RS56773B1

RS56773B1 - Dvojna bipartitna funkcionalna komplementacija izazvana antigenom

Info

Publication number: RS56773B1
Application number: RS20171357A
Authority: RS
Inventors: Gernot Stuhler
Original assignee: Univ Wuerzburg J Maximilians
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2013-01-14
Publication date: 2018-04-30
Also published as: CA2861003A1; EA201400811A1; IL233566B; EP2802607B1; AU2013208895B2; US20150079093A1; JP6408915B2; HUE035207T2; CA2861003C; EP2802607A2; NO2802607T3; EP3907241A1; DK2802607T3; SG11201403997SA; SI2802607T1; MX2014008468A; CY1119928T1; CN108034006A; HRP20171912T1; JP2015505319A

Description

Predmetni pronalazak se odnosi na set polipeptida i njegovu upotrebu. Posebno predmetni pronalazak se odnosi na set polipeptida pri čemu ovaj set sadrži dva polipeptida od kojih svaki sadrži ciljajuću grupu „T“ koja se vezuje za antigen „A“ i fragment „F“ funkcionalnog domena, gde dva data polipeptida nisu povezana jedan sa drugim u odsustvu supstrata koji ima „A“ na svojoj površini i gde, posle dimerizacije „F“-a, dobijeni dimer postaje funkcionalan. Osim toga, opisane su medicinske i dijagnostičke upotrebe datog seta. Štaviše, predmetni pronalazak se odnosi na molekul (molekule) nukleinske kiseline koji kodira dati set polipeptida. Predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na vektor koji sadrži nukleotidne sekvence molekula nukleinske kiseline koji kodira dati set polipetida. Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutske preparate koji sadrže dati set polipeptida. Osim toga, predmetni pronalazak se odnosi na komplet koji sadrži dati set polipeptida.

Poslednjih godina pojavio se znatan broj važnih članaka koji objavljuju izvanrednu efikasnost konstrukta bispecifičnih antitela za imunoterapiju tumora in vitro i u prekliničkim i ranim kliničkim ispitivanjima. Danas, dostupan je značajan broj različitih specifičnih konstrukata koji se razlikuju po veličini, sastavu, farmakokinetici i sposobnosti da direktno eliminišu neoplastične ćelije ili angažuju imunske efektorske ćelije za lizu ćelija tumora.

Strategije imunoterapije kancera (raka) bazirane na antitelima su terapijske opcije koje vrlo mnogo obećavaju zbog njihove izvanredne osetljivosti i specifičnosti prema ciljanim strukturama.

Modularna strukturna i funkcionalna organizacija antitela omogućavaju ekstenzivnu manipulaciju genetskim inžinjeringom. Različiti imunoglobulinu slični domeni se mogu izdvojiti i/ili povezati a da se pritom ne izgube specifične sa domenom povezane funkcionalne osobine. Štaviše, one se mogu kombinovati i povezati sa heterologim domenima proteina ali, takođe, i sa nepeptidnim grupama. Moguće je, prema tome, razviti fuzione konstrukte i na racionalan način izbeći ograničenja konvencionalnih antitela. .

Fuzioni proteini zasnovani na antitelima mogu se stvoriti sa novim biološkim i/ili farmaceutskim osobinama. Postoje napori koji obećavaju da se modifikuje sposobnost Fc domena da izazove ADCC (od engl. antibody dependent cell mediated cytotoxicity, ćelijska citotoksičnost posredovana antitelima) i CDC (od engl. complement-dependent cytotoxicity, citooksičnost koja zavisi od komplementa) mutagenezom, u zavisnosti od namene primene, bilo da se smanje nuspojave (inhibitorske mutacije) ili da se pojača terapijska efikasnost (aktivacione mutacije). Nove primene koje su postale moguće genetskim inžinjeringom mogu još više varirati kad se uzmu u obzir antiigen vezujući domen antitela

Varijabilni domeni teškog (VH) i lakog lanca (VL) antitela koji prepoznaju antigen mogu se genetskim inžinjeringom povezati peptidnom spojnicom čuvajući u isto vreme sposobnost vezivanja antigena. Takvi antigen-vezujući varijabilni fragmenti jednog lanca (scFvs) mogu se upotrebiti kao mali surogati antitela sa velikom sposobnošću prodiranja u tkivo i malim vremenom retencije seruma za procedure kliničke dijagnostike i radioterapiju i druge primene. Značajno je što se ove scFv grupe mogu lako upotrebiti kao antigen specifični moduli u razvoju novih rekombinantnih lekova.

Novi izveštaji ukazuju na ogromni potencijal rekombinantnih bispecifičnih antitela u antitumorskoj terapiji. Takva bispecifična antitela prepoznaju dva antigena, jedan od njih je eksprimiran tumorom, dok je drugi obično nađen u imunskoj ćeliji. Većina bispecifičnih antitela u antitumorskoj terapiji cilja tumorski linijski marker sa jedne strane i CD3ε, invarijantni molekul kompleksa T-ćelijski receptor/CD3 sa druge strane, na taj način angažujući T-ćelije da unište tumor [Müller i Kontermann, Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: Current perspectives. BioDrugs 2010, 24(2):89-98].

Uprkos ekstenzivnim mogućnostima za manipulaciju strukture i funkcije antitela, terapijska efikasnost takvih na antitelu zasnovanih reagenasa je ograničena prirodom antitela o kome se radi, pristupačnosti antigena tumoru i tkivu povezanim sa tumorom i sposobnosti antitela da izazove ili posreduje u željenoj funkciji izazivanja smrti ćelije.

Na primer, kad se pacijenti lečeni bispecifičnim konstruktom usmerenim prema antigenima koji su, takođe, eksprimirani na tkivima sa vitalnim funkcijama, primećene su ozbiljne nuspojave. To je ozbiljan problem, pošto, sa izuzetkom nepoznatog broja pojedinačno mutiranih molekula površine ćelije i receptora monoklonalnih B- ili T- ćelija u slučaju limfoma, tumor specifični antigeni koji razlikuju transformiranu ćeliju od njenog zdravog progenitora nisu dostupni.

Kako se terapijski koncepti zasnovani na upotrebi bispecifičnih antitela obično odnose na angažovanje efektorskih ćelija, dešava se da što je efikasnije sredstvo (bispecifični konstrukt), to je verovatnije da će nastati nuspojave, i čak mala ekspresija antigena na netransformisanom tkivu može da izazove efekte van okvira cilja, koji se ne mogu kontrolisati.

U 2008, SCIENCE je publikovao prvi izveštaj o kliničkoj efikasnosti jednolančanog bispecifičnog antitela koje angažuje T ćelije (BiTE) MT103/blinatumomab; on izaziva remisiju kod oko 80% pacijenata sa limfomom koji imaju relaps ili su refraktorni na standardnu imunohemoterapiju na nivoima seruma od oko 5 redova veličine manjim od nivoa seruma objavljenim za monoklonalno antitelo rituksimab (Bargou, R. et al Science 321, 974-977, 2008). Ova publikacija i kasniji izveštaji o konfirmatornoj fazi II ispitivanja u akutnoj limfoblastnoj leukemiji (ALL) najavili su novu eru bispecifičnih antitela, do tada u teškoj demisiji tokom skoro dve dekade zbog sistemske toksičnosti i male ili odsustva terapijske aktivnosti. U velikoj meri pri pojavi ovog SCIENCE članka, bispecifična antitela su ponovo postala polje koje se razvija i u kome je nabrojano više od 35 različitih formata (Reichert, Drug Discov Today. 17 (2012) 954-963). Ovi formati se razlikuju u veličini i optimizovani su u odnosu na afinitet za antigen, stabilnost, sposobnost da angažuju efektorske ćelije (uglavnom T ćelije) i farmakokinetiku. Afinitet ili funkcinalni afinitet kunstrukta su podešeni sazrevanjem afiniteta koristeći različite tehnike ili jednostavno povezivanjem višestrukih scFv domena u liniju da bi se kreirao multivalentni konstrukt. Objavljena su čak tri-specifična antitela dizajnirana da pokažu pojačane sposobnosti vezivanja usmeravanjem na dva umesto na jedan ciljani molekul. Stabilnost formata može biti optimizovana dodavanjem imunoglobulinu sličnih domena da bi se imitirala antitela koja se javljaju u prirodi i da se istovremeno pojačaju farmakokinetičke osobine kao što je produženi poluživot u serumu i zaštita od proteolitičke digestije proteazama. Osim toga, stabilnost formata se može pojačati optimizacijom proizvodnje. Pošto sekvence spojnica upotrebljene da kovalentno vežu scFv domene često dovode do agregata, uspostavljene su linije proizvodnje koje prvo proizvedu dva ili tri polipeptida koja se mogu lako ponovo okupiti kako bi se kreirao funkcionalni lek. Takve tehnike koriste usmerene disulfidne mostove ili umrežavajuće reagense da kovalentno vežu dva različita polipeptida. Druge tehnike koriste hetero- ili homo-dimerizaciju domena kao što su domeni leucinskog zatvarača, Fc-domeni i drugi kao što su „knob into hole“ tehnologije (videti, na primer, WO 2007/062466). Štaviše, interakcije VHi VL, koje se mogi stabilizovati vezivanjem antigena, upotrebljene su u takozvanim „open-sandwich“ imunotestovima za detekciju antigena (Ueda, Nature Biotechnology 14 (1996), 1714-1718; Ohmuro-Matsuyama (2012) Detection of Protein Phosphorylation by Open-Sandwich Immunoassay, Integrative Proteomics, Dr. Hon-Chiu Leung (Ed.), ISBN: 978-953-51-0070-6; WO 2004/016782/EP-A1 1536005.)

Međutim, bi/tri-specifični i bi- ili multivalentni konstrukti opisani u tehnici imaju nedostatke. Prvo, odsustvo zaista specifičnih antigena tumora koji se mogu označiti kao ciljani molekul. Ustvari, što je potentniji format bispecifičnog antitela, toliko su ozbiljnija kolateralna oštećenja, zato što do sada označeni ciljani antigeni su diferencijacioni antigeni koje dele tumori i ćelije koje nisu maligne. Kao posledica, bi- ili tri-specifični formati prethodne tehnike ne mogu da razlikuju maligne ćeljie od ćelija koje nisu maligne. U tom pogledu, tri-specifični konstrukti, razvijeni zbog funkcionalnog afiniteta vezivanja za ciljane ćelije, mogu uspostaviti visoki stepen efekata van mete zato što je vezivanje jednog ciljanog molekula u opštem slučaju dovoljno da angažuje imunske ćelije za destrukciju ćelije koja eksprimira bilo koji ciljani molekul. Prema tome, tri-specifićni konstrukt pojačava funckionalni afinitet na račun specifičnosti. Skorašnje multiparametarske analize ukazuju da se ćelije tumora mogu razlikovati od njihovih odgovarajućih izvornih netransformisanih tkiva zbog ekspresije aberantnih signatura antigena. Danas, ovi nalazi čine integralni deo klasifikacionog sistema hematopetskih neoplazmi Svetske zdravstvene organizacije (WHO), i takođe važe za rak i matične ćelije raka ili ćelije koje izazivaju rak drugog porekla. Prema tome, bilo bi povoljno za ciljane ćelije da istovremeno eksprimiraju kombinaciju antigena koji zajedno označavaju maligno stanje. Nijedno od antitela opisano u prethodnoj tehnici nije sposobno da razlikuje ćelije koje eksprimiraju kombinaciju ciljanih antigena od pojedinačnih antigen pozitivnih ćelija.. Drugo, glavni problem tehnologija bi-specifičnih antitela koje upotrebljavaju, na primer, kompletne CD3 module (tj. anti Cd3 scFv) je inherentna sposobnost ovih proteina da stimulišu ili prethodno stimulišu T ćelije bez obzira na vezivanje za ciljani antigen na ciljane ćelije i izgleda da su mnoge do sada primećene nuspojave povezane sa funkcijom lutajućihT ćelija.

Takođe, Demibodies™ kako su opisani u WO2007/062466 i kako su dati u internet citatu BIOLINK PARTNERS LTD (Bio-Link: Demibodies™: Dimerization-activated therapeutic antibodies; 2007; URL: http://www.biolink.org.au/library/File/Demibodies.pdf) mogli bi da dovedu do neželjene aktivnosti. Zbog njihovog tehničkog karaktera (tj. prisustva leucin zatvarača), par Demibodies™ može da gradi dimer čak i u odsustvu mete, tj. u odsustvu površine ćelije koja nosi oba antigena za koju se dva člana para Demibodies™ vezuju. Dakle, Demibodies™ mogu, takođe, da dovedu do neželjene aktivacije efektorskih funkcija koje će se primeniti. Slično, par FRET proba kako je opisano u WO2004/042404, takođe, bi mogao da dovede do lažne pozitivne aktivnosti. Svaki član takvog para proba sadrži antitelo vezano za biotin i fluorohrom (član FRET para). Kad je prisutan avidin, probe grade dimer i javlja se FRET signal. Opet, ovaj FRET signal mogao bi da se javi čak i u odsustvu mete para FRET proba koje nose dva antigena za koje se sadržana antitela vezuju. Isto se odnosi na GFP varijantom markirani par scFvs kako je opisan u Ohiro (ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, 74 22, 2002, 5786 - 5792) koji, takođe, koristi par leucin zatvarača. Prethodno opisane tehnologije, takođe, zahtevaju dodatne komponente (leucin zatvarače, biotin/avidin itd.) osim njihovih funkcionalnih domena.

Prema tome, u tehnici postoji potreba za specifičnijim opcijama lečenja u lečenju raka, naročito postoji potreba za pobošljanim načinima da se identifikuju i/ili eliminišu ćelije kancera (raka) sa većom specifičnošću i da se smanje nuspojave.

Slične potrebe postoje i na polju transplantacje alogenih matičnih ćelija, tj transplantacije pacijentu matičnih ćelija dobijenih od druge osobe. Pacijent koji pati od relapsirane ili refraktorne leukemije ili druge hematološke bolesti može biti lečen hemoterapijom/zračenjem (da bi se odstranile maligne hematopoetske ćelije) u kombinaciji sa transplantacijom zdravih hematopetskih ćelija donora. Ako je odstranjivanje malignih ćelija nepotpuno, tumor može ponovo da raste od preživelih malignih ćelija primaoca uprkos prisutvu zdravih ćelija dobijenih transplanatcijom. Kao rezultat, stope pereživljavanja među pacijentima koji su podvrgnuti lečenju tumora i alogenoj transplantacijii su značajno smanjene.

Međutim, teško je odstraniti (i, takođe, identifikovati) preživele maligne ćelije sa velikom specifičnošću, i stoga uprkos raznim naporima, dobra rešenja za ovaj problem nisu nađena. Prema tome, u tehnici postoji potreba za obezbeđivanjem poboljšanih načina da se speciifično identifikuju i/ili odstrane takve maligne ćelije primaoca sa minimalnim nuspojavama na drugim ćelijama.

Kalem (alogene matične ćelije), dat kratko posle terapije pripreme (zračenje/hemoterapija) može da zameni i rekonsituiše hematopoezu. Kalem je uzet ili iz koštane srži ili iz stimulisanih ćelija periferne krvi i sadrži oko jedan procenat hematopoetskih matičnih ćelija koje su izvor noovoizgrađenih ćelija krvi. Osim toga, kalem normalno sadrži ogroman broj imunskih ćelija, naročito T limfocita, koje su deo usvojenog imunskog sistema i to može biti vrlo korisno u slučaju kad te T ćelije povečavaju imunski napad protiv leukemijskih ćelija. Ova situacija je dobro opisana i poznata kao efekat kalem protiv leukemije. S druge strane, pogrešan imunski odgovor koji usmerava T ćelije protiv pacijenta, poznat kao oboljenje kalem protiv domaćina, takođe je često primećen.

Da bi se minimizirala bolest kalem protiv domaćina, kalemovi su obično izabrani na osnovu HLA (humani leukocitni antigen) ili MHC (glavni histokompatibilni kompleks). Što su više usklađeni antigeni donora i primaoca, toliko je manja verovatnoća ozbiljne bolesti kalem protiv domaćina. Međutim, za mnoge pacijente, potpuno odgovarajući kalem ne može biti nađen. U tim slučajevima, uptrebljavaju se koštana srž ili matične ćelije periferne krvi koje se razlikuju u jednom ili čak u više HLA molekula. Takve kliničke situacije zahtevaju striktni imunosupresivni režim posle transplantacije da bi se sistem T ćelija držao striktno pod kontrolom.

Prema tome, jedan cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi poboljšane načine da se specifično identifikuju i/ili odstrane specifične vrste ćelija. Osim toga, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi poboljšane načine da se specifično identifikuju i/ili odstrane ćelije koje imaju specifične kombinacije dva specifična antigena na svojoj površini. Dalje, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi poboljšane načine da se specifično identifikuju i/ili odstrane kancerozne ćelije. Osim toga, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi poboljšane načine da se specifično identifikuju i/ili odstrane ćelije koje (1) imaju određeno poreklo (tako što, u situaciji transplantacije tkiva ili ćelija, ćelije potiču od donora ili primaoca) i što (2) pripadaju specifičnom tipu ćelija ili ćelijskoj liniji (kao što su hetopoetske ćelije).

Ciljevi predmetnog pronalaska su rešeni setom polipeptida koji sadrže:

Prvi polipeptid P1 koji sadrži

(i) ciljajuću grupu T1, gde se ciljajuća grupa T1 specifično veže za antigen A1, i

(ii) fragment F1 funkcionalnog domena F, gde ni dati fragment F1 sam po sebi niti dati polipeptid P1 sam po sebi nije funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F, i

drugi polipeptid P2 koji sadrži

(i) ciljajuću grupu T2, gde se ciljajuća grupa T2 specifično veže za antigen A2, i (ii) fragment F2 funkcionalnog domena F, gde ni dati fragment F2 sam po sebi niti dati polipeptid P2 sam po sebi nije funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F, gde je dati antigen A1 različit od datog antigena A2, gde dati polipeptid P1 i dati polipeptid P2 nisu povezani jedan sa drugim u odsustvu ćelije koja ima oba antigena A1 i A2 u ili na svojoj površini, specifičnije ćelije koja nosi oba antigena A1 i A2 u ili na svojoj površina, i gde, posle dimerizacije datog fragmenta F1 datog polipeptida P1 sa datim fragmentom F2 datog polipeptida P2, dobijeni dimer je funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F, i gde dati fragment F1 sadrži VLdomen antitela i dati fragment F2 sadrži VHdomen istog antitela; ili gde navedni fragment F1 sadrži VHdomen antitela i dati fragment F2 sadrži VLdomen istog antitela.

Ovde su opisani sledeći elementi:

1. Set polipeptida koja sadrži:

Prvi polipeptid P1 koji sadrži

(i) ciljajuću grupu T1, gde se ciljajuća grupa T1 specifično vezuje za antigen A1, i (ii) fragment F1 funkcionalnog domena F, gde ni dati fragment F1 sam po sebi niti dati polipeptid P1 sam po sebi nije funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F,

i

drugi polipeptid P2 koji sadrži

(i) ciljajuću grupu T2, gde se ciljajuća grupa T2 specifično vezuje za antigen A2, i

(ii) fragment F2 funkcionalnog domena F, gde ni dati fragment F2 sam po sebi niti dati polipeptid P2 sam po sebi nije funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F,

gde je dati antigen A1 različit od datog antigena A2, gde dati polipeptid P1 i dati polipeptid P2 nisu povezani jedan sa drugim u odsustvu supstrata koji ima oba antigena A1 i A2 na svojoj površini, specifičnije ćelije koja nosi oba antigena A1 i A2 na svojoj površina, i pri čemu, posle dimerizacije datog fragmenta F1 datog polipeptida P1 sa datim fragmentom F2 datog polipeptida P2, dobijeni dimer je funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F.

2. Set polipeptida u skladu sa elementom 1, gde ćelija koja nosi oba anatigena A1 i A2 na svojoj površini izaziva dimerizaciju fragmenta F1 datog polipeptida P1 sa fragmentom F2 datog polipeptida P2, gde ćelija koja ne nosi oba antigena A1 i A2 na svojoj površini ne izaziva dimerizaciju fragmenta F1 datog polipeptida P1 sa fragmentom F2 datog polipeptida P2.

3. Set polipeptida u skladu sa elementom 1 ili 2, gde data ciljajuća grup T1 sadrži modul imunoglobulina, poželjno modul imunoglobulina I1 koji sadrži VLdomen vezan za VHdomen, poželjnije modul imunoglobulina I1 koji sadrži scFv (jednolančana varijanta fragmenta) antitela, ili modul imunoglobulina koji sadrži varijabilni domen VHH antitela lame, antitela kamile ili antitela ajkule, i/ili data ciljana grupa T2 sadrži modul imunoglobulina, poželjno modul imunoglobulina I2 koji sadrži VLdomen vezan za VHdomen, poželjnije modul imunoglobulina I2 koji sadrži scFv (jednolančana varijanta fragmenta ) antitela, ili modul imunoglobulina koji sadrži varijabilni domen VHH antitela lame, antitela kamile ili antitela ajkule, ili gde data ciljajuća grupa T1 i/ili data ciljajuća grupa T2 sadrži aptamer ili prirodni ligand datog antigena A1, odnosno antigena A2.

4. Set polipeptida u skladu sa bilo kojim od prethodnih elemenata, gde dati antigen A1i/ili dati antigen A2 je antigen eksprimiran na površini ćelije tumora ili na površini progenitorskih/prekursorskih ćelija tumora, poželjno antigen eksprimiran na površini ćelija hematološkog tumora ili antigen eksprimiran na površini ćelija nehematološkog tumora.

5. Set polipeptida u skladu sa bilo kojim od prethodnih elemenata, gde je kombinacija antigena A1 i antigena A2 nađena samo u kanceroznim ćelijama, i nije nađena u ćelijama koje nisu kancerozne, i gde je, poželjno, kombinacija antigena A1 i antigena A2 specifična za kancerozne ćelije određenog tipa kancera.

6. Set polipeptida u skladu sa bilo kojim od prethodnih elemenata, gde dati antigen A1 je MHC antigen, poželjno alelna varijanta bilo kog od HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR, ili HLA-DM, poželjnije alelna varijanta MHC klase I molekula, poželjnije alelna varijata izabrana iz grupe koja se sastoji od HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A25, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B35, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, i HLA-Cw7, i/ili dati antigen A2 je antigen koji je specifičan za određeni tip ćelije ili ćelijske linije

7. Set polipeptida u skladu sa bilo kojim od prethodnih elemenata, gde dati funkcionalni domen F je modul imunoglobulina, poželjno scFv (jednolančana varijanta fragmenta) antitela, ili fluorescentni molekul, poželjno GFP ili GFP varijanta, ili molekul sposoban da posreduje u bioluminescenciji, poželjno Gaussia luciferaza.

8. Set polipeptida u skladu sa bilo kojim od prethodnih elemenata, gde dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za molekul nosač, poželjno za molekul nosač koji je molekul peptida ili ugljenog hidrata, ili marker afiniteta, poželjno marker afiniteta izabran iz grupe koja se sastoji od FLAG-markera, myc-markera, markera glutation-S-transferaze (GST), markera hemaglutinin (HA), markera polihistidina (His) i markera koji vezuje maltozu (MBP).

9. Set polipeptida u skladu sa bilo kojim od prethodnih elemenata, gde dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za radioaktivno jedinjenje, domen koji se specifično vezuje za molekul toksina koji sam po sebi nije sposoban da prođe kroz ćelijsku membranu humane ćelije i koji je ubačen u humanu ćeliju posle povezivanja sa ćelijskom membranom date ćelije, domen koji se specifično vezuje za fluorescentni molekul, ili domen koji se specifično vezuje za molekul sposoban da posreduje u bioluminescenciji.

10. Set polipeptida u skladu sa bilo kojim od pethodnih lemenata, gde dati fragment F1 sadrži VLdomen antitela i dati fragment F2 sadrži VHdomen istog antitela, gde, poželjno, dato antitelo je anti-CD3 antitelo, i gde dati fragment F1 sadrži VHdomen antitela i dati fragment F2 sadrži VLdomen istog antitela, gde, poželjno, dato antitelo je anti-CD3 antitelo.

11. Set polipeptida u skladu sa bilo kojim od pethodnih elemenata za upotrebu u lečenju pacijenta koji boluje od tumora ili za dijagnostičku upotrebu kod pacijenta koji boluje od tumora, poželjno za upotrebu u lečenju pacijenta koji boluje od tumora i podvrgnut je transplantaciji alogenog tkiva ili ćelija ili treba da bude podvrgnut takvoj transplantaciji, ili za dijagnostičku upotrebu kod pacijenta koji boluje od tumora i podvrgnut je ili treba da bude podvrgnut transplantaciji alogenog tkiva ili ćelija, gde, poželjno, dati set polipeptida je primenjen kod datog pacijenta.

12. Molekul nukleinske kiseline ili grupa nukleinskih kiselina koje kodiraju grupu polipeptida ili jedan od polipeptida seta polipeptida u skladu sa bilo kojim od prethodnih elemenata.

13. Vektor koji sadrži sekvence nukleotida molekula nukleinske kiseline prema elementu 12 ili sekvencu jednog od molekula nukleinske kiseline grupe molekula nukleinske kiseline u skladu sa elementom 12.

14. Farmaceutski preparat koji sadrži ili grupu polipeptida u skladu sa bilo kojim od elemenata 1 do 11 ili molekul nukleinske kiseline/grupu molekula nukleinske kiseline u skladu sa elementom 12 ili vektor u skladu sa elementom 13, gde, poželjno, dati farmaceutski preparat dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Komplet koji sadrži grupu polipeptida u skladu sa bilo kojim od elemenata 1-11.

Poželjno, dati antigen A1 je molekul površine ćelije. Poželjno, dati antigen A2 je molekul površine ćelije. Poželjno, dati antigen A1 je specifičan za maligno stanje ćelije. Poželjno, dati antigen A2 je specifičan za određeni tip ćelije ili ćelijske linije ili za maligno stanje ćelije. Poželjno, dati antigen A1 je specifičan za tip maligne ćelije. Poželjno, dati antigen A2 je specifičan za tip maligne ćelije.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak odnosi se na set polipeptida kako je ovde definisano i opisano, gde je, međutim, antigen A1 isti kao antigen A2. Dakle, u takvom setu polipeptida P1 i P2, F1 fragment može biti vezan za ciljajuću grupu T1 i F2 fragment može biti vezan za ciljajuću grupu T2, pri čemu se oba T1 i T2 specifično vezuju za isti antigen. U tom kontekstu, epitop na antigenu A1, za koji se ciljajuća grupa T1 vezuje, može biti isti ili različiti epitop od epitopa na antigenu A2, za koji se vezuje ciljajuća grupa T2. U slučaju kad je epitop na antigenu A1 isti kao epitop na antigenu A2, polipeptid P1 može da sadrži grupu koja cilja koja je identična grupi koja cilja koja se nalazi u P2. Takođe je ovaj aspekt pronalaska zasnovan na pogodnosti što set polipeptida P1 i P2 sa razorenim F domenom ne ispoljava efekte van okvira cilja (na primer, nema prethodne aktivacije T ćelija koje ispoljavaju CD3, i, otuda, manje je toksičnih osobina i/ili nuspojava, na primer u poređenju sa konvencionalnim bispecifičnim antitelima).

U kontesktu pronalaska, dati fragment F1 i dati fragment F2 zajedno su dati funkcionalni domen F.

U jednoj realizaciji, dati polipeptid P1 i dati polipeptid P2 nisu kovalentno vezani jedan za drugog u odsustvu supstrata koji ima oba antigena A1 i A2 na svojoj površini, konkretno, ćelije koja nosi oba antigena A1 i A2 na svojoj površini.

U jednoj realizaciji, dati polipeptid P1 i dati polipeptid P2 nisu kovalentno vezani jedan za drugog.

Dati polipeptid P1 i polipeptid P2 i/ili, posebno, dati sadržani fragment F1 i fragment F2, posebno VHi VLkoje mogu sadržati, nisu povezani jedan sa drugim, posebno kad se daju subjektu kome je potrebna medicinska intervencija. tj., kome je potrebna terapija ili dijagnoza. Shodno tome, farmaceutska ili dijagnostička sredstva koja su ovde obezbeđena sadrže dva polipeptida P1 i P2 kako su sadržani u ovde definisanom „setu polipeptida“ u nepovezanom obliku. Povezivanje dva data polipeptida nastaje in vivo u prisustvu datog supstrata ili ćelije. U prisustvu datog supstrata ili ćelije, povezivanje dva data polipeptida može biti (dodatno) stabilizovano stabilizacionim sredstvom (na primer antigenom, sličnim, na primer, CD3, HIS ili DIG kako je ovde opisano). Poželjno, oni nisu povezani međusobno u odsustvu datog supstrata ili ćelije i/ili ne dimerizuju se u odsustvu navednog supstrata ili ćelije. Još poželjnije, oni nisu međusobno povezani u odsustvu datog supstrata ili ćelije i/ili ne dimerizuju se u odsusrvu datog supstrata ili ćelij, čak iako je prisutan agens koji stabilizuje povezivanje i/ili dimerizaciju polipeptida P1 i polipeptida P2 i/ili, posebno, fragmenta F1 i fragmenta F2, tj. čak iako su dati polipeptid P1 i polipeptid P2 i/ili, posebno, dati fragment F1 i fragment F2 prisutni u stabilizaciji agent/P1(F1)/P2(F2)-trimernog kompleka (na primer, u antigen/VH/VL-trimernom kompleksu).

U kontekstu pronalaska, dati polipeptid P1 i polipeptid P2 i/ili, posebno, u njima sadržani dati fragment F1 i fragment F2, posebnije VHi VLkoji mogu biti sadržani, povezuju se jedan sa drugim i/ili dimerizuju stvarajući trodelni kompleks, poželjno interakcijom posredovanom agensom koji stabilizuje povezivanje i/ili dimerizaciju polipeptida P1 i polipeptida P2 i/ili, posebno, fragmenta F1 i fragmenta F2 (na primer, antigen posredovanom interakcijom), pri čemu povezivanje i/ili dimerizacoja nastaje samo u prisusrvu datog supstrata ili ćelije.

Procenjuje se da je jačina afiniteta kojim se, na primer, leucinski zatvarači i/ili konstantni domeni, kao što je imunoglobulin CH3 ili Fc fragmenti, hetero- i homodimeruju određena konstanomi disocijacije KDu rasponu od ∼ 10<-8>do 10<-11>M (videti, na primer, Zhu (1997) Protein Sci.6, 781-8; Plückthun (1997) Immunotech.3, 83-105). Ovaj raspon KDje jasno ispod KDkojom, u odsustvu navedeog supstrata ili ćelije, može nastati povezivanje i/ili dimerizacija datih polipeptida P1 i P2, posebno datih fragmenata F1 i F2, ovog pronalaska. Prema tome, u jednoj realizaciji, polipeptid P1 i polipeptid P2 i/ili, posebno, fragment F1 i fragment F2 koji se u njima sadrže, posebnije VHi VLkoji se mogu u njima sadržati, povezuju se jedan sa drugim i/ili dimerizuju u odsustvu datog supstrata ili ćelije samo sa KDkoja je iznad KD, na primer, hetero- i homodimerizacije leucin-zatvarača i/ili konstantnih domena, kao što su imunoglobulin CH3 ili Fc fragmenti. U prisustvu datog supstrata ili ćelije, predviđeno je da se polipeptid P1 i polipeptid P2 i/ili, posebno u njima sadržani fragment F1 i fragment F2, posebnije VHi VLkoji se mogu sadržati u njima, povezuju međusobo i/ili dimerizuju sa KDkoja je u rasponu KD, na primer, hetero- i homodimerizacije leucin-zatvarača i/ili konstantnih domena, kao što su imunoglobulin CH3 ili Fc fragmenti, ili čak ispod tog raspona.

Jačina interakcije, na primer, izolovanih VH i VL domena u opštem slučaju je malog afiniteta. Upotrebom tehnika kalorimetrije, fluorimetrije li ultravioletne diferencijalne spektroskopije i/ili cirkularnog dihroizma, određene su konstantne disocijacije KDod 10<-9>do 10<-6>M (videti, na primer, Worn JMB (2001) 305, 989-1010; Plückthun (1992) Immunological Reviews No 130). Upotrebom tehnika rezonance plazmona (SPR biosensor BIAcore ili BIAcore 2000, Pharmacia) i sistema anti HEL-antitela (antitelo HyHEL-10 na lizozim kokošjeg jajeta), Ueda (loc. cit.) i Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.) nađeno je da izolovani VH i VL domeni ne dimerizuju na svim (Ka< 10<5>/M, ispod granice detekcije). Međutim, povezivanje VH i VL peptida je znatno pojačano u prisustvu srodnih antigena (Ka ∼ 10<9>/M) sa značajnim smanjenjem brzine disocijacije antigen/VH/VL-trimernog kompleksa sa izračunatom Kd∼ 2.73 x 10<-5>± 1.43 x 10<-6>/s sa 1.4 µM antigena. Prema tome, u kontekstu ovog pronalaska posebno je procenjeno da KDsa kojom u odustvu datog supstrata ili ćelije, povezivanje i/ili dimerizacina datih polipeptida P1 i P2, posebno datih fragmenata F1 i F2, ovog pronalska može nastati samo na, ili čak iznad, KDili raspona KDizolovanih VH i VL domena, na primer kao što je određeno u kontekstu Wörn-a (loc. cit.), Plückthun-a (1992; loc. cit.), Ueda-e (loc. cit.) i Ohmuro-Matsuyama-e (loc. cit.), posebno iznad KDili raspona KDantigen/VH/VL-trimernog kompleksa kao što je određeno u kontekstu Worn-a (loc. cit.), Plückthun-a (1992;loc. cit.), Ueda-e (loc. cit.) i Ohmuro-Matsuyama-e (loc. cit.). U prisustvu datog supstrata ili ćelije, predviđeno je da polipeptid P1 i polipeptid P2 i/ili, posebno, fragment F1 i fragment F2 koji se tamo sadrže, posebnije VHi VLkoji tamo mogu biti sadržani, povezuju se jedan sa drugim i/ili dimerizuju sa KDkoja je (daleko) ispod KDili raspona KDizolovanih VH i VL domena, na primer kao što je određeno u kontekstu Wörn-a (loc. cit.), Plückthun-a (1992;loc. cit.), Ueda-e (loc. cit.) i Ohmuro-Matsuyama-e (loc. cit.), Poželjno na, ili čak ispod, KDili raspona KDantigen/VH/VL-trimernog kompleksa kako je nađeno u kontekstu Plückthun-a (loc. cit.), Ueda-e (loc. cit.) i Ohmuro-Matsuyama-e (loc. cit.)

U jednom aspektu, polipeptid P1 i polipeptid P2 i/ili, posebno, fragment F1 i fragment F2 koji se tamo sadrže, posebnije VHi VLkoji tamo mogu biti sadržani, nisu povezani u odsustvu datog supstrata ili ćelije i/ili se ne dimerizuju u odsustvu datog supstrata ili ćelije. Ukoliko se uopšte povezuju, oni se povezuju jedan sa drugim i/ili dimerizuju u odsustvu datog supstrata ili ćelije samo sa KDiznad 10<-8>M, poželjno iznad 10<-6>M, poželjnije iznad 10<-5>M i još poželjnije iznad 10<-4>M. U drugom aspektu, ukoliko se uopšte povezuju, oni se povezuju jedan sa drugim i/ili dimerizuju u odsustvu datog supstrata ili ćelije samo sa KDu rasponu od10<-8>M do 10<-2>M, poželjno 10<-7>M do 10<-3>M, još poželjnije 10<-6>M do 10<-3>M i čak još poželjnije 10<-5>M do 10<-3>M. U još jednom aspektu, polipeptid P1 i polipeptid P2 i/ili, posebno, fragment F1 i fragment F2 koji se tamo sadrže, posebnije VHi VLkoji tamo mogu biti sadržani, povezani su u prisustvu datog supstrata ili ćelije i/ili dimerizuju se u prisustvu datog supstrata ili ćelije. Posebno, oni se međusobno povezuju i/ili dimerizuju u prisustvu datog supstrata ili ćelije sa KDispod 10<-6>M, poželjno ispod10<-7>M, poželjnije ispod 10<-8>M i još poželjnije ispod 10<-9>M. Oni se, takođe, mogu povezati jedan sa drugim i/ili se mogu dimerizovati u prisustvu datog supstrata ili ćelije sa KDu rasponu od 10<-11>M do 10<-6>M, poželjnije 10<-11>M do 10<-7>M i još poželjnije 10<-11>M do 10<-8>M.

U poželjnoj realizaciji, gore navedeno primenjuje se čak i u slučaju kad je prisutan agens koji stabilizuje povezivanje i/ili dimerizaciju polipeptida P1 i polipeptida P2 i/ili, posebno, fragmenta F1 i fragmenta F2. Na primer, takav stabilizacioni agens u skladu sa ovim pronalaskom može biti antigen, kao što je, na primer, CD3, HIS ili DIG kako je ovde opisano, sposoban da se veže za domen F koji, na primer, može da sadrži VHi aVLantitela (F1 odnosno F2, ili F2 odnosno F3).

Biti „prisutan", u kontekstu ovog pronalaska i, posebno, u prethodnom kontekstu (tj., u odnosu na dati agens i/ili dati supstrat ili ćeliju i/ili date antigene A1 i A2), posebno označava biti prisutan sa koncentracijom u rasponu od 0,01 µM do 1 mM, u rasponu od 0,1 do 500 µM, u rasponu od 0,1 do 300 µM, u rasponu od 0,1 do 100 µM, u rasponu od 1 do 500 µM, u rasponu od 10 do 500 µM. Biti „odsutan“, u kontekstu ovog pronalaska i, posebno, u prethodno datom kontekstu (tj., u odnosu na dati agens i/ili dati supstrat ili ćeliju i/ili date antigene A1 i A2), posebno označava biti prisutan sa koncentracijom ispod gore datih raspona ili ispod 1 mM, 500 µM, 300 µM, 100 µM, 10 µM, 1 µM, 0.1 µM, 0.01 µM, 0.001 µM ili 1 nM pri čemu su niže vrednosti poželjnije.

Prosečni stručnjak je spreman da meri KDdimerizacije, posebno P1 i P2, posebnjie F1 i F2 koji su sadržani u njima, još posebnije VHi VLkoji mogu biti sadržani u njima. Primeri odgovarajućih metoda merenja su rendgenska kristalografija; nuklearna magnetna resonancija (NMR); izotermalna kalorimetrija (ITC); krio-elektro mikroskopija (CEM); masena spektrometrija (MS); rezonancja površinskih plazmona (SPR). Takve metode su, na primer, opisane u Protein Surface Recognition: Approaches for Drug Discovery: Approaches for the Inhibition of Protein-Protein Interactions for Drug Discovery (Eds: Ernest Giralt, Mark Peczuh, Xavier Salvatella John Wiley & Sons; 12. November 2010). Dalji primeri odgovarajućih metoda merenja su analiza spektara cirkularnog dihroizma; gel-filtraciona hromatografija malog područja; usporavanje mobilnosti fluorescentnog gela; sedimentaciona ravnoteža; fluorescentna polarizacija; blot preklapanje (Blot Overlay) ili far western blot test; test kapilarna elektroforeza afiniteta; fluorescencentno rezonantni energetski transfer (FRET); takve metode su, na primer, opisane u Protein'Protein Interactions: Methods i Applications: 261 (Methods in Molecular Biology); Haian Fu (Editor); Humana Press; 1 (23. März 2004). Poželjna metoda za merenje KDu skladu sa ovim pronalaskom je fluorescentna korelaciona spektroskopija (FCS). Ova metoda je opisana, na primer, u Douglas Magde (Physical Review Letters 29, 11, 1972, S.705-708).

U jednom posebnom aspektu, ovde date KD(i) odnose se na, (ii) jesu ili (iii) treba da se mere na temperaturi od 4 do 38 °C, poželjno 4 do 20 °C (na primer 10°C) ili 20 do 38 °C (na primer 30°C), i/ili pH od 4,5 do 8 (na primer pH 7), „Nije povezan“ u kontekstu predmetnog pronalaska posebno znači nije funkcionalno povezan u odnosu na funkcije domena F, tj ne dozvoljava da F1 i F2 grade funkcionalni F. Prema tome, u jednom aspektu pronalaska, P1 i P2 mogu biti međusobno povezani (na primer kovalentno) sve dok nije stvoren funkcionalni domen F od F1 i F2. Međutim, poželjno je da su P1 i P2 odvojeni.

U jednoj realizaciji, dati antigen A1 i/ili dati antigen A2 je molekul.

U jednoj realizaciji, dati antigen A1 i/ili dati antigen A2 je protein.

U jednoj realizaciji, dati antigen A1 i/ili dati antigen A2 nije protein.

U jednoj realizaciji, data ciljajuća grupa T1 vezuje se nekovalentno za dati antigen A1.

U jednoj realizaciji, data ciljajuća grupa T2 vezuje se nekovalentno za dati antigen A2.

Ovde je opisano da supstrat koji ima na svojoj površini oba antigena A1 i A2 izaziva dimerizaciju fragmenta F1 datog polipeptida P1 sa fragmentom F2 datog polipeptida P2, dok supstrat koji nema na svojoj površini oba antigena A1 i A2 ne izaziva dimerizaciju fragmenta F1 datog polipeptida P1 sa fragmentom F2 datog polipeptida P2.

U kontekstu pronalaska, ćelija koja nosi na svojoj površini oba antigena A1 i A2 izaziva dimerizaciju fragmenta F1 datog polipeptida P1 sa fragmentom F2 datog polipeptida P2, dok ćelija koja ne nosi na svojoj površini oba antigena A1 i A2 ne izaziva dimerizaciju fragmenta F1 datog polipeptida P1 sa fragmentom F2 datog polipeptida P2. U ovom kontekstu „izaziva dimerizaciju“ posebno znači „omogućava postavljenje jednog uz drugog i kasniju dimerizaciju“.

U jednoj realizaciji, data ciljajuća grupa T1 sadrži modul imunoglobulina i/ili data ciljajuća grupa T2 sadrži modul imunoglobulina.

U jednoj realizaciji, data ciljajuća grupa T1 sadrži modul imunoglobulina I1 koji sadrži VLdomen vezan za VHdomen, poželjno, modul imunoglobulina I1 koji sadrži scFv (jednolančani varijabilni fragment) antitela, Fab ili F(ab')2(na primer, sa dodatnim delovima, na primer, Fc domena) antitela ili kompletno antitelo i/ili data ciljajuća grupa T2 sadrži modul imunoglobulina I2 koji sadrži VLdomen vezan za VHdomen, poželjno modul imunoglobulina I2 koji sadrži scFv (jednolančani varijabilni fragment antitela Fab ili F(ab')2(na primer, sa dodatnim delovima, na primer, Fc domena) antitela ili kompletno antitelo.

U jednoj realizaciji, data ciljajuća grupa T1 i/ili data ciljajuća grupa T2 sadrži modul imunoglobulina koji sadrži varijabilni domen VHH antiela lame, antitela kamile ili antitela ajkule.

U jednoj realizaciji, data ciljajuća grupa T1 i/ili data ciljajuća grupa T2 je aptamer, ili prirodni ligand datog antigena A1, odnosno antigena A2.

U jednoj realizaciji, data ciljajuća grupa T1 i/ili data ciljajuća grupa T2 sadrži Fv ili scFv (jednolančani varijabilni fragment) antitela.

U jednoj realizaciji, modul imunoglobulina sadržan u ciljajućoj grupi T1 i T2 sadrži V domen izabran iz grupe koja se sastoji od:

(i) V domena anti-HLA-A2 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 78 i 79 (CDRs 1 i 3) i DAS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 75-77 (CDRs 1-3);

(ii) V domena anti-HLA-Cw6 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 83 i 84 (CDRs 1 i 3) i DDS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 80-82 (CDRs 1-3);

(iii) V domena anti-EpCAM antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 88 i 89 (CDRs 1 i 3) i WAS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 85-87 (CDRs 1-3);

(iv) V domena anti-Her2 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 93 i 94 (CDRs 1 i 3) i SAS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 90-92 (CDRs 1-3);

(v) V domena anti-EGFR1 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 98 i 99 (CDRs 1 i 3) i DAS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 95-97 (CDRs 1-3);

(vi) V domena anti-CEA antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 103 i 104 (CDRs 1 i 3) i SAS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS:100-102 (CDRs 1-3);

(vii) V domena anti-CD45 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 107 i 108 (CDRs 1 i 3) i LAS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 105 i 106 (CDRs 1 i 2) i CDR3 ili SEQ ID NOS: 132-134 (CDRs 1-3);

(viii) V domena anti-CD138 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 112 i 113 (CDRs i 1 i 3) i YTS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 109-111 (CDRs 1-3); i

(ix) V domena anti-CD19 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 158 i 159 (CDRs 1 i 3) i DAS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 155-157 (CDRs 1-3).

U još jednoj, poželjnoj, realizaciji, modul imunoglobulin sadržan u ciljajućoj grupi T1 i/ili T2 sadrži V domen izabran iz grupe koja se sastoji od:

(i) V domena anti-HLA-A2 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 52 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 51;

(ii) V domena anti-HLA-Cw6 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 54 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 53;

(iii) V domena anti-EpCAM antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 56 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 55;

(iv) V domena anti-Her2 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 58 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 57;

(v) V domena anti-EGFR1 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 60 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 59;

(vi) V domena anti-CEA antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 62 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 61;

(vii) V domena anti-CD45 antitela kojiesadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 64 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 63; i

(viii) V domena anti-CD138 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 66 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 65;

(ix) V domena anti-CD19 antitela koje sadrži a VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 153 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 152.

I u još jednoj, poželjnoj, realizaciji, modul imunoglobulin sadržan u ciljajućoj grupi T1 i/ili T2 sadrži V domen koji sadrži bilo koju od SEQ ID NOS: 67-74 i 154.

U jednoj realizaciji, polipeptid P1 ima opštu strukturu F1-T1 i/ili polipeptid P2 ima opštu strukturu F2-T2. F fragment i T grupe mogu biti razdvojene spojnicom (npr. F1-spojnica-T1 i/ili F2-spojnica-T2) i/ili oivičene dodatnim nizom (nizovima) amniokiseline 1 i/ili 2 (niz-F1-(spojnica)-T1-niz 2 i/ili niz 1-F2-(spojnica)-T2-niz 2). Poželjno je da gore data opšta struktura je od N terminusa do C terminusa polipeptida, tj. N-F1-T1-C i/ili N-F2-T2-C, N-F1-spojnica-T1-C i/ili N-F2-spojnica-T2-C i N-niz 1-F1-(spojnica)-T1-niz 2-C i/ili N-niz l-F2-(spojnica)-T2-niz 2-C. U slučaju kad je grupa koja cilja modul imunoglobulina I ili ga sadrži, kao Fv ili scFv, polipeptid P1 može imati opštu strukturu F1-VH1-VL1 i/ili polipeptid P2 može imati opštu strukturu F2-VH2-VL2 ili polipeptid P1 može imati opštu strukturu F1-VL1-VH1 i/ili polipeptid P2 može imati opšru strukturu F2-VL2-VH2. Takođe, u tim slučajevima F fragment i T grupe mogu biti razdvojene spojnicom (npr. F1-spojnica-VH/VL1-VL/VH1 i/ili F2-spojnica-VH/VL2-VL/VH2) i/ili oivičene dodatnim nizom (nizovima) amniokiseline 1 i/ili 2 (niz 1-F1-(spojnica)-VH/VL1-VL/VH1-niz 2 i/ili niz 1-F2-(spojnica)-VH/VL2-VL/VH2-niz 2). Takođe, u tom slučaju, poželjno je da je opšta struktura od N-terminusa do C-terminusa polipeptida, tj. N-F1-VH/VL1-VL/VH1-C i/ili N-F2-VH/VL2-VL/VH2-C, N-F1-spojnica-VH/VL1-VL/VH1-C i/ili N-F2-spojnica-VH/VL2-VL/VH2-C i N-niz 1-F1-(spojnica)-VH/VL1-VL/VH1-niz 2-C i/ili N-niz1-F2-(spojnica)-VH/VL2-VL/VH2-niz 2-C. Takođe, može postojati spojnica između VH i VL ili VL i VH.

Prethodno opisana spojnica (linker), posebno između V domena, može da sadrži 1 do 25 aminokiselina, poželjno 12 do 20 aminokiselina, poželjno 12 do 16 ili 15 do 20 aminokiselina. Prethodno opisana spojnica može da sadrži jedan ili više (G3S) i/ili (G4S) motiva, posebno 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 (G3S) i/ili (G4S) motiva, poželjno 3 ili 4 (G3S) i/ili (G4S) motiva, poželjnije 3 ili 4 (G4S) motiva.

U jednoj realizaciji, dati modul imunoglobulina I1 i dati fragment F1 su razdvojeni spojnicom koji sadrži 1 do 12, poželjno 3 do 12, aminokiselina, i/ili dati modul imunoglobulina I2 i dati fragment F2 su razdvojeni spojnicom koja sadrži 1 do 12, poželjno 3 do 12, aminokiselina.

U jednoj realizaciji, VLdomen I1 je vezan za VHdomen I1 spojnicom koja sadrži 12 do 25 aminokiselina, poželjno apojnicom sa sekvencom (G3S)3ili (G3S)4ili (G4S)3ili (G4S)4i/ili VLdomen I2 je vezan za VHdomen I2 spojnicom koja sadrži 12 do 25 aminkiselina, poželjno spojnicom sa sekvencom (G3S)3ili (G3S)4ili (G4S)3ili (G4S)4.

Kako je pomenuto, spojnica kako je prethodno opisana može da sadrži (G3S) i/ili (G4S) motive. Alternativne spojnice se mogu sastojati od ili sadržati GEGTSTGSGGSGGSGGAD motiv. Prosečni stručnjak može bez dodatnog truda naći i upotrebiti dodatnu spojnicu (peptid) poznatu u tehnici.

Dati dodatni nizovi amino kiseline 1 i/ili 2 mogu da se sastoje od ili da sadrže 1 do 200, 1 do 100, 1 do 70, 1 do 65, 1 do 50, 1 do 25 ili1 do 20 aminokiseelina.

U jednoj realizaciji, dati antigen A1 i/ili dati antigen A2 je antigen eksprimiran na površini ćelije tumora ili na površini progenitorskih/prekursorskih ćelija tumora, poželjno antigen eksprimiran na površini hematološkog tumora, poželjnije antigen eksprimiran na površini ćelija izabranih iz grupe koja se sastoji od ćelija akutne mijeloične leukemije, ćelija hronične mijeloične leukemije, ćelija akutne limfatične leukemije, ćelija hronične limfatične leukemije, ćelija limfoma, ćelija mijeloproliferativnog sindroma, mielodisplastičnih ćelija, poželjnije ćelija mijeloma, ili dati antigen A1 i/ili dati antigen A2 je antigen eksprimiran na površini ćelija tumora koji nije hematološki, poželjno ćelije izabrane iz grupe koja se sastoji od ćelija karcinoma bubrega, ćelija raka mokraćne bešike, ćelija raka pluća, ćelije mezotelioma, ćelije raka prostate, ćelije raka mozga, ćelije raka kostiju, ćelije sarkoma, ćelije raka mekog tkiva, ćelije raka jajnika, ćelije raka grlića materice, ćelije raka dojke, ćelije raka endometrijuma, ćelije raka materice, ćelije tumora semenih ćelija, ćelije analnog kancera, ćelije rektalnog karcinoma, ćelije karcinoma debelog creva, ćelije karcinoma tankih creva, ćelije karcinoma želuca, ćelije gastrointestinalnog stromalnog tumora, ćelije karcinoma jetre, ćelije karcinoma pankreasa, ćelije karcinoma žučnih puteva, ćelije karcinoma žučne kese, ćelije raka glave i vrata, ćelije hipofariengalnog raka, ćelije laringealnog raka, ćelije raka ezofagusa, ćelije raka kože, poželjno ćelije melanoma, ćelije dečjeg raka, ćelije endokrinog tumora, ćelije karcinoidnog tumora, ćelije timoma, ćelije raka štitaste žlezde, ćelije tumora islet ćelija, ćelije tumora adrenalnih ćelija, ćelije neuroendokrinog tumora i ćelije nepoznatog primarnog kancera (raka nepoznatog primarnog porekla). Detaljne informacije o takvim kancerima mogu se naći u relevantnoj literaturu, kao što je „Cancer Medicine“, JF Holland, E Frei (editors), Mcgraw-Hill Professional, 8th edition (2010) i tamo citiranim referencama.

U jednoj realizaciji, kombinacija antigena A1 i antigena A2 je nađena samo na ćelijama krvi ili prekursorskim ćelijama krvnih ćelija, poželjno samo na jednom tipu krvnih ćelija.

U jednoj realizaciji, kombinacija antigena A1 i antigena A2 je nađena samo u ciljanim posebno kanceroznim ćelijama, i nije nađena (ili je nađena samo u zanemarljvoj meri) na ćelijama koje nisu ciljane ćelije, posebno koje nisu kancerozne. U željenoj realizaciji, kombinacija antigena A1 i antigena A2 je speciifična za kancerozne ćelije određenog tipa raka.

U jednoj realizaciji, kombinacija antigena A1 i antigena A2 razlikuje određenu vrstu ćelija, poželjno određeni tip ćelija raka, od bilo kojih drugih ćelija.

„Određeni tip raka“ u ovom kontekstu može da znači tip kancera/raka koji karakteriše isti organ u kome je raka formiran ili, poželjno, tip raka okarakterisan istim parom aberantnih antigena A1 i A2.

U jednoj realizaciji, kombinacija antigena A1 i antigena A2 je nađena na progenitorskim/prekursorskim ćelijama koje su progenitorske/prekursorske ćelije tumora i nije nađena na progenitorskim/prekursorkim ćelijama koje nisu progenitorske/prekursorske ćelije tumora.

U jednoj realizaciji, dati antigen A1 je antigen koji je specifičan za maligno stanje ćelije i dati antigen A2 je antigen koji je specifičan za tip ćelije ili ćelijsku liniju date ćelije.

U jednoj realizaciji,

a) antigen A1je EpCAM (epitelijalni ćelijski adhezivni molekul) i antigen A2 je CD10 (klaster diferencijacije 10), HER2/neu (receptor 2 humanog epidermalnog faktora rasta), VEGF-R (receptor vaskularnog endotelijalnog faktora rasta), EGFR (receptor epidermalnog faktora rasta; takođe nazvan HER1 (receptor 1 humanog epidermalnog faktora rasta) ili ErbB1) ili MDR (protein povezan sa rezistencijom na više lekova), ili

b) antigen A1 je MCSP (hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom) i antigen A2 je melanoferrn ili EpCAM, ili

c) antigen A1 je CA125 (kancer antigen 125/ugljeni hidrat antigen 125) i antigen A2 je CD227 (PEM (polimorfni epitelijalni mucin) ili MUC1 (mucin-1)), ili

d) antigen A1 je CD56 i antigen A2 je CD140b (PDGFRβ (receptor faktora rasta beta izvedenog iz trombocita)) ili GD3 gangliozid, ili

e) antigen A1 je EGFR i antigen 2 je HER2, ili

f) antigen A1 je PSMA (prostata-specifični membranski antigen) i antigen 2 je HER2, ili

g) antigen 1 je Sialyl Lewis i antigen 2 je EGFR, ili

h) antigen 1 je CD44 i antigen 2 je ESA (antigen epitelne površine) (CD326, EpCAM), CD24, CD133, MDR (protein povezan sa rezistencijom na više lekova) ili CD117, ili i) antigen 1 je CD34 i antigen 2 je CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR (humani leukocitni antigen DR), CD 13, CDR117, CD33 ili CD15, ili

j) antigen 1 je CD33 i antigen 2 is CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR (humani leukocitni antigen DR), CD13, CD117 ili CDR15, ili

k) antigen 1 je MUC1 i antigen 2 je CD10, CEA ili CD57, ili

l) antigen 1 je CD38 i antigen 2 je CD138, ili

m) antigen 1 ijeCD 24 i antigen 2 je CD29 ili CD49f, ili

n) antigen 1 je ugljena anhidraza IX i antigen 2 je akvaporin, poželjno akvaporin-2.

U jednoj realizaciji, dati antigen A1 i/ili dati antigen A2 je izabran iz grupe koja se sastoji od HLA-A (HLA-A glavni histokompatibilni kompleks, klasa I, A [Homo sapiens]; Gene ID: 3105 ažuriran 13-Jan-2013; DAQB-90C11.16-002; Chromosome: 6; NC_000006.11 (29910247..29913661); za HLA-A2: 1. mRNA = LOCUS NM_001242758 = Version NM_001242758.1 GI:337752169 = GenBank: AY191309.1 PRI 13-JAN-2013; 2. Protein = P79495 [UniParc]. Poslednja modifikacija Maj 1, 1997. Verzija 1.; za HLA-Cw6: mRNA = LOCUS HUMMHCCW6A = GenBank: VERSION M28160.1 GI:531197PRI (18-AUG-1994); Protein = Q29963 [UniParc]. poslednja modifikacija Avgust 22, 2003. Verzija 2.); EpCAM (EPCAM adhezioni molekul epirelnih ćelija [Homo sapiens]; takođe poznat kao ESA; KSA; M4S1; MK-1; DIAR5; EGP-2; EGP40; KS1/4; MIC18; TROP1; EGP314; HNPCC8; TACSTD1.; Gene ID: 4072, ažuriran 6-Jan-2013; mRNA = VERSION NM_002354.2 GI:218505669PRI 06-JAN-2013; Protein = P16422 [UniParc]. poslednja modifikacija Novembar 13. 2007. Version 2.); CD45 (PTPRC proteinska tirozinska fosfataza, receptor tip, C [Homo sapiens]; takođe poznat kao LCA; LY5; B220; CD45; L-CA; T200; CD45R; GP180; Gene ID: 5788, ažuriran 13-Jan-2013; mRNA = VERSION NM_002838.4 GI:392307006 PRI 13-JAN-2013; Protein = P08575-1 = Izoforma 1, Poslednja modifikacija Juli 19, 2003. Version 2.; Protein = P08575-2 = Izoforma 2); Her2 (ERBB2 v-erb-b2 viralni onkogeni homolog eritroblastične leukemije 2, neuro/glioblastom izvedeni onkogeni homolog (avian) [Homo sapiens]; takođe poznat kao NEU; NGL; HER2; TKR1; CD340; HER-2; MLN 19; HER-2/neu; gene ID: 2064, ažuriran 13-Jan-2013; mRNA varijanta transkripta 1 = VERSION NM_004448.2 GI:54792095, PRI 06-JAN-2013; mRNA varijana transkripta 2 = VERSION NM_001005862.1 GI:54792097, PRI 06-JAN-2013; Protein = P04626-1 = Izoform 1, poslednja modifikacija Avgust 13, 1987. Version 1.; Protein = P04626-2= Izoform 2; Protein = P04626-3= Izoform 3; Protein = P04626-4= Izoform 4); EGFR (EGFR receptor epidermelnog faktora rasta [Homo sapiens]; takođe poznat kao ERBB; HER1; mENA; ERBB1; PIG61; Gene ID: 1956, ažuriran 13-Jan-2013; mRNA varijanta transkripta 1 = VERSION NM_005228.3 GI:41327737, PRI 13-JAN-2013; mRNA varijanta transkripta 2 = VERSION NM_201282.1 GI:41327731, PRI 13-JAN-2013; mRNA t varijanta transkripta 3 = VERSION NM_201283.1 GI:41327733, PRI 13-JAN-2013; mRNA varijanta transkripta 4 = VERSION NM_201284.1 GI:41327735, PRI 13-JAN-2013; Protein = P00533-1 = Izoforma 1, poslednja modifikacija Novembar 1, 1997. Version 2.; Protein = P00533-2 = Izoforma 2; Protein = P00533-3 = Izoforma 3; Protein = P00533-4 = Izoforma 4); CD138 (SDC1 sindekan 1 [Homo sapiens]; Gene ID: 6382, ažuriran 6-Jan-2013; mRNA varijanta transkripta 1 = VERSION NM_001006946.1 GI:55749479, PRI 06-JAN-2013; mRNA varijanta transkripta 2 = VERSION NM_002997.4 GI:55925657, PRI 06-JAN-2013; Protein = P18827 [UniParc].poslednja modifikacija Maj 5, 2009. Version 3.); CEA (CEACAM5 karcinoembrionskom antigenu srodan ćelijski adhezioni molekul 5 [Homo sapiens]; takođe poznat kao CEA; CD66e; Gene ID: 1048, ažuriran 13-Jan-2013; mRNA = VERSION NM_004363.2 GI:98986444, PRI 13-JAN-2013; P06731, poslednja modifikacija Januar 11, 2011. Version 3.); i CD19 (CD19 CD19 molekul [Homo sapiens]; takođe poznat kaoB4; CVID3; Gene ID: 930, ažuriran 5-Jan-2013; mRNA transkript 1 = VERSION NM_001178098.1 GI:296010920, PRI 06-JAN-2013; mRNA transkript 2 = VERSION NM_001770.5 GI:296010919, PRI 06-JAN-2013; Protein = P15391 [UniParc]. Poslednja modifikacija Novembar 13, 2007. Verzija 6).

U jednoj realizaciji, dati antigen A1 i/ili dati antigen A2 je MHC antigen, poželjno alelna varijanta bilo kog od HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR, ili HLA-DM, poželjnije alelna varijanta MHC klasa I molekul, poželjnije alelna varijanta izabrana iz grupe koja se sastoji od HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A25, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B35, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw6, i HLA-Cw7.

U jednoj realizaciji, dati antigen A1 je HLA-A2.

U jednoj realizaciji, dati antigen A1 i/ili dati antigen A2 je izabran iz grupe koju čine CD45, akvaporin, poželjno akvaporin-2, skevendžer receptor klasa B član 1 (SCARB1), CD34, CD33, CD138, CD15, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD20, CD23, CD31, CD43, CD56, CD57, CD68, CD79a, CD146, sinaptofizin, CD56, CD57, nikotin acetiliholini receptor, mišićspecifična kinaza (MUSK), voltažno zavisni kanali za kalcijuml (P/Q-type), voltažno zavisni kanali za kalijum (VGKC), N-metil-D-aspartat receptor (NMDA), TSH (hormon stimulacije tiroide) receptor, amfifizin, HepPar-1, gangliozid GQ1B, gangliozid GD3, gangliozd GM1 i glikoforin-A.

U poželjnoj realizaciji, dati antigen A1 je MHC antigen i dati antigen A2 je antigen koji je specifičan za određeni tip ćelije ili ćelijsku liniju.

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je modul imunoglobulina, poželjno scFv (jednolančani varijabilni fragment) antitela, poželjnije Fv (varijabilni fragment) antitela. Ovde je takođe opisano da je funkcionalnit domen F fluorescentni molekul, poželjno molekul bimolekulske flourescencijske komplementacije, poželjnije GFP ili GFP varijanta, ili molekul sposoban sa porsreduje u bioluminescenciji, poželjno molekul luciferaze, poželjnije Gaussia luciferaza.

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je Fv (varijabilni fragment) antitela.

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F specifično vezuje ili je sposoban za specifično vezivanje za antigen. U specifičnom aspektu, dati antigen može biti antigen koji je prisutan na ćelijama humanog imunog sistema. U poželjnoj realizaciji, dato vezivanje aktivira date ćelije humanog imunskog sistema.

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je domen koji angažuje T ćelije, poželjno domen koji angažuje T ćelije koje se specifično vezuju za CD2, CD3, CD5, receptor T ćelija ili CD28, poželjno domen koji angažuje T ćelije koje se specifično vezuju za CD3ε, domen koji angažuje NK ćelije (prirodna ćelija ubica), domen koji angažuje NK ćelije koje se specifično vezuju za CD1a, CD16a ili CD56, domen koji angažuje ćelije makrofaga, poželjno domen koji angažuje ćelije makrofaga koje se specifično vezuju za CD16a, CD32a, CD32b, CD89 ili CD64, domen koji angažuje monocite, poželjno domen koji angažuje monocite koji se specifično vezuju za CD32a, CD32b, CD64 ili CD89, domen koji angažuje granulocite, poželjno domen koji angažuje granulocite koji se specifično vezuju za CD16b, CD32a, CD32b, CD64, ili CD89, domen koji angažuje neutrofilne granulocite, poželjno domen koji angažuje neutrofilne granulocite koji se specifično vezuju za CD89 (FcαRI), ili domen koji angažuje aktivirane neutrofilne granulocite, monocite i/ili makrofage, poželjno domen koji nagažuje aktivirane neutrofilni granulocite, monocite i/ili makrofage koji se specifično vezuju za CD64 (FcγRI).

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za antigen vezan za dijagnostićko ili terapijsko jedinjenje.

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za molekul nosač ili marker afiniteta. Poželjno, dati molekul nosač je vezan za dijagnostićko ili terapijsko jedinjenje. Poželjno, dati maker afiniteta je vezan za dijagnostićko ili terapijsko jedinjenje.

Poželjno, dati marker afiniteta je izabran iz grupe koja sadrži marker FLAG-a, myc-tag, marker glutation-S-transferaze (GST), marker hemagglutinina (HA), marker polihistidina (His), marker digoksigenina (DIG) i marker maltoza vezujućeg proteina (MBP).

Poželjno, dati molekul nosač je peptid iliili molekul ugljenog hidrata. U poželjnoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za molekul nosač, poželjno molekul nosač vezan za dijagnostićko ili terapijsko jedinjenje, pri čemu dati molekul nosač je izabran iz grupe koju čine želatin, inulin, dekstran i hidroksietil skrob.

U jednoj realizaciji, dato terapijsko jedinjenje je radioaktivno jedinjenje, poželjno radioaktivno jedinjenje koje sadrži<90>Y,<177>Lu,<131>I,<32>P,<10>B, ili<213>Bi. U jednoj realizaciji, dato terapijsko jedinjenje je toksin. Poželjno, dati toksin je izabran iz grupe koju čine B. anthracis edema faktor, B. anthracis letalni faktor, C. perfringens jota toksin, C. botulinum C2 toxin, C. difficile ADP-ribosyltransferase, C. diphtheriae diphteria toxin fragment A, Burgholderia sp. shiga toksin (podjedinica A), Clostridium perfringens str. 13 toksin pfoA perfringolizin O, Ricin A lanac, biljni RIP bouganin, humana RNASE3 ribonukleaza (RNase A family, 3) i antraks letalni faktor endopeptidaza. Dalji neograničavajući primer toksina u skladu sa pronalaskom je toksin koji je ili sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS 160 do 168.

U jednoj realizaciji, dato dijagnostičko jedinjenje je radioaktivno jedinjenje, poželjno radioaktivno jedinjenje koje sadrži<99m>Tc,<111>In,<82>Rb ili<201>Tl. U jednoj realizaciji, dato dijagnostičko jedinjenje je fluorescentno jedinjenje, poželjno GFP, GFP varijanta, ili malomolekulsko fluorescentno jedinjenje kao što je FITC (fluorescein izotiocianat), PE (fikoeritrin), alexa fluor boja (kao što je AlexaFluor488 ili srodne boje) ili cijanin boja (kao što je Cy3 (Indokarbocijanin) ili Cy5 (Indodikarbocijanin) ili srodne boje). U jednoj realizaciji, dato dijagnostičko jedinjenje je molekul sposoban da posreduje u bioluminiscenciji, poželjno molekul luciferaze, poželjnije Gaussia luciferaza.

U kontekstu pronalaska, fragment F1 sadrži VLdomen antitela i dati fragment F2 sadrži VHdomen istog antitela, pri čemu, poželjno, dato antitelo je anti-CD3 antitelo, poželjnije anti-CD3ε antitelo, ili anti-His ili anti-DIG antitelo ili dati fragment F1 sadrži VHdomen antitela i dati fragment F2 sadrži VLdomen istog antitela, pri čemu, poželjno, dato antitelo je anti-CD3 antitelo, poželjnije anti-CD3ε antitelo, ili anti-His ili anti-DIG antitelo..

Ovde je opisano da VLi VHdomeni sadržani u F1 odnosno u F2 fragmentu, ili u F2 odnosno u F1 fragmentu, mogu takođe biti od dva različita antitela, bilo specifična za isti antigen (i za isti ili različiti epitop) ili za različiti antigen. To je, na primer, predviđeno za primenu u kreiranju novih specifikacija (na primer u pristupima koji obuhvataju eksponiranje na fazima).

U drugoj realizaciji modul imunoglobulina sadržan u F domenu sadrži V domen izabran iz grupe koju čine:

(i) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 18-20 (CDRs 1-3) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 15-17 (CDRs 1-3);

(ii) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 24-26 (CDRs 1-3) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 21-23 (CDRs 1-3);

(iii) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 30-32 (CDRs 1-3) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 27-29 (CDRs 1-3);

(iv) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 36 i 37 (CDRs 1 i 3) i DTS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 33-35 (CDRs 1-3);

(v) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 41 i 42 (CDRs 1 i 3) i YTN (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 38-40 (CDRs1-3); and

(vi) V domen anti-His antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 46 i 47 (CDRs 1 i 3) i KVS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 43-45 (CDRs 1-3); (vii) V domen anti-DIG antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 50 i 131 (CDRs 1 i 3) i YSS (CDR 2) i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NOS: 48 i 49 (CDRs 1 i 2) i A (CDR 3).

U drugoj, poželjnoj realizaciji, modul imunoglobulina sadržan u F domenu sadrži V domen izabran iz grupe koju čine:

(i) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 2 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 1;

(ii) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 4 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 3;

(iii) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 6 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 5;

(iv) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 8 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 7;

(v) V domen anti-CD3 antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 10 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 9; and

(vi) V domen anti-His antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 12 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 11;

(vii) V domen anti-DIG antitela koje sadrži VLdomen koji sadrži SEQ ID NO: 14 i/ili VHdomen koji sadrži SEQ ID NO: 30.

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za molekul toksina, poželjno molekul toksina koji sam po sebi nije sposoban da prodire kroz ćelijsku membranu humane ćelije i koji je, poželjno, ubačen u humanu ćeliju posle povezivanja sa ćelijskom membranom date ćelije, pri čemu, poželjno, dato povezivanje sa ćelijskom membranom date ćelije je posredovano specijalnim vezivanjem u heterodimer stvoren od dva molekula, poželjno dva molekula povezana sa datom ćelijskom membranom, gde, poželjno, data dva molekula su polipeptidi P1 i P2 kako je ovde opisano. U jednoj realizaciji, dati funkcionalnil domen F je domen koji se specifično vezuje za A-komponentu (aktivnu komponentu) bakterijskog dvokomponentog A-B toksina.U jednoj realizaciji dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za toksine izabran iz grupe koju činef B. anthracis edema faktor, B. anthracis letalni faktor, C. perfringens jota toksin, C. botulinum C2 toksin, C. difficile ADP-ribosiltransferaza, C. diphtheriae difterija toksin fragment A, Burgholderia sp. shiga toksin (podjedinica A), Clostridium perfringens str. 13 toksin pfoA perfringolisin O, Ricin A lanac, biljni RIP bouganin, humana RNASE3 ribonukleaza (RNase A family, 3) i antraks letalni faktor endopeptidaza. Još jedani neograničavajući primer toksina u skladu sa pronalaskom je toksin koji je ili sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS 160 do 168.

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za fluorescentni molekul, poželjno fluorescent molekul koji sam po sebi nije sposoban da prodre kroz ćelijsku membranu humane ćelije. Poželjno, dati fluorescentni molekul je GFP, ili GFP varijanta, ili molekul koji sadrži malomolekulsko jedinjenje kao što je FITC (fluorescein izotiocianat), PE (fikoeritrin), alexa fluor boja (kao što je AlexaFluor488 ili srodne boje) ili cijanin boja (kao što je Cy3 (Indokarbocijanin) ili Cy5 (Indodikarbocijanin) ili srodne boje).

U jednom aspektu, dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za molekul sposoban za posredovanje u bioluminescenciji, poželjno molekula luciferaze, poželjnije Gaussia luciferaze.

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je fluorescentni molekul, poželjno molekul bimolekularne fluorescencentne komplementacije, poželjnije GFP ili GFP varijanta, kao što je YFP, CFP, Venus, ili Cerulean.

Primeri posebnih polipeptida P1 ili P2 koji se nalaze u grupi polipeptida u skladu sa ovim pronalaskom su polipeptidi koji sadrže aminokiselinski sekvencu izabranu iz grupe koja sa sastoji od SEQ ID NOS: 114-129 i 197.

Generalno, predmetni pronalazak se odnosi na tretiranje ili eliminaciju bilo koje neželjene populacije ćelija i lečenje ili prevenciju bilo kog poremećaja ili bolesti koja dolazi zajedno sa tom neželjenom populacijom ćelija. Za ovu svrhu, koristi se set polipeptida ovog pronalaska.

U jednoj realizaciji, dati set polipeptida je set polipeptida za upotrebu u lečenju pacijenta koji boluje od tumora ili raka ili za dijagnostičku upotrebu kod pacijenta koji boluje od tumora ili raka, poželjno za upotrebu u lečenju pacijenta koji boluje od tumora ili raka i podvrgnut je transplantaciji alogenog tkiva ili ćelija ili namerava da bude podvrgnut takvoj transplantaciji, ili za dijagnostičku upotrebu kod pacijenta koji boluje od tumora ili raka i koji je podvrgnut ili namerava da bude podvrgnut transplantaciji alogenog tkiva ili ćelija, pri čemu, poželjno, dati set polipeptida je primenjen kod datog pacijenta.

Primeri tumora koji će se lečiti ili diagnozirati su oni za koje su ćelije tumora ili raka ovde prehodno opisane u vezi sa antigenima A1 i/ili A2.

U jednoj realizaciji, dato lečenje uključuje elimnaciju tkiva/ćelija primaoca određenog tipa ćelia, poželjno tipa kanceroznih ćrlija, ili prekursorskih ćelija primaoca koje se razvijaju u određeni tip ćelije, poželjno kancerozni tip ćelije, opciono posle ili paralelno sa transplantacijom primaocu tkiva/ćelija donora ili precursorskih ćelija koje se razvijaju u dati isti tip ćelija.

U jednoj realizaciji, set polipeptida pronalaska je za upotrebu u postavci alogenske transplantacije za hematopoietske neoplazije, na primer sa neusklađenim HLA antigenima, posebno za upotrebu u terapijskom korišćenju ove situacije neusaglašenosti. U ovoj uzornoj situaciji, dvojna informacija r HLA haplotipa (HLApatient) primaoca i hematopoetskog porekla linije (CD45) prikazana je ekskluzivno na leukemijskim blastima i drugim hematopoetskim ćelijama pacijenta. Sve druge ćelije koje su pripadaju primaocu eksprimiraju haplotip primaoca ali ne antigen hematopoetske linije CD45 (npr. nehematopoetske ćelije primaoca su pozitivne za HLA-A2 ali negativne za CD45). Takođe, sve hematopoetske ćelije donora eksprimiraju molekule HLA haplotipa donora što znači da su one CD45 pozitivne ali HLA-A2 negativne u situaciji neusklađana transplantacije gde je pacijent ali ne i donor pozitivan za HLA-A2. Zbog toga, predmetni pronalazak, takođe, se odnosi na bimolekularni i komplementarni konstrukt jednolančanog antitela usmeren protiv HLA-A2, u slučajevima gde pacijent ali ne i donor je HLA-A2 pozitivan, i na drugi konstrukt specifičan za haematopoietski linijski marker CD45 da bi specifično napao sve hematopoetske ćelije pacijenta uključujući sve hematološke neoplazme. Prema tome, prvi polipeptid P1 može da sadrži konstrukt jednolančanog varijabilnog fragmenta antitela usmeren prema HLA pacijenta (ciljana grupa T1) fuzionisan za VLfragment F1 antiCD3 (na primer, fragment F1). Drugi polipeptid P2 može da sadrži konstrukt jednolančanog varijabilnog fragmenta specifičan za haematopotski linijski marker (na primer, CD45; grupa koja cilja T2), fuzionisan sa VHrazdvojenim-fragmentom F2 anti CD3-Fv (fragment F2).

U jednoj realizaciji, data eliminacija uključuje uništavanje datog tkiva/ ćelija primaoca ili date prekursorske ćelije primaoca ćelijama imunskog sistema, toksinom ili radioaktivnim jedinjenjem.

U jednoj realizaciji, dati set polipeptida je set polipeptida za dujagnostičku upotrebu kod pacijenta koji je podvrgnut transplantaciji alogenog tkiva ili ćelija, pri čemu, poželjno, dati pacijent je pacijent koji boluje od tumora.

U jednoj realizaciji, data dijagostička upotreba uključuje specifični detekciju ćelija primaoca određenog tipa ćelija ili linijske ćelije među ćelijama promaoca različitog tipa ćelije ili ćelijske linije i ćelija donora istog ili različitog tipa ili ćelijska linije.

U jednoj realizaciji, dati dijagnostička upotreba uključuje specifičnu detekciju ćelija receptora koje su maligne ćelije među ćelijama primaoca koje nisu maligne i među ćelijama donora. U jednoj realizaciji, dati set polipeptida je primenjen kod pacijenta.

Poželjno, dati pacijent je sisar, poželjnije, ljudsko biće.

U jednoj realizaciji, data primena se vrši bolusom ili kontinualnom primenom

U jednoj realizaciji, polipeptidi P1 i P2 date grupe polipeptida su primenjeni paralelno. U drugoj realizaciji polipeptidi P1 i P2 datog seta polipeptida su primenjeni uzastopno.

U jednoj realizaciji, jedan od polipeptida P1 ili P2 datog seta polipeptida je primenjen bolusom, dok je drugi primenjen kontinualnom primenom.

U jednoj realizaciji, količina primenjenog polipeptida je u rasponu od 0.5 µg/m<2>na dan do 500 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2, poželjnou rasponu od 5 µg/m<2>na dan do 200 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2, poželjnije u rasponu od 10 µg/m<2>na dan do 80 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2.

U jednoj realizaciji, količina primenjenog polipeptida je u rasponu od 0,05 µg/m<2>na dan do 0,5 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2.

U jednoj realizaciji, količina primenjenog polipeptida P1 je različita od količine primenjenog polipeptida P2.

U jednoj realizaciji, količina primenjenog polipeptida je u rasponu od 0.5 µg/m<2>na dan do 50 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2. U jednoj realizaciji, količina primenjenog polipeptida je u rasponut od 50 µg/m<2>na dan do 100 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2. U jednoj realizaciji, t količina primenjenog polipeptida je u rasponu od 100 µg/m<2>na dan do 200 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2. U jednoj realizaciji, količina primenjenog polipeptida je u rasponu od 200 µg/m<2>na dan do 300 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida polipeptida P1 i P2. U jednoj realizaciji, količina primenjenog polipeptida je u rasponu od 300 µg/m<2>na dan do 400 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili zapolipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2. U jednoj realizaciji, količina primenjenog polipeptida je u rasponu od 400 µg/m<2>na dan do 500 µg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2. U jednoj realizaciji, količina primenjenog polipeptida je u rasponu od 500 µg/m<2>na dan do 1 mg/m<2>na dan za polipeptid P1 ili za polipeptid P2 ili za svaki od polipeptida P1 i P2.

Dodatne referentne tačke za određivanje količine polipeptida P1 i P2 koje će se primenjivati mogu se takođe dobiti konsultovanjem ispitivanja izvedenih sa konstruktima bispecifičnih antitela (npr. Bargou R et al., Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antitelo. Science. 2008; 321(5891):974-7; i Topp MS et al. Targeted therapy with the T-cell-engaging antitelo blinatumomab of chemotherapy-refractory minimal residual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results in high response rate i prolonged leukemia-free survival. J Clin Oncol.2011, 29:2493-8).

U jednoj realizaciji, data primena traje kontinualno tokom najmanje 12 sati ili tokom najmanje 1 dana ili tokom najmanje 2 dana ili tokom najmanje 3 dana ili tokom najmanje 4 dana ili tokom najmanje 5 dana ili tokom najmanje 6 dana ili tokom najmanje 7 dana ili tokom najmanje 8 dana ili tokom najmanje 9 dana ili tokom najmanje 10 dana ili tokom najmanje 11 dana ili tokom najmanje 12 dana ili tokom najmanje 13 dana ili tokom najmanje 14 dana ili tokom najmanje 15 dana ili tokom najmanje 16 dana ili tokom najmanje 17 dana ili tokom najmanje 18 dana ili tokom najmanje 19 dana ili tokom najmanje 20 dana ili tokom najmanje 21 dan ili tokom najmanje 22 dana ili tokom najmanje 23 dana ili tokom najmanje 24 dana ili tokom najmanje 25 dana ili tokom najmanje 26 dana ili tokom najmanje 27 dana ili tokom najmanje 28 dana ili tokom najmanje 29 dana ili tokom najmanje 30 dana ili tokom najmanje 5 nedelja ili tokom najmanje 6 nedelja.

U jednoj realizaciji, data primena datog seta polipeptida ili jednog polipeptida iz datog seta polipeptida odigrava se intravenozno, poželjno intravenoznom injekcijom.

U jednoj realizaciji, data primena datog seta polipeptida ili jednog polipeptida iz datog seta polipeptida odigrava se supkutano, poželjno supkutanom injekcijom.

U jednoj realizaciji, dati set polipeptida je primenjen u kombinaciji sa jednim ili više lekova izabranih iz grupe koja se sastoji od imunomodulatornog leka, i/ili steroida, poželjno prednisolona ili prednisona.

U jednoj realizaciji, dati set polipeptida je primenjen u kombinaciji sa radioaktivnim jedinjenjem, poželjno radioaktivnim jedinjenjem vezanim za antigen, molekul nosač ili marker afiniteta, pri čemu dato radioaktivno jedinjenje dati antigen, dati molekul nosač ili dati marker afiniteta je specifično vezan datim funkcionalnim domenom F.

U jednoj realizaciji, dati set polipeptida je primenjen u kombinaciji sa toksinom, poželjno toksinom vezanim za antigen, molekul nosač ili marker afiniteta, pri čemu dati toksin, dati antigen, dati molekul nosač ili dati marker afiniteta je specifično vezan datim funkcionalnim domenom F.

U jednoj realizaciji, dati set polipeptida je primenjen u kombinaciji sa fluorescentnim molekulom, poželjno fluorescentnim molekulom vezanim za antigen, molekul nosač ili marker afiniteta, pri čemu data fluorofora, dati antigen, dati molekul nosač ili dati marker afiniteta je specifično vezan datim funkcionalnim domenom F.

U jednoj realizaciji, dati funkcionalni domen F je domen koji se specifično vezuje za antigen koji nije prepoznat kao strani imunskim sistemom datog pacijenta kod koga je primenjen dati set polipeptida.

U jednoj realizaciji dva seta polipeptida kao što su prethodno opisani (prvi set polipeptida i drugi set polipeptida) primenjeni su istovremeno ili uzastopno. U jednoj poželjnoj realizaciji, dati prvi set polipeptida ima različite fragmente F1 i F2 od datog drugog seta polipeptida. U jednoj poželjnoj realizaciji, dati prvi set polipeptida ima iste fragmente F1 i F2 kao dati drugi set polipeptida. U jednoj poželjno realizaciji, ciljajuće grupe T1 i T2 datog prvog seta polipeptida vezuju se za iste antigene kao ciljajuće grupe T1 i T2 datog drugog seta polipeptida.

U jednoj poželjnoj realizaciji, ciljajuće grupe T1 i T2 datog prvog seta polipeptida vezuju se za različite antigene od ciljajućih grupa T1 i T2 datog drugog seta polipeptida.

U jednoj realizaciji, navedeni pacijent je bio podvrgnut lečenju raka pre lečenja datim setom polipeptida, navedno lečenje lečenje kancera je poželjno bila hemoterapija, radiaciona terapija ili operativno uklanjanje tumora, ili je pacijent bio podvrgnut lečenju raka paralelno sa lečenjem datim setom polipeptida, pr čemu je navedeno lečenje raka poželjno bila hemoterapija, radiaciona terapija ili operativno uklanjanje tumora,

U jednoj realizaciji, dati set polipeptida ili jedan od polipeptida datog seta polipeptida je proizveden sistemom prokariotske ili eukariotske ekspresije ili de novo sintezom peptida.

U jednoj realizaciji, dati set polipeptida ili jedan od polipeptida iz datog seta polipeptida je stvoren u navednom pacijentu ekspresijom proteina iz nukleinske kiseline unesene u navedenog pacijenta.

Mnogi pacijenti boluju od alergijskih ili autoimunskih bolesti. U mnogim od ovih alučajeva, populacija kloniranih B ćelija proizvodi lutajuće antitelo koje reaguje sa antigenima eksprimiranim tkivom pacijenta ili gradi kompleks sa alergenom, uzrokujući anafilatičke reakcije. U oba slučaja, poželjno je specifično eliminisati klon lutajućihB ćelija.

Do sada, bilo je moguće modifikovati kombinatorijski sistem tako da jedna grana P1 ili P2, posebno T1 ili T2) prepoznaje antigen vezan za B ćeliju (npr. CD19, CD20, CD38 ili CD138) i druga grana (P2 ili P1, posebno T2, odnosno T1) je alergen ili supstrat vezan za antitelo koji izaziva autoimunsku bolest. Kad se ova dva konstrukta vežu za B ćeliju koja je CD19 (CD20, CD38 ili CD138) pozitivna i istovremeno na površini pokazuje tipično za klon antitelo, pripojeni anti-CD3 VH i VL mogu da reaguju i rekonstituišu mesto vezivanja CD3 tačno na B ćeliji. Ovaj alergen specifični ili antigen-specifični skup će konačno dovesti do klonalne deplecije ciljanih B ćelija.

Dakle, u skladu sa ovim pronalaskom, bilo koji od datih antigena A1 i A2 može, takođe, biti antitelo tipično za klon na površini B ćelije, posebno B ćelije koja izaziva autoimunu bolest.

U ovom kontekstu, na primer, jedan od datih antigena A1 i A2 može biti CD 19 i drugi može biti antitelo tipično za klon na površini B ćelije, posebno B ćelije koja izaziva autoimunu bolest.

U skladu sa ovim aspektom pronalaska, bilo koja od datih ciljajućih grupa T1 i T2 može da sadrži alergen ili supstrat koji se vezuje za antitelo tipično za klon na površini B ćelije i/ili koji je, posle vezivanja za antitelo tipično za klon, sposobno da izazove autoimunski poremećaj. Neograničavajući primer alergena sadržanog u bilo kojoj od datih ciljajućih grupa T1 i T2 su alergeni dlake, kao štto su, na primer, alergeni dlake psa, dlake mačke (npr. Fel d 1, Feld d1A, Feld d1B) ili dlake zamorčeta, ili alergeni polena, kao što su, na primer, breza, trava. Dalji neograničavajući primeri su alergeni grinje (na primer Tyr p 2, Der P1, Der f 2), alergeni mačke (na primer, Fel d 1, Feld d1A, Feld d1B), alergeni kikirikija (fna primer Conglutin-7), alergeni trulih gljiva (ba primer Alt a 1), alergeni psa (na primer Can f 1), alergeni žita (eng. sprue wheat (na primer Alpha/beta-gliadin)), alergeni nemačke bubašvabe (na primer, Bla g 1.02 varijanta alergen), alergeni polena drveta breze ili (glavni) alergeni polena (na primer Cyn d 1, Pha a 1, Dac g 3, Phl p 2, Phl p 1, Profilin, Bet v 1-L, Bet v 1-A), glavni alergeni jabuke (na primer Mal d 1), alergeni kravljeg mleka (na primer alpha-laktalbumin, alpha-S1-kazein), alergeni kokošjeg jajeta (na primer lizozm C, ovalbumin) i alergeni konja (fna primer laterin, Equ c 1), i slični. Dalji neoganičavajući i poželjni primer alergena sadržan u bilo kom od datih ciljajućih grupa T1 i T2 je antigen za humanu ćelijsku liniju mijeloma U266 antitelo IgE-ND. Dalji neoganičavajući i poželjni primer alergena sadržan u bilo kom od datih ciljajućih grupa T1 i T2 je alergen koji jeste ili sadrži sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS 169 do 195.

Ovde je, takođe, otkriven set polipeptida kao što je ove opisano, i, posebno u ranije datom aspektu, za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja izabranih iz grupe koja se sastoji od (i) autoimunog poremećaja; i

(ii) poremećaja preosetljivosti.

Neograničavajući primeri autoimunog poremećaja koji se leče ili sprečavaju u skladu sa pronalaskom su izabrani iz sledeće grupe

(i) alergijski poremećaji;

(ii) multipla skleroza;

(iii) psorijaza;

(iv) sistemski Lupus Erythematosus;

(v) Sjögren-ov sindrom;

(vi) reumatoidni artritiss;

(vii) Idiopatska trombocitopenična purpura;

(viii) dijabetes;

(xi) vaskulitis;

(x) Crohn-ova bolest; i

(xi) amilodioza

Neograničavajući primeri poremećaja preosetljivosti koji se leče ili sprečavaju u skladu sa ovim pronalaskom su izabrani iz grupe koju čine alergije (tip I reakcije preosetljivosti prema Coombs i Gell klasifikaciji), antitelo zavisna citotoksična reakcija (tip II reakcije preosetljivosti), bolest imunskih kompleksa (tip III reakcije preosetljivosti), odloženi tip preosetljivosti (tip IV reakcoje preosetljivosti) i receptorom posredovana autoimunska bolest (tip V reakcije preosetljivosti).

U poželjnom aspektu, dati autoimunski poremećaj ili poremećaj preosetljivosti dolaze zajedno sa ili su izazvani transplantacijom alogenih matičnih ćelija (tj. bilo koji od tipa I do tipa V poremećaja preosetljivosti prema Coombs i Gell klasifikaciji).

Mnoge ćelije inficirane patogenom (na primer, virusom kao što je, na primer, HIV, EBV, CMV) eksprimiraju patogen-kodirane proteine na svojoj površini. Prema tome, u skladu sa ovim pronalaskom, bilo koji od datih antigena A1 i A2 može, takođe, biti takav patogenkodirani protein, kao što je, na primer, HIV, EBV ili CMV protein na površini ćelije. U tom kontekstu, ovde je takođe otkriven set polipeptida kao što je ovde opisano za upotrebu u lečenju ili prevenciji infektivne bolesti, na primer, virusne infektivne bolesti. Posebni primeri patogenkodiranih proteina se mogu naći u http://www.uniprot.org/uniprot/ i to su HIV gp120 (Q78706); EBV LMP-2 (P13285); CMV gB (P06473); HBV HBS (Q9JG36); HCV E1 (C4B751); HCV E2 (Q6TRB1); Human adenovirus C serotype 2 HAdV-2 (P03276).

Ciljevi predmetnog probalaska su, takođe, rešeni molekulom nukleinske kiseline ili grupom molekula nukleinske kiseline koji kodiraju set polipeptida ili jedan od polipeptida iz seta polipeptida kako je definisano u prethodnim realizacijama, gde, poželjno, dati molekul nukleinske kiseline ili molekuli nukleinske kiseline daet grupe molekula nukleinske kiseline sadrže signal za eksport koji posreduje u sekreciji kodiranih polipeptida bakterijskom ili eukariotskom ćelijom.

Neograničavajući primer molekula nukleinske kiseline ili grupe molekula nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom sadrži jednu ili više nukleotidnih sekvenci kako je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 135-150 i 196.

Ciljevi predmetnog pronalaska su, takođe, rešeni vektrom koji obuhvata nukleotidnu sekvencu molekula nukleinske kiseline, kao što je prethodno definisano, ili sekvencu jednog od molekula nukleinske kiseline iz seta molekula nukleinske kiseline, kao što je prethodno definisano.

Ciljevi predmetnog pronalaska su, takođe, rešeni ćelijom koja sadrži datu nukleinsku kiselinu/set nukleinskih kiselina ili dati vektor.

Ciljevi predmetnog pronalaska su, takođe, rešeni farmaceutskim preparatom koja obuhvata ili set polipeptida kao što je prethodno definisano ili molekul nukleinske kiseline/set molekula nukleinske kiseline kako je gore definisano ili vektor kao što je prethodno definisano, pri čemu, poželjno, dati farmaceutski preparat dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.

Ciljevi predmetnog pronalaska, takođe, se rešavaju kompletom koji sadrži set polipeptida kao što je prethodno definisano i / ili molekula nukleinske kiseline ili set molekula nukleinske kiseline prema pronalasku i/ili vektora prema pronalasku.

U jednoj realizaciji, polipeptidi datog seta polipeptida koji su obuhvaćeni datim setom su zatvoreni u jednoj fioli.

U jednoj od realizacija kojoj se daje prednost, polipeptidi datog seta polipeptida koji su obuhvaćeni datim setom su zatvoreni u odvojenim fiolama.

U jednoj realizaciji, jedan ili više polipeptida datog seta polipeptida koji su obuhvaćeni datim kompletom su osušeni zamrzavanjem.

U jednoj realizaciji, jedan ili više polipeptida datog seta polipeptida koji su obuhvaćeni datim kompletom su u rastvoru.

Ovde su, takođe, opisani i postupci lečenja pacijenta koji pati od

(i) tumora ili raka i/ili koji je podvrgnut alogenskoj transplantaciji ćelija ili tkiva;

(ii) autoimunog poremećaja; ili

(iii) poremećaja hipersenzitivnosti.

Dati postupak može da obuhvata korake:

● Dobijanje seta polipeptida, dati set polipeptida obuhvata prvi polipeptid P1 koji se sastoji od

(i) ciljajuće grupe T1, ovde data ciljajuća grupa T1 se specifično vezuje za antigen A1,

i

(ii) fragmenta F1 funkcionalnog domena F, pri čemu ni dati fragment F1 sam po sebi niti dati polipeptid P1 sam po sebi nije funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F,

i

drugi polipeptid P2 koji se sastoji iz

(i) ciljajuće grupe T2, pri čemu data ciljajuća grupa T2 se specifično vezuje za antigen A2, dati antigen A2 molekul na površini ćelije koji je specifičan za određeni tip ćelije ili ćelijsku liniju, i

(ii) fragmenta F2 datog funkcionalnog domena F,

pri čemu ni dati fragment F2 sam po sebi ni dati polipeptid P2 sam po sebi nisu funkcionalni u odnosu na dunkciju datog domena F,

pri čemu se dati antigen A1 razlikuje od datog antigena A2, pri čemu dati polipeptid P1 i polipeptid P2 nisu povezani jedan s drugim u odsustvu supstrata koji ima na svojoj površini obe antigena A1 i A2, konkretnije ćeliju koja nosi oba antigena A1 i A2 na svojoj ćelijskoj površini, i pri čemu, nakon dimerizacije datog fragmenta F1 polipeptida P1 sa datim fragmentom F2 polipeptida P2, dobijeni dimer je funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F,

● Davanje datog seta polipeptida pacijentu.

U takvom postupku, lečenja dati set polipeptida je definisan kao u gore navedenim realizacijama.

Takođe je ovde prikazan postupak korišćenja seta polipeptida kao što je gore opisano za lečenje pacijenta koji je podvrgnut transplantaciji ćelija ili tkiva.

Objekti predmetnog pronalaska su, takođe, rešeni korišćenjem seta proteina kao što je definisano u gore navedenim realizacijama za proizvodnju leka za lečenje pacijenta koji pati od gore definisanih i opisanih bolesti, poremećaja ili, na primer, pacijent koji boluje od raka i/ili je podvrgnut transplantaciji ćelija ili tkiva.

Ovde upotrebljen, termin „polipeptid“ označava linearni molekularni lanac aminokiselina koji sadrži više od 30 aminokiselina. Opciono, polipeptid može da uključuje jednu ili više disulfidnih veza ili da bude hemijski modifikovan. Štaviše, opciono neproteinski element (kao što je fluorofor, RNK-aptamer, DNK-aptamer ili mali molekul) može biti vezan za dati linearni molekularni lanac aminokiselina. Takvi polipeptidi mogu biti proizvedeni bilo kojim poznatim postupkom. Polipeptid se, na primer, može generisati ekspresijom iz nukleinske kiseline koja kodira dati polipeptid, ili se može sintetisati metodama sinteze čvrste faze ili biti proizvedena konjugacijom ili povezivanjem postojećih molekula, npr. hemijskom vezom.

Termin „polipeptid P1“ se koristi da označi polipeptid koji obuhvata (i) ciljajuću grupu, pri čemu se data ciljajuća grupa specifično vezuje za antigen, i (ii) fragment funkcionalnog domena, pri čemu ni jedan fragment nije sam po sebi niti dati polipeptid P1 sam po sebi funkcionalan u odnosu na funkciju navedenog funkcionalnog domena. Termin „polipeptid P2“ se koristi da označi polipeptid koji obuhvata (i) ciljajuću grupu, pri čemu se data ciljajuća grupa specifično vezuje za antigen, i (ii) fragment funkcionalnog domena, pri čemu ni dati fragment sam po sebi ni dati polipeptid P2 sam po sebi nije funkcionalan u odnosu na funkciju datog funkcionalnog domena.

Termin „domen“, ovde upotrebljen, odnosi se na linearni molekularni lanac aminokiselina koji uključuje aminokiselinsku sekvencu čitavog polipeptida ili dela polipeptida. Opciono, domen može da sadrži jednu ili više disulfidnih veza ili da bude hemijski modifikovan. Osim toga, opcionalno domen može da sadrži neproteinski element (kao što je fluorofor). U jednoj realizaciji, međutim, pojam „domen“ ne sadrži jedinjenja koja su hemijski modifikovana ili sadrže neproteinske elemente.

„Funkcionalni domen“, ovde upotrebljen, je domen koji je sposoban da ispunjava određenu funkciju, kao što je specifično vezivanje za određenog vezujućeg partnera ili antigen, specifična aktivacija određenog receptora, posredovanje toksičnih efekata, ili fluorescenciju posle podsticaja svetlošću odgovarajuće talasne dužine. Izraz „funkcionalni domen F“ predviđen je da, poželjno, obuhvata i jedinjenja koja nisu proteinska. U jednoj realizaciji, međutim, odnosi se na proteinsko jedinjenje ili njegov funkcionalni deo.

Izraz „fragment domena“", ovde upotrebljen, odnosi se na linearni molekularni lanac aminokiselina koji odgovara delu domena, ali ne i na ceo domen. Opciono, fragment domena može da obuhvata jednu ili više disulfidnih veza ili da bude hemijski modifikovan. Osim toga, opcionalno domen može da sadrži neproteinski element ili deo takvog neproteinskog elementa. Izraz „fragment F1“ se koristi da označi fragment funkcionalnog domena. Izraz „fragment F2“ se koristi da označi fragment funkcionalnog domena.

Parovi skraćenica P1, P2; T1, T2; F1, F2; A1, A2; i I1, I2, kako su ovde upotrebljeni, imaju za cilj da odrede različite polipeptide, ciljajuće grupe, fragmente, antigene i imunoglobulinske module, respektivno. Oni su sinonimi za prvi polipeptid, drugi polipeptid; prvu ciljajuću grupu, drugu ciljajuću grupu; prvi fragment, drugi fragment; prvi antigen, drugi antigen; i prvi imunoglobulinski modul, drugi imunoglobulinske module, respektivno.

Izraz „grupa (deo)“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na linearni molekularni lanac aminokiselina koji uključuje aminokiselinsku sekvencu čitavog polipeptida ili dela polipeptida. Opciono, deo može da sadrži jednu ili više disulfidnih veza ili da bude hemijski modifikovan. Štaviše, opciono, deo može sadržati neproteinski element (kao što je oligonukleotid). U jednoj realizaciji, međutim, izraz „grupa“ ne obuhvata jedinjenja koja su hemijski modifikovana ili sadrže neproteinske elemente. Izraz „ciljajuća grupa T1“ se koristi da označi deo koji se specifično vezuje za antigen, na primer antigen A1. Izraz „ciljajuća grupa T2" se koristi da označi deo koji se specifično vezuje za antigen, na primer antigen A2.

Ovde upotrebljena, „spojnica (linker)“ je sekvenca aminokiselina unutar polipeptida koja povezuje dva dela pomenutog polipeptida ili dva domena koja obuhvata dati polipeptid.

Izraz „molekul nukleinske kiseline“, upotrebljen u ovom pronalasku, definiše linearni molekularni lanac koji se sastoji od više od 30 nukleotida. Izraz uključuje DNK, kao što je cDNK ili genomska DNK, i RNK.

Izraz „konstrukt“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji sadrži jednu ili više rekombinantnih nukleotidnih sekvenci. Izraz, takođe, uključuje polipeptide koji su eksprimovani iz rekombinantne nukleotidne sekvence ili su veštački napravljeni ili rekombinantne molekule koji sadrže dve ili više aminokiselinskih sekvenci koje se prirodno ne nalaze u tom istom proteinu.

Izraz „se specifično vezuje za“ ili „specifično vezuje“, kako upotrebljen u ovom pronalasku u kontekstu molekula ili domena koji se specifično vezuje za partnera ili antigena interakcije ili koji specifično vezuje partnera interakcije ili antigen, znači da se molekul ili domen vezuje za dati partner interakcije ili antigen, poželjno nekovalentnim vezivanjem, ili je sposoban za vezivanje datog partnera interakcije ili antigena, poželjno nekovalentnim vezivanjem, a ne reaguje ili u suštini ne reaguje unakrsno sa bilo kojim drugim partnerom interakcije ili antigenom sa strukturom sličnom onoj kod partnera interakcije ili antigena. U kontekstu ciljajuće grupe (kao što je ciljajuća grupa T1 ili T2) koji se specifično vezuje za antigen (kao što je antigen A1 ili A2), izraz „se specifično vezuje za“ ima za cilj da označi situaciju u kojoj ili je data ciljajuća grupa sposobna da se specifično veže za navedeni antigen, ili u kojoj se u stvari vezuje za njega. U kontekstu domena angažovanja T ćelija, domena za angažovanje NK ćelija, domena za angažovanje ćelija makrofaga, domena za angažovanje monocita, domena za angažovanje granulocita, domen aza angažovanje neutrofilnih granulocita ili domena za angažovanje aktiviranih neutrofilnih granulocita, monocita i/ili makrofaga, izraz „koji se specifično vezuje za“ antigen ili molekul ili se „specifično vezuje za“ antigen ili molekul ima za cilj da označi situaciju u kojoj je ili odgovarajući domen sposoban da se specifično vezuje za dati antigen ili molekul, ili situaciju u kojoj se u stvari vezuje za njega. U kontekstu funkcionalnog domena koji je domen koji se „specifično vezuje za“ antigen, molekul, jedinjenje, molekul-nosač ili afinitetnu oznaku, izraz „se specifično vezuje za“ ima za cilj da označi situaciju u kojoj je dati funkcionalni domen ili sposoban da se specifično vezuje za navedeni antigen, molekul, jedinjenje, molekul nosač ili afinitetnu oznaku ili situaciju u kojoj se u stvari vezuje za njih. U kontekstu toksina, fluorofora, antigena, molekula nosača ili afinitetne oznake koje su „specifično vezane“ funkcionalnim domenom, ovo se odnosi na situaciju u kojoj je pomenuti funkcionalni domen ili sposoban da se specifično vezuje za pomenuti toksin, fluorofor, antigen, molekul-nosač ili afinitetne oznake, ili situaciju u kojoj se u stvari vezuje za njih.

Ovde upotrebljen, molekul ili antigen je „specifičan za određeni tip ćelije ili ćelijsku liniju“ ako se eksprimuje datim ćelijskim tipom/ćelijama date ćelijske linije, ali ne (ili samo u zanemarljivoj meri) drugim tipovima ćelija ili ćelijama druge ćelijske linije. U određenim realizacijama, molekul ili antigen je „specifičan za određeni ćelijski tip ili ćelijsku liniju“ ako se eksprimuje pomenutim ćelijskim tipom/ćelijama date ćelijske linije, a ne više od nekoliko drugih tipova ćelija ili ćelija druge ćelijske linije osim datog ćelijskog tipa/ćelija date ćelijske linije eksprimuje navedeni antigen, takođe, dok većina drugih ćelijskih tipova ili ćelija druge ćelijske linije pored datog ćelijskog tipa/ćelija datog ćelijske linije ne eksprimuju navedeni antigen (ili samo u zanemarljivoj meri) . Izraz „specifičan za određeni ćelijski tip ili ćelijsku liniju“, takođe, može značiti da je dati molekul ili antigen eksprimovan datim ćelijskim tipom/ćelijama date ćelijske linije većom brzinom ili u većoj proporciji ili količini nego kod drugih tipova ćelija/ćelija drugih ćelijskih linija, u smislu da može postojati i mala, ali detektibilna ekspresija datog molekula, takođe, u drugim ćelijskim tipovima/ćelijama drugih ćelijskih linija. Izraz „marker“, koji se ovde koristi u kontekstu markera za određeni ćelijski tip ili ćelijsku liniju, može se odnositi na molekul ili antigen koji je specifičan za ćelijski tip ili ćelije ćelijske linije, respeltivno, kao što je gore opisano.

Ovde upotrebljen, izraz „aptamer“ odnosi se na malo jedinjenje sastavljeno od oligonukleinske kiseline (kao što je RNK ili DNK) ili peptidnog ili nepeptidnog molekula koji se vezuje za specifični ciljni molekul sa visokim afinitetom.

Ovde upotrebljen, izraz „molekul nosač“ odnosi se na molekul ili deo molekula koji nije prepoznat kao strano telo od strane imunog sistema pacijenta kod koga se set polipeptida prema pronalasku administrira ili koji ne uzrokuje nikakvu ili samo slabu imunološku reakciju pacijenta kod koga se administrira set polipeptida prema pronalasku. Poželjno, takav „molekul nosač“ je vezan ili može biti vezan drugim molekulom, kao što je antitelo. U nekim realizacijama, „molekul nosač“ je molekul ili deo molekula koji je U određenim realizacijama moleku nosač povezan je kovalentno ili nekovalentno sa drugim molekulom ili delom drugog molekula, na primer fluoroforom ili toksinom.

Izraz „MHC“ odnosi se na Glavni kompleks histokompatibilnosti, koji je set gena koji kodiraju grupu molekula koji sadrže molekule ćelijske površine koji su potrebni za prezentaciju antigena u T ćelije i koji su, takođe, odgovorni za brzo odbacivanje kalema. Kod ljudi, MHC uključuje gene HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-HQ i HLA-DR. U sadašnjoj primeni, izraz se koristi da označi gene glavnog kompleksa histokompatibilnosti, kao i na genske proizvode koji su kodirani ovim genom. Izraz „HLA“ odnosi se na humane leukocitne antigene. Ovde upotrebljen, „HLA“ je humani oblik „MHC“.

Izraz „alelna varijanta“, ovde upotrebljen, označava bilo koji od dva ili više alternativnih oblika gena koji zauzimaju isti hromozomski lokus. Na primer, HLA-A1, HLA-A2 i HLA-A3 su tri alelne varijante HLA-A. Izraz alelna varijanta se ovde koristi i za označavanje proteina kodiranog alelnom varijantom gena.

Izraz „antigen“, ovde upotrebljen, označava molekul za koji se zna da je specifično vezan ili može biti specifično vezan antitelom ili antigen vezujućim delom antitela. U svom najširem smislu, „antigen A1“ se odnosi na antigen koji je gore definisan. U svom najširem značenju „antigen A2“ se odnosi na antigen koji je gore definisan. Oznake „antigen A1“ i „antigen A2“ su izabrane kako bi se omogućilo razlikovanje između „antigena A1“ i „antigena A2“. „MHC antigen“ je antigen koji je, takođe, molekul koji pripada glavnom kompleksu histokompatibilnosti. MHC antigeni uključuju antigene MHC klase I (kod ljudi, antigeni HLA-A, -B i -C) i MHC klase II antigena (kod ljudi, antigeni HLA-DP, -DQ i -DR). Fraza da ćelija „nosi antigen“ ili „nosi antigen na svojoj ćelijskoj površini“ ima za cilj da označi situaciju u kojoj ćelija eksprimuje antigen koji je prisutan na ćelijskoj površini pomenute ćelije i dostupan za antitelo s spoljne strane date ćelije. Fraza da supstrat „ima antigen na svojoj površini“ ima za cilj da označi situaciju u kojoj je navedeni antigen prisutan na površini datog supstrata i dostupan za antitelo primenjeno na dati supstrat.

Izraz „antigen koji je specifičan za maligno stanje ćelije“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na antigen koji malignu ćeliju određenog ćelijskog tipa (kao što je maligna tumorska B ćelija) nosi na svojoj ćelijskoj površini, ali da ga ćelija istog tipa koja nije maligna (kao što je nemaligna B ćelija) ne nosi (ili samo u zanemarljivoj meri nosi) na svojoj ćelijskoj površini. Izraz „antigen/molekul koji je specifičan za maligni tip ćelije“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na antigen/molekul kojeg maligna ćelija određenog ćelijskog tipa (kao što je maligna tumorska B ćelija) nosi na svojoj ćelijskoj površini ali ga ćelija istog tipa koja nije maligna (kao što je nemaligna B ćelija) ili ćelije drugih vrsta (kao što su T ćelije ili hepatociti) ne nose (ili samo u zanemarljivoj meri nose) na svojoj ćelijskoj površini. U određenim realizacijama, izraz „antigen/ molekul koji je specifičan za maligni tip ćelije“ odnosi se na antigen/molekul koga maligna ćelija određenog ćelijskog tipa (kao što je maligna tumorska B ćelija) nosi na svojoj ćelijski površini, ali ga ćelija istog ćelijskog tipa koja nije maligna (kao što je nemaligna B ćelija) ne nosi (ili samo u zanemarljivoj meri nosi) na svojoj ćelijski površini, a da ga samo ćelije nekoliko drugih tipova ćelija pored osim određenog ćelijskog tipa nose na površini ćelije, dok ga ćelije većine drugih ćelija ne nose (ili samo u zanemarljivoj meri nose). Izraz „antigen/molekul koji je specifičan za maligni tip ćelije“, takođe može da znači da je dati antigen/molekul eksprimovan pomenuta maligna ćelija određenog ćelijskog tipa većom brzinom ili u većoj proporciji ili količini nego kod ćelije istog ćelijskog tipa koji nije maligni, u smislu da može biti i mala, ali detektibilna ekspresija datog molekula, takođe u ćeliji istog ćelijskog tipa koja nije maligna. Izraz „marker“, kako je ovde upotrebljen u kontekstu markera za maligno stanje određene ćelije ili malignog tipa ćelije, može se odnositi na molekul ili antigen koji je specifičan za maligno stanje određene ćelije ili za maligni tip ćelije, respektivno, kao što je gore opisano.

Izraz „domen imunoglobulina“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na domen koji se u suštini sastoji od globularnog regiona lanca antitela. Imunoglobulinske domene karakteriše to da zadržavaju imunoglobulinsku bočnu karakteristiku molekula antitela. Imunoglobulini, kao što su IgG, IgE ili IgM, sastoje se od različitog broja teških i lakih lanaca. Svaki teški i laki lanac sadrži konstantnu regiju i varijabilnu regiju. Svaka varijabilna regija lakog lanca (VL) i svaka varijabilna regija težeg lanca (VH) sadrži tri hipervariabilne regije, koje se, takođe, zovu „regije koji određuju komplementarnost“ ili „CDR-ovi“. CDR su prvenstveno odgovorni za vezivanje imunoglobulina za antigen.

Izrazi „VH“ ili „VHdomen“ se koriste međusobno zamenljivo i odnose se na varijabilnu regiju teškog lanca imunoglobulina antitela. Izrazi „VL“ ili „VLdomen“ se međusobno zamenljivo i odnose se na varijabilnu regiju lakog lanca imunoglobulina antitela.

Izraz „imunoglobulinski modul“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na molekul, deo molekula ili molekularnog sklopa koji sadrži jedan ili više, poželjno dva ili više imunoglobulinska domena i koji je sposoban da se vezuje za antigen. Poželjno, „imunoglobulinski modul“ sadrži linearni molekularni lanac amino kiselina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu jednog ili više, poželjno dva ili više, imunoglobulinska domena. Opciono, „imunoglobulinski modul“ sadrži jednu ili više, poželjno dve ili više, disulfidne veze. Izrazom „imunoglobulinski modul“ obuhvaćeni su molekuli ili delovi molekula koji sadrže ili se sastoje od „jednolančane varijante fragmenta“ antitela. Izrazom „imunoglobulinski modul“ obuhvaćeni su, takođe, molekuli ili delovi molekula koji sadrže ili se sastoje od VHH domena antitela lama, antitela kamiljeg porekla, ili antitela od ajkula.

Izraz „imunoglobulinski modul I1“ se koristi da označi modul imunoglobulina koji sadrži VLdomen povezan sa VHdomenom. Poželjno, dati domen VLi VHdomen datog imunoglobulinskog modula I1 izvedeni su iz istog antitela. Poželjno, dati VLdomen i VHdomen datog imunoglobulinog modula I1 formiraju dimer. Poželjno, dati dimer je sposoban da se specifično vezuje za antigen. Antigen može biti, na primer, antigen A1. U jednoj realizaciji dati „imunoglobulinski modul I1“ sadrži „jednolančanu varijantu fragmenta“ antitela koji je sposoban da se specifično vezuje za antigen, na primer antigen A1.

Izraz „imunoglobulinski modul I2“ se koristi da označi imunoglobulinski modul koji sadrži VLdomen povezan sa VHdomenom. Poželjno, dati domen VLi dati VHdomen imunoglobulinskog modula I2 izvedeni su iz istog antitela. Poželjno, dati VLdomen i VHdomen datog imunoglobulinog modula I2 formiraju dimer. Poželjno, dati dimer je sposoban da se specifično vezuje za antigen. Antigen može biti, na primer, antigen A2. U jednoj realizaciji dati „imunoglobulinski modul I2“ sadrži „jednolančanu varijantu fragmenta“ antitela koji je sposoban da se specifično vezuje za antigen, na primer antigen A2. U okviru konstrukta imunoglobulinskog modula koji sadrži VLdomen povezan sa VHdomenom, VLdomen može biti pozicioniran N- ili C-kraju odgovarajućeg VHdomena. Stručnjak u tehnici je u stanju da odredi koji je aranžman VHi VLdomena pogodniji za određeni domen jednolančane varijante fragmenta.

Izrazi „Fv“ i „varijanta fragmenta“, kako su ovde upotrebljeni, odnose se na fragment antitela koji je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto prepoznavanja antigena i vezivanja. Ova regija se sastoji od dimera varijabilnog regiona jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi (VH-VLdimer). U ovoj konfiguraciji, VHi VLdomen zajedno definišu mesto vezivanja antigena sa specifičnošću vezivanja antigena na površini VH-VLdimera.

Izrazi „scFv“, „jednolančani Fv“ i „jednolančana varianta fragmenta“ se koriste neđusobno zamenljivo i imaju za cilj da odrede antitelo ili deo antitela u kojem su varijabilna regija teškog lanca (VH) i varijabilna regija lakog lanca (VL) tradicionalnog antitela sa dvostrukim lancima spojeni da formiraju jedan lanac. Uobičajeno je da se spojnica ubaci između dva lanca kako bi se omogućilo pravilno sklapanje i stvaranje aktivnog mesta za vezivanje.

Izraz „antitelo lame“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na antitelo ili deo antitela izveden iz lame. Izraz „kamilje antitelo“ (antitelo kamile), kako je ovde upotrebljen, odnosi se na antitelo ili deo antitela izveden iz kamele. Izraz „antitelo ajkule“, kako je ovde upotrebljeno, odnosi se na antitelo ili deo antitela izveden iz ajkule. Antitela lama, kamile i ajkule imaju antigen vezujući deo koji je sačinjen od strane jednog pojedinačnog domena, VHH, (umesto VHi VLlanca)

Izraz „domen za angažovanje T ćelija“, kako je ovde upotrebljen, podrazumeva se da se odnosi na domen koji se specifično vezuje za antigen koji je prisutan na ćelijskoj površini T ćelija. Poželjno, vezivanje datog domen za angažovanje T ćelija za dati antigen aktivira T ćeliju. Slično tome, izraz „domen za angažovanje NK ćelija“ odnosi se na domen koji se specifično vezuje za antigen koji je prisutan na ćelijskoj površini ćelija ubica (eng. Natural Killer). Poželjno, vezivanje datog domena za angažovanje NK ćelija za dati antigen aktivira NK ćelije.

Izraz „domeni koji angažuju ćelije makrofaga“ odnosi se na domen koji se specifično vezuje za antigen koji je prisutan na ćelijskoj površini ćelija makrofaga. Poželjno, vezivanje datih domeni koji angažuju ćelije makrofaga za dati antigen aktivira ćelije makrofaga. Izraz „domen za angažovanje monocita“ odnosi se na domen koji se specifično vezuje za antigen koji je prisutan na ćelijskoj površini monocita. Poželjno, vezivanje datog domena za angažovanje monocita za dati antigen aktivira monocite. Izraz „domen za angažovanje granulocita“ odnosi se na domen koji se specifično vezuje za antigen koji je prisutan na ćelijskoj površini granulocita. Poželjno, vezivanje datog domena za angažovanje granulocita za dati antigen aktivira granulocite. Izraz „domen za angažovanje neutrofilih granulocita“ se odnosi na domen koji se specifično vezuje za antigen koji je prisutan na ćelijskoj površini neutrofilnog granulocita. Poželjno, vezivanje datog domena za angažovanje neutrofilih granulocita za dati antigen aktivira neutrofilne granulocite. Izraz „domen za angažovanje neutrofilih granulocita, monocita i/ili makrofaga“ se odnosi na domen koji se specifično vezuje za antigen koji je prisutan na ćelijskoj površini aktiviranih neutrofilnih granulocita, monocita i/ili makrofaga. Poželjno, vezivanje datog domena za angažovanje neutrofilih granulocita, monocita i/ili makrofaga za dati antigen aktivira date monocite i/ili makrofage.

Izraz „molekul sposoban za posredovanje bioluminiscencije“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na molekul (ili funkcionalni deo molekula) koji ima enzimsku aktivnost koja u prisustvu odgovarajućeg supstrata katalizuje reakciju koja uzrokuje bioluminiscenciju. Izraz uključuje luciferaze, kao što su luciferaze svitaca ili Gaussia.

Izraz „GFP varijanta“, ovde upotrebljen, odnosi se na molekul koji ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz aminokiselinske sekvence zelenog fluorescentnog proteina iz Aequorea victoria uvođenjem izmena koje imaju za rezultat veću fluorescenciju ili fluorescenciju u različitim bojama. Izrazom je obuhvaćeno, između ostalog, YFP (žuti fluorescentni protein), CFP (cijan fluorescentni protein), Venus (Nagai T et al., A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications (Varijanta žutog fluorescentnog proteina sa brzim i efikasnim sazrevanjem za ćelijsko-biološke primene). Biotechnol 2002 Jan; 20 (1): 87-90), Cerulean (Poboljšani CFP sa S72A, Y145A i H148D supstitucijama). „Poboljšani GFP“ (i, analogno, „poboljšani YFP“, „poboljšani CFP“) odnosi se na GFP (YFP, CFP) koji je „humanizovan“, kako je objavljeno u Kain et al. (1995) Biotechniques 19 (4): 650-55. „Humanizovani“ odnosi se na promene u sekvenci nukleinske kiseline GFP (YFP, CFP) za optimizaciju kodona za ekspresiju proteina u ljudskim ćelijama.

Izraz „molekul komplementacije bimolekularne fluorescencije“, kako je ovde upotrebljeno, odnosi se na fluorescentni molekul koji se može dobiti kao dva fragmenta koji sami po sebi nisu fluorescentni, ali koji nakon heterodimerizacije između dva fragmenta formiraju dimer koji je sposoban za fluorescenciju.

Izraz „terapeutsko jedinjenje“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na jedinjenje pogodno za sprečavanje, lečenje, ublažavanje ili izlečenje bolesti ili stanja bolesti. Poželjno, „terapeutsko jedinjenje“ je jedinjenje koje, nakon ulaska u ćeliju, može da izazove smrt te ćelije. U nekim realizacijama, terapeutsko jedinjenje može biti hemijsko ili radioaktivno jedinjenje koje oštećuje vitalne ćelijske strukture ili prekida vitalne ćelijske procese.

Izraz „dijagnostičko jedinjenje“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na jedinjenje koje se može detektovati uobičajenim metodama detekcije, kao što su metode koje se koriste na klinici ili u biohemijskim ili medicinskim dijagnostičkim laboratorijama, na primer, fluorescentno jedinjenje, radioaktivno jedinjenje ili molekul koji posreduje bioluminiscenciju.

Izraz „progenitor/prekursorske ćelije“ podrazumeva se da označava nezrele, nediferencirane ili delimično diferencirane ćelije koje se obično nalaze na postnatalnim životinjama/ljudima i imaju potencijal da diferenciraju u određeni ćelijski tip ili u određene vrste ćelija. Izraz „progenitor/prekursorske ćelije tumora“ označava progenitorne/prekursorske ćelije sa promenjenim svojstvima (npr. u vezi sa ponašanjem proliferacije ili šemom ekspresije gena) koje dovode do pojave tumorskih ćelija. Primeri za takve progenitorne/prekursorske ćelije tumora su npr. leukemijski prekursor ili progenitorske ćelije.

Izraz „rak“, ovde upotrebljen, odnosi se na malignu ćeliju, grupu ćelija ili malignu neoplaziju. Izraz obuhvata i karcinome, sarkome, limfome, leukemije, tumore germinalnih ćelija i blastom. „Kancerozna ćelija“ je ćelija koja je deo ili koja je izvedena iz raka. Izraz „tumor“ se koristi naizmenično sa izrazom „rak (kancer)“.

Ovde upotrebljen, izraz „hematološki tumor“ odnosi se na rak krvnog sistema ili sistema za izgradnju krvi (kao što su ćelije koštane srži, ćelije za izgradnju krvi i ćelije prekursora zrelih krvnih zrnaca). U nekim realizacijama, izraz „hematološki tumor“ se odnosi na hematološku neoplaziju. Ovde upotrebljen, izraz „nehematološki tumor“ odnosi se na tumor koji nije hematološki tumor.

Izraz „pacijent koji je podvrgnut transplantaciji alogenog tkiva ili ćelija“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na situaciju u kojoj pacijent prima ili je primio transplantirane ćelije ili transplantirano tkivo koje je dobijeno od druge osobe. Poželjna situacija u vezi sa ovim aspektom je situacija sa neusaglašenim HLA antigenima. Jedinica „µg/m<2>“, kako je ovde upotrebljena u kontekstu količine polipeptida koji se administrira, odnosi se na određenu količinu polipeptida po kvadratnom metru površine tela pacijenta kojem se daje dati polipeptid (peptid se može administrirati bilo kojim adekvatnim načinom primene, kao što je intravenozno ili supkutano ubrizgavanje). Na primer, izraz „Količina polipeptida koja je administrirana je 50 µg/m<2>dnevno za polipeptid P1.“ ima za cilj da označi situaciju u kojoj je količina polipeptida P1 koja se primenjuje dnevno 50 µg po kvadratnom metru površine tela pacijenta kome se daje polipeptid P1. U slučaju pacijenta sa telesnom površinom od 2 m<2>, to bi značilo da mu se daje 100 µg polipeptida P1 dnevno.

Sadašnji pronalazači su iznenađujuće utvrdili da se sa setom polipeptida prema pronalasku mogu prevazići gore opisani problemi iz stanja tehnike i goreopisani ciljevi mogu postići. Štaviše, sadašnji pronalazači su iznenađujuće utvrdili da sa setom polipeptida prema pronalasku, ćelije sa specifičnom kombinacijom dva antigena mogu biti identifikovane i/ili eliminisane sa visokom specifičnošću i smanjenim neželjenim efektima.

Jedna od prednosti kombinatorne strategije pronalaska je da se ne koriste prethodno formirane F jedinice (na primer, anti-CD3 jedinice). F1 i CD3 VHi VL) ne heterodimerizuju per se, čak ni u prisustvu agensa koji stabilizuje njihovu dimerizaciju (na primer, antigen sposoban da se vezuje za domen F, kao na primer, CD3, HIS ili DIG), i time nemaju za rezultat funkcionalni F domen (na primer, ne stimulišu T ćelije). Isključivo u situacijama u kojima se oba komplementarna konstrukta P1 i P2 istovremeno vezuju na površini date ćelije, dve komponente F1 i F2 rekonstruišu F domenu (na primer, mesto vezivanja CD3). Stoga, funkcija F domena (na primer, aktivacija T ćelija) odvija se upravo tamo gde je to potrebno, ali ne i sistemski. Stoga se može pretpostaviti da kombinatorna strategija pronalaska ima manje toksičnih efekata, na primer u poređenju sa normalnim bispecificnim strategijama antitela. To se, takođe, dokazuje dodatnim primerima, naročito in vivo modelom alogene transplantacije, gde HLA-A2 pozitivni miševi nisu trpeli nikakve kliničke efekte nakon infuzije HLA-A2 reaktivnih konstrukata.

Posebno, za označavanje ćelija koje eksprimuju predefinisani antigen potpis, dva polipeptida sa jednostrukim lancem su kreirana kao delovi finalnog bipartitnog (bi-molekularnog) konstrukta (bi-molekularni / trispecifični antitelski konstrukt), svaki sastavljen od jednolančane varijante fragmenta koji vezuje antigen (scFv) i ili varijabilnog domena lakog (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) antitela. Kada ova dva hibridna fragmenta vezuju svoje odgovarajuće antigene na površini jedne ćelije, VL i VH domeni međusobno reaguju kako bi rekonstituisali izvorno mesto vezivanja antigena i time ispunjavaju željene zahteve.

Kao što je već pomenuto, jedna od prednosti seta polipeptida iz pronalaska je da je vezivanje oba ciljna antigena na površinu ćelije neophodno za funkcionalnu heterodimerizaciju. Samosastavljanje dva komplementarna dela i naknadna stimulacija T ćelije nakon vezivanja samo jednog kraka za njegov antigen može se isključiti, čime se potkrepljuju objavljeni podaci koji pokazuju da je vezivanje VHili VLsamo po sebi niskog afiniteta i da VH/VLheterodimeri imaju tendenciju da se brzo razdvoje u odsustvu antigena (Colman, 1987, Nature 326, 358-363; Amit, 1986, Science 233, 747-753; Law, 2002, Int Immunol 14, 389-400; Ueda, 1996, Nat Biotechnol 14, 1714-1718).

Za razliku od domena homo- ili heterodimerizacije koji su dobro poznati u tehnici (leucinski zatvarač, Fc-domeni, „knob into hole“, itd.), VH i HL interakcije su niskog afiniteta. Međutim, pokazano je da se VH / VL interakcija može stabilizovati posle vezivanja za specifični antigen. Ne vezujući se za teoriju, VH/VL interakcija u skladu sa ovim pronalaskom odvija se samo u situacijama kada su oba fragmenta ranije vezana za svoje srodne antigene, na primer na površini ciljne ćelije. Takođe, ne vezujući se za teoriju, nakon istovremenog vezivanja na meti (cilju), konstrukti se dovode u neposrednu blizinu, tako da mogu formirati trimerni kompleks sa antigenom. Tako na cilju dopunjeni trispecifični heterodimer iz pronalaska funkcionalan je u odnosu na funkciju domena F, na primer, pokreće i stimuliše T ćelije na uništavanje tumorskih ćelija ako je anti-CD3 rekonstituisan.

Osim jedne prednosti konstrukata prema pronalasku P1 i P2, npr. izazvana je kombinatorna priroda imunološkog odgovora, iznenađujuće je otkriveno u kontekstu ovog pronalaska da bimolekularni konstrukt sa prekinutim F domenom, na primer scFv-anti CD3, ne pokazuje van ciljne efekte.

Set polipeptida prema ovom pronalasku, posebno polipeptidi P1 i P2 koji su ovde obuhvaćeni, imaju dodatnu prednost da su stabilniji i/ili imaju poboljšan rok trajanja (naročito na 4°C) u poređenju sa konvencionalnim bispecifičnim konstruktima kao što su BiTE konstrukti. Ovi konvencionalni bispecifični konstrukti imaju tendenciju da se agregiraju (naročito na 4°C).

Predviđeno je da polipeptidi iz ovog pronalaska P1 i P2, posebno F1 i F2 koji su sadržani u njima, posebno od VHi VLkoji mogu da se sastoje u njima, zahvaljujući njihovom hidrofobnom interfejsu, mogu da vezuju albumin. To dovodi do poboljšanog vremena zadržavanja; tj. duže bioraspoloživosti in vivo, ali i in vitro, kao na primer, u uzorcima seruma ili krvi.

Set polipeptida prema predmetnom pronalasku obuhvata prvi polipeptid P1 i drugi polipeptid P2. Prvi polipeptid P1 sadrži prvu ciljajuću grupu T1 (koji je sposoban da se specifično vezuje za antigen A1) spojen (fuzionisan) sa prvim fragmentom F1 funkcionalnog domena F (vidi Sliku 1A, gore). Drugi polipeptid P2 obuhvata drugu ciljajuću grupu T2 (koji je sposoban da se specifično vezuje za antigen A2) spojen (fuzionisan) sa drugim fragmentom F2 funkcionalnog domena F (vidi Sliku 1A, dole). Ono šta je važno, fragmenti F1 resp. F2 funkcionalnog domena nisu toksični samostalno i ne mogu da izvrše bilo kakvu biološku funkciju osim ukoliko ne postoji partnerstvo između dva polipeptida P1 i P2. Kada se oba polipeptida P1 i P2 simultano vezuju za svoje antigene na površini jedne ćelije koja eksprimuje oba antigena A1 i A2, fragmenti F1 i F2 funkcionalnog domena F su dovedeni u neposrednu blizinu, oni hetero-dimerizuju i stoge doprinose željenoj biološkoj funkciji (vidi Sliku 1B). Sa druge strane, ćelija koja eksprimuje ili samo antigen A1 (Slika 1C) ili samo antigen A2 (Slika 1D) ili nijedan od antigena ne uzrokuje komplementaciju biološke funkcije. Stoga biološka funkcija se postiže sa visokom specifičnošću samo u prisustvu ćelija koje imaju oba antigena A1 i A2 na svojoj ćelijskoj površini po simultanom vezivanju oba polipeptida P1 i P2 za takvu ćeliju. U zavisnosti od prirode funkcionalnog domena F, različiti ciljevi, kao što je specifična identifikacija/detekcija ili eliminacija ćelija koje eksprimuju oba antigena A1 i A2, se mogu postići.

U jednom od primera realizacije, ovo primenjen je princip iz pronalaska za specifičnu eliminaciju tumorskih ćelija:

Nove histopatološke analize i protočna citometrija otkrile su da ćelije tumora mogu da se detektuju i razlikuju od netransformisanih ćelija ne sa jednim površinskim markerom, već ekspresijom aberantnih kombinacija/profila antigena, kao što je poznato za hematopoetsku neoplaziju i ćelije raka i matične ćelije raka raznog drugog porekla. Stoga dok jedan antigen možda ne bude dovoljan da specifično identifikuje određenu tumorsku ćeliju, specifična kombinacija dva antigena može da dozvoli razlikovanje tumorske ćelije od nekog drugog tipa ćelije.

Na primer, set polipeptida prema ovom pronalasku može se koristiti da specifično ukloni ćelije rakak koje karakteriše simultana ekspresija antigena CD33 i CD19 na njihovoj ćelijskoj površini. Ova kombinacija antigena nalazi se kod određenih vrsta ćelija akutne leukemije i razlikuje te ćelije od bilo kojih drugih ćelija (kao što su nemaligne ćelije), koje mogu nositi ili CD33 ili CD19 na svojoj ćelijskoj površini ali ne nose i CD33 i CD19 na svojoj ćelijskoj površini (Ossenkoppele et al., Review of the relevance of aberrant antigen expression by flow cytometry in myeloid neoplasms. Br J Haematol 2011, 153(4):421-36).

Da bi se specifično eliminisale ove ćelije leukemije koje nose i CD33 i CD19 na svojoj ćelijskoj površini, prva ciljajuća grupa T1 prvog polipeptida P1 može da bude jednolančana varijanta fragmenta (scFv) specifična za CD33. Kao fragment F1 funkcionalnog domena F, može se izabrati varijabilni domen lakog lanca VLanti CD3 antitela. Druga ciljajuća grupa T2 drugog polipeptida P2 može biti scFv specifičan na CD19. Kao fragment F2 funkcionalnog domena F, može se izabrati varijabilni domen teškog lanca VHanti CD3 antitela. Varijabilni domen lakog lanca VL i varijabilni domen teškog lanca VH anti CD3 antitela su svaki samostalno netoksični. Takođe, ne mogu da ispolje svoju biološku funkciju (tj. da efektivno vežu CD3 antigen) osim ukoliko ne postoji partnerstvo između polipeptida P1 i P2.

U prisustvu leukemijske ćelije koja ima i CD33 i CD19 na svojoj ćelijskoj površini, oba polipeptida P1 i P2 se istovremeno vezuju za tu ćeliju. Kao posledica toga, fragmenti F1 i F2 funkcionalne grupe F (tj. teški i laki lanac Fv anti CD3 varijabilnog domena tog anti-CD3 antitela) dovedeni su u neposrednu blizinu, heterodimerizuju i time dopunjuju željenu biološku funkciju, omogućujući dimeru P1 i P2 da se specifično vezuju za CD3.

CD3 je molekul površine ćelije koji je prisutan na površini T ćelija. Molekul je deo kompleksa signalizacije T ćelija, a unakrsna veza molekula CD3 na površini T ćelije nakon vezivanja CD3 specifičnog antitela dovodi do aktivacije T ćelije. Angažovanjem CD3 antigena na površini T ćelija, heterodimeri polipeptida P1 i P2 mogu da regrutuju T ćelije i aktiviraju ih. Kao rezultat toga, izaziva se tipični efektorski mehanizmi citotoksičnog T ćelijskog odgovora, što dovodi do lize ćelija: oslobađanja litičnih granula koje sadrže citotoksične proteine perforina, granzime i granulizin. Perforin formira pore u membrani ciljne ćelije kroz koje granzimi mogu ući i indukovati apoptozu. Ovi efekti dovode do specifičnog razaranja ćelija koje nose i CD33 i CD19 antigen na svojoj ćelijskoj površini.

Druge ćelije osim leukemijskih ćelija nemaju i CD33 i CD 19 antigen na svojoj ćelijskoj površini. Stoga, ne mogu regrutovati oba polipeptida P1 i P2 i ne postiže se komplementacija sposobnosti vezivanja CD3 i angažovanja CD3 pozitivnih limfocita. Posledično, druge ćelije osim ćelija leukemije nisu ugrožene, i postiže se razaranje malignih ćelija sa izrazitom specifičnošću.

Ovo je u potpunoj suprotnosti sa konvencionalnim bispecifičnim antitelima. Konvencionalni bispecifični konstrukt koji angažuje T ćelije i ima specifičnost za ćelije koje eksprimuju CD33 posreduje uništavanje svih CD33 pozitivnih ćelija. Budući da je CD33 marker mijeloidne linije koji je eksprimovan na mnogim mijeloidnim ćelijama i mijeloidnim progenitornim ćelijama, uništavanje ovih ćelija će imati za rezultat dugotrajnu aplaziju i verovatnu smrt pacijenta. Konvencionalni bispecifični konstrukt koji angažuje T ćelije i ima specifičnost za CD19 pozitivne ćelije bi doveo do eliminacije svih ćelija koje nose CD19 antigen na svojoj ćelijskoj površini. CD19 je eksprimovan na značajnom podskušu B limfocita. Razaranje ovih ćelija bi dovelo do ozbiljnog razaranja imunog sistema. Stoga, osim eliminisanja leukemijskih ćelija koje istovremeno eksprimuju CD33 i CD19 na površini, primena konvencionalnih bispecifičnih antitela sa specifičnošću na CD33 i CD19 bi vodila eliminaciji mijeloidnih ćelija i značajnog podskupa B limfocita.

Stoga, dok konvencionalna bispecifična antitela prepoznaju samo jedan antigen na površini ćelije koji treba eliminisati, aktivacija efektora prema predmetnom pronalasku zahteva simultano prepoznavanje dva specifična antigena na površini ćelije koje je potrebno identifikovati/eliminisati. Kao posledica, predmetni pronalazak postiže značajno unapređenu specifičnost i smanjena neželjena dejstva.

Stručnjaku u tehnici je jasno da su, u okviru principa predmetnog pronalaska, moguće različite varijacije u odnosu na primer realizacije gore opisan.

Na primer, pristup opisan u prethodnom primeru realizacije može se lako prilagoditi za identifikaciju/eliminaciju drugih vrsta tumorskih ćelija pored CD33 i CD19 pozitivnih ćelija akutne leukemije jednostavno izborom odgovarajućih ciljajućih grupa T1 i T2 koje se specifično vezuju za antigene A1 i A2, respektivno, koji su istovremeno prisutni na ćelijama koje se identifikuju/eliminišu, ali nisu istovremeno prisutni na drugim tipovima ćelija. Kao što je prethodno citirano, mnoge, ako ne i sve ćelije raka (ali i progenitorne/prekursor ćelije ćelija raka), eksprimuju određeni broj molekula ćelijske površine, koje su per se široko eksprimovani na normalnim tkivima, ali su indikativni za maligni fenotip ako se iskažu u nefiziološkoj kombinaciji. Na primer, CD34 je marker za hematopoetske matične ćelije, a CD7 se može detektovati na podskupu limfoidnih ćelija. Kombinacija CD34 i CD7, međutim, snažno je povezana sa malignitetom, a aberantna ko-ekspresija dva antigena može se otkriti u značajnom delu akutnih mielogenih leukemija (Ossenkoppele et al., Review of the relevance of aberrant antigen expression by flow cytometry in myeloid neoplasms. Br J Haematol 2011, 153(4):421-36.). Slično tome, aberantna ko-ekspresija CD44 i CD 117 je opisana za matične ćelije raka jajnika, CD44 i CD24 za pokretačke ćelije raka pankreasa i kombinacija EpCAM i CD44 u matičnim ćelijama raka kolona i dojke (Natasha Y. Frank, Tobias Schatton, Markus H. Frank; The therapeutic promise of the cancer stem cell concept. J Clin Invest. 2010; 120:41-50). Ekspresija CD24 i CD29, kao i CD24 i CD49f, je utvrđena da je specifična za karcinom dojke (Vassilopoulos A et al. Identification and characterization of cancer initiating cells from BRCA1 related mammary tumours using markers for normal mammary stem cells. Int J Biol Sci 2008; 4:133-142). Štaviše, kombinacije sa visoko eksprimovanim nivoima antigena su indikativne za niz maligniteta, kao što su CD38 i CD138 za mijelom.

Pored navedenih kombinacija antigena specifičnih za rak i onih poznatih iz naučne literature, dodatne kombinacije dva antigena koji se istovremeno eksprimuju na specifičnim tumorskim ćelijama, ali ne i na drugim ćelijama, mogu se direktno izvesti od strane stručnjaka u tehnici.

Prvo, stručnjak u tehnici može doći do kombinacije antigena koja je specifična za određenu vrstu raka kombinovanjem antigena koji je specifičan za maligno stanje odgovarajućeg tipa ćelije sa odgovarajućim markerom tipa ćelije ili markerom ćelijske linije. Na primer, karbonska anhidraza IX je marker čvrsto povezan sa karcinomom bubrežnih (renalnih) ćelija i metastazama karcinoma renalnih ćelija i na taj način predstavlja marker za maligno stanje renalnih ćelija. Ovaj marker, koji se nalazi na membrani, međutim, eksprimuje se i na normalnim ćelijama crevnog trakta. Izborom kao drugog antigena markera bubrežne linije kao što je akvaporin, nastala kombinacija dva antigena specifična je za ćelije karcinoma renalnih ćelija i ćelije koje proizlaze iz metastaza karcinoma renalnih ćelija, dok ni nemaligne ćelije bubrega (koje ne eksprimuju karbonatnu anhidrazu IX ) niti ćelije iz crevnog trakta (koje ne eksprimuju akvaporine) nisu okarakterisane izabranim parom antigena.

Detaljne informacije o markerima za maligno stanje različitih vrsta ćelija i o markerima za brojne tipove ćelija ili ćelijske linije dostupne su iz literature i resursa na internetu (videti u daljem tekstu detalje) ili se mogu dobiti direktnim eksperimentima (videti u daljem tekstu).

Primeri za markere za maligno stanje ćelije uključuju: E-kaderin za epitelne ćelije i ćelije karcinoma dojke duktalnog tipa; Ca-125 za epiteloidne malignosti i ćelije raka jajnika, ćelije adenokarcinoma i ćelije raka dojke; Her-2/neu za ćelije raka dojke; gross cystic disease fluid protein (BRST-2 protein) za ćelije raka dojke; BCA-225 (glikoprotein povezan sa karcinomom dojke) za ćelije raka pluća i dojke; CA 19-9 (antigen ugljenih hidrata 19-9) za ćelije raka pankreasa, žučnih kanala i ćelija karcinoma crevnog trakta; CEA za ćelije kolorektalnog raka; CD117 (c-kit) za gist (gastrointestinalnog stromalnog tumora) ćelije (i mieloidne i mastocitne); CD30 za Reed-Sternbergove ćelije (i Ki-1 aktivirane T ćelije i B ćelije); Epitelni antigen (BER-EP4), Epigenelni membranski antigen i Epitelno srodni antigen (MOC-31) za epitelne ćelije raka; Receptor epidermalnog faktora rasta (ovde) za ćelije različitih vrsta raka; Receptor faktora rasta izveden iz trombocita (PDGFR) alfa za ćelije različitih vrsta raka; Markeri povezani sa melanomima / Mart 1/ Melan-A za melanomske ćelije; CD133 za populacije matičnih ćelija raka i druge; TAG 72 (gp 72 povezan sa tumorom) za ćelije adenokarcinoma.

Drugi primeri za markere za maligno stanje ćelije/ćelija su: EpCAM, CD19, HER-2, HER-3, HER-4, PSMA, MUC-1 (mucin), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, Lewis-Y, CD20, CD33, CD44v6, Wue-1, plazma ćelijski antigen, (membranski vezani) IgE, Melanomski hondroitin sulfat proteoglikan (MCSP), STEAP, mezotelin, antigen matičnih ćelija prostate (PSCA), sTn (sijalidazni Tn antigen), FAP (antigen za aktivaciju fibroblsta), EGFRvIII, Igα, Igβ, MT-MMPs, Cora antigen, EphA2, L6 i CO-29, CCR5, βHCG, gangliozid GD3, 9-O-Acetyl-GD3, GM2, Globo H, Fukozil GM1, Poli SA, GD2, Karboanhidraza IX (MN/CA IX), Sonic Hedgehog (Shh), CCR8, TNF-alfa prekursor, A33 Antigen, Li-6, dezmoglein 4, E-kadherin neoepitop, Fetalni acetilholinski receptor, CD25, Muelerova inhibitorska supstanca (MIS) receptor tip II, endosijalin, SAS, CD63, TF-antigen, CD7, CD22, Igα(CD79a), Igβ (CD79b), G250, gp100, F19-antigen i EphA2.

Primeri antigena koji su specifični za određeni ćelijski tip/ćelijsku liniju ili za nekoliko tipova ćelija/linija ćelija (markeri tipa ćelija / markeri ćelijske linije) uključuju: CD45 za hematopoetske ćelije; CD34 za endotelne ćelije, matične ćelije i stromalne ćelije; CD33 za mijeloidne ćelije; CD138 za ćelije plazme i podskup epitelnih ćelija; CD15 za epitelne, mijeloidne i Reed-Sternbergove ćelije; CD1a za kortikalne timocite i Langerhansove ćelije; CD2 za timične ćelije, T ćelije i Ćelije ubice (NK); CD3 za T ćelije; CD4 za pomoćne T ćelije; CD5 za T ćelije, podskup B ćelija i ćelije karcinoma timusa; CD8 za citotoksične T ćelije; CD20 za B ćelije; CD23 za aktivirane B ćelije; CD31 za endotelne ćelije; CD43 za T ćelije, mijeloidne ćelije, podskup B ćelija, histiocita i ćelije plazme; CD56 za NK ćelije; CD57 za neuroendokrine ćelije i NK ćelije; CD68 za makrofage; CD79a za B ćelije i ćelije plazme; CD 146 za endotelnu ćelijsku liniju; proteini surfaktanta za plućne ćelije; sinaptofizin, CD56 ili CD57 za neuroendokrine ćelije; nikotinski acetilholinski receptor ili mišićno specifična kinaza (MUSK) za mišićne ćelije; naponom kontorlisani kalcijumski kanal (P/Q tip) ili naponom kontorlisani kalijumski kanal (VGKC) ili N-metil-D-aspartatni receptor (NMDA) za mišićne ćelije i neurone; TSH (receptor za stimulaciju štitaste žlezde) receptor za štitastu žlezdu; amfifizin za mišićne ćelije; HepPar-1 za hepatocite; gangliozid GQ1B, GD3 ili GM1 za neuronske ćelije; i glikoforin-A za ćelije eritropoetske ćelijske linije.

Treba napomenuti da postoje situacije u kojima bi bila prednost da se, u svrhu predmetnog pronalaska, oslanja na antigen koji ima manje od savršene specifičnosti za tip ćelije ili ćelijske linije od interesa. Na primer, u situacijama kada nema poznatog antigena koji se nalazi isključivo na ćelijskom tipu/ćelijskoj liniji od interesa, a ne na drugim tipovima ćelija/linijama ili u situacijama kada nije moguće potvrditi ekskluzivnu specifičnost antigena, takođe, antigeni koji su prisutni na jednom ili više drugih tipova ćelija/ćelijskih linija, osim tipa ćelija/ćelijske linije od interesa mogu se razmotriti. Slično mišljenje se primenjuje i na markere za maligno stanje ćelije, ili čak i za specifičnost kombinacije dva antigena. Tako, na primer, postoje situacije gde je za svrhe predmetnog pronalaska izabrana kombinacija dva antigena koja je specifična ne samo za ćelije od interesa, već i za jedan ili više (nekoliko) drugih tipova ćelija/linija ćelija / vrsta malignih ćelija.

Drugo, stručnjak može doći do kombinacije antigena koja je specifična za određenu vrstu raka jednostavnim eksperimentisanjem. Ovo može obuhvatati korake (1) određivanja površinskih antigena na tumorskim ćelijama koje treba eliminisati i (2) identifikovati između ovih površinskih antigena tumora dva antigena koji nisu prisutni istovremeno na drugim ćelijskim tipovima (ili u nekim realizacijama prisutni samo na nekoliko drugih tipova ćelija).

Često eksperimentisanje možda nije neophodno kako bi se utvrdili površinski antigeni na tumorskim ćelijama koje treba eliminisati, jer takve informacije mogu već biti dostupne za odgovarajuću vrstu raka iz štampane literature (vidi, npr. David J. Dabbs, Diagnostic immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 3rd edition (2010); or F Lin and J Prichard, Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently Asked Questions, Springer, New York, 1st edition (2011)). Još šire informacije dostupne su putem internet resursa. Na primer, Projekat anatomije genoma raka (CGAP) američkog Nacionalnog instituta za rak (NCI) sistematski je odredio profile ekspresije gena različitih normalnih, prekanceroznih i ćelija raka (Strausberg RL. The Cancer Genome Anatomy Project: building a new information and technology platform for cancer research. In: Molecular Pathology of Early Cancer, 1999, (Srivastava, S., Henson, D.E., Gazdar, A., eds. IOS Press), pp. 365-370). Resursi generisani CGAP inicijativom su slobodno dostupni (http://cgap.nci.nih.gov/) i uključuju pristup svim CGAP podacima i neophodnim alatima za analizu. Slično tome, Inicijativa za karakterizaciju genoma raka (CGCI) Nacionalnog instituta za rak se fokusira na alate za karakterizaciju genomskih promena kod različitih tumora, na primer postupke genomske karakterizacije, uključujući egzome i analizu transkriptoma pomoću sekvenciranja druge generacije. Podaci koji generiše CGCI dostupni su putem javno dostupne baze podataka (http://cgap.nci.nih.gov/cgci.html). Prema tome, u mnogim slučajevima informacije o prisustvu ili odsustvu različitih poznatih proteina na ćelijskoj površini na ćelijama tumora od interesa mogu biti izvedene jednostavnim proveravanjem ovih javno dostupnih baza podataka. Ukoliko je to poželjno, ove informacije se zatim mogu potvrditi u drugom koraku imunocitohemijskim / imunohistohemijskim analizama tumorskih ćelija/tkiva prema postupcima opisanim u nastavku teksta.

Ako nema dostupnih informacija o proteinima eksprimovanim tumorskim ćelijama/tkivom od interesa, kvalifikovani stručnjak može da sprovede karakterizaciju antigena na tumorskim ćelijama/tkivima pomoću imunocitohemijskih / imunohistohemijskih metoda sa panelom antitela (vidi, npr. „Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently Asked Questions“ od F Lin i J Prichard, Springer New York, 1st edition (2011); ili „Using Antibodies: A Laboratory Manual“ of E Harlow i D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Ukratko, histološki preparat ili ćelije izolovane iz tumora inkubiraju se sa prvim antitelima usmerenim na potencijalni površinski antigen i, nakon koraka ispiranja, inkubacija drugog antitela usmerenog protiv Fc domena prvog antitela. Ovo drugo antitelo je označeno fluoroforom ili enzimom poput HRP (peroksidaza rena), kako bi se vizuelizovala ekspresija ciljanog antigena. Paneli antitela koji se mogu koristiti za potrebe profilisanja visoke propusnosti antigena za antigene sa površine ćelija su komercijalno dostupni od brojnih proizvođača. Pored toga, alati koji su posebno namenjeni karakterizaciji proteomskih ćelija visoke propusnosti za identifikaciju i analizu ekspresije proteina ćelijske površine su komercijalno dostupni, kao što su tehnologija visokopropusnog testiranja zasnovana na FACS (Fluorescentno aktivirana ćelijska sortiranja), BD FACS™ CAP (Kombinatorni profil antitela) firme Becton, Dickinson & Company. Imunocitohemijska / imunohistohemijska / proteomska analiza opisana gore može biti prethodno sprovedena (ili, u nekim slučajevima, zamenjena) pomoću profilisanja ekspresije gena tumorskih ćelija na nivou genoma ili masenom spektrometrijskom analizom proteina eksprimovanih tumorskim ćelijama/tkivom od interesa. Na primer, profilisanje genskih ekspresija tumorskih ćelija na nivou genoma može se sprovesti kako bi se proverila ekspresija različitih molekula na površini ćelija, a prisustvo takvih antigena na ćelijskoj površini tumorskih ćelija može se potvrditi putem bojenja na bazi antitela metode gore opisanog. Dalje informacije o pristupima za karakterizacije površinskih antigena (raks) ćelija dostupne su u relevantnoj naučnoj literaturi (npr. Zhou J, Belov L, Huang PY, Shin JS, Solomon MJ, Chapuis PH, Bokey L, Chan C, Clarke C, Clarke SJ, Christopherson RI. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J Immunol Methods. 2010;355:40-51; or Carter P, Smith L, Ryan M. Identification and validation of cell surface antigens for antibody targeting in oncology. Endocr Relat Cancer. 2004;11:659-87).

U sledećem koraku, kvalifikovani stručnjak može identifikovati između antigena na ćelijskoj površini tumorskih ćelija kombinaciju dva antigena koji se ne eksprimuju istovremeno na drugim tipovima ćelija.

Često, već literatura ili javno dostupne baze podataka mogu pružiti detaljne informacije o prisustvu ili odsustvu antigena iz drugih tipova ćelija:

Ekspresija različitih molekula na površini ćelije kod različitih tipova ćelija je sistematski proučavana od strane istraživača proteklih decenija imunofenotipizacijom i profilisanjem ekspresije gena za skoro svaki tip ćelija u telu.

Na primer, detaljne informacije o ekspresiji više od 360 „klastera diferencijacije“ antigena (ili CD antigena) dostupne su u štampanom obliku (npr. „Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers“ od Zola H, Swart B, Nicholson I, i Voss E; John Wiley & Sons, 1st ed. (2007)) i u online bazama (npr. www.hcdm.org/MoleculeInformation/tabid/54/Default.aspx), i and includes information on tissue distribution and expression levels of antigens, as well as information about antigen reactive antibodies and the epitopes these antibodies bind to. i obuhvataju informacije o raspodeli tkiva i nivoima ekspresije antigena, kao i informacije o antigenskim reaktivnim antitelima i epitopima za koje se ta antitela vezuju.

Štaviše, postoje javno dostupne baze podataka koje omogućavaju pristup velikom broju genomskih podataka koje generiše naučna zajednica. Na primer, Gene Ekpression Omnibus (GEO) platforma Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) Sjedinjenih Država (Barrett T et al., NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--10 years on Nucleic Acids Res. 2011;39(Database issue):D1005-10) arhivira i daje pristup ogromnoj kolekciji čipova, sekvenciranju sledeće generacije i drugim oblicima visokopropusnih funkcionalnih genomskih podataka, i dalje pruža internetske interfejse i aplikacije za lakši pristup informacijama (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Kada je par od dva antigena identifikovan kroz ove resurse koji, kako se čini, nema u drugim vrstama ćelija, pored tumorskih ćelija koje su od interesa, stručnjak u tehnici može lako potvrditi podobnost kombinacije antigena za dalji razvoj P1 i P2 -polipeptidnih konstrukata. Ovakva potvrda da identifikovana kombinacija dva antigena zaista nije eksprimovana istovremeno na drugim tipovima ćelija osim tumorskih ćelija može biti izvedena imunohistohemijskom / imunocitohemijskom analizom (optimalno velike) kolekcije različitih tipova ćelija i/ili tkiva sa antitelima nasuprot dva antigena. Ćelije i tkiva bilo koje vrste mogu se dobiti od ATCC (Kolekcija kultura američkog tipa - American Type Culture Collection), od odeljenja za patologiju i od banaka tkiva povezanih sa univerzitetima i istraživačkim institucijama. Pogodna kombinacija antigena je definisana kao par antitela koji boji isključivo tumorske ćelije, ali ne i zdrava tkiva ili zdrave ćelije (tj. oba antitela u paru boje tumorske ćelije, ali nijedna druga tkiva/ćelije nisu obojene od strane oba antitela).

Treba napomenuti da dok je u mnogim situacijama, naravno, poželjan najviši stepen specifičnosti (poželjno apsolutna specifičnost), postoje situacije u kojima je prihvatljiv niži stepen specifičnosti. Na primer, ako se set polipeptida koristi u dijagnostičke svrhe, neki stepen unakrsne reaktivnosti sa drugim tipovima ćelija ili tkivima može biti prihvatljiv (naročito u slučaju čvrstih tumora, s obzirom da dodatne informacije o položaju pomažu u razlikovanju tumorskih ćelija od uzajamno reagujućih ćelija). Štaviše, ako se set polipeptida koristi u terapeutske svrhe, neki stepen unakrsne reaktivnosti sa drugim vrstama ćelija ili tkivima, takođe, može biti prihvatljiv, u zavisnosti od težine bolesti kod lečenog pacijenta i tipova ćelija/tkiva koja su pogođena unakrsnom aktivnošću. Druge situacije u kojima se može prihvatiti niži stepen specifičnosti može se pojaviti u kontekstu transplantacije (videti u daljem tekstu).

U slučajevima kada nagoveštaji o odgovarajućoj kombinaciji antigena ne mogu da se izvedu iz literature ili javnih baza podataka, prisustvo/odsustvo antigena na ćelijskoj površini tumorskih ćelija u drugim tipovima ćelija može se proveriti direktnim eksperimentisanjem. U tom cilju, različiti tipovi ćelija i/ili tkiva koji se mogu dobiti iz gore navedenih izvora mogu biti podvrgnuti proteomskoj karakterizaciji ćelija, imunocitohemijskoj / imunohistohemijskoj analizi i/ili profiliranju ekspresije gena. (Treba napomenuti da se takva analiza ćelija/tkiva bez tumora mora izvršiti samo jednom da bi se dobili podaci koji se mogu koristiti za dizajniranje različitih konstrukata prema pronalasku koji se mogu prilagoditi raznim različitim terapijskim ili dijagnostičkim situacijama). Upoređivanjem dobijenih rezultata sa informacijama o antigenu na ćelijskoj površini tumorskih ćelija koje su od interesa, lako se može identifikovati kombinacija dva antigena koja nije prisutna na bilo kojoj drugoj ćeliji osim tumorskih ćelija od interesa.

Sličan sistematski pristup identifikacije para dva antigena koji su specifični za tumorske ćelije, takođe, je opisan u nedavnoj publikaciji od strane Balagurunatana, koja se oslanja na profilisanje gena na nivou genoma, nakon čega sledi imunohistohemija (Yoganand Balagurunathan, Gene expression profiling-based identification of cell-surface targets for developing multimeric ligands in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther 2008;7. 3071-3080). Koristeći DNK čipove, autori tog rukopisa generisali su baze podataka o profilima ekspresije mRNK gena za značajan broj uzoraka raka pankreasa i uzoraka normalnog tkiva. Podaci o ekspresiji za gene koji kodiraju molekule ćelijske površine analizirani su pomoću računskog pristupa zasnovanog na multivarijantnom pravilu kako bi se identifikovale kombinacije gena koje se preferentno eksprimuju na tumorskim ćelijama, ali ne i u normalnim tkivima. Aberantna ko-ekspresija antigena koji čine tumorsku specifičnu kombinaciju antigena potom jee potvrđena primenom standardnih tehnika imunohistohemije na tkivu tumora pankreasa i normalnim tkivnim čipovima.

Nakon što je identifikovana i validirana takva kombinacija antigena koja je specifična za tumorske ćelije od interesa, konstrukti polipeptida P1 i polipeptida P2 mogu se kreirati standardnim tehnikama proteinskog inžinjeringa i postupcima molekularne biologije (vidi, npr. G Howard and M Kaser, Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, CRC Press, 1st edition (2006); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)).

Za mnoge molekule površine ćelija, specifična monoklona antitela su okarakterisana i stoga dostupna. Prema tome, u mnogim slučajevima kvalifikovani stručnjak može imati pristup hibridomskim ćelijama monoklonih antitela koja su specifična za antigene identifikovane kombinacije antigena. Imajući mogućnost da biraju iz panela antitela specifičnih za dat antigen, osoba koja je stručnjak u tehnici može izabrati reaktivno antitelo koje vezuje epitop blizu membrane, kako bi se minimiziralo rastojanje ćelije koja eksprimira antigen od efektora ćelije (Bluemel C, Hausmann S, Fluhr P, Sriskandarajah M, Stallcup WB, Baeuerle PA, Kufer P. Epitope distance to the target cell membrane and antigen size determine the potency of T cellmediated lysis by BiTE antibodies specific for a large melanoma surface antigen. Cancer Immunol Immunother. 2010 Aug;59(8):1197-209). Ako takvo antitelo nije dostupno protiv jednog ili oba antigena identifikovane kombinacije antigena, monoklona antitela protiv antigena mogu se generisati standardnim tehnikama (e.g. G Howard and M Kaser, Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, CRC Press, 1st edition (2006)). Štaviše, različite kompanije nude potpune usluge za proizvodnju monoklonih antitela i hibridoma ćelija po porudžbini.

DNK ili mRNK kodiranje za varijabilne domene monoklonskih antitela od interesa mogu se dobiti od hibridoma pomoću PCR amplifikacije ili kloniranja (Orlandi R, Gussow PT, Jones: Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A 1989, 86(10):3833-3837; Wang Z, Raifu M, Howard M, Smith L, Hansen D, Goldsby R, Ratner D: Universal PCR amplification of mouse immunoglobulin gene variable regions: the design of degenerate primers and an assessment of the effect of DNA polymerase 3' to 5'exonuclease activity. J Immunol Methods 2000, 233(1-2):167-177; Essono S, Frobert Y, Grassi J, Cremino C, Boquet D: A general method allowing the design of oligonucleotide primers to amplify the variable regions from immunoglobulin cDNA. J Immunol Methods 2003, 279:251-266; G Howard and M Kaser, Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, CRC Press, 1st edition (2006)) ili od već utvrđenih vektora koji sadrže DNK sekvencu varijabilnog fragmenta odgovarajućeg antitela. Često, sekvenca se može izvući iz javnih baza podataka, gde se deponuju mnoge sekvence, a onda se konstrukt može generisati i sintezom gena, jer to nude razni komercijalni dobavljači (npr. Creative Biolabs, Širli, SAD).

Da bi se formirao konstrukt polipeptida P1, sekvenca koja kodira varijabilni fragment Fv antitela specifičnog za prvi antigen identifikovanog para antigena (ili, opciono, sekvencu od varijabilnog fragmenta sa jednim lancem izvedenu iz te sekvence) za prvu ciljajuću grupu (T1) i povezan preko odgovarajuće spojnice (kodiranje, npr. za manje od 12 aa) za sekvencu koja kodira prvi fragment F1 funkcionalnog domena (npr. VLdomen anti-CD3 antitela). Takođe, kako bi se formirao konstrukt polipeptida P2, sekvenca koja kodira varijabilni fragment Fv antitela specifičnog za drugi antigen identifikovanog para antigena (ili, opciono, sekvencu od varijabilnog fragmenta sa jednim lancem izvedenu iz te sekvence) je korišćena za drugu ciljajuću grupu (T2) i povezana preko odgovarajućeg linkera za sekvencu koja kodira drugi fragment F2 tog funkcionalnog domena (npr. VHdomen anti-CD3 antitela).

Za bilo koji konstrukt polipeptida P1 ili P2 prema pronalasku razmatraju se modifikacije konstrukta ili sekvence koje se koriste za oblikovanje konstrukta kako bi se prilagodio konstrukt specifičnim potrebama. Na primer, konstrukt se može modifikovati na način koji smanjuje ili ukida imunogenost kod ljudi. U slučaju da se sekvenca izvede iz antitela koje nije humani roditelj, kao što je mišje antitelo, može se izvršiti modifikacija sekvence koja rezultira u smanjenoj imunogenosti kod ljudi, zadržavajući ili u značajnoj meri zadržavajući antigen vezujuća svojstva roditeljskog antitela (poznata stručnjaku u tehnici kao „humanizovanje“ antitela/konstrukcije).

Različite modifikacije gore opisanih procedura i prilagođavanja kako bi se sprovele realizacije i varijacije opisanim u ovoj aplikaciji su očigledne stručnjaku u tehnici

Osim varijacija u odnosu na antigene na koje se ciljajuće grupe T1 i T2 specifično vezuju, moguće su razne druge modifikacije. Na primer, umesto jednolančane varijante fragmenta (scFv) kao ciljajuća grupa T1 i/ili T2 mogu se koristiti druge vrste monovalentnih antitela ili struktura sličnih antitelima. Na primer, može se koristiti antitelo / antitelu-slična struktura izvedena iz antitela lame, kamile ili ajkule. S obzirom da antitela lame, kamile ili ajkule imaju antigen vezujući deo koji je izgrađen od jednog pojedinačnog domena (a ne VHi VLlanca), dobijeni polipeptid P1 ili P2 je znatno manji i na taj način može bolje prodirati u tumorska tkiva.

Pored toga, pošto su mnogi antigeni relevantni za tumore receptori vezani za površinu, jednostruki lanac Fv ciljajuće grupe T1 i/ili T2 može biti zamenjen prirodnim ili veštačkim ligandom takvog receptora vezanog za površinu ćelije. Kao i antitela, ovi prirodni ili veštački ligandi pružaju odličnu specifičnost prema ciljnom receptoru. Alternativno, ciljajuća grupa T1 i/ili T2 može biti aptamer.

Pored toga, kako bi se povećao vezujući afinitet ciljajuće grupe prema antigenu, ciljajući deo se može multimerizovati i/ili izmeniti glikozilacijom ili drugim vrstama posttranslacionih ili hemijskih modifikacija ili biti optimizovan putem mutageneze usmerene na mesto ili procesa odabira displeja faga.

Štaviše, fragmenti F1 i F2 (tj. VLi VHfragmenti anti CD3 Fv u gore opisanom primeru realizacije) mogu biti zamijenjeni fragmentima različitog funkcionalnog domena F, što rezultira različitim biološkim efektom nakon komplementacije dva fragmenta. Koristeći fragmente anti CD56, anti CD1a ili anti CD16a, NK ćelije mogu se regrutovati i aktivirati. Korišćenjem fragmenata anti CD 16, NK ćelija, polimorfonuklearnih neutrofilnih leukocita, monocita i makrofaga mogu se regrutovati i aktivirati. Koristeći fragmente anti CD32a, anti CD32b, anti CD89, anti CD16a ili anti CD64, makrofage se mogu regrutovati i aktivirati. Koristeći fragmente anti CD32a, anti CD32b, anti CD64 ili anti CD89, monociti mogu biti regrutovani i aktivirani. Koristeći fragmente anti CD16b, anti CD89, anti CD32a, anti CD32b ili anti CD64, granulociti mogu biti regrutovani i aktivirani. Štaviše, alternativno anti-CD3, T ćelije se, takođe, mogu regrutovati i aktivirati korišćenjem fragmenata anti CD2, anti CD5, anti CD28 ili anti TCR (T ćelijski receptor). Dodatne informacije ili dodatne opcije vezane za regrutaciju i aktivaciju efektorskih ćelija putem vezivanja antitela dostupne su iz objavljene literature nor. "Bispecific Antibodies" Rolanda E. Kontermanna (urednik), Springer Berlin Heidelberg; 1st Edition. (2011).

Dodatna opcija je korišćenje seta polipeptida P1 i P2 sa fragmentima F1 i F2 funkcionalnog domena F koji vezuje antigen na efektorskoj ćeliji nakon komplementacije dva fragmenta, ali pri čemu vezivanje za ovaj antigen efektorske ćelije ne uzrokuje aktivaciju date efektorske ćelije. Zatim se ovaj set polipeptida („prvi set polipeptida“) koristi (npr. daje pacijentu) u kombinaciji sa drugim setom polipeptida sa fragmentima funkcionalnog domena F koji se nakon komplementacije vezuje za drugi, različiti antigen na istoj efektorskoj ćeliji, ali gde, ponovo, vezivanje za ovaj antigen efektorske ćelije ne uzrokuje aktiviranje efektorske ćelije. Antigeni na koje se prvi i drugi set polipeptida vezuju biraju se na način da, dok vezivanje samo jednog od dva antigena na efektorske ćelije ne rezultira aktiviranjem efektorske ćelije, vezivanje oba antigena na efektor ćelija istovremeno vodi do aktivacije efektorske ćelije. Ovo ima prednosti da (1) se mogu koristiti antigeni na efektorskim ćelijama koji ne funkcionišu pojedinačno, već zahtevaju kostimulaciju drugog antigena, i (2) broj različitih antigena koji diktiraju specifičnost kojom se određena ćelija (kao što je ćelija raka) razlikuje od drugih ćelija može se povećati sa dva (ako prvi i drugi set polipeptida imaju iste ciljajuće grupe T1 i T2, respektivno) do četiri različita antigena (ako prvi i drugi set polipeptida nemaju zajedničke ciljajuće grupe)

Slični efekti se mogu postići s dva seta polipeptida sa različitim ciljajućim grupama, ali istom funkcionalnim domenom: Ovi setovi polipeptida su kreirani tako da imaju funkcionalni domen usmeren protiv antigena efektorskih ćelija koji normalno dozvoljava svakom setu polipeptida samostalno da aktivira efektorske ćelije. Međutim, oba seta polipeptida koriste se u koncentraciji koja je previše niska da bi izazvala efikasnu aktivaciju efektorskih ćelija. Ako su oba seta polipeptida prisutna istovremeno (npr. istovremenim davanjem pacijenta) svaki set polipeptida sam po sebi nije sposoban da aktivira efektorsku ćeliju (zbog svoje male koncentracije), dok je kombinacija oba seta polipeptida (jer efekti dva seta polipeptida deluju sinergijski i stoga je zbir efekata izazvanih dvema setinama polipeptida dovoljan da aktivira efektorsku ćeliju).

Kao još jedna alternativa regrutovanju/aktiviranju efektorskih ćelija, može se uzeti pristup „predtargetiranja“, jer je dobro uspostavljen za konstrukte bispecifičnih antitela (Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Goldenberg DM, Chatal JF, Barbet J, Boerman O, Sharkey RM. Update Cancer Ther.2007 Mar;2(1):19-31). U tom cilju, F1 i F2 su supstituisani VHi VLfragmentima antitela specifičnim za antigen, molekulomnosačem (tj. molekul/deo molekula koji nije prepoznat kao strano telo od strane imunološkog sistema pacijenta kod koga se dati set polipeptida administrira ili molekul koji ne izaziva nikakvu ili samo slabu imunološku reakciju pacijenta kome se daje) ili afinitetnom oznakom. Kasnije (ili istovremeno) za administriranje polipeptida P1 i P2, daju se terapeutsko ili dijagnostičko jedinjenje spojeno sa navedenim antigenom, molekulom-nosačem ili afinitetnom oznakom. Samo ćelije koje nose i antigene A1 i A2 na svojoj površini vezane su sa oba polipetpida - i sa polipeptidom P1 i polipeptidom P2. Shodno tome, samo kod ovih ćelija funkcionalno komplementiranje dovodi do stvaranja mesta vezivanja sposobnog za regrutovanje terapeutskog ili dijagnostičkog jedinjenja preko navedenog antigena, molekulanosača ili afinitetne oznake. Ovaj pristup omogućava ekskluzivno adresiranje ciljnih ćelija kombinovanih sa mogućnošću precizne primene i doziranja terapijskih jedinjenja kao što su toksini ili radioaktivne supstance ili dijagnostičkih jedinjenja, dok se ne utiče na ćelije koje ne eksprimuju antigene ili eksprimuju samo jedan od antigena.

Odgovarajući molekul nosač može, na primer, da bude peptid ili molekul ugljenih hidrata. Poželjno, molekul nosač može biti želatin, dekstran ili hidroksietil skrob, koji su uobičajeni plazma ekspanderi koji su metabolički inertni, ostaju u krvi i, ako su dovoljno mali, renalno se eliminišu. Alternativno, molekul nosač može biti inulin, metabolički inertni molekul koji se rutinski koristi u klinici za određivanje glomerularnog klirensa (i, osim toga, postoje antitela koja specifično prepoznaju inulin). Pogodna afinitetna oznaka može biti, na primer, Flagoznaka, myc-oznaka, glutation-S-transferaza(GST)-oznaka, hemaglutinin(HA)-oznaka, polihistidin(His)-oznaka ili protein za vezivanje maltoze (MBP)- oznaka, digoksigenin(DIG)-oznaka.

Terapeutsko jedinjenje spojeno sa antigenom, molekulom-nosačem ili afinitetnom oznakom može, na primer, biti radioaktivno jedinjenje ili toksin. Pogodna radioaktivna jedinjenja su, na primer, jedinjenja koja sadrže<90>Y,<177>Lu,<131>I,<32>P,<10>B, ili<213>Bi. Regrutovanje antigena, molekula nosača ili afinitetne oznake povezane sa radioaktivnim jedinjenjem na ćelijama koje eksprimuju i prvi i drugi antigen dovodi do akumulacije radioaktivnosti na mestu tumora, što ima za rezultat specifično uništavanje tumorskih ćelija/tkiva. Alternativno, terapeutsko jedinjenje spojeno sa antigenom, molekulom-nosačem ili afinitetnom oznakom može, na primer, biti toksično jedinjenje koje nije u stanju da pređe ćelijsku membranu bez prethodnog vezivanja na površinu ćelije.

Ovaj preduslov ispunjavaju komponente A klasičnih AB-toksina izvedenih iz brojnih patogenih bakterija kao što su Clostridium perfringens, C. botulinum, C. difficile, B. anthracis i drugi. AB-toksini su dvokomponentni proteinski kompleksi koji ometaju unutrašnje funkcije ćelije. Komponenta A je „aktivna“ komponenta (tj. ona ubija ćeliju nakon penetracije membrane), ali nije u mogućnosti da samostalno prođe ćelijsku membranu. Komponenta B je komponenta „vezivanja“ koja je po sebi netoksična, ali je od suštinskog značaja za unos i penetraciju membrane od strane komponente A.

Na primer, zaštitni antigen Bacillus anthracis (PA) je klasična komponenta B toksina koja posreduje u unostu stvarnog faktora eksotoksinskog edema antraksa i smrtonosnog faktora (LF). LF bez PA-komponente nije toksičan jer LF samostalno ne prodire membrane i stoga ne može izvršiti svoje patogene sposobnosti (Pezard C, Berche P, Mock M. "Contribution of individual toxin components to virulence of Bacillus anthracis" 1991 Infect. Immun.59 (10): 3472). Međutim, kada se veže za molekule ćelijske površine, LF je internalizovan i visoko toksičan za ćeliju.

Nakon dimerizacije polipeptida P1 i P2, funkcija funkcionalnog domena F se rekonstituiše. Kroz interakciju rekonstituisanog funkcionalnog domena sa antigenom, molekulom nosačem ili afinitetnom oznakom povezanom sa toksinom, toksin se regrutuje na ćelijsku membranu ciljnih ćelija, inkorporira u ćelije i ubija ćelije.

Ovaj princip lako se prilagođava svrsi pronalaska od strane kvalifikovanog stručnjaka, jer se već široko koristi u tzv. imunotoksinama, pri čemu je ciljajući deo, uglavnom domen sličan antitelu ili prirodni ligand, spojen sa toksinskom komponentom (vidi npr., Immunotoxins for targeted cancer therapy. Kreitman RJ, AAPS J.2006 Aug 18;8(3):E532-51). Primeri uključuju imunotoksine zasnovane na toksinu difterije (kao što je Denileukin diftitoks (američki trgovački naziv Ontak) koji je odobren od strane FDA za lečenje nekih T ćelijskih limfoma) ili na osnovu B. anthracis letalni faktor (Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ, Kreitman RJ (2007). "Immunotoxin treatment of cancer". Annu. Rev. Med. 58: 221-37). Pogodne A komponente AB-toksina mogu, na primer, biti B. anthracis edema faktor, B. anthracis letalni faktor, C. perfringens jota toksin, C. botulinum C2 toksin, C. difficile ADP-riboziltransferaza C. diphteriae difterija toksin fragment A.

Alternativno, terapeutsko jedinjenje može na primer biti citotoksično jedinjenje koje je toksično po ulasku u ćeliju i koje je sposobno za prolazak ćelijske membrane samostalno bez prethodnog vezivanja na površinu ćelije. U ovom slučaju, antigen, molekul nosač ili afinitetni marker na koga je terapeutsko jedinjenje spojeno, odabrani su tako da sprečavaju nastao konjugat (tj. terapeutsko jedinjenje vezano za oznaku afiniteta antigena / molekula-nosača / afiniteta) od prolaska ćelijske membrane i ulaza u ćelije bez prethodnog vezivanja konjugata na površinu ćelije (odgovarajući molekul-nosač može, na primer, biti hidroksietil skrobni nosač). Prema tome, takav konjugat ne ulazi u ćelije bez prethodnog vezivanja na njihovu ćelijsku površinu; kada se takav konjugat vezuje za površinu ćelije, međutim, ona se internalizuje u ćeliju i toksično jedinjenje ubija ćeliju. Konjugat se ne vezuje za ćelije, osim ako se regrutuje u prisustvu seta polipeptida iz pronalaska na ćelijama koje istovremeno eksprimiraju oba antigena A1 i A2 na njihovoj ćelijski površini. Takve ćelije se vezuju i regrutuju oba polipeptida P1 i P2, a rekonstituisan funkcionalni domen se specifično vezuje i regrutuje oznaku antigena/ molekula-nosača / afiniteta, što za rezultat ima internalizaciju terapeutskog jedinjenja. Kao posledica toga, izvršeno je specifično ubijanje ćelija koje nose oba antigena A1 i A2 na svojoj ćelijskoj površini. Citotoksična jedinjenja koja se mogu koristiti u ovom kontekstu uključuju npr. auristatin, ricin, saponin, briodin 1, buganin, gelonin, antivirusni protein vinobojke (PAP), antifolati, vinka alkaloidi, antraciklini, kaliheamicin, ribonukleaza, abrin, modecin ili listeriolizin O.

Dijagnostičko jedinjenje spojeno sa antigenom, molekulom nosačem ili afinitetnim markerom može, na primer, da bude radioaktivno jedinjenje, fluorofor ili jedinjenje sposobno za posredovanje bioluminiscencije.

Pogodna radioaktivna jedinjenja su, na primer, jedinjenja koja sadrže<99m>Tc,<111>In,<82>Rb ili<201>Tl. Takva jedinjenja se detektuju poznatim medicinske procedurama snimanja na klinici.

Alternativno, fluorescentno jedinjenje se može koristiti kao dijagnostičko jedinjenje, kao što je GFP (zeleni fluorescentni protein) ili GFP varijanta (npr. BFP (plavi fluorescentni protein), CFP (cijan fluorescentni protein) ili YFP (žuti fluorescentni protein)) ili fluorescentno jedinjenje malih molekula kao što su FITC (fluorescein izotiocijanat) ili PE (fikoeritrin), aleksa fluor boje (kao što je AlekaFluor488 i srodne boje koje prodaju Molecular Probes, npr.) ili cijaninske boje (kao što su Cy3 (Indokarbocijanin) ili Ci5 (Indodikarbocijanin) ili srodnih boja). Alternativno, jedinjenje sposobno za posredovanje bioluminiscencije može se koristiti kao dijagnostičko jedinjenje, kao što je luciferaza, na primer Gaussia luciferaza ((Chopra A. Gaussia princeps luciferase. In: Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD) [database online]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), NCBI; 2004-2012. Available from: http://micad.nih.gov.).

Primena Gaussia luciferaza za in vivo imidžing je dobro definisana (vidi npr. Santos EB et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nat Med. 2009 Mar;15(3):338-44. Epub 2009 Feb 15; ili Inoue Y et al. Gaussia luciferase for bioluminescence tumor monitoring in comparison with firefly luciferase. Mol Imaging. 2011 Oct 1;10(5):377-85. doi: 10.2310/7290.2010.00057. Epub 2011 Apr 26; videti u daljem tekstu za dodatne detalje).

Štaviše, fragmenti F1 i F2 (tj. fragmenti VLi VHanti-CD3 Fv u gore opisanom primeru realizacije) mogu biti zamijenjeni sa fragmentima VLi VHantitela koji je specifičan za terapeutsko ili dijagnostičko jedinjenje (tj. u ovom slučaju funkcionalni domen F je sposoban za direktno vezivanje za terapeutsko ili dijagnostičko jedinjenje). Ovde se mogu razmotriti ista terapijska i dijagnostička jedinjenja koja su opisana iznad u kontekstu pristupa „predtargetiranja“. Pored toga, ovde je opisano da fragmenti F1 i F2 (tj. fragmenti VLi VHanti CD3 Fv u prethodno opisanom primeru realizacije) mogu biti zamenjeni fragmentima fluorescentnog ili bioluminiscentnog jedinjenja koji su biološki neaktivni sami, ali obnavljaju svoju funkciju (tj. svoju sposobnost posredovanja fluorescencije ili bioluminiscencije) nakon udruživanja dva fragmenta i funkcionalne komplementacije, čime se omogućava specifična identifikacija ćelija koje nose i antigene A1 i A2.

Brojni fluorescentni molekuli koji se mogu koristiti u ovom kontekstu su dobro poznati i karakterisani u tehnici uključujući, ali bez ograničenja, GFP (zeleni fluorescentni protein), GFP derivate (kao što su YFP (žuti fluorescentni protein) i CFP (cijan fluorescentni protein), Venus (Nagai T et al., A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol.2002 Jan;20(1):87-90), or Cerulean (Enhanced CFP with S72A, Y145A and H148D substitutions)). Za ove molekule opisani su rascepljeni fragmenti koji se sami sklapaju u situaciji kada su u neposrednoj blizini u procesu koji se zove bimolekularna fluorescencijska komplementacija (BiFC).

Na primer, GFP, CFP, Venus, Venus sa supstitucijom M153T ili Cerulean mogu se razdvojiti nakon aminokiseline 155 (tj. npr. fragment F1 može sadržati aminokiseline 1-155 GFP, dok fragment F2 može sadržavati aminokiseline 156 -245 GFP-a, ili obrnuto). Alternativno, YFP ili Venus se mogu podeliti nakon aminokiseline 173. Dodatni detalji o podeljenim GFP i podeljenim GFP varijantama mogu se naći u Kerppola TK., Visualization of molecular interactions using bimolecular fluorescence complementation analysis: characteristics of protein fragment complementation. Chem Soc Rev.2009;38:2876-86.

Primer za molekul koji posreduje bioluminiscencijom i koji se može koristiti u ovom kontekstu je razdvojena luciferaza. Posebno je pogodna luciferaza Gaussia princeps, koja ne zahteva kofaktore da budu aktivni i katalizuju oksidaciju supstratnog koelenteratnog luciferina (koelenterazina) u reakciji koja emituje plavo svetlo, ili derivati Gaussia luciferaze (Remy I and Michnick S, A highly sensitive protein-protein interaction assay based on Gaussia luciferase. Nature Methods - 3, 977 - 979 (2006)). Na primer, fragment F1 može da sadrži fragment sa N-kraja Gaussia luciferaze do Gly-93, dok fragment F2 može da sadrži fragment od Glu-94 do C-kraja Gaussia luciferaze ili obrnuto (vidi: Remy I and Michnick S, Nature Methods, 2006 za detalje). Uspostavljena je primena sistema Gaussia podeljene luciferaze in vivo (Luker et al., In vivo imaging of ligand receptor binding with Gaussia luciferase complementation. Nature Medicine 2011, doi:10.1038/nm.2590), koja omogućava direktno prilagođavanje svrsi predmetnog pronalaska od strane kvalifikovanog stručnjaka.

Intravitalna slika tumorskih lezija je od izuzetnog značaja u slučajevima gde ćelije raka infiltriraju tkiva i gde je potpuna eliminacija svih transformisanih ćelija preduslov za izlečenje. Hirurg u potrazi za diseminiranim ćelijama raka na mestu operacije može koristiti podeljeni GFP ili podeljene GFP derivate spojene sa ciljajućim grupama i laserski potpomognut sistem multispektralne fluorescencijske kamere za detekciju ćelija koji nepotrebno eksprimuju adresirani antigen profil, slično intraoperativnoj upotrebi fluorescencije ili bioluminiscencije koja se već koristi u nekim kliničkim postavkama (van Dam GM et al., Intraoperative tumorspecific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat Med.2011 Sep 18;17(10):1315-9; Luker et al., In vivo imaging of ligand receptor binding with Gaussia luciferase complementation. Nature Medicine 2011, doi:10.1038/nm.2590).

Za detekciju komplementarne podeljene (split) luciferaze, primena supstrata za luciferazu, koji može biti luciferin ili koelenterazin, je obavezna. Koelenterazin je poželjan jer koelenterazin emituje svetlost nezavisnu od ATP i dobro je ustaljena za in vivo imidžing i in vivo primenu. Hirurg će moći da vizualizuje ćelije raka nakon što je označio tumor polipeptidom P1 i P2 i injektirao netoksičnu količinu koelenterazina intravenozno.

U drugom primeru realizacije, inventivni princip se primjenjuje u kontekstu pacijenta koji pati od hematopoetskog tumora i koji je primio transplantaciju zdravih hematopoetskih ćelija od druge osobe (donatora). Ovde, set polipeptida prema pronalasku može se koristiti za specifičnu eliminaciju (ili detekciju) preostalih malignih hematopoetskih ćelija primaoca nakon transplantacije zdravih hematopoetskih ćelija od donora.

Da bi uništio maligne hematopoetske ćelije kod pacijenta koji pati od hematopoetskog tumora, pacijent može biti podvrgnut hemoterapiji i/ili radioterapiji. Nakon toga, pacijent dobija transplantaciju zdravih hematopoetskih ćelija od donora.

Da bi se smanjio rizik od odbacivanja transplantata ili bolesti kalem protiv domaćina, obično se daje prednost transplantaciji tkiva/ćelija (npr. koštane srži) od donatora koji ima isti set MHC molekula (glavnog kompleksa histokompatibilnosti). Međutim, često se ne može identifikovati donator sa istim setom MHC molekula („HLA identičan donor“). Zbog toga su sve više korišćeni transplantirani kalemovi sa jednim ili dva neusaglašenja (nekompatibilnosti) u setovima MHC varijanti, nepovezana krv iz pupčane vrpce sa do tri neusaglašenja ili haploidentične transplantacije. Shodno tome, uobičajeno je da postoji najmanje jedna prepoznata razlika između seta molekula MHC kojeg eksprimuju ćelije primaoca i ćelije donora. Kod transplantacije prema ovom primeru realizacije pronalaska koriste se donorske ćelije koje se razlikuju od ćelija primaoca u odnosu na barem jednu od njihovih HLA varijanti. To znači da postoji najmanje jedan „razlikujući antigen“ koji je prisutan na ćelijskoj površini ćelija primaoca, ali ne i na površini ćelija donorskih ćelija. Na primer, razlikujući antigen može biti HLA-A2, ako je pacijent (tj. primalac) HLA-A2 pozitivan, dok je donor HLA-A2 negativan.

Uprkos hemoterapiji/radioterapiji, pojedine maligne hematopoetske ćelije primalaca su možda izbegle eradikaciju. Kako su preživele maligne hematopoetske ćelije, ćelije primaoca, one nose razlikujući antigen koji razlikuje ćelije primaoca od donorskih ćelija. Istovremeno, one su ćelije poreklom iz hematopoetske linije i tako imaju markere ove ćelijske linije, kao što je CD45, na svojoj ćelijskoj površini. Leukemijski blasti i druge hematopoetske ćelije pacijenta su jedine ćelije koje istovremeno prikazuju razlikujući antigen (ovde HLA-A2) i markere hematopoetske ćelijske linije (ovde CD45). Sklop polipeptida prema pronalasku koristi ovu činjenicu da bi specifično eliminisao ove ćelije.

U tom cilju, prva ciljajuća grupa T1 prvog polipeptida P1 može biti scFv specifičan za razlikujući antigen koji je prisutan samo na ćelijama primaoca (ovde HLA-A2). Kao fragment F1 funkcionalnog domena F, može se odabrati varijabilni region lakog lanca (VL) CD3-specifičnog antitela. Druga ciljajuća grupa T2 drugog polipeptida P2 može biti jednolančana varijanta fragmenta (scFv) specifičan za CD45. Kao fragment F2 funkcionalnog domena F, može se odabrati varijabilni region teškog lanca (VH) datog CD3ε -specifičnog antitela. (Naravno, podjednako je moguće koristiti varijabilni region teškog lanca (VH) CD3ε -specifičnog antitela kao fragment F1 i varijabilni region lakog lanca (VL) datog CD3ε -specifičnog antitela kao fragment F2. Kao što je očigledno za stručnjaka u tehnici, ovo je opšti princip, i generalno je moguće zameniti fragmente koji se koriste za fragment F1 i fragment F2.) Niti je VLCD3-specifičnog antitela sposoban za angažovanje CD3ε u odsustvu VH, niti je VHCD3-specifičnog antitela sposoban za angažovanje CD3ε u odsustvu VL. Shodno tome, ni P1 niti P2 nisu sami za sebe sposobni da se vezuju za CD3ε.

Međutim, ako su oba antigena i razlikujući (npr. HLA-A2) i CD45 antigen prisutna na jednoj pojedinačnoj ćeliji, vezivanje za njihove odgovarajuće antigene dovodi do toga da dva polipeptida P1 i P2 budu u neposrednoj blizini. Kao posledica se sastavljaju neupareni VHi VLdomeni, što rezultira heterodimerizacijom polipeptida P1 i P2 i formiranjem funkcionalnog varijabliog fragmenta Fv iz VHi VLdomena koji je sposoban za vezivanje za CD3ε (vidi Sliku 2) .

Kao rezultat, T ćelije se regrutuju i aktiviraju pomoću CD3ε, a ćelija koja nosi i HLA-A2 i CD45 na svojoj ćelijskoj površini posebno se eliminiše citotoksičnim T ćelijskim odgovorom.

Stručnjak u tehnici razume da su, u skladu sa principom ovog pronalaska, moguće razne varijacije ovog primera realizacije

Na primer, u polipeptidu P2 fragment scFv koji prepoznaje marker hematopoietične ćelijske linije CD45 može se zameniti fragmentom scFv koji prepoznaje marker različite ćelijske linije ili vrste ćelija, tj. ciljajući deo T2 može biti domen koji specifično vezuje antigen koji specifičan je za ćelijsku liniju, osim linije hematopoetske ćelije, ili određeni tip ćelije (za detaljnu listu različitih markera ćelijske linije i markera tipa ćelije koji se mogu koristiti u ovom kontekstu videti David J. Dabbs, Diagnostic immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 3rd edition (2010); or F Lin and J Prichard, Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently Asked Questions, Springer, New York, 1st edition (2011)). Da bi se set polipeptida prilagodio alternativnom markeru ćelijske linije / markeru ćelijskog tipa, dovoljno je zameniti ciljajući deo T2 polipeptida P2 sa viljajućim delom koji ima specifičnost vezivanja za željeni marker alternativne ćelijske linije /marker ćelijskog tipa.

Na primer, u situaciji metastatskog karcinoma renalnih ćelija, stručnjak u tehnici može da konsultuje gore citirane baze podataka za informacije o proteinima na površini ćelija sa ograničenim eksprimovanjem na ćelije bubrega. Među mnogim drugim molekulima, on će saznati da je eksprimunje određenih članova porodice akvaporina ograničeno na ćelije bubrega i eritrocite. Posle dobijanja ove informacije, stručnjak u tehnici će konstruisati polipeptid P2 koji prepoznaje člana akvaporinske porodice koji je ograničen na ćelije bubrega i eritrocite spojene sa varijabilnom regijom teškog lanca (VH) CD3ε -specifičnog antitela. U slučaju da je pacijent koji pati od karcinoma renalnih ćelija HLA A2 pozitivan, a transplantacija bubrega od zdravog donatora je HLA A2 negativna, lekar koji leči pacijenta može koristiti dva konstrukta (anti-akvaporin spojen sa anti-CD3 (VH) i anti -HLA A2 spojen sa lakim lancem (VL) navedenog CD3ε -specifičnog antitela). U ovom slučaju, sve ćelije koje istovremeno eksprimuju dati akvaporin i HLA A2 biće označene za lizu T ćelijama koje su ćelije karcinoma renalnih ćelija i metastatska tkiva. Ćelije bubrega donirane od strane zdravog donatora su HLA A2 negativne i neće biti napadnute. Pošto eritrociti gube HLA ekspresiju tokom procesa ontogeneze i na taj način ne nose HLA molekule na svojoj površini, oni će biti pošteđeni uprkos eksprimovanju velikih količina akvaporina. Opet, konvencionalno, ne-komplementarno bispecifično antitelo koje se odnosi na akvaporin posreduje ubijanju svih ćelija bubrega od donora i primaoca, kao i eritrocita. Bispecifično antitelo koje se odnosi na HLA A2 u pozitivnom pacijentu HLA A2 najverovatnije bi bilo fatalno, s obzirom da svaka ćelija primaoca, osim eritrocita, eksprimu HLA A2 i može biti napadnuta od preusmerenih T ćelija.

Drugi primer je hepatocelularni karcinom (HCC). Hepatociti su u velikoj meri uključeni u brojne metaboličke procese, uključujući prenos lipoproteina. U tom cilju, hepatociti eksprimiraju receptore za lipoproteine visoke gustine (HDL) na svojim površinama (scavenger receptor klasa B član 1, SCARB1). Lečenje HLA A2 pozitivnog pacijenta koji pati od HCC-a koji eksprimira SCARB1 na površini tumorskih ćelija i metastaza može se postići pomoću polipeptidnog P2 konstrukta koji sadrži scFv domen koji se odnosi na SCARB1 fuzionisan na varijabilni region teškog lanca (VH) pomenutog CD3 ε - specifičnog antitela i polipeptida P1 (anti-HLA A2 scFv fuzionisanog sa lakim lancem (VL) navedenog CD3ε-specifičnog antitela) i transplantacije ćelija jetre iz zdravog HLA A2 negativnog donora. U ovom slučaju, sve hepatocite i hepatocitne maligne ćelije koje eksprimiraju i SCARB 1 i HLA A2 biće označene za lizu T limfocitima. Hepatociti donora koji nemaju HLA A2 biće pošteđeni, kao i normalne SCARAB1 negativne donorske ćelije koje eksprimuju HLA A2. Pošto je ekspresija SCARB1, takođe, prijavljena za ćelije koje učestvuju u sintezi steroida u nadbubrežnoj žlezdi, ove ćelije će najverovatnije uništiti preusmerene T ćelije, što dovodi do Addisonove bolesti.

Poznati su različiti markeri koji su specifični za određene tipove ćelija ili linije ćelija ili nekoliko tipova/linija ćelija (za listu primera, vidi gore). Više informacija o markerima linije, diferencijacionim antigenima i markerima tkiva, kao i njihovoj distribuciji u tkivima lako je dostupno iz objavljenih izvora (vidi npr. David J. Dabbs, Diagnostic immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 3rd edition (2010); ili F Lin and J Prichard, Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently Asked Questions, Springer, New York, 1st edition (2011)) i javnih baza podataka (kao što su Gene Expression Atlas of the European Bioinformatics Institute (EBI), http://www.ebi.ac.uk/gxa/; ili Gene Expression Omnibus (GEO) platforma, vidi u gornjem tekstu). Osim toga, ovakvi markeri mogu se identifikovati i/ili proveriti na direktan način od strane kvalifikovanog stručnjaka koji koristi slične postupke kao što je prethodno opisano za identifikaciju tumor-specifičnih kombinacija antigena.

U određenim realizacijama kojima se daje prednost, koristi se antigen sa manjom od savršene specifičnosti za određeni ćelijski tip ili ćelijsku liniju (tj. koristi se antigen koji je prisutan na više od jednog, ali poželjno je na samo nekoliko tipova ćelija ili ćelijskih linija). U nekim realizacijama se koristi antigen koji je eksprimovan datim ćelijskim tipom/ćelijskom linijom većom brzinom ili u većoj proporciji ili količini nego sa drugim tipovima ćelija/linijama ćelija, u smislu da može postojati mala, ali detektabilna ekspresija datog antigena, takođe, i u drugim tipovima ćelija/ćelijskim linijama.

Koncept se dalje može prilagoditi bilo kom drugom HLA haplotipu osim HLA-A2 koji se koristi u gorenavedenom primeru realizacije, sve dok su ćelije primaoca pozitivne na ovaj HLA antigen i donorske ćelije su negativne na njega. Mogući HLA antigeni uključuju, između ostalog, HLA A1, HLA A2, HLA A3, HLA A25, HLA B7, HLA B8, HLA B35, HLA B44 i HLA Cw3, HLA Cw4, HLA Cw6, HLA Cw7. Da bi se set polipeptida prilagodio alternativnom HLA antigenu, dovoljno je zameniti ciljajući deo T1 polipeptida P1 sa ciljajućim delom koji ima specifičnost vezivanja za željeni alternativni HLA antigen. Odgovarajućim izborom ciljajućeg dela T1, naravno, moguće je i specifično eliminisati donorske ćelije.

Štaviše, umesto VLdomena i VHdomena koji nakon sklapanja formiraju domen sposoban za vezivanje za CD3ε (tj. fragment F1 i fragment F2 polipeptida P1 i P2, respektivno), VLdomen i VHdomen mogu se zameniti domenima / fragmentima koji nakon sastavljanja imaju drugačiju funkciju do dobijenog dimera. S tim u vezi, sve varijacije koje su gore opisane za primer realizacije u vezi sa eliminacijom/otkrivanjem tumorskih ćelija identifikovanih specifičnom kombinacijom dva antigena ćelijske površe jednako se primenjuju. Na primer, nakon sklapanja komplementni funkcionalni domen može posredovati vezivanje/ aktiviranje drugih efektorskih ćelija osim T ćelija, može se prilagoditi pristupu „predtargetiranja“, može vezati terapeutsko ili dijagnostičko jedinjenje ili može formirati fluorescentni molekul / molekul sposoban za posredovanje bioluminiscencije.

Različite opcije za izbor fragmenata F1 i F2 i za izbor ciljajućih grupa T1 ili T2 opisanih gore u primeru realizacije koji se odnosi na primenu principa iz pronalaska za specifičnu eliminaciju tumorskih ćelija može se, naravno, takođe razmotriti.

Iz opisanih primera realizacija i varijacija, biće jasno za stručnjaka u tehnici da se gore opisani princip iz pronalaska ne može koristiti samo za visoko specifičnu identifikaciju/eliminaciju tumorskih ćelija ili preostalih malignih ćelija primaoca nakon transplantacije ćelija, već i za identifikaciju/eliminaciju bilo koje vrste ćelije koja nosi specifičnu kombinaciju dva antigena koji ga razlikuju od drugih vrsta ćelija.

U daljem tekstu, pozivamo se na sledeće slike:

Slika 1 prikazuje princip pronalaska. Slika 1A: Antigeni i kreiranje polipeptida P1 i P2. Slika 1B: Ukoliko ćelija eksprimuje i antigen 1 i 2 na svojoj ćelijskoj površini, simultano vezivanje polipeptida P1 i polipeptida P2 za površinu ove ćelije dovodi P1 i P2 u neposrednu blizinu, izazivajući udruživanje delova F1 i F2 i obnovu biološke funkcije domena F komplementacijom. Ne dolazi do obnove biološke funkcije ukoliko su samo antigen A1 (Slika 1C) ili antigen A2 (Slika 1D) prisutni na površini ćelije.

Slika 2 prikazuje primer realizacije pronalaska u okruženju alogenske transplantacije za hematopoetske neoplazije sa neusklađenim HLA antigenima. U ovoj situaciji, dvojna informacija recipijenta HLA haplotipa (HLApacijent) i porekla hematopoetske linije (CD45) se prikazuje isključivo na leukemijskim blastima i drugim hematopoetskim ćelijama pacijenta. Prvi polipeptid P1 obuhvata jednolančanu varijantu fragmetna konstrukta antitela usmerenog nasuprot HLA pacijenta (ciljajuća grupa T1) spojen sa VLfragmentom anti CD3 (fragment F1). Drugi polipeptid P2 obuhvata jednolančanu varijantu fragmetna konstrukta specifičnu za hematopoetski linijski marker CD45 (ciljajuća grupa T2), spojen sa VHrazdvojeni-fragment anti CD3 Fv (fragment F2). CD45: antigen specifičan za hematopoetske ćelija. HLApacijent: HLA-antigen specifičan za ćelije pacijenta, tj. alelička varijanta humane MHC koji is prisutan na površini ćelija pacijenta (= ćelijama recipijenta ćelijske transplantacije), ali nedostaje na površini donorskih ćelija. αCD45 scFv: scFv sa vezujućom specifičnošću za CD45. αHLApacijentscFv: scFV sa vezujućom specifičnošću za HLApacijenta. CD3(VH): varijabilni region teškog lanca imunoglobulina antitela sa vezujućim specifičnostima za CD3. CD3(VL): varijabilni region lakog lanca imunoglobulina antitela sa vezujućim specifičnostima za CD3. Nakon vezivanja dva konstrukta kroz njihove αCD45 scFv i αHLApacijentscFv, respektivno, ćeliji koja nosi i CD45 i HLApacijentantigen, spajanje CD3(VH) sa CD3(VL) vodi funkcionalnoj komplementaciji antitela sa vezijućom specifičnošću za CD3, dozvoljavajući time specifično izdvajanje i aktivaciju T ćelija kroz CD3 molekule na njihovoj ćelijskoj površini.

Slika 3 prikazuje konstrukte korišćene u eksperimentima prikazanim na Slikama 4-9. (Konstrukt 85 razlikuje se od konstrukta 71 u činjenici da konkstrukt 85 ima Flag marker (oznaku) dok konstrukt 71 ima myc marker. Konstrukt 75 razlikuje se od konstrukta 82 u činjenici da konkstrukt 75 ima Flag marker dok konstrukt 82 ima myc marker.) VHCD3: varijabilni region teškog lanca anti-CD3 antitela; VLCD3: varijabilni region lakog lanca anti-CD3 antitela; VHA2: varijabilni region teškog lanca anti-HLA-A2 antitela; VLA2: varijabilni region lakog lanca anti-HLA-A2 antitela; VL45: varijabilni region teškog lanca anti-CD45 antitela; VH45: varijabilni region lakog lanca anti-CD45 antitela; L18, L7, L15, L6, L19: linker 18, 7, 15, 6, 19 amino kiselina, respektivno.

Slika 4 prikazuje konvencionalni tandem konstrukata bispecifičnog jednostrukog lanca scFv korišćen za kontrolu sistema testiranja. Ukratko, konstrukti bispecifičnog antitela sa specifičnošću za CD3 i HLA A2 su titrirani kako je navedeno za ko-kulturu U266, HLA A2 pozitivna, CD45 pozitivna mijelomska ćelijska linija, i HLA A2 negativne T ćelije (monocitno osiromašene mononuklearne ćelije periferne krvi) i određena je proizvodnja interleukina 2 od strane T ćelija. Detektovan je značajan stimulativni kapacitet T ćelija za dva FvCD3-HLA-A2 konstrukta 85 i 71, koji se razlikuju po svojim Flag ili Myc-Oznakama, respektivno (Za strukturu domena konstrukata videti Sliku 3). Konstrukti bispecifičnog tandema Fv u HLA-A2-CD3 konfiguraciji bili su manje efikasni i konstrukti jednostrukog lanca koji su se bavili ili HLA-A2 ili CD3 uopšte nisu stimulisali T ćelije. Pozitivna kontrola sprovedena je korišćenjem nespecifične PHA-L (Fitohemaglutinin) stimulacije.

Slika 5 prikazuje izvrstan i visoko specivičan kapacitet za stimulisanje T ćelija ukoliko se upotrebi par komplementarnih konstrukata prema pronalasku, ali ne ukoliko se samo jedan of dva konstrukta iz para upotrebi pojedinačno. Ukratko, VLCD3-scFvHLA-A2 (konstrukt 42), VHCD3-scFvCD45(VL-VH) (konstrukt 45) i VHCD3-scFvCD45(VH-VL) (konstrukt 55) su odvojeno titrirani ili u kombinaciji konstrukata 42 i 45, ili 42 i 55 sa ko-kulturama U266 i T ćelijama kako je opisano. Visok kapacitet za stimulisanje T ćelija demonstriran je i za kombinacije 42/45 ili 42/55 sa minutnom aktivnošću, ukoliko je jedan od ovih konstrukata dat posebno. Ovi rezultati prikazuju da VLi VHdomeni FvCD3 moraju da sarađuju u cilju rekonstituisanja ili dopune funkcije pokretanja T ćelija. Ono šta je bitno, scFvCD45 ciljajući deo može se prebaciti iz (VL-VH) u (VH-VL) konfiguraciju, jasno naznačavajući da modularni karakter konstrukata dozvoljava zamenu ciljaućih grupa (delova) drugim ciljajućim delovima se željenom specifičnošću. Sistem testova kontrolisan je upotrebom konstrukata sa jednostrukim lancem CD45(VL-VH) i CD45(VH-VL) koji nisu stimulisali T ćelije da proizvode IL2.

Slika 6 prikazuje prvi od tri konkurentna eksperimenta blokiranjam. Bispecifičan tandem konstrukt FvCD3-HLA-A2 (konstrukt 71) je dat ko-kulturama U266 i T ćelijama kako je opisano i stimulativna funkcija je određena kroz izazvanu proizvodnju IL2 od strane T limfocita. Funkcija stimulisanja T ćelije je blokirana konstruktom sa jednostrukim lancem koji zauzima ciljni epitop na HLA A2 molekulu (konstrukt 4, koncentarcija *100). Unutrašnja stimulacija T ćelija pomoću HLA A2 ili CD3 specifičnim konstruktom sa jednim lancem (konstrukt 4 (koncentracija *100) ili konstrukt 36 (koncentracija *9)) je isključena. PHA-L je korišćen kao pozitivna kontrola.

Slika 7 prikazuje da „tridomenski konstrukti“ (tj. konstrukti prema predmetnom pronalasku) prvo moraju da se vežu za površinu jedne ćelije kako bi dimerizovali i dopunili T ćelije pokrećući funkcije eksperimenta blokiranja konkurentskog epitopa. Ukratko, konstrukti 42 i 45 su dodati ko-kulturama U266 ćelija i HLA-A2 negativnim T limfocitima i kapacitet za stimulisanje je određen proizvodnjom IL2 od strane T ćelija. U eksperimentalnim situacijma gde epitopi na HLA A2 ili CD45 molekulima su konkurentski blokirani konstruktima 4 ili 46 (oba u koncentraciji *100), T ćelijska stimulišuća funkcija je ukinuta. Ovi rezultati jasno ističu da dva odgovarajuća „tridomenska konkstrukta“ moraju da se vežu simultano na površinu ćelije u cilju obnavljanja ili dopunjavanja pokretačle funkcije T ćelije. Unutrašnje stimulišuće aktivnosti ili konstrukta (42, 45, 4, 46 i 36) su isključene korišćenjem različitih koncentracija.

Slika 8 prikazuje analogni eksperiment Slici 7 za kombinaciju konstrukata 42 i 55. Još jednom stimulišući kapacitet T ćelija za kombinovanje dva „tridomenska konstruka“ je prekinut konkurentskim blokiranjem antigenskih epitopa na HLA A2 ili CD45 molekulu. Ono šta je bitno, ovi rezultati ponovo pokazuju da ciljni modul može lako biti zamenjen drugim modulom sa odgovarajućom specifičnošću. Još važnije, VL-VH-VLkonfiguracija konstrukta 42 i VH-VH-VLkonfiguracija konstrukta 55 nameću homo- ili hetero-dimerizaciju ili samospajanje konstrukata bez prethodnog vezivanja za supstrat koji eksprimuje i HLA A2 i CD45 antigene.

Slika 9 prikazuje lizu U266 ćelija pomoću HLA A2 negativnih T ćelija u uzorku koji obuhvata i VLCD3-scFvHLA-A2 i VHCD3-scFvCD45(VH-VL) konstrukte („oba konstrukta“). Nije primećena značajna liza u kontrolnom uzorku koji obuhvata samo jedan od dva konstrukta.

Slika 10 prikazuje obnavljanje polipeptida na cilju. Vezivanje dva odvojena polipeptida (P1 i P2) za njihove odgovarajuće antigene na ciljnoj ćeliji, od kojih se svaki sastoji od specifične jednolančane varijante fragmenta antitela (scFv, VH-VL) spojenog sa varijabilnnim lakim (VL) ili varijabilnim domenom teškog lanca (VH) CD3-specifičnog antitela (Fragment F1 i F2), omogućava VH/VLheterodimerizaciju i formiranje funkcionalnog CD3 mesta vezivanja za pokretanje T ćelija.

Slika 11 prikazuje da CD3 VH/VLdimerizacija pokreće T ćelije i da je dualno-antigenski ograničena. U266 mijelom, primarna T ćelija pro-limfotičke leukemije (T-PLL), i THP-1 ćelije akutne mijeloidne leukemije, sve HLA-A2-positivne i CD45-positivne, testirane su sa HLA-A2-negativnim donorskim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) i polipeptidima kako je naznačeno. Angažovanje T ćelija procenjeno je proizvodnjom reaktivnog interleukin-2 (IL-2) (A) i lizom ciljnih ćelija (B). Bispecifično tandem scFv (CD3(VH-VL) - HLA-A2(VH-VL) antitelo je korišćeno kao pozitivna kontrola. (C), Vezivanje polipeptida za THP-1 ćelije konkurentski blokirano viškom scFvCD45 (levo) i scFvHLA-A2 (desno) inhibitora (koji blokiraju pojedinačne epitope antigena na ciljnoj ćeliji), kako je navedeno i proizvodnjom reaktivnog IL2 donorskog PBMC je ispitivano. (D), Vršene su probe antigena sa jednom ili duplom negativnom ćelijskom linijom antigena RAJI i KMS-12-BM sa polipetpidima. PHA-L je korišćen kao nespecifična kontrola sitimulacije za PBMC.

Slika 12 prikazuje usmerenu terapiju uslovljenom CD3VH/VLkomplementacijom in vivo. (A), Preživljavanje miševa (n = 6 po grupi) nakon intraperitonealne injekcije 5×10<6>THP-1 ćelija akutne leukemije zajedno sa 1,25 × 10<5>CMV-specifičnih, HLA-A2-negativnih donorskih T ćelija i polipeptida (0,5 µg) kako je navedeno (tumorske ćelije: odnos T ćelija = 40/1). (B), Aktivacija kaspaze 3 je procenjena in vitro citometrijom protoka kod HLA-A2/CD45 dvostruko-positivnih THP-1 i CD45-positivnih ali HLA-A2-negativnih posmatračkih ćelija nakon ko-uzgajanja sa donorskim T ćelijama i polipeptidima (3 nM) kako je navedeno. Bispecifično tandem scFv (CD3(VH-VL) - HLA-A2(VH-VL)) antitelo je korišćeno kao pozitivna kontrola.

Slika 13 prikazuje da EGFR- i EpCAM-usmereni polipeptidi angažuju T ćelije za razaranje ćelija karcinoma. EGFR i EpCAM dvostruko-pozitivne ćelijske linije humanog raka debelog creva COLO-206F i ćelijske linije melanoma FM-55 (EGFR-positivne ali EpCAM-negativne) su bile testirane sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za EGFR (CD3(VH)-EGFR(VH-VL)) i EpCAM (CD3(VL)-EpCAM(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog interferona-γ (IFNγ) (A) i aktivacijom kaspaze 3 u ciljnim ćelijama (B).

Slika 14 prikazuje da HLA-A2 i CEA usmereni polipeptidi preusmeravaju T ćelije za uništenje tumorskih ćelija. Ćelijska linija humanog raka debelog creva COLO-206F, ćelijska linija melanoma FM-55 i ćelijska linija raka jajnika OVCAR testirane su sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za HLA-A2 (CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL)) i CEA (CD3(V.H)-CEA(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 15 prikazuje da HLA-A2 i EGFR usmereni polipeptidi preusmeravaju T ćelije za uništenje tumorskih ćelija. Ćelijske linije humanog COLO-206F, FM-55 i OVCAR testirane su sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za HLA-A2 (CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL)) i EGFR (CD3(VH)-EGFR(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 16 prikazuje da HLA-A2 i Her2 usmereni polipeptidi preusmeravaju T ćelije za uništenje tumorskih ćelija. Ćelijske linije humanog COLO-206F, FM-55 i OVCAR testirane su sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za HLA-A2 (CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL)) i Her2 (CD3(VH)-Her2(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 17 prikazuje da CD45 i HLA-A2 usmereni polipeptidi preusmeravaju T ćelije za uništenje tumorskih ćelija. U ovom eksperimentu, rascepljeni antiCD3 fragmenti (CD3(VH) i CD3(VL)) za anti-CD45 i anti-HLA-A2 ciljajući delovi su zamenjeni, u poređenju sa CD45 i HLA-A2 polipeptidima korišćenim na Sl.5, 7-9, 11,12, 14-16. Ćelijska linija humanog mijeloma U266 testirana je sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za CD45 (CD3(VL)-CD45(VH-VL)) i HLA-A2 (CD3(VH)-HLA-A2(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 18 prikazuje da EGFR i EpCAM usmereni polipeptidi preusmeravaju T ćelije za uništenje tumorskih ćelija. Ćelijska linija humanog raka debelog creva COLO-206F i CX-1 i ćelijska linija raka jajnika OVCAR testirane su sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za EpCAM (CD3(VL)-EpCAM(VH-VL)) i EGFR (CD3(VH)-EGFR(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 19 prikazuje da Her2 i EpCAM usmereni polipeptidi preusmeravaju T ćelije za uništenje tumorskih ćelija. Ćelijska linija humanog raka jajnika OVCAR testirana je sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za EpCAM (CD3(VL)-EpCAM(VH-VL)) i Her2 (CD3(VH)-Her2(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 20 prikazuje da CD45 i CD138 usmereni polipeptidi preusmeravaju T ćelije za uništenje tumorskih ćelija. Ćelijska linija humanog mijeloma AMO-1 testirana je sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za CD45 (CD3(VL)-CD45(VH-VL) gornji panel, CD3(VH)-CD45(VH-VL) donji panel) i CD138 (CD3(VH)-CD138(VH-VL) gornji panel, CD3(VL)-CD138(VH-VL) donji panel) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 21 prikazuje da targetiranje pojedinačnog antigena (CD138) sa CD138 usmerenim polipeptidima preusmerava T ćelije za uništenje tumorskih ćelija. Ćelijska linija humanog mijeloma AMO-1 testirana je sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za CD138 (CD3(VL)-CD138(VH-VL) i (CD3(VH)-CD138(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 22 prikazuje da targetiranje pojedinačnog antigena (CD45) sa CD45 usmerenim polipeptidima preusmerava T ćelije za uništenje tumorskih ćelija. Ćelijska linija humanog mijeloma AMO-1 i U266 testirane su sa PBMC u prisustvu polipeptida specifičnih za CD45 (CD3(VL)-CD45(VH-VL) i (CD3(VH)-CD45(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija bilo je procenjeno proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 23 prikazuje uspostavljanje dva polipeptida na ciljnom mestu usmerenih protiv pojedinačnog antigena na površini ćelije, koji targetira dva različita epitopa (gornji deo) ili isti epitor (donji deo) na antigenu. Vezivanje dva različita polipeptida (P1 i P2) za njihove odgovarajuće epitope na istom antigenu, na ciljnoj ćeliji. Za targetiranje dva različita epitopa, ciljajući deo svakog polipeptida obuhvata specifični fragment sa jednostrukim lancem varijabilnog antitela (scFv). Za targetiranje istog epitopa, ciljajući deo svakog polipeptida sastoji se od iste jednolančane varijante fragmenta antitela (scFv). Ciljajući delovi se spajaju putem peptidnih spojnica sa varijabilnim domenom lakog (VL) ili varijabilnim domenom teškog lanca (VH) CD3-specifičnog antitela (Fragment F1 i F2), omogućava VH/VLheterodimerizaciju i formiranje funkcionalnog CD3 vezujućeg mesta (funkcionalnog domena) za angažovanje T ćelija.

Slika 24 prikazuje mogućnost da se upotrebe različiti efektorski načini kako ubiti ciljnu ćeliju setom polipeptidnih delova. U tom cilju, anti-CD3 modul (F1 i F2) je zamenjen sa anti-HIS (heksa-histidin) modulom koji, nakon simultanog vezivanja polipeptida 1 i 2, dopunjuje heksahistidin vezujuću lokaciju i stoga vezuje histidinom označene terete (npr. HIS-označen toksin). Ciljajuća grupa T1 (VH-VL) polipeptida P1 specifično vezuje za HLA-A2, ciljajuća grupa T2 (VH-VL) polipeptida P2 specifično vezuje za CD45. Fragment F1 polipeptida P1 obuhvata VHdomen antitela protiv heksahistidin-oznake i fragment F2 polipeptid P2 obuhvata VLdomen istog antitela. Ćelijska linija humane mijeloidne leukemije THP-1 testirana je sa histidinom (His) označenom Clostridium perfringens Iota toksin komponentom Ia na 0,01 µg/ml u kombinaciji sa navedenim polipeptidima. Nakon 48 časova u kulturi ćelijska održivost je merena korišćenjem alamarBlue® testa. Rezultati prikazuju smanjenu održivost nasuprot pozadini testa za ćelijse za koje su vršene probe sa kombinacijom, ali ne sa pojedinačnim polipeptidima. Kontrolne THP-1 ćelije su simulatno uzgajane u kulturi bez toksina. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 25 prikazuje da HLA-A2 i CD45 usmereni polipeptidi, koji obuhvataju rascepljeno antitelo protiv His-oznake, ubijaju ćelije tumora histidin (His) označenom Shiga toksinskom podjedinicom A u koncentraciji od 0,01µg/ml. Isto eksperimentalno okruženje je korišćeno kao na Slici 24.

Slika 26 prikazuje da HLA-A2 i CD45 usmereni polipeptidi, koji obuhvataju rascepljeno antitelo protiv His-oznake, ubijaju ćelije tumora histidin (His) označenom Shiga toksinskom podjedinicom A u koncentraciji od 0,1µg/ml. Isto eksperimentalno okruženje je korišćeno kao na Slikama 24 i 25.

Slika 27 prikazuje da EGFR i EpCAM usmereni polipeptidi, koji obuhvataju funkcionalni domen F sa F1 i F2 su VHi HLantitela specifičnog na digoksigenin (aDig), markiraju ćelije tumora korišćenjem digoksigenin označenog molekula peroksidaze rena (HRP). Ciljajuća grupa T1 (VH-VL) polipeptida P1 specifično se vezuje za EGFR, ciljajuća grupa T2 (VH-VL) polipeptida P2 specifično se vezuje za EpCAM. Fragment F1 polipeptida P1 obuhvata VHdomen antitela protiv digoksigenina i fragment F2 polipeptida P2 obuhvata VLdomen istog antitela. Ćelijska linija humanog raka debelog creva Colo-206F je prvo testirana sa naznačenim polipeptidima a nakon toga sa digoksigeninom označenim HRP. Uzorci su analizirani korišćenjem (Invitrogen™, ELISA Kit) i apsorbanca je očitavana sa BioRAD-micro plate čitačem. Za analizu praznog uzorka hromogena (bez Digoksigenin-HRP) je bio podešen na 0. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 28 prikazuje da CD45 i HLA-CW6 usmereni polipeptidi preusmeravaju T ćelije na uništavanje ćelija pacijenta. Primarne ćelije pacijenta sa poznatim HLA-haplotipovima su korišćene. A51 = ćelije pacijenta sa MDS (mijelodisplastičnim sindromom), homozigotne za HLA-Cw6 haplotip. A49 = ćelije pacijenta nakon alogenske transplatacije koštane srži, heterozigotne za HLA-Cw6 haplotip. Ćelije pacijenta su inkubirane sa zdravim PBMC tokom 30 časova, u prisustvu polipeptida specifičnih za CD45 (CD3(VL)-CD45(VH-VL) i HLA-Cw6 (CD3(VH)-HLA-CW6(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija je procenjihvano proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 29 prikazuje da EGFR i EpCAM usmereni polipeptidi preusmeravaju T ćelije na uništavanje primarnih ćelija raka kod pacijenta. A44 tumorske ćelije su sakupljene iz malignih ascita 48-godišnjem pacijenta muškog pola sa metastatskim rakom pankreasa. Tumorske ćelije pacijenta su inkubirane sa PBMC samog pacijenta (prikupljenih flebotomijom) tokom 30 časova, u prisustvu polipeptida specifičnih za EpCAM (CD3(VL)-EpCAM(VH-VL) i EGFR (CD3(VH)-EGFR(VH-VL)) kako je navedeno. Angažovanje T ćelija je procenjihvano proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 30 prikazuje da CD45 i HLA-A2 usmereni polipeptidi preusmeravaju CMV ograničene CD8+ T ćelije na uništenje tumorskih ćelija. Humane ćelije tumora THP-1 i U266 su inkubirani sa CMV ograničenim T ćelijama iz HLA-A2 negativnog zdravog donora tokom 30 sati, u prisustvu polipeptida specifičnih za HLA-A2 (CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL) i CD45 (CD3(VH)-CD45(VH-VL)) kako je navedeno. Koršćeno je bispecifično tandem scFv (CD3(VH-VL) x HLA-A2(VH-VL))-antitelo kao pozitivna kontrola. rol. Angažovanje T ćelija je procenjihvano proizvodnjom reaktivnog IFNγ. Uzorci su testirani i analizirani kao duplikati.

Slika 31 prikazuje načelnu ideju da se ukloni autoimuli ili hipersensibilni poremećaj koji uzrokuje klonove B ćelija sa setom polipeptidnih delova, koi se sastoje od alergen specifičnog polipeptida i polipetpida specifičnih za tip ćelije. Prvi polipeptid P1 ima svoj ciljajući deo koji je alergen (npr. Betv-1A, Der-f2, Conglutin-7, Can-fl, Feld-d1). Drugi polipeptid P2 ima kao svoj ciljajući deo specifični fragment varijabilnog antitela sa jednim lancem (scFv, VH-VL) koji cilja protein na površini ćelije (npr. CD19, CD 138, CD38). Oba ciljajuća dela su spojena sa ili varijabilnim domenom lakog (VL) ili varijabilnim domenom teškog lanca (VH) CD3-specifičnog antitela (Fragment F1 i F2).

U daljem tekstu, poziva se na određene (humane) gene ili proteine na koje se takođe osvrnuli i u specifikaciji, pratećim primerima i na crtežima kao i (delimično) u patentnim zahtevima. U daljem tekstu, dati su odgovarajući (primeri) pristupnih brojeva gena. Dodatni pristupni brojevi su, takođe, dati u specifikaciji na drugim mestima u ovoj prijavi kao i u priloženim primerima.

CD45: Gen ID: 5788, ažuriran 13. jan.2013, 3. Protein = P08575-1 = Izoform 1, poslednji put modifikovano 19. jula 2003. Verzija 2

CD34: Protein: P28906-1/2 poslednji put modifikovano 15.. jul 1998. verzija 2.

CD33: Gen ID: 945, ažuriran 30. dec. 2012: Protein: P20138 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 17. oktobar 2006. Verzija 2. Checksum: 1C73E588240FBAD8

CD138: Gen ID: 6382, ažuriran 6.jan. 2013, 4. Protein = P18827 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 5. maj 2009. Verzija 3.

CD15: Gen ID: 2526, ažuriran 5. jan.2013.

CD1a: Gen ID: 909, ažuriran 30. dec.2012, P06126 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 9. februar 2010. Verzija 4. Checksum: C575C3C538F0AA29

CD2: Gene ID: 914, ažuriran 5. jan 2013; P06729 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 23. oktobar 2007. Verzija 2. Checksum: A03D853C3B618917

CD3ε: Gene ID: 916, ažuriran 5. jan. 2013, P07766 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1.februar 1996. Verzija 2. Checksum: A1603D01CE9957D7

CD4: Gen ID: 920, ažuriran 13. jan.2013; P01730 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. novembar 1988. Verzija 1. Checksum: 20ED893F9E56D236

CD5: Gen ID: 921, ažuriran 30. dec.2012; P06127 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 30. novembar 2010. Verzija 2. Checksum: 9131AEC9683EE1D3

CD8a: Gen ID: 925, ažuriran 30. dec. 2012; Isoform 1/2 (membrane) P01732-1/2 (mCD8alpha) [UniParc]. Poslednji put modifikovano 21. jul 1986. Verzija 1. Checksum: FCCA29BAA73726BB

CD20: Gen ID: 931, ažuriran 6. jan.2013; P11836 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. oktobar 1989. Verzija 1. Checksum: AC5420F8B626BDD1

CD23: Gen ID: 2208, ažuriran 4. jan.2013; P06734 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. januar 1988. Verzija 1. Checksum: F86708C0E6515B87

CD31: Gen ID: 5175, ažuriran 13. jan. 2013; Isoform Long [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. april 1990. Verzija 1. Checksum: C57BBFA200A407A6, P16284-1/2/3/4/5/6 = Izoformi 1-6

CD43: Gen ID: 6693, ažuriran 30. dec. 2012; P16150 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. april 1990. Verzija 1. Checksum: C9C9AB8435D5E1FE

CD56: Gen ID: 4684, ažuriran 30. dec.2012; Isoform 1 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 22. jul 2008. Verzija 3. Checksum: FD3B9DE80D802554, P13591-2/1/3/4/4/6, Izoformi 1-6

CD57: Gen ID: 27087, ažuriran 5. jan.2013. godine.

CD68: Gen ID: 968, ažuriran 6. jan. 2013; Isoform Long (CD68.1) [UniParc]. Poslednji put modifikovano 15. maj 2007. Verzija 2. Checksum: 69E68D69EDE8EFB0, P34810-1/2, Izoform 1/2

CD79a: Gen ID: 973, ažuriran 5. jan. 2013; Izoform 1 (Long) [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. jun 1994. Verzija 2. , Checksum: 6E5B837409969292, P111912-1/2, Izoform 1/2

CD146: Gen ID: 4162, ažuriran 30. dec. 2012; Isoform 1 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 10. januar 2006. Verzija 2. Checksum: E46CB8AC7BA0738E, P43121-1/2, Izoform 1/2.

Proteini surfaktanta (A i B):

Gen ID: 6440, ažuriran 30. dec.2012 i Gen ID: 6439, ažuriran 30. dec.2012, P07988 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. maj 1992. Verzija 3. Checksum: 9FD7F66678A35153, i Isoform 1 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. april 1990. Verzija 2. Checksum: C26A21E33C60AA78, P11686-1/2, Izoform 1/2

sinaptofizin:

Gen ID: 6855, ažuriran 30. dec.2012, P08247 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. avgust 1991. Verzija 3. Checksum: 592289C43B12EFA7

nikotinski acetilholinski receptori:

Gen ID: 1138, ažuriran 30. dec. 2012, Gen ID: 1136, ažuriran 6. jan 2013, Gen ID: 1139, ažuriran 13. jan. 2013, Gen ID: 1137, ažuriran 30. dec. 2012, Gen ID: 1141, ažuriran 5. jan.

2013. godine.

mišićno specifična kinaza MUSK:

Gen ID: 4593, ažuriran 8. jan 2013, Isofonn 1 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. januar 1998. Verzija 1. Checksum: 3DDC20E179FA010C, 015146-1/2, Izoform 1/2

naponom-kontrolisani kalcijumski kanal (P/Q-tip):

Gen ID: 773, ažuriran 5. jan 2013; Isoform 1 (1A-1) (BI-1-GGCAG) [UniParc]. Poslednji put modifikovano 15. jul 1999. Verzija 2. Checksum: 2F2F378ACE02FD56, O00555-1/2/3/4/5/6/7, Izoformi 1-7, Gen ID: 25398, ažuriran 11. jan. 2013, J3KP41 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 3. oktobar 2012. Verzija 1. Checksum: AEDF4D2A5E49263F

naponom-kontrolisani kalijumski kanal (VGKC):

Gen ID: 3737, ažuriran 30. dec. 2012, Gen ID: 3736, ažuriran 8. jan. 2013, Gen ID: 3742, ažuriran 8. jan.2013. godine.

N-metil-D-aspartat receptor (NMDA):

Gen ID: 2904, ažuriran 5. jan 2013, Q13224 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 20. jun 2001. Verzija 3. Checksum: 40AEB12BE6E50CEF; Gen ID: 2902, ažuriran 30. dec. 2012, Isoform 3 (Long) (NR1-3) [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. jun 1994. Verzija 1. Checksum: CDF5402769E530AB, Q05586-1/2/3/4/5, Izoformi 1-5

TSHR: Gen ID: 7253, ažuriran 4. jan. 2013, Isoform Long [UniParc]. Poslednji put modifikovano 29. mart 2005. Verzija 2. Checksum: D2EE9CEBFD64A65F, P16473-1/2/3, Izoformi 1-3

Amfifizin:

Gen ID: 273, ažuriran 8. jan.2013, Isoform 1 (128 kDa) [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. februar 1996. Verzija 1., Checksum: 78B4F75AB75BA357, P49418-1/2, Izoform 1-2

gangliozid GQ1B: Gen ID: 29906, ažuriran 30. dec 2012.

GD3: Gen ID: 117189, ažuriran 22. jun 2012. godine.

Ca-125: Gen ID: 94025, ažuriran 30. dec. 2012, Q8WXI7 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. mart 2003. Verzija 2. Checksum: B3E7BDF19997A440

Her-2/neu: Gen ID: 2064, ažuriran 13. jan.2013, 4. Protein = P04626-1/2/3/4 = Izoform 1-4 , Poslednji put modifikovano 13. avgust 1987. Verzija 1. gross cystic disease fluid protein 15; Gen ID: 5304, ažuriran 30. dec.2012.

CD117: Gen ID: 3815, ažuriran 6. jan.2013. godine.

CD30: Gen ID: 943, ažuriran 6. jan. 2013; Isoform Long [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. decembar 1992. Verzija 1. Checksum: 7A407CC78A6E0BC8, P28908-1/2, Izoform 1/2

Trombocitno izvedeni faktor rasta PDGFR alfa:

Gen ID: 5159, ažuriran 13. jan. 2013, Gen ID: 5156, ažuriran 13. jan. 2013, Isoform 1 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. april 1990. Verzija 1. Checksum: 5E3FB9940ACD1BE8, P16234-1/2/3, Izoformi 1-3; P09619 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. jula 1989. Verzija 1. Checksum: 038C15E531D6E89D

Marker povezan sa melanomom /Mart 1:

Gen ID: 2315, ažuriran 30. dec. 2012; Q16655 [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. novembar 1996. Verzija 1. Checksum: B755BFF39CFCB16E

CD133: Gen ID: 8842, ažuriran 13. jan. 2013; Isoform 1 (AC133-1) (S2) [UniParc]. Poslednji put modifikovano 1. jun 1998. Verzija 1. Checksum: D21CBC05ADB2DEDF, 043490-1/2/3/4/5/6/7, Izsoformi 1-7

[0265] U daljem tekstu, pozivamo se na primere koji su dati u svrhu ilustracije, bez da ograničavaju predmetni pronalazak.

Primeri

Primer 1

Kloniranje rekombinantnog konstrukta antitela

DNK sekvence izvedene iz ćelije hibridoma i koje kodiraju varijablne domene anti-CD3, anti-CD45 i anti-HLA A2 antitela, respektivno, korišćene su za dobijanje konstrukata antitela opisanih na Slici 3 prema standardnim metodama molekularne biologije (videti, npr. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). Konstrukti su osmišljeni tako da nose različite afinitetne markere (tagove) kako bi se omogućila identifikacija i prečišćavanje nakon ekspresije rekombinantnih proteina (Myc, Flag, His-marker (Tag) Za detalje rasporeda domena, afinitetnih markera i spojnica konstrukata, videti Sliku 3.

Vodeća sekvenca pelB aminokiselina koja usmerava protein eksprimiran u bakteriji na bakterijsku periplazmu. Vodeća sekvenca se zatim otcepljuje bakterijskim enzimima i protein se može izolovati.

Primer 2

Eksprimovanje i prečišćavanje rekombinantnih antitela

Eksprimovanje periplazmatičnog proteina:

Rekombinantni konstrukti antitela eksprimirani su u periplazmi E. coli soja TG1 pomoću odgovarajućeg prokariotskog ekspresionog vektora. Dve litre 2 × TY medijuma uključujući 0,1 % glukozu i 100 µg/ml ampicilina inokulirane su sa 20 ml kulture transformisanih TG1 i gajene do eksponencijalne faze (OD600 0,8 – 0,9) na 37°C. Budući da su fragmenti antitela pod kontrolom promotora laktoze, ekspresija proteina indukovana je dodatkom 1 mM IPTG pa zatim inkubacijom na RT (sobnoj temperaturi) uz mućkanje od još 3h. Ćelije su oborene centrifugiranjem od 10 min na 2,750 × g i 4°C i resusnedovane su u 100 ml odgovarajućeg pufera. Ćelijska liza izvedena je dodatkom 50 µg/ml sveže rastvorenog lizozima [Roche Diagnostics] i inkubacijom od 25 min na ledu. Zatim, dodato je 10 mM MgSO4za stabilizaciju sferoblasta i ćelije su centrifugirane 10 min na 6,200 × g i 4°C. Na kraju , dobijeni supernatant koji sadrži periplazmatični protein, dijaliziran prema PBS preko noći na 4°C i ponovo centrifugiran 15 min kao što je prethodno opisano. Nakon ovoga, rekombinantni proteini su prečišćeni pomoću Ni-NTA-IMAC (Nikl Nitrilo-trisirćetna kiselina afinitetna hromatografija sa imobilizovanim metalnim jonima).

Afinitetna hromatografija sa imobilizovanim metalnim jonima (IMAC):

Za prečišćavanje rekombinantnih proteina sa His6markerom, IMACje izvedena pomoću niklnitrilosirćetne kiseline (NTA) imobilizovane na agaroznim kuglicama [Qiagen]. Prvo, kolona od 1 ml Ni-NTA agaroze treba da bude ekvilibrisana sa oko 10 ml sterilnog rastvora PBS ili rastvora natrijum fosfatnog pufera sa 20 mM imidazola. Zatim, sirov protein, bilo staložen iz citoplazmatičnog eksprimovanja ili dijaliziran iz periplazmatičnog eksprimovanja, postepeno je nanet na kolonu. Nakon ispiranja sa oko 20 ml odgovarajućeg IMAC pufera za ispiranje (rastvor natrijum fosfatnog pufera koji sadrži 20 - 35 mM imidazola) sve dok protein više nije detektovan u frakciji od ispiranja, vezani protein je eluiran sa kolone u frakcijama od 500 µl sa rastvorom natrijum fosfatnog puger koji sadrži 250 mM imidazola.

Sve sakupljene frakcije od ispiranja i eluiranja su testirane na prisustvo proteina kvalitativnim Bradford testom dodavanjem po 10 µl svakog od uzoraka u 90 µl 1 × Bradford-ov rastvor. Provera procesa prečišćavanja izvedena je SDS-PAGE analizom. U ove svrhe, eluirane frakcije su praćene/analizirane paralelno sa sirovim proteinom, protokom i frakcijama od ispiranja pod redukujućim uslovima. Konačno, pozitivne frakcije su određene kolorimetijskim reakcijama koje su kombinovane u pik i manje frakcije i dijalizirane prema PBS-u preko noći na 4°C. Za upotrebu u stimulacionom testu, prečišćeni proteini moraju biti sterilno profiltrirani i određena njihova koncentracija. Dodatno, nakon kvantifikacije proteina, 2 µg od dodatno upotrebljenih frakcija je, takođe, analizirano pomoću SDS-PAGE i Western blot pod redukujućim i neredukujućim uslovima.

U alternativnom Primeru 2, DNK sekvence za kodiranje (VH)CD3-EGFR(VH-VL), (VH)CD3-CEA(VH-VL), (VH)CD3-Her2(VH-VL), (VH)CD3-HLA-A2(VH-VL), (VH)CD3-HLA-CW6(VH-VL) (VH)CD3-CD138(VH-VL), (VH)antiDig-EGFR(VH-VL), (VH)antiHis-HLA-A2(VH-VL), (VL)CD3-CEA(VH-VL), (VL)CD3-EpCAM(VH-VL), (VL)antiDig-EpCAM(VH-VL), (VL)antiHis-CD45(VH-VL), (VL)CD3-CD45(VH-VL) su sintetisane i dobijeni su proteini koji su i izolovani pomoću GenScript (Piscataway, NJ, USA). Optimizovan je kodon DNK za ekspresiju E.coli (vektor E3), ekspresiono optimizovan, gajen u 2 litre standardnog LB-medijuma, protein je dobijen iz inkluzionih tela ili periplazme (čeoni pelB) u jednom koraku pomoću Ni-HiTrap kolone. Bakterijski endotoksini su uklonjeni dijalizom prema 5 litara 1x rastvora fosfatnog pufera (PBS). Koncentracija je merena pomoću Bradford-ovog proteinskog testa sa goveđim serum albuminom (BSA) kao standardom. Čistoća je određena denzitometrijskom analizom Kumasi plavim SDS-PAGE gel analizom. Alikvoti su čuvani na -80°C ili 4°C. Kao pufer za skladištenje korišćen je 1xPBS, 5% Glicerol, 0,5% natrijum lauroil sarkozin, pH 7,4.

Primer 3

Tehnike kultura ćelija

Kultivacija ćelija:

Ćelije sisara kultivisane su u T75 flasku za kultivaciju tkiva u 20 ml odgovarajućeg medijuma za gajenje na 37°C sa 5% CO2. Ćelije su deljene svaka 2 - 3 dana. Ćelije koje prijanjaju na zidove suda, treba prvo odvojiti pomoću 1 × tripsin-EDTA. Ćelije su izbrojane bojenjem ćelija vitalnom bojom, eozinom ili tripan plavim. Za skladištenje, ćelije sa 60 - 80 % konfluentnosti su oborene centrifugiranjem tokom 5 min na 450 × g, resuspendovane u FCS sa 10 % DMSO, u alikvotima prebačene u kriovajle, i postepeno zamrzavane na temepraturu od

-80°C. Ćelije su brzo odmrznute na 37°C u vodenom kupatilu i pažljivo dodate u 5 ml medijuma. U cilju uklanjanja DMSO, ćelije su ponovo centrifugirane, resuspendovane u svežem medijumu i prebačene u sud za kultivaciju tkiva.

Priprema mononuklearnih ćelija perfierne krvi (PBMC):

PBMC, sastavljene od limfocita i monocita, prethodno su izolovane iz podloge od goveđih ćelija zdravih humanih donora centrifugiranje u gradijentu gustine koristeći Ficoli rastvor za separaciju limfocita LSM 1077 (PAA Laboratories, Pasching, Austria). Budući, da tokom korišćenja, ove PBMC se međutim pojavljuju kao nehomogena ćelijska populacija, razdvajanje od preostalih eritrocita, granulocita i trombocita je ponovljeno na sledeći način. Odmrznute PBMC, resuspendovane u 30 ml RPMI 1640 medijuma koji sadrži 10 % FCS i Pen-Strep, pažljivo su nanete na 10 ml LSM 1077 i centrifugirane tokom 5 min na 800 × g bez kočenja. Nakon odbacivanja gornje faze, PBMC koncentrovane u interfazi su prebačene u čistu epruvetu, resuspendocane u 30 ml medijua i centrifugirane tokom 5 min na 450 × g. Monociti su uklonjeni kultivacijom PBMC na sud od Ø 10 cm za kultivaciju tkiva, preko noći, omogućavajući prianjanje monocita na zidove suda. Konačno, PBMC, preostale u rastvoru su sakupljene.

U alternativi Primera 3, ćelije primarnog karcinoma čoveka od pacijenata sa metastaznim karcinomom pankerasa ekstrahovane su iz ascita pacijenta (slika 29). 4 litre sa sveže sakupljenim malignnim ascitima čuvani su u stakelnim bocama od 2 litre na 4°C preko noći. Sledećeg dana ćelijeks pelete sa dna staklenih boca isprane su u 1xPBS i resuspendovane u medijumu za kultivaciju (DMED u koji je dodato 200 µM 1-glutamina, 10% toplotno aktiviranog FBS, penicilina (200 U/mL), streptomicina (200 µg/mL) i natrijum piruvata (ImM) (Gibco®)). Ćelije koje prianjaju na zidove suda kultivisane su u inkubatoru na 36°C, 5%CO2, 90% vlažnosti. Istog dana tečnost ascita je sakupljena od pacijenata, pa je sakupljeno 20ml periferne krvi za ekstrakciju PBMC. Primarne leukemijske ćelije dobijene su od muškarca, starosti 71 godine sa T-ćelijskom prolimfocitnom leukemijom (T-PLL) (Slika 11A) u recidivu/relapsu 32 dana nakon usklađenih alogenih transplantata matičnih ćelija. Leukmijske T-PLL ćelije su ekstrahovane sa PBMCs iz periferne krvi pacijenata. U momentu uziimanja uzorka krvi pacijent je imao >90% leukemijskog blasta u kliničkoj analizi krvi u rutinskoj kliničkoj dijaznostici. Od svih pacijenata dobijena je saglasnost, koju je potvrdila Univerzitetska bolnica Würzburg i potpisala etička komisija.

U alternativi Primera 3, dobijanje citomegalovirus (CMV)-specifičnih T-ćelija čoveka: Ukratko, dendritske ćelije (DC) su dobijene od plastičnih adherentnih monocita od PBMC HLA-A0201 negativnog , B0702+ donora. Nakon 72h kultivisanja, medijum koji sadrži GM-CSF/IL4- DC (Cellgenix), DC su sazrele u medijumu koji sadrži IL4(100ng/ml), GM-CSF(800IU/ml), LPS (10ng/ml) i IFNγ (100U/ml) plus 2.5ug/ml CMV pp65 izveden peptid. TPRVTGGG. Posle 16h, DC su osvetljene (30Gy)i inkubirane sa CD45RO-, CD57<->naïve CD8<+>T-ćelijama u odnosu 1:4 u medijumu koji sadrži 5% AB seruma i IL21 (10ng/ml). svež medijum, IL7 i IL15 dodati su u dane 3, 5 i 7 kultivisanja, pre određivanja na dan 10-12. Ćelije su kultivisane u medijumu Cellgenix DC. Humani AB serum je upotrebljen od PAA. Tokom svih eksperimenata korišćena je jedna serija reagenasa. IL4, IL7, IL15, IL21 su bilo kupljene od Peprotech ilki Cellgenix (sa identičnim rezultatima). GM-CSF je kupljen od Gentaur. LPS (E.coli O:15) je kupljen od Sigma. HLA-B0702-ograničen CMV-specifičan peptid TPRVTGGG kupljen je od jpt. Za in vivo eksperimente, CMV-specifične T-ćelije su dalje prečišćene pomoću APC-obeleženih MHC-multimera (Immudex). Bojenje MHC multimerom izvedeno je na sobnoj temperature, nakon čega su izolovane MHC-multimer+ T-ćelije sa anti-APC-kuglicama (Miltenyi).

Primer 4

Test funkcionalnosti

Protočna citometija:

Vezivanje fuzionih proteina antitela za antigen-prezentujuće ćelije tumora i/ili T limfocita tstirano je protočnom citometrijom. U ove svrhe, 2.5 - 5 × 10<5>ćelija je inkubirano sa 10 µg/ml scFv or 0.004 - 4 µg/ml titrairanih fuzionih proteina u 100 µl odgovarajućeg rastvora pufera (kao što ej PBS goveđi serum albumin, ili drugi prihtvatljiv puferski rastvor) po ležištu ploče V-oblika sa 96-ležišta na 4°C tokom 2 h. Nakon ispiranja tri puta sa 150 µl rastvora odgovarajućeg pufera, ćelije su inkubirane sa FITC-konjugvanim anti-His6markerom ili anti-Flag markerom ili antitelom sa anti-myc markerom na RT tokom 30 min i ponovo isprane dva puta. Za otvaranje kanala i testiranje pozadinskog bojenja, pripremljena su dva dodatna uzorka svakog tipa ćelija, jedan od neobojenih ćelija i drugi sa ćelijama obojenim sa FITC-konjugovanim anti-His6marker antitelom bez bilo kakvog proteina. Konačno, ćelije su resuspendovane u 500 µl rastvora odgovarajućeg pufera, prebačene u FACS epruvete i analizirane protočnom citometrijom.

Ispitivanje stimulacije PBMC:

Stimulacijske osobine rekombinantnih proteina testirane su u testom stimulacije koji se temelji na ćeliji (engl. cell-based stimulation assay). Tako, aktivacija T-ćelija posredovana bispecifičnim antitelima i „tridomenskim konstruktima“ određena je merenjem PBMC stimulacije u smislu indukovanog oslobađanja IL-2.

Merenje stimulatorne aktivnosti konstrukata:

Ćelijske linije A2 U266 mijeloma CD45 pos/HLA zasejane su na ploči za ćelijsku kulturu sa 96-ležišta sa ravnim dnom u gustini od 105 ćelija po ležištu u 100 µl medijuma za kultivaciju. Titrirani stimulatorni proteini dodati su kao što je naznačeno u 100 µl medijum po ležištu i preinkubirani tokom 1h na 37°C i 5% CO2kako bi se omogućilo dovoljno vezivanje. Nestimulisane PBMC, odmrznute i izolovane dan ranije, dodate su u naznačenoj gustini i inkubirane tokom 24 h na 37°C u 5% CO2. Konačno, ploče su centrifugirane 5 min na 450 × g kako bi se sakupili supernatanti bez ćelija za kvantifikaciju IL-2 u ELISA.

Sendvič ELISA IL-2:

Kao indikator za stimulatornu aktivnost, aktivacija T-ćelija indukovana bispecifičnim antitelima merena je u smislu oslobađanja IL-2. Nakon stimualcije PBMC, koncentrovanje sekretovanih IL-2 u supernatantu određena je pomoću IL-2 sendivč ELISA testa.

Prvo, ELISA poča sa 96-ležišta obložena je mišjim anti-humanim IL-2 antitelom od 400 ng/100 µl po ležištu preko noći na 4°C, nakon čega je izvršena saturacija nespecifičnih mesta vezivanja dodatkom odgovarajućeg pufera za blokiranje tokom 2 h na RT. U međuvremenu, pripremljena su serijska 1 : 2 razblaženja IL-2 standarda u duplikatu u rastvaraču/dilunetu polazeći od maksimalne IL-2 koncentracije od 1,000 pg/ml. Zatim, supernatanti koji sadrže IL-2 su razblaženi u odnosu 1 : 3 u RPMI 1640 medijumu koji sadrži 10% FCS i Pen-Strep (Penicillin-Streptomycine). Oba razblažena supernatanta i standardni su prebačeni na ELISA ploču i inkubirani 2 h na RT. Zatim, IL-2 je detektovan inkubacijom sa 17,5 ng/100 µl po ležištu biotinizovanog kozjeg anti-humanog IL-2 antitela tokom 2 h at na RT. Konačno, dodato je 100 µl po ležištu RP-konjugovanog streptavidina, razblaženog 1 : 200 u rastvaraču i inkubirano 20 min na RT. Svaka ploča je razvijena dodatkom rastvora TMB supstrata. Da bi se postigao pozadinski signal, najmanje 2 ležišta na svakoj ploči su inkubirana sa rastvaračem ili samo medijumom i detektovano je antitelo plus TMB. Između svakog koraka inkubacije, ploča je isprana tri puta sa PBS koji sadrži 0.05 % Tween-20 i jednom samo sa PBS-om.

Pripremljena je standardna kriva od sedam tačaka crtanjem signala apsorbance svakog standarda u odnosu na koncentraciju IL-2. Tako, količina IL-2 svakog supernatanta može se odrediti interpolacijom standardne krive fitovane jednačinom nenlinearne regresije za jednu fazu eksponencijalne asocijacije pomoću GraphPad Prism®.

IFN-γ ELISA (alternativa Primera 4):

U 100µl supernatanta ćelijske kulture, merna je koncetracija IFN-γ pomoću humanog IFN-γ ELISA Kit (Invitrogen™) prema protokolu proizvođača. Ukratko 50 µL Inkubacionog pufera dodato je u svako ležište prethodno obložene ploče sa 96-ležišta. U nulto ležište dodato je 50 µL pufera za rastvaranje standarda. Dodato je po 50 µL standarda i uzoraka u svako ležište. U svako ležište dodato je 50 µL rastvora biotinizovanog Hu IFN-γ Biotin konjugata. U cilju mešanja, nežno tapkati strane ploče. Prekriti ploču poklopcem i inkubirati 1 sat i 30 minuta na sobnoj temperaturi. Temeljno usisati rastvor iz ležišta i odbaciti tečnost. Isprati ležišta 4 puta. Dodati po 100 µL radnog rastvora Streptavidin-HRP u svako ležište. Prekriti ploču poklopcem i inkubirati 45 minuta na sobnoj temperaturi. Temeljno usisati rastvor iz ležišta i odbaciti tečnost. Dodati 100 µL Stabilizovanog hromogena i svako ležište. Tečnost u ležitima bi trebalo da se obojila u plavo. Inkubirali smo 15-30 minuta na sobnoj temperaturi i u mraku. Dodali smo po 100 µL Stop rastvora u svako ležište. U cilju mešanja, pažljivo tapkati stranice ploče. Boja rastvora u ležištima promenjena je iz plave u žutu. Apsorbanca svakog ležišta očitana je pomoću čitača poloča BioRad na 450 nm.

Analiza citotoksičnosti:

The HLA-A2/CD45 pozitivna ćelijska linija U266 ili ćelijska linija U266 mijeloma obeležena je sa 10 µM CFSE (Invitrogen Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit) u 350 µl PBS tokom 10 min na sobnoj temperaturi (RT) u mraku. Reakcija obeležavanja je zaustavljena dodatkom 5 ml fetalnog telećeg seruma (FCS), pa nakon toga inkubacija u trajanju od 1-minutna na RT. Posle 2 ispiranja, CFSE-obeležene ciljne ćelije su resuspendovane u medijumu za analizu i zajedno inkubirane sa mononuklearnim ćelijama periferne krvi.(engl. Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC)) iz HLA-A2 negativnih zravih donora u odnosu 1:10 (5*10<5>U266 i 5*10<6>PBMCs u 2 ml) i 27 nM konstrukata antitela kao što je naznačeno. Uzorak tretiran sa Tritonom je upotrebljen kao pozitivna kontrola (100% lize) i uzorak bez konstrukta antitela kao negativna kontrola (0% lize). Posle 24h, apoptotične ćelije su vizuelizovane dodatkom 7AAD boje (Biozol, 10 min na RT) i izračunat je % specifične lize CFSE obleleženih U266 ćelija primenom tehnike protočne citometrije.

Analiza kaspaze -3 (alternativa Primera 4):

Bojenje je izvedeno nakon zajedničkog inkubiranja ciljnih ćelija sa T-ćelijama (tumorske ćelije: T-ćelije u odnosu 2:1) sa ili bez specifičnih polipeptida tokom 4h. Prvo je obojena površina HLA-A2 i CD45m pa zatim fiksiranje i permeabilizacija (Fix+Perm, BD Biosciences). Aktivirano kaspaza-3 antitelo je zatim dodato tokom 30 min. (BD Biosciences). Ćelije su isprane sa 1xPBS 5% humanim serumom (HS, PAA Laboratories) i analizirane na a BD-FACS Canto-II. Izračunat je % specifične apoptoze kao (% eksperimentalne vrednosti -% spontanog oslobađanja)/(100% - % spontanog oslobađanja)*100.

Analiza Alamar plavim (alternativa Primera 4):

Analiza alamarBlue® (Abd Serotec) korišćena je za merenje ćelijske proliferacije i njihovog vijabilitita nakon izlaganja toksinima. Ukratko, ćelije su gajene u 100µl medijuma za kultivaciju ćelija, po ležištu (ploča sa 96 ležišta). Za analizu dodato je 10µl po ležištu alamarBlue i ploča je inkubirana u inkubatoru 30-120 minuta. Apsorbanca je očitana na čitaču BioRad na 570nM i 600nM. Za slepu probu korišćen je samo medijum. Procenat razlike u smanjenju ćeljske proliferacije između različitih polipeptidnih grupa izračunat je prema uputstvima proizvođača, koristeći kao kontrolu ćelije gajene medijumu za kultivaciju bez prisustva toksina.

Digoksigenin test (alternativa Primera 4):

Prva peroksidaza iz rena (HRP, Sigma-Aldrich Chemie gmbH) obeležena je digoksigenin NHS-estrom (Sigma-Aldrich Chemie gmbH) u molarnom odnosu 1/3. Dig-HRP je prečišćen hromatografskim kolonama mikro Bio-Spin™ (BioRad i ostavljen da stoji na 4°C u mraku). Ćelije Colo-206F su prvo inkubirane sa naznačenim polipeptidima u različitim koncentracijama tokom 90 minuta. Ćelije su isprane sa PBS-om i resuspendovane u medijumu za kultivaciju ćelija sa Dig-HRP i inkubirane 30 minuta. Potom su ćelije isprane dva puta sa PBS-om i resuspendovane u 50µl PBS. Dodato je 50µL Stabilizovanog Chromogen-a (Invitrogen™) tokom 15-30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Dodato je zatim 50 µL rastvora za prekidanje reakcije (Stop rastvor) i očitana je apsorbanca na čitaču ploča BioRad na 450 nm.

Miševi (alternativa Primera 4):

Transgeni HLA.A2 imunodeficijentni miševi (NodScid IL-2rg -/- HLA.A2/B2m tg; skladišni broj 14570, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) za in vivo eksperiment (Slika 12A) čuvani su u našim sertifikovanim objektima za čuvanje životinja (ZEMM, Center for experimental molecular medicine, University hospital Würzburg) prema evropskim smernicama. Ženke miševa, starosti 6-10 nedelja, podeljene su u pet grupa, šest miševa po grupi (n=30).5x10<6>THP-1 ćelija, 1,25x10<5>CMV specifičnih CD8+ T-ćelija (tumurske ćelije: odnos T-ćelija 40/1) i 0,5µg polipeptida je injektirano intraperitonealno (i.p.) kao što je naznačeno. Nakon injekcije, miševi su praćeni dnevnom kontrolom. Druga injekcija 1,16x10<5>CMV-specifinih CD8+ T-ćelija/mišu data je 13 –og dana i injekcije polipeptida su ponovljene na svaka tri dana nedeljno. Životinjes su uspavane kada su dostigle povećanje telesne težine od 80% ili kada su izgledale kao da su na samrti prema instituticionalnim smernicama.

Strukture domena, afintentni marker i spojnice konstrukta ili polipeptida upotrebljeni u Primerima 5-9 ili na Slikama 4-11 prikazane su na Slici 3. Ovi konstrukti i svi konstrukti ili polipeptidi upotrebljeni na Slikama 4-30 pripremljeni su kao što je opisano u Primerima 1 i 2. Ćelijska kultura i funkcionalni testovi u Primerima 5-9 i kulture, funkcionalni testovi i in vivo rad prema Slikama 4-30 izvedeni su kao što je opisano u Primerima 3 i 4.

Primer 5

CD45 i HLA A2 pozitivne ciljne ćelijske linije U266 mijeloma inkubirane su zajedno sa HLA A2 negativnim T ćelijama (monocitno osriomašene PBMCs (mononuklearne ćelije perfierne krvi) od zdravih donora i različitih količina konstrukata HLA A2 i CD3 bispecifičnih antitela kao što je naznačeno (brojevi 85, 82, 75 i 71). Kao pozitivna kontrola korišćen je PHA-L (fitohemaglutinin, lectin koji izaziva nespecifičnu stimulaciju T cellsćelija; krajnja koncentracija 1 µg/ml) i ispitivani su jednolančani scFv konstrukti sa specifičnošću za HLA A2 (Broj 4) ili CD3 (Broj 36). Merena je količina IL2 (Interleukin-2) koju proizvedu T ćelije pomoću ELISA tehnika. Nije utvrđena proizvodnja IL2 u eksperimentalnim uslovima bez konstrukata. Dobijeni podaci dati su na Slici 4.

Primer 6

CD45 i HLA A2 pozitivne ciljne ćelijske linije U266 mijeloma inkubirane su zajedno sa HLA A2 negativnim T ćelijama (monocitno osiromašene PBMCs) od zdravih donora i različitih količina „konstrukata sa tri domena“ dodati istovremeno ili odvojeno (Brojevi 42, 45, 55; brojevi se odnose na konstrukte kao što je naznačeno na Slici 3) ili u kombinacijama (42 45 ili 42 55). Kao kontrole korišćeni su PHA-L i jednolančani scFv konstrukti sa specifičnošću za CD45 (Brojevi 46 i 17). Proizvodnja IL2 od strane T ćelija merena je ELISA tehnikama. Nije utvrđena proizvodnja IL2 u eksperimentalnim uslovima bez konstrukata. Dobijeni podaci dati su na Slici 5.

Primer 7

CD45 i HLA A2 pozitivne ciljne ćelijske linije U266 mijeloma inkubirane su zajedno sa HLA A2 negatinim T ćelijama (monocitno osriomašene PBMCs) od zdravih donora i samim konstruktima HLA A2 i CD3 bispecifičnih antitela (broj 71, 27 nM) ili u kombinaciji sa jednolančanim scFv konstruktima koji blokiraju antigenske epitope na HLA A2 (Broj 4, stostruki višak u odnosu na koncentraciju konstrukta 71, tj. 2700 nM) ili CD3 (Broj 36, devetostruki višak u odnosu na koncentraciju konstrukta 71, tj. 243 nM). Proizvodnja IL2 od strane T ćelija merena je ELISA tehnikama i kao kontrola upotrebljena je PHA-L. Dobijeni podaci dati su na Slici 6.

Primer 8

CD45 i HLA A2 pozitivne ciljne ćelijske linije U266 mijeloma inkubirane su zajedno sa HLA A2 negatinim T ćelijama (monocitno osiromašene PBMCs) od zdravih donora i kombinacijom konstrukata 42 i 45. Stimulatorna funkcija T ćelija blokirana je jednolančanim konstruktima specifičnim za HLA A2 (broj 4) ili CD45 (broj 46). Komplementacija stimulatorne funckije T ćelija testirana je analizom konstrukata 42 i 45 posebno ili jednolančanim scFv kosntruktom usmerenim na CD3 (broj 36). Količina IL2 koje proizvode T ćelije merena je ELISA tehnikama i kao kontrola upotrebljena je PHA-L. Koncentracija konstrukata iznosila je 27 nM, osim ako je drugačije naznačeno. („9x“ ukazije na koncentraciju od 243 nM, „100x“ nakoncentraciju od 2700 nM.) Dobijeni podaci dati su na Slici 7.

Primer 9

CD45 i HLA A2 pozitivne ciljne ćelijske linije U266 mijeloma inkubirane su zajedno sa HLA A2 negativnim T ćelijama (monocitno osiromašeni PBMCs) od zdravih donora i kombinacijom konstrukata 42 i 55. Stimulatorna funkcija T ćelija blokirana je jednolančanim konstruktima speficičnim za HLA A2 (broj 4) ili CD45 (broj 46). Komplementacija stimulatorne funckije T ćelija testirana je analizom konstrukata 42 i 45 posebno ili jednolančanim scFv kosntruktom usmerenim na CD3 (broj 36 Količina IL2 koje proizvode T ćelije merena je ELISA tehnikama i kao kontrola upotrebljena je PHA-L. Koncentracija konstrukata iznosila je 27 nM, osim ako je drugačije naznačeno. („9x“ ukazije na koncentraciju od 243 nM, „100x“ ukazije na koncentraciju od 2700 nM.) Dobijeni podaci dati su na Slici 8.

Rezultati dati u prethodnim Primerima jasno pokazuju da dva konstrukta (42+45) ili (42+55) prvo moraju da vežu svoje ligande na površini jedne ćelije kako bi naknadno naknadno dopunili funkciju T ćelije za angažovanje.

Primer 10

Liza CD45 i HLA A2 pozitivnih ciljnih ćelijskih linija U266 mijeloma dejstvom HLA A2 negativnih T ćelija (monocitno osiromašeni PBMCs) u prisustvu VLCD3-scFvHLA A2 (27 nMol) ili VH-scFvCD45 (27 nMol) ili kombinaciji oba od ovih konstrukata (po 27 nMol) određena je tehnikama baziranim na protočnoj citometriji. Procenat lize izračunat apoptotičnim U266 ćelijama podeljenim na ukupan broj U266 ćelija i oduzeta je pozadinska apoptoza. Dobijeni podaci dati su na Slici 9.

Primer 11

Kao deo krajnjeg bipartitnog konstrukta, konstruisana su dva polipeptida, svaki se sastoji od antigen-vezujućeg jednolančanog varijablnog fragmenta (scFv) i/ili domena varijabilnog lakog (VL) ili domena varijabilnog teškog lanca (VH) anti-CD3 antitela koja aktiviraju T-ćelije (Slika 10). Kada ova dva polipeptida vezuju svoje odgovarajuće antigene na površini jedne ćelije, domeni VLi VHmeđusobno interaguju kako bi rekonstituisali originalno mesto vezivanja anti-CD3. Tako na taj način formirani trispecifični heterodimer uključuje i stimuliše T ćelije za uništavanje tumorskih ćelija.

Ovaj scenario je u potpunosti potvrđen in vitro kada su T limfociti suprotstavljeni ciljnim ćelijama koje su inkubirane sa dva različita polipeptida. Kao dokaz, glavni antigen histokompatibilnosti HLA-A2 i hematopoetski linijski marker CD45 su ciljani kao prvi i drugi antigen, pri čemu su oba eksprimirani na U266 ćelijama mijeloma, primarne ćelije od pacijenata sa pro-limfocitnom leukemijom T ćellijskog porekla (T-PLL), i THP-1 akutnom mijeloidnim leukemijskim blastima (Slika 11). Usled opisaniih VL/VHinterakcija, trispecifični heterodimer snažno stimuliše T ćelije da sekretuju interleukin-2 (IL-2) (Slika 11a) i da liziraju obeležene ćelije tumora u nanomolarnoj koncentraciji (Slika 11b), citotoksična efikasnost je sasvim slična efikasnosti bispecifičnog antitela koje aktivira T ćelije, što je korišćeno kao pozitivna kontrola (Slika 11A, levi panel), Mack, 1995, Proc Natl Acad Sci 92, 7021-7025. Kada su polipeptidi dodati odvojeno jedan od drugog, oni nisu indukovali T limfocite da liziraju ciljne ćelije. Ovi rezultati u skladu sa strukturnim podacima koji ukazuju na to da su oba domena VHi VLneophodna da dodele dovoljan afinitet ciljnom antigenu (Slika 11A, B), Colman, 1987, Nature 326, 358-363; Amit, 1986, Science 233, 747-753. Dalje, rezultati otkrivaju da moguća homodimerizacija VHili VLkraka dovodi do zanemarljivo merljivog biološkog efekta.

Da bi pokazali da dva molekula moraju prvo da vežu svoje antigene na površini ciljne ćelije za odvijanje VH/VLheterodimerizacije, jednolančani varijablni fragmenti specifični za HLA-A2 i CD45 su upotrebljeni za blokiranje odgovarajućih epitopa na cilju. Kao što je prikazano na Slici 11c, kada su prisutni u velikom višku, ovi inhbitori sprečavaju da dva polipeptida pokrenu T ćelije na način zavisan od doze. Dalje, T ćelije nisu stimulisane kada su ciljne ćelije izostavljene (podaci nisu dati) ili kada su ciljne ćelije ispitivane da eksprimiraju samo CD45 (RAJI ćelije, Fig.11D) ili ni ciljni molekul (KMS-12-BM, Slika 11D).

Primer 12

Za in vivo dokaz koncepta, primenjen je model alogene nekomplementarne transplantacije matičnih ćelija u kojem pecijentove rezidualne leukemijske ili hematopoetske ćelije, svi HLA-A2 i CD45-pozitivni, moraju da budu eliminisani kako bi dale alogenim matičnim ćelijama donora (HLA-A2-negativne, CD45-pozitivne) priliku da ukaleme i rekonstituišu hematopoezu (videti Sliku 2). Da bi testirali specifičnost bipartitnog konstrukta, korišćeni su imunodeficijentni miševi koji eksprimiraju HLA-A2 transgen čoveka praktično svim nukleiranim ćelijama, pitanje je bilo da li bi HLA-A2-pozitivna ili CD45-negativna tkiva miša pretrpela kolateralnu štetu. THP-1 ćelije su injektirane intraperitonealno sa ili bez CD8 T limfocita od HLA-A2-negativnog donora, koje su selektovane zbog specifičnosti na citomegalovirus (CMV) da bi se izbegla humana anti-mišja imuna reaktivnost. Intraperitonealni tumori su se brzo razvili kod miševa koji nisu primali polipeptide i kod miševa tretiranih ili jednom vrstom molekula ili kombinacijom oba polipeptida, ali bez T ćelija. U svim slučajevima, fatalna dismeninovana bolest razvila se tokom 3 do 4 nedelje (slika . 12A). U oštrom kontrastu, svi miševi sa tumorima tretirani T ćelijama i ponovljenim injekcijama oba polipeptida preživela su kraj eksperimenta 31-og dana, sa palpablnim tumorima na mestu injekcije. Ovi rezultati jasno pokazuju sa bipartitni konstrukti zaista preusmeravaju T ćelije bez obira na njihovu specifičnost na ćelije tumora koje istovremeno eksprimiraju oba ciljna molekula (HLA-A2 i CD45) in vivo. S druge strane, bispecifična antitela koja angažuju T ćelije protiv HLA-A2 bi izazvala veliku štetu preusmeravanjem T ćelija na sva HLA-A2 pozitivna mišja tkiva. Slično, CD45-vezujuće bispecifično antitelo je posredovalo u lizi svih matičnih ćelija hematopeze, uključujući THP-1 leukemjska bujanja i T ćelije od donora. U našoj postavci, međutim, injekcije HLA-A2-specifičnog polipeptida u HLA-A2 transgene životinje nisu izazvale očiglednu toksičnost.

Da bi dalje ispitali moguću toksičnost za posmatrače, primenili smo visoko osetljiv test apoptoze na THP-1 ćelije i HLA-A2-negativne ali CD45-pozitivne monocite, gde ovi drugi predstavljaju prostor za zdrave posmatrače. Kao što je opisano na Slici 12B, uočili smo aktivaciju kaspaze-3 u THP-1 ćelijama ali ne i u monocitima koji su tretirani u istom ležištu kombinacijom polipeptida ili bispecifičnom pozitivnom kontrolom i donorom T ćelija. THP-1 ćelije kultvisane sa T ćelijama i pojedinačnim polipeptidima su ostale nepromenjene. Ova zapažanja ponovo jasno pokazuju inicijaciju apoptoze isključivo u dvojno antigen pozitivnoj ciljnoj populaciji, dok su HLA-A2-negativne ćelije posmatrača pošteđene. Ovaj model eksperimenata daje prilično tačnu kobnu kliničku situaciju pacijenata obolelih od leukemije sa transplatnom HLA-neusaglašenih matičnih ćelija. Kombinatorni pristup upotrebe prepoznatljivog HLA molekula i CD45 ima za cilj poboljšanje željenih efekata kalema vs. leukemije preumeravanjem T ćelije donora protiv leukemijskih blasta mijeloidnog i limfoidnog porekla.

Primer 13

Kako bi se prihvatili čvrtih tumora, ciljali smo na kombinatorni pristup antigenima adhezionih molekula epitelnih ćelija (EpCAM) i receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR). Oba antigena se prekomerno eksprimiraju u različitim karcinomima i obimno su ispitivana u kliničkim ispitivanjima II i III faze. Eskpresija EGFR je tesno povezana sa ćelijskom proliferacijom, dok je EpCAM prisutan na bazolateralnoj površini gotovo svakog epitela i nedavno je nađeno da deluje kao signalni protein u Wnt putanji, Maetzel, 2009, Nat Cell Biol 11, 162-171. Kao što je dato na Slici 13a, dva polipeptida pokreću oslobađanje interferona-γ (IFNγ) iz ko-inkubiranih limfocita donora i posreduju u apoptozi dvostruko pozitivne linije ćelija COLO-206F karcinoma u nanomolarnim koncentracijama (Slika 13a, b), ali samo onda kada su u datoj kombinaciji i ne sa svakim delom pojedinačno. Kao potomci neuroepitelnog tkiva, ćelijskoj liniji FM-55 melanoma nedostaje EpCAM, i shodno tome je potpuno otporna na polipeptide (Slika 13a, b). Iako se ekspresija EGFR EpCAM u širokoj meri preklapa sa proliferacijom ćelija karcinoma, ne-proliferirajućih epitelnih ćelija, npr. jetre i pankreasa koje isključivo eksprimiraju EGFR ili EpCAM antigene, trebalo bi da je manje susceptibilna na ili zaštićena od dvostrukog napada. Posebno, hepatični i pancreatski toksini su ograničeni dozom za visoko-afinitetna monoklonalna EpCAM antitela u kliničkim ispitivanjima (za pregled videti, Munz, 2010, Cancer Cell Int 10:44).

Primer 14

Dalja validacija bipartitne funkcionalne strategije komplementacije izvedena je opsežnim in vitro eksperimentima, koristeći kombinaciju različitih polipeptida, ciljanjem različitih antigena na povrišini ćelija na različitim ćelijskim linijama čoveka.

HLA A2 pozitivne tumorske linije FM-55 čoveka (mijelom), Colo-206F (karcinom debelog creva) i OVCAR (karcinom jajnika) su inkubirane zajedno sa HLA-A2 negativnim PBMCs od zdravih donora, polipeptidom protiv HLA-A2 (CD3(VL) - HLA-A2(VH-VL)) i sa drugim polipeptidom koji cilja CEA (CD3(VH) - CEA(VH-VL)), EGFR (CD3(VH)-EGFR(VH-VL)) ili Her2 (CD3(VH) - Her2(VH-VL)). Količina IL2 ili IFN-γ koje proizvode limfociti mereni su ELISA tehnikama. Ovi podaci pokazuju da (i) specifična kombinacija antigena, antigen signatura, može se eksprimirati na karcinomima različitog porekla (tkivo kože, neuroepitela, creva i jajnika), (ii) antigen signatura je pristupačan našem bipartitnoj funkcionalnoj strategiji komplemenata koristeći set poipeptida koji su specifični za antigen signatura. Dobijeni podaci dati su na Slikama14, 15 i 16.

Primer 15

Za demonstraciju izmenljivosti funkcionalnog domena, fragmenti F1 i F2 seta polipeptida su međusobno zamenjeni, zadržavajuči svoje specifične sposobnosti komplementacije za ciljno obnavljanje njihovog izvornog domena antitela za angažovanje T ćelija. Prema tome, korišćen je set polipeptida protiv CD45 i HLA-A2 ciljnog antigena. Polipeptid protiv CD45 sadrži CD3(VL) kao fragment F1 i polipeptid protiv HLA-A2 sadrži CD3(VH) kao fragment F2. CD45 i HLA-A2 pozitivna ćelijska linija U266 mijeloma zajedno je inkubirana sa HLA-A2 negativnim T ćelijama od zdravog donorora i polipeptidima protiv CD45 (CD3(VL) -CD45(VH-VL)) i HLA-A2 (CD3(VH) - HLA-A2(VH-VL)) u različitim količinama. Angažovanje T ćelija određeno je proizvodnjom reaktivnog IFNγ, mereno ELISA tehnikama.

Nije nađena proizvodnja IFNγ u eksperimentalnim uslovima bez jednog od polipeptida. Dobijeni podaci dati su na Slici 17.

Primer 16

Bipartitna funkcionalna strategija komplentarnosti dalje je testirana ciljanjem seta antigena, koji su već upotrebljeni za ciljane terapije karcinoma antitelima (EGFR, EpCAM i Her2) (Her2 je cilj za Trastuzumab kod karcinoma dojke, EGFR je cilj za Cetuximab kod karcinoma creva i EpCAM je cilj za Catumazumab za lečenje neoplastičnih ascitesa). EGFR, EpCAM i Her2 pozitivne ćelije (Colo-206F, CX-1 i OVCAR) zajedno su inkubirane sa PBMCs od zdravih donora i kombinacijom polipeptida protiv EGFR (CD3(VH) - EGFR(VH+VL)), EpCAM (CD3(VL) - EpCAM(VH+VL)) i Her2 (CD3(VH) - Her2(VH+VL)). Komplementacija stimulatorne funkcije limfocita određena je proizvodnjom reaktivnog IFNγ, merenom ELISA tehnikama. Nije uočena proizvodnja IFNγ u eksperimentalnim uslovima bez polipeptida. Dobijeni podaci dati su na Slikama 18 i 19.

Primer 17

Za testiranje kombinacije antigena sa bliskom kliničkom korelacijom, korišćena je kombinacija CD45 i CD138 za ciljanje multiplih ćelija mijeloma (MM) čoveka. Veći deo MM ćelija čoveka je pozitivno na CD45 i CD138. Bispecifična antitela koja angažuju T ćelije protiv CD45 ubila bi sve hematopoetične ćelije pacijenta i protiv CD138 bi izazvale ozbiljne sporedne efekte zbog svog eksprimovanja na različitim normalnim tkivima (epitelne ćelije, endotelne, trofoblastične ćelije i glandularne ćelije GI trakta, The Human Protein Atlas, Version: 10.0, Atlas ažuriran: 2012-09-12). Suprotno, kombinacija CD45 i CD138 je nađena isključivo na ćelijama plazme i MM ćelijama i shodno tome je dobra antigen signatura za pristup ciljne terapije. CD45 i CD138 pozitivna multipla ćelijska linija AMO-1 mijeloma čoveka je inkubirana zajedno sa PBMCs od zdravog donora i kombinacijom polipeptida protiv CD45 (CD3(VL) - CD45(VH+VL)) i CD138 8 (CD3(VH)-CD138(VH+VL)). Komplementacija stimulatorne funkcije limfocita određena je proizvodnjom reaktivng IFNγ, merenog ELISA tehnikama . Nije zabeležan prouvodnja IFNγ u ovim kesperimentalnim uslovima sa pojedinačnim polipeptidima ili bez polipeptida. Dobijeni podaci dati su na Slici 20.

Primer 18

Naredna primena bipartitne funkcionalne strategije komplementacije je ciljane pojedinačnih antigena na povrišini ćelije i i ubiti tumorske ćelije pozitivne na pojedinačni antigen. Glavni nedostatak za bispecifična antitela koja angažuju T ćelije sa funkcinalnim antiCD3 mestima vezivanja su ozbiljni sporedni efekti izazvani aktivacijom nespecifičnih T- ćelija i oslobađanjem citokina (Linke, R. et al. Catumaxomab: clinical development and future directions. MAbs 2, 129-136 (2010)). Prednost ove bipartitne funkcinalne strategije komplemenatrnosti leži u činjenici da antitela čiji T ćelijski aktivirajući antiCD3 funkcionalni domen je obnovljen isključivo na ciljnoj ćeliji. Bez ciljne ćelije, nije priosutan ni domen koji aktivira T-ćelije. CD45 i CD138 pozitivne multiple ćelije AMO-1 mijeloma čoveka i U266 inkubirane su zajedno sa PBMCs od zdravog donora i kombinacija polipeptida protiv pojedinačnog ciljnog antigena, bilo CD138 (CD3(VH) - CD138(VH+VL) CD3(VL) -CD138(VH+VL)) ili CD45 (CD3(VH) - CD45(VH+VL) CD3(VL) - CD45(VH+VL)). Komplementacija stimulatorne funkcije limfocita određena je proizvodnjom reaktivng IFNγ, merenog ELISA tehnikama. Nije zabeležena proizvodnja IFNγ u ovim eksperimentalnim uslovima sa pojedinačnim polipeptidima ili bez polipeptida. Dobijeni podaci dati su na Slikama 21 i 22. Na Slici 23 ilustrovan je pristup pojedinačnog antigena, koristeći set polipeptida usmerenog na dva različita epitopa (gonji deo) ili isti epitop (niži deo) ciljnog antigena A1.

Primer 19

Ovo je primer kojim se pokazuje da funkcionalna strategija komplementacije može da bude dalje objašnjena za ciljanu isporuku tereta i da su mogući različiti efektorski putevi za ubistvo ciljne ćelije. Dopunjavanjem fragmenata F1 i F2 seta vezanih polipeptida za cilj, novo obrazovana mesta vezivanja antitela mogu da vežu bilo koji molekul koji je specifičan za to. Da bi se usmerio HIS-markiran teret precizno na ciljnu ćeliju, korišćeni su fragmenti VHi VLanti-HIS(heksa-histidin)-antitela. Nakon istvoremenog vezivanja polipeptida 1 (antiHis(VL)-CD45(VH-VL) i polipeptida 2 (antiHis(VH)-HLA-A2(VH-VL) za svoje specifične ciljne antigene CD45 i HLA-A2, heksa-histidinsko mesto vezivanja je dopunjeno na cilju koje sa visokim afinitetom vezuje histidinom obeležene terete. Teret je HIS-markiran toksin kao što je dato u ovom primeru. CD45 i HLA-A2 pozitivne ćelije THP-1 su zajedno inkubirane sa histidin(His)-markiranom Clostridium perfringens Iota toksinskom komponentom Ia (Slika 24) ili histidin(His)-markiran Shiga toksinom podjedinicom A (Slika 25, 26) u kombinaciji sa polipeptidima protiv CD45 (antiHis(VL)-CD45(VH-VL)) i HLA-A2 (antiHis(VH)-HLA-A2(VH-VL)). Komplementacija vezivanja his-markiranog toksina i naknadno ubijanje ciljne ćelije procenjeno je merenjem ćelijskog viabiliteta primenjujući alamarBlue® test. Pri najvišim koncentracijama polipeptida (80nM), jasna razlika u ubijanju ciljnih ćelija, merena kaosmanjenje vijabiliteta ćelije, nađena je u eksperimentalnim situacijama sa kombinacijom oba polipeptida u odnosu na pojedinačne polipeptide.

Primer 20

Da bi dalje objasnili svestranost, fleksibilnost i mogućnost razmene bipartitna funkcionalna strategija komplementacije, fragmenti VHi VLanti-Digoksigenin antitela su upotrebljena za identifikaciju i makriranje dvostruko antigen pozitivnih ćelija sa Digoksigenin-označenom HRP (peroksidazom rena). EGFR i EpCAM pozitivne Colo-206F ćelije su zajedno inkubirane sa polipeptidima protiv EGFR (antiDig(VH) - EGFR(VH+VL)) i EpCAM (antiDig(VL) -EpCAM(VH+VL)). Ciljna komplementacija funkcionalnog domena anti-Digoksigenina, označenog kao Digoksigenin-HRP obeležavanje Colo-206F ćelija, procenjena je merenjem aktivnosti peroksidaze, koristeći standardni ELISA Komplet (Invitrogen™). Jasna razlika između Dig-HRP obeleženih ciljnih ćelija nađena je u eksperimentalnim uslovima sa kombinacijom oba polipeptida u odnosu na pojedinačne polipeptide. Dobijeni podaci dati su na Slici 27.

Primer 21

Koristeći leukocitne antigene (HLA) čoveka kao jednu granu za dvojnu bipartitnu funkcionalnu komplementaciju ograničenu antigenom, ova strategija halotipa je dalje validirana zamenom funkcionalnih domena polipeptida sa fragmetnima VHi VLanti-HLA-Cw6 antitela. HLA-Cw6 pozitivna PBMCs primarnog pacijenta inkubiorana su zajedno sa HLA-Cw6 negativnim PBMCs od zdravih donora, polipeptidom protiv CD45 (CD3(VL) - CD45(VH-VL)) i HLA-Cw6 (CD3(VH) - HLA-Cw6(VH-VL)). Količina IFNγ koju proizvedu limfociti merena je ELISA tehnikama. Ovi podaci pokazuju da hematopoietske ćelije pacijenata sa haplotipima izuzev HLA-A2 mogu da budu ciljane jednostavnom zamenom jednog ciljnog domena (anti HLA-A2, Slika 5, 7-9, 11-12) drugim (anti HLA-Cw6). Dobijeni podaci dati su na Slikama 28.

Primer 22

Dvojna bipartitna funkcionalna strategija komplementacije izazvana antigenom dalje je validirana testom in nitro kod pacijenata, koristeći sveže izolovane ćelije raka od primarnog pacijenta i antigen ciljeve koji su već korišćeni u kliničkoj terapiji raka ili u kliničkim ispitivanjima (EGFR, EpCAM, CEA i Her2). Maligne ćelije muškog pacijenta starosti 48 godina sa metastaznim karcinomom pankreasa su inkubirane zajedno sa limfocitima periferne krvi istog pacijenta i kombinacijom polipeptida protiv EGFR (CD3(VH) - EGFR(VH+VL)), EpCAM (CD3(VL) - EpCAM(VH+VL)), Her2 (CD3(VH) - Her2(VH+VL)), CEA (CD3(VH) -CEA(VH-VL)) i HLA-A2 (CD3(VL) - HLA-A2(VH-VL)). Komplementacija limfocitne stimulatorne funkcije procenjena je proizvodnjom reaktivnog IFNγ, mereno ELISA tehnikama. Nije uočena proizvodnja IFNγ u eksperimentalnim uslovima bez polipeptida. Ovi podaci pokazuju potencijal ove strategije korišćenja pacijentovih spostvenih imunskih ciljnih ćelija i ubijanje sopstvenih maligno transformisanih ćelija. Dobijeni podaci dati su na Slici 29.

Primer 23

Populacija visoko obogaćenih CD3/CD8 pozitivnih CMV ograničenih T-ćelija je korišćena da bi se pokazalo da bilo koja T ćelija, bez obzira na njenu specifičnost, može da posluži kao efektorska ćelija i da ubije svojne antigen pozitivne tumorske ćelije ovom strategijom komplementacije. CD45 i HLA-A2 pozitivne U266 i THP-1 ćelije su zajedno inkubirane sa citomegalovirus (CMV) specifičnim T-ćelijama od HLA-A2 negativnih zdravih donora i polipeptida protiv CD45 (CD3(VH)-CD45(VH-VL)) i HLA-A2 (CD3(VL) - HLA-A2(VH-VL)) u različitim količinama. Bispecifični tandem scFv (CD3(VH-VL) x HLA-A2(VH-VL))-antitelo je korišćeno kao pozitivna kontrola. Angažovanje T ćelije procenjeno je proizvodnjom reaktivnog IFNγ, mereno ELISA tehnikama. Nije uočena proizvodnja IFNγ u eksperimentalnim uslovima sa pojedinačnim polipeptidima ili bez polipeptida. Dobijeni podaci dati su na Slici 30. Ćelije iz iste smrznute serije, CMV specifične T-ćelije i THP-1 ćelije su korižene za mišji in vivo model (Slika 12A).

Primer 24

Ova ilustracija prikazuje potencijal za ciljanje alergen/ klonova autoimunski specifičnih B-ćelija sa bipartitnom funkcionalnom strategijom komplementacije. Korišćenjem sintetičkog alergena kao ciljnog molekula, polipetid vezan za alergen će se specifično vezati za svoje receptore klonotipske B-ćelije eksprimriane na površini klona alergen specifične B-ćelije. Druga grana bipartitne strategije koristiće polipeptid specifičan za B-ćelije (CD19, CD20, CD38, CD138), ograničavajući komplementaciju efektorskog domena sa naknadnim ubijanjem ciljnih ćelija na klon alergena specifične B-ćelije. Krajnji cilj ove strategije je eliminisati klon B ćelije koji izaziva alergijsku ili autoimunsku bolest (gornji deo na Slici 31) dok štede B ćelije sa drugim specifičnostima ili druge ćelije pored osim B ćelija (npr. mast ćelije ili bazofilne ćelije) koje vezuju antitelo odgovorno za boelsti preko Fc-receptora (donji deo na Slici 31).

Karakteristike predmetnog pronalaska koji su otkriveni u specifikaciji, patentnim zahtevima i/ili u pratećim crtežima mogu biti odvojeno i u bilo kojoj kombinaciji istih, materijal za realizaciju pronalaska u različitim oblicima.

LISTING SEKVNCI

Claims

Patentni zahtevi

1. Set polipeptida koji sadrži:

prvi polipeptid P1 koji sadrži

(i) ciljajuću grupu T1, pri čemu se ciljajuća grupa T1 specifično vezuje za antigen A1, i

(ii) fragment F1 funkcionalnog domena F,

pri čemu niti je dati sâm fragment F1 niti je dati sâm polipeptid P1 funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F,

i

drugi polipeptid P2 koji sadrži

(i) ciljajuću grupu T2, pri čemu se data ciljajuća grupa T2 specifično vezuje za antigen A2, i

(ii) fragment F2 datog funkcionalnog domena F,

pri čemu niti je dati sâm fragment F2 niti je dati sâm polipeptid funkcionalan u odnosu na funkciju datog domena F,

pri čemu se antigen A1 razlikuje od antigena A2,

a polipeptid P1 i polipeptid P2 nisu međusobno povezani u odsustvu ćelije koja ima antigene A1 i A2 na svojoj površini, gde, nakon dimerizacije fragmenta F1 polipeptida P1 sa fragmentom F2 polipeptida P2, dobijeni dimer je funkcionalan u odnosu na funkciju domena F, i

gde fragment F1 sadrži domen VLantitela i fragment F2 sadrži domen VHistog antitela; ili pri čemu fragment F1 sadrži domen VHantitela i fragment F2 sadrži domen VLdomain istog antitela.

2. Set polipeptida prema zahtevu 1, pri čemu ćelija koja ima oba antigena A1 i A2 na svojoj površini indukuje dimerizaciju fragmenta F1 polipeptida P1 sa fragmentom F2 polipeptida P2, pri čemu ćelija koja nema oba antigena A1 i A2 na svojoj površini ne indukuje dimerizaciju fragmenta F1 polipeptida P1 sa fragmentom F2 polipeptida P2.

3. Set polipeptida prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu polipeptidi P1 i P2 imaju, u odsustvu supstrata ili ćelije, konstante disocijacije KDu opsegu od 10<-8>M do 10<-2>M, u opsegu od 10<-7>M do 10<-3>M ili u opsegu od 10<-6>M do 10<-3>M; i/ili dati polipeptidi P1 i P2 imaju, u prisustvu supstrata ili ćelije, konstante disocijacije KDispod 10<-6>M, ispod 10<-7>M ispod 10<-8>M ili ispod 10<-9>M.

4. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 3, gde antigen A1 i/ili antigen A2 je antigen eksprimiran na površini ćelija tumora ili na površini progenitor/prekursorskih ćelija tumora.

5. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 4, gde kombinacija antigena A1 i antigena A2 je nađena jedino ćelijama raka, a ne i na ćelijama koja nisu kancerogene.

6. Set polipeptida prema zahtevu 5, gde kombinacija antigena A1 i antigena A2 je specifična za kancerogene ćelije određene vrste raka.

7. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 6, gde dati antigen A1 je antigen MHC koji je alelna varijanta odabrana iz grupe koju čine:

HLA-A2, HLA-Cw6, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A25, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B35, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, i HLA-Cw7; i/ili

dati antigen A2 je antigen koji je specifičan za određenu vrstu ćelija ili ćelijsku liniju odabranu iz grupe koju čine:

CD45; CD34; CD33; CD138; CD15; CD1a; CD2; CD3; CD4; CD5; CD8; CD20; CD23; CD31; CD43; CD56; CD57; CD68; CD79a; CD146; proteini surfaktanta; sinaptofizin; CD56; CD57; nikotin acetilholinski receptor; mišićno-specifična kinaza MUSK; naponom kotrolisani kalcijumski kanal (P/Q-tipa); naponom kontrolisani kalijumski kanal (VGKC); N-metil-D-aspartatni receptor (NMDA); TSH; amfifizin; HepPar-1; gangliozid GQ1B, GD3 ili GM1; i glikoforin-A.

8. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 7, gde jedan od antigena A1 i A2 je odabran iz grupe koju čine: HLA-A2; HLA-Cw6; EpCAM; CD20; CD33; CD38; CD45; Her2; EGFR; CD138; CEA; CD19; PSMA; E-kadherin; Ca-125; Her-2/neu; prolaktinom indukovan protein (GCDFP); BCA-225; CA 19-9; CD117; CD30; Epitelni antigen BER-EP4, Epitelni membranski antigen i Epitelno srodan antigen MOC-31; receptor epidermalnog faktora rasta HER1; receptor faktora rasta dobijen iz trombocita PDGFR alfa; Melanom povezani marker/Mart 1/Melan-A; CD133; TAG 72; akvaporin-2 i klonotipska antitela na površini B ćelije.

9 Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 8, gde

(i) jedan od antigena A1 i A2 je EpCAM a drugi je EGFR, HER2/neu, CD10, VEGF-R ili MDR;

(ii) jedan od antigena A1 i A2 je MCSP, a drugi je melanoferin ili EpCAM;

(iii) jedan od antigena A1 i A2 je CA125, a drugi je CD227

(iv) jedan od antigena A1 i A2 je CD56, a drugi je CD140b ili GD3 gangliozid;

(v) jedan od antigena A1 i A2 je EGFR, a drugi je HER2;

(vi) jedan od antigena A1 i A2 je PSMA, a drugi je HER2;

(vii) jedan od antigena A1 i A2 je Sialyl Lewis, a drugi je EGFR;

(viii) jedan od antigena A1 A2 je CD44, a drugi je ESA, CD24, CD133, MDR ili CD117; (ix) jedan od antigena A1 i A2 je CD34, a drugi je CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR, CD13, CD117, CD33 ili CD15;

(x) jedan od antigena A1 i A2 je CD33, a drugi je CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR, CD13, CD117 ili CD15;

(xi) jedan od antigena A1 i A2 je MUC1, a drugi je CD10, CEA or CD57;

(xii) jedan od antigena A1 i A2 je CD38 , a drugi je CD138;

(xiii) jedan od antigena A1 i A2 je CD 24 , a drugi je CD29 or CD49f;

(xiv) jedan od antigena A1 i A2 je karbonatna anhidraza IX, a drugi je akvaporin-2;

(xv) jedan od antigena A1 i A2 je HLA-A2, a drugi je EpCAM;

(xvi) jedan od antigena A1 i A2 je HLA-A2, a drugi je CD45;

(xvii) jedan od antigena A1 i A2 je HLA-A2, a drugi je EGFR;

(xviii) jedan od antigena A1 i A2 je HLA-A2, a drugi je Her2;

(xix) jedan od antigena A1 i A2 je HLA-A2,a a drugi je CEA;

(xx) jedan od antigena A1 i A2 je EpCAM, a drugi je CEA;

(xxi) jedan od antigena A1 i A2 je CD45 or CD38 , a drugi je CD138;

(xxii) jedan od antigena A1 i A2 je EGFR, a drugi je CEA;

(xxiii) jedan od antigena A1 i A2 je Her2, a drugi je CEA; ili

(xxiv) jedan od antigena A1 i A2 je CD19, a drugi je klonotipno antitelo na površini B ćelija.

10. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 9, gde ciljajuća grupa T1 i/ili T2 sadrži modul imunoglobulina; ili gde ciljajuća grupa T1 i/ili T2 sadrži aptamer ili pirodni ligand antigena A1 ili antigena A2.

11. Set polipeptida prema zahtevu 10, gde ciljajuća grupa T1 sadrži modul imunoglobulina I1 koji sadrži domen VLvezan za domen VHili sadrži varijabilni domen VHH antitela lame, antitela kamile ili antiela ajkule; i/ili ovaj ciljni ostatak T2 sadrži modul imunoglobulina I2 koji sadrži VLdomen vezan za domen VHili sadrži varijablni domen VHH antitela lame, antitela kamile ili antitela ajkule.

12. Set polipeptida prema zahtevu 11, gde dati modul I1 imunoglobulina sadrži scFv (jednolančana varijanta fragmenta), Fab ili F(ab')2antitela ili celog antitela; i/ili gde dati modul imunoglobulina I2 sadrži scFv (varijanta jednolačnanog fragmenta), Fab li F(ab')2antitela ili kompletnog antitela.

13. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 3 i 6 do 12, gde jedna od ciljajuća grupa T1 i T2 sadrži alergen ili supstrate koji vezuje klonotipno antitelo na površini B ćelija.

14. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 13, gde dati funckionalni domen F je ili sadrži modul imunoglobulina.

15. Set polipeptida prema zahtevu 14, gde funkcionalni domen F je Fv (varijanta fragmenta) ili scFv (jednolančana varijanta fragmenta) antitela.

16. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 15, gde dati fragment F1 sadrži domen VLanti-CD3, anti-His ili anti-DIG antitela u gde fragment F2 sadrži domen VHistog antitela ili pri čemu fragment F1 sadrži domen VHanti-CD3 anti-His ili anti-DIG antitela, fragment F2 sadrži VLdomen istog antitela.

17. Set polipeptida prema jednom od zahteva 14 do 16, gde modul imunoglobulina sadrži V domen odabran iz grupe koju čine:

(i) V domain anti-CD3 antitela koji sadrži VLdomen sa SEQ ID NO: 2 i/ili VHdomen sa SEQ ID NO: 1;

(ii) a V domen an anti-CD3 antitela koji sadrži VLdomen sa SEQ ID NO: 4 i/ili VHdomen sa SEQ ID NO: 3;

(iii) V domen anti-CD3 antitela koji sadrži VLdomen sa SEQ ID NO: 6 i/ili VHdomen sa SEQ ID NO: 5;

(iv) V domen anti-CD3 antitela koji sadrži VLdomen sa SEQ ID NO: 8 i/ili VHdomen sa SEQ ID NO: 7;

(v) V domen anti-CD3 antitela koji sadrži VLdomen sa SEQ ID NO: 10 i/ili VHdomen sa SEQ ID NO: 9; i

(vi) V domen anti-His antitela koji sadrži VLdomen sa SEQ ID NO: 12 i/ili VHdomen sa SEQ ID NO: 11;

(vii) V domen anti-DIG antitela koji sadrži VLdomen sa SEQ ID NO: 14 i/ili VHdomen sa SEQ ID NO: 30.

18. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 17, gde jedan od polipeptida P1 i P2 ima sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 114-129 i 197 ili obuhvata istu.

19. Set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 18 za upotrebu u lečenju pacijenata koji su oboleli od karcinoma i/ili tumoura ili za upotrebu u dijagnostici pacijenta koji je oboleo od karcinoma i/ili tumora.

20. Molekul nukleinske kiseline ili set molekula nukleinskih kiselina koji kodira set polipeptida ili jedan od polipeptida seta polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 18.

21. Molekul nukleinke kiseline ili set molekula nukleinskih kiselina prema zahtevu 20 koji sadrži nukleoitdnu sekvencu kao što je opisano u jednoj od SEQ ID NO: 135-150 i 196.

22. Farmaceutski preparat koji sadrži ili set polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 18 ili molekul nukleinske kiseline/ set molekula nukleinskih kiselina prema jednom od zahteva 20 ili 21, naznačena time, što farmaceutski preparat sadrži još i farmaceutski prihvatljiv nosač.

23. Komplet koji sadrži set polipeptida prema jednom od zahteva 1-18 ili molekul nukleinske kiseline ili set molekula nukleinskih kiselina prema jednom od zahteva 20 ili 21.