadijum rane neurule (stadijum 15-16). Eksplanti su fotografisani i merena je dužina svakog eksplanta korišćenjem algoritma za analizu slike dizajniranog za kvantifikaciju animalnog pola. Eksplanti koji nisu tretirani ni sa faktorom rasta ni sa Fab (kontrole), sklupčavaju se u lopte epidermisa. Miostatin i GDF-11 indukuju mezoderm u ovim ektodermalnim eksplantima što izaziva izduživanje eksplanata i formiranje struktura sličnih tegu. Antitela ili Fabs, kada su testirana u odnosu na neutralizujuću aktivnost, dodata su u medijum kulture koji sadrži miostatin tokom celog trajanja perioda kultivacije i procenjena je njihova sposobnost da inhibiraju elongacione pokrete izazvane faktorom rasta. Miostatin je dodat eksplantima sa 25 ng/ml. Antitela ili Fabs koja se testiraju dodata su sa 20 µg/ml. Fab generisan za irelevantni antigen korišćen je kao kontrola. Komercijalno dostupno monoklonalno anti-mišje GDF8 antitelo može se testirati kao kontrola, ovo antitelo je stvoreno u kozama imunizovanim sa prečišćenim mišjim GDF8 i od strane proizvođača je pokazano da neutralizuje elongaciju animalnog pola Xenopus izazvanu sa 25 ng/ml mišjeg GDF8 kada je prisutno sa 10-20 µg/ml (R&D Systems Cat. #MAB788).

[0121] ImagePro (v4.5.1.22, od Media Cybernetics) je korišćen za obradu slika. Napisan je makro za automatizaciju obrade slika. Makro obrađuje slike i registruje dužine u jedinicama bitova. Mogu se koristiti alternativni postupci merenja kao što je poznato u tehnici. Predviđeno je da antitela pronalaska neutrališu GDF8 aktivnost u testu za animalni pol.

Primer 3: Merenje afiniteta Fabs

[0122] Afinitet (KD) i koni koffstope anti-miostatin Fabs ovog pronalaska mereni su korišćenjem BIAcore® 2000 instrumenta koji sadrži CM4 senzorni čip. BIAcore® koristi optičke karakteristike površinske plazmon rezonance da bi se detektovale izmene u koncentraciji proteina molekula u interakciji unutar dekstran biosenzornog matriksa. Izuzev gde je naznačeno, svi reagensi i materijali kupljeni su od BIAcore® AB (Upsala, Sweden). Sva merenja su izvedena na 25°C. Uzorci koji sadrže Fabs rastvoreni su u HBS-EP puferu (150 mM natrijum hlorid, 3 mM EDTA, 0.05% (tež./zapr.) surfaktant P-20, i 10 mM HEPES, pH 7.4). Miostatin ili GDF-1 (R&D Systems) imobilisan je na protočnim ćelijama CM4 čipa koristeći hemiju kuplovanja amina. Protočne ćelije (1-4) aktivirane su sa 1:1 smešom 0.1 M N-hidroksisukcinimida i 0.1 M 3-(N,N-dimetilamino)propil-N-etilkarbodiimida na stopi protoka od 20 µl/min. Miostatin ili GDF-11 (2.5 µg/mL u 10 mM natrijum acetatu, pH 4.5) je manuelno injektiran preko pojedinačnih protočnih ćelija sa stopom protoka od 10 µL/min. Površinska gustina je praćena do postizanja površinske gustine u svakoj ćeliji od ~150 responsivnih jedinica (RU). Površine su blokirane sa 50 µl injekcijom 1 M etanolamin-HCl, pH 8.5 (10 µL/min). Da bi se osiguralo potpuno uklanjanje celokupnog nekovalentno vezanog miostatina ili GDF-11, dva puta je injektirano 15 µl 10 mM glicina, pH 1.5. Tekući pufer korišćen za kinetičke eksperimente sadržao je 10 mM HEPES, pH 7.4,150 mM NaCl, 0.005% P20.

[0123] Prikupljanje kinetičkih podataka vezivanja izvedeno je na maksimalnoj stopi protoka (100 µl/min). Svaki ciklus analize sastojao se od (i) 250 µl injekcije Fab (opseg koncentracije od 50 nM do 0.4 nM u dvostrukim inkrementima razblaženja) preko sve 4 protočne ćelije sa protočnom ćelijom 1 kao referentnom protočnom ćelijom, (ii) 20 min disocijacije (protočni pufer), (iii) regeneracija GDF-8 ili GDF- 11 površine sa dve 15 µl injekcije 10 mM glicina, pH 1.5, (iv) 15 µl blanko injekcije tekućeg pufera, i (v) 2 min stabilizacionog vremena pre početka sledećeg ciklusa. Signal je praćen kao protočna ćelija 2 minus protočna ćelija 1, protočna ćelija 3 minus protočna ćelija 1 i protočna ćelija 4 minus protočna ćelija 1. Uzorci i blanko pufer injektirani su u duplikatu po slučajnom redosledu. Podaci su obrađivani sa SCRUBBER (Center for Biomolecular Interaction Analysis, Univ. of Utah) programom. Stope asocijacije i disocijacije za svaki ciklus određeni su fitovanjem korišćenjem biosensornih podataka u jednostavnom modelu asocijacije korišćenjem ClampXP (Center for Biomolecular Interaction Analysis, Univ. of Utah) da bi se ekstrahovale konstante koni koffstopa; ravnotežna konstanta vezivanja Kdizračunata je korišćenjem odnosa Kd= koff/kon. Fabs 41-1 i 412-6, kada su merene u prethodnom testu, imaju afinitet za GDF-8 od 4.16 nM (4.16 x 10<-9>M) i 0.46 nM (4.6 x 10<-10>M) respektivno, i imaju afinitete za GDF-11 od 8.96 nM i 0.81 nM respektivno; relativna specifičnost za oba Fabs bila je oko dvostruke preference za GDF-8 u odnosu na GDF-11. (Tabela 2).

Tabela 2

Primer 4: Merenje afiniteta Mabs

[0124] Merenje afiniteta vezivanja monoklonalnog antitela pronalaska pune dužine određena su korišćenjem Sapidyne KINEXA testa. NHS-aktivirane kuglice sefaroze sa brzim protokom (GE Healthcare) prethodno su obložene sa antitelom pronalaska (50 µg anti-miostatin antitelo po ml kuglica) i blokirane sa 10 mg/ml BSA u 1 M Tris-HCl, pH 8.0. Zatim je 2 pM, 4 pM, 40 pM antitela pronalaska (npr., 3-74/C1E4) inkubirano sa različitim koncentracijama (npr., 2.4 pM do 10 nM, serijska razblaženja) miostatina u tekućem puferu (PBS, 0.005% (zapr./zapr.) Tween-20 i 1 mg/ml ovalbumina) 10 časova na sobnoj temperaturi. Da bi se odredilo slobodno antitelo prisutno u ravnoteži, svaki uzorak je propušten kroz miostatinobložene kuglice. Količina antitela vezana za kuglice je zatim kvantifikovana propuštanjem rastvora fluorescentno (Cy5) obeleženog kozjeg anti-humanog Fc antitela (Jackson Immuno Research) razblaženog 1:4000 u tekućem puferu preko kuglica. Mereni fluorescentni signal je proporcionalan koncentraciji slobodnog antitela u ravnoteži. Svaka koncentracija miostatina merena je u duplikatu. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) dobijena je ne-linearnom regresijom kriva kompeticije korišćenjem višestruke krive, homogenog modela vezivanja za jedno mesto (KINEXA program).

[0125] Konstanta stope asocijacije (kon) za vezivanje GDF-8 takođe je određena korišćenjem Sapidyne KINEXA testa. Dva pM antitela pomešano je sa 20 pM GDF-8 korišćenjem istih uslova kao što je prethodno navedeno. U različitim vremenima, uzorci su testirani na slobodno antitelo korišćenjem uslova prethodno navedenih za ravnotežno vezivanje, a zatim je rezltujuća zavisnost od vremena fitovana korišćenjem KINEXA programa da bi se odredila stopa asocijacije (kon). Konstanta stope disocijacije (koff) izračunata je korišćenjem izraza koff= KD x kon. Monoklonalno antitelo 3-74/C1E4 pune dužine (operativno vezano sa IgG4Fc regionom) mereno je korišćenjem opisanog testa, dobijeni rezultati su navedeni ispod u Tabeli 3.

Tabela 3

Primer 5 Miostatin/SBE Reporter test

[0126] U ovom reporter testu, plazmid koji kodira reporter gen, tj., gen luciferaze, nishodno od SMAD vezujućeg elementa ("SBE"), specifičnije (CAGA)12, eksprimira protein luciferazu kada se molekul kao što je miostatin, GDF- 11, ili drugi član TGF-β superfamilije veže za svoj receptor, čime se okida SMAD signalizacija koja rezultuje u fosforilovanom SMAD kompleksu koji je sposoban da veže SBE. Prethodno je objavljeno da je CAGA sekvenca TGF-β responsivna sekvenca unutar promotora TGF-β indukovanog gena PAI-1 (Denner et al., EMBO J., 17:3091-3100, 1998). Količina aktivnog miostatina izložena ćelijama je direktno proporcionalna količini stvorenog enzima luciferaze koja je direktno proporcionalna količini svetlosti koja se stvara i koja se može meriti. Prisustvo inhibitora (npr., antitelo koje vezuje miostatin) smanjuje količinu miostatina koji može aktivirati SBE što u krajnjem slučaju rezultuje u smanjenom stvaranju svetlosti. Ovaj test je takođe opisan u međunarodnoj objavi broj WO 2004/037861.

[0127] Predviđeno je da Miostatin/SBE Reporter test nije ograničen za egzaktne ovde opisane uslove, drugi tipovi ćelija se mogu koristiti, npr., 293HEK (ATCC) ili A204 ćelije rabdomiosarkoma (videti, npr., Whittemore, et al. BBRC, 200:965-7.1, 2003); drugi tipovi reportera se mogu koristiti, npr., CAT, β-gal, GFP, i mogu se koristiti drugi uslovi za rast i test uslovi uključujući variranje količine miostatina u reakciji. Stručnjak će lako uočiti ukoliko je neki test unutar obima miostatin/SBE reporter testa jer bi imao vektor koji sadrži SBE element ushodno od reporter gena introdukovanog u ćeliju domaćina, gde korišćeni SBE element odgovara na SMAD proizveden kao odgovor na vezivanje miostatina za miostatin receptor. R.S. Thies, et al., Growth Factors, 18:251-259, 2001, opisuje sličan test dok, Wittemore, L. et al., BBRC, 300:965-971, 2003 opisuje odgovor SBE elementa na SMAD proizveden kao odgovor na vezivanje miostatina za njegov receptor.

[0128] U testu, 293E ćelije (Edge Biosystems) u T-75 boci gajene su u DMEM/F12 medijumu (1:1) (Gibco 10565-042) i 10% FBS. Ćelije su transficirane sa smešom 100 µl lipofektamin 2000 (Invitrogen 11668-019), 5 ml OptiMEM I (Gibco 51985-034) i 30 µg SB-luciferaza DNK 4 časa na 37°C. Smeša za transfekciju je zatim uklonjena i kompletan medijum je dodat u toku 1 časa na 37°C. Ćelije su zatim tripsinizovane i resuspendovane u kompletnom medijumu sa 2 x 10<6>ćelija/ml i 50 µl je postavljeno u svaku komoricu Biocoat 96-komorne ploče (BD 35-6461) i inkubirane 1 čas na 37°C. Nakon što je inkubacija završena, medijum je zamenjen sa 100 µl svakog Fab koje se testira koje je serijski razblaženo 1:2 i pre-inkubirano 1 čas na 37°C sa 1:1 rastvorom 40 ng/ml miostatina (R&D Systems 788-G8) ili GDF-11 (R&D Systems) u kompletnom medijumu.

[0129] Ploča je ostavljena preko noći na 37°C, 5% CO2i sledećeg dana je dodato 100 µl 1:1 smeše Glo Lysis Buffer i Bright-Glo Luciferase reagent (Promega) u svaku komoricu i pomešano pipetiranjem. Iz ove smeše, 150 µl je preneto na belu 96-komornu ploču i luminescencija je merena korišćenjem luminometra. Luminescencija je zatim plotovana na Fab koncentraciju i izračunata je IC50za svaki Fab za miostatin i GDF-11.

[0130] Testirani Fabs korišćenjem prethodno opisanih uslova daju IC50vrednosti navedene ispod u Tabeli 4.

Tabela 4

Primer 6 Farmakokinetika

[0131] Farmakokinetika (PK) antitela pronalaska može se proceniti kod C57B6/SCID miševa na dozi od 1 mg/kg nakon jedne intravenske (IV) ili intraperitonealne (IP) primene. Životinje primaju smešu neobeleženih i<125>I-obeleženih antitela sa prethodno opisanom dozom i koncentracija u serumu je određena na osnovu<125>I radioaktivnosti u serumu i specifične aktivnosti injektirane doze. Plotovana je koncentracija antitela u serumu primenjenih bilo IV ili IP nasuprot vremenu.

Primer 7 In vivo efekat na masu i snagu mišića

[0132] Da bi se odredilo da li antitelo pronalaska blokira aktivnost miostatina in vivo, antitelo pronalaska može se testirati kod adultnih SCID miševa. SCID miševi pate od teške kombinovane imunodeficijencije, i stoga ne stvaraju imunološku reakciju nakon injekcije antitela pronalaska. Mišićna masa je korišćena kao indikator za aktivnost miostatina kod miševa tretiranih sa antitelom pronalaska.

[0133] Ženkama SCID/CB17 miševa (Taconic Biotechnology) merena je težina i raspoređene su u grupe po deset. Antitelo pronalaska (41C1E4) u PBS puferu je injektirano subkutano u miševe sa različitim dozama (10, 5, i 2 mg/kg) na dane 0 i 7. U kontrolnoj grupi, IgG sa 10 mg/kg je injektiran potkožno u miševe na dane 0 i 7. Na dan 14, snaga mišića, snaga prednjih udova, merena je sa test metrom koji meri snagu hvatanja (npr., model 1027 csx, Columbus Instruments). Životinje su terminirane i mišićna masa je procenjena nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR). Vlažna težina mišića gastroknemijusa i kvadricepsa su takođe merene kao i telesna težina. Rezultati, srednje vrednosti i standardne greške za različite parametre, prikazane su ispod u Tabeli 5. Podaci su transformisani postupkom Box Cox transformacije da bi se normalizovali podaci. Ekstremne vrednosti za svaki parametar identifikovane su statitičkim načinima sa JMP 5.1 programom (SAS, Inc.) i isključene su iz seta podataka. Statistička značajnost je određena sa ANOVA i Studentovim t-testom. p vrednost manja od 0.05 smatrana je značajnom. Antitelo testirano sa 5 mg/kg i 10 mg/kg rezultuje u statistički značajnim rezultatima u odnosu na kontrolnu IgG grupu za sve testirrane parametre. Antitelo testirano sa 2 mg/kg rezultuje u statistički značajnim rezultatima u odnosu na kontrolnu IgG grupu za parametre NMR mišića, vlažnu težinu mišića kvadricepsa i vlažnu težinu mišića gastroknemijusa.

Tabela 5

LISTING SEKVENCI

<212> PRT

<400> 6

<400> 8

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<220>

<212> PRT

<223> Sintetički konstrukt

<211> 17

<220>

<400> 81

<211> 108

<210> 88

<212> PRT

<213> Homo sapiens

Claims

Patentni zahtevi

1. Miostatin antitelo koje sadrži polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 123 i polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 98.

2. Miostatin antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što antitelo dalje sadrži konstantni region teškog lanca izabran od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM i IgD.

3. Miostatin antitelo prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što konstantni region prisutan u antitelu potiče iz genoma životinje izbarane od domaćih životinja, sportskih životinja i životinja koje su izvor hrane.

4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3.

5. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 4 koja dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

6. Miostatin antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 ili farmaceutska kompozicija prema patentom zahtevu 4 ili patentnom zahtevu 5 za upotrebu kao medikament.

7. Miostatin antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 4 ili patentnom zahtevu 5 za korišćenje u tretmanu ili prevenciji jednog ili više stanja izabranih od slabosti, kaheksije, gubitka mišića, slabosti mišića, miopatije, mišićne distrofije, osteoporoze, COPD, insuficijencije ili bolesti bubrega, insuficijencije ili bolesti jetre, insuficijencije srca, dijabetesa tipa II ili metaboličkog sindroma.